JPH02291253A

JPH02291253A - 細胞の培養方法及び装置

Info

Publication number: JPH02291253A
Application number: JP10911989A
Authority: JP
Inventors: Hajime Yoshida; 一吉田
Original assignee: Asahi Medical Co Ltd
Current assignee: Asahi Kasei Medical Co Ltd
Priority date: 1989-05-01
Filing date: 1989-05-01
Publication date: 1990-12-03

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、透析１漠を内蔵する培養液処理器を持つ細胞
の培養装置、及びそれを用いた培養方法に関する。

（従来技術とその問題点）近年バイオテクノロジーの発展に伴い、動物細胞の大量
培養技術の工業的重要性は急速に高まっている。

ところで一般に、動物細胞の培養には、アミノ酸や糖な
どの低分子量物質からなる工業的に生産さわる液（以下
基礎培養液と称す）に、血清または血清由来の蛋白質等
の成分（両者を総称して以下単に血清成分と称す）を添
加した液即ち培養液が用いられる。この血清成分は基礎
培ａｔ＆に比べて非常に高価であり、基礎培養液に血清
成分を適量加えた、実際に動物細胞の培養に用いられる
ＩＢ禿液の価格のほとんどを占めるのである。そのため
上記の大量培養によって細胞由来の有用物質（以下単に
生産物と称す）を工業的に生産しようとする場合、いか
に血清成分の使用量を減らすかが、コスト面での最も大
きな．！！題の１つとなるのである。

さらに生産物の培養液中での濃度は、培養液中の栄養物
の鼠と蓄Ｊｔ？される老廃物の量による限界があるので
あるが、その濃度は細菌などと異なり道かに低く、この
ことが培養液からの生産物の精製を非常に困難なものに
している。

そこで、培養液中の特に多く消費される栄養物の供給と
、低分子量老廃物の除去を行うことにより、培養液の寿
命を伸ばし、結果的に、コストを低減しかつ生産物濃度
を高める工夫が成されている。即ち、培養液の処理部分
を持つ培養装置と培養方法が考案されている。例えば、
中空糸等の透析膜からなる培養液処理器を持つタンク式
攪拌培養装置がある（特開昭６２−１３０６８３）。こ
れは攪拌培養法によるものであって、細胞の成育する培
養タンク（以下単にタンクと称す）より培養液処理器中
の中空糸外に、細胞を含む均質に攪拌された培養液（細
胞浮遊Ｍ）をボンブ等の培養液の循環手段によって循環
し、中空糸内を循環する基礎培養液との間で中空糸膜を
隔てて透析するか、あるいはタンク内の細胞浮遊液中に
、内部を基礎培養液が循環する中空糸を浸清して同じく
中空糸膜を隔てて透析することにより連続的に処理しよ
うとするものである。

更に、同じ攪拌培養法によるものであって、タンクの外
部に限外濾過部分をもち、培養液を限外１過することに
よって低分子■鋒物質を除去すると同時に、これとは別
に設けた供給口より低分子量の栄養成分を補充する方法
もある（特開昭６３−１　６０５７９）。

しかしながら特開昭６２−１３０６８３では、透析膜か
らなる培養液処理器をタンク外に設置した場合、均質に
攪拌された細胞浮遊液をボンブ等の循環手段により上記
培養液処理器へ循環するに際し、■ボンブ等による細胞
への物理的衝撃は細胞に対し大きな悪影響を与え、細胞
の生存に影響する。■培養液処理器に細叱あるいは細胞
片が蓄積し、これによって透析膜の膜面積を有効に活用
できない。■攪拌培養法では、多くの攪拌方法が考案さ
れていることからも明らかなように、いかに静かにタン
ク内を攪拌するかが技術的に重要である。即ち特開昭６
２−１　３０６８３に示される方法を実施しようとする
場合、タンク内の細胞浮遊液の流れを乱さずに細胞浮遊
液の回収及び供給がなされねばならない。それ故、培養
液処理器へのあるいは培養液処理器からの細胞浮遊液の
循環速度は自ずから限定され、よって特開昭６２−１３
０６８３の方法は一定時間当りに処理できる細胞浮遊液
の量の点で限界がある。又、■同じく特開昭６２−１３
０６８３に記載される、タンク内に中空糸からなる培養
液処理器を設置した場合は更にタンク内の細胞浮遊液の
流れを阻害し、成育細胞に対し大きな悪影習を与えるこ
とになる。

特開昭８３−１　６０５７８では上記特開昭６２−１３
０８８３の問題点と同時に更に、限外濾過による問題点
も又存在する。即ち、膜による濾過はある分子四を境に
クリアカットに分踵されるのではなく、一般にある分子
量の範囲で溶存する物質の除去率はその物質によって異
なるのである。

この時、限外濾過される分子量の培養液成分を別に供給
すると、本来細胞にとって厳密に最適化された培養液中
の各成分について上記分子量の範囲で溶存する物質の濃
度の変化を生じるので細ｊＲ増殖が低下する等の問題点
がある。さらに一方通行の限外濾過では目づまり等によ
り膜性能の劣化を伴い、長期使用には適さない。

（発明の目的）本発明の目的は、このような従来法の欠点を改善するも
ので、特に培養液中の血清成分使用量低減効果をもつ細
胞の培養方法及び装置を提供するにある。

（発明の構成）本発明者は、培養液の連続的循環手段を持つ細胞培養に
おいて、内部に細胞を保持し、細胞の成育空間内に機械
的な培養液の均質化手段を持たない培養器と、培養液を
貯留する手段と、透析膜を内蔵する培養液処理器と、培
養液が循環する第１の空間とは異なる該透析膜で隔たれ
た第２の空間に基礎培養液を循環する手段と、該基礎培
養液を貯留する手段とからなる細胞の培養装置が非常に
１憂れていることを見いたし、本発明を完成したもので
ある。即ち、本発明の要旨は下記のとおりのものである
。

■内部に細胞を保持し、細胞の成育空間内に機械的な培
養液の均質化手段を持たない培養器中で、培養液を循環
させつつ細胞を培弄し、この循環培養液を透析膜を内蔵
する培養液処理器の第１の空間に循環し、一方、該透析
膜で第１の空間と隔てられた第２の空間には基礎培養液
を循環させることを特徴とする細胞の珀養方法。

■内部に細Ｉｌｌを保持し、細胞の成育空間内に機械的
な培養液の均質化手段を持たない培五器と、培養液を貯
留する手段と、透析膜を内蔵する培養液処理器と、該透
析膜で隔てられた第１の空間に培養液を循環する手段と
、第１の空間とは異なる第２の空間に基礎培養液を循環
する手段と、該基礎培養液を貯留する手段とからなるこ
とを特徴とする細胞の培養装置。

次に、本発明の特徴をその作用と共に具体的に説明する
。

（作用）本発明でＯま・培養器中に細胞を保＋；ｙ　シて１身養
し、細胞成育空間内に機域的均質化手段をもたないこと
を大きな特徴としているため、公知の攪拌培養法と異な
り原理的に培養液中に浮遊する細胞または細胞片は非常
に少ないか又は全く無いのである。よって本発明では■
循環手段による細ｊκへの物理的悪影響がない、■培養
液処理器の中空糸外空間への細胞あるいは細胞片の蓄積
か無く、このため培養の全期間中にわたり、透析膜の面
積を有効に利用できる、■タンク内培養液の流わ阻害の
問題に由来する培養液の処理ｈ１の限界かない等、特開
昭６２−１　３０６８３の欠点に加えて、■特開昭６３
−１６０５７９における溶存する物質の濃度の変化や、
■膜性能の劣化等の欠点を完全に解決した優れた細胞の
培養装置及び方法てある。

第１図、第２図は、それぞれ本発明の実施例を示すもの
で、本発明の培養装置は、細胞が成育すル培養器（１）
と、培養液を貯留する培養液溜（３）と、１１１養液の
連続的循環手段（４）とを持つ動物細ｊｎの１１１養装
置であって、ボンブ等ニヨリよ｝１養掖。連続的循環手
段（４）にょり細ｊ胞が成育する培養器（１）に強制的
に培養液を循環させる結宋、培養器中ての細胞密度はデ
ィッシュ等通常の培養法でｊｉＩらねる一般的細Ｉｒａ
密度（ＩＸＩＯ６ｍＩＩ　Ｉ廐／ｍ１）以上、即ち例え
ば培養器中での細胞密度ＩＸＩＯ’細胞／　ｍ　ｆｌ以
上、場合によっては、１０８細１ｌｃ！／ｍρ以上の高
密度になる。

但しここで言う細胞密度は、培養する細ｊにや培養液の
種類によって変わり／ｊ；るため、相対的な意１床にお
いて重要である。

培養液の連続的循原千段（４）を持つ培養器（１）に接
続される透析膜を内蔵する培養液処理器（５）とは、培
養液ｆＲ（　３）より培養液循環手段（４）により培養
器（１）を経て培養液を透析膜で区切られた培養液処理
器（５）の第１の空間に送り、別の基礎培養液等の基礎
培養液溜（９）から培養液循環手段とは異なる基礎培養
液循環手段（７）により、基礎培養液を透析膜にて区切
られた培養液処理器（５）の第２の空間に送り、透析に
よって低分子量成分の交換、即ち老廃物の除去と栄養素
の補給を行った後、培養液を、再び培養液溜（３）に戻
すものであるかく第１図）、あるいは培養液溜（３）か
ら培養器（１）への循環回路とは別に，培養液溜（３）
より直接第２の培養液循環手段（８）により透析膜にて
区切られた培養液処理器（５）の第１の空間に送くり、
第２の空間に送られる基礎培養液に対して、透析によっ
て低分子量成分の交換、即ち老廃物の除去と栄養素の補
給を行った後、培養液を再び培養液溜（３）に戻すもの
である。この時使用済みの基礎培養液は基礎培養液溜（
９）に戻し、劣化するまで再使用することも可能である
し、あるいは２ｔ，礎培養液溜（９）に戻さず廃棄する
ことも可能である。ここで言う培養器について、具体的
に例をあげると、例えば中空系を用いたもの、不織布、
スポンジ、セラミックス等の多孔体、高分子製のマイク
ロカプセルやビーズを充填したカラムなどがある。培養
液処理器に使用する透析膜は平膜でも使用可能であるが
、決められた容積でより多くの膜面積が得られる中空系
がより有効である。透析膜に開いた細孔径は分画分子量
で１００．０００ダルトン以下、あるいは５０，０００
ダルトン以下がよい。望ましくは１０００ダルトン以上
３ｏ，ｏｏｏダルトン以下がよい。透析膜の膜面積は培
養器にて培養する細胞数や細１Ｂの種類によって決まり
、特に規定は不要である。

本発明によれば、■培養液の循環手段による培養中の細
胞に対する物理的悪影晋がない、■培養液処理器の中空
糸外空間への細胞あるいは細胞片の蓄積等による中空糸
の有効膜面積の減少による性能劣化がない、■処理能力
についても、培養器と培養液処理器とを直列につないた
場合《第１図》は、特開昭６２−１３０６８３とは根本
的に異なり、培養器を循環する培養液量は培養器中で成
育する全細胞にとって必要士分な量であり、培養器を循
環する培養液を培養液処理器にて処理することで、培養
液の処理量の不足はない。又、培養液処理器を培養器と
は異なる循環回路によって培養液溜から直接接続した場
合（第２図）は、処理する培養液量は全く自由に選択で
きるなど培養細胞に悪影ツ７を与えることなしに必要な
量の細胞液を処理できる。■タンク内に培養液処理器を
設置した場合のタンク内培養液流れ阻害による細１κへ
の悪影響は全くない、等特開昭６２−１３０６８３の持
つ問題点を全て解決できる。

さらに本発明の優れた点は、培養器と培養液処理器とを
直接接続して培養液を完全循環する場合、培養液処理器
での培養液の処理効率は特開昭６２−１３０６８３に比
べて溝かに高いことにある。これは特開昭６２−１３０
６８３では、全培養液が均質に攪拌された状態、即ち培
養液処理器にて処理された培養液もまた未処理の培養液
と均質に攪拌されてしまい、処理が進むにつれて、処理
すべきいわゆる劣化した培養液は希釈され処理効率は低
下してしまうのに対して、本発明では培養器にて劣化し
た培養液は、全培養液と攪拌すること無しに培養液処理
器にて処理できるからである。即ち、本法では培養器よ
り出た、老廃物濃度が高く、かつ消費された栄養素濃度
が低い培Ａ液を、全培−Ｎｔｉに対して希釈すること無
しに処理できる。これは、透析が透析膜で区切られた両
空間の液中の物質の濃度差にイΔ存するものであること
より、もっとも高い培養液の処理効率（透析効率）を培
養期間中にわたって維持できる、非常に優れた培養装置
及び方法である。更に驚くへきことに、培養器循種回路
内に培養液処理器を接続する場合（第１図）及び培養器
とは異なる循環回路に培養液処理器を接続する場合（第
２図）のいずれの場合にも、得られる総生産物の量は、
通常の培養法に比べて道かに高い。これは老廃物濃度を
より低濃度に、かつ栄養素濃度をより適当な濃度で連続
的に維持できることによる効果と考えられる。本発明は
コスト面での効果のみでなく生産量そのものを高められ
る、生産性の面でも優れた培養装置及び方法である。

以下に具体的例をあげてより詳しく説明する。

（実施例）（１）培養器及び培養液処理器細旭培養器としては，ポリエチレン製中空糸（細孔径０
．４μｍ）約１０００本をポリカーボネート製容器に内
蔵したもの（膜面積約０．１４ｍ２、中空糸外容積約１
０ｍｌ）を、培養液処理器には再生セルロース製中空糸
（カットオフ原子量３０．０００ダルドン）を内蔵する
、膜面積約０．５ｍ２の医療用透析器を用いた。

（２）システムシステム例を以下に述べる。使用する器具は必要に応じ
て定法に従ってオートクレープ滅菌又はエチレンオキサ
イドガス滅菌した。

■比較システム（第３図）培養器のみを用いた、通常の中空糸培養方法による。

■システム１（第１図）培五器（１）と培養液処理器（５）をシリコンチューブ
（内径４ｍｍ、外径７ｍｍ）を用いて直列に接続し、培
養液を循環した。培養液処理器の基礎培養液口（６）に
はシリコンチューブを介してノ，（礎培査液溜（９）を
接続した。この時、培養液用及びＪ，（礎培養液用のシ
リコンチューブの途中（：Ｆ０：れぞれ培養器及び培養
液処理器の各液の人［１側）には塩化ビニル製チューブ
（内径２ｍｍ、外径３　ｍ　ｍ　）を接続して、東京理
化器械社製ベリスタポンプ（４及び７）にて培五液また
はジ，（礎培養液を循環させた。この時培養液と基礎培
養液の流れは培養液処理器内で逆方向になるようにした
。

■システム２く第２図）培養器（１）と培養液処理器（５）とを火なる循環回路
によって別々に培養液（ｒｊ！　（　３）と接続し、そ
れそれシステム１と同様ベリスタポンプ（４及び８）に
て墳養液を循環した。培養液処理器の基礎培養液口（６
）と基礎培養液溜（９）とをシリコンチューブにて接続
した。基礎培養液の循環もシステム１と同様にベリスタ
ポンブ（７）にて行った。

（３）用いた細胞及び培養液、基礎培養液細胞：抗ヒト
ＩｇＧ千ノクローナル抗体産生マウス由来ハイブリドー
マ株（ＳＧ−１培養液＝１０％ウシ胎児血清、５０μｇ　／　ｍ　１カ
ナマイシンを含むＲＰＭＩ−１６４０培養液基礎培養液＝５０μｇ　／　ｍ　１カナマイシン、５ｍ
Ｍへベスを含むＲＰＭＩ−１６４０培養液（４）培養方法ＳＧ−１４　　２．５ｘｌＯ’細胞を培養器の細１胞添
加Ｄ（２）よりディスポーザブルシリンジを用いて添加
した。培養液の交換は、比較システムでは培養液中のグ
ルコース濃度をモニターして、必要に応じて実施した。

システム１及び２では３［１ごとに交換した。基礎培養
液の循環による透析は培養３口目より開始し、その後５
℃つつ３目毎に基礎培養液を交換した。この時の流速は
５ｍｌ／分で一定とした。

（５）モノクローナル抗体量の測定モノクローナル抗体の測定方法は、酵素免疫測定法によ
って行った。固相として９６穴マイクロプレート（日木
インターメッＦ製、モジュールプレートＦ−　１　６８
）．抗原としてシグマ社製精製ヒトＩｇＧ、２次抗体に
Ｍｉ　ｌｅｓ社製アルカリフォスファターセ標識抗マウ
スＩｇＧ抗体を使用し、定法に従って行った。又、標準
抗体としてＳＧ−１４を無血清培養液（富士レビオ社製
、ＨＢ１０ｌ）にて培養して得られた−ト清より、プロ
デインＡ（ファルマシア社製）充填力ラムにて＄１１製
したものを、２１１０　Ｅ”＝　１　４．　０として蛋
白量を求めて使用した。

（６）結果結果を第１表に示す。

最適な量と頻度で培養液の交換を行った比較システムと
比べて、より少ない培養液量、交換頻度のシステム１、
２ともに細ｊｎの増殖速度は同様であり、顕微鏡観察に
おいても細胞状態は良好であった。即ち本発明で栄養素
の供給．１１２びに老ｊ允物の除去が十分に行われてい
ることか明らかである。

この時培養液の使用量は基礎培養液に対する連続透析に
よって減少し、使用した血清のｈ［は比較システムに比
べ非掌に少なかった（１／４〜１／５）。一方培五液中
のモノクローナル抗体の濃度は比較システムに比べて道
かに高く（５〜７倍）、得られたモノクローナル抗体量
、即ち全生産量も多かった。

以上より本発明は、細胞の培養による生産において非常
に優れた装置及び方法であることが明らかである。

（発明の効果）本発明の培養装置及び方法は、細胞培養において血清成
分の使用量を低減し、生産物がより高い濃度で得られ、
４１つ生産性も高い優れた培養装置及び方法である。

【図面の簡単な説明】

第１図および第２図は、本発明の実施例を示すもので、
第１図はシステムｌ、第２図はシステム２の説明図であ
る。第３図は比較システムの説明図である。１．培養器　　　　　　　２．細胞添加口３．培養液溜
　　　　　　４．ボンブ５．培養液処理器　　　　６．基礎培養液口７，ボンブ
　　　　　　　８．ボンブ９．基礎培養液溜

Claims

【特許請求の範囲】

（１）内部に細胞を保持し、細胞の成育空間内に機械的
な培養液の均質化手段を持たない培養器に、培養液を循
環させつつ細胞を培養し、この循環培養液を透析膜を内
蔵する培養液処理器の第１の空間に循環し、一方、該透
析膜で第１の空間と隔てられた第２の空間には基礎培養
液を循環させることを特徴とする細胞の培養方法。
（２）内部に細胞を保持し、細胞の成育空間内に機械的
な培養液の均質化手段を持たない培養器と、培養液を貯
留する手段と、透析膜を内蔵する培養液処理器と、該透
析膜で隔てられた第１の空間に培養液を循環する手段と
、第１の空間とは異なる第２の空間に基礎培養液を循環
する手段と、該基礎培養液を貯留する手段とからなるこ
とを特徴とする細胞の培養装置。