JP2016527257A

JP2016527257A - ボツリヌス毒素の高純度神経毒成分の製造方法とその使用

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Publication number: JP2016527257A
Application number: JP2016530382A
Authority: JP
Inventors: プファイルミヒャエル; ビーゼンブルクアンドレアス
Original assignee: メルツファーマゲゼルシャフトミットベシュレンクテルハフツングウントコンパニーコマンディトゲゼルシャフトアウフアクティーン
Priority date: 2013-07-30
Filing date: 2014-07-30
Publication date: 2016-09-08
Anticipated expiration: 2034-07-30
Also published as: KR20160036581A; CN105658662B; US20180147266A1; KR102272580B1; AU2014298922B2; WO2015014487A1; HK1225744A1; JP6517800B2; IL243573B; RU2663136C2; MX2016001220A; BR112016001730B1; US10653754B2; IL243573A0; BR112016001730A2; US20160175407A1; CA2918233A1; US9937245B2; CA2918233C; RU2016103329A

Abstract

本発明は、ボツリヌス毒素の産生を可能にする条件下でボツリヌス菌を培養し、ボツリヌス毒素から神経毒成分を分離することにより、ボツリヌス毒素の高純度神経毒成分を調製するための方法に関する。さらに本発明は、本発明の方法により得られるボツリヌス毒素の高純度神経毒成分と、その使用とに関する。

Description

発明の分野
本発明は、ボツリヌス毒素の産生を可能にする条件下で、ボツリヌス菌（Clostridium botulinum）を培養し、ボツリヌス毒素から神経毒成分を分離することにより、ボツリヌス毒素の高純度神経毒成分（highly pure neurotoxic component）を調製するための方法に関する。さらに本発明は、本発明の方法により得られるボツリヌス毒素の高純度神経毒成分、及びその使用に関する。

発明の背景
ボツリヌス毒素は、人にとって最も強力なタンパク質毒素である。これは、神経筋接合部におけるアセチルコリン放出をブロックして、筋肉の脱神経を引き起こすことにより作用する。ボツリヌス毒素はまた、他の末梢のコリン作動性神経末端において活性を有し、その結果、例えば、唾液分泌や発汗の低下、及び顔のラインとしわの低減を引き起こす。これらの作用様式の特異性により、ボツリヌス毒素の臨床応用の範囲が継続的に増大しており、ボツリヌス毒素は、今日、薬理化粧品として広く使用されている。

ボツリヌス毒素は、特定のクロストリジウム属により、ボツリヌス毒素分子（「神経毒成分」）と、結合した非毒性の細菌タンパク質（「複合体化タンパク質」とも呼ぶ）とを含む大きな複合体の形態で、合成され放出される。複合体化タンパク質は、異なる非毒性の血球凝集素（ＨＡ）タンパク質、及び非毒性の非血球凝集素（ＮＴＮＨ）タンパク質を含む。毒素複合体の分子量は、７種の異なるボツリヌス毒素血清型（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、及びＧ）の間で、約３００ｋＤａ〜約９００ｋＤａの間で変動する。複合体化タンパク質は、神経毒成分に安定性を提供する。毒素複合体とは異なり、神経毒成分はその分離された純粋な形態で、すなわち複合体化クロストリジウムタンパク質を欠いた形態で、酸に不安定であり、消化管での攻撃的環境に耐えられない。

神経毒成分は、７種のすべての既知のボツリヌス毒素血清型について、約１５０ｋＤａの分子量を有する不活性な１本鎖前駆体（切断されていないポリペプチド）として合成される。この１本鎖前駆体は、タンパク質分解的切断によって活性化されて、ジスルフィド結合した二本鎖タンパク質を生成する。５０ｋＤａの軽鎖は触媒ドメインを含み、一方、１００ｋＤａの重鎖は、内部転位ドメインと受容体結合ドメインとを含む。１００ｋＤａの重鎖は、シナプス前コリン作動性神経末端への結合と細胞内への毒素の内在化とを媒介する。５０ｋＤａの軽鎖は、毒性作用の原因であり、亜鉛エンドペプチダーゼとして作用し、膜融合を担当する特定のタンパク質（ＳＮＡＲＥ複合体のタンパク質）を切断する。神経細胞内の膜融合のプロセスを破壊することによって、ボツリヌス毒素は、シナプス間隙へのアセチルコリンの放出を防止する。

ボツリヌス毒素血清型Ａ複合体（ＢｏＮＴ／Ａ複合体）は、最初は１９８９年に米国において、斜視、眼瞼痙攣、及び他の障害の治療用に、ヒトでの使用が承認された。今日ではボツリヌス毒素複合体の「Ａ」型は、いくつかの供給源から、例えばAllerganから商品名Botox（登録商標）で、Ipsenから商品名Dysport（登録商標）で、及びGaldermaから商品名Azzalure（登録商標）で市販されている。

しかし、多数の症例では、患者は、ＢｏＮＴ／Ａ複合体の繰り返し注射に応答して、中和抗体を産生した。この作用は、ＢｏＮＴ／Ａ複合体の複合体化タンパク質と関連していると考えられている。患者は、いわゆる「二次非応答者」となり、ＢｏＮＴ／Ａ複合体を用いた治療はもはや効果的ではない。そのような抗体誘導性の治療の失敗のリスクは、この処置された対象の１０％〜２０％以上に影響を与えることが分かった。ボツリヌス毒素複合体の使用に関連する別の欠点は、標的筋肉への注射後の、その局所的又は全身性の広がりである。例えば、単繊維筋電図検査（ＳＦ−ＥＭＧ）を用いた研究は、注射部位から離れた筋肉におけるジッターの増加を示した。

これらの欠点は、純粋な神経毒成分の投与では観察されない。具体的には、純粋な神経毒成分の投与は、非応答又は応答の減少のリスクを低減させ、これは、長期治療を受けている患者にとって特に重要である。純粋な神経毒成分に関連する他の利点は、作用の速やかな発現と優れた温度安定性あり、これは、コールドチェーンや冷蔵庫での貯蔵を必要としない。複合体化タンパク質無しでＡ型の神経毒成分のみを含有する製剤は、Merzから商品名Xeomin（登録商標）及びBoconture（登録商標）で市販されている。

神経毒成分は、ボツリヌス毒素を産生するクロストリジウム株を培養し、産生されたボツリヌス毒素複合体から神経毒成分を、一連の沈殿とクロマトグラフィー工程により分離することにより、調製することができる。天然に存在するクロストリジウム株が使用される場合、ボツリヌス毒素は、その活性な急性毒性の形態で産生され放出される。従って、ボツリヌス毒素の産生及び／又は毒素複合体からの神経毒成分の精製に関係する職員への、健康への好ましくない影響を避けるために、具体的な対策を取らなければならない。毒性エアロゾルへの曝露の危険性を低減するために、ＷＯ２００６／１３３８１８Ａ１号パンフレットは、毒性物質へのオペレータの接触を回避するために、例えば、周囲の製造室よりも低い圧力で運転されるアイソレーター中でボツリヌス毒素の産生を行うことを提唱している。

ＷＯ２００６／１３３８１８Ａ１号パンフレットに記載された製造方法は、適切な運転安全性を確保しているが、産生される神経毒成分の純度には改善の余地がある。製薬業界では、化学的及び微生物的な高い純度が非常に重要である。従って、薬物開発の最終目標は、所望の安全性及び有効性を確立するために、できるだけ高い薬物純度を達成することである。

発明の概要
従って、本発明の目的は、ボツリヌス毒素の高純度神経毒成分を安全な方法で調製するための改善された方法を提供することである。

第１の形態において、本発明は、ボツリヌス毒素の高純度神経毒成分を調製するための方法であって、
（ａ）ボツリヌス毒素の産生を可能にする条件下でボツリヌス菌（Clostridium botulinum）を培養する工程と、
（ｂ）ボツリヌス毒素から神経毒成分を分離する工程と、を含み、
ここで、培養工程（ａ）と分離工程（ｂ）とは圧力勾配装置中で行われ、この装置は、ボツリヌス菌を培養するための発酵槽を含む第１のアイソレーターユニットと、任意に、第２の又はさらなるアイソレーターユニットと、並びにＢＳＣ（生物学的安全キャビネット（Biological Safety Cabinet））の内外への材料の無菌的移送を可能にする移送システムを備えたクラスＩＩＢＳＣである安全作業台とを含む、方法を提供する。

第１及び第２の又はさらなるアイソレーターユニットは、エアロックを介して環境に接続されている製造室に配置され、ここで、第１及び第２の又はさらなるアイソレーターユニット内の圧力は製造室内の圧力より低く、製造室内の圧力は周囲圧力より低く、エアロック内の圧力は周囲圧力よりも高い。安全作業台もまた、製造室に位置している。

別の形態において本発明は、２．００重量％未満の１本鎖含量を有するボツリヌス菌毒素の高純度神経毒成分を提供する。

さらに別の形態において本発明は、本明細書に記載のボツリヌス菌毒素の高純度神経毒成分と、１種以上の医薬的に許容し得る担体とを含む医薬組成物を提供する。

さらに別の形態において本発明は、医薬として使用するための本明細書に記載のボツリヌス菌毒素の高純度神経毒成分を提供する。

さらに別の形態において、本発明は、筋肉又は外分泌腺の高活動性コリン作動性神経支配に関連する疾患の治療に使用するための、本明細書に記載ボツリヌス菌（Clostridium botulinum）毒素の高純度神経毒成分を提供する。

本発明の好適な実施態様は、添付された従属性特許請求の範囲に記載される。

発明の詳細な説明
驚くべきことに、これまで考慮されていないが、ボツリヌス毒素の神経毒成分の品質、特に純度に重大な影響を与え得る重要な製造パラメータが存在することが見出された。さらに、本発明の製造方法は、安全、健康、及び環境に関連する法律上の要件を満たし、かつ、安全で無害な作業環境を促進する。すなわち本発明は、製造プロセスの動作のさらなるモードが存在し、これは、環境と人間の健康問題に対して安全なだけでなく、優れた品質、特に優れた品質のボツリヌス毒素の神経毒成分を提供する、という予想外の発見に基づく。

第１の態様において、本発明は、ボツリヌス毒素の高純度神経毒成分を調製するための方法であって、
（ａ）ボツリヌス毒素の産生を可能にする条件下でボツリヌス菌を培養する工程と、
（ｂ）ボツリヌス毒素から神経毒成分を分離する工程と、を含む方法に関する。

本明細書において用語「ボツリヌス毒素」又は「ボツリヌス毒素複合体」は、交換可能であり、約１５０ｋＤａの神経毒成分と、さらに血球凝集素及び非血球凝集素タンパク質を含むクロストリジウム属の非毒性タンパク質とを含有する高分子量の複合体をを指す。また、用語「ボツリヌス毒素」及び「ボツリヌス毒素複合体」は、７種すべての毒素血清型（すなわち、血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、及びＧ）ならびにそのサブタイプ（例えば、Ａ１、Ａ２、Ｃ１、Ｃ２など）を包含ーすることを意図している。

本明細書において用語「神経毒成分」は、ボツリヌス毒素複合体（「純粋な毒素」又は「純粋な神経毒素」とも言う）中に含まれるボツリヌス毒素タンパク質分子を指す。すなわち、本発明の意味内で「神経毒成分」は、ボツリヌス菌の関連する非毒性タンパク質（血球凝集素及び非血球凝集素タンパク質を含む）が結合しておらず、これが欠如している。好ましくは、これはまた、神経毒成分に結合している可能性のあるＲＮＡを含まない。

さらに、本発明の意味の範囲内の「神経毒成分」は、約１５０ｋＤａの一本鎖前駆体タンパク質と、約５０ｋＤａの軽鎖（ＬＣ）と約１００ｋＤａの重鎖（ＨＣ）（これらは、一般に一つ又はそれ以上のジスルフィド結合によって連結されている）とを含む、タンパク質分解的に処理された２本鎖形態の神経毒成分とを包含する。未処理の前駆体が、いくつかの生物学的機能を発揮することができると考えられるが、完全な生物学的活性は、タンパク質分解的活性化後にのみ達成されることを、当業者は理解するであろう。「生物学的機能」とは、（ａ）受容体結合、（ｂ）内在化、（ｃ）エンドソーム膜を横切るサイトゾルへの転位、及び／又は（ｄ）シナプス小胞の膜融合に関与するタンパク質のエンドプロテアーゼ切断を指すことができる。

好ましくは、神経毒成分は、血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、又はＧの天然に存在するボツリヌス毒素複合体に由来する、本発明の文脈内で特に好ましい神経毒成分は、ボツリヌス菌毒素血清型Ａ、特にHall株（ＡＴＣＣ３５０２）により産生されるボツリヌス菌毒素Ａ型に由来する。しかしながら、本発明の文脈内で神経毒成分は、キメラ（融合）神経毒成分を含む組換え産生された神経毒成分でもよい。また、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は最大２０個のアミノ酸変異を含有する遺伝的に修飾された神経毒成分も含まれる。変異は、置換、挿入、又は欠失であってもよい。さらに、化学的に修飾されたアミノ酸、例えば、グリコシル化、アセチル化、脂質化、又は他の方法で修飾された１種以上のアミノ酸、を含む神経毒成分もまた、用語「神経毒成分」内に含まれる。

本発明の意味内で用語「高純度神経毒成分」とは、基本的に他の固体成分を含まず、本明細書において詳細に記載される方法により調製される、精製された神経毒成分、又はその組成物、調製物、もしくは製剤を意味する。さらに、本明細書で使用される用語「高純度」は、複合体化タンパク質（生成物関連不純物）、他のクロストリジウムタンパク質（生成物に関連しない不純物）、及び非クロストリジウムタンパク質を含まない、ボツリヌス毒素の神経毒成分、又はその製剤、調製物、もしくは組成物を指す。好ましくは、用語「高純度」は、少なくとも９９．９０重量％、より好ましくは少なくとも９９．９５重量％、最も好ましくは少なくとも９９．９９重量％の総純度を意味する。「総純度」は、本発明の高純度神経毒成分の試料の総重量当たりの、神経毒成分の１本鎖及び２本鎖形態の重量パーセントを意味する。本発明において、純度はドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって評価される。

工程（ａ）においてボツリヌス菌は、ボツリヌス毒素を生成するために、例えば、２％プロテオースペプトン、１％酵母エキス、１％グルコース、及び０．０５％チオグリコール酸ナトリウムを含む培地などの適切な発酵培地で培養（又は発酵）される。本明細書で使用される用語「培養する」は、用語「発酵する」と交換可能に使用される。用語「ボツリヌス菌」は、ボツリヌス菌タイプＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、又はＧ型を含むことが意図される。本発明の文脈内で、好ましくはＡ型、すなわちボツリヌス菌Ａ型のボツリヌス毒素を産生するボツリヌス菌株が用いられる。特に本発明に用いるのに好適なのは、ボツリヌス菌Ａ型Hall株（ＡＴＣＣ３５０２）（以下において「Hall株」と呼ぶ）である。毒素複合体を生成するためにボツリヌス菌を培養する方法は、当該分野で公知である（例えば、Schantz E. and Kautter D., J. Assoc. Off. Anal. Chem. 61 :96-99, 1978を参照）。

本発明の方法の工程（ａ）において発酵（培養）温度は、使用される特定のボツリヌス菌株及び発酵条件に依存する。好ましくは、温度は常に、事前に定義された狭い温度範囲内に維持される。例えば、ボツリヌス菌毒素Ａ型、特にHall株の産生のためには、発酵温度は、好ましくは３３．５℃±１．０℃、より好ましくは３３．５℃±０．５℃、そして最も好ましくは３３．５℃±０．２℃に設定され維持される。

約３３．５℃の一定温度は、ボツリヌス毒素産生のための最適な温度であることが、本発明者らによって発見された。高すぎるか、低すぎるか、及び／又は変化しすぎる温度は、ボツリヌス菌による望ましくない化合物の製造を発生させる。驚くべきことに、発酵温度が上記に示した温度範囲内に制御されていない場合、神経毒成分の望ましくない不活性な１本鎖形態の量が大幅に増加することがわかった。なお、本発明の文脈内で、１本鎖形態の神経毒成分は、タンパク質分解処理されず、基本的に不活性であるため、望ましくない「不純物」であるとみなされることが、強調される。

本発明に沿って、発酵温度は好ましくは、加熱ジャケットを使用して、示された温度範囲に設定され維持される。本明細書において「加熱ジャケット」は、発酵槽の大きな表面積、典型的には側面全体を取り囲む材料であり、加熱することができる。例えば、加熱ジャケットは、加熱用の熱電基層、温度損失を回避するために絶縁層、及び発酵環境の危険から加熱ジャケットを保護するための防水外層などの、発酵に必要な温度安定性を提供するための異なる層を組み込むことができる。加熱ロッドによって温度を上昇させ維持することとは対照的に、典型的には本発明の方法の場合のように、培養培地が撹拌されていない場合でも、加熱ジャケットの使用は、培養培地中の異なる部位間の加熱の差を基本的に回避し、従って、均一な温度分布を確保する。

発酵中のクロストリジウム培養物（すなわち、細胞密度）の増加は、好ましくは培養液の濁度によって評価され、オンライン光プローブにより適切に追跡することができる。本明細書で使用される用語「濁度」は、試料を通して、光を散乱させ、吸収ではなく直線で透過させる光学特性を指す。濁度は、市販の濁度計により測定することができる。この濁度計は、通常、液体試料中に存在する粒子により、入射光線に対して直角に散乱される光の量を測定する。本例では、濁度計は、入射光線に対して９０°の角度で、培地中に存在する細菌細胞によって散乱される光を測定するために使用される。細胞密度（これは本明細書において、培養物の単位体積当たりのボツリヌス菌細胞数として定義される）を測定するために、濁度計は、市販の認定されたホルマジン濁度基準物質（すなわち、定義された粒子の懸濁液）で較正される。測定された濁度値は、本明細書においてホルマジン濁度単位（ＦＴＵ）として表される。

本発明の文脈において、発酵は一般に、培養物の細胞密度が細菌増殖のために増加した後、細胞溶解により減少するまで継続される。ボツリヌス菌Ａ型、特にHall株について、２４時間培養後の細胞密度は、好ましくは約１．３±０．３ＦＴＵである。２４時間後のｐＨは、好ましくは約５．７±０．２である。ボツリヌス菌Ａ型、特にHall株での発酵の終了時に、細胞密度は好ましくは０．８ＦＴＵ未満である。発酵終了時のｐＨは、通常約５．５±０．３である。

発酵時間は、再度ボツリヌス菌Ａ型、特にHall株について、典型的には６５〜８０時間の範囲で、好ましくは約７２時間、例えば７２時間±４時間、７２時間±２時間、７２時間±１時間、又は７２時間±０．５時間である。培養物容量は特に限定されないが、約１０〜４０リットルの範囲、好ましくは約２０リットルである。ボツリヌス菌Ａ型株、特にHall株を使用する発酵後のボツリヌス毒素複合体の収率は、発酵終了時の発酵培地１ｍｌ当たり、通常３．５±２．０μｇ、特に３．５±１．０μｇの範囲である。

濁度測定は、発酵ブロス中の細胞密度を決定するために従来から当該技術分野で使用されている透過光の測定とは異なり、装置固有ではなく、より正確な値を与え、特に、はるかに優れた再現性のある同等の測定結果を与える。予想外に、濁度測定による細胞密度の評価は、極めて正確で再現性があるだけでなく、プロセスを制御することを可能にし、従って、１本鎖形態の神経毒成分の形成が制限されることがわかった。従って、細胞増殖を追跡するための、特に発酵の終点を決定するための、濁度測定の使用は、最終生成物中の不要な１本鎖形態の量を減少させることを可能にする。これは、現在の精製方法が、活性ある（切断された）２本鎖形態から不活性な（切断されていない）１本鎖形態を分離することができないため、重要なプロセスの改善である。

本発明において、工程（ａ）のボツリヌス菌培養物は、好ましくは、（ｉ）５３０〜８５０ＦＴＵ、特に６００〜８００ＦＴＵ、さらに詳しくは６５０〜７５０ＦＴＵの細胞密度を有するボツリヌス菌の初期培養物を提供し、（ｉｉ）所定量の初期培養物を培地に添加することにより、得られる。好ましくは、初期培養物は、好ましくは５．０％〜１０．０％ｖ／ｖの量で、好ましくは７．７％〜８．２％ｖ／ｖの量で、発酵培地に添加される。さらに初期培養物は、嫌気性生菌数が、少なくとも５．０×１０⁵ｃｆｕ／ｍｌ（コロニー形成単位／ｍｌ）、特に少なくとも２．０×１０⁶ｃｆｕ／ｍｌ、さらに詳しくは１．０×１０⁷ｃｆｕ／ｍｌ超、最も１．０×１０⁷ｃｆｕ／ｍｌ〜１．０×１０⁸ｃｆｕ／ｍｌであることが好ましい。本発明の範囲内で、好気性又は嫌気性生菌数は、初期試料の連続希釈物を血液寒天プレート上に広げ、プレートを所定の温度（例えば３７℃）で所定の時間（例えば４０時間〜７２時間）、好気性又は嫌気性条件下でインキュベートし、増殖したコロニーを、特にPharm. Eur. 2.6.12 und USP <61>に従って計測することにより決定される。

初期培養物は、最初にボツリヌス菌を有する種培地の接種を伴う前培養物を調製し、適切な増殖温度（例えば３７℃）で細菌を増殖させることにより、得ることができる。得られた前培養物のアリコートは培地の接種に使用され、次に、適切な増殖温度で細菌を増殖させる。次に、得られた前初期培養物のアリコートを使用して、所望の細胞密度に達するまで、適切な増殖温度で培養培地に接種する。その後、得られた初期培養物のアリコートは、本発明の方法の工程（ａ）で使用される発酵培地の接種のために使用される。

本発明の範囲内で使用されるボツリヌス菌株（例えばHall株）の供給源は、ワーキングセルバンク（ＷＣＢ）の凍結アリコートの形で便利に提供することができる。ＷＣＢは、当技術分野で公知の技術に従って、それぞれの株のマスターセルバンク（ＭＣＢ）から樹立される。ＷＣＢの凍結アリコートを、例えば８００μｌのＷＣＢと凍結防止剤として２００μｌの滅菌グリセロールとを含むクリオバイアルの形態で提供することができる。一般的に、ボツリヌス菌、特にHall株の凍結アリコートの嫌気性生菌数は、少なくとも５．０×１０⁵ｃｆｕ／ｍｌ、好ましくは１．０×１０⁷ｃｆｕ／ｍｌ超である。凍結アリコート（例えばクリオバイアル）は、冷凍庫で−８０℃で、又は好ましくは液体窒素の気相中で約−１３０℃で保存してもよい。

本発明の方法の工程（ｂ）において、神経毒成分は、産生されたボツリヌス毒素（複合体）から分離される。ボツリヌス菌により産生された毒素複合体からの神経毒成分の精製法は、当技術分野で公知である（例えばDasGupta B.R. and Sathyamoorthy, V., Toxicon. 22:415-424, 1984；及びＷＯ００／７４７０３号パンフレットを参照）。精製の終了時に、精製された神経毒成分の濃度は、精製された神経毒成分の最終溶液１ｍｌ当たり、１００μｇ／ｍｌ〜５００μｇ／ｍｌの範囲である。

本発明内での使用のために、特にHall株を含むボツリヌス菌毒素Ａ型の神経毒成分の分離のために、適した分離法は、発酵の終了時にボツリヌス毒素の酸沈殿（例えば、３Ｎ硫酸を加えることにより；最終ｐＨは約３．５）の段階を含む。遠心分離後、沈殿物は抽出されて（例えば０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０で）、毒素複合体を溶液中に放出する。次に抽出物は、硫酸プロタミン沈殿（例えば２％硫酸プロタミン）に供されて、上清から核酸を沈殿させ、硫酸アンモニウムを使用して（例えば、上清１００ｇ当たり３８グラムの硫酸アンモニウムを加えることにより）上清から毒素複合体が沈殿される。

リン酸緩衝液（例えば５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０）で可溶化した後、毒素はさらに、次の順序で３回のイオン交換クロマトグラフィー工程により精製される：ＤＥＡＥセファロースファストフロー、Ｑセファロースファストフロー、及びＳＰセファロースファストフロー。グリセロールの添加後、最終溶出液は、滅菌フィルター（例えば、０．２２μｍフィルター）を通して濾過して最終生成物を得る。精製後、この最終生成物はその後さらに処理されて、例えば安定化助剤（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）又はショ糖）を補足されるか及び／又は凍結乾燥される。

本発明において、本発明の方法の培養工程（ａ）と分離工程（ｂ）とは、圧力勾配装置で行われる。この装置は、第１のアイソレーターユニットと、任意に第２の又はさらなるアイソレーターユニットと、ならびに安全作業台とを含む。安全作業台は、第１のアイソレーターユニット及び／又は第２の又はさらなるアイソレーターユニットに、材料、特にオートクレーブ処理することができない熱に敏感な材料（例えば、ワーキングセルバンク）を、無菌的に充填するために使用される。この目的のために、材料は、さらに以下に記載されるように、特定の移送システム（例えばGetinge Groupから入手可能なアルファ／ベータ−ポートシステム）を使用して、安全作業台からアイソレーターに移送されてもよい。これは、汚染（微生物、特に不純物）がより少なく、ボツリヌス毒素の高純度の神経毒成分を与えることが見出されたため、本発明の重要な態様である。

本発明の範囲内で、安全作業台は、ＢＳＣの内外への材料の無菌的移送を可能にする移送システムを備えたクラスＩＩＢＳＣである。本発明の意味の範囲内で「生物学的安全キャビネット」や「生体安全キャビネット」又は「ＢＳＣ」は、細菌、ウイルス、又は他の毒性もしくは病原性物質などの有害物質のリスクから、研究室の作業員や周囲の環境を保護するための、及び作業スペース内の材料の無菌性を維持するための、囲まれた換気された実験室作業スペースである。すなわち、ＢＳＣは、周囲環境からの実験の保護、及び実験からの周囲環境の保護を提供する。本発明の文脈内で、これはまた、滅菌工程無しで、アイソレーター１又はアイソレーター２への感熱材料（例えばセルバンク）の移送も含む。

好ましくは、安全作業台に使用されるＢＳＣは、米国疾病管理予防センター（U.S. Centers for Disease Control and Prevention (ＣＤＣ)）による分類では、クラスＩＩＢＳＣ、より好ましくはクラスＩＩ、タイプＡ１もしくはタイプＡ２ＢＳＣ、最も好ましくはクラスＩＩ、タイプＡ２ＢＳＣ（U.S. Department of Health and Human Services, Public Health Service; Centers for Disease Control and Prevention; National Institutes of Health. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Appendix A - Primary Containment for Biohazards: Selection, Installation and Use of Biological Safety Cabinets. 5th Edition, HHS Publication No. (CDC) 21-1112, Revised December 2009を参照）であり、及びＮＳＦ／ＡＮＳＩ基準４９−２００７（NSF International (NSF); American National Standards Institute (ANSI). NSF/ANSI Standard 49-2007. Class II (laminar flow) biosafety cabinetry. Ann Arbor (Ml); 2004を参照）で定義された。安全作業台は、典型的には製造室と同じ圧力で運転される。

ＢＳＣは、作業室と、作業室内の上部から下部に移送する一方向の空気流の空気を供給するための供給手段と、一方向の空気流の空気を排出するための排出手段と、を含む。生体安全キャビネットは、扱われる生成物の上に、無菌空気のカーテンを引くことによって動作する。その後、空気は作業面（例えば、テーブルやベンチ）の下に引かれて、上に戻る。空気の一部は排出され、一方、別の一部は再度作業スペースに導入されて、無菌空気のカーテンを引く。このシステムのある時点で、空気は、１つ以上のフィルター、通常ＨＥＰＡ（高効率微粒子空気のクラス）フィルターを通過し、従って、排出空気と再循環空気の両方が、無菌で粒状物不含となる。排気は、キャビネットの前面に引き込まれる空気により補給され、次に作業面の下に引き込まれて、作業面の下の内部のキャビネットから引かれる再循環空気と一緒になる。典型的なクラスＩＩ、タイプＡ１ＢＳＣの場合には、空気の約３０％は、排気ＨＥＰＡフィルターを通過し、約７０％は、供給ＨＥＰＡフィルターを通してキャビネットの作業領域に再循環される。クラスＩＩ、タイプＡ２ＢＳＣは、Ａ１タイプに類似しているが、最小の流入速度は、典型的には、約１００ｆｔ／分以上である。

本発明の意味の範囲内において、「ＢＳＣ」は「クリーンベンチ」ではないことを理解すべきである。本明細書で使用される「クリーンベンチ」は、水平層流「クリーンベンチ」又は垂直流「クリーンベンチ」を指し、これは一般に、粒状物不含環境を必要とする操作のためのクラス１００作業領域のみを提供する。補給空気は濾過され、排出空気は濾過されない。これに対して、ＢＳＣの場合、補給空気と排出空気の両方が濾過、例えばＨＥＰＡ濾過される。すなわち、クリーンベンチは生成物の保護のみを与え、作業員がクリーンベンチ上で操作される材料に曝露されることを防ぐことはしない。一般にクリーンベンチは、毒性物質、変異原性物質、又は発がん性物質、生物学的毒素、感染性物質（例えば、細菌、ウイルス、寄生虫など）を含む、任意の潜在的バイオハザード材料で使用するには不適切であり、作業に無菌状態が必要な場合は、一般的に使用することができない。

安全作業台の移送システムは、好ましくは、互いに着脱可能に接続された、第１の移送ユニットと第２の移送ユニットとを備え、ここで、第１の移送ユニットは、ＢＳＣの表面に実装された密閉可能な部分であり、通常ＢＳＣの壁に固定され、第２の移送ユニットは密閉可能な容器である。密封可能な容器は、ステンレス鋼、ポリエチレンなどの様々な材料で作ることができる。これは、例えば、剛性又は可撓性でもよく、例えば袋の形態であり、単回使用の又は再利用可能な容器であってもよい。好ましくは、移送システムは、アルファ部分とベータ部分（これらは、それぞれドア、ロック、及びシール機能を装備し、アルファ部分とベータ部分内に含まれる無菌又は毒性環境の完全性を破壊することなく、材料の連続的な移送を可能にしている）である２つの別々のユニットを含む、ＤＰＴＥ（登録商標）移送システム（Getinge）である。

本発明の圧力勾配装置は、第１のアイソレーターユニットと、任意に第２の又はさらなるアイソレーターユニットを備える。第１のアイソレーターユニットと第２の又はさらなるアイソレーターユニットは、ＢＳＣの内外への材料の無菌的移送を可能にする移送システムを備えたクラスＩＩＢＳＣである。一般に、神経毒との接触を防止するために、手袋が前面に取り付けられる。移送システムは、例えば、安全作業台に関連して上述したＤＰＴＥシステムであってもよい。第１のアイソレーターユニットは、ボツリヌス菌を培養する工程が実施される発酵槽を含む。第１の及び第２の又はさらなるアイソレーターユニットは、エアロックを介して環境に接続されている製造室に配置され、ここで、アイソレーターユニットと製造室とエアロックとの間に圧力勾配が形成される。

具体的には、第１及び第２の又はさらなるアイソレーターユニット内の圧力は、製造室内の圧力より低く、例えば製造室中より、１０〜１００Ｐａ、好ましくは２０〜８０Ｐａ、より好ましくは５０〜７０Ｐａ、最も好ましくは６０Ｐａ低い。さらに、製造室内の圧力は第１及び第２の又はさらなるアイソレーターユニット内の圧力よりも高いが、それでも周囲圧力より低く、例えば周囲圧力より、５〜５０Ｐａ、好ましくは１０〜３０Ｐａ、より好ましくは１２〜１８Ｐａ、最も好ましくは約１５Ｐａ低い。

エアロック内の圧力は周囲圧力より高く、例えば周囲圧力より、１０〜１００Ｐａ、好ましくは２０〜８０Ｐａ、より好ましくは２５〜３５Ｐａ、最も好ましくは３０Ｐａ高い。すなわち、典型的には、エアロックと製造室との間には、約１５〜１５０Ｐａ、好ましくは約３０〜１１０Ｐａ、より好ましくは約３７Ｐａ〜５３Ｐａ、最も好ましくは約４５Ｐａの圧力差がある。用語「周囲圧力」は、周囲の大気の圧力を意味し、一般に約１気圧であるが、地理的な位置や気象条件に依存して変化することがある。

第１アイソレーターユニットに関連して上述したように、第２の又はさらなるアイソレーターユニットはＢＳＣでもよい。これは、第１アイソレーターユニットと同じか又は異なる圧力で操作することができる。さらに、第１のアイソレーターユニットは、例えば、１つ以上のロック可能なエアロック、二重トラップ容器、又はポートにより、第２の又はさらなるアイソレーターユニットに接続されても接続されなくてもよい。本発明において、培養工程（ａ）及び分離工程（ｂ）は、第１のアイソレーターユニットで実施することができる。しかし、好ましくは、培養工程と少なくとも１つの段階の精製工程は、第１のアイソレーターユニットで行われ、残りの精製段階は、第２の又はさらなるアイソレーターユニットで行われる。第１のアイソレーターユニットは、高温で、例えば約１５℃〜５０℃、又は２０℃〜４０℃で操作することができ、第２の又はさらなるアイソレーターユニットは、より低い温度で、例えば約−５℃〜＋２５℃の範囲で操作することができる。本発明の文脈において使用される「約」という用語は、「約」又は「ほぼ」を意味する。数値の文脈では、厳密な数値的定義を使用することなく、この用語は、示された値又は範囲の±１０％の値を推定するように解釈されてもよい。

本発明の製造室は密閉され、その気密室は負圧で動作させることができる。これは、一つ以上のエアロックにより外部からアクセスすることができる。製造室は、安全作業台、並びに第１のアイソレーター、及び、任意に第２の又はさらなるアイソレーターを含む。製造室の内外への空気の供給は、フィルター、特にＨＥＰＡフィルターを介して行われる。製造室の内部では、温度が例えば１９℃〜２６℃に制御され、相対湿度が例えば４０％〜６０％、特に５５％に制御される。ボツリヌス毒素の製造に必要な又はこれに関連する測定又は検査を含む特定の操作又は活性は、特にこれらがエアロゾル形成に関連しない場合、又は生物学的活性物質が、ボツリヌス毒素産生に従事する者に危険をもたらすことのない形態で存在する場合、アイソレーターユニット外で実行することができる。

別の形態において、本発明は、２．００重量％未満の１本鎖含量を有するボツリヌス菌毒素の高純度神経毒成分に関する。好ましくは１本鎖含有量は、１．９０重量％未満、１．８０重量％未満、１．７０重量％未満、１．６０重量％未満、１．５０重量％未満、１．４０重量％未満、１．３０重量％未満、１．２０重量％未満、１．１０重量％未満、１．００重量％未満、０．９０重量％未満、又は０．８０重量％未満である。さらに、本発明の高純度神経毒成分は、総純度が、少なくとも９９．９０重量％、より好ましくは少なくとも９９．９５重量％、最も好ましくは９９．９９重量％であり、用語「総純度」は上記で定義された意味を有する。さらに、本発明のボツリヌス菌毒素の高純度神経毒成分は、精製後の最終生成物１ｍｌ当たり、すなわち、典型的には１００μｇ／ｍｌ〜５００μｇ／ｍｌの濃度のボツリヌス毒素の高純度神経毒成分を含有する溶液１ｍｌ当たり、エンドトキシン含有量が５．０ＩＵ以下、特に１．０ＩＵ／ｍｌ以下である。

さらに、本発明のボツリヌス菌毒素の高純度神経毒成分は、好ましくは、１００μｇ／ｍｌ〜５００μｇ／ｍｌの濃度のボツリヌス毒素の高純度神経毒成分を含有する溶液１ｍｌ当たり、総嫌気性生菌数が、１ｃｆｕ／ｍｌ未満、好ましくは０．５ｃｆｕ／ｍｌ未満、より好ましくは０ｃｆｕ／ｍｌである。

さらに、本発明のボツリヌス菌毒素の高純度神経毒成分は、ＬＤ₅₀アッセイで，４．０〜８．０ｐｇタンパク質／ＬＤ₅₀単位、特に５．０〜６．０ｐｇタンパク質／ＬＤ₅₀単位の生物活性（相対力価）を有する。生物活性の評価のために本明細書で使用されるＬＤ₅₀アッセイは当該分野で公知であり、例えばPearce L. B., Borodic G. E., First E. R., and MacCallum R. D., Measurement of botulinum toxin activity: evaluation of the lethality assay, Toxicol. Appl. Pharmacol. 128:69-77, 1994に記載されている。生物活性は「単位」（Ｕ）で表示され、ここで１Ｕは、腹腔内注射後に特定のマウス集団の５０％を死滅させる毒素（すなわち、神経毒成分）の相当量であると定義される。

上記のボツリヌス菌毒素の高純度神経毒成分は、本発明の方法により得ることができる。すなわち、本発明の好適な実施態様において、本明細書に記載のボツリヌス菌毒素の高純度神経毒成分は、本発明の方法により調製される。

さらなる形態において、本発明は、ボツリヌス菌毒素の高純度神経毒成分と、１種以上の医薬的に許容し得る担体と、を含む医薬組成物に関する。「医薬組成物」は、活性成分が含有されているか又は含まれる製剤である。医薬組成物の剤形は特に限定されないが、好ましくは非経口製剤、例えば、注射又は注入用の水性又は非水性の溶液又は分散液である。本発明の医薬組成物は、凍結乾燥又は真空乾燥されるか、復元されるか、又は溶液中にあってもよい。復元される場合は、復元される溶液は、滅菌生理食塩水（すなわち、０．９重量％のＮａＣｌ）を添加することにより調製されることが好ましい。

医薬組成物は一般に、本発明の神経毒成分の有効量を含む。本発明の範囲内で用語「有効量」は、投与後、疾患の症状又は状態の部分的又は完全な除去をもたらす、神経毒成分の量を意味する。治療上有効な量は、１回以上の投与、適用又は投薬で投与することができ、特定の製剤又は投与経路に限定されるものではない。有効量は一般に、１〜２０００Ｕの範囲である。しかし、最大５０００Ｕの用量を使用することができる。高用量の神経毒成分が対象に投与される場合には、治療を複数の治療セッションに分割することが有益であろう。用語「複数の治療セッション」とは、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０回の治療セッションを意味する。

本発明の文脈において、「担体」は、活性成分が投与される希釈剤又はビヒクルを意味する。本明細書で使用するのに適した担体は、無菌の液体又は分散物、特に、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition (2000)に記載されたような非経口投与（例えば、筋肉内又は皮下注射による）に適したものが挙げられる。好ましくは、担体は、水又は水性ｐＨ緩衝液、例えばリン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、又は酢酸緩衝液である。本明細書において用語「医薬的に許容し得る」は、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー応答、及び他の問題のある合併症の無い、哺乳動物、特にヒトの組織との接触に適した化合物又は物質を指す。

さらに、本発明の医薬組成物は、賦形剤、安定剤、及び／又は凍結防止剤などの追加の成分を含むことができる。賦形剤は、特に限定されないが、糖（例えば単糖又は二糖類、例えばショ糖）、塩（例えば塩化ナトリウム）、界面活性剤（例えば、非イオン性、アニオン性、又はカチオン性界面活性剤）、及びキレート剤（例えばＥＤＴＡ）が挙げられる。安定剤の例は、タンパク質性安定剤、例えばゼラチン又はアルブミン（すなわちＨＳＡ）、及び非タンパク質性安定剤、例えばヒアルロン酸、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、及びそれらの混合物を含む。凍結防止剤は、凍結乾燥中のタンパク質（すなわち、神経毒成分）に対する安定化作用を発揮し、特に、アルコール、特にイノシトール、マンニトール、又はグリセロールのような多価アルコールを含む。また医薬組成物は、本発明の神経毒成分と同時投与される１種以上のさらなる活性物質を含んでもよい。

好ましくは、本発明の医薬組成物は、本明細書に記載される高純度神経毒成分、ｐＨ緩衝液、好ましくはリン酸緩衝液、又は酢酸緩衝液、及びヒアルロン酸安定剤、又はポリビニルピロリドン安定剤、又はポリエチレングリコール安定剤、又はＢＳＡもしくはＨＳＡ安定剤を含む。さらに、医薬組成物は、多価アルコール及び／又は界面活性剤を含んでもよい。

さらに別の形態において、医薬としての、本発明のボツリヌス菌毒素の神経毒成分の使用に関する。本明細書で使用される「医薬」は、疾患の治療のためのボツリヌス菌毒素の神経毒成分を含む任意の組成物を指す。この文脈において用語「疾患」とは、特定の疾患に限定されず、身体機能、システム、又は臓器を破壊する任意の障害又は状態を含む。

さらに別の形態において、本発明は、筋肉又は外分泌腺の活動亢進性コリン作動性神経支配に関連する疾患又は状態を治療するための、本発明のボツリヌス菌毒素の神経毒成分の使用に関する。本明細書中で使用される用語「治療」は、疾患又は状態の治療的処置及び予防的処置（予防）、ならびに美容的処置を含む。本発明の意味の範囲内において「処置」は、一般に、筋肉又は外分泌腺の活動亢進性コリン作動性神経支配に関連する疾患又は状態を有する対象への、本発明の高純度のボツリヌス菌神経毒成分の有効量の投与を含む。

本明細書において用語「対象」は、哺乳動物、好ましくはヒトを指す。対象は、ボツリヌス毒素に曝露されたことがなくても、又はボツリヌス毒素に曝露されたことがあってもよい。この文脈で使用される用語「有効量」は、医薬組成物に関連して上述したものと同じ意味を有する。

本明細書において用語「活動亢進性コリン作動性神経支配」とは、シナプスに関し、シナプス間隙への異常に多量のアセチルコリン放出により特徴付けられる。「異常に多量」は、例えばその放出を、同じタイプのしかし活動亢進状態ではないシナプスでの放出と比較することにより得られる基準活性に対して、最大２５％、最大５０％、またはそれ以上の上昇に関し、ここで、筋肉のジストニアは活動亢進状態を示してもよい。「最大２５％」とは、例えば約１％〜約２５％を意味する。必要な測定を行うための方法は、当技術分野で公知である。

筋肉又は外分泌腺の活動亢進性コリン作動性神経支配に関連する代表的な疾患又は状態は、Dressier, D., Botulinum Toxin Therapy, Thieme, Stuttgart, New York, 2000に詳細に記載されており、特に限定されないが、ジストニア（例えば、頭蓋ジストニア、頸部ジストニア、咽頭ジストニア、喉頭ジストニア、四肢ジストニア）、化粧品としての使用（例えば、カラスの足、しかめっ面、顔面非対称、オトガイくぼみ）、斜視、外分泌腺活動亢進（例えば、フレイ症候群、クロコダイルの涙症候群、多汗症）、鼻漏、過流涎（よだれ）、痙性状態、及び他の疾患を含む。

筋肉又は外分泌腺の活動亢進性コリン作動性神経支配に関連する他の疾患は、例えば、口蓋ミオクローヌス、ミオクローヌス、ミオキミア、剛性、良性の筋肉けいれん、遺伝性顎震え、異常顎筋活動、反咀嚼痙攣、肥厚性鰓ミオパシー、咬筋肥大、前脛骨筋肥大、眼振、動揺視、核上注視麻痺、てんかん持続性部分、痙性斜頸手術の計画、外転声帯麻痺、難治性突然変異発声障害、上部食道括約筋機能不全、声帯肉芽腫、吃音、ジルドラトゥレット症候群、中耳ミオクローヌス、保護喉頭閉鎖、喉頭切除後音声障害、保護眼瞼下垂、内反、括約筋オッディ機能不全、偽アカラシア、非アカラシア食道運動障害、膣痙、術後固定、振戦、膀胱機能不全、片側顔面痙攣、神経再生のジスキネジア、スティッフパーソン症候群、破傷風、前立腺肥大症、肥満症治療、乳児脳性麻痺、アカラシア、及び裂肛を含む。

適切な投与経路は、特に限定されないが、非経口投与、特に皮下及び筋肉内注射を含む。投与計画は特に制限はないが、例えば、隔週、毎月、隔月に一度、３ヶ月、６ヶ月、及び９ヶ月に一度、及び年に一度を含むか、又は単回の適用投与スキームがある。対象に投与される本発明の高純度神経毒成分の治療上有効な用量は、適用モード、疾患又は状態のタイプ、対象の体重、年齢、性別、健康状態等に依存する。投与は、必要に応じて、単回又は複数回であることができる。本発明の高純度神経毒成分はまた、他の活性物質と同時投与することもできる。

本発明は、以下の非限定例により、さらに説明される。

以下の実施例は、本明細書に記載するような圧力勾配装置の使用が、無菌であり、極端に少ない数の浮遊粒子を有する作業領域の作成を可能にすることを示す。驚くべきことに、これは、全体的な生産品の品質に、特に神経毒成分の純度に関して、強い影響を与えることが見出されている。

実施例１
安全作業台の構築
ＤＰＴＥ（登録商標）移送システム（Getinge Group）の「アルファ」部分を、ＨＥＰＡフィルター（Thermo Fisher Scientific, Inc.）を装備したHERAsafe（登録商標）（NSF）クラスＩＩタイプＡ２生物学的安全キャビネットの右側の壁に取り付けた。剛性の移送容器（ステンレス製ＤＰＴＥ１９０ベータ容器）は、可動性ＤＰＴＥ（登録商標）「ベータ」部分として使用された。ＤＰＴＥ（登録商標）移送システムの２つの別々のユニット（アルファ部分とベータの部分）は、それぞれ、ドア、ロック、とシール機能が備わっており、アルファ部分とベータの部分内に含まれる無菌又は毒性環境の整合性を破壊することなく、毒性又は病原性物質の連続移送を可能にする。

以下に説明される全ての実験において、この安全作業台は、製造室で使用され、位置していた（製造室の圧力と比較して中立の圧力で運転）。製造室は、１９℃〜２６℃の温度と、周囲圧力に対して−１５Ｐａの圧力で運転された。製造室において、製造室の圧力と比較して−６０Ｐａの圧力で運転されたさらに２つのアイソレーター（アイソレーター１：発酵；アイソレーター２：精製）があった。製造室は、人員エアロックと材料エアロックにより環境に接続されていた。

実施例２
本発明のアイソレーターユニット内の微生物純度
本研究の目的は、本発明の方法を使用するボツリヌス菌の培養が、無菌条件下で行われることを示すことであった。従って、すべての培養操作は、微生物無しで３回連続の実験でシミュレートされた。すべての培養培地及び添加剤は、無菌試験のための培地（好気性又は嫌気性プロセス条件用のＴＳＢ−及びチオグリコール酸培地）に置き換えられた。

微生物汚染がないことを確認するために、別のプロセス工程から採取した試料を、少なくとも１４日間（しかし２１日間を超えない）２０℃〜３５℃で以下のようにインキュベートした：２０℃〜２５℃で少なくとも７日間インキュベーション、直後に、３０℃〜３５℃で少なくとも７日間インキュベーション。

表１から分かるように、異なる培養段階を通じて微生物汚染は検出されなかった。これは、本発明内で使用されたアイソレーターが、製造室の圧力より低い圧力で運転されるが、潜在的な不純物の流入をもたらし、無菌プロセスの制御を可能にすることを示す。

さらに、浮遊雑菌の数は、アイソレーターユニット１中の３つの異なる測定点（ＭＰ１８、ＭＰ１９、及びＭＰ２０と指定）で測定された、表２に示すように、すべての３つの測定点において、浮遊雑菌は検出されなかった。対照的に、製造室の浮遊雑菌の平均数は、２０１０年に測定されたように３ｃｆｕ／ｍ³であった。

従って、本発明の方法で使用されるアイソレーターユニットの使用は、微生物汚染や浮遊雑菌を含まない作業領域の作成を可能にする。

実施例３
アイソレーターユニット内の粒子含有量
微生物汚染や浮遊雑菌の数に加えて、生産品の品質を決定するもう一つの重要な要因は、粒子状不純物の濃度である。これは、（浮遊）粒子からのある生産品の保護が非常に重要である製薬業界で特に重要である。従って、本発明の範囲内で使用されるアイソレーターユニットの異なる作業領域における浮遊粒子（ＭＰ１８、ＭＰ１９、及びＭＰ２０と指定）の数を測定した。粒子測定は、CAS Clean-Air-Service AG, Switzerlandから販売されている粒子カウンターを用いて行った。結果は以下の表３に示される。

結果は、本発明内で使用されるアイソレーターユニットが、全ての３つの測定点で、非常に少ない数の直径≧０．５ｐｍの粒子を含有し、直径≧５．０ｐｍの粒子を基本的に含有しないことを示す。これとは対照的に、２０１０年に測定されたように、製造室中の平均粒子数は、直径≧０．５ｐｍの粒子について４３４／ｆｔ³であり、直径≧５．０ｐｍの粒子について２２／ｆｔ³であることがわかった。これは、周囲の製造室中の粒子純度と比較して、本発明のアイソレーターユニットにおける非常に高い粒子純度を証明している。

実施例４
生化学的純度の点での生産品の品質
本発明のアイソレーターを使用し及び使用せずにHall株（ＡＴＣＣ３５０２）により産生されたボツリヌス菌毒素Ａ型から精製された神経毒成分の異なるロットの総純度と１本鎖含量とを測定した。

１０ｍｌの培養培地に、ボツリヌス菌Ａ型Hall株（ＡＴＣＣ３５０２）のワーキングセルバンクのアリコートを接種して、総量１０ｍｌの前培養物を得た。前培養物のアリコートを使用して５０ｍｌの培地に接種して、初期培養物１を得た。次に、１６００ｌの培地に初期培養物１のアリコートを接種して初期培養物２を得た。発酵培養物（１７．４リットル）の培地を、発酵槽中でインサイチュで滅菌した。１リットルの滅菌グルコース溶液を添加後、発酵培養物に１６００ｍｌの初期培養物２を接種した。発酵は、３３．５℃で７２時間行なった。

精製は本明細書で上述したように行われた。「総純度」は、精製された神経毒成分の試料の総重量当たりの、神経毒成分の１本鎖及び２本鎖形態の重量パーセントとして定義される。得られた結果は下記表４に示される。

表４から分かるように、本発明に従って調製された神経毒成分の総純度は９９．９重量％と高い。比較して、本発明のアイソレーター技術を使用せずに得られた総純度は、わずかに９７．８重量％である。すなわち、本発明に従って調製された神経毒成分製剤は、基本的に神経毒成分（１本鎖又は２本鎖形態）のみからなり、本発明のアイソレーター技術を使用せずに調製された神経毒成分製剤は、２．２重量％の多量の汚染物質を含む。

表４のロットは、１本鎖形態の神経毒成分の含量についてさらに評価された。比色法評価を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して、１本鎖含量を測定した。切断されていない１本鎖形態は基本的に不活性であり、従って本発明の意味の範囲内において「不純物」であるため、１本鎖含量は特に重要なパラメータである。さらに、これは、クロマトグラフィーにより、活性のある２本鎖形態から分離することはできない。結果は表５に示される。

予想外に結果は、本発明の方法が、比較ロットで得られる１．７重量％に比べて、１．２重量％の平均１本鎖含量を提供することを示す。

実施例５
微生物純度の点での生産品の品質
生産品の微生物純度（生物負荷）は、本発明に従って調製されたロットの異なるプロセス工程で、Pharm. Eur. 2.6.12 及び USP <61>に従って好気性微生物の生物負荷を、本発明で使用されるアイソレーター技術無しで調製されたロットと比較して、測定することにより評価した。結果は、表６、７、及び８に示される。

表６、７、及び８に示された結果は、本発明による方法の早期プロセス段階（透析後１）での生物負荷が＜８であり、従って、本発明のアイソレーターを使用せずに得られた平均値５４７よりもはるかに低いことを示している。これは、最終生産品中には好気性（細菌）数が無いことを確実に示している。

実施例６
エンドトキシン汚染に関連した生産品の品質
本発明に従って調製されたロットのエンドトキシンレベルを、Pharm. Eur. 2.6.14 及び USP <85>に従って測定し、本発明のアイソレーター技術を使用せずに調製されたロットについて測定されたレベルと比較した。測定されたエンドトキシン値は、最終生産品の１ｍｌあたりＩＵで示される（高純度神経毒成分の１００〜５００μｇ／ｍｌを含有する溶液）。結果は表９に示される。

表９から分かるように、本発明に従って調製されたロットのエンドトキシンレベルは、比較ロットのレベルより顕著に低い。本発明の神経毒成分について見いだされた＜０．８ＩＵ／ｍｌの平均エンドトキシンレベルは、ボツリヌス毒素含有医薬品の許容できるエンドトキシンレベルである。

上記結果は、本発明の方法が、ボツリヌス毒素の高純度神経毒成分の調製を可能にし、同時に、職業衛生と安全上の基準を満たすことを示す。

Claims

ボツリヌス毒素の高純度神経毒成分を調製するための方法であって、
（ａ）ボツリヌス毒素の産生を可能にする条件下でボツリヌス菌（Clostridium botulinum）を培養する工程と、
（ｂ）ボツリヌス毒素から神経毒成分を分離する工程と、を含み、
ここで、培養工程（ａ）と分離工程（ｂ）とは圧力勾配装置中で行われ、この装置は、ボツリヌス菌を培養するための発酵槽を含む第１のアイソレーターユニットと、任意に、第２の又はさらなるアイソレーターユニットとを含み、第１のアイソレーターユニットと第２の又はさらなるアイソレーターユニットは、エアロックを介して環境に接続された製造室中に位置し、第１のアイソレーターユニットと第２の又はさらなるアイソレーターユニット中の圧力は、製造室中の圧力より低く、製造室中の圧力は周囲圧力より低く、及び、エアロック中の圧力は周囲圧力より高く、そして、圧力勾配装置は、ＢＳＣ（生物学的安全キャビネット）の内外への材料の無菌的移送を可能にする移送システムを備えたクラスＩＩＢＳＣである安全作業台をさらに含み、安全作業台もまた製造室中に存在する、上記方法。
培養温度は、３３．５℃±１．０℃に維持される、請求項１に記載の方法。
工程（ａ）の培養中の細胞密度は、１次濁度基準物質としてホルマジンを使用する濁度測定により追跡される、請求項１又は２に記載の方法。
ボツリヌス菌の培養は、培養２４時間後に到達される１．３±０．３ＦＴＵの細胞密度から０．８ＦＴＵ未満に低下するまで継続される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
工程（ａ）で使用されるボツリヌス菌培養物は、（ｉ）５３０〜８５０ＦＴＵの細胞密度を有するボツリヌス菌の初期培養物を提供し、（ｉｉ）所定量の初期培養物を発酵培地に添加することにより、得られる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
初期培養物は、５．０％〜１０．０％ｖ／ｖの量で発酵培地に添加される、請求項５に記載の方法。
クラスＩＩＢＳＣの移送システムは、互いに着脱可能に接続された、第１の移送ユニットと第２の移送ユニットとを備え、ここで、第１の移送ユニットはＢＳＣの表面に実装されているか、又はＢＳＣの壁に固定されている密閉可能な部分であり、第２の移送ユニットは密閉可能な容器である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
ボツリヌス菌は、Hall株（ＡＴＣＣ５０２）を含むボツリヌス菌Ａ型である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
１本鎖含量が２．００重量％未満であるボツリヌス菌毒素の高純度神経毒成分。
総純度が少なくとも９９．９０重量％である、請求項９に記載の高純度神経毒成分。
エンドトキシン含量が５．０ＩＵ／ｍｌ以下であり、及び／又は総嫌気性生菌数が１ｃｆｕ／ｍｌ未満である、請求項９又は１０に記載の高純度神経毒成分。
請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法により得られる、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の高純度神経毒成分。
請求項９〜１２のいずれか１項に記載のボツリヌス菌毒素の高純度神経毒成分と、１種以上の医薬的に許容し得る担体とを含む医薬組成物。
医薬として使用される、請求項９〜１２のいずれか１項に記載のボツリヌス菌毒素の高純度神経毒成分。
筋肉又は外分泌腺の活動亢進性コリン作動性神経支配に関連する疾患又は状態の治療に使用される、請求項９〜１２のいずれか１項に記載のボツリヌス菌毒素の高純度神経毒成分。