JP2598801B2

JP2598801B2 - 悪性‐ＰＴＨｒＰの液性過カルシウム血症において活性なタンパク

Info

Publication number: JP2598801B2
Application number: JP62503674A
Authority: JP
Inventors: ジョンマルティン，トマス; マリーズモゼリー，ジェイン; アーネストケンプ，ブルース; エドワードヒューウェッテンホール，リチャード
Original assignee: University of Melbourne
Current assignee: University of Melbourne
Priority date: 1986-07-18
Filing date: 1987-06-04
Publication date: 1997-04-09
Anticipated expiration: 2012-04-09
Also published as: US5116952A; US5703207A; DE3751997D1; JPH08211053A; US5872221A; DE3751997T2; CA1341030C; EP0273928B1; JP2657053B2; EP0273928A4; US5460978A; JPH09216899A; JP2807660B2; JPH01501148A; EP0273928A1; WO1988000596A1

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、以後PTHrP（副甲状腺ホルモンに関連した
ホルモン）、ACSF（アデニル酸シクラーゼ刺激因子）、
又はBRF（骨放出因子）と称される悪性の液性過カルシ
ウム血症において活性なタンパクに関する。

さらに本発明は、ACSFのペプチド断片、並びにPTHrP
の精製及びPTHrPの部分的配列決定に関する。さらにま
た本発明は、PTHrP又はそれらの断片について向けられ
る抗体及びPTHrPの同定に有用な該抗体を含有するキッ
トに関する。〔注：ここに記載される引用文献は、本明
細書の最後に全部示される。〕悪性の液性過カルシウム血症（HHM）は、一定の癌、
特徴的には肺の扁平細胞癌に非常に一般的な併発症があ
り、それにより罹病率及び死亡率に本質的に寄与する
（1,2）。癌が誘導する液性因子は、腎による骨吸収を
促進しそしてカルシウム排出を制限することによって血
中のカルシウムレベルを高め得る（１−３）。これら
の癌による“異所性（ectopic）”産生の副甲状腺ホル
モン（PTH）が上記HHM症候群を惹起すると多年にわたり
考えられていた（4,5）にもかかわらず、形質転換成長
因子（TGF′Ｓ）を含むPTH以外の因子が原因であること
が明らかになってきた（１−3,6−８）。そして該因子
は骨吸収を促進する能力がある（2,3,9−11）。また、P
THから免疫学的に別個ないくつかの因子の特定は癌によ
る産生についても証拠があるが、その因子は直接的にPT
Hレセプター又は密接に関連する膜構成要素に作用する
ことによって、PTH標的細胞（腎及び骨）中でアデニル
酸シクラーゼを刺激する点ではPTHに似ている。かかる
可能性は、臨床的知見に基づき予想され、そしてさらに
HHMを有する患者由来の抽出物中に（12,13）、腎皮質性
癌由来の条件化培地中に（14）、そしてHHMモデル動物
由来の腫瘍抽出物と条件化培地培養物中で（15,16）そ
の活性が記録されている。

初めは、気管支の扁平細胞癌を有する過カルシウム血
症患者から樹立されたBEN細胞系（17）が、先に記載し
たPTHrPのような、感知できる量の上記PTH様活性を示す
ことを本発明者らは見い出した。

本発明者らは、ここにPTHrPの精製及びPTHrPの特徴付
けに成功した。

従って、本発明の態様の１つは、後に特定されるよう
な実質的に純粋なPTHrPを提供するにある。

従って、本発明の次なる態様は、PTHrP活性を具備す
るPTHrPの断片又はPTHrPのサブ−ユニットを抵抗するに
ある。

PTHrPの単離及び精製は、悪性の液性過カルシウム血
症におけるその役割を特徴付けるために行われる研究を
可能にするであろう。

PTHrP又はそれらのペプチド断片は、本技術分野にお
けるそれ自体公知の方法によって、モノクローナル及び
ポリクローナル双方の抗体試薬を産生するために使用し
得る。例えば、PTHrPもしくはそれらのペプチド断片単
独で又はアジュバント及び／もしくは担体タンパク質の
存在下で適当な免疫感作をすることにより、抗体試薬が
調製され得る。適切な宿主の例としては、マウス、ラッ
ト、ラビット、羊、馬、山羊及び牛を包含する。モノク
ローナル抗体試薬が調製される場合、一般に用いられる
技術はKohler等（18）及びKennet等（19）により提示さ
れた手法に従っている。

PTHrPに対して向けられる抗体試薬は、例えば全血
液、血清、又は他の生物学的流体中のPTHrP活性を検出
するためのアッセイにおいて利用され得る。特に、かか
る試薬は、PTH自体が原因となることが考えられる癌、
慢性腎不全及び他の骨疾患を有する患者の調査及び診断
において相当な有用性があるであろう。

PTHrP及びそれらのペプチド断片に対して産生された
抗体は、またさらに、免疫組織化学的な診断薬として有
用であり、そして種々の組織中でPTHrPを産生しうる細
胞の免疫的位置決定（immunolocalisation）のために有
用である。

診断の目的のための抗体試薬は、検出しうるマーカ
ー、例えば；ローダミン、フルオレセイン、コロイド状
の金、ワサビパーオキシダーゼ、β−ガラクトシダー
ゼ、ウレアーゼ、アルカリフォスファターゼ、フィコ
ビリプロテイン（phycobiliproteins）、ルシフェラー
ゼ、フェリチン、¹²⁵I、³²P、³H又は¹⁴Cで適当に標識付
けされたPTHrPに対して向られる抗体を含んでなること
ができる。

本発明者らは、PTHrPの合成ペプチドに対する抗体を
調製した。これらの抗体は、例えば放射線イムノアッセ
イ（50）又はウェスターン法（51）により、PTHrP又は
それらの断片を見い出すために使用し得る。試験管内
（in vitro）培養細胞又は生体内（in vivo）腫瘍によ
って産生されるPTHrPは、PTHrPに対して向けられるこれ
らの抗体又は他の抗体試薬を用いて検出され得る。

本発明のさらなる態様によれば、PTHrP及びそれらの
断片に対して向けられる抗体試薬が提供される。

本発明のさらに次なる態様によれば、PTHrPのエピト
ープに結合することが出来る１以上の抗体試薬を含んで
なるPTHrP又はそれらの断片を検出するためのキットが
提供される。

本発明によって提供されるキットは、例えば上記に記
載したようなフルオレセイン、放射性活性、又はタンパ
ク性標識でラベルされたPTHrPに対して向けられる抗体
を含有してもよい。また、キットは１以上のラベルした
第二又は第三の抗体を含有してもよい。付言すれば、キ
ットは試薬を希釈するための緩衝液、そしてアッセイを
実施するための皿又はトレイのような種々の支持材を含
有してもよい。PTHrP又はそれらの断片に対して向けら
れる抗体は、凍結乾燥し、そして、即ち適当な水溶液中
での懸濁のために適した粉末状態であってもよい。他
方、該抗体は、貯蔵のために適切な水溶液の中に存在し
てもよい。

さらに本発明の態様によれば、PTHrPのエピトープに
結合し得る抗体試薬とサンプルを接触するか、又は該試
薬と担体上に固定化されたサンプル中のタンパクと接触
し、そしてその後抗体結合性の有無を検出することを含
んでなる、所与のタンパク含有サンプル中のPTHrP又は
それらの断片を検出するための方法が提供される。

本発明の別の態様によれば、PTHrPのエプトープに結
合し得る抗体を担体上に結合されたものとサンプルとを
抗体が結合することを許容するために十分な時間を通し
てインキュベーションし、そしてその後PTHrPのエプト
ープと結合し得る抗体試薬と結合したPTHrPの存否を検
出することを含んでなる、所与のサンプル中のPTHrP又
はそれらの断片を検出するための方法が提供される。

PTHrPの精製及びそれらのＮ−末端アミノ酸配列の決
定は、PTHrPのアミノ酸配列に対応して合成オリゴヌク
レオチドを製造することを可能にするだろう。次に、こ
れらのオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション
プローブとして使用でき、即ちPTHrPをコードする遺
伝子又は遺伝子類の単離を容易にする。また、かかるオ
リゴヌクレオチドは診断試薬としても使用でき、またさ
らにPTHrPをコードするmRNAの発現の検出、及びPTHrPを
コードする遺伝子又は遺伝子類の発現の制御の研究にお
いて使用され得る。

ヒト腫瘍系BENによって産生されるPTHrPは２つの形態
で存在し、まったく同一の生物学的活性を有している
が、免疫交叉反応性、分子量及びHPLCによる溶出挙動に
基づき識別し得る。PTHrPのこれらの形態のどちらのも
のも本発明の態様の範囲内にある。

さらに本発明の態様によれば、PTHrPはBEN細胞が培養
された培養物から得られる。さらに具体的に、PTHrPの
精製のための１の方法は次の工程：（ａ）培地中でBEN細胞を培養する；（ｂ）培養物を陽イオン交換樹脂にかける；（ｃ）上記陽イオン交換樹脂から溶出分画する；（ｄ）溶出された画分をPTHrP活性についてアッセイ
する；（ｅ）それらのPTHrP活性を有する画分について逆相
高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）を実施し、そし
てその後実質的に純粋なPTHrPを単離する、を含んでなる。

単に例示のために添付する図面を引用して、ここに本
発明のより詳細に記載する。そしてその内容は：第１図は、PTHrPの最終精製工程における、215nmにお
ける吸収及び生物学的活性のHPLC挙動を示す；Ａ Vydac HPLC由来のピークＢ物質を集めた220μｇがC
₁₈ベイカーボンド（Bakerbond）カラム（25×0.496cm）
にかけられた。溶離は１分当たり0.66％の比率における
０−60％アセトニトリル/0.1％TFAのグラージェントを
用いて実施された。画分は215nmにおいて観察されるタ
ンパクピークに従って集められた。アデニル酸シクラー
ゼ活性は、各々の画分から10μ分取したものでアッセ
イされそして画分容量に対して数値が調製された。

Ｂ実験Ａ（画分51−55）から集められた６μg hPTH
（１−34）同等物が、上記実験Ａのカラムに再びかけら
れそして１分当たり0.33％の比率における０−68％アセ
トニトリル/0.9％TFAのグラージェントで溶離された。

第２図は、第１図の画分31,32及び33のSDSポリアクリ
ルアミドゲルを示す；第３図は、インタクト（intact）UMR106細胞において
ウシPTH（１−34）に対してアッセイされた（○）第１
図の画分31の生化学的活性のプロット（●）を示す；第４図は、SPセファデックスカラムクロマトグラフ
ィー、及び２回のBakerbondクロマトグラフィー工程の
後に得られた逆相HPLCカラム（Bakerbond C18widepore2
5×0.46cm）４でクロマト処理された精製PTHrPのHPLC挙
動を示す。挿入は画分47のSPSPAGE銀染色法（silver−s
tain）ゲル挙動及び分子量標準を示す。

第５図は、トリプシンによる消化後のPTHrP（100pMol
es）のHPLC挙動を示す。トリプシン消化物は、C8Brownl
eeカートリッジ、10cm×2.1mm、流速250μ／分．及び
0.1％TFA中の０−50％アセトニトリルのグラージェント
（１％／分）が用いられクロマト処理された。

第６図は、ブラウンリー（Brownlee）C8（2.1mm）マ
イクロボアー（microbore）カラム上でクロマト処理さ
れた第４図の画分46及び48を集めた物質を示す。挿入
は、主要ピークのダイオードアレー（diode array）
検出を示す。

第７図は、トレーサーとして種々のラベルしていない
ペプチド及びI¹²⁵でラベルした〔Asn¹⁰,Try¹⁷〕PTHrP
（１−17）及び合成PTHrP（１−17）ペプチドに対する
ラビット抗血清を用いるラジオイムノアッセイを示す。
結合したペプチド／遊離ペプチドがペプチド/mlの量に
対してプロットされた。

Ａラベルされていないペプチドは：〔Glu⁸,Asn¹⁰,Cys¹¹〕PTHrP（１−11）（○）,hPTH（１
−34）（■）、ラットカルシトニン遺伝子関連ペプチ
ド（CGRP）、ヒト副腎皮質刺激ホルモン及びウシイン
シュリン（全て、10μg/ml,△）、サケカルシトニン
（10μg/ml,▲）であった。

Ｂラベルされていないペプチドは：〔Glu⁸,Asn¹⁰,Cys
¹¹〕PTHrP（１−11）（○），ラットPTH（１−34）
（□）、ウシPTH（１−34）（■），ヒトPTH（１−34）
（●），ラットCGR（10μg/ml,△）、サケカルシトニ
ン（10μg/ml,▲）。

第８図は、SP−セファデックス部分精製PTHrPのHPLC
に由来する画分の生物学的なアッセイ及びラジオイムノ
アッセイの比較を示す。

第９図は：Ａ UMR106−01細胞における増加するサイクリックAMP
産生についての合成PTHrP（１−34）の生物学的活性
（●）を、標準としてのウシPTH（１−34）（○）と比
較して示す。

Ｂ ¹²⁵I−フィブリン上で培養されたUMR106−01細胞に
おけるプラスミノーゲンアクチベーター活性に対する
合成PTHrP（１−34）の効果（●）及びウシPTH（１−3
4）の効果（○）を示す。このアッセイは既にAllanらに
記載された方法により実施された（52）。

第10図は、実施例３のピークＡの２つのサンプル（A1
及びA2,レーン２及び３）、高度に精製したウシ副甲状
腺ホルモン（レーン１）、及び高度に精製した実施例３
のピークＢから誘導されたPTHrP（レーン４）のウェス
ターンブロト分析を示す。サンプルはSDS−PAGEで分
離され、ニトロセルロースに移され;PTHrP（１−16）に
対して生じるラビット抗血清によりプローブし；洗浄し
そして山羊の抗−ラビットIgG1の¹²⁵I−ラベルしたFab
断片とインキュベートし、そしてアートラジオグラフ化
した。分子量標準は水平線で示される。

定義： “PTHrP"とは、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳
動により測定される場合に、15,000〜25,000ダルトンの
分子量を有し、そして副甲状腺ホルモンと同様の態様
で、適当な標的細胞（例えば、UMR106−01細胞）中でア
デニル酸シクラーゼ活性を刺激する活性を有する悪性の
液性過カルシウム血症において活性なタンパクを称す
る。

既に記載したように、BEN細胞から精製されるPTHrPは
多型性でありそして実質的に同一の生物学的活性を有す
る２つの識別されうる産生物として存在する。これらの
産生物の１つは、SDS−PAGEにより測定される場合に15
−18K間の分子量を有し、そしてＮ−末端配列は第１表
に示される。別の産生物は、18K−25K間の分子量を有す
る。この第２の産生物は第１に記載した産生物のPTHrP
に対して産生される抗血清と交叉反応する。PTHrPの両
産生物とも本発明の態様に含まれそして“PTHrP"の語に
より包含される。

さらに、PTHrP活性を有するPTHrPの対立遺伝子的変形
体（Variants）も本発明の態様内のものでありそしてま
たさらに“PTHrP"の語により包含される。このような変
形体は、PTHrPの配列に対するアミノ酸（類）の削除、
置換又は付加により提供され、そしてこれらは第１表に
示される（一部）。第１表により示されるようなもとも
と存在するアミノ酸が削除されそして／もしくは他のア
ミノ酸に置換されるか、又は本来的な配列のPTHrPに対
しさらにアミノ酸が加えられる場合の変形体は、通常の
タンパク合成技術（41）又は組換えDNA技術（53）によ
って調製され得る。これらの変種でPTHrP活性を具備す
るものは本発明の態様内のものであり、そしてまた“PT
HrP"の語により包含される。

PTHrPに関連して使用される場合の“実質的に純粋”
とは、PTHrPと通常会合しているタンパク性の又は他の
汚染物質が実質的に存在しない場合のPTHrPを意味す
る；一般にSDS−PAGE上で単一バンドを生じせしめ；そ
して全タンパクの一般に約95重量％−100重量％、通常
約97重量％がPTHrPである場合をいう。本発明の実施に
従う“PTHrP"は、先行技術文献に記載されたようなPTH
様の活性を有する物質の粗製の特徴付けられていない生
産物から識別出来る。先行技術文献の生産物（54及び5
5）は、多数のタンパクから成り、活性因子はタンパク
及び他の物質の合計量に比べて非常に少量である。これ
らの生産物は、タンパク配列分析又はPTHrPに対して特
異的な抗体の調製のためには適していなかった。

本明細書の“サブユニット（sub−unit）”又は“断
片”の語は、PTHrPに特有であるところのPTHrPタンパク
の一部を意味するために用いらるる。予想されるよう
に、これは単一のアミノ酸を特に除去する。一般に、長
さとして５個以下のアミノ酸のペプチドは特異的なもの
にはならないだろう。

“エピトープ”とは免疫応答を引き出すことができる
PTHrP又はそれらの断片もしくはサブユニットの任意の
抗原部位を意味する。

略語： HPLC 高性能液体クロマトグラフィー SDS−PAGE ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルア
ミドゲル電気泳動 PTH 副甲状腺ホルモン hPTH ヒト副甲状腺ホルモン PTHrP（１−11）第１表のアミノ酸１から11に対応す
るPTHrPの合成ペプチド PTHrP（１−16）第１表のアミノ酸１から16に対応す
るPTHrPの合成ペプチド PTHrP（１−17）第１表のアミノ酸１から17に対応す
るPTHrPの合成ペプチド PTHrP（１−34）第２表のアミノ酸１から34に対応す
るPTHrPの合成ペプチド CGRP ラットカルシトシン遺伝子関連ペプチド TFA トリフルオロ酢酸実施例１ PTHrP活性に対する生物学的なアッセイ生物学的アッセイは、PTHに応答して、骨芽細胞様の
細胞、例えば広範囲な種々のUMR106−01細胞系（20−4
0）におけるサイクリックAMPの量依存性産生を利用す
る。上記アッセイが実施し得る種々の方法は骨芽細胞様
の細胞の膜ホモジネート中のアデニル酸シクラーゼの直
接的な測定、そして無処理（intact）細胞によって産生
さるサイクリックAMPのアッセイを包含するものであ
る。簡単に、都合よくそして非常に多量のサンプルの迅
速なアッセイを可能にするために、本発明者らは、12−
ウェルプラスチック皿中でUMR106−06細胞をレプリカ培
養として増殖せしめ、³H−アデニンと共に２時間にわた
り前−インキュベーションすることにより細胞ATPプー
ルを³Hによりラベルし、細胞を短時間洗浄し、次にホス
ホジエステラーゼインヒビターとして1mMイソブチル
メチルキサンチンを添加することにより応答を測定し
た。10分間後に反応を止めそしてDowex（登録商標）及
び中性アルミナ上での連続的なクロマトグラフィーによ
り培養物から³H−サイクリックAMPを精製した。上記細
胞は、サイクリックAMP産生において投与量依存性増加
を伴って、PTHそしてＥシリーズのプロスタグランジン
（主にPGE₂）に対して応答する。これはPTH又はPTH様活
性についての簡単な再現性ある生物学的なアッセイに改
良されている（34,40）。この系において、PTH（40）の
拮抗ペプチド又は合成ヒトPTH（１−34）（40）に対し
て産生したPTHに対する他の抗血清と共にサンプルを事
前にインキュベートすることによりPTHに対する応答は
抑制されたが、PGE₂に対してはそうでなかった。

実施例２ BEN細胞によって誘導されるPTHrP活性実施例１に記載された生物学的アッセイによりBEN細
胞培養液が直接アッセイされた場合に、それはサイクリ
ックAMP産生を刺激する能力を示す。活性は培地の連続
的な希釈物、しばしばほぼ1:100の希釈物中で測定でき
る。粗培養液の希釈物はPTHにより誘導されるそれと平
行して活性を刺激し；山羊抗−ヒトPTH（１−34）と培
地との事前のインキュベーションは、PTHPrPに対してい
かなる効果ももたらさないが、同じ抗血清はhPTH（１−
34）それ自体（40）の活性を完全に不活化する。合成ペ
プチド、〔³⁴Tyr〕hPTH（３−34）アミド及び〔³⁴Tyr〕
hPTH（５−34）アミドは、上記UMR106−01細胞中のPTHr
P及びhPTH（１−34）に対するサイクリックAMP応答をそ
れぞれ抑制するが、これらの拮抗剤は同じ細胞中のPGE₂
に対する応答についてなんらの効果ももたない（40）。

BEN細胞培地とトリプシンとのインキュベーション
は、PTHrPの生物学的な活性の欠失をもたらし、それが
タンパクであることと一致する。それは２分間100℃の
温度に耐えうるから適度な熱安定性を有する。0.1M酢酸
中Biogel P60上での無血清BEN細胞条件化培地のゲルの
過は、流出物チューブの生物学的なアッセイにより、
活性が約40,000の分子量の巨大分子に基づくことを示し
た。これはおそらく、未精製段階にある間、上記活性物
質が他のタンパクを伴う結果として過大に算定されるた
めであることが後となってわかった。

PTHラジオイムノアッセイは多数の相違する抗血清具
体的にはカルボキシ末端について２つ、分子の中間につ
いて１つ、そしてアミノ末端について１つ、について実
施された。どの場合でも、BEN細胞培養中で免疫反応性P
THは検出されなかった。BEN細胞をコンフルエンスに増
殖せしめ、洗浄して血清を除去し、そして無血清培地
（50％Dulbeco′s Modified Eagles′ Medium,50％メデ
ウム199）中で24時間インキュベートすることにより、
実質的な量のPTHrP活性（１−100までの希釈で検出可
能）の生産を行うことが可能であることが見い出され
た。従って、これは活性物質を大量に含む培地を蓄積す
る標準方法として使用され、そして該培地は精製が始め
られるまで−20℃で貯蔵された。

実施例３ BEN細胞培養物からのPTHrPの精製 BEN細胞培養物（24時間、無血清インキュベーショ
ン）が蓄積され、そしてUMR106−01サイクリックAMP応
答アッセイにおいて、標準としてヒトPTH（１−34）に
対する生物学的なアッセイによりPTHrP活性が測定され
た。培養物の蓄積したバッチ−１回に５−が、1Mの酢
酸でpH4.8に酸性にした後、SPセファデックスカラム（3
5ml容積）上が注がれた。そのカラムがpH4.8の0.1M酢酸
ナトリウムで十分に洗浄された後、個々の試験管につい
てE₂₈₀の存在を測定しながら、0.1,0.2及び0.3M NaClの
各250ml、そしてさらに0.5M NaCl500mlを加えることに
よりタンパクの回分的な溶出が実施された。生物活性は
個々のカラム試験管のサンプル100μについてアッセ
イされ、そして生物活性のバルク（bulk）は、0.5M NaC
l画分を集めることにより得られた。この段階での生物
活性の回収率は90−100％であり、そして10倍の精製を
達成する。それは本質的な精製手段というよりは、むし
ろ有用な濃縮方法として役立つ。

かかる５段階から蓄積した活性物質は、SP1,SP2,等
のように称される。上記活性プール（0.5M NaCl）はTFA
により0.1％の濃度に酸性にされ、そして逆相HPLC（RP
300）カラム上に注がれ、そのカラムから１分当り0.66
％のアセトニトリルグラージェントを用いて活性物質
は溶出された。RP300カラム溶出物からの個々のカラム
画分（1ml画分当たり10μ）は、バイオアッセイされ
そしてロータリーエバポレーターにより処理される。
この段階での回収率は60％である。６つのかかるSPプー
ルが次の段階の精製のために一緒にされた。すなわち、
これは培養物の30分に相当する。

タンパクの評価は、標準としてBSAを用いてブラッド
フード法（Bradford method）（56）により行われ、そ
してその物質は2mgづつ分けてHPLC Vydac C18カラム（1
0μ,2.54×22cm）にかけられ、そしてカラムから１分当
たり0.5％アセトニトリルグラージェントでそれは溶
離される。該Vydacカラムから生物活性の２つのピー
ク、すなわち32％アセトニトリルにおいてピークＡそし
て37％においてピークＢが首尾よく得られる。ピークＢ
はピークＡより他のタンパクによる汚染がより少なく、
そして次の精製のために機械的に選ばれる。活性の合計
回収率は30％である。ピークA:ピークＢの割合はバッチ
間で2:1から0.5:1まで変化する。

ピークＢ物質が集められ、そしてwide pore（300Å）
Bakerbond C18逆相カラムにかけられ、そしてさらにア
セトニトリルグラージェントで溶離される（第1A
図）。215nmにおける吸収がモニターされる。個々のカ
ラム画分がバイオアッセイされ、そして最高の活性を有
する画分（画分50−55）が集められる。該活性物質は第
1B図に示されるように改良した溶出条件を用いる逆相HP
LCによりさらに精製される〔１分当たり0.33％のシャロ
ウワー（shallower）アセトニトリルグラージェン
ト〕。第１図の細かい平行線の領域は、生物学的アッセ
イデータをヒトPTH（１−34）のμｇ相当量として示
し、そして試験管番号28−38のカラム画分が示される。
生物活性ピークは画分31において観察され、それは４つ
の近似する位置のタンパクピークの１つに一致する。画
分31の内容物はアミノ酸配列決定のために用いられそし
てSDS−PAGE分析のために用いられた。まず最初のこの
物質の配列決定は、第１表のアミノ酸１−24を同定し
た。

上記ピーク画分は、銀染色法（silver−staining）に
よるタンパクバンドを検出するために使用されたゲル
の一部を用いてSDS−PAGEにより分析された。上記ゲル
の残りをスライスしてはぎとり、そして生物活性につい
てアッセイされたゲルスライスから活性物質を溶離し
た。

17％ポリアクリルアミドゲルへの画分31の20％の使
用（約6pMoles、又は120ng）は、分子量標準により決定
した場合18−19Kの分子量に一致する銀染色する物質の
主要バンドをもたらす（第２図）。２つの不明瞭なバン
ドが35K及び67Kに観察された。これらはPTHrPの２量体
及び３量体の可能性がある。再度試験したゲルが3mm幅
の切片にスライスされそして0.1％SDSで溶離された場
合、溶離した活性は18−19Kにおける銀染色ピークに一
致する単一バンドのみ観察された（第３図）。ゲルに適
用された量は生物学的アッセイによりhPTH（１−34）の
1.4μｇと等価であった。直接的にタンパクの定量は行
わなかったが、アミノ酸配列データから計算された。

配列決定のために用いられた純粋物質の比活性は、μ
g PTHrPタンパク当たりウシPTH（１−34）の６μｇと等
価であることが推定された（第３図）。

別々の精製バッチにおいて、HPLC工程Ｂから回収され
た生物活性物質（第１図，画分31−32）は一緒にされそ
して１分当たり0.33％の割合でアセトニトリルグラー
ジェントによりwide pore（300A）Bakerbond C18逆相カ
ラム上で再クロマト処理された。第４図に見られるよう
な、単一の鮮明に限定されたピーク、すなわちピーク47
は、分子量18K−19Kのタンパクを含む。この画分中に
は、SDS−PAGEで測定されるような他のいかなる夾雑タ
ンパクもも検出されなかった。この物質は実施例１に示
すアッセイによれば生物活性があり、そしてバイオシス
テムガスフェーズマイクロシークエンサー器（Ap
plied Biosystems Gas Phase Microsequencer）を使用
してアミノ酸配列決定のために使用された。この物質の
配列決定は、次の実施例中に示すように41個のアミノ酸
を同定した。

実施例４ PTHrPの部分的配列決定実施例３により調製された精製PTHrPが一連のエドマ
ン分解にかけられ、そしてApplied Biosistems gas pha
se sequentator（57）を用いて分析された。配列決定は
３度行われ、得られる結果を第１表に示す。精製PTHrP
のＮ−末端配列分析により41個のアミノ酸が同定され
る。PTHrPのアミノ酸配列はPTHrPのトリプシン分解断片
を用いて50残基まで拡張された。第１表のアミノ酸は、
レターコード（letter code）を使用して指定される
（58）。

精製PTHrPのトリプシン分解は、75μｇのPTH様生物活
性物（合成PTH標準に対して、UMR−106細胞生物学的ア
ッセイによってPTHrPの調整物をアッセイすることによ
りPTH様生物活性物は測定される）を37℃で24時間トリ
プシン（1:10W/W）とインキュベートすることにより実
施された。このトリプシン分解物はHPLCにより18個のピ
ークに分離された（第５図）。これらのピークの数個の
アミノ酸配列が決定され、そしてピーク７に含まれる配
列は、残基38において始まるPTHrPのNH₂−末端配列と重
なることがわかった。このペプチドがPTHrPのアミノ酸
配列を残基50まで伸張した。

PTHrPの最初の24個のアミノ酸が、コンピュータプロ
グラムを使用してNBRFデーターベース（59）中のタン
パク配列と比較された。45−80％の重複配列の相同性を
伴って、ヒト及びラットPTHの最初の24個のアミノ酸と
の実質的な同質性が明らかにされた。構造的同一性は、
ヒトPTHの最初の13個のアミノ酸とで特に示され、そし
てそれ以降ではずっとより少ない。PTHの最初の10個の
アミノ酸を含有する配列は、非常に弱い免疫原であり、
そして実際にこれは現実の配列、そしてコンピューター
化した予測法から予測され得る。PTHrP配列欝が同様な
方法で分析される場合、PTHよりも感知できるほどより
一層免疫原性であることがわかった。

実施例５精製PTHrPのアミノ酸分析高度に精製したPTHrPのサンプル（第４図のカラム溶
出由来の46−48試験管；合計PTH様生物活性物７μｇ）
が、第６図に示されるようにBrownlee C8カラム（2.1m
m）によりクロマト処理された。主要ピークのダイオー
ド・アレイ（Diode array）検出（第６図の挿入部）
は、ピークの肩に芳香族アミノ酸内容物の夾雑を示し
た。主要ピークの中心部は110℃で25時間加水分解さ
れ、そしてベックマン6300アミノ酸分析器（Beckman 63
00 Amino Acid Analyser）で分析された。その結果は第
２表から示される。分析された量は20pmolesで、そして
8.8μｇのウシPTH（１−34）と生物活性において等価で
あることがわかった。この精製調製物の比活性はPTHの
それよりも約20倍大きいことを示した。上記アミノ酸分
析は、PTHrPが154個のアミノ酸を含有することを示す。

第２表精製PTHrPのアミノ酸組成アミノ酸残基数（測定値）残基数（理論値） AsP 12.60 12 Thr 10.40 12 Ser 11.40 14 Glu 22.14 17 Gly 13.02 10 Ala 7.99 ５ Val 3.69 ５ Ile 4.97 ４ Leu 11.35 12 Nle 0.0 ０ Tyr 1.88 ２ Phe 3.11 ３ His 7.10 ８ Lys 21.11 17 Arg 10.76 12 Pro 12.01 ７ TOTAL 153.57 140 実施例６ PTHrPペプチドのペプチド合成及びこれらのペプチドに
対する抗血清の調製 PTHrPのアミノ末端配列に対応して合成ペプチドが、A
pplied Biosystems Model 430A自動ペプチド合成装置を
用いてメリフィールド法（41）により合成された。合成
ペプチドは無水HFを用いて担体樹脂から開裂され（4
2）、60％アセトニトリル及び0.1％トリフルオロ酢酸で
抽出され、ロータリーエバポレートされ、さらに凍結
乾燥された後、０−60％アセトニトリルのグラージェン
ト（合計容量1000ml）により低圧逆相カラム（2.5×30c
m,Amicon C₁₈逆相、15−17μ250A pore size）でクロマ
ト処理された。精製されたペプチドは凍結乾燥された。
ペプチドの組成を確認するためにアミノ酸分析が用いら
れた。カルボキシ末端システインを介して大豆トリプシ
ンインヒビターに接合された合成ペプチドにより、ラ
ビットが免疫感作された。

第１表における配列情報に基づき次のペプチド類似化
合物が合成された： Ala−Val−Ser−Glu−His−Gln−Leu−Glu−His−Asn
−Cys（〔Glu⁸,Asn¹⁰,Cys¹〕PTHrP（１−11）,Ala−Val
−Ser−Glu−His−Gln−Leu−Leu−His−Asn−Lys−Gly
−Lys−Ser−Ile−Gln（〔Asn¹⁰〕PTHrP（１−16）），
〔Asn¹⁰,Tyr¹⁷〕PTHrP（１−17）、及びPTHrP（１−3
4）。該類似化合物〔Glu⁸,Asn¹⁰,Cys¹¹〕PTHrP（１−1
1）及び〔Asn¹⁰〕PTHrP（１−16）はアデニル酸シクラ
ーゼアッセイ中で不活性であり、そしてPTHそれ自体
の又はBEN細胞由来の条件化培地の活性に拮抗しなかっ
た。大豆トリプシンインヒビターに接合された〔Glu⁸,A
sn¹⁰,Cys¹¹〕PTHrP（１−11）が、ラビットを免疫感作
するために使用され、そして抗血清が調製され、これが
ラジオイムノアッセイで使用された。また、〔Asn¹⁰〕P
THrP（１−16）に対する抗血清は同様な態様でラビット
に生じた。

実施例７ PTHrPに対して向けられた抗血清を用いるアッセイラジオイムノアッセイは、ラジオイムノアッセイのた
めのトレーサーとしてI¹²⁵−ラベル化〔Asn¹⁰,Tyr¹⁷〕P
THrP（１−17）を用いて実施され、そしてラビット抗血
清が、1/1000の最終希釈物として実施例５により調製さ
れた。最初のインキュベーションは、0.1％ウシ血清ア
ルブミンを含む0.05Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.5）
中で４℃６で夜通し行われた。遊離ペプチドからの結合
ペプチドの分離は、固相第二抗体（Sac Cell−Wellcom
e,Australia）を用いて達成された。合成ペプチドのヨ
ウ素化は、既にカルシトニンについて開示されているよ
うに（44）、約150μCi/μｇの比活性になるように実施
された。

第7A図に示したように、上記アッセイはPTHrP（１−1
0）及び（１−16）を同等に認識した。hPTH（１−10）
及びhPTH（１−34）の交叉反応性は、それぞれ0.5及び
0.3％であった。ラットPTH（１−34）、ウシPTH（１−3
4）及びヒトPTH（１−34）の交叉反応性は、それぞれ７
％、５％及び0.4％であった（第7B図）。PTHrPは、PTHr
Pのエピトープに結合することができる抗体を用いる免
疫アフィニティークロマトグラフィーにより精製するこ
とができる。この技術において、PTHrPに結合すること
ができる抗体が担体マトリックスに付着される。PTHrP
含有材料は、担体マトリックスがクロマトグラフィー
カラム中にある場合にはそれを通して過され、また別
法としてバッチ的法を用いるならば該マトリックスと混
合される。上記材料中に存在するすべてのPTHrPが該マ
トリックスに結合し、そしてそれはすべての夾雑物失を
除去するため洗浄することができる。その後、精製PTHr
Pは、抗体結合を開裂する条件、例えば高いか又は低いp
H条件を用いてマトリックスから溶出され得る。同様な
技術がPTHrPに結合することができる抗体を精製するた
めに使用し得る。これに関しては、実施される工程はPT
HrPが担体マトリックスに付着されることを除いては、
上記の概要のものと同じである。

第８図は、部分的に精製されたPTHrpのHPLC画分（即
ち、SP−セファデックスクロマトグラフィー溶出物）
へのラジオイムノアッセイの結果を示す。

部分的に精製されたPTHrP（35μg hPTHに等価）は、C
₁₈逆相監視（guard）カラム（RP300,7μ 0.3×4.0cm）
によりクロマト処理された。溶離は90分以上1ml/minの
流速で０−60％アセトニトリル/0.1％TEAのグラージェ
ントにおいて実施された。生物学的アッセイはあいてい
る円（○）を表わし、閉じた円（●）としてラジオイム
ノアッセイが表わされる。第８図は、生物学的活性及び
免疫学的活性の同時的溶出を示す。

PTHrP（１−34）ペプチドは、UMR106−01細胞中のサ
イクリックAMP応答についてウシPTH（１−34）に対して
アッセイされ、そして等価な能力が存在することがわか
った（第9A図）。同様に、UMR106−01細胞中のプラスミ
ノーゲンアクチベーター活性を増加する能力において
もウシPTH（１−34）に対して等価であった（第9B
図）。これは、本発明者らが報告してきたPTH応答系で
あり、そして十分に特徴付けられている（52）。

ウエスターンブロット（western Blot）分析実施例３のピークＡの２つのサンプル由来のタンパ
ク、実施例３のピークＢから誘導される高度に精製した
PTHrP、及び純粋なウシ副甲状腺ホルモンがSDS−PAGEに
かけられ、ニトロセルロースに移され、１時間低界面活
性剤“ブロット（Blotto）”でブロックされ、1:200希
釈における〔ASN¹⁰〕PTHrP（１−16）に対するラビット
抗血清とインキュベートされ（実施例５参照）、山羊抗
−ラビット血清の¹²⁵IでラベルしたFab断片と１時間イ
ンキュベートし、そしてその後オートラジオグラフ処理
された（第10図）。

予期されたように、高度に精製したPTHrPを含有した
レーン４は、PTHrPの分子量と一致する18Kdのバンドを
示す。これに対して、実施例３のピークＡ由来のタンパ
クを含有するレーン２及び３は約22Kdのバンドを示す。
このことは、PTHrPが少なくとも２つの形態で存在し、
両方とも同じ生物学的な能力を有するが、分子量及び逆
相HPLC上の溶離挙動において相違することを強く示唆す
る。純粋なウシ副甲状腺ホルモン（レーン１）は、これ
らの条件下ではいかなるバンドも示さなかった。

PTHrPに対して向けられる抗体は、生物学的サンプル
中に上記タンパクが存在するか否かを検出するために使
用され得る。

該生物学的サンプルは固相担体、例えばニトロセルロ
ース又はPVCに結合され、そして抗−PTHrP抗体と反応さ
れ得る。抗体の結合性は、その後抗体に付着する検出可
能なラベルを用いることにより検出され得るか、又はむ
しろ結合した抗体に対して特異的な第２のラベルした試
薬を用いることにより検出されるであろう。試薬として
は、例えばプロテインＡ、又は抗−Fabもしくは抗−Fc
抗体が使用され得る。

他方、抗−PTHrP抗体が固相担体、例えばPVCプレー
ト、ポリスチレンビーズ等に結合され得るだろう。そ
の後、アッセイされるための物質が上記担体に添加さ
れ、そしてそれが抗体と結合することを可能にするため
十分な時間インキュベートされ、次いで結合していない
物質が洗浄除去される。その後、第２のラベルしたPTHr
P抗体が抗体結合性を検出するために上記担体に加えら
れるであろう。第２の抗体がラベルされていないなら、
抗体結合性を検出するために改めてラベルした試薬が該
担体に加えられるだろう。容易に予期され得るように、
これらの手段は、PTHrPが少なくとも２つのエピトー
プ、その１つは固相担体に結合した抗体に結合するもの
であり、そして他は第２の抗体に結合するもの、を含有
することを想定している。

好適な検出可能なラベルは、¹²⁵I、³²P、³H、¹⁴C、ビ
オチン、アビジン、プロテインＡ、コロイド状の金もし
くは銀、ウレアーゼ、アルカリホスファターゼ、ワサ
ビパーオキシダーゼ又はフィコビリプロテインを包含
する。

実施例７遺伝分析 PTHrPタンパクはPTHに対し実質的に相同性を持つた
め、それが特有の非対立遺伝子によってコードされたも
のか、又はPTH遺伝子それ自体の変異形であるかを決定
することが必要だと思われた。

実験は、³²Pでラベルされた単一コピーPTH遺伝子及び
その３′フラッキング領域（flanking region）に特異
的なプローブ（45）を用いて実施された。ノザン（Nort
hern）ゲル分析は、BEN細胞に由来するか又は外科的に
切除されたヒト上皮小体腺腫から調製されるトラック
（track）当たり5mgのPoly A⁺mRNAを用い、既に開示さ
れているように（46）実施された。サザーン（Souther
n）ゲル分析は、BEN細胞に由来するか又はヒト白血球か
ら調製されるトラック当たり10mgの制限酵素消化された
ゲノムDNAを用い標準法（47）を改良したものである。
ヒトPTHプローブは、³²P−ヌクレオチドにより10⁸dpm/m
g以上の比活性にまでランダムにプライムされた（2
6）。ハイブリダイゼーション及び洗浄条件は開示され
たところのものであった（46）。

poly A⁺メッセンジャーRNAのノザンゲル分析は、BE
N細胞が上皮小体腺腫組織に比し検知可能なレベルにお
いてPTH遺伝子を発現しなかったことを示した（例示し
なかった）。BEN細胞に由来するか又はヒト白血球に由
来する制限酵素消化しなゲノムDNAのサザーンゲル分
析は、同一のPTH−含有制限断片、例えば4.2及び3.7Kb
のEcoRI断片を示した。従って、BENは、非発現性PTH遺
伝子、及び指示したタンパク配列内を備えているPTHrP
の発現から推論すると、PTH−関連遺伝子をコードする
相同の遺伝子の両方を含有する。

実施例８様々な組織によるPTHrPの産生 PTHrP産生は腫瘍細胞に限られるとは思われない。こ
の点を明らかにするために羊の胎児、雌羊の組織及び胎
盤の抽出物に関連する実験が遂行された。抗−PTH抗血
清又はPTH拮抗物質と前もってインキュベーションした
後にアッセイを行うことによって、本発明者らは生物活
性が単独のPTHもしくはPTHrPに帰すべきか、又はそれら
の２つの混合物に帰すべきかを決定することが出来た。

羊の胎児上皮小体は50％だけがPTHにより説明でき、
残りはPTHrPに帰する可能性があるところの生物活性を
含有することがわかった。いくらかのPTHrP（約20％）
は母性上皮小体中に見い出された。

しかしながら、最も著しいことは胎盤に感知しうる程
度に活性を含むことが見い出され、そしてそれはPTHrP
として完全に説明することができ、そしてまたそれはBE
N細胞培養物由来のPTHrPと同じ態様においてHPLC上で挙
動した。さらにまた、胎盤中で検出できるPTHrPの量
は、上記上皮小体が胎児から切除された雌羊由来の胎盤
の中では減少されなかった。このことは、胎盤がPTHrP
の重要な源泉でありうることを示唆する。

本発明者らは、悪性の液生過カルシウム血症を有する
患者の尿からPTHrPを精製した（データは示さない）。
これらの結果に基づけば、本発明の抗体試薬を用いて血
清、尿又は他の生物学的な流体中のPTHrPの存在が検出
され得る。従って、本発明の抗体試薬は悪性腫瘍の識別
における診断薬として有用性を有する。

本発明の他の態様、それらに対する改良そしてそれら
に対する変形は、本明細書を読むことにより当業者によ
って明らかになるであろうし、そしてかかる全ての他の
態様、改良及び変形は本発明の態様の中に包含されよう
に考えられる。

引用文献 1. Martin,T.J.及びAtkins,D.（1979）Essays in Med.
Biochem.4,49−82. 2. Mundy,G.R.及びMartin,T.J.（1982）Metabolism31,
1274−1277. 3. Mundy,G.R.,Ibbotson,K.J.,D′Suoza,S.M.,Simpso
n,E.L.,Jacobs,J.W.及びMartin,T.J.（1984）New Eng.
J.Med.310,1718−1727. 4. Albright,F.（1941）New Eng.J.Med.225,789−796. 5. Berson,S.A.及びYalow,R.S.（1966）Science154,90
7−909. 6. Powell,D.,Singer,F.R.,Murray,T.M.,Mankin,C.及
びPotts,J.T.Jr.（1973）New Eng.J.Med.289,176−181. 7. Stewart,A.f.,Horst,R.,Deftos,L.J.,Cadman,E.C.,
Lang,R.及びBroadus,A.E.（1980）New Eng.J.Med.303,1
377−1383. 8. Simpson,E.L.,Mundy,g.R.,D′Souza,S.M.,Ibbotso
n,K.J.,Bockman,R.及びJacobs,J.W.（1983）New Eng.J.
Med309,325−332. 9. Ibbotson,K.J.,D′Souza,S.M.,Ng,K.W.,Osborne,C.
K.,Niall,M.,Martin,T.J.及びMundy,G.R.（1983）Scien
ce221,1292−1294. 10. Ibbotson,K.J.,Harrod,J.,Gowen,M.,D′Suoza,S.,
Smith,D.D.,Winkler,M.E.,Derynck,R.及びMundy,G.R.
（1986）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83,2228−2232. 11. Tashjian,A.J.Jr.,Voelkel,E.F.,Lazzaro,M.,Sing
er,F.R.,Roberts,A.B.,Derynck,R.,Winkler,M.E.及びLe
vine,L.（1985）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82,4535−453
8. 12. Stewart,A.F.,Insogna,K.L.,Goltzman,D.及びBroa
dus,A.E.（1983）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80;1454−14
58. 13. Rodan,S.B.,Insogna,K.L.,Vignery,A.M.C.,Stewar
t,A.F.,Boradus,A.E.,D′Souza,S.M.,Bertolini,D.R.,M
undy,G.R.及びRodan,G.A.（1983）J.Clin,Invst,72;151
1−1515. 14. Strewler,G.J.,Williams,R.D.及びNissenson,R.A.
（1983）J.Clin.Invest.71;769−774. 15. Merendino,J.J.,Insogna,K.K.,Milstone,L.M.,Bro
adus,A.E.及びStewart,A.F.（1986）Science 231,388−
390. 16. Rosol,T.J.,Capen,C.C.,Weisbrode,S.E.及びHors
t,R.L.（1986）Lab.Invest.54,679−688. 17. Ellison,M.,Woodhouse,D.,Hillyard,C.J.,Dowset
t,M.,Coombes,R.C.,Gilby,E.D.,Greenberg,P.B.及びNev
ille,A.M.（1975）Br.J.Cancer32,373−379. 18. Kohler et al.,（1976）Eur.J.Immunol.6,11−19. 19. Kennet et al（1978）Current Topics in Microbi
ology及びImmunology 81,77−91. 20. T.J.Marin,P.M.Ingleton,J.C.E.Underwood,R.A.Me
lick,V.P.Michelangeli及びN.H.Hunt.Parathyroid horm
ine responsive adenylate cyclase in an induced tra
nsplantable osteogenic sarcoma in the rat.Nature 2
60,436−438（1976）． 21. D.Atkins,N.H.Hunt,P.M.Ingleton and T.J.Marti
n.Rat osteogenic sarcoma cells:isolation及びeffect
s of hormones on the production of cyclic AMP及びc
yclic GMP.Endocrinology,101,555−561,（1977）． 22. D.Atkins and T.J.Martin.Rat osteogenic sarcom
a cells:Effects of some prostaglandins,their metab
olites及びanalogues on cyclic AMP production.Prost
aglandins,13,861−871（1977）． 23. A.Crawford,N.H.Hunt,J.K.Dawborn,V.P.Michelang
eli及びT.J.Martin.Membranes from a transplantable
osteogenic sarcoma responsive to parathyroid hormo
ne及びprostaglandins:regulation及びadenylate cycla
se及びthe hormone metabolism.J.Endocr.,77,213,224,
（1978）． 24. A.Crawford,D.Atkins and T.J.Martin.Rat Osteog
enic sarcoma cells:Comparison of the effects of pr
ostaglandins E₁,E₂,I₂（prostacyclin）,6 keto
F_１α，及びthromboxane B₂ on cyclic AMP production
及びadenylate cyclase activity.Biochem.Biophys.Re
s.Comm.,28,1195−1201,（1978）． 25. Martin.P.M.,Ingleton,L.A.,Coulton及びR.A.Meli
ck,Metabolic properties of hormonally responsive o
steogenic sarcoma cells.Clin.Orthop.Rel.Res.,140,2
47−254,（1979）． 26. D.Atkins,P.C.Waller及びT.J.Martin.Rat osteoge
nic sarcoma cells:Modulation of hormone stimulated
cyclic AMP production by prostaglandin antagonist
s及びbiosyntesis inhibitors.Clin.Exp.Pharm.及びPhy
s.,7,31−44（1980） 27. N.C.Partridge,D.Alcorn,V.P.Michelangeli,B.E.K
emp,G.B.Ryan及びT.J.Martin.Functional properties o
f hormonal responsive cultured normal及びmalignant
rat osteoblastic cells.Endocrinology,108,213−219
（1981）． 28.N.C.Partridge,B.E.Kemp,M.C.Veroni及びT.J.Marti
n.Activation of cyclic AMP−dependent protein kina
se in normal and malignant bone cells by parathyro
id hormone,prostaglandin E₂及びprostacyclin.Endocr
inology,108,220−226（1981）． 29. N.C.Partridge,R.J.Frampton,J.A.Eisman,V.P.Mic
helangeli E.Elms.,T.R.Bradley及びT.J.Martin.Recept
ors for 1,25（OH）₂ vitamin D₃ enriched in cloned
osteoblast−like rat osteogenic sarcoma cell.FEBS
Letters,115,139−142（1980）． 30. N.C.Partridge,B.E.Kemp,S.A.Livesey及びT.J.Mar
tin.Activity ratio measurements reflect intracellu
lar activation of cyclic AMP−dependent protein ki
nase in osteoblasts.Endocrinology,111,178−183（19
82）． 31. S.A.Livesey,B.E.Kemp,C.A.Re,N.C.Partridge,及
びT.J.Martin.Selective hormonal activation of cycl
ic AMP−dependent protein kinase isoenzymes in nor
mal及びmalignant osteoblasts.J.Biol.Chem.257,14983
−14988（1982）． 32. N.C.Partridge,D.Alcorn,V.P.Michelangeli,G.Rya
n及びT.J.Martin.Morphological及びbiochemical chara
cterization of four clonal osteogenic sarcoma cell
lines of rat origin.Cancer Res.43,4308−4314,（19
83）． 33. J.A.Hamilton,S.R.Lingelbach,N.C.Partridge及び
T.J.Martin.stimulation of plasminogen activator in
osteoblast−like cells by bone−resorbing hormone
s.Biochem.Biophys.Res.Comm.,122,230−236（1984）． 34. S.M.Forrest.K.W.Ng,D.M.Findlay,V.P.Michelange
li,S.A.Livesey,N.C.Partridge,J.D.Zajac及びT.J.Mart
in.Characterization of an osteoblast−like clonal
line which responds to both parathyroid hormone及
びcalcitonin.Calc.Tiss.Int.37,51−56（1985）． 35. M.Kubota,K.W.Ng及びT.J.Martin.Effect of 1,25
−dihydroxyvitamin D₃ on cyclic AMP responses to h
ormones in clonal osteogenic sarcoma cells.Bioche
m.J.,231,11−17（1985）． 36. N.C.partridge,A.L.Opie,R.T.Opie及びT.J.Marti
n.Inhibitory effects of parathyroid hormone on gro
wth of osteogenic sarcoma cells.Calc.Tiss.Int.,37,
519−525（1985）． 37. K.W.Ng,S.A.Livesey,F.Collier,P.Gummer及びT.J.
Martin.Effect of retinoids on the growth,ultrastru
cture of cytoskeletal structures of malignant oste
oblasts.Cancer Res,45,5106−5113（1985）． 38. S.A.Livesey,K.W.Ng.G.Collier,M.Kubota,A.L.Ste
iner及びT.J.Martin.Effect of retonoic acid on cell
ular content及びPTH activation of cyclic AMP−depe
ndent protein kinase isoenzymes in clonal osteogen
ic sarcoma cells.Cancer Res.45,5734−5741（198
5）． 39. J.A.Hamilton,S.R.Lingelbach,N.C.Patridge,及び
T.J.Martin.Hormone regulation of plasminogen activ
ator production by bone−resorbing hormones in nor
mal及びmalignant osteoblasts.Endocrinology,116,218
6−2191（1985）． 40. M.Kubota,K.W.Ng,J.Murase,T.Noda,J.M.Moseley a
nd T.J.Martin.Efficacy及びspecificity of human par
athyroid hormone analogues as antagonists in intac
t clonal osteogenic sarcoma cells.J.Endocrinol.10
8,261−265（1986）． 41. Hodges,R.S.及びMerrifield,R.B.（1975）Anal.Bi
ochem.65,241−272. 42. Stewart,J.M.及びYoung,J.P.（1966）Solid Phase
Peptide Synthesis pp.44;66,Freeman,San Francisco. 43. Carlsson,j.,Drevin,H.及びAxen,R.（1978）Bioch
em.J.173,723−737. 44. Findlay,D.M.,DeLuise,J.Michelangeli,V.P.,Elli
son,M.及びMartin,T.J.（1980）Cancer Res.40,1311−1
317 45. Vasicek,T.J.,McDevitt,B.E.,Freeman,M.W.,Fenni
ck,B.J.,Hendy,G.N.,Potts,J.T.Jr.,Rich,A.及びKronen
berg,H.M.（1983）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80,2127−2
131. 46. Zajac,J.D.,Martin,T.J.,hudson,P.,Niall,H.D.及
びJacobs,J.W.（1985）Endocrinology 116,749−755. 47. Reed,K.C.及びMann,D.A.（1985）Nucleic Acids R
es.13,7207−7221. 48. Weeks,D.R.,Beerman,N.及びGriffiths,O.M.（198
6）Anal.Biochem,152,376−385. 49.Hudson,P.,Haley,J.,John,M.Cronk,M.,Crawford,R.,
Haralambidis,J.,Tregear,G.W.,Shine,J.及びNiall,H.
D.（1983）Nature 301,628−631. 50.Yalow,R.及びBerson,S.A.（1959）Nature（Lond.）,
184,1648−1650. 51. Towbin,H.,Stackelin,T.及びGordon,J.（1979）Pr
oc.Natl.Acad.Sci.USA,76,4350−4354. 52. Allann,E.H.,Hamilton,J.A.,Medcalf,R.L.,Kubot
a,M.及びMartin,T.J.（1986）Biochim,Biophys.Acta.,8
88,199−207. 53. Schold,M.,Colombero,D.,Reyes,A.及びWallace,B.
（1984）DNA,Vol.3,6,469−477. 54. Rabbani,S.A.Mitchell,J.,Roy,D.A.,Kramer,R.,Be
nnett,H.P.J.及びSoltryman,D.（1985）Endocrinology
118,1200−1209. 55. Stewart,A.F.,Insogna,K.L.,Soltryman,D.及びBro
adus,A.E.（1983）Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80,1454−1
458. 56. Bradford,M.（1976）Anal.Biochem.72,248−254. 57. Wettenhall,R.E.H.,Kudlicki,W.,Kramer,G.及びHa
rdeshy,B.（1986）J.Biol.Chem.261,12444−12447. 58. IUPAC−IUB Joint Commission on Biochemical No
menclature,（1985）J.Biol.Chme.260,14−42. 59. National Biochemical Research Foundation,Geor
getown University Medical Center,3900,Reservoir R
d,N.W.,Washington,D.C.20007.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ケンプ，ブルースアーネストオーストラリア国，ビクトリア，3101, キュー，ケレットグローブ 20 (72)発明者ウェッテンホール，リチャードエドワードヒューオーストラリア国，ビクトリア，キャンバーウェル 3124，ロイヤルクレスト 23

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】（ａ）下記特徴：（ｉ）Ｎ−末端アミノ酸配列:AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRFF
LHHLIAEIHTAEIRATSE; （ii）還元及び非還元条件下でドデシル硫酸ナトリウム
ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定される場
合、15〜25キロダルトンの分子量；及び（iii）アデニル酸シクラーゼ応答アッセイにおいて測
定される場合、mgタンパク質当たり副甲状腺ホルモンの
アミノ酸１〜34から構成されるペプチドの少なくとも約
6mg等価の生物学的比活性、を有する実質的に純粋なPTHrP;並びに（ｂ）少なくともアミノ酸１〜34を含んで成るPTHrPの
断片、から成る群から選ばれた、PTHrP生物活性又は免疫原性
を有するポリペプチド。
【請求項２】PTHrPの精製方法であって、次の工程：（ａ）培地中でBEN細胞を培養し；（ｂ）上記培養物を陽イオン交換樹脂に適用し；（ｃ）上記陽イオン交換樹脂からの画分を溶離し、そし
てPTHrP活性についてその画分をアッセイし；及び（ｄ）PTHrP活性を有するこれらの画分について逆相高
性能液体クロマトグラフィー（HPLC）を行い、そして引
き続き実質的に純粋なPTHrPを単離する、ことを含んで成る方法。