CN106794238A - 用于靶向治疗以治疗神经疾病的通用平台 - Google Patents

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Abstract

本发明提供将功能性、异源性化合物递送至特定细胞的通用递送平台，采用经修饰以包括异源性化合物的毒素。在一个实施方式中，所述毒素是AB5毒素。在一个实施方式中，AB5毒素是来自大肠杆菌的热不稳定性肠毒素(LT)，包括LTI、LTII、LTIIa、LTIIb、LTIIc和LT的其它重组形式。还提供了使用方法。

Description

用于靶向治疗以治疗神经疾病的通用平台
相关申请的交叉引用
本申请要求2014年9月30日提交的美国临时专利申请号62/057,447的优先权，通过引用将该申请全文纳入本文。
关于联邦资助研究或开发的声明
本发明是在政府支持下由国家卫生研究院授予的基金号AI101313和AI057153资助完成。政府对本发明拥有一定的权利。
发明背景
通常，存在两种将异源性蛋白质递送进入细胞的方式；它们分别基于病毒和基于蛋白质。基于蛋白质的疗法缺乏遗传性、感染性的组分，这是优于基于病毒的疗法的一项优势。例如，炭疽毒素的保护性抗原(PA)已被开发为异源性蛋白质递送系统。PA递送平台是有效且普遍的，因为炭疽毒素受体在常见于多种细胞类型中。然而，这也是PA作为细胞型特异性蛋白质递送平台的一项限制性特征。免疫毒素(IT)是用于异源性蛋白质递送的另一平台。通过鉴定相对于“正常”细胞而言在目标癌细胞上具有升高的宿主受体表达的受体，能够增强IT的特异性。然而，这会限制可被靶向的细胞的类型。因此，需要一种递送平台，其能够将功能性治疗递送进入特定细胞，例如，神经元。
肉毒杆菌中毒是一种稀有且很可能致命的麻痹性疾病，其由肉毒杆菌神经毒素(BoNT)所致，估计人类致死剂量中值(LD-50)是静脉内或肌内1-2ng/kg和吸入10–20ng/kg。BoNT能进入周围神经系统的神经元，并靶向和切割可溶性NSF附着蛋白受体(SNARE)蛋白一段持续的时间(长达6个月)，这将造成迟缓性麻痹，并且在严重情况下可导致死亡。没有能够抵抗肉毒杆菌中毒的疫苗或疗法。虽然天然产生的肉毒杆菌中毒是罕见的(每年约150例)，但存在自然或全球爆发的威胁，而这将需要长期、支持性的治疗。因为肉毒杆菌中毒的长期麻痹归因于胞内BoNT的长期活性，针对BoNT中毒(intoxication)的治疗平台应靶向神经元且直接使胞内毒素失活。虽然在BoNT疫苗和中和抗体方面已有显著进步，但尚未开发出靶向胞内BoNT以抑制胞内BoNT的特定化合物的特异性疗法。
脑中的蛋白质聚集的特征是神经退行性疾病(例如，阿兹海默症(AD)、帕金森病(PD)、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)和亨廷顿氏舞蹈病(HD)。现如今，还没有相对于仅仅减轻这些神经退行性疾病的症状而言能够减缓这些疾病的进展的靶向治疗。
神经节甘脂，一种包含唾液酸的鞘糖脂，是所有动物细胞膜的组分，并且在神经元质膜中含量尤其丰富。脑包含的神经节甘脂比大多数非神经组织要多上高达20～500倍。在高等脊椎动物的神经系统中，复杂神经节甘脂(例如，GM1a、GD1a、GD1b和GT1b)占总神经节甘脂的约80-90％，而简单神经节甘脂GM2和GM3更常见于神经元外组织且在脑组织上高度缺乏。因此，用于识别神经节甘脂，尤其是复杂神经节甘脂的平台，对于向神经元递送治疗而言更具前景。
AB5毒素合成于数种细菌病原体和植物，其包含单体酶活型A亚基和五聚体结合型B亚基。A亚基是由两个结构域A1和A2组成的单一多肽，这两个结构域通过二硫键连接在一起。A1结构域包括负责向宿主细胞施放毒性的酶促结构域。A2结构域由α螺旋组成，其穿透进入B亚基的中央孔，由此将A亚基和B亚基非共价地锚着在一起，以形成全毒素(holotoxin)。
存在AB5毒素的四个主要家族：霍乱毒素(CT)家族、百日咳毒素、志贺毒素，和枯草杆菌蛋白酶细胞毒素。霍乱毒素(CT)家族包括来自霍乱弧菌(Vibrio霍乱)的CT以及大肠杆菌(大肠杆菌)的热不稳定肠毒素(LT)：LTI、LTIIa、LTIIb和LTIIc。LT是多聚型蛋白质，其包含两个功能不同的结构域：具有ADP-核糖基化活性的酶活性A亚基，和包含GM1(单唾液酸神经节苷脂)受体-结合位点的五聚体B亚基。表1显示CT和LT AB5毒素的生化性质和生物性质。CT样和LT样毒素通过结合细胞表面上的神经节甘脂来进入宿主细胞，这导致内吞作用。在过去的20年中，CT和LT已发展为刺激免疫或遏制自身免疫的佐剂。CT和LT利用神经节甘脂作为宿主受体。例如，CT、LTI和LTIIc结合GM1a；LTIIa结合GD1b；而LTIIb结合GD1a。
表1:AB5毒素。
需要相比仅仅减轻神经退行性疾病的症状而言能够至少减缓神经退行性疾病的进展的疗法。
发明内容
本文提供通用递送平台，其利用经修饰以包括异源性化合物的毒素来将功能性、异源性化合物递送至特定细胞。在一个实施方式中，所述毒素是AB5毒素。在一个实施方式中，AB5毒素是来自大肠杆菌的热不稳定性肠毒素(LT)。
第一方面，本文提供递送平台，其包含经修饰以纳入异源性化合物的毒素。所述毒素可以是AB5毒素。所述毒素可经修饰以去除A1结构域。在一些情况中，所述毒素选自下组：CT、LTI、LTIIa、LTIIb、LTIIC，和任何重组LT衍生物。所述毒素可以是LTIIa，并且所述异源性化合物可以是β-内酰胺酶。然而，在其它实施方式中，可采用能够有效地转移功能性异源性化合物的任何毒素。可利用本发明递送任何异源性化合物。在一些情况中，异源性化合物选自下组：β-内酰胺酶、骆驼科(camelid)抗体、Adam10和相关蛋白酶、TFEB、E3结合蛋白、BDNF、蛋白酶、激酶、P53、PTEN、pRb、SOD1、HFE、NOD2、CARD15、P53、PTEN、pRB，和GMCSF。
在另一个方面，本文提供一种治疗肉毒杆菌中毒的方法，所述方法包括，向有此需要的对象给予递送平台，所述递送平台包含经修饰以纳入β-内酰胺酶的AB5毒素，其中所述肉毒杆菌中毒被治疗。所述AB5毒素可以是LTIIa。
在另一个方面，本文提供一种治疗帕金森病的方法(PD)，其中，所述方法包括向有此需要的对象给予递送平台，所述递送平台包含经修饰以纳入异源性化合物的毒素，其中所述异源性化合物包含神经保护剂，并且其中所述PD被治疗。一些情况中，所述毒素是AB5毒素。所述毒素可经修饰以去除A1结构域。在一些情况中，所述AB5毒素是LTIIa。所述神经保护剂可选自下组：BDNF、Brn4，和颗粒蛋白前体(progranulin)。
在另一个方面，本文提供一种治疗囊胞性纤维症(CF)的方法，所述方法包括，向有此需要的对象给予递送平台，所述递送平台包含经修饰以纳入异源性化合物的毒素，其中所述异源性化合物包含CFTR多肽，并且其中所述CF被治疗。一些情况中，所述毒素是AB5毒素。所述毒素可经修饰以去除A1结构域。在一些情况中，AB5毒素是LTIIa。
本发明还提供一种治疗帕金森病的方法，所述方法包括，向有此需要的对象给予递送平台，所述递送平台包含经修饰以纳入BDNF的AB5毒素，其中，所述帕金森病被治疗。在一个实施方式中，所述AB5毒素是LTIIa。
附图简要说明
本专利或申请文件包含至少一幅有色附图。本专利或专利申请公开与彩色附图的副本将根据要求，在支付所需的费用之后由政府机关提供。
图1显示LTIIa和βlac-LTIIa的表达。(上图)编码LTIIa的A和B亚基的基因在pET28中表达，利用双顺反子T7启动子。B亚基经修饰以包含HA-His6表位，分别用于免疫检测和纯化。编码β-内酰胺酶的基因经亚克隆以替代A1亚基(βlac-LTIIa)。(中图)LTIIa、βlac-LTIIa，和βlac空-LTIIa的AB5组织示意图。(下图)通过SDS-PAGE分离且由考马斯蓝染色的，纯化的LTIIa、βlac-LTIIa，和βlac空-LTIIa。B亚基与A亚基的比率通过测(光)密度术来测定(B/A比列在各泳道下)。
图2A-2B显示βlac通过βlac-LTIIa的剂量依赖性递送。大鼠初生皮质神经元与40nMβlac-LTIIa在37℃孵育60分钟。细胞与CCF2-AM在室温孵育30分钟，然后由IF检测LTIIa结合(抗HA，左侧列)和βlac(抗FLAG，左数第二列)。显示了未切割的CCF2(右数第二列)，并且切割的CCF2(CCF2C)以蓝绿色显示(右侧列)。(B)大鼠初生皮质神经元与40nMLTIIa或0.1-40nMβlac-LTIIa在37℃孵育60分钟。CCF2的切割利用切割的CCF2与CCF2的荧光之比与所添加的βlac-LTIIa的关系来定量。
图3A-3C显示，相对于富含GM1a的Neuro-2a细胞，LTIIa能将被载物(βlac)更有效地递送进入富含GD1b的Neuro-2a细胞。Neuro-2a细胞用含0.5％FBS的DMEM中的10μg/ml神经节甘脂GD1b或GM1a在37℃加载3小时。细胞经冲洗并与40nMβlac-LTIIaB或LTIIa在37℃孵育60分钟。细胞用CCF2AM在室温加载30分钟，然后用抗HA抗体进行IF染色(红色)。未切割的CCF2显示绿色而切割的CCF2(CCF2c)显示蓝绿色。(B)底物CCF2的切割采用CCF2c/CCF2/HA荧光强度比来定量。(C)Neuro-2a细胞用GD1b加载，然后用40nMβlac-LTIIa、βlac空-LTIIa或LTIIa在37℃孵育60分钟，孵育单独进行或伴随0.1μg/ml的布雷菲德菌素A(BFA)进行。细胞经冲洗并用CCF2AM在室温加载30分钟。CCF2的切割利用CCF2c/CCF2/HA荧光强度比来定量。
图4A-4B显示递送，以及在β-lac-LTIIa进入神经元的过程中，β-lac与B亚基的分离。大鼠初生皮质神经元与40nMβlacF-LTIIa在4℃或37℃孵育60分钟。细胞经冲洗，然后用抗HA抗体(绿色)和抗FLAG抗体(红色)进行IF染色。(B)通过Cytofluogram，采用测定的皮尔森系数(PC)来显示HA和FLAG染色之间的代表性共定位。
图5A-5C显示，βlac-LTIIa切割BoNT毒性接触的初生皮质神经元中的CCF2。大鼠皮质初生神经元与2nM的BoNT/D在37℃孵育16小时。BoNT处理的神经元与40nMβ-lac-LTIIa在37℃孵育60分钟，孵育单独进行或伴随0.1μg/ml布雷菲德菌素A(BFA)进行，细胞经冲洗并用CCF2AM在室温加载30分钟，然后用抗HA抗体(红色)和抗VAMP2(洋红色)进行IF染色，VAMP2仅识别全长VAMP2。胞质CCF2以绿色显示，而切割的CCF2(CCF2C)以蓝绿色显示。(B)VAMP2的切割利用VAMP2/HA荧光强度比来定量。(C)底物CCF2的切割利用CCF2C/CCF2/HA荧光强度比来定量。
图6A-6E是VHH-B8-LTIIa的示意图。1nM浓度的BoNT/A与大鼠皮质神经元在37℃孵育2小时，此时移出毒素并向神经元添加指示量的VHH-B8-LTIIa(B8)，并另置3小时。细胞经固定并与作为细胞标志物的Alexa 647-麦胚凝集素(WGA；洋红色)孵育30分钟。IF分析针对BoNT/A处理的细胞中的HA(红色)和切割的SNAP25(SNAP25c，绿色)染色。(C)1nM浓度的BoNT/D与大鼠皮质神经元在37℃孵育2小时，此时移出毒素并向神经元添加指示量的VHH-B8-LTIIa(B8)，另置3小时。细胞经固定并与作为细胞标志物的Alexa 647-麦胚凝集素(WGA；洋红色)孵育30分钟。IF分析针对BoNT/D处理的细胞中的完整VAMP2(绿色)中的切割的SNAP25(SNAP25c，绿色)和HA(红色)进行染色。(D)切割通过如下方式定量：检测BoNT/A处理的细胞的SNAP25c/WGA荧光强度比和BoNT/D处理的细胞的VAMP2/WGA荧光强度比。(E)BoNT/A或BoNT/D(1nM)与大鼠皮质神经元在37℃孵育2小时，此时移出毒素并向神经元添加指示量的VHH-B8-LTIIa(B8)，放置过夜。切割如关于图D所述进行定量。数据经双尾斯氏t检验分析为SEM。*，P<0.05；**，P<0.005。标尺20μm。NS，不显著；o/n，过夜。
图7显示，相比富含GM1a的Neuro-2a细胞，LTIIa能更有效地将被载物(βlac)递送进入富含GD1b的Neuro-2a细胞。Neuro-2a细胞用0.5％FBS的DMEM中的10μg/ml神经节甘脂GD1b或GM1a在37℃加载3小时。细胞经冲洗并用40nMβlac-LTIIa或LTIIa在37℃孵育60分钟。细胞用CCF2-AM在室温加载30分钟，然后用抗HA抗体进行IF染色(红色)。未切割的CCF2显示绿色而切割的CCF2(CCF2C)显示蓝绿色。数据由双尾斯氏t检验分析。*，P<0.05；**，P<0.005；***，P<0.001。标尺＝20μm。
图8显示，相比Neuro-2a细胞和HeLa细胞，LTIIa能更有效地将βlac递送至神经元。40nM浓度的βlac-LTIIa与大鼠皮质神经元孵育；Neuro-2a细胞用GD1b或GM1a加载；且HeLa细胞用GD1b、GM1a、GM2或GD2在37℃加载60分钟。细胞用CCF2-AM在室温加载30分钟，然后用用抗HA抗体IF染色。底物CCF2的切割利用CCF2C/CCF2/HA荧光强度比定量。通过IF基于可检测的移位来绘制虚线。数据由双尾斯氏t检验分析。*，P<0.05；**，P<0.005；***，P<0.001。
图9A-9B显示，经工程改造的AB5毒素作为平台将功能性异源性蛋白质递送进入了神经元。AB5毒素包含催化活性结构域，其编码催化活性(A1)，和ADP-核糖基转移酶活性，针对霍乱毒素和大肠杆菌的热不稳定性肠毒素，和接头(A2)。A1和A2由二硫键接合。A2通过非共价相互作用，插入B5寡聚体。(B)构建LTIIa，其中A1结构域用β内酰胺酶(βlac-LTIIa)或针对BoNT/A(VHH-LTIIa)的LC的单一链骆驼科抗体替代，其允许通过LTIIA度量蛋白质向神经元中的移位，并使BoNT毒性接触的神经元中的LC失活。
图10A-10B。β-内酰胺酶(上图)CCF2-AM(英杰公司(Invitrogen))通过细胞膜的胞内定位测定。(中图)在胞液中，CCF2-AM具有Ex 409nm和FRET Em 520nm(绿色)，β-内酰胺酶切割CCF2，以使Em移至447nm(蓝色)。(下图)CCF2切割反应的示意图。(B).底物CCF2的切割利用CCFC/CCF2/DsRed(β-lac表达)荧光强度比定量。
图11.复杂神经节甘脂。显示4种常见的脑神经节甘脂。脑和运动神经元中富集的几种复杂神经节甘脂，包括GT1b、GD1b和GD1a，而GM1a存在于神经元的膜以及非神经元来源中。A系列神经节苷脂具有sia6唾液酸(SA)，而b系列神经节甘脂具有sia6 sia7 SA。
图12.CT和LT的基于结构的序列比对。指示了CT-GM1a结构中的神经节甘脂-结合区域：Gal4-结合区域(蓝绿色)和接触残基(#)、Sia6-结合(绿色)。标记出Sia5(紫色)和LTIIb(芥末黄)中的Sia7-结合。与糖残基形成氢键的残基标为红色#。全部五种蛋白质中的保守残基用黄色高亮标记，并且在仅三种LTII衍生物中保守的那些为粉红色。
图13.工程改造全BoNT(pan-BoNT)治疗。有两种方式能编码抗BoNT LC治疗。首先，SNAP25和VAMP2底物NAP25(141-206)和VAMP2(1o-94)的不可水解的SNARE结合衍生物将能被工程改造，以向7种BoNT血清型编码不可水解的P1'突变。初始时各自的高亲和性(+)SNAP25和高亲和性(+)VAMP2衍生物将替代LTIIa的Al结构域。接下来，两种SNARE治疗将融合以供胞内递送。然后，包含αLC/A和α-LC/B纳米抗体的VHH结构域的αLC抑制剂将被递送进入胞液，以中和胞内LC活性。初始的个体骆驼科抗体(camelids)将经工程改造以替代LTIIa的A1结构域，然后融合，以供胞内递送。为增强功效，将添加F盒结构域以靶向SNARE或αLC复合物，供于E3泛素连接酶降解。
发明详述
综述描述本发明材料和方法之前，应理解，本发明不限于所述具体方法、方案、材料和试剂，这些可发生变化。还应理解，本文所用术语的目的仅是描述具体实施方式，不应用来限制本发明的范围，本发明的范围仅受所附权利要求书的限制。
必须注意到，本文和所附权利要求书所用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数含义，除非上下文另有明确说明。同样，术语“一个”(或“一种”)、“一个或多个”和“至少一个”在本文中可互换使用。还应当注意，术语“包括”、“包含”、和“具有”可以互换使用。
除非另外定义，否则，本文中所使用的所有技术和科学术语都具有本发明所属领域普通技术人员通常所理解的同样含义。虽然可采用与本文所述类似或等同的任何方法和材料实施或测试本发明，但现在描述优选的方法和材料。本文具体提及的所有出版物和专利都通过引用全文纳入本文用于所有目的，包括描述和公开在出版物中报道的可与本发明关联使用的化学物质、细胞系、载体、动物、工具、统计分析和方法。本说明书引用的所有参考文献都应看作对本领域技术水平的指示。本文中所有内容均不应解释为承认本发明不能凭借在先发明而先于这些公开内容。
本文中提供的系统和方法至少部分基于发明人的如下发现：LT肠毒素能够以一定特异性将治疗性被载物递送至神经元，以中和胞内BoNT轻链活性。因此，本文提供用于将功能性、异源性化合物递送至特定细胞类型的通用递送平台，其中采用经修饰以供靶向递送功能性“被载物”(例如，治疗剂和其它异源性化合物)的毒素。因此，本文提供用于递送治疗性物质以治疗神经元中的潜伏性病毒感染、BoNT中毒，和神经退行性疾病的新方法。
在示例性实施方式中，所述用于递送功能性被载物的通用递送平台包含经修饰的毒素，本发明中，其为大肠杆菌(E.coli)热不稳定性肠毒素(LT)。LT在功能、结构，和免疫学上与霍乱弧菌(Vibrio cholerae)的霍乱毒素(CT)相关(Clements等，1978，Infect.Immun.21:1036-1039)。LT和CT被合成为全毒素(holotoxin)分子，其包含五个相同的亚基B和酶活性亚基A。硫醇还原后，亚基A分解成两条多肽链：酶活性A1肽和较小A2肽。本文中所用的术语“LT”指任何热不稳定性肠毒素，其由任何肠毒性的大肠杆菌(E.coli)菌株生成。术语“LT”涵盖大肠杆菌的LTI、LTIIa、LTIIb和LTIIc肠毒素，以及LTI、LTIIa、LTIIb、LTIIc的重组形式，其中A1亚基/结构域的任何部分已被异源性化合物(包括蛋白质、碳水化合物，和/或核酸)替代。该化合物将包含对人、动物或植物疾病具有特异性的特定治疗物。"经修饰"指，毒素的部分已被异源性化合物替代。在示例性实施方式中，毒素是热不稳定性肠毒素，AB5。在此类情况中，"经修饰"指：AB5毒素的毒性催化性结构域被功能性异源性化合物替代，以用于将功能性“被载物”递送进入神经元细胞的胞液(图1)。例如，在一些实施方式中，LTIIa毒素的A1结构域(残基1-172)被β-内酰胺酶或骆驼科单链抗体(其靶向肉毒毒素血清型A(VHH-B8)的轻链)替代，以提供经工程改造的细菌毒素递送平台，其能够跨越血脑屏障将治疗性化合物如β-内酰胺酶或VHH-B8递送至神经元。然而，毒素的结构域A的任何区域均可用特定的"被载物"化合物有效替代。在一些情况中，结构域B可经修饰以用于递送至特定细胞，这由本领域技术人员决定(还参见图13)。
本文中所用的术语“异源性化合物”指：与所述递送化合物不同的任何分子或化合物。在示例性实施方式中，可采用本发明的通用递送平台将能向靶细胞提供治疗或功能性益处的任何分子或化合物递送进入所述细胞。异源性化合物包括但不限于，β-内酰胺酶(β-lac)、骆驼科抗体、锌依赖性蛋白酶、转录因子EB(TFEB)、E3结合蛋白、脑源性神经营养因子(BDNF)、蛋白酶、激酶、p53、磷酸酶和张力蛋白同系物(PTEN)、超氧化物歧化酶1(SOD1)、人血色沉着病蛋白(HFE)、含有胱冬酶征募结构域的蛋白质15(CARD15)、成视网膜细胞瘤基因产物(pRB)，和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。
在一些情况中，经修饰的毒素递送平台包含β-lac-LTIIa，其中LTIIa平台高效且特异性地递送被载物(例如，异源性分子例如蛋白质或多核苷酸)进入神经元。能将该异源性分子共价连接至经修饰的肠毒素，以供靶向递送。
例如，用于采用本文提供的平台递送的异源性化合物或“被载物”是神经保护剂，其经修饰以用于递送至特定细胞以治疗帕金森病(PD)。PD是神经退行性疾病，其可由多巴胺能神经元退化所致。本文中所用的短语“神经保护活性”指，防止神经细胞死亡。该作用可以通过如下形式发挥：保护神经元细胞，即，神经元，免于凋亡或退化。用于评定神经保护活性的试验包括细胞活力测定(例如，XTT、MTT)、形态学试验(例如，细胞染色)或凋亡生化分析(例如，胱冬酶3活性等)。化合物例如BDNF、Brn4和颗粒蛋白前体(Progranulin)可提供针对PD或针对一种或多种其它神经退行性疾病的神经保护作用。因此，本文所述的递送平台的神经保护剂(例如，BDNF、Brn4、颗粒蛋白前体)的递送能够减缓临床进展并治疗帕金森病患者中的帕金森病症状。已知BDNF是治疗神经退行性疾病(例如，ALS)或糖尿病性周围神经病变的治疗剂(Mizisin等，Journal of Neuropathology and Experimental Neurology56:1290(1997))。Brn4是POU结构域转录因子家族的成员。Brn4诱导NSC分化成神经元，并且酪氨酸羟化酶(TH)和Brn4的共转染能够促进NSC分化成成熟多巴胺合成型神经元。PRGN在中枢神经系统中广泛分布，其作为神经炎症的调节剂，并且对于长期神经元存活起重要作用。本文中所用的“帕金森病症状”包括常见的帕金森病症状，例如运动迟缓，或随意运动缓慢、脑至骨骼肌的信号传送延迟、手、手指、前臂、足、口和下巴的震颤；僵硬，和平衡性差。此外，随意肌和不随意肌控制的丧失会导致与PD相关的多种次级症状。
在另一个实施方式中，本文提供的平台能将锌依赖性蛋白酶，例如，ADAM10(ADAM金属肽酶结构域10)、ADAM17或ADAM9递送至诊断患有或疑似患有阿兹海默症的对象的细胞，其中，锌依赖性蛋白酶的递送有益于那些特定的细胞。据信，ADAM10、ADAM17、ADAM9和其它相关蛋白酶(例如，跨膜蛋白ADAM家族的其它分泌酶)能切割淀粉样蛋白前体蛋白质(APP)并起始APP的蛋白水解加工。已显示，AD患者脑中的ADAM10免疫染色减弱(Bernstein等，2003，J Neurocytol 32(2):153-60)。携带人APP突变(V717I)的转基因小鼠中的ADAM10的神经元过表达增加了sAPPα分泌，减少了Aβ生成并防止其在斑块中沉积(Postina等，2004，J Clin Invest 113(10):1456-64)。
在另一个实施方式中，本文提供的联合递送平台能递送转录因子EB(TFEB)。已显示TFEB能减少亨廷顿氏舞蹈病的小鼠模型中的聚集和神经毒性。TFEB也是溶小体贮积疾病(LSD)(例如，庞贝氏症)的治疗靶标。例如，TFEB的过表达能减少小鼠PD模型中的糖原负载和溶酶体尺寸，改善自噬体加工，并减少自噬性碎片的体外聚集(Spampanato等，EMBO MolMed.2013年5月；5(5):691–706)。
在另一个实施方式中，胞内微小RNA(miRNA)可被递送至特定细胞以作为疼痛调节物(pain mediator)。miRNA是基因表达的关键调节物。例如，miRNA-let-7b诱导背根神经节(DRG)神经元中的快速内向电流和动作电位。
使用方法.在一个实施方式中，本发明的通用递送平台可用于递送治疗有效量的功能性、治疗性蛋白质至有此需要的对象。"对象"表示哺乳动物和非哺乳动物。“哺乳动物”指的是任意的哺乳动物纲成员，包括但不限于人类、非人灵长类，例如大猩猩和其他猿类和猴类；农场动物，例如牛、马、山羊、绵羊和猪；家养动物，例如兔、狗和猫；实验室动物，包含啮齿动物，例如大鼠、小鼠和豚鼠；等等。非哺乳动物的示例包括但不限于鸟类等。术语“对象”不表示特定年龄或性别。"有此需要的对象"表示已被诊断患有需要治疗的疾病或病症的动物或人对象。
具体而言，本文提供的通用递送平台可用于将治疗有效量的异源、功能性、治疗性化合物递送至对象的特定细胞，以治疗特定病症或疾病。例如，在一个实施方式中，本发明的通用递送平台可用于将功能性异源性蛋白质(例如，β-内酰胺酶)高效递送进入神经元的胞液以治疗肉毒杆菌中毒。
本文所用的“治疗有效量”指给予对象用于治疗疾病时，足以实现对疾病的治疗的化合物用量。根据所述化合物、治疗的疾病状态、治疗的疾病严重程度、所述对象的年龄和相对健康状态、给药路径和方式、主治医生或兽医从业者的判断、和其他因素，所述“治疗有效量”可以改变。就本发明目的而言，“治疗”或“处理”描述了管理和护理患者以用于对抗疾病、病症、或紊乱的目的。该术语包括预防性治疗(即预防)和缓解性治疗或处理。
"治疗"或"处理"包括给予本发明的化合物以防止所述症状或并发症的发作、缓解所述症状或并发症、或消除所述疾病、病症、或紊乱。例如，在一个实施方式中，本发明的通用递送平台可用于递送治疗性化合物，该递送对于LT-递送的治疗提供"功能获得性(gain-of-function)"益处，以修复宿主生理学的分子缺陷。在一些疾病中，替代甚至一小部分靶分子的功能即可有效于减缓疾病进展。例如，大多数囊胞性纤维症(CF)情况源自ΔF508突变或提前终止密码子(PTC)，其导致不稳定的mRNA和截短的CF跨膜转导调节物(CFTR)。已显示，通过促进ΔF508-CFTR介导的Cl(-)运输从内质网排出达到大于在非CF人支气管上皮培养物中所见的10％(预计该水平将导致CF患者中的临床益处)来部分修正运输缺陷，CF患者能显示意料不到的病症改善。用于修正CF的新策略已经鉴定了数种蛋白质靶标，其过表达或其siRNA敲减会促进ΔF508-CFTR加工/生物合成并增强ΔF508-CFTR通道活性(Collawn等，Expert Rev Proteomics.7(4):495–506(2010))。
本发明的通用递送平台可用于治疗任何疾病或病症，其中，治疗性化合物的靶向递送可以是有用的，所述疾病或病症包括，例如但不限于，肉毒杆菌中毒、亨廷顿病、帕金森病、阿尔茨海默病、庞贝病、带状疱疹、脑肿瘤(包括胶质瘤)、ALS、CF、脊髓损伤、血色素沉着症、克罗恩病、癌症、HIV、白血病、结核病等。如表2所示，本发明的通用LT递送系统可通过调节所用的LT平台来经调节以靶向特定病症或疾病。
表2:LT平台和靶向疾病
治疗性化合物的剂量将取决于待治疗的病症。期望将通过递送的化合物的功效确定的传统剂量用于该递送系统。此外，如果该LT递送系统或其"被载物"显示具有免疫刺激，则应定位并去除刺激免疫应答的表位，如Pastan及其同伴所述，他们鉴定并去除了绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)外毒素A(ETA)中的结合结构域中的免疫刺激表位，以促进ETA作为治疗性药物的应用。
通过下文描述将能够更好地理解本发明的这些和其它特征、目标和益处。在以下说明书中，参照构成说明书的一部分的附图，其中以说明性方式显示，但不限于，本发明的优选实施方式。关于优选实施方式的描述并不意在限制本发明以覆盖全部修改形式、等同形式和替代形式。因此应当参考用于对本发明的全部范围进行解释的所附的权利要求。
实施例
当然，提供以下实施例仅用于说明目的，并非旨在以任何方式限制本发明的范围。实际上，根据前述说明和后述实施例，本发明所示和描述以外的各种变化对本领域技术人员显而易见，所述变化也包括在所附权利要求书的范围之内。
实施例1.材料与方法.
质粒构建体.LTIIa(登录号JQ031711)A亚基和B亚基的大肠杆菌密码子优化序列采用双重IPTG-诱导型T7启动子(GenScript)合成，并亚克隆进入PET28a载体，用于表达。将His6和HA2表位加至B亚基的C末端，分别用于纯化和免疫荧光检测。LTIIa A亚基和B亚基编码前导序列，用于共翻译分泌进入周质。TEM1β-内酰胺酶(βlac，GenBank：AGW45163.1:氨基酸24-286)替代LTIIa(氨基酸1-172)的A1亚基，3X FLAG标签在β-lac(βlac-LTIIa)下游，生成βlac-LTIIa(图1)。定点诱变(S45A)产生βlac空-LTIIa，其缺乏β-lac活性。也将编码βlac和βlac空的DNA亚克隆进入DsRedmonoN1以分别构建pβlac-Dsred和pβlac空-Dsred。编码对具有C末端3X FLAG标签的BoNT/A(ALc-B8，GenBank编号FJ643070，氨基酸7-121)具有特异性的单一结构域骆驼科抗体(VHH)的DNA替代编码LTIIa(氨基酸1-172)的A1亚基的序列，产生VHH-B8-LTIIa。构建体通过DNA测序确认。
蛋白质表达和纯化.编码LTIIa、βlac-LTlla、βlac空-LTlla、βlacF-LTlla和VHH-B8-LTIIa的质粒转入大肠杆菌BL-21(DE3)。转化株在包含50μg的卡那霉素/ml的LB琼脂板上过夜生长，其为用于包含相同抗生素的液体培养(LB，400ml)的接种物。细胞在37℃培养至OD600为约0.6，此时用1mM IPTG诱导T7启动子表达。细胞以250rpm在16℃培养过夜。细胞经沉淀并在20mM Tris缓冲液(pH 7.9，具有25％蔗糖)中重悬。细胞用溶菌酶(0.1M EDTA中的0.16mg/ml)处理30分钟。在冰上，随后添加70mM MgCl2(终)并以5,000x g离心20分钟，以分离可溶周质和细胞。带His6标签的蛋白质采用Ni2+-NTA树脂(凯杰(Qiagen))从周质纯化。纯化的蛋白质透析进入20mM Tris缓冲液(pH7.9，含20mM氯化钠和40％甘油)。等分试样储存于-80℃下。
细胞和试剂.Neuro-2a细胞(ATCC；CCL-131)在杜氏改良伊氏培养基(DMEM，英杰公司)(含10％胎牛血清(英杰公司))中培养。细胞用pβlac-Dsred或pβlac空-Dsred，采用Lipofectamine LTX(英杰公司)按照生产商说明转化。大鼠初生皮质神经元如前所述培养。简言之，大鼠E18皮质神经元或大鼠E18海马神经元(BrainBits有限公司)在如下介质中培养：Neurobasal培养基(目录号21103；英杰公司)，补充有0.5mM Glutamax-I(目录号35050；英杰公司)、2％B27补充物(目录号17504；英杰公司)、和Primocin(英杰公司)。每五天补充一半培养基。神经元在铺板后第10-14天使用。肉毒杆菌神经毒素D型(BoNT/D)从肉毒杆菌(C.botulinum)菌株1873分离。150kDa蛋白质采用与先前描述用于从其它BoNT血清型分离毒素的那些相似的方法纯化。小鼠中的特定活性是1.1x 108LD50单元/mg。
Neuro-2a细胞和初生皮质神经元中的βlac-LTIIaB和LTIIa进入与移位。Neuro-2a细胞加载DMEM(含0.5％FBS)中10μg/ml的神经节甘脂GD1b或GM1a，在37℃持续3小时。细胞经清洗并用无血清DMEM中的40nM的β-lac-LTIIaB或LTIIa在37℃孵育60分钟。初生神经元用Neurobasal培养基(补充有B27和GlutaMAX)中的40nM的LTIIa、β-lac-LTIIaB在37℃或4℃孵育60分钟。细胞用Hanks平衡感盐溶液(HBSS)清洗，并加载CCF2-AM染料(英杰公司，按照生产商说明6X制备，以获得HBSS中的1X终浓度)。样品室温孵育30分钟并清洗，然后如下所述进行免疫荧光染色。
VHH-B8-LTIIaB对BoNT-中毒的神经元的作用。大鼠皮质神经元用1nM的BoNT/A或BoNT/D在37℃孵育2小时，移去毒素，并将指示量的VHH-B8-LTIIaB(B8)与神经元在37℃另孵育3小时。细胞经固定并用Alexa 647-麦胚凝集素室温(RT)孵育30分钟。免疫荧光(IF)染色，如下所述，检测BoNT/D处理的细胞中的BoNT/A切割的SNAP25(SNAP25c)或完整VAMP2。SNARE底物的切割对于BoNT/A接触的细胞利用荧光强度比SNAP25c/WGA定量，对于BoNT/D接触的细胞利用VAMP2/WGA定量。在该实验的其它参数中，神经元用1nM的BoNT/A或BoNT/D与指示量的VHH-B8-LTIIa在37℃孵育过夜，并如上所述评价SNARE底物切割。
IF染色.细胞用DPBS中的4％(重量/体积)多聚甲醛RT孵育15分钟，用DPBS清洗两次，用DPBS中的4％甲醛中的0.1％曲通X-100RT透性化15分钟，与DPBS中的150mM甘氨酸RT孵育10分钟，用DPBS清洗两次，并进行IF染色。经处理的细胞在封闭溶液(DPBS中的10％常规山羊血清、2.5％冷鱼皮明胶[西格玛]、0.1％曲通X-100、0.05％吐温20)中孵育1小时(RT)，然后添加抗体孵育溶液(DPBS中的5％常规山羊血清、1％冷鱼皮明胶、0.1％曲通X-100、0.05％吐温20)中的一抗(抗HA抗体(罗氏)和抗FLAG抗体(西格玛))，4℃过夜。细胞用DPBS+0.05％吐温20洗涤三次，然后用抗体孵育溶液中的山羊或大鼠IgG Alexa-标记的二抗(分子探针公司(Molecular Probes))，持续1小时(RT)。细胞清洗3次，用DPBS中的4％多聚甲醛固定15分钟(RT)，并用DPBS清洗。添加封固剂Citifluor AF-3(电子显微镜科学公司(Electron Microscopy Sciences))，然后用装配有CFI Plan Apo VC 100×油镜，数值孔径(NA)1.49型物镜的Nikon TE2000全内反射荧光(TIRF)显微镜，用PhotometricsCoolSnap HQ2相机采集图像。图像分析采用Nikon NIS-Elements进行。图像利用Canvas X(ACD系统公司)编辑。
数据分析和统计学.图像用等同曝光时间和条件产生。图像强度分析和共定位分析采用Image J 1.48b(NIH)进行。数据统计学分析采用GraphPad Prism 5.0(GraphPadSoftware，加利福尼亚)进行。
结果.βlac在Neuro2a细胞中具有催化活性。采用基于FRET的试验来检测神经元细胞中的βlac。简言之，细胞用CCF2-AM(一种杂环小分子)孵育，其通过细胞膜并由胞质宿主酯酶转化成CCF2。胞内CCF2具有FRET性质。在409nm的激发下，CCF2显示520nm的FRET发射(绿色)，但β-lac切割CCF2且FRET信号丢失，并且发射迁移至447nm(蓝色)。Neuro-2a细胞用pβ-lac-Dsred或pβlac空-Dsred转染，并测试CCF2的激发/发射概况。表达βlac-Dsred但非βlac空-Dsred的细胞显示蓝色荧光，其支持CCF2的βlac依赖性切割(图2)。
βlac-LTlla组装成AB蛋白。SDS-PAGE分析评估了βlac-LTlla向AB蛋白复合物的组装。亲和性纯化的LTIIa、βlac-LTIIa和βlac空-LTIIa包含两个条带，其对应于A或LTIIa嵌合体内的βlac-A2的大小和B亚基，其中A:B比为5.4和5.2。由于蛋白质利用位于B亚基上的亲和性表位纯化，对于LTIIa和βlac-LTIIaB上的A亚基的检测支持βlac-LTIIaβ中的A-B组装(图1)。
LTIIa递送功能性被载物(β-lac)进入神经元。为了测试LTIIa能否递送功能性、异源性蛋白质进入神经元，工程改造嵌合LTIIa衍生物，β-lac-LTIIaB。酶活性βlac向初生大鼠皮质神经元中的合适递送通过CCF2FRET切割试验来测试。β-lac-LTIIaB与初生大鼠神经元孵育显示CCF2切割(蓝绿色)，而与LTIIa孵育不产生CCF2切割(图3A-C)。该结果支持LTIIa递送功能性、异源性蛋白质(β-lac)进入神经元的能力。β-lac-LTIIaB的滴定产生了一定比例量的CCF2切割，其中对于用低至0.1nM的β-lac-LTIIaB的量处理的细胞中β-lac活性进行检测。
为了研究异源性蛋白质递送是否具有“脱靶”作用，如果递送通过BFA敏感途径，则通过复杂神经节甘脂对LTIIa进行优选递送β-lac的评价。LTIIa以最高亲和性结合神经节甘脂GD1b，并以较低亲和性结合GD1a、GT1b、GQ1b、GM1和GD2。T84细胞中的GM1a不介导通过LTIIa的信号转导。Neuro-2a细胞不表达复杂神经节甘脂(例如，GD1b)，然而，在与外源性神经节甘脂孵育后，它们的膜可加载神经节甘脂。在膜与外源性神经节甘脂孵育后，相比GM1a处理的细胞，LTIIa以超过2倍更高效地将β-lac递送进入GD1b处理的细胞，这与相对于GM1a，LTIIa对GD1b具有较高亲和性相一致。BFA是真菌代谢物，其抑制分泌途径中的膜泡运输和真核细胞中核内体和高尔基潴泡/ER之间的小泡交换。BFA通过LTlla在GD1b加载的Neuro-2a细胞和大鼠初生神经元中抑制βlac移位，如对于天然LT所报告。这些实验指示，β-lac-LTIIaB不具有“脱靶”运输性质。
为了进一步研究β-lac被载物和β-lac-LTIIaB的B亚基的运输，将FLAG表位工程改造于β-lac的C末端以检测被载物定位，同时HA表位允许B亚基检测。FLAG标签不影响被载物通过LTIIA的移位，如通过基于FRET的切割试验对于β-lac活性所测定(图4A-B)。FLAG和HA表位在β-lac-LTIIaB在神经元上于4℃孵育之后具有0.64的皮尔森系数(PC)，这指示细胞结合时的共定位基线。在37℃孵育1小时之后，FLAG/HA的PC降至0.43，显示两个表位之间的隔离特征。这支持神经元细胞进入和被载物与神经元中LTIIa的B亚基的分离(图4A，4B)。
LTIIa递送功能性被载物(β-lac)进入BoNT/D-中毒的神经元。肉毒杆菌神经毒素切割SNARE蛋白以防止突触囊泡融合。为了确定LTIIa能否作为用于BoNT中毒的神经元的治疗递送平台，通过CCF2FRET试验检测LTIIa递送β-lac进入BoNT/D中毒的神经元的能力。大鼠初生神经元与2nM BoNT/D孵育过夜以切割内源性VAMP2，其通过IF染色来证实(图5A-5C)。这些神经元与β-lac-LTIIaB的孵育导致CCF2切割，其类似于未暴露至BoNT/D的对照神经元。这意味着βlac通过LTIIa的进入和移位在BoNT/D中毒的神经元中未受抑制(图5A、5C)。因此，LTIIa可以是用于BoNT治疗的有用的递送平台。
VHH-B8-LTIIa抑制大鼠皮质神经元中SNAP25的BoNT/A切割。为了评估LTIIa作为用于抗肉毒杆菌中毒治疗的递送平台的应用，工程改造一种LTIIa嵌合体，其中，A1亚基用单链可变区骆驼科抗体替换，该抗体已于先前显示靶向并抑制BoNT/A的LC(B8)(称为VHH-LTIIa)(图6A)。
初生皮质神经元与1nM BoNT/A或BoNT/D在37℃孵育2小时，经清洗，并与不同量的VHH-LTIIa孵育3小时，然后检测经切割的SNAP25(BoNT/A处理的细胞)或全长VAMP2(BoNT/D处理的细胞)(图6B，6C)。在仅用BoNT/A处理的细胞中检测经切割的SNAP25，而也用VHH-LTIIa处理的BoNT/A中毒的细胞显示经切割的SNAP25的剂量依赖性减少(图6D，6E)。对照显示，VHH-LTIIa抑制是血清型依赖性的，因为VHH-LTIIa不抑制VAMP2通过BoNT/D的切割。VHH-LTIIa也抑制孵育过夜的细胞的BoNT/A蛋白酶活性，显示该BoNT/A治疗的作用的潜在持久性。这是将功能性治疗物递送进入BoNT-中毒的神经元的第一个实施例。
讨论.在该实施例中，LTIIa被选择用于开发神经元特异的治疗性递送系统，基于LTIIa与复杂神经节甘脂GD1b(其在神经元组织中含量丰富)的高亲和性。LTIIa递送的β-lac作为报告被载物进入初生皮质神经元和加载有外源性GD1b的Neuro-2a细胞(图5)。在所有大鼠初生皮质神经元(图5)和Neuro-2a细胞(图6)中检测β-lac的移位。在体外，LTIIa对于GD1a、GT1b、GQ1b、GM1和GD2具有低亲和性，而对于GD1b具有高亲和性。因此，LTIIa可被开发为用于神经元细胞的递送平台。未来的研究将通过工程改造LTIIa以结合神经元特有的神经节甘脂来最优化神经元特异性。
β-lac-LTIIaB被检测为神经元特异的递送平台。βlac被载物进入并在BoNT/D中毒的神经元中移位，这支持了LTIIa作为BoNT中毒后的治疗性递送平台的应用(图8)。当治疗性骆驼科单一结构域蛋白VHH-B8通过LTIIa平台被递送至BoNT/A中毒的神经元时，VHH-B8抑制了通过BoNT/A的SNAP25切割(图8)。
BoNT的轻链在神经元内仍具活性，这可造成高达六个月的迟缓性麻痹。治疗性被载物的递送是中和神经元内的BoNT LC所必需的。VHH-B8-LTIIa不仅在与BoNT/A中毒的神经元孵育3小时时抑制SNAP25切割，而且当其与神经元伴随BoNT/A孵育过夜时也是如此(图9)，这提出了在BoNT中毒后的一项治疗方案。事实上，VHH-B8-LTIIa不影响通过BoNT/D的VAMP2切割，这进一步证实该治疗性平台的特异性(图8)。
在过去二十年间，在开发BoNT疫苗和中和抗体方面已有一定进展，然而，它们无法在BoNT已进入神经元细胞之后提供治疗。我们的研究首次将LTIIa用作平台来将治疗性被载物特异性地递送至神经元，以中和胞内BoNT轻链活性。
本发明的LTIIa-衍生物提供了用于递送治疗物以治疗神经退行性疾病、BoNT中毒，和神经元中的潜伏性病毒感染的新方法。
实施例2.LTII递送平台的功效和神经元特异性的表征.
实施例1中所述的LTIIa递送平台将异源性蛋白质组装成AB5构象，并将两种独立被载物，β-lac和骆驼科抗体(camelid)，通过BFA敏感途径递送进入神经元的胞液。这显示该LTIIa-衍生物向天然LTIIa一般运输，并且不通过“脱靶”机制。实施例1还显示，相对于GM1a，LTIIa被载物递送采用GD1b作为宿主受体则更高效，这显示LTIIa递送的神经元特异性。
在该实施例中，发明人表征了所述LTII递送平台的功效和神经元特异性。首先，发明人使LT的B亚基的免疫应答失活。定点诱变(QuickChange)将变化工程改造进入编码LTI的B亚基的DNA，以获得H57S取代，从而去除免疫调节活性。LTIIa和LTIIb的B亚基将经工程改造以去除TLR1/2响应区域(LT-BIIa的残基68-74)，这获得L73A/S74D取代，其直接接触TLR2；其中，各个别突变将巨噬细胞中的LTB介导的细胞因子活化减少至近背景水平。突变的B亚基和全毒素LTII形式将接受关于细胞因子刺激的评估，采用THP-1源性单核细胞。固相结合将测试突变是否消除TLR2结合，同时保留神经节甘脂结合。总之，这些实验将消除LT毒素的B-亚基的固有免疫调节性质。
对于神经元的多个细胞亚型，确定通过LTIIa(结合GD1b)、LTIIb(结合GDIa)和LTI(结合GM1a)的被载物递送的向性。我们已显示，相比培养的神经元细胞或非神经元细胞(例如，HeLa细胞)，LTIIa将被载物更高效地递送进入初生皮质神经元，这表明LTIIa对于初生神经元的趋向性。该实施例将研究对于多个神经元亚组的LTII毒素的向性，包括初生神经元细胞(脊髓、运动神经元、海马体，和皮质神经元，购自BrainBits)、培养的神经元细胞(PC-12，ATCC CRL-1721，Neuro-2a，ATCC CCL-131和C6-神经胶质细胞，ATCC CCL-107)，和非神经元细胞(上皮细胞，HeLa，ATCC CCL-2和内皮细胞，ATTC PCS-100-010)。细胞将被培养成单层，并与βlac-LTIIa、βlac-LTIIb或βlac-LTI孵育。各LT-衍生物的移位功效将采用β-lac作为报告物来测定，如初步结果中所述。培养的神经元和非神经元细胞将用个体的复杂神经节甘脂加载，并测试对于βlac-LTIIa、βlac-LTIIb或βlac-LTI的敏感性。这些实验将建立LTII-衍生物对于多种神经元亚组的功效阵列以及对于被载物移位的神经节甘脂优先性。这将初步指示对于神经元亚组中LT-衍生物的潜在异质性，这可促进对于脑部独特区域中个别LT-衍生物的优选靶标的鉴定。
检测细胞结合和胞内运输的效率.LTIIa(对GD1b有高亲和性)，LTIIb(对GDIa有高亲和性)，和LTI(对GM1a有高亲和性)将采用或不采用催化活性并采用A亚基(FLAG)或B亚基(HA)上的独特表位进行工程改造，以跟踪两种结构域的胞内移动。检测两种探测表位之间的共定位的皮尔森系数(PC)将建立LTII-衍生物的A和B亚基在细胞膜上(结合形式)的关联，然后随着LTII-衍生物进入细胞评估评估A和B亚基的关联，以建立被载物蛋白质的胞内递送效率。
检测被载物移位进入细胞胞液的效率.βlac-LTIIa、βlac-LTIIb或βlac-LTI将用于检测被载物随着CCF2切割递送进入细胞胞液的效率(βlac移位至胞液的定量试验)。被载物移位至布雷菲德菌素A(BFA)质量的敏感性将确定运输和移位是否进展通过高尔基体，如对于天然LT观察到的那样。因此，BFA敏感性是对于通过LTII-衍生物的潜在“脱靶”运输的一项评估。培养的神经元细胞，例如Neuro-2a，具有限制性的复杂神经节甘脂，并且这些细胞的并且质膜将通过与外源性神经节甘脂，包括GT1b、GD1b、GD1a和GM1a孵育来“加载”，以评估通过各类神经节甘脂的运输如何影响运输和移位。神经节甘脂的加载效率将通过如下方式建立：采用神经节甘脂特异性抗体(α-GT1b抗体，密理博(Millipore))和毒素，其结合至特定类型的神经节甘脂(CTB，其仅结合至GM1a)。
确定胞内运输如何影响通过LTII的被载物递送的功效。A2的C末端RDEL序列将LTII靶向至内质网以促进A1亚基向胞质中的移位，并且删去RDEL序列将LT的运输重新分配进入其它递送途径。RDEL将从A2删除LTII(a-c)以确定对于LTII进入和β-lac移位效率的影响。皮尔森系数(PC)将检测带探测表位之间的共定位，并建立LTII-衍生物的进入进展和胞内递送β-lac被载物进入胞液的效率。通过布雷菲德菌素A的被载物移位的敏感性将确定运输是否通过高尔基体加工，以及其它进入途径是否提供高效移位或递送位点的改变。对于这方面是感兴趣的，因为早期研究中，相比βlac-LTIIa-衍生物(外周，延伸进入树突和轴突)，βlac-霍乱毒素-衍生物将被载物递送进入初生培养的神经元的不同亚细胞位置(中央)。对于BFA敏感性的评估也将确定通过不同LTII-衍生物的潜在的“脱靶”运输。总之，这些实验将检测C末端RDEL序列对于胞内运输和被载物移位的功效的影响。
预期结果.我们预期，LTBII毒素的TLR1/2结合区域中和有LTI的免疫调节区域中的突变将减少与TLR1/2受体的关联并减少细胞因子生成以控制(未受刺激的)水平。我们预期这些突变不会影响神经节甘脂结合、B亚基的五聚体状态，或与A2接头组装的能力。
LTII-衍生物在进入初生神经元的各独特亚组之后将具有独特功效和运输特性，并与具有各类神经节苷脂的培养的神经元细胞具有独特关联。被载物移位，将βlac递送进入胞液，LTIIa、LTIIb和LTI的潜力和神经节甘脂如何影响被载物移位效率将是独特的。注意，通过建立LTIIa、LTIIb和LTI对于培养的Neuro-2a细胞中GT1b、GD1b、GD1a和GM1a的优先结合，能够将运输性质和通过各LT-衍生物的各类神经节苷脂的被载物移位的功效相关联。这将确定与特定神经节甘脂的关联将如何影响运输和被载物输送。我们无法预计LTIIa或LTIIb在将递送被载物递送进入神经元方面是否是最高效的，但基于先前采用LTIIa和CT的研究，我们预计LTII-衍生物之一将在递送被载物方面相对于LTI更为高效。
预期从A2的C末端删去C末端RDEL将会使LTIIa分布进入核内体进入途径，这可增强效率和被载物移位的定位。我们初步预期RDEL的移除将延迟被载物向胞液内的递送，但不影响移位效率且将改变被载物胞内定位的位点，这可影响治疗的功效。该预测基于采用霍乱毒素的较早研究，其中观察到差异化的胞内运输，以及移除RDEL序列情况下的A亚基移位。
可选方案.我们没有预期工程改造B亚基中的点突变的问题，但如果这样做不高效，则可采用重叠PCR诱变来获得这些突变。如果点突变的B亚基保留残余的免疫活性，则将在TLR1/2结合区域中工程改造第三个点突变。将测试三重突变的B亚基的生物学性质，以确定其它功能(神经节甘脂/五聚化/A2接头组装)也受影响。还关注减少TLR2调节的突变也减少将A2接头组装进入B寡聚体的能力。如果A2组装受影响，则将在B亚基的残基73/74处工程改造更保守的突变，以促进A2接头，但消除通过TLR1/2的免疫刺激。例如，因为TLR-2-B亚基相互作用主要是疏水的，将利用疏水性的类别变化来消除TLR1/2相互作用，且不影响A2接头-B亚基相互作用。
如果神经节甘脂类别不影响LTII-衍生物的运输或被载物移位效率，则将在后续实验中采用最高效地组装异源性被载物的LT-II衍生物。此外，如果RDEL的缺失使得A亚基–B寡聚体相互作用无法进行，则将对保守取代进行工程改造以交换会消除对于高尔基体的靶向的RDEL，但保留亚基关联。
该实施例将对作为蛋白质递送平台的LTII-衍生物做出最优化，消除潜在的细胞因子刺激，并确定特定神经节甘脂受体如何相互作用和胞内运输如何影响被载物移位的效率和位点。该编类组的LTII-衍生物的获得将提供机会以测试LT-II衍生物在本发明其它部分中分析的特定被载物上的移位效率。
实施例3.最优化LTII对于神经元的神经元结合特异性.
在该实施例中，我们显示B亚基结合神经元的特异性和功效如何通过结合复杂神经节甘脂而被增强。脑中富含数种复杂神经节甘脂(图11)，包括GT1b、GD1b和GD1a，而GM1a存在于神经元的膜和非神经元来源中。目的在于通过靶向复杂神经节甘脂GT1b来减少LTII治疗的“脱靶”作用。LTIIa和LTIIb将经工程改造以结合GT1b。
具体而言，对于LTIIa，通过添加来自LTIIb的sia5唾液酸结合口袋将GD1b结合位点改变为GT1b结合位点。此外，对于LTIIb，通过添加来自LTIIa的sia7唾液酸结合口袋将GD1a结合位点改变为GT1b结合位点。
方法.增强LTIIa和LTIIb与复杂神经节甘脂GT1b的结合。诱变将在LTIIa中产生对于5’唾液酸的结合口袋，且在LTIIb中产生对于7’唾液酸的结合口袋以增加对于GT1b的亲和性。因为LTIIa天然结合GD1b，添加结合GT1b的能力将要求在GD1b结合位点上添加Sia5结合位点。包含Sia5位点的残基源自对霍乱毒素-GM1a结构建模(PDB:至LTIIb上(PDB:1TII)。该分析预期，残基50-59包含Sia5结合位点口袋，而残基30-35包含Sia7结合位点(图12)。因此，突变将被工程改造进入编码LTIIa的B亚基的DNA，其将经诱变以引入Sia5位点、51-YIPGGR-56(SEQ ID NO:1)→RISRAK(SEQ ID NO:2)，且编码LTIIb的B亚基的DNA将经诱变以引入Sia7位点，30-INNNTD-35(SEQ ID NO:3)→VNTNTR(SEQ ID NO:4)(表3)。
表3:对于LT的修饰.
如上所述产生的神经节甘脂对于LTII-衍生物的结合亲和性将通过固相试验检测，以建立亲和性变化并用于纯化的神经节甘脂。此外，神经节甘脂特异性的变化将测试神经节甘脂富集的Neuro2a细胞和大鼠初生皮质神经元中来自诱变的βlac-LTII-衍生物的βlac的进入和移位效率的变化之间的相关性，如上所述。
预期结果.GT1b结合的获得将增加LTIIa和LTIIb递送平台的功效，因为相对于天然LTIIs，GT1b将具有若干额外的直接神经节甘脂相互作用。我们预期，相比经修饰的LTIIb，诱变的LTIIa将以较高亲和性结合GT1b，因为相比LTIIb，LTIIa对于神经节甘脂具有固有高亲和性。因此，该分析将提供检测神经节甘脂亲和性如何影响递送功效的机会。我们预期，LTIIa和LTIIb对于GM1a的固有结合将不必然经修饰，因为他处已显示LTIIa与GM1a的结合不导致有成效的(productive)中毒。
可选方案.最初考虑可能需要额外的修饰来提供用于LTIIa结合GT1b的Sia5的口袋。如果两组突变不足以允许GT1b结合，则包含Sia5位点的口袋将通过突变LTIIa Y49R和I39M而体积增加，其位于Sia5口袋附近。另一考虑是，提出的这两个Ala突变不足以干扰LTIIa-Sia6相互作用以降低对于GM1a的亲和性。在该情况中，庞大的疏水残基将被导入，它们干扰T17之间的氢键以减少Sia6-LTIIa相互作用。如果经修饰的LTIIa或LTIIb对于GM1a固有结合，我们已定位对于Sia6与E11和H13的CT等同物的相互作用的B亚基区域(图13)且将对该区域进行诱变以降低经修饰的LTIIa和LTIIb对于GM1a的亲和性。
通过最优化LTIIa和LTIIb的结合性质以工程改造B亚基以结合特定类别的神经节甘脂，我们将确定运输至各神经节甘脂如何影响治疗物的递送效率和位置。
实施例4.工程改造LTII以递送BoNT治疗物以构建全血清型BoNT治疗。
该实施例将对我们对于LTIIa递送单链骆驼科抗体(B8)作为针对BoNT中毒的治疗的确定进行拓展。该治疗体外和/或在细胞中表达时中和BoNT，但没有用作治疗。中和胞内LC活性的治疗性方案包括递送：a)单链骆驼科(VHH)β-LC抗体(约14kDa)。Shoemaker及同事显示，VHH以高亲和性(Kd约1nM)结合BoNT-LC，抑制BoNT蛋白酶活性(K(i)约1nM)，并在哺乳动物神经元细胞中表达时保留结合特异性和抑制功能。
我们和他人已定位(map)了BoNT-LC和底物之间的相互作用，鉴定了涉及结合与水解的特定残基和底物中降低和增加LC与底物亲和性的特定突变，采用该信息，可将不可水解的高亲和性SNAP25和VAMP2底物工程改造为胞内LC抑制剂。
高亲和性SNARE底物抑制剂和骆驼科单一结构域抗体治疗融合以研究全血清型BoNT治疗的工程改造，和d)添加βTrCP的E3连接酶-结合结构域以靶向治疗-LC复合物至泛素降解途径。Shoemaker及同事已观察到，添加E3连接酶-结合结构域F盒(175-293)增强了胞内VHH的清除。逻辑上，初始实验将建立针对体外SNARE切割和培养的初生神经元中的BoNT中毒的治疗性功效。最有力的治疗将在BoNT中毒小鼠模型中测试。
用于工程改造被载物-LT衍生物的一般策略是替代靶向的LT(LTIIa、LTIIb或LTI)的A亚基的氨基酸1-170，其通过工程改造βlac或β-BoNT/A B8骆驼科单链抗体-LTIIa嵌合体来进行(图16A-16C)。
单链骆驼科β-LC抗体(VHH)中和BoNT-A和BoNT-B.表4显示将被用作由LTIIa递送的治疗性被载物的β-LC-骆驼科VHH的初生氨基酸序列。BoNT血清型特异性将采用异源性血清型BoNT测试。
表4:骆驼科单链抗体氨基酸序列.
SNARE结合抑制剂(高亲和性(HAf)-SNAP25和HAf-VAMP2)作为BoNT治疗.我们已于先前确定用于各BoNT血清型的最优SNARE结合结构域。SNAP25(残基141-206)将编码三种突变，它们不影响SNARE结合，但阻滞BoNT血清型A、E和C切割(R198A、I181E和A199D)。还将甘氨酸插在P1-P1’残基之间用于BoNT/A切割，因为该添加使对于LC/A的亲和性增加约10倍。VAMP2(残基10-94)将编码四种突变，它们不影响LC-SNARE结合，但阻滞BoNT血清型B、D、F和G切割(F77A、L60A、K59A和G82D)，和使对LC/B的亲和性分别增强约70倍(V42A、V43A、D44A、I45A)的四种突变。注意，该治疗可经修饰的，其中鉴定“新”BoNT血清型，例如，“新”BoNT/F和假定的BoNT/H。8采用高亲和性不可水解的SNARE底物用于多种LC血清型应使这些底物相对于天然SNARE蛋白质具有优先性。
全BoNT治疗:(HAf-SNAP25-HAf-VAMP2-LTII)和BoNT/A-BoNT/B治疗。(α-LC/A-α-LC/B)重叠PCR将工程改造SNAP25-VAMP2-LTII和αLC/A-LC/B-LTII基因融合，其将被组装进入LTII从而产生全血清型BoNT治疗。SNARE蛋白质或骆驼科α-LC VHH的融合可包括(GGGGS)3肽接头以促进柔性。
利用添加的顺-E3泛素连接酶F盒增强治疗性功效。编码βTrCP的F盒(E3泛素连接酶结合结构域，残基175-293)的基因融合至SNAP25-VAMP2，并使β-LC抑制剂包括活性基(active basis)(泛素靶向)以清除胞内BoNT LC。
编码治疗剂的DNA将通过重叠PCR被工程改造进入LTII平台。DNA将被测序用于验证。将通过如下方式评估治疗-LTIIa衍生物的移位效率和中和功效：靶向已在先前经BoNT/A或BoNT/B中毒的初生神经元，和，分别检测皮尔森系数或检测胞内SNARE蛋白质切割。非特异性作用的控制将包括分别针对BoNT/A或BoNT/B中毒的SNAP25-LTII和VAMP2-LTII的衍生物的滴定，其中，预期结果将是通过同源BoNT血清型治疗而非异源性血清型治疗提供对于BoNT攻击的保护。LTII组分的神经节甘脂特异性将通过如下方式确定：测试缺乏神经节甘脂结合的突变的LTII-衍生物，例如LTIIa(T34I)突变的功效。
BoNT-中毒后的最初几次治疗给予的范围是1小时至1个月，这基于我们团队的近期报告，建立了初生大鼠脊髓细胞以检测长期BoNT/A中毒。治疗将从0.1nM滴定至40nM，其中，对初生大鼠皮质神经元中的βlac-LTII嵌合体观察到对于被载物的递送的剂量响应，并且将通过Western印迹随时间推移监测SNAP25的再生。该定量允许后续修饰LTIIa递送平台以最优化BoNT-LTIIa治疗的移位效率。注意，最复杂全血清型SNARE结合抑制剂的大小是约30kDa，而中和BoNT/A和BoNT/B的α-LC抑制剂是约40kDa，这显示串联采用SNARE结合抑制剂开发全血清型BoNT治疗的潜在应用。实验将建立中和酶促底物切割反应中LC活性的功效，对于治疗的调节，包括调节被载物和平台之间的距离。
预期结果.我们预期工程改造治疗-LTII嵌合体将是直接的，而最优化表达和纯化将需要对培养条件和纯化方案进行滴定(titration)。治疗性-LTII应高效地组装，基于我们已工程改造且在初步结果部分中描述的衍生物。α-LC骆驼科-LTIIa的功效应是BoNT血清型特异性的。SNARE结合抑制剂治疗的益处是能够修饰SNARE抑制剂以解决对于“新”BoNT血清型的发现。添加E3泛素连接酶F盒将增强治疗的中和功效，这导致较快的治疗性功效(图13)。我们预期该平台不会显示免疫-刺激性。
可选方案.如果其它骆驼科-LTII或SNAP25-VAMP2-LTII衍生物限制了针对BoNT攻击的保护，则实验将建立用于受限的BoNT中和的基础，检测在酶促反应中中和LC活性的功效。这还将允许估计中和LC所需的衍生物的量。这些实验将提供关于LC中和和进程中关于速率限制步骤的信息。我们预期沿着A亚基在可选位点插入被载物可产生更高效的蛋白质表达和/或组装进入和AB5结构。如果稳定性或组装显示对于工程改造的任何被载物-LT嵌合体的限制，则采用基于结构的蛋白质结构保守性的预测，测试被载物插入的若干位点。还将相对于具有中和能力的B8-α-LC/A骆驼科-LTIIa来测试D4α-LC/A骆驼科。该分析应提供关于骆驼科VHH的中和机制的新信息。仅在细胞模型中而非体外评估F盒E3泛素化连接酶的作用。如果LTIIa或被载物显示免疫刺激，则应如Pastan及其同伴所述定位刺激该免疫应答的表位，他们鉴定了绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)外毒素A(ETA)中的结合结构域中的免疫刺激表位，以促进ETA作为治疗性药物的应用。如果高亲和性SNARE抑制剂显示对于BoNT/A和BoNT/B的有力的治疗，则应通过蛋白质建模来预测其它BoNT血清型-SNARE底物相互作用并将该突变引入SNARE抑制剂。蛋白质治疗物也可以反式加入以测试功效对比融合蛋白。可将新治疗物纳入如此发现的LTII平台。
该实施例将协助鉴定可通过LT平台递送进入神经元的最优治疗物并建立用于生成各LT-衍生物的最优稳定性和最优功效。
实施例5.确定小鼠-/+反α-BoNT抗血清中BoNT治疗的功效。
将细胞培养实验中鉴定的最有力的中和α-BoNT被载物-LTII治疗作为BoNT中毒小鼠模型中的一种疗法进行测试。该分析将采用BoNT/A标准制备物来建立至死亡曲线的平均时间(ATTD)。IV方法采用浓集的BoNT溶液在30–70分钟内产生毒性数据，而IP方法采用更稀释的BoNT溶液在3–4天内完成。我们还生成了兔全血清型特异性α-BoNT-HCR(A-G)抗血清(由Covance产生)，其将以反式添加以确定α-BoNT抗血清的反式添加是否作用以降低毒素负载，作为补充治疗性策略。除了胞内轻链的胞内持久性以外，这将指示增强BoNT毒性持续的胞外BoNT的存在。
确定肉毒杆菌中毒中至死亡曲线的平均时间(ATTD)模型中的BoNT治疗功效。细胞培养实验中最有力的中和抗BoNT被载物-LTIIa将在BoNT中毒小鼠模型中测试为一种疗法，初始采用BoNT/A和BoNT/B攻击。该分析能由BoNT/A标准制备物来建立至死亡曲线的平均时间(ATTD)。IV方法采用浓集的BoNT溶液在30–70分钟内产生毒性数据，而IP方法采用更稀释的BoNT溶液在3–4天内完成。初始时，BoNT-治疗伴随BoNT攻击(10LD50)给予，然后，继BoNT攻击之后给予(在攻击后1小时给予并根据观察到的结果数据延长该时间)。相对于接种体积，初始治疗将以40nM给予，然后将基于初始攻击实验的结果向上或向下滴定。通过BoNT-治疗检测的保护之后将采用异源性BoNT血清型进行攻击实验以测试“脱靶”作用，如前所述。对于BoNT治疗的宿主响应(促炎性免疫细胞因子生成)和免疫原性(对于LTIIa或被载物的抗体的刺激)将通过在BoNT-治疗性处理后24和48小时收集血清来确定。
确定BoNT中毒吸入模型和食源性模型中的BoNT治疗的功效。还将在小鼠攻击实验中于食源性和吸入性负荷肉毒杆菌中毒中评估如上鉴定的最优BoNT治疗。这些攻击研究将应用BoNT复合物，因为这些将是BoNT的最有可能的武器化(weaponized)形式，鉴于这些形式具有较高稳定性且易于生成。已显示通过口服途径，BoNT/A复合物的毒性显著高于纯化的BoNT/A，而对于吸入途径则没有观察到毒素功效差异。在食源性肉毒杆菌中毒，小鼠将被通过胃内管饲法直接递送进入胃的测定量的BoNT所攻击。对于吸入模型，小鼠将用异氟烷进行轻度麻醉，然后将BoNT的20μl液滴(该模型将耐受高达50μl)置入一个鼻孔同时使该动物的头保持垂直式，直至BoNT被吸至最小液体，如前所述。这两种操作均在生物安全柜中进行。对于这两种给予途径，将对4小时内致死的各血清型确定BoNT剂量(约50LD50单位的BoNT/A，2μg毒素，将在IP注射后4小时之内致死)。这将是用于攻击研究的起始剂量，然后，如果小鼠活过了最初攻击，则增加10倍。小鼠将伴随BoNT攻击或在BoNT攻击之后，在攻击后1小时且延伸至BoNT中毒后2、3和4小时用BoNT治疗处理。
预期结果.该实施例将建立最优化的β-BoNT治疗的保护性功效，用于在肉毒杆菌中毒的至死亡曲线平均时间(ATTD)模型中进行保护，然后抵抗吸入肉毒杆菌中毒和食源性肉毒杆菌中毒。我们预期该治疗将提供抵抗各肉毒杆菌中毒模型的高水平保护，因为BoNT在进入血流后发挥其作用，它们从血流分布至周围神经系统。尽管BoNT鼻内递送已于先前被应用作吸入肉毒杆菌中毒模型，鼻内递送并不完美模拟可能导致更大毒性的气溶胶暴露。
可选方案.造成经口或吸入肉毒杆菌中毒所需的BoNT浓度仅关于BoNT/A被详细描述，而通过IP或IV注射则显著较低。因此，用于其它BoNT血清型的相关浓度将在该研究中建立。采用经口管饲法，能够给予足够大体积，其相对于BoNT/A的功效降低并不是困难。然而，对于鼻内递送，可被递送的最大体积是50μl。因为我们的毒素纯化常导致典型浓度在0.2–1mg/ml范围内的高度浓集的毒素，这将足以进行相比BoNT/A功效减少达50倍的BoNT递送。然而，如果BoNT血清型通过鼻内途径甚至力度更低，则应通过降低攻击剂量或给予重复毒素剂量来做出调节。
本发明不受限于前述实施例，但涵盖落在权利要求范围内的全部修改形式和变化形式。
序列表
<110> 威斯康星州医药大学股份有限公司(The Medical College of Wisconsin)
威斯康星校友研究基金会(Wisconsin Alumni Research Foundation)
J·T·巴比里(Barbieri, Joseph T)
陈晨(Chen, Chen)
A·普莱兹佩斯基(Przedpelski, Amanda)
E·A·约翰逊(Johnson, Eric A)
S·佩莱特(Pellett, Sabine)
<120> 用于异源蛋白质的功能性递送平台及其使用方法
<130> 650053.00362
<150> US 62/057,447
<151> 2014-09-30
<160> 9
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 6
<212> PRT
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 1
Tyr Ile Pro Gly Gly Arg
1 5
<210> 2
<211> 6
<212> PRT
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 2
Arg Ile Ser Arg Ala Lys
1 5
<210> 3
<211> 6
<212> PRT
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 3
Ile Asn Asn Asn Thr Asp
1 5
<210> 4
<211> 6
<212> PRT
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 4
Val Asn Thr Asn Thr Arg
1 5
<210> 5
<211> 10
<212> PRT
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 5
Tyr Ile Pro Gly Gly Arg Asp Tyr Pro Asp
1 5 10
<210> 6
<211> 10
<212> PRT
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 6
Arg Ile Ser Arg Ala Lys Asp Tyr Pro Asp
1 5 10
<210> 7
<211> 115
<212> PRT
<213> 羊驼(Lama pacos)
<400> 7
Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys
1 5 10 15
Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ile Tyr Ala Met Gly Trp Tyr Arg
20 25 30
Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala Ala Ile Ser Ser Tyr
35 40 45
Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser
50 55 60
Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys
65 70 75 80
Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Ala Asp Ile Ala Thr Met
85 90 95
Thr Ala Val Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 8
<211> 111
<212> PRT
<213> 羊驼(Lama pacos)
<400> 8
Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys
1 5 10 15
Ala Ala Ile Gly Ser Val Phe Thr Met Tyr Thr Thr Ala Trp Tyr Arg
20 25 30
Gln Thr Pro Gly Asn Leu Arg Glu Leu Val Ala Ser Ile Thr Asp Glu
35 40 45
His Arg Thr Asn Tyr Ala Ala Ser Ala Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser
50 55 60
Arg Asp Asn Ala Lys His Thr Val Asp Leu Gln Met Thr Asn Leu Lys
65 70 75 80
Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Leu Glu His Asp Leu Gly
85 90 95
Tyr Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
<210> 9
<211> 121
<212> PRT
<213> 羊驼(Lama pacos)
<400> 9
Ser Gly Gly Gly Met Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys
1 5 10 15
Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg
20 25 30
Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val Ser Ile Ile Asn Ala Gly
35 40 45
Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Ala Ile
50 55 60
Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu
65 70 75 80
Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Ala Ser Tyr
85 90 95
Tyr Cys Arg Gly Tyr Val Cys Ser Pro Pro Glu Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120

Claims (17)

1.一种递送平台，其包含经修饰以纳入异源性化合物的毒素。
2.如权利要求1所述的平台，其中，所述毒素是AB5毒素。
3.如权利要求2所述的平台，其中，所述毒素已经过修饰以移除A1结构域。
4.如权利要求2所述的平台，其中，所述毒素选自下组：CT、LTI、LTIIa、LTIIb、LTIIC，和任何重组LT衍生物。
5.如权利要求1所述的平台，其中，所述毒素是LTIIa且所述异源性化合物是β-内酰胺酶。
6.如权利要求1所述的平台，其中，所述异源性化合物选自下组：β-内酰胺酶、骆驼科抗体、锌依赖性蛋白酶、转录因子EB(TFEB)、E3结合蛋白、脑源性神经营养因子(BDNF)、蛋白酶、激酶、p53、磷酸酶和张力蛋白同系物(PTEN)、超氧化物歧化酶1(SOD1)、人血色沉着病蛋白(HFE)、含有胱冬酶征募结构域的蛋白质15(CARD15)、成视网膜细胞瘤基因产物(pRB)，和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。
7.一种治疗肉毒杆菌中毒的方法，所述方法包括：向由此需要的对象给予递送平台，所述递送平台包含经修饰以纳入β-内酰胺酶的AB5毒素，其中，所述肉毒杆菌中毒被治疗。
8.如权利要求7所述的方法，其中，所述AB5毒素是LTIIa。
9.一种治疗帕金森病的方法，所述方法包括，向有此需要的对象给予递送平台，所述递送平台包含经修饰以纳入异源性化合物的毒素，其中，所述异源性化合物包含神经保护剂，并且其中，所述帕金森病被治疗。
10.如权利要求9所述的方法，其中，所述毒素是AB5毒素。
11.如权利要求10所述的方法，其中，所述毒素已经过修饰以移除A1结构域。
12.如权利要求10所述的方法，其中，所述AB5毒素是LTIIa。
13.如权利要求9所述的方法，其中，所述神经保护剂选自下组：BDNF、Brn4和颗粒蛋白前体。
14.一种治疗囊胞性纤维症(CF)的方法，所述方法包括：向有此需要的对象给予递送平台，所述递送平台包含经修饰以纳入异源性化合物的毒素，其中，所述异源性化合物包含CFTR多肽，并且其中，所述CF被治疗。
15.如权利要求14所述的方法，其中，所述毒素是AB5毒素。
16.如权利要求15所述的方法，其中，所述毒素已经过修饰以去除A1结构域。
17.如权利要求15所述的方法，其中，所述AB5毒素是LTIIa。
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