JP2657053B2 - ＰＴＨｒＰ又はその断片に対する抗体及びこの抗体を含むキット - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、以後ＰＴＨｒＰ（副甲状腺ホル
モンに関連したホルモン）、ＡＣＳＦ（アデニル酸シク
ラーゼ刺激因子）、又はＢＲＦ（骨放出因子）と称され
る悪性の液性過カルシウム血症において活性なタンパク
に関する。

【０００２】さらに本発明は、ＡＣＳＦのペプチド断
片、並びにＰＴＨｒＰの精製及びＰＴＨｒＰの部分的配
列決定に関する。さらにまた本発明は、ＰＴＨｒＰ又は
それらの断片について向けられる抗体及びＰＴＨｒＰの
同定に有用な該抗体を含有するキットに関する。〔注：
ここに記載される引用文献は、本明細書の最後に全部示
される。〕

【０００３】悪性の液性過カルシウム血症（ＨＨＭ）
は、一定の癌、特徴的には肺の扁平細胞癌に非常に一般
的な併発症があり、それにより罹病率及び死亡率に本質
的に寄与する（１，２）。癌が誘導する液性因子は、腎
による骨吸収を促進しそしてカルシウム排出を制限する
ことによって血中のカルシウム レベルを高め得る（１
−３）。これらの癌による“異所性（ｅｃｔｏｐｉ
ｃ）”産生の副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）が上記ＨＨＭ
症候群を惹起すると多年にわたり考えられていた（４，
５）にもかかわらず、形質転換成長因子（ＴＧＦ’Ｓ）
を含むＰＴＨ以外の因子が原因であることが明らかにな
ってきた（１−３，６−８）。そして該因子は骨吸収を
促進する能力がある（２，３，９−１１）。また、ＰＴ
Ｈから免疫学的に別個ないくつかの因子の特定の癌によ
る産生についての証拠があるが、その因子は直接的にＰ
ＴＨレセプター又は密接に関連する膜構成要素に作用す
ることによって、ＰＴＨ標的細胞（腎及び骨）中でアデ
ニル酸シクラーゼを刺激する点ではＰＴＨに似ている。
かかる可能性は、臨床的知見に基づき予想され、そして
さらにＨＨＭを有する患者由来の抽出物中に（１２，１
３）、腎皮質性癌由来の条件化培地中に（１４）、そし
てＨＨＭモデル動物由来の腫瘍抽出物と条件化培地培養
物中で（１５，１６）その活性が記録されている。

【０００４】初めは、気管支の扁平細胞癌を有する過カ
ルシウム血症患者から樹立されたＢＥＮ細胞系（１７）
が、先に記載したＰＴＨｒＰのような、感知できる量の
上記ＰＴＨ様活性を示すことを本発明者らは見い出し
た。

【０００５】本発明者らは、ここにＰＴＨｒＰの精製及
びＰＴＨｒＰの特徴付けに成功した。従って、本発明の
態様の１つは、後に特定されるような実質的に純粋なＰ
ＴＨｒＰを提供するにある。

【０００６】従って、本発明の次なる態様は、ＰＴＨｒ
Ｐ活性を具備するＰＴＨｒＰの断片又はＰＴＨｒＰのサ
ブ−ユニットを提供するにある。ＰＴＨｒＰの単離及び
精製は、悪性の液性過カルシウム血症におけるその役割
を特徴付けるために行われる研究を可能にするであろ
う。

【０００７】ＰＴＨｒＰ又はそれらのペプチド断片は、
本技術分野におけるそれ自体公知の方法によって、モノ
クローナル及びポリクローナル双方の抗体試薬を産生す
るために使用し得る。例えば、ＰＴＨｒＰもしくはそれ
らのペプチド断片単独で又はアジュバント及び／もしく
は担体タンパク質の存在下で適当な免疫感作をすること
により、抗体試薬が調製され得る。適切な宿主の例とし
ては、マウス、ラット、ラビット、羊、馬、山羊及び牛
を包含する。モノクローナル抗体試薬が調製される場
合、一般に用いられる技術はＫｏｈｌｅｒ等（１８）及
びＫｅｎｎｅｔ等（１９）により提示された手法に従っ
ている。

【０００８】ＰＴＨｒＰに対して向けられる抗体試薬
は、例えば全血液、血清、又は他の生物学的流体中のＰ
ＴＨｒＰ活性を検出するためのアッセイにおいて利用さ
れ得る。特に、かかる試薬は、ＰＴＨ自体が原因となる
ことが考えられる癌、慢性腎不全及び他の骨疾患を有す
る患者の調査及び診断において相当な有用性があるであ
ろう。

【０００９】ＰＴＨｒＰ及びそれらのペプチド断片に対
して産生された抗体は、またさらに、免疫組織化学的な
診断薬として有用であり、そして種々の組織中でＰＴＨ
ｒＰを産生しうる細胞の免疫的位置決定（ｉｍｍｕｎｏ
ｌｏｃａｌｉｓａｔｉｏｎ）のために有用である。

【００１０】診断の目的のための抗体は、検出しうるマ
ーカー、例えば；ローダミン、フルオレセイン、コロイ
ド状の金、西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ、β−ガラク
トシダーゼ、ウレアーゼ、アルカリ性フォスファター
ゼ、フィコビリプロテイン（ｐｈｙｃｏｂｉｌｉｐｒｏ
ｔｅｉｎｓ）、ルシフェラーゼ、フェリチン、 ¹²⁵Ｉ，
³²Ｐ， ³Ｈ又は¹⁴Ｃで適当に標識付けされたＰＴＨｒＰ
に対して向られる抗体を含むことができる。

【００１１】本発明者らは、ＰＴＨｒＰの合成ペプチド
に対する抗体を調製した。これらの抗体は、例えば放射
線イムノアッセイ（５０）又はウェスターン法（５１）
により、ＰＴＨｒＰ又はそれらの断片を見い出すために
使用し得る。試験管内（ｉｎｖｉｔｒｏ）培養細胞又は
生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）腫瘍によって産生されるＰＴ
ＨｒＰは、ＰＴＨｒＰに対して向けられるこれらの抗体
又は他の抗体試薬を用いて検出され得る。

【００１２】本発明のさらなる態様によれば、ＰＴＨｒ
Ｐの生物学的活性又は免疫原性をもつポリペプチドに対
する抗体であって、そのポリペプチドが以下の： （ａ）以下の特徴： （ｉ）配列ＡＶＳＥＨＱＬＬＨＤＫＧＫＳＩＱＤＬＲＲ
ＲＦＦＬＨＨＬＩＡＥＩＨＴＡをもつＮ−末端アミノ
酸； （ii）還元及び非還元条件下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより
測定されるとき、１５〜２５キロダルトンの間の分子
量；及び （iii)アデニレート・シクラーゼ応答検定において測定
されるとき、タンパク質１mg当り、副甲状腺ホルモンの
アミノ酸番号１〜３４から成るペプチドの少なくとも約
６mgに相当する、比生物学的活性、をもつ実質的に純粋
なＰＴＨｒＰ；並びに （ｂ）少なくともアミノ酸番号１〜１１を含んで成るＰ
ＴＨｒＰの断片、から成る群から選ばれることを特徴と
する抗体が提供される。本発明のさらに他の態様によれ
ば、１以上の上記抗体を含む、ＰＴＨｒＰ又はその断片
の検出のためのキットが提供される。

【００１３】本発明によって提供されるキットは、例え
ば上記に記載したようなフルオレセイン、放射性活性、
又はタンパク性標識でラベルされたＰＴＨｒＰに対して
向けられる抗体を含有してもよい。また、キットは１以
上のラベルした第二又は第三の抗体を含有してもよい。
付言すれば、キットは試薬を希釈するための緩衝液、そ
してアッセイを実施するための皿又はトレイのような種
々の支持材を含有してもよい。ＰＴＨｒＰ又はそれらの
断片に対して向けられる抗体は、凍結乾燥し、そして、
即ち適当な水溶液中での懸濁のために適した粉末状態で
あってもよい。他方、該抗体は、貯蔵のために適切な水
溶液の中に存在してもよい。

【００１４】さらに本発明の態様によれば、ＰＴＨｒＰ
のエピトープに結合し得る抗体試薬とサンプルを接触す
るか、又は該試薬と担体上に固定化されたサンプル中の
タンパクと接触し、そしてその後抗体結合性の有無を検
出することを含んでなる、所与のタンパク含有サンプル
中のＰＴＨｒＰ又はそれらの断片を検出するための方法
が提供される。

【００１５】本発明の別の態様によれば、ＰＴＨｒＰの
エピトープに結合し得る抗体を担体上に結合されたもの
とサンプルとを、抗体が結合することを許容するために
十分な時間を通してインキュベーションし、そしてその
後ＰＴＨｒＰのエピトープと結合し得る抗体試薬と結合
したＰＴＨｒＰの存否を検出することを含んでなる、所
与のサンプル中のＰＴＨｒＰ又はそれらの断片を検出す
るための方法が提供される。

【００１６】ＰＴＨｒＰの精製及びそれらのＮ−末端ア
ミノ酸配列の決定は、ＰＴＨｒＰのアミノ酸配列に対応
して合成オリゴヌクレオチドを製造することを可能にす
るだろう。次に、これらのオリゴヌクレオチドは、ハイ
ブリダイゼーション プローブとして使用でき、即ちＰ
ＴＨｒＰをコードする遺伝子又は遺伝子類の単離を容易
にする。また、かかるオリゴヌクレオチドは診断試薬と
しても使用でき、またさらにＰＴＨｒＰをコードするｍ
ＲＮＡの発現の検出、及びＰＴＨｒＰをコードする遺伝
子又は遺伝子類の発現の制御の研究において使用され得
る。

【００１７】ヒト腫瘍系ＢＥＮによって産生されるＰＴ
ＨｒＰは２つの形態で存在し、まったく同一の生物学的
活性を有しているが、免疫交叉反応性、分子量及びＨＰ
ＬＣによる溶出挙動に基づき識別し得る。ＰＴＨｒＰの
これらの形態のどちらのものも本発明の態様の範囲内に
ある。

【００１８】さらに本発明の態様によれば、ＰＴＨｒＰ
はＢＥＮ細胞が培養された培養物から得られる。さらに
具体的に、ＰＴＨｒＰの精製のための１の方法は次の工
程： （ａ）培地中でＢＥＮ細胞を培養する； （ｂ）培養物を陽イオン交換樹脂にかける； （ｃ）上記陽イオン交換樹脂から溶出分画する； （ｄ）溶出された画分をＰＴＨｒＰ活性についてアッセ
イする； （ｅ）それらのＰＴＨｒＰ活性を有する画分について逆
相高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を実施
し、そしてその後実質的に純粋なＰＴＨｒＰを単離す
る、を含んでなる。

【００１９】単に例示のために添付する図面を引用し
て、ここに本発明をより詳細に記載する。そしてその内
容は：第１図は、ＰＴＨｒＰの最終精製工程における、
２１５nmにおける吸収及び生物学的活性のＨＰＬＣ挙動
を示す； Ａ Ｖｙｄａｃ ＨＰＬＣ由来のピークＢ物質を集めた
２２０μｇがＣ₁₈ベイカーボンド（Ｂａｋｅｒｂｏｎ
ｄ）カラム（２５×０．４６cm）にかけられた。溶離は
１分当たり０．６６％の比率における０−６０％アセト
ニトリル／０．１％ＴＦＡのグラージェントを用いて実
施された。画分は２１５nmにおいて観察されるタンパク
ピークに従って集められた。アデニル酸シクラーゼ活性
は、各々の画分から１０μｌ分取したものでアッセイさ
れそして画分容量に対して数値が調整された。

【００２０】Ｂ 実験Ａ（画分５１−５５）から集めら
れた６μｇ ｈＰＴＨ（１−３４）同等物が、上記実験
Ａのカラムに再びかけられそして１分当たり０．３３％
の比率における０−６６％アセトニトリル／０．９％Ｔ
ＦＡのグラージェントで溶離された。

【００２１】第２図は、第１図の画分３１，３２及び３
３のＳＤＳポリアクリルアミド ゲルを示す；第３図
は、インタクト（ｉｎｔａｃｔ）ＵＭＲ１０６細胞にお
いてウシＰＴＨ（１−３４）に対してアッセイされた
（○）第１図の画分３１の生化学的活性のプロット
（●）を示す；

【００２２】第４図は、ＳＰセファデックス カラムク
ロマトグラフィー、及び２回のＢａｋｅｒｂｏｎｄクロ
マトグラフィー工程の後に得られた逆相ＨＰＬＣカラム
（Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ Ｃ１８ｗｉｄｅｐｏｒｅ２５×
０．４６cm）でクロマト処理された精製ＰＴＨｒＰのＨ
ＰＬＣ挙動を示す。挿入は画分４７のＳＰＳＰＡＧＥ銀
染色法（ｓｉｌｖｅｒ−ｓｔａｉｎ）ゲル挙動及び分子
量標準を示す。

【００２３】第５図は、トリプシンによる消化後のＰＴ
ＨｒＰ（１００ｐＭｏｌｅｓ）のＨＰＬＣ挙動を示す。
トリプシン消化物は、Ｃ８Ｂｒｏｗｎｌｅｅカートリッ
ジ、１０cm×２．１mm、流速２５０μｌ／分、及び０．
１％ＴＦＡ中の０−５０％アセトニトリルのグラージェ
ント（１％／分）が用いられクロマト処理された。

【００２４】第６図は、ブラウンリー（Ｂｒｏｗｎｌｅ
ｅ）Ｃ８（２．１mm）マイクロボアー（ｍｉｃｒｏｂｏ
ｒｅ）カラム上でクロマト処理された第４図の画分４６
及び４８を集めた物質を示す。挿入は、主要ピークのダ
イオード アレー（ｄｉｏｄｅ ａｒｒａｙ）検出を示
す。

【００２５】第７図は、トレーサーとして種々のラベル
していないペプチド及びＩ¹²⁵ でラベルした〔Ａｓ
ｎ¹⁰，Ｔｙｒ¹⁷〕ＰＴＨｒＰ（１−１７）及び合成ＰＴ
ＨｒＰ（１−１７）ペプチドに対するラビット抗血清を
用いるラジオイムノアッセイを示す。結合したペプチド
／遊離ペプチドがペプチド／mlの量に対してプロットさ
れた。

【００２６】Ａ ラベルされていないペプチドは： 〔Ｇｌｕ⁸ ，Ａｓｎ¹⁰，Ｃｙｓ¹¹〕ＰＴＨｒＰ（１−１
１）（○）、〔Ａｓｎ¹⁰〕ＰＴＨｒＰ（１−１６）
（●）、ｈＰＴＨ（１−１０）（□）、ｈＰＴＨ（１−
３４）（■）、ラット カルシトニン遺伝子関連ペプチ
ド（ＣＧＲＰ）、ヒト副腎皮質刺激ホルモン及びウシ
インシュリン（全て、１０μｇ／ml，△）、サケ カル
シトニン（１０μｇ／ml，▲）であった。

【００２７】Ｂ ラベルされていないペプチドは：〔Ｇ
ｌｕ⁸ ，Ａｓｎ¹⁰，Ｃｙｓ¹¹〕ＰＴＨｒＰ（１−１１）
（○）、ラットＰＴＨ（１−３４）（□）、ウシＰＴＨ
（１−３４）（■）、ヒトＰＴＨ（１−３４）（●）、
ラットＣＧＲ（１０μｇ／ml，△）、サケ カルシトニ
ン（１０μｇ／ml，▲）。

【００２８】第８図は、ＳＰ−セファデックス部分精製
ＰＴＨｒＰのＨＰＬＣに由来する画分の生物学的なアッ
セイ及びラジオイムノアッセイの比較を示す。第９図
は： Ａ ＵＭＲ１０６−０１細胞における増加するサイクリ
ックＡＭＰ産生についての合成ＰＴＨｒＰ（１−３４）
の生物学的活性（●）を、標準としてのウシＰＴＨ（１
−３４）（○）と比較して示す。

【００２９】Ｂ ¹²⁵Ｉ−フィブリン上で培養されたＵ
ＭＲ１０６−０１細胞におけるプラスミノーゲン アク
チベーター活性に対する合成ＰＴＨｒＰ（１−３４）の
効果（●）及びウシＰＴＨ（１−３４）の効果（○）を
示す。このアッセイは既にＡｌｌａｎらに記載された方
法により実施された（５２）。

【００３０】第１０図は、実施例３のピークＡの２つの
サンプル（Ａ１及びＡ２、レーン２及び３）、高度に精
製したウシ副甲状腺ホルモン（レーン１）、及び高度に
精製した実施例３のピークＢから誘導されたＰＴＨｒＰ
（レーン４）のウェスターンブロト分析を示す。サンプ
ルはＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離され、ニトロセルロースに
移され；ＰＴＨｒＰ（１−１６）に対して生じるラビッ
ト抗血清によりプローブし；洗浄しそして山羊の抗−ラ
ビットＩｇＧ１の ¹²⁵Ｉ−ラベルしたＦａｂ断片とイン
キュベートし、そしてオートラジオグラフ化した。分子
量標準は水平線で示される。

【００３１】定義：“ＰＴＨｒＰ”とは、ＳＤＳポリア
クリルアミド ゲル電気泳動により測定される場合に、
１５，０００〜２５，０００ダルトンの分子量を有し、
そして副甲状腺ホルモンと同様の態様で、適当な標的細
胞（例えば、ＵＮＲ１０６−０１細胞）中でアデニル酸
シクラーゼ活性を刺激する活性を有する悪性の液性過カ
ルシウム血症において活性なタンパクを称する。

【００３２】既に記載したように、ＢＥＮ細胞から精製
されるＰＴＨｒＰは多型性でありそして実質的に同一の
生物学的活性を有する２つの識別されうる産生物として
存在する。これらの産生物の１つは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
により測定される場合に１５−１８Ｋ間の分子量を有
し、そしてＮ−末端配列は第１表に示される。別の産生
物は、１８Ｋ−２５Ｋ間の分子量を有する。この第２の
産生物は第１に記載した産生物のＰＴＨｒＰに対して産
生される抗血清と交叉反応する。ＰＴＨｒＰの両産生物
とも本発明の態様に含まれそして“ＰＴＨｒＰ”の語に
より包含される。

【００３３】さらに、ＰＴＨｒＰ活性を有するＰＴＨｒ
Ｐの対立遺伝子的変形体（Ｖａｒｉａｎｔｓ）も本発明
の態様内のものでありそしてまたさらに“ＰＴＨｒＰ”
の語により包含される。このような変形体は、ＰＴＨｒ
Ｐの配列に対するアミノ酸（類）の削除、置換又は付加
により提供され、そしてこれらは第１表に示される（一
部）。第１表により示されるようなもともと存在するア
ミノ酸が削除されそして／もしくは他のアミノ酸に置換
されるか、又は本来的な配列のＰＴＨｒＰに対しさらに
アミノ酸が加えられる場合の変形体は、通常のタンパク
合成技術（４１）又は組換えＤＮＡ技術（５３）によっ
て調製され得る。これらの変種でＰＴＨｒＰ活性を具備
するものは本発明の態様内のものであり、そしてまた
“ＰＴＨｒＰ”の語により包含される。

【００３４】ＰＴＨｒＰに関連して使用される場合の
“実質的に純粋”とは、ＰＴＨｒＰと通常会合している
タンパク性の又は他の汚染物質が実質的に存在しない場
合のＰＴＨｒＰを意味する；一般にＳＤＳ−ＰＡＧＥ上
で単一バンドを生じせしめ；そして全タンパクの一般に
約９５重量％−１００重量％、通常約９７重量％がＰＴ
ＨｒＰである場合をいう。本発明の実施に従う“ＰＴＨ
ｒＰ”は、先行技術文献に記載されたようなＰＴＨ様の
活性を有する物質の粗製の特徴付けられていない生産物
から識別出来る。先行技術文献の生産物（５４及び５
５）は、多数のタンパクから成り、活性因子はタンパク
及び他の物質の合計量に比べて非常に少量である。これ
らの生産物は、タンパク配列分析又はＰＴＨｒＰに対し
て特異的な抗体の調製のためには適していなかった。

【００３５】本明細書の“サブユニット（ｓｕｂ−ｕｎ
ｉｔ）”又は“断片”の語は、ＰＴＨｒＰに特有である
ところのＰＴＨｒＰタンパクの一部を意味するために用
いられる。予想されるように、これは単一のアミノ酸を
特に排除する。一般に、長さとして５個以下のアミノ酸
のペプチドは特異的なものにはならないだろう。“エピ
トープ”とは免疫応答を引き出すことができるＰＴＨｒ
Ｐ又はそれらの断片もしくはサブユニットの任意の抗原
部位を意味する。

【００３６】略語 ： ＨＰＬＣ 高性能液体クロマトグラフィー ＳＤＳ−ＰＡＧＥ ドデシル硫酸ナトリウム ポリアクリルアミドゲル電 気泳動 ＰＴＨ 副甲状腺ホルモン ｈＰＴＨ ヒト副甲状腺ホルモン ＰＴＨｒＰ（１−１１） 第１表のアミノ酸１から１１に対応するＰＴＨｒＰの 合成ペプチド ＰＴＨｒＰ（１−１６） 第１表のアミノ酸１から１６に対応するＰＴＨｒＰの 合成ペプチド ＰＴＨｒＰ（１−１７） 第１表のアミノ酸１から１７に対応するＰＴＨｒＰの 合成ペプチド ＰＴＨｒＰ（１−３４） 第１表のアミノ酸１から３４に対応するＰＴＨｒＰの 合成ペプチド ＣＧＲＰ ラットカルシトシン遺伝子関連ペプチド ＴＦＡ トリフルオロ酢酸

【００３７】

【実施例】実施例１ ＰＴＨｒＰ活性に対する生物学的なアッセイ 生物学的アッセイは、ＰＴＨに応答して、骨芽細胞様の
細胞、例えば広範囲な種々のＵＭＲ１０６−０１細胞系
（２０−４０）におけるサイクリックＡＭＰの量依存性
産生を利用する。上記アッセイが実施し得る種種の方法
は骨芽細胞様の細胞の膜ホモジネート中のアデニル酸シ
クラーゼの直接的な測定、そして無処理（ｉｎｔａｃ
ｔ）細胞によって産生されるサイクリックＡＭＰのアッ
セイを包含するものである。簡単に、都合よくそして非
常に多量のサンプルの迅速なアッセイを可能にするため
に、本発明者らは、１２−ウェルプラスチック皿中でＵ
ＭＲ１０６−０６細胞をレプリカ培養として増殖せし
め、 ³Ｈ−アデニンと共に２時間にわたり前−インキュ
ベーションすることにより細胞ＡＴＰプールを ³Ｈによ
りラベルし、細胞を短時間洗浄し、次にホスホジエステ
ラーゼ インヒビターとして１mMイソブチルメチルキサ
ンチンを添加することにより応答を測定した。１０分間
後に反応を止めそしてＤｏｗｅｘ（登録商標）及び中性
アルミナ上での連続的なクロマトグラフィーにより培養
物から ³Ｈ−サイクリックＡＭＰを精製した。上記細胞
は、サイクリックＡＭＰ産生において投与量依存性増加
を伴って、ＰＴＨそしてＥシリーズのプロスタグランジ
ン（主にＰＧＥ₂ ）に対して応答する。これはＰＴＨ又
はＰＴＨ様活性についての簡単な再現性ある生物学的な
アッセイに改良されている（３４，４０）。この系にお
いて、ＰＴＨ（４０）の拮抗ペプチド又は合成ヒトＰＴ
Ｈ（１−３４）（４０）に対して産生したＰＴＨに対す
る他の抗血清と共にサンプルを事前にインキュベートす
ることによりＰＴＨに対する応答は抑制されたが、ＰＧ
Ｅ₂ に対してはそうでなかった。

【００３８】実施例２ ＢＥＮ細胞によって誘導されるＰＴＨｒＰ活性 実施例１に記載された生物学的アッセイによりＢＥＮ細
胞培養液が直接アッセイされた場合に、それはサイクリ
ックＡＭＰ産生を刺激する能力を示す。活性は培地の連
続的な希釈物、しばしばほぼ１：１００の希釈物中で測
定できる。粗培養液の希釈物はＰＴＨにより誘導される
それと平行して活性を刺激し；山羊抗−ヒトＰＴＨ（１
−３４）と培地との事前のインキュベーションは、ＰＴ
ＨｒＰ活性に対していかなる効果ももたらさないが、同
じ抗血清はｈＰＴＨ（１−３４）それ自体（４０）の活
性を完全に不活化する。合成ペプチド、〔³⁴Ｔｙｒ〕ｈ
ＰＴＨ（３−３４）アミド及び〔³⁴Ｔｙｒ〕ｈＰＴＨ
（５−３４）アミドは、上記ＵＭＲ１０６−０１細胞中
のＰＴＨｒＰ及びｈＰＴＨ（１−３４）に対するサイク
リックＡＭＰ応答をそれぞれ抑制するが、これらの拮抗
剤は同じ細胞中のＰＧＥ₂ に対する応答についてなんら
の効果ももたない（４０）。

【００３９】ＢＥＮ細胞培地とトリプシンとのインキュ
ベーションは、ＰＴＨｒＰの生物学的な活性の欠失をも
たらし、それがタンパクであることと一致する。それは
２分間１００℃の温度に耐えうるから適度な熱安定性を
有する。０．１Ｍ酢酸中Ｂｉｏｇｅｌ Ｐ６０上での無
血清ＢＥＮ細胞条件化培地のゲルの濾過は、流出物チュ
ーブの生物学的なアッセイにより、活性が約４０，００
０の分子量の巨大分子に基づくことを示した。これはお
そらく、未精製段階にある間、上記活性物質が他のタン
パクを伴う結果として過大に算定されるためであること
が後になってわかった。

【００４０】ＰＴＨラジオイムノアッセイは多数の相違
する抗血清具体的にはカルボキシ末端について２つ、分
子の中間について１つ、そしてアミノ末端について１
つ、について実施された。どの場合でも、ＢＥＮ細胞培
養物中で免疫反応性ＰＴＨは検出されなかった。ＢＥＮ
細胞をコンフルエンスに増殖せしめ、洗浄して血清を除
去し、そして無血清培地（５０％Ｄｕｌｂｅｃｏ’ｓ
Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅｓ’ Ｍｅｄｉｕｍ，５
０％メデウム１９９）中で２４時間インキュベートする
ことにより、実質的な量のＰＴＨｒＰ活性（１／１００
までの希釈で検出可能）の生産を行うことが可能である
ことが見い出された。従って、これは活性物質を大量に
含む培地を蓄積する標準方法として使用され、そして該
培地は精製が初められるまで−２０℃で貯蔵された。

【００４１】実施例３ ＢＥＮ細胞培養物からのＰＴＨｒＰの精製 ＢＥＮ細胞培養物（２４時間、無血清インキュベーショ
ン）が蓄積され、そしてＵＭＲ１０６−０１サイクリッ
クＡＭＰ応答アッセイにおいて、標準としてヒトＰＴＨ
（１−３４）に対する生物学的なアッセイによりＰＴＨ
ｒＰ活性が測定された。培養物の蓄積したバッチ−１回
に５ｌ−が、１Ｍの酢酸でpH４．８に酸性にした後、Ｓ
Ｐセファデックスカラム（３５ml容積）上に注がれた。
そのカラムがpH４．８の０．１Ｍ酢酸ナトリウムで十分
に洗浄された後、個々の試験管についてＥ₂₈₀ の存在を
測定しながら、０．１，０．２及び０．３Ｍ ＮａＣｌ
の各２５０ml、そしてさらに０．５Ｍ ＮａＣｌ５００
mlを加えることによりタンパクの回分的な溶出が実施さ
れた。生物活性は個々のカラム試験管のサンプル１００
μｌについてアッセイされ、そして生物活性のバルク
（ｂｕｌｋ）は、０．５Ｍ ＮａＣｌ画分を集めること
により得られた。この段階での生物活性の回収率は９０
−１００％であり、そして１０倍の精製を達成する。そ
れは本質的な精製手段というよりは、むしろ有用な濃縮
方法として役立つ。

【００４２】かかる５ｌ段階から蓄積した活性物質は、
ＳＰ１，ＳＰ2 、等のように称される。上記活性プール
（０．５Ｍ ＮａＣｌ）はＴＦＡにより０．１％の濃度
に酸性にされ、そして逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ３００）カラ
ム上に注がれ、そのカラムから１分当り０．６６％のア
セトニトリルグラージェントを用いて活性物質は溶出さ
れた。ＲＰ３００カラム溶出物からの個々のカラム画分
（１ml画分当たり１０μｌ）は、バイオアッセイされそ
してロータリー エバポレーターにより処理される。こ
の段階での回収率は６０％である。６つのかかるＳＰプ
ールが次の段階の精製のために一緒にされた。すなわ
ち、これは培養物の３０ｌ分に相当する。

【００４３】タンパクの評価は、標準としてＢＳＡを用
いてブラッドフード法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ ｍｅｔｈｏ
ｄ）（５６）により行われ、そしてその物質は２mgづつ
分けてＨＰＬＣ Ｖｙｄａｃ Ｃ１８カラム（１０μ，
２．５４×２２cm）にかけられ、そしてカラムから１分
当たり０．５％アセトニトリル グラージェントでそれ
は溶離される。該Ｖｙｄａｃカラムから生物活性の２つ
のピーク、すなわち３２％アセトニトリルにおいてピー
クＡそして３７％においてピークＢが首尾よく得られ
る。ピークＢはピークＡより他のタンパクによる汚染が
より少なく、そして次の精製のために機械的に選ばれ
る。活性の合計回収率は３０％である。ピークＡ：ピー
クＢの割合はバッチ間で２：１から０．５：１まで変化
する。

【００４４】ピークＢ物質が集められ、そしてｗｉｄｅ
ｐｏｒｅ（３００Å）ＢａｋｅｒｂｏｎｄＣ１８逆相
カラムにかけられ、そしてさらにアセトニトリル グラ
ージェントで溶離される（第１Ａ図）。２１５nmにおけ
る吸収がモニターされる。個々のカラム画分がバイオア
ッセイされ、そして最高の活性を有する画分（画分５０
−５５）が集められる。該活性物質は第１Ｂ図に示され
るように改良した溶出条件を用いる逆相ＨＰＬＣにより
さらに精製される〔１分当たり０．３３％のシャロウワ
ー（ｓｈａｌｌｏｗｅｒ）アセトニトリル グラージェ
ント〕。第１図の細かい平行線の領域は、生物学的アッ
セイデータをヒトＰＴＨ（１−３４）のμｇ相当量とし
て示し、そして試験管番号２８−３８のカラム画分が示
される。生物活性ピークは画分３１において観察され、
それは４つの近似する位置のタンパクピークの１つに一
致する。画分３１の内容物はアミノ酸配列決定のために
用いられそしてＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のために用いられ
た。まず最初のこの物質の配列決定は、第１表のアミノ
酸１−２４を同定した。

【００４５】上記ピーク画分は、銀染色法（ｓｉｌｖｅ
ｒ−ｓｔａｉｎｉｎｇ）によるタンパク バンドを検出
するために使用されたゲルの一部を用いてＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥにより分析された。上記ゲルの残りをスライスして
はぎとり、そして生物活性についてアッセイされたゲル
スライスから活性物質を溶離した。

【００４６】１７％ポリアクリルアミド ゲルへの画分
３１の２０％の使用（約６ｐＭｏｌｅｓ、又は１２０n
g）は、分子量標準により決定した場合１８−１９Ｋの
分子量に一致する銀染色する物質の主要バンドをもたら
す（第２図）。２つの不明瞭なバンドが３５Ｋ及び６７
Ｋに観察された。これらはＰＴＨｒＰの２量体及び３量
体の可能性がある。再度試験したゲルが３mm幅の切片に
スライスされそして０．１％ＳＤＳで溶離された場合、
溶離した活性は１８−１９Ｋにおける銀染色ピークに一
致する単一バンドのみ観察された（第３図）。ゲルに適
用された量は生物学的アッセイによりｈＰＴＨ（１−３
４）の１．４μｇと等価であった。直接的なタンパクの
定量は行わなかったが、アミノ酸配列データから計算さ
れた。

【００４７】配列決定のために用いられた純粋物質の比
活性は、μｇ ＰＴＨｒＰタンパク当たりウシＰＴＨ
（１−３４）の６μｇと等価であることが推定された
（第３図）。別々の精製バッチにおいて、ＨＰＬＣ工程
Ｂから回収された生物活性物質（第１図、画分３１−３
２）は一緒にされそして１分当たり０．３３％の割合で
アセトニトリル グラージェントによりｗｉｄｅ ｐｏ
ｒｅ（３００Ａ）ＢａｋｅｒｂｏｎｄＣ１８逆相カラム
上で再クロマト処理された。第４図に見られるような、
単一の鮮明に限定されたピーク、すなわちピーク４７
は、分子量１８Ｋ−１９Ｋのタンパクを含む。この画分
中には、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定されるような他のいか
なる夾雑タンパクも検出されなかった。この物質は実施
例１に示すアッセイによれば生物活性があり、そしてバ
イオシステム ガス フェーズ マイクロシークエンサ
ー器（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｇａｓ
Ｐｈａｓｅ Ｍｉｃｒｏｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）を使用
してアミノ酸配列決定のために使用された。この物質の
配列決定は、次の実施例中に示すように４１個のアミノ
酸を同定した。

【００４８】実施例４ ＰＴＨｒＰの部分的配列決定 実施例３により調製された精製ＰＴＨｒＰが一連のエド
マン分解にかけられ、そしてＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓ
ｙｓｔｅｍｓｇａｓ ｐｈａｓｅ ｓｅｑｕｅｎｔａｔ
ｏｒ（５７）を用いて分析された。配列決定は３度行わ
れ、得られる結果を第１表に示す。精製ＰＴＨｒＰのＮ
−末端配列分析により４１個のアミノ酸が同定される。
ＰＴＨｒＰのアミノ酸配列はＰＴＨｒＰのトリプシン分
解断片を用いて５０残基まで拡張された。第１表のアミ
ノ酸は、レター コード（ｌｅｔｔｅｒ ｃｏｄｅ）を
使用して指定される（５８）。

【００４９】精製ＰＴＨｒＰのトリプシン分解は、７５
μｇのＰＴＨ様生物活性物（合成ＰＴＨ標準に対して、
ＵＭＲ−１０６細胞生物学的アッセイによってＰＴＨｒ
Ｐの調製物をアッセイすることによりＰＴＨ様生物活性
物は測定される）を３７℃で２４時間トリプシン（１：
１０ｗ／ｗ）とインキュベートすることにより実施され
た。このトリプシン分解物はＨＰＬＣにより１８個のピ
ークに分離された（第５図）。これらのピークの数個の
アミノ酸配列が決定され、そしてピーク７に含まれる配
列は、残基３８において始まるＰＴＨｒＰのＮＨ₂ −末
端配列と重なることがわかった。このペプチドがＰＴＨ
ｒＰのアミノ酸配列を残基５０まで伸張した。

【００５０】ＰＴＨｒＰの最初の２４個のアミノ酸が、
コンピュータープログラムを使用してＮＢＲＦデーター
ベース（５９）中のタンパク配列と比較された。４５
−８０％の重複配列の相同性を伴って、ヒト及びラット
ＰＴＨの最初の２４個のアミノ酸との実質的な同質性が
明らかにされた。構造的同一性は、ヒトＰＴＨの最初の
１３個のアミノ酸とで特に示され、そしてそれ以降では
ずっとより少ない。ＰＴＨの最初の１０個のアミノ酸を
含有する配列は、非常に弱い免疫原であり、そして実際
にこれは現実の配列、そしてコンピューター化した予測
法から予測され得る。ＰＴＨｒＰ配列が同様な方法で分
析される場合、ＰＴＨよりも感知できるほどより一層免
疫原性であることがわかった。

【００５１】

【表１】

【００５２】実施例５ 精製ＰＴＨｒＰのアミノ酸分析 高度に精製したＰＴＨｒＰのサンプル（第４図のカラム
溶出由来の４６−４８試験管；合計ＰＴＨ様生物活性物
７μｇ）が、第６図に示されるようにＢｒｏｗｎｌｅｅ
Ｃ８カラム（２．１mm）によりクロマト処理された。
主要ピークのダイオード・アレイ（Ｄｉｏｄｅ ａｒｒ
ａｙ）検出（第６図の挿入部）は、ピークの肩に芳香族
アミノ酸内容物の夾雑を示した。主要ピークの中心部は
１１０℃で２５時間加水分解され、そしてベックマン６
３００アミノ酸分析器（Ｂｅｃｋｍａｎ６３００ Ａｍ
ｉｎｏ Ａｃｉｄ Ａｎａｌｙｓｅｒ）で分析された。
その結果は、第２表に示される。分析された量は２０pm
olesで、そして８．８μｇのウシＰＴＨ（１−３４）と
生物活性において等価であることがわかった。この精製
調製物の比活性はＰＴＨのそれよりも約２０倍大きいこ
とを示した。上記アミノ酸分析は、ＰＴＨｒＰが１５４
個のアミノ酸を含有することを示す。

【００５３】

【表２】

【００５４】実施例６ ＰＴＨｒＰペプチドのペプチド合成及びこれらのペプチ
ドに対する抗血清の調製 ＰＴＨｒＰのアミノ末端配列に対応して合成ペプチド
が、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｏｄｅ
ｌ ４３０Ａ自動ペプチド合成装置を用いてメリフィー
ルド法（４１）により合成された。合成ペプチドは無水
ＨＦを用いて担体樹脂から開裂され（４２）、６０％ア
セトニトリル及び０．１％トリフルオロ酢酸で抽出さ
れ、ロータリー エバポレートされ、さらに凍結乾燥さ
れた後、０−６０％アセトニトリルのグラージェント
（合計容量１０００ml）により低圧逆相カラム（２．５
×３０cm，Ａｍｉｃｏｎ Ｃ₁₈逆相、１５−１７μ２５
０Ａ ｐｏｒｅ ｓｉｚｅ）でクロマト処理された。精
製されたペプチドは凍結乾燥された。ペプチドの組成を
確認するためにアミノ酸分析が用いられた。カルボキシ
末端システインを介して大豆トリプシン インヒビター
に接合された合成ペプチドにより、ラビットが免疫感作
された。

【００５５】第１表における配列情報に基づき次のペプ
チド類似化合物が合成された：Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ
−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−
Ａｓｎ−Ｃｙｓ（〔Ｇｌｕ⁸ ，Ａｓｎ¹⁰，Ｃｙｓ¹¹〕Ｐ
ＴＨｒＰ（１−１１），Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌ
ｕ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ
−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ
（〔Ａｓｎ¹⁰〕ＰＴＨｒＰ（１−１６）），〔Ａｓ
ｎ¹⁰，Ｔｙｒ¹⁷〕ＰＴＨｒＰ（１−１７）、及びＰＴＨ
ｒＰ（１−３４）。該類似化合物〔Ｇｌｕ⁸ ，Ａｓ
ｎ¹⁰，Ｃｙｓ¹¹〕ＰＴＨｒＰ（１−１１）及び〔Ａｓｎ
¹⁰〕ＰＴＨｒＰ（１−１６）はアデニル酸シクラーゼ
アッセイ中で不活性であり、そしてＰＴＨそれ自体の又
はＢＥＮ細胞由来の条件化培地の活性に拮抗しなかっ
た。大豆トリプシンインヒビターに接合された〔Ｇｌｕ
⁸ ，Ａｓｎ¹⁰，Ｃｙｓ¹¹〕ＰＴＨｒＰ（１−１１）が、
ラビットを免疫感作するために使用され、そして抗血清
が調製され、これがラジオイムノアッセイで使用され
た。また、〔Ａｓｎ¹⁰〕ＰＴＨｒＰ（１−１６）に対す
る抗血清は同様な態様でラビットに生じた。

【００５６】実施例７ ＰＴＨｒＰに対して向けられた抗血清を用いるアッセイ ラジオイムノアッセイは、ラジオイムノアッセイのため
のトレーサーとしてＩ ¹²⁵ −ラベル化〔Ａｓｎ¹⁰，Ｔｙ
ｒ¹⁷〕ＰＴＨｒＰ（１−１７）を用いて実施され、そし
てラビット抗血清が、１／１０００の最終希釈物として
実施例５により調製された。最初のインキュベーション
は、０．１％ウシ血清アルブミンを含む０．０５Ｍリン
酸ナトリウム緩衝液（pH７．５）中で４℃で夜通し行わ
れた。遊離ペプチドからの結合ペプチドの分離は、固相
第二抗体（Ｓａｃ Ｃｅｌｌ−Ｗｅｌｌｃｏｍｅ，Ａｕ
ｓｔｒａｌｉａ）を用いて達成された。合成ペプチドの
ヨウ素化は、既にカルシトニンについて開示されている
ように（４４）、約１５０μｃｉ／μｇの比活性になる
ように実施された。

【００５７】第７Ａ図に示したように、上記アッセイは
ＰＴＨｒＰ（１−１１）及び（１−１６）を同等に認識
した。ｈＰＴＨ（１−１０）及びｈＰＴＨ（１−３４）
の交叉反応性は、それぞれ０．５及び０．３％であっ
た。ラットＰＴＨ（１−３４）、ウシＰＴＨ（１−３
４）及びヒトＰＴＨ（１−３４）の交叉反応性は、それ
ぞれ７％、５％及び０．４％であった（第７Ｂ図）。Ｐ
ＴＨｒＰは、ＰＴＨｒＰのエピトープに結合することが
できる抗体を用いる免疫アフィニティークロマトグラフ
ィーにより精製することができる。この技術において、
ＰＴＨｒＰに結合することができる抗体が担体マトリッ
クスに付着される。ＰＴＨｒＰ含有材料は、担体マトリ
ックスがクロマトグラフィーカラム中にある場合にはそ
れを通して濾過され、また別法としてバッチ的法を用い
るならば該マトリックスと混合される。上記材料中に存
在するすべてのＰＴＨｒＰが該マトリックスに結合し、
そしてそれはすべての夾雑物質を除去するため洗浄する
ことができる。その後、精製ＰＴＨｒＰは、抗体結合を
開裂する条件、例えば高いか又は低いpH条件を用いてマ
トリックスから溶出され得る。同様な技術がＰＴＨｒＰ
に結合することができる抗体を精製するために使用し得
る。これに関しては、実施される工程はＰＴＨｒＰが担
体マトリックスに付着されることを除いては、上記の概
要のものと同じである。

【００５８】第８図は、部分的に精製されたＰＴＨｒＰ
のＨＰＬＣ画分（即ち、ＳＰ−セファデックス クロマ
トグラフィー溶出物）へのラジオイムノアッセイの結果
を示す。部分的に精製されたＰＴＨｒＰ（３５μｇｈＰ
ＴＨに等価）は、Ｃ₁₈逆相監視（ｇｕａｒｄ）カラム
（ＲＰ３００，７μ０．３×４．０cm）によりクロマト
処理された。溶離は９０分以上１ml／min の流速で０−
６０％アセトニトリル／０．１％ＴＥＡのグラージェン
トにおいて実施された生物学的アッセイはあいている円
（○）を表わし、閉じた円（●）としてラジオイムノア
ッセイが表わされる。第８図は、生物学的活性及び免疫
学的活性の同時的溶出を示す。

【００５９】ＰＴＨｒＰ（１−３４）ペプチドは、ＵＭ
Ｒ１０６−０１細胞中のサイクリックＡＭＰ応答につい
てウシＰＴＨ（１−３４）に対してアッセイされ、そし
て等価な能力が存在することがわかった（第９Ａ図）。
同様に、ＵＭＲ１０６−０１細胞中のプラスミノーゲン
アクチベーター活性を増加する能力においてもウシＰ
ＴＨ（１−３４）に対して等価であった（第９Ｂ図）。
これは、本発明者らが報告してきたＰＴＨ応答系であ
り、そして十分に特徴付けられている（５２）。 ウエスターン ブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ）
分析

【００６０】実施例３のピークＡの２つのサンプル由来
のタンパク、実施例３のピークＢから誘導される高度に
精製したＰＴＨｒＰ、及び純粋なウシ副甲状腺ホルモン
がＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけられ、ニトロセルロースに移
され、１時間低界面活性剤“ブロット（Ｂｌｏｔｔ
ｏ）”でブロックされ、１：２００希釈における〔ＡＳ
Ｎ ¹⁰〕ＰＴＨｒＰ（１−１６）に対するラビット抗血清
とインキュベートされ（実施例５参照）、山羊抗−ラビ
ット血清の ¹²⁵ＩでラベルしたＦａｂ断片と１時間イン
キュベートし、そしてその後オートラジオグラフ処理さ
れた（第１０図）。

【００６１】予期されたように、高度に精製したＰＴＨ
ｒＰを含有したレーン４は、ＰＴＨｒＰの分子量と一致
する１８Ｋｄのバンドを示す。これに対して、実施例３
のピークＡ由来のタンパクを含有するレーン２及び３は
約２２Ｋｄのバンドを示す。このことは、ＰＴＨｒＰが
少なくとも２つの形態で存在し、両方とも同じ生物学的
な能力を有するが、分子量及び逆相ＨＰＬＣ上の溶離挙
動において相違することを強く示唆する。純粋なウシ副
甲状腺ホルモン（レーン１）は、これらの条件下ではい
かなるバンドも示さなかった。ＰＴＨｒＰに対して向け
られる抗体は、生物学的サンプル中に上記タンパクが存
在するか否かを検出するために使用され得る。

【００６２】該生物学的サンプルは固相担体、例えばニ
トロセルロース又はＰＶＣに結合され、そして抗−ＰＴ
ＨｒＰ抗体と反応され得る。抗体の結合性は、その後抗
体に付着する検出可能なラベルを用いることにより検出
され得るか、又はむしろ結合した抗体に対して特異的な
第２のラベルした試薬を用いることにより検出されるで
あろう。試薬としては、例えばプロテインＡ、又は抗−
Ｆａｂもしくは抗−Ｆｅ抗体が使用され得る。

【００６３】他方、抗−ＰＴＨｒＰ抗体が固相担体、例
えばＰＶＣプレート、ポリスチレンビーズ等に結合され
得るだろう。その後、アッセイされるための物質が上記
担体に添加され、そしてそれが抗体と結合することを可
能にするため十分な時間インキュベートされ、次いで結
合していない物質が洗浄除去される。その後、第２のラ
ベルしたＰＴＨｒＰ抗体が抗体結合性を検出するために
上記担体に加えられるであろう。第２の抗体がラベルさ
れていないなら、抗体結合性を検出するために改めてラ
ベルした試薬が該担体に加えられるだろう。容易に予期
され得るように、これらの手段は、ＰＴＨｒＰが少なく
とも２つのエピトープ、その１つは固相担体に結合した
抗体に結合するものであり、そして他は第２の抗体に結
合するもの、を含有すること想定している。

【００６４】好適な検出可能なラベルは、 ¹²⁵Ｉ、
³²Ｐ、 ³Ｈ、¹⁴Ｃ、ビチオン、アビジン、プロテイン
Ａ、コロイド状の金もしくは銀、ウレアーゼ、アルカリ
ホスファターゼ、ワサビ パーオキシダーゼ又はフィ
コビリプロテインを包含する。

【００６５】実施例７ 遺伝分析 ＰＴＨｒＰタンパクはＰＴＨに対し実質的に相同性を持
つため、それが特有の非対立遺伝子によってコードされ
たものか、又はＰＴＨ遺伝子それ自体の変異形であるか
を決定することが必要だと思われた。

【００６６】実験は、³²Ｐでラベルされた単一コピーＰ
ＴＨ遺伝子及びその３′フラッキング領域（ｆｌａｎｋ
ｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）に特異的なプローブ（４５）を
用いて実施された。ノザン（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ）ゲル分
析は、ＢＥＮ細胞に由来するか又は外科的に切除された
ヒト上皮小体腺腫から調製されるトラック（ｔｒａｃ
ｋ）当たり５mgのｐｏｌｙＡ⁺ ｍＲＮＡを用い、既に開
示されているように（４６）実施された。サザーン（Ｓ
ｏｕｔｈｅｒｎ）ゲル分析は、ＢＥＮ細胞に由来するか
又はヒト白血球から調製されるトラック当たり１０mgの
制限酵素消化されたゲノムＤＮＡを用い標準法（４７）
を改良したものである。ヒトＰＴＨプローブは、³²Ｐ−
ヌクレオチドにより１０⁸ dpm ／mg以上の比活性にまで
ランダムにプライムされた（２６）。ハイブリダイゼー
ション及び洗浄条件は開示されたところのものであった
（４６）。

【００６７】ｐｏｌｙＡ⁺ メッセンジャーＲＮＡのノザ
ン ゲル分析は、ＢＥＮ細胞が上皮小体腺腫組織に比し
検知可能なレベルにおいてＰＴＨ遺伝子を発現しなかっ
たことを示した（例示しなかった）。ＢＥＮ細胞に由来
するか又はヒト白血球に由来する制限酵素消化したゲノ
ムＤＮＡのサザーン ゲル分析は、同一のＰＴＨ−含有
制限断片、例えば４．２及び３．８ＫｂのＥｃｏＲＩ断
片を示した。従って、ＢＥＮは、非発現性ＰＴＨ遺伝
子、及び指示したタンパク配列を備えているＰＴＨｒＰ
の発現から推論すると、ＰＴＨ−関連遺伝子をコードす
る相同遺伝子の両方を含有する。

【００６８】実施例８ 様々な組織によるＰＴＨｒＰの産生 ＰＴＨｒＰ産生は腫瘍細胞に限られるとは思われない。
この点を明らかにするために羊の胎児、雌羊の組織及び
胎盤の抽出物に関連する実験が遂行された。抗−ＰＴＨ
抗血清又はＰＴＨ拮抗物質と前もってインキュベーショ
ンした後にアッセイを行うことによって、本発明者らは
生物活性が単独のＰＴＨもしくはＰＴＨｒＰに帰すべき
か、又はそれらの２つの混合物に帰すべきかを決定する
ことが出来た。

【００６９】羊の胎児上皮小体は５０％だけがＰＴＨに
より説明でき、残りはＰＴＨｒＰに帰する可能性がある
ところの生物活性を含有することがわかった。いくらか
のＰＴＨｒＰ（約２０％）は母性上皮小体中に見い出さ
れた。

【００７０】しかしながら、最も著しいことは胎盤に感
知しうる程度の活性を含むことが見い出され、そしてそ
らはＰＴＨｒＰとして完全に説明することができ、そし
てまたそれはＢＥＮ細胞培養物由来のＰＴＨｒＰと同じ
態様においてＨＰＬＣ上で挙動した。さらにまた、胎盤
中で検出できるＰＴＨｒＰの量は、上記上皮小体が胎児
から切除された雌羊由来の胎盤の中では減少されなかっ
た。このことは、胎盤がＰＴＨｒＰの重要な源泉であり
うることを示唆する。

【００７１】本発明者らは、悪性の液性過カルシウム血
症を有する患者の尿からＰＴＨｒＰを精製した（データ
は示されない）。これらの結果に基づけば、本発明の抗
体試薬を用いて血清、尿又は他の生物学的な流体中のＰ
ＴＨｒＰの存在が検出され得る。従って、本発明の抗体
試薬は悪性腫瘍の識別における診断薬として有用性を有
する。

【００７２】本発明の他の態様、それらに対する改良そ
してそれらに対する変形は、本明細書を読むことにより
当業者にとって明らかになるであろうし、そしてかかる
全ての他の態様、改良及び変形は本発明の態様の中に包
含されように考えられる。

【００７３】引用文献 １．Martin, T.J.及びAtkins, D.（1979）Essays in Me
d.Biochem.4, 49-82. ２．Mundy, G.R. 及びMartin, T.J.（1982）Metabolism
31.1274-1277. ３．Mundy, G.R., Ibbotson, K.J., D'Suoza, S.M., Si
mpson, E.L., Jacobs,J.w. 及びMartin, T.J.（1984）N
ew Eng.J.Med.310, 1718-1727. ４．Albright, F.（1941）New Eng.J.Med.225,789-196. ５．Berson, S.A.及びYalow, R.S. （1966）Science15
4, 907-909.

【００７４】６．Powell, D., Singer,F.R., Murray,
T.M., Mankin, C. 及びPotts, J.T.Jr.（1973）New En
g.J.Med.289,176-181. ７．Stewart, A.f., Horst, R., Deftos, L.J., Cadma
n, E.C., Lang,R. 及びBroadus, A.E. （1980）New En
g. J.Med. 303 ，1377-1383. ８．Simpson, E.L., Mundy,g.R., D'Souza, S.M., Ibbo
tson, K.J., Bockman,R. 及びJacobs, J.W.（1983）New
Eng.J.Med309,325-332. ９．Ibbotson, K.J., D'Souza, S.M.,Ng, K.W., Osborn
e, C.K., Niall, M.,Martin, T.J.及びMundy, G.R. （1
983）Science221,1292-1294.

【００７５】１０．Ibbotson, K.J., Harrod, J., Gowe
n, M.,D'Suoza, S., Smith, D.D.,Winkler, M.E., Dery
nck, R.及びMundy, G.R. （1986）Proc.Natl. Acad. Sc
i.USA83, 2228-2232. １１．Tashjian, A.J. Jr., Voelkel, E.F., Lazzaro,
M., Singer, F.R., Roberts, A.B., Derynck, R., Wink
ler, M.E．及びLevine, L.（1985）Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA82, 4535-4538. １２．Stewart, A.F., Insogna, K.L., Goltzman, D.及
びBroadus, A.E. （1983）Proc. Natl.Acad.Sci.USA80;
1454-1458.

【００７６】１３．Rodan, S.B., Insogna, K.L., Vign
ery, A.M.C., Stewart, A.F., Boradus, A.E., D'Souz
a,S.M., Bertolini, D.R., Mundy, G.R. 及びRodan, G.
A. （1983）J.Clin. Invest.72;1511-1515. １４．Strewler, G.J., Williams, R.D.及びNissenson,
R.A. （1983）J.Clin.Invest.71;769-774. １５．Merendino, J.J., Insogna, K.K., Milstone, L.
M., Broadus, A.E. 及びStewart, A.F. （1986）Scienc
e 231, 388-390.

【００７７】１６．Rosol, T.J., Capen, C.C., Weisbr
ode, S.E. 及びHorst, R.L.(1986)Lab. Invest. 54, 67
9-688. １７．Ellison, M., Woodhouse, D., Hillyard, C.J.,
Dowsett, M., Coombes, R.C., Gilby, E.D., Greenber
g, P.B.及びNeville, A.M.(1975) Br. J. Cancer32, 37
3-379. １８．Kohier et al., (1976) Eur.J.Immunol. 6, 11-1
9.

【００７８】１９．Kennet et al (1978) Current Topi
cs in Microbiology及びImmunology81, 77-91. ２０．T.J.Marin, P.M.Ingleton, J.C.E.Underwood, R.
A.Melick, V.P.Michelangeli及びN.H.Hunt. Parathyroi
d hormine responsive adenylate cyclase inan induce
d transplantable osteogenic sarcoma in the rat. Na
ture 260, 436-438 (1976).

【００７９】２１．D.Atkins, N.H.Hunt, P.M.Ingleton
and T.J.Martin. Rat osteogenicsarcoma cells:isola
tion 及びeffects of hormones on the production of
cyclic AMP 及びcyclic GMP. Endocrinology, 101, 555
-561, (1977). ２２．D.Atkins and T.J.Martin. Rat osteogenic sarc
oma cells:Effects ofsome prostaglandins, their met
abolites 及びanalogues on cyclic AMP production. P
rostaglandins, 13, 861-871 (1977).

【００８０】２３．A.Crawford, N.H.Hunt, J.K.Dawbor
n, V.P.Michelangeli 及びT.J.Martin. Membranes form
a transplantable osteogenic sarcoma responsive to
parathyroid hormone及びprostaglandins:regulation
及びadenylate cyclase 及びthe hormone metabolism.
J.Endocr., 77, 213, 224, (1978) . ２４．A.Crawford, D.Atkins and T.J.Martin. Rat Ost
eogenic sarcoma cells:Comparison of the effects of
prostaglandins E₁, E₂, I₂ (prostacyclin),6 keto F
₁α、及びthromboxane B₂ on cyclie AMP production
及びadenylatecyclase activity. Biochem. Biophys. R
es. Comm., 28, 1195-1201, (1978).

【００８１】２５．Martin, P.M., Ingleton, L.A., Co
ulton 及びR.A.Melick, Metabolicproperties of hormo
nally responsive osteogenic sarcoma cells. Clin. O
rthop. Rel. Res., 140, 247-254, (1979). ２６．D.Atkins, P.C.Waller及びT.J.Martin. Rat oste
ogenic sarcoma cells:Modulation of hormone stimula
ted cyclic AMP production by prostaglandinantagoni
sts及びbiosynthesis inhibitors. Clin. Exp. Pharm
、及びPhys., 7,31-44 (1980)

【００８２】２７．N.C.Partridge, D.Alcorn, V.P.Mic
helangeli, B.E.Kemp, G.B.Ryan 及びT.J.Martin. Func
tional properties of hormonal responsive cultured
normal及びmalignant rat osteoblastic cells. Endocr
inology, 108, 213-219 (1981). ２８．N.C.Partridge, B.E.Kemp, M.C.Veroni 及びT.J.
Martin. Activation of cyclie AMP-dependent protein
kinase in normal and malignant bone cellsby parat
hyroid hormone, prostaglandin E₂ 及びprostacyclin.
Endocrinology, 108, 220-226 (1981).

【００８３】２９．N.C.Partridge, R.J.Frampton, J.
A.Eisman, V.P.Michelangeli, E.Elms., T.R.Bradley
及びT.J.Martin. Receptors for 1,25(OH)₂ vitamin D₃
enriched in cloned osteoblast-like rat osteogenic
sarcoma cells. FEBS Letters, 115, 139-142 (1980). ３０．N.C.Partridge, B.E.Kemp, S.A.Livesey及びT.J.
Martin. Activity ratio measurements reflect intrac
ellular activation of cyclic AMP-dependentprotein
kinase in osteoblasts. Endocrinology, 111, 178-183
(1982).

【００８４】３１．S.A.Livesey, B.E.Kemp, C.A.Re,
N.C.Partridge 、及びT.J.Martin.Selective hormonal
activation of cyclic AMP-dependent protein kinase
isoenzymes in normal及びmalignant osteoblasts.J.Bi
ol.Chem., 257, 14983-14988 (1982). ３２．N.C.Partridge, D.Alcorn, V.P.Michelangeli,
G.Ryan 及びT.J.Martin.Morphological及びbiochemical
characterization of four clonal osteogenicsarcoma
cell lines of rat origin.Cancer Res.43, 4308-431
4, (1983).

【００８５】３３．J.A.Hamilton, S.R.Lingelbach, N.
C.Partridge 及びT.J.Martin.Stimulation of plasmino
gen activator in osteoblast-like cells by bone-res
orbing hormones.Biochem.Biophys.Res.Comm., 122, 23
0-236 (1984). ３４．S.M.Forrest, K.W.Ng, D.M.Findlay, V.P.Michel
angeli, S.A.Livesey,N.C.Partridge, J.D.Zajac及びT.
J.Martin.Characterization of an osteoblast-like cl
onal line which responds to both parathyroid hormo
ne及びcalcitonin.Calc.Tiss.Int.37, 51-56 (1985).

【００８６】３５．M.Kubota, K.W.Ng及びT.J.Martin.E
ffect of 1, 25-dihydroxyvitaminD₃ on cyclic AMP re
sponses to hormones in clonal osteogenic sarcoma c
ells.Biochem.J., 231, 11-17 (1985). ３６．N.C.Partridge, A.L.Opie, R.T.Opie 及びT.J.Ma
rtin.Inhibitory effects of parathyroid hormone on
growth of osteogenic sarcoma cells.Calc.Tiss.Int.,
37, 519-525 (1985). ３７．K.W.Ng, S.A.Livesey, F.Collier, P.Gummer及び
T.J.Martin.Effect ofretinoids on the growth, ultra
structure of cytoskeletal structures of malignant
osteoblasts.Cancer Res.45, 5106-5113 (1985).

【００８７】３８．S.A.Livesey, K.W.Ng.G.Collier,
M.Kubota, A.L.Steiner及びT.J.Martin.Effect of reto
noic acid on cellular content及びPTH activation of
cyclic AMP-dependent protein kinase isoenzymes in
clonal osteogenic sarcomacells.Cancer Res.45, 573
4-5741 (1985). ３９．J.A.Hamilton, S.R.Lingelbach, N.C.Partridge
、及びT.J.Martin.Hormone regulation of plasminoge
n activator production by bone-resorbing hormones
in normal及びmalignant osteoblasts.Endocrinology,
116, 2186-2191(1985).

【００８８】４０．M.Kubota, K.W.Ng, J.Murase, T.No
da, J.M.Moseley and T.J.Martin.Efficacy 及びspecif
icity of human parathyroid hormone analogues as an
tagonists in intact clonal osteogenic sarcoma cell
s.J.Endocrinol.108, 261-265 (1986). ４１．Hodges, R.S.及びMerrifield, R.B. (1975) Ana
l.Biochem.65, 241-272. ４２．Stewart, J.M. 及びYoung, J.P. (1966) Solid P
hase Peptide Synthesis pp.44; 66, Freeman, San Fra
ncisco.

【００８９】４３．Carlsson, j., Drevin, H.及びAxe
n, R. (1978) Biochem.J.173, 723-737. ４４．Findlay, D.M., DeLuise, J.Michelangeli, V.
P., Ellison, M. 及びMartin, T.J. (1980) Cancer Re
s.40, 1311-1317 ４５．Vasicek, T.J., McDevitt, B.E., Freeman, M.
W., Fennick, B.J., Hendy, G.N., Potts, J.T.Jr., Ri
ch, A.及びKronenberg, H.M. (1983) Proc.Natl.Acad.S
ci.USA 80, 2127-2131. ４６．Zajac, J.D., Martin, T.J., Hudson, P., Nial
l, H.D.及びJacobs, J.W. (1985) Endocrinology 116,
749-755.

【００９０】４７．Reed, K.C.及びMann, D.A.(1985) N
ucleic Acids Res.13, 7207-7221. ４８．Weeks, D.R., Beerman, N.及びGriffiths, O.M.
(1986) Anal.Biochem.152, 376-385. ４９．Hudson, P., Haley, J., John, M.Cronk M., Cra
wford, R., Haralambidis, J., Tregear, G.W., Shine,
J. 及びNiall, H.D. (1983) Nature 301, 628-631. ５０．Yalow, R. 及びBerson, S.A. (1959) Nature (Lo
nd.), 184, 1648-1650. ５１．Towbin, H., Stackelin, T. 及びGordon, J. (19
79) Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 76, 4350-4354. ５２．Allan, E.H., Hamilton, J.A., Medcalf, R.L.,
Kubota, M.及びMartin, T.J. (1986) Biochim, Biophy
s.Acta., 888, 199-207.

【００９１】５３．Schold, M., Colombero, D., Reye
s, A.及びWallace, B. (1984) DNA,Vol.3, 6, 469-477. ５４．Rabbani, S.A.Mitchell, J., Roy, D.A., Krame
r, R., Bennett, H.P.J. 及びSoltryman, D. (1985) En
docrinology 118, 1200-1209. ５５．Stewart, A.F., Insogna, K.L., Soltryman, D.
及びBroadus, A.E. (1983) Proc. Natl.Acad.Sci.USA,
80, 1454-1458. ５６．Bradford, M. (1976) Anal.Biochem.72, 248-25
4.

【００９２】５７．Wettenhall, R.E.H., Kudlicki,
W., Kramer, G.及びHardeshy, B. (1986) J.Biol.Chem.
261, 12444-12447. ５８．IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical No
menclature, (1985) J.Biol.Chem.260, 14-42. ５９．National Biochemical Research Foundation, Ge
orgetown UniversityMedical Center, 3900, Reservoir
Rd, N.W., Washington, D.C.20007.

【図面の簡単な説明】

【図１】ＰＴＨｒＰの最終精製工程における、２１５nm
での吸収及び生物学的活性のＨＰＬＣ挙動性を示す。

【図２】図２の画分３１，３２及び３３のＳＤＳポリア
クリルアミドゲルを示す。

【図３】損なわれていないＵＭＲ１０６細胞においてウ
シＰＴＨ（１−３４）に対してアッセイされた画分３１
の生化学的活性のプロットを示す。

【図４】ＳＰセファデックスカラムクロマトグラフィー
により処理された精製ＰＴＨｒＰのＨＰＬＣ挙動性を示
す。

【図５】トリプシンによる消化後のＰＴＨｒＰのＨＰＬ
Ｃ挙動性を示す。

【図６】ブラウンリーＣ８（２．１nm）マイクロポアー
カラム上でクロマト処理された図４の画分４６及び４８
を染めた物質を示す。

【図７】ラベルされたペプチド及びＩ¹²⁵ でラベルされ
た〔Ａｓｎ¹⁰，Ｔｙｒ¹⁷〕ＰＴＨｒＰ（１−１７）及び
合成ＰＴＨｒＰ（１−１７）ペプチドに対するラビット
抗血清を用いてのラジオイムノアッセイを示す。

【図８】ＳＰ−セファデックス部分精製ＰＴＨｒＰのＨ
ＰＬＣに由来する画分の生物学的なアッセイ及びラジオ
イムノアッセイの比較を示す。

【図９】ＵＭＲ １０６−０１細胞における増加するサ
イクリックＡＭＰ産生についての合成ＰＴＨｒＰ（１−
３４）の生物学的活性を、標準としてのウシＰＴＨ（１
−３４）と比較して示す。

【図１０】種々のサンプルのウェスターンブロット分析
を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ケンプ，ブルース アーネスト オーストラリア国，ビクトリア，3101, キュー，ケレット グローブ 20 (72)発明者 ウェッテンホール，リチャード エドワ ード ヒュー オーストラリア国，ビクトリア，キャン バーウェル 3124，ロイヤル クレスト 23

Claims (8)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ＰＴＨｒＰの生物学的活性又は免疫原性
   をもつポリペプチドに対する抗体であって、そのポリペ
   プチドが以下の： （ａ）以下の特徴： （ｉ）配列ＡＶＳＥＨＱＬＬＨＤＫＧＫＳＩＱＤＬＲＲ
   ＲＦＦＬＨＨＬＩＡＥＩＨＴＡをもつＮ−末端アミノ
   酸； （ii）還元及び非還元条件下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより
   測定されるとき、１５〜２５キロダルトンの間の分子
   量；及び （iii)アデニレート・シクラーゼ応答検定において測定
   されるとき、タンパク質１mg当り、副甲状腺ホルモンの
   アミノ酸番号１〜３４から成るペプチドの少なくとも約
   ６mgに相当する、比生物学的活性、 をもつ実質的に純粋なＰＴＨｒＰ；並びに （ｂ）少なくともアミノ酸番号１〜１１を含んで成るＰ
   ＴＨｒＰの断片、 から成る群から選ばれることを特徴とする抗体。
2. 【請求項２】 請求項１に記載の抗体において、（ｂ）
   少なくともアミノ酸番号１〜１１を含んで成るＰＴＨｒ
   Ｐの断片が、（ｂ）少なくともアミノ酸番号１〜３４を
   含んで成るＰＴＨｒＰの断片である、ことを特徴とする
   抗体。
3. 【請求項３】 １以上の検出可能なマーカーによりラベ
   ルされた、請求項１又は２に記載の抗体。
4. 【請求項４】 ＰＴＨｒＰ又はその断片の検出のための
   キットであって、１以上の、ＰＴＨｒＰの生物学的活性
   又は免疫原性をもつポリペプチドに対する抗体であっ
   て、そのポリペプチドが以下の： （ａ）以下の特徴： （ｉ）配列ＡＶＳＥＨＱＬＬＨＤＫＧＫＳＩＱＤＬＲＲ
   ＲＦＦＬＨＨＬＩＡＥＩＨＴＡをもつＮ−末端アミノ
   酸； （ii）還元及び非還元条件下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより
   測定されるとき、１５〜２５キロダルトンの間の分子
   量；及び （iii)アデニレート・シクラーゼ応答検定において測定
   されるとき、タンパク質１mg当り、副甲状腺ホルモンの
   アミノ酸番号１〜３４から成るペプチドの少なくとも約
   ６mgに相当する、比生物学的活性、 をもつ実質的に純粋なＰＴＨｒＰ；並びに （ｂ）少なくともアミノ酸番号１〜１１を含んで成るＰ
   ＴＨｒＰの断片、 から成る群から選ばれることを特徴とする抗体を含んで
   成るキット。
5. 【請求項５】 請求項４に記載のキットにおいて、
   （ｂ）少なくともアミノ酸番号１〜１１を含んで成るＰ
   ＴＨｒＰの断片が、（ｂ）少なくともアミノ酸番号１〜
   ３４を含んで成るＰＴＨｒＰの断片である、ことを特徴
   とするキット。
6. 【請求項６】 １以上の抗体が、１以上の検出可能なマ
   ーカーによりラベルされたことを特徴とする、請求項４
   又は５に記載のキット。
7. 【請求項７】 ＰＴＨｒＰ又はそのペプチド断片への結
   合を検出するための１以上の試薬をさらに含むことを特
   徴とする、請求項４〜６のいずれか１項に記載のキッ
   ト。
8. 【請求項８】 さらに、以下の、 （ｉ）その上で、ＰＴＨｒＰ結合を検出するための検定
   が行われることができる、支持体マトリックス；及び／
   又は （ii）試薬の希釈のための１以上のバッファー又は他の
   好適な溶液、 をさらに含むことを特徴とする、請求項４〜７のいずれ
   か１項に記載のキット。