TW201514305A - 製造單株抗體之改良方法 - Google Patents

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TW201514305A
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Sanjeev Kumar Mendiratta
Sanjay Bandyopadhyay
Sanjay Patel
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Cadila Healthcare Ltd
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Abstract

本發明提供一種用以取得大量具有所欲帶電變體輪廓(profile)的單株抗體之改良方法。該方法包括在適合的溫度下初步地培養哺乳動物細胞，及隨後降低溫度，及任意地在該所欲分子製造期間同時添加適合的胺基酸。本發明亦提供一種以該改良方法所製備之具有所欲聚醣輪廓的抗體。

Description

製造單株抗體之改良方法
本發明關於一種用以得到大量具有所欲之帶電變體輪廓(profile)的單株抗體之改良方法。在一具體實例中，該方法亦提供具有所欲之多醣類輪廓的抗體。該方法包括在適合的溫度下初步地培養哺乳動物細胞，及隨後降低溫度，及任意地在該所欲分子的製造期間同時添加適合的胺基酸。
蛋白質為大且複雜的分子。它們需要處於其天然構型以維持生物活性。此外，在高濃度下，溶液中的蛋白質分子在儲存期間易聚集或降解或隨時間受到某種改質。在一態樣中，本發明提供一種用以得到增加數量的所欲品質產物(較佳為單株抗體)之改良方法。由於單株抗體(mAb)具有結合至目標抗原的高度專一性、對目標抗原能引發免疫反應、及長期血清持久性，其已獲得顯著的關注為如同治療試劑。有許多關於抗腫瘤專一性抗原的單株抗體。可發現每一免疫球蛋白之一些獨特的特徵(例如電荷性及多醣 結構)對於作用的模式具有重要性及專一性。與許多其他蛋白質類似，單株抗體具有能最佳化靜電作用及調節其結構、穩定性、化學及生物特性的電荷異質性(heterogeneity)。在製造期間，各種形式的微異質性的發生是因為降解、改質或各種酵素過程。蛋白質降解的發生是因為化學不穩定性或物理不穩定性。化學不穩定性的結果主要是因為脫醯胺作用、消旋作用、水解作用、氧化作用、β脫去作用或雙硫化物交換(disulfide exchange)。化學不穩定性導致各種電荷變體的形成，且因此改變該生物分子的性質。諸如脫醯胺作用及唾液酸化(sialylation)的化學改質分別造成mAb上淨負電荷的增加，並造成pI值的下降。其它產生酸性變體的機制在先前技術中為已知。脫醯胺之同型異構物(isoform)容易降解與失去活性，且因此，其顯著地影響單株抗體蛋白質的活性及穩定性。
同樣地，在Fc區的N-糖化作用調節免疫球蛋白及其他含Fc分子的抗體作用器功能。Fc聚醣能含有數個不同類型會影響抗體功能的末端糖。該技術領域之人士已知末端半乳糖基化的功用。不同免疫球蛋白的半乳糖基化型態展現此種免疫球蛋白中的產物專一性可變性。重要的是注意末端半乳糖基化的變異會影響結合至抗原之抗體，且大幅影響該分子的CDC活性。另一方面，已知半乳糖基化的變化程度對於ADCC活性影響較小，然而，海藻糖基化(afucosylation)對於ADCC活性極為重要。
該技術中已知有數種單株抗體的製造方法。此種方法 包括維持滲透壓、添加鹽與減低溫度等。
US 5705364揭示用於控制存在於醣蛋白的寡糖側鏈上唾液酸的量之細胞培養方法，其藉由添加烷酸或其鹽至培養物於濃度約0.1mM至約20mM、維持該培養物的滲透壓為250至約600mOsm，並將培養物的溫度維持在介於約30℃及35℃的溫度。
US 5976833提供一種用於改良由動物細胞所製造之有用物質產率的方法。其揭示一種用於動物細胞培養以製造所欲物質的方法，包含以下步驟：(1)在動物細胞可生長的溫度下培養動物細胞，及(2)將該動物細胞培養在較低溫度下。
WO 2014035475揭示一種用於控制重組表現蛋白質的寡糖分佈的方法，其包含以酵母水解補充物及植物水解補充物補充用於該蛋白質之重組表現的細胞培養介質。其亦揭示一種藉由調節細胞培養介質中天冬醯胺酸的胺基酸濃度以控制抗體的寡醣分佈的方法；然而，本發明不包括補充此種水解物於培養介質中。
雖然用於製造單株抗體的不同方法具有可利用性，但仍需要建立一種用於製造單株抗體的細胞培養方法，其能一致地產生所欲等級之帶電變體及聚醣輪廓，而無任何批次與批次間的顯著變異。此種方法亦將有助於取得具有所欲電荷和/或聚醣輪廓的單株抗體蛋白質。本發明提供使用此種經修改細胞培養方法以製造單株抗體的改良方法。本發明之方法不包括添加鹽或維持適合的滲透壓之任一 者。本發明提供用於製造具有所欲聚醣及帶電變體輪廓之單株抗體的新穎方法。
發明概要
本發明提供一種使用經修改之細胞培養方法以取得大量具有所欲聚醣及帶電變體輪廓之單株抗體的改良方法。
在一態樣中，細胞培養方法的特徵為在細胞培養方法期間以一次性或逐步方式任一者將細胞培養製造條件維持在各種溫度下。
在另一態樣中，本發明提供一種用於製造單株抗體的改良方法，其藉由在生長期(growth phase)於初始較高的溫度下進行製造程序，且接著在中對數(mid-log)至後對數期(late-log phase)或靜止期之任一期間減低培養系統的溫度至第二較低溫度。
在另一態樣中，本發明提供一種用於製造單株抗體的改良方法，其藉由在中對數至後對數期或靜止期期間將適合的胺基酸供給至培養系統。
在其他態樣中，本發明在細胞培養方法期間將胺基酸以某種濃度及特定時距添加至細胞培養介質。
在一較佳具體實例中，該胺基酸係選自麩醯胺酸及天冬醯胺酸或彼等之組合。
在一較佳具體實例中，本發明提供一種改良之上游方法以取得大量具有所欲聚醣及帶電變體輪廓之單株抗體， 其藉由在生長期在初始較高溫度下進行該程序，且接著在中對數至後對數期期間或靜止期之任一者減低培養系統的溫度至低於該初始溫度的第二溫度，並同時將胺基酸供給至該培養介質。
在其他態樣中，本發明之胺基酸選自含有醯胺基和鹼性胺基酸，例如麩醯胺酸、天冬醯胺酸、組胺酸、離胺酸、精胺酸及彼等之組合。
在一較佳具體實例中，單株抗體係選自抗-HER抗體、抗-TNF抗體、抗-VEGF抗體及抗-CD20抗體。
在一更加具體實例中，單株抗體係選自曲妥珠單抗(trastuzumab)、帕妥珠單抗(pertuzumab)、英夫利昔單抗(infliximab)、阿達木單抗(adalimumab)、貝伐單抗(bevacizumab)、蘭尼單抗(ranibizumab)及利妥昔單抗(rituximab)。
本發明之詳細說明
在一具體實例中，本發明提供一種用於製造具有所欲帶電變體輪廓同時維持蛋白質的所欲聚醣輪廓之單株抗體的方法，其藉由在生長期於初始較高溫度下進行製造程序，且接著在中對數至後對數期期間或靜止期之任一者以一次性或逐步方式將培養系統的溫度至降低至較低溫度。
在其他的具體實例中，細胞培養方法的特徵為在細胞培養方法期間以一次性或逐步方式任一者將細胞培養製造條件維持於各種溫度下。
在另一個具體實例中，本發明提供一種用於製造大量具有所欲聚醣輪廓之單株抗體的方法，較佳地藉由供給合適的胺基酸，諸如含有醯胺基及/或鹼性胺基酸至培養系統。可在中對數期至靜止期期間的任一階段供給此種胺基酸。
在其他的具體實例中，本發明在細胞培養方法期間將胺基酸以某種濃度及特定時距添加至細胞培養介質。
在另外的具體實例中，本發明將胺基酸在細胞培養方法期間以至少兩種不同間距進行添加。
在一較佳具體實例中，本發明將胺基酸以每次低於20mM，較佳低於10mM，的濃度進行添加至細胞培養介質係。
在一較佳具體實例中，本發明提供大量具有所欲聚醣及帶電變體輪廓之單株抗體，其藉由在生長期在初始較高溫度下進行製造程序，且接著在中對數至後對數期期間或靜止期之任一者減低培養系統的溫度至第二較低溫度，並將胺基酸供給至該培養系統。
在其他態樣中，本發明之胺基酸係選自含有醯胺基和鹼性胺基酸，例如麩醯胺酸、天冬醯胺酸、組胺酸、離胺酸、精胺酸及彼等之組合。
通常，該培養系統之該初始較高溫度係維持在37℃。在中對數期至靜止期期間的任一階段，本發明之培養系統的溫度在特定的時距可以一次性或逐步方式任一者降低至30℃。本發明之方法提供大量具有所欲聚醣及帶電 變體輪廓之單株抗體。此外，該方法維持該單株抗體的所欲聚醣輪廓。
在一個具體實例中，本發明提供蛋白質(較佳為單株抗體)之所欲聚醣輪廓，其藉由在中對數期至靜止期期間之任一階段將諸如麩醯胺酸和/或天冬醯胺酸之合適的胺基酸供給至培養系統。胺基酸的添加量介於1至4mM，較佳介於2至3mM。發現本發明在製造期間將麩醯胺酸和/或天冬醯胺酸供給至細胞培養介質會以產物專一性方式增加單株抗體蛋白質結構中所欲聚醣部分(moiety)的形成。
在一較佳具體實例中，本發明提供大量具有所欲聚醣及帶電變體輪廓之單株抗體的製造，其藉由在生長期於初始較高溫度下，且接著在中對數至後對數期期間或靜止期減低培養系統的溫度至第二較低溫度，並藉由在該所欲蛋白質的製造期間添加合適的胺基酸(麩醯胺酸和/或天冬醯胺酸)以進行該方法。
在一個具體實例中，本發明提供一種用於製造具有所欲聚醣及帶電變體輪廓之抗體的方法，其將葡萄糖濃度維持在介於0.5g/L至8g/L，較佳為2g/L至4g/L，更佳為約2.5g/L。
在另一個具體實例中，本發明提供一種用於製造具有所欲聚醣及帶電變體輪廓之抗體的方法，其藉由使用選自碳酸氫鈉、碳酸鈉及HEPES緩衝液之適合緩衝液將製造期間之pH維持在介於pH6至pH7.5。
在其他具體實例中，本發明提供一種用於製造具有所欲聚醣及帶電變體輪廓之抗體的方法，其細胞產率係維持在不低於0.5g/L，較佳為1-4g/L。
在另外的具體實例中，本發明提供一種用於製造具有所欲聚醣及帶電變體輪廓之抗體的方法，其細胞存活率係維持在不低於30%，較佳為約80%，更佳為大於95%。
在更佳具體實例中，該單株抗體係選自曲妥珠單抗(trastuzumab)、帕妥珠單抗(pertuzumab)、英夫利昔單抗(infliximab)、阿達木單抗(adalimumab)、貝伐單抗(bevacizumab)、蘭尼單抗(ranibizumab)及利妥昔單抗(rituximab)。
定義：
˙聚醣-該術語聚醣是指多醣或寡醣。聚醣可為單糖殘基的均聚物或異聚物，且可為線型或分支型。聚醣可被用來指諸如醣蛋白、醣脂質或蛋白聚醣之複合糖體(glycoconjugate)的碳水化合物部分。
˙所欲聚醣輪廓-其可被定義為附著至蛋白質之對於蛋白質的生物活性是必要的各種聚醣分子的分佈型態。
˙中對數期-其被定義為在細胞群體指數增加期間在培養介質中細胞的生長期。將此時期以生長輪廓的一部分表示，當細胞群體的對數值相對於時間所繪製時，其顯示為直線片段，稱為對數期，且其中點被稱為中對數期。
˙後對數期-其被定義為在過渡至靜止期之前的後 對數期之細胞生長期。將此時期以生長輪廓的一部分表示，當細胞群體的對數值為相對於時間所繪製時，其顯示為直線片段，稱為對數期，且其末期被稱為後對數期。
˙靜止期-在培養介質中細胞對數期生長之後生長輪廓的平線區(plateau)，在此細胞群體維持恆定的時間稱為靜止期。新細胞產生與較老細胞死亡的速率相同。
˙帶電種類變體-其為最佳化靜電作用及調節蛋白質結構、穩定性、化學及生物特性之蛋白質的專一性。其在蛋白質與蛋白質間有所不同，此乃因為在蛋白質分子上帶電胺基酸的專一性分佈。
本發明所使用的分析性方法： 高壓離子交換層析法(HP-IEC)：藉由使用分析性HP-弱陽離子交換層析法分離經純化單株抗體(例如，阿達木單抗)之不同帶電變體。將該管柱於pH6.9之磷酸鈉緩衝液(移動相A)中平衡。以0.5mL/min在移動相A中以增加的鹽濃度(氯化鈉)進行該蛋白質之帶電種類變體的沖提。
毛細管電泳-雷射誘導螢光法(CE-LIF)：藉由PNG酶(PNGase)處理從該蛋白質分離之碳水化合物部分後藉由CE-LIF方法進行經純化單株抗體製備物(例如，阿達木單抗)的聚醣分析(醣化作用變體)。酵素處理之後，以APTS(8-胺基芘1,2,6-三磺酸鹽)標記該碳水化合物(聚醣)部分，且該衍生性聚醣接著藉由毛細管系統(塗佈N-CHO；50cm×50μm)基於流體動力大小進行分離。以對照於藉由具有激發波長488nm及發射波長520nm之LIF偵測器所 測得之經標示葡萄糖階標準(labeled glucose ladder standard)識別聚醣。
圖1：圖示藉由HP-IEC之經純化阿達木單抗蛋白質的帶電變體輪廓。
圖2：圖示藉由CE-LIF之經純化阿達木單抗蛋白質的聚醣輪廓。
本發明之單株抗體之製造方法的較佳方式藉由以下實例說明如下，該些實例不應被解釋為以任何方式限制發明的範圍：
實例1
藉由標準分子生物技術產生表現抗TNFα抗體阿達木單抗的哺乳動物細胞。將殖株進行限制性稀釋以得到衍生自同源群體的單一細胞。將該細胞以細胞銀行的形式冷凍保存並用於其他的培育。將細胞還原並以一系列的接種培育步驟增殖，並將其接種在含有合適的生長介質的生物反應器中。當需要時，在經控制之環境中藉由使用CO2氣體和/或碳酸氫鈉維持pH7.2±0.4以進行細胞培養。以空氣和/或氧氣之噴霧並藉由控制生物反應器中的攪拌速度將溶解之氧濃度維持在40±20%飽合度。將溫度控制在37℃。 生長介質含有以下成分：
使細胞在上述條件下生長兩天。從第3天起，開始並持續供給直到該批次結束。將以下介質成分供給至被視為一般供給之該細胞培養介質-
收穫培養介於13及18天之該批次。在將細胞澄清之後，將含有阿達木單抗的上清液重調整(recondition)以實質上符合下一個純化管柱平衡條件。將該所欲之蛋白質純化至符合要求的程度，並針對帶電種類變體及聚醣輪廓分別進行HP-IEC及CE-LIF分析，如表1及表2所示。此 處所例示之方法可以用於任何所欲抗體。
實例2 將溫度由37℃降低至35℃對於阿達木單抗的影響：
在30L生物反應器中進行實驗。除了培養系統之溫度條件，該生長條件與實例-1相同，包括共同供給介質及其他方法參數。將後對數期之該培養系統溫度由37℃減低至35℃。將阿達木單抗純化至符合要求的程度，並針對帶電種類變體及聚醣輪廓分別進行HP-IEC及CE-LIF分析，如表1及表2所示。
實例3 供給麩醯胺酸對於阿達木單抗的影響：
在30L生物反應器中進行實驗。除了供給麩醯胺酸胺基酸至該培養系統，該生長條件與實例-1相同，包括共同供給介質及其他方法參數。從細胞生長的中對數期開始供給2mM麩醯胺酸，並將其在特定間距持續供給直到製造結束。
將阿達木單抗純化至符合要求的程度，並針對帶電種類變體及聚醣輪廓分別進行HP-IEC及CE-LIF分析，如表1及表2所示。
實例4 降低溫度及供給麩醯胺酸對於阿達木單抗的影響：
在30L生物反應器中進行實驗。除了溫度條件及供給麩醯胺酸至培養系統，該生長條件與實例-1相同，包括共同供給介質及其他方法參數。將中對數期之培養系統溫度由37℃降低至35℃，之後將對數期至靜止期之過渡期間之培養系統溫度進一步降低至33℃。從該中對數期開始供給3mM麩醯胺酸，並將其在特定間距持續供給直到該所欲單株抗體製造結束。
將阿達木單抗純化至符合要求的程度，並針對帶電種類變體及聚醣輪廓分別進行HP-IEC及CE-LIF分析，如表1及表2所示。
實例5 在37℃之溫度下培養而不供給麩醯胺酸對於曲妥珠單抗的影響：
在生物反應器中進行實驗。除了溫度條件及供給麩醯胺酸至培養系統，該生長條件與實例-1相同，包括共同供給介質及其他方法參數。將整個批次期間之培養系統溫度維持在37℃。除了起始批次介質中的麩醯胺酸，無另外供給麩醯胺酸。
將曲妥珠單抗純化至符合要求的程度，並針對帶電種類變體及聚醣輪廓分別進行HP-IEC及CE-LIF分析，如表1及表2所示。
實例6 將溫度由37℃降低至33℃對於於曲妥珠單抗的影響：
在生物反應器中進行實驗。除了溫度條件及供給麩醯胺酸至培養系統，該生長條件與實例-1相同，包括共同供給介質及其他方法參數。將從對數期至靜止期的過渡期間之該培養系統溫度由37℃降低至33℃。從該中對數期開始供給2mM麩醯胺酸，並將其以特定間距持續供給直到該所欲單株抗體製造結束。
將曲妥珠單抗純化至符合要求的程度，並針對帶電種類變體及聚醣輪廓分別進行HP-IEC及CE-LIF分析，如表1及表2所示。
實例7 將溫度由37℃降低至35℃而不供給麩醯胺酸對於貝伐單抗的影響：
在30L生物反應器(培養瓶(culti-flask))中進行實驗。除了溫度條件及供給麩醯胺酸至培養系統，該生長條件與實例-1相同，包括共同供給介質及其他方法參數。將從對數期至靜止期之過渡期間之培養系統溫度由37℃降低至35℃。除了起始批次介質中的麩醯胺酸，無另外供給麩醯胺酸。
將貝伐單抗純化至符合要求的程度，並針對帶電種類變體及聚醣輪廓分別進行HP-IEC及CE-LIF分析，如表1及表2所示。
實例8 將批次全程於37℃下培養及供給麩醯胺酸對於貝伐單抗的影響：
在生物反應器中進行實驗。除了溫度條件及供給麩醯胺酸至培養系統，該生長條件與實例-1相同，包括共同供給介質及其他方法參數。將整個批次期間之培養系統溫度維持在37℃。從該中對數期開始供給4mM麩醯胺酸，並將其以特定間距持續供給到該所欲單株抗體製造結束。
將貝伐單抗純化至符合要求的程度，並針對帶電種類變體及聚醣輪廓分別進行HP-IEC及CE-LIF分析，如表1及表2所示。
實例9 將批次全程於37℃下培養而無供給麩醯胺酸對於利妥昔單抗的影響：
在生物反應器中進行實驗。除了溫度條件及供給麩醯胺酸至培養系統，該生長條件與實例-1相同，包括共同供給介質及其他方法參數。將整個批次期間之培養系統溫度維持在37℃。除了起始批次介質中的麩醯胺酸，無另外供給麩醯胺酸。
將利妥昔單抗純化至符合要求的程度，並針對帶電種類變體及聚醣輪廓分別進行HP-IEC及CE-LIF分析，如表1及表2所示。
實例10 將批次全程於37℃下培養及供給麩醯胺酸對於利妥昔單抗的影響：
在生物反應器中進行實驗。除了溫度條件及供給麩醯胺酸至培養系統，該生長條件與實例-1相同，包括共同供給介質及其他方法參數。將整個批次期間之培養系統溫度維持在37℃。從該中對數期開始供給4mM麩醯胺酸，並將其以特定間距持續供給直到該所欲單株抗體製造結束。
將利妥昔單抗純化至符合要求的程度，並針對帶電種類變體及聚醣輪廓分別進行HP-IEC及CE-LIF分析，如表1及表2所示。
實例11 將批次全程於37℃下培養及供給麩醯胺酸對於曲妥珠單抗的影響：
在30L生物反應器(200L生物反應器)中進行實驗。除了溫度條件及供給麩醯胺酸至培養系統，該生長條件與實例-1相同，包括共同供給介質及其他方法參數。將整個批次期間之培養系統溫度維持在37℃。從該中對數期開始供給2mM麩醯胺酸，且將其以特定間距持續供給直到該所欲單株抗體製造結束。
將曲妥珠單抗純化至符合要求的程度，並針對帶電種類變體及聚醣輪廓分別進行HP-IEC及CE-LIF分析，如表1及表2所示。
實例12 將溫度由37℃降低至35℃而不供給麩醯胺酸對於曲妥珠單抗的影響：
在30L生物反應器(培養瓶)中進行實驗。除了溫度條件及供給麩醯胺酸至培養系統，該生長條件與實例-1相同，包括共同供給介質及其他方法參數。將從對數期至靜止期之過渡期間之培養系統溫度由37℃降低至35℃。除了起始批次介質中的麩醯胺酸，無另外供給麩醯胺酸。
將曲妥珠單抗純化至符合要求的程度，並針對帶電種類變體及聚醣輪廓分別進行HP-IEC及CE-LIF分析，如表1及表2所示。
結果
隨後將該所得產物藉由該領域中已知的技術進行純化及適當地調配。

Claims (15)

  1. 一種使用經修改之細胞培養方法以製造具有所需聚醣和/或電荷種類變體輪廓(profile)的抗體之方法，其中該方法包含：a)將細胞培養條件在某間距維持在合適的溫度條件；b)在方法期間在某間距同時或依序添加特定胺基酸至該培養介質。
  2. 如請求項1之方法，其中細胞培養方法之特徵為在細胞培養方法期間將細胞培養製造條件以固定的溫度或以逐步方式降低溫度任一者維持在合適的溫度。
  3. 如請求項2之方法，其中合適的溫度條件包括在第一溫度條件下細胞生長至中對數期(mid-log phase)，接著在第二及任意地第三溫度條件下維持該細胞培養條件直到方法結束。
  4. 如請求項3之方法，其中將該第一溫度條件維持在高於該第二及任意地該第三溫度條件的溫度。
  5. 如請求項2~4項中任一項之方法，其中該第一溫度條件為約37℃，且該第二及任意地該第三溫度條件介於35℃至30℃。
  6. 如請求項1之方法，其中在細胞培養方法期間將該胺基酸以某濃度及特定時距添加至該細胞培養介質。
  7. 如請求項6之方法，其中在細胞培養方法期間將胺基酸以至少兩個不同的間距進行添加。
  8. 如請求項1之方法，其中將胺基酸以每次低於10mM的濃度進行添加至該細胞培養介質。
  9. 如請求項1之方法，其中該胺基酸係選自含有醯胺基及鹼性胺基酸，例如麩醯胺酸、天冬醯胺酸、組胺酸、離胺酸、精胺酸及彼等之組合。
  10. 如請求項1~4及6~9項中任一項之方法，其中將葡萄糖濃度維持在介於0.5g/L至8g/L，較佳為2g/L至4g/L。
  11. 如請求項1~4及6~9項中任一項之方法，其中藉由使用選自碳酸氫鈉、碳酸鈉及HEPES緩衝液之適合緩衝液將pH係維持在介於pH 6至pH 7.5。
  12. 如請求項1~4及6~9項中任一項之方法，其中細胞產率係不低於0.5g/L，較佳為1-4g/L。
  13. 如請求項1~4及6~9項中任一項之方法，其中細胞存活率係維持在不低於30%，較佳為約80%，更佳為大於95%。
  14. 如請求項1~4及6~9項中任一項之方法，其中抗體係選自抗-HER抗體、抗-TNF抗體、抗-VEGF抗體及抗-CD20抗體。
  15. 如請求項1~4及6~9項中任一項之方法，其中抗體係選自曲妥珠單抗(trastuzumab)、帕妥珠單抗(pertuzumab)、英夫利昔單抗(infliximab)、阿達木單抗(adalimumab)、貝伐單抗(bevacizumab)、蘭尼單抗(ranibizumab)及利妥昔單抗(rituximab)。
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