JP2009013138A - 新規レクチン及びその製造方法、並びに糖鎖検出方法及び糖鎖分別方法 - Google Patents

Abstract

【課題】グルコースα１→６結合、及び、マンノースα１→６結合を認識する新規なレクチンを提供する。
【解決手段】（１）分子量が、１０，０００〜３０，０００であり、（２）Ｎ−末端領域のアミノ酸配列が、Thr-Ile-Gly-であり、（３）Ｇｌｃα１→６Ｇｌｃ、及び、Ｍａｎα１→６Ｍａｎに結合するヌメリガサ属（Hygrophorus）担子菌に由来するレクチンである。
【選択図】なし

Description

本発明は、新規レクチン及びその製造方法に関し、特にキノコ抽出物由来の新規レクチン及びその製造方法、並びに該レクチンを用いた糖鎖検出方法及び糖鎖分別方法に関する。

レクチンは、植物、動物のほか菌類などにも存在するタンパク質又は糖タンパク質のうち、糖に対する特異的結合活性をもった物質の総称である。レクチンは、単糖のみならず糖鎖中の糖も認識するため、有用糖鎖プロファイラーとして広く用いられている。またレクチンは糖鎖に対する特異的な結合能が高いため、これを利用した目的物質の検出が可能である。目的物質の検出をより効率よく行うために、従来のレクチンとは特異性や結合能の高さなどが異なる新規なレクチンが探索され、種々見出されている（例えば、特許文献１及び２参照）。

一方、糖鎖の研究の進歩に伴って、糖鎖が生体内外で重要な役割を果たしていることが明らかになってきた。例えば、ウィルス感染や癌等の各種疾患における糖鎖の役割が重要視されてきている。このため、より詳細な糖鎖研究が求められており、糖鎖の分析や癌などの診断において、特定の糖鎖を認識可能なレクチンは、有用なツールとして利用されてきている（例えば、特許文献３参照）。
特許第２６３０４３１号公報 特許第２８９５９６２号公報 特開平１０−３０７１３８号公報

現在知られているレクチンでは認識が困難な糖鎖があり、新規なレクチンの開発に対する要請が大きくなっている。特に、コンカナバリンＡやエンドウ豆レクチンなどの公知のグルコース、マンノース特異的レクチンでは、グルコースやマンノースの結合様式までは、判断することができない。
本発明は、グルコースやマンノースの結合において、特に、α１→６結合を有するグルコースオリゴマー又はマンノースオリゴマーを特異的に検出可能なレクチンを提供することを目的とする。

本発明のレクチンは、（１）分子量が、約１０，０００〜３０，０００であって、（２）Ｎ−末端領域のアミノ酸配列が、Thr-Ile-Gly-であって、（３）Ｇｌｃα１→６Ｇｌｃ及びＭａｎα１→６Ｍａｎに結合するヌメリガサ属（Hygrophorus）担子菌に由来のレクチンである。
前記Ｎ−末端領域のアミノ酸配列は、Thr-Ile-Gly-X-Ala-Lys-Pro-であることが好ましい。
また、本発明のレクチンは、ヌメリガサ属担子菌の水系媒体抽出物を、グルコース残基及び／又はマンノース残基を有する糖を含有する溶出液と、グルコース残基及び／又はマンノース残基を含有する担体とを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより精製して得られるものであることが好ましい。

また、本発明のレクチンの製造方法は、ヌメリガサ属担子菌の子実体から水系媒体抽出物を得る抽出工程と、前記水系媒体抽出物を、グルコース残基及び／又はマンノース残基を有する糖を含有する溶出液と、グルコース残基及び／又はマンノース残基を含有する担体とを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより精製する精製工程を有する。
前記ヌメリガサ属担子菌はサクラシメジ、ヒメサクラシメジ、サクラシメジモドキからなる群より選択された少なくとも１種であることが好ましい。

また、本発明の標識レクチンは、前記レクチンと標識手段とを含む。
また、本発明の糖鎖化合物の検出方法は、前記レクチン又は前記標識レクチンを用いて、Ｇｌｃα１→６Ｇｌｃ及びＭａｎα１→６Ｍａｎの少なくとも１種を含む糖鎖を検出する工程を含む糖鎖検出方法である。

また、本発明のレクチン固定化担体は、前記レクチンと支持担体とを含む。
更に、本発明の糖鎖化合物の分別方法は、前記レクチン又は前記レクチン固定化担体を用いて、Ｇｌｃα１→６Ｇｌｃ及びＭａｎα１→６Ｍａｎの少なくとも１種を含む糖鎖を分別する工程を含む糖鎖分別方法である。

本発明によれば、グルコースやマンノースの結合において、特に、α１→６結合を有するグルコースオリゴマー又はマンノースオリゴマーを特異的に検出可能なレクチンを提供することができる。

本発明の上記レクチンは、ヌメリガサ属に属する担子菌に由来するレクチンである。なかでもヌメリガサ属担子菌の子実体（キノコ）に由来するレクチンであることが好ましい。
本発明におけるヌメリガサ属担子菌としては、サクラシメジ、ヒメサクラシメジ、サクラシメジモドキ、アケボノサクラシメジ、ウコンガサ、キヌメリガサ、コケイロヌメリガサ、シモフリヌメリガサ、フキサクラシメジ、ヤギタケ等を挙げることができ、このうちレクチンの糖認識特異性とレクチンの回収効率の観点から特に、サクラシメジ、ヒメサクラシメジ及びサクラシメジモドキから選択された少なくとも１種であることが好ましく、サクラシメジであることがより好ましい。

本発明のレクチンは、ＳＤＳ電気泳動法による分子量が１０，０００〜３０，０００であるが、１５，０００〜２０，０００であることが好ましい。
ＳＤＳ電気泳動法による分子量の測定は、例えば、Ｌａｅｍｍｉの方法（Nature, 227巻, 680頁, 1976年）に準じて行うことができる。

また、本発明のレクチンは、Ｎ−末端領域にThr-Ile-Gly-（配列番号１）からなるアミノ酸配列を有するタンパク質を含むものであるが、Ｎ−末端領域のアミノ酸残基は、Thr-Ile-Gly-X-Ala-Lys-Pro-（配列番号２）であることが好ましい。ここで、前記Ｘは任意のアミノ酸残基であってよいが、Thr又はCysであることが好ましい。
中でも、Ｎ−末端領域が、Thr-Ile-Gly-Thr-Ala-Lys-Pro-Ile-Leu-Ala-Gln-Thr-Ala-Ile-Val-Gly-Gly-Pro-Ser-Val-Pro-Phe-Asp-Asp-Ala-Arg-Glu-Val-Ala-Ser-Trp-Pro-Ala-Lys-Leu-Glu-Ile-Ala-Gln-Asp-（配列番号３）、Thr-Ile-Gly-X-Ala-Lys-Pro-Val-Leu-Val-Gln-Asn-Val-Leu-Leu-Gly-Gly-Pro-Ala-Val-（配列番号４）又はThr-Ile-Gly-X-Ala-Lys-Pro-Val-Leu-Val-Gln-Thr-Gly-Ile-Val-Gly-Gly-Pro-X-Val-（配列番号５）からなるアミノ酸配列を有するタンパク質を含むものであることがより好ましい。

また、本発明のレクチンは、Ｇｌｃα１→６Ｇｌｃ及びＭａｎα１→６Ｍａｎに対して高い結合特異性を有していることを特徴とする。
ここでＧｌｃα１→６Ｇｌｃは、２分子のグルコースがα１→６結合で結合したイソマルトース構造を意味する。また、Ｍａｎα１→６Ｍａｎは、２分子のマンノースがα１→６結合で結合したα１→６マンノビオース構造を意味する。
本発明のレクチンは、グルコース又はマンノースがα１→６結合で結合した部分構造を有する糖鎖を特異的に認識することができるという従来のレクチンには知られていなかった糖結合特異性を有する。

レクチンの糖結合特異性は、例えば、当該レクチンが特異的に凝集させることができる赤血球を用いて、その赤血球の凝集反応を阻止しうる糖類の種類とその濃度を調べることにより確認することができる。

本発明のレクチンは、ヌメリガサ属担子菌から、公知の抽出方法、分離方法及び精製方法等を適宜組み合わせて行うことにより単離して製造することができる。中でも、以下に説明する製造方法で得られるレクチンであることが好ましい。

本発明のレクチンの製造方法は、前記ヌメリガサ属担子菌の子実体を原料とし、水系媒体を抽出溶媒として用いて、水系媒体抽出物を得る抽出工程を有する。

水系媒体としては、各種の緩衝液、水と混合しうる各種の有機溶媒と水又は緩衝液との混合物等を挙げることができる。緩衝液又は有機溶媒と緩衝液の混合物を用いることが好ましい。
緩衝液としては、特に制限されることなく公知の緩衝液を用いることができる。中でも、ｐＨ３〜ｐＨ１０の範囲に緩衝能を有するものが好ましく、ｐＨ６〜ｐＨ８の範囲に緩衝能を有する緩衝液がより好ましい。

本発明に用いられる緩衝液としては、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、トリス緩衝液等を挙げることができる。中でも抽出効率の観点から、リン酸緩衝液等が好ましい。
緩衝液の塩濃度については、特に制限はないが、抽出効率と緩衝能の点から、１ｍＭ〜１００ｍＭであることが好ましく、５ｍＭ〜２０ｍＭであることがより好ましい。

また、緩衝液は各種の塩類を更に含むことができ、例えば、リン酸緩衝液に食塩を更に加えたリン酸緩衝化生理食塩水等を本発明における水系媒体として好ましく用いることができる。

また、有機溶媒としては水と混合しうる有機溶媒であれば特に制限なく用いることができるが、中でも、アセトン、メタノール、エタノール、２-プロパノール及びアセトニトリルを好ましく挙げることができる。有機溶媒と水又は緩衝液を混合する場合の有機溶媒の含有量としては１０質量％〜４０質量％であることが好ましい。

水系媒体とヌメリガサ属担子菌の子実体とから、水系媒体抽出物を得る方法については、水系媒体とヌメリガサ属担子菌の子実体とを接触させることができれば特に制限はない。抽出効率の観点から、水系媒体中でヌメリガサ属担子菌の子実体を粉砕して懸濁液とする方法が好ましい。また粉砕する方法としては、ミキサーやホモジナイザー等通常の粉砕方法を挙げることができる。

本発明における抽出工程は、水系媒体とヌメリガサ属担子菌の子実体との混合物から、水系媒体に対する不溶物を除去する工程を更に含むことが好ましい。不溶物の除去方法としては、濾過、遠心分離等の方法を挙げることができるが、除去効率の観点から遠心分離が好ましい。

本発明の抽出工程は、リン酸緩衝化生理食塩水中で、ヌメリガサ属担子菌の子実体を粉砕し、遠心分離によって不溶物を除去して水系媒体抽出物を得る工程であることが特に好ましい。

本発明のレクチンの製造方法においては、上記抽出工程によって得られた水系媒体抽出物を、グルコース残基及び／又はマンノース残基を有する糖類を含有する溶出液と、グルコース残基及び／又はマンノース残基を含有する担体とを用いたアフィニティークロマトグラフィーに付して精製する精製工程を有する。これにより、より効率的に精製を行うことができる。

本発明における担体としては、グルコース残基及び／又はマンノース残基を含有する担体であれば特に制限なく用いることができる。中でも、α１→６結合を有するグルコース残基を含有する担体であることが好ましい。α１→６結合を有するグルコース残基を含有する担体としては、例えば、デキストラン担体を挙げることができる。
前記デキストラン担体は、架橋デキストランを含有する担体であることが好ましく、中でも分画範囲が１００，０００Ｄａ以下の担体を用いることがより好ましく、１，５００〜８０，０００Ｄａの担体を用いることがより好ましい。具体的には、例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ担体（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス（株）製）を挙げることができる。中でも、精製効率の観点から、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０又はＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−７５を用いることが特に好ましい。

本発明におけるアフィニティークロマトグラフィーにおいては、グルコース残基及び／又はマンノース残基を含む担体を充填剤としたカラムを用いることが好ましい。前記水系媒体抽出物を前記カラムに吸着させ、グルコース残基及び／又はマンノース残基を有する糖類を含有する溶出液を用いて分離及び分画することで、より効率よく本発明のレクチンを精製することができる。
また本発明においては、前記水系媒体抽出物を前記カラムに吸着させた後に、適当な洗浄液、例えば、上述した緩衝液を用いて洗浄を行った後に、グルコース残基及び／又はマンノース残基を有する糖類を含有する溶出液を用いて分離及び分画することがより好ましい。

前記溶出液としては、グルコース残基及び／又はマンノース残基を有する糖類を含有する溶液であれば、特に制限なく用いることができる。グルコース残基及び／又はマンノース残基を有する糖類としては、例えば、イソマルトオリゴ糖、グルコース、マンノース、メチル-α-マンノシド、２αマンノビーオース、３αマンノビーオース、４αマンノビーオース、６αマンノビーオース等を挙げることができる。中でも、本発明のレクチンの糖特異性の観点から、イソマルトオリゴ糖、グルコース、マンノースを用いることが好ましい。
前記溶出液に含まれる糖類の濃度には特に制限はないが、例えば、イソマルトオリゴ糖を含む溶出液における糖類の含有量としては、精製効率の点から、０．１質量％〜１０質量％であることが好ましく、０．５質量％〜２質量％であることがより好ましい。また、グルコース又はマンノースを含む溶出液における糖類の濃度としては、精製効率の点から、１０ｍＭ〜１０００ｍＭであることが好ましく、１０ｍＭ〜５００ｍＭであることがより好ましい。
尚、グルコース、マンノース及びイソマルトオリゴ糖は市販のものを好適に用いることができる。

本発明における精製工程としては、デキストラン担体を充填剤としたカラムに前記水系媒体抽出物を吸着させ、緩衝液、特に、リン酸緩衝化生理食塩水を用いて非吸着成分の洗浄をおこなった後に、マンノース、グルコース、イソマルトオリゴ糖から選ばれる少なくとも１種を１０ｍＭ〜５００ｍＭ含有する溶出液を用いて精製する工程であることが特に好ましい。

本発明のレクチンの製造方法は、前記精製工程で得られたレクチンを含む画分を透析処理する工程と、透析処理後のレクチン溶液を凍結乾燥する工程とを含むことができる。これにより、レクチンを単離することができる。
透析処理する工程及び凍結乾燥する工程は、通常用いられる公知の方法によって行うことができる。

本発明のレクチンは、従来公知のレクチンとは物理化学的性質、及び、糖鎖への結合特異性などの生化学的性質が異なる新規のレクチンである。特にグルコース及びマンノースのα１→６結合を特異的に認識することから、検査試薬、免疫調節剤、糖質の分離分析用特異的吸着剤等として用いることができる。

本発明の標識レクチンは、前記レクチンと標識手段とを少なくとも含み、検出可能に標識化されていることを特徴とする。標識手段としては、特に制限なく公知の標識化方法を適用することができ、例えば、放射性同位元素による標識化、標識化合物の結合等を挙げることができる。
標識化合物としては、この用途に通常用いられるものであれば特に制限なく適用することができ、例えば、直接又は間接標識化合物、酵素、蛍光化合物等を挙げることができる。具体的にはビオチン、ジゴキシゲニン、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ、フルオレセインイソチオシアネート、ＣｙＤｙｅ等を挙げることができる。これらの標識化合物は常法によりレクチンと結合することができる。

本発明の糖鎖検出方法は、前記レクチン又は前記標識レクチンを用いて、Ｇｌｃα１→６Ｇｌｃ及び／又はＭａｎα１→６Ｍａｎを含む糖鎖を検出する工程を含むことを特徴とする。前記レクチンはＧｌｃα１→６Ｇｌｃ及びＭａｎα１→６Ｍａｎを特異的に認識して結合できることから、Ｇｌｃα１→６Ｇｌｃ及び／又はＭａｎα１→６Ｍａｎを含む糖鎖を含有する多糖類、糖脂質、糖タンパク質等の糖鎖化合物を特異的に検出することができる。

レクチンが結合した糖鎖化合物の検出は、例えば、標識手段によってレクチンを予め標識化することで容易に行うことができる。中でも、感度と検出の容易さから、標識化合物を予めレクチンに結合してレクチンを標識化しておき、標識化合物を検出することによって行うことが好ましい。
標識レクチンの検出手段は、用いられた標識手段に応じて適宜選択される。例えば、吸光度測定、発光強度測定、蛍光強度測定、目視等により行うことができる。

本発明のレクチン固定化担体は、前記レクチンと支持担体とを少なくとも含む。支持担体を構成する材料としては、特に制限はなく、例えば、無機材料、有機材料、及びこれらの複合材料を挙げることができる。無機材料としては、金属、半導体、金属酸化物等の金属化合物、セラミックス、ガラス、シリカ等を挙げることができる。また、有機材料としては、ゴム、ラテックス、ポリスチレン、ポリプロピレン等のポリビニルポリマー類、ポリアクリル酸エステル、ポリアクリルアミド、ポリエステル、ゼラチン等のポリアミド類、セルロース、アガー、アガロース等の多糖類等を挙げることができる。
また支持担体の構造としては、特に制限はなく、例えば、多孔質構造、繊維状構造、ゲル状構造等を挙げることができる。

本発明における支持担体としては、例えば、ポリアクリル酸エステル、アガロース、ビニルポリマー等を挙げることができ、糖鎖の分別効率の観点から、アガロース等が好ましい。
レクチンは前記支持担体に対して、支持担体に応じた常法を用いて固定化することができる。また、レクチンと支持担体との間には、連結基（スペーサー）が設けられていても良い。

本発明の糖鎖分別方法は、前記レクチン又は前記レクチン固定化担体を用いて、Ｇｌｃα１→６Ｇｌｃ及び／又はＭａｎα１→６Ｍａｎを含む糖鎖を分別する工程を含むことを特徴とする。前記レクチンはＧｌｃα１→６Ｇｌｃ及びＭａｎα１→６Ｍａｎを特異的に認識して結合できることから、Ｇｌｃα１→６Ｇｌｃ及び／又はＭａｎα１→６Ｍａｎを含む糖鎖を含有する多糖類、糖脂質、糖タンパク質等の糖鎖化合物を特異的に分別することができる。

レクチンが結合する糖鎖化合物の分別は、例えば、レクチンを固定化した担体を用いることによって容易に行うことができる。糖鎖化合物の分別方法は、レクチンを固定化した担体に応じて適宜選択され、カラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、Ｂ／Ｆ分離（bound/free分離）等により行えばよい。

本発明の糖鎖検出方法及び糖鎖分別方法においては、本発明のレクチンを用いるが、糖鎖検出感度、糖鎖分別効率の観点から、Ｇｌｃα１→６Ｇｌｃ及びＭａｎα１→６Ｍａｎを含む糖鎖との相互作用強度が、Ｇｌｃα１→６Ｇｌｃ及びＭａｎα１→６Ｍａｎを含まない糖鎖との相互作用強度の１０倍以上であることが好ましい。レクチンと糖鎖との相互作用強度は、例えば、赤血球凝集反応阻害試験を用いて測定することができる。

以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。尚、特に断りのない限り、「％」は質量基準である。

（実施例１）
山梨県山林中より採取したヌメリガサ属サクラシメジ（Hygrophorus russula）の子実体１００ｇに、１０ｍＭリン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．４、以下「ＰＢＳ」ということがある）を１００ｍｌ加えて、ミキサーにて粉砕した。これを４℃で昼夜放置した後、遠心分離（８５００×ｇ、２０分間、４℃）し、上清を粗抽出液（水系媒体抽出物）とした。
得られた粗抽出液を、ＰＢＳで平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−７５アフィニティーカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製；φ５×１５ｃｍ）に付した。非吸着分をＰＢＳ（約７００ｍｌ）にて洗浄した後、３００ｍＭのマンノース溶液を用いて溶出し、レクチン含有画分を得た。尚、レクチンを含有する画分は２８０ｎｍにおける吸光度及び赤血球凝集活性を測定することによって同定した。
得られたレクチン含有画分を、常法により透析処理し、凍結乾燥することでヌメリガサ属担子菌に由来するレクチン（Hygrophorus russula lectin : ＨＲＬ）を６ｍｇ得た。

＜レクチンの評価＞
実施例１で得られたレクチン（ＨＲＬ）に対して以下の評価を行った。
［ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動］
Laemmliらの方法に従い１０％のＳＤＳを含む濃縮ゲル５％Ｔ、分離ゲル１５％Ｔのアクリルアミドスラブゲルを作製した。
レクチン１０μｇを蒸留水３１．２５μｌに溶解し、ついで１０％ＳＤＳ１０μｌ、０．５Ｍトリス緩衝液（ｐＨ６．８）６．２５μｌ、２−メルカプトエタノール２．５μｌを加えて、総量５０μｌとした。これを１０分間煮沸した後、０．０５％ブロモフェノールブルー、７０％グリセロールを各５μｌ加えて、試料溶液とした。また、分子量マーカーとしては、XL-Ladder Low range（ＡＰＲＯ社製）を使用した。
泳動はコンパクト−ＰＡＧＥ（ＡＴＴＯ社製）を用いて行った。試料溶液、分子量マーカーは共に５μｌ用いた。泳動槽用緩衝液として、０．１％のＳＤＳを含むトリス２５ｍＭ、グリシン１９２ｍＭを含む緩衝液を用いた。泳動終了後、ゲルを直ちに染色液（０．１％ＣＢＢ Ｒ-２５０、３０％メタノール、１０％酢酸）に浸し、６０℃で３０分間緩やかに振とうしながら染色した。ついで脱色液（３０％メタノール、１０％酢酸)に浸し、同様に６０℃で時折脱色液を交換しながら脱色した。十分脱色後、ゲルを濾紙上にてゲル乾燥機により乾燥し、相対移動度から分子量を推定した。結果を図１に示した。

図１から、ＨＲＬの分子量が１５，０００〜２０，０００であることが分かる。
また、上記試料液の調製において、蒸留水を３３．７５μｌ用い、２-メルカプトエタノールを添加しなかった以外は同様にして調製した試料溶液を用いて、上記と同様にして電気泳動を行ったところ、上記と同様の結果が得られた。このことから、本発明のレクチンはサブユニットがジスルフィド結合で結合したタンパク質ではないことが分かる。

［ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析］
ＨＲＬ１０μｇをＴＡ（０．１％ＴＦＡとアセトニトリルの体積比２：１の混合物）に溶解した。ＴＡに溶解した飽和マトリックスとＨＲＬのＴＡ溶液を体積比４：１で混合したもの１．０μｌをターゲットプレートに滴下してサンプルを調製した。質量分析装置としてブルカーダルトニクス社製Autoflexを用い、ＬＰモードでＨＲＬの分子量を測定した。その結果、ＨＲＬの分子量は約１８，５００であった。

［ゲル濾過クロマトグラフィー］
ゲル濾過カラムとして、TSK-gel BioAssist G3SWXL（φ７．８×３００ｍｍ、東ソー（株）製）を用い、HPLCによるゲル濾過クロマトグラフィーを以下のようにして行い、未変性状態のＨＲＬの分子量を測定した。
あらかじめＰＢＳで平衡化しておいたカラムに試料溶液を付した。流速０．５ｍｌ/ｍｉｎで溶出し、試料の溶出時間から分子量を推定した。尚、検出は２８０ｎｍにおける吸光度で行い、分子量推定用検量線の作製には、Molecular weight markers for gel filtration chromatography（Sigma社製）を使用した。

ゲル濾過クロマトグラフィーの結果から、未変性状態におけるＨＲＬの分子量は７４ｋＤａであることが分かった。したがって本発明のレクチンは分子量１８，５００のサブユニットの４量体であると推定できる。

［Ｎ−末端領域のアミノ酸配列］
ＨＲＬのＮ−末端領域のアミノ酸配列を、Protein Peptide Sequencer PPSQ-21 System（島津製作所社製）を用いて解析したところ、下記アミノ酸配列（配列番号３）であることが分かった。
Thy-Ile-Gly-Thr-Ala-Lys-Pro-Ile-Leu-Ala-Gln-Thr-Ala-Ile-Val-Gly-Gly-Pro-Ser-Val-
Pro-Phe-Asp-Asp-Ala-Arg-Glu-Val-Ala-Ser-Trp-Pro-Ala-Lys-Leu-Glu-Ile-Ala-Gln-Asp

［等電点電気泳動］
市販のゲル（ＰｈａｓｔＧｅｌ ＩＥＦ ３−１０；ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用い、付属のインストラクションマニュアルに従って等電点電気泳動を行った。
試料として１０μｇのＨＲＬを蒸留水１０μｌに溶解したものを用い、等電点マーカーはＢｒｏａｄ ｐＩ ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いた。
本発明のレクチンの等電点はｐＩ６．５５であった。

［温度安定性］
５０μｇのＨＲＬを生理食塩水１ｍｌに溶解し、各試験温度で３０分間インキュベートした。直ちに氷冷し１０分後に上記と同様にして赤血球凝集活性を測定した。結果を図２に示した。

図２から、本発明のレクチンは０℃〜７０℃における温度安定性を示すことが分かる。

［ｐＨ安定性］
５０μｇのＨＲＬを生理食塩水１ｍｌに溶解し、これを試験管に分取した。等量の下記の各ｐＨ緩衝液をそれぞれ加え、４℃にて２４時間インキュベートした後、上記と同様にして赤血球凝集活性を測定した。結果を図３に示した。

−ｐＨ緩衝液−
ｐＨ２．０−３．５ : ２０ｍＭ ＫＣｌ−ＨＣｌ緩衝液
ｐＨ４．０−５．５ : ２０ｍＭ 酢酸緩衝液
ｐＨ６．０−７．５ : ２０ｍＭ リン酸緩衝液
ｐＨ８．０−８．５ : ２０ｍＭ トリス(トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン)緩衝液
ｐＨ９．０−１０．５ : ２０ｍＭ グリシン−ＮａＯＨ緩衝液
尚、各緩衝液は０．１５Ｍ 塩化ナトリウムを含む。

［タンパク質含有量］
タンパク質含有量は、ＩｇＧを標準としたＢｒａｄｆｏｒｄ色素結合法により測定した。１０μｇ／ｍｌ〜１．２５μｇ／ｍｌのＩｇＧ溶液を調製した。それぞれの溶液８００μｌにバイオラッドプロテインアッセイ染色液（日本バイオラッドラボラトリーズ社製）２００μｌを加え、激しく攪拌した。３０分後に５９５ｎｍの吸光度を測定して、検量線を作成した。
２０〜５μｇ／ｍｌのＨＲＬ試料溶液を調製し、上記と同様にして吸光度を測定し、検量線からタンパク質含有量を推定した。
ＨＲＬのタンパク質含有量は、７９．６％であった。

［中性糖含有量］
グルコースを標準としたフェノール−硫酸法により中性糖含有量を測定した。０〜３０％のグルコース溶液を調製し、グルコース溶液１００μｌを比色管に分注した。５％フェノール０．５ｍｌ、ついで濃硫酸２．５ｍｌを素早く加え、激しく振盪した。そして、室温になるまで冷却した後、４８５ｎｍの吸光度を測定し、検量線を作成した。
試料としてＨＲＬの１ｍｇ／ｍｌ水溶液を用い、グルコースと同様にして、吸光度を測定し、検量線から中性糖含有量を推定した。
ＨＲＬの中性糖含有量は３．５％であった。

［ウサギ赤血球凝集活性試験］
ウサギ血液１０ｍｌを採血後、直ちに３．８％クエン酸ナトリウム溶液２．０ｍｌを加えた試験管内でよく混合し、血液の凝固を阻止した。次に遠心分離（３０００×ｇ、３ｍｉｎ、常温）を行い血漿及び白血球を除去し、赤血球のみとした。これにＰＢＳを赤血球の約３倍量加えてよく混合し、同様の条件で遠心分離し上清を取り除いた。これを３回繰り返すことで血漿及び白血球を完全に取り除き、これを洗浄赤血球とした。この洗浄赤血球をＰＢＳで希釈し、ウサギ３％赤血球懸濁液とした。

−赤血球凝集活性の測定−
９６ウェルタイタープレートの一段にＰＢＳを各２０μl入れ、ウェルに、レクチン溶液（２０μｇ／ｍｌ）を２０μl入れ、順次１／２希釈系列を作製した。上記で得られたウサギ３％赤血球溶液をそれぞれ２０μl添加し、室温で約60分放置後、赤血球凝集活性を肉眼にて観察した。凝集が認められた最大稀釈度の逆数を原液の凝集力価とし、凝集力価の２を底とする対数を赤血球凝集活性として表１に示した。

［ヒツジ赤血球凝集活性試験］
ウサギ赤血球凝集活性試験において、ウサギ血液の代わりにヒツジ血液を用いた以外は同様にして、ヒツジ赤血球凝集活性試験を行った。結果を表１に示した。

［ヒト赤血球凝集活性試験］
Ａ型、Ｂ型、Ｏ型のヒト血液１０ｍｌを採血後、直ちに３．８％クエン酸ナトリウム溶液２．０ｍｌを加えた試験管内でよく混合し、血液の凝固を阻止した。次に遠心分離（３０００×ｇ、３ｍｉｎ、常温）を行い血漿及び白血球を除去し、赤血球のみとした。これにＰＢＳを赤血球の約３倍量加えてよく混合し、同様の条件で遠心分離し上清を取り除いた。これを３回繰り返すことで血漿及び白血球を完全に取り除き、これを洗浄赤血球とした。この洗浄赤血球をＰＢＳで希釈し、Ａ型、Ｂ型、Ｏ型の３％赤血球懸濁液とした。次いで以下の処理を行い、アクチナーゼＥ処理赤血球懸濁液、トリプシン処理赤血球懸濁液、ノイラミニダーゼ処理赤血球懸濁液を調製した。

・アクチナーゼＥ処理赤血球懸濁液の調製
上記で得られた洗浄赤血球１ｍｌを、４ｍｇのアクチナーゼＥを溶解させた９ｍｌのＰＢＳに懸濁し、４５℃で３０分間振とうして反応させた。反応後、遠心分離（３，０００×ｇ、３ｍｉｎ、常温）し、上清を取り除くことで赤血球のみとする洗浄を３回繰り返した。この赤血球をＰＢＳで希釈し、３％アクチナーゼＥ処理赤血球懸濁液とした。

・トリプシン処理赤血球懸濁液の調製
上記で得られた洗浄赤血球１ｍｌを１ｍｇのトリプシンを溶解させた９ｍｌのＰＢＳに懸濁し、３７℃で９０分間振とうして反応させた。さらに、１ｍｇのトリプシンを添加し、３７℃で９０分間振とうして反応させた。反応後、遠心分離（３，０００×ｇ、３ｍｉｎ、常温）し、上清を取り除くことで赤血球のみとする洗浄を３回繰り返した。この赤血球をＰＢＳで希釈し、３％トリプシン処理赤血球懸濁液とした。

・ノイラミダーゼ処理赤血球懸濁液の調製
上記で得られた洗浄赤血球１ｍｌを１Ｕのノイラミダーゼを溶解させた９ｍｌのＰＢＳに懸濁し、３７℃で６０分間振とうして反応させた。反応後、遠心分離（３，０００×ｇ、３ｍｉｎ、常温）し、上清を取り除くことで赤血球のみとする洗浄を３回繰り返した。この赤血球をＰＢＳで希釈し、３％ノイラミダーゼ処理赤血球懸濁液とした。

上記で得られたＡ型、Ｂ型、Ｏ型のアクチナーゼＥ処理赤血球懸濁液、トリプシン処理赤血球懸濁液、ノイラミニダーゼ処理赤血球懸濁液を用いた以外はウサギ赤血球凝集活性試験と同様にしてヒト赤血球凝集活性を測定した。結果を表１に示した。

［糖結合特異性］
種々の単糖、オリゴ糖、多糖および糖タンパクを用いて赤血球凝集反応阻害試験によりレクチンの糖結合特異性を評価した。９６穴Ｕ底マイクロタイタープレートに１０μｌの糖溶液の２倍希釈系列を作製した。力価４にあらかじめ調節しておいたレクチン溶液をそれぞれの穴に１０μｌずつ加えた。室温にて１時間静置して感作させた後、２０μｌの３％赤血球懸濁液をそれぞれの穴に加え、さらに室温にて１時間静置した。その後、赤血球の凝集を完全に阻害するサンプル溶液の希釈倍率を肉眼にて判定した。阻害を示す最低濃度を最小阻害濃度とした。この最小阻害濃度が小さいほど、レクチンに対する特異性が高いことを示している。結果を下記表２及び表３に示した。
また、これらの特異性を市販のグルコース・マンノース特異的レクチンであるコンカナバリンＡレクチン（ConA）ならびに、エンドウマメレクチン（PSA）について評価した結果を下記表２及び表３に併せて示した。

また、表２には示さなかったが、ガラクトース、フコース、Ｌ−フコース、アラビノース、Ｌ−アラビノース、リボース、ラフィノース、Ｌ−ラムノース、サッカロース、ラクトース、ラクチトール、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルラクトサミン、メチルβ−グルコシド、メチルα−ガラクシド、メチルβ−ガラクシド、メリビオース、キシロース、ガラクロン酸、グルクトサミン塩酸塩、ガラクトサミン塩酸塩、マンノサミン塩酸塩、グルロン酸、２−デオキシリボース、キトビオース、及び、マルトースは、１００ｍＭで赤血球凝集阻害活性を示さなかった。
更に、Ｎ−アセチルノイラミン酸、Ｎ−グリコリルノイラミン酸は、４０ｍＭで赤血球凝集阻害活性を示さなかった。

また、表３には示さなかったが、α_１−酸性糖タンパク質、トランスフェリン、ヒアルロン酸、及びウシアルブミンは、１ｍｇ／ｍｌで赤血球凝集阻害活性を示さなかった。

上記の結果から、実施例１で得られたレクチン（ＨＲＬ）は、Ｇｌｃα１→６Ｇｌｃ、及び、Ｍａｎα１→６Ｍａｎに特異的に結合することが分かる。

［マイトジェン活性］
Ｆ３４４ラット（オス、８週齢）を用いて、常法により脾臓リンパ球を調製した。培地としてＲＰＭＩ１６４０（１０％ＦＣＳ、グルタミン、２−メルカプトエタノール、ペニシリン／ストレプトマイシン、アンホテリシンＢを添加）を用い、細胞数が１ウェル当たり１×１０^６個となるようにした脾臓リンパ球の培養液に、終濃度が０μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、４μｇ／ｍｌ、８μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌとなるように、ＨＲＬをそれぞれ添加した。５％二酸化炭素雰囲気下で３７℃、３８時間培養した。培養上清を回収し、培養上清中のサイトカイン（ＩＬ−６及びＩＦＮ−γ）の含有量をＥＬＩＳＡ法にて測定した。また、ＨＲＬの代わりにＣｏｎＡを４μｇ／ｍｌ用い、同様にして培養上清中のサトカイン量を測定した。結果を図４及び図５に示した。

図４及び図５から、ＨＲＬはＩＦＮ−γとＩＬ−６の産生誘導活性を有することが分かる。ＩＦＮ−γ産生は、ＨＲＬ濃度に依存して誘導されることから、ＨＲＬはマイトジェン活性を有していることが分かる。また、ＣｏｎＡとは異なり、ＨＲＬはＩＬ−６の産生を著しく向上させることが明らかとなった。

（実施例２）
実施例１において、サクラシメジの代わりにヒメサクラシメジ（Hygrophorus capreolarius）を用いた以外は実施例１と同様にしてヌメリガサ属担子菌に由来するレクチン（ＨＣＬ）を１ｍｇ得た。
ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動の結果を図１に示した。図１からＨＣＬの分子量は１５，０００〜２０，０００であることが分かる。

[Ｎ−末端領域のアミノ酸配列］
ＨＣＬのＮ−末端領域のアミノ酸配列を、実施例１と同様にして解析したところ、下記アミノ酸配列（配列番号４）であることが分かった。
Thr-Ile-Gly-X-Ala-Lys-Pro-Val-Leu-Val-Gln-Asn-Val-Leu-Leu-Gly-Gly-Pro-Ala-Val-
尚、ＸはＮ−末端アミノ酸分析では、決定できなかったことより、Cysであることが予想される。

［赤血球凝集活性］
ＨＲＬの代わりにＨＣＬを用いた以外は実施例１と同様にして、ウサギ、ヒツジ及びヒト赤血球凝集活性を測定した。結果を表１に示した。
上記の結果から、ＨＣＬはウサギ及びヒツジの赤血球凝集活性を示すことが分かる。

［糖結合特異性］
ＨＲＬの代わりにＨＣＬを用いた以外は実施例１と同様にして、ＨＣＬの糖結合特異性を評価した。結果を表２及び表３に示した。
上記の結果から、ＨＣＬは、Ｇｌｃα１→６Ｇｌｃ、及び、Ｍａｎα１→６Ｍａｎに特異的に結合することが分かる。

（実施例３）
実施例１において、サクラシメジの代わりにサクラシメジモドキ（Hygrophorus purpurascens）を用いた以外は実施例１と同様にしてヌメリガサ属担子菌に由来するレクチン（ＨＰＬ）を各1ｍｇ得た。
ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動の結果を図１に示した。図１からＨＰＬの分子量は１５，０００〜２０，０００であることが分かる。

[Ｎ−末端領域のアミノ酸配列］
ＨＰＬのＮ−末端領域のアミノ酸配列を実施例１と同様にして解析したところ、下記アミノ酸配列（配列番号５）であることが分かった。
Thr-Ile-Gly-X-Ala-Lys-Pro-Val-Leu-Val-Gln-Asn-Val-Leu-Leu-Gly-Gly-Pro-Ala-Val-
尚、ＸはＮ−末端アミノ酸分析では、決定できなかったことより、Cysであることが予想される。

［赤血球凝集活性］
ＨＲＬの代わりにＨＰＬを用いた以外は実施例１と同様にして、ウサギ、ヒツジ及びヒト赤血球凝集活性を測定した。結果を表１に示した。
上記の結果から、ＨＰＬはウサギ及びヒツジの赤血球凝集活性を示すことが分かる。

［糖結合特異性］
ＨＲＬの代わりにＨＰＬを用いた以外は実施例１と同様にして、ＨＰＬの糖結合特異性を評価した。結果を表２及び表３に示した。
上記の結果から、ＨＰＬは、Ｇｌｃα１→６Ｇｌｃ、及び、Ｍａｎα１→６Ｍａｎに特異的に結合することが分かる。

以上より、本発明のヌメリガサ属担子菌に由来するレクチンは、ＳＤＳ電気泳動法による分子量が１０，０００〜３０，０００であって、Ｎ−末端領域のアミノ酸配列が、Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−であって、Ｇｌｃα１→６Ｇｌｃ、及び、Ｍａｎα１→６Ｍａｎに結合することが分かる。

ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量測定の結果を示す図である。 ＨＲＬの温度安定性を示す図である。 ＨＲＬのｐＨ安定性を示す図である。 ＨＲＬのＩＦＮ−γ誘導活性を示す図である。 ＨＲＬのＩＬ−６誘導活性を示す図である。

Claims (10)

1. 以下の特徴を有するヌメリガサ属（Hygrophorus）担子菌に由来するレクチン：
   （１）ＳＤＳ電気泳動法による分子量が、１０，０００〜３０，０００であり、
   （２）Ｎ−末端領域のアミノ酸配列が、Thr-Ile-Gly-であり、
   （３）Ｇｌｃα１→６Ｇｌｃ、及び、Ｍａｎα１→６Ｍａｎに結合する。
2. 前記Ｎ−末端領域のアミノ酸配列は、Thr-Ile-Gly-X-Ala-Lys-Pro-である請求項１に記載のレクチン。
3. 前記ヌメリガサ属担子菌が、サクラシメジ、ヒメサクラシメジ、サクラシメジモドキからなる群より選択された少なくとも１種である請求項１又は請求項２に記載のレクチン。
4. ヌメリガサ属担子菌の水系媒体抽出物を、グルコース残基及び／又はマンノース残基を有する糖類を含有する溶出液と、グルコース残基及び／又はマンノース残基を含有する担体とを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより精製することにより得られる請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載のレクチン。
5. 請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載のレクチンの製造方法であって、ヌメリガサ属担子菌の子実体から水系媒体抽出物を得る抽出工程と、前記水系媒体抽出物を、グルコース残基及び／又はマンノース残基を有する糖類を含有する溶出液と、グルコース残基及び／又はマンノース残基を含有する担体を含有する担体とを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより精製する精製工程と、を有するレクチンの製造方法。
6. 前記ヌメリガサ属担子菌が、サクラシメジ、ヒメサクラシメジ、サクラシメジモドキからなる群より選択された少なくとも１種である請求項５に記載のレクチンの製造方法。
7. 請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載のレクチンと、標識手段とを含む標識レクチン。
8. 請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載のレクチン又は請求項7に記載の標識レクチンを用いて、Ｇｌｃα１→６Ｇｌｃ及び／又はＭａｎα１→６Ｍａｎを含む糖鎖を検出する工程を含む糖鎖検出方法。
9. 請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載のレクチンと、支持担体とを含むレクチン固定化担体。
10. 請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載のレクチン又は請求項９に記載のレクチン固定化担体を用いて、Ｇｌｃα１→６Ｇｌｃ及び／又はＭａｎα１→６Ｍａｎを含む糖鎖を分別する工程を含む糖鎖分別方法。