WO2017131022A1 - 糖タンパク質の検出方法 - Google Patents

糖タンパク質の検出方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2017131022A1
WO2017131022A1 PCT/JP2017/002517 JP2017002517W WO2017131022A1 WO 2017131022 A1 WO2017131022 A1 WO 2017131022A1 JP 2017002517 W JP2017002517 W JP 2017002517W WO 2017131022 A1 WO2017131022 A1 WO 2017131022A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
glycoprotein
sugar
lectin
afp
detecting
Prior art date
Application number
PCT/JP2017/002517
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
夕香 小林
桂子 西藤
泰 上野
Original Assignee
株式会社Ｊ－オイルミルズ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 株式会社Ｊ－オイルミルズ filed Critical 株式会社Ｊ－オイルミルズ
Priority to JP2017564305A priority Critical patent/JPWO2017131022A1/ja
Priority to US16/070,751 priority patent/US20200088737A1/en
Publication of WO2017131022A1 publication Critical patent/WO2017131022A1/ja

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57469—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving tumor associated glycolinkage, i.e. TAG
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/415—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from plants
    • G01N2333/42—Lectins, e.g. concanavalin, phytohaemagglutinin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/95—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2400/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving carbohydrates
    • G01N2400/02—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving carbohydrates involving antibodies to sugar part of glycoproteins

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting a glycoprotein, and more particularly, to a method for detecting a glycoprotein that improves detection sensitivity.
  • the binding mode of a sugar chain to a protein is divided into an N-linked type that binds to the amide group of an asparagine residue and an O-linked type that binds to the hydroxyl group of a serine or threonine residue.
  • Any sugar chain modification plays an important role in protein activity, cell-cell interaction, adhesion and the like. It has been reported that changes in glycosylation are associated with diseases.
  • ⁇ -fetoprotein (N-linked sugar chain) contained in serum is hardly present in healthy adult serum.
  • serum of patients with benign liver disease has increased ⁇ -fetoprotein-L1 sugar chain (AFP-L1), and liver cancer patients have further fucosylated ⁇ -fetoprotein-L3 sugar chain (fAFP or AFP-L3).
  • AFP-L1 sugar chain AFP-L1 sugar chain
  • fAFP or AFP-L3 sugar chain fAFP or AFP-L3 sugar chain
  • Haptoglobin is a glycoprotein having four N-linked sugar chain binding sites in the ⁇ chain.
  • lesion haptoglobin in which fucose is added to haptoglobin is detected from patient serum or the like.
  • the lesion haptoglobin increases as the stage of pancreatic cancer progresses, and disappears after removal of the tumor part of pancreatic cancer. Early detection of pancreatic cancer is expected by highly accurate and rapid detection of fucosylated haptoglobin.
  • Thyroglobulin is a hormone that is synthesized in epithelial cells of the thyroid gland and accumulates in the follicle, and generally acts on cells throughout the body to increase the metabolic rate of the cells.
  • a representative example of hyperthyroidism in which thyroid hormone is secreted excessively is Graves' disease. Graves' disease causes symptoms such as trembling of limbs, protruding eyes, palpitation, thyroid swelling, sweating, weight loss, hyperglycemia, and hypertension.
  • An example of hypothyroidism that lacks thyroid hormone secretion is chronic thyroiditis (Hashimoto's disease). Hashimoto's disease causes symptoms such as general malaise, decreased sweating, weight gain, and constipation.
  • This protein has fucose which is a kind of sugar chain. By increasing the detection sensitivity of the sugar chain added to thyroglobulin, the measurement accuracy of the thyroglobulin content can be increased.
  • Transferrin is a glycoprotein having 679 amino acids, the 413th and 611th aspartic acid residues being N-glycosylated with two branched sugar chains having terminal sialic acid. There are polymorphisms of transferrin, TFC1 in which the 570th amino acid residue is proline and TFC2 in which it is substituted with serine.
  • AD Alzheimer's disease
  • patients with a TFC1C2 heterozygous genotype have a significantly reduced relative intensity of TF with six sialic acids than patients with a TFC1C1 homozygous genotype.
  • CSF glycoprotein collected from AD patients has a significantly reduced sialic acid addition rate.
  • changes in the amount of sialic acid have been observed for cardiovascular diseases, alcoholism, diabetes and the like.
  • lectin which is a kind of sugar-binding compound.
  • Lectin is a general term for proteins showing affinity for sugar residues such as sialic acid, galactose, and N-acetylglucosamine.
  • Many lectins derived from plants, animals or fungi having an affinity for specific sugar residues have been discovered.
  • lectin ELISA enzyme immunoassay
  • lectin affinity chromatography is a chromatography that utilizes the property that lectins specifically bind to sugar chains, and identifies and separates slight differences in sugar chain structures.
  • Lectin affinity chromatography using a lectin HPLC column for high performance liquid chromatography (HPLC) is effective not only for analysis of sugar chains but also for purification.
  • Patent 4514163 (fucose ⁇ 1 ⁇ 6 specific lectin)
  • glycoprotein detection methods such as lectin ELISA and lectin chromatography
  • accurate detection of glycoproteins is difficult if the signal due to the reaction between glycoprotein and lectin is low.
  • an increase in signal based on a lectin reaction is desirable.
  • an object of the present invention is to provide a method for increasing a signal (reaction value) based on a reaction product of a glycoprotein and a sugar-binding compound such as a lectin in order to detect the glycoprotein with high accuracy. is there.
  • the present invention is a glycoprotein detection method, Treating a sample containing the glycoprotein with a protease; A step of detecting a reaction product of the glycoprotein and the sugar-binding compound by causing a sugar-binding compound having an affinity for a sugar chain of the glycoprotein to act on the protease-treated glycoprotein.
  • a detection method is provided.
  • glycoprotein is used to include glycopeptides.
  • sugar chain is used herein to include a monosaccharide.
  • sugar-binding compound as used herein means a compound that binds to a sugar.
  • the sugar binding compound is preferably a sugar binding protein.
  • the protease treatment is, for example, pepsin treatment, papain treatment or actinase treatment.
  • the sample is, for example, serum.
  • the sugar-binding compound has affinity for at least one selected from the group consisting of fucose, sialic acid, mannose, glucose, galactose, N-acetylglucosamine and N-acetylgalactosamine, for example.
  • the glycoprotein is preferably immobilized on a carrier.
  • the glycoprotein is preferably immobilized on the carrier via the antibody.
  • the sugar-binding compound and / or the probe for detecting the sugar-binding compound is preferably labeled.
  • the sugar chain is, for example, a complex sugar chain, a high mannose sugar chain, or an O-linked sugar chain.
  • glycoprotein examples include haptoglobin, fucosylated haptoglobin, transferrin, ⁇ -glutamyl transpeptidase, immunoglobulin G, immunoglobulin A, immunoglobulin M, ⁇ 1-acid glycoprotein, ⁇ -fetoprotein, fucosylated ⁇ -fetoprotein, fibrinogen, human It is selected from the group consisting of placental chorionic gonadotropin, carcinoembryonic antigen, prostate specific antigen, fucosylated prostate specific antigen, thyroglobulin, fetuin, and asialofetin.
  • a signal (reaction value) based on a reaction product of a protease-treated glycoprotein and a sugar-binding compound is increased as compared with a protease-untreated one.
  • increased signal leads to early detection, diagnosis and treatment of the disease. It is also expected to be useful for medical and biochemical research related to the elucidation of disease onset mechanisms, treatment and prevention.
  • the method for detecting a glycoprotein of the present invention comprises a step of subjecting a sample containing the glycoprotein to protease treatment, and allowing the glycoprotein subjected to the protease treatment to act on a sugar-binding compound having affinity for a sugar chain of the glycoprotein.
  • the method of the present invention is the same as the conventional method for detecting a glycoprotein using a sugar-binding compound, except that it essentially includes a step of subjecting a sample containing a glycoprotein to protease treatment.
  • the glycoprotein to be measured in the present invention is not particularly limited as long as it is a protein having a sugar chain.
  • the sugar chain includes an N-linked sugar chain and an O-linked sugar chain.
  • N-linked sugar chains have the following formula: [In the formula, Man means mannose and GlcNAc means N-acetylglucosamine]
  • Man means mannose
  • GlcNAc means N-acetylglucosamine
  • a high mannose sugar chain in which an oligosaccharide composed only of mannose is added to the core structure;
  • a hybrid sugar chain in which the complex type and the high mannose type are hybridized; Is included.
  • the N-linked sugar chain includes a sugar chain in which fuco
  • Sugar residues to be detected in the present invention include sialic acid (Sia), galactose (Gal), mannose (Man), glucose (Glc), N-acetylglucosamine (GlcNAc), N-acetylgalactosamine (GalNAc), Fucose (Fuc) and the like are included. These sugar residues may be added to or deleted from the sugar chain structure normally possessed by healthy individuals.
  • glycoproteins include haptoglobin (HP), fucosylated haptoglobin (fHP), transferrin (TF), ⁇ -glutamyl transpeptidase ( ⁇ -GTP), immunoglobulin G (IgG), immunoglobulin A (IgA) , Immunoglobulin M (IgM), ⁇ 1-acid glycoprotein, ⁇ -fetoprotein (AFP), fucosylated ⁇ -fetoprotein (fAFP, AFP-L3), fibrinogen, hCG (human placental chorionic gonadotropin), CEA (carcinoembryonic) Antigen), prostate specific antigen (PSA), fucosylated prostate specific antigen (fPSA), thyroglobulin (TG), fetuin (FET), asialofetin (aFET) and the like.
  • the glycoprotein is preferably one that suggests a relationship between a change in the sugar chain structure of the glycoprotein and a disease or abnormality.
  • the origin of the sample containing glycoprotein is not particularly limited. Examples thereof include blood, plasma, serum, tears, saliva, body fluid, milk, urine, cell culture supernatant, and secretions from transformed animals. Blood, plasma or serum is preferable, and serum is particularly preferable.
  • a sample containing a glycoprotein such as serum may be diluted in advance.
  • the glycoprotein is treated with a protease (proteolytic enzyme) before reacting with the sugar-binding compound.
  • the protease is not particularly limited as long as it is an enzyme that acts on glycoprotein to produce a glycopeptide.
  • the protease includes aspartic protease (acidic protease), serine protease, cysteine protease, metalloprotease, N-terminal threonine protease, glutamic acid protease and the like.
  • the origin of the protease is not limited.
  • the protease includes animal-derived proteases such as pepsin, trypsin, chymotrypsin, elastase, cathepsin D, calpain and the like; plant-derived proteases such as papain, chymopapain, actinidine, kallikrein, ficin, bromelain and the like; and microorganism-derived proteases belonging to the genus Bacillus, Examples include those derived from the genera Aspergillus, Rhizopus, Aokabi (Penicillium), Streptomyces, Staphylococcus, Clostridium, and Rhizobacter.
  • pepsin includes porcine gastric mucosa-derived pepsin (Sigma-Aldrich)
  • papain includes papaya-derived papain (manufactured by Funakoshi Co., Ltd.)
  • streptomyces-derived protease includes actinase E (manufactured by Kaken Pharmaceutical Co., Ltd.).
  • the amount of protease used may be an amount that allows the reaction between the glycoprotein and the protease to proceed.
  • the concentration during the reaction is usually 0.0001 to 5 mg / mL.
  • pepsin is preferable in that the effect can be obtained with a small amount of 0.0001 to 1 mg / mL.
  • protease treatment The conditions such as pH, temperature, and time for protease treatment depend on the type of proteolytic enzyme used.
  • Protease treatment using pepsin is usually at a pH of 1.5-5, preferably 2-4, and usually at a temperature of 10-60 ° C, preferably 15-45 ° C, more preferably 20-40 ° C.
  • the reaction is usually performed for 1 minute to 24 hours, preferably 1 minute to 180 minutes, more preferably 2 minutes to 120 minutes, and even more preferably 2 minutes to 60 minutes.
  • Protease treatment using papain is usually under a pH of 3-10, preferably 5-8, and usually at a temperature of 20-80 ° C, preferably 20-45 ° C, more preferably 20-40 ° C.
  • Protease treatment using actinase E is usually at a pH of 7-10, preferably 7-8.5, and usually at a temperature of 10-50 ° C, preferably 20-45 ° C, more preferably 20-40 ° C.
  • the enzyme reaction is stopped by appropriate means such as pH change, heat treatment, addition of enzyme reaction stop solution. Thereafter, the reaction solution may be separated into a supernatant and a solid residue by separation means such as filtration, dialysis, and centrifugation.
  • a reaction product of the glycoprotein and the sugar-binding compound is obtained by allowing the glycoprotein treated with the protease to act on a sugar-binding compound having an affinity for the sugar chain of the glycoprotein.
  • Carriers for immobilizing glycoproteins can be materials such as glass, polyethylene, polypropylene, polyvinyl acetate, polyvinyl chloride, polymethacrylate, latex, agarose, cellulose, dextran, starch, dextrin, silica gel, porous ceramics, etc. And beads, disks, sticks, tubes, microtiter plates, microsensor chips, microarrays and the like.
  • the glycoprotein may be immobilized on a carrier via the antibody.
  • the antibody may be an antibody molecule itself, or may be an active fragment containing an antigen recognition site such as Fab, Fab ', F (ab') 2 obtained by enzymatic treatment of the antibody.
  • Antibodies include antisera and ascites fluid obtained by immunizing mammals such as humans, mice and rabbits with glycoproteins as antigens, as well as salting out, gel filtration, ion exchange chromatography, electrophoresis, affinity Polyclonal antibodies purified by a general method such as chromatography are included.
  • the antibody can be a hybridoma that produces a monoclonal antibody that recognizes the glycoprotein by fusing mouse-producing lymphocytes and myeloma cells of a mouse immunized with a protein prepared from human or animal serum or the like.
  • the hybridoma or a cell line derived therefrom is cultured, and a monoclonal antibody collected from the culture is included.
  • a monoclonal antibody collected from the culture is included.
  • antibodies are sold as reagents, and in the present invention, they can be used without limitation.
  • the sugar chain is appropriately removed from the antibody.
  • the monoclonal antibody is treated with a sugar chain degrading enzyme such as neuraminidase, ⁇ -galactosidase, or N-glycanase.
  • the Fc part of the antibody is treated with pepsin, papain, etc.
  • Examples include a method of culturing by adding a sugar chain synthesis inhibitor to a hybridoma or a hybridoma-derived animal cell medium, which is limitedly hydrolyzed by a proteolytic enzyme, oxidatively degrades the sugar chain structure with a periodic acid aqueous solution.
  • the method for immobilizing the antibody on the carrier general-purpose methods such as physical adsorption, covalent bond, and crosslinking can be used without particular limitation.
  • the antibody is bound to the carrier by adding a solution of an antibody against the glycoprotein (eg, an anti-transferrin antibody) to the carrier.
  • glycoprotein is bound by the antigen-antibody reaction by adding a glycoprotein solution to the antibody-bound carrier.
  • the sugar-binding compound used in the present invention means a compound having an affinity for a sugar chain of a glycoprotein.
  • the sugar-binding compound to be used is appropriately selected depending on the sugar chain that binds to the glycoprotein.
  • the sugar-binding compound is, for example, a protein (including a peptide) that binds to a sugar, or a nucleic acid such as DNA or RNA that binds to a sugar.
  • the sugar binding protein includes lectin, anti-sugar chain antibody, maltose binding protein, glucose binding protein, galactose binding protein, cellulose binding protein, chitin binding protein, and carbohydrate binding module.
  • the sugar-binding compound is preferably a sugar-binding protein, more preferably a lectin and an anti-sugar chain antibody, and even more preferably a lectin.
  • the sugar-binding compound may be a single type or a combination of two types.
  • the affinity of the lectin is expressed in terms of the minimum inhibitory concentration of saccharide that inhibits hemagglutination, it is usually 100 mM or less, preferably 10 mM or less.
  • the minimum inhibitory concentration means the minimum concentration required for the sugar to prevent the aggregation reaction. A smaller minimum inhibitory concentration indicates a higher affinity for lectins.
  • Patent Document 1 Patent 4514163. US Pat. No. 4,514,163 is incorporated herein by reference.
  • the lectin may be a naturally-derived lectin or a lectin obtained by chemical synthesis or genetic engineering synthesis.
  • the origin of the natural lectin may be any of plants, animals and fungi. Examples of natural lectins that can be used in the present invention are shown below.
  • Examples of lectins having an affinity for galactose (Gal) / N-acetylgalactosamine (GalNAc) include mushroom lectin (ABA), dolicos bean lectin (DBA), deigo bean lectin (ECA), kidney bean lectin (PHA-E4, PHA-P), peanut lectin (PNA), soybean lectin (SBA), purple mulberry lectin (BPL), and castor lectin (RCA120).
  • Examples of lectins having affinity for mannose (Man) / glucose (Glc) include concanavalin A (ConA), lentil lectin (LCA, LCA-A), and pea lectin (PSA).
  • Examples of lectins that have an affinity for fucose include: white lectin lectin (AAL), lentil lectin (LCA, LCA-A), lotus lectin (Lotus), pea lectin (PSA), gorgeous lectin (UEA- I), Miyakogusa lectin (LTA), daffodils lectin (NPA), broad bean lectin (VFA), Neisseria gonorrhoeae lectin (AOL), Sugitake lectin (PhoSL), Tsutsugitake lectin (PTL), Salmonella lectin (SRL), Kuritatake Examples thereof include lectin (NSL), komura saxiform lectin (LSL), and fly agaric lectin (AML).
  • PhoSL, PTL, SRL, NSL, LSL and AML specifically bind to ⁇ 1 ⁇ 6 fucose, and therefore the addition or absence of ⁇ 1 ⁇ 6 fucose is advantageous for detection of a glycoprotein associated with a disease.
  • lectins having an affinity for N-acetylglucosamine include Datura morning glory lectin (DSA), American pokeweed lectin (PWM), wheat germ lectin (WGA), Banderia bean lectin-II (GSL-II) , Musinatake lectin (PVL).
  • Examples of lectins having an affinity for sialic acid include canine endlectin (MAM), Japanese elephant collectin (SSA), wheat germ lectin (WGA), willow matsutake lectin (ACG), Kikarasuri lectin (TJA-I) ), Mushroom lectin (PVL), and western elder collectin (SNA-I).
  • canine endlectin MAM
  • SSA Japanese elephant collectin
  • WGA wheat germ lectin
  • ACG willow matsutake lectin
  • TJA-I Kikarasuri lectin
  • PVL Mushroom lectin
  • SNA-I western elder collectin
  • the sugar-binding compound is preferably labeled with a labeling means known in the art so as to be detectable.
  • the sugar-binding compound may be detected via a probe that reacts with the sugar-binding compound (for example, an antibody that binds to a sugar-binding compound such as an anti-lectin antibody).
  • the probe is preferably labeled with a labeling means known in the art.
  • the probe for detecting the sugar-binding compound may be used alone or in combination of two or more.
  • Examples of means for labeling the sugar-binding compound and / or the probe for detecting the sugar-binding compound include horseradish peroxidase (HRP), alkaline phosphatase (AP), ⁇ -D-galactosidase, glucose oxidase, glucose-6-phosphorus Enzymes such as acid dehydrogenase, fluorescent compounds such as fluorescein isothiocyanate (FITC), tetramethylrhodamine B isothiocyanate (TRITC), rhodamine, CyDye, radioactive materials such as 125 I, 3 H, 14 C, gold sol, silver sol, Examples thereof include metal colloids such as platinum sol, synthetic latex such as polystyrene latex colored with pigments, biotin and digoxigenin.
  • HRP horseradish peroxidase
  • AP alkaline phosphatase
  • ⁇ -D-galactosidase glucose oxidase
  • glucose-6-phosphorus Enzymes such
  • HRP horseradish peroxidase
  • TMB 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine
  • OPD o-phenylenediamine
  • PNPP p-nitrophenyl phosphate
  • 4-methylumbelliferyl phosphate as a substrate for alkaline phosphatase
  • o-nitrophenol as a substrate for ⁇ -D-galactosidase
  • the labeling means can be bound to the sugar-binding compound or a probe for detecting the sugar-binding compound by a conventional method.
  • the glycoprotein is exposed to a solution containing the sugar binding compound.
  • a reaction product between the glycoprotein and the sugar-binding compound is detected.
  • a method for detecting a reaction product between a glycoprotein and a sugar-binding compound is not particularly limited, and can be used by methods well known to those skilled in the art. Examples of detection methods include lectin ELISA (direct adsorption method, sandwich method), lectin affinity chromatography (eg, using HPLC-lectin column), lectin affinity electrophoresis, chrominization of enzymes, etc., luminescence, fluorescence, etc.
  • a method for detecting evanescent waves such as a sugar chain array or a lectin array
  • a method for detecting a mass change such as a crystal oscillator microbalance method or a surface plasmon resonance method.
  • the surface plasmon resonance method is convenient because the amount of glycoprotein immobilized on a carrier and the amount of detected sugar-binding compound bound to the glycoprotein can be simultaneously measured by a multi-step method.
  • the amount of sugar chain represented by the amount of labeled substance (absorbance, etc.) of the labeled sugar-binding compound can be detected by comparing it with that of the standard sample. For example, when the glycoprotein concentration of the sample is adjusted to a constant value, the measurement result of the detected sugar-binding compound reflects a change in the amount of a specific sugar chain added to the glycoprotein. By comparing the amount of sugar chains of glycoproteins between healthy subjects and patients, it is possible to diagnose diseases associated with sugar chain changes with higher accuracy than before.
  • Quantifying the rate of change in the amount of sugar residues is very useful for diagnosis, treatment and prevention, research, etc. of diseases associated with sugar chain changes.
  • the total amount of sugar residues in a reference sample for example, a healthy person's glycoprotein or a commercially available or synthesized reagent
  • the amount of sugar residue is represented by the amount of labeled substance (absorbance etc.) of the labeled detection sugar-binding compound.
  • the amount of sugar residues in the unknown sample is measured by the detection method of the present invention.
  • a value obtained by dividing the amount of sugar residues measured in an unknown sample by the total amount of sugar residues is the sugar addition rate.
  • the sugar deficiency rate is obtained by subtracting the sugar addition rate from 1.
  • the rate of change in the amount of sugar chain may be expressed by the ratio of the amount of sugar chain to the amount of glycoprotein in the measurement sample.
  • the amount of glycoprotein is determined by absorbance, enzyme-linked immunosorbent method, Bradford method, Raleigh method or the like.
  • a calibration curve for derivation of the sugar addition rate or sugar deficiency rate is advantageous in terms of increasing the efficiency of measurement work.
  • a plurality of standard samples with known sugar residue amounts and different sugar residue amounts were measured in advance by the detection method of the present invention, and the target sugar residue amount and the amount of labeled substance (absorbance, etc.) of the detected sugar-binding compound were determined. And create a calibration curve.
  • the amount of labeled product (absorbance, etc.) of a sample whose target sugar residue amount is unknown is determined by the detection method of the present invention, and the amount of labeled product is applied to the calibration curve.
  • ELISA direct adsorption method
  • a sample such as serum containing glycoprotein is added to an ELISA plate and immobilized (analyte reaction).
  • a biotin-labeled lectin is added to react the sugar chain with the lectin (lectin reaction, primary reaction).
  • An HRP-labeled streptavidin solution is added as a secondary labeling compound to react biotin with streptavidin (probe reaction, secondary reaction).
  • the color developing substrate for HRP is added to cause color development, and the color intensity is measured with an absorptiometer. If a calibration curve is prepared in advance using a standard sample containing a sugar chain having a known concentration, the sugar chain can be quantified.
  • ELISA sandwich method
  • an antibody that binds to a glycoprotein (antigen) is added to an ELISA plate, and the antibody is immobilized on the plate.
  • a sample serum or the like
  • a biotin-labeled lectin is added to react the sugar chain with the lectin (lectin reaction).
  • An HRP-labeled streptavidin solution is added as a secondary probe to react biotin with streptavidin (probe reaction).
  • the color developing substrate for HRP is added to cause color development, and the color intensity is measured with an absorptiometer. If a calibration curve is prepared in advance with a standard sample having a known concentration, sugar chains can be quantified.
  • glycoprotein detection sensitivity is improved, which contributes to improvement in diagnosis accuracy of diseases associated with sugar chain changes.
  • diseases in which galactose residues can serve as diagnostic indicators include rheumatoid arthritis, liver cancer, myeloma and the like.
  • diseases in which mannose residues can serve as diagnostic indicators include rectal cancer.
  • diseases in which fucose residues can serve as diagnostic indicators include colon cancer, pancreatic cancer, liver cancer and the like.
  • diseases in which N-acetylglucosamine residues can serve as diagnostic indicators include idiopathic normal pressure hydrocephalus and liver cancer.
  • Examples of diseases in which sialic acid residues can serve as diagnostic indicators include Alzheimer's disease, cardiovascular disease, alcoholism, IgA nephropathy, liver cancer, prostate cancer, ovarian cancer, myocardial infarction, fibrosis, pancreatitis, diabetes, sugar Examples include protein sugar chain transfer deficiency.
  • the reagent used for this invention was prepared or prepared in the following procedures.
  • PBS phosphate buffered saline
  • [1M glycine hydrochloride buffer (pH 3.0)] 75.07 g of glycine (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was dissolved in about 900 mL of water, 6N hydrochloric acid was added to adjust to pH 3.0 with a pH meter, and the volume was increased to 1000 mL with water.
  • Tris-HCl buffer (pH 9.0) 60.6 g of trishydroxymethylaminomethane (manufactured by Nacalai Tesque) was dissolved in about 400 mL of water, 6N hydrochloric acid was added to adjust to pH 9.0 with a pH meter, and the volume was adjusted to 500 mL with water.
  • Tris-HCl buffer (pH 9.0) 20.2 g of the above trishydroxymethylaminomethane was dissolved in about 400 mL of water, 6 N hydrochloric acid was added, the pH was adjusted to 9.0 with a pH meter, and the volume was adjusted to 500 mL with water.
  • glycoprotein solution Each of the following glycoproteins was dissolved in water to a concentration of 2 mg / mL to obtain a glycoprotein solution.
  • Protease solution A protease solution shown below was prepared.
  • ⁇ pepsin ⁇ Pepsin (derived from porcine gastric mucosa, manufactured by Sigma-Aldrich, code No. P6887) was dissolved in 0.1 M / mL (0.01% by mass) with 1M glycine hydrochloride buffer (pH 3.0).
  • [Papain] Papain derived from papaya, manufactured by Funakoshi Co., Ltd., code No. LS003126 was added at a concentration of 2 mg / min with a cysteine solution (0.2 M phosphate buffer, pH 6.5 containing 1.1 mM EDTA, 0.067 mM cysteine hydrochloride).
  • Actinase E (manufactured by Kaken Pharmaceutical Co., Ltd., code No. 90002-1611) was dissolved in 10 mM calcium chloride / 100 mM Tris-HCl buffer (pH 7.8) to a concentration of 10 mg / mL (1% by mass).
  • PMSF solution 17.4 mg of phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) is dissolved in 500 ⁇ L of dimethyl sulfoxide (DMSO, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) to obtain 200 mM.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • a PMSF solution was prepared. This was diluted 20-fold with water immediately before use to prepare a 10 mM PMSF solution.
  • BSA concentration 1% bovine serum albumin
  • PhoSL an ⁇ 1-6 fucose-specific lectin
  • Sugitake according to the method described in Non-Patent Document 1.
  • a synthetic PhoSL peptide (SEQ ID NO: 1), which is one of the synthetic peptides of PhoSL, was synthesized according to the method described in Non-Patent Document 1.
  • Aspergillus lectin (AOL) was obtained from Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.
  • Western chick collectin (SNA-I), bittern lectin (MCL), and tulip lectin (TxLC-I) were purified by the methods described in Non-Patent Documents 2 to 4, respectively.
  • Biotin-labeled chickpea lectin AAL
  • biotin-labeled lentil lectin LCA
  • biotin-labeled pea lectin PSA
  • biotin-labeled red bean lectin ConA
  • biotin-labeled Japanese elder collectin SSA
  • biotin Labeled castor lectin RCA120
  • biotin-labeled lentil lectin EAA
  • biotin-labeled kidney bean lectin PHA-E4
  • All biotin-labeled lectins were prepared in PBS to a concentration of 1 mg / mL and diluted to the appropriate concentration when used.
  • the procedure for actinase E treatment of glycoprotein is shown below using AFP-L3 as an example.
  • (1) Enzymatic reaction The 1% by mass actinase E solution was diluted with the 10 mM calcium chloride / 100 mM Tris-HCl buffer (pH 7.8) to a concentration of 0.00125% by mass. 42 ⁇ L of this diluted solution and 70 ⁇ L of an AFP-L3 aqueous solution having a concentration of 8 mg / mL were mixed and incubated at a temperature of 37 ° C. for 30 minutes.
  • (2) Stopping the reaction The above reaction solution was mixed with 14 ⁇ L of 10 mM PMSF to stop the proteolytic reaction, and a solution of actinase E-treated AFP-L3 was obtained.
  • AFP-L3 The procedure of papain treatment of glycoprotein is shown below using AFP-L3 as an example.
  • HRP horseradish peroxidase
  • the absorbance at wavelengths of 450 nm and 630 nm was measured using a plate reader (product name: POWERSCAN (registered trademark) HT, manufactured by Biotech Co., Ltd.).
  • a value obtained by subtracting the absorbance value at 630 nm from the absorbance value at 450 nm was defined as a detection value (signal: S).
  • the value obtained by subtracting the detection value (noise: N) without addition of glycoprotein from the detection value (S) with addition of glycoprotein was defined as the reaction value (S ⁇ N).
  • Examples 1 to 14 Detection of pepsin-treated AFP-L3 with a lectin having affinity for fucose, sialic acid, galactose, mannose, glucose, etc.
  • Glycoprotein AFP-L3 was treated with pepsin for 30 minutes, and the resulting pepsin-treated AFP-L3 was detected by lectin ELISA (sandwich method). The detection test was performed in the same manner as the above sandwich ELISA method except for the following points.
  • an anti-human AFP monoclonal antibody (mouse) (manufactured by Funakoshi Co., Ltd.) was used as the immobilized antibody.
  • Table 1 shows the reaction value (SN) and increase ⁇ of pepsin-treated AFP-L3 and untreated AFP-L3 to lectins or antibodies.
  • the reaction value of protease-treated AFP-L3 with lectin was higher than the reaction value of protease-untreated AFP-L3 and lectin.
  • the reaction value was not increased by the protease treatment. Therefore, the increase in the reaction value between the protease-treated glycoprotein AFP-L3 and lectin (that is, the improvement in detection sensitivity of glycoprotein) is not caused by the increase in the amount of glycoprotein bound to the solid phase antibody. It was confirmed.
  • the reaction value of the AFP treated with protease and the lectin was higher than the reaction value of AFP and lectin untreated with protease.
  • the reaction value was not increased by the protease treatment. This confirms that the increase in the reaction value between glycoprotein and lectin by protease treatment, that is, the improvement in detection sensitivity of glycoprotein is not caused by the increase in the amount of AFP bound to the solid phase antibody of glycoprotein. It was.
  • Example 22 Detection of AFP-L3 by actinase E treatment with lectin having affinity for fucose
  • the protease treatment of glycoprotein was changed from pepsin treatment to actinase E treatment. Specifically, in Example 1, the same operation was performed except for the following points.
  • AFP-L3 400 ng / mL
  • untreated AFP-L3 400 ng / mL
  • biotin-labeled PhoSL 0.5 ⁇ g / mL
  • Table 3 shows the lectin reaction values (SN) of protease-treated AFP-L3 and untreated AFP-L3, and the increase ⁇ in the reaction value due to protease treatment.
  • Example 23 Detection of papain-treated AFP-L3 with a lectin having affinity for fucose
  • the protease treatment of glycoprotein was changed from pepsin treatment to papain treatment.
  • the same operation was performed except for the following points.
  • an anti-human AFP monoclonal antibody (mouse) (manufactured by Funakoshi Co., Ltd.) was used as the immobilized antibody.
  • papain-treated AFP-L3 1000 ng / mL
  • untreated AFP-L3 1000 ng / mL
  • biotin-labeled PhoSL 0.5 ⁇ g / mL
  • Table 4 shows the lectin reaction values (SN) of protease-treated AFP-L3 and untreated AFP-L3, and the increase ⁇ in the reaction value due to protease treatment.
  • Table 4 shows that even when papain, which is a proteolytic enzyme different from pepsin, is used for protease treatment, the reaction value between AFP-L3 and lectin increases by protease treatment.
  • a TF solution after pepsin treatment (1 ⁇ g / mL) and an untreated TF solution (1 ⁇ g / mL) were used as glycoprotein solutions.
  • biotin-labeled SSA (1 ⁇ g / mL) described in Table 1 was used.
  • 0.2 ⁇ g / mL anti-human transferrin polyclonal antibody (mouse) (manufactured by Cosmo Bio Co., Ltd.) was used instead of lectin.
  • HRP horseradish peroxidase
  • Table 5 shows the reaction value (SN) and increase ⁇ of pepsin-treated TF and untreated TF to lectin or antibody.
  • HRP horseradish peroxidase
  • Table 6 shows the reaction value (SN) and increase ⁇ of pepsin-treated IgG and untreated IgG with respect to lectin or antibody.
  • AFP-L3 solution To human pool serum (100% serum, manufactured by KAC Co., Ltd.) 992 ⁇ L and 10% serum 992 ⁇ L obtained by diluting this 100% serum 10 times with PBS, 50 ⁇ g / 8 ⁇ L of mL AFL-L3 solution was added to prepare AFP-L3 / 100% serum and AFP-L3 / 10% serum (both AFP-L3 concentration: 400 ng / mL).
  • the detection test using lectins was carried out in the same manner as described above in the sandwich ELISA method except for the following points.
  • an anti-human AFP monoclonal antibody (mouse) (manufactured by Funakoshi Co., Ltd.) was used as the immobilized antibody.
  • AFP-L3 / 100% serum after pepsin treatment AFP-L3 / 10% serum after pepsin treatment
  • untreated AFP-L3 / 100% serum untreated AFP-L3 / 10% serum
  • untreated AFP-L3 / 10% serum AFP-L3 concentration: 0.2 ⁇ g / mL
  • biotin-labeled PhoSL biotin-labeled AAL
  • biotin-labeled SNA-I biotin-labeled SSA (all 0.5 ⁇ g / mL) were used.
  • Example 35 Detection of pepsin-treated AFP-L3 with a lectin having affinity for fucose (III)
  • the serum to which AFP-L3 was added was subjected to pepsin treatment at different times, and AFP-L3 detection test was performed on each treated sample by sandwich ELISA.
  • the AFP-L3 / 100% serum (AFP-L3: 400 ng / mL) of Example 31 was used in the pepsin treatment procedure. , 15, 30, 45 or 60 minutes except that the procedure was the same as in Example 31.
  • Table 8 shows the response value (SN) and increase ⁇ of pepsin-treated AFP-L3 / 100% serum and untreated AFP-L3 / 100% serum to lectins.
  • Example 40 Detection of pepsin-treated AFP-L3 on HPLC-lectin column Aglycine protein was subjected to pepsin treatment for 30 minutes using AFP-L3, and a pepsin-treated AFP-L3 binding test was performed on an HPLC-PhoSL column. .
  • the specific procedure is shown below. (1) Preparation of HPLC-PhoSL column PhoSL was immobilized on activated hard gel (manufactured by J-Oil Mills Co., Ltd.) according to the attached manual, and packed in a stainless steel column (150 mm ⁇ 4.6 mm ID).
  • HPLC analysis Using an HPLC analyzer (system: LC-8020, pump: DP-8020, both manufactured by Tosoh Corporation), pepsin-treated AFP-L3 or pepsin-untreated AFP-L3 was treated with buffer A at 10 100 ⁇ L of the diluted product was injected. Buffer A was allowed to flow for 10 minutes to obtain a non-adsorption peak, and then Buffer B was allowed to flow for 10 minutes to obtain an adsorption elution peak. The flow rate was 0.5 mL / min, and the detection was UV280 nm (UV-2080, manufactured by Tosoh Corporation).
  • Table 9 shows the non-adsorption peak area, adsorption elution peak area, and binding rate (%) of pepsin-treated AFP-L3 by HPLC-PhoSL.
  • AFP-L3 solution was added to human pooled serum to prepare AFP-L3 / 100% serum (AFP-L3 concentration: 200 ng / mL).
  • reagent [1.2 M glycine hydrochloride buffer (pH 3.25)] 90.08 g of glycine was dissolved in about 900 mL of water, 6N hydrochloric acid was added to adjust the pH to 3.25 with a pH meter, and the volume was increased to 1000 mL with water.
  • BSA bovine serum albumin
  • 1.2 M glycine hydrochloride buffer pH 3.25
  • Pepsin reaction In 60 ⁇ L of the above AFP-L3 / 100% serum, pepsin dissolved in 0.1% BSA / 1.2M glycine hydrochloride buffer (pH 3.25) (0.47 to 1.1 mg / mL) ) was added, and after stirring, the mixture was allowed to stand at 25 ° C.
  • Stop reaction After 5, 7, 9, 11, 13, or 15 minutes, 30 ⁇ L of 0.33 M Tris-HCl buffer (pH 9.0) was added to stop the reaction.
  • the detection test using lectins was carried out in the same manner as described above in the sandwich ELISA method except for the following points.
  • an anti-human AFP monoclonal antibody (mouse) (manufactured by Funakoshi Co., Ltd.) was used as the immobilized antibody.
  • the AFP-L3 / 100% serum after the pepsin treatment and the untreated AFP-L3 / 100% serum were used as glycoprotein solutions (both AFP-L3 concentration: 0.1 ⁇ g) / ML).
  • biotin-labeled PhoSL 0.5 ⁇ g / mL
  • Table 10 shows the detection values for lectins of pepsin-treated AFP-L3 / 100% serum and untreated AFP-L3 / 100% serum.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

【課題】糖タンパク質を高精度に検出するために、糖タンパク質と糖結合化合物との反応による反応物の検出レベルを増大させる方法を提供する。 【解決手段】本発明の糖タンパク質の検出方法は、該糖タンパク質を含む試料をプロテアーゼ処理する工程、前記プロテアーゼ処理された糖タンパク質に、前記糖タンパク質の有する糖鎖と親和性を有する糖結合化合物を作用させて、該糖タンパク質と該糖結合化合物との反応物を得る工程、及び、前記反応物を検出する工程を含む。糖結合化合物は、好ましくは糖結合タンパク質である。

Description

糖タンパク質の検出方法
　本発明は、糖タンパク質の検出方法に関し、より詳細には、検出感度を向上させる糖タンパク質の検出方法に関する。
　タンパク質の半数以上が翻訳後に糖鎖修飾を受けている。糖鎖のタンパク質への結合様式は、アスパラギン残基のアミド基に結合するＮ結合型及びセリン又はスレオニン残基のヒドロキシル基に結合するＯ結合型に分けられる。いずれの糖鎖修飾も、タンパク質の活性、細胞間相互作用、接着等に重要な役割を果たしている。糖鎖修飾の変化が疾患と関連することが数多く報告されている。
　例えば、血清に含まれるαフェトプロテイン（Ｎ結合型糖鎖）は、健康な成人の血清にほとんど存在しない。一方、良性の肝疾患を持つ患者血清にはαフェトプロテイン－Ｌ１型糖鎖（ＡＦＰ－Ｌ１）が増加し、肝臓ガン患者にはさらにフコシル化したαフェトプロテイン－Ｌ３型糖鎖（ｆＡＦＰ又はＡＦＰ－Ｌ３）が検出される。レクチンで検出される糖鎖の違いが、肝疾患診断に利用されている。
　ハプトグロビンは、β鎖に４個のＮ結合型糖鎖結合部位を有する糖タンパク質である。膵臓癌になると、ハプトグロビンにフコースが付加した病変ハプトグロビンが患者血清等から検出される。病変ハプトグロビンは、膵臓癌の病期の進行とともに増え、膵臓癌の腫瘍部摘出後には消失する。フコシル化ハプトグロビンの高精度かつ迅速な検出により、膵臓癌の早期発見が期待される。
　チログロブリンは、甲状腺の上皮細胞で合成され濾胞に貯留し、一般に全身の細胞に作用して細胞の代謝率を上昇させる働きをもつホルモンである。甲状腺ホルモンが過剰に分泌される甲状腺機能亢進症の代表例が、バセドウ病である。バセドウ病は、手足の震え、眼球突出、動悸、甲状腺腫脹、多汗、体重減少、高血糖、高血圧等の症状を引き起こす。甲状腺ホルモンの分泌が不足する甲状腺機能低下症の例が慢性甲状腺炎（橋本病）である。橋本病は、全身倦怠感、発汗減少、体重増加、便秘等の症状を引き起こす。このタンパク質は、糖鎖の一種であるフコースを有する。チログロブリンに付加した糖鎖の検出感度を高めることで、チログロブリン含量の測定精度を上げることができる。
　関節リウマチ患者では、血清中ＩｇＧの末端ガラクトースの付加率が減少し、末端にＮ－アセチルグルコサミンを持つ糖鎖の割合が増加する。ガラクトース欠損は、ＩｇＧの重要な生理機能である補体の活性化やＦＣ受容体への結合能を著しく損なう。
　トランスフェリン（ＴＦ）は、６７９個のアミノ酸を持ち、その４１３番目と６１１番目のアスパラギン酸残基が末端シアル酸を有する二個の分岐状糖鎖でＮ－グリコシル化されている糖タンパク質である。トランスフェリンには、５７０番目のアミノ酸残基がプロリンであるＴＦＣ１と、それがセリンで置換されたＴＦＣ２という多型が存在する。ＴＦＣ１Ｃ２のヘテロ接合体の遺伝子型を持つアルツハイマー疾患（ＡＤ）患者は、６個のシアル酸を有するＴＦの相対強度が、ＴＦＣ１Ｃ１ホモ接合体の遺伝子型を持つ患者よりも有意に減少している。
　ＡＤ患者から採取したＣＳＦ糖タンパク質は、シアル酸付加率が有意に低下している。シアル酸量の変化は、ＡＤ以外にも、心臓血管疾患、アルコール依存症、糖尿病等について観察されている。
　上記糖タンパク質を検出するために、糖結合化合物の一種であるレクチンの使用が公知である。レクチンは、シアル酸、ガラクトース、Ｎ－アセチルグルコサミン等の糖残基に親和性を示すタンパク質の総称である。特定の糖残基に親和性を有する植物、動物あるいは菌類由来のレクチンが数多く発見されている。
　レクチンを用いた糖タンパク質の検出方法として、レクチンＥＬＩＳＡ（酵素免疫測定法）やレクチンアフィニティクロマトグラフィーが知られている。レクチンＥＬＩＳＡは、多数の検体を同時に測定できる、糖鎖を比較的簡便に測定することができる等の長所を有する。レクチンアフィニティクロマトグラフィーは、レクチンが特異的に糖鎖に結合する性質を利用したクロマトグラフィーであり、糖鎖構造のわずかな違いを見分けて分離する。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）用のレクチンＨＰＬＣカラムを用いるレクチンアフィニティクロマトグラフィーは、糖鎖の分析だけでなく、精製にも有効である。
特許４５１４１６３（フコースα１→６特異的レクチン）
Ｙｕｋａ　Ｋｏｂａｙａｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ．，"Ａ　Ｎｏｖｅｌ　Ｃｏｒｅ　Ｆｕｃｏｓｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｌｅｃｔｉｎ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　Ｍｕｓｈｒｏｏｍ　Ｐｈｏｌｉｏｔａ　ｓｑｕａｒｒｏｓａ"，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２０１２，２８７，ｐ３３９７３－３３９８２ Ｎａｏｔｏ　Ｓｈｉｂｕｙａ　ｅｔ　ａｌ．，"Ｔｈｅ　Ｅｌｄｅｒｂｅｒｒｙ　（Ｓａｍｂｕｃｕｓ　ｎｉｇｒａ　Ｌ．）　Ｂａｒｋ　Ｌｅｃｔｉｎ　Ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｓ　ｔｈｅ　Ｎｅｕ５Ａｃ（ａ２－６）Ｇａｌ／ＧａｌＮＡｃ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ"，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，１９８７，　２６２，　ｐ　１５９６－１６０１ Ｔ．Ｂ　ＮＧ　ｅｔ　ａｌ．，"Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｇａｌａｃｔｏｓｅ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｌｅｃｔｉｎ　ｗｉｔｈ　ｉｎｓｕｌｉｎｏｍｉｍｅｔｉｃ　ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ’’Ｉｎｔ．　Ｊ．　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒｅｓ　２８，　１９８６，　ｐ１６３－１７３ Ｙａｓｕｏ　Ｏｄａ　ｅｔ　ａｌ．，"Ａ　ｎｅｗ　ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　Ｔｕｌｉｐａ　ｇｅｓｎｅｒｉａｎａ　ｂｕｌｂｓ"，Ｅｕｒ．　Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ，　１０８７，　１６５，　ｐ２９７－３０２
　レクチンＥＬＩＳＡやレクチンクロマトグラフィー等の糖タンパク質の検出方法において、糖タンパク質とレクチンとの反応によるシグナルが低いと、糖タンパク質の正確な検出が困難である。糖鎖量の変化と関連するような疾患を早期に精度高く診断するためには、レクチン反応に基づくシグナルの増大が望ましい。
　そこで、本発明の目的は、糖タンパク質を高精度に検出するために、糖タンパク質とレクチンをはじめとする糖結合化合物との反応物に基づくシグナル（反応値）を増大させる方法を提供することにある。
　本発明者らは、上記課題を鋭意検討した結果、糖結合化合物反応前に糖タンパク質をプロテアーゼ処理することにより、上記課題を解決できることを見出した。すなわち、本発明は、糖タンパク質の検出方法であって、
該糖タンパク質を含む試料をプロテアーゼ処理する工程、
前記プロテアーゼ処理された糖タンパク質に、前記糖タンパク質の有する糖鎖と親和性を有する糖結合化合物を作用させて、該糖タンパク質と該糖結合化合物反応物を検出する工程
を含む、前記糖タンパク質の検出方法を提供する。
　本明細書において、「糖タンパク質」という用語は、糖ペプチドを含む意味で用いられる。「糖鎖」の用語は、本明細書において、単糖を含む意味で用いられる。また、「糖結合化合物」とは、本明細書において、糖に結合する化合物を意味する。前記糖結合化合物は、好ましくは糖結合タンパク質である。
　前記プロテアーゼ処理は、例えばペプシン処理、パパイン処理又はアクチナーゼ処理である。
　前記試料は、例えば血清である。
　前記糖結合化合物は、例えばフコース、シアル酸、マンノース、グルコース、ガラクトース、Ｎ－アセチルグルコサミン及びＮ－アセチルガラクトサミンからなる群から選ばれる少なくとも一種に親和性を有する。
　前記糖タンパク質は、担体に固定化されていることが好ましい。
　前記糖タンパク質は、その抗体を介して前記担体に固定化されていることが好ましい。
　前記糖結合化合物及び／又は前記糖結合化合物を検出するプローブは、標識されていることが好ましい。
　前記糖鎖は、例えば複合型糖鎖、高マンノース型糖鎖又はＯ結合型糖鎖である。
　前記糖タンパク質は、例えばハプトグロビン、フコシル化ハプトグロビン、トランスフェリン、γ－グルタミルトランスペプチターゼ、イムノグロブリンＧ、イムノグロブリンＡ、イムノグロブリンＭ、α１－酸性糖タンパク質、αフェトプロテイン、フコシル化αフェトプロテイン、フィブリノーゲン、ヒト胎盤絨毛性性腺刺激ホルモン、癌胎児性抗原、前立腺特異抗原、フコシル化前立腺特異抗原、チログロブリン、フェツイン、及びアシアロフェツインからなる群から選ばれる。
　本発明の糖タンパク質の検出方法によれば、プロテアーゼ処理された糖タンパク質と糖結合化合物との反応物に基づくシグナル（反応値）が、プロテアーゼ未処理のものより増大する。糖鎖の欠損や付加が疾患と関連することが知られている糖タンパク質では、シグナルの増大は、疾患の早期の発見、診断や治療につながる。また、疾患の発症機構の解明、治療や予防に関する医学や生化学の研究に役立つことも期待される。
　以下に、本発明の一実施の形態を詳細に説明する。本発明の糖タンパク質の検出方法は、該糖タンパク質を含む試料をプロテアーゼ処理する工程、及び
前記プロテアーゼ処理された糖タンパク質に、前記糖タンパク質の有する糖鎖と親和性を有する糖結合化合物を作用させて、該糖タンパク質と該糖結合化合物との反応物を得る工程、及び、前記反応物を検出する工程を含む。本発明の方法は、糖タンパク質を含む試料をプロテアーゼ処理する工程を必須に含む以外は、糖結合化合物を用いた従来の糖タンパク質の検出方法と同様である。
　本発明の測定対象となる糖タンパク質は、糖鎖を有するタンパク質であれば、特に限定されない。糖鎖には、Ｎ結合型糖鎖及びＯ結合型糖鎖が含まれる。Ｎ結合型糖鎖には、下記式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
 　〔式中、Ｍａｎはマンノース、ＧｌｃＮＡｃはＮ－アセチルグルコサミンを意味する〕
で示されるコア構造に、
フコース、シアル酸、ガラクトース及びＮ－アセチルグルコサミンで構成される側鎖（Ｎ－アセチルラクトサミン構造、ポリＮ－アセチルラクトサミン構造）が１～６本付加した複合型糖鎖；
前記コア構造にマンノースのみにより構成されるオリゴ糖が付加された高マンノース型糖鎖；
；並びに
前記複合型と前記高マンノース型とが混成した混成型糖鎖；　
が含まれる。また、前記Ｎ結合型糖鎖には、前記コア構造の還元末端のＮ－アセチルグルコサミンにフコースが付加した糖鎖も含まれる。
　本発明の検出対象となる糖残基には、シアル酸（Ｓｉａ）、ガラクトース（Ｇａｌ）、マンノース（Ｍａｎ）、グルコース（Ｇｌｃ）、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、フコース（Ｆｕｃ）等が含まれる。これらの糖残基は、健常者が通常有する糖鎖構造に対して付加するものであっても、又は欠損するものであってもよい。
　糖タンパク質の具体例には、ハプトグロビン（ＨＰ）、フコシル化ハプトグロビン（ｆＨＰ）、トランスフェリン（ＴＦ）、γ－グルタミルトランスペプチターゼ（γ－ＧＴＰ）、イムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）、イムノグロブリンＡ（ＩｇＡ）、イムノグロブリンＭ（ＩｇＭ）、α１－酸性糖タンパク質、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）、フコシル化αフェトプロテイン（ｆＡＦＰ、ＡＦＰ－Ｌ３）、フィブリノーゲン、ｈＣＧ（ヒト胎盤絨毛性性腺刺激ホルモン）、ＣＥＡ（癌胎児性抗原）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、フコシル化前立腺特異抗原（ｆＰＳＡ）、チログロブリン（ＴＧ）、フェツイン（ＦＥＴ）、アシアロフェツイン（ａＦＥＴ）等が挙げられる。糖タンパク質は、糖タンパク質の糖鎖構造の変化と疾患や異常との関係が示唆されるものが好ましい。
　糖タンパク質を含む試料の由来は、特に限定されない。例えば、血液、血漿、血清、涙、唾液、体液、乳汁、尿、細胞の培養上清、形質転換動物からの分泌物等が挙げられる。好ましくは血液、血漿又は血清であり、特に好ましくは血清である。プロテアーゼ処理に際し、血清等の糖タンパク質を含む試料を予め希釈しておいてもよい。
　本発明の方法では、糖タンパク質を糖結合化合物と反応させる前にプロテアーゼ（タンパク質分解酵素）で処理する。プロテアーゼは、糖タンパク質に作用して、糖ペプチドを生成させる酵素であれば、特に制限がない。該プロテアーゼを機能的に分類すると、アスパラギン酸プロテアーゼ（酸性プロテアーゼ）、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、金属プロテアーゼ、Ｎ－末端スレオニンプロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ等が含まれる。
　上記プロテアーゼは、その由来を問わない。該プロテアーゼは、動物由来のプロテアーゼとしてペプシン、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、カテプシンＤ、カルパイン等；植物由来のプロテアーゼとしてパパイン、キモパパイン、アクチニジン、カリクレイン、フィシン、ブロメライン等；そして微生物由来のプロテアーゼとしてバチルス属、アスペルギルス属、リゾプス属、アオカビ属（ペニシリウム属）、ストレプトマイセス属、スタフィロコッカス属、クロストリジウム属及びリソバクター属由来のものが挙げられる。
　上記プロテアーゼは、市販のものを特に制限なく使用可能である。例えばペプシンとして、ブタ胃粘膜由来ペプシン（シグマ・アルドリッチ製）、パパインとして、パパイヤ由来パパイン（フナコシ（株）製）、ストレプトマイセス由来プロテアーゼとしてアクチナーゼＥ（科研製薬（株）製）等が挙げられる。
　プロテアーゼの使用量は、糖タンパク質とプロテアーゼとの反応が進行する量であればよい。反応時の濃度は、通常、０．０００１～５ｍｇ／ｍＬでよい。特にペプシンは、０．０００１～１ｍｇ／ｍＬのような少量で効果が得られる点で好ましい。
　プロテアーゼ処理のｐＨ、温度、時間等の条件は、使用するタンパク分解酵素の種類に依存する。ペプシンを使用するプロテアーゼ処理は、通常、１．５～５、好ましくは２～４のｐＨ、及び、通常、１０～６０℃、好ましくは１５～４５℃、より好ましくは２０～４０℃の温度の下で、通常、１分間～２４時間、好ましくは１分間～１８０分間、より好ましくは２分間～１２０分間、さらに好ましくは２分間～６０分間行われる。パパインを使用するプロテアーゼ処理は、通常、３～１０、好ましくは５～８のｐＨ、及び、通常、２０～８０℃、好ましくは２０～４５℃、より好ましくは２０～４０℃の温度の下で、通常、１分間～２４時間、好ましくは１分間～１８０分間、より好ましくは２分間～１２０分間、さらに好ましくは２分間～６０分間行われる。アクチナーゼＥを使用するプロテアーゼ処理は、通常、７～１０、好ましくは７～８．５のｐＨ、及び、通常、１０～５０℃、好ましくは２０～４５℃、より好ましくは２０～４０℃の温度の下で、通常、１分間～２４時間、好ましくは１分間～１８０分間、より好ましくは２分間～１２０分間、さらに好ましくは２分間～６０分間行われる。
　プロテアーゼ処理後、使用したプロテアーゼに基づいて、ｐＨの変更、加熱処理、酵素反応停止液の添加等の適宜の手段で酵素反応を停止させる。その後、反応液を濾過、透析、遠心分離等の分離手段によって、上清と固体残渣とに分離してもよい。
　上記プロテアーゼ処理された糖タンパク質に、前記糖タンパク質の有する糖鎖と親和性を有する糖結合化合物を作用させて、該糖タンパク質と該糖結合化合物との反応物を得る。
　前記プロテアーゼ処理された糖タンパク質と糖結合化合物との反応時に、糖タンパク質あるいは糖結合化合物を必ずしも固定化する必要はないが、固定化する方が好ましい。糖タンパク質を固定化するための担体は、例えばガラス、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ酢酸ビニル、ポリ塩化ビニル、ポリメタクリレート、ラテックス、アガロース、セルロース、デキストラン、デンプン、デキストリン、シリカゲル、多孔性セラミックス等の素材できたビーズ、ディスク、スティック、チューブ、マイクロタイタープレート、マイクロセンサーチップ、マイクロアレイ等が挙げられる。
　前記糖タンパク質の担体への固定化方法は、物理的吸着、共有結合、架橋等の汎用の方法を特に制限なく使用可能である。
　前記糖タンパク質は、その抗体を介して担体に固定化されていてもよい。抗体は、抗体分子自体でよく、また、抗体を酵素処理して得られるＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２等の抗原認識部位を含む活性フラグメントでもよい。
　抗体の由来は限定されない。抗体には、ヒト、マウス、ウサギ等の哺乳動物に抗原としての糖タンパク質を免疫することにより得られる抗血清や腹水液、並びにこれらを塩析、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー等の汎用の方法で精製したポリクローナル抗体が含まれる。さらに、抗体には、ヒトや動物の血清等から調製したタンパク質で免疫されたマウスの抗体産生リンパ細胞とミエローマ細胞とを融合させることによって、該糖タンパク質を認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得、次いで該ハイブリドーマ又はそれに由来する細胞株を培養し、その培養物から採取されるモノクローナル抗体が含まれる。汎用の糖タンパク質については、その抗体が試薬として販売されており、本発明ではそれらを制限なく使用可能である。
　上記の抗体等が糖結合化合物と反応する糖鎖を有する場合は、適宜、抗体から糖鎖を除去する。糖結合化合物と反応する糖鎖を持たない抗体を取得するには、モノクローナル抗体をノイラミニダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、Ｎ－グリカナーゼ等の糖鎖分解酵素で処理する、抗体のＦｃ部をペプシン、パパイン等のタンパク質分解酵素により限定加水分解する、過ヨウ素酸水溶液で糖鎖構造を酸化分解する、ハイブリドーマ又はハイブリドーマ由来の動物細胞の培地に糖鎖合成阻害剤を添加して培養する方法が挙げられる。
　上記抗体の担体への固定化方法は、物理的吸着、共有結合、架橋等の汎用の方法を特に制限なく使用可能である。糖タンパク質に対する抗体（例えば抗トランスフェリン抗体）の溶液を担体に添加することにより、担体に抗体を結合させる。
　抗体の結合した担体に糖タンパク質の溶液を添加することにより、糖タンパク質を抗原－抗体反応で結合させる。
　本発明で使用する糖結合化合物は、糖タンパク質が有する糖鎖と親和性を有する化合物を意味する。使用する糖結合化合物は、糖タンパク質に結合する糖鎖に依存して、適宜、選択される。
　前記糖結合化合物は、例えば糖に結合するタンパク質（ペプチドを含む）、並びに糖に結合するＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸である。
　前記糖結合タンパク質には、レクチン、抗糖鎖抗体、マルトース結合タンパク質、グルコース結合タンパク質、ガラクトース結合タンパク質、セルロース結合タンパク質、キチン結合タンパク質、炭水化物結合モジュールが含まれる。前記糖結合化合物は、好ましくは糖結合タンパク質であり、より好ましくはレクチン及び抗糖鎖抗体であり、さらに好ましくはレクチンである。
　前記糖結合化合物は、一種単独でもよく、または二種の併用でもよい。
　前記レクチンの親和性を、赤血球凝集を阻害する糖の最小阻害濃度で表すと、通常１００ｍＭ以下、好ましくは１０ｍＭ以下である。最小阻害濃度とは、糖が凝集反応を阻止するために要する最小濃度を意味する。最小阻害濃度が小さいほど、レクチンに対する親和性が高いことを示す。赤血球凝集反応阻害試験法は、特許文献１（特許４５１４１６３）に記載されている方法で行うことができる。特許４５１４１６３を参照のためにここに編入する。
　前記レクチンは、天然由来レクチン、若しくは化学合成又は遺伝子工学的合成により得られるレクチンのいずれでもよい。天然レクチンの由来は、植物、動物及び菌類のいずれでもよい。以下に、本発明に使用可能な天然レクチンの例を示す。
　ガラクトース（Ｇａｌ）／Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）に親和性を有するレクチンの例には、マッシュルームレクチン（ＡＢＡ）、ドリコスマメレクチン（ＤＢＡ）、デイゴマメレクチン（ＥＣＡ）、インゲンマメレクチン（ＰＨＡ－Ｅ４、ＰＨＡ－Ｐ）、ピーナッツレクチン（ＰＮＡ）、ダイズレクチン（ＳＢＡ）、ムラサキモクワンジュレクチン（ＢＰＬ）、ヒマレクチン（ＲＣＡ１２０）が挙げられる。マンノース（Ｍａｎ）／グルコース（Ｇｌｃ）に親和性を有するレクチンの例には、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）、レンズマメレクチン（ＬＣＡ、ＬＣＡ－Ａ）、及びエンドウマメレクチン（ＰＳＡ）が挙げられる。フコース（Ｆｕｃ）に親和性を有するレクチンの例には、ヒイロチャワンタケレクチン（ＡＡＬ）、レンズマメレクチン（ＬＣＡ、ＬＣＡ－Ａ）、ロータスレクチン（Ｌｏｔｕｓ）、エンドウマメレクチン（ＰＳＡ）、ハリエニシダレクチン（ＵＥＡ－Ｉ）、ミヤコグサレクチン（ＬＴＡ）、ラッパスイセンレクチン（ＮＰＡ）、ソラマメレクチン（ＶＦＡ）、麹菌レクチン（ＡＯＬ）、スギタケレクチン（ＰｈｏＳＬ）、ツチスギタケレクチン（ＰＴＬ）、サケツバタケレクチン（ＳＲＬ）、クリタケレクチン（ＮＳＬ）、コムラサキシメジレクチン（ＬＳＬ）、ベニテングタケレクチン（ＡＭＬ）が挙げられる。このうち、ＰｈｏＳＬ、ＰＴＬ、ＳＲＬ、ＮＳＬ、ＬＳＬ及びＡＭＬは、α１→６フコースに特異的に結合するので、α１→６フコースの付加又は欠如が疾患と関連する糖タンパク質の検出に有利である。Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）に親和性を有するレクチンの例には、チョウセンアサガオレクチン（ＤＳＡ）、アメリカヤマゴボウレクチン（ＰＷＭ）、小麦胚芽レクチン（ＷＧＡ）、バンデリアマメレクチン－ＩＩ（ＧＳＬ－ＩＩ）、ムジナタケレクチン（ＰＶＬ）が挙げられる。シアル酸（Ｓｉａ）に親和性を有するレクチンの例には、イヌエンジュレクチン（ＭＡＭ）、ニホンニワトコレクチン（ＳＳＡ）、小麦胚芽レクチン（ＷＧＡ）、ヤナギマツタケレクチン（ＡＣＧ）、キカラスウリレクチン（ＴＪＡ－Ｉ）、ムジナタケレクチン（ＰＶＬ）、西洋ニワトコレクチン（ＳＮＡ－Ｉ）等が挙げられる。
　糖結合化合物は、検出可能とするために、当分野で公知の標識手段で標識されていることが好ましい。また、糖結合化合物は、糖結合化合物と反応するプローブ（例えば抗レクチン抗体のような糖結合化合物と結合する抗体）を介して検出してもよい。その際、プローブは、当分野で公知の標識手段で標識されていることが好ましい。糖結合化合物を検出するプローブは、一種単独、又は二種以上の併用でもよい。
　前記糖結合化合物及び／又は前記糖結合化合物を検出するプローブの標識手段の例としては、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、β－Ｄ－ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ等の酵素、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミンＢイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、ローダミン、ＣｙＤｙｅ等の蛍光化合物、１２５Ｉ、３Ｈ、１４Ｃ等の放射性物質、金ゾル、銀ゾル、白金ゾル等の金属コロイド、顔料で着色されたポリスチレンラッテクス等の合成ラテックス、ビオチンやジゴキシゲニンを挙げることができる。
　標識手段が酵素の場合、酵素活性を測定するために発色基質が用いられる。セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の基質としては３，３’，５，５’－テトラメチルベンチジン（ＴＭＢ）、２，２’－アジノジ－［３－エチルベンズチアゾリンスルホン酸］２アンモニウム塩、５－アミノサリチル酸、又はｏ－フェニレンジアミン（ＯＰＤ）、アルカリホスファターゼの基質としてはｐ－ニトロフェニルホスフェート（ＰＮＰＰ）又は４－メチルウンベリフェリルホスフェート、そしてβ－Ｄ－ガラクトシダーゼの基質としてはｏ－ニトロフェノール－β－Ｄ－ガラクトピラノシドを挙げることができる。
　標識手段は、常法により、前記糖結合化合物又は前記糖結合化合物を検出するプローブへ結合することができる。特に、標識をストレプトアビジン（又はアビジン）－ビオチン系を介して結合することは、感度が高くなる点で好ましい。
　適宜、固定化された糖タンパク質と糖結合化合物とを反応させるために、糖結合化合物を含む溶液に糖タンパク質を曝す。
　上記糖結合化合物反応後、糖タンパク質と糖結合化合物との反応物を検出する。糖タンパク質と糖結合化合物との反応物の検出方法は、特に限定されず、当業者に周知の方法で使用することができる。検出方法の例としては、レクチンＥＬＩＳＡ（直接吸着法、サンドイッチ法）、レクチンアフィニティクロマトグラフィー（例えばＨＰＬＣ－レクチンカラムを使用）、レクチン親和電気泳動、レクチン染色のように酵素等の発色や発光、蛍光を検出する方法、糖鎖アレイ、レクチンアレイのようにエバネッセント波を検出する方法、水晶発振子マイクロバランス法や表面プラズモン共鳴法のように質量変化を検出する方法等を挙げることができる。表面プラズモン共鳴法は、担体に固定化した糖タンパク質量、及び、糖タンパク質に結合した検出糖結合化合物量を多段階法で同時に測定できるので利便である。
　標識した糖結合化合物の標識物量（吸光度等）等で表わした糖鎖量は、標準試料のものと対比することによって、その変化を察知することができる。例えば、検体の糖タンパク質濃度を一定値に調整すると、検出糖結合化合物の測定結果は糖タンパク質に付加した特定の糖鎖量の変化を反映することになる。糖タンパク質の糖鎖量を健常者と患者との間で比較することにより、糖鎖変化に関連する疾患を従来よりも高い精度で診断できる。
　糖残基量の変化率（糖付加や糖欠損の度合い）を定量化することは、糖鎖変化と関連する疾患の診断、治療及び予防、研究等に大いに役立つ。糖の付加率を求めるには、予め、糖鎖末端の全位置に目的とする糖残基が付加した参照試料（例えば、健常者の糖タンパク質や市販又は合成した試薬）の全糖残基量を本発明の検出方法で測定する。糖残基量を、標識した検出糖結合化合物の標識物量（吸光度等）で表わす。次いで、未知試料の糖残基量を本発明の検出方法で測定する。未知試料で測定された糖残基量を全糖残基量で除した値が糖付加率となる。糖付加率を１から減じたものが糖欠損率となる。
　糖鎖量の変化率は、測定試料の糖タンパク質量に対する糖鎖量の比で表してもよい。まず、糖タンパク質の量を吸光度、酵素結合免疫吸着法、ブラッドフォード法、ローリー法等で求めておく。
　糖付加率又は糖欠損率の導出に検量線を使用することは、測定作業の効率化の点で有利である。予め、目的糖残基量が既知で、糖残基量の異なる複数の標準試料を、本発明の検出方法で測定し、目的糖残基量と検出糖結合化合物の標識物量（吸光度等）との関係を求め、検量線を作成しておく。目的糖残基量が未知の試料の標識物量（吸光度等）を本発明の検出方法で求め、標識物量を前記検量線に当てはめる。
　いくつかの代表的な検出方法を、以下に概説する。ＥＬＩＳＡ（直接吸着法）では、糖タンパク質を含む血清等の検体をＥＬＩＳＡプレートに添加して固定化する（検体反応）。次いで、ビオチン標識したレクチンを添加して、糖鎖とレクチンとを反応させる（レクチン反応、１次反応）。２次標識化合物としてＨＲＰ標識ストレプトアビジン溶液を添加して、ビオチンとストレプトアビジンとを反応させる（プローブ反応、２次反応）。次いで、ＨＲＰ用発色基質を加えて発色させ、発色強度を吸光光度計で測定する。予め、既知の濃度の糖鎖を含む標準試料によって検量線を作成しておけば、糖鎖の定量化も可能である。
　ＥＬＩＳＡ（サンドイッチ法）では、糖タンパク質（抗原）に結合する抗体をＥＬＩＳＡプレートに添加し抗体をプレートに固定化する。次いで、糖タンパク質を含む検体（血清等）を添加して、前記抗体と糖タンパク質とを反応させる（検体反応）。次いで、ビオチン標識したレクチンを添加して、糖鎖とレクチンとを反応させる（レクチン反応）。２次プローブとしてＨＲＰ標識ストレプトアビジン溶液を添加して、ビオチンとストレプトアビジンとを反応させる（プローブ反応）。次いで、ＨＲＰ用発色基質を加えて発色させ、発色強度を吸光光度計で測定する。予め、既知の濃度の標準試料によって検量線を作成しておけば、糖鎖の定量化も可能である。
　本発明の方法によれば、糖タンパク質の検出感度が向上するので、糖鎖変化と関連する疾患の診断精度の向上に寄与する。ガラクトース残基が診断の指標となり得る疾患の例としては、慢性関節リウマチ、肝癌、骨髄腫等がある。マンノース残基が診断の指標となり得る疾患の例としては、直腸癌等がある。フコース残基が診断の指標となり得る疾患の例としては、大腸癌、膵臓癌、肝癌等がある。Ｎ－アセチルグルコサミン残基が診断の指標となり得る疾患の例としては、特発性正常圧水頭症、肝癌等がある。シアル酸残基が診断の指標となり得る疾患の例としては、アルツハイマー病、心臓血管疾患、アルコール依存症、ＩｇＡ腎症、肝癌、前立腺癌、卵巣癌、心筋梗塞、繊維症、膵炎、糖尿病、糖タンパク質糖鎖転移不全症等がある。
　以下に本発明の実施例を示して、本発明をより詳細に説明する。しかし、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
　本発明に使用する試薬を、以下の手順で調製又は用意した。
（１）緩衝液
〔リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）〕
　リン酸水素二ナトリウム（和光純薬工業（株）製）５．７５ｇ、リン酸二水素カリウム（和光純薬工業（株）製）１．０ｇ、塩化カリウム（和光純薬工業（株）製）１．０ｇ、塩化ナトリウム（和光純薬工業（株）製）４０．０ｇを秤量し、水で５Ｌにメスアップした。これをリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）とした。
〔０．０５％　Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳ〕
　ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（商品名　Ｔｗｅｅｎ２０、ナカライテスク（株）製）２．５ｍＬを５ＬのＰＢＳに溶解して、濃度０．０５％のＴｗｅｅｎ２０のＰＢＳ溶液（以下、０．０５％　Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳという）を得た。
〔１Ｍグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）〕　
　グリシン（和光純薬工業（株）製）　７５．０７ｇを、水９００ｍＬ程度に溶解し、６Ｎ塩酸を添加してｐＨメーターでｐＨ３．０に合わせ、さらに水で１０００ｍＬにメスアップした。
〔０．５Ｍグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．３）〕
　上記グリシン３７．５４ｇを、水９００ｍＬ程度に溶解し、６Ｎ塩酸を添加しｐＨメーターでｐＨ３．３に合わせ、水で１０００ｍＬにメスアップした。
〔１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）〕
　トリスヒドロキシメチルアミノメタン（ナカライテスク（株）製）　６０．６ｇを、水４００ｍＬ程度に溶解し、６Ｎ塩酸を添加しｐＨメーターでｐＨ９．０に合わせ、水で５００ｍＬにメスアップした。
〔０．３３Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）〕　
　上記トリスヒドロキシメチルアミノメタン２０．２ｇを、水４００ｍＬ程度に溶解し、６　Ｎ　塩酸を添加しｐＨメーターでｐＨ９．０に合わせ、水で５００ｍＬにメスアップした。
〔１０ｍＭ塩化カルシウム／１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）〕
　塩化カルシウム（和光純薬工業（株））０．７４ｇを５ｍＬチューブに量り取り、水５ｍＬで溶解して１Ｍ塩化カルシウム水溶液を得た。上記トリスヒドロキシメチルアミノメタンを１２．１１ｇ量り取り、水８０ｍＬで溶解後、６Ｎ塩酸溶液を加えてｐＨを７．８に調整し、さらに水で液量１００ｍＬまでメスアップして、１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）を得た。１Ｍ塩化カルシウム水溶液と１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）から１０ｍＭ塩化カルシウム／１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）を調製した。
（２）　糖タンパク質溶液
　以下の糖タンパク質を、それぞれ、濃度２ｍｇ／ｍＬになるように水に溶解して糖タンパク質溶液を得た。
トランスフェリン（ＴＦ）：シグマ・アルドリッチ製
イムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）：シグマ・アルドリッチ製
αフェトプロテイン（ＡＦＰ）：フナコシ（株）製
αフェトプロテイン－Ｌ３（ＡＦＰ－Ｌ３）：非特許文献１に記載の方法に準じて調製した。
（３）　プロテアーゼ溶液
　以下に示すプロテアーゼ溶液を調製した。
〔ペプシン〕
　ペプシン（ブタ胃粘膜由来、シグマ・アルドリッチ製、コードＮｏ．Ｐ６８８７）を、１Ｍ　グリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）で０．１ｍｇ／ｍＬ（０．０１質量％）になるように溶解した。
〔パパイン〕
　パパイン（パパイヤ由来、フナコシ（株）製、コードＮｏ．ＬＳ００３１２６）を、システイン溶液（１．１ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．０６７ｍＭ　システイン塩酸塩を含む０．２Ｍ　リン酸緩衝液、ｐＨ６．５）で濃度２ｍｇ／ｍＬ（０．２質量％）になるように溶解した。
〔アクチナーゼＥ〕
　アクチナーゼＥ（科研製薬製、コードＮｏ．９０００２－１６１１）を、１０ｍＭ塩化カルシウム／１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）で、濃度１０ｍｇ／ｍＬ（１質量％）になるように溶解した。
（４）　ＰＭＳＦ溶液
　フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ、和光純薬工業（株）製）１７．４　ｍｇを、５００μＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、和光純薬工業（株）製）に溶解して、２００ｍＭ　ＰＭＳＦ溶液を調製した。これを使用直前に水で２０倍に希釈して、１０ｍＭ　ＰＭＳＦ溶液を調製した。
（５）　ＢＳＡ／ＰＢＳ
　ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、シグマ・アルドリッチ製）１ｇを１００ｍＬのＰＢＳに溶解して、ＢＳＡのＰＢＳ溶液（ＢＳＡ濃度１％）を調製した。
（６）　レクチン
　表１に示すレクチンを用意した。α１－６フコース特異的レクチンであるＰｈｏＳＬを、非特許文献１に記載の方法に従ってスギタケから精製した。また、ＰｈｏＳＬの合成ペプチドの一種である合成ＰｈｏＳＬペプチド（配列番号１）を非特許文献１に記載の方法に従って合成した。麹菌レクチン（ＡＯＬ）は、東京化成工業（株）から入手した。西洋ニワトコレクチン（ＳＮＡ－Ｉ）、ニガウリレクチン（ＭＣＬ）、及びチューリップレクチン（ＴｘＬＣ－Ｉ）は、それぞれ、非特許文献２～４の方法で精製した。上記レクチンを非特許文献１に記載の方法に準じてビオチン標識化した。ビオチン標識化ヒイロチャワンタケレクチン（ＡＡＬ）、ビオチン標識化レンズマメレクチン（ＬＣＡ）、ビオチン標識化エンドウマメレクチン（ＰＳＡ）、ビオチン標識化タチナタマメレクチン（ＣｏｎＡ）、ビオチン標識化日本ニワトコレクチン（ＳＳＡ）、ビオチン標識化ヒマレクチン（ＲＣＡ１２０）、ビオチン標識化デイゴマメレクチン（ＥＣＡ）、及びビオチン標識化インゲンマメレクチン（ＰＨＡ－Ｅ４）は、Ｊ－オイルミルズ製のビオチン標識化レクチンを使用した。すべてのビオチン標識化レクチンは、ＰＢＳで濃度１ｍｇ／ｍＬに調製し、使用の際、適切な濃度に希釈した。
　糖タンパク質のペプシン処理の手順を、以下に示す。
（１）反応溶液の調製
　濃度２ｍｇ／ｍＬの糖タンパク質溶液２５質量部に、１Ｍグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）を２５質量部加えた。
（２）ペプシン反応
　ペプシン溶液（０．１ｍｇ／ｍＬ　１Ｍグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０））を、（１）の１質量部添加して、撹拌後、３７℃で静置した。
（３）反応停止
　ペプシン反応５～３０分間処理した後、２５質量部の１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）と混合し反応を停止させた。これらの試料をペプシン処理後の糖タンパク質溶液とした。
　糖タンパク質のアクチナーゼＥ処理の手順を、ＡＦＰ―Ｌ３を例に以下に示す。
（１）酵素反応
　前記１質量％アクチナーゼＥ溶液を、前記１０ｍＭ　塩化カルシウム／１００ｍＭ　トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）で濃度０．００１２５質量％になるまで希釈した。この希釈液４２μＬと濃度８ｍｇ／ｍＬのＡＦＰ－Ｌ３水溶液７０μＬとを混合し、３７℃の温度で３０分間、保温した。
（２）反応停止
　上記反応液を１０ｍＭ　ＰＭＳＦ　１４μＬと混合してタンパク質分解反応を停止し、アクチナーゼＥ処理ＡＦＰ－Ｌ３の溶液を得た。
　糖タンパク質のパパイン処理の手順を、ＡＦＰ―Ｌ３を例に以下に示す。
（１）酵素反応
　６ｍｇ／ｍＬ（水に溶解）のＡＦＰ－Ｌ３溶液５μＬに対して、２ｍｇ／ｍＬのパパイン溶液を５μＬ添加（終濃度１ｍｇ／ｍＬ）し、３７℃で保温した。
（２）反応停止
　パパイン溶液添加から３０分後に、濃度１０μｇ／ｍＬのアンチパイン（シグマ・アルドリッチ製）２μＬと混合して反応を停止させ、パパイン処理後のＡＦＰ溶液とした。
　レクチンＥＬＩＳＡ（サンドイッチ法）の手順を以下に示す。
（１）抗体固定化
　非特許文献１に記載の方法に準じて糖鎖除去した固相化抗体をＰＢＳで５μｇ／ｍＬに希釈し、９６穴マイクロタイタープレート（グライナー社製）のウェルに５０μＬ添加して４℃で１６時間放置後、添加した液を廃棄した。
（２）洗浄
　ウェルに０．０５％　Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳを２５０μＬ添加し、添加した液を廃棄した。
（３）ブロッキング
　ウェルにＢＳＡ／ＰＢＳを２００μＬ添加して、３７℃で１時間放置後、添加した液を廃棄した。
（４）洗浄
　ウェルに０．０５％　Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳを２５０μＬ添加し、添加した液を廃棄した。この操作を合計３回繰り返した。
（５）抗原抗体反応
　ＢＳＡ／ＰＢＳで希釈した糖タンパク質溶液　５０μＬをウェルに添加して、室温で１時間放置後、添加した液を廃棄した。
（６）洗浄
　ウェルに０．０５％　Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳを２５０μＬ添加し、添加した液を廃棄した。この操作を合計３回繰り返した。
（７）レクチン反応
　ビオチン標識化レクチン（１ｍｇ／ｍＬ　ＰＢＳ）を、適切な濃度になるように、ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液で希釈した。このレクチン溶液５０μＬをウェルに添加して、４℃で３０分間放置後、添加した液を廃棄した。
（８）洗浄
　ウェルに０．０５％　Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳを２５０μＬ添加し、添加した液を廃棄した。この操作を合計３回繰り返した。
（９）西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ストレプトアビジン反応
　１ｍｇ／ｍＬのＨＲＰ標識ストレプトアビジン（フナコシ（株）製）をＢＳＡ／ＰＢＳで希釈した（１μｇ／ｍＬ）。これをウェルに５０μＬ添加して、室温で３０分間放置後、添加した液を廃棄した。
（１０）洗浄
　ウェルに０．０５％　Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳを２５０μＬ添加し、添加した液を廃棄した。この操作を合計３回繰り返した。
（１１）発色反応
　ＨＲＰ用発色基質（ＴＭＢ　Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ　Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ、フナコシ（株）製）を、ウェルに５０μＬ添加し、室温で５分間放置した。
（１２）反応停止
　１Ｍリン酸を５０μＬ添加し、反応を停止した。
　プレートリーダー（製品名：ＰＯＷＥＲＳＣＡＮ（登録商標）ＨＴ、バイオテック（株）製）を用いて、波長４５０ｎｍ及び６３０ｎｍの吸光度を測定した。４５０ｎｍの吸光度値から６３０ｎｍの吸光度値を引いた値を検出値（シグナル：Ｓ）とした。糖タンパク質未添加の検出値（ノイズ：Ｎ）を、糖タンパク質添加の検出値（Ｓ）から引いた値を反応値（Ｓ－Ｎ）とした。
　式（１）に示すように、プロテアーゼ処理での反応値（Ｓ－Ｎ）ｐから、プロテアーゼ未処理での反応値（Ｓ－Ｎ）ｎｐを減じた値を増大量Δとした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
［実施例１～１４］　フコース、シアル酸、ガラクトース、マンノース、グルコース等に親和性を有するレクチンによるペプシン処理ＡＦＰ－Ｌ３の検出（Ｉ）
　糖タンパク質ＡＦＰ－Ｌ３を３０分間、ペプシン処理し、得られたペプシン処理ＡＦＰ－Ｌ３をレクチンＥＬＩＳＡ（サンドイッチ法）により検出した。検出試験は、以下の点を除き、上記したサンドイッチＥＬＩＳＡ法と同様の操作を行った。
（１）抗体固定化において、固相化抗体に抗ヒトＡＦＰモノクローナル抗体（マウス）（フナコシ（株）製）を使用した。
（５）抗原抗体反応において、糖タンパク質溶液として、ペプシン処理ＡＦＰ－Ｌ３（５，０００ｎｇ／ｍＬ）及び未処理ＡＦＰ－Ｌ３（５，０００ｎｇ／ｍＬ）を使用した。
（７）レクチン反応では、表１に記載のビオチン標識化レクチンを使用し、また、レクチンの代わりに１μｇ／ｍＬの抗ＡＦＰ抗体（ダコ・ジャパン製）を使用した。
（９）ＨＲＰ標識ストレプトアビジン反応では、（７）でレクチン反応の代わりに抗ＡＦＰ抗体を使用した場合には、ＨＲＰ標識ストレプトアビジンに替えて、ＨＲＰ標識化抗ウサギＩｇＧ抗体溶液（フナコシ（株）製）をＢＳＡ／ＰＢＳで０．５μｇ／ｍＬとしたものを使用した。
　ペプシン処理ＡＦＰ－Ｌ３及び未処理ＡＦＰ－Ｌ３のレクチン又は抗体に対する反応値（Ｓ－Ｎ）及び増大量Δを表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　すべての実施例において、プロテアーゼ処理したＡＦＰ－Ｌ３のレクチンとの反応値は、プロテアーゼ未処理のＡＦＰ－Ｌ３とレクチンとの反応値よりも増大した。一方、抗体を用いた比較例１では、反応値は、プロテアーゼ処理によって増大しなかった。このことから、プロテアーゼ処理された糖タンパク質ＡＦＰ－Ｌ３とレクチンとの反応値の増大（すなわち、糖タンパク質の検出感度の向上）は、糖タンパク質の固相抗体への結合量の増大が原因ではないことが確認された。
　［実施例１５～２１］シアル酸、ガラクトース、マンノース、グルコース等に親和性を有するレクチンによるペプシン処理ＡＦＰの検出
　糖タンパク質ＡＦＰを３０分間、ペプシン処理し、得られたペプシン処理ＡＦＰをレクチンＥＬＩＳＡ（サンドイッチ法）により検出した。検出試験は、実施例７～１３及び比較例１において、糖タンパク質をＡＦＰ－Ｌ３からＡＦＰに代えた以外は前記実施例又は比較例と同様の手順で行った。ペプシン処理ＡＦＰ及び未処理ＡＦＰの各レクチンに対する反応値（Ｓ－Ｎ）及び増大量Δを表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表２を見ると、すべての実施例において、プロテアーゼ処理したＡＦＰのレクチンとの反応値は、プロテアーゼ未処理のＡＦＰとレクチンとの反応値よりも増大した。一方、抗体を用いた比較例２では、反応値は、プロテアーゼ処理によって増大しなかった。このことから、プロテアーゼ処理による糖タンパク質とレクチンとの反応値の増大、すなわち、糖タンパク質の検出感度の向上は、糖タンパク質の固相抗体へのＡＦＰ結合量の増大が原因ではないことが確認された。
［実施例２２］　フコースに親和性を有するレクチンによるアクチナーゼＥ処理ＡＦＰ－Ｌ３の検出
　実施例１において、糖タンパク質のプロテアーゼ処理をペプシン処理からアクチナーゼＥ処理に変更した。具体的には、実施例１において、以下の点を除き、同様の操作を行った。
（５）抗原抗体反応において、糖タンパク質溶液としてアクチナーゼＥ処理後のＡＦＰ－Ｌ３（４００ｎｇ／ｍＬ）、及び未処理のＡＦＰ－Ｌ３（４００ｎｇ／ｍＬ）を使用した。
（７）レクチン反応では、ビオチン標識化ＰｈｏＳＬ（０．５μｇ／ｍＬ）を使用した。
　プロテアーゼ処理ＡＦＰ－Ｌ３及び未処理ＡＦＰ－Ｌ３のレクチン反応値（Ｓ－Ｎ）、及び、プロテアーゼ処理による反応値の増大量Δを、表３に示す。
　表３から、プロテアーゼ処理にペプシンと異なるタンパク質分解酵素であるアクチナーゼＥを用いても、プロテアーゼ処理により、ＡＦＰ－Ｌ３とレクチンの反応値が増大することがわかった。
［実施例２３］　フコースに親和性を有するレクチンによるパパイン処理ＡＦＰ－Ｌ３の検出
　実施例１において、糖タンパク質のプロテアーゼ処理をペプシン処理からパパイン処理に変更した。具体的には、実施例１において、以下の点を除き、同様の操作を行った。
（１）抗体固定化において、固相化抗体に抗ヒトＡＦＰモノクローナル抗体（マウス）（フナコシ（株）製）を使用した。
（５）抗原抗体反応において、糖タンパク質溶液としてパパイン処理後のＡＦＰ－Ｌ３（１０００ｎｇ／ｍＬ）及び未処理のＡＦＰ－Ｌ３（１０００ｎｇ／ｍＬ）を使用した。
（７）レクチン反応では、ビオチン標識化ＰｈｏＳＬ（０．５μｇ／ｍＬ）を使用した。
　プロテアーゼ処理ＡＦＰ－Ｌ３及び未処理ＡＦＰ－Ｌ３のレクチン反応値（Ｓ－Ｎ）、及び、プロテアーゼ処理による反応値の増大量Δを、表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　表４から、プロテアーゼ処理にペプシンと異なるタンパク質分解酵素であるパパインを用いても、プロテアーゼ処理により、ＡＦＰ－Ｌ３とレクチンの反応値が増大することがわかった。
［実施例２４］　シアル酸に親和性を有するレクチンによるペプシン処理トランスフェリン（ＴＦ）の検出
　糖タンパク質ＴＦを５分間、ペプシン処理し、得られたペプシン処理ＴＦをレクチンＥＬＩＳＡ（サンドイッチ法）により検出した。検出試験は、以下の点を除き、上記したサンドイッチＥＬＩＳＡ法と同様の操作を行った。
（１）抗体固定化において、固相化抗体に抗ヒトトランスフェリンポリクローナル抗体（ウサギ）（フナコシ（株）製）を使用した。
（５）抗原抗体反応において、糖タンパク質溶液としてペプシン処理後のＴＦ溶液（１μｇ／ｍＬ）及び未処理のＴＦ溶液（１μｇ／ｍＬ）を使用した。
（７）レクチン反応では、表１に記載のビオチン標識化ＳＳＡ（１μｇ／ｍＬ）を使用した。また、レクチンの代わりに０．２μｇ／ｍＬの抗ヒトトランスフェリンポリクローナル抗体（マウス）（コスモ・バイオ（株）製）を使用した。
（９）西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ストレプトアビジン反応では、（７）でレクチン反応の代わりに抗ＴＦ抗体を使用した場合には、ＨＲＰ標識ストレプトアビジンに替えて、ＨＲＰ標識化抗マウスＩｇＧ抗体溶液（インビトロジェン製）をＢＳＡ／ＰＢＳで０．５μｇ／ｍＬとしたものを使用した。
　ペプシン処理ＴＦ及び未処理ＴＦのレクチン又は抗体に対する反応値（Ｓ－Ｎ）及び増大量Δを表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　表５から、トランスフェリンをシアル酸特異的レクチンＳＳＡで検出した場合においても、ペプシン処理により反応値を増大させられることがわかった。一方、トランスフェリンを抗ＴＦ抗体で検出した場合では、ペプシン処理による反応値の増加はないことから、固相抗体に捕捉されるトランスフェリン量が増えることがレクチン反応値の増大原因ではないことがわかった。
［実施例２５～２６］　シアル酸に親和性を有するレクチンによるペプシン処理イムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）の検出
　糖タンパク質ＩｇＧを５分間、ペプシン処理し、得られたペプシン処理ＩｇＧをレクチンＥＬＩＳＡ（サンドイッチ法）により検出した。試験は、上記したサンドイッチＥＬＩＳＡ法において、以下の点を除き、同様の操作を行った。
（１）抗体固定化において、固相化抗体に抗ヒト免疫グロブリンポリクローナル抗体（ヤギ）（フナコシ（株）製）を使用した。
（５）抗原抗体反応において、糖タンパク質溶液としてペプシン処理後のＩｇＧ溶液（１μｇ／ｍＬ）及び未処理のＩｇＧ溶液（１μｇ／ｍＬ）を使用した。
（７）レクチン反応では、ビオチン標識化ＰｈｏＳＬ及びビオチン標識化ＡＡＬ（いずれも１μｇ／ｍＬ）を使用した。また、レクチンの代わりに、０．２μｇ／ｍＬの抗ヒト免疫グロブリンポリクローナル抗体（ヤギ）を使用した。
（９）西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ストレプトアビジン反応では、（７）でレクチン反応の代わりに抗ヒト免疫グロブリンポリクローナル抗体（ヤギ）を使用した場合には、ＨＲＰ標識ストレプトアビジンに替えて、ＨＲＰ標識化抗ヤギＩｇＧ抗体溶液（コスモ・バイオ（株）製）をＢＳＡ／ＰＢＳで０．５μｇ／ｍＬとしたものを使用した。
　ペプシン処理ＩｇＧ及び未処理ＩｇＧのレクチン又は抗体に対する反応値（Ｓ－Ｎ）及び増大量Δを表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　表６から、ＩｇＧをフコース特異的レクチンであるＰｈｏＳＬ又はＡＡＬで検出した場合においても、ペプシン処理により反応値を増大できることがわかった。一方、ＩｇＧを抗ＩｇＧ抗体で検出した場合では、ペプシン処理による反応値の増加はないことから、固相抗体に捕捉されるＩｇＧ量が増えることがレクチン反応値の増大原因ではないことがわかった。
［実施例２７～３４］　フコース又はシアル酸に親和性を有するレクチンによるペプシン処理ＡＦＰ－Ｌ３の検出（ＩＩ）
　ＡＦＰ－Ｌ３を添加した血清を用いて、ペプシン処理を行い、サンドイッチＥＬＩＳＡ法によりＡＦＰ－Ｌ３の検出試験を行った。ＡＦＰ－Ｌ３の血清溶液のペプシン処理手順を、以下に示す。
（１）ＡＦＰ－Ｌ３溶液の調製
　ヒトプール血清（１００％血清、（株）ケー・エー・シー製）９９２μＬ、及びこの１００％血清をＰＢＳで１０倍希釈した１０％血清９９２μＬに、それぞれ、５０μｇ／ｍＬのＡＦＬ－Ｌ３溶液８μＬを添加し、ＡＦＰ－Ｌ３／１００％血清、及びＡＦＰ－Ｌ３／１０％血清を調製した（いずれもＡＦＰ－Ｌ３濃度：４００ｎｇ／ｍＬ）。
（２）ペプシン反応
　ＡＦＰ－Ｌ３／１００％血清５５μＬには、４００μｇ／ｍＬのペプシン／１Ｍグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）を２２μＬ添加して、撹拌後、２５℃で静置した。ＡＦＰ－Ｌ３／１０％血清５５μＬには、１０μｇ／ｍＬのペプシン／１Ｍグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）を２２μＬ添加して、撹拌後、２５℃で静置した。
（３）反応停止
　ペプシン溶液添加３０分後、それぞれ、０．３３Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）を３３μＬ添加し、反応を停止させ、ペプシン処理後のＡＦＰ－Ｌ３／１００％血清及びペプシン処理後のＡＦＰ－Ｌ３／１０％血清を得た。
　レクチンによる検出試験は、上記したサンドイッチＥＬＩＳＡ法において、以下の点を除き、同様の操作を行った。
（１）抗体固定化において、固相化抗体に抗ヒトＡＦＰモノクローナル抗体（マウス）（フナコシ（株）製）を使用した。
（５）抗原抗体反応において、糖タンパク質溶液としてペプシン処理後のＡＦＰ－Ｌ３／１００％血清、ペプシン処理後のＡＦＰ－Ｌ３／１０％血清、未処理のＡＦＰ－Ｌ３／１００％血清、及び未処理のＡＦＰ－Ｌ３／１０％血清を使用した（いずれもＡＦＰ－Ｌ３濃度：０．２μｇ／ｍＬ）。
（７）レクチン反応では、ビオチン標識化ＰｈｏＳＬ、ビオチン標識化ＡＡＬ、ビオチン標識化ＳＮＡ－Ｉ、ビオチン標識化ＳＳＡ（いずれも０．５μｇ／ｍＬ）を使用した。
　ペプシン処理ＡＦＰ－Ｌ３／１００％血清及びペプシン処理ＡＦＰ－Ｌ３／１０％血清、　未処理ＡＦＰ－Ｌ３／１００％血清及び未処理ＡＦＰ－Ｌ３／１０％血清のレクチンに対する反応値（Ｓ－Ｎ）及び増大量Δを表７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　表７から、血清存在下、フコース特異的レクチンＰｈｏＳＬ又はＡＡＬでＡＦＰ－Ｌ３を検出した場合であっても、ペプシン処理により反応値を増大できることがわかった。表７から、シアル酸特異的レクチンＳＮＡ－Ｉ又はＳＳＡで検出した場合も同様に、ペプシン処理により反応値を増大できることが確認された。したがって、ヒト血清中の糖タンパク質においても、反応値を増大できることが確認できた。
〔実施例３５〕　フコースに親和性を有するレクチンによるペプシン処理ＡＦＰ－Ｌ３の検出（ＩＩＩ）
　ＡＦＰ－Ｌ３を添加した血清のペプシン処理を、時間を変えて行い、各処理サンプルについてサンドイッチＥＬＩＳＡ法によりＡＦＰ－Ｌ３の検出試験を行った。ペプシン処理手順は、実施例３１のＡＦＰ－Ｌ３／１００％血清（ＡＦＰ－Ｌ３：４００　ｎｇ／ｍＬ）をペプシン処理手順において、ペプシン添加後反応を停止するまでの時間を、３０分間から５、１０、１５、３０、４５又は６０分間に変えた以外は、実施例３１と同様に行った。
　レクチンによる検出試験は、実施例３１と同様の操作で行った。
　　ペプシン処理ＡＦＰ－Ｌ３／１００％血清及び未処理ＡＦＰ－Ｌ３／１００％血清のレクチンに対する反応値（Ｓ－Ｎ）及び増大量Δを表８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　表８から、ペプシン処理５分後、反応値の増大量が０．２４１まで増大した。ペプシン処理１０～６０分間での増大量は、０．３３１～０．３６４であり、ほぼ一定であった。増大効果は、反応時間が５分間から少なくとも６０分間までで得られることがわかった。
［実施例４０］ペプシン処理ＡＦＰ－Ｌ３のＨＰＬＣ－レクチンカラムでの検出
　糖タンパク質にＡＦＰ－Ｌ３を用いてペプシン処理を３０分間行い、ＨＰＬＣ－ＰｈｏＳＬカラムによりペプシン処理ＡＦＰ－Ｌ３の結合試験を行った。その具体的手順を以下に示す。
（１）ＨＰＬＣ－ＰｈｏＳＬカラムの作製
　活性化ハードゲル（（株）Ｊ－オイルミルズ製）にＰｈｏＳＬを添付マニュアルに従って固定化後、ステンレスカラム（１５０ｍｍ×４．６ｍｍＩ．Ｄ．）に充填した。
（２）ペプシン処理ＡＦＰ－Ｌ３のＨＰＬＣ－ＰｈｏＳＬカラムによる分析
１．ＨＰＬＣ用緩衝液の調製
緩衝液Ａ　（５０ｍＭ酢酸アンモニウム）：１Ｍ酢酸アンモニウム（和光純薬（株）製）５０ｍＬを水で１０００ｍＬにメスアップした。
緩衝液Ｂ（０．２Ｎアンモニア）：２５％アンモニア水溶液（シグマ・アルドリッチ製）７．５５ｍＬを水で５００ｍＬにメスアップした。
２．ＨＰＬＣ分析
　ＨＰＬＣ分析装置（システム：　ＬＣ－８０２０、ポンプ：ＤＰ－８０２０、いずれも（株）東ソー社製）を用いて、ペプシン処理ＡＦＰ－Ｌ３又はペプシン未処理ＡＦＰ－Ｌ３を、緩衝液Ａで１０倍希釈したものを１００μＬインジェクトした。緩衝液Ａを１０分間流し、非吸着ピークを得た後、緩衝液Ｂを１０分間流し、吸着溶出ピークを得た。流速は０．５ｍＬ／ｍｉｎ、検出は、ＵＶ２８０ｎｍ（ＵＶ－２０８０、（株）東ソー社製）とした。
　未処理、ペプシン処理ＡＦＰ－Ｌ３をＨＰＬＣ－ＰｈｏＳＬで分析したときの、非吸着ピークエリアの面積及び吸着溶出ピークエリアの面積を測定した。結合率を以下の式に従って計算した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000011
　ペプシン処理　ＡＦＰ－Ｌ３のＨＰＬＣ－ＰｈｏＳＬによる非吸着ピーク面積、吸着溶出ピーク面積及び結合率（％）を、表９に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　表９から、ペプシン処理ＡＦＰ－Ｌ３のＨＰＬＣ－ＰｈｏＳＬによる検出値（結合率）は、未処理のものより増大することがわかった。
〔実施例４１〕　フコースに親和性を有するレクチンによるペプシン処理ＡＦＰ－Ｌ３の検出（ＩＶ）
　ＡＦＰ－Ｌ３を添加した血清のペプシン処理を、ペプシン濃度と時間を変えて行い、各処理サンプルについてサンドイッチＥＬＩＳＡ法によりＡＦＰ－Ｌ３の検出試験を行った。ペプシン処理は、以下のように行った。
（１）ＡＦＰ－Ｌ３溶液の調製
　ヒトプール血清に、ＡＦＰ－Ｌ３溶液を添加し、ＡＦＰ－Ｌ３／１００％血清（ＡＦＰ－Ｌ３濃度：２００ｎｇ／ｍＬ）を調製した。
（２）試薬の調製
〔１．２Ｍグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．２５）〕
　グリシン　９０．０８ｇを、水９００ｍＬ程度に溶解し、６Ｎ塩酸を添加してｐＨメーターでｐＨ３．２５に合わせ、さらに水で１０００ｍＬにメスアップした。
〔０．１％ＢＳＡ／１．２Ｍグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．２５）〕
　ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、シグマ・アルドリッチ製）０．１ｇを１００ｍＬの１．２Ｍグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．２５）に溶解して調製した。
（３）ペプシン反応
　上記ＡＦＰ－Ｌ３／１００％血清６０μＬに、ペプシンを０．１％ＢＳＡ／１．２Ｍグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．２５）に溶解したもの（０．４７～１．１ｍｇ／ｍＬ）を３０μＬ添加して、撹拌後、２５℃で静置した。
（４）反応停止
　５、７、９、１１、１３又は１５分後、０．３３Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）を３０μＬ添加し、反応を停止させた。
　レクチンによる検出試験は、上記したサンドイッチＥＬＩＳＡ法において、以下の点を除き、同様の操作を行った。
（１）抗体固定化において、固相化抗体に抗ヒトＡＦＰモノクローナル抗体（マウス）（フナコシ（株）製）を使用した。
（５）抗原抗体反応において、糖タンパク質溶液として、上記ペプシン処理後のＡＦＰ－Ｌ３／１００％血清及び未処理のＡＦＰ－Ｌ３／１００％血清を使用した（いずれもＡＦＰ－Ｌ３濃度：０．１μｇ／ｍＬ）。
（７）レクチン反応では、ビオチン標識化ＰｈｏＳＬ（０．５μｇ／ｍＬ）を使用した。
　ペプシン処理ＡＦＰ－Ｌ３／１００％血清及び未処理ＡＦＰ－Ｌ３／１００％血清のレクチンに対する検出値を、表１０に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　表１０で示したように、ペプシンの濃度を変えることで、短時間でも十分に反応値を高められることがわかった。

Claims (10)

  1. 　糖タンパク質の検出方法であって、
    該糖タンパク質を含む試料をプロテアーゼ処理する工程、
    前記プロテアーゼ処理された糖タンパク質に、前記糖タンパク質の有する糖鎖と親和性を有する糖結合化合物を作用させて、該糖タンパク質と該糖結合化合物との反応物を得る工程、及び、
    前記反応物を検出する工程
    を含む、前記糖タンパク質の検出方法。
  2. 　前記プロテアーゼ処理が、ペプシン処理、パパイン処理又はアクチナーゼ処理であることを特徴とする、請求項１に記載の糖タンパク質の検出方法。
  3. 　前記試料が血清であることを特徴とする、請求項１に記載の糖タンパク質の検出方法。
  4. 　前記糖結合化合物が、糖結合タンパク質である、請求項１に記載の糖タンパク質の検出方法。
  5. 　前記糖結合化合物が、フコース、シアル酸、マンノース、グルコース、ガラクトース、Ｎ－アセチルグルコサミン及びＮ－アセチルガラクトサミンからなる群から選ばれる少なくとも一種に親和性を有することを特徴とする、請求項１に記載の糖タンパク質の検出方法。
  6. 　前記糖タンパク質は、担体に固定化されている、請求項１に記載の糖タンパク質の検出方法。
  7. 　前記糖タンパク質は、その抗体を介して前記担体に固定化されている、請求項６に記載の糖タンパク質の検出方法。
  8. 　前記糖結合化合物及び／又は前記糖結合化合物を検出するプローブが、標識されている、請求項１に記載の糖タンパク質の検出方法。
  9. 　前記糖鎖が、複合型糖鎖、高マンノース型糖鎖、又はＯ結合型糖鎖である、請求項１に記載の糖タンパク質の検出方法。
  10. 　前記糖タンパク質は、ハプトグロビン、フコシル化ハプトグロビン、トランスフェリン、γ－グルタミルトランスペプチターゼ、イムノグロブリンＧ、イムノグロブリンＡ、イムノグロブリンＭ、α１－酸性糖タンパク質、αフェトプロテイン、フコシル化αフェトプロテイン、フィブリノーゲン、ヒト胎盤絨毛性性腺刺激ホルモン、癌胎児性抗原、前立腺特異抗原、フコシル化前立腺特異抗原、チログロブリン、フェツイン、及びアシアロフェツインからなる群から選ばれる、請求項１に記載の糖タンパク質の検出方法。
PCT/JP2017/002517 2016-01-27 2017-01-25 糖タンパク質の検出方法 WO2017131022A1 (ja)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2017564305A JPWO2017131022A1 (ja) 2016-01-27 2017-01-25 糖タンパク質の検出方法
US16/070,751 US20200088737A1 (en) 2016-01-27 2017-01-25 Method for Detecting Glycoprotein

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2016013188 2016-01-27
JP2016-013188 2016-01-27

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2017131022A1 true WO2017131022A1 (ja) 2017-08-03

Family

ID=59398202

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2017/002517 WO2017131022A1 (ja) 2016-01-27 2017-01-25 糖タンパク質の検出方法

Country Status (3)

Country Link
US (1) US20200088737A1 (ja)
JP (1) JPWO2017131022A1 (ja)
WO (1) WO2017131022A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019189940A1 (ja) 2018-03-30 2019-10-03 積水メディカル株式会社 抗原の処理方法。

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL252923A0 (en) * 2017-06-14 2017-07-31 Alon Yasovsky Sensing system and method for discrimination and analysis

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002502037A (ja) * 1998-02-02 2002-01-22 バイオジーンズ ゲーエムベーハー 生体試料におけるフコシル化タンパク質の測定のためのイムノアッセイおよび試験キット
JP2004233303A (ja) * 2003-01-31 2004-08-19 Hiroyuki Kaji 糖ペプチドの糖鎖結合部位特定方法
JP2009013138A (ja) * 2007-07-09 2009-01-22 National Univ Corp Shizuoka Univ 新規レクチン及びその製造方法、並びに糖鎖検出方法及び糖鎖分別方法
JP2010525328A (ja) * 2007-04-16 2010-07-22 モメンタ ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド 細胞表面グリコシル化に関連する方法
JP2012255736A (ja) * 2011-06-10 2012-12-27 J-Oil Mills Inc 糖タンパク質の検出方法
JP2015040817A (ja) * 2013-08-23 2015-03-02 住友ベークライト株式会社 糖タンパク質試料の調製方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002502037A (ja) * 1998-02-02 2002-01-22 バイオジーンズ ゲーエムベーハー 生体試料におけるフコシル化タンパク質の測定のためのイムノアッセイおよび試験キット
JP2004233303A (ja) * 2003-01-31 2004-08-19 Hiroyuki Kaji 糖ペプチドの糖鎖結合部位特定方法
JP2010525328A (ja) * 2007-04-16 2010-07-22 モメンタ ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド 細胞表面グリコシル化に関連する方法
JP2009013138A (ja) * 2007-07-09 2009-01-22 National Univ Corp Shizuoka Univ 新規レクチン及びその製造方法、並びに糖鎖検出方法及び糖鎖分別方法
JP2012255736A (ja) * 2011-06-10 2012-12-27 J-Oil Mills Inc 糖タンパク質の検出方法
JP2015040817A (ja) * 2013-08-23 2015-03-02 住友ベークライト株式会社 糖タンパク質試料の調製方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KRUSIUS, TOM ET AL.: "The structural basis of the different affinities of two types of acidic N-glycosidic glycopeptides for concanavalin A-sepharose", FEBS LETTERS, vol. 71, no. 1, 15 November 1976 (1976-11-15), pages 117 - 120, XP025602726, ISSN: 0014-5793, DOI: 10.1016/0014-5793(76)80911-8 *
NERI, GIOVANNI ET AL.: "Effect of Neuroaminidase and Papain Treatment on Lectin-induced Agglutination of Novikoff Tumor Cells and Assay of Lectin Receptor Activity of the Glycopeptides Released from the Cell Surface by Papain", CANCER RESEARCH, vol. 36, no. 1, 1 January 1976 (1976-01-01), pages 263 - 268, XP055598949 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019189940A1 (ja) 2018-03-30 2019-10-03 積水メディカル株式会社 抗原の処理方法。

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2017131022A1 (ja) 2018-11-22
US20200088737A1 (en) 2020-03-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Halleen et al. Tartrate‐resistant acid phosphatase from human bone: Purification and development of an immunoassay
US20120107858A1 (en) Cancer diagnosis method using the glycosylation of a glycoprotein
JP5808583B2 (ja) 糖タンパク質の検出方法
US20140193832A1 (en) Detection of prostate cancer using psa glycosylation patterns
JP2008249716A (ja) 癌発生及び転移に関与するタンパク質の糖鎖変化を測定して癌を診断する方法及びそれを利用した診断キット
KR20200138300A (ko) 단백질 글리코프로파일링의 수단 및 방법
KR101219519B1 (ko) 렉틴을 이용한 암 진단 방법
JP2008032520A (ja) グリコシル化異常症の検査方法
US20060141546A1 (en) Bacterial test method by glycated label binding
WO2012173228A1 (ja) ３´硫酸化コア１糖鎖に結合するプローブを用いるムチン１の分析方法、及び乳癌の検出又はモニタリング方法
US20060040345A1 (en) Deglycosylated enzymes for conjugates
WO2017131022A1 (ja) 糖タンパク質の検出方法
JP2010540953A (ja) 膵炎、敗血症および膵臓癌のためのグリコシル化マーカー
JP2012530253A (ja) ペルオキシレドキシン４の診断的使用
US9562904B2 (en) Competition based-detection assays
KR101130755B1 (ko) 대장암 진단 방법
KR101311886B1 (ko) 폐렴연쇄상구균의 분비단백질을 포함하는 폐렴 진단용 조성물
WO2017131021A1 (ja) 糖タンパク質の測定方法
KR101143891B1 (ko) 단백질의 비정상적인 당쇄화를 이용하는 암진단 마커
KR101100809B1 (ko) 암 진단용 펩티드 마커 및 이를 이용한 암 진단방법
US20070275422A1 (en) Methods and Compositions for Detecting Pancreatic Disease
EP4191246A1 (en) Novel cancer biomarker in pancreatic cancer or malignant intraductal papillary mucinous carcinoma
US20140335535A1 (en) Peptide marker for cancer diagnosis and cancer diagnosis method using the same
Khairol Mokhtar et al. Systematic Optimisation of Microtiter Plate Lectin Assay to Improve Sialic Acid Linkage Detection
JP2007024661A (ja) 糖鎖不全ＩｇＡ分子の定量方法及び定量キット

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 17744252

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2017564305

Country of ref document: JP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 17744252

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1