JPH11507523A - 哺乳類細胞培養によって生産されるタンパク質のシアリル化を制御する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、細胞培養環境を操作することによって生産される糖タンパク質のシアル酸含量を広範囲にわたって制御する、哺乳類細胞培養による糖タンパク質の新規製造法に関する。本発明は、細胞比生産能に影響を及ぼす細胞培養パラメーターを変化させることによって糖タンパク質のシアル酸含量を変更する方法を規定する。本発明の好ましい態様には、その細胞培養の生産相で細胞培養の重量オスモル濃度と転写エンハンサーの濃度を制御する細胞培養法が含まれる。さらに本発明は、可溶性1型腫瘍壊死因子免疫グロブリンG1の新規製剤と炎症性疾患又は免疫関連疾患の処置におけるそれらの使用をも規定する。

Description

【発明の詳細な説明】 哺乳類細胞培養によって生産されるタンパク質のシアリル化を制御する方法 発明の分野 本発明は、哺乳類細胞培養中で生産される糖タンパク質のシアル酸含量を制御 する方法に関する。本発明は、哺乳類細胞培養によって生産される糖タンパク質 のシアル酸含量を増大及び減少させる方法を提供する。また本発明は、腫瘍壊死 因子受容体（TNFR）-免疫グロブリン（Ig）キメラの生産法及び新規TNFR-IgG₁製 剤並びに種々の炎症性疾患及び免疫障害の診断及び処置におけるそれらの使用に 関する。 関連技術の説明 組換え生産された糖タンパク質のグリコシル化パターンの相違は、最近、有望 な予防薬及び治療薬として生産された組換えタンパク質が臨床段階に近づくにつ れて、科学界で多くの注目を集めている。糖タンパク質のオリゴ糖側鎖は、その タンパク質の機能（Wittwer A.及びHoward，S.C．（1990）Biochem．29:4175-41 80）と、糖タンパク質の部分間の分子内相互作用（これはその糖タンパク質の配 座（コンフォメーション）と提示される3次元表面に帰着する）（Hart（1992）C urr．Op．Cell Biol.，4:1017-1023; Goocheeら(1991)Bio/Technology，9:1347- 1355; Parech，R.B．（1991）Curr．Op．Struct．Biol.，1:750-754）に影響を 及ぼす。オリゴ糖は、与えられたポリペプチドを、特異的細胞炭水化物受容体に 基づいて、一定の構造に誘導する機能をも果たしうる（Bevilacqua，M.P.及びNe lson，R.M．（1993）J．Clin．Invest．91:379-387; Nelson，R.M.ら(1993)J．C lin．Invest．91:1157-1166，Norgard，K.E.ら(1993)Proc．Natl．Acad．Sci．U SA 90:1068-1072; Imai，Y.ら(1993)Nature 361:555-557）。糖タンパク質グリ コ糖側鎖の末端シアル酸成分は、吸収性、血清半減期及び血清からのクリアラン ス並びにその糖タンパク質の物理的、化学的特性と免疫原性に影響を与える（Pa rekh，R.B.,上記; Varki，A．（1993）Glycobiology 3:97-100; Paulson，J．（ 1989）TIBS 14:272-276; Goocheeら(1991)Biotechnology 9:1347-1355; Kobata ， A．（1992）Eur．J．Biochem．209:483-501）。したがって、糖タンパク質、特 に治療薬としての使用が意図される糖タンパク質のシアル酸含量を維持すること は重要である。 組換えタンパク質生産中のグリコシル化に影響を及ぼす因子、例えば生育法（ 付着又は懸濁）、培地処方中のウシ胎児血清、培養密度、酸素供給、pH、精製法 などには、多くの注意が払われてきた（Werner，R.及びNoe，W．（1993）Drug R es．43:1134-1249; Hayterら(1992)Biotech．and Bioeng．39:327-335; Borysら (1994)Biotech and Bioeng．43:505-514; Borysら(1993)Bio/technology 11:720 -724; Hearingら(1989)J．Cell Biol．108:339-353; Goocheeら，Frontiers in Bioprocessing II（Toddら編，1992，アメリカ化学会）の199〜240頁; 米国特許 第5,096,816号；chotigeat，W．（1994）Cytotech．15:217-221）。いくつかの グループが、組換えタンパク質の生産を取り巻くプロセスパラメーター、特に組 換えタンパク質の生産における培地組成の効果を研究している（Parkら(1992)Bi otech．Bioeng．40:686-696; Cox及びMcClure（1983）In Vitro 19:1-6; Mizuta niら(1992)Biochem．Biophys．Res．Comm．１87:664-669; LeGrosら（1985）Lym ph．Res．4(3):221-227）。 酪酸のようなアルカン酸の添加は、組換え細胞培養における外来DNAの一時的 発現をもたらすことが知られている（Prasad及びSinha（1976）In Vitro．12:12 5-132; 日本国特許出願番号62-48935; 日本国特許出願番号55-150440; Klehrら( 1992)Biochem．31:3222-3229; Gorman及びHoward（1983）Nucleic acid Res．11 :7631-7648）。しかし酪酸ナトリウムは、種々の細胞系及び培地組成における遺 伝子発現（D'Annaら(1980)Biochem．19:2656-2671; Hagopian，H.K．（1977）Ce 11 12:855-860）とタンパク質生産(Mi1haud（1980）J．Cell Physiol 104:163-1 70; 英国特許出願番号GB 2 122 207 A)に対して、ある範囲の効果を持ち、酪酸 が遺伝子発現を修正（Yuanら（1985）J．Biol．Chem．3778-3783）又は一定の遺 伝子の発現を阻害（Yuanら,上記）しうることが示唆される。 欧州特許番号0 239 292 B1は、アルカン酸又はその塩（酪酸など）の存在下に タンパク質の生産量を増大させる方法を記述している。しかしこの刊行物は添加 物の適切な濃度を選択する際の指標をほとんど記述していないし、タンパク質グ リコシル化に対する添加物の効果にも触れていない。また他の文献には、細胞比 生産能（cell specific productivity）を増大させるために低レベル（0〜1.5mM ）の酪酸ナトリウムを細胞培養生産培地に添加すると、それに付随して、生産さ れた組換えタンパク質の酸性糖型（glycoform）の増大（シアル酸含量の増大に 相当する）が起こることが記述されている（Chotigeatら(1994)Cytotech．15:21 7-221）。 いくつかのグループが、細胞増殖とポリペプチド生産に対する重量オスモル濃 度の効果を調べている（Ozturk及びPallsson（1991）Biotech．and Bioeng．37: 989-993; Stubblefieldら(1960)Cancer Research．20:1646-1655; Garcia-Perez ら(1989)Journal of Biological Chemistry 264(28)16815-16821; Minerら(1981 )Invasion Metastasis 1:158-174; GB 2,251,249; EP 481,791; 米国特許番号5, 151,359; 米国特許番号4,724,206; 米国特許番号5,122,469及びWO 89/04867）。 細胞増殖又はポリペプチド生産については、種々の重量オスモル濃度範囲が提案 されている。一般に、細胞培養培地の重量オスモル濃度の増大はNacl又はアミノ 酸の添加によって行われる。塩濃度の増大などといった環境圧は、細胞産物生産 量を増大させることがある。哺乳類細胞培養における哺乳類タンパク質産物の発 現量の増大は、溶質圧（例えば培養培地に対する塩、乳酸、アンモニアの添加） によって達成できるという概念が報告されている（国際公開番号WO 89/04867） 。これらの圧力（ストレス）は一般に増殖阻害的であるが、細胞比生産能には有 利である。 組換え細胞培養における細胞増殖及び/又はポリペプチド生産に対するグルコ ース濃度の効果も議論されている。例えば、Parkら(1992)Biotechnology and Bi oengineering，40:686-696; Huangら(1991)Journal of Biotechnology，18:161- 162; EP387,840; Reuvenyら(1986)Journal of Immunological Methods 86:53-59 ; Fineら(1976)In Vitro 12(10):693-701; Dircksら(1987)Exp．Eye Res．44:95 1-958; Mizutaniら(1992)Biochemical and Biophysical Research Communicatio ns 187(2):664-669; Sugiura（1992）Biotechnology and Bioengineerin g 39:953-959; WO 88/01643; Grafら(1989)DECHEMA Biotechnol．Conf．3:615-6 18; 日本国特許出願番号JP 1-101882; 米国特許番号3,926,723; WO 87/00195; F leischaker，Jr．マサチューセッツ工科大学博士論文196-229頁(1982年6月)を参 照のこと。しかし、過去の研究では、成熟タンパク質のシアル酸含量（糖タンパ ク質生産において臨床的成功に直結する因子）に対する種々のプロセスパラメー ターの効果は研究されていなかった。 本発明は、哺乳類細胞培養によって生産される糖タンパク質のシアル酸の含量 を制御する方法を提供する。 発明の概要 本発明者らは、一定の哺乳類細胞培養プロセスパラメーターが、細胞比生産能 と生産されるタンパク質のグリコシル化の程度及びタイプに影響を及ぼすことを 発見した。より具体的に述べると、本発明者らは、細胞比生産能を増大させる一 定の因子が、生産されるタンパク質のシアル酸含量に対して逆の効果を持つこと を発見した。そこで本発明者らは、哺乳類細胞培養中で生産される糖タンパク質 の特定の糖型を濃縮するために、種々の細胞培養法を発明した。 したがって本発明は、哺乳類細胞培養によって生産される糖タンパク質のシア ル酸含量を制御する方法を規定する。本発明のこの側面によれば、細胞培養の生 産相における糖タンパク質の生産速度を変化させると、成熟タンパク質のシアル 酸含量が変化する。より具体的に述べると、糖タンパク質生産相中の細胞比生産 能の増大は、成熟タンパク質のシアル酸含量の減少をもたらす。逆に、細胞比生 産能の減少は、成熟タンパク質中のシアル酸含量の増大をもたらす。 本発明は、その一態様として、細胞比生産能に影響を及ぼす因子を制御するこ とによって、哺乳類細胞培養のタンパク質生産相中の哺乳類宿主細胞の細胞比生 産能を変化させる方法を規定する。本発明の一側面として、DNA転写を増大させ る因子の濃度を制御する。もう1つの態様として、細胞培養の重量オスモル濃度 を一定の範囲内に維持することによって、細胞比生産能を制御する。本発明では 、上述のパラメーターを単独で、もしくは組み合わせて制御することにより、成 熟糖タンパク質シアル酸含量に影響を与える。本発明の一態様では、DNA転写を 増 大させる因子が、アルカン酸又はその塩、例えば約0.1mM〜約20mM濃度の酪酸ナ トリウムである。本発明の第2の側面では、細胞培養の重量オスモル濃度を約250 〜600mOsmに維持する。さらなる側面として、細胞培養の温度を約30℃〜37℃に 制御する。 好ましい態様として、本発明は、哺乳類細胞培養によって生産される成熟糖タ ンパク質のシアル酸含量を増大させる方法であって、上述のプロセスパラメータ ーのいずれか又は全てを（任意に当技術分野で知られる他のパラメーターと共に ）制御することによって、細胞比生産能を低く維持することからなる方法を規定 する。本発明のこの側面では、約0.1mM〜約6mMのアルカン酸（又はその塩）濃度 で宿主細胞を培養し、任意に細胞培養の重量オスモル濃度を約300〜450mOsmに維 持することにより、シアル酸含量が増大したタンパク質を生産する。 もう1つの好ましい態様として、本発明は、哺乳類細胞培養によって生産され る成熟糖タンパク質のシアル酸含量を減少させる方法であって、その細胞培養の 細胞比生産能を増大させることからなる方法を規定する。好ましい態様として、 約6mM〜約12mMのアルカン酸（又はその塩）濃度で宿主細胞を培養すること、及 び細胞培養の重量オスモル濃度を約450〜600mOsmに維持することのいずれかから なる細胞培養法を提供することによって、細胞培養細胞比生産能を増大させる。 さらに本発明は、その一態様として、3つの細胞培養相を持つ細胞培養法を規 定する。つまり、本発明は、哺乳類細胞培養によって生産される糖タンパク質の シアル酸含量を制御する方法であって、タンパク質を発現させる宿主細胞を増殖 相で、細胞増殖が最大となる条件下に、細胞増殖が最大となる期間、培養する段 階を含む方法を提供する。本発明のこの側面では、その増殖相の後に、遷移相（ transition phase）が続く。この遷移相では、所望の成熟糖タンパク質シアル酸 含量に合った細胞培養パラメーターを選択し、それを確保する。この遷移相の後 には細胞培養の生産相が続く。この生産相では、遷移相で選択したパラメーター を維持し、糖タンパク質産物を生産、収集する。細胞培養に約0.1mM〜約20mM濃 度のアルカン酸又はその塩を添加すること、及び細胞培養の重量オスモル濃度を 約250〜600mOsmに維持すること（任意に遷移相中にそれらを互いに組み合わせる こと）によって、細胞培養の生産相の細胞比生産能を変化させると、シアル酸量 の異なるタンパク質が生産される。 もう1つの好ましい態様として、本発明は可溶性1型腫瘍壊死因子受容体（TNFR 1）-免疫グロブリンG₁（IgG₁）キメラタンパク質中に存在するシアル酸の量を制 御する方法を提供する。本発明者らは、一定の生産条件下に、有意な機能的活性 を維持しつつも血液からのクリアランスが延期されるという望ましい特性を示す 新規TNFR1-IgG₁糖型製剤が得られることを発見した。長い機能的半減期は、簡略 化したボーラス投与を可能にし、生成した糖タンパク質の生体内効力に寄与して 、低容量の糖タンパク質剤形を可能にする。 本発明のこの側面では、シアル酸残基含量が多いTNFR1-IgG₁糖タンパク質分子 を生産する。TNFR1-IgG₁の生産相に関する細胞培養パラメーターを、所望のシア ル酸含量が得られるように選択する。好ましい態様として、生産相の酪酸ナトリ ウム濃度を約0.1〜約6mMとし、重量オスモル濃度を約300〜450mOsmに維持する。 より好ましい側面として、酪酸ナトリウム濃度を約1mMにし、重量オスモル濃度 を約350〜400mOsmに維持する。 もう1つの態様として、本発明は、本発明の方法によって生産されるTNFR1-IgG₁ 糖タンパク質の製剤を規定する。本発明のこの側面によれば、約5.5〜7.5のpI 範囲を持つTNFR1-IgG₁含有製剤が提供される。また、タンパク質に対するシアル 酸のモル比が約4〜約7（とりわけ約5〜約6）のTNFR1-IgG₁製剤が提供される。さ らなる側面として、本TNFR1-IgG₁製剤は、タンパク質1モルにつき約1〜約2モル の露出したN-アセチルグルコサミンを持つ。さらなる側面として、この製剤では 、N-アセチルグルコサミンに対するシアル酸のモル比が約0.35〜約0.5（より好 ましくは約0.4〜約0.45）である。 本発明は、TNF介在性病状の処置に有用な上記製剤を含む治療用組成物をも提 供する。 図面の説明 図1A及び図1B：図1Aと図1Bは、代表的細胞培養法の生産相における比生産能を 計算するために使用した方法を示す。比生産能は、図1Aに示すように生存可能細 胞数（生存可能細胞・日数）の関数として、あるいは図1Bに示すようにパック細 胞容積（PCV）の関数として表わすことができる。比生産速度には90%の信頼区間 が与えられる。 図2A及び図2B：図2Aと図2Bは、生産相における生存可能細胞・日数（図2A）及 びパック細胞容量（PCV）（図2B）に基づく比生産能と収集した産物のシアル酸 （NANA）含量の間の相関関係を示す。9種類の方法（A〜I）に関する値を示す。 データ点は表Iに記載の独立した生産法を表わす。 発明の詳細な説明 Ｉ．定義 本発明の炭水化物成分は、オリゴ糖類の説明に一般的に使用される命名法を使 って記述することにする。この命名法を使用した炭水化物化学に関する総説は、 Hubbard及びIvatt（1981）Ann．Rev．Biochem．50:555-583に認められる。この 命名法には、例えば、マンノースを表わすMan；2-N-アセチルグルコサミンを表 わすGlcNAc；ガラクトースを表わすGla；及びグルコールを表わすGlcなどが含ま れる。シアル酸は、5-N-アセチルノイラミン酸については略号NeuNAcを、5-グリ コリルノイラミン酸についてはNeuNGcを使って記述する（J．Biol．Chem．1982 ，257:3347; J．Biol．Chem．1982，257:3352）。 「重量オスモル濃度」は、水溶液中の溶解溶質粒子の浸透圧の測定単位である 。溶質粒子には、イオンと非イオン化分子の両方が含まれる。重量オスモル濃度 は、溶液1kgに溶解している浸透活性粒子の濃度（すなわちオスモル）として表 される（38℃における1mOsm/kg H₂Oは19mmHgの浸透圧に等しい）。これに対し、 「容量オスモル濃度」は、溶液1リットル中に溶解している溶質粒子の数を意味 する。本明細書で使用する場合、「mOsm」という略号は、「ミリオスモル/kg溶 液」を意味する。 本明細書で使用する「糖タンパク質」という用語は、一般に、約10個以上のア ミノ酸と少なくとも1つのオリゴ糖側鎖を持つペプチド及びタンパク質を意味す る。糖タンパク質は宿主細胞と同種であってもよいが、例えばチャイニーズハム スター卵巣細胞によって生産されるヒトタンパク質のように、使用される宿主細 胞に対して異種（すなわち外来）であることが好ましい。哺乳類糖タンパク質（ 元々、哺乳類生物に由来する糖タンパク質）を使用することが好ましく、なかで も培地中に直接分泌されるものを使用することがより好ましい。哺乳類糖タンパ ク質の例としては、サイトカインやその受容体などの分子、及びサイトカイン又 はその受容体を含むキメラタンパク質が挙げられ、例えば次に挙げるものが含ま れる：腫瘍壊死因子アルファ及びベータ、それらの受容体（TNFR-1; EP 417,563 （1991年3月20日公開）及びTNFR-2; EP 417,014（1991年3月20日公開））及びそ れらの誘導体；レニン；成長ホルモン（ヒト成長ホルモン及びウシ成長ホルモン を含む）；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リ ポタンパク質；アルファ-1-アンチトリプシン；インスリンA鎖；インスリンB鎖 ；プロインスリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グル カゴン；因子VIIIC、因子IX、組識因子及びフォン・ウィレブラント因子などの凝 固因子；プロテインCなどの抗凝固因子；心房性ナトリウム利尿因子；肺界面活 性剤；ウロキナーゼ又はヒト尿又は組識型プラスミノーゲン活性化因子（t-PA） などのプラスミノーゲン活性化因子；ボンベシン；トロンビン；造血増殖因子； エンケファリナーゼ；RANTES（regulated on normally T-cell expressed and s ecreted）；ヒトマクロファージ炎症性タンパク質（MIP-1-アルファ）；ヒトア ルブミンなどの血清アルブミン；ミュラー阻害物質（mullerian-inhibiting sub stance）；リラキシンA鎖；リラキシンB鎖；プロリラキシン；マウス性腺刺激ホ ルモン関連ペプチド；ベーターラクタマーゼなどの微生物タンパク質；DNase； インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子（VEGF）；ホルモン又は増殖因子の 受容体；インテグリン；プロテインA又はD；リウマチ因子；牛由来神経親和性因 子（BDNF）、ニューロトロフィン-3、-4、-5又は-6（NT-3、NT-4、NT-5又はNT-6 ）などの神経親和性因子又はNGF-βなどの神経成長因子；血小板由来増殖因子（ PDGF）；aFGFやbFGFなどの繊維芽細胞増殖因子；表皮増殖因子（EGF）；TGF-ア ルファやTGF-ベータなどのトランスフォーミング増殖因子（TGF）（TGF-β1、TG F-β2、TGF-β3、TGF-β4又はTGF-β5を含む）；インスリン様増殖因子-I及び-I I（IGF-I及びIGF-II）；des(1-3)-IGF-I（脳IGF-I）、インスリン様増殖因子結 合タンパ ク質；CD-3、CD-4、CD-8及びCD-19などのCDタンパク質；赤血球生成促進因子； 骨誘導因子；イムノトキシン；骨形態形成タンパク質（BMP）；インターフェロ ン-アルファ、-ベータ及び-ガンマなどのインターフェロン；コロニー刺激因子 （CSF）（例えばM-CSF、GM-CSF及びG-CSF）；インターロイキン（IL）（例えばI L-1〜IL-10）；スーパーオキシドジスムターゼ；T細胞受容体；表面膜タンパク 質；崩壊加速因子；例えばAIDSエンベロープの一部などといったウイルス抗原； 輸送タンパク質；誘導受容体（homing receptor）；アドレッシン；調節タンパ ク質；抗体；イムノアドヘシンなどのキメラタンパク質、及び任意の上記ポリペ プチドの断片。 「細胞培養培地」及び「培養培地」という用語は、一般に次に挙げるカテゴリ ーの1又はそれ以上に属する少なくとも1成分を提供する哺乳類細胞増殖用の栄養 溶液を指す： 1）エネルギー源（通常はグルコースなどの炭水化物の形態） 2）すべての必須アミノ酸（通常は２０アミノ酸の基本セットとシステイン） 3）ビタミン類及び/又は低濃度に必要とされる他の有機化合物 4）遊離脂肪酸 5）微量元素（微量元素とは、一般に極めて低濃度（通常μM域）に要求される 無機化合物又は天然に認められる元素をいう）。 栄養溶液には、任意に次に挙げるカテゴリーのいずれかに属する1又はそれ以 上の成分を補足してもよい： 1）ホルモンその他の増殖因子（例えばインスリン、トランスフェリン、表皮 増殖因子など） 2）塩類及び緩衝剤（例えばカルシウム、マグネシウム、リン酸塩など） 3）ヌクレオシド及び塩基（例えばアデノシン、チミジン、ヒポキサンチンな ど） 4）タンパク質及び組識加水分解物。 「哺乳類宿主細胞」、「宿主細胞」、「哺乳類細胞」などの用語は、哺乳類に 由来する細胞系であって、適当な栄養素及び増殖因子を含む培地中で単層培養又 は懸濁培養した時に、増殖及び生存できるものを意味する。特定の細胞系に必須 の増殖因子は、例えばMammalian Cell Culture（Mather，J.P.編，Plenum Press ，N.Y.[1984]）やBarnes及びSato（1980）Cell 22:649などに記述されているよ うに、過度な実験を行なわなくても、経験的に容易に決定される。一般に、これ らの細胞は、目的の糖タンパク質を大量に発現させ、培養培地中にそれらを分泌 させることができる。本発明との関連で好適な哺乳類宿主細胞の例としては、次 の細胞を挙げることができる：チャイニーズハムスター卵巣細胞/-DHFR（CHO；U rlaub及びChasin，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，77:4216[1980]）；dp12.CHO細 胞（EP 307,247; 1989年3月15日公開）；SV40で形質転換されたサル腎臓CV1系（ COS-7，ATCC CRL 1651）；ヒト胚腎臓系（293細胞又は懸濁培養で増殖するよう にサブクローニングされた293細胞，Grahamら，J．Gen Virol．36:59[1977]）； ベビーハムスター腎臓細胞（BHK，ATCC CCL 10）；マウスセルトリ細胞（TM4，M ather，Biol．Reprod．23: 243-251[1980]）；サル腎臓細胞（CV1 ATCC CCL70） ；アフリカミドリザル腎臓細胞（VERO-76，ATCC CRL-1587）；ヒト子宮勁癌細胞 （HELA，ATCC CCL 2）；イヌ腎臓細胞（MDCK，ATCC CCL 34）；バッファローラ ット肝臓細胞（BRL 3A，ATCC CRL 1442）；ヒト肺細胞（W138，ATCC CCL 75）； ヒト肝臓細胞（Hep G2，HB8065）；マウス乳腫瘍（MMT 060562，ATCC CCL51）； TRI細胞（Matherら，Annals N.Y．Acad．Sci．383:44-68[1982]）；MRC 5細胞； FS4細胞；ヒト肝癌系（Hep G2）。 好ましい宿主細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞/-DHFR（CHO；U rlaub及びChasin，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，77:4216[1980]）；dp12.CHO細 胞（EP 307,247；1989年3月15日公開）が挙げられる。 本発明に関して「ペプトン」という用語は、本質的に加水分解された動物タン パク質である培地捕捉剤を指す。このタンパク質の供給源は屠殺場からでる動物 副産物であってもよいし、精製ゼラチン又は植物材料であってもよい。このタン パク質は一般に酸、加熱又は種々の酵素製剤を用いて加水分解される。好ましい ペプトン混合物の例は「Primatone RL」と「Primatone HS」であり、これらは共 に市販されている（英国シェフィールド）。 本明細書では、「細胞比生産能」、「細胞比速度」などの用語を使って、比（ すなわち、細胞あたり又は細胞質量もしくは細胞体積の測定単位あたりの）生成 物発現速度を表わす。細胞比生産能は、例えば1日あたり1細胞あたりに生産され るタンパク質のグラム数などといった単位で測定される。細胞比生産能は、次の 積a分法に従って測定すると便利である： dP/dt = q_pX 又は、 P = q_p∫₀ ^tXdt ［式中、q_pは細胞比生産能定数、Xは細胞数又は細胞容量又は細胞質量等価値、d P/dtはタンパク質生産速度を表わす］。したがって、q_pは、生存細胞の時間積分 （∫₀ ^tXdt（生存細胞・日数））に対する生成物濃度のグラフから得ることができ る。この式によれば、生産された糖タンパク質産物の量を生存細胞・日数に対し てプロットすると、その傾斜が細胞比速度に等しくなる。生存細胞は、生物量（ バイオマス）、O₂取り込み速度、乳酸デヒドロゲナーゼ（lactase dehydrogenas e；LDH）、パック細胞容量又は濁度など、いくつかの基準で測定することができ る。 細胞培養の「増殖相」とは、細胞が一般に迅速に分裂する指数的細胞増殖期間 （対数期）をいう。この相では、細胞増殖を最大にするような条件下に、細胞増 殖を最大にするような期間（通常1〜4日間）、細胞を培養する。宿主細胞に関す る増殖周期は、想定する宿主細胞に関して、過度の実験を行なわなくても決定す ることができる。「細胞増殖を最大にするような条件下に、細胞増殖を最大にす るような期間」とは、その細胞系に関して、細胞増殖と細胞分裂にとって最適と なるように決定された培養条件を指す。増殖相では、その細胞系について最適な 増殖が達成されるように、必須添加物を含む栄養培地中、加湿制御された雰囲気 下に、一般に約30〜40℃で細胞を培養する。細胞は、約1〜4日間（通常は2〜3日 間）、増殖相に維持される。 細胞培養の「遷移相」とは、生産相用の培養条件を確保する期間をいう。遷移 相中に、細胞培養の温度、培地重量オスモル濃度などの環境因子を増殖条件から 生産条件に置き換える。 細胞培養の「生産相」とは、細胞増殖が安定期に達している期間をいう。生産 相では、対数的細胞増殖が終わっていて、タンパク質生産が主になっている。一 般にこの期間では、継続的なタンパク質生産を維持して所望の糖タンパク質産物 を得るために、培地を補充する。 本明細書では、「発現」又は「発現させる」という用語を使って、宿主細胞内 で起こる転写及び翻訳を表わす。宿主細胞における産物遺伝子の発現レベルは、 その細胞内に存在する対応するmRNAの量か、その細胞によって生産される産物遺 伝子がコードするタンパク質の量に基づいて測定することができる。例えば、あ る産物遺伝子から転写されたmRNAは、ノーザンハイブリダイゼーションによって 定量することが望ましい。Sambrookら，Molecular Cloning: A Laboratory Manu al，7.3-7.57頁（Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989）。産物遺伝子 がコードするタンパク質は、そのタンパク質の生物学的活性をアッセイするか、 そのような活性には依存しないアッセイ（例えばそのタンパク質と反応できる抗 体を用いるウェスタンブロッティングやラジオイムノアッセイなど）を使用する ことによって定量することができる。Sambrookら，Molecular Cloning: A Labor atory Manual，18.1-18.88頁（Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989） 。 アルカン酸又はその塩とは、直鎖又は分枝鎖飽和又は不飽和アルカン酸もしく はその塩を意味する。アルカン酸は一般に1〜10個の炭素原子を持ち、好ましく は3〜6個の炭素原子を持つ。アルカン酸の典型例は酪酸であり、これに対応する 塩は酪酸ナトリウムである。 II．細胞培養法 本発明者らは、哺乳類細胞培養によって生産される糖タンパク質の生産中に細 胞比生産能を増大させる因子が、生産された糖タンパク質のシアル酸含量に対し て逆の効果を持つことを発見した。各複合型オリゴ糖構造につき1又はそれ以上 のシアル酸残基を持つタンパク質は生体内で長い浄化速度（clearance rate）を 持つので、その製剤の全体的なシアリル化度により、浄化速度を広範囲にわたっ て操作することができる。本発明は、哺乳類細胞培養によって生産される糖タン パク質のシアリル化の程度を制御する方法を規定する。本明細書に記載する方法 論に従えば、哺乳類細胞培養によって生産される糖タンパク質の所望のシアル酸 含量を規定する正確なプロセスパラメーターを決定することができる。 本発明では、哺乳類宿主細胞を培養することにより、回収可能な糖タンパク質 産物を生産する。その糖タンパク質中の総シアル酸含量は、細胞比生産能に影響 を及ぼす細胞培養パラメーターを制御することによって制御される。細胞比生産 能に影響を及ぼす因子は当技術分野で良く知られており、例えばDNA/RNAコピー 数に影響する因子、RNAに影響する因子（RNAを安定化する因子など）、培地栄養 素その他の補給物、転写エンハンサーの濃度、培養環境の重量オスモル濃度、細 胞培養の温度とpHなど（ただしこれらに限らない）が挙げられる。本発明によれ ば、これらの因子を単独で、又は組み合わせて調節することによって細胞比生産 能を増大させると、生成するタンパク質のシアル酸含量が減少する。これらの因 子を単独で、又は組み合わせて調節することによって細胞比生産能を減少させる と、生成するタンパク質のシアル酸含量が増大する。 以下、種々の（よく知られているものを含む）細胞培養技術とその原理を参照 して、本発明を説明する。 本発明では、哺乳類細胞を培養することにより、所望の糖タンパク質産物を生 産する。本発明との関連で糖タンパク質の生産に使用する宿主細胞を選択する際 には、種々の宿主細胞が、発現されたタンパク質の翻訳時及び翻訳後のプロセシ ング及び修飾（例えばグリコシル化、切断）に関して、特有の機構を持つことを 認識することが重要である。所望の翻訳後修飾が可能なことが保証されるように 、適当な細胞系を選択すべきである。あるいは、特定の翻訳後修飾に必要な所望 の遺伝子産物を発現させるように、宿主細胞を改変することもできる。 具体的に述べると、所望のタンパク質を発現させる哺乳類細胞は、本明細書に 記述する適当な条件下に、適当な翻訳後修飾が生体内で起こるように、特定の酵 素を発現させるか、もしくはそれを発現させるように操作すべきである。これら の酵素には、N-及びO-結合型炭水化物の付加及び完成に必要な酵素（N-結合型オ リゴ糖についてはHubbard及びIvan（上記）に記載のものなど）が含まれる。任 意に、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ、アルファーグルコシダーゼI、ア ル ファーグルコシダーゼII、ERアルファ(1.2)マンノシダーゼ、ゴルジアルファ-マ ンノダーゼI、N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼI、ゴルジアルファ -マンノダーゼII、N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼII、アルファ( 1.6)フコシルトランフェラーゼ及びβ(1.4)ガラクトシルトランスフェラーゼを 、これらの酵素に含めてもよい。また、宿主細胞は、宿主細胞ゲノムの一部とし て、特定の位置に特定の結合様式で末端シアル酸を結合させると予想することが できる適当なシアリルトランスフェラーゼをも発現させる。任意に、例えばシア リルトランスフェラーゼをコードするDNAによる宿主細胞のトランスフェクショ ンなどによって、宿主細胞が適当なシアリルトランスフェラーゼを発現させるよ うにしてもよい。 上述のシアリルトランスフェラーゼは、Galβ1-4GlcNAcなどの適当なオリゴ糖 母核構造に末端シアル酸残基を付加すると予想される。本発明との関連で適当な シアリルトランスフェラーゼとしては、N-及びO-結合型オリゴ糖の複合型シアリ ル化及び分岐を触媒するシアリルトランスフェラーゼ（ただしこれらに限らない ）が挙げられる。 所望のタンパク質を発現させ、特定の位置に特定の結合様式で所望の炭水化物 を付加することができる哺乳類細胞の培養については、培養する宿主細胞に特別 の注意を払えば、数多くの培養条件を使用することができる。哺乳類細胞に適し た培養条件は当技術分野で良く知られている（J．Immunol．Methods（1983）56: 221-234）か、もしくは当業者が容易に決定することができ（例えばAnimal Cell Culture: A Practical Approach 第2版，Rickwood，D.及びHames，B.D.編，Oxfo rd University Press，ニューヨーク(1992)）、それらは選択した宿主細胞によ って異なる。 本発明の哺乳類細胞培養は、培養しようとする細胞に適した培地中に調製され る。ハムF10（Sigma）、最小必須培地（[MEM]，Sigma）、RPMI-1640（Sigma）及 びダルベッコ改良イーグル培地（[DMEM]，Sigma）などの市販の培地は代表的な 栄養溶液である。また、Ham及びWallace（1979）Meth．Enz．58:44; Barnes及び Sato（1980）Anal．Biochem．102:255; 米国特許番号4,767,704; 4,657,866; 4, 927,762; 5,122,469又は4,560,655; 国際公開番号WO 90/03430及びWO 87/00195 （これらの開示はすべて参考文献として本明細書の一部を構成する）に記載の培 地はいずれも培養培地として使用できる。これらの培地はいずれも必要に応じて ホルモン類及び/又は他の増殖因子類（インスリン、トランスフェリン、表皮増 殖因子など）、塩類（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩 など）、緩衝剤（HEPESなど）、ヌクレオシド（アデノシンやチミジンなど）、 抗生物質（ゲンタマイシン(Gentamycin^TM)剤など）、微量元素（これは、通常、 μM域の最終濃度で存在する無機化合物と定義される）、脂質（リノール酸その 他の脂肪酸）とそれらの適当な担体、及びグルコース又は等価なエネルギー源を 補足することができる。また、その他の必要な補足物も、当業者に知られる適当 な濃度で含めることができる。 ある態様では、哺乳類宿主細胞がCHO細胞（好ましくはdp12.CHO細胞）であり 、好適な培地は、いくつかの成分（例えばアミノ酸、塩類、糖及びビタミン類な ど）の濃度が変更されたDMEM/HAM F-12系製剤（DMEMとHAM F12の組成については 、American Type Culture Collection Catalogue of Cell lines and Hybridoma s（第6版，1988）の346〜349頁に記載の培養培地処方を参照のこと）などの基本 培地成分を含有し（米国特許5,122,469に記述されているような培地処方はとり わけ好適である）、任意に、グリシン、ヒポキサンチン及びチミジン、組換えヒ トインスリン、加水分解ペプトン（例えばPrimatone HS又はPrimatone RL(英国 シェフィールド)、又はその等価物）、細胞保護剤（例えばプルロニックF68又は 等価なプルロニックポリオール）、ゲンタマイシン、及び微量元素を含有しても よい。 本発明の糖タンパク質は、所望のタンパク質を発現させる細胞を、種々の細胞 培養条件下に生育することによって生産することができる。例えば、タンパク質 の大規模又は小規模生産用の細胞培養法は、本発明との関連で有用でありうる。 例えば、流動床バイオリアクター、中空糸バイオリアクター、回転ボトル培養、 又は攪拌タンクバイオリアクターシステムなど（後者2つのシステムでは、微粒 子担体を使用しても使用しなくてもよい）の手法（ただしこれらに限らない）を 使用することができ、これらはバッチ方式、フィードバッチ（fed-batch）方式 又は連続方式で運転することができる。 好ましい態様として、本発明の細胞培養を攪拌タンクバイオリアクターシステ ムで行い、フィードバッチ培養法を使用する。好ましいフィードバッチ培養とし て、哺乳類宿主細胞と培養培地をまず培養器に供給し、培養しながら培養物に培 養栄養素を補給する。この際、培養終了前に定期的に細胞及び/又は生成物を収 集する場合もあるし、そのような収集を行なわない場合もある。フィードバッチ 培養には、例えば半連続的フィードバッチ培養を含めることができる。この場合 は、定期的に全培養（細胞と培地を含む）を取り出し、新鮮な培地に置換する。 フィードバッチ培養は、細胞培養用のすべての成分（細胞とすべての培養栄養素 を含む）がその培養工程の開始時に培養器に供給される単純なバッチ培養とは区 別される。また、フィードバッチ培養は、製造過程で上清が培養器から除去され ないという点で潅流培養とも区別される（潅流培養では、細胞を例えば濾過、封 入、微粒子担体への固定などによって培養中に留め、培養培地を連続的又は断続 的に導入するとともに培養器から除去する）。また、培養物の細胞は、その宿主 細胞と意図する生産計画に適した任意の計画又は手順に従って増殖させることが できる。つまり、本発明には、一段階培養法と多段階培養法が考えられる。一段 階培養では、宿主細胞を培養環境に接種し、その細胞培養のただ一つの生産相で 、本発明の方法を使用する。別法として、多段階培養も考えられる。多段階培養 では、細胞をいくつかの段階又は相で培養する。例えば、細胞を第1段階又は増 殖相培養で生育することができる。ここでは、細胞（貯蔵庫から取り出した細胞 が考えられる）を増殖の促進と高い生存率に適した培地に接種する。その宿主細 胞培養に新鮮な培地を添加することにより、細胞を適当な期間、増殖相に維持す ることができる。 本発明の好ましい側面として、フィードバッチ細胞培養条件又は連続的細胞培 養条件を、細胞培養の増殖相における哺乳類細胞の増殖を増進させるように工夫 する。増殖相では、増殖が最大となる条件下に、増殖が最大となる期間、細胞を 生育する。温度、pH、溶存酸素（dO₂）などの培養条件は、その宿主に使用され るものであり、当業者には明らかだろう。一般に、pHは、酸（例えばCO₂）又は 塩基（例えばNa₂CO₃又はNaOH）を用いて、約6.5〜7.5のレベルに調節される。CH O細胞などの哺乳類細胞の培養に適した温度範囲は約30〜38℃であり、適当なdO₂ は空気飽和状態の5〜90%である。 特定の段階で、細胞を細胞培養の生産相又は生産段階に接種することができる 。別法として、上述のように、生産相又は生産段階が増殖相又は増殖段階と連続 していてもよい。 本発明に従って、細胞培養の生産相中の細胞培養環境を制御する。本発明の方 法では、哺乳類宿主細胞の細胞比生産能に影響する因子を、結果として生じる糖 タンパク質中のシアル酸が所望の含量となるように操作する。より具体的に述べ ると、本細胞培養工程の生産相では、結果として生じる糖タンパク質産物が所望 のシアル酸含量を含むように、細胞比生産能を増大させる因子を制御する。 好ましい側面として、本細胞培養法の生産相の前に、細胞培養の遷移相を置き 、この期間に細胞培養の生産相用のパラメーターを確保する。 本発明の一側面によれば、アルカン酸のような転写エンハンサーの濃度を操作 することにより、細胞比生産能に（つまりは、得られる哺乳類細胞糖タンパク質 産物のシアル酸含量に）影響を及ぼす。そのアルカン酸は、哺乳類タンパク質の 転写を増進するいくつかの一本鎖又は分枝鎖アルカン酸のいずれでもよい。好ま しい態様では、そのアルカン酸が酪酸、特にその塩（酪酸ナトリウム）である。 本発明では、細胞比生産能を制御するために、酪酸ナトリウムの量を制御する 。0.1〜20mMの酪酸ナトリウム濃度を使用する。この濃度は、培養しようとする 宿主細胞と、生産されるタンパク質の所望のシアル酸含量に応じて修正される。 所望のシアル酸含量を持つタンパク質を生産するには、最も妥当なシアル酸特性 を持つ最高の細胞比生産能を与えるように、酪酸ナトリウム濃度を選択する。し たがって本発明では、酪酸ナトリウムなどの転写エンハンサーの濃度を、所望の シアル酸含量が得られるように選択する。 成熟糖タンパク質のシアル酸含量を増大させるには、一般に、低濃度の転写エ ンハンサーを使用する。この低濃度は転写を増大させるが、宿主細胞培養の生存 能を維持しつつ、低い細胞比生産能を維持する。一般的には、約0.1mM〜約8mM酪 酸ナトリウムなどといった転写エンハンサー濃度を使用する。約1.0mM〜約6.0mM の濃度を使用することがより好ましい。一態様として、約6mMの酪酸ナトリウム を使用する。もう1つの態様では、約1mMの酪酸ナトリウムを使用する。 もう1つの態様として、シアル酸レベルの減少した糖タンパク質を生産する。 本発明のこの側面では、細胞比生産能が増大するような条件下に、哺乳類細胞を 培養する。本発明のこの側面によれば、アルカン酸その他の適当な転写エンハン サーの濃度を、増大した細胞比生産能が所望のシアル酸特性を持つタンパク質を 与えるように選択する。好ましい態様として、アルカン酸又はその塩の濃度を約 5〜20mM、より好ましくは約6mM〜12mMにする。一態様として、酪酸ナトリウムの 濃度を約12mMにする。 アルカン酸又はその塩などの転写エンハンサーの適当な濃度を決定する際には 、図2及び下記実施例Iの表Iを参照することができる。本発明によれば、酪酸濃 度を低くすると、一般に細胞比生産能が低くなる。本発明では、生産相の重量オ スモル濃度などといった他のプロセスパラメーターに留意しながら、酪酸ナトリ ウムの濃度を選択する。後述するように、重量オスモル濃度も細胞比生産能に影 響を及ぼしうる。酪酸の濃度は、その生産相で維持すべき重量オスモル濃度に留 意して選択される。 別法として、他の哺乳類宿主細胞及び他の糖タンパク質については、細胞比生 産能が減少すると生産される糖タンパク質シアル酸含量が増大するということに 留意して、小さい試験培養を調製し、糖タンパク質産物生産速度（すなわち細胞 比生産能）を決定し、得られたシアル酸含量を用いて、培養しようとするその宿 主細胞に適した同様の表と図を作製することができる。アルカン酸又はその塩（ 酪酸ナトリウムなど）その他適当な転写エンハンサーは、その細胞培養の生産相 を開始した時又はその付近で、宿主細胞培養に加える。この細胞培養法では、生 産相に先立って遷移相を使用し、この間に、所望の細胞比生産能（したがって所 望の糖型特性）を得るための（本明細書で論じるような）細胞培養条件を確保す ると便利である。 アルカン酸又はその塩は当技術分野で知られる任意の手段によって添加される 。好ましい態様として、酪酸ナトリウムを、本明細書に記述するような（あるい は哺乳類細胞培養分野の当業者に知られている）他の適当な栄養素と共に（もし くはそれらの栄養素を伴わずに）、一括してフィードバッチ培養システムに添加 する。 本発明では、成熟糖タンパク質のシアリル化の程度を調節するために、上述の 因子に加えて、細胞培養環境の重量オスモル濃度を制御する。一態様として、細 胞比生産能に影響する他の因子とは無関係に重量オスモル濃度を制御することに より、成熟タンパク質のシアル酸含量を制御する。もう１つの態様として、細胞 比生産能に影響する他の因子を制御することに加えて、重量オスモル濃度を制御 する。好ましい態様として、重量オスモル濃度とアルカン酸濃度の両方を制御す る。 細胞培養環境の重量オスモル濃度は、細胞比生産能と、結果として生じる糖タ ンパク質のシアル酸含量の間に所望の平衡が生まれるように制御される。一般に 、重量オスモル濃度が増大すると、細胞比生産能が増大する。重量オスモル濃度 が増大すると、一般にそのタンパク質の生産速度が増大するということに留意し て、所望のシアル酸を持つタンパク質を生産する重量オスモル濃度を選択する。 生産速度を減少させ、成熟糖タンパク質のシアル酸含量を増大させるためには、 一般に、培養しようとするその細胞タイプについて、重量オスモル濃度を低レベ ルに維持する。 哺乳類細胞培養の場合、培養培地の重量オスモル濃度は、一般に約290〜330mO smである。しかし、重量オスモル濃度の増大は、一般に、タンパク質の生産速度 の増大をもたらす。重量オスモル濃度は、生産速度が所望の生成物特性に対応す るように選択される。シアル酸含量を増大させるには、培養しようとする宿主細 胞に留意しながら、生産速度を減少させ、重量オスモル濃度を一般に低い範囲内 に維持する。シアル酸含量を増大させるには、約250mOsm〜約450mOsmの範囲の重 量オスモル濃度が適当である。本発明のこの側面では、重量オスモル濃度を約30 0〜450mOsmに維持することが好ましく、より好ましくは約350〜400mOsm、最も好 ましくは約400mOsmに維持する。 シアル酸含量を低下させるには、生産速度を増大させるような重量オスモル濃 度を選択する。本発明のこの側面では、重量オスモル濃度を約350〜600mOsmに維 持する。本発明のこの側面では、重量オスモル濃度が約450〜550mOsmであること が好ましい。 当業者は、培地の重量オスモル濃度が培地液中の浸透活性粒子の濃度に依存す ること、及び複合哺乳類細胞培養培地を構成するいくつかの変数が重量オスモル 濃度に影響することに気づくだろう。培養培地の初期重量オスモル濃度は、培養 培地の組成によって決まる。重量オスモル濃度は、浸透圧計（例えばFisher Sci entific（ペンシルベニア州ピッツバーグ）がOSMETTEという商標名で販売してい るもの、又はPrecision Systems，Inc.（マサチューセッツ州ナティック）から 入手できるOsmetteモデル2007など）を用いて測定することができる。重量オス モル濃度を所望の範囲にするには、培養培地中の種々の構成成分の濃度を調節す ればよい。 重量オスモル濃度を増大させるために培養培地に加えることができる溶質には 、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、ペプトンなどの加水分解動物タンパク質、 代謝されないポリマー、ビタミン類、イオン類、塩類、糖類、代謝産物類、有機 酸類、脂質類などがある。一態様として、フィードバッチ培養法の細胞培養に他 の培養培地成分と共にペプトンを添加することによって、重量オスモル濃度を制 御する。 本発明では、ペプトンに加えて、例えば、アミノ酸、種々の塩類（NaClなど） を含む基本培地製剤の添加により、重量オスモル濃度が所望の範囲に維持又は調 節される。好ましい態様として、培養培地に、例えば過剰のアミノ酸（例えば米 国特許番号5,122,469の「スーパー」培地を参照のこと）、グルコース及びペプ トンを含有する基本培養培地を補足する。 しかし、上述したような重量オスモル濃度範囲を達成するために、培養培地中 の他の成分の濃度を変更してもよいことは理解されるだろう。培養培地中の例え ばグルコース（主たるエネルギー源）の濃度を培養中に断続的又は連続的に制御 することにより、培地の重量オスモル濃度を指定の望ましい範囲にほぼ維持する ことができる。グルコース濃度の制御は、細胞に対して十分な炭素供給源を提供 する機能を果たすと同時に、宿主細胞による乳酸の生産を制御する機能をも果た す。これは、中和剤（例えばNa₂CO₃又はNaOHなどの塩基）の添加（これは重量オ スモル濃度の増大を引き起こす）を余儀なくする培養培地のpH低下を制限する点 で有利である。 細胞培養の維持にどのような方法を使用していても、培地に補給することによ って、重量オスモル濃度を適当な範囲内に維持することができる。好ましい態様 では、培養システムをフィードバッチ培養システムとし、細胞培養の生産相中に 、培地に一括して補給する。後述のように、生産相中に、さらに培地に補給する ことができる。 別法として、培養培地の断続的オフライン試料採取を行なうこともできる。そ うすれば、供給溶液を必要に応じて調整することにより、培養培地の重量オスモ ル濃度を修正することができる。 本発明の細胞培養法が、生産されるタンパク質のシアリル化が所望のレベルに なるように選択されることは、当業者には理解されるだろう。シアリル化に影響 を与えるプロセスパラメーターには、本明細書に記述したものの他に、酸素レベ ルとグルコースレベルがある。培養密度、時間及び貯蔵条件（温度など）もシア リル化に影響を与える。本発明は、シアリル化の増大に最適なこれらのプロセス パラメーターをも包含するものとする。 III．糖タンパク質の回収 ポリペプチド生産相に続いて、当技術分野で十分に確立された技術を用いて、 目的のポリペプチドを培養培地から回収する。 目的のポリペプチドは、宿主細胞溶解物から回収することもできるが、培養培 地から分泌されたポリペプチドとして回収されることが好ましい。 第1段階として、培養培地又は溶解物を遠心分離して、粒子状細胞残渣を除去 する。その後、ポリペプチドを汚染可溶性タンパク質及びポリペプチドから精製 する。次に挙げる操作は好適な精製法の典型例である：免疫アフィニティーカラ ム又はイオン交換カラムによる分画；エタノール沈殿；逆相HPLC；シリカ又は陽 イオン交換樹脂（DEAEなど）によるクロマトグラフィー；クロマトフォーカシン グ；SDS-PAGE；硫酸アンモニウム沈殿；例えばセファデックスG-75などを用いる ゲル濾過；プロテインAセファロースカラムによるIgGなどの汚染物質の除去。フ ェニルメチルスルホニルクロリド（PMSF）などのプロテアーゼ阻害剤も、精製中 のタンパク質分解減成を阻害するのに有用である。目的のポリペプチドに適した 精製法が、組換え細胞培養での発現によるそのポリペプチドの特徴の変化を補う ために、修正を必要とするかもしれないことは、当業者には理解されるだろう。 本発明には、本発明の炭水化物用に選択された精製技術と精製法が、特に好ま しい。本発明の所望の糖型は、例えばイオン交換軟ゲルクロマトグラフィー又は 陽イオン又は陰イオン交換樹脂を用いるHPLCなど（この場合は、より酸性の画分 を集める）によって、シアル酸含有分子を濃縮することができる。 IV 糖タンパク質の分析 本発明の方法によって生産される糖タンパク質の複合型炭水化物部分は、所望 であれば、従来の炭水化物分析法によって、容易に分析することができる。例え ば、当技術分野で良く知られているレクチンブロッティングにより、末端マンノ ース又はその他の糖類（ガラクトースなど）の比率が明らかになる。モノ-、ビ- 、トリ-又はテトラ-分岐型（antennary）オリゴ糖の末端がシアル酸で終わって いることは、無水ヒドラジン又は酵素法を使用してそのタンパク質から糖を放出 させ、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、又は当 技術分野で良く知られているその他の方法でオリゴ糖を分画することによって確 認できる。ノイラミニダーゼ処理によるシアル酸除去の前後に、糖タンパク質の pIを測定することもできる。ノイラミニダーゼ処理後のpIの増大は、その糖タン パク質上にシアル酸が存在することを示す。 本発明の炭水化物構造は、N-結合型又はO-結合型炭水化物として、発現された タンパク質上に現われる。N-結合型炭水化物とO-結合型炭水化物は主としてその 母核構造が異なる。N-結合型グリコシル化とは、ペプチド鎖のアスパラギン残基 にGlcNAcを介して炭水化物部分が結合することをいう。N-結合型炭水化物はすべ て共通のMan1-6(Man1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAcβ-R母核構造を持つ。した がって、この母核構造において、Rは生産されたタンパク質のアスパラギン残基 を表わす。生産されるタンパク質のペプチド配列は、アスパラギン-X-セリン、 アスパラギン-X-スレオニン、及びアスパラギン-X-システイン（ここにXはプロ リンを除く任意のアミノ酸を表わす）を含むだろう。これに対し、O-結合型炭水 化物は、GalNAcがスレオニン又はセリンの水酸基に結合した共通の母核構造を特 徴とする。N-結合型炭水化物とO-結合型炭水化物のうち、最も重要なのは、複合 型のN-結合型炭水化物と複合型のO-結合型炭水化物である。このような複合型炭 水化物は、いくつかの分岐構造を持つだろう。末端シアル酸に付加には、モノ- 、ビ-、トリ-及びテトラ-側鎖（outer）構造が重要である。このような側鎖構造 は、本発明の炭水化物を構成する特定の糖及び結合様式の付加部位となる。 得られた炭水化物は、当技術分野で良く知られている任意の方法（本明細書に 記述する方法を含む）によって分析することができる。当技術分野では、いくつ かのグリコシル化分析法が知られており、それらは本発明にも有用である。それ らの方法は、ペプチドに結合しているオリゴ糖の同定と組成に関する情報を提供 する。本発明に役立つ炭水化物分析法には、例えばレクチンクロマトグラフィー ；HPAEC-PAD（この方法では、高pH陰イオン交換クロマトグラフィーを使用して 、オリゴ糖を電荷に基づいて分離する）；NMR；質量分析；HPLC；GPC；単糖類組 成分析；連続的酵素消化などがある（ただしこれらに限らない）。 また、オリゴ糖を放出させる方法も知られている。これらの方法には、1）酵 素法（これは一般にペプチド-N-グリコシダーゼF/エンド-β-ガラクトシダーゼ を用いて行われる）；2）苛酷なアルカリ性環境を用いて主としてO-結合型構造 を放出させるβ解離；及び3）無水ヒドラジンを用いてN-結合型オリゴ糖とO-結 合型オリゴ糖の両方を放出させる化学法があるが、これらに限るわけではない。 分析は、次の段階を用いて行なうことができる： １．脱イオン水に対して試料を透析することにより、すべての緩衝剤塩を除去 した後、凍結乾燥する。 ２．無水ヒドラジンによる無傷のオリゴ糖鎖の放出。 ３．HCl無水メタノール溶液で無傷のオリゴ糖を処理することにより、個々の 単糖類をO-メチル誘導体として放出させる。 ４．全ての1級アミノ基をN-アセチル化する。 ５．ペルーO-トリメチルシリルメチルグリコシドへの誘導体化。 ６．CP-SIL8カラムを用いるキャピラリーGLC（気-液クロマトグラフィー）に よるそれら誘導体の分離。 ７．GLCの保持時間と質量分析を既知の標品と比較することにより、個々のグ リコシド誘導体を同定する。 ８．内部標準（13-O-メチル-D-グルコース）を用いてFIDで個々の誘導体を定 量する。 中性糖とアミノ糖は、パルス電流検出と組み合わせた高性能陰イオン交換クロ マトグラフィー（HPAE-PAD Carbohydrate System，Dionex Corp.）によって決定 することができる。例えば、20%（v/v）トリフルオロ酢酸中100℃で6時間の加水 分解により、糖を放出させることができる。次に加水分解物を凍結乾燥又はSpee d-Vac（Savant Instruments）で乾燥する。次に、残渣を1%酢酸ナトリウム三水 和物溶液に溶解して、Anumulaら（Anal．Biochem．195:269-280(1990)）が記述 しているように、HPLC-AS6カラムで分析する。 シアル酸は、3つの同一試料からYaoら（Anal Biochem．179:332-335(1989)） の直接比色法によって個別に決定することができる。好ましい態様として、Warr en，L.，J．Biol．Chem．238(8)(1959)のチオバルビツール酸（thiobarbaturica cid）（TBA）を使用する。 別法として、免疫ブロット炭水化物分析を行なってもよい。この方法では、タ ンパク質結合型炭水化物を、HaselbeckとHoselによって記述された酸化的免疫ブ ロット法［Haselbeckら，Glycoconjugate J．7:63(1990)］に基づく市販のグリ カン検出システム（Boehringer）を用いて検出する。タンパク質をニトロセルロ ース膜ではなくポリビニリデンジフルオリド膜に転写することと、遮断緩衝液が 0.9%塩化ナトリウムを含む10mMトリス緩衝液（pH7.4）中に5%ウシ血清アルブミ ンを含有する点以外は、製造者の推奨する染色法に従う。検出は、100mM塩化ナ トリウムと50mM塩化マグネシウムを含む100mMトリス緩衝液pH9.5中のホスファタ ーゼ基質4-ニトロブルーテトラゾリウムクロリド0.03%（w/v）と5-ブロモ-4クロ ロ-3-インドリルーホスフェート0.03%（w/v）を用いて、アルカリ性ホスファタ ーゼ複合体と結合した抗ジゴキシゲニン抗体（Boehringer）（トリス緩衝食塩水 中に1:1000希釈）で行なう。炭水化物を含有するタンパク質バンドは、通常、約 10〜15分で可視化される。 炭水化物は、ペプチド-N-グリコシダーゼFによる消化で分析することもできる 。この方法では、0.18%SDS、18mMβ-メルカプトエタノール、90mMリン酸塩、3.6 mMEDTAを含むpH8.6の緩衝液14μlに残基を懸濁し、100℃で3分間加熱する。室温 に冷却した後、試料を2等分する。その一方はさらに処理せず、対照とする。も う1つの画分を約1%NP-40界面活性剤に調節した後、0.2単位のペプチド-N-グリコ シダーゼF（Boehringer）を加える。両試料を37℃で2時間温めた後、SDS-ポリア クリルアミドゲル電気泳動で分析する。 Ｖ．腫瘍壊死因子受容体-免疫グロブリンキメラ 好ましい態様として、腫瘍壊死因子受容体（TNFR）-免疫グロブリン（Ig）キ メラの生産に本発明の方法を使用する。この種のキメラタンパク質のなかでは、 可溶性1型TNFR-IgG₁が特に好ましい。生産されるTNFR1-IgG₁キメラは、多くのTN F介在性又はTNF関連疾患及び障害の処置又は診断に有用である。この文脈におけ る「処置」には、予防（防止）、抑制（例えば症状の抑制）と現に存在する状態 の処置の両方が含まれる。TNFに関係する病状としては、グラム陰性菌血症、グ ラム陽性菌血症、エンドトキシン性ショック、移植片拒絶現象、慢性関節リウマ チ、全身性狼瘡、クローン病、その他のTNFに関係する自己免疫及び炎症性疾患 が挙げられるが、これらに限るわけではない。 本発明のTNFR1-IgG₁製剤は、TNFに対するモノクローナル抗体が有用であると わかっている適応症には一般に有用である。例えば、動物モデルでは、TNF-アル ファに対するモノクローナル抗体が、予防的に使用した時に、保護効果を持つこ とがわかっている（Tracey，K.J.ら（1987）Nature330:662）。Exley，A.R.ら（ 1990）Lancet 335:1275に報告されたI相臨床試験では、組換えヒトTNF-アルファ に対するネズミモノクローナル抗体が、重度の敗血症性ショックを持つ患者に投 与しても安全であることがわかった。TNFR1-IgG₁の使用は、敗血症性ショックと 共に慢性関節リウマチの処置にも適している。 TNFに関係する疾患又は障害を処置する方法では、TNFR1-IgG₁製剤の治療活性 量を、当該処置の必要な対象に投与する。好ましい対象はヒトである。 本発明TNFR1-IgG₁糖型製剤の疾患又は障害の処置に関する有効量は、0.01〜10 0mg/患者（好ましくは1mg〜75mg/患者、最も好ましくは約10〜約50mg/患者）の 投与量範囲にある。 投与するには、TNFR1-IgG₁製剤を適当な医薬又は治療用組成物に製剤化すべき である。そのような組成物は、通例、TNFR1-IgG₁製剤の治療活性量と、食塩水、 緩衝食塩水、ブドウ糖又は水などといった薬学的に許容できる賦形剤又は担体と を含有する。また、組成物が糖類（マンノース及びマンニトールを含む）などの 特定の安定化剤と、注射可能組成物用の局部麻酔剤（例えばリドカインなど）を 含んでもよい。 本発明は、モノクローナル抗体（例えば抗TNF抗体、Mac1又はLFA1に対する抗 体）又はTNF生産に関係する他の受容体（例えばIL-1又はIL-2受容体）などの補 助的活性成分の治療活性量をも含む組成物を提供する。 上述のように、単一治療又は複合治療用の好ましい治療用組成物は、有意な機 能的活性を保持しつつも血液からのクリアランスが延長された本発明の新規TNFR 1-IgG₁製剤を含む。このような半減期の延長は、簡略化したボーラス投与を可能 にし、生体内効力に寄与する。治療用組成物中の好ましいTNFR1-IgG₁キメラとし ては、本明細書に記述するTNFR1-IgG₁とその製剤、例えば、 （1）1又はそれ以上のシアル酸残基を末端に持つ複合型オリゴ糖を含むTNFR-IgG₁ 製剤； （2）クロマトフォーカシングによって決定される製剤の等電点（pI）が5.5〜7. 5であり、そのpIがノイラミニダーゼ処理に反応するTNFR1-IgG₁製剤； （3）タンパク質1モルにつき約1〜2モルの露出したN-アセチルグルコサミン残基 を持つTNFR1-IgG₁製剤； （4）タンパク質に対するシアル酸のモル比が約4〜7（特に約5〜6）であるTNFR1 -IgG₁製剤； （5）N-アセチルグルコサミンに対するシアル酸のモル比が約0.35〜約0.5（より 好ましくは約0.4〜約0.45）であるTNFR1-IgG₁製剤； などが挙げられる。 本発明の個々の治療用製剤又は組み合わせた治療用製剤の投与経路としては、 標準的な経路、例えば静脈内注入やボーラス注射などが挙げられる。 また、ヒト又は動物を処置するための医薬の製造における本発明TNFR1-IgG₁製 剤の使用も提供される。 ここに本発明を一般的に記述し終えたので、下記の実施例を参照すれば、本発 明がより容易に理解されるだろう。ただし、これらの実施例は例示のために記載 するのであって、特に明記しない限り、本発明の限定を意図するものではない。 実施例 TNF-アルファ及びTNF-ベータの生物学的効果は、特定の受容体によって媒介さ れる（Dembicら（1990）Cytokines，2:231）。分子クローニングによって、TNF 受容体（TNFR）には、見かけ上の分子量が55kD（1型）（Schallら（1990）Cell6 1:361）及び75kD（2型）（Smithら（1990）Science 248:1019）の2種類のタイプ が存在することが示されており、これらはそれぞれ自然界でTNFアルファとTNFベ ータの両方に結合する（Loetscherら（1990）Cell 61:351; Shallら（1990）ｃe ll 61:361; Kohnoら（1990）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87:8331）。両受容体 の細胞外部分は、可溶性TNF結合タンパク質として自然界に存在する（Kohnoら， 上記）。種々の免疫及び炎症事象におけるTNFの有害な作用を遮断するTNFアゴニ ストが作られている（Peppelら（1991）J．Exp．Med．174:1483-1489; Ulich（1 993）Am．J．Path．142:1335-1338; Howard，O.M.Z．（1993）Proc．Natl．Acad ．Sci．USA 90:2335-2339; Wooley，P.H．（1993）J．Immunol．151:6602-6607 ）。このようなアゴニストの一つ（Wernerら（1991）J．Cell Biochem．Abstrac ts．第20回年会115頁）は、ヒト55kD 1型TNFRの細胞外ドメインをヒト免疫グロ ブリンG1重鎖のヒンジ及びFc領域の一部と結合したものである。 この実施例では、TNFR1-IgG₁キメラをコードするcDNAを含有するベクターでト ランスフェクションされた哺乳類細胞を培養した。 方法 Ａ．細胞系 哺乳類宿主細胞として使用したチャイニーズハムスター卵巣細胞系は、CHO-K1 （ATCC番号CCL61 CH0-K1）から得た。次に、CHO-K1 DUX-B11（DHFR^-）と命名さ れたCHO-K1突然変異ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR^-）欠損細胞系（コロンビ ア大学のL．Chasin博士から入手；Simonsen，C.C.及びLevinson，A.D．（1983） Proc．Natl．Acad．Sci．USA 80:2495-2499; Urlaub G.及びChasin，L．（1980 ）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 77:4216-4220）を用いて、プレプロインスリン のcDNAを含有するベクターでトランスフェクションすることにより、インスリン 要求性が減少した細胞系を得た（Suresら（1980）Science 208:57-59）。選択し たクローン（dp12.CHOと命名）は、増殖にグリシン、ヒポキサンチン及びチミジ ンを要求するので、それらのDHFR^-遺伝子型が確認される。 Ｂ．可溶性1型TNFR-IgG₁キメラの構築 ヒト1型TNFRの細胞外ドメインをIgG₁重鎖のヒンジ領域、C_H2ドメイン及びC_H3 ドメインと遺伝子融合することにより、可溶性1型TNFR-IgG₁キメラを構築した（ 以下、TNFR1-IgG₁という）。 ヒト1型TNFRコードDNA配列（Loetscherら，上記）は、プラスミドpRK-TNF-R［ Schallら，Cell 61，361(1990)］から得た。この出発物質を構築するために、2. 1kb胎盤cDNAクローン（Schallら，上記）を哺乳類発現ベクターpRK5に挿入した （この構築は、EP公開番号307,247（1989年3月15日公開）に記述されている）。 このcDNAはLoetscherらが報告した配列のヌクレオチド位置64から始まり、その1 18bp下流に開始メチオニンを持つ。 IgG₁コード配列の供給源は、CD4-IgG発現プラスミドpRKCD4₂F_c1［Capon，D.J. ら，Nature 337，525(1989); Byrnら，Nature 344，667(1990)］とした。この発 現プラスミドは、アスパラギン酸216（アミノ酸114を重鎖定常領域の最初の残基 （これは、重鎖-軽鎖結合に関与するシステイン残基後のIgG₁ヒンジ領域の最初 の残基である）とする［Kabatら，Sequences of Proteins of Immunological In terest第4版(1987)］）に始まり、IgG₁のC_H2及びC_H3 Fcドメインを含んで残基44 1で終わるヒトIgG₁配列に融合した、成熟ヒトCD4タンパク質の残基1〜180（2つ のN末端CD4可変ドメイン）からなるハイブリッドポリペプチドをコードするcDNA 配列を含有する。 プラスミドpRK-TNF-RとpRKCD4₂F_c1の制限断片を調製し、それらを連結し、成 熟TNFRのスレオニン残基171がIgG₁重鎖のアスパラギン酸残基216に並置されるよ うに欠失突然変異誘発法を用いることによって、TNFR1-IgG₁を構築した［Kabat ら，上記］。得られたプラスミドpRKTNFR-IgGはTNFR₁ IgG₁の完全長コード配列 を含有した。 Ｃ．細胞培養 可溶性1型TNFR-IgG₁をコードする遺伝子をdp12.CHO細胞にトランスフェクショ ンによって導入した。これは、哺乳類細胞にDNAを導入するためのリン酸カルシ ウム技術を用いて行なった。トランスフェクションの2日後、細胞をトリプシン 処理し、選択培地（グリシン-ヒポキサンチン及びチミジン非含有ハムF-12 DMEM 1:1 v/v＋2%透析血清）で再培養した。得られた単離物をTNFR1-IgG₁の分泌につ いてスクリーニングした。次に、メトトレキセート中で増幅した時に高発現クロ ーンを与えるTNFR1-IgG₁発現クローンを無血清培地に適合させた。接種物の増殖 及び拡張用の非選択培地に移すまで、これらの細胞を継続的な選択圧下に置いた 。 TNFR1-IgG₁生産培養を得るため、上述の細胞集団を、メトトレキセート含有培 地から、メトトレキセートを含まない増殖培地に、容器の体積を増大させながら 連続的に継代培養することにより拡張した。本工程のこれらの段階では、非選択 増殖培地を、グルコース、アミノ酸、塩類、糖、ビタミン類、グリシン、ヒポキ シンチン及びチミジン、組換えヒトインスリン、加水分解ペプトン（Primatone HS又はPrimatone RL）、細胞保護剤（プルロニックF68（プルロニックポリオー ル）又はその等価物など）；ゲンタマイシン；脂質及び微量元素などといったい くつかの成分の濃度を調節したDMEM/ハムF-12系製剤（例えば米国特許5,122,469 を参照のこと）とした。 培養を、CO₂ガス（酸）及び/又はNa₂CO₃（塩基）を用いてpH7.2±0.4に制御し た。増殖期間中の温度はほぼ37℃に制御した。溶存酸素は空気及び/又は酸素ガ スを直接散布することにより、空気飽和状態の5%以上に維持した。 接種物拡張相中の重量オスモル濃度は、約250mOsm〜350mOsmに維持した。 各培養の増殖相を第2相又は遷移相を移し、この相で培養パラメーターを最適 増殖条件から生産条件に変化させた。この遷移相中に、培養システムの温度を一 般に約30〜35℃まで下げた。酪酸塩を添加し、一定の重量オスモル範囲を確保し た。この生産相中に蓄積した生成物をシアル酸含量について分析した。 典型的な生産計画では、300mOsmの出発重量オスモル濃度を持つ増殖相で生育 した場合、選択段階で得た接収物の拡張により、約1.2×10⁶細胞が得られた。増 殖培地には微量元素、組換えヒトインスリン及び加水分解ペプトンを補足した。 細胞をこれらの条件下に2日間生育した。3日目の初めに細胞培養の温度を下げた 。温度変化と同時に、又は温度変化の後、酪酸ナトリウムを細胞培養に添加し、 種々の培地成分の添加により所望の生産重量オスモル濃度を確保した。これらの 条件下に、補給しながら、細胞を9〜10日間生育した。種々の培地成分を、必要 に応じて、細胞に補給した。 種々の生産工程に関する生産条件を表Iに記載する。 Ｄ．TNFR-IgG の回収 TNFR-IgG₁キメラを、Caponら（上記）に記述されているような固定化黄色ブド ウ球菌プロテインAによるアフィニティークロマトグラフィーにより、95%以上に 精製した。 Ｅ．炭水化物分析 シアル酸含量を、Warren，L．（1959）J．Biol．Chem．234:1971-1975の方法 で分析した。結果 表Iに記載の各生産培養の細胞比生産能を、収集した生成物のシアル酸含量に 対してプロットした。その結果を図1に示す。最も高いシアル酸含量は、プロセ スパラメーターを約360〜420mOsmの生産重量オスモル濃度と約1mMの酢酸濃度に 維持した時に観測された。シアル酸含量は、プロセスパラメーターを調節するこ とにより、広範囲の値にわたって制御できた。 実施例II 様々な製剤の血漿薬物動力学的半減期及び/又は浄化速度を決定した。シアル 酸含量の高い製剤は一般に、シアル酸含量の低い製剤に比べて血漿半減期が長く 、かつ/または、総浄化速度が低い。方法 体重272〜315gのスプレーグ・ドーリーラット17匹を、3つのTNFR1-IgG₁融合タ ンパク質処置群（各群N=5又は6）の一つに無作為に割り当てた。これらのラット に名目投与量5mg/kgの試験物質を大腿静脈カニューレを通して静脈内注射した。 選択した試験物質には、生産相中の酪酸濃度を6mMとし、生産相中の重量オスモ ル濃度を約400mOsmに維持した方法（プロセスI）で得た2つのTNFR1-IgG₁製剤と 、酢酸濃度を12mMとし、生産相中の重量オスモル濃度を約500mOsmとした方法（ プロセスII）で得た第3のTNFR1-IgG₁を含めた。投与前、投与後5分、2、6、10、 24、34、48、56、72、96及び120時間に、血液試料2mLをEDTA（8.5%）上に集めた 。血液試料を遠心分離し、血漿を収集し、試料をTNFR1-IgG₁融合タンパク質濃度 について分析した。 酵素結合免疫学的及び生物学的結合アッセイ（ELIBA）を用いて、ラット血漿 中のTNFR1-IgG₁を定量した。このアッセイは、西洋ワサビペルオキシダーゼにカ ップリングしたTNF-アルファ（TNF-アルファ-HRP）がTNFR1-IgG₁融合タンパク質 の受容体部分に結合できるということに基づいている。このアッセイでは、マイ クロタイタープレートのウェル上にコーティングしたヤギ抗ヒトIgGFcのFab断片 を用いて、TNFR1-IgG₁を、その分子のFc部分との相互作用により捕捉した。TNF- アルファ-HRPをそのウェルに加え、捕捉されたTNFR1-IgG₁の受容体部分に結合さ せる。定量は、ペルオキシダーゼの過酸化物及びオルト-フェニレンジアミン（O PD）基質との反応によって生じる色を測定することにより行なった。このアッセ イの範囲は0.003〜0.02mg/mLである。血漿試料中のEDTAの存在は、このアッセイ の性能に何の効果も持たないことがわかった。 投与溶液の濃度差を補正するために、投与量を正規化した。すべての計算は、 120時間時点までの濃度対時間データに基づいて行なった。曲線下の切断（trunc ated）面積（AUC_{0 〜120}）を台形公式を用いて計算し、重量正規化切断（truncat e d）クリアランス（CL_{0 〜120}/W）を投与量/AUC_{0 〜120}として計算した。結果 浄化速度は、使用した方法（プロセスIとプロセスIIとの比較）及び生成物中 に存在するシアル酸の量に依存して変化した。個々の動物に関する浄化速度とこ の研究で得られた平均及び標準偏差を下記表IIに示す。プロセスIは、より遅く 、より好ましい浄化速度を示す。 実施例III TNFR1-IgG₁ の単糖類組成 実施例1に記述したように調製したTNFR1-IgG₁のオリゴ糖炭水化物組成と構造 を決定したところ、種々の方法のシアル酸含量が異なることがわかった。オリゴ 糖鎖上に露出したGlcNAcが多く、シアル酸が少なく、タンパク質がマンノース又 はガラクトース受容体に対して接近しにくい（と推測される）ものは、速い血漿 クリアランスを持っていた。末端シアル酸残基の多いものは遅い血漿クリアラン スを持っていた。 Ａ．試験物質の供給源 TNFR1-IgG₁を、上記実施例1に概論した方法に従って製造した。プロセスI物質 は、6mMの酪酸と約400mOsmの重量オスモル濃度を生産相に使用した細胞培養から 得た。プロセスII物質は、12mMの酪酸と約500mOsmの重量オスモル濃度を生産相 に使用した細胞培養から得た。 Ｂ．方法 無傷の中性糖及びアミノ糖の放出を、パルス電流検出と組み合わせた高pH陰イ オン交換クロマトグラフィーによって測定した。分析は次の操作を用いて行なっ た： １．TNFR1-IgG1（約50μg/ml）と適当な参照試料に対して、最終試料が1%酢酸 中に含まれるように緩衝液交換を行なった。 ２．約90μgのTNFR1-IgG₁と参照物質の試料をドライアイス/アルコール槽で凍 結し、その凍結試料を終夜凍結乾燥した。 ３．凍結乾燥試料を500μｌトリフルオロ酢酸中に再構成し、120℃で1時間イ ンキュベートした。 ４．酸加水分解後、TNFR1-IgG₁と参照試料を冷却し、蒸発乾固した。 ５．試料を水で最終濃度約0.6mg/mlに再構成した。 ６．Dionex CarboPac PA1（4×250mm）カラム（Dionex Corp.,カリフォルニア 州サニーヴェール）を使用して、パルス電流検出と高pH陰イオン交換カラムクロ マトグラフィーによる単糖類の分離を周囲温度で行なった。 ７．個々の単糖類の定量を、参照単糖類との比較によって行なった。 Ｃ．結果 上記2つの製剤中の各単糖類の相対モル含量を下記表IIIに示す。 上の結果は、糖タンパク質の生産相で選択したプロセスパラメーターが、成熟 糖タンパク質の炭水化物組成に影響を与えることを立証している。シアル酸含量 の高い製剤は一般に長い血清半減期を示した。 下記表IVと表Vは、プロセスI型及びプロセスII型条件下に製造したTNFR1-IgG₁ キメラ製剤のオリゴ糖側鎖の炭水化物組成を示している。表Vは、このキメラ分 子のFcグリコシル化部位を差引いた受容体部分上の炭水化物に関するデータを示 す。 表IVと表Vに記載の結果は、TNFR1-IgG₁が、シアル酸を末端とする典型的なモ ノ-、ビ-及びトリ-分岐複合型オリゴ糖であることを示している。プロセスIによ って生産されたTNFR1-IgG₁は、シアル酸比率が有意に高く、露出GlcNAc比率が有 意に低いと結論できる。タンパク質1モルあたりのシアル酸は、この物質がプロ セスIIによって生産される物質よりも低い等電点を持つであろうことを示してい る。これらの結果を表IIの結果と比較すると、プロセスI物質の遅い血漿クリア ランスが、低い露出GlcNAc含量と概して高いシアル酸含量とに相関していること がわかる。 表IVと表Vは、TNFR1-IgG₁製剤が1又はそれ以上のシアル酸残基を末端とする複 合型オリゴ糖を含むことを示している。好ましいTNFR1-IgG₁製剤は、タンパク質 1モルにつき約1〜2モルの露出N-アセチルグルコサミン残基を持つTNFR1-IgG₁分 子を含有する。タンパク質に対するシアル酸のモル比は約4〜7である。このTNFR 1-IgG₁製剤はN-アセチルグルコサミンに対するシアル酸のモル比が約0.4〜約0.4 5である。 実施例IV 多量にシアリル化された製剤のpIは、シアリル化量の少ない製剤のpIより低い 。方法 等電フォーカシングを実施例IIに記述した種々の調製物に対して行なった。等 電フォーカシングゲルは、pHの異なる両性電解質で作製したpH勾配を用いること により、製剤の糖タンパク質をその等電点（pI）に従って分離する。この研究で は、10から4までのpH勾配を用いて製剤を分析した。結果 TNFR1-IgG₁製剤は、クロマトフォーカシングで測定したところ、約5.5〜約7.5 の等電点範囲を示し、そのpIはノイラミニダーゼ処理による影響を受ける。 上に引用した文献は全て、特記したか否かに関わらず、参考文献として本明細 書の一部を構成する。 本発明をその特定の態様に関して説明したが、さらなる変更を施しうることは 理解されるだろう。本願は、本発明が属する技術分野の公知の又は通常の実施に 含まれるようなもの、及び添付の請求の範囲に記載するような上述の基本的特徴 に適用しうるものを含めて、一般に本発明の原理に従う本発明のいかなる変法、 使用及び翻案をも包含するものとする。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｌ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ライル，トーマス アメリカ合衆国94402カリフォルニア州 サン・マテオ、ウエスト・サード・アベニ ュー120番 アパートメント908 (72)発明者 レスローアー，ヴェルナー スイス、ツェーハー−4125リーヘン、アオ イセレ・バーゼルシュトラーセ288番 (72)発明者 シュライトムラー，トーマス ドイツ連邦共和国デー−79539レラハ、ビ ンツェナーシュトラーセ11エー番 (72)発明者 リヒター，ヴォルフガング ドイツ連邦共和国デー−7850レラハ、ディ ンケルベルクシュトラーセ23アー番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．哺乳類細胞培養によって生産される糖タンパク質のオリゴ糖側鎖上に存在 するシアル酸の量を制御する方法であって、 i）その細胞培養に約0.1mM〜約20mM濃度のアルカン酸又はその塩を添加し、 ii）その細胞培養の重量オスモル濃度を約250〜約600mOsmに維持することを特 徴とする該培養の生産相で哺乳類宿主細胞を培養することからなる方法。 ２．宿主細胞を約0.1〜約6mMのアルカン酸又はその塩濃度で培養し、その重量 オスモル濃度を約300〜約450mOsmに維持することによって細胞培養の細胞比生産 能を減じ、糖タンパク質のオリゴ糖側鎖上に存在するシアル酸の量を増大させる 請求項1の方法。 ３．宿主細胞がCHO細胞である請求項2の方法。 ４．アルカン酸又はその塩が酪酸ナトリウムである請求項3の方法。 ５．生産される糖タンパク質が哺乳類糖タンパク質である請求項4の方法。 ６．糖タンパク質が腫瘍壊死因子受容体-免疫グロブリンキメラである請求項5 の方法。 ７．宿主細胞が可溶性1型腫瘍壊死因子免疫グロブリンG₁キメラをコードするc DNAを保持するベクターでトランスフェクションされたdp12.CHO細胞系である請 求項6の方法。 ８．宿主細胞を約6mM〜約12mMのアルカン酸又はその塩濃度で培養し、その重 量オスモル濃度を約450〜600mOsmに維持することによって細胞培養の細胞比生産 能を増大させ、糖タンパク質のオリゴ糖側鎖上に存在するシアル酸の量を減少さ せる請求項1の方法。 ９．宿主細胞がCHO細胞である請求項8の方法。 10．アルカン酸又はその塩が酪酸ナトリウムである請求項9の方法。 11．生産される糖タンパク質が哺乳類糖タンパク質である請求項10の方法。 12．糖タンパク質が腫瘍壊死因子受容体-免疫グロブリンキメラである請求項1 1の方法。 13．宿主細胞が可溶性1型腫瘍壊死因子免疫グロブリンG₁ TNFR1-IgG₁キメラの cDNAを保持するベクターでトランスフェクションされたdp12.CHO細胞系である請 求項14の方法。 14．（a）TNFR-IGキメラを発現させる哺乳類宿主細胞を、最大細胞増殖が達成 されるような条件下に、最大細胞増殖が達成されるような期間、増殖相で培養す る； （b）約6mM〜約12mM濃度の酪酸ナトリウムの存在下に、生産相でその宿主細胞 を培養する； （c）その生産相の重量オスモル濃度を約450〜600mOsmに維持する； ことからなる腫瘍壊死因子受容体-免疫グロブリンTNFR1-IgG₁キメラタンパク質 の生産法。 15．（a）TNFR-IGキメラを発現させる哺乳類宿主細胞を、最大細胞増殖が達成 されるような条件下に、最大細胞増殖が達成されるような期間、増殖相で培養す る； （b）約1mM〜約6mM濃度の酪酸ナトリウムの存在下に、生産相でその宿主細胞 を培養する； （c）その生産相の重量オスモル濃度を約300〜450mOsmに維持する； ことからなる腫瘍壊死因子受容体-免疫グロブリンTNFR1-IgG₁キメラタンパク質 の生産法。 16．宿主細胞がCHO細胞である請求項15の方法。 17．宿主細胞がdp12.CHO系である請求項16の方法。 18．請求項17の方法によって生産されるTNFR1-IgG₁を含む製剤。 19．請求項15の方法によって生産されるTNFR1-IgG₁と医薬的に許容できる賦形 剤とを含む治療用組成物。 20．タンパク質に対するシアル酸のモル比が約4〜7のTNFR1-IgG1分子を含むTN FRI-IgG1製剤。 21．TNFR1-IgG₁タンパク質1モルにつき約1〜2モルの露出したN-アセチルグル コサミン残基を持つTNFR1-IgG1分子を含むTNFR1-IgG1製剤。 22．N-アセチルグルコサミンに対するシアル酸のモル比が約0.35〜約0.5であ るTNFR1-IgG1分子を含むTNFR1-IgG1製剤。 23．N-アセチルグルコサミンに対するシアル酸のモル比が約0.39〜約0.45であ る請求項22のTNFR1-IgG1製剤。