JP2010525328A - 細胞表面グリコシル化に関連する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2007年4月16日に出願された米国仮特許出願第60/923,655号の優先権の利益を主張するものであり、その内容全体を本明細書に援用する。
(a)治療用糖タンパク質産物などの糖タンパク質産物のグリコシル化の特徴を評価または予測する、
(b)糖タンパク質産物を生成するためのプロセスの1つ以上のステップで糖タンパク質産物の品質(グリカン構造など)を監視する、
(c)糖タンパク質産物を生成するためのプロセスにおけるプロセス条件の変化を検出する、
(d)(比較目的などで)糖タンパク質調製物の異なるバッチに関する情報を提供する、
(e)(比較目的などで)糖タンパク質産物を生成するためのプロセスの異なるステップで細胞の状態または糖タンパク質産物の状態に関する情報を提供する、
(f)(比較目的などで)糖タンパク質産物を生成するための複数のプロセスの同一のステップで細胞の状態または糖タンパク質産物の状態に関する情報を提供する、および/または
(g)(比較目的などで)同様または同一の条件下で増殖させた2つ以上の細胞または細胞集団(最初の細胞集団から選択された単一の細胞に由来するクローン集合体など)によって産生される糖タンパク質産物のグリコシル化の特徴に関する情報を提供する目的で、細胞表面グリカンを評価することが可能である。
およそ、約、だいたい:本明細書で使用する場合、1以上の目的の値に適用される「およそ」、「約」または「だいたい」という表現は、明記された参照値に近い値を示す。特定の実施形態では、「およそ」、「約」または「だいたい」という表現は、明記された参照値の25%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%またはそれ未満以内に入る値の範囲を示す。
本明細書に記載されているように、本開示は、細胞の表面に存在するグリカン構造の検出に関するものであり、その存在、アイデンティティおよび/または分布(相対量など)によって、細胞によって産生される1つ以上の非細胞表面糖タンパク質のグリコシル化状態および/または特徴に関する情報など、細胞の状態に関する情報が明らかになる。すなわち、本開示の一態様では、細胞表面グリカンが、非細胞表面糖タンパク質に見られるグリカン構造および/またはグリコシル化パターンの判定の代用となる。本開示のいくつかの実施形態では、非細胞表面糖タンパク質が治療用糖タンパク質である。このようないくつかの実施形態では、あらかじめ定められたレベルまたはあらかじめ定められた条件下で、細胞を操作して治療用糖タンパク質を発現および/または治療用タンパク質を発現させる。
多くの異なるタイプの細胞が、自ら産生するタンパク質および/または脂質の少なくともいくつかをグリコシル化し、このようなグリコシル化にも何とおりかの機序が存在する。しかしながら、オリゴ糖鎖は通常、小胞体およびゴルジ体でN−結合またはO−結合のいずれかによってポリペプチド鎖(すなわちタンパク質)および/または脂質に結合される。
一般に、N−結合型オリゴ糖鎖は小胞体の管腔でタンパク質に付加される(Alberts et al.,Molecular Biology of the Cell,1994(本明細書に援用する)を参照のこと)。特に、はじめのオリゴ糖(一般に14糖)は、Asn−X−Ser/Thrの標的コンセンサス配列に含まれるアスパラギン残基の側鎖のアミノ基に付加されるが、この場合のXは、プロリン以外のどのようなアミノ酸であってもよい。このはじめのオリゴ糖の構造はほとんどの真核生物に共通であり、3つのブドウ糖、9つのマンノース、2つのN−アセチルグルコサミン残基を含む。このはじめのオリゴ糖鎖は通常、小胞体の特定のグリコシダーゼ酵素でトリミングされ、2つのN−アセチルグルコサミンと3つのマンノース残基からなる短い分岐コアオリゴ糖になる。
ポリペプチド鎖の特定のセリンまたはトレオニン残基にO−結合型オリゴ糖鎖を加える。多くの場合はN−アセチルガラクトサミンである第1の糖残基の移動は、一般に小胞体で開始されてゴルジ体で完了する。O−結合型オリゴ糖の残基を一度にひとつずつ加え、各残基の付加を特定の酵素で触媒する。N−結合型グリコシル化とは対照的に、O−結合型グリコシル化のコンセンサスアミノ酸配列はあまりうまく画定されない。
本開示の技法を適用して、特定の細胞または細胞集団によってグリカンが直接的に分析または産生されるもの以外の目的の非細胞表面糖タンパク質または他の糖タンパク質のグリコシル化状態を評価してもよい。目的の非細胞表面糖タンパク質のアイデンティティは本開示を限定することを意図したものではない。しかしながら、ほとんどの実施形態では、細胞は、グリコシル化状態が評価対象となる、特定の目的の糖タンパク質(「標的」糖タンパク質)を産生することが知られている。
本明細書に記載されているようにしてグリコシル化を監視する対象となる糖タンパク質を、多岐にわたる細胞および/または細胞系のいずれにおいて産生させてもよいことは、当業者であれば容易に分かるであろう。特に、そのタンパク質のうち少なくともいくつかをグリコシル化する細胞を利用して、このようなグリコシル化を発生させることのできる条件下で増殖させることが可能である。好適な細胞としては、哺乳類の細胞、鳥の細胞、魚の細胞、昆虫の細胞、植物の細胞、真菌の細胞、細菌の細胞、ハイブリッド細胞があげられるが、これに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、細胞を操作(遺伝的におよび/または化学的になど)して、ヒトの細胞に一層よく似ている1つ以上のグリコシル化の特徴を持たせるようにする。
本開示に基づいて、好適な任意の手法を用いて細胞表面のグリカンを検出することができる。たとえば、依然として細胞によって産生される糖タンパク質の一部であるままの状態で、グリカンを細胞で検出および/または分析可能である。たとえば、特定の実施形態によれば、プロテアーゼ処理やグリコシダーゼ処理をほどこさずに、細胞でグリカンを検出および/または分析する。上記の他にまたは上記に加えて、グリカンを細胞から放出した後、検出および/または分析することが可能である。グリカンを細胞から放出するには、1種類以上のプロテアーゼ、グリコシダーゼまたはその両方に細胞を曝露してもよい。たとえば、限定することなく、本明細書に記載のプロテアーゼなどの1種類以上のプロテアーゼに細胞を曝露することで、糖ペプチドを細胞から遊離させることが可能であり、遊離された糖ペプチドを、限定することなく、本明細書に記載のグリコシダーゼなどの1種類以上のグリコシダーゼに曝露する。もうひとつの非限定的な例として、細胞にグリコシダーゼ処理をほどこすことで、細胞にプロテアーゼ処理をほどこさずに、細胞から直接的にグリカンを放出することが可能である。特定の代表的な分析法については下記にて詳細に説明するが、本開示の範囲を限定することを意図したものではない。
本開示の特定の実施形態では、細胞表面グリカンの分析に伴う一ステップは細胞の表面からこのようなグリカンを遊離している。このような実施形態で得られるいくつかの利点には、主に細胞内に見られるグリカンによって大幅に汚染されることなく、極めて純粋な細胞表面グリカンの集合体を得られることがある。たとえば、細胞表面グリカンを細胞から遊離させる際に、本開示の特定の方法を用いて、細胞の溶解を実質的に回避する。それに加えてあるいはその代わりに、本明細書に開示の特定の方法では、現在利用可能な方法と比較して、操作ステップの数および/または困難さが大幅に低減される。
本開示の特定の実施形態では、分析前に細胞表面グリカンを切断する。たとえば、特定の実施形態では、細胞表面糖ペプチドを(詳細については上述したように、プロテアーゼでの処理によるなどして)細胞から遊離させた後で、1つ以上のグリカン構造を細胞表面糖ペプチドから切断する。特定の実施形態では、細胞から遊離していない細胞表面糖タンパク質から1つ以上のグリカン構造を切断する。
グリカンの分析には、たとえば、配位子結合、質量分析、核磁気共鳴および/または他の方法論をはじめとするどのような手法を用いてもよい。グリカンを分析するための多岐にわたる方法が従来技術において周知である。たとえば、Anumula,Anal.Biochem,350(1):1〜23,2006;Klein et al.Anal.Biochem.,179:162〜66,1989;and Townsend,R.R.,Carbohydrate Analysis:High Performance Liquid Chromatography and Capillary Electrophoresis,ed.Z.El Rassi,pp.181〜209,1995,Yuan et al.,J.Chromatography A(2005)1067:145〜152(各々その内容全体を本明細書に援用する)を参照のこと。
多岐にわたる用途のいずれにも本明細書に記載の技法を利用できることは理解できよう。通常、これらの技法は、グリカンの構造的な特性決定を必要とするどのような用途でも有用であり、特に、標的複合糖質(糖タンパク質など)に関連したグリカンを特性決定することが望ましいが、標的複合糖質の単離には時間と手間を要する、あるいは他に課題がある(複合糖質の不安定さに関連する課題など)ような場合に有用である。
1つ以上の本開示の方法を実施するのに有用な試薬については、キットに同梱して一緒に提供すると望ましいことがある。特定の実施形態では、本開示のキットは、糖タンパク質を細胞表面から遊離させるのに有用な1種類以上の試薬(1種類以上のプロテアーゼ、グリコシダーゼおよび/または他の作用剤など)および/または緩衝液、コファクターなどの補助成分などを含む。特定の実施形態では、本開示の胃キットは、細胞表面糖タンパク質の遊離元となる細胞からの遊離細胞表面糖タンパク質の精製および/または分析に有用な1種類以上の試薬を含む。
実施例1:エキソグリコシダーゼ処理によって放出される細胞表面グリカンの検出によって、細胞表面グリコシル化と非細胞表面グリコシル化に同等の変化あることが明らかになる
目的の細胞表面糖タンパク質を産生したCHO細胞(この場合、非細胞表面抗体)を、第1の量のグルコサミンを含有する第1の培地と、第2の量のグルコサミンを含有する第2の培地という2種類の培地にて標準的な条件下で培養した。ここで、グルコサミンの第2の量のほうがグルコサミンの第1の量よりも多かった。
目的の細胞表面糖タンパク質を産生したCHO細胞(この場合、非細胞表面抗体)を、第1の量のN−アセチルマンノサミンを含有する第1の培地と、第2の量のN−アセチルマンノサミンを含有する第2の培地という2種類の培地にて標準的な条件下で培養した。ここで、N−アセチルマンノサミンの第2の量のほうがN−アセチルマンノサミンの第1の量よりも多かった。
糖タンパク質産物を産生するCHO細胞をグルコサミン補充の存在下または非存在下で培養した。5日後、細胞および産物を収集し、シアル酸含有量を別々に分析した。細胞表面シアル酸含有量については、図8に示すように陰イオン交換クロマトグラフィで求めた。グルコサミンを補充しなかった場合に対するシアル酸の変化率を細胞表面と産物の両方について下記の表2に示す。表2のデータは複数回の平均(S.D.)で示してある。
当業者であれば、本明細書に記載の本開示の特定の実施形態の多くの等価物を定法による実験だけで認識するか、または確認できる。本開示の範囲は上記の説明に限定されることを意図したものではなく、添付の特許請求の範囲に記載されているようなものである。
Claims (95)
- a)
(i)目的の糖タンパク質を産生する細胞の表面に第1の一組の条件下で存在する第1の表面グリコシル化パターンと、
(ii)この細胞の表面に第2の一組の条件下で存在する第2の表面グリコシル化パターンと、
の間のグリコシル化パターンの相違を判断するステップと、
b)こうして判断した相違に基づいて、細胞によって産生される目的の糖タンパク質のグリコシル化パターンの1つ以上の特徴を確立するステップと、を含む、細胞によって産生される糖タンパク質のグリコシル化パターンの1つ以上の特徴を判断する方法。 - 1つ以上の特徴が、目的の糖タンパク質のグリコシル化パターンの変化を含む、請求項1に記載の方法。
- 相違を判断するステップが、第1の表面グリコシル化パターンと第2の表面グリコシル化パターンとの間のシアリル化の相違を判断することを含む、請求項1に記載の方法。
- 1つ以上の特徴を確立するステップが、目的の糖タンパク質のグリコシル化パターンに存在するシアリル化の程度を確立することを含む、請求項3に記載の方法。
- 目的の糖タンパク質を産生する細胞が、目的の糖タンパク質を産生する細胞の培養であり、
第1の表面グリコシル化パターンが第1の時点で培養中の細胞表面に存在するパターンであるように、第1の一組の条件が第1の時点を表し、
第2の表面グリコシル化パターンが第2の時点で培養中の細胞表面に存在するパターンであるように、第2の一組の条件が第2の時点を表し、
このため、目的の糖タンパク質のグリコシル化パターンの1つ以上の特徴を確立するステップが、目的の糖タンパク質のグリコシル化パターンの経時的な変化を確立することを含み、これによって産生状態または品質を評価できるようにする、請求項1に記載の方法。 - 目的の糖タンパク質を産生する細胞が、目的の糖タンパク質を産生する細胞の培養であり、
第1および第2の一組の条件が、目的の糖タンパク質を産生する細胞の培養に適用される成長パラメータの異なる集合を表し、
このため、目的の糖タンパク質の産生に望ましい増殖パラメータが確立される、請求項1に記載の方法。 - a)
(i)細胞の第1の培養中の細胞表面に存在する第1の表面グリコシル化パターンと、
(ii)培養中の細胞表面に存在する第2の表面グリコシル化パターンと、
の間のグリコシル化パターンの相違を判断するステップと、
b)こうして判断した相違に基づいて、少なくとも1つのパラメータが、培養中の細胞によって産生される糖タンパク質のグリコシル化に対しておよぼす影響を確立するステップと、を含み、
第1の培養と第2の培養とは少なくとも1つのパラメータが互いに異なる、方法。 - 少なくとも1つのパラメータが単一のパラメータである、請求項7に記載の方法。
- 少なくとも1つのパラメータが細胞のアイデンティティを含む、請求項7または請求項8に記載の方法。
- 確立された効果に基づいて、糖タンパク質の産生に望ましい細胞を選択するステップをさらに含む、請求項9に記載の方法。
- 少なくとも1つのパラメータが少なくとも1つの増殖条件を含む、請求項7または8に記載の方法。
- 確立された効果に基づいて、糖タンパク質の産生に望ましい増殖条件を選択するステップをさらに含む、請求項11に記載の方法。
- 相違を判断するステップが、グリコシル化部位占有の度合い、結合型グリカンのアイデンティティ、結合型グリカンの相対量、結合型グリカンの完全組成または部分組成、結合型グリカンの相対量、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される特徴の相違を判断することを含む、請求項1または請求項7に記載の方法。
- 判断するステップが、少なくとも1つの細胞表面グリカンを細胞から遊離させ、遊離グリカンを分析することを含む、請求項1に記載の方法。
- 判断するステップが、
少なくとも1つの第1の細胞表面グリカンを第1の培養にて細胞から遊離させるステップと、
少なくとも1つの第2の細胞表面グリカンを第2の培養にて細胞から遊離させるステップと、
第1および第2の遊離細胞表面グリカンを分析するステップとを含む、請求項7に記載の方法。 - 遊離させるステップが細胞をプロテアーゼに曝露することを含む、請求項14に記載の方法。
- 遊離させるステップが各々、細胞をプロテアーゼに曝露することを含む、請求項15に記載の方法。
- 曝露するステップが、少なくとも1つの糖タンパク質が遊離されるようにプロテアーゼ処理することを含み、プロテアーゼ処理は細胞膜を実質的に破壊しないものである、請求項16または17に記載の方法。
- プロテアーゼが、プロテイナーゼK、トリプシン、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項18に記載の方法。
- プロテアーゼ処理するステップが、約0.1から2.0mg/mLの濃度で1種類以上のプロテアーゼに曝露することを含む、請求項19に記載の方法。
- プロテアーゼ処理するステップが、約37℃の温度で約15分間プロテアーゼ処理することを含む、請求項19に記載の方法。
- 分析するステップが、NMR、質量分析、液体クロマトグラフィ、二次元クロマトグラフィ、SDS−PAGE、抗体染色、レクチン染色、単糖定量化、蛍光標識糖質電気泳動(FACE)、ミセル動電クロマトグラフィ(MEKC)、エキソグリコシダーゼ処理またはエンドグリコシダーゼ処理、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される特性決定法を利用するものである、請求項14または15に記載の方法。
- 判断するステップが、細胞からグリカンを遊離させることを含まない、請求項1または請求項7に記載の方法。
- 判断するステップが、少なくとも1つの細胞表面複合糖質に、抗体染色、レクチン染色、単糖定量化、エキソグリコシダーゼ処理、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される特性決定法を適用することを含む、請求項23に記載の方法。
- 遊離させるステップが、
a)1つ以上のタンパク質結合型細胞表面グリカンを細胞表面糖タンパク質から切断し、
b)1つ以上の切断されたタンパク質結合型細胞表面グリカンを特性決定することを含む、請求項14または15に記載の方法。 - NMR、質量分析、液体クロマトグラフィ、二次元クロマトグラフィ、SDS−PAGE、抗体染色、レクチン染色、単糖定量化、蛍光標識糖質電気泳動(FACE)、ミセル動電クロマトグラフィ(MEKC)、エキソグリコシダーゼ処理またはエンドグリコシダーゼ処理、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される方法によって、1つ以上の切断されたタンパク質結合型細胞表面グリカンを特性決定する、請求項25に記載の方法。
- タンパク質結合型細胞表面グリカンがN−結合型グリカンである、請求項25に記載の方法。
- タンパク質結合型細胞表面グリカンがO−結合型グリカンである、請求項25に記載の方法。
- タンパク質結合型細胞表面グリカンが複合型グリカンを含む、請求項25に記載の方法。
- タンパク質結合型細胞表面グリカンが少なくとも1つのシアル酸残基を含む、請求項29に記載の方法。
- タンパク質結合型細胞表面グリカンが高マンノース型グリカンを含む、請求項25に記載の方法。
- タンパク質結合型細胞表面グリカンがハイブリッド型グリカンを含む、請求項25に記載の方法。
- 判断した相違に関する情報または固定培地におけるグリコシル化パターンのうちの少なくとも1つに関する情報を記録するステップをさらに含む、請求項1または請求項7に記載の方法。
- 記録した情報と履歴記録または参照標準とを比較するステップをさらに含む、請求項33に記載の方法。
- 記録または比較するステップが品質制御手順の一部である、請求項33または34に記載の方法。
- a)目的の糖タンパク質を産生する細胞であって、細胞が細胞表面グリコシル化パターンを有するように細胞表面に結合した少なくとも1つの細胞表面グリカンを有する細胞を提供するステップと、
b)細胞表面グリコシル化パターンの少なくとも1つの特徴を判断するステップと、
c)こうして判断した特徴に基づいて、目的の糖タンパク質のグリコシル化パターンの1つ以上の特徴を確立するステップとを含み、判断した特徴が目的の糖タンパク質のグリコシル化パターンの1つ以上の特徴と相関する、
細胞によって産生される目的の糖タンパク質のグリコシル化パターンの1つ以上の特徴を判断する方法。 - 少なくとも1つの細胞表面グリカンが細胞表面複合糖質の一部である、請求項36に記載の方法。
- 少なくとも1つの細胞表面グリカンが細胞表面糖タンパク質の一部である、請求項37に記載の方法。
- 確立するステップが、細胞表面糖タンパク質の一部である複数のグリカンを特性決定することを含む、請求項38に記載の方法。
- 判断した特徴が、グリコシル化部位占有の度合い、結合型グリカンのアイデンティティ、結合型グリカンの相対量、結合型グリカンの完全組成または部分組成、結合型グリカンの相対量、およびこれらの組み合わせからなる群から選択され、
確立するステップが、目的の糖タンパク質のグリコシル化パターンに、判断した特徴が共通して備わっている旨を判断することを含む、請求項39に記載の方法。 - 判断するステップよりも前に細胞表面糖タンパク質を細胞から遊離させる、請求項38に記載の方法。
- 糖タンパク質が細胞から遊離されるように細胞をプロテアーゼ処理することで、細胞表面糖タンパク質を細胞から遊離させ、プロテアーゼ処理は細胞膜を実質的に破壊しないものである、請求項41に記載の方法。
- プロテイナーゼK、トリプシン、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される1種類以上のタンパク質分解酵素に細胞を曝露することで、細胞表面糖タンパク質を細胞から遊離させる、請求項41に記載の方法。
- 曝露するステップが、約0.1から2.0mg/mLの濃度で1種類以上のタンパク質分解酵素に細胞を曝露することを含む、請求項43に記載の方法。
- 曝露するステップが、細胞を約37℃の温度で約15分間プロテアーゼ処理することを含む、請求項43に記載の方法。
- 判断するステップが、細胞表面糖タンパク質に、NMR、質量分析、液体クロマトグラフィ、二次元クロマトグラフィ、SDS−PAGE、抗体染色、レクチン染色、単糖定量化、蛍光標識糖質電気泳動(FACE)、ミセル動電クロマトグラフィ(MEKC)、エキソグリコシダーゼ処理またはエンドグリコシダーゼ処理、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される特性決定法を適用することを含む、請求項41に記載の方法。
- 判断するステップよりも前に細胞表面糖タンパク質を細胞から遊離させない、請求項37に記載の方法。
- 判断するステップが、少なくとも1つの細胞表面複合糖質に、抗体染色、レクチン染色、単糖定量化、蛍光標識糖質電気泳動(FACE)、ミセル動電クロマトグラフィ(MEKC)、エキソグリコシダーゼ処理またはエンドグリコシダーゼ処理、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される特性決定法を適用することを含む、請求項47に記載の方法。
- 細胞表面糖タンパク質が、1つ以上のタンパク質結合型細胞表面グリカンを含み、判断するステップが、
a)1つ以上のタンパク質結合型細胞表面グリカンを細胞表面糖タンパク質から切断し、
b)1つ以上の切断されたタンパク質結合型細胞表面グリカンを特性決定することを含む、請求項38に記載の方法。 - NMR、質量分析、液体クロマトグラフィ、二次元クロマトグラフィ、SDS−PAGE、抗体染色、レクチン染色、単糖定量化、蛍光標識糖質電気泳動(FACE)、ミセル動電クロマトグラフィ(MEKC)、エキソグリコシダーゼ処理またはエンドグリコシダーゼ処理、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される方法によって、1つ以上の切断されたタンパク質結合型細胞表面グリカンを特性決定する、請求項49に記載の方法。
- タンパク質結合型細胞表面グリカンがN−結合型グリカンである、請求項49に記載の方法。
- タンパク質結合型細胞表面グリカンがO−結合型グリカンである、請求項49に記載の方法。
- タンパク質結合型細胞表面グリカンが複合型グリカンを含む、請求項49に記載の方法。
- タンパク質結合型細胞表面グリカンが少なくとも1つのシアル酸残基を含む、請求項53に記載の方法。
- タンパク質結合型細胞表面グリカンが高マンノース型グリカンを含む、請求項49に記載の方法。
- タンパク質結合型細胞表面グリカンがハイブリッド型グリカンを含む、請求項49に記載の方法。
- 固定培地で特性決定した少なくとも1つの細胞表面グリカンに関する情報を記録するステップをさらに含む、請求項36〜56のいずれか一項に記載の方法。
- 記録した情報と履歴記録とを比較するステップをさらに含む、請求項57に記載の方法。
- 記録または比較するステップが品質制御手順の一部である、請求項57または請求項58に記載の方法。
- a)目的の糖タンパク質を産生する第1の細胞の表面に結合した少なくとも1つの第1の細胞表面グリカンを含む第1の細胞を提供するステップと、
b)少なくとも1つの第1の細胞表面グリカンを特性決定するステップと、
c)目的の糖タンパク質を産生する第2の細胞の表面に結合した少なくとも1つの第2の細胞表面グリカンを含む第2の細胞を提供するステップと、
d)少なくとも1つの第2の細胞表面グリカンを特性決定するステップと、
e)第1の細胞表面グリカンと第2の細胞表面グリカンとの1つ以上の相違を判断するステップと、
f)目的の糖タンパク質のグリコシル化パターンにおける1つ以上の相違を確立するステップとを含み、第1の細胞表面グリカンと第2の細胞表面グリカンとの間の判断した相違が、目的の糖タンパク質のグリコシル化パターンにおける1つ以上の相違と相関している、目的の糖タンパク質のグリコシル化パターンにおける1つ以上の相違を判断する方法。 - 第1および第2の細胞を細胞の初期集団から選択する、請求項60に記載の方法。
- 第1および第2の細胞を異なる細胞培養条件下で増殖させる、請求項60または61に記載の方法。
- 細胞培養条件が、細胞型、培養のタイプ、培養時間、培地のタイプ、モル浸透圧濃度、pH、温度、単離ステップ、およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるパラメータの点で異なっている、請求項62に記載の方法。
- 第1の細胞および第2の細胞を同一の細胞培養条件下で増殖させる、請求項60または61に記載の方法。
- 目的の糖タンパク質を産生する細胞を含む細胞培養液から、異なる時点で第1および第2の細胞を単離し、第1の細胞表面グリカンと第2の細胞表面グリカンとの間で判断した1つ以上の相違が、目的の糖タンパク質のグリコシル化パターンの経時的な変化を表す、請求項64に記載の方法。
- 第1および第2の細胞が、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、HeLa細胞、メイディンダービーイヌ腎臓(MDCK)細胞、ベビーハムスター腎臓(BHK細胞)、NS0細胞、MCF−7細胞、MDA−MB−438細胞、U87細胞、A172細胞、HL60細胞、A549細胞、SP10細胞、DOX細胞、DG44細胞、HEK 293細胞、SHSY5Y、ジャーカット細胞、BCP−1細胞、COS細胞、Vero細胞、GH3細胞、9L細胞、3T3細胞、MC3T3細胞、C3H−10T1/2細胞、NIH−3T3細胞、C6/36細胞、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項60〜65のいずれか一項に記載の方法。
- 少なくとも1つの第1の細胞表面グリカンが第1の細胞表面複合糖質の一部であり、第2の細胞表面グリカンが第2の細胞表面複合糖質の一部である、請求項60に記載の方法。
- 少なくとも1つの第1の細胞表面グリカンが第1の細胞表面糖タンパク質の一部であり、第2の細胞表面グリカンが第2の細胞表面糖タンパク質の一部である、請求項67に記載の方法。
- 少なくとも1つの第1の細胞表面グリカンを特性決定するステップが、細胞表面糖タンパク質の一部である複数の第1のグリカンを特性決定することを含み、
少なくとも1つの第2の細胞表面グリカンを特性決定するステップが、細胞表面糖タンパク質の一部である複数の第2のグリカンを特性決定することを含む、請求項68に記載の方法。 - 少なくとも1つの第1および第2の細胞表面グリカンを特性決定するステップが、グリコシル化部位占有の度合い、結合型グリカンのアイデンティティ、結合型グリカンの相対量、グリカンの完全組成または部分組成、および細胞表面グリカンに対するこれらの組み合わせからなる群から選択される特徴を評価することを含み、
目的の糖タンパク質のグリコシル化パターンにおける1つ以上の相違を確立するステップが、目的の糖タンパク質に、評価した特徴が共通して備わっている旨を判断することを含む、請求項69に記載の方法。 - 第1および第2の細胞表面グリカンを特性決定するステップの前に、第1および第2の細胞表面糖タンパク質を第1および第2の細胞から遊離させる、請求項69に記載の方法。
- 糖タンパク質が細胞から遊離されるように細胞をプロテアーゼ処理することで、第1および第2の細胞表面糖タンパク質を第1および第2の細胞から遊離させ、プロテアーゼ処理は細胞膜を実質的に破壊しないものである、請求項71に記載の方法。
- プロテイナーゼK、トリプシン、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される1種類以上のタンパク質分解酵素に細胞を曝露することで、第1および第2の細胞表面糖タンパク質を第1および第2の細胞から除去する、請求項72に記載の方法。
- 曝露するステップが、約0.1から2.0mg/mLの濃度で1種類以上のタンパク質分解酵素に細胞を曝露することを含む、請求項73に記載の方法。
- 曝露するステップが、細胞を約37℃の温度で約15分間プロテアーゼ処理することを含む、請求項73に記載の方法。
- 少なくとも1つの第1および第2の細胞表面グリカンを特性決定するステップが、少なくとも1つの第1および第2の細胞表面糖タンパク質に、NMR、質量分析、液体クロマトグラフィ、二次元クロマトグラフィ、SDS−PAGE、抗体染色、レクチン染色、単糖定量化、蛍光標識糖質電気泳動(FACE)、ミセル動電クロマトグラフィ(MEKC)、エキソグリコシダーゼ処理またはエンドグリコシダーゼ処理、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される特性決定法を適用することを含む、請求項71に記載の方法。
- 少なくとも1つの第1および第2の細胞表面グリカンを特性決定するステップよりも前に第1および第2の細胞表面複合糖質を第1および第2の細胞から遊離させない、請求項67に記載の方法。
- 少なくとも1つの第1および第2の細胞表面グリカンを特性決定するステップが、第1および第2の細胞表面複合糖質に、抗体染色、レクチン染色、単糖定量化、エキソグリコシダーゼ処理、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される特性決定法を適用することを含む、請求項77に記載の方法。
- 第1の細胞表面糖タンパク質が1つ以上の第1のタンパク質結合型細胞表面グリカンを含み、第2の細胞表面糖タンパク質が1つ以上の第2のタンパク質結合型細胞表面グリカンを含み、少なくとも1つの第1および第2の細胞表面グリカンを特性決定するステップが、
a)1つ以上の第1および第2のタンパク質結合型細胞表面グリカンを第1および第2の細胞表面糖タンパク質から切断し、
b)1つ以上の第1および第2の切断されたタンパク質結合型細胞表面グリカンを特性決定することを含む、請求項68に記載の方法。 - NMR、質量分析、液体クロマトグラフィ、二次元クロマトグラフィ、SDS−PAGE、抗体染色、レクチン染色、単糖定量化、蛍光標識糖質電気泳動(FACE)、ミセル動電クロマトグラフィ(MEKC)、エキソグリコシダーゼ処理またはエンドグリコシダーゼ処理、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される方法によって、1つ以上の第1および第2の切断されたタンパク質結合型細胞表面グリカンを特性決定する、請求項79に記載の方法。
- 第1のタンパク質結合型細胞表面グリカンがN−結合型グリカンであるか、第2のタンパク質結合型細胞表面グリカンがN−結合型グリカンであるか、またはその両方である、請求項79に記載の方法。
- 第1のタンパク質結合型細胞表面グリカンがO−結合型グリカンであるか、第2のタンパク質結合型細胞表面グリカンがO−結合型グリカンであるか、またはその両方である、請求項79に記載の方法。
- 第1のタンパク質結合型細胞表面グリカンが複合型グリカンを含むか、第2のタンパク質結合型細胞表面グリカンが複合型グリカンを含むか、またはその両方である、請求項79に記載の方法。
- 第1のタンパク質結合型細胞表面グリカンが少なくとも1つのシアル酸残基を含むか、第2のタンパク質結合型細胞表面グリカンが少なくとも1つのシアル酸残基を含むか、またはその両方である、請求項83に記載の方法。
- 第1のタンパク質結合型細胞表面グリカンが高マンノース型グリカンを含むか、第2のタンパク質結合型細胞表面グリカンが高マンノース型グリカンを含むか、またはその両方である、請求項79に記載の方法。
- 第1のタンパク質結合型細胞表面グリカンがハイブリッド型グリカンを含むか、第2のタンパク質結合型細胞表面グリカンがハイブリッド型グリカンを含むか、またはその両方である、請求項79に記載の方法。
- 固定培地で特性決定した少なくとも1つの第1および第2の細胞表面グリカンに関する情報を記録するステップをさらに含む、請求項60〜86のいずれか一項に記載の方法。
- 記録した情報と履歴記録とを比較するステップをさらに含む、請求項87に記載の方法。
- 記録または比較するステップが品質制御手順の一部である、請求項87または請求項88に記載の方法。
- a)目的の糖タンパク質を産生する細胞の表面に結合した少なくとも1つの細胞表面グリカンを含む細胞を提供するステップと、
b)少なくとも1つの細胞表面グリカンを特性決定するステップと、
c)目的の糖タンパク質のグリコシル化パターンの1つ以上の特徴を判断するステップと、を含み、特性決定された少なくとも1つのグリカンが目的の糖タンパク質のグリコシル化パターンの1つ以上の特徴と相関している、目的の糖タンパク質のグリコシル化パターンの1つ以上の特徴を判断する方法。 - 糖タンパク質が細胞から遊離されるように細胞をプロテアーゼ処理することで、細胞表面糖タンパク質を細胞から遊離させ、プロテアーゼ処理は細胞膜を実質的に破壊しないものである、請求項90に記載の方法。
- プロテイナーゼK、トリプシン、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される1種類以上のタンパク質分解酵素に細胞を曝露することで、細胞表面糖タンパク質を細胞から遊離させる、請求項90に記載の方法。
- 曝露するステップが、約0.1から2.0mg/mLの濃度で1種類以上のタンパク質分解酵素に細胞を曝露することを含む、請求項92に記載の方法。
- 曝露するステップが、細胞を約37℃の温度で約15分間プロテアーゼ処理することを含む、請求項92に記載の方法。
- 判断するステップが、細胞表面糖タンパク質に、NMR、質量分析、液体クロマトグラフィ、二次元クロマトグラフィ、SDS−PAGE、抗体染色、レクチン染色、単糖定量化、蛍光標識糖質電気泳動(FACE)、ミセル動電クロマトグラフィ(MEKC)、エキソグリコシダーゼ処理またはエンドグリコシダーゼ処理、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される特性決定法を適用することを含む、請求項90に記載の方法。
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