JPH06321992A

JPH06321992A - Ｃｅａ誘導体

Info

Publication number: JPH06321992A
Application number: JP6053936A
Authority: JP
Inventors: Alexey Terskikh; テルスキクアレクセイ; Andre Pelegrin; ペルグランアンドレ; Jean-Pierre Mach; − ピエールマシュジャン
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1993-03-25
Filing date: 1994-03-24
Publication date: 1994-11-22
Also published as: EP0618292A1; CA2116640A1; US5672513A

Abstract

(57)【要約】【目的】本発明は、診断の分野で有用な組換えＣＥＡ
糖蛋白質誘導体、それをコードするＤＮＡおよびそれら
の製造方法を提供することを目的とする。【構成】本発明による組換えＣＥＡ糖蛋白質誘導体
は、交差反応性ＣＥＡ様抗原類を含まない；腫瘍細胞か
ら脱離するＣＥＡの可溶性形態とは抗原的に区別されな
い；およびエタノールアミン欠損において多量に分泌さ
れる等を特徴とする組換えＣＥＡ糖蛋白質誘導体に関す
るものである。例示的には、本発明による組換えＣＥＡ
糖蛋白質誘導体は、アミノ酸配列［ＳＥＱＩＤＮ
Ｏ：１］有している。また本発明の組換えＣＥＡ糖蛋白
質誘導体をコードするＤＮＡは、例示的にはヌクレオチ
ド配列［ＳＥＱＩＤＮＯ：２］により表される。【効果】本発明の組換えＣＥＡ糖蛋白質誘導体は、例
えばテストキット等に組み込まれ、新生物性疾患等の診
断において有用な試薬が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、ガン胎児性抗原（ＣＥＡ）の誘
導体に関するものである。

【０００２】ガン胎児性抗原（ＣＥＡ）は、最もよく研
究されているヒト腫瘍マーカーの一つであり、直腸結腸
癌等の新生物性疾患の診断において広く使用されてい
る。従って、例えばＣＥＡの血清濃度が患者において上
昇した場合、外科的治療後のＣＥＡ濃度の低下は、腫瘍
の切除の成功を意味している。他方において、外科的治
療後の血清ＣＥＡ濃度の引き続く上昇は、元の腫瘍の転
移が形成されたか、あるいは、新たな一次腫瘍が成長し
ていることを意味する。概説としてＳｈｉｖｅｌｙ
Ｊ．Ｅ．およびＢｅａｔｔｙＪ．Ｄ．の“ＣＥＡ−関
連抗原：分子生物学および臨床的意味”、Ｃｒｉｔ．Ｒ
ｅｖ．Ｏｎｃｏｌ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２，３５５−３９
９［１９８５］；ならびにＭａｃｈＪ．Ｐ．、Ｐｅｌ
ｅｇｒｉｎＡ．およびＢｕｃｈｅｇｇｅｒＦ．の“非
造血性腫瘍におけるモノクローナル抗体による造影およ
び治療”Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３，６
８５−６９３［１９９１］参照。

【０００３】ＣＥＡ蛋白質をコードする完全ｃＤＮＡ配
列は、３４アミノ酸残基長の先行ペプチド、１０８アミ
ノ酸残基長のＮＨ2 −末端領域、１７８アミノ酸残基の
３個の同種的反復領域、および２６アミノ酸残基の疎水
性Ｃ−末端領域からなる７０２アミノ酸残基のポリペプ
チドをコードしている（ＺｉｍｍｅｒｍａｎｎＷ．，
ＯｒｔｌｉｅｂＢ．，ＦｒｉｅｄｒｉｃｈＲ．およ
びｖｏｎＫｌｅｉｓｔＳ．“ヒトガン胎児性抗原を
コードするｃＤＮＡクローンの単離および特徴付けは、
高度に保存的な反復構造を明らかにする”、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４，２９６０
−２９６４［１９８７］；Ｂｅａｕｃｈｅｍｉｎ
Ｎ．，ＢｅｎｃｈｉｍｏｌＳ．，Ｃｏｕｒｎｏｙｅｒ
Ｄ．，ＦｕｋｓＡ．およびＳｔａｎｎｅｒｓＣ．
Ｐ．“ヒトガン胎児性抗原の完全長機能的ｃＤＮＡクロ
ーンの単離および特徴付け”，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉ
ｏｌ．７，３２２１−３２３０［１９８７］；Ｏｉｋａ
ｗａＳ．，ＫｏｓａｋｉＧ．およびＮａｋａｚａｔ
ｏＨ．，“ガン胎児性抗原（ＣＥＡ）遺伝子ファミリ
ーの一員についての遺伝子のモレキュラークローニン
グ；非特異的交差反応抗原（ＮＣＡ）のシグナルペプチ
ドおよびＮ−末端領域配列”，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１４６，４６４−４
６９［１９８７］）。３４アミノ酸残基長の先行ペプチ
ドは、内質小網膜を通過する移送過程にて前駆体ＣＥＡ
ポリペプチドから切断される。

【０００４】疎水性Ｃ−末端領域も、成熟膜結合ＣＥＡ
糖蛋白質においては欠失されている。ＣＥＡは、エタノ
ールアミンを介して成熟ＣＥＡのＣＯＯＨ−末端残基に
共有的に結合するホスファチジルイノシトール−グリカ
ンテイル（ＰＩ−Ｇ）によって膜に結合することが示さ
れた（ＨｅｆｔａＳ．Ａ．，ＨｅｆｔａＬ．Ｊ．，
ＬｅｅＴ．Ｄ．，ＰａｘｔｏｎＲ．Ｊ．およびＳｈ
ｉｖｅｌｙＪ．Ｅ．，“ガン胎児性抗原はグリコシル
ホスファチジルイノシトール残基への共有結合により膜
に固定されている；エタノールアミン連結部位の同
定”，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８５，４６４８−４６５２［１９８８］）。ＣＥＡ
は、翻訳後に疎水性Ｃ−末端領域が除去され、次いで第
３の反復領域の最後のアミノ酸にＰＩ−Ｇアンカーが付
加される処理を受けるものと一般に考えられている。該
ＰＩ−Ｇ尾部は、ホスファチジルイノシトール−特異的
ホスフォリパーゼＣによって切断され得、ＣＥＡの膜結
合形態が放出される。このように形成されるＣＥＡの可
溶性形態は、ＣＥＡの成熟形態に存在する最後のアミノ
酸配列のカルボキシ末端（即ち、第３の反復領域の最後
のアミノ酸のカルボキシ末端）に結合するエタノールア
ミン残基を常に含み、また、多分ホスファチジルイノシ
トールグリカン尾部を含む。

【０００５】ＰＩ−Ｇ固定化蛋白質のＣＯＯＨ−末端領
域が、細胞表面に対する目標付けおよび固定化のために
重要であることが示唆されている（ＣａｒａｓＩ．
Ｗ．，ＷｅｄｄｅｌｌＧ．Ｎ．，ＤａｖｉｔｚＭ．
Ａ．，ＮｕｓｓｅｎｚｗｅｉｇＶ．およびＭａｒｔｉｎ
Ｄ．Ｗ．Ｊｒ．“崩壊加速因子におけるリン脂質膜ア
ンカーの結合のためのシグナル”，Ｓｃｉｅｎｃｅ２
３８，１２８０−１２８３［１９８７］；Ｈｅｆｔａ
Ｌ．Ｊ．，ＳｃｈｒｅｗｅＨ．，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ
Ｊ．Ａ．，ＯｉｋａｗａＳ．，Ｎａｋａｚａｔｏ
Ｈ．およびＳｈｉｖｅｌｙＪ．Ｅ．，“モルモット卵
巣およびマウス線維芽細胞におけるガン胎児性抗原およ
び非特異的交差反応性抗原の相補的ＤＮＡおよびゲノム
クローンの発現、ならびに膜発現生成物の特徴付け”，
ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５０，２３９７−２４０３［１
９９０］；ＨｅｍｐｅｒｌｙＪ．Ｊ．，Ｅｄｅｌｍａ
ｎＧ．Ｍ．およびＣｕｎｎｉｎｇｈａｍＢ．Ａ．，
“膜展開領域を欠く神経細胞粘着分子（Ｎ−ＣＡＮ）の
ｃＤＮＡクローンはホスファチジルイノシトール中間体
を介した膜結合の証拠と一致する”，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８３，９８２２−９８
２６［１９８６］）。疎水性領域の完全または部分的削
除は、媒質中への変異蛋白質の分泌を生じうる（Ｕｄｅ
ｎｆｒｉｅｎｄＳ．，ＭｉｃａｎｏｖｉｃＲ．および
ＫｏｄｕｋｕｌａＫ．“ＰＩ−Ｇ固定化形態生成のた
めの発生期蛋白質の構造的要求：完全細胞および細胞非
含有系における研究”ＣｅｌｌＢｉｏｌ．Ｉｎｔ．Ｒ
ｅｐ．１５，７３９−７５９［１９９１］）。

【０００６】現在使用されている標準ＣＥＡ対照は、ヒ
ト腫瘍抽出物から一般に単離されている。このＣＥＡ
は、ＰＩ−Ｇアンカーの切断により、腫瘍の細胞表面か
ら脱落されるものと考えられている（Ｋｕｒｏｋｉ
Ｍ．，ＭｕｒａｋａｍｉＭ．，Ｗａｋｉｓａｋａ
Ｍ．，ＩｋｅｄａＳ．，ＯｉｋａｗａＳ．，Ｏｓｈ
ｉｍａＴ．，ＮａｋａｚａｔｏＨ．，Ｋｏｓａｋｉ
Ｇ．およびＭａｔｓｕｏｋａＹ．“Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａｃｏｌｉにおいて発現される組換えガン胎児性抗
原蛋白質の免疫反応性”，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｎｖｅｓ
ｔ．２１，２４１−２５７［１９９２］）。ヒト腫瘍抽
出物から単離されるＣＥＡの不利な点は、それが、腫瘍
により放出されるＣＥＡのイムノアッセイを妨害するで
あろう交差反応性のＣＥＡ様抗原を含みうることであ
る。これらのＣＥＡ様抗原は、炎症性肝疾患および喫煙
者等の多くの非腫瘍性条件下において上昇することが知
られている。干渉性のＣＥＡ様抗原により生じる問題を
克服する努力は、ＣＥＡをコードするＤＮＡのクローニ
ングを導いた。ＥＰ−Ａ−２６３，９３３には、ＣＥＡ
ペプチド配列をコードする種々の核酸配列が開示されて
いる。

【０００７】細菌内にてＣＥＡ分子の異なる領域を発現
する努力は、細菌内で発現されるＣＥＡ領域が、多分不
完全な巻き込みのために低い抗原性を有することを示し
た（ＫｕｒｏｋｉＭ．，ＭｕｒａｋａｍｉＭ．，Ｗ
ａｋｉｓａｋａＭ．，ＫｒｏｐＷａｔｏｒｅｋ
Ａ．，ＯｉｋａｗａＳ．，ＮａｋａｚａｔｏＨ．，
ＫｏｓａｋｉＧ．およびＭａｔｓｕｏｋａＹ．，
“悪性腫瘍患者の血漿中のガン胎児性抗原上に保持され
るが健常人の血漿中のそれには無いエピトープ”，Ｊｐ
ｎ．Ｊ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．８３，５０５−５１４
［１９９２］）。

【０００８】ヒト腫瘍抽出物の代替物として、ヒトガン
細胞系の培養培地からＣＥＡを単離する事が提案され
た。しかしながら、ＣＥＡの完全成熟形態は、活性を持
って分泌されず、結腸癌細胞系の培養培地中に少量が離
脱することが見いだされた（下記参照）。低濃度の発現
の問題を克服するための一つの解決法は、ＣＥＡの断片
を調製することである。しかしながら、断片は当然に、
Ｈａｍｍａｒｓｔｏｒｍ等により記述されているＧＯＬ
Ｄ１−５として一般に知られているエピトープ等のＣＥ
Ａに存在する重要なエピトープを常にすべて含むもので
はない（ＨａｍｍａｒｓｔｏｒｍＳ．，Ｓｈｉｖｅｌ
ｙＪ．Ｅ．，ＰａｘｔｏｎＲ．Ｊ．，Ｂｅａｔｔｙ
Ｂ．Ｇ．，ＬａｒｓｏｎＡ．，ＧｈｏｓｈＲ．，
ＢｏｒｍｅｒＯ．，ＢｕｃｈｅｇｇｅｒＦ．，Ｍａ
ｃｈＪ．Ｐ．，ＢｕｒｔｉｎＰ．，Ｓｅｇｕｉｎ
Ｐ．，ＤａｒｂｏｉｕｒｅｔＢ．，Ｄｅｇｏｒｃｅ
Ｆ．，ＳｅｒｔｏｕｒＪ．，ＪｏｌｕＪ．Ｐ．，Ｆ
ｕｋｓＡ．，ＫａｌｔｈｏｆｆＨ．，Ｓｃｈｍｉｅ
ｇｅｌＷ．，ＡｒｎｄｔＲ．，Ｋｌｏｐｐｅｌ
Ｇ．，ｖｏｎＫｌｅｉｓｔＳ．，Ｇｒｕｎｅｒｔ
Ｆ．，ＳｃｈｗａｒｔｚＫ．，Ｍａｔｓｕｏｋａ
Ｙ．，ＫｕｒｏｉＭ．，ＷａｇｅｎｅｒＣ．，Ｗｅ
ｂｅｒＴ．，ＹａｃｈｉＡ．，ＩｍａｉＫ．，Ｈ
ｉｓｈｉｋａｗａＮ．およびＴｓｕｊｉｓａｋｉＭ．
“ガン胎児性抗原における抗原性部位”，Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ．４９，４８５２−４８５８［１９８９］）。

【０００９】本発明により解決されるべき問題は、従っ
て、交差反応性ＣＥＡ様抗原非含有であって、腫瘍細胞
から脱離するＣＥＡの可溶形態から抗原性的に区別する
ことが出来ず、従ってＣＥＡ蛋白質のすべての重要なエ
ピトープを含む一方、組換え宿主により大量に分泌され
るＣＥＡ誘導体を提供することにある。

【００１０】ここにおいて、２６アミノ酸の疎水性領域
をコードする３’領域を欠くＣＥＡをコードする組換え
ｃＤＮＡが、上述の要求を満たすＣＥＡ誘導体を分泌し
うることが見いだされた。前記ｃＤＮＡをラットまたは
ヒトガン細胞等の適当な宿主細胞にトランスフェクトす
ることにより５０〜１００倍の高濃度の完全に免疫原性
のＣＥＡ糖蛋白質の培養培地中への分泌が得られる。

【００１１】従って、本発明は、（ａ）交差反応性ＣＥＡ様抗原類を含まない；（ｂ）腫瘍細胞から脱離するＣＥＡの可溶性形態とは抗
原的に区別されない；および（ｃ）エタノールアミン欠
損において多量に分泌されるを特徴とする組換えＣＥＡ糖蛋白質誘導体に関するもの
である。

【００１２】前記組換えＣＥＡ糖蛋白質誘導体は、前記
組換えｃＤＮＡによりトランスフェクトされた細胞か
ら、培養培地中に多量に分泌される。

【００１３】“交差反応性ＣＥＡ様抗原を含まない”な
る用語は、本発明の組換えＣＥＡ糖蛋白質誘導体が、前
記組換えＣＥＡ糖蛋白質誘導体をコードするｃＤＮＡを
含む組換えベクターによって形質転換された宿主細胞に
よって分泌されるという事実に関連する。それは腫瘍抽
出物から単離されたものでないため、そのような抽出物
に通常存在する交差反応性ＣＥＡ様抗原を含まない。

【００１４】“腫瘍細胞から脱離するＣＥＡの可溶性形
態とは抗原的に区別されない”なる用語は、組換えＣＥ
Ａ糖蛋白質誘導体がＣＥＡの天然形態と免疫学的に同等
であること、すなわちＣＥＡに存在するすべての主要な
エピトープを含み、特に一般にＧＯＬＤ１−５エピトー
プ（Ｈａｍｍａｒｓｔｏｒｍ等、［１９８９］前出文
献）として知られている５個のすべてのエピトープを含
むことを意味する。

【００１５】“エタノールアミン欠損である”との用語
は、本発明の組換えＣＥＡ糖蛋白質が、エタノールアミ
ン残基、および多分、例えば腫瘍細胞からの脱離後、ま
たはホスファチジルイノシトール特異的ホスフォリパー
ゼによる処理後に、非トランスフェクト腫瘍細胞から得
られるようなＣＥＡの可溶形態に通常存在するホスファ
チジルイノシトール末端部のいくらかの断片を欠損する
ことに関連する。本発明の組換えＣＥＡ糖蛋白質をコー
ドするｃＤＮＡは、ＣＥＡポリペプチドの前駆体形態に
おいて存在する疎水性Ｃ−末端部をコードする配列を欠
損するため、このｃＤＮＡから発現されるポリペプチド
は、細胞膜に固定化され得ない。全く驚くべきことに、
ＣＥＡ糖蛋白質の疎水性領域の欠失は、ヒトまたはラッ
ト癌細胞において細胞表面へのＣＥＡの輸送になんら影
響を与えず、単に細胞表面への固定化を阻害するのみで
あることが見いだされた。

【００１６】本発明の好ましい組換えＣＥＡ糖蛋白質誘
導体は、下記のアミノ酸配列を有する：

【００１７】

【化１】［ＳＥＱＩＤＮＯ：１］

【００１８】また本発明は、前記ＣＥＡ糖蛋白質の生物
学的および免疫学的性質を本質的に変更しない削除、挿
入または置換によって上記アミノ酸配列に関連するアミ
ノ酸配列を有する機能的に同等な組換えＣＥＡ糖蛋白質
誘導体に関するものである。

【００１９】蛋白質の免疫学的性質を実質的に変化させ
ないアミノ酸の置換の例は、例えば、Ｎｅｕｒａｔｈ等
の“ＴｈｅＰｒｏｔｅｉｎｓ”，Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９７９）、特にその
１４頁Ｆｉｇ．６に記述されている。もっとも頻繁に観
察されるアミノ酸の置換は、Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／
Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇ
ｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａ
ｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｙｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒ
ｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌ
ｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ
およびそれらの逆である。

【００２０】本発明の組換えＣＥＡ糖蛋白質は、この分
野で公知の、例えば色素、放射能、酵素、蛍光または化
学発光等の標識一つにより標識されてもよい。好ましい
標識は、放射性標識化ヨウ素（¹²⁵Ｉ）である。

【００２１】本発明の組換えＣＥＡ糖蛋白質は、例えば
体液試料等の生物学的試料中のＣＥＡを検出するための
イムノアッセイにおける標準として使用されうる。当業
者は、免疫診断の分野における一般的知識に基づいてそ
のようなイムノアッセイを配置できる立場にある。酵素
結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）の使用が好ましい。
そのようなイムノアッセイの例は、例えばＥＰ−Ａ−３
４６，７１０に記載されている。本発明の組換えＣＥＡ
糖蛋白質誘導体の標識のために使用される酵素の例は、
アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、西洋
わさびパーオキシダーゼ、グルコース−６−リン酸デヒ
ドロゲナーゼ、３−ホスフォグリセレートキナーゼ（Ｐ
ＧＫ）糖を含む。

【００２２】また、本発明は、新生物性疾患の診断のた
めのイムノアッセイに関し、このイムノアッセイにおい
て、本発明の組換えＣＥＡ糖蛋白質誘導体が、好ましく
は試薬の形態の標準として使用され、ここにおいて前記
組換えＣＥＡ糖蛋白質は不活性担体物質と混合される。
そのような不活性担体物質の例は、蒸留水、安定剤を含
んでもよい緩衝剤、および診断用試薬において一般に使
用される他の添加物である。

【００２３】本発明は、そのような試薬の調製方法およ
び試薬それ自体、ならびに生物学的試料中の癌細胞の存
在を測定するためのテストキットに関するものである。
このようなテストキットは、容器内に本発明による組換
えＣＥＡ糖蛋白質誘導体を、必要に応じて不活性担体、
および必要に応じてモノクローナル抗体またはポリクロ
ーナル抗体等の付加的試薬との組み合わせにおいて含
む。

【００２４】本発明の組換えＣＥＡ糖蛋白質誘導体は、
好ましくは、Ｃ−末端疎水性末端部をコードする領域を
欠くｃＤＮＡ断片によってコードされる。このようなｃ
ＤＮＡ断片を得るための一方法は、ＣＥＡの完全形態を
コードするｃＤＮＡを、本発明の組換えＣＥＡ糖蛋白質
で欠損する疎水性末端部をコードする領域からすぐ上流
側で切断するための適当な制限エンドヌクレアーゼを使
用することである。次いで、該ｃＤＮＡ断片の３’末端
は、制限エンドヌクレアーゼにより不注意に切断された
付加的ヌクレオチドをコードする合成オリゴヌクレオチ
ド二重鎖にて修復される。好ましくは前記合成オリゴヌ
クレオチド二重鎖は、アミノ酸配列［ＳＥＱＩＤＮ
Ｏ：１］の最後のアミノ酸残基の後で翻訳を停止させる
停止コドンを含む。制限エンドヌクレアーゼＥａｅＩ
は、前記ｃＤＮＡ断片の調製のためにもっとも好適な酵
素である。残念ながら、この制限エンドヌクレアーゼ
は、ＣＥＡをコードするｃＤＮＡを１以上の部位で切断
する。この問題を克服するために、ＣＥＡｃＤＮＡの
３’末端を含む８００塩基対断片をＢｓｕ３６Ｉおよび
ＸｂａＩを用いて消化し、次いでこうして得られた断片
を別個にＥａｅＩを用いて切断することにより単離する
ことが出来る。

【００２５】従って、本発明は下記のヌクレオチド配列
を有するＤＮＡ等の本発明のＣＥＡ糖蛋白質誘導体をコ
ードするＤＮＡをも提供するものである。

【００２６】

【化２】

【化３】［ＳＥＱＩＤＮＯ：２］

【００２７】上記ＤＮＡ配列は、ＣＥＡをコードする遺
伝子の天然形態において存在する３４アミノ酸残基長の
シグナルペプチドをコードするコドンをも含み、このシ
グナルペプチド配列は、ＣＥＡ蛋白質の成熟化の過程で
切断されるものと理解される。他方において、前記ＤＮ
Ａ配列は、ＣＥＡをコードする遺伝子の天然形態に存在
するＣ−末端疎水性領域をコードするコドンを明らかに
含まない。

【００２８】上記に示したように、配列［ＳＥＱＩＤ
ＮＯ：２］を有するＤＮＡは、ＣＥＡの完全長形態を
コードするｃＤＮＡから組換えＤＮＡ技術の方法を使用
して調製されうる。そのようなＤＮＡ配列は、化学合成
および／または適切なＤＮＡ断片を配列［ＳＥＱＩＤ
ＮＯ：２］を有する完全ＤＮＡが得られるように結合
することによっても調製されうる。

【００２９】遺伝子コードの縮重のために、アミノ酸配
列［ＳＥＱＩＤＮＯ：１］を有する組換えＣＥＡ糖
蛋白質誘導体をコードし得る多くの可能性あるヌクレオ
チド配列（機能的同等物）が存在することが理解される
であろう。従って、本発明は、［ＳＥＱＩＤＮＯ：
２］の機能的に同等な配列にも関するものであり、その
ヌクレオチド配列は、上記に引用したように機能的に同
等なＣＥＡ糖蛋白質誘導体をコードする。このような機
能的に同等なヌクレオチド配列は、Ｍｏｒｉｎａｇａ
Ｙ．，ＦｒａｎｃｅｓｃｈｉｎｉＴ．，Ｉｎｏｕｙｅ
Ｓ．およびＩｎｏｕｙｅＭ．，“二重鎖プラスミド
ＤＮＡを使用するオリゴヌクレオチド−指向部位特異的
変異生成の改良”，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，
２，６３６−６３９［１９８４］に記述されるように、
本発明の例示的ｃＤＮＡ［ＳＥＱＩＤＮＯ：２］上で
のプライマー指向性部位特異的変異生成において適切な
合成オリゴヌクレオチドを使用して容易に調製されるで
あろう。

【００３０】さらに、本発明は、適合する宿主細胞内に
おいて組換えＣＥＡ糖蛋白質誘導体をコードするＤＮＡ
含み、かつその発現を支配しうる組換えベクター、およ
びこのようなベクターを含む宿主細胞を提供するもので
ある。組換えベクター中に挿入されるべき本発明のヌク
レオチド配列は、組換えベクターが適切な宿主細胞内に
おいて本発明に従って組換えＣＥＡ糖蛋白質誘導体の産
生を支配しうる限り、付加的なヌクレオチドまたは断片
を含んでいてもよく、この付加的ヌクレオチドは、本発
明の組換えＣＥＡ糖蛋白質誘導体をコードする実際の構
造遺伝子の一部ではないものと理解される。

【００３１】本発明による組換えＣＥＡ糖蛋白質誘導体
をコードするＤＮＡの、クローニングベクターへの挿入
は、該ＤＮＡおよび所望のクローニングベクターの両者
が同様な制限酵素により切断された場合には、相補的Ｄ
ＮＡ末端が生成されるため、容易に行うことが出来る。
これを行うことが出来ない場合には、単鎖ＤＮＡを消化
して平滑末端を生じさせるか、または単鎖末端を適当な
ＤＮＡポリメラーゼにて埋めることにより同様な結果を
生じさせて、切断末端を修飾することが必要であろう。
このような方法でＴ４ＤＮＡリガーゼ等の酵素を用い
て平滑末端の連結が行われる。別法として、所望の任意
の部位がヌクレオチド配列（リンカー）をＤＮＡ端部に
連結することによって生成されうる。このようなリンカ
ーは、制限部位認識配列をコードする特定のオリゴヌク
レオチド配列を含んでよい。切断されたベクターおよび
本発明の組換えＣＥＡ糖蛋白質誘導体をコードするＤＮ
Ａは、ホモポリマーテイリングによって修飾されてもよ
い（ＭｏｒｒｏｗＪ．Ｆ．“組換えＤＮＡ技術”，Ｍ
ｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６８，３
−２４［１９７９］参照）。

【００３２】当業者に既知の多くのクローニングベクタ
ーを、本発明に従って組換えベクターを調製するために
使用することが出来る。そのようなクローニングベクタ
ーは、所望の形質転換体を選択するために使用されうる
一つ以上のマーカー活性を含む。そのようなマーカー活
性の例は、例えば、ネオマイシン耐性（下記参照）、ゲ
ネチシン耐性、およびメトトレキセート耐性である。

【００３３】本発明の組換えＣＥＡ糖蛋白質誘導体をコ
ードするＤＮＡを、クローニングベクター中に挿入する
ための多くの方法があることが理解されなければならな
い。この点に関して本質的なことは、組換えベクターが
適切な宿主細胞内において組換えＣＥＡ糖蛋白質誘導体
の発現を支配しうることである。

【００３４】本発明の組換えＣＥＡ糖蛋白質誘導体をコ
ードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡを含む組換え
ベクターは：（ａ）組換えＣＥＡ糖蛋白質誘導体をコードするヌクレ
オチド配列を有するＤＮＡをベクター中に挿入し；（ｂ）前記ベクターを宿主細胞内にて複製し；および（ｃ）該宿主細胞から組換えベクターを単離すること、によって調製されうる。

【００３５】適当な宿主の選択は、この技術において知
られている多くの因子によって影響を受ける。これらの
因子は、例えば選択したベクターとの適合性、組換えベ
クターによりコードされる蛋白質の毒性、所望の蛋白質
の分泌可能性、所望のＣＥＡ糖蛋白質の回収の容易性、
発現の特性、生物学的安全性および費用等を含む。これ
らの因子の釣合を考慮しなければならず、また、すべて
の宿主が特定の組換えＤＮＡ分子の発現に対して等しく
有効であるのではないことを理解しなければならない。
本発明の組換えＣＥＡ糖蛋白質の産生のために好適な宿
主細胞は、ＣＥＡ−ネガティブな細胞である。そのよう
な細胞の例は、例えば、Ｍａｃｈ等に記述されているヒ
ト結腸癌細胞系ＣＯ１１５由来のサブクローンＣＯ１１
５- （ＭａｃｈＪ．Ｐ．，ＣａｒｒｅｌＳ．，Ｍｅｒ
ｅｎｄａＣ．，ＳｏｒｄａｔＢ．およびＣｅｒｏｔｔ
ｉｎｉＪ．Ｃ．“ヌードマウスへのヒト結腸癌の移植
片におけるインビボでのガン胎児性抗原への放射標識抗
体の局在化”，Ｎａｔｕｒｅ２４８，７０４−７０６
［１９７４］；ならびにＣａｒｒｅｌＳ．，Ｓｏｒｄ
ａｔＢ．およびＭｅｒｅｎｄａＣ．“ヌードマウス
に移植されたヒト結腸癌由来の細胞系（Ｃｏ−１１５）
の樹立”Ｃａｎｃｅｒ３６，３９７８−３９８４［１
９７６］参照）、およびＣａｉｇｎａｒｄ等によって記
述されているラット結腸癌細胞系ＰＲＯｂ（Ｃａｉｇｎ
ａｒｄＡ．，ＭａｒｔｉｎＭ．Ｓ．，Ｍｉｃｈｅｌ
Ｍ．Ｆ．およびＭａｒｔｉｎＦ．“同系宿主に接種
された場合のラット結腸癌の２種の細胞準母集団の間の
相互作用”，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ３６，２７３
−２７９［１９８５］）等のヒトまたはラット結腸癌細
胞系である。前記サブクローンＣＯ１１５- は、直接に
蛍光標識された抗ＣＥＡモノクローナル抗体のパネルを
使用する蛍光活性化細胞選択法によって、細胞表面にＣ
ＥＡおよびＣＥＡ交差反応性抗原を発現しないことが示
された。また、酵素結合免疫吸着剤アッセイによって、
トランスフェクトされないＣＯ１１５-サブクローン由
来の培養培地中には、アッセイに干渉し得るＣＥＡまた
はＣＥＡ交差反応性抗原が含有されないことが示され
た。

【００３６】外来ＤＮＡ断片を細胞に導入するための種
々の方法が当業者に知られている。そのような方法の例
は、マイクロインジェクション、エレクトロポレーショ
ン、トランスフェクションおよびウイルスベクターを用
いる感染である。本発明の組換えＣＥＡ糖蛋白質誘導体
をコードする組換えｃＤＮＡを細胞に導入するための好
ましい方法は、周知のカルシウムホスフェート法である
（ＧｒａｈａｍＦ．Ｌ．およびＶａｎｄｅｒＥｂ
Ａ．Ｊ．“ヒトアデノウイルス５ＤＮＡの感染力ア
ッセイのための新技術”Ｖｉｒｏｌｏｇｙ５４，４５
６−４６７［１９７３］に最初に記述された）。ゲネチ
シン耐性トランスフェクタントは、抗ＣＥＡ抗体を用い
るＥＬＩＳＡによって、上澄中のＣＥＡ分泌について選
択されうる。一旦形質転換宿主細胞が生成されると、該
細胞母集団は、必要な栄養素を含む培養培地中で該細胞
母集団の生育に適当な条件下で、および／または組換え
ＤＮＡの高分泌に適当な条件下で増幅され、本発明の組
換えＣＥＡ糖蛋白質誘導体の大量の産生を導く。

【００３７】分泌された本発明の組換えＣＥＡ糖蛋白質
誘導体は、細胞培養培地中に分泌され、これから第１に
は低速遠心分離により細胞および細胞残渣が除去され
る。こうして得られた本発明の組換えＣＥＡ糖蛋白質誘
導体は、次いで限外濾過によって濃縮される。上澄みか
らの組換えＣＥＡ糖蛋白質誘導体の最初の分離は、硫酸
ナトリウムまたはアンモニウム等の塩を用いる沈殿、限
外濾過、または当業者に周知の他の方法によって行われ
うる。更なる精製は、限定されるものではないが、ゲル
濾過、イオン交換クロマトグラフィ、調製用ディスクゲ
ルまたは膜電気泳動、等電点電気泳動、低温度有機溶媒
分画または向流分配を含む慣用の蛋白質精製技術により
行われうる。精製は、イムノアフィニティクロマトグラ
フィによっても行われうる。

【００３８】従って、本発明は、上記に定義された組換
えＣＥＡ糖蛋白質誘導体の製造方法をも提供するもので
あって、その方法は：（ａ）ヌクレオチド配列［ＳＥＱＩＤＮＯ：２］ま
たはその同等な配列等の前記組換えＣＥＡ糖蛋白質誘導
体をコードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡを含む
組換えベクターを含む宿主細胞を、該ＤＮＡが発現され
る条件下で培養し；および（ｂ）該培養物から該宿主細
胞によって産生される該組換えＣＥＡ糖蛋白質誘導体を
単離することを含んでなる、組換えＣＥＡ糖蛋白質誘導
体の製造方法である。

【００３９】本発明のＣＥＡ断片をコードする組換えｃ
ＤＮＡの好ましい構築方法は、以下のように要約されう
る：

【００４０】−第１工程において、下記の例に記述され
るようにＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ^TMベクター等の完全長の
ＣＥＡ蛋白質をコードするｃＤＮＡを含む適当なベクタ
ーを、Ｂｓｕ３６Ｉエンドヌクレアーゼを用いて固有の
部位にて消化する。次いで切断ベクターを脱ホスホリル
化し、さらにＸｂａＩエンドヌクレアーゼを用いて固有
の部位にて消化し、０．８および４．６Ｋｂ（１Ｋｂ＝
１０００塩基対）の２個の断片を生成させる。

【００４１】−第２工程において、ベクターＤＮＡおよ
びＣＥＡｃＤＮＡの５’部分を含む４．６Ｋｂ断片
を、ＥａｅＩ部位から下流の第３のＣＥＡ反復部分から
成熟蛋白質において見いだされる最後のアミノ酸のコド
ンまでの終わりの４３塩基対（ｂｐ）を含み、さらにＴ
ＡＧ停止コドンおよびＸｂａＩ粘着末端を含む合成オリ
ゴヌクレオチド二重鎖のＸｂａＩ部位に連結する。

【００４２】−第３の工程は、前述の０．８Ｋｂ断片を
固有のＥａｅＩ部位にて切断することを含む。これはそ
れぞれ約０．４Ｋｂの２個の断片を生じ、一方の断片
は、最終的組換えｃＤＮＡに保持されるべき第３のＣＥ
Ａ反復部位の欠失した部分を含み、他方の断片は除去さ
れるべき疎水性尾部を含む。

【００４３】−第４の工程においては、ベクターが閉環
される。先行する工程において得られた２個の０．４Ｋ
ｂ断片のうち、第３のＣＥＡ反復を含むもののみが、上
記の合成二重鎖に結合される４．６Ｋｂ断片の二重連結
および閉環のために適切な粘着末端、すなわちＢｓｕ３
６ＩおよびＸｂａＩを有する。得られた構築物を例えば
Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ^TMベクター等の適当なベクター中
で増幅することが出来る。該ベクターの正しい構築は、
ＳｔｙＩおよびＥａｅＩエンドヌクレアーゼを使用する
制限分析によって検査されうる。次いで、本発明の組換
えＣＥＡ糖蛋白質誘導体をコードする組換えｃＤＮＡ
は、真核性細胞においてｃＤＮＡを発現するために適切
なベクター中に再クローニングされうる。このようなベ
クターの例は、下記の例において引用される真核性発現
ベクターｐＲｃ／ＣＭＶである。このベクターｐＲｃ／
ＣＭＶは、本質的ＣＭＶプロモーターの制御下で挿入遺
伝子の高水準の安定な発現のために設計されている。該
ベクターは、牛成長ホルモンポリアデニル化シグナルお
よびＳＶ４０初期プロモーターから発現されるネオマイ
シン耐性遺伝子を含んでいる。最終的構築物の正確さ
は、制限分析により証明されうる。本発明の組換えＣＥ
Ａ糖蛋白質誘導体をコードする組換えｃＤＮＡの３’末
端の正確さは、配列決定によって確認されうる。

【００４４】本発明の組換えＣＥＡ糖蛋白質誘導体をコ
ードする組換えｃＤＮＡおよびネオマイシン耐性遺伝子
を含んでなるベクターは、好ましくは、カルシウムホス
フェート法によるトランスフェクションを使用して、ヒ
ト結腸癌細胞系ＣＯ１１５（ＭａｃｈＪ．Ｐ．ら［１
９７４］の前出文献；ＣａｒｒｅｌＳ．等［１９７
６］の前出文献）由来のサブクローンまたはラット結腸
癌細胞系ＰＲＯｂ（ＣａｉｇｎａｒｄＡ．等［１９８
５］の前出文献）由来のサブクローン等のＣＥＡ−ネガ
ティブ細胞に導入される。

【００４５】本発明の組換えＣＥＡ糖蛋白質誘導体をコ
ードする組換えｃＤＮＡの挿入のために使用される宿主
細胞に依存して、形質転換された宿主細胞は、完全長Ｃ
ＥＡ蛋白質をコードするｃＤＮＡによって形質転換され
た宿主細胞よりも約５０−１００倍多くのＣＥＡを脱離
させることが見いだされた。従って、例えば本発明の組
換えＣＥＡ糖蛋白質誘導体をコードする組換えｃＤＮＡ
によって形質転換されたヒト結腸癌細胞系ＣＯ１１５由
来のサブクローンは、約７．７−１３．６マイクログラ
ムＣＥＡ／１０6 細胞／７２時間を分泌することが見い
だされた。同じ条件下において、高水準のＣＥＡ発現性
を有するものとして知られているトランスフェクトされ
ないヒト結腸癌細胞系は、約５０−３００倍少ないＣＥ
Ａを脱離させた。より正確には、細胞系ＣＯ１１２（Ｍ
ａｃｈＪ．Ｐ．ら［１９７４］の前出文献）は、約
０．０４５マイクログラムＣＥＡ／１０6 細胞／７２時
間を脱離させ、また細胞系ＬＳ１７４Ｔ（Ｒｕｔｚｋｙ
Ｌ．Ｐ．，ＫａｙａＣ．Ｉ．，Ｓｉｃｉｌｉａｎｏ
Ｍ．Ｊ．，ＣｈａｏＭ．およびＫａｈａｎＢ．
Ｄ．“培養ヒト結腸腺癌細胞系ＬＳ１８０およびＬＳ１
７４Ｔの縦方向の核型および遺伝的特徴の分析”，Ｃａ
ｎｃｅｒＲｅｓ．４０，１４４３−１４４８［１９８
０］）は、０．１２８マイクログラムＣＥＡ／１０6 細
胞／７２時間を脱離させた。

【００４６】本発明の組換えＣＥＡ糖蛋白質誘導体をコ
ードする組換えｃＤＮＡにてトランスフェクトされたＰ
ＲＯｂラット癌クローンは、０．６１−０．９９マイク
ログラムＣＥＡ／１０6 細胞／７２時間を分泌した。完
全長ＣＥＡ−ｃＤＮＡをトランスフェクトされた同じＰ
ＲＯｂ細胞から選択されたクローンは、最大でも０．０
１５マイクログラムＣＥＡ／１０6 細胞／７２時間を脱
離するのみであった（ＰｅｌｅｇｒｉｎＡ．，Ｔｅｒ
ｓｋｉｋｈＡ．，ＨａｙｏｚＤ．，Ｃｈａｌａｎｄ
ｏｎＹ．，ＯｌｓｓｏｎＮ．Ｏ．，Ｆｏｌｌｉ
Ｓ．，ＢｕｃｈｅｇｇｅｒＦ．，Ｋｒｏｍｅｒ
Ｂ．，ＳｃｈｗａｒｚＫ．，ＭａｒｔｉｎＭ．，Ｍａ
ｒｔｉｎＦ．およびＭａｃｈＪ．Ｐ．“ラット癌細
胞内にて発現されるヒトガン胎児性抗原ｃＤＮＡは、ヌ
ードラットにおける抗体の腫瘍局在化標的抗原として、
および同系ラットにおける拒絶抗原として機能しう
る”，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ５２，１１０−１１
９［１９８２］）。従って、Ｃ−末端領域を欠失するＣ
ＥＡ−ｃＤＮＡによるラット結腸癌ＰＲＯｂのトランス
フェクションは、完全長のＣＥＡ−ｃＤＮＡでトランス
フェクトされた同じ細胞系由来のクローンに比べて５０
倍高いＣＥＡ分泌を生じた。

【００４７】上記の結果は、ヒト細胞およびラット細胞
によって分泌される本発明の組換えＣＥＡ糖蛋白質誘導
体（ｒＣＥＡ）の量の間に差異があることを示してい
る。転写および転写後の制御機構が、結腸癌におけるＣ
ＥＡ遺伝子の発現を制御することが以前提案されている
（ＨａｕｃｋＷ．およびＳｔａｎｎｅｒｓＣ．Ｐ．
“分化する結腸癌細胞系、Ｃａｃｏ−２におけるガン胎
児性抗原遺伝子族の発現制御”ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．
５１，３５２６−３５３３［１９９１］）。トランスフ
ェクションに使用されたＤＮＡ構築物の同等性からみ
て、ｒＣＥＡの低い分泌率は、２つの種間の転写後制御
の差異に起因するのであろう。

【００４８】トランスフェクト細胞により発現されるＣ
ＥＡの大きさは、ウエスタンブロットにより分析されう
る（ＴｏｗｂｉｎＨ．，ＳｔａｅｈｅｌｉｎＴ．お
よびＧｏｒｄｏｎＪ．“ポリアクリルアミドゲルから
ニトロセルロースシートへの蛋白質の電気泳動的移送：
方法およびいくつかの応用”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７６，４３５０−４３５４［１
９７９］）。このような分析は次のように行われる：細
胞培養上澄を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル、好ま
しくは７．５−１５％線形勾配のＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲルにて電気泳動的に分離する。次いでＣＥＡ蛋
白質上の主要なエピトープを認識する抗体を使用して、
イムノブロットが行われる。この目的のために、好まし
くは¹²⁵Ｉ−標識抗−ＣＥＡモノクローナル抗体（ＭＡ
ｂｓ）のプールが使用される。典型的な例のおいて、下
記に例示されるｒＣＥＡｃＤＮＡ−トランスフェクト
ＣＯ１１５ヒト結腸癌は、約２００ｋＤａのｒＣＥＡを
産生した。これは、ヒト結腸癌ＬＳ１７４Ｔにより産生
されるＣＥＡ蛋白質の大きさに対応する。ＰＲＯｂラッ
ト結腸癌にトランスフェクトした場合、同じｒＣＥＡ
ｃＤＮＡは、完全長ＣＥＡｃＤＮＡをＰＲＯｂラット
癌細胞にトランスフェクトした場合と同様に低分子量
（約１４４ｋＤａ）を有するｒＣＥＡを産生する（Ｐｅ
ｌｅｇｒｉｎ等の［１９９２］前出文献］）。

【００４９】本発明の組換えＣＥＡ糖蛋白質誘導体をコ
ードする組換えｃＤＮＡによって形質転換された宿主細
胞により産生される¹²⁵Ｉ−標識精製ｒＣＥＡのエピト
ープ特徴付けは、セファロース^TMに固定化された異なる
抗ＣＥＡＭＡｂに対する前記ｒＣＥＡの結合を試験す
ることによって行われうる。本発明の組換えＣＥＡ糖蛋
白質誘導体をコードする組換えｃＤＮＡにて形質転換さ
れたヒト結腸癌ＣＯ１１５細胞を使用する典型的な実験
において、ＣＥＡ分子の５個の主要なエピトープＬＤ１
〜５（Ｈａｍｍａｒｓｔｒｏｍ等［１９８９］前出文
献）について６５％〜８８％の範囲の結合値が見いださ
れた（下記の例参照）。このような結合値は、ヒト腫瘍
から精製される¹²⁵Ｉ−標識ＣＥＡを用いて得られる結
合値と公的に対比される。

【００５０】従って、本発明は、疎水性Ｃ−末端領域を
コードする領域が除去された組換えＣＥＡｃＤＮＡク
ローンのヒトおよびラット癌細胞へのトランスフェクシ
ョンが、完全に抗原性のｒＣＥＡ分子の培地中への大量
分泌を生じることを示すものである。上述したようにＣ
ＥＡは、通常、ホスファチジルイノシトール−グリカン
（ＰＩ−Ｇ）によって細胞膜に固定化され、ＰＩ−特異
的ホスフォリパーゼによって膜から切断された後にのみ
培養細胞の培地中または癌患者の血清中に脱離するであ
ろう。本発明の組換えＣＥＡ糖蛋白質誘導体は、Ｃ−末
端疎水性尾部を欠失している。従って、ＰＩ−Ｇ固定化
されず、直接に細胞外空間に分泌される。該ＣＥＡ糖蛋
白質の疎水性領域の欠失は、ヒトまたはラット癌におい
て、ＣＥＡの細胞表面に向けての輸送に影響を与えるこ
となく、単に細胞表面への固定化を阻害するのみである
ことが見いだされた。本発明の組換えＣＥＡ糖蛋白質誘
導体は、５個の良く特徴付けられたエピトープＧＯＬＤ
１−５を認識する。

【００５１】ウエスタンブロット分析は、驚くべきこと
にトランスフェクトされたラット結腸癌から分泌された
ｒＣＥＡは、ヒト結腸癌から単離された対照ＣＥＡの分
子量（約２００ｋＤａ）よりも低い分子量（約１４４ｋ
Ｄａ）を有する。このことは、完全長ＣＥＡｃＤＮＡ
でトランスフェクトされたラット結腸癌細胞により産生
されるＣＥＡが、ＰＩ−ＰＬＣによる切断後に同様な低
分子量を有するという観察に一致する（Ｐｅｌｅｇｒｉ
ｎ等［１９９２］前出文献）。完全長ＣＥＡ遺伝子でト
ランスフェクトされた異種細胞において発現された異常
な分子量を有するＣＥＡ分子は、マウスＬ−細胞および
モルモット卵巣細胞において観察された（Ｈｅｆｔａ等
１９９０）。全ヒトＤＮＡによりトランスフェクトされ
たＬ−細胞で同定される分子は、トランスフェクトされ
たハムスター細胞で同定されるもの（１８０ｋＤａ）よ
りも低い分子量（１５０ｋＤａ）を有していた。不完全
なグリコシル化は、完全長ＣＥＡｃＤＮＡまたは切断
ＣＥＡｃＤＮＡのいずれによりトランスフェクトされ
たラット結腸癌細胞により発現されるＣＥＡ分子の低い
分子量について原因となるものと思われる。

【００５２】本発明は、以下の例および図を参照してよ
り容易に理解されるであろう。図の内容は以下の通りで
ある。

【００５３】図１：本発明による例示的組換え切断ＣＥ
ＡｃＤＮＡの構築の模式的概略。ブラックボックス
は、削除される疎水性領域を示す。ホスホリル化末端
は、Ｐにより示されている。

【００５４】図２：異なるクローンおよび対照細胞系に
よるＣＥＡ分泌。ＣＯ１１５は、ヒト結腸癌細胞系のＣ
ＥＡ−ネガティブクローン；２Ｃ２，１Ｄ６，２Ｂ１２
は、切断ＣＥＡ−ｃＤＮＡＣＯ１１５誘導トランスフ
ェクタント；ＣＯ１１２，ＬＳ１７４Ｔは、高ＣＥＡ−
発現ヒト結腸癌細胞系；ＰＲＯｂは、ラット結腸癌細胞
系；１Ｈ５，１Ａ８，１Ｇ７は、切断ＣＥＡ−ｃＤＮＡ
ＰＲＯｂ誘導トランスフェクタント；３Ｇ７／２Ｃ１
１は、完全長ＣＥＡ−ｃＤＮＡＰＲＯｂ誘導トランス
フェクタント（Ｐｅｌｅｇｒｉｎ等［１９９１］前
出）。

【００５５】図３：異なるクローンおよび対照細胞系由
来のＣＥＡのウエスタンブロット分析。細胞培養上澄
は、ＣＥＡ−分泌クローンについて直接に、あるいは、
他の細胞系についてＰＩ−ＰＬＣによる細胞の処理後に
操作された。ＬＳ１７４Ｔは、高ＣＥＡ−発現ヒト結腸
癌細胞系；ＣＯ１１５は、ヒト結腸癌細胞系のＣＥＡ−
ネガティブクローン；２Ｃ２，１Ｄ６，２Ｂ１２は、切
断ＣＥＡ−ｃＤＮＡＣＯ１１５誘導トランスフェクタ
ント；ＰＲＯｂは、ラット結腸癌細胞系；３Ｇ７／２Ｃ
１１は、完全長ＣＥＡ−ｃＤＮＡＰＲＯｂ誘導トラン
スフェクタント（Ｐｅｌｅｇｒｉｎ等［１９９１］前
出）；１Ｈ５，１Ａ８，１Ｇ７は、切断ＣＥＡ−ｃＤＮ
ＡＰＲＯｂ誘導トランスフェクタント。

【００５６】図４：異なるＣＥＡエピトープに対する固
定化ＭＡｂへの¹²⁵Ｉ対照ＣＥＡ（□）および¹²⁵Ｉ−
ｒＣＥＡ（■）の結合。約５ｎｇのＣＥＡを、セファロ
ース^TMに共有的に結合したそれぞれ５マイクログラムの
５種類の抗−ＣＥＡＭＡｂと共に２５℃にて１６時間
インキュベートした。

【００５７】

【実施例】別途特定しない限り、下記の百分率は、固体
中の固体混合物、液体中の液体、液体中の固体につい
て、それぞれｗｔ／ｗｔ、ｖｏｌ／ｖｏｌおよびｗｔ／
ｖｏｌに基ずく。更に別途特定しない限り完全長ＣＥＡ
−ｃＤＮＡを含み試薬の供給者、並びに下記の装置は、
強制的なものでない。当業者は、他の供給者から同様な
試薬または装置を選択することが出来る。

【００５８】ＣＥＡの疎水性尾部をコードする領域の削
除完全長のＣＥＡｃＤＮＡを固有のＨｉｎｄ IIIおよび
ＸｂａＩ部位の間に含むＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ^TM（ＫＳ
＋）ベクター（ＺｉｍｍｅｒｍａｎｎＷ．，Ｗｅｂｅ
ｒＢ．，ＯｒｔｌｉｅｂＢ．，Ｒｕｄｅｒｔ
Ｆ．，ＳｃｈｅｍｐｐＷ．，ＦｉｅｂｉｇＨ．，Ｓ
ｈｉｖｅｌｙＪ．Ｅ．，ｖｏｎＫｌｅｉｓｔＳ．
およびＴｈｏｍｐｓｏｎＪ．Ａ．“ガン胎児性抗原遺
伝子のクロモゾーム局在化および種々の腫瘍における特
異的発現”ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．４８，２５５０−２
５５４［１９８８］；Ｐｅｌｅｇｒｉｎ等［１９９２］
前出）を、エンドヌクレアーゼＢｓｕ３６Ｉ（Ｂｏｅｈ
ｒｉｎｇｅｒ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を
用いて消化し、アルカリホスファターゼ（Ｂｏｅｈｒｉ
ｎｇｅｒ）にて脱ホスホリル化した。ＸｂａＩ（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用い
る第２の消化は、０．８Ｋｂおよび０．４Ｋｂの２個の
断片を生じ、これらを分離し、１％アガロースゲルから
電気溶出した（図１、工程１参照）。

【００５９】第３のＣＥＡ反復の最後の４３塩基対の両
鎖をコードする２種類のオリゴヌクレオチド、すなわち
ＪＰＭ１５’−ＧＧＣＣＧＣＡＡＴＡＡＴＴＣＣＡＴＡＧＴＣＡ
ＡＧＡＧＣＡＴＣＡＣＡＧＴＣＴＣＴＧＣＡＴＡＧＴ−
３’［ＳＥＱＩＤＮＯ：３］およびＪＰＭ２５’−ＣＴＡＧＡＣＴＡＴＧＣＡＧＡＧＡＣＴＧＴＧＡ
ＴＧＣＴＣＴＴＧＡＣＴＡＴＧＧＡＡＴＴＡＴＴＧＣ−
３’［ＳＥＱＩＤＮＯ：４］を、それぞれ市販のＤＮＡ合成装置で合成した。該オリ
ゴヌクレオチドを、セファデックス^TMＮＡＰ−２５カラ
ム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を通して精製し、凍結乾燥
し、０．１ｍＭのＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス−ＨＣ
ｌ緩衝溶液ｐＨ７．６に溶解した。

【００６０】ゲル精製およびアニーリングの後、該合成
オリゴヌクレオチドは、ＥａｅＩから下流の成熟蛋白質
に見いだされる最後のアミノ酸のコドンまでの第３のＣ
ＥＡ反復の４３ｂｐを含む合成二重鎖を形成する。これ
にＴＡＧ停止コドン、および３’末端を形成するＸｂａ
Ｉ粘着末端が続き、一方５’末端は、ＥａｅＩ粘着末端
を有する。

【００６１】該二重鎖は、１ｍＭＡＴＰ中で８℃にて一
夜インキュベートすることにより大型の４．６Ｋｂ断片
のＸｂａＩ部位に連結される（図１、工程２参照）。該
反応混合物を、合成二重鎖と連結された４．６Ｋｂ断片
を過剰量の遊離の二重鎖から精製するために１％アガロ
ースゲルで分離した。

【００６２】０．８Ｋｂ断片を、ＥａｅＩ（Ｂｏｅｈｒ
ｉｎｇｅｒ）にて消化し（図１、工程３参照）、該ＤＮ
Ａ混合物を合成二重鎖と連結した４．６Ｋｂ断片と連結
した（図１、工程４参照）。ポリヌクレオチドキナーゼ
４（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にてＢｓｕ３６Ｉ部位をホス
ホリル化した後、該構築物を環状化し、これをＥ．ｃｏ
ｌｉ株ＸＬ１−ｂｌｕｅ（ＳｔｒａｔａｇｅｎｅＣｌ
ｏｎｉｎｇＳｙｓｔｅｍｓ，ＬａＪｏｌｌａ，Ｃａ
ｌｉｆｏｒｎｉａ）にトランスフェクトした。個々のク
ローンを、ＳｔｙＩおよびＥａｅＩエンドヌクレアーゼ
を用いる制限にて分析した。選択されたクローンからの
ＤＮＡを増幅し、単離した。組換えＣＥＡｃＤＮＡを
Ｈｉｎｄ IIIおよびＸｂａＩエンドヌクレアーゼを用い
た二重消化により切断し、ｐＲｃ／ＣＭＶ発現ベクター
（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，Ｃａ
ｌｉｆｏｒｎｉａ）中にクローン化した。

【００６３】更に個々のクローンを制限エンドヌクレア
ーゼＳｔｙＩおよびＥａｅＩにて調節した。選択された
クローンからのＤＮＡを増幅、および単離し、合成二重
鎖により形成される４６ｂｐ領域を含む組換えＣＥＡ
ｃＤＮＡの３’末端からの約２００ヌクレオチドを、Ｔ
７およびＳＰ６プライマーを使用してＵＳＢＳｅｑｕ
ｅｎｃｉｎｇキット（ＵＳＢ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｏ
ｈｉｏ）にて配列決定した。

【００６４】細胞培養およびトランスフェクションヒト結腸癌細胞系ＣＯ１１５は、公知の方法に従って株
化された（Ｍａｃｈ等［１９７４］前出；Ｃａｒｒｅｌ
等［１９７６］）。ＰＲＯｂと称されるラット結腸癌細
胞系ＤＨＤ／Ｋ１２／ＴＲｂは、同系ＢＤＩＸラットに
おいて１，２−ジメチルヒドラジンにより誘発された移
植可能な結腸腺癌から株化された細胞系から選択された
サブクローンである（ＭａｒｔｉｎＦ．，Ｃａｉｇｎ
ａｒｄＡ．，ＪｅａｎｎｉｎＪ．Ｆ．，Ｌｅｃｌｅｒ
ｃＡ．およびＭａｒｔｉｎＭ．“進行性または退行性
腫瘍を形成するラット結腸癌細胞の２種の準系のトリプ
シンによる選択”，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，３２，
６２３−６２７［１９８３］）。ＰＲＯｂサブクローン
は、ＢｅｒｌｉｎＤｒｕｃｋｒｅｙＩＸ／Ｏｒｌ
（ＢＤＩＸ）株のラット（Ｃａｉｇｎａｒｄ等［１９８
５］前出）において、進行性腫瘍を誘発することが示さ
れている。ヒトおよびラット細胞系は、１０％ウシ胎児
性血清（ＦＣＳ）を補充したＲＰＭＩ１６４０およびＤ
ｕｌｂｅｃｃｏＦ１２培地にそれぞれ維持された。リン
酸カルシウムを用いて３マイクログラムのＤＮＡを沈殿
させ（ＭａｍｍａｌｉａｎＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ
Ｋｉｔ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，
Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、１０％ＦＣＳを含む１０ｍｌ
の培養培地中で約３ｘ１０6 の単融合付着癌細胞と共に
１６時間インキュベートした。培地を除去し、次いで１
０ｍｌの新たな培養培地を添加した。更に２４時間イン
キュベートし、細胞を回収し、９６穴マイクロタイター
プレートに分配し、ネオマイシン類似物Ｇ４１８（Ｇｉ
ｂｃｏ，Ｐａｉｓｌｅｙ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ）を２００
マイクログラム／ｍｌの濃度で添加する前に２４時間生
育させた。各ウエルからの上澄をＣＥＡの分泌について
ＥＬＩＳＡによりスクリーニングした（Ｂｕｃｈｅｇｇ
ｅｒＦ．，ＭｅｔｔｒａｕｘＣ．，Ａｃｃｏｌｌａ
Ｒ．Ｓ．，ＣａｒｒｅｌＳ．およびＭａｃｈＪ．Ｐ．
“ガン胎児性抗原（ＣＥＡ）の異なるエピトープに対す
る３種のモノクローナル抗体を使用するサンドイッチ酵
素免疫アッセイ”，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．５，８
５−９１［１９８２］）。

【００６５】モノクローナル抗体ＭＡｂＢ９３、３５、Ｂ１７、およびＣＥ２５は、Ｃ
ＥＡにたいして特異的である。それらは交差反応性抗原
にも顆粒球にも結合しない（Ｂｕｃｈｅｇｇｅｒ
Ｆ．，ＰｅｌｅｇｒｉｎＡ．，Ｄｅｌａｌｏｙｅ
Ｂ．，Ｂｉｓｃｈｏｆ−ＤｅｌａｌｏｙｅＡ．および
ＭａｃｈＪ．Ｐ．“¹³¹Ｉ標識Ｆ（ａｂ’）２はヌ
ードマウスにおける大型ヒト結腸癌移植片の放射免疫治
療において完全な抗ＣＥＡ抗体より効果的かつ非毒性で
ある”，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．３１，１０３５−１０
４４［１９８４］）。ＭＡｂ１９２は、非特異的交差反
応性抗原（ＮＣＡ）と交差反応する抗ＣＥＡ抗体である
（ＢｕｃｈｅｇｇｅｒＦ．，Ｓｃｈｒｅｙｅｒ
Ｍ．，ＣａｒｒｅｌＳ．およびＭａｃｈＪ．Ｐ．
“モノクローナル抗体は、抗原性および組織分配におい
て先に記述した５５ｋＤのＮＣＡと区別される９５ｋＤ
のＣＥＡ交差反応性抗原（ＮＣＡ−９５）を同定す
る”，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ３３，６４３−６４
９［１９８４］）。５種のＭＡｂ（Ｂ９３、３５、Ｂ１
７、ＣＥ２５および１９２）は、ＣＥＡ分子上の最近同
定されたＧｏｌｄ１−５エピトープの一つと特異的に反
応する（Ｈａｍｍａｒｓｔｒｏｍ等［１９８９］前
出）。

【００６６】ＣＥＡ産生のアッセイＣＥＡｃＤＮＡトランスフェクトヒトまたはラット癌
クローン由来、または非トランスフェクトヒト結腸癌由
来の同数の細胞（５ｘ１０⁵）を、１０％ＦＣＳＲＰ
ＭＩ培地中で２４穴培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ，Ｂｅ
ｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＵＳＡ）の各ウエルに
添加した。１８時間後、完全培地を１ｍｌの血清非含有
培地に置き換え、これはＣＥＡ分泌を阻害することなく
細胞増殖を顕著に低減した。上澄を回収し、次いで更に
７２時間インキュベートした。上澄中のＣＥＡの量を、
３種の抗−ＣＥＡＭＡｂを使用して、酵素結合免疫吸
着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により測定した（Ｂｕｃｈｅ
ｇｇｅｒ等［１９８２］前出）。

【００６７】ＣＥＡ精製および¹²⁵Ｉによる標識ｒＣＥＡを、血清非含有培養上澄から、ＭＡｂＢ１７
を固定化したセファロース^TMを容れた免疫吸着剤カラム
にてアフィニティ精製した。５０ｍｌの血清非含有培養
上澄のバッチを４ｍｇのＢ１７ＭＡｂを含む２ｍｌの
セファロース^TMカラムに流速２ｍｌ／時にてかけた。結
合したＣＥＡをＨ₂Ｏ中の３Ｍアンモニウムチオシアネ
ートを用いてカラムから溶離させ、直ちに０．１Ｍトリ
ス緩衝溶液ｐＨ７．４に対して透析した。

【００６８】ＣＥＡを肝臓転移から、過塩素酸法を用い
て抽出した（ＫｒｕｐｅｙＪ．，Ｗｉｌｓｏｎ
Ｔ．，ＦｒｅｅｄｍａｎＳ．Ｏ．およびＧｏｌｄ
Ｐ．“大量腫瘍組織殻のヒト消化系の精製ガン胎児性抗
原の調製”Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ．９，６１７−６２２
［１９７２］；ＦｒｉｔｓｃｈｅＲ．およびＭａｃｈ
Ｊ．Ｐ．“正常人結腸粘液から抽出したガン胎児性抗
原（ＣＥＡ）の単離および特徴付け”Ｉｍｍｕｎｏｃｈ
ｅｍ．１４，１１９−１２７［１９７７］）。略述すれ
ば、１容の組織を３容の０．０３Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ
７．０に、ＳｏｒｖａｌｌＯｍｎｉｍｉｘｅｒ（Ｓｏ
ｒｖａｌｌ，Ｎｅｗｔｏｎ，ＣＴ，ＵＳＡ）中で４℃に
て１０分間、８０００ｒｐｍにてホモジナイズした。粗
製のホモジネートを０．６Ｍの過塩素酸にて２０分間抽
出し、１０，０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離した。
上澄を脱イオン水に対して透析し、凍結乾燥し、トリス
緩衝溶液に溶解させ、セファデックス^TMＧ−２００カラ
ム、次いでセファロース^TM６Ｂカラム上でゲル濾過して
精製した。

【００６９】２０マイクログラムの精製ＣＥＡおよびｒ
ＣＥＡのバッチを、クロラミンＴ法を用いて１ｍＣｉの
¹²⁵Ｉにて標識した。ヨウ素の取り込みは、約３０−４
０％であった。¹²⁵Ｉ- 標識ＣＥＡおよびｒＣＥＡを、
セファデックス^TMＧ−２００カラム上でのゲル濾過にて
更に精製した。

【００７０】エピトープの特徴付けＣＥＡ分子上の異なるエピトープを、直接結合アッセイ
により分析した。約５ｎｇの¹²⁵Ｉ−ＣＥＡを、ＣＮＢ
ｒ−セファロース^TM（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に結合され
たそれぞれ５マイクログラムの５種の抗−ＣＥＡＭＡ
ｂと共に２５℃にて１６時間インキュベートした。特異
的結合の百分率を、ＭＡｂに結合した放射能を測定する
ことにより決定した。¹²⁵Ｉ−ＣＥＡの非特異的結合
を、セファロース^TMに結合された無関係なＩｇＧを用い
て同様にインキュベートすることにより測定した。

【００７１】ウエスタンブロット分析ｒＣＥＡを分泌する選択されたトランスフェクトクロー
ン由来の細胞培養物上澄を、更に処理することなくウエ
スタンブロットにて分析した。膜結合ＣＥＡを合成する
対照の非トランスフェクトヒト結腸癌細胞（５−１０ｘ
１０⁶）を、０．５−１．０単位のホスファチジルイノ
シトール特異的ホスフォリパーゼＣ（ＰＩ−ＰＬＣ）
（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍ
ａｎｙ）を用いて１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡおよび２０ｍＭ
のＥＤＴＡを含むＲＰＭＩ培地中で３７℃にて１時間処
理した。

【００７２】約１００ｎｇのＣＥＡを含む細胞培養上澄
の試料を、７．５−１５％の線形勾配のＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅゲル上で走らせ、ニトロセルロース膜（Ｍｉｌｌｉｐ
ｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）に移した。ビオチン化
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ標準（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｒｉｃｈｍｏ
ｎｄ，ＣＡ）を分子量決定のために使用した。膜を、４
種の¹²⁵Ｉ−標識抗ＣＥＡＭＡｂ（３５，ＣＥ２５，
Ｂ９３およびＢ１７）並びに¹²⁵Ｉ−標識アビジンのプ
ールを用いて、４℃にて一夜インキュベートし、次いで
オートラジオグラフィにかけた。

【００７３】

【配列表】

配列番号：１（ｉ）配列の特徴（Ａ）配列の長さ：６４２（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：単鎖（Ｄ）トポロジー：ｕｎｋｎｏｗｎ（ii）分子型：蛋白質（iii ）ハイポセティカル：ＮＯ（iii ）アンチセンス：ＮＯ（v ）断片の型：Ｃ−末端（vi）起源（Ａ）生物名：ホモサピエンス（xi）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：１

【表１】

【表２】

【表３】

【００７４】配列番号：２（ｉ）配列の特徴（Ａ）配列の長さ：２０３１（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：二本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（i）分子型：ＤＮＡ（Ｇｅｎｏｍｉｃ）（iii）ハイポセティカル：ＮＯ（iii）アンチセンス：ＮＯ（vi）起源（Ａ）生物名：ホモサピエンス（xi）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：２

【表４】

【表５】

【００７５】配列番号：３（ｉ）配列の特徴（Ａ）配列の長さ：４６（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：単鎖（Ｄ）トポロジー：直線状（ii）分子型：ｃＤＮＡ（iii）ハイポセティカル：ＮＯ（iii）アンチセンス：ＮＯ（vi）起源（Ａ）生物名：ホモサピエンス（xi）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：３

【表６】

【００７６】配列番号：４（Ａ）配列の長さ：４６（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：単鎖（Ｄ）トポロジー：直線状（ii）分子型：ｃＤＮＡ（iii）ハイポセティカル：ＮＯ（iii）アンチセンス：ＮＯ（vi）起源（Ａ）生物名：ホモサピエンス（xi）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：４

【表７】

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明による例示的組換え切断ＣＥＡｃＤＮ
Ａの構築の模式図である。ブラックボックスは、削除さ
れる疎水性領域を示す。ホスホリル化末端は、Ｐにより
示されている。

【図２】異なるクローンおよび対照細胞系によるＣＥＡ
分泌を表すグラフである。ＣＯ１１５は、ヒト結腸癌細
胞系のＣＥＡ−ネガティブクローン；２Ｃ２，１Ｄ６，
２Ｂ１２は、切断ＣＥＡ−ｃＤＮＡＣＯ１１５誘導ト
ランスフェクタント；ＣＯ１１２，ＬＳ１７４Ｔは、高
ＣＥＡ−発現ヒト結腸癌細胞系；ＰＲＯｂは、ラット結
腸癌細胞系；１Ｈ５，１Ａ８，１Ｇ７は、切断ＣＥＡ−
ｃＤＮＡＰＲＯｂ誘導トランスフェクタント；３Ｇ７
／２Ｃ１１は、完全長ＣＥＡ−ｃＤＮＡＰＲＯｂ誘導ト
ランスフェクタント（Ｐｅｌｅｇｒｉｎ等［１９９１］
前出）

【図３】異なるクローンおよび対照細胞系由来のＣＥＡ
のウエスタンブロット分析を示す図である。細胞培養上
澄は、ＣＥＡ−分泌クローンについて直接に、あるい
は、他の細胞系についてＰＩ−ＰＬＣによる細胞の処理
後に操作された。ＬＳ１７４Ｔは、高ＣＥＡ−発現ヒト
結腸癌細胞系；ＣＯ１１５は、ヒト結腸癌細胞系のＣＥ
Ａ−ネガティブクローン；２Ｃ２，１Ｄ６，２Ｂ１２
は、切断ＣＥＡ−ｃＤＮＡＣＯ１１５誘導トランスフ
ェクタント；ＰＲＯｂは、ラット結腸癌細胞系；３Ｇ７
／２Ｃ１１は、完全長ＣＥＡ−ｃＤＮＡＰＲＯｂ誘導
トランスフェクタント（Ｐｅｌｅｇｒｉｎ等［１９９
１］前出）；１Ｈ５，１Ａ８，１Ｇ７は、切断ＣＥＡ−
ｃＤＮＡＰＲＯｂ誘導トランスフェクタント。

【図４】異なるＣＥＡエピトープに対する固定化ＭＡｂ
への¹²⁵Ｉ対照ＣＥＡ（□）および¹²⁵Ｉ−ｒＣＥＡ
（■）の結合を示すグラフである。約５ｎｇのＣＥＡ
を、セファロース^TMに共有的に結合したそれぞれ５マイ
クログラムの５種類の抗−ＣＥＡＭＡｂと共に２５℃
にて１６時間インキュベートした。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ０７Ｋ 15/14 8318−4ＨＣ１２Ｎ 5/10 15/12 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4ＢＧ０１Ｎ 33/53 Ｄ 8310−2Ｊ 33/574 Ｅ 8310−2Ｊ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者アンドレペルグランフランス国モントプリエ，スクアルミュリロ，フォンテンサン．クレマン 10 (72)発明者ジャン − ピエールマシュスイス国ローザンヌ，アヴニュドゥヴァルモン 20

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】（ａ）交差反応性ＣＥＡ様抗原類を含ま
ない；（ｂ）腫瘍細胞から脱離するＣＥＡの可溶性形態
とは抗原的に区別されない；および（ｃ）エタノールア
ミン欠損を特徴とする組換えＣＥＡ糖蛋白質誘導体。
【請求項２】配列番号１［ＳＥＱＩＤＮＯ：１］
のアミノ酸配列を有するか、またはその対立遺伝子変異
物もしくは機能的同等物である請求項１に記載の組換え
ＣＥＡ糖蛋白質誘導体。
【請求項３】請求項１または２に記載の組換えＣＥＡ
糖蛋白質誘導体をコードするＤＮＡ。
【請求項４】配列番号２［ＳＥＱＩＤＮＯ：２］
のヌクレオチド配列の全部もしくは一部を有する請求項
１または２に記載の組換えＣＥＡ糖蛋白質誘導体をコー
ドするＤＮＡ、またはその機能的同等物。
【請求項５】請求項１または２に記載の組換えＣＥＡ
糖蛋白質誘導体をコードするヌクレオチド配列を有する
ＤＮＡを含み、適合する宿主細胞内で前記ＤＮＡの発現
を支配可能である組換えベクター。
【請求項６】請求項１または２に記載の組換えＣＥＡ
糖蛋白質誘導体をコードするヌクレオチド配列を有する
ＤＮＡを含む組換えベクターを含んでなり、前記ＤＮＡ
の発現を支配可能である形質転換宿主細胞。
【請求項７】診断目的のための請求項１または２に記
載の組換えＣＥＡ糖蛋白質誘導体。
【請求項８】請求項１または２に記載の組換えＣＥＡ
糖蛋白質誘導体および不活性担体物質を含んでなる新生
物疾患診断用試薬。
【請求項９】請求の範囲１または２に記載の組換えＣ
ＥＡ糖蛋白質誘導体の製造に際し、（ａ）ヌクレオチド
配列［ＳＥＱＩＤＮＯ：２］またはその同等な配列
等の前記組換えＣＥＡ糖蛋白質誘導体をコードするヌク
レオチド配列を有するＤＮＡを含む組換えベクターを含
む宿主細胞を、該ＤＮＡ換えベクターを含む宿主細胞が
発現される条件下で培養し；および（ｂ）該培養物から
該宿主細胞によって産生される該組換えＣＥＡ糖蛋白質
誘導体を単離することを含んでなる、組換えＣＥＡ導体
を単離することを含んでなる、組換え糖蛋白質誘導体の
製造方法。
【請求項１０】請求の範囲１または２に記載の組換え
ＣＥＡ糖蛋白質誘導体をコードするヌクレオチド配列を
有するＤＮＡを含む組換えベクターの製造に際し、
（ａ）組換えＣＥＡ糖蛋白質誘導体をコードするヌクレ
オチド配列を有するＤＮＡをベクターに挿入し；（ｂ）
前記ベクターを宿主細胞内にて複製させ；および（ｃ）
該組換えベクターを宿主細胞から単離することを含んで
なる、組換えベクターの製造方法。
【請求項１１】請求の範囲１または２に記載の組換え
ＣＥＡ糖蛋白質誘導体を、不活性担体物質と混合するこ
とを含んでなる、生物学的試料中の新生物性疾患の診断
用試薬の製造方法。
【請求項１２】生物学的試料中のＣＥＡ濃度を、請求
の範囲１または２に記載の組換えＣＥＡ糖蛋白質誘導体
を使用してイムノアッセイにて測定することを含んでな
る、生物学的試料中の新生物性疾患の診断方法。
【請求項１３】請求項９に記載の製造方法により製造
される請求項１または２に記載の組換えＣＥＡ糖蛋白質
誘導体。
【請求項１４】請求項１０に記載の製造方法により製
造される請求項１または２に記載の組換えＣＥＡ糖蛋白
質誘導体をコードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡ
を含んでなる組換えベクター。
【請求項１５】容器中に請求項１または２に記載の組
換えＣＥＡ糖蛋白質を、必要に応じて不活性担体物質と
の組み合わせにおいて含み、および必要に応じてＣＥＡ
に対するモノクローナルまたはポリクローナル抗体を含
んでなる、新生物性疾患診断用テストキット。