JP2023528476A - 組み換え微生物においてゲノムに安定に組み込むための方法 - Google Patents
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Abstract
合成微生物、組み換え微生物、生きた生物学的製剤(rLBP)、およびその組成物を調製するための改良された方法が提供される。この合成微生物は機能の安定性を少なくとも500世代にわたって示すため、微生物感染症の治療、予防、および/または再発防止に有用である。
Description
背景
本出願は、2021年6月2日にPCT国際出願として出願されており、2020年6月2日に出願されたアメリカ合衆国仮出願第63/033,681号と、2020年6月8日に出願されたアメリカ合衆国仮出願第63/049,544号の優先権の恩恵を主張する。そのそれぞれの全内容は参照によって本明細書に組み込まれている。
本出願は、2021年6月2日にPCT国際出願として出願されており、2020年6月2日に出願されたアメリカ合衆国仮出願第63/033,681号と、2020年6月8日に出願されたアメリカ合衆国仮出願第63/049,544号の優先権の恩恵を主張する。そのそれぞれの全内容は参照によって本明細書に組み込まれている。
合成微生物、組み換え生物学的製剤(rLBP)、およびその組成物を調製するための改良された方法が提供される。この合成微生物は機能の安定性を少なくとも500世代にわたって示すため、微生物感染症の治療、予防、または再発防止に有用である。
細菌干渉は、感染性疾患を予防するためのマイクロバイオームの管理における1つの有効な治療戦略になる可能性がある。1960年代のメチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)のアウトブレイクを受けて、Shinefieldらは黄色ブドウ球菌(SA)の502aと呼ばれる1つの株を使用し、正しい条件においてそれが小児マイクロバイオームからMRSAを排除する能力を臨床で実証した。しかしこれらの試験中、小児はその細菌を偶発的に注射されて死亡するに至った。Houck et al.「黄色ブドウ球菌502Aに起因する致命的敗血症」American Journal of Diseases of Children 123 (1972): 45-48。
除菌し、薬感受性微生物で置換することによって微生物感染症に抵抗し、微生物感染症の再発を減らすための方法と組成物が開発中である。
WO 2019/113096 A1(Starzl他)には、細胞死遺伝子と機能可能に関連した誘導性プロモータをゲノムに挿入することを含む分子改変を持つ合成微生物が開示されている。この合成微生物は皮膚環境または粘膜環境においてよく増殖し、望ましいことに血液または血清に曝露されたとき細胞死遺伝子の発現を誘導することによって自己破壊する。しかし遺伝子改変の設計と作製は厄介である可能性がある。例えばステッチPCRとギブソン・アセンブリを利用することにより、黄色ブドウ球菌の中で血清/血液遺伝子を上方調節してsprA1毒素の発現を駆動することに責任を持つプロモータ領域を含み、場合により、黄色ブドウ球菌の中で血清/血液遺伝子を下方調節してsprA1ASの発現を駆動することに責任を持つプロモータ領域を用いる完全なオペロンが構成された。
WO 2017/123676(Falb他)には、ヒトの腸で増殖しやすい例えばフマル酸・硝酸レダクターゼ調節因子応答(FNR)誘導性プロモータに機能可能に連結されたアミノ酸異化酵素をコードする異種遺伝子を含む組み換え大腸菌Nissle株が開示されている。場合により、細胞は、対象の長期定着を阻止する栄養要求性および/または遅延殺傷スイッチ改変を含んでいてもよい。
例えば皮膚条件または粘膜条件で望ましくない微生物を安全かつ持続的に置換することのできる最小ゲノム改変を含む安定な組み換え微生物を作製するための改良された効率的な方法が提供されることが望ましい。
本開示により、得られた合成微生物とその生物学的組成物が偶発的に病原体になることはできないことを保証する安全機構として、ゲノムに組み込まれた安定な殺傷スイッチ(KS)改変を含む合成微生物株を作製する方法が提供される。
本開示により、安全性と有効性を保証するために遺伝子改変された多くの細菌株が提供される。一般に、だが絶対にではなく、殺傷スイッチ(KS)ゲノム改変を含むこれらの操作された微生物は2つの重要な属性を持つように設計されている。第1に、これらは宿主のマイクロバイオームの外側上皮ニッチ(皮膚、鼻孔)を持続的に占めるように設計されている。第2に、ゲノム改変されたKS株は、内部全身体液環境(血漿、血清、滑液)に一旦導入されると人工的にプログラムされた細胞死をただちに開始するよう設計されている。殺傷スイッチを含む合成微生物は、そもそもは黄色ブドウ球菌において細菌干渉の「抑制と置換」型パラダイムを通じて院内MRSA感染と戦うために開発された。手短に述べると、潜在的に有害なSA株が最初に宿主のマイクロバイオームから除菌すなわち除去された後、SAの病理学的に不活性なKS株がマイクロバイオームに導入され、潜在的な病原体によって一度は満たされたが今は空いている生態学的ニッチを満たす。
本明細書に提示されているように、合成黄色ブドウ球菌KS株は、インビトロでのヒト血漿アッセイ、ヒト血清アッセイ、ヒト滑液アッセイ、およびウサギ脳脊髄液アッセイにおいて優れた有効性を示した。本明細書に提示されている合成黄色ブドウ球菌KS株は、マウスの生体内での菌血症とSSTIの研究において優れた有効性を示した。それに加え、生体内で菌血症または皮膚・軟部組織感染症を引き起こすことのできない合成黄色ブドウ球菌KS株が提供される。
長期にわたって機能安定性とゲノム安定性を示す最少のゲノム改変を含む組み換え微生物が提供される。
いくつかの実施形態では、内在性の誘導性遺伝子またはプロモータと機能可能に関連した作用遺伝子のゲノム挿入を含むか、内在性作用遺伝子と機能可能に関連した誘導性プロモータのゲノム挿入を含む最少の分子改変を持つ組み換え微生物が提供される。
標的株の中の内在性プロモータ遺伝子の後ろを標的として作用遺伝子を例えば相同組み換えによって挿入するのに使用するため、作用遺伝子と、場合により制御アームと、相同性アームとを含むプラスミドを効率的に作製するための改良された通過微生物株が提供される。この通過株は、プラスミドを調製する効率を改善するため、そし標的株のゲノムへの作用遺伝子の組み込みを改善するため、ゲノム改変(例えば、エピジェネティックな適応(例えば標的微生物のDNAメチル化パターン)と、作用遺伝子に対して特異的な抗毒素遺伝子)を含むことができる。
皮膚環境または粘膜環境で増殖するが、全身条件に曝露される(例えば血液、血清、血漿、汚染された脳脊髄液、または滑液に曝露される)と自己破壊する安全な合成微生物を調製する方法が提供される。
例えば合成微生物は、皮膚条件または粘膜条件では誘導されないが、全身条件に曝露されると発現の誘導が引き起こされて合成微生物の自己破壊を引き起こす誘導性プロモータ遺伝子に機能可能に関連した細胞死遺伝子である作用遺伝子を含むことができる。
例えば皮膚条件または粘膜条件で望ましくない微生物を安全かつ持続的に置換することのできる最少のゲノム破壊を含む安全な合成微生物が提供される。
標的株の中にゲノムが組み込まれて進化的安定性を少なくとも500世代にわたって示す合成微生物が提供される。この合成微生物は、遺伝的安定性と機能的安定性を少なくとも500世代にわたって示す。
合成微生物は、対象宿主のマイクロバイオームの外側上皮ニッチ(例えば皮膚、鼻孔)を持続的に占めるように設計することができる。
例えば安全な合成微生物が対象宿主のマイクロバイオームの外側上皮ニッチ(例えば皮膚、鼻孔)を持続的に占めるように設計されているが、対象宿主の内部体液(全身)環境に一旦導入されるとこの安全な合成株はプログラムされた細胞死を開始して自己破壊を引き起こし、宿主対象の中で菌血症を有意に軽減するか予防する。
合成微生物は、第1の組み換えヌクレオチドを標的微生物のゲノムに挿入することを含む方法によって調製することができる。第1の組み換えヌクレオチドは、作用遺伝子と、場合により制御アームを含むこと、主にそれらからなること、またはそれらからなることができる。合成微生物は、作用遺伝子と制御アームを含む第1の組み換えヌクレオチドを標的微生物のゲノムに挿入することを含むことができる。制御アームは作用遺伝子に対して5'に位置させることができる。制御アームは作用遺伝子の開始コドンの直近に位置させることができる。制御アームは作用遺伝子に対して3'に位置させることができる。制御アームは作用遺伝子の終止コドンの直近に位置させることができる。制御アームは転写されるが翻訳されないように設計することができる。制御アームは、作用遺伝子の発現のチューニングに使用できるアンチセンスヌクレオチドに対して相補的にすることができる。
作用遺伝子として毒素遺伝子が可能である。毒素遺伝子として、例えば、sprA1、sma1、rsaE、relF、187/lysK、ホリン、リゾスタフィン、SprG1、SprA2、mazF、またはYoebという遺伝子が可能である。
本開示により、合成微生物を調製する方法として、標的微生物の形質転換を、上流相同アームと下流相同アームに隣接した作用遺伝子を含む合成核酸配列を含むプラスミド(ただし前記上流相同アームと前記下流相同アームはそれぞれ第1と第2の相補的な核酸配列を含む)の存在下で実施し、前記標的微生物のゲノム内の天然の誘導性プロモータ遺伝子の後ろを標的として前記作用遺伝子を挿入することを含む方法が提供される。
この方法は、作用遺伝子を含む合成核酸配列を標的を定めて挿入するため標的株の中の天然の誘導性プロモータ遺伝子を選択し、第1の環境条件で増殖させるときの標的微生物の中での天然の誘導性遺伝子の相対的RNA転写レベルを第2の環境条件と比較することをさらに含み、標的微生物は、第2の環境条件で増殖させるときには第1の環境条件と比べて同等な期間にわたって少なくとも10倍増加したRNA転写レベルを示す。期間は、少なくとも約15分間、20分間、30分間、40分間、45分間、50分間、60分間、75分間、75分間、90分間、120分間、180分間、210分間、240分間、270分間、300分間、330分間、および360分間、またはこれらの間の任意の時間からなるグループから選択することができ、場合により、標的微生物の中でのRNA転写レベルをRNA-seqアッセイを利用して評価する。
標的微生物として、第1の環境ニッチに定着することのできる細菌種が可能であり、それは、ブドウ球菌、レンサ球菌、大腸菌、バシラス、アシネトバクター、マイコバクテリウム、マイコプラズマ、エンテロコッカス、コリネバクテリウム、クレブシエラ、エンテロバクター、トゥルエペレラ、およびシュードモナスから選択される属のメンバーが可能である。第1の環境条件として、完全培地、または対象内の皮膚、胃腸、泌尿生殖器、または粘膜のニッチが可能である。
第2の環境条件は、対象における血液、血漿、血清、間質液、滑液、汚染された脳脊髄液、ラクトース、グルコース、またはフェニルアラニンへの曝露、またはこれらの濃度上昇を含むことができる。
いくつかの実施形態では、合成微生物は、標的微生物のゲノムに挿入された第1の分子改変を含むことができ、その分子改変は、作用遺伝子を含む第1の組み換えヌクレオチドを含み、その第1の組み換えヌクレオチドは、天然の第1の誘導性プロモータ遺伝子を含む内在性の第1の調節領域と機能可能に関連しており、その天然の第1の誘導性プロモータは、第2の環境条件への曝露に応答して、第1の組み換えヌクレオチドを第1の環境条件と比べて少なくとも10倍、少なくとも20倍、少なくとも50倍、少なくとも75倍、または少なくとも100倍に増加した高レベルで遺伝子を条件付き転写させる。
作用遺伝子の選択は、細胞死作用遺伝子、毒力阻止作用遺伝子、代謝改変作用遺伝子、ナノファクトリー作用遺伝子、転写調節因子TetR-ファミリー遺伝子、β-ガラクトシダーゼ(ラクターゼまたはβ-gal)をコードするlacZ遺伝子、または酵素またはホルモンをコードしていて、ソルターゼA(例えばsrt A)、好気性グリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子(例えばglpD)、チミジンキナーゼ(tdk)、グルテナーゼ、エンドペプチダーゼ、プロリルエンドペプチダーゼ(PEP)、エンドペプチダーゼ40、およびインスリンからなるグループから選択される遺伝子からなるグループからなすことができる。いくつかの実施形態では、作用遺伝子は細胞死遺伝子である。
プラスミドは、通過微生物と標的微生物の両方で使用するのに適したシャトルベクターに由来することができる。
いくつかの実施形態では、(a)標的微生物に由来するDNAメチル化酵素および/またはアセチル化酵素をコードする第1の合成核酸配列を含む第1のゲノム改変と;(b)細胞死遺伝子の少なくとも一部とハイブリダイズすることのできるアンチセンスRNA配列をコードする抗毒素遺伝子を含む第2の合成核酸配列を含む第2のゲノム改変を含む合成通過株が提供される。通過株の中にアンチセンスゲノム改変が存在することで、その通過株が細胞死遺伝子を含むプラスミドを増殖させることを可能にするとともに、その通過株がプラスミドの中での毒素遺伝子の漏れ発現から生き延びることを可能にする。通過株の中にDNAメチル化酵素および/またはアセチル化酵素をコードするゲノム改変が存在することで、その通過株が、標的微生物のメチル化パターンおよび/またはアセチル化パターンと十分似たメチル化パターンおよび/またはアセチル化パターンをプラスミドDNAに与えることができて、その通過株の中での増殖したプラスミドを用いた標的株の形質転換を可能にするかその効率を高めることができる。通過株として大腸菌株または酵母株が可能である。
いくつかの実施形態では、標的微生物は、対象で菌血症またはSSTIを引き起こすことのできる望ましくない微生物と同じ属と種を持つ。いくつかの実施形態では、望ましくない微生物は対象で菌血症またはSSTIを引き起こすことができる可能性がある。
本開示の方法に従って調製された合成微生物は、第2の環境条件への曝露後、少なくとも事前設定期間内に合成微生物の測定可能な平均細胞死を示す可能性がある。測定可能な平均細胞死は、前記第2の環境条件への曝露から少なくとも約15、30、60、90、120、180、240、300、または360分以内からなるグループから選択される事前設定期間内に起こる可能性がある。第1の環境条件として、完全培地であるか、対象内の皮膚または粘膜のニッチが可能である。第2の環境条件は、血液、血漿、血清、間質液、滑液、または汚染された脳脊髄液への曝露、またはこれらの濃度上昇を含むことができる。
いくつかの実施形態では、測定可能な平均細胞死は、事前設定期間の後の少なくとも50%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、少なくとも99.8%、または少なくとも99.9%のcfuカウント減少である。
いくつかの実施形態では、合成微生物は対象で菌血症またはSSTIを引き起こすことができない。
いくつかの実施形態では、標的微生物は黄色ブドウ球菌株に由来する。
いくつかの実施形態では、作用遺伝子は、sprA1、sprA2、sprG、mazF、relE、relF、hokB、hokD、yafQ、rsaE、yoeB、yefM、kpn1、sma1、またはリゾスタフィンという毒素遺伝子からなるグループから選択されるか、このグループに由来する細胞死遺伝子である。いくつかの実施形態では、作用遺伝子は、以下の配列番号、すなわちBP_DNA_003(配列番号3)、BP_DNA_008(配列番号8)、BP_DNA_0032、BP_DNA_035(配列番号25)、BP_DNA_045(配列番号29)、BP_DNA_065(配列番号34)、BP_DNA_067(配列番号35)、BP_DNA_068(配列番号36)、BP_DNA_069(配列番号37)、BP_DNA_070(配列番号38)、BP_DNA_071(配列番号39)、または実質的に同じヌクレオチド配列からなるグループから選択されるヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、標的微生物は黄色ブドウ球菌株であり、第1の誘導性プロモータ遺伝子の選択は、isdA(鉄によって調節される表面決定タンパク質A)、isdB(鉄によって調節される表面決定タンパク質B)、isdG(ヘム分解モノオキシゲナーゼ)、hlgA(ガンマ-ヘモリシンコンポーネントA)、hlgA1(ガンマ-ヘモリシン)、hlgA2(ガンマ-ヘモリシン)、hlgB(ガンマ-ヘモリシンコンポーネントB)、hrtAB(ヘムによって調節されるトランスポーター)、sbnC(luc Cファミリーシデロホア生合成タンパク質)、sbnD、sbnI、sbnE(lucA/lucCファミリーシデロホア生合成タンパク質)、isdI、lrgA(ムレインヒドロラーゼ調節因子A)、lrgB(ムレインヒドロラーゼ調節因子B)、ear(Earタンパク質)、fhuA(フェリクロム輸送ATP結合タンパク質fhuA)、fhuB(フェリクロム輸送パーミアーゼ)、hlb(ホスホリパーゼC)、ヘムABCトランスポーター2遺伝子、ヘムABCトランスポーター遺伝子、isd ORF3、sbnF、アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ遺伝子、鉄ABCトランスポーター遺伝子、トレオニン脱水酵素遺伝子、シデロホアABCトランスポーター遺伝子、SAM依存性Metrans遺伝子、HarA、splF(セリンプロテアーゼSplF)、splD(セリンプロテアーゼSplD)、dps(一般ストレスタンパク質20U)、SAUSA300_2617(推定コバルトABCトランスポーター、ATP結合タンパク質)、SAUSA300_2268(ナトリウム/胆汁酸シンポーターファミリータンパク質)、SAUSA300_2616(コバルトファミリー輸送タンパク質)、srtB(ソルターゼB)、sbnA(おそらくシデロホア生合成タンパク質sbnA)、sbnB、sbnG、leuA(2-イソプロピルリンゴ酸シンターゼアミノ酸生合成酵素)、sstA(鉄輸送膜タンパク質)、sirA(鉄ABCトランスポーター基質結合タンパク質)、isdA(ヘムトランスポーター)、およびspa(ブドウ球菌のタンパク質A)からなるグループからなされる。
いくつかの実施形態では、第1の誘導性プロモータ遺伝子は、BP_DNA_001(配列番号1)、BP_DNA_002(配列番号2)、BP_DNA_004(配列番号4)、BP_DNA_006(配列番号6)、BP_DNA_007(配列番号7)、BP_DNA_010(配列番号9)、BP_DNA_BP_DNA_012(配列番号10)、BP_DNA_013(配列番号11)、BP_DNA_014(配列番号12)、BP_DNA_016(配列番号13)、BP_DNA_017(配列番号14)、BP_DNA_029(配列番号20)、BP_DNA_031(配列番号22)、BP_DNA_033(配列番号24)、BP_DNA_041(配列番号27)、およびBP_DNA_057(配列番号31)、またはこれらと実質的に同じヌクレオチド配列からなるグループから選択される核酸配列を持つ上流または下流の相同アームと相補的なヌクレオチド配列を含む。
合成微生物を調製する方法は、少なくとも第2の分子改変(発現クランプ)を標的微生物のゲノムの中に挿入することをさらに含み、その第2の分子改変は、制御アームまたは作用遺伝子に対して特異的な短鎖非コードRNA(sRNA)をコードする(抗作用)調節因子遺伝子を含み、その調節因子遺伝子は、合成微生物を第1の環境条件で増殖させるときは転写活性(構成的)だが、少なくとも120分の期間にわたって第2の環境条件に曝露された後は、誘導されない、誘導が1.5倍未満である、または抑制される第2のプロモータ遺伝子を含む第2の調節領域と機能可能に関連している。
いくつかの実施形態では、調節因子遺伝子は、作用遺伝子の少なくとも一部とハイブリダイズすることのできるsRNA配列をコードすることができる。
いくつかの実施形態では、合成微生物は、sprA1抗毒素遺伝子、sprA2抗毒素遺伝子、sprG抗毒素遺伝子またはsprF、ホリン抗毒素遺伝子、187-lysK抗毒素遺伝子、yefM抗毒素遺伝子、リゾスタフィン抗毒素遺伝子、またはmazE抗毒素遺伝子、kpn1抗毒素遺伝子、sma1抗毒素遺伝子、relF抗毒素遺伝子、rsaE抗毒素遺伝子、またはyoeB抗毒素遺伝子のそれぞれからなるグループから選択される毒素遺伝子を含む、又は誘導された第2の分子改変を含む。いくつかの実施形態では、第2の分子改変は、BP_DNA_005(配列番号5)または実質的に同じヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列を含む。
第2のプロモータは、PsprA1as(sprA1as天然プロモータ)、clfB(クランピング因子B)、sceD(オートリシン、エキソプロテインD)、walKR(毒力調節因子)、atlA(主要オートリシン)、oatA(O-アセチルとランスフェラーゼA);ホスホリボシルグリシンアミドホルミルトランスフェラーゼ遺伝子、ホスホリボシルアミノイミダゾールシンターゼ遺伝子、アミドホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子、ホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシンターゼ遺伝子、ホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシンターゼ遺伝子、ホスホリボシルアミノイミダゾール-スクシノカルボキサミド遺伝子、トレハロースパーミアーゼIIC 遺伝子、DeoRファミリー転写調節因子遺伝子、ホスホフルクトキナーゼ遺伝子、PTSフルクトーストランスポーターサブユニットIIC遺伝子、ガラクトース-6-リン酸イソメラーゼ遺伝子、NarZ、NarH、NarT、アルキルヒドロペルオキシダーゼ遺伝子、仮定的タンパク質遺伝子、DeoRトランス因子遺伝子、リゾホスホリパーゼ遺伝子、タンパク質分解シャペロン遺伝子、アルキルヒドロペルオキシダーゼ遺伝子、ホスホフルクトキナーゼ遺伝子、gyrB、sigB、およびローからなるグループから選択される遺伝子を含むか、その遺伝子に由来することができる。
いくつかの実施形態では、標的微生物のゲノムに挿入された第1の分子改変を含む合成微生物として、その分子改変は作用遺伝子を含む第1の組み換えヌクレオチドを含み、その第1の組み換えヌクレオチドは、天然の第1の誘導性プロモータ遺伝子を含む内在性の第1の調節領域と機能可能に関連しており、その天然の第1の誘導性プロモータは、状態変化への曝露に応答して基礎生産性と比べて少なくとも3倍という第1の組み換えヌクレオチドの条件的な高レベルの遺伝子転写をさせる合成微生物が提供される。
いくつかの実施形態では、標的微生物のゲノムに挿入された第1の分子改変を含む合成微生物として、その分子改変は、第1の誘導性プロモータ遺伝子を含む第1の調節領域を含む組み換えヌクレオチドを含み、その第1の誘導性プロモータ遺伝子は内在性作用遺伝子と機能可能に関連しており、その第1の誘導性プロモータは、状態変化への曝露に応答して基礎生産性と比べて少なくとも3倍という内在性作用遺伝子の条件的な高レベルの遺伝子転写をさせる合成微生物が提供される。
合成微生物をある期間にわたって第1の環境条件下で増殖させるとき、基礎生産性は、第1の誘導性プロモータ遺伝子および/または作用遺伝子の遺伝子転写レベルによって決まる。
いくつかの実施形態では、第1の誘導性プロモータ遺伝子は、第2の環境条件への曝露を含む状態の変化から少なくとも120分の期間内に少なくとも10倍上方調節される。
いくつかの実施形態では、標的微生物は望ましくない微生物と同じ属と種を持つ。
いくつかの実施形態では、標的微生物は、単離された野生型微生物、市場で入手できる微生物、または合成微生物である。
いくつかの実施形態では、第1のプロモータ遺伝子を含む合成微生物は、第1の環境条件下で増殖させるとき、誘導されない、誘導が1.5倍未満である、または抑制される。
第1の組み換え遺伝子は、作用遺伝子の直近にある制御アームをさらに含む。この制御アームは、作用遺伝子に対して5'の非翻訳領域(UTR)および/または3'のUTRを含む。この制御アームは、合成微生物のゲノムによってコードされるアンチセンスオリゴヌクレオチドと相補的にすることができる。そのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、合成微生物のゲノムに内在性であるか挿入された遺伝子がコードすることができる。
第1のプロモータ遺伝子は、第2の環境条件への曝露に応答して基礎生産性の少なくとも3倍、5倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、少なくとも50倍、または少なくとも100倍の増加という作用遺伝子の条件的な高レベルの遺伝子発現を誘導することができる。
合成微生物は、同じオペロンの中にある作用遺伝子と第1のプロモータ遺伝子を含む。
作用遺伝子は、第1のプロモータ遺伝子と同じオペロンの中に位置する任意の遺伝子の終止コドンと転写ターミネータの間に組み込むことができる。
合成微生物は、制御アームまたは作用遺伝子に対して特異的な短鎖非コードRNA(sRNA)をコードする(抗作用)調節因子遺伝子を含む少なくとも第2の分子改変(発現クランプ)をさらに含み、その調節因子遺伝子は、この合成微生物を第1の環境条件で増殖させるときには転写活性(構成的)だが、少なくとも120分の期間にわたって第2の環境条件に曝露された後は誘導されない、誘導が1.5倍未満である、または抑制される第2のプロモータ遺伝子を含む内在性の第2の調節領域に機能可能に関連している。
いくつかの実施形態では、微生物を第1の環境条件下で増殖させるとき、調節因子遺伝子の転写により、sRNAが作用遺伝子の発現を阻止または抑制するのに十分な量で生成する。
第1の分子改変は、殺傷スイッチ分子改変、毒力阻止分子改変、代謝性分子改変、およびナノファクトリー分子改変からなるグループから選択することができる。
本開示の合成微生物は、第1の分子改変のゲノム安定性と前記作用遺伝子の機能的安定性を少なくとも500世代、少なくとも1000世代、少なくとも1500世代、少なくとも3000世代、またはそれよりも多くの世代にわたって示す。
合成微生物は、天然の第1の誘導性プロモータ遺伝子と機能可能に関連した第1の細胞死遺伝子を含む作用遺伝子を含む殺傷スイッチ分子改変を含むことができるが、その細胞死遺伝子と天然の第1の誘導性プロモータ遺伝子は、自然界では機能可能に関連していない。
合成微生物は、天然の作用遺伝子の少なくとも一部の欠失をさらに含むことができる。場合により、欠失したその天然の作用遺伝子は毒素遺伝子またはその一部である。天然の作用(毒素)遺伝子の少なくとも一部の欠失は、シャイン-ダルガノ配列、リボソーム結合部位、および前記天然毒素遺伝子の転写開始部位からなるグループから選択される天然核酸配列の欠失を含むことができる。
合成微生物は、天然毒素遺伝子に対して特異的な天然の抗毒素遺伝子の少なくとも一部の欠失を含むことができる。場合により、その天然の抗毒素遺伝子は、天然毒素遺伝子に対して特異的なmRNAまたはsRNAアンチセンス、または抗毒素ペプチドをコードする。
本開示の方法に従って調製される合成微生物として、第2の環境条件に曝露されるとき、この合成微生物の測定可能な平均細胞死が、状態が変化してから少なくとも事前設定期間内に起こる合成微生物が提供される。測定可能な平均細胞死は、第2の環境条件への曝露から少なくとも約15、30、60、90、120、180、240、300、または360分以内からなるグループから選択される少なくとも事前設定期間内に起こる可能性がある。測定可能な平均細胞死は、事前設定期間の後の少なくとも50%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、少なくとも99.8%、または少なくとも99.9%のcfuカウント減少になる可能性がある。
本開示の方法に従って調製される合成微生物として、第2の環境条件内でのこの合成微生物の感染性増殖を減らす、または阻止することのできる殺傷スイッチ分子改変を含む合成微生物が提供される。
第1の環境条件は、対象内の皮膚条件、粘膜条件、泌尿生殖器条件、胃腸条件、または完全培地からなるグループから選択することができる。
第2の環境条件は、血液、血漿、血清、間質液、滑液、汚染された脳脊髄液、ラクトース、グルコース、またはフェニルアラニンへの曝露、またはこれらの濃度上昇からなるグループから選択することができる。
標的微生物は、少なくとも1つの抗微生物剤に対して感受性であることができる。
標的微生物は、細菌標的微生物と酵母標的微生物からなるグループから選択することができる。
標的微生物として、ブドウ球菌、レンサ球菌、大腸菌、バシラス、アシネトバクター、マイコバクテリウム、マイコプラズマ、エンテロコッカス、コリネバクテリウム、クレブシエラ、エンテロバクター、トゥルエペレラ、およびシュードモナスからなるグループから選択される属を持つ細菌種が可能である。
標的微生物は、黄色ブドウ球菌、大腸菌、およびレンサ球菌属の種からなるグループから選択することができる。
作用遺伝子として、sprA1、sprA2、sprG、mazF、relE、relF、hokB、hokD、yafQ、rsaE、yoeB、yefM、kpn1、sma1、およびリゾスタフィン毒素遺伝子からなるグループから選択されるか、このグループに由来する細胞死遺伝子が可能である。細胞死遺伝子は、以下の配列番号、すなわちBP_DNA_003(配列番号3)、BP_DNA_008(配列番号8)、BP_DNA_0032、BP_DNA_035(配列番号25)、BP_DNA_045(配列番号29)、BP_DNA_065(配列番号34)、BP_DNA_067(配列番号35)、BP_DNA_068(配列番号36)、BP_DNA_069(配列番号37)、BP_DNA_070(配列番号38)、BP_DNA_071(配列番号39)、または実質的に同じヌクレオチド配列からなるグループから選択されるヌクレオチド配列を含むことができる。
標的微生物として黄色ブドウ球菌株が可能であり、その中の第1の誘導性プロモータ遺伝子の選択は、isdA(鉄によって調節される表面決定タンパク質A)、isdB(鉄によって調節される表面決定タンパク質B)、isdG(ヘム分解モノオキシゲナーゼ)、hlgA(ガンマ-ヘモリシンコンポーネントA)、hlgA1(ガンマ-ヘモリシン)、hlgA2(ガンマ-ヘモリシン)、hlgB(ガンマ-ヘモリシンコンポーネントB)、hrtAB(ヘムによって調節されるトランスポーター)、sbnC(luc Cファミリーシデロホア生合成タンパク質)、sbnD、sbnI、sbnE(lucA/lucCファミリーシデロホア生合成タンパク質)、isdI、lrgA(ムレインヒドロラーゼ調節因子A)、lrgB(ムレインヒドロラーゼ調節因子B)、ear(Earタンパク質)、fhuA(フェリクロム輸送ATP結合タンパク質fhuA)、fhuB(フェリクロム輸送パーミアーゼ)、hlb(ホスホリパーゼC)、ヘムABCトランスポーター2遺伝子、ヘムABCトランスポーター遺伝子、isd ORF3、sbnF、アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ遺伝子、鉄ABCトランスポーター遺伝子、トレオニン脱水酵素遺伝子、シデロホアABCトランスポーター遺伝子、SAM依存性Metrans遺伝子、HarA、splF(セリンプロテアーゼSplF)、splD(セリンプロテアーゼSplD)、dps(一般ストレスタンパク質20U)、SAUSA300_2617(推定コバルトABCトランスポーター、ATP結合タンパク質)、SAUSA300_2268(ナトリウム/胆汁酸シンポーターファミリータンパク質)、SAUSA300_2616(コバルトファミリー輸送タンパク質)、srtB(ソルターゼB)、sbnA(おそらくシデロホア生合成タンパク質sbnA)、sbnB、sbnG、leuA(2-イソプロピルリンゴ酸シンターゼアミノ酸生合成酵素)、sstA(鉄輸送膜タンパク質)、sirA(鉄ABCトランスポーター基質結合タンパク質)、isdA(ヘムトランスポーター)、およびspa(ブドウ球菌のタンパク質A)からなるグループからなされる。
標的微生物として黄色ブドウ球菌株が可能であり、その中の第1の誘導性プロモータ遺伝子は、BP_DNA_001(配列番号1)、BP_DNA_002(配列番号2)、BP_DNA_004(配列番号4)、BP_DNA_006(配列番号6)、BP_DNA_007(配列番号7)、BP_DNA_010(配列番号9)、BP_DNA_BP_DNA_012(配列番号10)、BP_DNA_013(配列番号11)、BP_DNA_014(配列番号12)、BP_DNA_016(配列番号13)、BP_DNA_017(配列番号14)、BP_DNA_029(配列番号20)、BP_DNA_031(配列番号22)、BP_DNA_033(配列番号24)、BP_DNA_041(配列番号27)、およびBP_DNA_057(配列番号31)、またはこれらと実質的に同じヌクレオチド配列からなるグループから選択される核酸配列を持つ上流または下流の相同アームと相補的なヌクレオチド配列を含む。
合成微生物は、作用遺伝子の少なくとも一部にハイブリダイズすることのできるsRNA配列をコードするか、その作用遺伝子によってコードされるタンパク質の少なくとも一部に対して特異的なペプチドをコードする第2の分子改変を含むことができる。第2の分子改変は、sprA1抗毒素遺伝子、sprA2抗毒素遺伝子、sprG抗毒素遺伝子またはsprF、ホリン抗毒素遺伝子、187-lysK抗毒素遺伝子、yefM抗毒素遺伝子、リゾスタフィン抗毒素遺伝子、またはmazE抗毒素遺伝子、kpn1抗毒素遺伝子、sma1抗毒素遺伝子、relF抗毒素遺伝子、rsaE抗毒素遺伝子、またはyoeB抗毒素遺伝子のそれぞれからなるグループを含むか、そのグループに由来することが可能である。第2の分子改変は、BP_DNA_005(配列番号5)を含むヌクレオチド配列、または実質的に同じヌクレオチド配列を含む。
第2のプロモータ遺伝子は、PsprA1as(sprA1as天然プロモータ)、clfB(クランピング因子B)、sceD(オートリシン、エキソプロテインD)、walKR(毒力調節因子)、atlA(主要オートリシン)、oatA(O-アセチルとランスフェラーゼA);ホスホリボシルグリシンアミドホルミルトランスフェラーゼ遺伝子、ホスホリボシルアミノイミダゾールシンターゼ遺伝子、アミドホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子、ホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシンターゼ遺伝子、ホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシンターゼ遺伝子、ホスホリボシルアミノイミダゾール-スクシノカルボキサミド遺伝子、トレハロースパーミアーゼIIC gen、DeoRファミリー転写調節因子遺伝子、ホスホフルクトキナーゼ遺伝子、PTSフルクトーストランスポーターサブユニットIIC遺伝子、ガラクトース-6-リン酸イソメラーゼ遺伝子、NarZ、NarH、NarT、アルキルヒドロペルオキシダーゼ遺伝子、仮定的タンパク質遺伝子、DeoRトランス因子遺伝子、リゾホスホリパーゼ遺伝子、タンパク質分解シャペロン遺伝子、アルキルヒドロペルオキシダーゼ遺伝子、ホスホフルクトキナーゼ遺伝子、gyrB、sigB、およびローからなるグループから選択される遺伝子を含むか、その遺伝子に由来することができる。
外来性作用遺伝子を含む合成微生物を調製する方法として、興味ある標的微生物を選択し;外来性作用遺伝子を活性化させるための興味ある体液を選択し;興味ある標的微生物の中で、興味ある体液の存在下において完全培地または標的微生物のニッチ環境と比べて少なくとも3倍に増加した発現を示す天然の誘導性遺伝子を同定し;作用遺伝子と誘導性遺伝子が機能可能に関連するよう、作用遺伝子を標的微生物のゲノムの誘導性遺伝子と同じオペロン内に挿入して合成微生物を提供することを含む方法が提供される。標的微生物として望ましくない微生物と同じ属と種のものが可能である。標的微生物として、単離された標的微生物、市場で入手できる標的微生物、または合成標的微生物が可能である。興味ある体液として、血液、血清、血漿、脳脊髄液、滑液、および母乳が可能である。合成微生物は、完全培地または標的微生物のニッチ環境において少なくとも500世代にわたってゲノムが安定である可能性がある。標的微生物のニッチ環境として、完全培地、または対象内の皮膚、胃腸、泌尿生殖器、または粘膜のニッチが可能である。
いくつかの実施形態では、生きた生物学的組成物として、ブドウ球菌、レンサ球菌、大腸菌、バシラス、アシネトバクター、マイコバクテリウム、マイコプラズマ、エンテロコッカス、コリネバクテリウム、クレブシエラ、エンテロバクター、トゥルエペレラ、およびシュードモナスからなるグループから選択される属を持つ標的微生物から調製された1つ以上、2つ以上、より多くの3つ、4つ以上、5つ以上、6つ以上、7つ以上、または1~20、2~10、3~5種類の異なる合成微生物を含む生物学的組成物が提供される。
いくつかの実施形態では、生きた生物学的組成物として、黄色ブドウ球菌、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌(CNS)、A群レンサ球菌、B群レンサ球菌、C群レンサ球菌、C群とG群レンサ球菌、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、スタフィロコッカス・クロモゲネス、スタフィロコッカス・シミュランス、スタフィロコッカス・サプロフィティカス、スタフィロコッカス・ヘモリティカス、スタフィロコッカスヒイカス、アシネトバクター・バウマンニー、アシネトバクター・カルコアセティカス、化膿レンサ球菌、ストレプトコッカス・アガラクティエ、ストレプトコッカス・ディスガラクティエ、ストレプトコッカス・ウベリス、大腸菌、乳腺病原性大腸菌(MPEC)、セレウス菌、バシラス・ヘモリシス、ヒト型結核菌、ウシ型結核菌、マイコプラズマ・ボビス、エンテロコッカス・ファエカリス、エンテロコッカス・ファエシウム、コルネトバクテリウム・ボビス、コルネトバクテリウム・アミコラタム、コルネトバクテリウム・ウルセランス、クレブシエラ・ニューモニア、クレブシエラ・オキシトカ、エンテロバクター・アエロゲネス、アルカノバクテリウム・ピオゲネス、トゥルエペレラ・ピオゲネス、緑膿菌からなるグループ選択される1つ以上、2つ以上、より多くの3つ、4つ以上、5つ以上、6つ以上、7つ以上、または1~20、2~10、3~5種類の異なる合成微生物を含む生物学的組成物が提供される。
対象における皮膚・軟部組織感染症(SSTI)の再発をなくすためと予防するための薬の製造で利用するため、場合により2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上、6つ以上、7つ以上、8つ以上、9つ以上、10以上、または1~20、2~10、3~5種類の異なる合成微生物を含む組成物が提供される。
いくつかの実施形態では、ブドウ球菌属の種、大腸菌属の種、およびレンサ球菌属の種の合成株を少なくとも含む合成微生物の混合物を含む生きた生物学的組成物が提供される。
特別な一実施形態では、ブドウ球菌属の種、レンサ球菌属の種、および大腸菌属の種のそれぞれを含む標的微生物に由来する3つ以上の合成微生物を含む生きた生物学的組成物が提供される。
標的ブドウ球菌属の種は、カタラーゼ陽性ブドウ球菌属の種とコアグラーゼ陰性のレンサ球菌属の種からなるグループから選択することができる。標的ブドウ球菌属の種は、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、S.クロモゲネス、S.シミュランス、S.サプロフィティカス、S.シウリ、S.ヘモリティカス、およびS.ヒイカスから選択することができる。標的レンサ球菌属の種として、A群、B群、またはC/G群の種が可能である。標的レンサ球菌属の種は、ストレプトコッカス・ウベリス、ストレプトコッカス・アガラクティエ、ストレプトコッカス・ディスガラクティエ、およびストレプトコッカス・ピオゲネスからなるグループから選択することができる。大腸菌属の種として、乳腺病原性大腸菌(MPEC)種が可能である。
あるマイクロバイオームを有する対象内の望ましくない微生物に関連する皮膚・軟部組織感染症の治療、予防、およびまたは再発防止のための方法として、(a)宿主マイクロバイオームを除菌し;(b)非天然の属性を与える少なくとも1つの要素を含む合成微生物を含む生物学的組成物を対象に投与することによって望ましくない微生物を持続的に置き換えることを含む方法が提供され、合成微生物は宿主マイクロバイオームに持続的に一体化して宿主マイクロバイオームの中で望ましくない微生物と同じニッチを占めることができる。
除菌を対象内の少なくとも1つの部位で実施し、その少なくとも1つの部位から望ましくない微生物の検出可能な存在を実質的に減らすかなくすことができる。
ニッチとして、望ましくない微生物が少なくとも1つの部位に安定に定着することを可能にする皮膚または粘膜の環境が可能である。
対象内の微生物エコシステム(マイクロバイオーム)に安全かつ持続的に影響を与えて多彩な機能(例えば望ましくない微生物(毒性微生物、病原性微生物、および/または薬剤耐性微生物)による感染のリスクを低下させることが含まれる)を実施するための方法と組成物が提供される。
本明細書では、対象内の望ましくない微生物による定着、感染、定着の再発、または病原体感染の再発のリスクを防止する、または減らす方法として、望ましくない微生物を対象内の少なくとも1つの部位で除菌してその部位からその望ましくない微生物の存在を減らすかなくし;合成微生物を対象内のその少なくとも1つの部位に投与することによってその望ましくない微生物を持続的に置き換え(合成微生物は、望ましくない微生物によって以前占められていたニッチを占めることによって宿主マイクロバイオームに持続的に一体化することができる);場合により、対象内へのその合成微生物の定着を促進することを含む方法が提供される。
本開示により、あるマイクロバイオームを有する対象内の望ましくない微生物の再発をなくすとともに予防する方法として、(a)宿主マイクロバイオームを除菌し;(b)殺傷スイッチ分子改変を含む合成微生物を対象に投与することによって望ましくない微生物を持続的に置き換えることを含む方法が提供され、合成微生物は宿主マイクロバイオームに持続的に一体化して宿主マイクロバイオームの中で望ましくない微生物と同じニッチを占めることができる。
いくつかの実施形態では、除菌を対象内の少なくとも1つの部位で実施して、その少なくとも1つの部位から望ましくない微生物の検出可能な存在を実質的に減らすかなくす。
いくつかの実施形態では、望ましくない微生物または合成微生物の検出可能な存在は、表現型法および/または遺伝子型法を含む方法によって明らかにされる。表現型法は、生化学的反応、血清学的反応、抗微生物剤に対する感受性、ファージに対する感受性、バクテリオシンに対する感受性、および/または細胞タンパク質のプロファイルからなるグループから選択される。いくつかの実施形態では、遺伝子型法は、選択されたハイブリダイゼーション技術、プラスミドのプロファイル、プラスミド多型の分析、制限酵素消化、パルスフィールドゲル電気泳動(PFGE)による反応と分離、リボタイピング、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)とそのバリアント、リガーゼ連鎖反応(LCR)、転写に基づく増幅系(TAS)である。
いくつかの実施形態では、ニッチは、対象内の前記少なくとも1つの部位への望ましくない微生物の安定な定着を可能にする皮膚環境または粘膜環境である。
いくつかの実施形態では、宿主マイクロバイオームに持続的に一体化する能力は、投与工程の後、前記少なくとも1つの部位における、少なくとも2週間、少なくとも4週間、少なくとも6週間、少なくとも8週間、少なくとも10週間、少なくとも12週間、少なくとも16週間、少なくとも26週間、少なくとも30週間、少なくとも36週間、少なくとも42週間、または少なくとも52週間の期間にわたる合成微生物の検出可能な存在によって明らかにされる。
いくつかの実施形態では、望ましくない微生物を持続的に置き換える能力は、投与工程の後、前記少なくとも1つの部位における、少なくとも2週間、少なくとも4週間、少なくとも6週間、少なくとも8週間、少なくとも10週間、少なくとも12週間、少なくとも16週間、少なくとも26週間、少なくとも30週間、少なくとも36週間、少なくとも42週間、または少なくとも52週間の期間にわたる合成微生物の検出可能な存在の不在によって明らかにされる。
いくつかの実施形態では、同じニッチを占める能力は、投与工程の後、前記少なくとも1つの部位における、望ましくない微生物と合成微生物の共定着の不在によって明らかにされる。いくつかの実施形態では、共定着の不在は、投与工程の後、前記少なくとも1つの部位における、少なくとも2週間、少なくとも4週間、少なくとも6週間、少なくとも8週間、少なくとも10週間、少なくとも12週間、少なくとも16週間、少なくとも26週間、少なくとも30週間、少なくとも36週間、少なくとも42週間、または少なくとも52週間明らかにされる。
いくつかの実施形態では、合成微生物は、合成微生物に持続可能に組み込まれる非天然の属性を与える少なくとも1つの要素を含む。いくつかの実施形態では、非天然の属性を与えるその少なくとも1つの要素は、合成微生物によって宿主マイクロバイオームに持続可能に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、非天然の属性を与えるその少なくとも1つの要素は、殺傷スイッチ分子改変、毒力阻止分子改変、またはナノファクトリー分子改変である。いくつかの実施形態では、合成微生物は、合成微生物の染色体に組み込まれる分子改変を含む。いくつかの実施形態では、合成微生物は、望ましくない微生物からの遺伝材料の水平遺伝子伝播を阻止する毒力阻止分子改変を含む。
いくつかの実施形態では、殺傷スイッチ分子改変を含む合成微生物の測定可能な平均細胞死は、状態が変化した後に第1のプロモータが誘導されてから少なくとも設定期間内に起こる。いくつかの実施形態では、測定可能な平均細胞死は、状態が変化した後、少なくとも1、5、15、30、60、90、120、180、240、300、または360分以内からなるグループから選択される設定期間内に少なくとも起こる。いくつかの実施形態では、測定可能な平均細胞死は、設定期間の後の少なくとも50%のcfu、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、少なくとも99.8%、または少なくとも99.9%のcfuカウント減少である。いくつかの実施形態では、状態の変化は、pH、温度、浸透圧、オスモル濃度、酸素レベル、栄養素の濃度、血液の濃度、血漿の濃度、血清の濃度、金属の濃度、キレート化された金属の濃度、1つ以上の免疫因子の組成または濃度の変化、ミネラルの濃度、および電解質の濃度の1つ以上から選択される。いくつかの実施形態では、状態の変化は、対象の前記少なくとも1つの部位における正常な生理学的(ニッチ)条件と比べて血液、血清、または血漿がより高い濃度であること、および/またはその組成が変化していることである。
合成微生物を含む生物学的組成物は、それを必要とする乳牛、ヤギヒツジ、または雌ブタに、出産前、初期、中期、または後期の授乳期、または乾乳期に投与することができる。
いくつかの実施形態では、望ましくない微生物は黄色ブドウ球菌株であり、検出可能な存在の測定は、対象の前記少なくとも1つの部位からサンプルを取得し、そのサンプルを発色寒天と接触させ、その接触した寒天をインキュベートし、あらかじめ決めた期間の後に細菌タネの陽性cfuをカウントすることを含む方法によってなされる。
いくつかの実施形態では、除菌剤を対象内の前記少なくとも1つの部位に局所的に投与してその少なくとも1つの部位から望ましくない微生物の存在を減らすかなくす除菌工程を含む方法が提供される。
いくつかの実施形態では、除菌工程は除菌剤の局所投与を含み、全身抗微生物剤が同時に投与されることはない。いくつかの実施形態では、いかなる全身抗微生物剤も、除菌剤の最初の局所投与、または合成微生物の投与の前、その投与と同時に、および/またはその投与後の1週間、2週間、3週間、1ヶ月、2ヶ月、3ヶ月、6ヶ月、または1年以内に投与されることはない。いくつかの実施形態では、除菌剤は、消毒剤、殺菌剤、防腐剤、収斂剤、および抗菌剤からなるグループから選択される。
いくつかの実施形態では、除菌剤の選択は、アルコール(エチルアルコール、イソプロピルアルコール)、アルデヒド(グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、ホルムアルデヒド放出剤(ノキシチオリン=オキシメチレンチオウレア、タウロリン、ヘキサミン、ダントイン)、o-フタルアルデヒド)、アニリド(トリクロカルバン=TCC=3,4,4’-トリクロロカルバニリド)、ビグアナイド(クロルヘキシジン、アレキシジン、高分子ビグアナイド(MWが3,000 g/モル超のポリヘキサメチレンビグアナイド、バントシル)、ジアミジン(プロパミジン、イセチオン酸プロパミジン、プロパミジン二塩酸塩、ジブロモプロパミジン、イセチオン酸ジブロモプロパミジン)、フェノール(フェンチクロル、p-クロロ-m-キシレノール、クロロキシレノール、ヘキサクロロフェン)、ビス-フェノール(トリクロサン、ヘキサクロロフェン)、クロロキシレノール(PCMX)、8-ヒドロキシキノリン、ドデシルベンゼンスルホン酸、ナイシン、クロリン、モノラウリン酸グリセロール、C8-C14脂肪酸、第四級アンモニウム化合物(セトリミド、塩化ベンズアルコニウム、塩化セチルピリジニウム)、銀化合物(銀スルファジアジン、硝化銀)、ペルオキシ化合物(過酸化水素、過酢酸、過酸化ベンゾイル)、ヨウ素化合物(ポビドン-ヨウ素、ポロキサマー-ヨウ素、ヨウ素)、コリン放出剤(次亜塩素酸ナトリウム、次亜塩素酸、二酸化塩素、ジクロロイソシアヌル酸ナトリウム、クロラミン-T)、銅化合物(酸化銅)、イソトレチノイン、硫黄化合物、植物抽出物(ペパーミント、キンセンカ、ユーカリ、コバノブラシノキ属の種(ティーツリー油)、(スノキ属の種(例えばA型プロアントシアニジン)、カシア・フィスチュラLinn、バエケア・フルテスデンスL.、メリア・アデダラチL.、ムニンギア・カラブラ、ヴィティス・ヴィニフェラL、テルミナリア・アヴィケニオイデスGuill & Perr.、フィラントゥス・ディスコイデウスmuel. Muel-Arg.、オシマム・グラティシマムLinn.、アカリファ・ウィルケシアナMuell-Arg.、ヒペリカム・プルイナタムBoiss.&Bal.、ヒペリカム・オリンピカムL.、およびヒペリカム・サブラムL.、ハマメリス・ヴァージニアナ(マンサク)、チョウジ油、ユーカリ属の種、ロセマリヌス・オフォキナリス種(ローズマリー)、イブキジャコウソウ属の種(タイム)、イワダレソウ属の種(オレガノ)、オガルカヤ属の種、ニッケイ属の種、フウロソウ属の種、ラバンデュラ属の種、キンセンカ属の種)、アミノレブリン酸、局所抗生剤化合物(バクテリオシン;ムピロシン、バシトラシン、ネオマイシン、ポリミキシンB、ゲンタマイシン)からなるグループからなされる。
いくつかの実施形態では、抗微生物剤の選択は、セファピリン、アモキシシリン、トリメトプリム-スルホンアミド、スルホンアミド、オキシテトラサイクリン、フルオロキノロン、エンロフロキサシン、ダノフロキサシン、マルボフロキサシン、セフキノーム、セフチオフル、ストレプトマイシン、オキシテトラサイクリン、バンコマイシン、セファゾリン、セファロチン、セファレキシン、リネゾリド、ダプトマイシン、クリンダマイシン、リンコマイシン、ムピロシン、バシトラシン、ネオマイシン、ポリミキシンB、ゲンタマイシン、プルリフロキサシン、ウリフロキサシン、フィダキソマイシン、ミノサイクリン、メトロニダゾール、メトロニダゾール、スルファメトキサゾール、アンピリシン、トリメトプリム、オフロキサシン、ノルフロキサシン、チニダゾール、ノルフロキサシン、オルニダゾール、レボフロキサシン、ナリジクス酸、セフトリアキソン、アジスロマイシン、セフィキシム、セフトリアキソン、セファレキシン、セフトリアキソン、リファキシミン、シプロフロキサシン、ノルフロキサシン、オフロキサシン、レボフロキサシン、ガチフロキサシン、ゲミフロキサシン、プルフロキサシン、ウリフロキサシン、モキシフロキサシン、ナイスタチン、アムホテリシンB、フルシトシン、ケトコナゾール、ポサコナゾール、クロトリマゾール、ボリコナゾール、グリセオフルビン、硝酸ミコナゾール、およびフルコナゾールからなるグループからなされる。
いくつかの実施形態では、除菌は、除菌剤を置換工程の前に少なくとも1、2、3、4、5、または6回以上局所投与することを含む。いくつかの実施形態では、除菌工程は、除菌剤を対象内の前記少なくとも1つの部位に0.5~48時間の間隔をあけて1~6回以上、または2~4回投与することを含み、置換工程は最終除菌工程の後に実施される。
置換工程は最終除菌工程の後に実施することができ、場合により除菌剤は、スプレー、浸漬液、ローション、泡、クリーム、バルム、または乳房内輸液の形態である。
いくつかの実施形態では、望ましくない微生物を除菌し、合成微生物で置換することを含む方法が提供され、この方法は、少なくとも105、少なくとも106、少なくとも107、少なくとも108、少なくとも109、少なくとも1010、または少なくとも1011 CFUの合成株と、医薬として受容可能な基剤とを含む組成物を対象内の少なくとも1つの宿主部位に局所投与することを含む。いくつかの実施形態では、初期置換工程は、除菌工程から12時間、24時間、36時間、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、または10日、または0.5~10日、1~7日、または2~5日以内に実施される。いくつかの実施形態では、置換工程は、最終除菌工程の後に2週間~6ヶ月ごとに1回以下の間隔で繰り返す。いくつかの実施形態では、除菌工程と置換工程は、2週間~6週間ごと、または3週間~3ヶ月ごとに1回以下の間隔で繰り返す。いくつかの実施形態では、置換は、合成微生物を前記少なくとも1つの部位に少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10回投与することを含む。いくつかの実施形態では、置換は、合成微生物を1ヶ月に前記少なくとも1つの部位に1回以下、2回以下、3回以下、4回以下投与することを含む。
いくつかの実施形態では、望ましくない微生物を除菌し、合成微生物で置換する方法は、対象内の合成微生物の定着を促進することをさらに含む。いくつかの実施形態では、対象内の合成微生物の定着促進は、対象に促進剤を投与することを含み、場合によりその促進剤は、栄養素、プレバイオティック細菌種、片利共生細菌種、安定剤、保湿剤、および/またはプロバイオティック細菌種である。いくつかの実施形態では、促進は、初期除菌工程の後、プロバイオティック種を105~107 cfu、106~109 cfu、または107~108 cfuで対象に投与することを含む。
いくつかの実施形態では、栄養素の選択は、塩化ナトリウム、塩化リチウム、グリセロリン酸ナトリウム、フェニルエタノール、マンニトール、トリプトン、ペプチド、および酵母エキスからなされる。いくつかの実施形態では、プレバイオティックスの選択は、短鎖脂肪酸(酢酸、プロピオン酸、酪酸、イソ酪酸、吉草酸、イソ吉草酸)、グリセロール、農業副産物からのペクチン由来オリゴ糖、フルクト-オリゴ糖(例えばイヌリン様プレバイオティクス)、ガラクト-オリゴ糖(例えばラフィノース)、コハク酸、乳酸、およびマンナン-オリゴ糖からなるグループからなされる。
いくつかの実施形態では、プロバイオティクスの選択は、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、ビフィドバクテリウム・ラクティス、ビフィドバクテリウム・インファンティス、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・ロンガム、ラクトバチルス・ロイテリ、ラクトバチルス・パラカセイ、ラクトバチルス・プランタルム、ラクトバチルス・ジョンソニー、ラクトバチルス・ラムノースス、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・サリバリウス、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・プランタルム、ラクトコッカス・ラクティス、ストレプトコッカス・サーモフィルス、およびエンテロコッカス・フェカーリスからなるグループからなされる。
いくつかの実施形態では、望ましくない微生物は抗微生物剤耐性微生物である。いくつかの実施形態では、抗微生物剤耐性微生物は抗生剤耐性細菌である。いくつかの実施形態では、抗生剤耐性細菌は、レンサ球菌属の種、キューティバクテリウム属の種、およびブドウ球菌属の種からなるグループから選択されるグラム陽性細菌種である。いくつかの実施形態では、レンサ球菌属の種は、肺炎レンサ球菌、ストレプトコッカス・ミュータンス、ストレプトコッカス・ソブリヌス、化膿レンサ球菌、およびストレプトコッカス・アガラクティエからなるグループから選択される。いくつかの実施形態では、キューティバクテリウム属の種は、キューティバクテリウム・アクネス亜種アクネス、キューティバクテリウム・アクネス亜種デフェンデンス、およびキューティバクテリウム・アクネス亜種エロンガタムからなるグループから選択される。いくつかの実施形態では、ブドウ球菌属の種は、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌およびスタフィロコッカス・サプロフィティカスからなるグループから選択される。いくつかの実施形態では、望ましくない微生物は、1つ(SCCmec I型)または複数の抗生剤耐性遺伝子(SCCmec II型とIII型)をコードする、および/または毒素を産生する染色体カセット(SCCmec I~III型)を含有するメチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)株である。いくつかの実施形態では、毒素の選択は、パントン-バレンタインロイコシジン(PVL)毒素、トキシックショック症候群毒素-1(TSST-1)、ブドウ球菌アルファ-ヘモリシン毒素、ブドウ球菌ベータ-ヘモリシン毒素、ブドウ球菌ガンマ-ヘモリシン毒素、ブドウ球菌デルタ-ヘモリシン毒素、エンテロトキシンA、エンテロトキシンB、エンテロトキシンC、エンテロトキシンD、エンテロトキシンE、およびコアグラーゼ毒素からなるグループからなされる。
いくつかの実施形態では、本開示に従う方法で治療される対象は、対象の前記少なくとも1つの部位でのスワビングによって証明されるように、投与工程の後の少なくとも2週間、少なくとも2週間、少なくとも4週間、少なくとも6週間、少なくとも8週間、少なくとも10週間、少なくとも12週間、少なくとも16週間、少なくとも24週間、少なくとも26週間、少なくとも30週間、少なくとも36週間、少なくとも42週間、または少なくとも52週間にわたって望ましくない微生物の再発または定着を示さない。
本開示により、対象内の望ましくない微生物を持続的に置換するための合成微生物が提供される。この合成微生物は、全身感染のリスクを減らすことによって安全性を増強する設計にされた分子改変を含む。一実施形態では、分子改変は、血液、血清、血漿、または間質液に応答して合成微生物の増殖または細胞死の有意な減少を引き起こす。合成微生物を方法と組成物で利用して、対象内の望ましくない微生物の皮膚または粘膜への定着または再定着の再発を予防すること、または減らすことができる。
本開示により、対象内の望ましくない微生物によって起こる定着または再定着、全身感染、菌血症、または心内膜炎を治療または予防する、そのリスクを下げる、またはその確率を下げるための組成物と方法で使用する合成微生物が提供される。
本開示により、第1の誘導性プロモータを含む第1の調節領域に機能可能に関連した第1の細胞死遺伝子を含む少なくとも1つの殺傷スイッチ分子改変を含む組み換えヌクレオチドを含む合成微生物が提供され、第1の誘導性プロモータは、血液、血清、または血漿への曝露に応答して基礎生産性の少なくとも3倍の増加という組み換えヌクレオチドの条件的な高レベルの発現を示す。いくつかの実施形態では、第1の誘導性プロモータは、血液、血清、または血漿への曝露から少なくとも30分、60分、90分、120分、180分、240分、300分、または360分以内に、少なくとも10倍、少なくとも20倍、少なくとも50倍、少なくとも75倍、または少なくとも100倍の上方調節を示す遺伝子を含む、その遺伝子に由来する、またはその遺伝子から選択される。
いくつかの実施形態では、合成微生物は、第1の誘導性プロモータを含む第1の調節領域に機能可能に関連した第1の細胞死遺伝子を含む1つの殺傷スイッチ分子改変を含み、第1のプロモータは、対象内の前記少なくとも1つの部位における正常な生理学的(ニッチ)条件とは対照的に、微生物の環境における状態の変化によって活性化(誘導)される。
いくつかの実施形態では、合成微生物は、第1の細胞死遺伝子またはその産物に対して特異的な抗毒素遺伝子を含む発現クランプ分子改変をさらに含み、抗毒素遺伝子は、構成的であるか、皮膚または粘膜への定着時に、または完全培地の中で活性であるが、少なくとも30分間にわたって血液、血清、または血漿に曝露した後に誘導されない、誘導が1.5倍未満である、または抑制される第2のプロモータを含む第2の調節領域に機能可能に関連している。いくつかの実施形態では、第2のプロモータは、皮膚または粘膜への定着時に、またはTSB培地の中で活性であるが、少なくとも30分、60分、90分、120分、180分、240分、300分、または360分後の血液、血清、または血漿への曝露時に少なくとも2倍だけ抑制される。
いくつかの実施形態では、合成微生物は、血液、血清、または血漿に曝露されてから少なくとも1、5、15、30、60、90、120、180、240、300、または360分以内にcfuが少なくとも50%減少する測定可能な平均細胞死を示す。いくつかの実施形態では、合成微生物は、血液、血清、または血漿に曝露されてから少なくとも1、5、15、30、60、90、120、180、240、300、または360分以内にcfuカウントが少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、少なくとも99.8%、または少なくとも99.9%減少する測定可能な平均細胞死を示す。
いくつかの実施形態では、合成微生物は、対象内の全身条件下でその合成微生物の感染性増殖を減らすか予防する殺傷スイッチ分子改変を含む。
いくつかの実施形態では、合成微生物は、この合成微生物の染色体に組み込まれた少なくとも1つの分子改変を含む。
いくつかの実施形態では、合成微生物は、望ましくない微生物と同じ属と種を持つ標的微生物に由来する。いくつかの実施形態では、標的微生物は、少なくとも1つの抗微生物剤に対して感受性である。いくつかの実施形態では、標的微生物は、細菌標的微生物または酵母標的微生物から選択される。ある実施形態では、標的微生物は、乳房内、皮膚、および/または粘膜のニッチに定着することができる。
いくつかの実施形態では、標的微生物は、除菌された宿主マイクロバイオームにバイオームとして組み込まれる能力を有する。いくつかの実施形態では、合成微生物は、宿主マイクロバイオームから単離された標的微生物に由来する。
標的微生物として、皮膚および/または粘膜のニッチに定着することのできる細菌種が可能であり、ブドウ球菌、レンサ球菌、大腸菌、バシラス、アシネトバクター、マイコバクテリウム、マイコプラズマ、エンテロコッカス、コリネバクテリウム、クレブシエラ、エンテロバクター、トゥルエペレラ、およびシュードモナスからなるグループから選択される属のメンバーが可能である。
標的微生物の選択は、黄色ブドウ球菌、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌(CNS)、A群レンサ球菌、B群レンサ球菌、C群レンサ球菌、C群とG群レンサ球菌、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、スタフィロコッカス・クロモゲネス、スタフィロコッカス・シミュランス、スタフィロコッカス・サプロフィティカス、スタフィロコッカス・ヘモリティカス、スタフィロコッカスヒイカス、アシネトバクター・バウマンニー、アシネトバクター・カルコアセティカス、化膿レンサ球菌、ストレプトコッカス・アガラクティエ、ストレプトコッカス・ディスガラクティエ、ストレプトコッカス・ウベリス、大腸菌、乳腺病原性大腸菌(MPEC)、セレウス菌、バシラス・ヘモリシス、ヒト型結核菌、ウシ型結核菌、マイコプラズマ・ボビス、エンテロコッカス・ファエカリス、エンテロコッカス・ファエシウム、コルネトバクテリウム・ボビス、コルネトバクテリウム・アミコラタム、、コルネトバクテリウム・ウルセランス、クレブシエラ・ニューモニア、クレブシエラ・オキシトカ、エンテロバクター・アエロゲネス、アルカノバクテリウム・ピオゲネス、トゥルエペレラ・ピオゲネス、および緑膿菌からなるグループからなすことができ、場合により、標的株は黄色ブドウ球菌の502a株またはRN4220株である。
いくつかの実施形態では、合成微生物は、sprA1、sprA2、kpn1、sma1、sprG、relF、rsaE、yoeB、mazF、yefM、またはリゾフタフィンという毒素遺伝子からなるグループから選択される細胞死遺伝子を含む殺傷スイッチ分子改変を含む。
いくつかの実施形態では、第1の誘導性プロモータ遺伝子は、血液、血清、および/または血漿に応答するプロモータである。いくつかの実施形態では、第1のプロモータ遺伝子は、血液、血清、または血漿に曝露されてから、少なくとも30分、60分、90分、120分、180分、240分、300分、および360分からなるグループから選択される期間以内に、少なくとも1.5倍、少なくとも3倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、少なくとも50倍、または少なくとも100倍上方調節される。いくつかの実施形態では、第1のプロモータ遺伝子は、状態の変化が不在だと、誘導されない、誘導が1.5倍未満である、または抑制される。いくつかの実施形態では、第1のプロモータ遺伝子は、血液、血清、または血漿の存在下である期間内に少なくとも1.5、2、3、4、5、または少なくとも6倍誘導される。いくつかの実施形態では、第1のプロモータ遺伝子は、前記少なくとも1つの部位で正常な生理学的(ニッチ)条件において誘導されない、誘導が1.5倍未満である、または抑制される。
いくつかの実施形態では、第1の誘導性プロモータ遺伝子は、isdA(鉄によって調節される表面決定タンパク質A)、isdB(鉄によって調節される表面決定タンパク質B)、isdG(ヘム分解モノオキシゲナーゼ)、hlgA(ガンマ-ヘモリシンコンポーネントA)、hlgA1(ガンマ-ヘモリシン)、hlgA2(ガンマ-ヘモリシン)、hlgB(ガンマ-ヘモリシンコンポーネントB)、hrtAB(ヘムによって調節されるトランスポーター)、sbnC(luc Cファミリーシデロホア生合成タンパク質)、sbnD、sbnI、sbnE(lucA/lucCファミリーシデロホア生合成タンパク質)、isdI、lrgA(ムレインヒドロラーゼ調節因子A)、lrgB(ムレインヒドロラーゼ調節因子B)、ear(Earタンパク質)、fhuA(フェリクロム輸送ATP結合タンパク質fhuA)、fhuB(フェリクロム輸送パーミアーゼ)、hlb(ホスホリパーゼC)、ヘムABCトランスポーター2遺伝子、ヘムABCトランスポーター遺伝子、isd ORF3、sbnF、アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ遺伝子、鉄ABCトランスポーター遺伝子、トレオニン脱水酵素遺伝子、シデロホアABCトランスポーター遺伝子、SAM依存性Metrans遺伝子、HarA、splF(セリンプロテアーゼSplF)、splD(セリンプロテアーゼSplD)、dps(一般ストレスタンパク質20U)、SAUSA300_2617(推定コバルトABCトランスポーター、ATP結合タンパク質)、SAUSA300_2268(ナトリウム/胆汁酸シンポーターファミリータンパク質)、SAUSA300_2616(コバルトファミリー輸送タンパク質)、srtB(ソルターゼB)、sbnA(おそらくシデロホア生合成タンパク質sbnA)、sbnB、sbnG、leuA(2-イソプロピルリンゴ酸シンターゼアミノ酸生合成酵素)、sstA(鉄輸送膜タンパク質)、sirA(鉄ABCトランスポーター基質結合タンパク質)、isdA(ヘムトランスポーター)、およびspa(ブドウ球菌のタンパク質A)からなるグループから選択される遺伝子を含むか、その遺伝子に由来する。
本開示により、本開示による合成微生物の有効量と、医薬として許容な基剤とを含み、場合によりさらに、希釈剤、界面活性剤、皮膚軟化剤、結合剤、賦形剤、封止剤、バリアーティートディップ、潤滑剤、甘味剤、香味剤、湿潤剤、保存剤、バッファ、または吸収剤、またはこれらの組み合わせの1つ以上を含む生きた生物学的組成物が提供される。いくつかの実施形態では、組成物は促進剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、促進剤の選択は、栄養素、プレバイオティック細菌種、封止剤、バリアーティートディップ、片利共生細菌種、および/またはプロバイオティック細菌種からなされる。
本開示により、本開示の生きた生物学的組成物または合成微生物を含む単回投与単位が提供される。いくつかの実施形態では、単一用量単位は、少なくとも少なくとも約105、少なくとも106、少なくとも107、少なくとも108、少なくとも109、少なくとも1010 CFU、または少なくとも1011または約105~約1011、または約106~約109、または約107~約108の合成株と、医薬として許容可能な基剤とを含む。いくつかの実施形態では、単一用量単位は局所投与用の製剤にされる。いくつかの実施形態では、単回投与単位は、対象の少なくとも1つの部位に皮膚投与または粘膜投与するため製剤化される
本開示により、対象内の望ましくない微生物の再発のリスクをなくす、予防する、または減らす方法で用いるための本開示による合成微生物組成物が提供される。いくつかの実施形態では、対象として、哺乳類対象(ヒト、ウシ、ヤギ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、または他の哺乳類対象など)が可能である。いくつかの実施形態では、対象はヒト対象である。
本開示の合成微生物の有効量と、医薬として許容な賦形剤とを含む医薬組成物が提供される。医薬として許容な賦形剤は、基剤、希釈剤、皮膚軟化剤、結合剤、賦形剤、潤滑剤、甘味剤、香味剤、湿潤剤、保存剤、バッファ、または吸収剤、またはこれらの組み合わせを含むことができる。
医薬組成物は、本開示の合成微生物の有効量、栄養素、プレバイオティック細菌種、片利共生細菌種、および/またはプロバイオティック細菌種と、医薬として許容な賦形剤とを含むことができる。
少なくとも少なくとも105、少なくとも106、少なくとも107、少なくとも108、少なくとも109、少なくとも1010 CFU、または少なくとも1011の合成微生物と、医薬として許容可能な賦形剤とを含む本開示の医薬組成物を含む単回投与単位が提供される。単回投与単位は局所投与用に製剤化することができる。
対象内の望ましくない微生物の再発をなくすためと予防するための薬の製造に利用するための、本開示の合成微生物または組成物を含む組成物が提供される。
安定な組み換え微生物を作製するための改良された方法が提供される。
本開示により、細胞の天然の機構を利用するがゲノムの改変は最少にして望む発現と表現型応答を生じさせるのに必要なすべての成分を提供する作用遺伝子を含む合成微生物を創出するため、特定のDNA配列を標的微生物に効率的かつ安定的に挿入する戦略と方法が提供される。
天然遺伝子または異種遺伝子を生物内で長期にわたって安定に発現させるため、それらを単に自己複製プラスミド上にではなくてゲノム内に位置させることができる。遺伝子の位置に加え、他の複数の成分(転写開始部位を有する調節されたプロモータ、前記遺伝子がタンパク質をコードしている場合のリボソーム結合部位(RBS)、および転写ターミネータなど)が適切に発現する必要がある。これらの成分が組み合わさって生物内で表現型応答を生じさせ、伝統的には必要とされる成分のすべてが設計され、合成され、ゲノムの非コード領域にまとめて挿入される。
本開示により、殺傷スイッチ(KS)作用遺伝子を持つ細菌の多数の株を操作するための方法と、その操作に適した毒素-抗毒素(TA)系を持つ合成微生物が提供される。いくつかの殺傷スイッチ株が、哺乳類マイクロバイオームの外側ニッチ(皮膚、鼻孔)を占めつつ表現型野生型株として振る舞うように設計されている。しかしこれらの改変されたKS株は、鉄が欠乏している可能性がある内部体液環境(血漿、血清、滑液、CSF)に導入されると人工的にプログラムされた細胞死をただちに開始するように設計されている。
毒素-抗毒素(TA)系は大半の原核生物が利用している生物学的調節プログラムである。Sayed et al., Nature structural & molecular biology 19.1 (2012): 105. doi:10.1038/nsmb.2193;Schuster et al., Toxins 8.5 (2016): 140. doi:10.3390/toxins8050140。黄色ブドウ球菌(S. aureus)では、他の多くの種におけるように、これらの生きたアルゴリズムが環境シグナル伝達に応答したプロテオーム調節のために利用される。3つのタイプのTA系が同定されており、黄色ブドウ球菌で研究されてきた。sprA1/sprA1ASはI型TA系であり、そこではsprA1遺伝子によってコードされるタンパク質であるペプチドA1(PepA1)の合成は、同時に転写されるアンチセンスsprA1(sprA1AS)短鎖非コードRNA(sRNA)によって転写後に調節される。この系では、sprA1AS sRNAがsprA1メッセンジャーRNA(mRNA)転写産物の5’非翻訳領域に結合してリボソーム結合部位をカバーするため、PepA1の翻訳が阻止される。PepA1は膜ポリン毒素である。正常な細胞条件下では、PepA1の合成は、sprA1と比べて35~90倍過剰なモル数で転写されるsprA1ASによって阻害される。細胞死開始因子としてのsprA1毒素遺伝子を用い、この毒素遺伝子を細胞による鉄取得に関与するオペロンに挿入することにより、いくつかの細菌KS株が提供される。例えば遺伝子isdBとsbnAは鉄取得に関与しており、ヒトの血液、血漿、および血清において大きく上方調節されている。
例えば鉄によって調節される表面決定基(Isd)系はヘモグロビンに結合してヘムを取り出し細胞質の中に移す。そこでヘムは分解されて鉄を細胞の中に放出する。Muryoi et al.「黄色ブドウ球菌における、鉄によって調節される表面決定基(Isd)ヘム輸送経路の実証」Journal of Biological Chemistry 283.42 (2008): 28125-28136. doi:10.1074/jbc.m802171200。
別の一例として、sbnオペロンは、宿主タンパク質(トランスフェリンなど)との複合体になった細胞外の鉄を回収するスタフィロフェリンBを生合成する遺伝子をコードしている。Dale et al.「黄色ブドウ球菌の毒力におけるシデロホアの役割:シデロホアの産生に関与する遺伝子の同定と特徴づけ」Infection and immunity 72.1 (2004): 29-37. doi:10.1128/iai.72.1.29-37.2004。
血液、血漿、または血清に曝露されたとき、殺傷スイッチ(例えばisdB::sprA1および/またはPsbnA::sprA1)を活性化させて1、2、3、4、5、または6時間以内、または1~4、または2~3時間以内に自己破壊殺菌作用を開始させるように設計された合成微生物が提供される。これら経路の一方または両方が活性化されると、sprA1 mRNA転写産物のレベルがsprA1ASの阻害域値を超えて上昇し、sprA1AS sRNAはPepA1タンパク質の翻訳をもはや抑制できなくなる。これらの場合には、過剰なレベルのPepA1毒素の結果としてKS黄色ブドウ球菌株が細胞死に至ると推定される。本発明の発明者らによる以前のいくつかの研究が、本明細書の実施例に提示されているように、生体内とインビトロの両方でこれらの推定KS機構が存在することを裏づけた。
例えば血液、血清、血漿、間質液、CSF、滑液、または鉄の濃度に対して感受性の天然の誘導性遺伝子または誘導性プロモータと機能可能に関連した毒素遺伝子を含む殺傷スイッチ最少ゲノム改変を含む合成微生物が提供される。本明細書に開示されている一連の実験で、鉄の濃度が異なる合成黄色ブドウ球菌KS株の生存に及ぼす効果と、ゲノムに組み込まれた追加コピーの抗毒素を持つKSの有効性を「チューニングする」能力を評価した。第2のsprA1AS発現カセットをゲノムに付加すると細胞質の中のsprA1AS sRNA転写産物のコピーが増加する可能性がある。sprA1AS sRNAのこの増加を活用してPepA1ペプチド毒素の発現を阻害し、従ってKSを「チューニングして」1コピーだけのsprA1ASを有する株よりも低いレベルの利用可能な鉄に耐えることができると仮定した。
鉄は大半の生物にとって不可欠な無機物であり、微生物にとっては増殖を制限する1つの栄養素であることがしばしばある。ヒトの体内では鉄は主にタンパク質に結合した複合体の形態で存在する。Abbaspour et al.,「鉄と、ヒトの健康にとってのその重要性に関するレビュー」Journal of research in medical sciences: the official journal of Isfahan University of Medical Sciences 19.2 (2014): 164。https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/ PMC3999603/。宿主による鉄の封鎖は、侵入してくる微生物の感染を阻止するのに利用される自然免疫応答である。Hammer et al.,「黄色ブドウ球菌鉄取得の分子機構」Annual review of microbiology 65 (2011): 129-147. doi/full/10.1146/annurev-micro-090110-102851
黄色ブドウ球菌は、多彩な毒力因子(シデロホア、ヘム獲得経路、および分泌される酵素が含まれる)を利用して鉄をその宿主から獲得する能力を持つ病原性の大きな生物である可能性がある。本発明の発明者らは、天然の鉄探索遺伝子をKS毒素のための転写促進部位として利用することによってこの天然の綱引きを活用することを試みた。
鉄調節経路は典型的にはその宿主の内部から鉄を回収するとき大きく上方調節されているだけである。KSが組み込まれた黄色ブドウ球菌株をこれら鉄調節経路の中に戦略的に配置し、正常な増殖条件の間は効果を最小にし、感染条件の間は効果を最大にした。殺傷スイッチを有する細胞が血液、血漿、血清、またはCSFの中に入るとき、鉄調節遺伝子はsprA1 KS遺伝子とともに誘導されて細胞内でアポトーシスを引き起こし、可能な感染を予防することになる。
本明細書に提示されている実施例20では、例えば血清増殖アッセイとRPMI増殖アッセイにおいて、変化するレベルの鉄利用可能性に応答して黄色ブドウ球菌の合成KS株が増殖するパターンを野生型と比較して調べた。同じレベルのFe(III)をRPMI培地に添加して野生型黄色ブドウ球菌株であるBP_001を調べたところ、調べたどのレベルでも差または毒性は観察されなかった。これは、野生型増殖曲線からのあらゆるずれが、組み込まれた殺傷スイッチと関係していて、培地内の多すぎる鉄からの毒性効果とは関係していないことを示す。これらアッセイからのデータが図31~34に示されている。追加コピーの天然のsprA1AS発現カセット(例えばBP_144)を用いて改変された操作された殺傷スイッチ株では、生きている細胞のカウントは、鉄欠乏培地における増殖アッセイの終了時にその親株(例えばBP_109)よりも多かった。したがってゲノム内のsprA1AS発現カセットの数を増やすと、細胞が鉄制限培地の中で増殖するとき、sprA1殺傷スイッチの有効性を変化させることができる。図31~34に示されているように、線形関係が、培地内で利用可能な特定の範囲の鉄について、合成黄色ブドウ球菌株の培養物の中の生きているCFUの数/mLに対して実証された。
2つの観察を防御可能性実験に基づいて実施した。
最初に、BP_109とBP_144の中の鉄感受性殺傷スイッチは、限定された「作用範囲」で鉄の濃度に依存したやり方で活性化するように見える。すなわち、利用可能な鉄がある濃度範囲内だと、細菌細胞の生存率低下におけるKSの有効性は培地の鉄濃度と負に相関する。逆に、KS株の生存率は利用可能な鉄の濃度と非常によく相関している。細胞生存率と鉄の濃度の間の線形関係は、KSが鉄の利用可能性に頼っていることを決定的に実証している(図31~34参照)。この相関は、鉄感受性殺傷スイッチを有する合成KS株に関して提案されている作用機構を経験的に補強している。
第2に、第1の知見の拡張として、鉄利用可能性とKS活性化の間の明らかな線形関係は、殺傷スイッチisdB::sprA1とPsbnA::sprA1をチューニングできる可能性を支持する。Isd鉄獲得経路とsbn鉄獲得経路は、部分的な発現または変動する発現を可能にする鉄取り込み調節転写因子(fur)によって調節される。これら殺傷スイッチの活性化は「有か無か」の応答ではなく、むしろ多くの因子(そのうちの1つが、利用可能な鉄のレベルである)による影響を受ける、勾配に基づく系であるように見える。
RPMI 1640でのSA合成株BP_109とBP_144の鉄添加アッセイに関する実施例20からのデータは、追加のsprA1ASがKS活性化の域値の効果を高められることを示している。余分なアンチセンス挿入カセットで改変された株は、鉄利用可能性の「作用範囲」の各条件内でその親株と比べてより多くの生きている細胞を確実に生成させるため、KSをチューニングできることをさらに示唆する。sprA1AS発現カセットの追加コピーをあるKS株(例えばBP_144)のゲノム内の部位2と名づけた非コード領域に挿入した。余分なコピーのsprA1ASはゲノムの他の領域内のsprA1殺傷スイッチの調節を助けるように見えるため、抗毒素が有効であるようにするのに、それが抑制する毒素遺伝子の近傍に位置させる必要はないと結論することができる。
図34に示されているCSFアッセイにおいて、CSFの中のヒト血清の濃度が上昇するにつれてBP_109が生存を失う傾向を見ることができる。野生型対照であるBP_121は、CSFの利用可能性が制限されることが理由でCSF+1.0%血清添加という条件では増殖しなかったが;BP_121はヒト血清の中では容易に増殖し、血清強化CSF条件で培養するときには生存率が上昇することが実証された。ここに示されているデータは、CSFにおけるKS活性化のレベルが環境内の栄養素のレベルおよび細胞内の代謝活性の対応するレベルと結びついている可能性があることを示す。
生体内でKSをチューニングできることで、望む状態における殺傷スイッチの機能を保持しつつ、設計する将来の株がさまざまな環境において成長することが可能になる。平均すると、ヒトの血液と血清の中の代謝産物は濃度が劇的に変動する(±50%)可能性がある。皮膚マイクロバイオームの生態学は、地形的位置、内在性宿主因子、および外来性環境因子に依存する。宿主環境内の差に依存して殺傷スイッチを「チューニングする」能力を利用して患者特異的または地理特異的に設計されたKS株のライブラリを生成させることができる。
標的微生物の中の天然の誘導性遺伝子または誘導性プロモータを同定する方法が提供される。RNA seqまたはqPCRを通じて標的微生物株の中のトランスクリプトームを分析し、さまざまな増殖条件下で発現が異なる内在性プロモータ遺伝子候補を同定することができる。異なる条件下で適切なレベルの発現を示す上位の内在性プロモータ遺伝子候補をゲノム上に位置させることができる。オペロンに必要とされる要素も同定することができる。例えば遺伝子に挿入するための内在性候補プロモータ遺伝子が標的株または通過株の中で調節されない場合には、作用遺伝子をオペロンの中に位置する任意の遺伝子の終止コドンと転写ターミネータの間に組み込むことができる。すると挿入された作用遺伝子が細胞によるオペロンの天然の調節に「便乗する」ことが可能になる。
定義
単数形「1つの」と「その」は、文脈が明らかに異なることを示している場合を除き、複数形も含むことが想定されている。
「および/または」という用語は、関連する掲載されている項目の1つ以上の任意のあらゆる可能な組み合わせを意味し、それを包含する。
「含む」および/または「含んでいる」という用語は、本明細書で使用するときには、述べられている特徴、整数、工程、操作、要素、および/または成分の存在を明確にしているが、1つ以上の他の特徴、整数、工程、操作、要素、成分、および/またはこれらのグループの存在または追加を除外しない。特に断わらない限り、あらゆる用語は、本明細書で使用されている科学技術用語を含め、本開示が属する分野の当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を持つ。用語が矛盾する場合には、本明細書が優先する。
「病原体」または「病原性微生物」という用語は、疾患を引き起こすことのできる微生物を意味する。病原性微生物は対象のある部位に定着することができ、その後対象で全身性感染を引き起こす可能性がある。病原性微生物は、他の微生物を通常は制限する細胞性障壁と解剖学的障壁を突破する遺伝的能力を進化させている可能性がある。病原体は、本来的に細胞に損害を与え、他の微生物との競争をより少なくするとともにすぐに使える新たな栄養素供給源を提供する新たな独自のニッチへのアクセスを強制的に獲得することができる。Falkow, Stanley, 1998 Emerging Infectious Diseases, Vol. 4, No. 3, 495-497。病原性微生物として、薬剤耐性微生物が可能である。
「毒性の」または「毒力」という用語は、微生物が疾患を引き起こす力を記述するのに用いられる。
「片利共生」という用語は、1つの生物が別の生物からその生物に影響を与えることなく食物または他の利益を引き出すという共生の1つの形態を意味する。片利共生細菌は通常は正常な植物界の一部である。
「抑制する」または「除菌する」という用語は、原初の望ましくない病原性微生物をさまざまな手段によって実質的に減らすかなくすことを意味する(「除菌」と呼ばれることがしばしばある)。実質的に減らすは、本分野で知られている任意の手段によって望ましくない微生物の原初の定着の90%超、95%超、98%超、99%超、または99.9%超を減らすことを意味する。
「置換する」という用語は、新たな微生物を導入することによって原初の病原性微生物を置き換え(「再定着」と呼ばれることがしばしばある)、その新たな微生物が、「押しのけ」て原初の微生物が通常は占めるであろうニッチを占めることで、原初の望ましくない微生物がマイクロバイオームエコシステムに戻ることを阻止すること(「干渉」および「非共定着」と呼ばれることがしばしばある)を意味する。
「持続的に置換する」、「持続的に排除する」、「持続的な排除」、または「持続的な置換」という用語は、新たな微生物の存在を、例えばその対象のスワビングによって検出するとき、対象へのその新たな合成微生物の導入後の少なくとも30日間、60日間、84日間、120日間、168日間、または180日間にわたって検出できることを意味する。いくつかの実施形態では、「持続的に置換する」、「持続的に排除する」、「持続的な排除」、または「持続的な置換」は、例えば対象のスワビングにより、新たな合成微生物を対象に導入した後の少なくとも30日間、60日間、84日間、120日間、168日間、または180日間にわたって原初の病原性微生物が不在であることを意味する。
「レオスタティック細胞」という用語は、対象内の天然のニッチ、すなわち自然に生じるニッチを持続的に占める能力を持つ合成微生物を意味し、その環境における状態の変化に応答する能力も持つ。
「促進する」または「促進している」という用語は、例えば対象内で新たな生物の定着と生存を増強する活性または方法を意味する。例えば対象における合成細菌の定着の促進は、栄養素、プレバイオティック細菌種、および/またはプロバイオティック細菌種の投与を含むことができる。
「予防(防止)」、「予防する」、「予防している」、「予防」、および本明細書で使用されているようにという用語は、疾患状態または疾患条件の臨床的な表出の開始前に始まって疾患状態または疾患条件のそのような臨床的な表出を予防するか減らす一連の行動(本開示の化合物または医薬組成物の投与など)を意味する。このような予防と抑制が絶対的に有用である必要はない。
「治療」、「治療する」、および「治療している」という用語は、本明細書では、疾患状態または疾患条件の臨床的な表出の開始後に始まって疾患状態または疾患条件のそのような臨床的な表出をなくすか減らす一連の行動(本開示の化合物または医薬組成物の投与など)を意味する。このような治療が絶対的に有用である必要はない。
「治療を必要とする」という表現は、本明細書では、患者が治療を必要としているか、治療からの利益が得られるであろうと介護人が判断することを意味する。この判断は、介護人の専門知識の範囲内の多彩な因子に基づいてなされるが、その専門知識には、ある状態の結果として患者が病気である、または病気になり、それを本開示の方法、化合物、または医薬組成物によって治療可能であるという知識が含まれる。
本開示により、マイクロバイオームの宿主である対象内の望ましくない微生物の再発を排除するとともに予防する方法と、そのために有用な合成微生物を含む組成物が提供され、方法は、(a)宿主マイクロバイオームを除菌し;(b)非天然の属性を与える少なくとも1つの要素を含む合成微生物を対象に投与することによって望ましくない微生物を持続的に置き換えることを含み、合成微生物は宿主マイクロバイオームに持続的に一体化して宿主マイクロバイオームの中で望ましくない微生物と同じニッチを占めることができる。
いくつかの実施形態では、除菌剤を対象の少なくとも1つの部位に投与してその少なくとも1つの部位から望ましくない微生物の存在を減らすかなくすことを含む除菌工程を含む方法が提供される。
いくつかの実施形態では、除菌工程は除菌剤を局所投与することを含み、全身抗微生物剤が同時に投与されることはない。いくつかの実施形態では、合成抗微生物剤が、除菌剤の最初の局所投与、または合成微生物の投与の前に、それと同時に、および/またはその後の1週間、2週間、3週間、1ヶ月、2ヶ月、3ヶ月、6ヶ月、または1年以内に投与されることはない。いくつかの実施形態では、除菌剤は、消毒剤、殺菌剤、防腐剤、収斂剤、および抗菌剤からなるグループから選択される。
本開示により、対象内で望ましくない微生物を持続的に置き換えるための合成微生物が提供される。合成微生物は、全身感染のリスクを低下させることによって安全性を増強させる設計の分子改変を含む。一実施形態では、この分子改変が、血液、血清、血漿、または間質液に応答した合成微生物の増殖または細胞死の有意な減少を引き起こす。合成微生物は、望ましくない微生物の皮膚または粘膜への定着または再定着の再発を予防または軽減するための方法と組成物で使用することができる。
本開示により、対象内の望ましくない微生物によって起こる定着または再定着、全身感染、菌血症、または心内膜炎を治療または予防する、そのリスクを低下させる、またはその蓋然性を低下させるための組成物と方法で使用する合成微生物が提供される。
いくつかの実施形態では、本開示の方法を用いて治療される対象は、その対象の少なくとも1つの部位でのスワビングによって証明されるように、投与工程の後の少なくとも2週間、少なくとも2週間、少なくとも4週間、少なくとも6週間、少なくとも8週間、少なくとも10週間、少なくとも12週間、少なくとも16週間、少なくとも24週間、少なくとも26週間、少なくとも30週間、少なくとも36週間、少なくとも42週間、または少なくとも52週間にわたって望ましくない微生物の再発または定着を示さない。
「予防を必要とする」という表現は、本明細書では、患者が治療を必要としているか、治療からの利益が得られるであろうと介護人が判断することを意味する。この判断は、介護人の専門知識の範囲内の多彩な因子に基づいてなされるが、その専門知識には、ある状態の結果として患者が病気である、または病気になり、それを本開示の方法、化合物、または医薬組成物によって治療可能であるという知識が含まれる。
「個体」、「対象」、または「患者」という用語は、本明細書では、哺乳類(ヒトなど)、ペット動物、使役動物、または食物連鎖の哺乳類(ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウサギ、ブタ、ラクダ、ヤク、スイギュウ、ウマ、ロバ、コブウシ、トナカイ、またはキリンなど)を意味する。特に、この用語は雄または雌を指定することができる。一実施形態では、対象は雌のウシ、ヤギ、またはヒツジである。ペット動物として、イヌ、ネコ、娯楽用のウマ、トリ、ラット、アレチネズミ、マウス、モルモット、またはフェレットが可能である。食物連鎖の動物として、ニワトリ、シチメンチョウ、ガチョウ、またはアヒルが可能である。別の一実施形態では、雄の動物と雌の動物の両方とも対象になることができる。1つの側面では、患者は成人または成体の動物である。別の1つの側面では、患者は非新生児または非新生動物である。いくつかの実施形態では、対象は、微生物の望ましくない株または病原性株が定着していることが見いだされた女または男のヒトである。
「新生」または新たに生まれたという用語は、誕生後の最初の28日目までの乳児を意味する。「非新生」という用語は、28日齢超の動物を意味する。
「有効な量」という用語は、本明細書では、疾患状態または疾患条件の任意の症状、側面、または特徴に対して任意の検出可能なプラスの効果を持つことのできる、単独での、または医薬組成物の一部としての薬剤の量を意味する。このような効果が絶対的に有益である必要はない。
「測定可能な平均細胞死」という用語は、ある微生物の生存率の逆を意味し、変化導入後のあらかじめ決めた期間の時点で、規定された条件下で状態の変化がない同じ微生物と比べて求められる。生存率は、生きている微生物細胞を定量するための既知の任意の方法によって求めることができる。例えば生存率は、培養した合成微生物細胞のcfu/mLをあらかじめ決めた期間の時点でカウントし、誘導されていない合成微生物細胞のcfu/mLをカウントした後、誘導されたcfu/mLを誘導されていないcfu/mLで割り、100を掛けることによって計算できる=x%生存率。測定可能な平均細胞死は、100%-x%生存率=y%測定可能な平均細胞死によって求めることができる。例えば生存率が5%である場合、測定可能な平均細胞死は、100%-5%=95%である。培養した生きている微生物細胞をカウントする任意の方法(cfu、OD600、フローサイトメトリー、または他の既知の技術が含まれる)を生存率の計算に用いることができる。同様に、「生存率」を求めるための計算と同様の計算(100%-生存率=z%「生きている細胞の減少」)を利用して、誘導された合成株を、同じ期間にわたって同じ条件に曝露された野生型標的微生物と比較することができる。
いくつかの実施形態では、合成微生物の測定可能な平均細胞死は、例えば第2の環境に曝露して「状態の変化」があった後、第1のプロモータを誘導してから少なくともあらかじめ決めた期間以内に起こる。いくつかの実施形態では、合成微生物の測定可能な平均細胞死は、状態の変化後の少なくとも1、5、15、30、60、90、120、180、240、300、または360分以内からなるグループから選択されるあらかじめ決めた期間以内に起こる。いくつかの実施形態では、測定可能な平均細胞死は、あらかじめ決めた期間の後の、少なくとも50%cfu、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、少なくとも99.8%、または少なくとも99.9% cfuのカウント減少である。
いくつかの実施形態では、状態の変化は細胞環境の変化であり、その選択は、例えばpH、温度、浸透圧、オスモル濃度、酸素レベル、栄養素の濃度、血液の濃度、血漿の濃度、血清の濃度、金属の濃度、イオンの濃度、キレート化された金属の濃度、1つ以上の免疫因子の組成または濃度の変化、ミネラルの濃度、および電解質の濃度の1つ以上からなすことができる。いくつかの実施形態では、状態の変化は、対象の前記少なくとも1つの部位における正常な生理学的(ニッチ)条件と比べて血液、血清、血漿、脳脊髄液(CSF)、汚染されたCSF、滑液、または間質液がより高い濃度であること、および/またはその組成が変化していることである。いくつかの実施形態では、「正常な生理学的条件」として、皮膚または粘膜の条件、または完全培地(TSBなど)における細胞増殖が可能である。
「含む」という用語は、本明細書では、範囲が限定されていないことであり、掲載されている要素に加え、追加の要素が、可能であるとして考慮される。この用語は、いかなる場合にも「含むが、それに限定されない」と読むことができる。
「シャトルベクター」という用語は、本明細書では、2つの異なる宿主種の中で増殖させることができるように構成されたベクターを意味する。したがってシャトルベクターに挿入されたDNAは、2つの異なるタイプの細胞の中で試験すること、または操作することができる。
「プラスミド」という用語は、本明細書では、例えば細菌と原生動物に見いだすことのできる染色体から分離されていて、典型的には環状形態の二本鎖DNAを意味する。
「発現ベクター」という用語は「発現コンストラクト」としても知られ、一般に、特定の遺伝子を標的細胞の中に導入するのに用いられるプラスミドである。
「転写」という用語は、DNAの指示でRNAを合成することを意味する。
「形質転換」または「形質転換する」という用語は、本明細書では、DNAの輸送によって起こる細菌細胞の変化を意味する。「形質転換する」または「形質転換」という用語は、核酸断片を親細菌細胞の中に輸送し、その結果として遺伝的に安定な遺伝的形質になることを意味する。形質転換された核酸断片を含む合成細菌細胞は、「組み換え」または「トランスジェニック」または「形質転換された」生物と呼ぶこともできる。
本明細書では、「安定に維持された」または「安定な」合成微生物は、細胞のゲノムに組み込まれた非天然遺伝材料(例えば細胞死遺伝子および/または他の作用遺伝子)を有する合成微生物細胞を意味し、その結果としてその非天然遺伝材料が保持されて増殖される。安定な細菌はインビトロ(例えば培地)および/または生体内(例えば皮膚、粘膜、または他の意図する環境)で生存および/または増殖することができる。
「オペロン」という用語は、本明細書では、単一のプロモータの制御下にある一群の遺伝子を含有する、DNAの機能するユニットを意味する。これら遺伝子は1つのmRNA鎖にまとめて転写され、細胞質の中でまとめて翻訳されるか、スプライシングを受けて単シストロン性mRNAを生成させ(すなわちいくつかの鎖になったmRNAがそれぞれ単一の遺伝子産物をコードする)、それが別々に翻訳される。その結果は、オペロンに含まれるこれら遺伝子がまとめて発現されるか、まったく発現されないかである。いくつかの遺伝子はオペロンを規定するため同時に転写されねばならない。
「機能可能に連結された」という表現は、本明細書では、単一の核酸配列上の複数の核酸配列が関連していて、1つの核酸配列の機能が別の核酸配列によって影響を受けることを意味する。例えばプロモータなどの調節要素が作用遺伝子と機能可能に連結されているのは、その調節要素(プロモータなど)とその作用遺伝子の間の距離に関係なく、その調節要素がその作用遺伝子の発現に影響を及ぼすことができるときである。より具体的には、機能可能に連結されたは、例えば作用遺伝子を含む調節要素(例えば誘導性プロモータ)に、その作用遺伝子の発現が可能になるように接合された核酸配列を意味する。
「調節領域」という用語は、興味ある遺伝子(作用遺伝子など)の転写を指示することのできる核酸配列を意味し、さまざまな制御要素(プロモータ配列、エンハンサ配列、応答要素、タンパク質認識部位、誘導性要素、プロモータ制御要素、タンパク質結合配列、5'と3'の非翻訳領域、転写開始部位、終止配列、ポリアデニル化配列、およびイントロンなど)を含むことができる。
「プロモータ」または「プロモータ遺伝子」という用語は、本明細書では、コード配列または遺伝子の発現を制御することのできるヌクレオチド配列を意味する。プロモータは一般に、それが制御する配列の5'に位置する。プロモータは、その全体が天然遺伝子に由来すること、または自然界に見いだされるプロモータに由来する異なる要素で構成すること、および/または合成ヌクレオチドセグメントを含むことができる。いくつかの場合には、プロモータは、例えば細胞特異的または組織特異的なやり方で特定の刺激に応答して、異なる環境条件または生理学的条件に応答して、または特定の化合物に応答して、コード配列または遺伝子の発現を調節することができる。原核生物のプロモータは、2つのクラス、すなわち誘導性と構成的に分類することができる。
「誘導性プロモータ」または「誘導性プロモータ遺伝子」という用語は、調節領域内にあって1つ以上の遺伝子(作用遺伝子など)に機能可能に連結された調節要素を意味し、その遺伝子の発現が、特定の環境条件、または前記調節領域の誘導因子の存在に応答して増加する。「誘導性プロモータ」は、それが制御するコード配列または遺伝子の転写レベルの上昇を、刺激または外来環境条件に応答して開始させるプロモータを意味する。誘導性プロモータは、環境条件の変化に曝露されたときに誘導することができる。誘導性プロモータとして、血液または血清の誘導性プロモータが可能であり、タンパク質への曝露によって誘導すること、炭水化物への曝露によって誘導すること、またはpH変化によって誘導することができる。
血液または血清の誘導性プロモータの選択は、isdB、leuA、hlgA、hlgA2、isdG、sbnC、sbnE、hlgB、SAUSA300_2616、splF、fhuB、hlb、hrtAB、IsdG、LrgA、SAUSA300_2268、SAUSA200_2617、SbnE、IsdI、LrgB、SbnC、HlgB、IsdG、SplF、IsdI、LrgA、HlgA2、CH52_04385、CH52_05105、CH52_06885、CH52_10455、PsbnA、およびsbnAからなるグループからなすことができる。
「構成的プロモータ」という用語は、それが制御するコード配列または遺伝子、および/または正常な生理学的条件下で、その構成的プロモータ機能可能に連結されているコード配列または遺伝子の連続的な転写を容易にすることのできるプロモータを意味する。
「動物」という用語は、動物界の定義を意味する。
「実質的な一致」または「実質的に一致する」という表現は、ヌクレオチドまたはその断片に言及するときには、適切なヌクレオチドの挿入または欠失を入れて別のヌクレオチド(またはその相補的な鎖)と最適なアラインメントにして配列一致の任意の周知のアルゴリズム(下で議論するように、FASTA、BLAST、Gapなど)によって測定するとき、ヌクレオチド塩基の少なくとも約96%、97%、98%、または99%が一致するヌクレオチド配列が存在することを意味する。参照ヌクレオチド分子と実質的に一致するヌクレオチド分子は、ある場合には、参照ヌクレオチド分子によってコードされるポリペプチドと同じか実質的に類似したアミノ酸配列を持つポリペプチドをコードする。
ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列に言及されているときの「に由来する」という用語は、連続したヌクレオチド配列またはアミノ酸配列それぞれの少なくとも50%を有する改変された配列を意味し、その改変された配列は、合成微生物に、遺伝要素(プロモータ、細胞死遺伝子、抗毒素遺伝子、毒力ブロック、またはナノファクトリーなど)の参照配列と似た望ましい属性(状態の変化に応答した上方調節または下方調節、毒素、抗毒素、またはナノファクトリー産物、または実質的に似た配列を発現させる能力、アンチセンスRNA抗毒素を転写する能力、または望ましくない微生物からの遺伝材料の遺伝子の水平伝播を阻止するか減少させる能力が含まれる)を示させる。ヌクレオチド配列に言及されているときの「に由来する」という用語には、参照ヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列と実質的に似たアミノ酸配列を発現させるため特定の微生物にコドンが最適化された改変がなされた配列も含まれる。微生物に言及されているときの「に由来する」という用語は、合成微生物を得るため分子改変がなされる標的微生物を意味する。
ポリペプチドに適用される「実質的な類似」または「実質的に似ている」という用語は、2つのペプチド配列またはタンパク質配列が、例えばデフォルトギャップの重みを用いてGAPまたはBESTFITというプログラムによって最適なアラインメントにしたとき、少なくとも95%一致する配列、より一層好ましくは少なくとも98%または99%一致する配列を共有することを意味する。同じでない残基の位置は、保存的アミノ酸置換の違いであることが好ましい。
「保存的アミノ酸置換」という用語は、1個のアミノ酸残基が、似た化学的特性(電荷または疎水性など)を持つ側鎖(R基)を有する別のアミノ酸残基で置き換えられていることを意味する。一般に、保存的アミノ酸置換は例えば毒素または抗毒素タンパク質の機能的特性を実質的に変化させない。似た化学的特性を持つ側鎖を有するアミノ酸のグループの例に含まれるのは、(1)脂肪族側鎖:グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン;(2)脂肪族-ヒドロキシ側鎖:セリンとトレオニン;(3)アミド含有側鎖:アスパラギンとグルタミン;(4)芳香族側鎖:フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン;(5)塩基性側鎖:リシン、アルギニン、およびヒスチジン;(6)酸性側鎖:アスパラギン酸とグルタミン酸であり;(7)硫黄含有側鎖はシステインとメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換のグループは、バリン-ロイシン-イソロイシン、フェニルアラニン-チロシン、リシン-アルギニン、アラニン-バリン、グルタミン酸-アスパラギン酸、およびアスパラギン-グルタミンである。
ポリペプチド配列は、GCGバージョン6.1の中のプログラムであるFASTAを利用し、デフォルトパラメータまたは推奨パラメータを用いて比較することができる。FASTA(例えばFASTA2とFASTA3)は、質問配列と検索配列の間が最もよく重複する領域のアラインメントと配列一致率を提供する(例えばPearson, W.R., Methods Mol Biol 132: 185-219 (2000)を参照されたい(参照によって本明細書に組み込まれている))。本開示の配列を、異なる生物からの多数の配列を含有するデータベースと比較するときの別の好ましいアルゴリズムは、コンピュータプログラムBLAST(特にBLASTPまたはTBLASTN)であり、デフォルトパラメータを使用する。例えばAltschul et al., J Mol Biol 215:403-410 (1990)とAltschul et al., Nucleic Acids Res 25:3389-402 (1997)を参照されたい。
特に断わらない限り、本明細書に提示されているヌクレオチド配列は5'-3'の向きで示されている。
あらゆる代名詞はその最も広い意味を与えられているものとする。特に断わらない限り、女性形の代名詞は男性形を包含し、男性形の代名詞は女性形を包含し、単数形の代名詞は複数を包含し、複数形の代名詞は単数を包含する。
「全身投与」という用語は、身体全体が影響を受けるよう循環系に投与する経路を意味する。全身投与は、腸投与(胃腸管を通じた吸収、例えば経口投与)または非経口投与(例えば注射、輸液、または移植)を通じて実現することができる。
「局所投与」という用語は、効果の位置に関係なく、身体の局所的な領域、または身体部分の表面に適用することを意味する。局所投与の典型的な部位に含まれるのは、皮膚または粘膜の表面の部位である。いくつかの実施形態では、投与の局所経路に、薬または組成物の腸投与が含まれる。
「望ましくない微生物」という用語は、病原性微生物、薬剤耐性微生物、抗生剤耐性微生物、刺激発生微生物、発臭微生物である可能性のある微生物、および/または望ましくない毒力因子を含む微生物である可能性のある微生物を意味する。望ましくない微生物として、ブドウ球菌、レンサ球菌、大腸菌、バシラス、アシネトバクター、マイコバクテリウム、マイコプラズマ、エンテロコッカス、コリネバクテリウム、クレブシエラ、エンテロバクター、トゥルエペレラ、およびシュードモナスからなるグループから選択される属を持つ細菌種が可能である。
「望ましくない微生物」の選択は、黄色ブドウ球菌、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌(CNS)、A群レンサ球菌、B群レンサ球菌、C群レンサ球菌、C群とG群レンサ球菌、ブドウ球菌属の種、表皮ブドウ球菌、スタフィロコッカス・クロモゲネス、スタフィロコッカス・シミュランス、スタフィロコッカス・サプロフィティカス、スタフィロコッカス・ヘモリティカス、スタフィロコッカスヒイカス、アシネトバクター・バウマンニー、アシネトバクター・カルコアセティカス、化膿レンサ球菌、ストレプトコッカス・アガラクティエ、ストレプトコッカス・ディスガラクティエ、ストレプトコッカス・ウベリス、大腸菌、乳腺病原性大腸菌(MPEC)、セレウス菌、バシラス・ヘモリシス、ヒト型結核菌、ウシ型結核菌、マイコプラズマ・ボビス、エンテロコッカス・ファエカリス、エンテロコッカス・ファエシウム、コルネトバクテリウム・ボビス、コルネトバクテリウム・アミコラタム、、コルネトバクテリウム・ウルセランス、クレブシエラ・ニューモニア、クレブシエラ・オキシトカ、エンテロバクター・アエロゲネス、アルカノバクテリウム・ピオゲネス、トゥルエペレラ・ピオゲネス、および緑膿菌からなるグループからなすことができる。
いくつかの実施形態では、望ましくない微生物は抗微生物剤耐性微生物である。いくつかの実施形態では、抗微生物剤耐性微生物は抗抗生剤耐性細菌である。いくつかの実施形態では、抗抗生剤耐性細菌は、レンサ球菌属の種、キューティバクテリウム属の種、およびブドウ球菌属の種からなるグループから選択されるグラム陽性細菌種である。いくつかの実施形態では、レンサ球菌属の種は、肺炎レンサ球菌、ストレプトコッカス・ミュータンス、ストレプトコッカス・ソブリヌス、化膿レンサ球菌、およびストレプトコッカス・アガラクティエからなるグループから選択される。いくつかの実施形態では、キューティバクテリウム属の種は、キューティバクテリウム・アクネス亜種アクネス、キューティバクテリウム・アクネス亜種デフェンデンス、およびキューティバクテリウム・アクネス亜種エロンガタムからなるグループから選択される。いくつかの実施形態では、ブドウ球菌属の種は、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、およびスタフィロコッカス・サプロフィティカスからなるグループから選択される。いくつかの実施形態では、望ましくない微生物は、1つ(SCCmec I型)または複数の抗生剤耐性遺伝子(SCCmec II型とIII型)をコードする、および/または毒素を産生するブドウ球菌の染色体カセット(SCCmec I~III型)を含有するメチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)株である。いくつかの実施形態では、毒素は、パントン-バレンタインロイコシジン(PVL)毒素、トキシックショック症候群毒素-1(TSST-1)、ブドウ球菌アルファ-ヘモリシン毒素、ブドウ球菌ベータ-ヘモリシン毒素、ブドウ球菌ガンマ-ヘモリシン毒素、ブドウ球菌デルタ-ヘモリシン毒素、エンテロトキシンA、エンテロトキシンB、エンテロトキシンC、エンテロトキシンD、エンテロトキシンE、およびコアグラーゼ毒素からなるグループから選択される。
いくつかの実施形態では、望ましくない微生物は黄色ブドウ球菌株であり、その検出可能な存在は、対象の少なくとも1つの部位からサンプルを取得し、発色性寒天をそのサンプルと接触させ、その接触した寒天をインキュベートし、所定の期間の後にその細菌種の陽性cfuをカウントすることを含む方法によって測定される。
「合成微生物」という用語は、非天然の属性を与える少なくとも1つの要素を含むよう任意の手段によって改変された単離された微生物を意味する。例えば合成微生物として、非天然の属性を組み込むための遺伝材料の付加、欠失、および/または改変を含む分子改変を含むように操作された「組み換え微生物」が可能である。いくつかの実施形態では、合成微生物は栄養要求性ではない。
「栄養要求性」、「栄養要求株」、または「栄養要求性変異体」という用語は、本明細書では、自然界からの生物(野生型株)が必要としない増殖サプリメントを必要とする微生物の株を意味する。例えばD-アラニンに依存する表皮ブドウ球菌の栄養要求株が、WhitfillらのUS 20190256935に開示されている(参照によって本明細書に組み込まれている)。
「生物学的組成物」または「生きた生物学的組成物」という用語は、本開示による合成微生物を含む組成物を意味する。
「生きた生物学的製剤」(LBP)という用語は、本明細書では、1)生きている生物(細菌など)を含有し;2)ヒトにおける疾患または状態の予防、治療、または治癒に適用でき;3)ワクチンではない生物学的製品を意味する。本明細書に記載されているように、LBPは、濾過性ウイルス、腫瘍溶解性細菌、または遺伝子療法剤として想定されている製品ではなく、一般に注射によって投与されない。
「組み換えLBP」(rLBP)は、本明細書では、遺伝材料の意図的な付加、欠失、または改変を通じて遺伝子改変された微生物を含む生きた生物学的製剤である。
本明細書で用いられる「薬」の非限定的な例に含まれるのは、ヒトまたはそれ以外の動物における疾患の診断、治癒、緩和、治療、または予防に使用されることが想定される製品である。
「薬物質」は、本明細書では、製剤化されていない活性物質であり、後に賦形剤を用いて製剤化されて薬製品を生成させる。LBPに含まれる微生物は典型的には細胞性微生物(細菌または酵母など)である。したがってLBPのための薬物質は、典型的には製剤化されていない生きた細胞である。
「薬製品」は、本明細書では、製品の最終剤型である。
微生物の「検出可能な存在」という表現は、サンプル中で微生物の属、種、および/または株の存在が検出されたことが本分野で知られている任意の方法によって確認されることを意味する。確認として、熟練した専門家および/または方法の反復による陽性の試験解釈が可能である。
「マイクロバイオーム」または「マイクロバイオームの」または「微生物叢」という用語は、本明細書では、微生物エコシステムを意味する。これらエコシステムは、あらゆる動物と植物に見られる片利共生微生物、共生微生物、および病原性微生物のコミュニティである。
「微生物」という用語は、本明細書では、顕微鏡の助けを借りてのみ見ることのできる生物を意味し、典型的には単一の細胞だけからなる。微生物には、細菌、原生動物、および真菌が含まれる。
「ニッチ」と「ニッチ条件」いう用語は、本明細書では、特定の種の微生物にとって必要な環境条件と栄養条件の生態学的アレイを意味する。ある1つの種のニッチにとっての価値の定義が、特定のバイオームの中でその種が物理的に占めることができる場所を規定し、可能な細菌競合者を規定する。
「定着」という用語は、本明細書では、体表(例えば皮膚または粘膜の表面)の微生物が個体に疾患を引き起こすことなく永続的に検出可能な状態で存在することを意味する。
「共定着」という用語は、本明細書では、対象の1つの部位内のニッチに同じ種の微生物の2つ以上の株またはバリアントが同時に定着することを意味する。例えば「共定着」という用語は、同じニッチを同時かつ非一過性に占めている2つ以上の株またはバリアントを意味する。非一過性にという用語は、少なくとも2週間離して対象から得られた多数のサンプル中で、その後の2つ以上の時点において対象の1つの部位で株またはバリアントの存在が同定されることを意味する。
「標的微生物」という用語は、本明細書では、例えば合成微生物を提供するため分子改変を目的として選択された野生型微生物または親合成微生物を意味する。標的微生物は、病原性感染を引き起こす可能性のある望ましくない微生物と同じ属と種であってもよい。
「標的微生物」の選択は、黄色ブドウ球菌、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌(CNS)、A群レンサ球菌、B群レンサ球菌、C群レンサ球菌、C群とG群レンサ球菌、ブドウ球菌属の種、表皮ブドウ球菌、スタフィロコッカス・クロモゲネス、スタフィロコッカス・シミュランス、スタフィロコッカス・サプロフィティカス、スタフィロコッカス・ヘモリティカス、スタフィロコッカスヒイカス、アシネトバクター・バウマンニー、アシネトバクター・カルコアセティカス、化膿レンサ球菌、ストレプトコッカス・アガラクティエ、ストレプトコッカス・ディスガラクティエ、ストレプトコッカス・ウベリス、大腸菌、乳腺病原性大腸菌(MPEC)、セレウス菌、バシラス・ヘモリシス、ヒト型結核菌、ウシ型結核菌、エンテロコッカス・ファエカリス、エンテロコッカス・ファエシウム、コルネトバクテリウム・ボビス、コルネトバクテリウム・アミコラタム、、コルネトバクテリウム・ウルセランス、クレブシエラ・ニューモニア、クレブシエラ・オキシトカ、エンテロバクター・アエロゲネス、アルカノバクテリウム・ピオゲネス、トゥルエペレラ・ピオゲネス、および緑膿菌からなるグループからなすことができる。
「標的株」として、合成微生物を提供するため分子改変を目的として選択された標的微生物の特定の株が可能である。標的株は、1つ以上の抗微生物剤に対して感受性であることが好ましい。例えば望ましくない微生物がメチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)株である場合には、標的微生物として、抗生剤感受性標的株またはメチシリン感受性ブドウ球菌(MSSA)株(WT-502aなど)が可能である。いくつかの実施形態では、標的微生物は望ましくない微生物と同じ種が可能である。いくつかの実施形態では、標的微生物は異なる株だが望ましくない微生物と同じ種が可能である。
「細菌置換」または「非共定着」という用語は、本明細書では、1つの種の1つのバリアント/株だけが任意の所与の時点でバイオーム内の任意の所与のニッチを占めることができるという原理を意味する。
「作用遺伝子」という用語は、本明細書では、標的微生物の中で例えば分子改変に組み込まれるあらかじめ選択された遺伝子を意味する。分子改変は、誘導性プロモータを含む調節領域と機能可能に関連した作用遺伝子を含む。作用遺伝子は外来性DNAを含むことができる。作用遺伝子は内在性DNAを含むことができる。作用遺伝子は、標的微生物内の内在性遺伝子と同じか実質的に同じ核酸配列を持つDNAを含むことができる。作用遺伝子は、有効な量で発現するとき細胞内で作用応答または表現型応答を引き起こす分子(タンパク質など)をコードすることができる。作用応答または表現型応答は、細胞の自殺(殺傷スイッチ分子改変)、遺伝子の水平伝播の阻止(毒力阻止分子改変)、代謝性改変(代謝性分子改変)、レポータ遺伝子、および望ましい分子の産生(ナノファクトリー分子改変)からなるグループから選択することができる。
「殺傷スイッチ」または「KS」という用語は、本明細書では、誘導性プロモータ、遺伝要素、またはカセットを含む調節領域に機能可能に関連した細胞死遺伝子を含むようにする合成微生物の意図的な分子改変を意味し、殺傷スイッチ内の細胞死遺伝子の誘導発現により、特定の状態変化(微生物の環境条件の変化など)に応答して細胞死、微生物の増殖の停止、または複製不能が引き起こされる。例えば殺傷スイッチを含む合成微生物では、第1の誘導性プロモータは、血液、血清、血漿、ヘム、滑液、間質液、または汚染された脳脊髄液(CSF)の存在によって活性化することができ、機能可能に関連した細胞死遺伝子の上方調節と転写/発現の結果として、微生物の細胞死、または微生物の増殖停止が起こり、合成微生物の安全性が改善される。
標的微生物として、例えばブドウ球菌属の種、大腸菌属の種、またはレンサ球菌属の種が可能である。
標的微生物として、ブドウ球菌属の種または大腸菌属の種が可能である。標的微生物として黄色ブドウ球菌標的株が可能である。作用遺伝子として毒素遺伝子が可能である。毒素遺伝子の選択は、sprA1、sma1、rsaE、relF、187/lysK、ホリン、リゾスタフィン、SprG1、sprG2、sprG3、SprA2、mazF、Yoeb-sa2からなすことができる。誘導性プロモータ遺伝子として、血清、血液、血漿、ヘム、CSF、間質液、または滑液が誘導するプロモータ遺伝子が可能であり、その選択は、例えばisdB、leuA、hlgA、hlgA2、isdG、sbnC、sbnE、hlgB、SAUSA300_2616、splF、fhuB、hlb、hrtAB、IsdG、LrgA、SAUSA300_2268、SAUSA200_2617、SbnE、IsdI、LrgB、SbnC、HlgB、IsdG、SplF、IsdI、LrgA、HlgA2、CH52_04385、CH52_05105、CH52_06885、CH52_10455、PsbnA、またはsbnAからなされる。
標的微生物としてレンサ球菌属の種が可能である。標的微生物として、ストレプトコッカス・アガラクティエ、肺炎レンサ球菌、またはストレプトコッカス・ミュータンスという標的株が可能である。作用遺伝子として毒素遺伝子が可能である。毒素遺伝子の選択は、RelE/ParEファミリーの毒素、ImmA/IrrEファミリーの毒素、mazEF、ccdまたはrelBE、Bro、abiGII、HicA、COG2856、RelE、またはFicからなすことができる。誘導性プロモータ遺伝子として、血清、血液、血漿、ヘム、CSF、間質液、または滑液が誘導するプロモータ遺伝子が可能であり、例えば調節タンパク質CpsA、莢膜多糖合成タンパク質CpsH、多糖生合成タンパク質CpsL、R3Hドメイン含有タンパク質、チロシン-タンパク質キナーゼCpsD、莢膜多糖生合成タンパク質CpsC、UDP-N-アセチルグルコサミン-2-エピメラーゼNeuC、GTPピロホスホキナーゼRelA、PTS系トランスポーターサブユニットIIA、グリコシルトランスフェラーゼCpsE、莢膜多糖生合成タンパク質CpsJ、NeuDタンパク質、IgA結合β抗原、多糖生合成タンパク質CpsG、多糖生合成タンパク質CpsF、またはフィブリノーゲン結合表面タンパク質C FbsCから選択される。
「代謝性分子改変」は、代謝の遺伝子障害に対処するように設計された合成微生物の意図的な分子改変を意味し、対象は、典型的にはその対象の代謝性分子を調節する酵素を異常な量で産生する。
代謝には、身体が生命の維持に利用する化学反応の複雑なセット(エネルギー産生が含まれる)が包含される。ある酵素は食物またはある化学物質を分解するため、身体はそれを燃料としてただちに利用すること、またはそれを貯蔵することができる。また、ある化学プロセスは、身体がもはや必要としない物質を分解したり、身体に欠如している物質を作り出したりする。
ホルモンまたは酵素が欠乏してこれらの化学プロセスが適切に機能しないとき、代謝障害がおこる。遺伝性代謝障害は、具体的な物質と、その物質が有害な量蓄積するかどうか、その物質が少なすぎるかどうか、またはその物質が失われているかどうかに応じて異なるカテゴリーに分類される。異なる遺伝子の欠陥によって起こる数百の遺伝性代謝障害が存在している。
例えば
www.mayoclinic.org/diseases-conditions/inherited-metabolic-disorders/symptoms-causes/syc-20352590を参照されたい。
www.mayoclinic.org/diseases-conditions/inherited-metabolic-disorders/symptoms-causes/syc-20352590を参照されたい。
対象は、代謝性障害、例えば糖尿病(インスリンの産生が少ないことに起因する長期にわたる高血糖)、ラクトース不耐症(ラクターゼの産生が減っていることが原因でラクトースを代謝してグルコースとガラクトースを形成することができない)、およびフェニルケトン尿症(PKU)(フェニルアラニンヒドロキシラーゼの欠如が原因でフェニルアラニンをチロシンに変換できない)などを患っている可能性がある。
「外来性DNA」という用語は、本明細書では、標的微生物の外部から来るDNAを意味する。外来性DNAは、本明細書に記載されている方法を利用して標的微生物のゲノムに導入することができる。外来性DNAは、標的微生物に見られるのと同じか実質的に同じ核酸配列を持っていても持っていなくてもよいが、ゲノムの非天然位置に挿入することができる。例えば外来性DNAは、それが挿入されるゲノムの異なる部分からコピーすることができる。なぜならその挿入断片は標的生物の外部で作り出され(すなわちPCR、合成DNAなど)、その後その挿入断片にとって外部である標的生物に形質転換のために入れられたからである。
「外来性遺伝子」という用語は、本明細書では、標的微生物の外部から来る遺伝子を意味する。外来性遺伝子は、標的微生物に見られるのと同じか実質的に同じ核酸配列を持っていても持っていなくてもよいが、ゲノムの非天然位置に挿入することができる。導入遺伝子は、微生物のゲノムに導入される外来性DNA配列である。これら導入遺伝子には、同じ微生物からの遺伝子、または完全に異なる微生物からの新規な遺伝子を含めることができる。得られた微生物は形質転換されたと言われる。
「内在性DNA」という用語は、本明細書では、ゲノム改変前の標的微生物のゲノムの中からのDNAを意味する。
「内在性遺伝子」という用語は、本明細書では、ゲノム改変前の標的微生物のゲノムの中からの遺伝子を意味する。
本明細書では、「最少ゲノム改変」(MGM)という用語は、改変されていない標的微生物の中では作用遺伝子と誘導性プロモータ遺伝子が機能可能に関連していないのに対し、誘導性プロモータ遺伝子を含む調節領域に作用可能に関連した作用遺伝子を含むよう標的微生物に対してなされた分子改変を意味する。作用遺伝子または誘導性プロモータ遺伝子のいずれかが標的微生物にとって外来性であることが可能である。
例えば第1の最少ゲノム改変を有する合成微生物は、第1の外来性制御アームと第1の外来性作用遺伝子からなる第1の組み換え核酸配列を含有することができ、第1の外来性作用遺伝子は内在性誘導性プロモータ遺伝子を含む内在性調節領域と機能可能に関連している。
作用遺伝子をゲノム内のオペロンに挿入すると、オペロンに挿入されたその遺伝子の調節がオペロンの天然の調節と結びつくことになろう。ゲノムの中で、作用遺伝子の読み枠の上流、下流、または内部のいずれかに挿入される配列に追加DNA塩基を付加することにより、挿入された作用遺伝子の転写または翻訳をさらに調節することができる。
本明細書では、「制御アーム」という用語は、作用遺伝子の転写、またはそれによってコードされるタンパク質の発現を制御するのを助けるため、作用遺伝子の上流および/または下流のいずれかに挿入される追加DNA塩基を意味する。制御アームは、挿入されたDNAの末端領域に位置させることができる。合成制御要素または天然制御要素(マイクロRNA(miRNA)、アンチセンスRNA、またはタンパク質)を用いて制御アームの領域を標的とし、挿入された遺伝子に調節の追加層を付加することができる。
作用遺伝子に対する調節要素の比が十分に過剰であるとき、作用遺伝子の漏れ発現が抑制される可能性がある。作用遺伝子を含有するオペロンの発現が誘導されるとき、および/または調節要素の発現が抑制されるとき、作用遺伝子のmRNAの濃度は調節要素を圧倒し、その1つまたは複数の作用遺伝子の完全な転写と翻訳が可能になる。
例えば制御アームを、sprA1遺伝子を含む殺傷スイッチ分子改変で利用することができる。ここでは制御アームは、sprA1遺伝子の前の5'非翻訳領域(UTR)に挿入することができる。BP_001からのsprA1遺伝子をPCR増幅したとき、その(すなわち制御アーム)すぐ上流の天然の配列が含まれていた。sprA1 (AS)はsprA1 mRNAに2箇所で結合する。1箇所は開始コドンの直後であり、1箇所はRBSを阻止する5' UTRの中である。sprA1 (AS)からの最大効率を得てPepA1タンパク質の翻訳を抑制するため、制御アーム配列が保持された。
さらなる一例として、sprA2遺伝子を含む殺傷スイッチ分子改変のための制御アームは、そのアンチセンスが結合する5' UTRも含むことができ、sprG1遺伝子のための制御アームは、そのアンチセンス抗毒素が結合する3' UTRを含むことができるため、制御アームは、開始コドンの上流領域に限定されない。いくつかの実施形態では、作用遺伝子のための開始コドンは、その前にある遺伝子のための終止コドンの非常に近くに挿入すること、または前にある遺伝子の終止コドン、そしてRBS、次いで作用遺伝子の後ろ数塩基以内に挿入することができる。分子改変が殺傷スイッチ分子改変であり、作用遺伝子がsprA1であるいくつかの実施形態では、プロモータ遺伝子(例えばisdB)への影響を最小にして作用遺伝子をよりよく調節するため、制御アームとしてsprA1の5' UTR配列が可能である。
制御アーム配列を、作用遺伝子の発現を「チューニング」するための別の標的として利用することができる。塩基対を変化させることにより、アンチセンスの結合効率を利用して調節のレベルを微調整することができる。
例えばsprA1毒素遺伝子のための抗毒素はアンチセンスsprA1RNA(sprA1AS)であり、sprA1毒素(PepA1)の翻訳を調節する。sprA1AS RNAの濃度がsprA1 mRNAよりも少なくとも35倍大きいとき、PepA1は翻訳されず、細胞は正常に機能することができる。sprA1AS:sprA1の比が約35:1未満になるとき、sprA1翻訳の抑制は完全でなく、細胞は正常に増殖しようと努力する。ある時点でsprA1AS:sprA1 RNAの比が十分に小さくなると十分なPepA1の翻訳が可能になり、アポトーシスが誘導されて細胞が殺傷される。
「細胞死遺伝子」または「毒素遺伝子」という用語は、誘導されたとき、細胞の状態を、複製を終了する状態、細胞の調節機構を十分に変化させて細胞の生存を永続的に破壊する状態、老化を誘導する状態、細胞の膜、遺伝系、またはプロテオーム系に致命的な変化を誘導する状態にする作用遺伝子を意味する。例えば細胞死遺伝子として、毒素タンパク質または毒素ペプチドをコードする毒素遺伝子が可能である。毒素遺伝子の選択は、sprA1、sma1、rsaE、relF、187/lysK、ホリン、リゾスタフィン、sprG1、sprA2、sprG2、sprG3、mazF、およびyoeb-sa2からなるグループからなすことができる。毒素遺伝子としてsprA1が可能である。一実施形態では、毒素遺伝子は毒素タンパク質または毒素ペプチドをコードすることができる。いくつかの実施形態では、毒素タンパク質または毒素ペプチドは合成微生物にとって殺菌剤となる可能性がある。いくつかの実施形態では、毒素タンパク質または毒素ペプチドは合成微生物にとって静菌剤となる可能性がある。
「抗毒素遺伝子」という用語は、作用遺伝子に対して特異的な抗毒素RNAアンチセンス分子をコードするDNA配列、または例えば細胞死遺伝子またはそれによってコードされる産物に対して特異的な抗毒素タンパク質または別の抗毒素分子をコードするDNA配列を意味する。抗毒素遺伝子は標的微生物にとって内在性および/または外来性であることが可能である。
「毒力阻止」または「V-阻止」という用語は、作用遺伝子を含む合成微生物の分子改変を意味し、その結果として他の株または種からの外来DNAを受け入れる能力が低下した生物になる。例えば遺伝子の水平伝播または他の方法を介して。外来性毒力または抗生剤耐性遺伝子を獲得する能力が低下した生物が効率的に得られる。
「ナノファクトリー」という用語は、本明細書では、作用遺伝子を含むような微生物の分子改変を意味し、その結果として産物(これら修飾の一次タンパク質、ポリペプチド、アミノ酸、または核酸であるか、二次産物のいずれか)が生成する。いくつかの実施形態では、ナノファクトリー産物は、合成微生物、宿主マイクロバイオーム、および/または宿主対象望ましい有益な効果を生じさせることができる。
「毒素タンパク質」または「毒素ペプチド」という用語は、本明細書では、作用遺伝子(細胞死遺伝子など)を含む合成微生物の内部で、微生物が定着している対象に有害な効果を引き起こすことなく、その微生物にとって有害な効果を引き起こすのに有効な量で産生される物質を意味する。
「分子改変」または「分子操作された」という用語は、本明細書では、本分野で知られている任意の遺伝子編集法を利用した微生物の遺伝子の意図的な改変を意味する。その方法の非限定的な例に含まれるのは、本明細書で後述する組み換えDNA技術、NgAgo、ミニ-Cas9、CRISPR-Cpf1、CRISPR-C2c2、標的-AID、ラムダ・レッド、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、または本分野で知られているファージ技術の利用である。GreenとSambrook による"Molecular Cloning A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 4th Edition 2012(その全体が参照によって本明細書に組み込まれている)に見いだされるような分子改変のための他の技術を利用することができる。DNAをシークエンシングし、化学的に操作するか、分子生物学の技術を利用して操作し、例えば1つ以上の要素(例えば調節領域、プロモータ、毒素遺伝子、抗毒素遺伝子、または他のドメイン)を適切な構成で配置すること、またはコドンの導入、コドンの削除、コドンの最適化、システイン残基の創出、アミノ酸の変更、付加、または欠失などを実施することができる。分子改変に含めることができるのは、例えば、プラスミドの利用、遺伝子の挿入、望ましくない遺伝子を切除または除去するための遺伝子ノックアウト、コーディングフレームを破るため塩基対を付加または削除することによるフレームシフト、例えばRNAアンチセンス抗毒素をコードするDNAに埋め込むことのできる誘導性プロモータまたは構成的プロモータを例えば用いることによる外来性サイレンシング、例えば侵入してくる毒力遺伝子を例えば誘導性プロモータまたは構成的プロモータに連結されたガイドRNAを用いて消化するためのCRISPR-cas9または他の編集タンパク質の生成、または遺伝子の水平伝播に対する耐性を増大させるため例えば侵入してくる毒力遺伝子を認識して破壊する制限修飾/メチル化系である。作用遺伝子(例えば殺傷スイッチ、発現クランプ、および/またはv-阻止)を含む分子改変は、合成微生物のゲノムにその改変を挿入することによってその合成微生物に持続的に組み込むことができる。
合成微生物は、作用遺伝子を含む追加分子改変(例えばナノファクトリー)をさらに含むことができ、それは、例えばナノファクトリー生成の効果の持続時間を調整するため細菌のゲノムまたはプラスミドに直接組み込むことができる。持続時間は、(細菌種のための非複製プラスミドを用いる)短期から(嗜好依存性のない複製プラスミドを用いる)中期、(細菌ゲノムを直接操作する)長期の範囲にすることができよう。
分子改変は、宿主マイクロバイオームに持続的に組み込むことが望まれる非天然の属性を付与すること、マイクロバイオーム内の生物、または宿主マイクロバイオーム全体に増強された安全性または機能性を提供すること、増強された安全性特性(殺傷スイッチまたは他の制御機能が含まれる)を提供することができる。いくつかの実施形態では、このように埋め込まれた安全性属性は、微生物または宿主マイクロバイオーム全体の状態または条件の変化に応答することができる。
分子改変は、1個以上、2個以上、5個以上、10個以上、30個以上、または100個以上のコピー、または1個以下、3個以下、5個以下、10個以下、30個以下、または100個以下のコピーを合成微生物に組み込むことができる。
合成微生物に関して本明細書で用いられる「ゲノム安定性」または「ゲノム的に安定な」という用語は、既知の任意の核酸配列分析技術によって評価するとき、分子改変が合成微生物の少なくとも500世代にわたって安定であることを意味する。
合成微生物に関して本明細書で用いられる「機能的安定性」または「機能的に安定な」という用語は、作用遺伝子によって与えられる表現型特性がその合成微生物の少なくとも500世代にわたって安定であることを意味する。
例えば殺傷スイッチ分子改変を含む機能的に安定な合成微生物は、既知の任意のインビトロ培養技術によって評価するとき、合成微生物の少なくとも500世代にわたって血液、血清、または血漿に曝露された後の少なくとも約2時間以内、4時間以内、または6時間以内に細胞死を示すであろう。機能的安定性は、状態変化の存在下または不在下で培地内における合成微生物の増殖を比較することにより、例えば少なくとも約500世代の後に評価することができる。例えば細胞死遺伝子を含む合成微生物は、血液、血清、または血漿に曝露した後、例えば少なくとも約2時間、少なくとも約4時間、または少なくとも約6時間にわたってcfu/mLを比較することによって細胞死が明らかになる可能性があり、その場合にはt=0時間での開始cfu/mLと比べてcfu/mLが少なくとも約3桁、または少なくとも約4桁の低下を示す。合成微生物の機能的安定性は、生体内モデルにおいて評価することもできる。例えばマウスの尾の静脈に接種する菌血症モデルを利用できる。KS分子改変を有する合成微生物(10^7 CFU/mL)(KS分子改変を有する合成黄色ブドウ球菌など)を投与されたマウスは、同じ用量の野生型黄色ブドウ球菌を投与されて死んだり瀕死状態を示したりするマウスと比べて少なくとも約4日間、5日間、6日間、または7日間長く生存するであろう。
「再発」という用語は、本明細書では、除菌された微生物が同じニッチに再定着することを意味する。
「医薬として許容可能な」という用語は、妥当な医学的判断の範囲で過度な毒性、刺激、アレルギー応答、または他の問題または合併症なしに合理的な利益/リスク比でヒトと動物の組織と接触させて用いるのに適した化合物、基剤、賦形剤、組成物、および/または剤型を意味する。
「医薬として許容可能な基剤」という用語は、共に投与される合成微生物の完全性と望ましい特性を保持しつつ、治療される対象にとって生理学的に受け入れ可能な基剤を意味する。医薬として許容可能な基剤の例に含まれるのは、生理食塩水、またはリン酸塩緩衝化生理食塩水である。減菌ルリアブロス、トリプトンブロス、またはトリプティックソイブロス(TSB)も基剤として使用できる。他の生理学的に受け入れ可能な基剤とその製剤は、本明細書に提示されているか、当業者に知られており、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences, (20th edition), ed. A. Gennaro, 2000, Lippincott, Williams & Wilkins、フィラデルフィア、ペンシルヴェニア州に記載されている。
本明細書で用いられている数値範囲は、具体的に開示されているかどうかに関係なく、その範囲に含まれるすべての数と数の部分集合を含むことが想定されている。さらに、これらの数値範囲は、請求項がその範囲内の任意の数または数の部分集合に向けられることをサポートすると解釈すべきである。例えば1~10の開示は、2~8、3~7、5~6、1~9、3.6~4.6、3.5~9.9などの範囲をサポートすると解釈すべきである。
本明細書で引用されているあらゆる特許、特許公開、および査読を経た刊行物(すなわち参照文献)は、それぞれの個別の参考文献が参照によって組み込まれているとして具体的かつ個別に示されているかのようにして、参照によって明示的に本明細書に組み込まれている。本開示と組み込まれている参考文献の間に矛盾がある場合には、本開示が優先する。
特に断わらない限り、本明細書で用いられているあらゆる科学技術用語は、本開示が属する分野の当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を持つ。本明細書では、「約」という用語は、言及されている特定の数値に関して用いられるときには、その値が言及されている値から1%以下まで変化してもよいことを意味する。例えば本明細書では、「約100」という表現に、99と101、およびその間のあらゆる数値(例えば99.1、99.2、99.3、99.4など)が含まれる。
本明細書に記載されているのと似ているか同等な方法と材料を、本開示の実践または試験で利用できるが、好ましい方法と材料をこれから記述する。
合成生物学と生物の操作
合成生物学は、特定の目的のため、新たな能力を与えることによって、またはその生物の天然の機構を改造することによって生物を再設計することを含む。生物を持続的かつ安定に変化させる操作は難しく、成功するにはある規則に従わねばならない。天然遺伝子または異種遺伝子をある生物の中で長期にわたって安定に発現させるには、それら遺伝子を自己複製プラスミド上ではなくてゲノムの中に位置させる必要がある。その生物は、遺伝子の位置に加え、適切に発現または抑制される多くの他の成分(転写開始部位を持つ調節されるプロモータ、遺伝子がタンパク質をコードしている場合のリボソーム結合部位(RBS)、および転写ターミネータなど)を持たねばならない。ある条件下でこれらの成分が合わさってその生物内において表現型応答を生じさせる。伝統的な遺伝子操作では、これらの成分はすべてまとめて設計され、合成され、ゲノムの非コード領域の中に挿入される。
本開示により、DNA配列を安定に挿入して細胞の天然の機構を利用する誘導性遺伝子スイッチを創出し、望む発現と表現型応答を生じさせるのに必要な成分の大半を提供する方法が提供される。RNA seqまたはqPCRを通じてトランスクリプトームを分析し、異なる環境内のさまざまな増殖条件で発現が異なる遺伝子を同定する。その後、望む条件と環境で適切なレベルの発現を示す上位候補をゲノム上に位置させ、それらが中に位置しているオペロンを特徴づける。
遺伝子操作を通じ、内在性または外来性の作用遺伝子を生物のDNA内の天然の遺伝子またはオペロンの発現とカップルさせる方法が提供される。異なる環境において十分に低い割合と高い割合で異なる発現をしている遺伝子またはオペロンを標的にすることで、作用遺伝子は、それぞれ2つの明確に異なるオフとオンの状態で機能することが可能になる。この情報を活用して低発現の間は作用遺伝子を生物から「隠している」ため、それがゲノムから除去されたり、変異して必要とされるときにもはや機能しなくなったりすることはない。天然の遺伝子の高発現を誘導する環境条件も、組み込まれた作用遺伝子の高転写を誘導し、望む表現型応答につながる。
天然または合成の短鎖非コードRNA(sRNA)を用いて生物内の内在性または外来性の遺伝子を転写後に調節することもできる。sRNAは通常、標的mRNA分子に結合することによってタンパク質の発現を調節して二本鎖RNAを創出し、それが細胞内の天然の系によって探し出されて分解される。本開示により、sRNA調節を合成スイッチまたは遺伝回路に組み込み、ゲノムへの非常に安定な組み込みを助ける作用遺伝子の漏れ発現を制御する方法が提供される。
原核細胞に見いだされる短鎖非コードRNA(sRNA)は、mRNA標的と塩基対を形成することによって遺伝子発現を調節することが明らかにされており、シス作用性sRNAとトランス作用性sRNAと呼ばれる2つのカテゴリーに分けられる。Bloch, Sylwia, et al.「原核細胞内での毒素遺伝子発現の調節における短鎖とより短鎖の-sRNAとマイクロRNA:ミニレビュー」Toxins 9.6 (2017): 181。
sRNAは、大半の細菌のゲノムに見られる多くの毒素遺伝子を含め、広い範囲の遺伝子発現を調節することが示されている。細菌内のI型毒素-抗毒素系の抗毒素は、毒素の発現を転写後に調節するsRNAである。Schuster, Christopher F., and Ralph Bertram.「黄色ブドウ球菌の毒素-抗毒素系」Toxins 8.5 (2016): 140. doi:10.3390/toxins8050140。
本開示は、細胞の毒素-抗毒素系を再操作して環境特異的な誘導性殺傷スイッチとして機能させ、細胞に人工的にプログラムされた細胞死を特定の条件下で強制的に誘導する、または代謝を停止させる能力を実証する。この戦略は、増殖が中断されない環境において十分な濃度の抗毒素を維持して毒素タンパク質の翻訳を抑制した後、生物が望ましくない環境にアクセスするときに毒素と抗毒素の発現の比を逆転させることを含む。
生物の天然のニッチと疾患を引き起こす環境の両方で毒素遺伝子とsRNA抗毒素の転写産物のレベルの測定を実施し、これらの環境で殺傷スイッチが誘導されるか、眠ったままになるかを予測することができる。
さまざまなタイプのサンプルからのRNAを迅速に保存して処理することのできる多くのツールが研究者のために存在している。sRNAは合成されてから数分以内に分解を始める可能性があるため、サンプルから正確で信頼性あるデータを得るのに迅速かつロバストなサンプリング技術が必要とされる。われわれは、RNA保存溶液(ZymoからのRNA Shieldなど)を使用し、多くの供給源(マイクロバイオームスワブまたは感染した組織など)からのRNAを長期にわたって保存することができる。
RNAの抽出工程と精製工程の間、あるRNAキットが長さ20塩基長の全RNA分子を捕獲することで、sRNA抗毒素を興味ある毒素遺伝子のmRNA転写産物とともに回収することが可能になる。qPCR、RNA-seq、ノーザンブロット、および他の方法を通じ、操作された殺傷スイッチまたは天然の毒素-抗毒素系の成分の転写産物のレベルを定量することができる。上に論じたあらゆる話題を組み合わせることにより、殺傷スイッチ成分を捕獲してそのレベルを測定することができる。こうすることで、コストのかかるヒトまたは動物での試験を実施する必要なく、殺傷スイッチを有する生物が多彩な環境で生存または戦う可能性を予測することができる,。
ゲノム改変
他の技術を利用してもよいが、相同組み換えと呼ばれる方法を通じてDNA配列を生体内で操作することができる。この遺伝子組み換え技術は、2つのDNA配列の間の相同な領域と、その領域が配列を一致させて組み合わせる能力を中心に展開される。この技術を利用して細胞のゲノムに挿入するため、ゲノム内の標的とされる領域と相同で組み込まれるDNA配列に隣接する領域(相同アーム)を持つプラスミドを構成する。典型的には長さが約1,000、1,200、またはより多い塩基対の断片を相同アームのために使用する。これは、挿入される1つまたは複数の遺伝子の上流にプロモータ領域が存在する可能性が高いことをしばしば意味する。
黄色ブドウ球菌のゲノム改変
黄色ブドウ球菌のゲノムを編集する場合には、適切にメチル化されたプラスミドDNAを十分な量作製するのに大腸菌通過株が必要とされる可能性があり、挿入される作用遺伝子の上流の相同アームの中にプロモータ領域が存在する場合には、大腸菌通過株が遺伝子を転写して翻訳する可能性が高いであろう。本開示では、挿入される作用遺伝子が、その遺伝子を生成させる細胞にとって毒性であるペプチドをコードしていることがときどきあるため、通過株における漏れ発現を最少に維持せねばならない。
通過株における発現の漏れを最少にする1つの方法は、標的とする挿入領域を、プロモータの直後ではなく、オペロン内の大きな遺伝子の後ろにすることである。プロモータ領域が遺伝子の中央に見いだされる可能性と、通過株における作用遺伝子の発現が悪影響を受ける可能性がより小さくなる。殺傷スイッチを組み込む部位を遺伝子の末端に選択する場合、組み込みに必要な相同アームは、プロモータ領域が相同アームの一部でないように選択することができるため、プラスミド上に位置する毒素遺伝子が大腸菌通過株に及ぼす効果が減少する。
本開示はこの戦略を実現し、殺傷スイッチの多くを作るのにかなり成功した。この戦略により、挿入された遺伝子は、通過株を殺傷することなく、または後ろに挿入される遺伝子の発現を妨害することなく、標的生物による遺伝子またはオペロンの天然の調節に便乗することが可能になる。
便乗(ピギーバック)は、(毒力を制御するのに)遺伝子ノックアウトよりも優れている
本開示により、健康な状態における天然のバランスを乱さないが、それでも個体内における日和見感染の確立を阻止するようにしてヒトの相利共生微生物と動物のマイクロバイオームを管理することに特化した方法が提供される。そうするため、生物がその天然のニッチから疾患を引き起こすことのできる環境に逃避するとき、その生物が増殖して複製することを許さない方法と、殺傷スイッチを含む合成微生物が開発された。
生物が自らの天然のニッチで生存することを確実にすると同時にマイクロバイオーム内の共生生物がその宿主の中で疾患を引き起こす能力を低下させるため、(i)その生物が自らの天然のニッチを占めている間は下方調節されているが、(ii)疾患を引き起こす条件では有意に上方調節される遺伝子を同定する方法が開発された。この方法はさらに、調節が異なると同定された1つまたは複数の遺伝子の発現を、その生物にとって毒性である遺伝子の発現と結びつけることを含む。毒素遺伝子は標的生物自身の毒素-抗毒素系の1つに由来することが可能であり、その場合には有利なことに細胞内でその天然の調節の少なくとも一部を利用することが可能になる。調節が異なる天然の遺伝子の発現と毒素を結びつけることは、毒素遺伝子を、ゲノム内で調節が異なる遺伝子と同じ転写産物上に含まれるようになる位置に挿入することを含むことができ、したがってそれら2つの遺伝子の発現が結びつけられる。
本開示の殺傷スイッチ系を含む合成微生物は、他の伝統的な方法(毒力遺伝子、または疾患または感染症を引き起こすのに必要な遺伝子のノックアウトなど)による生物の生存または毒力の制御よりも優れている。ゲノム内の遺伝子をノックアウトすると、正常な増殖条件下で細胞が不安定化する可能性が本開示のピギーバック法よりも大きい。
細菌ゲノムは一般に小さくて効率的である。これは、あらゆる増殖条件の中のある側面で必要とされない遺伝子または経路がほとんど存在しないことを意味する。1つの遺伝子全体のノックアウトは、想定する環境における想定する応答を生じさせる可能性があるが、天然環境においても代謝または生存の変化を引き起こす可能性もある。マイクロバイオーム内の相利共生微生物の場合には、これは、編集された生物が、その生物が通常は占めているニッチにおける自らの利点を失い、その結果として安定性の低下、持続性の低下につながり、他のより悪性の株によって置き換えられる可能性があることを意味する。
ピギーバック戦略を利用して殺傷スイッチを持つように設計した合成微生物(A)におけるゲノムへの毒素の挿入の直線状地図が、野生型黄色ブドウ球菌標的株BP_001(B)と比較して図1Bに示されている。合成微生物(A)では、sprA1遺伝子が、場合により制御アームを介在させて内在性isdB遺伝子の直後に挿入され、isdB::sprA1を含む合成黄色ブドウ球菌が得られた。isdB mRNA転写産物は合成微生物の中で伸長されてsprA1遺伝子を含むようになったため、野生型株BP_001(B)のようにisdB遺伝子の直後で終わるのでなく、sprA1遺伝子の下流で終わる。
制御アーム
ゲノム内のオペロンへの作用遺伝子の挿入は、その遺伝子の調節を、その遺伝子が挿入されたオペロンの天然の調節と結びつける。ゲノム内の作用遺伝子の読み枠の上流、下流、または内部のいずれかに挿入される配列に追加DNA塩基を付加することにより、挿入された作用遺伝子の転写または翻訳をさらに調節することが可能である。追加DNA塩基が作用遺伝子の上流または下流にある場合、それをわれわれは制御アームと呼ぶ。なぜならそれは遺伝子またはタンパク質の発現を制御するのを助け、通常は挿入されたDNAの末端領域に見いだされるからである。例えば制御アームは、挿入された遺伝子に対する制御の追加層を付加するため、合成または天然の調節要素(マイクロRNA(miRNA)、リボスイッチ、短鎖非コードRNA(sRNA)、またはタンパク質など)を含むことができる。
作用遺伝子に対する調節要素の比が十分に過剰であるとき、作用遺伝子の漏れ発現を抑制することができる。作用遺伝子を含有するオペロンの発現が誘導されるとき、および/または調節要素の発現が抑制されるとき、作用遺伝子のmRNAの濃度は調節要素を圧倒し、その1つまたは複数の作用遺伝子の完全な転写と翻訳が可能になる
例えばsprA1毒素遺伝子のための抗毒素はアンチセンスsprA1 sRNA(sprA1AS)であり、sprA1毒素(PepA1)の翻訳を調節する。sprA1AS RNAの濃度がsprA1 mRNAよりも少なくとも35倍大きいとき、PepA1は翻訳されず、細胞は正常に機能する。sprA1AS:sprA1の比が35:1未満になるとき、sprA1翻訳の抑制は完全でなく、細胞は正常に増殖しようと努力する。ある時点でsprA1AS:sprA1 RNAの比が十分に小さくなると十分なPepA1の翻訳が可能になり、アポトーシスが誘導されて細胞が殺傷される。
合成微生物の設計法
殺傷スイッチを有する合成微生物を設計する方法が提供される。殺傷スイッチを有する株を利用して内在性の微生物または病原性微生物からの日和見感染のリスクを予防すること、または減らすことができる。殺傷スイッチは生物が自らの天然のニッチで生きる能力を損なうことを想定していないが、その生物が感染症または疾患を引き起こすと考えられる環境(血流など)で複製されることを阻止するであろう。
合成微生物が1つ以上の非常に特殊な環境にあるときだけ誘導される有効な殺傷スイッチを設計するため、想定されるニッチまたは完全培地と、1つ以上の追加の特定の環境における標的生物の転写プロファイルを調べることができる。
いくつかの細菌は、過剰発現したときに増殖を停止するか細胞死に至る可能性のある発現系を含有することが知られている。Kourtis, MMWR Morb. Mortal. Wkly. Rep. 68, (2019)。細菌毒素-抗毒素系およびを操作して有用な殺傷スイッチ戦略の創出を助けることができる。
微生物が自らの正常な生息地で生きている間はどの遺伝子が低レベルで発現しているかと、その微生物が疾患を引き起こす状態にある間にどの遺伝子が有意に上方調節または下方調節されているかを、その微生物の転写プロファイルを利用して明らかにすることができる。その後、調節が異なる遺伝子を標的微生物自身の毒素-抗毒素系の成分とカップルさせるか機能可能に関連させ、自身の正常なニッチ(対象内の皮膚または粘膜のニッチなど)および/または完全培地では生きられるが、別の環境(対象の血液、血清、血漿、間質液などの中の全身環境など)と接触する状態にされた場合には複製することと疾患を引き起こすことができない合成微生物を生成させることができる。
1つの目的は、偶発的に病原体になることと、予防するよう設計された疾患に至ることができないよう保証する殺傷スイッチを含む合成微生物を作製することである。別の目的は、より悪性の株(病原性株など、例えばMRSA株)が対象に定着または再定着することを阻止するため、対象における細菌干渉で利用するための安全な合成微生物を提供することである。したがって、合成微生物のゲノムに遺伝子として挿入される殺傷スイッチを設計し、その株が身体の意図しない領域にアクセスする場合に細胞死または静菌を引き起こす方法が提供される。
細菌を操作して、自らの正常なニッチでは自らの挙動を妨害することなく、特定の疾患誘起状態において増殖できないようにする株設計法が提供される。RNA-SeqとqPCRを利用し、正常な増殖条件と比べて特定の疾患条件で調節が異なる遺伝子を同定することができる。細胞自身の毒素-抗毒素系を利用して特定の条件における増殖と生きている細胞の数を制御することができる。
本開示による殺傷スイッチを含む合成微生物を調製する方法は、表1Aと図1Aに示されている工程を含むことができる。各工程は、1つの代表的な殺傷スイッチ設計の文脈で示されている;しかし代わりの、または追加の作用遺伝子を使用することができる。
標的微生物(興味ある微生物(MOI))を選択する
標的微生物(興味ある微生物MOIであり、興味ある黴菌BOIとしても知られる)を選択する基準には、ヒトまたは動物のマイクロバイオームに存在しているか、そこに組み込まれる可能性のある微生物を選択することが含まれる。標的微生物は、日和見感染を引き起こすことのできる病原性微生物と同じ種であることが可能である。いくつかの実施形態では、標的微生物として抗生剤感受性微生物が可能である。例えば標的微生物としてメチシリン感受性黄色ブドウ球菌(MSSA)(502a株など)が可能である。病原性微生物として抗生剤耐性微生物が可能である。病原性微生物としてメチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)が可能である。標的微生物は、場合によりゲノム改変の前に、対象のニッチ内の病原性微生物と持続的に置き換わることができる可能性が大きい。しかし比較的良性の標的微生物でさえ日和見感染を引き起こすことができる可能性がある。
標的微生物における殺傷スイッチ活性化のための体液または環境を選択する
標的微生物は天然のニッチ(皮膚または粘膜のニッチなど)を持続的に占めることができるように設計される。標的微生物は安定に遺伝子改変されるため、対象内の全身条件(感染につながる可能性のある静脈内または皮下の生理学的環境など)のもとで生き延びることができてはならない。興味ある体液(FOI)として、標的微生物が日和見感染を引き起こすことのできる体液、または食品が可能である。潜在的なFOIのいくつかの例は、血液、血清、脳脊髄液、滑液、および母乳である。次いで標的微生物は改変され、ゲノムに組み込まれた殺傷スイッチが導入されるため、得られた合成微生物は、選択された多くの異なる体液(FOI)または環境の中で増殖することができない。
標的微生物のゲノムのマッピング
標的微生物の完全なDNA配列は、株の潜在力の調査を開始するのに有用である可能性がある。注釈付き配列を公開データベースで入手できない場合には、標的微生物のDNAを抽出してシークエンシングすることができる。次世代シークエンシング技術を利用してゲノム配列の大半(99%まで)を捕獲することができるが、この技術は短いリードのマッピングに参照鎖を必要とする。利用できる参照鎖がない場合には、マッピングされるより短いリードのための参照鎖として機能できる長いシークエンシングのリードを作るため、ナノポアシークエンシングも利用することができる。ゲノム配列が組み立てられて注釈を付けられると、それをゲノムマッピングに利用すること、株相互間で類似性を探すこと、および殺傷スイッチの組み込みまたは他の用途のためゲノムを編集することができる。
RNA-Seq実験を利用して上方調節された遺伝子を見つける
RNA-Seq(RNAシークエンシング)またはマイクロアレイ実験を利用して異なる環境における標的微生物のトランスクリプトームのプロファイルを捕獲し、変動する遺伝子発現を見つけることができる。これらの方法の両方とも、異なる環境に応答して転写されるRNAのレベルを定量することにより標的微生物の遺伝子/プロモータの発現を分析することができる。潜在的な殺傷スイッチのプロモータを見つけるため、FOIの中で標的微生物を増殖させ、あらかじめ決められた時点にサンプルを採取し、サンプルからRNAを抽出し、RNAの濃度と純度を測定することを含むRNA-Seqを実施することができる。その後rRNAを分解し、サンプル中に残留しているmRNAを逆転写してcDNAライブラリを創出せねばならない。得られたcDNAを次世代シークエンサでシークエンシングした。リードをマッピングし、標的微生物の参照配列にアラインメントした。得られたデータセットは、注釈付き参照配列にマッピングされた、遺伝子1個当たりのリード数を示すであろう。Conesa et al. RNA-seqデータ分析の最良の実施法の探索. Genome Biol. 17, 13 (2016)。
RNA-Seq(「RNAシークエンシング」の略号)は、所与の時点における生物サンプル中のRNAの存在と量を明らかにするため次世代シークエンシング(NGS)を使用するシークエンシング技術であり、細胞トランスクリプトームの連続的な変化を分析する。Voelkerding et al., 2009, Clinical Chem 55:4; 641-658。RNA-Seqは、代替遺伝子によってスプライスされた転写産物、転写後修飾、遺伝子融合、時間経過による遺伝子発現における変異/SNPと変化、または異なる群または処理における遺伝子発現の差を見ることを容易にする。RNA-Seqは、mRNA転写産物に加え、異なるRNA集団(全RNA、短鎖RNA(miRNAなど)、tRNA、およびリボソーマルプロファイリングが含まれる)を見ることができる。RNA-Seqを利用すると、エキソン/イントロンの境界を明確にすることと、以前に注釈された5'と3' の遺伝子境界を検証または修正することもできる。次世代シークエンシング(NGS)は超並列シークエンシングとしても知られ、超並列処理を利用したDNAシークエンシングへのハイスループットのアプローチである。これらの技術は、ミニチュア化され並列化されたプラットフォームを使用して装置を1回作動させるごとに100万~4300万個の短いリード(それぞれ約50~400塩基)のシークエンシングをすることを含むことができる。
RNA-Seqの実施には、FOIの中で標的微生物を増殖させること;あらかじめ決められた時点にサンプルを採取すること;サンプルからRNAを抽出すること;RNAの濃度と純度を測定すること;rRNAを分解し、サンプル中に残留しているmRNAを逆転写してcDNAライブラリを生成させること;そのcDNAライブラリを場合により次世代シークエンサ(ThermoFisher Scientific)でシークエンシングしてDNA配列のリードを創出すること; DNA配列のリードを標的微生物の注釈付き参照配列にマッピングとアラインメントすること;および、注釈付き参照配列にマッピングされた、遺伝子1個当たりのリード数を計算することを含めることができる。
標的微生物を対照培地とFOIの両方の中で増殖させ、あらかじめ決められた時点にサンプリングするプロトコルの一例は、以下の諸工程を含むことができる。
プロトコルの例:インキュベートされたシェイカーの中で、標的微生物を培地(対照)とFOI両方の中で増殖させる。サンプルをt=0分、t=30分、およびt=60分に採取する。それぞれの時点で細胞をペレットにし、RNA Protectを添加してRNAを保存する。RNAを抽出し、RNA Seq分析のために送り出す。RNA Seqデータ分析はConesa 2016に従って実施することができる。データセットを規格化してTPM(100万当たりの転写産物)の出力を生成させる。遺伝子の長さ(リード数/遺伝子の長さ(単位はキロ塩基)からRPK=1キロ塩基当たりのリードが得られる)を説明するため遺伝子1個当たりのリード数を規格化する。サンプル1つ当たりの全リードの差を説明するためRPK値を100万当たりのスケーリング因子で割る。こうして、必ずしも異なる増殖状態で調節が異なるという理由ではなくて全リードの増加/減少が原因で人工的に上昇/下降していると考えられる値を規格化する。最後に、培地の中では発現が低レベルだがFOIの中では上方調節されている遺伝子(毒素のための遺伝子/プロモータ候補)を同定する。
FOIの中での転写産物の発現レベルが高く、培地の中での発現が正常または低い遺伝子またはプロモータが、操作された殺傷スイッチのために使用する上で興味深い。FOIの中で「オン」になる遺伝子を、同じmRNA転写産物上の毒素遺伝子と一体化する領域として使用でき、するとその毒素がFOIの中で上方調節された遺伝子とともに発現する。
標的微生物にとって天然の毒素/抗毒素系を同定する
毒素/抗毒素系は多くの微生物に自然に備わっており、ストレスに満ちた条件下で細胞増殖調節因子として機能することができる。Yamaguchi, Y., Park, J.-H. & Inouye, M. 細菌と古細菌における毒素-抗毒素系 Annu. Rev. Genet. 45, 61-79 (2011)。少なくとも6つのタイプの毒素/抗毒素系が発見されており、そのすべてで抗毒素がどのようにして毒素を調節するかが異なっている。例えばI型毒素/抗毒素系では、RNA抗毒素が毒素mRNAの翻訳を阻害する。タンパク質性毒素は、タンパク質、細胞壁合成、およびDNA複製の阻害を通じて細胞死を誘導できる小さなペプチド(ほぼ100 bp)であり、細胞壁との一体化を損なってmRNA安定性に影響を与える。理想的には、株の設計に使用される毒素は標的株に自然に備わっていると考えられるが、他の微生物からの他の毒素遺伝子も使用できる可能性がある。
標的微生物(MOI)のためのゲノム編集法を特定する
標的微生物に適したゲノム編集法を特定することができる。相同組み換えを指示して標的微生物のゲノムを編集することのできる適切なプラスミドを特定することができる。Thomason et al., Current Protocols in Molecular Biology (eds. Ausubel, F. M. et al.) 1.16.1-1.16.39 (John Wiley & Sons, Inc., 2014). doi:10.1002/0471142727.mb0116s106。他のゲノム編集系(CRISPR/Cas9系など)を利用すること、またはPCRアンプリコンを直接取り込むのに超コンピテント細胞を用いることもできる。Adli, M. ゲノム編集とその先のためのCRISPRツールキット. Nat. Commun. 9; Junges, R. et al. Markerlessコンピテントレンサ球菌におけるゲノム編集. Methods Mol. Biol. Clifton NJ 1537, 233-247 (2017)。したがって相同組み換え、CRISPR-Cas9系、マーカーレスゲノム編集、または本分野で知られている適切な他の任意の方法を利用して標的微生物のゲノムの中の誘導性の遺伝子またはプロモータ領域の近くに毒素を持続的に組み込むことができる。
毒素を有するプラスミドを作製して毒素の有効性を調べる
天然または非天然の候補毒素を標的微生物に対する有効性に関してスクリーニングすることができる。これは、誘導性プロモータの制御下にある候補毒素を含有するプラスミドを作製することによって実現できる。例えばテトラサイクリンまたは無水テトラサイクリンによって誘導することのできるtetOオペロンを持つプラスミドを用いて毒素産生を誘導することができる。Helle, L. et al. 黄色ブドウ球菌における改善されたTetリプレッサ依存性の緩やかな遺伝子誘導またはサイレンシングのためのベクター Microbiology 157, 3314-3323 (2011)。プラスミドで標的微生物を形質転換するとき、そのプラスミドを誘導し、例えばCFU播種、または分光光度計を用いた光学密度の測定によって細胞死を測定することができる。Nutrition, C. for F. S. and A. BAM: Aerobic Plate Count. FDA (2019)。例えば本明細書で言及されているRNA-Seq法で見られるように、最も致死性の候補毒素の1つ以上を選択してFOI内の誘導性の遺伝子またはプロモータの調節下にある標的微生物のゲノムに組み込むことができる。
RNA Seqの結果をqPCRで検証する
qPCRまたは本分野で知られている他の適切な技術を利用すると、興味ある遺伝子に結合するプライマーを使用して異なる環境におけるそれら遺伝子の活性を測定することにより、RNA-Seqの結果を確認することができる。12この技術は、殺傷スイッチ株の中のRNA転写産物のレベルを確認し、毒素とプロモータの機構が適切であることを保証するのにも利用できる。
qPCR測定のための増殖プロトコルの一例は、以下の諸工程を含むことができる
a.標的微生物(MOI)の培養物を一晩増殖させる。
b.12~16時間増殖させた後、使い捨て殺菌震盪フラスコに50 mLの一晩培養物を光学密度600(OD)が0.1になるまで接種する。
c.細胞をODが2になるまで増殖させる。OD 2の時点でt=0分RNAサンプルのため500 μlを取り出す。3×7 mLの残留細胞を三連の50 mLの円錐形のチューブに移す。チューブを遠心分離し、上清をデカントし、1×リン酸塩緩衝化生理食塩水(PBS)で洗浄し、再度遠心分離し、上清をデカントし、細胞を7 mLの対照培地(例えばTSB)と興味ある体液(例えば血液、血清、母乳など)の中に再懸濁させる。
d.240 rpmで震盪しながらチューブを37℃の培養器に入れる。
e.RNAサンプルを血清または血液に曝露してからt=0分後(37℃の培養器に入れる直前のサンプルチューブ)、t=15分後、およびt=45分後に回収する。RNAのための増殖サンプルを採取するため、500 μLを1.7 mLの微量遠心チューブに移し、細胞を13,200 rpmで1分間回転させ、上清をデカントし、100 μLのRNA産物を添加する。
f.全サンプルを-20℃で保管する。
a.標的微生物(MOI)の培養物を一晩増殖させる。
b.12~16時間増殖させた後、使い捨て殺菌震盪フラスコに50 mLの一晩培養物を光学密度600(OD)が0.1になるまで接種する。
c.細胞をODが2になるまで増殖させる。OD 2の時点でt=0分RNAサンプルのため500 μlを取り出す。3×7 mLの残留細胞を三連の50 mLの円錐形のチューブに移す。チューブを遠心分離し、上清をデカントし、1×リン酸塩緩衝化生理食塩水(PBS)で洗浄し、再度遠心分離し、上清をデカントし、細胞を7 mLの対照培地(例えばTSB)と興味ある体液(例えば血液、血清、母乳など)の中に再懸濁させる。
d.240 rpmで震盪しながらチューブを37℃の培養器に入れる。
e.RNAサンプルを血清または血液に曝露してからt=0分後(37℃の培養器に入れる直前のサンプルチューブ)、t=15分後、およびt=45分後に回収する。RNAのための増殖サンプルを採取するため、500 μLを1.7 mLの微量遠心チューブに移し、細胞を13,200 rpmで1分間回転させ、上清をデカントし、100 μLのRNA産物を添加する。
f.全サンプルを-20℃で保管する。
例示的なqPCRサンプル処理とデータ分析のプロトコルは、以下の諸工程を含むことができる、またはTaylor et al. Methods 50, S1-S5 (2010)などの文献に見られる通りである。
a.凍結したRNAペレットをPBSの中で1回洗浄する。
b.Ambion RiboPure Bacteriaキットを用いてRNAを抽出し、25 ulの中に溶離させる。
c.Ambion Turbo DNaseキットを用いてサンプルからDNAを取り出す。
d.Applied BiosystemsのHigh-Capacity cDNA逆転写キットを用いて10 μLの最終RNAをcDNAに変換する。
e.Applied Biosystems PowerUp SYBR Greenマスターミックス(1 μlのcDNAを含む10 μlの反応物)を用いてqPCR測定を実施する。
f.サンプルを調べ、遺伝子発現の経時変化と培地の違いによる変化を探す
g.ΔΔCt法を利用してハウスキーピング遺伝子gyrBに規格化する。各RNAサンプルについて、gyrB転写産物に関するCt(域値までのサイクル数)値を遺伝子転写産物に関するCt値から差し引く。ΔCt値をt=0分に規格化する。
a.凍結したRNAペレットをPBSの中で1回洗浄する。
b.Ambion RiboPure Bacteriaキットを用いてRNAを抽出し、25 ulの中に溶離させる。
c.Ambion Turbo DNaseキットを用いてサンプルからDNAを取り出す。
d.Applied BiosystemsのHigh-Capacity cDNA逆転写キットを用いて10 μLの最終RNAをcDNAに変換する。
e.Applied Biosystems PowerUp SYBR Greenマスターミックス(1 μlのcDNAを含む10 μlの反応物)を用いてqPCR測定を実施する。
f.サンプルを調べ、遺伝子発現の経時変化と培地の違いによる変化を探す
g.ΔΔCt法を利用してハウスキーピング遺伝子gyrBに規格化する。各RNAサンプルについて、gyrB転写産物に関するCt(域値までのサイクル数)値を遺伝子転写産物に関するCt値から差し引く。ΔCt値をt=0分に規格化する。
RNA-Seqとプラスミド毒素スクリーンの結果を組み合わせて標的微生物における殺傷スイッチを設計する
選択されたゲノム編集法を利用してプラスミドまたは他の系を設計し、標的微生物の中にあってFOIの中で大きく上方調節されている誘導性の遺伝子またはプロモータ領域の近く(前、途中、または末尾)に毒素遺伝子を挿入することで、殺傷スイッチの持続的な組み込みを実現することができる。ゲノム編集の成功をシークエンシングによって確認した後、FOIアッセイを利用して新たな株をFOIの中で調べることができる。
新たに構成した合成微生物をFOIアッセイで調べる
FOIアッセイ(殺傷アッセイプロトコルとも呼ばれる)を利用して合成微生物における毒素の致死率を明らかにすることができる。遺伝子改変された株を、あらかじめ決められた時点に採取したFOIとサンプルに曝露すること、またはそのFOIとサンプルの中でインキュベートすることができる。サンプルの増殖は、所定の希釈液を寒天プレートに播種し、インキュベーション期間の後にコロニーの数をカウントすることによって測定される1 mL当たりのコロニー形成単位(CFU)によって測定すること、またはOD600での光学密度測定、フローサイトメトリー、または他のタイプのルミネセンスアッセイを通じて測定することができる。
殺傷アッセイの一例のプロトコルには以下の諸工程が含まれる。
a.合成株を細胞培養培地の中で増殖させ、培養物を沈降させ、PBSで洗浄し、再度沈降させ、PBSの中に再懸濁させる。場合により、標的株を同様に増殖させる。
b.洗浄した培養物をFOIと細胞培地(対照)に接種する。
c.各培養物をt=0時間にサンプリングした後、接種された培養物を37℃の培養器の中に入れ、240 rpmで震盪する。
d.PBSの中で各サンプルの平板希釈を実施し、CFU/mLを翌日計算できるようにする。
e.培養物が増殖中のあらかじめ決められた時点(例えばt=2時間、t=4時間、t=6時間、t=8時間)にサンプルを採取し、平板希釈を実施する。
a.合成株を細胞培養培地の中で増殖させ、培養物を沈降させ、PBSで洗浄し、再度沈降させ、PBSの中に再懸濁させる。場合により、標的株を同様に増殖させる。
b.洗浄した培養物をFOIと細胞培地(対照)に接種する。
c.各培養物をt=0時間にサンプリングした後、接種された培養物を37℃の培養器の中に入れ、240 rpmで震盪する。
d.PBSの中で各サンプルの平板希釈を実施し、CFU/mLを翌日計算できるようにする。
e.培養物が増殖中のあらかじめ決められた時点(例えばt=2時間、t=4時間、t=6時間、t=8時間)にサンプルを採取し、平板希釈を実施する。
殺傷スイッチ合成株がFOIの中で毒素を有効なレベルで発現している場合、CFU/mLはアッセイの期間中に減少するであろう。CFU/mlが細胞培養培地の中で増殖した株と同じか同様にとどまる場合には、毒素遺伝子をFOIの中で上方調節された他の遺伝子に付加することによって、または毒素遺伝子を単一の株の中で上方調節された複数の遺伝子に付加することによって別の株を設計することができる。FOIの中で細胞死を測定するあるタイプのアッセイを利用してすべての合成株コンストラクトを調べることができる。
標的微生物の中の毒素-抗毒素系を活用し、あらかじめ決められた環境条件下でオンになって合成微生物を殺傷する殺傷スイッチを含む合成微生物を創出する方法が提供される。 FOIの中でMOIを増殖させてRNA-Seqデータを生成させ、どの遺伝子またはプロモータがFOIの中で上方調節されているかを明らかにすることができる。その後、毒素遺伝子を近くの標的株のゲノムに挿入して内在性の誘導性遺伝子と機能可能に関連させ、殺傷スイッチを含む合成株を生成させることができる。この合成株が特定の環境に曝露されるとき、上方調節された領域がオンになり、したがってこの株を殺す新たに組み込まれた毒素が生成する。この技術により、宿主対象における全身日和見感染のリスクなく、例えば細菌干渉で使用するための合成微生物を含む生きた生物学的製剤(LBP)を創出することが可能になる。
作用遺伝子の最適な発現のためにゲノムに組み込む部位の選択:殺傷スイッチのための開始部位の最適化
本開示により、作用遺伝子のDNA断片を生物のゲノムに挿入して誘導性プロモータをその作用遺伝子に機能可能に連結し、特定の環境刺激下で細胞が自らの天然のニッチで生き残る能力を損なうことなく生物の表現型を変えることができるようにする方法が提供される。方法は、細胞の天然の調節系が作用遺伝子の転写と翻訳を十分に調節して表現型応答が観察されるか検出可能な限界未満であるかのいずれかになるような最少のゲノム改変にすることを含む。生物のゲノムに挿入された外来性DNAは作用遺伝子または誘導性プロモータを含有することができる。
外来DNA配列を挿入する最適な位置を決めるための2つの主要な基準または段階、すなわち、1)作用遺伝子が「オン」と「オフ」の両方であることが望まれる条件において調節が異なる遺伝子またはプロモータを見いだすため、標的宿主のトランスクリプトームの全体的な検索を実施し、2)作用遺伝子を含有するRNA転写産物を最適に発現させるためゲノム内に局所的スケールで外来DNA配列を組み込む正確な位置を求めるという基準または段階が存在する。標的生物のゲノム内の全体的スケールと局所的スケールの両方で、外来性DNA断片を挿入するために選択される位置が、作用遺伝子の操作された発現に大きな効果を及ぼす可能性がある。操作された生物から最適な性能を実現するには、誘導性プロモータと作用遺伝子を機能可能に連結させるゲノム内の適切な位置を決めるとき注意せねばならない可能性がある。
環境が誘導する殺傷スイッチの開発における第1段階では、異なる培地(ヒト血清やトリプティックソイブロス(TSB)など)内での増殖アッセイにおいて(例えば黄色ブドウ球菌(SA)からの)標的微生物のサンプルを用いるRNA-seq実験を実施することができる。サンプルをRNA抽出のため異なる時点に採取することができ、RNA転写産物をシークエンシングして両方の増殖条件における特定の時点での全体的な遺伝子発現を明らかにすることで、その異なる増殖条件の間で発現が異なる遺伝子の同定が可能になる。調節が異なる遺伝子は、外来性DNAを組み込む位置としてさらに調べるための潜在的候補であると同定される。
誘導性の遺伝子またはプロモータが適切な環境内で望む発現パターンを持つことが同定されると、外来性DNA断片を挿入するのに適切な向きと位置を決めるためさらに調べることができる。作用遺伝子の発現を誘導性プロモータと結びつけるため、作用遺伝子は、天然遺伝子の転写または翻訳を阻止しないようRNA転写産物の中で転写開始部位とターミネータの間に位置することが好ましい。細胞内で発現するそれぞれの個別の遺伝子、オペロン、および他の調節RNAのための転写産物は多くの点で異なるため、組み込みの標的とする最適な位置は複雑な判断である。本明細書に示されている実施例は、isdB::sprA1殺傷スイッチ内の組み込みの上流の遺伝子の終止コドンの間の距離をわずかに変えることが、血清中で評価する場合の、殺傷スイッチの有効性にほとんど、またはまったく影響を与えないことを示している。
持続的に組み込まれていて誘導性プロモータ系に機能可能に連結された作用遺伝子を創出するには、ゲノムへの組み込み位置が重要な役割を果たす。本明細書の実施例に示されているように、異なる培地条件で増殖させた黄色ブドウ球菌株BP_001のRNA-seq分析は、図18と実施例に示されているように、異なる条件の間で非常に異なる転写産物プロファイルを示した。標的株がTSBの中で増殖している間は非常に低レベルの転写産物が存在し、この株がヒト血清の中で増殖している間は非常に高レベルの転写産物を示した遺伝子(いくつか挙げると、isdB、harA、isdC、およびsbnA遺伝子など)を選択した。
選択された遺伝子(isdB、PsbnA、harAが含まれる)のオペロンを標的として毒素遺伝子sprA1を組み込み、合成株BP_118、BP_092、およびBP_128をそれぞれ作製した。1つのケースでは、sprA1遺伝子のための天然プロモータを除去し、sbnA遺伝子(PsbnA_BP_150)のためのプロモータで置き換えた。BP_128に関する血清アッセイを実施した後、アッセイのために使用した株はフレームシフトした短縮型sprA1遺伝子を持っていたことが見いだされた。
図19に示されているように、株BP_118(isdB::spra1)、BP_092(PsbnA::sprA1)、およびBP_128(harA::sprA1)のそれぞれは、血清中で増殖する能力を調べたとき、2時間と4時間の時点の両方でCFU/mLの減少を示した。BP_118(isdB::spra1)は、CFU/mLの最大の低下として、最強の殺傷スイッチ活性を示した。株BP_150は野生型親株よりもほんのわずかだけゆっくりと増殖したが、それでも4時間アッセイの間、プラスの増殖曲線を維持した。
調べたどの株も、野生型株BP_001と比べるとTSBの中での増殖に差を示さなかった。これは、sprA1作用遺伝子の発現がその増殖条件で十分に抑制されたことを示す。
黄色ブドウ球菌(S. aureus)と大腸菌(E. coli)の中の多数の死誘導殺傷スイッチが本明細書で提供される。これら殺傷スイッチは、プラスミドに含有されるかゲノム内に組み込まれており、ある状態変化を感知して細胞死を誘導する。これらは一般に黄色ブドウ球菌毒素遺伝子sprA1を利用して設計されている。毒素遺伝子(sprA1やsprG1など)の過剰発現が大腸菌と黄色ブドウ球菌における細胞死につながる可能性がある。大半の黄色ブドウ球菌株に見られるsprG2遺伝子とsprG3遺伝子はI型毒素-抗毒素ファミリーに属しており、その発現は、それぞれ対応するsRNA抗毒素sprF2とsprF3によって制御することができる。抗毒素sRNAに対する毒素mRNAの比が、抗毒素によって毒素遺伝子の翻訳をもはや抑制できないレベルに達したとき、毒素タンパク質が合成され、それが形質転換された細胞の静菌につながる。Riffaud, Camille, et al.「黄色ブドウ球菌の中の4つのSprG/SprF I型毒素-抗毒素系の機能と交差調節」Nucleic acids research 47.4 (2019): 1740-1758。これは、本明細書において実施例21で実証される。pRAB11発現ベクターを利用して、作用遺伝子sprG2とsprG3の両方が大腸菌と黄色ブドウ球菌において静菌を引き起こす能力を調べた。p305上のsprG2遺伝子の過剰発現が大腸菌(BPEC_025)と黄色ブドウ球菌(BP_165)の両方における静菌につながった。
殺傷スイッチを超えるピギーバックの応用
本開示には、殺傷スイッチを超える他の誘導性遺伝子スイッチを創出するために細胞の機構を利用する方法が含まれる。ピギーバック法を「レオスタティック(加減抵抗器)」細胞の生成と産生にも利用することができる。これらは状態変化を感知したとき特定のやり方で応答するため、ピギーバック技術を利用して改変することのできる細胞である。殺傷スイッチの例は有効性が優れていることが実証された;しかし誘導性殺傷スイッチを超える応用は漠然としている。非致死的誘導性応答を実証するためのレポータ遺伝子を始めとして、地球全体での健康管理に大きな影響があるピギーバックのいくつかの潜在的な応用が提供される。
レポータ遺伝子の組み込み
レポータ遺伝子(緑色蛍光タンパク質(GFP)など)を用いて細胞の内外の特定の状態変化を検出することができる。調節が異なる遺伝子と上記のオペロンを同定するのと同じ戦略を利用して診断目的で使用できる離散したスイッチを有する細胞を操作し、ある環境条件(pHまたは温度の変化、ある化学物質の存在または不在、および細胞レベルでの他の環境刺激など)を検出することができる。
細胞の天然の調節系を利用するか、合成された短鎖非コードRNA(sRNA)分子を設計することによって、スイッチが「オフ」のときにレポータ遺伝子の転写と翻訳の速度を調節してゼロに近くした後、スイッチを「オン」にする物質または環境条件の存在下で遺伝子抑制系を除去することは、1つの貴重な診断ツールである可能性がある。レポータタンパク質は、蛍光タンパク質または発色タンパク質を用いることによって視覚的に検出すること、酢酸イソアミル(バナナの香り)を産生するアルコールアセチルトランスフェラーゼIなどのタンパク質を用いることによって匂いを通じて検出すること、生物の表現型応答の変化(通常はカタラーゼ陰性である株でのカタラーゼ産生の誘導(H2O2→2H2O+O2)など)を通じて検出すること、または分子生物学の方法(特定のmRNA転写産物のレベル上昇を探すqPCRまたはRNA-seqなど)を通じて検出することができよう。作用遺伝子として、レポータ遺伝子、例えば蛍光レポータ遺伝子(例えば緑色蛍光タンパク質(GFP)または赤色蛍光タンパク質(RFP)(mKATE2など))が可能である。
蛍光レポータ遺伝子は、ピギーバック法を利用して、黄色ブドウ球菌、ストレプトコッカス・アガラクティエ、および大腸菌のゲノムの中の血清応答性プロモータ遺伝子の後ろに挿入することができる。培養物が血清とTSBの中で増殖している間にレポータタンパク質からの蛍光を定量化し、レポータ遺伝子の発現を調節するプロモータまたはmRNA転写産物の転写と翻訳の速度に関する定量データを得ることができる。これらの転写と翻訳の速度を利用して、調べた条件で細胞がこれらの経路をどのように調節しているかに関する貴重な情報を得ることができる。緑色蛍光タンパク質(GFP)とmKATE2(赤色蛍光タンパク質、RFP)は、励起されたときに蛍光を出す蛍光色素分子である。これらは元々は異なる水性動物から単離され、両方とも特定の励起スペクトルと発光スペクトルを持つが、特異性と安定性を求めてそれ以来操作され最適化されてきた。これら遺伝子の1つをゲノムの厳密に制御されるプロモータ、遺伝子、またはオペロンの後ろに組み込んだ後、蛍光プレートリーダーを用いて培養物の蛍光を定量することにより、蛍光タンパク質GFPとmKATE2の転写と翻訳の速度を計算することができよう。
本開示は、殺傷スイッチを有する細菌株が500世代超にわたって増殖させた後に機能的に安定であることの証拠を示す。そのためこの技術は、上記の技術と同様、診断目的に使用できる生物の開発によく適しているはずであり、GFPとmKATE2を用いて実証された。
ヒトにおけるラクトース不耐症
ヒトにおけるラクトース不耐症は胃腸管における酵素ラクターゼ(β-ガラクトシダーゼ酵素としても知られ、lacZ遺伝子によってコードされる)の産生不足によって起こり、二糖化合物ラクトースを消化できないことにつながる。この状態は多くの人に影響を及ぼしており、ある集団では90%にも達する。高濃度のラクトースが哺乳類の母乳に見いだされているが、多くの個人が離乳後は乳製品を消費するのに十分なラクターゼを生成させる能力を失う。ラクトースはガラクトースとグルコースからなる二糖(4-O-β-ガラクトピラノシル-D-グルコピラノース)である。Campbell et al.「ラクトース不耐症の分子的基礎」Science progress 88.3 (2005): 157-202。ラクトース不耐症の個人はそれでもガラクトースとグルコースを代謝できるため、その人の消化系が二糖であるラクトースを十分に分解するだけのラクターゼを産生できる場合には、その状態からの症状が緩和されると考えられる。
合成大腸菌細胞におけるレオスタティックラクターゼ産生は本明細書に提示されている方法を利用して実施することができる。例えば追加のlacZ遺伝子を図41に示されているように細胞内の天然のlacオペロン経路に組み込むことができる。
ラクトースオペロン(lacオペロン)は、大腸菌と他の多くの腸内細菌の中でラクトースの輸送と代謝に必要とされるオペロンである。大腸菌のlacオペロンはラクトース代謝に関与する遺伝子を含有する。lacオペロンは、ラクトースが存在し、かつグルコースが不在のときにだけ発現する。lacオペロンは、3つの構造遺伝子と、プロモータ、ターミネータ、調節因子、およびオペレータからなる。3つの構造遺伝子はlacZ、lacY、およびlacAである。lacZは、二糖ラクトースを切断してグルコースとラクトースにする細胞内酵素であるベータ-ガラクトシダーゼ(LacZ)をコードする。lacYは、プロトン勾配を利用してラクトースを含むベータ-ガラクトシドを細胞内にポンピングする膜貫通シンポータであるベータ-ガラクトシダーゼパーミアーゼ(LacY)をコードする。パーミアーゼはベータ-ガラクトシドに対する細胞の浸透性を増大させる。LacAは、アセチル基をアセチル-CoAからベータ-ガラクトシドに転移する酵素であるベータ-ガラクトシダーゼトランスアセチラーゼ(LacA)をコードする。lacZとlacYだけがラクトースの代謝に必要である可能性がある。
例えばストレプトコッカス・サーモフィルスからのB-ガラクトシダーゼを大腸菌のためにコドン最適化した後、大腸菌の天然ラクトース経路に挿入し、ラクトース代謝を増大させることができる。細胞培地内のラクトースの減少、およびまたは時間経過に伴う培地中でのラクトースからのラクトース代謝産物の増加を測定することにより、培地内でのラクトースの代謝速度を野生型細胞と合成株の間で比較する。B-ガラクトシダーゼ遺伝子BP_DNA_152(配列番号266)とBP_DNA_153(配列番号267)を、大腸菌(K12)のためにIDTによってコドン最適化した後に調製した。BP_152はストレプトコッカス・サーモフィルスに由来し、BP_DNA_153は大腸菌に由来する。これら2つの遺伝子を大腸菌内のlacオペロンの中の1つ以上、2つ以上、またはいくつかの位置に別々に組み込み、これらが野生型生物のラクトース代謝を増強する能力を調べることができる。ストレプトコッカス・サーモフィルスB-galはBP_AA_026(配列番号270)のアミノ酸配列を含むことができる。大腸菌B-galアミノ酸配列はBP_AA_024(配列番号268)を含むことができる。それに加え、GFP(BP_DNA_077)(配列番号42)は上にレポータ遺伝子として使用したのと同じ位置に組み込むことができる。GFP成分は、ラクトースの存在下で増殖させるとき、無ラクトース培地と比べて蛍光の増加を示す可能性がある。
ピギーバック技術を利用して、ラクトース代謝活性を増強する必要のある対象でその活性を増強することができる。例えばラクトース代謝の間、(lacZ遺伝子によってコードされる)β-ガラクトシダーゼ酵素が二糖を切断してグルコースとガラクトースにする反応を触媒する。この酵素工程の活性の低下は大半の人が経験する症状の原因であると考えられており、その症状はラクトース不耐症と呼ばれる。
いくつかの実施形態では、ヒトの腸に内在する微生物を操作し、ラクトースが存在するときにβ-ガラクトシダーゼ酵素の発現およびまたは活性が増強されるようにすることができる。いくつかの実施形態では、ストレプトコッカス・サーモフィルスからのβ-ガラクトシダーゼ遺伝子が、大腸菌で見つかった天然のlacオペロンに挿入される。大腸菌lacオペロンは非常によく研究されており、ラクトースが存在し、かつグルコースが不在のときにだけ転写されることが知られている。
操作された株は、ラクトースが存在する場合と不在の場合の両方の条件で増殖させ、複数の時点でサンプルを採取することにより調べることができる。β-ガラクトシダーゼ活性は、培地からのラクトースの消費速度、または同じサンプルからの粗細胞ライセートにおけるβ-ガラクトシダーゼ活性を見ることによって調べることができる。いくつかの実施形態では、組み込まれたGFPレポータ遺伝子を有する株を上と同じ条件で増殖させるが、蛍光の測定値は各サンプルから取られ、それが、経路がオンにされていることと、われわれのピギーバック技術を利用して大腸菌lacオペロンに追加機能を付加できることを示すことになる。
原核生物は、β-ガラクトシダーゼ(ラクターゼまたはβ-gal)をコードするlacZ遺伝子を含有するlacオペロンを含有する。ストレプトコッカス・サーモフィルスは似たオペロンを含有しており、マウスの消化管で活性なβ-galを産生できることが実証された。Drouaultet al.「ストレプトコッカス・サーモフィルスは、無菌マウスの消化管を通過中に活性なβ-ガラクトシダーゼを産生することができる」Appl. Environ. Microbiol. 68.2 (2002): 938-941。細菌β-galの酵素委員会(EC)番号はEC 3.2.1.23(BP_AA_024)(配列番号268)である。細菌ラクターゼは小腸によって産生されるラクターゼとアミノ酸配列が類似していない。ベータ-ガラクトシダーゼをコードする遺伝子は、配列番号266または267のDNA配列を含むことができる。ベータ-ガラクトシダーゼ酵素は、配列番号94、268、または270のアミノ酸配列を含むことができる。
本開示により環境性殺傷スイッチを組み込むためのピギーバック戦略が提供され、この戦略を利用して腸内細菌(すなわち大腸菌属、乳酸菌属、バクテロイデス属)を操作し、生物が腸内にラクトースの存在を感知したときラクターゼを産生して分泌するオペロンを付加することができよう。ラクターゼの産生と分泌を、ラクトースが存在することを生物が感知したときだけという条件とカップルさせることにより、細胞の代謝の妨害をその天然のニッチにおいて最少にするはずである。こうすることで、腸内の他の生物と同じ競合上の利点を持つ操作された生物が提供され、マイクロバイオームにこの操作された生物を持続的に組み込むことが可能になる。
ヒトにおけるグルテン不耐症
グルテンは、コムギ、オオムギ、およびライムギに存在するグリアジンとグルテニンからなる不溶性タンパク質の異種混合物である。Cavaletti, Linda, et al., 2019「グルテン不耐症の食事管理のための、グルテンタンパク質を効率的に解毒する新規な微生物プロテアーゼE40」Scientific reports 9.1: 1-11。グルテンは哺乳類のタンパク質分解酵素による消化が難しいことで悪名が高いため、プロリン-リッチな消化抵抗性ペプチドが血流に入ることが可能になって免疫応答を引き起こす。Amador, Maria de Lourdes Moreno, et al.「新規な微生物グルテン分解プロリルエンドペプチダーゼ:セリアック病に応用してグルテン免疫原性ペプチドを減らす可能性」PloS one 14.6 (2019)。時間が経過すると、繰り返される免疫応答が腸と周囲の領域に損傷を引き起こす可能性がある。30%のヒト集団がセリアック病を発症するリスクに曝す遺伝成分を有するが、それよりもはるかに少ない割合が、この疾患と関係する合併症を経験する。これは、関与する他の成分が存在することを示唆する。Galipeau, Heather J., and Elena F. Verdu.「腸内微生物と有害な食物反応:グルテン関連障害に注目する」Gut Microbes 5.5 (2014): 594-605。効果的なグルテナーゼ(グルテンに見られるタンパク質を分解する酵素)(プロリルエンドペプチダーゼ(PEP)など)を用いると、本開示のピギーバック法を利用して腸内微生物叢の常在微生物を操作して生物がグルテンの存在を感知したときそのエンドペプチダーゼを分泌させることにより、宿主におけるグルテン不耐症の効果を弱めることができる可能性がある。
本開示は、生物を操作するため最少のゲノム改変を利用して作用遺伝子の発現を誘導性プロモータ系と結びつけるピギーバック法を提供しは、IG管に持続的に組み込むことができてグルテンタンパク質を血流に入る前に十分に分解することのできる微生物を作製することができよう。例えば安定な常在腸内微生物を操作して生物がプロリン-リッチなペプチドの存在を感知したときだけエンドペプチダーゼ酵素(プロリルエンドペプチダーゼ(BP_AA_022)(配列番号92)またはエンドペプチダーゼ40酵素(BP_AA_023)(配列番号93)など)を発現して分泌するようにすると、グルテン感受性の個人の胃腸管に見られる不十分なプロテアーゼ活性を増大させることができよう。Cavaletti et al., 2019。操作された生物は、その生物がグルテンタンパク質の存在下にあるときに誘導されるか上方調節されるオペロンプロモータ系と結びついた酵素を発現して分泌すると考えられる。
プロリンリッチなタンパク質(グリアジンなど)の存在下と不在下で腸内微生物叢において発現が異なるプロモータと遺伝子オペロンは、高グルテン食と低グルテン食をしている多彩な個人で腸内微生物叢のメタトランスクリプトームとメタプロテオームをサンプリングすることによって明らかにすることができよう。どちらかのデータセットをシークエンシングし、配列を注釈付き参照地図にマッピングすることにより、理想的なプロモータまたは遺伝子オペロンを選別して特定することができる。腸内で見いだされて単離された株を用いてインビトロ試験を実施し、多彩な条件に対する細胞の個別の応答を分析することができよう。
糖尿病
糖尿病は、血流中のグルコースの濃度上昇に関連する慢性疾患である。I型はインスリン依存型糖尿病と呼ばれている。なぜなら身体は、膵臓によって分泌されて体内の細胞が糖を血流に取り込むのに必要とされるホルモンであるインスリンを十分な量で産生することができないからである。インスリンの経口投与は理論的には可能であり、この治療技術の多くの障壁を克服するための溶液が研究の標的である。Wong et al.「糖尿病を治療するためのインスリンの経口送達:現状、課題、および可能性」Journal of Pharmacy and Pharmacology 68.9 (2016): 1093-1108。他の治療法は、投与経路から生じる問題を持つ宿主に届く精製したインスリンの注射である。腸内微生物叢の中の1つまたは複数の微生物を操作してインスリンを産生させて分泌させ、それを上皮層が腸または血流の中のグルコースの濃度に正比例して吸収できるようにすることにより、疾患の多くの効果を弱めることができよう。
グルコースは多くの生命形態が好んで代謝する高エネルギーの糖である。自然界におけるその価値は高く、多くの生物が糖を取り込んでエネルギーに変換しているため、細胞外の糖の存在または不在に敏感な多くの系が細胞内に存在する。メタトランスクリプトームシークエンシングプロジェクトを通じてあらゆる環境で適切に異なる調節をされるプロモータと遺伝子オペロンを同定し、微生物によって分泌されて宿主によって吸収されることが可能なインスリンを産生させるのに利用できよう。
宿主が必要とするインスリンを腸内微生物叢の1つのメンバーに産生させることで、インスリンの経口投与に見られる多くの制約(ホルモンが胃の中の厳しい酸性条件に曝露されることの制限や長期安定性など)が回避される。こうすると、インスリン注射で見られる他の副作用(皮膚疾患など)、患者のより低いコンプライアンス、および血中グルコースレベルの常時モニタリングもなくなる。インスリンを産生させて腸内微生物叢に分泌させ、この産生を腸内で吸収されるグルコースの濃度と結びつけることは、上記の治療よりも、そして同じ治療によって見られる多くの残念な副作用を回避することよりも正確に身体の自然な応答を模倣することであると考えられる。いくつかの実施形態では、作用遺伝子は、例えばアミノ酸配列GIVEQCCTSI CSLYQLENYC NFVNQHLCGS HLVEALYLVC GERGFFYTPK T(配列番号105)またはその断片を含むインスリンまたはインスリン前駆体をコードすることができる。
作用遺伝子をコードする合成微生物が提供される。いくつかの実施形態では、作用遺伝子は、毒素、エンドペプチダーゼ、ガラクトシダーゼ、またはインスリンタンパク質をコードすることができる。毒素の選択は、sprA1、sprA2、短縮型sprA1、sprG1、短縮型sprG1、sprG2、sprG2バリアント、またはsprG3毒素からなすことができる。作用遺伝子として、配列番号72、73、84、89、90、91、または95から選択されるアミノ酸配列を含む毒素をコードする毒素遺伝子が可能である。作用遺伝子として、ベータ-ガラクトシダーゼ酵素をコードするガラクトシダーゼ遺伝子が可能である。ベータ-ガラクトシダーゼ酵素をコードする遺伝子は、配列番号266または267のDNA配列を含むことができる。ベータ-ガラクトシダーゼ酵素は、配列番号94、268、または270のアミノ酸配列を含むことができる。作用遺伝子はエンドペプチダーゼ遺伝子をコードすることができる。エンドペプチダーゼ遺伝子は、プロリルエンドペプチダーゼまたはエンドペプチダーゼ40をコードすることができる。エンドペプチダーゼ遺伝子は、配列番号92または93から選択されるエンドペプチダーゼアミノ酸配列をコードすることができる。
標的微生物としてレンサ球菌属の種が可能である。いくつかの実施形態では、標的微生物として、ストレプトコッカス・アガラクティエ、肺炎レンサ球菌、またはストレプトコッカス・ミュータンスが可能である。安全なレンサ球菌属株を調製する方法として、自己致死性に関して標的レンサ球菌属遺伝子をスクリーニングし、ゲノムの中にあって血清中で上方調節される1つ以上のオペロンに致死遺伝子を組み込むことを含む方法が提供される。レンサ球菌属の種としてB群レンサ球菌属の種が可能である。ピギーバック法を利用して例えばストレプトコッカス・アガラクティエの中に殺傷スイッチを創出することができる。
ストレプトコッカス・アガラクティエは新生児敗血症とウシ乳腺炎を引き起こす可能性のある病原性の株である。Stoll et al., Pediatrics 2011, 127 (5), 817-826. https://doi.org/10.1542/peds.2010-2217。Keefe, G. P. ストレプトコッカス・アガラクティエ乳腺炎:1つのレビュー Can. Vet. J. 1997, 38 (7), 429-437。
ストレプトコッカス・アガラクティエは正常なヒトマイクロバイオームの一部になりうるが、ある環境へのアクセスが許された場合には日和見病原体になる可能性もある。本発明の技術を利用して殺傷スイッチを有するストレプトコッカス・アガラクティエを創出すると、その天然のニッチを占める能力を損なうことなく、その株からの感染のリスクが低下する。毒素-抗毒素系を利用して、血清中で活性化されてストレプトコッカス・アガラクティエが人工的にプログラムされた細胞死を再現または誘導できなくする殺傷スイッチを創出する。このピギーバック法により、感染のリスクなく細菌干渉を通じて多くの日和見感染を予防的に治療するのに用いるための生きた生物学的製剤の設計と製造が可能になる。
ウシ集団では、ストレプトコッカス・アガラクティエは伝染力の大きな病原体であり、乳腺環境で繁殖するのによく適している。ストレプトコッカス・アガラクティエは、乳腺炎と、乳製品産業にとっての大きな問題を引き起こす主要な病原体の1つである。なぜなら毎年数百万ドルの損害が乳腺炎に帰されているからである。それは、アメリカ合衆国では妊娠中の30%までの女性にも見られるため、幼児にとって危険である。なぜなら幼児には、産道を通過することによって、または感染した羊水から定着する可能性があるからである。
ストレプトコッカス・アガラクティエはマイクロバイオームの片利共生メンバーになることもでき、有害な症状を引き起こすことなく生きている。日和見感染を予防するため、殺傷スイッチを設計してストレプトコッカス・アガラクティエのゲノムに組み込む。そのためそれが血流または他の体液に到達する場合には、疾患を進行させたり引き起こしたりすることはできないであろう。最初に、ストレプトコッカス・アガラクティエにとって天然の毒素/抗毒素系を調べ、レンサ球菌属の株にとって致死性の毒素遺伝子を見つける。その後その毒素遺伝子を、血清中で大きく上方調節されているオペロンに組み込むことができる。ゲノム編集技術を利用して毒素遺伝子を上方調節された遺伝子の同じmRNA転写産物の上に配置すると、毒素の発現がその上方調節された遺伝子と結びつけられる。毒素の増加した発現は、血清中でストレプトコッカス・アガラクティエの細胞死を誘導するであろう。
ベクターと標的微生物
ポリヌクレオチド分子を含むベクターのほか、そのようなベクターで形質転換された標的細胞も本明細書に記載されている。本明細書に記載されているポリヌクレオチド分子は、興味ある増殖宿主のため、選択マーカーと複製起点を含むベクターに接合することができる。細胞を遺伝子改変してこれらベクターが含まれるようにし、そのことによってRNAを転写し、ポリペプチドを発現させることができる。本明細書のベクターは、適切な転写または翻訳の調節配列(微生物標的細胞のためのものなど)に機能可能に連結されたポリヌクレオチド分子を含む。調節配列の例に含まれるのは、転写のプロモータ、オペレータ、またはエンハンサ、mRNAリボソーム結合部位、および転写と翻訳を制御する適切な配列である。本明細書に記載のヌクレオチド配列が機能可能に連結されているのは、本明細書の調節配列が例えば細胞死遺伝子をコードするポリヌクレオチドと機能的に関連しているときである。
典型的なビヒクルは、プラスミド、シャトルベクター、バキュロウイルス、不活化されたアデノウイルスなどを含む。本明細書に記載されているある実施例では、ビヒクルとして、本明細書で論じられているように、改変されたpIMAY、pIMAYz、またはpKOR組み込みプラスミドが可能である。
標的微生物は、除菌後に特定の望ましくない微生物を持続的に置き換える能力を持つ任意の微生物から選択することができる。標的微生物として、安全性を増強させるためその後本明細書に記載されている方法によって操作される野生型微生物が可能である。標的微生物は、細菌、真菌、または原生動物標的微生物から選択することができる。標的微生物として、対象の皮膚および/または粘膜のニッチに定着することのできる株が可能である。標的微生物として、さらなる分子改変を実施できる野生型微生物または合成微生物が可能である。標的微生物の選択は、ブドウ球菌、アシネトバクター、コリネバクテリウム、レンサ球菌、大腸菌、マイコバクテリウム、エンテロコッカス、バシラス、クレブシエラ、およびシュードモナスからなるグループからからなすことができる。標的微生物の選択は、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、スタフィロコッカス・クロモゲネス、スタフィロコッカス・シミュランス、スタフィロコッカス・サプロフィティカス、スタフィロコッカス・ヘモリティカス、スタフィロコッカスヒイカス、大腸菌、アシネトバクター・バウマンニー、化膿レンサ球菌、ストレプトコッカス・アガラクティエ、ストレプトコッカス・ディスガラクティエ、ストレプトコッカス・ウベリス、大腸菌、乳腺病原性大腸菌(MPEC)、セレウス菌、バシラス・ヘモリシス、ヒト型結核菌、ウシ型結核菌、マイコプラズマ・ボビス、エンテロコッカス・ファエカリス、エンテロコッカス・ファエシウム、コルネトバクテリウム・ボビス、コルネトバクテリウム・アミコラタム、、コルネトバクテリウム・ウルセランス、クレブシエラ・ニューモニア、クレブシエラ・オキシトカ、エンテロバクター・アエロゲネス、アルカノバクテリウム・ピオゲネス、トゥルエペレラ・ピオゲネス、緑膿菌からなるグループからなすことができる。標的微生物として、カンジダ属またはクリプトコッカス属からなるグループから選択される属を持つ種が可能である。標的微生物として、カンジダ・パラプシローシス、カンジダ・クルセイ、カンジダ・トロピカリス、カンジダ・アルビカンスカンジダ・グラブラータ、またはクリプトコッカス・ネオフォルマンスが可能である。
標的微生物として、望ましくない微生物と同じ属と種だが異なる株のものが可能である。例えば望ましくない微生物として、抗生剤耐性黄色ブドウ球菌株(MRS株など)が可能である。抗生剤耐性黄色ブドウ球菌株として、皮膚感染症、粘膜感染症、菌血症、および/または心内膜炎に関与することが知られている可能性のある病原性の株が可能である。望ましくない微生物が黄色ブドウ球菌株(例えばMRSA)である場合、標的微生物として例えば病原性がより少ない株が可能であり、それは単離された株でもよい(RN4220株または502株などの黄色ブドウ球菌標的細胞など)。あるいは標的細胞として、望ましくない微生物と同じ株のものが可能である。別の一例では、望ましくない微生物は、大腸菌株、例えば尿路病原性大腸菌1型株またはp型線毛保有株(例えば尿路感染症、菌血症、および/または心内膜炎に関与する株)である。別の一例では、望ましくない株は、キューティバクテリウム・アクネス株(例えば尋常性ざ瘡、菌血症、および/または心内膜炎に関与する株)である。別の一例では、望ましくない微生物はストレプトコッカス・ミュータンス株(例えばS.ミュータンス心内膜炎、虫歯に関与する株)である。
モデル抗生剤感受性標的微生物
標的微生物として、望ましくない微生物と同じ種の抗生剤感受性微生物が可能である。一実施形態では、望ましくない微生物はMRS株であり、置換標的微生物は抗生剤感受性黄色ブドウ球菌株である。抗生剤感受性微生物として黄色ブドウ球菌株502a(「502a」)が可能である。502aは、コアグラーゼ陽性、ペニシリン感受性、非ペニシリナーゼ酸性ブドウ球菌であり、通常はファージ7、47、53、54、および77によって溶解される。血清型(b)ci。異常な円板状の抗生剤感受性パターンを502aは示す。なぜならこの株は、低濃度の大半の抗生剤に対して感受性だからである。ただしテトラサイクリンは例外であり、5 μgに対しては耐性だが10 μgのテトラサイクリンに対しては感受性である。いくつかの実施形態では、502株は、黄色ブドウ球菌亜種Aureus Rosenbach ATCC(登録商標)27217(商標)として市販されているものを購入することができる。
標的微生物を選択する方法
標的微生物の選択は、望ましくない微生物を同定し、その望ましくない微生物と同じ属および種である候補標的微生物を選択することによって実施することができる。望ましくない株と同じ属および種を持つ候補標的株は、例えばATCC(登録商標)から市販されているものを入手すること、または宿主対象からの単離によって取得することができる。標的株として、抗微生物剤(抗生剤など)に感受性の株が可能である。
適切な標的微生物の選択は、StarzlらのWO 2019113096(参照によって本明細書に組み込まれている)に記載されているように、宿主対象からの望ましくない微生物を効果的に除菌し、野生型推定標的微生物で置き換えることによって確認できる。望ましくない微生物を野生型標的微生物で少なくとも4週間、8週間、12週間、16週間、20週間、または28週間の期間にわたって持続的に置き換える能力で標的微生物の選択を確認する。例えば望ましくない微生物として、世界中で多すぎる量の侵襲性細菌感染症の原因であるメチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)が可能である。黄色ブドウ球菌の定着状態は、大半の侵襲性感染症にとって必要な前提条件であると見なされている。しかしMRSAの定着と感染を減らすための方法として標準的な防腐剤投与計画を利用した除菌は、まちまちの結果しか提供しなかった。Starzlらは、効果の持続性を標準的除菌と比べて改善することを期待して候補標的微生物を実施したため、1つの異なる黄色ブドウ球菌株を用いた意図的な再定着を利用することにより、望ましくない微生物MRSAに対する新たな除菌アプローチの実現可能性と持続性を候補標的株BP-001で研究した。StarzlらのWO 2019113096では、765人の健康なボランティアをスクリーニングして黄色ブドウ球菌の定着を探した。スクリーニングされた集団の全MRSA率は8.5%であった。MRSAが定着した53人のコホートが、黄色ブドウ球菌502a WT株BioPlx-01を用いた除菌/再定着療法を標準的除菌だけの対照群と比較する対照研究に参加した。定着状態からのMRSA不在の持続期間のほか、意図的なMSSA再定着の持続性を6ヶ月間にわたってモニタした。MRSA除菌プロトコルの有効性の部分に関する対照群(n=15)は、4週間の時点で60%のMRSA再発を示した。BioPlx-01WTプロトコル(n=34)を利用した試験群は8週間主要エンドポイントで0%のMRSA再発を示し、26週間までMRSA再発の証拠なしを示すことが続いた。
WT標的株黄色ブドウ球菌502a BP-001が除菌/再定着プロトコルで使用したときに除菌の優れた持続性を提供したという事実により、標的株としてのMSSA BP-001の選択が確認された。本明細書で後述するように、BioNumericsによって割り当てられたBP_001のspa型はt010である。
本発明の発明者の1人から単離した別のWT標的株はMSS株CX_001である。本明細書で後述するように、BioNumericsによって割り当てられたCX_001のspa型はt688である。
いくつかの実施形態では、標的微生物および/または合成微生物は、(i)望ましくない微生物を除菌し、標的微生物または合成微生物を対象に投与した後に対象内のニッチに持続的に定着する能力と、(ii)投与工程の後、対象内に望ましくない微生物が再発することを少なくとも2週間、少なくとも4週間、少なくとも6週間、少なくとも8週間、少なくとも10週間、少なくとも12週間、少なくとも16週間、少なくとも24週間、少なくとも26週間、少なくとも30週間、少なくとも36週間、少なくとも42週間、または少なくとも52週間の期間にわたって阻止する能力を有する。
残念なことに、抗微生物剤感受性標的微生物でさえ全身感染を引き起こす可能性がある。したがって本明細書に提示されているように、安全性を増強するとともに病原性感染症の可能性を小さくするため、標的微生物を分子改変して調節配列(例えば細胞死遺伝子、v-阻止、またはナノファクトリーを発現させるための第1の誘導性プロモータが含まれる)を組み込む。
微生物の検出可能な存在と同定のための方法
本分野で知られている任意の方法を利用して望ましくない、標的または合成微生物の属、種、および株の検出可能な存在を明らかにして同定することができる。方法の概説は、Aguilera-Arreola MG. 細菌感染症の研究のための同定法とタイピング法:症例研究としての簡単なレビュー. Arch Clin Microbiol. 2015, 7:11(参照によって本明細書に組み込まれている)に見いだすことができる。
ある細菌の属、種、および/または株の検出可能な存在および/または同定は、表現型法および/または遺伝子型法によって実現することができる。表現型法は、生化学反応、血清学的反応、抗微生物剤に対する感受性、ファージに対する感受性、バクテリオシンに対する感受性、および/または細胞タンパク質のプロファイルを含むことができる。生化学反応の一例は細胞外酵素の検出である。例えばブドウ球菌は多くの異なる細胞外酵素(DNAアーゼ、プロテイナーゼ、およびリパーゼが含まれる)を産生する。Gould, Simon et al., 2009、欧州の2つの研究グループからの黄色ブドウ球菌とMRSAの臨床単離体において脂肪分解活性の新規な発色基質fro検出の評価 FEMS Microbiol Let 297; 10-16。発色基質を用いて細胞外酵素を検出することができる。例えばCHROMager(商標)MRSA発色培地(CHROMagar、パリ、フランス国)をメチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)(低レベルのMRSAを含む)の単離と分化に使用することができる。サンプルは例えば鼻、会陰、喉、直腸の試料から得られは可能な富化工程で得られる。寒天プレートが冷蔵されていた場合には、それを接種前に室温まで温める。サンプルをプレートに画線塗布した後、有酸素条件で37℃にて18~24時間インキュベートする。コロニーの出現を読む。そのときMRSAコロニーはバラ色から藤色に着色されて見え、メチシリン感受性黄色ブドウ球菌(MSSA)コロニーは阻害され、他の細菌は、青色、無色、または阻害されたコロニーに見える。MRSAであると決定的に同定されるには、それに加えて黄色ブドウ球菌であると最終的に同定される必要がある。例えばCHROMagar(商標)黄色ブドウ球菌発色培地を用いることができ、その場合には黄色ブドウ球菌は藤色で出現し、S.サプロフィティカスは青緑色に見え、大腸菌、C.アルビカンス、およびE.ファエカリスは阻害される。B群レンサ球菌(GBS)(S.アガラクティエ)の検出にはCHROMagar(商標)StrepBプレートを使用することができ、その場合にはストレプトコッカス・アガラクティエ(B群)は藤色に見え、エンテロコッカス属の種とE.ファエカリスは暗青灰色に見え、ラクトバシラス属、ロイコノストック属、およびラクトコッカス属は淡いピンク色に見え、他の微生物は青、無色であるか、阻害する。カンジダ属のさまざまな種の検出にはCHROMager(商標)カンジダ発色培地を用いることができる。カンジダ属の種は口腔咽頭と泌尿生殖器の表面感染に関与する。C.アルビカンスは関与する主要な種であり続けているが、新たな抗真菌剤がC.アルビカンスに対して有効に作用しているため、他のタイプ(C.トロピカリス、C.クルセイ、またはC.ガラブラータなど)が増加している。皮膚、喀痰、尿、膣の試料サンプルをサンプリングして直接画線塗布し、プレートに直接画線塗布するか広げた後、有酸素条件で30~37℃にて48時間インキュベートし、プレートを読んでコロニーの出現を探すこと。そのときC.アルビカンスは緑色、C.トロピカリスはメタリックブルー色、C.クルセイはピンク色で毛羽立っており、C.ケフィルとC.ガラブラータは藤色-茶色、そして他の種は白色から藤色である。
属と種を同定するための遺伝子型法に含めることができるのは、ハイブリダイゼーション、プラスミドのプロファイル、プラスミド多型の分析、制限酵素消化、パルスフィールドゲル電気泳動(PFGE)による反応と分離、リボタイピング、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)とそのバリアント、ファージタイピング、リガーゼ連鎖反応(LCR)、転写に基づく増幅系(TAS)、または本明細書に記載されている方法の任意のものである。
微生物の同定は、例えばグラム陰性細菌DNA配列の注釈を提供するGalileo(商標)抗微生物耐性(AMR)検出ソフトウエア(Arc Bio LLC、メンロ・パーク、カリフォルニア州とケンブリッジ、マサチューセッツ州)を用いて実施することができる。
微生物タイピング法の選択は、アレルプロファイルを創出するのにいくつかのハウスキーピング遺伝子をPCRで増幅することに依存する多遺伝子座配列タイピング(MLST)を含む遺伝子型法;ゲノム内の反復配列のPCR増幅とバンド形成パターンの比較を含むPCR-遺伝子外回文反復要素(rep-PCR);任意のプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応であるAP-PCR;ゲノムDNAの酵素制限消化、制限断片の結合、および選択的増幅を含む増幅断片長多型(AFLP);ゲノムDNA消化を含むDNA制限断片(RFLP)の多型、または短い制限断片を生成させる制限酵素を有するアンプリコンの多型;任意のヌクレオチド配列の単一のプライマーを用いたゲノムDNAのランダムなセグメントのPCR増幅からのマーカーDNA断片を用いる、ランダムに増幅された多型DNA(RAPD);遺伝子座VTRのPCR増幅を含み、多型を可視化してアレルのプロファイルを創出する多遺伝子座タンデム反復配列分析(MLVA);またはマクロ制限断片の比較を含むパルスフィールドゲル電気泳動(PFGE)からなすことができる。電気泳動のPFGE法はさまざまな断片長(例えば50 kb超から10 Mbまでの長さ)の断片を分離できるが、それは、100 bp~50 kbの断片だけを分離できる従来の電気泳動では不可能である。PFGEのこの能力はその多方向性という特徴に起因しており、電場の向きの連続的な変化、したがってDNA分子の向きの再配向を可能にするため、DNA分子はアガロースゲルを通って移動することができる。このイベントに加え、印加される電気パルスは長さが異なるため、分子の再配向と、異なるサイズの断片の分離が強化される。PFGEは、Bonness et al., 2008, J Clin Microbiol Vo. 46, No. 2, pp. 456-461に記載されている(参照によって本明細書に組み込まれている)。1つのPFGE装置としてContour Clamped Homogeneous Electric Fields(CHEF、BioRad)が可能である。パルスフィールドゲル電気泳動(PFGE)は、その大きな識別力を理由としてMRSAタイピングのための黄金の標準的技術と見なされているが、その手続きは複雑で時間がかかる。
さまざまな黄色ブドウ球菌株を同定する別の方法は、配列に基づくspaタイピングを利用する。spa遺伝子は黄色ブドウ球菌タンパク質Aの細胞壁成分をコードしており、多型を示す。ブドウ球菌タンパク質A遺伝子(spa)の反復領域の単一遺伝子座DNAシークエンシングを利用すると、信頼性があって正確で識別力があるタイピングが可能である。反復には数字コードを割り当てることができ、spa型は特定の反復の順番から導出することができる。
配列に基づくspaタイピングは、例えばNarukawa et al. 2009 Tohoku J Exp Med 2009, 218, 207-213(参照によって本明細書に組み込まれている)の方法による迅速な試験スクリーンに使用することができる。単離された黄色ブドウ球菌株のSpaタイピングを実施例1に示されているようにして実施した;ここで候補標的株として18個のMSSA株が単離され、spaタイピングが実施された。結果が表2に示されている。これらSAサンプルの中で同定された少なくとも10種類のspa型が存在しており、その中に含まれるのは、タイプt010(株BP_001)、t688(CX_001)、t008(A1-033N、A1-0905A)、t005(A1-0791N、A1-0940A、A1-0068、A1-1691N)、t021(A1-0915N)、t127(A1-1415N、A1-0609N)、t002(A1-9080A、A1-415)、t3841(A1-1D-915、A1-1618、A1-1235N)、t272(A1-1D-180)、およびt1328(A1-0909N)である。
例えば微生物が他の似た微生物を特定のニッチから競合的に除外する能力を予測するのを助けるには、spa型が知られている標的株を使用することが有用である可能性がある。株の型とマイクロバイオームの持続的定着の間の関係を理解することも極めて有用な情報であると考えられる。
いくつかの実施形態では、標的株は黄色ブドウ球菌株である。標的株としてMSS株が可能である。標的株として、t010、t688、t008、t005、t021、t127、t002、t3841、t272、およびt1328から選択されるspa型を持つ黄色ブドウ球菌株が可能である。標的株としてMRS株が可能である。
菌血症を起こすことのできない合成微生物
本明細書の実施例に記載されているように、菌血症の研究をマウスの生体内で実施し、殺傷スイッチ(KS)(BP_109、CX_013)技術で改変した合成黄色ブドウ球菌(SA)、または野生型(WT)標的株(BP_001、CX_001)を10^7個尾の静脈に注射して8日間にわたって観察した後のマウスにおける臨床効果(菌血症)を比較した。KS技術で改変された合成微生物は、哺乳類宿主の血液、血清、または血漿と相互作用すると人工的にプログラムされた細胞死を開始するように設計した。
図28に示され、実施例に記載されているように、KS生物と陰性対照を尾の静脈に静脈内注射したマウスは、低活性が1件観察されたこと(次の観察までに解決した)を例外としてすべて健康であり、研究期間中は有害な臨床症状がなかった。WT生物を注射されたすべてのマウスが有意な罹患率で多彩な異常な臨床所見を経験し、死亡するか、倫理基準による安楽死に適合した。この研究によりKS技術の有効性と安全性が実証され、すべての試験対象が100%の生存率と健康であった。殺傷スイッチを含む合成黄色ブドウ球菌株は、感染性疾患の予防と治療のための方法で使用すると有意にリスクを小さくして生物を保護できる可能性がある。
使用方法と組成物
いくつかの実施形態では、最少のゲノム改変を含む本明細書で提供される合成微生物は、望ましくない微生物の除菌または抑制の後の合成微生物を用いた再定着または置換を含む方法で使用することができる。非共定着の予想は、病原性定着または感染の再発を予防するための本発明の方法の持続性にとって重要である。
抑制/除菌
望ましくない微生物の抑制または除菌は、消毒剤、防腐剤、または殺生物組成物を対象の皮膚または粘膜に直接局所的に塗布することによって、例えば冒された領域(場合により冒された領域と隣接領域)を、または対象の外側領域または粘膜表面領域の25%超、50%超、75%超、または90%超を、前記消毒剤、防腐剤、または殺生物組成物を用いてスプレーすること、浸すこと、または覆うことによって実現できる。いくつかの実施形態では、冒された領域または追加表面領域は、空気乾燥させること、または軽く加熱して空気乾燥機で乾燥させること、または対象が衣服を着る前に紫外線照射または太陽光に曝露することができる。一実施形態では、抑制は、冒された領域と、場合により対象の1つ以上の隣接領域または遠位領域を紫外線照射に曝露することを含む。さまざまな実施形態では、一般に用いられている任意の消毒剤、防腐剤、または殺生物組成物を用いることができる。一実施形態では、クロルヘキシジンまたはその医薬として許容可能な塩を含む消毒剤が使用される
いくつかの実施形態では、殺菌剤、防腐剤、収斂剤、および/または抗菌剤の選択は、アルコール(エチルアルコール、イソプロピルアルコール)、アルデヒド(グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、ホルムアルデヒド放出剤(ノキシチオリン=オキシメチレンチオウレア、タウロリン、ヘキサミン、ダントイン)、o-フタルアルデヒド)、アニリド(トリクロカルバン=TCC=3,4,4’-トリクロロカルバニリド)、ビグアナイド(クロルヘキシジン、アレキシジン、高分子ビグアナイド(MWが3,000 g/モル超のポリヘキサメチレンビグアナイド、バントシル)、ジアミジン(プロパミジン、イセチオン酸プロパミジン、プロパミジン二塩酸塩、ジブロモプロパミジン、イセチオン酸ジブロモプロパミジン)、フェノール(フェンチクロル、p-クロロ-m-キシレノール、クロロキシレノール、ヘキサクロロフェン)、ビス-フェノール(トリクロサン、ヘキサクロロフェン)、第四級アンモニウム化合物(セトリミド、塩化ベンズアルコニウム、塩化セチルピリジニウム)、銀化合物(銀スルファジアジン、硝化銀)、ペルオキシ化合物(過酸化水素、過酢酸)、ヨウ素化合物(ポビドン-ヨウ素、ポロキサマー-ヨウ素、ヨウ素)、コリン放出剤(次亜塩素酸ナトリウム、次亜塩素酸、二酸化塩素、ジクロロイソシアヌル酸ナトリウム、クロラミン-T)、銅化合物(酸化銅)、植物抽出物(コバノブラシノキ属の種(ティーツリー油)、カシア・フィスチュラLinn、バエケア・フルテスデンスL.、メリア・アデダラチL.、ムニンギア・カラブラ、ヴィティス・ヴィニフェラL、テルミナリア・アヴィケニオイデスGuill & Perr.、フィラントゥス・ディスコイデウスmuel. Muel-Arg.、オシマム・グラティシマムLinn.、アカリファ・ウィルケシアナMuell-Arg.、ヒペリカム・プルイナタムBoiss.&Bal.、ヒペリカム・オリンピカムL.、およびヒペリカム・サブラムL.、ハマメリス・ヴァージニアナ(マンサク)、ユーカリ属の種、ロスマリヌス・オフォキナリス種(ローズマリー)、イブキジャコウソウ属の種(タイム)、イワダレソウ属の種(オレガノ)、オガルカヤ属の種(レモングラス)、ニッケイ属の種、フウロソウ属の種、ラバンデュラ属の種)、および局所抗生剤化合物(バクテリオシン;ムピロシン、バシトラシン、ネオマイシン、ポリミキシンB、ゲンタマイシン)からなるグループからなされる。
望ましくない微生物の抑制は、例えば局所抗生剤の代わりに、または局所抗生剤に加えて光増感剤を用いることによって実現することもできる。例えばPeng Zhangら(抗生剤の代わりに光増感剤を用いてMRSAを殺傷する、GEN News Highlights, August 20, 2018; 48373)は、光を用いて酸素を活性化させて微生物の増殖を抑制する技術を開発した。光増感剤(染料分子など)は光を照射されたとき励起状態になる。光増感剤は酸素を変換して微生物(MRSAなど)を殺傷する反応性酸素種にする。有効性の向上を目的として光増感剤を濃縮するため、分子性光増感剤を捕獲する両親媒性ポリマーで修飾された貴金属ナノ粒子を含んでいて水に分散可能なハイブリッド光増感剤が、Zhangらによって開発された。このハイブリッド光増感剤を対象の例えば皮膚表面または傷に、スプレー、ローション、またはクリームの形態で塗布した後、赤色光または青色光を照射して微生物の増殖を減らすことができる。
除菌組成物は、消毒剤、殺生物光増感剤、または防腐剤化合物と、医薬として許容可能な1つ以上の基剤または賦形剤とを含む局所溶液、ローション、または軟膏の形態にすることができる。特別な一例では、医薬として許容可能な基剤の中にグルコン酸クロルヘキシジン(0.4%)、グリセリン(10%)を含み、場合によりスプレーのカバー範囲を明確にする染料を含有するエアロゾル消毒剤スプレーを使用する。一実施形態では、抑制工程は、1つ以上の冒された領域と、場合により1つ以上の周辺領域に、アメリカ合衆国特許第4,548,807号および/または第4,716,032号(そのそれぞれは、その全体が参照によって本明細書に組み込まれている)に開示されているスプレー消毒剤を投与することを含む。消毒剤スプレーとして、市販されている例えばFight Bac(登録商標)(Deep Valley Farm, Inc.、ブルックリン、コネチカット州)が可能である。他の消毒剤材料に含めることができるのは、クロルヘキシジンまたはその塩(グルコン酸クロルヘキシジン、酢酸クロルヘキシジン、および他のジグアナイドなど)、エタノール、SDアルコール、イソプロピルアルコール、p-クロロ-o-ベンジルフェノール、o-フェニルフェノール、第四級アンモニウム化合物(塩化n-アルキル/ジメチルエチルベンジルアンモニウム/塩化n-アルキルジメチルベンジルアンモニウムなど)、塩化ベンズアルコニウム、セトリミド、塩化メチルベンゼトニウム、塩化ベンゼトニウム、塩化セトアルコニウム、塩化セチルピリジニウム、塩化ドファニウム、臭化ドミフェン、過酸化物と過マンガン酸塩(過酸化水素溶液、過マンガン酸カリウム溶液、過酸化ベンゾイルなど)、抗細菌染料(ヘミ硫酸プロフラビン、トリフェニルメタン、ブリリアントグリーン、クリスタルバイオレット、ゲンチアナバイオレットなど)、キノロン誘導体(ヒドロキシキノリン、ヒドロキシキノリン硫酸カリウム、クロルキナルドール、塩化デカリニウム、ジ-ヨードヒドロキシキノリンなど)、ブロー氏溶液(酢酸アルミニウムの水溶液)、漂白溶液、ヨウ素溶液、臭化物溶液である。一般に安全であると認識されている(GRAS)さまざまな材料を消毒剤または殺生物組成物で使用することができ、その中に含まれるのはグリセリンとグリセリドであり、その非限定的な例は、食用の脂肪形成脂肪酸のモノグリセリドとジグリセリド、モノグリセリドとジグリセリドのジアセチルテトラ酢酸エステル、トリアセチン、アセトオレイン、アセトステアリン、ラクトパルミチン酸グリセリル、ラクトオレイン酸グリセリル、およびオキシステアリンである。
投与と組成物
いくつかの実施形態では、合成微生物と、賦形剤または基剤とを含む組成物が提供される。これら組成物は、その特別な免疫原性の特徴、または生物学的または免疫学的に活性な特徴に適した任意の方法(経口、静脈内、口腔、鼻、粘膜、皮膚、または他の方法が含まれる)で適切な担体マトリックスに入れて投与することができる。一実施形態では、対象の皮膚部位および/または粘膜部位に局所投与するための組成物が提供される。別の特別な実施形態は、本開示の組成物の経口投与を含む。
いくつかの実施形態では、置換工程は、合成株を、対象の皮膚または粘膜の少なくとも1つの塗布部位と、場合により対象の隣接領域に、1回以下、2回以下、または3回以下局所投与することを含む。投与は、少なくとも106、少なくとも107、少なくとも108、少なくとも109、または少なくとも1010 CFUの合成株と、医薬として許容可能な基剤とを含む組成物を、対象の少なくとも1つの塗布部位に初期局所塗布することを含むことができる。初期置換工程は、最終抑制工程から12時間以内、24時間以内、36時間以内、48時間以内、72時間以内、4日以内、5日以内、6日以内、7日以内、8日以内、または9日以内に実施することができる。
合成微生物を含む組成物は、対象の皮膚および/または粘膜の少なくとも1つの部位と、場合により隣接部位に、1ヶ月に少なくとも1回(例えば1~30回、1~20回、1~10回、1~6回、1~5回、1~4回、1~3回、または1~2回)、または1ヶ月に1回以下、2回以下、3回以下、4回以下、5回以下、6回以下、8回以下、1ヶ月に10回、または12回以下投与することができる。組成物のその後の投与は、最初に投与してから例えば1~30日、2~20日、3~15日、または4~10日の期間の後にすることができる。
合成微生物の定着を対象内で促進することが、栄養素、プレバイオティック細菌種、安定剤、保湿剤、および/またはプロバイオティック細菌種から選択される促進剤を含む組成物を投与することによって可能である。促進剤は、別の促進剤組成物の中で対象に投与すること、または微生物組成物に添加することができる。
いくつかの実施形態では、促進剤として、例えば塩化ナトリウム、塩化リチウム、グリセロリン酸ナトリウム、フェニルエタノール、マンニトール、トリプトン、および酵母エキスから選択される栄養素が可能である。いくつかの実施形態では、プレバイオティクスの選択は、短鎖脂肪酸(酢酸、プロピオン酸、酪酸、イソ酪酸、吉草酸、イソ吉草酸)、グリセロール、農業副産物からのペクチン由来オリゴ糖、フルクト-オリゴ糖(例えばイヌリン様プレバイオティクス)、ガラクト-オリゴ糖(例えばラフィノース)、コハク酸、乳酸、およびマンナン-オリゴ糖からなるグループからなされる。
いくつかの実施形態では、促進剤としてプロバイオティクスが可能である。プロバイオティクスとして、本分野で知られている既知の任意のプロバイオティクスが可能である。プロバイオティクスは、健康上の利点を宿主に提供する生きた微生物である。本明細書に提示されている方法では、プロバイオティクスを皮膚と粘膜のマイクロバイオームに局所的に塗布して、および/またはプロバイオティクスを経口投与して皮膚と粘膜の健康上の利益を対象に提供することができる。ラクトバシラス属のいくつかの株は全身抗炎症効果を持つことが示されている。複数の研究により、ラクトバチルス・ロイテリのいくつかの株が全身抗炎症サイトカイン(インターロイキン(IL)-10など)を誘導することが示されている。ラクトバチルス・ロイテリからの可溶性因子は炎症促進性サイトカインの産生を阻害する。ラクトバチルス・パラカセイ株は皮膚モデルにおいて神経性炎症を阻害することが示されている(Kober at al., 2015, Int J Women’s Dermatol 1(2015) 85-89)。ヒト皮膚線維芽細胞と無毛マウスモデルでは、ラクトバチルス・プランタルムがUVBによって誘導されるマトリックスメタロプロテイナーゼ1(MMP-1)の発現を阻害してヒト線維芽細胞におけるプロコラーゲン発現を保持することが示されている。無毛マウスの組織学的サンプルの中のL.プランタルムを経口投与することにより、L.プランタルムが皮膚組織におけるMMP-13、MMP-2、およびMMP-9の発現を阻害することが実証された。
臨床的には、プロバイオティクスの局所塗布が皮膚の障壁機能を変化させ、皮膚の抗微生物特性を二次的に強めることも示されている。ストレプトコッカス・サーモフィルスは、局所塗布されたとき、皮膚の障壁機能を変化させ、皮膚の抗微生物特性を二次的に強めることが示されている。ストレプトコッカス・サーモフィルスは、局所的に塗布されたとき、インビトロと生体内の両方でセラミドの産生を増加させることが示されている。セラミドは皮膚内の水分とあるセラミドスフィンゴ脂質(フィトスフィンゴシン(PS)など)を捕獲し、P.アクネスに対する直接的な抗微生物活性を示す。Kober at al., 2015, Int J Women’s Dermatol 1(2015) 85-89。
プロバイオティクスの局所用調製物の2つの臨床試験でざ瘡に対するその効果が評価されている。エンテロコッカス・フェカーリスのローションを顔に8週間塗布すると炎症性病変が50%減少したことがプラセボと比べて記録された。ざ瘡のカウント数、サイズ、および関連する紅斑の減少が、ラクトバチルス・プランタルム局所用エキスの臨床研究の間に記録された。Kober at al., 2015, Int J Women’s Dermatol 1(2015) 85-89。
局所用プロバイオティクスの臨床試験で粘膜系に対するその効果が評価されている。1つの研究では、ストレプトコッカス・サリバリウスが急性中耳炎(AOM)を予防するため鼻スプレーによって投与された。鼻咽頭にうまく定着した場合には、AOMを減らす有意な効果があった。Marchisio et al. (2015). Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 34, 2377-2383。別の試験では、S.サングイニスとL.ラムノーススのスプレー塗布により分泌性中耳炎の子供で中耳液が減少した。Skovbjerg et al. (2008). Arch. Dis. Child. 94, 92-98。
プロバイオティクスとして局所用プロバイオティクスまたは経口プロバイオティクスが可能である。プロバイオティクスは、例えば望ましくない微生物とは異なる属と種であること、または望ましくない微生物と同じ属だが異なる種であることが可能である。プロバイオティック種は、標的微生物とは異なる属と種であることが可能である。プロバイオティクスは殺傷スイッチ分子改変を含むように改変されていてもいなくてもよい。プロバイオティクスは、ラクトバシラス属の種、ビフィドバクテリウム属の種、レンサ球菌属の種、またはエンテロコッカス属の種から選択することができる。プロバイオティクスの選択は、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、ビフィドバクテリウム・ラクティス、ビフィドバクテリウム・インファンティス、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・ロンガム、ラクトバチルス・ロイテリ、ラクトバチルス・パラカセイ、ラクトバチルス・プランタルム、ラクトバチルス・ジョンソニー、ラクトバチルス・ラムノースス、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・サリバリウス、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・プランタルム、ラクトコッカス・ラクティス、ストレプトコッカス・サーモフィルス、ストレプトコッカス・サリバリウス、またはエンテロコッカス・フェカーリスからなすことができる。
促進剤はタンパク質安定剤を含むことができ、アメリカ合衆国特許第5,525,336号から参照によって組み込まれているに開示されているものが組成物に含まれる。非限定的な例に含まれるのは、グリセロール、トレヘロース、エチレンジアミン四酢酸、システイン、シクロデキストリン(アルファ-、ベータ-、またはガンマ-シクロデキストリンなど)またはその誘導体(2-ヒドロキシプロピルベータ-シクロデキストリンなど)、およびプロテイナーゼ阻害剤(ロイペプチン、ペプスタチン、アンチパイン、およびシスタチンなど)である。
促進剤は保湿剤を含むことができる。保湿剤の非限定的な例に含まれるのは、グリセリン、ソルビトール、2-ピロリドン-5-カルボン酸ナトリウム、可溶性コラーゲン、およびジブチルフタル酸塩である。
組成物
本開示の合成微生物と、医薬として許容可能な基剤、希釈剤、皮膚軟化剤、結合剤、賦形剤、潤滑剤、甘味剤、香味剤、バッファ、増粘剤、湿潤剤、または吸収剤とを含む組成物が提供される。
組成物を製剤化するための医薬として許容可能な希釈剤または基剤の選択は、水、生理食塩水、リン酸塩緩衝化生理食塩水(PBS)、PBST、減菌ルリアブロス、トリプトンブロス、またはトリプティックソイブロス(TSB)、または溶媒からなるグループからなすことができる。溶媒の選択は、例えばエチルアルコール、トルエン、イソプロパノール、n-ブチルアルコール、ひまし油、エチレングリコールモノエチルエーテル、ジエチレングリコールモノブチルエーテル、ジエチレンモノエチルエーテル、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、およびテトラヒドロフランからなすことができる。基剤または希釈剤がさらに含むことができるのは、1つ以上の界面活性剤、例えばi)アニオン性界面活性剤(脂肪酸の金属塩またはアルカノールアミン塩など、例えばラウリン酸ナトリウムとオレイン酸トリエタノールアミン);アルキルベンゼンスルホン(例えばドデシルベンゼンスルホン酸トリエタノールアミン);硫酸アルキル(例えばラウリル硫酸ナトリウム);硫酸アルキルエーテル(例えばラウリルエーテル硫酸ナトリウム(2~8個のEO));スルホンコハク酸塩(例えばジオクチルスルホンコハク酸ナトリウム);硫酸モノグリセリド(例えばモノステアリン酸モノ硫酸ナトリウムグリセリル);イソチオン酸塩、例えばイソチオン酸ナトリウム;メチルタウリド(例えばIgepon T);アシルサルコシン(例えばミリスチルサルコシンナトリウム);アシルペプチド(例えばMayponsとlamepons);乳酸アシル、ポリアルコキシル化されたグリコール酸エーテル(例えばトリデセス-7カルボン酸);リン酸塩(例えばジラウリルリン酸ナトリウム);カチオン性界面活性剤(アミン塩など、例えばサパミン塩酸塩);第四級アンモニウム塩(例えばQuaternium 5、Quaternium 31、およびQuaternium 18);両性界面活性剤(イミダゾール化合物など、例えばMiranol);N-アルキルアミノ酸(コカミノプロピオン酸ナトリウムとアスパラギン誘導体など);ベタイン(例えばコカミドプロピルベタイン);非イオン性界面活性剤(脂肪酸アルカノールアミドなど、例えばオレイン酸エタノールアミド);エステルまたはポリアルコール(例えばSpan);ポリグリセロールエステル(例えば脂肪酸と1つまたはいくつかのOH基でエステル化されたもの);ポリアルコキシル化された誘導体(例えばポリオキシ:ステアリン酸ポリオキシエチレン);エーテル(例えばポリオキシエテラウリルエーテル);エステルエーテル(例えばTween);アミン酸化物(例えばココナツとドデシルジメチルアミン酸化物)である。いくつかの実施形態では、2つ以上の界面活性剤または溶媒が含まれる。
組成物は、pHの安定化を助けるためバッファ成分を含むことができる。いくつかの実施形態では、pHは4.5~8.5である。例えばpHとして、ほぼ4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、または8.0(間の任意の数値が含まれる)が可能である。いくつかの実施形態では、pHは、5.0~8.0、6.0~7.5、6.8~7.4、または約7.0である。バッファの非限定的な例に含めることができるのは、ACES、酢酸塩、ADA、水酸化アンモニウム、AMP(2-アミノ-2-メチル-1-プロパノール)、AMPD(2-アミノ-2-メチル-1,3-プロパンジオール)、AMPSO、BES、BICINE、ビス-トリス、BIS-TRISプロパン、ホウ酸塩、CABS、カコジル酸塩、CAPS、CAPSO、炭酸塩(pK1)、炭酸塩(pK2)、CHES、クエン酸塩(pK1)、クエン酸塩(pK2)、クエン酸塩(pK3)、DIPSO、EPPS、HEPPS、エタノールアミン、ギ酸塩、グリシン(pK1)、グリシン(pK2)、グリシルグリシン(pK1)、グリシルグリシン(pK2)、HEPBS、HEPES、HEPPSO、ヒスチジン、ヒドラジン、イミダゾール、リンゴ酸塩(pK1)、リンゴ酸塩(pK2)、マレイン酸塩(pK1)、マレイン酸塩(pK2)、MES、メチルアミン、MOBS、MOPS、MOPSO、リン酸塩(pK1)、リン酸塩(pK2)、リン酸塩(pK3)、ピペラジン(pK1)、ピペラジン(pK2)、ピペリジン、PIPES、POPSO、プロピオン酸塩、ピリジン、ピロリン酸塩、コハク酸塩(pK1)、コハク酸塩(pK2)、TABS、TAPS、TAPSO、タウリン(AES)、TES、トリシン、トリエタノールアミン(TEA)およびTrizma(トリス)である。賦形剤に含めることができるのは、ラクトース、マンニトール、ソルビトール、微結晶セルロース、スクロース、クエン酸ナトリウム、リン酸二カルシウム、リン酸塩バッファ、または似た性質の他の任意の単独の成分、またはその適切な組み合わせである。
微生物組成物は結合剤を含むことができ、それは例えば、トラガカントゴム、アラビアゴム、メチルセルロース、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、デンプン、バイオフィルム、または似た性質の他の任意の単独の成分、またはその適切な組み合わせである。
バイオフィルムからの生物活性な組成物を同定する方法においてバイオフィルムを生きた生物学的組成物の中で糊または保護マトリックスとして用いることは、アメリカ合衆国特許第10,086,025号;第10,004,771号;第9,919,012号;第9,717,765号;第9,713,631号;第9,504,739号に記載されている(そのそれぞれが参照によって本明細書に組み込まれている)。バイオフィルムを免疫応答と皮膚および/または粘膜の障壁機能を改善するための材料および方法として用いることは、アメリカ合衆国特許第10,004,772号と第9,706,778号に記載されている(そのそれぞれが参照によって本明細書に組み込まれている)。例えば組成物は、ラクトバシラス・ファーメンタム細菌の株、またはその生物活性な抽出物を含むことができる。好ましい実施形態では、細菌の抽出物は、細菌をバイオフィルムとして増殖させるときに得られる。本開示により、L.ファーメンタム細菌、またはその生物活性な抽出物を凍結乾燥された形態、フリーズドライの形態、および/またはライセートの形態で含む組成物も提供される。いくつかの実施形態では、細菌株はラクトバシラス・ファーメンタムQi6(本明細書ではLf Qi6とも呼ぶ)である。一実施形態では、本開示により、Lf Qi6の単離された培養物または生物学的に純粋な培養物が提供される。別の一実施形態では、本開示により、バイオフィルムとして増殖させたLf Qi6の生物学的に純粋な培養物が提供される。医薬組成物はLf Qi6バイオフィルムの生物活性な抽出物を含むことができる。例えばL.ファーメンタムQi6は標準的な培養法を利用してMRS培地の中で増殖させることができる。細菌は、再び専用の培養法を利用して追加期間の間500 mlのMRS培地の中で継代培養することができる。細胞を超音波処理し(Reliance Sonic 550、STERIS Corporation、メンター、オハイオ州、アメリカ合衆国)、10,000 gで遠心分離し、細胞ペレットを減菌水の中に分散させ、溶解した細胞を回収し(Sonic Ruptor 400, OMNI International、ケネソー、ジョージア州、アメリカ合衆国)、再び10,000 gで遠心分離し、可溶性画分を遠心分離することができる(50 kDa Amicon Ultra膜充填剤、EMD Millipore Corporation、ダルムシュタット、ドイツ国、カタログ番号UFC905008)。得られた画分は0.5 mlのアリコートに分配し、液体窒素の中で瞬間凍結させ、-80℃で保管する。
本明細書に提示されている組成物は、場合により、単回(単位)用量のプロバイオティック細菌、またはそのライセートまたは抽出物を含有することができる。プロバイオティック細菌(完全なもの、溶解物、または抽出物)の適切な用量は、10^4~10^12 cfuの範囲、例えば10^4~10^10、10^4~10^8、10^6~10^12、10^6~10^10、または10^6~10^8 cfuの1つが可能である。いくつかの実施形態では、用量を1日に1回または2回投与することができる。いくつかの実施形態では、組成物は、結合剤およびまたは賦形剤のそれぞれの1つ以上を重量で少なくとも約0.01%~約30%、約0.01%~約20%、約0.01%~約5%、約0.1%~約30%、約0.1%~約20%、約0.1%~約15%、約0.1%~約10%、約0.1%~約5%、約0.2%~約5%、約0.3%~約5%、約0.4%~約5%、約0.5%~約5%、約1%~10約5%含むことができる
略号cfuは「コロニー形成単位」を意味し、寒天プレート上の細菌学的カウントによって明らかにされたときの細菌細胞の数と定義される。
組成物が含むことができるのは、寒天、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ケイ酸塩、アルギン酸、コーンスターチ、タピオカのデンプン、プリモゲル、または似た性質の他の任意の成分からなるグループから選択される単独の賦形剤、またはその適切な組み合わせ;ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、または似た性質の他の任意の成分からなるグループから選択される単独の潤滑剤;コロイド状二酸化ケイ素または似た性質の他の任意の成分からなるグループから選択される単独の流動促進剤、またはその適切な組み合わせ;マンニトール、スクロース、トレハロース、グリシン、アルギニン、デキストランなどからなるグループから選択される1つの安定剤、またはこれらの組み合わせ;ペパーミント、サリチル酸メチル、オレンジフレーバー、バニラフレーバー、または医薬として許容可能な他の任意の着臭剤または着香剤からなるグループから選択される単独の着臭剤または着香剤、またはその適切な組み合わせ;アセチルアルコール、モノステアリン酸グリセリル、または医薬として許容可能な他の任意の湿潤剤からなるグループから選択される単独の湿潤剤、またはその適切な組み合わせ;カオリン、ベントナイト粘土、または医薬として許容可能な他の任意の吸収剤からなるグループから選択される単独の吸収剤、またはその適切な組み合わせ;ワックス、パラフィン、または医薬として許容可能な他の任意の遅延剤からなるグループから選択される単独の遅延剤、またはその適切な組み合わせである。
微生物組成物は1つ以上の皮膚軟化剤を含むことができる。皮膚軟化剤の非限定的な例に含まれるのは、ステアリルアルコール、モノリシノール酸グリセリル、モノステアリン酸グリセリル、プロパン-1,2-ジオール、ブタン-1,3-ジオール、ミンクオイル、セチルアルコール、イソステアリン酸イソプロピル、ステアリン酸、パルミチン酸イソブチル、ステアリン酸イソセチル、オレイルアルコール、ラウリン酸イソプロピル、ラウリン酸ヘキシル、オレイン酸デシル、オクタデカン-2-オール、イソセチルアルコール、パルミチン酸セチル、ジメチルポリシロキサン、セバシン酸ジ-n-ブチル、ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、ステアリン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチル、ポリエチレングリコール、トリエチレングリコール、ラノリン、ゴマ油、ココナツ油、ピーナツ油、ひまし油、アセチル化ラノリンアルコール、石油、鉱物油、ミリスチン酸ブチル、イソステアリン酸、パルミチン酸、リノレン酸イソプロピル、乳酸ラウリル、乳酸ミリスチル、オレイン酸デシル、ミリスチン酸ミリスチルである。
微生物組成物は増粘剤を含むことができ、例えば増粘剤の選択は、ヒドロキシエチルセルロース(例えばNatrosol)、デンプン、ゴム(アラビアゴムなど)、カオリンまたは他の粘土、含水ケイ酸アルミニウム、ヒュームドシリカ、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウムまたは他のセルロース誘導体、モノステアリン酸エチレングリコール、およびアルギン酸ナトリウムからなすことができる。微生物組成物は、保存剤、防腐剤、顔料または着色剤、香料、マスキング剤、および基剤(水や低級アルキルアルコールなど)を含むことができ、例えばアメリカ合衆国特許第5,525,336号から参照によって組み込まれているに開示されているものが組成物に含まれる。
生きた生物学的組成物は場合により保存剤を含むことができる。保存剤は、合成微生物の活性を壊さない適切な任意の保存剤から選択することができる。保存剤として、例えばキトサンオリゴ糖、安息香酸ナトリウム、プロピオン酸カルシウム、トコフェロール、選択されたプロバイオティック株、フェノール、ブチルアルコールまたはベンジルアルコール;アルキルパラベン(メチルパラベンまたはプロピルパラベンなど);カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3-ペンタノール;およびm-クレゾール);低分子量(約10残基未満)ポリペプチド;タンパク質(血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなど);キレート剤(EDTAなど);塩形成対イオン(ナトリウムなど);金属錯体(例えばZn-タンパク質錯体)、m-クレゾールまたはベンジルアルコールなどが可能である。保存剤として、FDAのGRAS食品保存剤のリストにあるトコフェロールが可能である。トコフェロール保存剤として、例えばトコフェロール、ジオレイルトコフェリルメチルシラノール、アスコルビルトコフェリルリン酸カリウム、トコフェルソラン、酢酸トコフェリル、リノレン酸トコフェリル、リノレン酸/オレイン酸トコフェリル、ニコチン酸トコフェリル、コハク酸トコフェリルが可能である。組成物は、例えば0~2%、0.05~1.5%、0.5~1%、または約0.9%v/vまたはwt/vの保存剤を含むことができる。
本開示の組成物は安定剤および/または抗酸化剤を含むことができる。安定剤として、例えばアメリカ合衆国特許第5,849,704号に記載されているように、例えばアミノ酸(例えばアルギニン、グリシン、ヒスチジン)またはその誘導体、イミダゾール、イミダゾール-4-酢酸が可能である。安定剤として「糖アルコール」(例えばマンニトール、キシリトール、エリトリトール、トレイトール、ソルビトール、またはグリセロール)が可能であり、を添加することができる。本発明の文脈では、「二糖」は、天然の二糖(スクロース、トレハロース、マルトース、ラクトース、セファロース、ツラノース、ラミナリビオース、イソマルトース、ゲンチオビオース、またはメリビオースなど)を指すのに用いられる。抗酸化剤として、例えばアスコルビン酸、グルタチオン、メチオニン、およびエチレンジアミン四酢酸(EDTA)が可能である。場合によるこの安定剤または抗酸化剤は、液体組成物1 mL当たり約0~約20 mg、0.1~10 mg、または1~5 mgの量にすることができる。
局所投与のための微生物組成物は、液体、溶液、懸濁液、クリーム、ローション、軟膏、ゲルの形態で、または投与の直前に懸濁液にするため固体形態(粉末、錠剤、またはトローチなど)で提供することができる。局所用の組成物は硬質カプセル、または軟質ゼラチンカプセルとして提供することもでき、その場合に良性微生物および/または合成微生物は水媒体または油媒体(例えばピーナツ油、液体パラフィン、またはオリーブ油)と混合される。粉末と顆粒は、従来のやり方で溶解させるため上記の成分を用い、例えばミキサー、流動床装置、凍結乾燥またはスプレー乾燥の装置を使用して錠剤とカプセルに調製することができる。乾燥させた微生物組成物は、直接投与すること、または基剤の中の懸濁液にすることができる。組成物が粉末形態であるときには、粉末は、チョーク、タルク、フーラー土、コロイド状二酸化ケイ素、ポリアクリル酸ナトリウム、テトラアルキルおよび/またはトリアルキルアリールアンモニウムスメクタイト、および化学的に修飾されたケイ酸アルミニウムマグネシウムを基剤の中に含むことができる。組成物が粉末形態であるときには、粉末は、チョーク、タルク、フーラー土、コロイド状二酸化ケイ素、ポリアクリル酸ナトリウム、テトラアルキルおよび/またはトリアルキルアリールアンモニウムスメクタイト、および化学的に修飾されたケイ酸アルミニウムマグネシウムを含むことができる
微生物組成物は、凍結させて、冷蔵して、または室温で保管したとき(好ましくは室温で保管したとき)、少なくとも1、2、3ヶ月、6ヶ月、12ヶ月18ヶ月、または24ヶ月の間に失われるcfuが30%未満、20%未満、10%未満、または5%未満である安定なCFUを示す可能性がある。
キット
上記の組成物または合成微生物のどれもキットの形態で提供することができる。いくつかの実施形態では、キットは、生きた細菌を収容する容器、または凍結乾燥させた生きた細菌を収容する容器を含む。キットは、培地を含む第2の容器を含むことができる。キットは1つ以上の除菌剤も含むことができる。キットは、組成物を投与するための指示も含むことができる。ある実施形態では、指示は、微生物株を組成物の他の成分と混合するために提供される。いくつかの実施形態では、キットは、微生物組成物を対象に適用するためのアプリケータをさらに含む。
用量
ある実施形態では、局所投与のための組成物(すなわち溶液組成物)、または再構成して溶液組成物にするための組成物が提供される。一実施形態では、組成物は、約1×105~1×1012 cfu/ml、1×106~1×1010 cfu/ml、または1.2×107~1.2×109 CFU/mLの合成微生物を水溶液(リン酸塩緩衝化生理食塩水(PBS)など)の中に含むことができる。対象での予備的刺激研究では、より少ない用量を使用することができる。
対象は、少なくとも1つの部位で対象のスワビングを実施することによって証明されるように、最初の投与工程を実施してから少なくとも2、3、4、6、10、15、22、26、30、または52週間後に望ましくない微生物の再発を示さないことが好ましい。
実施例
実施例1.親微生物の選択と同定 - spaタイピングによる黄色ブドウ球菌株の同定
実施例
実施例1.親微生物の選択と同定 - spaタイピングによる黄色ブドウ球菌株の同定
局所的スケールと全体的スケールの両方での細菌種の迅速かつ正確な同定が、ヒトまたは動物の集団での疾患診断、疫学、およびマイクロバイオーム理解のために重要である。微生物株タイピング法の大半は、シークエンシングなどのゲノム分析またはバンド形成パターンを見ることのいずれかのため、または選択用または識別用のさまざまな培地または試薬に対する生物の表現型応答を分析するため、十分な量まで生物を増殖させる必要がある長いプロトコルを含む。これらの方法はどれも非常に遅いか、高価な装置またはキットを必要とするか、1つの検査結果を次の検査結果と比較できる結果を出さない。
Spaタイピングは、黄色ブドウ球菌株を同定するための優れた技術として国際的なレベルで推奨される。O’Hara et al., 2016 Spaタイピングと多遺伝子座配列タイピングは、アメリカ合衆国における黄色ブドウ球菌のマクロな疫学的研究で同等な性能を示す Microbial Drug Resistance. Vol. 22. No.1. p.88-96。これは、ブドウ球菌タンパク質A(spa)と呼ばれる黄色ブドウ球菌に独自のタンパク質の多型領域のDNA配列を分析する技術である。Spaタイピングでは、よく保存されたDNA領域が隣接した24塩基対反復の中のミクロとマクロのバリエーションを分析した後、その配列を既知の株のデータベースと比較する。Ridom SpaServer (www.spaserver.ridom.de)。
配列は、反復配列の番号と順番によって生成される数字コードに基づいて株を同定する国際データベースに収納されており、この国際データベースは現在19,000通りを超える異なるspa型と794通りの異なる反復配列を含有する。4-5 Spaタイピングは1つの理想であり、さまざまな環境(黄色ブドウ球菌が疑われるかヒトの鼻孔に存在する細菌感染症など)中の黄色ブドウ球菌の存在を探すためのコスト効率のよい方法である。ブドウ球菌タンパク質Aは黄色ブドウ球菌だけのものであるため、spaの存在に関して陽性のPCRは黄色ブドウ球菌が存在することを示しており、spa型は、地域または世界における株の流行に加えてその株が関与する疾患の疫学に関する詳細を与えることができる。
材料
装置と装置使用
PCR反応のためのサーマルサイクラー(BioRad #1861096)を使用した。さまざまなピペット、PCR反応チューブ、微量遠心機、およびPCR産物を精製するためのQiaquick PCR精製カラムキット(Qiagen、28104)を使用した。試薬に含まれていたのは、黄色ブドウ球菌の粗gDNA調製物のためのSA溶解バッファSA溶解バッファ、黄色ブドウ球菌の細胞壁を分解するためSA溶解バッファとともに使用されるプロテインキナーゼK(Omega Biotek、AC115)、Econotaq(登録商標)PCRマスターミックス(2×)(Lucigen、30032)、Q5(登録商標)Hot Start High-Fidelity PCRマスターミックス(2×)、High Fidelity PCRマスターミックス(NEB、M0494L)、および分子生物学グレードの水、分子生物学グレードの無DNアーゼ、無RNアーゼ、および無プロテアーゼの水(Light Labs、80001-04)である。表1Bは、Econotaq PCR反応とQ5 PCR反応で使用したプライマーを示す。
方法
新鮮な寒天プレート(TSB/MSA/血液寒天プレート)に画線塗布またはパッチ塗布することによって細菌の単一コロニーを単離し、プレートを37℃で16~24時間インキュベートする。
スクリーニングするコロニーを調製して溶解させる。スクリーニングする各コロニーのための50 μLの細胞溶解溶液(1 mLのSA溶解バッファにつき5 μLのProK)を添加し、55℃で1時間、95℃で10分間インキュベートした後、室温まで冷却する。簡単に述べると、チューブを回転させて細胞残屑をペレットにし、次のPCRのための鋳型として2 μLの上清を用いてspa遺伝子の一部を増幅する。プライマーDR_606とDR_607を用いるHigh Fidelity Q5 PCRを準備する。DR_606はゲノムに可変領域の上流のspa遺伝子内で結合し、DR_607はspa遺伝子のすぐ下流に結合する。
PCR産物の1%アガロースゲル電気泳動を実施し、PCRで正しいサイズのバンドを探すとともにクリーンさをチェックする。バンドは約750塩基対のはずだが、異なる株の間でサイズがわずかに異なる可能性がある。反応によって正しいサイズの位置に1つのクリーンなバンドが生じる場合には、Qiaquick PCR Cleanupキット(Qiagen)を製造者の指示に従って用いてDNAをクリーンにする。DNAは、プライマーDR_606とDR_607を用いたサンガーシークエンシングに送り出された。
DNAシークエンシングの結果を使用し、ソフトウエア(Applied Maths)を開発者の指示に従って用いてspa遺伝子の可変領域を分析した。このソフトウエアは、データベースの中に一致するものを見つけた場合にspa型を割り当てる。
結果
図6Bは、Q5 PCRマスターミックスを用いてspa遺伝子に関してスクリーニングされた14個のコロニーからのPCRを分析する1%アガロースゲル電気泳動の写真画像を示す。すべてのレーンがspa遺伝子の存在を示す陽性バンドを示した。spa遺伝子の可変領域内の反復の数の差は、PCR産物のサイズのわずかな差の原因である可能性が大きい。
異なる黄色ブドウ球菌株のspaタイピングの結果を表2に示す。
上記の表は、BioPlxによって集められた18個のspaタイピングの株からの結果を示す。これらサンプルの中で同定された10種類の異なるspa型が存在している。
spaタイピングは迅速かつ正確な試験であり、黄色ブドウ球菌の異なる株のタイピングに利用できる。ブドウ球菌タンパク質A(spa)は黄色ブドウ球菌に独自であり、遺伝子のコード領域の3’末端に位置する超可変領域を含有する。試験は実施が容易であり、正確かつ再現可能な結果を出す。19,000を超える異なるspa型が現在データベースに収納されているため、多彩な異なる株を識別することができる。タイピングデータを使用して個体または集団のマイクロバイオームの変化を追跡すること、または感染症の潜在的な重症度の診断の助けにすることができる。
本発明の発明者らは、ヒトと動物のマイクロバイオームのサンプリングを通じて獲得した多彩な黄色ブドウ球菌株でSpaタイピング試験を実施した。BioNumericsソフトウエアを利用して反復の分析と株のタイピングを実施した。spaタンパク質の中の超可変領域は粗gDNA調製物からPCRによって増幅することが容易であり、シークエンシングデータの中に位置させるのが容易であることが見いだされた。少なくとも10通りの別々のspa型を持つ少なくとも18の異なる株が、この系を用いてデータベースに付加された。黄色ブドウ球菌株のあるものを合成微生物の調製において親標的株として使用した。t010またはt688を持つ標的株を分子改変のため選択した。
実施例2.黄色ブドウ球菌における複数のsprA1殺傷スイッチの設計
実施例2.黄色ブドウ球菌における複数のsprA1殺傷スイッチの設計
黄色ブドウ球菌株BP_001のゲノム内の内在性血清誘導性isdB遺伝子の後ろに組み込まれたsprA1毒素遺伝子を用いる殺傷スイッチの複数のバージョンを調製し、有効性を評価した。
図1Cは、株BP_001(502a)株を標的として挿入されたisdB::sprA1配列の短縮型配列アラインメントを示す。図1C(B)に示されているように、isdB::sprA1を含む第1の合成株BP_088は上流相同アームに組み込まれた変異を持っていたためisdB遺伝子にフレームシフトが生じ、読み枠が30塩基対、すなわち10個のアミノ酸の分だけ伸長した。このフレームシフトにもかかわらず、isdB::sprA1を含むBP_088は、図2に示されているように、ヒト血清への曝露後2時間以内に優れた自殺細胞死応答を示した(点線)。BP_088は完全培地(TSB、実線)の中で増殖する優れた能力も示した。
血清中で観察された表現型応答が、フレームシフトしたisdB遺伝子、または組み込まれた毒素遺伝子の結果であるかどうかを調べるため、追加の挿入ベクターを設計した。
最初は、変異が原初の挿入ベクターに存在していて株BP_088に組み込まれたかどうか、または株が細胞死を回避するため組み換えイベントの間に配列を変異させたかどうかを判断することは難しかったため、2つの新たなベクターを調製してこれらオプションの両方とも試験した。
新たなベクターの1つは第1の株と同じ配列を持っていたがisdB遺伝子の中にフレームシフトはなかったため、変異のない合成株BP_118を調製するのに使用した。他方の新たなベクターは合成株BP_115の調製に使用されるものであり、isdB遺伝子の末端にさらに2つの終止コドンが付加されていて(三重終止)、その株が組み込み中にインサートを変異させようと試みることがあればその2つは別のフレーム内にある。新たな挿入ベクターの両方を使用して黄色ブドウ球菌のゲノムを編集した。図2~5に示されているように、合成株BP_088、BP_115、およびBP_118がヒト血清中で増殖する能力を、野生型黄色ブドウ球菌親株BP_001(502a)と比較して評価した。
材料と方法
表3は、実験で使用した異なる培地と他の溶液を示す。
表4は、殺傷スイッチをBP_001のゲノムに挿入するのに使用したプラスミドの構築に用いたオリゴの名称と配列を示す。
表5は、sprA1のさまざまなバージョンを野生型BP_001(502a)のゲノム内のisdB遺伝子の後ろに挿入するのに使用したプラスミド遺伝子型を示す。
表5.プラスミドの名称と機能
表6は、この研究で使用した株と作製した株を示す。配列の太字部分はsprA1毒素遺伝子を表わし、下線を引いた配列はインサートの5’非翻訳領域を表わす。
すべての合成株を同じやり方で構成した。このやり方では、宿主のゲノムの中に入れて相同組み換えを容易にする温度感受性プラスミド(pIMAYz)を使用し、それがその後切除されて望む挿入された配列が残る。
プラスミド構築
i.p249(BP_088の作製に使用)相同アームとインサートをPCRで増幅するためのプライマー。
1.上流相同アーム
a.BP_948/BP_949
2.下流相同アーム
a.BP_952/BP_953
3.sprA1インサート
a.BP_950/BP_951
ii.p262(BP_118の作製に使用)相同アームとインサートをPCRで増幅するためのプライマー。
1.上流相同アーム
a.BP_948/BP_949
2.下流相同アーム
a.BP_952/BP_953
3.sprA1インサート
a.BP_950/BP_951
iii.p260(BP_115の作製に使用)相同アームとインサートをPCRで増幅するためのプライマー。
1.上流相同アーム
a.BP_948/DR_511
2.下流相同アーム
a.BP_952/BP_953
3.sprA1インサート
a.DR_512/BP_951
iv.各プラスミドについて、PCRで増幅された断片をpIMAYz骨格ベクターと組み合わせ、ギブソン・アセンブリキットを製造者の指示に従って用いて組み立てて環状プラスミドにしてエレクトロコンピテント大腸菌を形質転換した。
v.コロニーをスクリーニングした後、いくつかの陽性クローンをスクリーニングして適切なプラスミド配列であることを確認した。
i.p249(BP_088の作製に使用)相同アームとインサートをPCRで増幅するためのプライマー。
1.上流相同アーム
a.BP_948/BP_949
2.下流相同アーム
a.BP_952/BP_953
3.sprA1インサート
a.BP_950/BP_951
ii.p262(BP_118の作製に使用)相同アームとインサートをPCRで増幅するためのプライマー。
1.上流相同アーム
a.BP_948/BP_949
2.下流相同アーム
a.BP_952/BP_953
3.sprA1インサート
a.BP_950/BP_951
iii.p260(BP_115の作製に使用)相同アームとインサートをPCRで増幅するためのプライマー。
1.上流相同アーム
a.BP_948/DR_511
2.下流相同アーム
a.BP_952/BP_953
3.sprA1インサート
a.DR_512/BP_951
iv.各プラスミドについて、PCRで増幅された断片をpIMAYz骨格ベクターと組み合わせ、ギブソン・アセンブリキットを製造者の指示に従って用いて組み立てて環状プラスミドにしてエレクトロコンピテント大腸菌を形質転換した。
v.コロニーをスクリーニングした後、いくつかの陽性クローンをスクリーニングして適切なプラスミド配列であることを確認した。
黄色ブドウ球菌における株構築
i.配列を確認したプラスミドを37℃で播種してそのプラスミドを強制的に組み込み、エレクトロコンピテント黄色ブドウ球菌を形質転換した。
ii.次いでコロニーをスクリーニングしてゲノムに挿入されたプラスミドを探した。
1.3つの陽性クローンを5mLのBHI培地の中で室温にて一晩インキュベートし、BHI(AtC+X-gal)に播種した。
iii.白色のコロニーを取り上げてスクリーニングし、ゲノム内のプラスミドまたは細胞内で自己複製しているプラスミドの両方の存在を探した。
iv.残留プラスミドの兆候を示さないコロニーをスクリーニングして挿入されたDNA断片を探した。
v.いくつかの陽性クローンをシークエンシングして正しい配列がゲノムに挿入されたことを確認した。
vi.配列が確認された1つのクローンをデータベースにストックし、血清アッセイで使用した。
i.配列を確認したプラスミドを37℃で播種してそのプラスミドを強制的に組み込み、エレクトロコンピテント黄色ブドウ球菌を形質転換した。
ii.次いでコロニーをスクリーニングしてゲノムに挿入されたプラスミドを探した。
1.3つの陽性クローンを5mLのBHI培地の中で室温にて一晩インキュベートし、BHI(AtC+X-gal)に播種した。
iii.白色のコロニーを取り上げてスクリーニングし、ゲノム内のプラスミドまたは細胞内で自己複製しているプラスミドの両方の存在を探した。
iv.残留プラスミドの兆候を示さないコロニーをスクリーニングして挿入されたDNA断片を探した。
v.いくつかの陽性クローンをシークエンシングして正しい配列がゲノムに挿入されたことを確認した。
vi.配列が確認された1つのクローンをデータベースにストックし、血清アッセイで使用した。
ヒト血清アッセイ
i.5mLのTSBの中の実験株の3つの別々の単一コロニーからの3つの一晩培養物で開始する。内部アッセイ対照が目的の502aの1つの培養物で開始し、それを実験サンプルと同様に処理する。
ii.翌朝、5.5 mLの新鮮なTSBの中で一晩培養物のOD600を0.05に戻す。
1.培養物をTSBの中で1:10に希釈すること(900 uLのTSBの中に100 uLの培養物)によってOD600を測定する。
2.必要な体積の一晩培養物を計算して新しい培養チューブに接種する:(0.05*5.5)/OD600。
3.5.5 mLのTSBを接種し、培養物を攪拌しながら(37℃、240 rpm)2時間インキュベートして細胞の代謝と同期させる。
iii.工程2の新鮮な培養物を接種してから2時間後、OD600を測定する。
iv.培養物を減菌PBSの中で洗浄する。
1.スウィングアウトロータ(3500 rpm、5分間、室温)を用いて培養物を遠心分離し、5mLのPBSで洗浄する。
2.再び遠心分離し、1mLの減菌PBSに再懸濁させる。
v.OD600が0.05のTSB/血清を5 ml接種するのに必要な再懸濁させた培養物の量を計算する。
vi.OD600が0.05の新鮮なあらかじめ温めておいたTSBとヒト血清を5mL接種する(それぞれ3つのチューブ)。
vii.接種材料の添加後、パルス撹拌によって素早く混合し、100μLのサンプルを採取してcfu/mLを求める。残った培養物を37℃の震盪培養器に入れる。
1.次の8時間にわたって2時間ごとにサンプルを採取し、段階希釈を実施してcfu/mLを求める。
a.1.5mLの殺菌チューブの中の900μLの減菌PBSから始めて段階希釈を実施する。よく混合した培養物から100μLのサンプルを取り出し、第1のPBSチューブに移す。
b.それをパルス撹拌によってよく混合し、100μLを取り出して次のチューブに移す操作を、100 μLをTSB寒天プレートの表面に広げたときに30~300個のコロニーが増殖する程度に培養物が希釈されるまで実施する。このプロセスをすべての培養チューブについて、すべての時点で繰り返す。
c.すべてのプレートを37℃で12~16時間インキュベートし、コロニーのカウント数を記録し、培養物のcfu/mLを計算するのに使用する。
i.5mLのTSBの中の実験株の3つの別々の単一コロニーからの3つの一晩培養物で開始する。内部アッセイ対照が目的の502aの1つの培養物で開始し、それを実験サンプルと同様に処理する。
ii.翌朝、5.5 mLの新鮮なTSBの中で一晩培養物のOD600を0.05に戻す。
1.培養物をTSBの中で1:10に希釈すること(900 uLのTSBの中に100 uLの培養物)によってOD600を測定する。
2.必要な体積の一晩培養物を計算して新しい培養チューブに接種する:(0.05*5.5)/OD600。
3.5.5 mLのTSBを接種し、培養物を攪拌しながら(37℃、240 rpm)2時間インキュベートして細胞の代謝と同期させる。
iii.工程2の新鮮な培養物を接種してから2時間後、OD600を測定する。
iv.培養物を減菌PBSの中で洗浄する。
1.スウィングアウトロータ(3500 rpm、5分間、室温)を用いて培養物を遠心分離し、5mLのPBSで洗浄する。
2.再び遠心分離し、1mLの減菌PBSに再懸濁させる。
v.OD600が0.05のTSB/血清を5 ml接種するのに必要な再懸濁させた培養物の量を計算する。
vi.OD600が0.05の新鮮なあらかじめ温めておいたTSBとヒト血清を5mL接種する(それぞれ3つのチューブ)。
vii.接種材料の添加後、パルス撹拌によって素早く混合し、100μLのサンプルを採取してcfu/mLを求める。残った培養物を37℃の震盪培養器に入れる。
1.次の8時間にわたって2時間ごとにサンプルを採取し、段階希釈を実施してcfu/mLを求める。
a.1.5mLの殺菌チューブの中の900μLの減菌PBSから始めて段階希釈を実施する。よく混合した培養物から100μLのサンプルを取り出し、第1のPBSチューブに移す。
b.それをパルス撹拌によってよく混合し、100μLを取り出して次のチューブに移す操作を、100 μLをTSB寒天プレートの表面に広げたときに30~300個のコロニーが増殖する程度に培養物が希釈されるまで実施する。このプロセスをすべての培養チューブについて、すべての時点で繰り返す。
c.すべてのプレートを37℃で12~16時間インキュベートし、コロニーのカウント数を記録し、培養物のcfu/mLを計算するのに使用する。
結果が、培養物1 mL当たりのコロニー形成単位の8時間にわたるグラフを示す図2~5に示されている。点線は血清の中で増殖した培養物を表わし、実線はTSBの中で増殖した培養物を表わす。図5は、TSBまたはヒト血清の中のBP_088、BP_115、およびBP_118のそれぞれについて、8時間にわたる培養物1 mL当たりの平均(n=3)コロニー形成単位を示す。
isdB::sprA1をそれぞれが含む操作された黄色ブドウ球菌株BP_088、BP_115、およびBP_118と、WT親株BP_001は、それぞれ、図2~5に示されているように、完全培地(TSB、実線)の中で優れた細胞増殖を示した。図3と4(点線)に示されているように、WT BP_001もヒト血清に曝露されたときに増殖する能力を示した。しかしヒト血清に曝露すると、図2~5に示されているように、3つの操作された株BP_088、BP_115、およびBP_118はすべて、ヒト血清に曝露してから2時間以内に増殖の有意な減少を示した(点線)。
結論
この一連の実験において、ヒト血清中で増殖している間の黄色ブドウ球菌のいくつかの操作された株の表現型応答をTSB中と比べて評価した。これらの株は、ゲノムの同じ位置に組み込まれたわずかに異なる殺傷スイッチ配列を持つ。すべての配列がisdB遺伝子の後ろに直接挿入された。
組み込みの1つでは望む殺傷スイッチ配列(BP_118)になり、別の組み込みでは、殺傷スイッチの直前にあってisdB遺伝子に30個超の塩基を付加する変異が生じてisdB遺伝子にフレームシフトが起こり、第3の組み込みでは、isdB遺伝子の直後に複数の終止コドンが異なるフレームで導入されることで、その遺伝子がフレームシフト変異によって中断されることから保護された。
3つの操作された黄色ブドウ球菌株がヒト血清とTSBの中で増殖する能力を、野生型(BP_001)株と比較して調べた。調べたすべての実験株(BP_088、BP_115、およびBP_118)について、表現型応答は、ヒト血清の中で増殖させたとき、TSBの中と比べてcfu/mLの有意な低下を示した。この応答はヒト血清中ではどのWT BP_001株でも観察されず、その代わりにその株はヒト血清中で増殖する能力を示し、他の株が集団の数桁の減少を経験したのと同じ期間に複数回倍増した。
表7Aに示されているのと同様のやり方で多数の追加の殺傷スイッチ黄色ブドウ球菌細胞系を開発した。
追加プラスミドと生成した黄色ブドウ球菌合成株が図6Aの中の表7Bに示されている。
実施例3.大腸菌と黄色ブドウ球菌における短縮型sprA1とフレームシフトしたsprA1の有効性アッセイ
実施例3.大腸菌と黄色ブドウ球菌における短縮型sprA1とフレームシフトしたsprA1の有効性アッセイ
プラスミド p257 (pIMAYz_harA::sprA1) を作製すると、sprA1 遺伝子は、フレームシフトおよびアミノ酸配列 MLIFVHIIAPVISGCAIAFFLIG (BP_AA_014) (SEQ ID NO:84)を有する切断タンパク質(SEQ ID NO: 47) (BP_DNA_090) をもたらす塩基対欠失を獲得した。BLOSUM62マトリックスを用いたタンパク質配列アラインメントによって、変異タンパク質とBP_DNA_035(配列番号25)によってコードされるアミノ酸配列(BP_AA_002)MLIFVHIIAPVISGCAIAFFSYWLSRRNTK(配列番号72)を有する天然タンパク質との間で64.5%の類似性が示された。変異した短縮型タンパク質の有効性を調べるため、変異したsprA1遺伝子をpRAB11プラスミドの中に挿入し、その遺伝子をP(xyl/tet)プロモータによって調節して無水テトラサイクリン(ATc)によって誘導できるようにした。新たなプラスミドをp298と名づけ、過剰発現したときの細胞培養に対する効果を大腸菌と黄色ブドウ球菌BP_001で調べた。
簡単に述べると、プラスミドを有するそれぞれの株に関する3つの一晩培養物を生物学的レプリケートとして震盪培養器の中の37℃のTSB培地の中で240 rpmで増殖させた。翌日、培養物のODを0.05に戻し、それぞれの一晩培養物を2つのチューブに分け、37℃で2時間増殖させた。2時間の増殖の後、それぞれの株のための1つのチューブにATcを添加して短縮型sprA1遺伝子を発現させた後、震盪培養器に戻して増殖を継続させた。サンプルを毎時間採取し、600 nmでの吸光度(OD600)を測定することにより培養物の密度を測定した。図7と8は、調べた株の平均OD測定値を時間に対してプロットして示している。
図7は、p298プラスミドを有する大腸菌株IM08B(BPEC_023)の誘導された増殖曲線と誘導されていない増殖曲線を、OD600値を時間に対してプロットして示している。実線は、誘導されていない培養物の平均値(n=3)を表わし、点線は、誘導された培養物の平均値(n=3)を表わす。誤差棒は平均値の標準偏差を表わす。誘導から2時間以内にBPEC_023大腸菌培養物の増殖速度はそれぞれの追跡時点で遅くなり、最終的にはアッセイが終了する前に負になったのに対し、誘導されていない培養物はアッセイの6時間にわたって増殖を続けた。
図8は、p298プラスミドを有する黄色ブドウ球菌株BP_001の増殖曲線を、OD600値を時間に対してプロットして示している。実線は、誘導されていない培養物の平均値(n=3)を表わし、点線、誘導された培養物の平均値(n=3)を表わす。誤差棒は平均値の標準偏差を表わす。
BP_AA_014(配列番号84)をコードする短縮型sprA1遺伝子(BP_DNA_090、配列番号47)の過剰発現は、増殖中の大腸菌と黄色ブドウ球菌培養物に対する影響を持っていた。誘導されていない培養物の増殖曲線は誘導された培養物からATcの添加後2時間以内に乖離し始め、誘導されていない培養物は対数増殖期で増殖を続けたのに対し、誘導された培養物の増殖はATcを添加した直後に劇的に遅くなった。調べた両方の株で増殖速度はその後の各時点で遅くなり、最終的にはアッセイを停止する前に負になった。ATcは非毒性であることが示されているため、実験で用いる濃度で調べたどの種も阻害しない。そのため調べた2つの培養物の間で、誘導された培養物においてより低い培養密度にすることができたと考えられる唯一の変数は、過剰発現した短縮型sprA1遺伝子である。
実施例4.B群レンサ球菌の殺傷スイッチ設計
実施例4.B群レンサ球菌の殺傷スイッチ設計
ピギーバック法を利用して作用遺伝子をプロモータの後ろに挿入すること、または細菌ゲノムの中で調節が異なる遺伝子が、挿入された1つまたは複数の遺伝子を別の環境内の細胞から十分に「隠し」つつ、ある刺激に対する非常に独自で特異的な応答を生じさせることができる。われわれは、効果的な殺傷スイッチを黄色ブドウ球菌のゲノムに挿入すると、体液(血清、血液、血漿、および脳脊髄液(CSF)など)中で培養するときにその細胞がアポトーシスを誘導することを実証した。本明細書に提示されているように、これらゲノムスイッチが500世代超にわたって安定であることも示された。これは、細胞を操作するこの方法が多くの用途を持ちうることをさらに示している。
ピギーバック法の有用性をさらに実証するため、この方法をレンサ球菌(Strep)属の種に適用することができる。標的微生物としてB群レンサ球菌(SSTI、ウシ乳腺炎、新生児敗血症などを起こす可能性がある病原性の株であるストレプトコッカス・アガラクティエ)が可能である。
ストレプトコッカス・アガラクティエの仮想毒素/抗毒素は、例えばXie et al., 2018に提示されているように、ゲノムの中に見いだすことができる。Xie et al., TADB 2.0:細菌II型毒素-抗毒素遺伝子座の更新されたデータベースNucleic Acids Res. 2018, 46 (D1), D749-D753. https://doi.org/10.1093/nar/gkx1033。表8は、仮想ストレプトコッカス・アガラクティエ毒素遺伝子とそのアクセッション番号のリストを示す。他の肺炎レンサ球菌やストレプトコッカス・ミュータンスなど)からの毒素遺伝子もスクリーニングして潜在的な用途を探すことができる。毒素遺伝子は、特定のプライマーのペアを用いてストレプトコッカス・アガラクティエのゲノムからPCRで増幅することができる。毒素遺伝子は、DNAプリンティングサービスを用いてプリントアウトすること、または合成することもできる。毒素は、毒素遺伝子をプラスミドに誘導性プロモータとともに組み込むことによってストレプトコッカス・アガラクティエに対する致死性をスクリーニングすることができる。例えばプラスミドは、抗生剤テトラサイクリンの非毒性類似体である無水テトラサイクリン(ATc)によって誘導する(または脱抑制する)ことのできるtet誘導性プロモータ系(pRAB11など)とともに使用される。毒素はプラスミド上でプロモータの後ろに挿入されることになるため、毒素の発現はATcの付加によって誘導される。誘導された株と誘導されていない株の間の光学密度(OD)の差は、プラスミドに付加された毒素遺伝子の有効性を示しているであろう。誘導性プラットフォームにおける最も効果的な毒素遺伝子を用いてB群レンサ球菌における血清誘導性殺傷スイッチを創出することができる。表8は、2.0毒素/抗毒素データベース. Xie et al., 2018を用いて見いだされた毒素遺伝子を示す。
誘導性プロモータ遺伝子の選択。ストレプトコッカス・アガラクティエのゲノム内の複数の位置を標的として1つまたは複数の毒素遺伝子を組み込むことができる。血清中で上方調節されるプロモータと遺伝子は、RNA-seqを用いて見いだすこと、または文献から見いだすことができる。血清中で増殖させるか上方調節する必要があるストレプトコッカス・アガラクティエの遺伝子のリストに関する表9を参照されたい。興味ある1つの部位として、血清中で上方調節されるIgA結合β抗原遺伝子が可能であろう。Hooven et al. ストレプトコッカス・アガラクティエの緊縮応答はヒト血液における毒力とパーシスタンスを増強する。Infect. Immun. 2017, 86 (1). https://doi.org/10.1128/IAI.00612-17。
毒素は、IgA結合β抗原遺伝子と同じmRNA転写産物上に載るようにして誘導性プロモータ遺伝子の後ろに組み込まれることになる。血清中でのIgA結合β抗原遺伝子の上方調節された発現は、毒素遺伝子と結びつけられるか、毒素遺伝子に便乗する。これは血清中での毒素遺伝子の発現を増加させ、殺傷スイッチを創出するであろう。表9は、ストレプトコッカス・アガラクティエの中の血清誘導性プロモータ遺伝子の候補を示す。
表9は、トランスポゾンシークエンシングのデータに基づき、遺伝子#1~16がヒト血液中で生存するのに不可欠であることが見いだされたことを示す。Hooven et al. ストレプトコッカス・アガラクティエ緊縮応答がヒト血液における毒力とパーシスタンスを増強する. Infect. Immun. 2017, 86 (1). https://doi.org/10.1128/IAI.00612-17。表9は、遺伝子FbsC(#17)が全ゲノムシークエンシングに基づいて予測され、フィブリノーゲン結合タンパク質として特徴づけられたことを示す。Buscetta et al., 2014, 新規なフィブリノーゲン結合タンパク質であるFbsCはストレプトコッカス・アガラクティエ-宿主細胞相互作用を促進するhttp://www.jbc.org/content/289/30/21003.long。示されているすべての遺伝子候補が血液または上皮細胞の中で上方調節された発現を示すはずであり、そのことがこれら候補をピギーバック法で用いるための優れた標的にしている。
これらをゲノムに挿入するため、相同組み換えを通じてゲノムを改変するためのプラスミドを選択する。プラスミドとして、温度選択的複製始点とスクロース対抗選択を用いて相同組み換えイベントの後にゲノムからプラスミドを除去するシームレスなゲノムノックアウトまたは組み込みを可能にするpMBsacBが可能である。Hooven et al. 対抗選択可能なスクロース感受性マーカーが、ストレプトコッカス・アガラクティエにおける効率的で柔軟な突然変異誘発を可能にする. Appl. Environ. Microbiol. 2019, 85 (7). https://doi.org/10.1128/AEM.03009-18。
ギブソン・アセンブリを利用して相同アームと毒素遺伝子をpMBsacBプラスミドに付加することができる。数百キロ塩基までのDNA分子を酵素で組み立てる | Nature Methods https://www.nature.com/articles/nmeth.1318/。プラスミドでコンピテントストレプトコッカス・アガラクティエ細胞を形質転換し、プラスミドの複製が可能な許容温度で増殖させた。細胞を非許容温度に切り換え、相同アームの1つの位置でのゲノムへのプラスミドの組み込みを強制する。組み込みを確認した後、プラスミドをゲノムから除去し、編集物を残すことができる。これは、プラスミドを保持している細胞に対する対抗選択物として作用するスクロースを添加することによってなされる。コロニーをPCRによってスクリーニングし、シークエンシングしてゲノム編集が正確でプラスミドが除去されたことを確認する。ゲノム編集が完了すると、新たな株がヒト血清の中で増殖する能力を、本明細書に提示されている血清アッセイにおいて評価することによって調べることができる。殺傷スイッチを有する新たな株をヒト血清に接種し、さまざまな時点にサンプルを採取して寒天培地に播種し、血清1 mL当たりのコロニー形成単位(CFU)を計算することによって培養物の増殖を測定する。殺傷スイッチを有する新たなストレプトコッカス・アガラクティエ株は血清中では増殖しないが、他の複合培地の中では野生型株と同様に機能するはずである。
p296 pMBsacB_colE1。このプラスミドを使用するための典型的なプロトコルは、上述のように、30℃以下で増殖させるべきプラスミドを有する大腸菌を必要とするため、増殖速度が極度に低下し、レンサ球菌内でゲノム改変をするスケジュールが数日間延長する。レンサ球菌の中のDNAを操作するためのプラスミドを組み立てるプロセスを加速するため、colE1の複製起点の誘導体をpMBsacBプラスミド骨格に付加した。colE1の複製起点はプラスミドpcolE1に由来しており、われわれが使用した改変バージョンは細胞1個当たり約300~500のコピー数のプラスミドを維持し、大腸菌の中では温度感受性でない。プロモータはB群レンサ球菌によって認識されないはずであるため、その株における温度感受性インビトロでのDNA組み換えに干渉しないはずである。
PCR増幅によってpMBsacBベクター(BP_DNA_086)(配列番号43)を直線化し、pRAB11プラスミドからのcolE1複製起点を含有するPCRで増幅されたDNA断片(BP_DNA_085)を付加することにより、colE1複製起点のためのDNA配列を付加した。ギブソン・アセンブリキット(NEB)を製造者の指示に従って用いて2つのPCR産物を接合して1つの環状プラスミドを形成し、大腸菌を形質転換し、回収し、37℃で播種した。プレート上のコロニーをスクリーニングしてcolE1インサートを探し、3つの陽性プラスミドを精製し、シークエンシングして正しいDNA配列であることを確認した。新たなプラスミドをp296(BP_DNA_122)と名づけ、本発明の発明者らのプラスミドデータベースにストックする。ゲノム改変を目的とする相同アームをプラスミドに付加し、そのプラスミドが編集のためゲノムの中で組み換える能力をB群レンサ球菌の中で調べる。
実施例5.pIMAYzを用いた黄色ブドウ球菌の遺伝子操作
実施例5.pIMAYzを用いた黄色ブドウ球菌の遺伝子操作
このプロトコルは黄色ブドウ球菌のゲノムを編集するために設計されたものであり、CorvagliaらとIan Monkらによる論文に基づく。黄色ブドウ球菌の遺伝子操作は、外来DNAを検出して分解する強力な内在性制限改変障壁が理由で難しく、その結果として低い形質転換効率になる。細胞は、宿主特異的メチル化プロファイルの不在によって外来DNAを同定する。1 Corvaglia, A. R. et al.「臨床黄色ブドウ球菌株における水平遺伝子伝播に対する主要な障壁としてのIII型様制限エンドヌクレアーゼ機能」PNAS vol 107, no. 26, 2010, pp. 11954-11958. doi:10.1073/pnas.1000489107。大腸菌株IM08Bはある黄色ブドウ球菌株のI型アデニンメチル化プロファイルを模倣し、したがって内在性DNA制限系を回避する。
pIMAYzは大腸菌-黄色ブドウ球菌シャトルベクターであり、両方の株に関してクロラムフェニコール耐性を持ち、x-galを寒天プレートに添加するとき青色/白色スクリーニング技術を利用することができる。プラスミドは、大腸菌の中では温度感受性でないが、黄色ブドウ球菌の中では温度感受性である。これは、プラスミドが、30℃では複製できるが37℃では複製できないことを意味する。この温度感受性という特徴により、生体内で相同組み換えによって標的DNA配列(ゲノムDNA)を編集することが可能になる。
相同組み換え技術により、ドナーと標的DNA配列の間で相同な配列を用いて標的配列の中にマーカーレス挿入またはマーカーレス欠失を生じさせることが可能になる。これらの相同なDNA配列(相同アーム)は最初にプラスミド骨格に付加されねばならない。相同アームは、編集の標的とする位置のすぐ上流と下流のほぼ1000塩基に対応する。挿入が最終結果である場合には、挿入されるDNAはプラスミド内の相同アームの間に位置するはずである。最終結果がゲノム欠失である場合には、相同アームはプラスミド上で互いに隣り合うはずである。
プラスミドが作製されて標的生物が形質転換されると、培地の中にクロラムフェニコールを維持したままインキュベーションの温度を上昇させる。細胞は抗生剤に対する耐性を維持するのにプラスミドを必要とし、しかもプラスミドはより高温では複製できないため、生き延びるのは、プラスミド上の相同アームと標的配列をマッチさせることによってプラスミドが標的DNA(ゲノム)に組み込まれた細胞だけである。プラスミドに組み込まれたクローンがPCRによって確認されると、細胞を選択圧なしで増殖させた後、抗生剤テトラサイクリンの非毒性類似体である無水テトラサイクリン(ATc)を含有する培地に播種することにより、第2の交差イベントが起こることが可能になる。培地の中のATcは細胞を直接殺傷することはないが、黄色ブドウ球菌にとって毒性であるプラスミド骨格上のsecY遺伝子を誘導するため、この遺伝子がプラスミドを含有する細胞をすべて殺傷することになる。
ATcプレート上で増殖する細胞は、secY遺伝子の変異した部分を持つか、プラスミド上の相同アームとゲノムDNAを再びマッチさせることによる別の組み換えイベントを経ている。プラスミドは、第2の組み換えイベントにおける2つの経路の1つを通じて除去される。プラスミドが組み込まれたときのように同じ相同アームが並んでプラスミドを除去する場合には、標的DNA配列に変化は存在しないであろう。第2の組み換えイベントの間に別のセットの相同アームが並ぶ場合には、標的分子は想定された挿入または欠失を持つであろう。第2のイベントのこれら複数の結果は、コロニーが、挿入/欠失に関しては遺伝子型で、クロラムフェニコールとATcに対する耐性に関しては表現型でという両方でスクリーニングされねばならないことを意味する。株がすべてのQC工程に合格した場合には、ストックし、挿入されるか欠失したDNAの応答を調べる。
図9は、pIMAYプラスミドを用いたアレル交換を示す模式図を示す。pIMAYプラスミドを黄色ブドウ球菌細胞のゲノムへの挿入に用いることができる。この図は、Monk et al., Mbio, vol 3, no. 2, 2012. American Society For Microbiology, doi:10.1128/mbio.00277-11から取った。
プラスミド調製
1日目(PM)- 非常に濃縮されたpIMAYz組み込みプラスミド(200 ng超/uL)を調製する。
1.安全キャビネットの表面を70%アルコールで完全にクリーンにする。
2.安全キャビネットの中で、50 mLの殺菌セロロジカルピペットを用いて50 mLのLB培地を殺菌した250 mLのバッフル付き震盪フラスコに添加する。
3.100 uLのクロラムフェニコールを添加する(10 mg/mLの貯蔵溶液)。
4.殺菌接種ループを使用し、望むpIMAYzプラスミドを有する大腸菌株の新鮮な画線塗布プレート(5日齢未満)からコロニーをLB chlor 20培地の中に移す。
5.接種された培養フラスコを240 rpmで震盪し、37℃で一晩インキュベートする(12~18時間)。
6.その日使用したあらゆる作業空間と道具をクリーンにして殺菌する。
2日目
1.同体積の一晩培養物を2つの50 mLの円錐形チューブに移す。
2.卓上遠心機の中で固定角ロータを用いて円錐形チューブを室温にて7500×gで4分間回転させる。
3.両方のチューブから注意深く上清を捨て、細胞ペレットを乱さない。
4. 6 mLの分子グレードの水をチューブの1つに添加し、ボルテックスミキサーを用いてペレットを再懸濁させる。
5.十分に再懸濁させたペレットを第2のチューブに移し、ボルテックスして第2のペレットを再懸濁させる。
6.600 μLをZyppyプラスミドMiniprepキット(Zymo)からの10個のカラムに添加する。
7.プラスミドの抽出を製造者の指示に従って実施する。
a.30 uLの温かいZyppy溶離液バッファ(Zymo)を用いて溶離させる。
8.溶離液をプールし、混合し、抽出されたプラスミドDNAの濃度をNanodropを用いて求める。
9.抽出されたプラスミドをDNA Clean & Concentrator - 25(Zymo)を用いて濃縮する。
a.プラスミドの濃度に基づいて必要なチューブの数を計算する(それぞれのチューブは25 ugのDNAを保持することができる)。
b.プラスミドの濃度を製造者の指示に従って求める。
c.複数のチューブが必要とされる場合には、25 uLの分子グレードの水を用いて殺菌微量遠心チューブの中に溶離させ、溶離液をプールする。チューブが1つだけ必要とされる場合には、40 uLの分子生物学グレードの水を用いて溶離させる。イニシャルと日付を微量遠心チューブに記す。
d.クリーンにして濃縮したプラスミドの濃度をNanodropを用いて求める。
e.微量遠心チューブの側の濃度を記録する。
f.別の1.5 mLの微量遠心チューブに50 ng/μLのプラスミド溶液50 μLを入れて-20℃の冷凍庫にストックする。
g.残っているプラスミドは、ただちに形質転換に用いるか、4℃で短期間(2日間)または-20℃で長期保管することができる。複数回の凍結/解凍サイクルでプラスミドは時間経過とともに分解するであろう。
10.その日使用したあらゆる作業空間と道具をクリーンにして殺菌する。
黄色ブドウ球菌の形質転換
1.少量の砕いた氷をアイスバケットに添加する。エレクトロコンピテント黄色ブドウ球菌細胞の凍結アリコートを-80℃の冷凍庫から取り出し、氷の上で少なくとも10分間インキュベートする。
2.形質転換ごとに4つのBHI(chlor 10/X-gal 100)寒天プレートを37℃のプレート培養器に入れ、1つのBHI(chlor 10/X-gal 100)寒天プレートを30℃のプレート培養器に入れて、適切な温度に温め始める。
3.電気穿孔装置を適切な設定にする(装置をオンにし、電圧を2.5 kV、抵抗を100 Ωに設定する)。
4.エレクトロコンピテント黄色ブドウ球菌細胞のチューブを室温でさらに5分間インキュベートする。
5.微量遠心機の中で室温にて1分間かけて細胞をフルスピードでペレットにする。
6.P200ピペットを用い、ペレットにされた細胞から上清を取り出す。細胞ペレットを乱してはならない。ピペットを軽く上下させることによって細胞を100~150 μLの冷たい500 mMの減菌スクロースの中に再懸濁させる。塊が見つかった場合には確実に破砕する。
7.濃縮されたpIMAYzプラスミドを5 μLまで細胞懸濁液に添加する。
8.細胞とプラスミドの懸濁液を2 mMのギャップ電気穿孔キュベットに移す。細胞/プラスミド懸濁液がすべて確実にキュベットの底に行くようにして底全体に広げ、泡が細胞懸濁液の表面に存在しないようにする。
9.細胞とプラスミド懸濁液をキュベットの中で室温にて少なくとも1分間休ませる。
10.1 mLのSAリカバリー培地(B2培地)をP1000ピペットにあらかじめ満たし、ほぼ無菌で保管する。
11.電気穿孔装置のホルダの中にキュベットを置き、この装置から低いビープ音が聞こえるまで2つの赤いボタンを同時に押し続け、その後離す。
a.キュベットからの大きな跳ね返りまたは大きな飛沫が存在する場合には、バイオハザードの中のキュベットと細胞を廃棄し、反応を再度試みる(あらかじめ満たしたSAリカバリーバッファも廃棄する)。
b.跳ね返りまたは飛沫が存在しない場合には、あらかじめ満たしたSAリカバリーバッファをキュベット内の細胞に素早く添加し、ピペットを2回上下させることによって混合した後、殺菌した15 mLの培養チューブにできるだけ多く移す。
c.回復しつつある細胞を室温のシェイカーの中で240 rpmにて40分間インキュベートする。
d.室温で40分間震盪して回復させた後、回復しつつある細胞の培養チューブを37℃の震盪培養器にさらに30分間入れる。
e.その37℃のシェイカーの中で30分間インキュベートした後、細胞のアリコートをあらかじめ温めておいたBHI(chlor 10/X-gal 100)寒天プレートに播種する。50~200 μLをあらかじめ温めておいた37℃のプレートに、150 μLを30℃のプレートに播種する。(プレートに適切なラベルが付けられていることを確認する(株、プラスミドの名称、日付、温度、播種した体積)。
12.30℃のプレートを48時間までインキュベートし、37℃のプレートを24時間までインキュベートする。コロニーは、37℃では約16~18時間、30℃では30時間で目視でき始めるはずである。
a.培養器が37℃以上に設定されていることを確認し、プレートを単層で培養器の最も上の棚に載せてできるだけ早く37℃になるようにする。プレートがすべて十分に37℃になると、培養器内の保存室に積み重ねることができる。
13.その日に使用するすべての作業空間と道具をクリーンにして殺菌する。
一次交差選択
1.青色コロニーが37℃のプレートの表面に形成された場合、このセクションの工程2に飛ぶ。青色コロニーが37℃のプレートの表面に形成されなかった場合、コロニーをバイオハザードの中に入れ、30℃のプレートをチェックする。30℃のプレート上に青色コロニーが存在している場合には、1aに進む:
a.3つのBHI(chlor 10/X-gal 100)寒天プレートを37℃のプレート培養器の中に入れ、約1時間温める。
b.形質転換ごとに6つの1.5 mLの殺菌チューブを900 μLの減菌PBS、減菌TSB、または減菌BHIであらかじめ満たす。
c.1~4個の青色コロニーを30℃のプレートから取り上げ、前工程からのチューブの1つの中にボルテックスすることにより十分に再懸濁させる。
d.工程1.b.からの別のチューブに100 μLの細胞懸濁液を移し、少なくとも3回パルス撹拌して細胞を混合することにより、細胞懸濁液の段階希釈を実施する。
i.10-5の希釈(さらに4回の移動)がなされるまで工程1.dを繰り返す。
e.あらかじめ温めておいたプレートに適切なラベルを付け(株とプラスミドの名称、日付、一次交差、希釈)、100 μLの10-3~10-5希釈液をプレートに分配し、殺菌ビーズまたはスプレッダを用いて広げる。
f.プレートを37℃で16~24時間インキュベートする。
2.相同アームの外側かつプラスミド骨格の内側に結合するプライマーのペアを用いて青色コロニーをスクリーニングする(スクリーニングされるコロニー1つにつき2つの反応)。相同アームの外側でgDNAに結合するプライマーは、どのプライマーが最も近いTmを持っていてもDR_116、DR_116’、またはDR_117のいずれかとペアになるはずである。スクリーニングしたサンプル1つにつきプライマーの組み合わせの1つ(1つだけ)からバンドが得られると、プラスミドがゲノム内の適切な位置に組み込まれたことが確認される(バンドなし=組み込みなし、2つのバンド=問題発生)。
a.50 μLの新たに調製したSA溶解バッファ(6 μL proK/1mLのSAバッファ)の中でSA溶解を実施する。
i.1つのSOP_033についてスクリーニングされるコロニーの数にとって十分な体積のSA溶解溶液を調製する。
ii.使い捨ての殺菌接種針を用いてコロニーを取り上げ、新たなBHI(chlor/x-gal)プレートにパッチ塗布し、残った細胞塊をPCRチューブの中でのSA溶解反応に用いる。プレートを37℃で6~24時間インキュベートする。
iii.サーマルサイクラーを使用し、SA溶解プロトコルを利用して溶解させる。
iv.サーマルサイクラーSA溶解プログラムが終了したとき、チューブがまだ温かい場合には冷却し、ミニ微量遠心機の中でチューブをPCRチューブインサートとともに短時間回転させることによってチューブの中の細胞残屑をペレットにする。
b.Econotaqを用いてPCRによってインサートをスクリーニングする。
i.20 μLの全反応体積。
ii.鋳型のための2 μLのSA細胞溶解。
c.PCR産物の1%アガロースゲル電気泳動を実施する。
オプションの工程:Econotaqの中の鋳型とプライマーのペアDR_116/DR_117のための同じSA溶解を利用したPCRにより青色コロニーをスクリーニングし、環状プラスミドの存在を探す。37℃のプレートはいかなるバンドも生じさせないはずである。なぜならプラスミドは宿主に組み込まれたからである。DR_116/DR_117はpIMAYzの中の複数のクローニング部位に隣接しており、30℃のプレートでは、相同アーム+組み込まれる任意の領域と同じサイズを生成させるであろう
3.コロニーをスクリーニングして組み込まれたプラスミドを探している間にアガロースゲルがバンドを示す場合には、パッチ塗布プレートから陽性PCRバンドを持つ3つの異なるコロニーを取り上げる。室温のシェイカー内の5 mLのBHIブロスの中で一晩(約16時間)増殖させる。
4.翌日、(上記の一次交差の工程1に記載されているように)培養物をPBSの中で10-6まで段階希釈し、100 μLの10-4~10-6希釈液をBHI(ATc 1 μg/mL、X-Gal 100 μg/mL)寒天に播種し、プレートを37℃で一晩(16~24時間)インキュベートする。
二次交差選択
5.翌日、白色のコロニーを目視できる場合には、3つのプレートを37℃の培養器の中に1時間入れて温める:(1)BHI寒天(無水Tet 1μg/mL、X-Gal 100μg/mL)寒天プレート、(1)BHI(chlor 10μg/mL、X-Gal 100μg/mL)寒天プレート、(1)BHIまたはTSB寒天プレート。
6.グリッドスティッカーをプレートの裏側に取り付け、プレートに適切なラベルを付け(培地+添加物、株の名称、二次交差、日付)、あらかじめ温めておいたプレートに50個の白色のコロニーをパッチ塗布する。
a.プレートへのパッチ塗布の順番は以下のようにすべきである
i.BHI(ATc/x-gal)
ii.BHI(chlor/x-gal)
iii.BHI/TSB
b.可能な場合には播種された各培養物から同数のコロニーを採取する。
c.すべてのプレートを37℃で14~24時間インキュベートする
7.コロニーをATCに対する耐性(増殖)とクロラムフェニコールに対する感受性(増殖なし)に関してスクリーニングする。グリッド上でその基準を満たさないあらゆるコロニーを除去する。
8.BHIまたはTSB寒天プレートから取り上げ、ATcプレート上で増殖を示すがクロラムフェニコールプレート上では増殖を示さない少なくとも16個のパッチについて50 μLの新たに調製したSA溶解バッファ(6μLのproK/1mLのSAバッファ)の中でSA溶解を実行する。SA溶解プロトコルに従って細胞残屑を沈降させた後、反応物を次の工程でPCRのための鋳型として用いる。
9.前工程からのSA溶解物をPCRによってスクリーニングして望む遺伝子型を探す。(挿入されたDNAの内側の、または削除された配列を横断する)新しい遺伝子型内の独自の領域に結合する1つのプライマーを用いると、他方のプライマーは相同アームの外側でゲノムまたは標的DNAに結合するであろう。
a.Econotaqを用いたPCRスクリーン。
i.20 μLの全反応体積。
ii.鋳型としての2 μLのSA細胞溶解物。
b.PCR産物の1%アガロースゲル電気泳動を実施する。
10.PCRスクリーンからの陽性バンドが見られる場合には、株をシークエンシングして新しい株の正確な配列を確認せねばならない。以前のPCR反応と同じSA溶解鋳型を使用し、high fidelity PCRマスターミックスと、ゲノムに相同アームの外側で結合するプライマーのペアを用いて、PCRで改変された領域全体と相同アームを増幅する。
a.Q5 Hot-Start High Fidelity(またはPhusion)DNAポリメラーゼ。
i.50 uLの全反応体積。
ii.5 μLまでのSA細胞溶解を鋳型として用いる(以前に2 μLでうまく行った場合には2 μLを使用する)。
b.PCR産物の1%アガロースゲル電気泳動を実施し、トランスイルミネータで見る。
i.バンドが良好に見え、そのレーンが他の点ではクリーンである場合には、PCR精製キットを製造者の指示に従って用いてPCR産物を精製する。50 μLの分子生物学グレードの水を用いて溶離させる。
ii.非特異的バンドまたは他の汚染物がアガロースゲル上に見られる場合には、より最適化された条件を用いてPCRを繰り返すか、ゲル精製キットを製造者の指示に従って用いてアガロースゲルからDNAを精製する。
c.精製されたPCR産物のサンガーシークエンシングを実施し、少なくとも2×カバレッジのPCR断片全体が得られるようにする。
11.最後のPCRスクリーンにおいてSA溶解のために使用した同じBHIまたはTSBプレートからシークエンシングした各株について、BHIまたはTSBプレートの上の単一コロニーを単離するためプレートに画線塗布し、37℃で一晩インキュベートする。
12.シークエンシング反応が終わり、配列がeメールで戻されたとき、.ab1ファイルをダウンロードし、それをBenchlingの中の参照配列にアラインメントさせて望む標的DNA改変を探す。
13.シークエンシングのアラインメントが正しい配列で戻ってきた場合には、最良のクローンのうちの少なくとも3つのコロニーを取り上げ、PCRスクリーンによって遺伝子型を確認する(上記の工程9でしたのとまったく同様に)。1つのプライマーが新たな遺伝子型の中の独自の領域に結合するはずであり、他方のプライマーは相同アームの外側に結合するはずである。
a.1%アガロースゲル電気泳動を実施したときにすべてのPCRが陽性バンド示す場合には、画線塗布プレートからの単一コロニーを用いて株ストックを生成させる。
b.すべてのPCRが陽性でない場合には、プレートに再び画線塗布し、PCRを再度試みる。
14.その日に使用するすべての作業空間と道具をクリーンにして殺菌する。
株をストックする
1.スクリーニングを通じて新たな株を確認し、最終コロニーをスクリーニングした後、その株に株データベースの中の数と説明を与える。
a.株ごとに3つのクライオラベルを作ってプリントアウトする。
b.株の数、遺伝子型、およびストックした日付をラベルに含める。
2.安全キャビネットの中で、PCR(上記の工程13)によって確認した単一コロニーをプレートから取り上げて5 mLの減菌BHIを接種する。
3.震盪培養器の中で37℃にて240 rpmで一晩(12~20時間)インキュベートする。
4.翌朝、シェイカーから培養物を取り出して安全キャビネットの中に入れる。
a.750 ulの減菌50%グリセロールをあらかじめ満たした3つのクライオバイアルに適切な説明を書いたラベルを付ける。
b.P1000ピペットを使用して750 uLの培養物をクライオバイアルに移す。移すごとに新たなピペットチップを用いて残りのクライオバイアルに移す工程を繰り返す。
c.キャップがしっかりと取り付けられていることを確認した後、チューブを少なくとも10回ボルテックスするか反転させて細胞とグリセロールを均一に混合する。
d.-80℃の冷凍庫の中にある以下の箱それぞれの中に1つのクライオバイアルチューブを保管する:
i.株データベース
ii.バックアップ株データベース
iii.CUバックアップ株データベース
プラスミド調製
1日目(PM)- 非常に濃縮されたpIMAYz組み込みプラスミド(200 ng超/uL)を調製する。
1.安全キャビネットの表面を70%アルコールで完全にクリーンにする。
2.安全キャビネットの中で、50 mLの殺菌セロロジカルピペットを用いて50 mLのLB培地を殺菌した250 mLのバッフル付き震盪フラスコに添加する。
3.100 uLのクロラムフェニコールを添加する(10 mg/mLの貯蔵溶液)。
4.殺菌接種ループを使用し、望むpIMAYzプラスミドを有する大腸菌株の新鮮な画線塗布プレート(5日齢未満)からコロニーをLB chlor 20培地の中に移す。
5.接種された培養フラスコを240 rpmで震盪し、37℃で一晩インキュベートする(12~18時間)。
6.その日使用したあらゆる作業空間と道具をクリーンにして殺菌する。
2日目
1.同体積の一晩培養物を2つの50 mLの円錐形チューブに移す。
2.卓上遠心機の中で固定角ロータを用いて円錐形チューブを室温にて7500×gで4分間回転させる。
3.両方のチューブから注意深く上清を捨て、細胞ペレットを乱さない。
4. 6 mLの分子グレードの水をチューブの1つに添加し、ボルテックスミキサーを用いてペレットを再懸濁させる。
5.十分に再懸濁させたペレットを第2のチューブに移し、ボルテックスして第2のペレットを再懸濁させる。
6.600 μLをZyppyプラスミドMiniprepキット(Zymo)からの10個のカラムに添加する。
7.プラスミドの抽出を製造者の指示に従って実施する。
a.30 uLの温かいZyppy溶離液バッファ(Zymo)を用いて溶離させる。
8.溶離液をプールし、混合し、抽出されたプラスミドDNAの濃度をNanodropを用いて求める。
9.抽出されたプラスミドをDNA Clean & Concentrator - 25(Zymo)を用いて濃縮する。
a.プラスミドの濃度に基づいて必要なチューブの数を計算する(それぞれのチューブは25 ugのDNAを保持することができる)。
b.プラスミドの濃度を製造者の指示に従って求める。
c.複数のチューブが必要とされる場合には、25 uLの分子グレードの水を用いて殺菌微量遠心チューブの中に溶離させ、溶離液をプールする。チューブが1つだけ必要とされる場合には、40 uLの分子生物学グレードの水を用いて溶離させる。イニシャルと日付を微量遠心チューブに記す。
d.クリーンにして濃縮したプラスミドの濃度をNanodropを用いて求める。
e.微量遠心チューブの側の濃度を記録する。
f.別の1.5 mLの微量遠心チューブに50 ng/μLのプラスミド溶液50 μLを入れて-20℃の冷凍庫にストックする。
g.残っているプラスミドは、ただちに形質転換に用いるか、4℃で短期間(2日間)または-20℃で長期保管することができる。複数回の凍結/解凍サイクルでプラスミドは時間経過とともに分解するであろう。
10.その日使用したあらゆる作業空間と道具をクリーンにして殺菌する。
黄色ブドウ球菌の形質転換
1.少量の砕いた氷をアイスバケットに添加する。エレクトロコンピテント黄色ブドウ球菌細胞の凍結アリコートを-80℃の冷凍庫から取り出し、氷の上で少なくとも10分間インキュベートする。
2.形質転換ごとに4つのBHI(chlor 10/X-gal 100)寒天プレートを37℃のプレート培養器に入れ、1つのBHI(chlor 10/X-gal 100)寒天プレートを30℃のプレート培養器に入れて、適切な温度に温め始める。
3.電気穿孔装置を適切な設定にする(装置をオンにし、電圧を2.5 kV、抵抗を100 Ωに設定する)。
4.エレクトロコンピテント黄色ブドウ球菌細胞のチューブを室温でさらに5分間インキュベートする。
5.微量遠心機の中で室温にて1分間かけて細胞をフルスピードでペレットにする。
6.P200ピペットを用い、ペレットにされた細胞から上清を取り出す。細胞ペレットを乱してはならない。ピペットを軽く上下させることによって細胞を100~150 μLの冷たい500 mMの減菌スクロースの中に再懸濁させる。塊が見つかった場合には確実に破砕する。
7.濃縮されたpIMAYzプラスミドを5 μLまで細胞懸濁液に添加する。
8.細胞とプラスミドの懸濁液を2 mMのギャップ電気穿孔キュベットに移す。細胞/プラスミド懸濁液がすべて確実にキュベットの底に行くようにして底全体に広げ、泡が細胞懸濁液の表面に存在しないようにする。
9.細胞とプラスミド懸濁液をキュベットの中で室温にて少なくとも1分間休ませる。
10.1 mLのSAリカバリー培地(B2培地)をP1000ピペットにあらかじめ満たし、ほぼ無菌で保管する。
11.電気穿孔装置のホルダの中にキュベットを置き、この装置から低いビープ音が聞こえるまで2つの赤いボタンを同時に押し続け、その後離す。
a.キュベットからの大きな跳ね返りまたは大きな飛沫が存在する場合には、バイオハザードの中のキュベットと細胞を廃棄し、反応を再度試みる(あらかじめ満たしたSAリカバリーバッファも廃棄する)。
b.跳ね返りまたは飛沫が存在しない場合には、あらかじめ満たしたSAリカバリーバッファをキュベット内の細胞に素早く添加し、ピペットを2回上下させることによって混合した後、殺菌した15 mLの培養チューブにできるだけ多く移す。
c.回復しつつある細胞を室温のシェイカーの中で240 rpmにて40分間インキュベートする。
d.室温で40分間震盪して回復させた後、回復しつつある細胞の培養チューブを37℃の震盪培養器にさらに30分間入れる。
e.その37℃のシェイカーの中で30分間インキュベートした後、細胞のアリコートをあらかじめ温めておいたBHI(chlor 10/X-gal 100)寒天プレートに播種する。50~200 μLをあらかじめ温めておいた37℃のプレートに、150 μLを30℃のプレートに播種する。(プレートに適切なラベルが付けられていることを確認する(株、プラスミドの名称、日付、温度、播種した体積)。
12.30℃のプレートを48時間までインキュベートし、37℃のプレートを24時間までインキュベートする。コロニーは、37℃では約16~18時間、30℃では30時間で目視でき始めるはずである。
a.培養器が37℃以上に設定されていることを確認し、プレートを単層で培養器の最も上の棚に載せてできるだけ早く37℃になるようにする。プレートがすべて十分に37℃になると、培養器内の保存室に積み重ねることができる。
13.その日に使用するすべての作業空間と道具をクリーンにして殺菌する。
一次交差選択
1.青色コロニーが37℃のプレートの表面に形成された場合、このセクションの工程2に飛ぶ。青色コロニーが37℃のプレートの表面に形成されなかった場合、コロニーをバイオハザードの中に入れ、30℃のプレートをチェックする。30℃のプレート上に青色コロニーが存在している場合には、1aに進む:
a.3つのBHI(chlor 10/X-gal 100)寒天プレートを37℃のプレート培養器の中に入れ、約1時間温める。
b.形質転換ごとに6つの1.5 mLの殺菌チューブを900 μLの減菌PBS、減菌TSB、または減菌BHIであらかじめ満たす。
c.1~4個の青色コロニーを30℃のプレートから取り上げ、前工程からのチューブの1つの中にボルテックスすることにより十分に再懸濁させる。
d.工程1.b.からの別のチューブに100 μLの細胞懸濁液を移し、少なくとも3回パルス撹拌して細胞を混合することにより、細胞懸濁液の段階希釈を実施する。
i.10-5の希釈(さらに4回の移動)がなされるまで工程1.dを繰り返す。
e.あらかじめ温めておいたプレートに適切なラベルを付け(株とプラスミドの名称、日付、一次交差、希釈)、100 μLの10-3~10-5希釈液をプレートに分配し、殺菌ビーズまたはスプレッダを用いて広げる。
f.プレートを37℃で16~24時間インキュベートする。
2.相同アームの外側かつプラスミド骨格の内側に結合するプライマーのペアを用いて青色コロニーをスクリーニングする(スクリーニングされるコロニー1つにつき2つの反応)。相同アームの外側でgDNAに結合するプライマーは、どのプライマーが最も近いTmを持っていてもDR_116、DR_116’、またはDR_117のいずれかとペアになるはずである。スクリーニングしたサンプル1つにつきプライマーの組み合わせの1つ(1つだけ)からバンドが得られると、プラスミドがゲノム内の適切な位置に組み込まれたことが確認される(バンドなし=組み込みなし、2つのバンド=問題発生)。
a.50 μLの新たに調製したSA溶解バッファ(6 μL proK/1mLのSAバッファ)の中でSA溶解を実施する。
i.1つのSOP_033についてスクリーニングされるコロニーの数にとって十分な体積のSA溶解溶液を調製する。
ii.使い捨ての殺菌接種針を用いてコロニーを取り上げ、新たなBHI(chlor/x-gal)プレートにパッチ塗布し、残った細胞塊をPCRチューブの中でのSA溶解反応に用いる。プレートを37℃で6~24時間インキュベートする。
iii.サーマルサイクラーを使用し、SA溶解プロトコルを利用して溶解させる。
iv.サーマルサイクラーSA溶解プログラムが終了したとき、チューブがまだ温かい場合には冷却し、ミニ微量遠心機の中でチューブをPCRチューブインサートとともに短時間回転させることによってチューブの中の細胞残屑をペレットにする。
b.Econotaqを用いてPCRによってインサートをスクリーニングする。
i.20 μLの全反応体積。
ii.鋳型のための2 μLのSA細胞溶解。
c.PCR産物の1%アガロースゲル電気泳動を実施する。
オプションの工程:Econotaqの中の鋳型とプライマーのペアDR_116/DR_117のための同じSA溶解を利用したPCRにより青色コロニーをスクリーニングし、環状プラスミドの存在を探す。37℃のプレートはいかなるバンドも生じさせないはずである。なぜならプラスミドは宿主に組み込まれたからである。DR_116/DR_117はpIMAYzの中の複数のクローニング部位に隣接しており、30℃のプレートでは、相同アーム+組み込まれる任意の領域と同じサイズを生成させるであろう
3.コロニーをスクリーニングして組み込まれたプラスミドを探している間にアガロースゲルがバンドを示す場合には、パッチ塗布プレートから陽性PCRバンドを持つ3つの異なるコロニーを取り上げる。室温のシェイカー内の5 mLのBHIブロスの中で一晩(約16時間)増殖させる。
4.翌日、(上記の一次交差の工程1に記載されているように)培養物をPBSの中で10-6まで段階希釈し、100 μLの10-4~10-6希釈液をBHI(ATc 1 μg/mL、X-Gal 100 μg/mL)寒天に播種し、プレートを37℃で一晩(16~24時間)インキュベートする。
二次交差選択
5.翌日、白色のコロニーを目視できる場合には、3つのプレートを37℃の培養器の中に1時間入れて温める:(1)BHI寒天(無水Tet 1μg/mL、X-Gal 100μg/mL)寒天プレート、(1)BHI(chlor 10μg/mL、X-Gal 100μg/mL)寒天プレート、(1)BHIまたはTSB寒天プレート。
6.グリッドスティッカーをプレートの裏側に取り付け、プレートに適切なラベルを付け(培地+添加物、株の名称、二次交差、日付)、あらかじめ温めておいたプレートに50個の白色のコロニーをパッチ塗布する。
a.プレートへのパッチ塗布の順番は以下のようにすべきである
i.BHI(ATc/x-gal)
ii.BHI(chlor/x-gal)
iii.BHI/TSB
b.可能な場合には播種された各培養物から同数のコロニーを採取する。
c.すべてのプレートを37℃で14~24時間インキュベートする
7.コロニーをATCに対する耐性(増殖)とクロラムフェニコールに対する感受性(増殖なし)に関してスクリーニングする。グリッド上でその基準を満たさないあらゆるコロニーを除去する。
8.BHIまたはTSB寒天プレートから取り上げ、ATcプレート上で増殖を示すがクロラムフェニコールプレート上では増殖を示さない少なくとも16個のパッチについて50 μLの新たに調製したSA溶解バッファ(6μLのproK/1mLのSAバッファ)の中でSA溶解を実行する。SA溶解プロトコルに従って細胞残屑を沈降させた後、反応物を次の工程でPCRのための鋳型として用いる。
9.前工程からのSA溶解物をPCRによってスクリーニングして望む遺伝子型を探す。(挿入されたDNAの内側の、または削除された配列を横断する)新しい遺伝子型内の独自の領域に結合する1つのプライマーを用いると、他方のプライマーは相同アームの外側でゲノムまたは標的DNAに結合するであろう。
a.Econotaqを用いたPCRスクリーン。
i.20 μLの全反応体積。
ii.鋳型としての2 μLのSA細胞溶解物。
b.PCR産物の1%アガロースゲル電気泳動を実施する。
10.PCRスクリーンからの陽性バンドが見られる場合には、株をシークエンシングして新しい株の正確な配列を確認せねばならない。以前のPCR反応と同じSA溶解鋳型を使用し、high fidelity PCRマスターミックスと、ゲノムに相同アームの外側で結合するプライマーのペアを用いて、PCRで改変された領域全体と相同アームを増幅する。
a.Q5 Hot-Start High Fidelity(またはPhusion)DNAポリメラーゼ。
i.50 uLの全反応体積。
ii.5 μLまでのSA細胞溶解を鋳型として用いる(以前に2 μLでうまく行った場合には2 μLを使用する)。
b.PCR産物の1%アガロースゲル電気泳動を実施し、トランスイルミネータで見る。
i.バンドが良好に見え、そのレーンが他の点ではクリーンである場合には、PCR精製キットを製造者の指示に従って用いてPCR産物を精製する。50 μLの分子生物学グレードの水を用いて溶離させる。
ii.非特異的バンドまたは他の汚染物がアガロースゲル上に見られる場合には、より最適化された条件を用いてPCRを繰り返すか、ゲル精製キットを製造者の指示に従って用いてアガロースゲルからDNAを精製する。
c.精製されたPCR産物のサンガーシークエンシングを実施し、少なくとも2×カバレッジのPCR断片全体が得られるようにする。
11.最後のPCRスクリーンにおいてSA溶解のために使用した同じBHIまたはTSBプレートからシークエンシングした各株について、BHIまたはTSBプレートの上の単一コロニーを単離するためプレートに画線塗布し、37℃で一晩インキュベートする。
12.シークエンシング反応が終わり、配列がeメールで戻されたとき、.ab1ファイルをダウンロードし、それをBenchlingの中の参照配列にアラインメントさせて望む標的DNA改変を探す。
13.シークエンシングのアラインメントが正しい配列で戻ってきた場合には、最良のクローンのうちの少なくとも3つのコロニーを取り上げ、PCRスクリーンによって遺伝子型を確認する(上記の工程9でしたのとまったく同様に)。1つのプライマーが新たな遺伝子型の中の独自の領域に結合するはずであり、他方のプライマーは相同アームの外側に結合するはずである。
a.1%アガロースゲル電気泳動を実施したときにすべてのPCRが陽性バンド示す場合には、画線塗布プレートからの単一コロニーを用いて株ストックを生成させる。
b.すべてのPCRが陽性でない場合には、プレートに再び画線塗布し、PCRを再度試みる。
14.その日に使用するすべての作業空間と道具をクリーンにして殺菌する。
株をストックする
1.スクリーニングを通じて新たな株を確認し、最終コロニーをスクリーニングした後、その株に株データベースの中の数と説明を与える。
a.株ごとに3つのクライオラベルを作ってプリントアウトする。
b.株の数、遺伝子型、およびストックした日付をラベルに含める。
2.安全キャビネットの中で、PCR(上記の工程13)によって確認した単一コロニーをプレートから取り上げて5 mLの減菌BHIを接種する。
3.震盪培養器の中で37℃にて240 rpmで一晩(12~20時間)インキュベートする。
4.翌朝、シェイカーから培養物を取り出して安全キャビネットの中に入れる。
a.750 ulの減菌50%グリセロールをあらかじめ満たした3つのクライオバイアルに適切な説明を書いたラベルを付ける。
b.P1000ピペットを使用して750 uLの培養物をクライオバイアルに移す。移すごとに新たなピペットチップを用いて残りのクライオバイアルに移す工程を繰り返す。
c.キャップがしっかりと取り付けられていることを確認した後、チューブを少なくとも10回ボルテックスするか反転させて細胞とグリセロールを均一に混合する。
d.-80℃の冷凍庫の中にある以下の箱それぞれの中に1つのクライオバイアルチューブを保管する:
i.株データベース
ii.バックアップ株データベース
iii.CUバックアップ株データベース
pIMAYzプラスミドにより、黄色ブドウ球菌のゲノムを効率的かつ信頼性よく編集することが可能になる。初期の形質転換は制限障壁とそれ以外の因子が原因で低収率である可能性があるが、プラスミドを適切に設計し、黄色ブドウ球菌株がそのプラスミドを取り込んでクロラムフェニコールに対する耐性を示す場合には、プロトコルに従う場合に望む遺伝子改変が生じる確率が大きい。表現型選択とゲノム選択により、時宜にかなっていて信頼できる結果が可能になる。
DNAを標的領域の外側で編集する相同組み換えは知られていないため、各改変をした後にゲノム全体をシークエンシングする必要はない。相同アームは、単一のDNA塩基を変化させること、遺伝子またはオペロンを削除すること、または単一の塩基から数万の範囲の塩基を挿入することを可能にするゲノム改変が可能になるように設計することができる。このプロセスを同じ株の中で複数回繰り返して反復的改変をすることができる。
実施例6A.レポータ遺伝子:GFPとmKATE2のピギーバック組み込み
実施例6A.レポータ遺伝子:GFPとmKATE2のピギーバック組み込み
この実施例では、黄色ブドウ球菌ゲノム内の2つの位置、すなわち(i)合成株BP_0152 isdB::GFPとBP_0158 isdB::mKATE 2を調製するには内在性isdB遺伝子の後ろ、および(ii)合成株BP_0151 PsbnA::GFPとBP_0157 PsbnA::mKATE2を調製するにはsbnA遺伝子のための内在性プロモータとsbnA遺伝子のための開始コドンの間を、WT黄色ブドウ球菌株BP_001に蛍光タンパク質をコードするレポータ遺伝子を組み込む標的とした。ゲノムにこれらを挿入するため、ゲノム改変を可能にするプラスミドを開発した。相同アームをpIMAYzプラスミド骨格に付加し、本明細書に提示されているプロトコルに従って相同組み換えを利用して遺伝子編集をした。
蛍光レポータ遺伝子は標的微生物である大腸菌またはレンサ球菌のゲノムに挿入することもできる。例えば細胞をヒト血清中で培養するときに上方調節される大腸菌内の遺伝子の文献検索に基づき、大腸菌の中にGFPとRFPを組み込むためのいくつかの位置を選択した。組み込みのために同定されたゲノム内の位置は、遺伝子ybjE、yncE、およびftnの直後である。Huja, Sagi, et al. MBio 5.4 (2014): e01460-14。緒言に記載されている技術を利用して大腸菌ゲノム内で同定された部位への蛍光タンパク質の組み込みが成功した後、操作された細胞の蛍光のレベルが、内部に組み込みがなされたオペロンの発現のレベルを計算するのに使用される。
ヒト血清に曝露したときに上方調節されるB群レンサ球菌(ストレプトコッカス・アガラクティエ)内の遺伝子を探す文献検索から、血液中での増殖に必要であるか、その環境で上方調節されているいくつかの遺伝子(例えばcpsAとIgA結合β抗原(SAK_0186))が示された。Hooven et al. 2018. Infect Immun 86:e00612-17
ストレプトコッカス・アガラクティエ緊縮応答は、ヒト血液において毒力とパーシスタンスを増強する。Infect Immun 86:e00612-17。親切にもHooven博士から提供されたpMBsacBプラスミドを用いた相同組み換えを通じ、GFP遺伝子とRFP遺伝子を、ヒト血清で必要であるか上方調節されていると上で同定された遺伝子のほか、ストレプトコッカス・アガラクティエのゲノム内の複数の他の遺伝子の直後に別々に組み込むことができる。
培養物の蛍光を、ヒト血清に曝露した後に完全培地(TSBなど)と比較して調べ、その環境における上方調節のレベルを評価した。
血清応答性レポータ遺伝子を有する候補コンストラクト株を設計し、サンガーシークエンシングによって遺伝子型を確認した。その株をヒト血清またはトリプティックソイブロス(TSB)の中で増殖させた。蛍光分光法による表現型分析のため、各増殖条件からの培養サンプルをあらかじめ決められた時点に採取した。サンプルをt=0時間、t=1時間、t=2時間、t=3時間、t=4時間の時点で採取し、ペレットにし、96ウエルのマイクロプレートにロードし、プレートリーダーを用いて蛍光分析を三連で実施した。BioTek Synergy IIプレートリーダーを、GFPについては:Ex λ=485/20、Em λ=530/25、感度=80の装置設定、mKATE2については:Ex λ=575/15、Em λ=645/40、感度=110の装置設定にして用い、蛍光測定値を得る。次いでコンストラクト株から得られた蛍光の読みを、検証された基準から作成した較正曲線と比較し、株/コンストラクトの蛍光出力を信頼性よく定量し、ランク付けした。
図10は、ヒト血清(点線)とTSB(実線)の中で4時間培養した後の黄色ブドウ球菌合成株BP_151(PsbnA::GFP)とBP_152(isdB::GFP)による血清誘導蛍光発生に関するGFPの濃度(ng/ウエル)を時間(時間)に対してプロットし、親株BP_001と比較したグラフを示す。培養物を上記のようにして調製し、堅固な黒色の96ウエルのマイクロプレートに200 uLを技術的三連でロードした。「ピギーバック」法を利用して、血清誘導性プロモータから下流に位置するGFPが両方の株に組み込まれた。BP_152は血清の中で培養したとき強い蛍光を示した。BP_151も血清の中で培養したとき蛍光の放出を示した。BP_001は野生型対照としてアッセイに含まれた - それは血清またはTSBの中で蛍光を示さなかった。同様に、BP_151とBP_152は、TSBの中で培養したとき蛍光を出さなかった。すべての株を調製し、生物学的三連で調べた。
図11は、ヒト血清(点線)とTSB(実線)の中でのBP_157(PsbnA::mKATE2)とBP_158(isdB::mKATE2)による血清応答性蛍光発生についてRFP mKATE2の濃度(ng/ウエル)を時間(時間)に対してプロットしたグラフを示す。BP_001(mKATE2を欠く)が野生型対象として含まれた。すべての株と条件を生物学的三連で調べ、以前に記載されているようにして準備した。サンプルはt=0、2、3、4、5、および7時間の時点で採取した。技術的三連を黒色の堅固な底を持つ96ウエルのプレートに播種した。BP_158は血清の中で増殖させたとき強い蛍光を示した。BP_0157は非常にわずかな蛍光を示した。株BP_001、BP_157、およびBP_158のそれぞれはTSBの中で蛍光を示さなかった。
実施例6B.合成黄色ブドウ球菌株BP_088の進化的安定性
実施例6B.合成黄色ブドウ球菌株BP_088の進化的安定性
この実施例では、本開示に従って調製した合成黄色ブドウ球菌株の安定性を500世代にわたって評価した。BP_088(isdB::sprA1)と親黄色ブドウ球菌株BP_001を、増殖中の培養物を新鮮な培地に250時間にわたって継代することによって推定で500世代にわたって増殖させた。500世代の増殖期間の前と後でBP_088はヒト血清中で同様に機能した。500世代の増殖期間中に組み込まれた殺傷スイッチ領域のDNA配列に変異は起こらなかった。
黄色ブドウ球菌はゲノムが変化しやすいことが知られており、ゲノムに持続性のある組み込みをする際のその障害が、常に、生物のゲノムを編集するときの懸念事項である。さらに、毒素遺伝子が関与するゲノム編集を、その編集を有する生物から「隠す」能力を、特に生きた生物学的製剤空間(LBP)において実証することが重要である。生物が、定着することが想定されたニッチを去って広がるという懸念がある場合には常に、このことは、遺伝子操作の多くの側面にとって意味がある。
黄色ブドウ球菌合成株BP_088のピギーバックゲノム改変に関する進化的安定性を、培養物を250時間にわたって指数増殖期で増殖させ続けることによって調べた。黄色ブドウ球菌は、リッチな複合培地で増殖させるときには1世代の時間が約30分であるため、250時間増殖させた後に株はほぼ500世代を経ているはずであると計算された。増殖中の培養物の維持は、チューブの中で増殖中の培養物を8~12時間ごとに新鮮な培地で希釈することによって実現し、その後、500世代の増殖期間の前と後の両方でヒト血清に対する株の応答を調べた。野生型黄色ブドウ球菌(BP_001)を、組み込まれたisdB::sprA1を含有する株(BP_088)とともに増殖させた。
pIMAYzプラスミドをそれぞれプラスミドp249およびp264とともに用いた相同組み換えを利用して株BP_001に組み込み、BP_088とBP_121を作製した。BP_001のゲノムの編集によるBP_088とBP_121の作製を、本明細書に提示されている相同組み換えプロトコルに従って実施した。
表10と11は、それぞれ、安定性アッセイで使用した株と、実施したゲノム編集のDNA配列を示す。
0世代のためのBP_088の培養物と、BP_001の培養物を、5 mLのTSBの中で画線塗布プレート上の単一コロニーから開始した。培養物を240 rpmで震盪しながら37℃の培養器の中で一晩増殖させた。翌朝、すべての培養物を240 rpmで震盪しながら37℃の培養器の中で一晩増殖させた。2時間後、細胞を5mLの減菌PBSで1回洗浄した後、5 mLのあらかじめ温めた血清とTSBに接種してOD 600を0.05にした。その直後、t=0のサンプルを採取し、培養物を培養器に戻し、段階希釈を実施して播種した。サンプルは、t=2、4、6、および8時間の時点でも採取した。500世代のためのBP_088の培養と(1)BP_121の培養を、5mLのTSBの中で画線塗布プレート上の単一コロニーから開始した。培養物を240 rpmで震盪しながら37℃の培養器の中で一晩増殖させた。翌朝、すべての培養物を0.05まで希釈し、240 rpmで震盪しながら37℃の培養器の中に入れた。2時間後、細胞を5mLの減菌PBSで1回洗浄した後、5 mLのあらかじめ温めた血清とTSBに接種してODを0.05にした。その直後、t=0のサンプルを採取し、培養物を培養器の中に戻し、段階希釈を実施して播種した。サンプルはt=2、4、および9.4時間の時点でも採取した。
図12は、ヒト血清(点線)またはTSB(実線)の中で増殖させたときの黄色ブドウ球菌合成株BP_088(0世代と500世代の株)の生きているCFU/mLの平均値(n=6)のグラフを示す。TSBと血清の中のBP_001(n=6)を野生型対照としてプロットした。誤差棒は、全部で6つのレプリケートの1標準偏差を表わす。BP_088の500世代サンプルを黒い四角で、0世代サンプルを(▲)で表わす。親株BP_001は黒い円で表わす。合成株BP_088は、ヒト血清に曝露されたとき0世代のBP_088比べて増殖できない状態が維持されたことから証明されるように、少なくとも500世代にわたって機能的安定性を示す。ヒト血清の中で2時間後、約500世代を経たBP_088はcfu/mLが約4桁の有意な低下を示した。
サンガーシークエンシング。0世代株と500世代株の画線塗布プレートのBP_088からisdB::sprA1インサートをPCRによって増幅し、シークエンシングのために送り出した。得られたシークエンシング結果をBP_088ゲノム地図にアラインメントした。遺伝子の差(フレームシフトまたは変異など)が、isdB::sprA1殺傷スイッチ領域に見られた。図13は、isdB遺伝子の後ろに組み込まれたsprA1殺傷スイッチに関する参照配列と、BP_088の0世代株と500世代株からのサンガーシークエンシングの結果のアラインメントを示す。最上部のDNA配列はBenchlingの中のDNA地図からの参照配列であり、中央の配列はBP_088の500世代株に由来し、下方の配列はBP_088の0世代株に由来する。アラインメントは、下部の2つの株が、互いに比較したとき、または最上部の参照配列と比較したとき、変異または変化を持たないことを示す。合成株BP_088は、サンガーシークエンシングの結果によって証明されるように、少なくとも500世代にわたってゲノム安定性を示す。isdB::sprA1組み込み領域で実施したサンガーシークエンシングから、シークエンシングされた領域でBP_088の0世代株と500世代株の間に遺伝子の差がないことが明らかになった。
BP_088の500世代株のゲノム全体の新たなシークエンシングも実施した。(データは示さない)。
この実施例は、BP_001のゲノムへのisdB::sprA1の組み込みがほぼ500世代後に安定であることを示す。これは、250時間にわたって連続的に増殖させたBP_088株を用いて実施した血清アッセイによって実証される。アッセイのデータを250時間の増殖を経ていないBP_088株と比較するとき、両方ともヒト血清中で同じ応答であった。BP_088株の両方とも(0世代株と500世代株)、4時間の間にヒト血清中で増殖できず、図12に示されているように生存CFU/mLはその出発濃度から104超低下した。
ピギーバック法で利用される最少ゲノム改変を用いて組み込まれた殺傷スイッチの少なくとも500世代を超える安定性は、その組み込みの進化的安定性を実証しようと試みる以前の刊行物のはるかに上を行く。Stirling, Finn, et al.「進化的に安定な微生物殺傷スイッチの合理的な設計」Molecular cell 68.4 (2017): 686-697。
実施例7.p262のための代表的なプラスミド構築
実施例7.p262のための代表的なプラスミド構築
この実施例では、代表的なプラスミドp262の調製を記述する。黄色ブドウ球菌の中のisdB遺伝子の直後にsprA1遺伝子を挿入することを狙って相同アームを設計した。具体的には、プラスミドp262を組み込みベクターとして用い、sprA1遺伝子と5'非翻訳領域内の上流24個の塩基(制御アーム)を黄色ブドウ球菌のゲノムのisdB遺伝子の後ろに挿入する。例えばピギーバック法によって合成株BP_118を調製するには、プラスミドp262を用いてisdB::sprA1を黄色ブドウ球菌ゲノムに組み込む。
プラスミドp262の骨格は、大腸菌と黄色ブドウ球菌/表皮ブドウ球菌株のためのシャトルベクターとしてIan Monkらによって設計されたpIMAYzであり、黄色ブドウ球菌株と表皮ブドウ球菌株の両方においてマーカーレス欠失をさせることができる。Monk, Ian R. et al.「主要な黄色ブドウ球菌系譜のための制限系の完全なバイパス」MBio 6.3 (2015): e00308-15;Monk, Ian R. et al.,「形質転換できないものを形質転換する:直接的形質転換を応用した黄色ブドウ球菌と表皮ブドウ球菌の遺伝子操作」MBio 3.2 (2012): e00277-11。
pIMAYzは黄色ブドウ球菌の中で温度感受性である。これは、pIMAYzが、細胞を30℃で増殖させるときには自己複製するが、温度37℃以上では複製することができないことを意味する。プラスミドが温度感受性の性質を持つことにより、相同組み換え技術を利用した宿主のゲノムの編集が可能になる。挿入または欠失の標的とされるDNA位置が隣接している相同なほぼ1000塩基対(1 kb)の領域(相同アーム)をプラスミド骨格に付加することにより、その後このプラスミドを用いて生体内でゲノムDNAまたはプラスミドDNAのマーカーレス編集をすることができる。
pIMAYzプラスミド上の多重クローニング部位において、本発明の発明者らは、黄色ブドウ球菌のゲノム内のisdB遺伝子の直後にsprA1断片を組み込むため、黄色ブドウ球菌株BP_001のゲノムDNAからPCRで増幅したsprA1毒素遺伝子と開始コドンの上流24個の塩基を相同アームに隣接して付加した。二重組み換えプロセスを通じてプラスミドは黄色ブドウ球菌のゲノムに完全に組み込まれ、その後それ自身は除去されてゲノム内のisdB遺伝子の後ろにsprA1断片を残すことができる。本発明の発明者らは、黄色ブドウ球菌からのsprA1遺伝子が、高コピープラスミド上で誘導されるときに黄色ブドウ球菌細胞にとって毒性であることを示した。血清と複合培地(TSB)の中で増殖させている間の黄色ブドウ球菌株BP_001のトランスクリプトームを分析することにより、isdB遺伝子は、TSB培地の中では転写産物のレベルが非常に低く、血清中では大きく上方調節されていることが示された。
黄色ブドウ球菌の中に血清誘導性殺傷スイッチを設けるため、sprA1発現の毒性を、黄色ブドウ球菌細胞の中の高度に調節されたisdB遺伝子と機能可能に関連させる。プラスミドp262を用いてこのゲノム組み込みを実現する。
材料と方法
表12は、プラスミドp262の構築またはシークエンシングの間に使用したプライマーの一本鎖DNA配列を示す。すべての配列が5'から3'の方向である。
表13は、p262の構築に使用した一本鎖DNA断片を示す。使用したすべての断片が二本鎖DNAであった。BP_DNA_003では、太字の配列は読み枠の一部であり、下線を引いた配列は制御アームである。
PCR断片生成
1.以下のPCR反応を、Q5 High Fidelity Hot Start 2Xマスターミックス(NEB)を製造者の指示に従って用いて実施した
1.1. BP_DNA_063 - pIMAYz骨格断片
1.1.1. DR_022/DR_023
1.2. BP_DNA_010 - 上流相同アーム
1.2.1. BP_948/BP_949
1.3. BP_DNA_003 - sprA1(挿入された配列)
1.3.1. BP_950/BP_951
1.4. BP_DNA_002 - 下流相同アーム
1.4.1. BP_952/DR_518
2.上記のPCR断片を1%アガロースゲル上でチェックして適切な長さのクリーンなバンドであることを確認した後、Qiaquick PCR精製キット(Qiagen)を製造者の指示に従って用いて精製した。
3.pIMAYz断片をDpnI(NEB)で処理してPCRのための鋳型として用いられるメチル化された環状プラスミドを除去し、Qiaquick PCR精製キット(Qiagen)を用いて再び精製した。
4.ギブソン・アセンブリ(NEB)で4つの断片を使用し、製造者の指示に従って環状プラスミドを作製した。
5.次いでReport_SOP030の中の形質転換プロトコルに従い、組み立てられたプラスミドでわれわれの大腸菌通過株IMO8Bを形質転換し、LB(chlor/X-gal)に播種し、37℃で一晩インキュベートした。
6.翌日、青色のコロニーをコロニーPCRによってスクリーニングして十分に組み立てられたプラスミドを探し、1%アガロースゲル上でチェックした。
6.1. DR_116’/DR_254をコロニーのスクリーニングに使用した。
7.3つの陽性コロニーが、Q5 Hot Start 2Xマスターミックス(NEB)を使用し、プラスミド骨格に結合して挿入領域全体を捕獲するプライマーDR_116’とDR_117を用いて実施するるhigh fidelity PCR反応のための鋳型として選択された。次いでPCRを1%アガロースゲルで正しいサイズとクリーンさに関してチェックした。次いでPCR産物をQiaquick PCR精製キット(Qiagen)を用いて精製し、シークエンシングのためQuintara Biosciencesに送り出した。
8.シークエンシング結果を、プラットフォーム上の分子生物学プラットフォームの中の配列アラインメントツールを利用してインシリコでアラインメントした。
8.1. Report_SOP028「株とプラスミドのストックの調製」の中のプロトコルに従って最適なアラインメントを示した1つの陽性コロニーを選択してプラスミドデータベースの中にストックした。
1.以下のPCR反応を、Q5 High Fidelity Hot Start 2Xマスターミックス(NEB)を製造者の指示に従って用いて実施した
1.1. BP_DNA_063 - pIMAYz骨格断片
1.1.1. DR_022/DR_023
1.2. BP_DNA_010 - 上流相同アーム
1.2.1. BP_948/BP_949
1.3. BP_DNA_003 - sprA1(挿入された配列)
1.3.1. BP_950/BP_951
1.4. BP_DNA_002 - 下流相同アーム
1.4.1. BP_952/DR_518
2.上記のPCR断片を1%アガロースゲル上でチェックして適切な長さのクリーンなバンドであることを確認した後、Qiaquick PCR精製キット(Qiagen)を製造者の指示に従って用いて精製した。
3.pIMAYz断片をDpnI(NEB)で処理してPCRのための鋳型として用いられるメチル化された環状プラスミドを除去し、Qiaquick PCR精製キット(Qiagen)を用いて再び精製した。
4.ギブソン・アセンブリ(NEB)で4つの断片を使用し、製造者の指示に従って環状プラスミドを作製した。
5.次いでReport_SOP030の中の形質転換プロトコルに従い、組み立てられたプラスミドでわれわれの大腸菌通過株IMO8Bを形質転換し、LB(chlor/X-gal)に播種し、37℃で一晩インキュベートした。
6.翌日、青色のコロニーをコロニーPCRによってスクリーニングして十分に組み立てられたプラスミドを探し、1%アガロースゲル上でチェックした。
6.1. DR_116’/DR_254をコロニーのスクリーニングに使用した。
7.3つの陽性コロニーが、Q5 Hot Start 2Xマスターミックス(NEB)を使用し、プラスミド骨格に結合して挿入領域全体を捕獲するプライマーDR_116’とDR_117を用いて実施するるhigh fidelity PCR反応のための鋳型として選択された。次いでPCRを1%アガロースゲルで正しいサイズとクリーンさに関してチェックした。次いでPCR産物をQiaquick PCR精製キット(Qiagen)を用いて精製し、シークエンシングのためQuintara Biosciencesに送り出した。
8.シークエンシング結果を、プラットフォーム上の分子生物学プラットフォームの中の配列アラインメントツールを利用してインシリコでアラインメントした。
8.1. Report_SOP028「株とプラスミドのストックの調製」の中のプロトコルに従って最適なアラインメントを示した1つの陽性コロニーを選択してプラスミドデータベースの中にストックした。
結果
すべてのPCR断片を株BP_001の粗ゲノム調製物からうまく増幅することができた。それらを組み立てて環状プラスミドにし、それを用いてIMO8Bを形質転換した後、いくつかのコロニーをスクリーニングすると、プラスミドが望む断片をすべて含有することが示された。
シークエンシングの結果は変異を示さなかった。配列とアラインメントのデータをBioPlxのBenchlingアカウントに保管する。図14は、Benchlingプログラムで作成されたp262プラスミドの地図を示す。プラスミドは、isdB相同アームが隣接したsprA1遺伝子断片が組み込まれたpIMAYz骨格を特徴とする。
isdB相同アームとsprA1遺伝子を黄色ブドウ球菌gDNA(BP_001)からPCRで増幅した後、pIMAYz骨格に入れて複数のクローニング部位において組み立てた。こうすることで、p262を用いて黄色ブドウ球菌株のisdB遺伝子の直後(ゲノムのその領域ではBP_001株と遺伝子が似ている)にsprA1遺伝子のマーカーレス挿入をすることが可能になる。プラスミドの遺伝子型をスクリーニングによって確認するのに成功した。構成されたプラスミドのサンガーシークエンシングは、相同アームまたはsprA1領域の中に欠失がないことを示した。プラスミドをp262(pIMAYz_isdB::sprA1)と名づける。
表7に示されているように、他のいくつかのプラスミドを、pIMAYz骨格を用いて同様に構成した。
実施例8.血清応答性プロモータをゲノム発現させるためのqRT PCR
実施例8.血清応答性プロモータをゲノム発現させるためのqRT PCR
この報告では、文献で血液および/または血清応答性であることが見いだされている20個または23個の黄色ブドウ球菌遺伝子についてqRT PCRを実施する。簡単に述べると、502a(BP_0001)細胞をTSB培地、血液、または血清の中で増殖させ、RNAをさまざまな時点で抽出した。結果は、血液または血清の中で上方調節されているいくつかの遺伝子を示している。
mRNAのレベルによって遺伝子発現を調べる手続きは、全RNAを抽出し、残ったDNAを除去し、一本鎖mRNAを二本鎖DNA(相補的DNA、またはcDNA)に変換することを含む。cDNAへのこの変換の間、同じ実験からのRNAサンプルは一般に同じ濃度に規格化するため、各cDNAサンプルは同量のRNAから生成される。
502aグリセロールのストックを新鮮な細菌プレートに播種し、一晩増殖させた。プレートからの3~5個の単一コロニーをの4 mlのBHI培地培養物に接種し、240 rpmで震盪させながら37℃で一晩増殖させた。午前中に培養物を5 mlの新鮮なBHI培地の中で希釈して光学密度(OD)を0.05にした。細胞を150 rpmで震盪させながら37℃で数時間増殖させ、ODを約1にした。この時点で、T=0の時点のRNAを探すサンプルを回収した(1 mlを1.5 mlのマイクロ遠心分離チューブに移し、16,000 rpmで1分間遠心分離し、上清を除去し、細胞を1 mlの減菌PBSの中に再懸濁させ、16,000 rpmで1分間遠心分離し、上清を吸引し、細胞を200 ulのRNALaterの中に再懸濁させ、-20℃で保管した)。残った培養物を三連のヘパリン処理チューブ内の10mlの新鮮なBHI培地または解凍したヒト血清の中で再度希釈してODを0.05にし、150 rpmで震盪させながら37℃でインキュベートした。RNAを探す追加サンプルをT=90分とT=180分の時点で回収した。これらの後期サンプルについて、1つの10 mlのチューブを3,000 rpmで10分間遠心分離し、上清を除去し、細胞を1mlのPBSの中に再懸濁させ、1.5 mlのマイクロ遠心分離チューブに移し、16,000 rpmで1分間遠心分離し、上清を吸引し、細胞を200ulのRNALaterの中に再懸濁させ、-20℃で保管した。
qPCRサンプルの処置とデータ分析を以下のようにして実施した。RNAの抽出とcDNAの合成を18年10月8日に実施した。RNALaterの中に保管した凍結したRNAペレットをPBSの中で1回洗浄し、Ambion RiboPure細菌キットを用いて抽出し、2×50 ulの中で溶離させた。Ambion Turbo DNアーゼキットを用いてRNAサンプルをDNアーゼ化した。最終濃度が50 ng未満/ulのサンプルをエタノール沈降させてDNAを濃縮した。500 ngのDNアーゼ化されたRNAをApplied Biosystems High-Capacity cDNA逆転写キットで使用した。qPCRを、Applied Biosystems PowerUp SYBR Greenマスターミックス(1 ulのcDNAを含む10 ulの反応物)を用いて実施した。
サンプルを調べて遺伝子発現の経時変化と異なる培地での変化を探し、ΔΔCt法を利用してハウスキーピング遺伝子gyrB、sigB、ロー、またはこれら3つの平均に規格化した。表14は、黄色ブドウ球菌502Aで使用したqRT-PCRプライマーを示す。各RNAサンプルについて、ハウスキーピング遺伝子転写産物のCt(域値までのサイクル数)値を遺伝子転写産物のCt値から差し引いた。次いでこれらのΔCt値を初期時点に規格化した。
血液と血清に応答する候補プロモータ遺伝子に関するqPCRの結果が図15~17に示されている。図15は、15分、30分、または45分の時点における血清中でのプロモータの活性をTSBと比較して示している。ヒト血清中で45分の時点で上方調節されている遺伝子が表15に示されている。ヒト血清中で45分の時点で上方調節されている遺伝子に含まれるのは、hlgA2、hrtAB、isdA、isdB、isdG、sbnE、ear、splD、およびSAUSA300_2617である。
図16は、ヒト血液における15分、30分、または45分の時点のプロモータの活性をTSBと比較して示している。ヒト血液中で45分の時点で上方調節されている遺伝子が表16に示されている。ヒト血液中で45分の時点で上方調節されている遺伝子に含まれるのは、isdA、isdB、isdG、sbnE、およびSAUSA300_2617である。
図17は、血清の中で90分間インキュベートした後に上方調節されているいくつかの候補遺伝子を示す。具体的には、isd、sbn、およびfhuファミリーの中の遺伝子がさまざまな程度で上方調節されている。TSBと血清の両方における90分の時点の遺伝子発現をT=0での値に規格化した。ここで調べたすべての遺伝子が、TSBの中ではT=0からT=90分まで安定な発現を示した。
この実施例からのいくつかの遺伝子は血清中で大きな上方調節を示すのに対し、他の遺伝子は血清中で安定な発現を示す。これらの特徴の両方が、殺傷スイッチ活性のチューニングに有用である可能性がある。例えばヒト全身条件において増殖する能力を持たないであろう合成微生物を生成させるには、毒素遺伝子を血清中で上方調節されるプロモータの制御下に置き、抗毒素遺伝子を血清中で下方調節されるか安定に留まるプロモータの制御下に置くことができる。別の一例では、興味ある上方調節された遺伝子または安定な遺伝子それぞれのためのプロモータ領域を同定し、毒素(sprA1など)または抗毒素の前にクローニングすることができる。プロモータ遺伝子は、タンパク質レベルでの発現を求めるためレポータ遺伝子(GFPなど)の前にクローニングすることもできる。
実施例9.通過大腸菌株
実施例9.通過大腸菌株
この実施例では、黄色ブドウ球菌株の中に毒素遺伝子を組み込むのに用いるプラスミド、または黄色ブドウ球菌株の中で毒素遺伝子を利用するのに用いるプラスミドを組み立てるための大腸菌通過株を構成する。大腸菌の中の組み立てられたプラスミドからの異種毒素遺伝子の漏れ発現を抑制する目的で大腸菌通過株に抗毒素を付加する技術が記述される。通過株から単離されたプラスミドで黄色ブドウ球菌と表皮ブドウ球菌の標的株を直接形質転換することができる。
野生型細菌株を用いて作業しようと試みるとき課題が生じることがしばしばある。黄色ブドウ球菌の場合、課題に含まれるのは、その極度に厚いペプチドグリカン細胞壁に加え、適切にメチル化されていないすべてのDNAを切断する内在性制限改変系を回避することである。制限系の回避を助けるために特別に設計された大腸菌通過株から回収した高濃縮プラスミドDNAを作製することにより、本発明の発明者らは両方の課題を解決することができた。
以前は黄色ブドウ球菌と表皮ブドウ球菌に存在する強力な制限障壁が、機能的ゲノム分析を遺伝子操作しやすい株の小さなサブセットに限定していた。シトシンメチル化DNAを特異的に認識するSauUSIと名づけられた保存されたIV型制限系が、外来DNAを用いた形質転換の主要な障壁であると同定された。Monkら(2012年)は、高効率大腸菌K12クローニング株の中にDNAシトシンメチルトランスフェラーゼ変異体を以前に構成した。Monk et al., 2012, mBio 3(2):e00277-11. doi:10.1128/mBio.00277-11。
本開示の方法は、相同組み換えを通じてゲノムに組み込み、黄色ブドウ球菌のゲノム内で毒素遺伝子を操作することを含むため、その編集に用いるプラスミド上に毒素遺伝子が存在する。これは、大腸菌通過株も、ブドウ球菌の中での相同組み換えに使用されるプラスミド上に存在する毒素に対して耐性である必要があることを意味する。毒素は大腸菌の中でプラスミドから漏れ発現する可能性があるが、制御できるのでなければ大腸菌細胞を殺傷してその細胞が環状プラスミドを産生できなくするため、回収してブドウ球菌株を形質転換することができなくなる。sprA1毒素遺伝子に関してこれを解決するため、sprA1抗毒素のコピーであるsprA1アンチセンス(sprA1AS)をブドウ球菌内の天然プロモータの発現下で大腸菌IM08B株のゲノムに組み込んだ。こうすることで、sprA1毒素遺伝子を含有する組み立てられたプラスミドで大腸菌を形質転換することが可能になった。アンチセンスsprA1を大腸菌に組み込む前は、本発明の発明者らは、毒素遺伝子sprA1またはsprA2を含有する有用な組み込みプラスミドを複製することはまったくできなかった。アンチセンス組み込みに従い、本発明の発明者らは、毒素遺伝子sprA1とsprA2を有するプラスミド(p249など)を用いて形質転換と複製を可能にすることができた。
黄色ブドウ球菌株の中に毒素遺伝子を組み込むのに使用できるプラスミド、または黄色ブドウ球菌株の中で毒素遺伝子を利用するのに使用できるプラスミドを組み立てるためこの通過株を構成することには3つの主な理由がある。ブドウ球菌株は形質転換が難しいことで悪名が高いため、形質転換体を得るには大量のクリーンなプラスミドDNAを必要とする。黄色ブドウ球菌株は、適切にメチル化されてないDNAを検出して分解することのできる内在性制限修飾系を持つため、その大きなDNA調製物もブドウ球菌株を形質転換する前に適切にメチル化されねばならない。Monk, Ian R., et al.「主要な黄色ブドウ球菌系譜のための制限系の完全なバイパス」MBio 6.3 (2015): e00308-15。通過株にとって毒性である遺伝子を含有するプラスミドを組み立てるとき、毒素の発現を制御するには何らかの調節を利用せねばならないため、毒素は、プラスミドを産生するための正常な増殖条件下では通過株を殺傷しない。
十分な量のプラスミドDNAを取得し、DNAが適切にメチル化されているようにするため、Ian Monkは、ゲノムに組み込まれたメチル化酵素のいくつかを持つ大腸菌(K12)の株(IM08Bと名づけた)を創出した。毒素調節問題を克服するため、sprA1毒素ペプチドPepA1に対する抗毒素であるsprA1アンチセンス(sprA1AS)をその天然のプロモータ領域とともに黄色ブドウ球菌株BP_001から取り出してIM08Bのゲノムに組み込むという別のゲノム改変を株IM08Bに対して実施した。この組み込みにより、十分な量で産生されるsprA1毒素とsprA2毒素を含有するよう、IM08Bを使用して黄色ブドウ球菌株を形質転換するためのプラスミドDNAを作製することが可能になった。この改変を持つ新たに創出された株をBPEC_001と呼ぶ。
表17は、この実施例で使用したプラスミドを示す。
表18は、株BPEC_001の構築と適切な構成の確認に使用したプライマーとその配列を示す。
表19は、この報告に記載されているBPEC_001株の構築に使用したDNA配列を示す。
組み込みカセットの構築
大腸菌ゲノムに挿入されることになるDNAを作製するため、4つの別々のPCR産物を生成させた。2つの約500bpの相同アームを大腸菌K12ゲノムDNA(gDNA)からPCRによって増幅し、kanR遺伝子を含有する断片をプラスミドDNAから増幅し、sprA1AS遺伝子とプロモータをBP_001 gDNAからPCRによって増幅した。Q5 Hot Startポリメラーゼ(NEB)を製造者の指示に従って用い、断片生成とステッチPCRを、Report_SOP036に概略が示されているステッチPCR条件で実施した。
PCR断片の生成
つなぎ合わせて大腸菌ゲノムに組み込むことになるPCR断片を生成させるのに用いるプライマーを以下に記述する:
1)上流相同アーム(鋳型として使用される大腸菌gDNA)
a)DR_359/DR_409
2)PsprA1(as)-sprA1(as)(鋳型として使用されるBP_001 gDNA)
a)DR_357/DR_410
3)kanR断片(鋳型として使用されるプラスミドpCN51)
a)DR_408/DR_407
4)下流相同アーム(鋳型として使用される大腸菌gDNA)
a)DR_362/DR_361
5)青色LEDトランスイルミネータを用いて全PCR産物を可視化し、PCRクリーンアップキット(Qiagen)を用いて精製した。
1)上流相同アーム(鋳型として使用される大腸菌gDNA)
a)DR_359/DR_409
2)PsprA1(as)-sprA1(as)(鋳型として使用されるBP_001 gDNA)
a)DR_357/DR_410
3)kanR断片(鋳型として使用されるプラスミドpCN51)
a)DR_408/DR_407
4)下流相同アーム(鋳型として使用される大腸菌gDNA)
a)DR_362/DR_361
5)青色LEDトランスイルミネータを用いて全PCR産物を可視化し、PCRクリーンアップキット(Qiagen)を用いて精製した。
ステッチPCRによる組み立て
1)0.15ピコモルのsprA1AS断片を0.15ピコモルの上流HA断片と組み合わせ、0.15ピコモルのkanR断片を0.15ピコモルの下流HA断片と組み合わせた。
2)分子生物学グレードの水を添加して全体積を20 μLにした。
3)20 μLの2×Q5 Hot Startマスターミックス(NEB)を上記の工程1~2からのPCR断片カクテルに添加した。
4)PCR混合物をサーマルサイクラーに入れて以下の条件を利用した
a)98℃で30秒間の初期変性
b)98℃で5秒間のDNA変性
c)68℃で30秒間のアニーリング
d)72℃で20秒間の伸長
e)工程b~dを10回繰り返す
f)72℃で2分間の最終伸長
5)上記の反応物からの1 μLを、Q5 Hot Startマスターミックス(NEB)のための正常なサイクリング条件下で第2のPCR反応のための鋳型として使用した。
a)下流HA+sprA1AS断片
i)DR_362/DR_410
b)上流HA+kanR断片
i)DR_359/DR_408
6)PCR産物を1%アガロースゲル上でチェックし、青色LEDトランスイルミネータを用いて可視化し、PCRクリーンアップキット(Qiagen)を用いて精製した。
7)2つの精製されてつなぎ合わされたDNA断片を別のステッチPCR反応で利用し、前工程で記載したのと同じ鋳型を用いて原初の断片4つすべてを含有する1つの直線状DNA片を作製した。10サイクルのステッチ工程の後、プライマーのペアDR_359/DR_362を用いて断片全体を増幅した。
8)つなぎ合わされたPCR産物をシークエンシングし(Quintara)、シークエンシングの結果をBenchlingソフトウエアの中のアラインメント機能を利用して参照配列にアラインメントすることにより、PCR増幅工程の間に導入された変異が存在しないことを確認した。
1)0.15ピコモルのsprA1AS断片を0.15ピコモルの上流HA断片と組み合わせ、0.15ピコモルのkanR断片を0.15ピコモルの下流HA断片と組み合わせた。
2)分子生物学グレードの水を添加して全体積を20 μLにした。
3)20 μLの2×Q5 Hot Startマスターミックス(NEB)を上記の工程1~2からのPCR断片カクテルに添加した。
4)PCR混合物をサーマルサイクラーに入れて以下の条件を利用した
a)98℃で30秒間の初期変性
b)98℃で5秒間のDNA変性
c)68℃で30秒間のアニーリング
d)72℃で20秒間の伸長
e)工程b~dを10回繰り返す
f)72℃で2分間の最終伸長
5)上記の反応物からの1 μLを、Q5 Hot Startマスターミックス(NEB)のための正常なサイクリング条件下で第2のPCR反応のための鋳型として使用した。
a)下流HA+sprA1AS断片
i)DR_362/DR_410
b)上流HA+kanR断片
i)DR_359/DR_408
6)PCR産物を1%アガロースゲル上でチェックし、青色LEDトランスイルミネータを用いて可視化し、PCRクリーンアップキット(Qiagen)を用いて精製した。
7)2つの精製されてつなぎ合わされたDNA断片を別のステッチPCR反応で利用し、前工程で記載したのと同じ鋳型を用いて原初の断片4つすべてを含有する1つの直線状DNA片を作製した。10サイクルのステッチ工程の後、プライマーのペアDR_359/DR_362を用いて断片全体を増幅した。
8)つなぎ合わされたPCR産物をシークエンシングし(Quintara)、シークエンシングの結果をBenchlingソフトウエアの中のアラインメント機能を利用して参照配列にアラインメントすることにより、PCR増幅工程の間に導入された変異が存在しないことを確認した。
IM08BのゲノムへのsprA1ASの組み込み
1)コンピテント大腸菌を作製し、Report_065に概略が示されているプロトコルに従ってプラスミドpKD46で形質転換する。カルベニシリン(Teknova)を培地の中で100 mg/Lの作業濃度で用いてプラスミドを形質転換と回収の後に維持する。
2)単一コロニーを取り上げ、単一コロニーを探すため新鮮なLBカルベニシリンプレートに再び画線塗布し、コロニーが目視できるようになるまで30℃で一晩インキュベートする。
3)コロニーをLBカルベニシリンプレート上に目視できるようになると、単一コロニーを取り上げ、5 mLのLB+カルベニシリンの液体培養を開始し、ロータリーシェイカーの中で240 rpmにて30℃で一晩インキュベートする
4)翌日、1 mLの一晩培養物を、新鮮な50 mLのLBカルベニシリン培地を含有するガラス製バッフル付き震盪フラスコに移し、震盪を30℃で2時間継続する。
5)2時間のインキュベーションの後、1.75 mLの10%L-アラビノースを培養物に添加し、震盪フラスコを240 rpmで震盪しながら37℃でさらに45分間インキュベートする。
6)45分間のインキュベーションの後、震盪フラスコを氷浴に移し、Report_SOP030に概略が示されているプロトコルに従ってエレクトロコンピテント大腸菌を調製する。
7)上で生成した約500 ngのつなぎ合わされたPCR断片を工程6からの50 μLのエレクトロコンピテント大腸菌に添加し、電気穿孔する。
a)DNA/細胞溶液を冷やした0.1 mmギャップキュベットに移した。
b)電気穿孔装置の設定を1.8 kV、200 Ωにした。
c)細胞をストックした直後に1 mlのSOCブロス培地をキュベットに添加し、次いで240 rpmで震盪している37℃の培養器に3時間入れて細胞を回復させる。
8)3時間の回復プロセスの後、細胞をLBカナマイシン(50 mg/L)寒天プレートの上に載せ、37℃で一晩インキュベートした。
9)翌日、8個のコロニーをPCRによってスクリーニングして大腸菌ゲノム内のPsprA1(as)-sprA1(as)インサートを探した。
a)大腸菌コロニーを新鮮なLB+カナマイシン寒天プレートにパッチ塗布し、残ったコロニーを0.2 mLのPCRチューブの中の20 μLの分子生物学グレードの水に懸濁させ、サーマルサイクラーの中で98℃に10分間加熱して細胞を溶解させた後、ゆっくりと室温まで冷却する。
b)チューブを短時間遠心分離して細胞残屑をペレットにし、PCR反応において1 μLの溶液を鋳型として用いてインサートをスクリーニングする。
i)プライマーDR_371とDR_279を用いて859のPCRバンドを生成させた。
ii)次いでPCR産物を1%アガロースゲル電気泳動でチェックし、適切なバンドサイズを探す。
iii)陽性バンドを示した3つのクローンのgDNAをhigh fidelity PCRで鋳型として使用し、プライマーDR_371/DR_372を用いて組み込まれた領域全体を増幅した。
iv)次いで反応物をアガロースゲル電気泳動でチェックし、適切なサイズのクリーンなバンドを探した。クリーンに見える反応物をシークエンシングし、以前のようにして参照配列にアラインメントさせ、組み込みが変異をまったく含有しないことを確認した。配列を確認されたクローンを長期保管のためストックした。
10)配列を確認されたクローンのエレクトロコンピテントセルをReport_SOP030に概要が示されているプロトコルに従って作製した。
11)プラスミドp249のため0.6 μLのギブソン・アセンブリを用いてBPEC_001エレクトロコンピテントセルを形質転換し、LB+クロラムフェニコール(20 μg/mL)/X-gal(100 μg/mL)に播種し、37℃で一晩インキュベートした。
12)翌日、プライマーDR_117とDR_228を用いて青色のコロニーをスクリーニングし、反応物を1%アガロースゲル上でチェックした。
13)次いで3つの陽性クローンからのゲノムDNAをhigh fidelity PCRのための鋳型として用いてプラスミドの骨格に挿入される配列(相同アームとsprA1)を増幅した。
14)次いで反応物をアガロースゲル電気泳動でチェックし、適切なサイズとクリーンなバンドを探した。クリーンに見える反応物をシークエンシングし、前と同様に参照配列にアラインメントさせ、組み込みがいかなる変異も含まないことを確認した。配列を確認されたクローンを長期保管のためストックした。
1)コンピテント大腸菌を作製し、Report_065に概略が示されているプロトコルに従ってプラスミドpKD46で形質転換する。カルベニシリン(Teknova)を培地の中で100 mg/Lの作業濃度で用いてプラスミドを形質転換と回収の後に維持する。
2)単一コロニーを取り上げ、単一コロニーを探すため新鮮なLBカルベニシリンプレートに再び画線塗布し、コロニーが目視できるようになるまで30℃で一晩インキュベートする。
3)コロニーをLBカルベニシリンプレート上に目視できるようになると、単一コロニーを取り上げ、5 mLのLB+カルベニシリンの液体培養を開始し、ロータリーシェイカーの中で240 rpmにて30℃で一晩インキュベートする
4)翌日、1 mLの一晩培養物を、新鮮な50 mLのLBカルベニシリン培地を含有するガラス製バッフル付き震盪フラスコに移し、震盪を30℃で2時間継続する。
5)2時間のインキュベーションの後、1.75 mLの10%L-アラビノースを培養物に添加し、震盪フラスコを240 rpmで震盪しながら37℃でさらに45分間インキュベートする。
6)45分間のインキュベーションの後、震盪フラスコを氷浴に移し、Report_SOP030に概略が示されているプロトコルに従ってエレクトロコンピテント大腸菌を調製する。
7)上で生成した約500 ngのつなぎ合わされたPCR断片を工程6からの50 μLのエレクトロコンピテント大腸菌に添加し、電気穿孔する。
a)DNA/細胞溶液を冷やした0.1 mmギャップキュベットに移した。
b)電気穿孔装置の設定を1.8 kV、200 Ωにした。
c)細胞をストックした直後に1 mlのSOCブロス培地をキュベットに添加し、次いで240 rpmで震盪している37℃の培養器に3時間入れて細胞を回復させる。
8)3時間の回復プロセスの後、細胞をLBカナマイシン(50 mg/L)寒天プレートの上に載せ、37℃で一晩インキュベートした。
9)翌日、8個のコロニーをPCRによってスクリーニングして大腸菌ゲノム内のPsprA1(as)-sprA1(as)インサートを探した。
a)大腸菌コロニーを新鮮なLB+カナマイシン寒天プレートにパッチ塗布し、残ったコロニーを0.2 mLのPCRチューブの中の20 μLの分子生物学グレードの水に懸濁させ、サーマルサイクラーの中で98℃に10分間加熱して細胞を溶解させた後、ゆっくりと室温まで冷却する。
b)チューブを短時間遠心分離して細胞残屑をペレットにし、PCR反応において1 μLの溶液を鋳型として用いてインサートをスクリーニングする。
i)プライマーDR_371とDR_279を用いて859のPCRバンドを生成させた。
ii)次いでPCR産物を1%アガロースゲル電気泳動でチェックし、適切なバンドサイズを探す。
iii)陽性バンドを示した3つのクローンのgDNAをhigh fidelity PCRで鋳型として使用し、プライマーDR_371/DR_372を用いて組み込まれた領域全体を増幅した。
iv)次いで反応物をアガロースゲル電気泳動でチェックし、適切なサイズのクリーンなバンドを探した。クリーンに見える反応物をシークエンシングし、以前のようにして参照配列にアラインメントさせ、組み込みが変異をまったく含有しないことを確認した。配列を確認されたクローンを長期保管のためストックした。
10)配列を確認されたクローンのエレクトロコンピテントセルをReport_SOP030に概要が示されているプロトコルに従って作製した。
11)プラスミドp249のため0.6 μLのギブソン・アセンブリを用いてBPEC_001エレクトロコンピテントセルを形質転換し、LB+クロラムフェニコール(20 μg/mL)/X-gal(100 μg/mL)に播種し、37℃で一晩インキュベートした。
12)翌日、プライマーDR_117とDR_228を用いて青色のコロニーをスクリーニングし、反応物を1%アガロースゲル上でチェックした。
13)次いで3つの陽性クローンからのゲノムDNAをhigh fidelity PCRのための鋳型として用いてプラスミドの骨格に挿入される配列(相同アームとsprA1)を増幅した。
14)次いで反応物をアガロースゲル電気泳動でチェックし、適切なサイズとクリーンなバンドを探した。クリーンに見える反応物をシークエンシングし、前と同様に参照配列にアラインメントさせ、組み込みがいかなる変異も含まないことを確認した。配列を確認されたクローンを長期保管のためストックした。
結果
プラスミドp249のギブソン・アセンブリの形質転換の後、LB+クロラムフェニコール(20 μg/mL)/X-gal(100 μg/mL)寒天プレートは、大腸菌K12またはIM08Bエレクトロコンピテントセルを用いて実施した形質転換よりも多くの青色コロニーを示した。青色コロニーのコロニーPCRスクリーンは、細胞のいくつかが、sprA1毒素遺伝子を含有するプラスミドDNAを取り上げていたことを示した。以下のPCRとシークエンシングにより、プラスミドが実際に組み立てられていたため、大腸菌宿主細胞の内部で自己複製できることが確認された。
実施例10.株の構築と評価:合成微生物黄色ブドウ球菌
実施例10.株の構築と評価:合成微生物黄色ブドウ球菌
この実施例では、合成株BP_118(isdB::sprA1)を、ゲノムに毒素遺伝子sprA1が天然のisdB遺伝子の後ろにうまく組み込まれた標的株BP_001を用いて構成した。BP_0118は、親株BP_001と比べてヒト血清中の株BP_118に関して生きているcfu/mLの劇的な減少を示し、複合培地(TSB)の中では増殖に差がなかった。
プラスミドp262を構築し、それを用いて黄色ブドウ球菌株(BP_001)を形質転換し、相同組み換えによってゲノムに組み込むことにより、この編集をした。二重組み換えプロセスを通じてプラスミドが黄色ブドウ球菌株BP_001のゲノムに完全に組み込まれた後、第2の相同組み換えイベントを通じてプラスミドが除去され、sprA1遺伝子と5'非翻訳領域がisdB遺伝子の直後に残った。ゲノムへの組み込みの有効性を、ヒト血清中でのその増殖をインビトロで観察することによって評価した。
材料と方法
株の構築
株の作製に使用したプラスミドはプラスミドp262であった。p262由来で株に組み込まれるDNA配列を表21Aに見いだすことができる。
pIMAYzから構成したプラスミドを用いて黄色ブドウ球菌でゲノム編集をした。簡単に述べると、プラスミドで親株を形質転換し、プラスミドの複製が許されない温度で増殖させ、スクリーニングして一次交差株を探した後、増殖させ、再度播種し、コロニーをスクリーニングしてsprA1遺伝子が後ろに残った二次交差を探した。sprA1の挿入を、相同アームの外側でゲノムDNAに結合するプライマーにより、gDNAから増幅したPCR産物のサンガーシークエンシングによって確認した。
スクリーニング工程で使用したプライマーが表20に見られる:
i.一次スクリーン:
1.DR_117、DR_533
2.DR_117、DR_534
ii.二次スクリーン
1.DR_534、DR_254
iii.sprA1が組み込まれたことを確認するためのQ5 High Fidelity PCR:
1.DR_533/DR_534
iv.シークエンシングプライマー
1.DR_533、BP_949、DR_228、BP_965、BP_964、BP_950、DR_534、DR_318
v.最終確認:
1.DR_534、DR_254
i.一次スクリーン:
1.DR_117、DR_533
2.DR_117、DR_534
ii.二次スクリーン
1.DR_534、DR_254
iii.sprA1が組み込まれたことを確認するためのQ5 High Fidelity PCR:
1.DR_533/DR_534
iv.シークエンシングプライマー
1.DR_533、BP_949、DR_228、BP_965、BP_964、BP_950、DR_534、DR_318
v.最終確認:
1.DR_534、DR_254
インサートの配列を確認した後、新しい株BP_118を50%グリセロールの中にストックし、-80℃で保管した。
表20は、この研究で使用した一本鎖プライマーの配列を示す。配列はすべて、5'から3'に向かう方向である。
表21Aは、相同アームとsprA1組み込みのDNA配列を示す。使用したDNA配列は二本鎖だったが、示されている配列は鎖の一方だけであり、5'から3'に向かう方向である。DNA配列BP_DNA_003について、太字の配列はsprA1読み枠を示し、下線を引いた配列は5'非翻訳領域(制御アーム)を示す。
sprA1が組み込まれたことをプライマーDR_534とDR_254を用いたPCRによって確認した(図1)。BP_001を陰性対照とした電気泳動で組み込みが存在していないことが示された。その後株をサンガーシークエンシングに送り出した(QuintaraBio)。シークエンシングの結果は、変異がないことを示した。配列とアラインメントに関するデータは本発明の発明者らのBenchlingアカウントに保管されている。
図20Aは、BP_118の中のisdb::sprA1をPCRで確認するためのアガロースゲルを示す。図20Aは、プライマーDR_534とDR_254を用いた二次組み換えPCRスクリーンからのPCR産物をチェックするため実施した1%アガロースゲル電気泳動の写真を示す。プライマーDR_534は相同アームの外側でゲノムに結合し、プライマーDR_254は、組み込みのあるs株に対してアンプリコンのサイズが1367 bpであるものを作り、組み込みが存在しない場合にはPCR断片を作らない、sprA1遺伝子に結合する。組み込みが親株に存在していないことを示すため、BP_001を陰性対照として電気泳動を実施した。
図20Bは、sprA1遺伝子が挿入されたBP_118のゲノムの地図を示す。これはBenchlingプログラムで作成した。
図20Cは、株BP_001とBP_118をTSB培地とヒト血清の中で4時間の期間にわたって増殖させたときの増殖曲線を示す。グラフ上にプロットされている点は3つの生物学的レプリケートの平均を表わし、誤差棒は三連サンプルの標準偏差を表わす。実線はTSBの中で増殖させた培養物を表わし、点線はヒト血清の中で増殖させた培養物を表わす。BP_118は、血清アッセイで評価したとき、TSBの中では野生型株BP_001と同様に増殖できるが、BP_001とは異なり、ヒト血清中では増殖を維持できないことが示された。
同様のやり方で調製した他の合成黄色ブドウ球菌株が表21Bに示されている。
表21Cは合成大腸菌株を示す。
この実施例では、遺伝子型BP_001 ΔsprA1-sprA1(AS)、部位_2::PgyrB-sprA1(AS)(長)、isdB::sprA1を持つBP_112と呼ばれる黄色ブドウ球菌合成株を構成した。ヒト血清アッセイは、殺傷スイッチが有効であって株BP_112は野生型の親株BP_001と比べて生きているCFU/mLが劇的に低下し、複合培地(TSB)の中では増殖に差がないことを示唆した。
BP_112は、その天然のプロモータ以外のプロモータによってアンチセンスsprA1(sprA1(AS))の発現が制御される殺傷スイッチ付きの株を表わす。この株を作るため、本発明の発明者らは最初に、プラスミドp147(Report_P036)を用い、天然のsprA1毒素遺伝子に加えてsprA1(AS)を野生型黄色ブドウ球菌株BP_001のゲノムから除去した。次にプラスミドp250(Report_P018)を用い、PgyrB-sprA1(AS)(長)発現カセットをゲノムの部位_2と呼ばれる非コード領域に挿入した。sprA1(AS)の2つのバージョンを設計した。BP_112におけるバージョンは2つのバージョンの長い方を表わす。最後に、プラスミドp249を用いてisdB::sprA1殺傷スイッチを挿入した。ゲノムへの組み込みの有効性を、ヒト血清中でのその増殖をインビトロで観察することによって評価した。
gyrB遺伝子はDNAジャイレースサブユニットBをコードしており、細胞内で合理的な高くて安定なレベルで構成的に発現する。この遺伝子のためのプロモータをBP_001のゲノムからPCRで増幅し、sprA1遺伝子のための抗毒素sprA1(AS)の発現を駆動するのに使用した。これはゲノムの部位_2の位置に配置した。なぜならわれわれは、この位置を利用すると細胞の表現型を破壊することなく異種DNAを挿入できることを以前に実証したからである。PgyrB-sprA1(AS)カセットがisdB::sprA1殺傷スイッチを十分に抑制する能力を正しく調べるため、部位_2を改変する前に天然のsprA1(AS)をゲノムから削除した。研究によりブドウ球菌細胞の中のspr毒素-抗毒素系の間にはクロストークがないことが示されているため、sprA1(AS)を除去することにより、isdB::sprA1殺傷スイッチを調節するのはPgyrB-sprA1(AS)発現カセットだけになる。Germain-Amiot et al., Nucleic acids research 47.4 (2019): 1759-1773。
材料と方法
表22は、最終的な株BP_112を創出するため複数ラウンドのゲノム編集を通じて作製した3つの異なる株を示す。
株の構築
1.pIMAYzを用いた黄色ブドウ球菌の遺伝子操作に関して本明細書に概略が示されているプロトコルを利用し、プラスミドp147、p249、およびp250を用いて3ラウンドのゲノム編集で株を作製した。
1.1. 簡単に述べると、プラスミドで親株を形質転換し、プラスミドの複製が許されない温度で増殖させ、スクリーニングして一次交差株を探した後、増殖させ、再播種し、コロニーをスクリーニングしてゲノム中に望む挿入または欠失が残った二次交差を探した。挿入/欠失は、相同アームの外側でゲノムDNAに結合するプライマーにより、gDNAから増幅されたPCR産物のサンガーシークエンシングによって確認した。
2.インサートの配列を確認した後、新しい株を50%グリセロールの中にストックし、株とプラスミドのストックを用意するため-80℃で保管する。
3.BP_112を8時間ヒト血清アッセイで分析し、改変された株の表現型応答を評価した。BP_112をBP_001と比較し、血清アッセイを8時間実施した。結果が図21に含まれている。
1.pIMAYzを用いた黄色ブドウ球菌の遺伝子操作に関して本明細書に概略が示されているプロトコルを利用し、プラスミドp147、p249、およびp250を用いて3ラウンドのゲノム編集で株を作製した。
1.1. 簡単に述べると、プラスミドで親株を形質転換し、プラスミドの複製が許されない温度で増殖させ、スクリーニングして一次交差株を探した後、増殖させ、再播種し、コロニーをスクリーニングしてゲノム中に望む挿入または欠失が残った二次交差を探した。挿入/欠失は、相同アームの外側でゲノムDNAに結合するプライマーにより、gDNAから増幅されたPCR産物のサンガーシークエンシングによって確認した。
2.インサートの配列を確認した後、新しい株を50%グリセロールの中にストックし、株とプラスミドのストックを用意するため-80℃で保管する。
3.BP_112を8時間ヒト血清アッセイで分析し、改変された株の表現型応答を評価した。BP_112をBP_001と比較し、血清アッセイを8時間実施した。結果が図21に含まれている。
図21は、BP_112(n=3)とBP_001(n=1)を血清(点線)とTSB(実線)の中で8時間の期間にわたって増殖させたときの平均CFU/mLを示す。誤差棒は平均値の標準偏差を表わす。
株BP_001に対して3つのゲノム改変をして株BP_112を創出した。最初に、sprA1-sprA1(AS)遺伝子をノックアウトしてsprA1毒素またはアンチセンス(sprA1(AS))のバックグラウンド発現を取り除いた。次に、sprA1(AS)発現カセットを部位_2(PgyrB-sprA1(AS)(長))に挿入した。最終編集は、isdB遺伝子の後ろにsprA1遺伝子を挿入することによって殺傷スイッチを組み込むためであった。これらの編集はすべて成功し、BioPlxのデータベースにストックされた。
血清アッセイで評価したとき、BP_112(ΔsprA1-sprA1(AS)、部位_2::PgyrB-sprA1(AS)(長)、isdB::sprA1)はTSBの中では野生型株BP_001と同様に増殖することができたが、ヒト血清の中では増殖できなかった。これは、BP_112が人工的なsprA1抗毒素発現系を利用してsprA1殺傷スイッチをうまく制御したことを実証している。
実施例12.作用遺伝子の最適な発現のためのゲノムへの組み込み部位の選択:殺傷スイッチの開始部位最適化
実施例12.作用遺伝子の最適な発現のためのゲノムへの組み込み部位の選択:殺傷スイッチの開始部位最適化
作用遺伝子(殺傷スイッチなど)を組み込むために選択される位置は毒素の有効性に影響を与える可能性がある。遺伝子の発現は、環境条件に応じて生物内のそれぞれの遺伝子について広く変動する可能性がある。この実施例に示されているように、sprA1殺傷スイッチの有効性は、ゲノム内の組み込むことを選択した位置に依存して変化する。
外来性DNA配列を組み込んで殺傷スイッチ(KS)を創出するのに最適な部位を調べるため、短い増殖アッセイを、プールされたヒト血清とTSB培地の中で野生型黄色ブドウ球菌標的株BP_001を用いて実施した。
簡単に述べると、TSBの中のBP_001の一晩増殖培養物を新鮮なTSB培地の中で1:100に希釈し、細胞の代謝と同期させるため37℃でさらに2時間増殖させた。その2時間の増殖期間の後、細胞を2回洗浄したためODを再度取得し、リン酸塩緩衝(PBS)の中で1 mLの体積まで濃縮した。濃縮された細胞をそれぞれ3つのチューブのTSBとヒト血清に接種し、震盪培養器の中で37℃にて90分間増殖させた。接種後t=0分、30分、および90分の時点でサンプルを採取し、RNAを抽出し、RiboPure(商標)RNA精製キット、細菌(ThermoFisher)を用いて精製した。次いでRNAサンプルをVertis Biotechnologie AG(フライジング、ドイツ国)に送ってrRNAを除去し、cDNAライブラリを作製し、cDNAライブラリをシークエンシングし、シークエンシングデータのトリミングと処理をし、それを黄色ブドウ球菌502株の注釈付きゲノム配列にマッピングした。RNA seq実験からのデータを分析して調節が最も異なる転写産物に注目し、その後それらを作用遺伝子sprA1挿入の標的として用いた。この遺伝子はBP_001の中の天然の毒素抗毒素系であるは過剰発現したときに毒性であることが以前に示されている。
遺伝子の転写とタンパク質の翻訳を細胞の天然の調節系に機能可能に連結させるため、ゲノム内のいくつかの位置を選択して作用遺伝子を組み込んだ。
pIMAYzプロトコルと相同組み換えを利用してプラスミドて構築するための上記の実施例に記載されている方法を利用してゲノム改変を実施した。簡単に述べると、組み込みの標的とするゲノム位置の上流と下流の両方に相同アームを設計し、sprA1を作用遺伝子の上流の短い配列とともに含有するDNA断片、または誘導性プロモータのいずれかをゲノムに挿入した。その後、組み込みの有効性を、ヒト血清またはTSBの中での増殖アッセイを実施することによって調べた。
この実施例のプロトコルはRNA-seq実験で利用したものと似ているが、最終的な血清とTSB培養物を接種した後にアッセイを4時間実施し、サンプルを接種後t=0、2、および4時間の時点で採取し、液体取り扱いロボットによって段階希釈し、TSB寒天プレートに播種して培養物内の生きている細胞の濃度を1 mL当たりのコロニー形成単位(CFU/mL)として求めた。TSBとプールされたヒト血清の両方における操作された株の増殖を野生型株BP_001と比較した。
結果が図18に示されており、この図は、TSBとヒト血清の中での30分と90分の時点における黄色ブドウ球菌からの25個の遺伝子の発現の倍数変化を示している。上に示した遺伝子が、90分の時点でヒト血清とTSBブロスの間で調節が最も異なっていた。各遺伝子に関するリードの数を100万当たりの転写産物(TPM)に変換し、レプリケートを各条件(n=3)について平均し、ハウスキーピング遺伝子gyrBの発現に規格化し、t=0での初期発現レベルから差し引き、90分の時点で2つの培地条件の間で発現が最も異なることに関して選別した。図の最も下の遺伝子(CH52_00245)は値が175倍上方調節されていたが、この図を拡大して残りのデータをできるだけ見やすくするためカットして短くした。
RNA-seqの結果から、BP_001の中の多くの遺伝子が、TSBとヒト血清の中で増殖している間に調節が異なることが明らかになった。TSBと血清の間で調節が最も大きく異なる遺伝子の多くは、環境からの鉄の封鎖と獲得に関与する。殺傷スイッチの設計に関する最も興味深い遺伝子は、TSB中では大きく抑制され、ヒト血清中では大きく上方調節された。
表23は、作用遺伝子を組み込むとよい候補位置として同定された遺伝子またはプロモータを示す。遺伝子isdB、PsbnA、およびisdCが、図18に示されている上位25個の遺伝子の中から見いだされた。
組み込みの標的とされるいくつかの遺伝子は調節が異なる上位25個の遺伝子の中に存在しなかったが、殺傷スイッチからの応答のスペクトルを提供するために選択した。遺伝子sbnBとisdEを標的とした。それは、Psbnプロモータが二方向性プロモータであること、sbnBもsbnAと同様に調節されるであろうと仮定したこと、およびisdEは、上位25個の遺伝子のリストの中にあるisdCと同じオペロン上にあることが理由である。harA遺伝子を標的としたのは、そのタンパク質がisdB遺伝子と同様に調節されて機能すると文献に主張されているからである。Dryla et al. Journal of bacteriology vol. 189,1 (2007): 254-64. doi:10.1128/JB.01366-06。リストにある候補遺伝子標的とリストにない候補遺伝子標的の両方を選択することにより、殺傷スイッチからの応答の独自スペクトルを探索することができる。
表24は、作製してヒト血清とTSBの中でのsprA1殺傷スイッチの有効性を調べた株を示す。
図19は、異なる殺傷スイッチが組み込まれた4つの黄色ブドウ球菌合成株のヒト血清中における平均CFU/mLとしての殺傷スイッチ活性を親標的株BP_001と比較して示す。図19は、sprA1殺傷スイッチがゲノム内の4つの異なる位置に組み込まれた4つの異なる合成SA株を血清中で4時間にわたって増殖させたときの生きているCFU/mLを示す。データはCFU/mLとして3つの異なる時点でプロットされており、誤差棒は三連サンプルの標準偏差を表わす(BP_128は例外であり、n=1である)。このグラフではTSBの中で増殖させたすべての株のCFU/mLデータが血清の中のBP_001と重なるため、より見やすいグラフにするため省略した。
図19に示されているように、株BP_118(isdB::spra1)、BP_092(PsbnA::sprA1)、およびBP_128(harA::sprA1)のそれぞれは、血清の中で増殖する能力を調べたとき、約2時間と4時間の時点の両方でCFU/mLの減少を示した。BP_118(isdB::spra1)は、CFU/mLの最大の低下であったため、最強の殺傷スイッチ活性を示した。株BP_150は野生型親株よりもほんのわずかにゆっくりと増殖したが、それでも4時間アッセイの間、プラスの増殖曲線を維持した。
実施例13.BP_088、BP_101、BP_108、およびBP_109を用いたヒト血漿殺傷アッセイ
実施例13.BP_088、BP_101、BP_108、およびBP_109を用いたヒト血漿殺傷アッセイ
殺傷スイッチを有するいくつかの黄色ブドウ球菌株の有効性をヒト血漿の中で調べた。これらと同じ株はヒト血清の中ではすぐに死ぬことが示されたため、他の体液で、組み込まれた殺傷スイッチ(KS)を誘導する能力と生きている細胞の数を減らす能力を調べる。表25は、アッセイで使用した株を示す。
本明細書に記載されている血清アッセイのプロトコルを利用したが、血清での増殖条件をヒト血漿に変えた。
ヒト血漿は血液の液体部分である。それは回転させて細胞を除去することによって得られるが、それでもタンパク質、凝固因子、電解質、抗体、抗原、およびホルモンを含有している。凝固因子が液体の中にまだ存在しているため、ヒト血漿は細胞の培養に用いるのが難しい培地である。時間が経過すると細胞とタンパク質の塊が形成されるため、サンプリングする前に培養物を均一にするため注意を払った。3.5時間よりも長いアッセイが必要とされる場合には、接種前に抗凝固剤を血漿に添加すべきであることが見いだされた。
結果が図22に示されており、この図は、TSBとヒト血漿の両方の中で調べたすべての株に関するcfu/mLの濃度の棒グラフをt=0と増殖の3.5時間後(t=3.5)の両方で示している。株BP_088、BP_101、BP_108、およびBP_109の生きているcfu/mLはヒト血漿中で3.5時間後に99%超の減少を示した。BP_092は、ヒト血漿中では、3.5時間後に生きているcfu/mLが95%低下を示した。BP_001は、ヒト血漿中では、3.5時間後に生きているcfu/mLが非常にわずかな差を示した。すべての株がTSB培地の中で増殖した。アッセイからの結果は、KSが組み込まれた黄色ブドウ球菌株がヒト血漿中で増殖できなかったことを示している。すべての培養物をTSBとヒト血清の両方の中で約1×106 cfu/mLで開始すると、37℃で3.5時間増殖させた後、すべてのTSB培養物がcfu/mLの約100倍の増加を示した。502aはヒト血漿中でcfu/mLのわずかな低下を示し、殺傷スイッチを有する株(BP_088、BP_092、BP_101、BP_108、BP_109)はすべて、血漿中でcfu/mLの低下を示した。殺傷スイッチを有する微生物はヒト血漿中でよく機能した。アッセイからの結果は、KSが組み込まれた黄色ブドウ球菌株がヒト血漿中で増殖できなかったことを示している。
実施例14.大腸菌毒素の有効性試験
実施例14.大腸菌毒素の有効性試験
2つの異なる大腸菌株のゲノムをPXYL/Tetプロモータの制御下で改変し、推定大腸菌毒素hokB、hokD、relE、mazF、およびyafQと、既知の黄色ブドウ球菌毒素sprA1を組み込んだ。遺伝子hokD、sprA1、およびrelEが過剰発現した結果として合成大腸菌培養物の光学密度が低下した。これは、それらが宿主細胞に対して毒素として機能することを示す。逆に、上記の誘導性プロモータに機能可能に連結されたhokB、mazF、およびyafQを含む大腸菌の過剰発現は、このアッセイの条件下では宿主細胞に対する毒性効果を示さなかった。
推定大腸菌毒素遺伝子を大腸菌ゲノムに組み込み、得られた株が培養物の中で細胞増殖を停止させる能力、または生きている細胞を殺傷する能力を調べた。強力な誘導性を持っていて厳密に制御されるプロモータ系PXYL/Tetを選択してこのアッセイを効率的かつ効果的に実施した。
大腸菌は、内在性毒素-抗毒素(TA)系の成分であると注釈されている多くの遺伝子を持つ。本発明の発明者らは、TA系を利用して細胞内で環境変化によって誘導される殺傷スイッチを開発できることを示した。異なる種と株から有効な毒素遺伝子を同定することは、そのような殺傷スイッチの開発の決定的に重要な部分である。
RED系を用いて直線状DNAを2つの異なる大腸菌株のゲノム、すなわちIM08Bと名づけたK12バックグラウンド株(Monk et al., 2015 M Bio 6.3: e00308-15)と、Udder Health Systemsから購入した、彼らが大腸菌ウシ基準として使用している株に組み込んだ。Datsenko et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (12), 6640-6645 (2000)。
ゲノムに組み込まれた直線状DNAは、2つのtetO部位(そこにtetリプレッサ(TetR)タンパク質がきつく結合して推定毒素遺伝子の転写を阻止する)を含有する強力な構成的プロモータPXYL/Tetの後ろにある推定毒素遺伝子のほか、tetR遺伝子ととカナマイシン耐性遺伝子を含有する。Helle et al.「黄色ブドウ球菌においてTetリプレッサに依存した遺伝子の漸次的な誘導または沈黙を改良するためのベクター」Microbiology 157.12 (2011): 3314-3323。抗生剤テトラサイクリンの非毒性形態である無水テトラサイクリン(ATc)は、培地に添加されると、tetRタンパク質にアロステリックに結合してそのタンパク質の立体配座を変化させ、そのタンパク質を、tetO部位でDNAに結合することができないものにし、下流の1つまたは複数の遺伝子の転写を阻止する。TetRタンパク質が脱活性化されると、推定毒素遺伝子を高率で転写するためRNAポリメラーゼをリクルートするとき構成的プロモータは抑制が外れ、阻害されない。培養物に対する毒素の効果は、培養物の光学密度(OD600)の経時変化を測定することによって見ることができる。ATcを添加されたサンプルとそうでないサンプルを比較することにより、それぞれの毒素がどれほど有効であるかを見ることができる。上位候補は、環境条件に基づいて誘導されるか抑制される殺傷スイッチの開発に使用されることになる。
発現カセットとカナマイシン耐性遺伝子の組み込みは、それを大腸菌ゲノムの中に、β-D-グルクロニダーゼと呼ばれるタンパク質をコードするuidA遺伝子(gusAとも呼ばれる)の代わりに挿入することによってなされた。uidA遺伝子は最初の遺伝子3遺伝子オペロンであり、組み込みにより、uidB遺伝子(gusBとも呼ばれる)の中の最初の4塩基の除去(この遺伝子の発現が中断または不能にされる可能性が大きい)と、オペロンuidCの中の最後の遺伝子(gusC)の除去もなされる。それは大腸菌増殖にとって必須でなく、その不在がここで調べている毒素の有効性に影響を与えることはないため、組み込むための便利な位置になっている。この報告で実施した組み込みはすべて、ゲノム内のその位置を標的とするのに同じ相同アームを使用した。これは、組み込みがすべて正確に同じ位置でなされたことを意味する。
下記のリストはこの報告で調べた毒素を示しており、それぞれの簡単な説明は以下の通りである:
sprA1
sprA1遺伝子は黄色ブドウ球菌にもともと含まれており、I型毒素抗毒素系の一部である。sprA1遺伝子はPepA1と呼ばれる膜ポリンタンパク質をコードしており、それが細胞の膜に蓄積して分裂中の細胞でアポトーシスを誘導する。Schuster et al.,「黄色ブドウ球菌の毒素-抗毒素系」Toxins 8.5 (2016): 140。黄色ブドウ球菌の中でsprA1が有効であることが本明細書に示されているため、大腸菌の中で同様に機能するであろうと仮定した。ここで使用するsprA1遺伝子は、i BP_001と名づけた502a様の株のゲノムからPCRで増幅した。
hokB
hokB遺伝子は、大腸菌の中のhok-sokファミリーのI型毒素-抗毒素系の1つのメンバーである。このタンパク質は細胞質膜に挿入されて孔を形成し、その結果としてATPが漏出することが実証されている。Wilmaerts et al. 2018. パーシスタンスが誘導する毒素HokBがダイナミックな孔を形成してATP漏出を引き起こす. mBio 9:e00744-18. https://doi.org/10.1128/mBio .00744-18。配列分析から、hokBはhok(宿主殺傷)遺伝子のホモログであることが示された。この報告で使用されたhokB遺伝子は大腸菌K12株のゲノムからPCRで増幅した。
hokD
hokD遺伝子は、大腸菌の中のhok-sokファミリーのI型毒素-抗毒素系の1つのメンバーである。hokDからの安定なmRNAがsRNA抗毒素sokによって転写後調節される。hokD遺伝子は、大腸菌にとって毒性であることが示されているタンパク質をコードしており、その結果として膜電位の喪失、細胞呼吸の停止、形態学的変化、および宿主細胞死が起こる。Gerdes et al., The EMBO journal 5.8 (1986): 2023-2029。配列分析から、hokBはhok(宿主殺傷)遺伝子のホモログであることが示された。この報告で使用されているhokD遺伝子は大腸菌K12株のゲノムからPCRで増幅した。
mazF
mazF遺伝子は細菌の多くの種で見いだされており、mazE遺伝子との組み合わせの毒素抗毒素系を含み、その中のmazEは抗毒素として機能し、mazFは、一本鎖または二本鎖RNAに向かうリボヌクレアーゼ活性を示すことが示されていて、その結果として全体的に翻訳を阻害する毒素として機能する。Aizenman et al.,グアノシン3',5'-ビスピロリン酸によって調節される「大腸菌染色体」依存モジュール」:プログラムされた細菌細胞死のモデル」Proceedings of the National Academy of Sciences 93.12 (1996): 6059-6063。この報告で使用したmazF遺伝子は大腸菌K12株のゲノムからPCRで増幅した。
relE
relE遺伝子は大腸菌の中のtrelE-relB毒素-抗毒素系のメンバーであり、過剰発現したときにタンパク質の翻訳を阻害して可逆的細胞増殖を引き起こすことが示されている。翻訳阻害は、リボソームのA部位においてrelEが触媒となってmRNAを切断することから起こる。Pedersen et al.,「毒素と抗毒素の制御された発現による静菌条件の迅速な誘導と逆転」Molecular microbiology 45.2 (2002): 501-510。この報告で使用したrelE遺伝子は大腸菌K12株のゲノムからPCRで増幅した。
方法
表26は、宿主細胞の殺傷に関する推定毒素遺伝子の有効性を調べるため、大腸菌のゲノムに組み込まれる直線状のDNA断片を構成するのに使用したプライマーの名称と配列を示す。
DNA断片の構築
下記のリストは、断片をPCRで増幅するのに使用したプライマーのペア(と鋳型)を示しており、これらの断片が組み立てられて、大腸菌のゲノムに組み込まれるDNA断片を構成する。
1)ΔuidA::tetR_PXYL/Tet-sprA1_kanR
a)上流HA - DR_359/DR_409(大腸菌gDNA)
b)kanR - DR_407/DR_637(pCasSAプラスミド)
c)tetR_PXYL/tet - DR_634/DR_280(pRAB11プラスミド)
d)sprA1 - DR_278/DR_228(黄色ブドウ球菌gDNA)
e)下流HA- DR_362/DR_636(大腸菌gDNA、K12)
2)ΔuidA::tetR_PXYL/Tet-hokB_kanR
a)上流HA - DR_359/DR_409(大腸菌gDNA)
b)kanR - DR_407/DR_674(pCasSAプラスミド)
c)tetR_PXYL/tet - DR_634/DR_675(pRAB11プラスミド)
d)hokB - DR_672/DR_673(大腸菌gDNA、K12)
e)下流HA - DR_362/DR_636(大腸菌gDNA、K12)
3)ΔuidA::tetR_PXYL/Tet-hokD_kanR
a)上流HA -DR_359/DR_409(大腸菌gDNA)
b)kanR - DR_407/DR_661(pCasSAプラスミド)
c)tetR_PXYL/tet - DR_634/DR_244(pRAB11プラスミド)
d)hokD - DR_659/DR_660(大腸菌gDNA、K12)
e)下流HA - DR_362/DR_636(大腸菌gDNA、K12)
4)ΔuidA::tetR_PXYL/Tet-relE_kanR
a)上流HA - DR_359/DR_409(大腸菌gDNA、K12)
b)kanR - DR_407/BM_016(pCasSAプラスミド)
c)tetR_PXYL/tet - BM_017/DR_634(pRAB11プラスミド)
d)relE - BM_018/BM_019(大腸菌gDNA、K12)
e)下流HA - DR_362/DR_636(大腸菌gDNA、K12)
5)ΔuidA::tetR_PXYL/tet-yafQ_kanR
a)上流HA - DR_359/DR_409(大腸菌gDNA、K12)
b)kanR - BM_024/DR_407(pCasSAプラスミド)
c)tetR_PXYL/tet - BM_025/DR_634(pRAB11プラスミド)
d)yafQ - BM_052/BM_027(大腸菌gDNA、K12)
e)下流HA - DR_362/DR_636(大腸菌gDNA、K12)
6)ΔuidA::tetR_PXYL/Tet-mazF_kanR
a)上流HA - DR_359/DR_409(大腸菌gDNA、K12)
b)kanR - BM_049/DR_407(pCasSAプラスミド)
c)tetR_PXYL/tet - BM_013/DR_634(pRAB11プラスミド)
d)mazF - BM_015/BM_014(大腸菌gDNA)
e)下流HA - DR_362/DR_636(大腸菌gDNA)
1)ΔuidA::tetR_PXYL/Tet-sprA1_kanR
a)上流HA - DR_359/DR_409(大腸菌gDNA)
b)kanR - DR_407/DR_637(pCasSAプラスミド)
c)tetR_PXYL/tet - DR_634/DR_280(pRAB11プラスミド)
d)sprA1 - DR_278/DR_228(黄色ブドウ球菌gDNA)
e)下流HA- DR_362/DR_636(大腸菌gDNA、K12)
2)ΔuidA::tetR_PXYL/Tet-hokB_kanR
a)上流HA - DR_359/DR_409(大腸菌gDNA)
b)kanR - DR_407/DR_674(pCasSAプラスミド)
c)tetR_PXYL/tet - DR_634/DR_675(pRAB11プラスミド)
d)hokB - DR_672/DR_673(大腸菌gDNA、K12)
e)下流HA - DR_362/DR_636(大腸菌gDNA、K12)
3)ΔuidA::tetR_PXYL/Tet-hokD_kanR
a)上流HA -DR_359/DR_409(大腸菌gDNA)
b)kanR - DR_407/DR_661(pCasSAプラスミド)
c)tetR_PXYL/tet - DR_634/DR_244(pRAB11プラスミド)
d)hokD - DR_659/DR_660(大腸菌gDNA、K12)
e)下流HA - DR_362/DR_636(大腸菌gDNA、K12)
4)ΔuidA::tetR_PXYL/Tet-relE_kanR
a)上流HA - DR_359/DR_409(大腸菌gDNA、K12)
b)kanR - DR_407/BM_016(pCasSAプラスミド)
c)tetR_PXYL/tet - BM_017/DR_634(pRAB11プラスミド)
d)relE - BM_018/BM_019(大腸菌gDNA、K12)
e)下流HA - DR_362/DR_636(大腸菌gDNA、K12)
5)ΔuidA::tetR_PXYL/tet-yafQ_kanR
a)上流HA - DR_359/DR_409(大腸菌gDNA、K12)
b)kanR - BM_024/DR_407(pCasSAプラスミド)
c)tetR_PXYL/tet - BM_025/DR_634(pRAB11プラスミド)
d)yafQ - BM_052/BM_027(大腸菌gDNA、K12)
e)下流HA - DR_362/DR_636(大腸菌gDNA、K12)
6)ΔuidA::tetR_PXYL/Tet-mazF_kanR
a)上流HA - DR_359/DR_409(大腸菌gDNA、K12)
b)kanR - BM_049/DR_407(pCasSAプラスミド)
c)tetR_PXYL/tet - BM_013/DR_634(pRAB11プラスミド)
d)mazF - BM_015/BM_014(大腸菌gDNA)
e)下流HA - DR_362/DR_636(大腸菌gDNA)
上記のリストのすべての断片を、Q5 Hot Start DNAポリメラーゼ(NEB)を製造者の指示に従って用いてPCRで増幅し、1~2%アガロースゲル電気泳動を実施して鋳型DNAからうまく増幅されたことを確認した。次いでPCR断片をPCRクリーンアップキット(Qiagen)を用いて精製し、Report_SOP036に概略が記載されているステッチPCRのプロトコルによって組み立てた。プライマーのペアDR_362/DR_359を用い、それぞれの組み込みに用いる単一の直線状DNA断片を創出した。このPCR産物にはステッチPCRで使用される5つの断片(上流HA、kanR、tetR_PXYL/tet、推定毒素遺伝子、下流HA)が組み込まれている。
表27は、この報告で調べた推定毒素遺伝子とこの報告に記載されている推定毒素遺伝子のDNA配列を示す。
表28Aは、この報告に記載されている組み込み位置を標的とするための相同アームとして使用した二本鎖DNA配列の1つの鎖を示す。配列BP_DNA_075(配列番号40)について、下線を引いた配列はPXYL/tetプロモータ配列であり、太字部分はtetR遺伝子の配列である。BP_DNA_076(配列番号41)の中の太字部分はkanR遺伝子に対応する。
DNA断片を、形質転換されたDNAとゲノムの組み換えを容易にするのを助けるためRED遺伝子を含有するプラスミドpKD46を用いて大腸菌のゲノムに組み込んだ。この方法を利用して編集するためのプロトコルは以下の通りである:
1)Report_SOP030に概略が示されているプロトコルに従ってエレクトロコンピテント大腸菌細胞を作製し、プラスミドpKD46を用いてその新鮮なエレクトロコンピテントセルを形質転換する。
a)30℃で1時間回復させ、細胞をカルベニシリン(100 μg/mL)とともにLB寒天プレートに播種し、30℃で36~48時間インキュベートする。
2)コロニーを目視できるようになったとき、減菌接種ループを用いて単一コロニーを取り上げ、単一コロニーを単離するためカルベニシリン(100 μg/mL)とともに新鮮なLB寒天プレートに再び画線塗布し、そのプレートを30℃で36~48時間インキュベートする。
3)単一コロニーが増殖して十分なサイズになったとき、再びReport_SOP030に概略が示されているプロトコルに従い、以下の変更がある大腸菌pKD46エレクトロコンピテントセルを調製する:
a)形質転換の前にすべての増殖培地にカルベニシリンを添加して100 μg/mLの作業濃度にする。
b)細胞を30℃で一晩培養して増殖させる(1日目の工程1.4.)。
c)2日目の工程7において、30℃で2時間増殖させた後、3.5 mLの10%アラビノースを細胞培養物に添加し、フラスコを250 rpmで37℃の震盪培養器に移し、培養物をさらに45分間~1時間インキュベートする。
d)細胞が冷たく維持されるが凍結はしないように常に特に注意しながら、残りの工程に従って形質転換のための細胞を調製する。
e)400 ng超の直線状DNAを用いて大腸菌細胞を形質転換し、37℃で3時間回復させる。
f)さまざまな体積(25、100、250 μL)の回復した細胞を、50 μg/mLのカナマイシンが添加されたLB寒天プレートに播種し、そのプレートを37℃で一晩(16~24時間)インキュベートする。
4)翌日、相同アームの外側に結合するプライマーと、PXYL/Tetプロモータの後ろの推定毒素遺伝子に結合する1つのプライマーを用いたコロニーPCRによって細胞をスクリーニングした。
a)PCR産物の1%アガロースゲル電気泳動を実施し、組み込みに関して陽性のコロニーをチェックした。
b)組み込みに関して陽性だったコロニーはDNA挿入を持つため、周辺領域をシークエンシングして挿入された断片に変異がないことを確認した。
c)配列が確認されると単一コロニー単離のためそれを取り出し、増殖アッセイで使用して推定毒素遺伝子の誘導と過剰発現の効果を観察した。
1)Report_SOP030に概略が示されているプロトコルに従ってエレクトロコンピテント大腸菌細胞を作製し、プラスミドpKD46を用いてその新鮮なエレクトロコンピテントセルを形質転換する。
a)30℃で1時間回復させ、細胞をカルベニシリン(100 μg/mL)とともにLB寒天プレートに播種し、30℃で36~48時間インキュベートする。
2)コロニーを目視できるようになったとき、減菌接種ループを用いて単一コロニーを取り上げ、単一コロニーを単離するためカルベニシリン(100 μg/mL)とともに新鮮なLB寒天プレートに再び画線塗布し、そのプレートを30℃で36~48時間インキュベートする。
3)単一コロニーが増殖して十分なサイズになったとき、再びReport_SOP030に概略が示されているプロトコルに従い、以下の変更がある大腸菌pKD46エレクトロコンピテントセルを調製する:
a)形質転換の前にすべての増殖培地にカルベニシリンを添加して100 μg/mLの作業濃度にする。
b)細胞を30℃で一晩培養して増殖させる(1日目の工程1.4.)。
c)2日目の工程7において、30℃で2時間増殖させた後、3.5 mLの10%アラビノースを細胞培養物に添加し、フラスコを250 rpmで37℃の震盪培養器に移し、培養物をさらに45分間~1時間インキュベートする。
d)細胞が冷たく維持されるが凍結はしないように常に特に注意しながら、残りの工程に従って形質転換のための細胞を調製する。
e)400 ng超の直線状DNAを用いて大腸菌細胞を形質転換し、37℃で3時間回復させる。
f)さまざまな体積(25、100、250 μL)の回復した細胞を、50 μg/mLのカナマイシンが添加されたLB寒天プレートに播種し、そのプレートを37℃で一晩(16~24時間)インキュベートする。
4)翌日、相同アームの外側に結合するプライマーと、PXYL/Tetプロモータの後ろの推定毒素遺伝子に結合する1つのプライマーを用いたコロニーPCRによって細胞をスクリーニングした。
a)PCR産物の1%アガロースゲル電気泳動を実施し、組み込みに関して陽性のコロニーをチェックした。
b)組み込みに関して陽性だったコロニーはDNA挿入を持つため、周辺領域をシークエンシングして挿入された断片に変異がないことを確認した。
c)配列が確認されると単一コロニー単離のためそれを取り出し、増殖アッセイで使用して推定毒素遺伝子の誘導と過剰発現の効果を観察した。
結果:
上記の毒素はすべて、以前に記載した遺伝子tetRおよびkanRとともにゲノム大腸菌株にうまく組み込まれた。シークエンシングの結果は、ゲノムまたは周辺領域(組み込み部位の上流または下流約1000塩基)に挿入されたDNAに変異がないことを示していた。合成株を表28Bに示す。
表28Bに示されている新たに構成した大腸菌合成株の増殖アッセイを以下のようにして実施した。
1.新鮮な寒天プレート上の単一コロニーからの調べるべき毒素/株それぞれについて、1つの5 mLのLB+カナマイシン(50 μg/mL)培養物から出発する。37℃の震盪培養器の中で一晩(12~18時間)インキュベートする。
2.翌日、一晩培養物のOD600を測定する。
3.新鮮な5 mLのLB培地を接種してOD600を0.05にするのに必要な一晩(O-N)培養物の体積(V)を計算する、V=(0.05/O-N OD600)×5000 μL。
4.工程3で計算した体積の接種材料を用い、調べるそれぞれの株について2つのチューブのLB+カナマイシン(50 μg/mL)を接種する。
5.接種の直後かつチューブを37℃の震盪培養器に入れる前に、培養物を短時間ボルテックスして混合し、ODを初期ODの読みとして記録する(t=0)。OD(ほぼ0.05であるはず)が非常に小さくなるため希釈してはならない。
6.培養チューブを37℃の震盪培養器に1時間入れる。
7.1時間後、OD600の読みを測定して記録した後、4 μLの無水テトラサイクリン(ATc)(1 mg/mLの貯蔵溶液)を1セットの培養チューブに添加する(これを添加されたサンプルと呼ぶ)。
8.培養物を37℃の震盪培養器に戻し、OD600値を1時間ごとにさらに4時間にわたって測定して記録する。
9.記録したODを表に入力し、データをグラフにプロットして、調べたすべての株の増殖曲線を示す。下記のデータは、実験の複数の日から回収した。
1.新鮮な寒天プレート上の単一コロニーからの調べるべき毒素/株それぞれについて、1つの5 mLのLB+カナマイシン(50 μg/mL)培養物から出発する。37℃の震盪培養器の中で一晩(12~18時間)インキュベートする。
2.翌日、一晩培養物のOD600を測定する。
3.新鮮な5 mLのLB培地を接種してOD600を0.05にするのに必要な一晩(O-N)培養物の体積(V)を計算する、V=(0.05/O-N OD600)×5000 μL。
4.工程3で計算した体積の接種材料を用い、調べるそれぞれの株について2つのチューブのLB+カナマイシン(50 μg/mL)を接種する。
5.接種の直後かつチューブを37℃の震盪培養器に入れる前に、培養物を短時間ボルテックスして混合し、ODを初期ODの読みとして記録する(t=0)。OD(ほぼ0.05であるはず)が非常に小さくなるため希釈してはならない。
6.培養チューブを37℃の震盪培養器に1時間入れる。
7.1時間後、OD600の読みを測定して記録した後、4 μLの無水テトラサイクリン(ATc)(1 mg/mLの貯蔵溶液)を1セットの培養チューブに添加する(これを添加されたサンプルと呼ぶ)。
8.培養物を37℃の震盪培養器に戻し、OD600値を1時間ごとにさらに4時間にわたって測定して記録する。
9.記録したODを表に入力し、データをグラフにプロットして、調べたすべての株の増殖曲線を示す。下記のデータは、実験の複数の日から回収した。
結果が図23~26に示されている。
図23は、ゲノムに組み込まれた誘導性sprA1遺伝子を有する(4つの)異なる大腸菌(sprA1)株をLBの中で増殖させた増殖曲線のグラフを示す。点線はATcで誘導した培養物を表わし、実線はATcで誘導しなかった培養物を表わす。1時間の時点で培地にATcを添加した全4つの株は、アッセイ全体を通じ、ATcを添加しなかった培養物と比べて培養物の密度の有意な低下を示した。2つの異なるタイプの標的大腸菌株を使用した:株1、2、および15は大腸菌K12型標的株IM08Bに由来し、株16は、Udder Health Systemsから得られたウシ大腸菌標的株である。誘導されたすべての株が、2~5時間の時点で増殖の有意な減少を示した。
図24は、K12型大腸菌標的株IM08Bのゲノムに組み込まれた誘導性のhokB遺伝子またはhokD遺伝子を有する(4つの)異なる合成大腸菌単離体をLBの中で5時間にわたって増殖させた、OD600値としての増殖曲線のグラフを示す。接種してから1時間後にATcを培養物に添加することによってサンプルを誘導した。点線は、推定毒素遺伝子の発現を誘導するためATcを添加した培養物を表わし、実線は、ATcによって誘導されなかった培養物を表わす。hokDサンプルは、誘導されたサンプルと誘導されていないサンプルの間で乖離していく曲線を示した。hokB_1はUdder Health Systemsからのウシ大腸菌株であり、添加されたサンプルと添加されないサンプルは、ここで調べた他の3つの株よりもはるかに速く増殖した
図25は、relE遺伝子またはyafQ遺伝子がゲノムに組み込まれた2つの合成大腸菌株(n=3)を5時間にわたってLB(±ATc)の中で増殖させた、OD600値としての平均(n=3)増殖曲線のグラフを示す。点線は、推定毒素遺伝子の発現を誘導するためATcを添加した培養物を表わし、実線はATcによって誘導されなかった培養物を表わす。誤差棒は、それぞれの株の平均OD600値の1標準偏差を表わす。relE遺伝子は、誘導された培養物と誘導されていない培養物の間で乖離していく曲線を示し、誘導された培養物は有意に低いOD600の読みであった。誘導されたyafQ培養物は、2時間と4時間の間では誘導されていない培養物よりもわずかに遅い増殖を示したが、5時間の時点では2つの群はほぼ同じOD600値を持っていた。
mazF遺伝子がゲノムに組み込まれた合成大腸菌も、野生型ウシ大腸菌株(Udder Health Systems)も、t=1時間の時点の培養物へのATcの添加ありとなしでLBの中で増殖させたとき、5時間にわたって統計的に有意な増殖曲線は示さなかった(データは示さない)。
誘導性遺伝子に機能可能に連結された遺伝子sprA1、hokD、およびrelEがゲノムに組み込まれた合成大腸菌は、過剰発現したとき、液体培養物の中での増殖の有意な減少を示した。sprA1とhokDの両方とも、培養物の密度に対する素早い殺傷スイッチ活性を示したのに対し、relEは、誘導してから2時間後に宿主細胞に対する毒性効果を持つように見えた。
2つの異なる大腸菌標的株のゲノムをATc誘導性PXYL/Tetプロモータの制御下で改変し、推定大腸菌毒素hokB、hokD、relE、mazF、およびyafQと、既知の黄色ブドウ球菌毒素sprA1を組み込んだ。遺伝子hokD、sprA1、およびrelEが過剰発現した結果として合成大腸菌細胞培養物の光学密度が低下したため、これはそれら遺伝子が宿主細胞にとって毒素として機能することを示す。逆に誘導性プロモータに機能可能に連結されたhokB、mazF、およびyafQを含む大腸菌の過剰発現は、このアッセイの条件下では宿主細胞に対する毒性効果を示さなかった。
実施例15.滑液内の殺傷スイッチ
実施例15.滑液内の殺傷スイッチ
この実施例では、ヒト滑液(SF)における2つの合成黄色ブドウ球菌BP_109(殺傷スイッチ)とBP_121(対照)の表現型応答を評価した。
滑液は関節に見いだされる粘性液体である。滑液の2つの主要な機能は、関節包内の潤滑性を提供することと、周囲組織のための栄養素輸送媒体として機能することである。栄養素は血液血漿を通じて滑膜関節に輸送され、同様の廃棄生成物は血液によって滑液から運び去られる。血漿と同様、滑液は血清由来の流体である。滑液は本質的に超濾過血液血漿として始まる。そのため多くの滑液成分は血液血漿に由来しており、これら2つの体液のプロテオーム組成は非常によく似ていることが示されている。
敗血症性関節炎は関節組織の細菌感染によって起こる状態である。さまざまな微生物が敗血症性関節炎を引き起こす可能性があり、黄色ブドウ球菌はこの状態の1つの主要な原因である。敗血症性関節炎は、血流による体内の別の感染位置からの細菌の広がりが原因である可能性、または刺し傷または手術による関節への直接的な接種が原因である可能性がある。
血清、血漿、および滑液の間で出所が共有されていて組成が類似していることに基づき、殺傷スイッチを含む合成微生物は滑液の中で有効であり細胞の生存率を低下させると考えられることが予測された。2つの株BP_109とBP_121をアッセイのために選択した。BP_109は改変された殺傷スイッチ株であるのに対し、BP_121は対照群として機能する表現型野生型黄色ブドウ球菌である。対照BP_121(部位2::コード1)はPCRだけによる同定に用いるため、非コード領域にほんのわずかしか組み込まれていない。表29は、このアッセイで使用した合成黄色ブドウ球菌株のゲノムに挿入されたDNA断片の遺伝子型と配列を示す。
滑液アッセイで使用した培地を表30に示す。
表31は合成株で使用したDNA配列を示す。全DNAの挿入と欠失は二本鎖DNAである。上記の部分には一本鎖配列だけが掲載されている。
滑液アッセイのプロトコルは、下に示すように、培養物調製、段階希釈、播種、およびコロニーカウントを含む。
1.培養物の調製
1.1. 培養物は、14 mLの殺菌培養チューブの中で5 mLのTSBにBP_109とBP_121の単一コロニーを接種し、それを37℃かつ240 rpmにした震盪培養器の中に入れて一晩増殖させることから開始した。(生物学的レプリケートのためそれぞれ3つのチューブ)
1.2. 翌朝、5.5 mLの新鮮なTSBの中で一晩培養物のOD600を0.05に戻した。
1.2.1. OD600をNanoDrop分光光度計上の1 cmのキュベットの中で測定した。
1.2.2. 得られたOD600値を使用し、新鮮なTSBに0.05のOD600で接種するのに必要な一晩培養物の体積を計算した。
1.2.3. 新鮮な5.5 mLのTSB培養物に適切な体積の一晩培養物を接種して2時間(37℃、240 rpm)インキュベートし、細胞を再び対数増殖期で増殖させた。
1.2.4. 2時間のインキュベーションの後、OD600を各培養物について測定した。
1.2.5. 次いで培養物を減菌PBSの中で洗浄した。
1.2.5.1. スウィングアウトロータ(3500 rpm、5分間、室温)を用いて培養物を遠心分離して細胞をペレットにし、5 mLのPBSで洗浄した。
1.2.5.2. 培養物を遠心分離して細胞を再びペレットにし、1 mLの減菌PBSの中に再懸濁させた。
1.2.6. 2時間のインキュベーションの後に得られたOD600値を用い、1.8mLの滑液またはTSBを接種してOD600を0.05にするのに必要な体積を計算した。
1.2.6.1.(OD600測定値)(X mL)=(0.05 OD600)(1.8 mL)
1.2.7. 次に以下の培養物をあらかじめ37℃に温めて接種した:
1.2.7.1. TSBの中のBP_109(1つのチューブ)
1.2.7.2. 滑液の中のBP_109 in(3つのチューブ)
1.2.7.3. TSBの中のBP_121(1つのチューブ)
1.2.7.4. 滑液の中のBP_121(3つのチューブ)
1.2.8. 接種源の添加後、培養物をパルス撹拌によって混合し、100 uLのサンプルを採取して平板希釈によりcfu/mLを求めた(下記参照)。
1.2.9. 培養物をただちに37℃の震盪培養器(240 rpm)の中に入れ、サンプルを2時間後に採取し、そして再び4時間後に採取し、平板希釈によってcfu/mLを求めた。
2.段階希釈と培養物の播種
2.1. Report_SOP017に記載されているプロトコルに従ってOpentrons OT-2ロボットを用いて平板希釈を実施した。
2.1.1. TSプレートに播種した100 μLの希釈サンプルから30~300個のコロニーが増殖する濃度になるまで希釈を実施した。
3.インキュベーションとコロニーのカウント
3.1. TSAプレートを37℃で12~16時間にわたって一晩インキュベートした。
3.2. 翌朝、プレートを培養器から取り出し、コロニーをカウントして各時点で生きている細胞の濃度(cfu/mL)を求めた。
3.2.1. 複数の希釈液をそれぞれの時点でそれぞれの条件について二連で播種し、30~300個のコロニーがあるプレートだけを用いてcfu/mL値を計算した。
1.培養物の調製
1.1. 培養物は、14 mLの殺菌培養チューブの中で5 mLのTSBにBP_109とBP_121の単一コロニーを接種し、それを37℃かつ240 rpmにした震盪培養器の中に入れて一晩増殖させることから開始した。(生物学的レプリケートのためそれぞれ3つのチューブ)
1.2. 翌朝、5.5 mLの新鮮なTSBの中で一晩培養物のOD600を0.05に戻した。
1.2.1. OD600をNanoDrop分光光度計上の1 cmのキュベットの中で測定した。
1.2.2. 得られたOD600値を使用し、新鮮なTSBに0.05のOD600で接種するのに必要な一晩培養物の体積を計算した。
1.2.3. 新鮮な5.5 mLのTSB培養物に適切な体積の一晩培養物を接種して2時間(37℃、240 rpm)インキュベートし、細胞を再び対数増殖期で増殖させた。
1.2.4. 2時間のインキュベーションの後、OD600を各培養物について測定した。
1.2.5. 次いで培養物を減菌PBSの中で洗浄した。
1.2.5.1. スウィングアウトロータ(3500 rpm、5分間、室温)を用いて培養物を遠心分離して細胞をペレットにし、5 mLのPBSで洗浄した。
1.2.5.2. 培養物を遠心分離して細胞を再びペレットにし、1 mLの減菌PBSの中に再懸濁させた。
1.2.6. 2時間のインキュベーションの後に得られたOD600値を用い、1.8mLの滑液またはTSBを接種してOD600を0.05にするのに必要な体積を計算した。
1.2.6.1.(OD600測定値)(X mL)=(0.05 OD600)(1.8 mL)
1.2.7. 次に以下の培養物をあらかじめ37℃に温めて接種した:
1.2.7.1. TSBの中のBP_109(1つのチューブ)
1.2.7.2. 滑液の中のBP_109 in(3つのチューブ)
1.2.7.3. TSBの中のBP_121(1つのチューブ)
1.2.7.4. 滑液の中のBP_121(3つのチューブ)
1.2.8. 接種源の添加後、培養物をパルス撹拌によって混合し、100 uLのサンプルを採取して平板希釈によりcfu/mLを求めた(下記参照)。
1.2.9. 培養物をただちに37℃の震盪培養器(240 rpm)の中に入れ、サンプルを2時間後に採取し、そして再び4時間後に採取し、平板希釈によってcfu/mLを求めた。
2.段階希釈と培養物の播種
2.1. Report_SOP017に記載されているプロトコルに従ってOpentrons OT-2ロボットを用いて平板希釈を実施した。
2.1.1. TSプレートに播種した100 μLの希釈サンプルから30~300個のコロニーが増殖する濃度になるまで希釈を実施した。
3.インキュベーションとコロニーのカウント
3.1. TSAプレートを37℃で12~16時間にわたって一晩インキュベートした。
3.2. 翌朝、プレートを培養器から取り出し、コロニーをカウントして各時点で生きている細胞の濃度(cfu/mL)を求めた。
3.2.1. 複数の希釈液をそれぞれの時点でそれぞれの条件について二連で播種し、30~300個のコロニーがあるプレートだけを用いてcfu/mL値を計算した。
滑液アッセイの結果が、4時間増殖アッセイの間にTSBとヒト滑液の中で増殖させた合成黄色ブドウ球菌BP_109とBP_121細胞のグラフ濃度を示す図26に示されている。BP_121(対照)培養物とBP_109(殺傷スイッチ)培養物の両方がTSBの中で増殖した。BP_109は滑液条件において生きているcfu/mLの急速な減少を示した。
本研究は、BP_109がヒト滑液の中でヒト血漿およびヒト血清の中でと同じように振舞うことを実証した。滑液の中のBP_109は、アッセイの最初の2時間で生きているcfu/mLの有意な低下を示し、4時間後まで残ったのはほんの数個の生きているコロニーであった。逆にBP_121は、滑液の中で、BP_121およびBP_109のTSB対照群と同様の速度で増殖した。このアッセイの結果は、遺伝子操作された殺傷スイッチ株BP_109が設計通りに機能するという結論を支持する。殺傷スイッチはヒト滑液の中で活性化されるように見え、この体液中の生きている細胞の濃度を大きくかつ突然低下させる。
実施例16.脳脊髄液の中の殺傷スイッチ
実施例16.脳脊髄液の中の殺傷スイッチ
この実験では、2.5%ヒト血清で強化したウサギ脳脊髄液(CSF)における合成黄色ブドウ球菌株BP_109(殺傷スイッチ)とBP_121(対照)の表現型応答を評価した。BP_109は血清強化CSFにおいてヒト血漿、ヒト血清、およびヒト滑液におけるのと同様に機能した。血清強化CSFの中のBP_109は6時間の期間にcfu/mLの有意な低下を示した。
脳脊髄液は、中枢神経系(CNS)を取り囲む透明な液体である。CSFはCNSのクッションとなる物理的障壁として主に機能し、脳血流の自己調節に関与する。それに加え、CSFは輸送培地として機能し、栄養素を血流から周囲組織に提供して廃棄物を除去するため、「滋養酒」と呼ばれることがしばしばある。栄養素輸送培地としてのこの特徴にもかかわらず、CSFは血液血漿と比べて栄養素が乏しい環境である。細菌の多くの種が、黄色ブドウ球菌を含め、インビトロではCSFの中でほとんど増殖しないかまったく増殖しないことが報告されている。この現象は、栄養素封鎖を通じて侵入してくる細菌から中枢神経系を保護する進化的手段であると考えられよう。それに加え、CSFは脳と脊髄を取り囲む膜である髄膜によって微生物の侵入から保護される。CSFは最も内側の2つの髄膜であるクモ膜と軟膜の間のクモ膜下腔を占める。これら組織の細菌感染は髄膜炎と呼ばれる炎症を生じさせるAguilar et. al.「黄色ブドウ球菌髄膜炎の症例集と文献レビュー」Medicine, vol. 89, no. 2, pp. 117-125, 2010。
黄色ブドウ球菌髄膜炎が発生する可能性のある2つのシナリオが存在する。第1は術後髄膜炎である。これは、CSFを包含する髄膜ライニングの構造的完全性が手術の間に損なわれるときに起こる。こうした状況では、感染は、細菌が手術中に侵入して近傍との接触感染から広がるか、CSFシャントを通って侵入するときに起こりうる。黄色ブドウ球菌髄膜炎の第2の病因機構は血行性髄膜炎として知られており、これはCNS外での感染から菌血症が広がることによって起こる二次的感染である。メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)髄膜炎の場合には、大半が院内感染に起因することが報告されている。Pinado et al.「成人におけるメチシリン耐性黄色ブドウ球菌髄膜炎」Medicine, vol. 91, no. 1, pp. 10-17, 2011。
インビトロでは黄色ブドウ球菌は健康な脊髄液の中で比較的増殖できないため、生体内で潜在的に感受性のある状態を模倣する条件を創出することが適切であるように思われた。本研究では、通常は高度に保護されている脳脊髄液環境が栄養素の豊富な血清で汚染され、したがって感染に対して感受性のある環境が作り出されるという擾乱状態を模倣した条件下で、CSFにおける殺傷スイッチを有する合成黄色ブドウ球菌の有効性を調べた。ウサギCSFに2.5%ヒト血清を添加した。この低レベルの血清の添加によりBP_109において殺傷スイッチを活性化するのに十分な代謝活性が刺激され、その結果として生存率が劇的に低下すると仮定した。実施例15に記載されているように、BP_121(対照)と、殺傷スイッチゲノム改変を含む合成株BP_109でCSFアッセイを実施した。
CSFアッセイのプロトコルは実施例15に記載されているのと同様だったが、滑液を、汚染されたCSF、すなわち2.5%ヒト血清を添加したウサギCSF(ニュージーランド白ウサギウサギ脳脊髄液、BioChemed)で置き換えた点が異なる。
図27は、6時間アッセイの期間中のTSBと血清強化CSFの中の生きているBP_109細胞とBP_121細胞の濃度のグラフを示す。BP_121(対照)とBP_109(殺傷スイッチ)培養物の両方がTSBの中で増殖した。BP_121は2.5%ヒト血清で強化したCSFの中でも増殖した;しかしBP_109はそのCSF条件でcfu/mLの急速な低下を示した。
この実験で脳脊髄液におけるBP_109とBP_121の表現型応答を評価した。両方の株が黄色ブドウ球菌502aの遺伝子操作されたバージョンであるが、BP_121は非コード領域にほんの小さな組み込みを持ち、表現型野生型である。BP_109は、502a(BP_001)の遺伝子操作された殺傷スイッチ株であり、ヒト血清、血漿、および滑液に導入された後にcfu/mLが有意に低下することが以前に示されている。
黄色ブドウ球菌は生命を脅かす髄膜炎を引き起こすことができるという事実にもかかわらず、以前の研究では、インビトロでそれが容易に増殖したり死んだりすることはなく、CSFの中にむしろ安定なまま残ることが示されている。そのためヒト血清(2.5%)をCSFに添加して増殖に必要な基本的栄養素を提供した。これらの血清強化CSF条件下でBP_109は生存率が数桁低下した。このアッセイの結果は、遺伝子操作された殺傷スイッチ株BP_109が汚染されたCSFの中で設計されたように機能するという結論を支持する。殺傷スイッチは2.5%血清強化ウサギCSFの中で活性化されるように見え、BP_109は死亡する。
実施例17.菌血症の生体内研究黄色ブドウ球菌
実施例17.菌血症の生体内研究黄色ブドウ球菌
殺傷スイッチ(KS)技術で改変した2つの黄色ブドウ球菌微生物を尾の静脈に注射したマウスにおける臨床効果(菌血症)を、野生型(WT)黄色ブドウ球菌(SA)と比較する菌血症マウスの生体内研究。
この研究では、10^7 CFU/マウスの合成黄色ブドウ球菌(KS)を注射されたすべてのマウスが研究の8日間全体を生き延び、健康であり、臨床症状がなく、体重を維持することを実証した。すべての陽性対照(10^7 CFU/マウスのWT SAを注射されたマウス)が死亡するか、瀕死と判断されて倫理的基準によって安楽死させられた。
正常な体重は、初期体重の15%以内の体重と定義した。
殺傷スイッチゲノム改変を含有する黄色ブドウ球菌の合成株は、本明細書に記載されているように、ヒト血漿、ヒト血清、ヒト滑液、および汚染されたウサギ脳脊髄液のインビトロアッセイで優れた有効性を示した。この菌血症研究は、尾の静脈に注射した後の菌血症の予防における2つのKS改変ブドウ球菌株BP_109とCX_013の有効性を調べるために計画された(表32)。BP_001とCX_001は、それぞれBP_109およびCX_013と同じ系譜の野生型生物であるため、研究に陽性対照として含めた。
インビトロでの合成KS株の殺傷スイッチ活性に基づき、殺傷スイッチは生体内でも設計したように機能し、血流に入ったときに人工的にプログラムされた細胞死を開始すると仮定した。殺傷スイッチ群のマウスは健康なままで菌血症感染症を発症しないことと、野生型群は重い菌血症を発症するか瀕死と診断されて安楽死させられることが予想された。研究の結果はこれら予想と合致した。
材料
マウス菌血症研究で使用するため2つの生物をBioPlxで操作した。その2つの合成黄色ブドウ球菌生物は、表32に示されているように、それぞれBP_109およびCX_013と名づけられており、生物BP_001とCX_001のゲノムを変化させることを通じて作製された。
表33は、使用した株と、細胞の標的濃度(単位はCFU/マウス)を示す。
方法
試験物品の調製
試験物品を以下のようにして調製した。簡単に述べると、それぞれの株の単一コロニーを取り上げ、液体トリプティックソイブロス(TSB)の中で一晩増殖させた。それぞれの株について、1 mLの一晩培養物を100 mLの新鮮なTSBに接種した後、さらに14時間インキュベートした。この14時間のインキュベーション期間の後、細胞をリン酸塩緩衝化生理食塩水(PBS)で3回洗浄し、サンプルを段階希釈し、トリプティックソイ寒天(TSA)プレートに播種してCFU/mLを求め、細胞を4℃で一晩保管した。
翌日、CFUプレートをカウントして実際の濃度を求めた。PBS細胞溶液のCFU/mL細胞濃度の計算値を用い、最終試験物品を適切な濃度で調製した。BP_001のアリコートを作り、70%イソプロピルアルコールで処理して細胞を殺傷した後、PBSで3回洗浄してアルコールをすべて除去した。アルコール処理群をインキュベートしている間、残りの治療群をPBS細胞溶液から調製した。次いで試験物品を施設に手渡しし、そこで投与と観察がなされた。
非GLPマウス研究
非GLP探索的研究を実施した。5匹の雄のBALB/cマウスを実験のためそれぞれの群に割り当てた。研究の0日目、各動物に尾の静脈への静脈内注射によってビヒクルとしての減菌PBSを投与した。群ごとの処置と用量が(表33)に示されている。
文献での報告に従い、菌血症研究のほか静脈内注射のための適切なモデルとしてBALB/cマウスを選択した。Stortz et al.「敗血症と外傷のマウスモデル:われわれはギャップに橋を架けることができるか?」ILAR journal 58.1 (2017): 90-105。細菌のレベル(10^7 CFU/マウス)は、同じ種と似た年齢のマウスにおける菌血症の効果を研究する似た査読済みの論文に基づいて選択した。van den Berg et al.「軽い黄色ブドウ球菌皮膚感染が、マウスにおけるその後の内在性黄色ブドウ球菌菌血症を改善する」PloS one 10.6 (2015): e0129150。注射の前に動物を48時間かけて新しい環境に馴化させた後、体重を研究の0日目に取得して記録した。体重を研究期間中は毎朝1回測定した。死亡と瀕死状態のチェックを研究期間中は1日に2回(朝に1回と晩に1回)実施した。20%以上の体重減少を経験した動物は安楽死に適すると見なした。
すべての手続きで、動物の飼育と取り扱いのためのUSDAガイドラインに従った。研究設計と動物の利用はUSDA認証(84-R-0081)によって承認され、OLAWが、研究を実施する施設を保障した(A4678-01)。
結果
投与前の体重は21.9~30.7 gの範囲であった。臨床所見と体重測定は、群4からの1匹のマウスで研究の2日目に低活性が1回観察されたことを除き、群1、2、4、および6(陰性対照と殺傷スイッチ試験群)に関してすべて正常であった。
多くの異常な臨床所見(の非限定的な例)に含まれるのは、有意な体重減少、荒れた毛並み、目からの乳状の分泌物、および死であり、それが、群3と5(陽性対照)のすべてのマウスで観察された。群3(BP_001対象)からのすべての動物が研究の終了時に死亡していた。群5(CX_001対象)からの5匹の動物のうちの3匹が研究の終了時に死亡しており、生き延びた2匹は20%超の体重減少があったため両方とも安楽死に適していると宣告された。
菌血症の結果が図28に示されている。興味あるそれぞれの群について体重を平均して規格化することによってグラフの値を得た。規格化は、それぞれの時点における群の(平均)体重を群の初期(平均)体重で割ることによって実施した。それぞれの時点の平均は、生き延びたマウスだけを用いて得た。グラフの下に有害な臨床所見と死亡を表わす記号が示されている。
マウスの生体内で、尾の静脈に殺傷スイッチ(KS)技術で改変された黄色ブドウ球菌(SA)、または野生型(WT)標的株を10^7注射した後のマウスモデルにおける臨床効果(菌血症)を比較する菌血症研究を実施した。KS技術で改変された生物は、哺乳類宿主の血液、血清、または血漿と相互作用したときに人工的にプログラムされた細胞死を開始するように設計した。
次の観察までに解決した低活性が1件観察されたことを除き、尾の静脈を通じてKS生物と陰性対照を静脈内注射されたすべてのマウスが研究期間を通じて健康であり、有害な臨床症状がなかった。WT生物を注射されたすべてのマウスが多彩な異常臨床所見、顕著な瀕死状態を経験し、死亡するか、倫理基準により安楽死に適合した。この研究は殺傷スイッチKS技術の有効性と安全性を実証しており、すべての試験対象が研究の8日間にわたって100%生存し健康であった。殺傷スイッチを含む合成黄色ブドウ球菌株は、感染性疾患の予防と治療のための方法で使用すると、保護する生物のリスクを有意に小さくする可能性がある。
実施例18.SSTI生体内研究黄色ブドウ球菌
実施例18.SSTI生体内研究黄色ブドウ球菌
生体内研究を実施し、野生型(WT)黄色ブドウ球菌(SA)の皮下注射を受けたマウスと、殺傷スイッチ(KS)技術で改変した2つのSA生物の皮下注射を受けたマウスにおける臨床効果(皮膚・軟部組織感染症)を比較した。研究期間は10日間であった。
この研究では、10^7の合成黄色ブドウ球KS株を注射されたすべてのマウスが研究期間中は健康を臨床症状(すなわち膿瘍形成なし)と体重維持の両方で示したのに対し、陽性対照(WT SA株を注射されたマウス)の半数が膿瘍を発達させた。
マウスの生体内での皮膚・軟部組織感染症(SSTI)の研究を、皮下注射後のSSTIの予防における2つのKS改変SA株であるBP_109とCX_013の有効性を調べるために設計した(表34)。BP_001とCX_001はそれぞれBP_109およびCX_013と同じ系譜の野生型(WT)生物であり、研究に陽性対照として含まれた。インビトロと生体内での菌血症研究で達成された殺傷スイッチの有効性に基づき、KSは皮下注射後に生体内でも機能し、体内の皮膚の下に入ると人工的にプログラムされた細胞死を開始させると仮定した。KS群のマウスは研究期間を通じて健康を維持し、SSTI感染症を発症しないであろうことが予測された。WT群は膿瘍形成が発達する(SSTIを示す)ことが予想された。
材料
表34に示されているように、SSTI研究では、BP_109およびCX_013と名づけた2つの合成黄色ブドウ球菌KS株と、2つのWT標的微生物BP_001およびCX_001を使用した。
表35は、SSTI研究で用いた治療群、標的用量、および株のタイプを示す。
SC - 皮下注射;Neg - 陰性;Pos - 陽性;WT - 野生型;KS - 殺傷スイッチ
試験物品の調製
試験物品は、Malachowaら、2013年によって記載されているプロトコルに従って調製した。Malachowa, Natalia, et al.「黄色ブドウ球菌皮膚感染症のマウスモデル」Mouse Models of Innate Immunity. Humana Press, Totowa, NJ, 2013. 109-116。
簡単に述べると、それぞれの株の単一コロニーを取り上げて液体トリプティックソイブロス(TSB)の中で一晩増殖させた。それぞれの株について、1 mLの一晩培養物を用いて100 mLの新鮮なTSBに接種した後、さらに14時間インキュベートした。その14時間のインキュベーション期間の後、細胞をリン酸塩緩衝化生理食塩水(PBS)で3回洗浄し、サンプルを段階希釈し、トリプティックソイ寒天(TSA)プレートに播種してCFU/mLを求め、細胞を4℃で一晩保管した。翌日、CFUプレートをカウントし、実際の濃度を求めた。PBS細胞溶液のCFU/mL細胞濃度の計算値を用い、最終試験物品を適切な濃度で調製した。BP_001の1つのアリコートを作製し、70%イソプロピルアルコールで処理して細胞を殺傷した後、PBSで3回洗浄してアルコールをすべて除去した。アルコール処理群をインキュベートしている間に、残りの治療群をPBS細胞溶液から調製した。次いで試験物品を施設に手渡しし、そこで投与と観察がなされた。
非GLP探索研究を10日間にわたって実施した。5匹の雄のBALB/cマウス(Charles River)を実験のため各群に割り当てた。研究0日目に各動物にビヒクルとして減菌PBSを皮下に1回投与し、注射後10日間にわたって観察した。群ごとの治療と用量が表35に示されている。細菌のレベル(10^7 CFU/マウス)は、同じ種と似た年齢のマウスにおけるSSTIと全身細菌効果を研究する似た査読済みの論文に基づいて選択した。注射の前に動物の注射部位を取り囲む領域(背面)から体毛を除去した。動物は、体毛を除去する前と後の両方に十分な時間かけて馴化させて安定化した。研究0日目に体重を取得して記録した。注射部位/膿瘍の画像をすべての群のすべての対象について1日に1回撮影した。存在する膿瘍をノギスを用いて1日に1回測定した(長さと幅)。研究期間中、体重を毎朝1回測定した。死亡と罹患を週日は1日に2回(朝に1回と晩に1回)、週末は1回チェックした。20%以上の体重減少を経験した動物を安楽死に適した瀕死と見なした。すべての手続きで、飼育と取り扱いのためのUSDAガイドラインに従った。研究設計と動物の利用はInstitutional Animal Care and Use Committee(IACUC)によってUSDA認証(84-R-0081)において承認され、OLAWが施設を保障した(A4678-01)。
図29は、10日の研究期間にわたって膿瘍形成またはその欠如によって測定したときのSSTI研究における動物の健康のグラフを示す。群4(BP_109)と6(CX_013)それぞれのマウスは、それぞれその野生型親株BP_001およびCX_013と比べ、この研究の期間を通じて健康を維持した。陰性対照群1(ビヒクル)と2(殺傷されたWT BP_001)の全動物は研究を通じて健康なままであったため、示さない。
研究1日目(注射の翌日)、臨床所見は陰性対照群1と2のマウスで正常だった。同様に、KS群(群4と6)のどのマウスも、1件のわずかな反応を除き、注射の1日後に有害な臨床所見を示さなかった。小さな明るい色のこぶが、群4(BP_109)からの1匹のマウスで研究1日目に観察された。研究2日目までにそのこぶは群4のマウスにもはや存在しておらず、KS群からのすべてのマウスが良好な健康を維持し、研究の残り期間は有害な臨床所見がなかった。注射部位の画像を回収した(図1~2)。
逆に、WT陽性対照群のマウスの半数は、研究開始後しばらくして感染の徴候を示し始めた。WT陽性対照群からの10匹のマウスのうちの5匹が研究1日目までに膿瘍形成を経験した。その中には、群3(BP_001)からの2匹のマウスと、群5(CX_001)からの3匹のマウスが含まれていた。BP_001群における感染の徴候は、最初は黄色い形成物として現われ、それがすぐに進行して大きな灰白色の膿瘍になり、炎症を起こした赤い縁部で取り囲まれた。膿瘍は研究の残りの期間にわたって群3の両方のマウスに存在していた。
群5におけるSSTIは小さな赤い膿瘍として出現し、群5の中の1匹のマウスは研究の9日目までに正常な臨床所見に戻ったことが観察された。群5の中の他の2匹のマウスは研究期間中に膿瘍が存在していなかった。
投与前のマウスの体重は19.0 g~24.1 gの範囲であった。すべての対象が正常な体重を研究期間中維持した。したがって二項分布に関する仮説検定を利用してKS試験の対象を陽性対照の対象と比較して有意差を探した。これは株導出によって実施した;すなわちBP_109をBP_001と比較し、CX_013をCX_001と比較した。表36に示したように、膿瘍形成のある動物には値1を割り当て、膿瘍形成のない動物には値0を割り当てた。WT SA皮下注射と比べると、BioPlx KS群はより少ないSSTIを示し、有意であった(p<0.01)。
統計分析
研究に含まれるどの群でも体重の偏差は生じなかったため、2値スコアを用いて群を絶対測定によって比較した。研究中のあらゆる膿瘍形成はマウスに1の値を割り当て、研究中の膿瘍形成の完全な不在はマウスに0の値を割り当てた。そのため結果は以下のようであった:
膿瘍形成=1;膿瘍形成なし=0
二項分布に関する仮説検定を利用して群を親/娘株によって比較した。言い換えると、この分析を利用してBP_001をBP_109と、CX_001をCX_013と比較した。というのも後者は前者から導出されたからである。確率をWT群の膿瘍形成の存在によって割り当て、アルファを信頼性99%に設定した。
二項分布に関する仮説検定から、両方の株について試験群の5匹のマウスのうちの5匹に膿瘍がないはずであることが信頼性99%で明らかになった。試験群BP_109とCX_013の両方からの全5匹のマウスには完全に膿瘍がなかったため、両方の試験群は比較するWT群とp値<0.01で有意に異なると報告することができる。
このSSTI研究では、研究1日目に試験対象に起こって2日目の朝までに解決した1件の小さな反応を除き、SA KS生物と陰性対照を皮下に注射したすべてのマウスが研究期間中は健康で正常であった。WT SA生物を注射したマウスの半数に、研究の大半の期間にわたって膿瘍形成が存在していた。
実施例19.菌血症とSSTIの研究高用量黄色ブドウ球菌
実施例19.菌血症とSSTIの研究高用量黄色ブドウ球菌
菌血症とSSTIのこの高用量生体内研究は、4つの合成KS改変黄色ブドウ球菌株がマウスモデルにおいて菌血症と皮膚・軟部組織感染症(SSTI)を予防する能力の上限を調べるために設計された。
研究の目的は、黄色ブドウ球菌(Staph aureus)の異なる合成株と野生型株をそれぞれ尾に静脈内注射するか、皮下注射したマウスにおける臨床効果(菌血症とSSTI膿瘍)を比較することであった。
高用量菌血症研究では、マウスに高濃度(10^9 CFU/マウス)の黄色ブドウ球菌合成株BP_123とCX_013(両方とも殺傷スイッチ技術で改変されている)を静脈内注射した。すべてのマウスが研究期間中は良好な健康状態で生存し、注射と同じ日である研究0日目にだけ臨床症状が出現した。
高用量SSTI研究では、マウスは皮下に高濃度(10^9 CFU/マウス)の殺傷スイッチ付き生物BP_123とCX_013を注射された、もこれら2つの群に膿瘍形成がなく良好な健康状態であったのに対し、比較用野生型群はすべて重度の膿瘍を発達させた。
「膿瘍」は、急性の永続的な炎症応答の結果として封止状態または破裂状態の膿状材料が蓄積したことを目視できることと定義した。10^9 CFUの黄色ブドウ球菌を注射するには、その蓄積した材料が3日超にわたって存在していて永続的膿瘍と認められねばならない。
材料
4つの生物を指定して本研究で使用した。その4つの改変された生物をBP_092、BP_109、BP_123、およびCX_013と名づけた。BP株とCX_013株は、それぞれ野生型生物BP_001とCX_001の改変を通じて生成させた。本研究で使用した株を表37に示す。
表38は、各群で使用した株と、細胞の標的濃度(単位はCFU/マウス)を示す。陰性対照は1.00E+09 CFU/マウスの用量で調製し、注射前に熱で殺した。
方法
試験物品の調製
この研究で使用する試験物品は以下のようにして調製した。簡単に述べると、一晩培養物を震盪フラスコの中で増殖させた。翌日、細胞を回収して濃縮した。各株の同一のアリコートを複数調製し、クライオバイアルの中で-80℃にて凍結させた。いくつかの凍結アリコートを後に解凍し、リン酸塩緩衝化生理食塩水(PBS)で3回洗浄し、元の体積のPBSの中に再懸濁させ、平板希釈によってCFUのカウントを実施した。濃度が既知の残った凍結アリコートを-80℃で保管した。動物モデル研究で使用する直前に、濃度が既知のアリコートを解凍し、PBSで洗浄し、適切な体積のPBSの中に再懸濁させて標的濃度に到達させた。各試験物品の濃度を平板希釈によって求め、各試験物品の表現型を血清アッセイによって確認した(データは示さない)。
非GLPマウス研究
非GLP探索的7日研究を実施した。5匹の雄のBALB/cマウスを各群1~14に割り当てた。初期体重測定のため各動物を注射の直前に計量した。研究の0日目に各動物にビヒクルとして減菌PBSを1回投与し、注射後7日間観察した。群ごとの治療と用量が表38に示されている。
10^7 CFU/マウスを用いた本明細書に記載の以前の2つの動物研究に基づき、高レベルの細菌(10^9 CFU/マウス)を選択した。本研究は保護する生物の上限を調べるために設計したため、100倍の用量増加を選択した。
高用量菌血症研究において群1~7に属する動物に黄色ブドウ球菌を10^9 CFU/マウスで尾の静脈に50 μL静脈内注射し、観察して菌血症感染の臨床所見を探した。
高用量SSTI研究の群8~14に属する動物に黄色ブドウ球菌を10^9 CFU/マウスで100 μL皮下注射し、観察してSSTIの臨床所見(主に膿瘍形成)を探した。注射の前に皮下注射を受ける動物の注射部位を取り囲む領域(背面)から体毛を除去し、膿瘍形成を観察した(群8~14)。
皮下に殺傷スイッチ付き黄色ブドウ球菌を注射したマウスに形成される可能性のあるあらゆる膿瘍の原因をよりよく理解するため、マウスを安楽死させた後、膿瘍内の体液のサンプルを減菌接種ループを用いて採取し、膿瘍内に存在する可能性のあるあらゆる細菌を培養するため非選択寒天培地に播種した。プレート上で増殖したコロニーをPCRによってスクリーニングし、試験物品群に関係する、ゲノムに組み込まれた殺傷スイッチを探した(データは示さない)。
結果
投与前の体重は17.3 g~22.4 gの範囲であった。すべての動物(群1~14)に十分な馴化時間を与えて(適用可能な群については体毛除去の前と後の両方)安定化させた。表39は、菌血症群1~7の臨床所見を示す。
WT - 野生型;KS - 殺傷スイッチ;CFU - コロニー形成単位;IV - 静脈内注射
表39は、両方のWT陽性対照群(BP_001とCX_001を静脈内注射したマウス)からの全10匹の動物が注射に対して重い有害な反応を経験し、それぞれ5日目と2日目までにすべて死亡したことを示す。他方で、2つのKS試験群からの全10匹の動物(BP_123とCX_013を静脈内注射したマウス)は、注射と同じ日である0日目の何件かの反応を除き、良好な健康と体重を7日研究の全期間にわたって維持した。KS試験群BP_109の動物のうちの2匹は、良好な健康と体重を7日研究の全期間にわたって維持した。この群からの別の2匹は注射後に病気になって回復することがなく、2匹とも3日目までに死亡した。注射後2時間以内に死亡したこの群からの別の2匹の動物がいた- 1匹は原初のメンバーであり、もう1匹は原初のメンバーの代わりである。KS試験群BP_092からの全5匹の動物は陽性対照群と似た反応を経験し、研究の1日目までに死亡した。陰性対照群の殺されたBP_001からの全5匹の動物は、研究の全期間を通じて良好な健康と体重を維持した。
図30は、高用量菌血症研究において群1~7に高用量10^9の黄色ブドウ球菌を注射した後のマウスの健康、体重、および生存を示す。グラフの数値は、興味ある各群の体重を平均し、規格化することによって得た。規格化は、それぞれの時点における群(平均)体重を初期の群(平均)体重で割り、その値に100%を掛けることによって実施した。それぞれの時点の体重平均は、生き延びているマウスだけを用いて得た。図30の下部の記号は有害臨床所見と死亡を表わす。†群4 BP_109 10^9 CFU/マウス群だけが、4匹の動物を含む。というのも2匹のマウス(BP_109群の原初のメンバーとその代わり)が注射から2時間以内に死亡したが、それは菌血症の典型的な進行でないか、野生型黄色ブドウ球菌を注射された群と似ていないからである。したがってこれらを分析から除外した。表40は、高用量SSTI群8~14の臨床所見を示す。
WT - 野生型;KS - 殺傷スイッチ;CFU - コロニー形成単位;SC - 皮下注射
* 10^9 CFU/マウスの濃度の黄色ブドウ球菌を注射したマウスでの膿瘍の定義により、膿状材料の目に見える蓄積が3日超持続したため膿瘍と見なさねばならない。
† CX_013(13002)を注射した1匹のマウスで5日目に膿瘍が形成され、研究の最終日である7日目に小さな膿瘍がまだ存在していた。膿瘍が3日間を超えて持続するかどうかは明言できないが、2匹の同様のマウス(13005と12004)から内挿すると3日以内に消える可能性が大きかった。
‡BP_109は、他の菌血症群では10^9 CFUの用量で、ヒトではヤーリッシュ-ヘルクスハイマー反応として知られる状態と似た重い免疫応答を引き起こすことが示されており、それがこの群において膿瘍形成の原因となった可能性がある。
表40をまとめると、両方のWT陽性対照群からの全10匹の動物(BP_001とCX_001を皮下注射したマウス)が、研究中に膿瘍を発達させた。CX_001群(群9)からの2匹のマウスは、瀕死と見なされるほど深刻な有害反応を経験したため、安楽死させた。比較により、2つのKS試験群からのどの10匹の動物(皮下にBP_123とCX_013を注射したマウス)も研究中に膿瘍を発達させることはなかった。これらマウスのうちの3匹(BP_123からの1匹とCX_013からの2匹)から報告された単一の膿瘍形成はすべて、小さいか非常に小さい増殖と報告され、最初の出現から3日以内に消えた。KS試験群BP_109からの5匹のマウスのうちの2匹が膿瘍を発達させた。WT親株BP_001および他のBP-株KS BP_123との目視での比較によれば、膿瘍は重症度が中程度である。KS試験群BP_092からの全5匹の動物は他のどの群とも異なり、特にWT親株BP_001と比べたとき、急性の非膿瘍形成症状を持っていた。BP_092の動物は、皮膚の変色と、皮膚の下の壊死組織を経験したため、すべて瀕死と見なして3日目の朝までに安楽死させた。陰性対照群の殺されたBP_001からの全5匹の動物は、7日研究の全期間にわたって膿瘍形成を含め有害な臨床症状がなかった。
統計分析:
本研究で生き延びたマウスがいたどの群でも体重減少は起こらなかったため、2値スコアを用いて群を1つの絶対的指標によって比較した。二項分布の仮説検定を利用して親/娘株により群を比較した。表41に示されているように、研究を通じてわずかでも膿瘍形成があったマウスに値1を割り当て、研究期間中に膿瘍形成が完全に不在であったマウスに値0を割り当てた。
膿瘍形成=1;膿瘍形成なし=0
二項分布の仮説検定を利用して親/娘株により群を比較した。言い換えると、この分析を利用してBP_001をBP_123と、そしてCX_001をCX_013と比較した。というのも後者は前者から導出されたからである。確率をWT群の膿瘍形成の存在によって割り当て、アルファを信頼性99%に設定した。
この分析から、BP由来の株とCX由来の株の両方について試験群の中の5匹のマウスのうちの1匹だけが膿瘍がないはずであり、信頼性99%を達成することが明らかになった。試験群 BP_109からの5匹のうちの2匹だけが膿瘍を発達させ、試験群BP_123とCX_013からのどのマウスも膿瘍を発達させなかったため、BP_109、BP_123、およびCX_013の試験群は比較用WT群とp値<0.01で有意に異なると報告することができる。
群10(BP_092)は表41から除外した。なぜならこの群の全動物で、この研究で使用した定義に従う膿瘍形成が観察されず、WT親株BP_001(群8)およびこの研究の他のすべての群(実験群と対照の両方)と比べて有意に異なる反応が経験されたからである。群10は動物の背中の大部分に白色の皮膚の変色があって壊死組織形成につながった。これは観察された他のどの症状とも異なり、研究の範囲外である。さらに、群10の全動物を3日目の瀕死状態を理由として安楽死させ、安楽死の後、殺菌した接種針を用いて皮膚と壊死組織の間からスワブを採取し、次いでそのループをTSB寒天プレートに押し付けることにより、そのループによって取り上げた細菌を培養した。1匹のマウスからこのようにして培養した最も多い細菌はプレート上の25個のコロニーであった。
高用量の改変されたKS株BP_123とCX_013を注射したすべてのマウスが菌血症を発症せず、注射と同じ日である0日目にわずかな有害反応を経験しただけであった。両方のWT親株(BP_001とCX_001)は、10^9 CFU/マウスの用量で、菌血症研究では死を引き起こし、SSTI研究では重病と膿瘍形成を引き起こした。
BP_109は、ゲノムに組み込まれた2つの殺傷スイッチを持つ操作された黄色ブドウ球菌株であり、インビトロ試験を通じ、これまでで最も強力な殺傷スイッチ組み合わせであることが示されている。殺傷スイッチのこの増大した効力が静脈内注射の直後に細菌細胞成分を突然放出させてマウスの血流に流入させ、そのことが、菌血症群のマウスのうちの4匹が投与から数時間以内に経験した有害反応と、SSTI群における膿瘍形成の原因となった可能性がある。同様の状態がヒトで同定されており、それはヤーリッシュ-ヘルクスハイマー反応と呼ばれていて、感染症の抗生剤治療が原因でエンドトキシン様産物の突然の放出が起こるときに発生する。
BP_092は、血液と血清の中でisdBよりもはるかに低い割合で誘導される遺伝子sbnAを用いてインビトロ条件下で調べると、効力が最低のKSであることが実証された。静脈内注射をしたマウスはすべて、1日目の終わりまでに死亡するか安楽死させた。これは、尾の静脈を通じて静脈内注射した10^9 CFUは、株BP_092がマウスを死から保護するのに高すぎる細胞濃度であることを示す
実施例20.黄色ブドウ球菌におけるsprA1殺傷スイッチのチューニング
実施例20.黄色ブドウ球菌におけるsprA1殺傷スイッチのチューニング
一連の実験を設計し、鉄の濃度が、異なる培地と体液において異なる合成黄色ブドウ球菌KS株の生存に及ぼす効果と、ゲノムに組み込まれた追加コピーの抗毒素を有するKSの有効性を「チューニングする」能力を評価した。第2のsprA1AS発現カセットをゲノムに追加すると、細胞質の中に増加したコピー数のsprA1AS sRNA転写産物が得られるであろう。sprA1AS sRNAのこの増加を利用してPepA1ペプチド毒素の発現を阻害し、したがってKSを「チューニング」して1コピーだけのsprA1ASを有する株よりも低レベルの利用可能な鉄に耐えられるようにできると仮定した。
4つの異なるタイプのアッセイ、すなわち1)血清アッセイ、2)鉄添加血清アッセイ、3)RPMI 1640アッセイ、および4)鉄添加RPMI 1640アッセイを、追加コピーのPsprA1AS- sprA1ASの組み込みに対する応答におけるKSのチューニング可能性を評価するため実施した。
ヒト血清とRPMI 1640を「基本培地」として使用し、それぞれのアッセイにおける鉄欠損条件を模倣した。次いでFeCl3を貯蔵溶液からこれらのタイプの培地のそれぞれにさまざまなレベルで添加し、細菌細胞増殖に対する利用可能な鉄の効果を評価した。鉄添加アッセイの完全なプロトコルは下に掲載されており、鉄の濃度は付録の表10に見いだすことができる。
この一連の実験は、改変されたKS株BP_109とBP_144に焦点を絞った。KS株BP_144は、BP_109ゲノムの部位2に追加コピーの天然sprA1AS発現カセットを組み込むことによって作製した。BP_144内のこの追加sprA1ASカセットは、鉄が部分的に限定される環境において、sprA1AS発現カセットのコピーを1つだけ持つ親株BP_109よりもsprA1毒素遺伝子の翻訳を大きく阻害するはずである。利用可能な鉄のレベルは皮膚上の黄色ブドウ球菌の天然のニッチにおいて大きく変動する可能性があるため、目的は、これらのさまざまな条件でより安定に生存するKS株を創出することである。BP_001とBP_121は、この報告で議論されているアッセイで野生型対照として使用する。BP_001は野生型黄色ブドウ球菌株であるとともに、この報告で議論されているすべての株の親である。BP_121は、黄色ブドウ球菌ゲノムの非コード部分に組み込まれた33 bpを、PCRによって株をより容易に同定するためのゲノムIDタグとしてだけ用いるために有する。この株に対してなされた以前の試験は、その表現型が野生型親株BP_001と似ていることを示した。
それに加え、ウサギ脳脊髄液(CSF)におけるKS活性化を調べた。CSFは栄養素が乏しい環境であり、黄色ブドウ球菌の増殖を容易に促進することはない。しかしそれでも黄色ブドウ球菌は、外傷後などにCSFの中で増殖に十分な栄養素を利用できるようになる場合には、病原性になる可能性がある。ウサギCSFの中と、異なる量のヒト血清を添加したウサギCSFの中のKS株BP_109の生存率を調べた。結果を、CSFの中で増殖させた表現型が野生型の株BP_121と比較した。
表42は、チューニング可能性の研究で使用した株に加え、株の遺伝子型、それぞれの株に適用できるDNA配列ID、およびどのようにして株を構成して調べたかを記述する株報告を示す。BP_144は親株BP_109から構成した。BP_121は、同定の目的にだけ使用する小さな挿入配列を含有する。
表43は、この報告に記載されている実験にとって重要であるか、その実験で使用した二本鎖DNA配列の5’→3’の方向の1つの鎖を示す。BP_DNA_003について、太字の配列はsprA1読み枠を表わし、下線を引いた配列は5’非翻訳領域(制御アーム)を表わす。
方法
この実験における血清アッセイとRPMIアッセイは、本明細書で利用した血清アッセイと同様のプロトコルに従うが、増殖アッセイのための特定のレベルの鉄を含む培地に細胞を再懸濁させる前にリン酸塩緩衝化生理食塩水(PBS)洗浄工程を1回ではなく2回にした。追加のPBS洗浄工程は、鉄欠損培地に導入する前に以前の増殖培地からの成分が完全に除去されることを確実にするため、各培養物の調製中に実施した。
血清添加CSFアッセイは、本明細書の上に記載されているプロトコルに従ってCSF、CSF+1%血清、およびCSF+2.5%血清の中で実施し、BP_121も野生型対照としてCSFの中で増殖させた。
鉄添加アッセイ
1.培養物の調製
1.1. 培養は、複数の14 mLの殺菌培養チューブの中で5 mLのTSBに選択された株(BP_109および/またはBP_144)の単一コロニーを接種し、それらチューブを37℃で240 rpmの震盪培養器の中に入れて一晩増殖させることによって開始した。
1.2. 翌朝、一晩培養物を5.5 mLの新鮮なTSBに戻してOD600を0.05にした。
1.2.1. OD600をNanoDrop分光光度計の中の1 cmキュベットの中で測定した。
1.2.2. 得られたOD600値を用い、新鮮なTSBに接種してOD600を0.05にするのに必要な一晩培養物の体積を計算した。
1.2.3. 新鮮な5.5 mLのTSB培養物に適切な体積の一晩培養物を播種し、2時間(37℃、240 rpm)インキュベートして再び対数増殖期で増殖する細胞を得た
1.2.4. 2時間のインキュベーションの後、OD600を各培養物について測定した
1.2.5. 培養物を減菌PBSの中で2回洗浄した。
1.2.5.1. スウィングアウトロータ (3500 rpm、5分間、室温)を用いて培養物を遠心分離して細胞をペレットにし、5 mLのPBSで洗浄した。
1.2.5.2. 第2のPBS洗浄のため工程1.2.5.1を繰り返す。
1.2.5.3. 培養物を遠心分離して細胞を再びペレットにし、1 mLの減菌PBSの中に再懸濁させた。
1.2.6. 2時間インキュベートした後に得られたOD600値を用い、5 mLのヒト血清またはRPMI 1640に接種してOD600を0.05にするのに必要な体積を計算した。
1.2.6.1.(OD600測定値)(X mL)=(0.05 OD600)(5 mL)
1.2.7. 培養物をインキュベートする前に、培地に鉄を望む濃度で添加した
1.2.7.1. さまざまな濃度の鉄を規定されたようにして添加した。
1.2.8. 鉄の添加後、添加された培地をパルス撹拌によって混合した。
1.2.9. 次いで培養物を工程1.2.6で計算した体積で接種した。同じサンプルで各シリーズの濃度を接種した。
1.2.10. 接種材料の添加後、培養物をパルス撹拌によって混合し、100 μLのサンプルを採取し、平板希釈によってCFU/mLを求めた(工程2参照)。
1.2.11. 培養物をただちに37℃の震盪培養器(240 rpm)に入れ、サンプルを2時間後に採取し、4時間後に再び採取し、平板希釈によってCFU/mLを求めた。
2.段階希釈と培養物の播種
2.1. Opentrons OT-2ロボットを利用して平板希釈を実施した。
2.1.1. TSプレートに播種された100 μLの希釈サンプルから30~300個のコロニーが増殖する濃度になるまで希釈を実施した。
2.1.2. OT-2ロボットがすべての段階希釈を実行し、100 μLの希釈された培養物TSAbp_109血清添加0.6bp_109血清添加0.6bp_109血清添加0.6bp_109血清添加0.6プレートを播種し、殺菌したスプレッダを用いて培養物をプレート上の使用する表面領域にできるだけ広げた。
2.1.3. 希釈液を二連で播種し、2つのプレートの平均を計算し、単一のレプリケートデータ点のために使用した。
3.インキュベーションとコロニーのカウント
3.1. TSAプレートを37℃で一晩12~16時間にわたってインキュベートした。
3.2. 翌朝、プレートを培養器から取り出し、コロニーのカウントを実施して各時点での生きている細胞の濃度(CFU/mL)を求めた。
3.2.1. 複数の希釈液をそれぞれの時点でそれぞれの条件について二連で播種し、30~300個のコロニーがあるプレートだけを用いてCFU/mL値を計算した。
1.培養物の調製
1.1. 培養は、複数の14 mLの殺菌培養チューブの中で5 mLのTSBに選択された株(BP_109および/またはBP_144)の単一コロニーを接種し、それらチューブを37℃で240 rpmの震盪培養器の中に入れて一晩増殖させることによって開始した。
1.2. 翌朝、一晩培養物を5.5 mLの新鮮なTSBに戻してOD600を0.05にした。
1.2.1. OD600をNanoDrop分光光度計の中の1 cmキュベットの中で測定した。
1.2.2. 得られたOD600値を用い、新鮮なTSBに接種してOD600を0.05にするのに必要な一晩培養物の体積を計算した。
1.2.3. 新鮮な5.5 mLのTSB培養物に適切な体積の一晩培養物を播種し、2時間(37℃、240 rpm)インキュベートして再び対数増殖期で増殖する細胞を得た
1.2.4. 2時間のインキュベーションの後、OD600を各培養物について測定した
1.2.5. 培養物を減菌PBSの中で2回洗浄した。
1.2.5.1. スウィングアウトロータ (3500 rpm、5分間、室温)を用いて培養物を遠心分離して細胞をペレットにし、5 mLのPBSで洗浄した。
1.2.5.2. 第2のPBS洗浄のため工程1.2.5.1を繰り返す。
1.2.5.3. 培養物を遠心分離して細胞を再びペレットにし、1 mLの減菌PBSの中に再懸濁させた。
1.2.6. 2時間インキュベートした後に得られたOD600値を用い、5 mLのヒト血清またはRPMI 1640に接種してOD600を0.05にするのに必要な体積を計算した。
1.2.6.1.(OD600測定値)(X mL)=(0.05 OD600)(5 mL)
1.2.7. 培養物をインキュベートする前に、培地に鉄を望む濃度で添加した
1.2.7.1. さまざまな濃度の鉄を規定されたようにして添加した。
1.2.8. 鉄の添加後、添加された培地をパルス撹拌によって混合した。
1.2.9. 次いで培養物を工程1.2.6で計算した体積で接種した。同じサンプルで各シリーズの濃度を接種した。
1.2.10. 接種材料の添加後、培養物をパルス撹拌によって混合し、100 μLのサンプルを採取し、平板希釈によってCFU/mLを求めた(工程2参照)。
1.2.11. 培養物をただちに37℃の震盪培養器(240 rpm)に入れ、サンプルを2時間後に採取し、4時間後に再び採取し、平板希釈によってCFU/mLを求めた。
2.段階希釈と培養物の播種
2.1. Opentrons OT-2ロボットを利用して平板希釈を実施した。
2.1.1. TSプレートに播種された100 μLの希釈サンプルから30~300個のコロニーが増殖する濃度になるまで希釈を実施した。
2.1.2. OT-2ロボットがすべての段階希釈を実行し、100 μLの希釈された培養物TSAbp_109血清添加0.6bp_109血清添加0.6bp_109血清添加0.6bp_109血清添加0.6プレートを播種し、殺菌したスプレッダを用いて培養物をプレート上の使用する表面領域にできるだけ広げた。
2.1.3. 希釈液を二連で播種し、2つのプレートの平均を計算し、単一のレプリケートデータ点のために使用した。
3.インキュベーションとコロニーのカウント
3.1. TSAプレートを37℃で一晩12~16時間にわたってインキュベートした。
3.2. 翌朝、プレートを培養器から取り出し、コロニーのカウントを実施して各時点での生きている細胞の濃度(CFU/mL)を求めた。
3.2.1. 複数の希釈液をそれぞれの時点でそれぞれの条件について二連で播種し、30~300個のコロニーがあるプレートだけを用いてCFU/mL値を計算した。
結果:
KS株の増殖を維持するのに必要な利用可能な鉄の濃度を具体的に定量するという目的を達成するため、より明確で信頼性のある増殖培地が必要とされた。鉄添加アッセイのため、体液に付随する一貫しない結果を取り扱うよりもということで血清をRPMI 1640で置き換えた。
増殖の維持に必要な鉄の濃度を定量するため、FeCl3溶液を調製し、これら溶液をさまざまなモルFe(III)濃度でRPMI1640に添加した。
RPMI 1640は哺乳類細胞系の培養に用いられる明確に規定された培地であり、その中では野生型黄色ブドウ球菌が増殖を維持することができる。RPMI 1640は、培地に添加された鉄を封鎖してアッセイ中に一貫しない結果を生じさせる可能性のあるいかなるタンパク質または他の物質も含有しておらず、しかも現状の培地の中で利用できる鉄を持たないため、溶液中の鉄の精密な測定が可能になる。BP_001の増殖を0 μMと3 μMのFe(III)を含むRPMIで調べたところ、増殖に差は観察されなかった。
AとBは、殺傷スイッチ活性化が起こる鉄の濃度レベルを求めるため、異なるレベルのFe(III)を添加したRPMI 1640液体培地の中で株(A)BP_109と(B)BP_144を4時間増殖させている期間中の平均CFU/mL(n≧3)を示す。(A)BP_109では、培地の中の鉄のレベルが0から3 μMのFe(III)まで上昇するとき、そのレベルでは野生型BP_001とBP_109の間の増殖パターンは非常に似通って見え、誤差棒が重複する。(B)BP_144では、培地の中の鉄のレベルが0から1 μMのFe(III)まで上昇するにつれて生きている細胞の数/mLも増加する。1 μMと3 μMのFe(III) 両方の増殖曲線はBP_144株に関して野生型BP_001と重複する。誤差棒は平均したレプリケート(n=2~4)の1標準偏差を表わす。
図32は、0.00 μMのFe(III)を含むRPMIの中で実施した黄色ブドウ球菌BP_001(WT)、BP_109(KS)、およびBP_144(KS+AS)の増殖アッセイからの平均(n≧3)CFU/mLを示す。BP_109の生きている細胞のカウント数は4時間の期間に減少した。誤差棒は、平均したレプリケートからの1標準偏差を表わす。BP_144は、その親株BP_109と比べて生きているCFU/mLが増加した。
図33は、異なるレベルのFe(III)(0、0.25、0.38、および0.60 μM)を添加したRPMI 1640の中で4時間にわたって増殖させた株BP_109とBP_144のCFU/mLとしての生きている細胞の増殖のグラフを示す。BP_144は、4時間の増殖期間中に調べた各レベルの鉄で親株 BP_109と比べて生きているCFU/mLが増加した。
同様の細胞増殖アッセイを、RPMI培地をウサギCSF、またはヒト血清を添加したCSFに代えて実施し、BP_109(KS)を対照合成黄色ブドウ球菌株BP_121(KSなし)と比較した。図34に示されているCSFアッセイにおいて、CSF中のヒト血清の濃度が増加するにつれてBP_109が生存を失う傾向を見ることができる。野生型対照BP_121は、CSF+1.0%の血清添加の条件では、CSFの利用可能性が制限されたことが理由で増殖しなかった;しかしBP_121はヒト血清の中で容易に増殖し、血清強化CSF条件の中で培養するときには生存率が上昇することが実証された。ここに示されているデータは、CSF中のKS活性化のレベルを、環境中の栄養素のレベルおよび細胞中の代謝活性の対応するレベルと結びつけられる可能性があることを示す。
図34は、CSFの中の黄色ブドウ球菌株BP_121(殺傷スイッチなし)とBP_109(鉄感受性殺傷スイッチ)と、1.0%と2.5%のヒト血清を添加したウサギCSFの中のBP_109を比較するグラフ細胞増殖アッセイを示す。株を、全体積500 μLのCSFの中、またはCSF+血清の中で培養した(n=1)。BP_121+2.5%ヒト血清は別のアッセイで分析した(n=3)。CSF中のヒト血清の濃度が増加するにつれてBP_109が生存を失う傾向を見ることができる。逆に、BP_121はCSFに血清を導入すると生きている細胞のカウント数が増加する。
天然のsprA1AS発現カセットの追加コピーで改変された操作された殺傷スイッチ株では、生きている細胞のカウント数は、鉄欠乏培地の中での増殖アッセイが終了した時点でその親株と比べて大きかった。細胞を鉄制限培地の中で増殖させるときにゲノム中のsprA1AS発現カセットの数を増やすとsprA1殺傷スイッチの有効性を変化させることが可能であることが実証された。図31~34に示されているように、培地の中で利用できる特定の範囲の鉄と培養物の中の生きているCFUの数/mLに関して線形関係が実証された。
実施例21.sprG作用遺伝子を用いた誘導性静菌殺傷スイッチ
実施例21.sprG作用遺伝子を用いた誘導性静菌殺傷スイッチ
作用遺伝子sprG2とsprG3が大腸菌と黄色ブドウ球菌の中で静菌を引き起こす能力を、pRAB11発現ベクターを用いて調べた。
遺伝子sprG2とsprG3は多くの黄色ブドウ球菌種にとって天然である。これら遺伝子はI型TA系に属しており、黄色ブドウ球菌の中で過剰発現したときに両方とも静菌を引き起こすことができる。この実施例では、pRAB11骨格を用いた2つのプラスミドを、プラスミド上に位置するATc誘導性プロモータの後ろに遺伝子sprG2とsprG3を付加することによって調製した(それぞれp305およびp306と名づける)。プラスミドからの遺伝子sprG2とsprG3の過剰発現によって黄色ブドウ球菌と大腸菌の中で静菌が起こったが、sprG3は誘導後の短期間にわたって大腸菌の増殖を遅延させることができただけであった。
表44は、プラスミドp305とp306の作製に使用したオリゴの名称と配列を示す。組み立ては、ステッチPCRとギブソン・アセンブリを必要とした。一本鎖DNA配列は5’から3’への方向である。
高コピー発現ベクターpRAB11を用いて2つのプラスミドを作製した。このプラスミド は、大腸菌または黄色ブドウ球菌の中での無水テトラサイクリン(ATc)に依存した遺伝子発現に用いることができる。プラスミドpRMC2内のTetRが調節するプロモータPxyl/tetに別のtetOオペレータを付加することによってプラスミドpRAB11を作製し、そのプロモータの下流の遺伝子がより厳密に調節されるようにした。TetRは、tetO配列が存在する場合にDNAに結合する転写リプレッサタンパク質である。pRAB11内のPXYL/tetプロモータは、このプロモータのすぐ下流にある任意の遺伝子の転写を抑制する転写開始部位に隣接した2つのtetO配列を持つ。ATcは培養物に添加されるとリプレッサタンパク質TetRに結合してプロモータ内のTetOに結合するそのタンパク質の能力を阻害し、プロモータの活性化と遺伝子の過剰発現を可能にするであろう。Helle, Leonie, et al.「黄色ブドウ球菌においてTetリプレッサに依存した遺伝子の漸次的な誘導または沈黙を改良するためのベクター」Microbiology 157.12 (2011): 3314-3323。
図35は、pRAB11ベクター上にPtet::sprG3 DNAを含むプラスミドp306のプラスミド地図を示す。これはPtet::sprG2を含むp305のプラスミド地図も表わしており、唯一の違いは、sprG3ではなく作用遺伝子sprG2が存在することである。
表45は、黄色ブドウ球菌と大腸菌を形質転換するプラスミドを示す。* p305プラスミドの中のsprG2遺伝子は、ATG開始部位と、開始コドンの後の単一の点変異を有するため、天然のBP_001 sprG2遺伝子とはわずかに異なっている。
表46は、この研究で使用したか作製した株を示す。pRAB11骨格は長さが6 kb超であるため、作製した株について示されている配列はsprG3遺伝子とsprG2*遺伝子だけである。
* 2つの塩基対置換がsprG2に起こり、それをBP_001におけるその天然の配列とは異なるものにした。発現の確率を大きくするため開始コドンがGTGからATGへと意図的に変えられており、小文字のcは、プラスミド生成の間にAからCへと変化して起こった非意図的な点変異であった。この塩基対置換は、イソロイシンからロイシンへのアミノ酸の変化を引き起こす(sprG2.V1M、I2L)。
PCR断片の生成
以下のPCR反応を、Q5 High Fidelity Hot Startマスターミックス(NEB)を製造者の指示に従って用いて実施した。
BP_DNA_095 pRAB11直線化プラスミド骨格(p151)=配列番号52
BP_DNA_095の断片- p174骨格断片1(p305とp306)
- BP_717/BP_542
BP_DNA_095の断片- p174骨格断片2(p305とp306)
- BP_718/BP_725(p305)
- BP_718/BP_730(p306)
BP_DNA_125(配列番号71)- sprG2(pRAB11ベクター上の挿入された配列)(p305)
- DR_726/DR_727
BP_DNA_113(配列番号62)- sprG3(pRAB11ベクター上の挿入された配列)(p306)
- DR_729/DR_728
1)上記のPCR断片を1%または2.5%アガロースゲル上でチェックしてクリーンなバンドであることを確認した後、Qiaquick PCR精製キット(Qiagen)を製造者の指示に従って用いて精製した。
2)p174断片をDpnI(NEB)で処理し、PCRのための鋳型として使用したpRAB11プラスミドを除去し、PCRクリーンアップキット(NEB)を製造者の指示に従って用いて再度精製した。
3)各プラスミドに関するDNA断片をステッチPCRを利用してつなぎ合わせた後、ギブソン・アセンブリ反応(NEB)を製造者の指示に従って利用して環状プラスミドを作製した。
4)次に、Report_SOP030の形質転換プロトコルに従い、組み立てられたプラスミドでIM08Bを形質転換し、LB(カルベニシリン)寒天プレートに播種し、37℃で一晩インキュベートした。
5)翌日、コロニーPCRによってコロニーをスクリーニングして完全に組み立てられたプラスミドを探し、pRAB11プラスミド上のsprG2またはsprG3の存在をチェックした。
6)3つの陽性コロニーを取り上げ、5 mLのLB(+カルベニシリン、100 ug/mL)の中で37℃にて一晩増殖させ、ZymoPUREプラスミドminiprepキットを製造者の指示に従って用いてプラスミドを抽出した。次いでプラスミドをシークエンシングし、遺伝子sprG2またはsprG3と、挿入されたこれら遺伝子の上流のプロモータのDNA配列を確認した。
7)シークエンシングをインシリコでBenchlingの中の配列アラインメントツールを用いてアラインメントさせた。
a)シークエンシングのアラインメントが参照地図の配列と完璧なアラインメントを示したコロニーの1つを取り上げ、Report_SOP028「株の調製とプラスミドのストック」の中のプロトコルに従ってプラスミドデータベースにストックした。
注:sprG2については、それぞれの配列プラスミド上に単一の点変異が存在していた(表4参照)。その変異にもかかわらず1つを取り上げて調べた
8)工程6から生成した培養物に対して6時間増殖アッセイを実施し、挿入された遺伝子が宿主細胞に対して及ぼす効果を調べた。
a)配列を確認した調べるべきクローンの培養物5 mLから出発し、適切な抗生剤を添加してプラスミドが維持されていることを確認する。培養物を250 rpmで震盪させながら37℃で一晩増殖させる。
b)翌日、培養物の吸光度をOD600の測定によって測定する。
c)新鮮な5 mLの培養物に0.05のOD600で接種するのに必要な一晩培養物の体積を計算する。
d)開始したそれぞれの一晩培養物について、工程8cで計算した体積を用いて2つの新鮮な培養物に接種する。
e)これら培養物を混合し、ODを測定してアッセイ開始時の培養物の密度を求める。培養チューブを37℃の培養器の中に入れて250 rpmで震盪させる。
i)培養物のODを上記のようにして毎時間、6時間にわたって測定する。
ii)この2時間OD測定の後、ATc(10 ug/mL)を1セットの培養チューブに添加することによってsprG2/sprG3遺伝子の過剰発現を誘導し、全チューブを培養器に戻す。
iii)アッセイが終了するまで1時間ごとにODを測定し続ける。
9)Report_SOP029の中の形質転換プロトコルに従い、配列を確認したプラスミドでBP_001 も形質転換し、BHI(chlor/x-gal)に播種し、37℃で一晩インキュベートした。
10)3つの陽性コロニーを採取し、5 mLのTSB(+クロラムフェニコール、10 ug/mL)の中で一晩増殖させ、工程8におけるのと同じプロトコルを利用して6時間増殖アッセイを実施した。
BP_DNA_095 pRAB11直線化プラスミド骨格(p151)=配列番号52
BP_DNA_095の断片- p174骨格断片1(p305とp306)
- BP_717/BP_542
BP_DNA_095の断片- p174骨格断片2(p305とp306)
- BP_718/BP_725(p305)
- BP_718/BP_730(p306)
BP_DNA_125(配列番号71)- sprG2(pRAB11ベクター上の挿入された配列)(p305)
- DR_726/DR_727
BP_DNA_113(配列番号62)- sprG3(pRAB11ベクター上の挿入された配列)(p306)
- DR_729/DR_728
1)上記のPCR断片を1%または2.5%アガロースゲル上でチェックしてクリーンなバンドであることを確認した後、Qiaquick PCR精製キット(Qiagen)を製造者の指示に従って用いて精製した。
2)p174断片をDpnI(NEB)で処理し、PCRのための鋳型として使用したpRAB11プラスミドを除去し、PCRクリーンアップキット(NEB)を製造者の指示に従って用いて再度精製した。
3)各プラスミドに関するDNA断片をステッチPCRを利用してつなぎ合わせた後、ギブソン・アセンブリ反応(NEB)を製造者の指示に従って利用して環状プラスミドを作製した。
4)次に、Report_SOP030の形質転換プロトコルに従い、組み立てられたプラスミドでIM08Bを形質転換し、LB(カルベニシリン)寒天プレートに播種し、37℃で一晩インキュベートした。
5)翌日、コロニーPCRによってコロニーをスクリーニングして完全に組み立てられたプラスミドを探し、pRAB11プラスミド上のsprG2またはsprG3の存在をチェックした。
6)3つの陽性コロニーを取り上げ、5 mLのLB(+カルベニシリン、100 ug/mL)の中で37℃にて一晩増殖させ、ZymoPUREプラスミドminiprepキットを製造者の指示に従って用いてプラスミドを抽出した。次いでプラスミドをシークエンシングし、遺伝子sprG2またはsprG3と、挿入されたこれら遺伝子の上流のプロモータのDNA配列を確認した。
7)シークエンシングをインシリコでBenchlingの中の配列アラインメントツールを用いてアラインメントさせた。
a)シークエンシングのアラインメントが参照地図の配列と完璧なアラインメントを示したコロニーの1つを取り上げ、Report_SOP028「株の調製とプラスミドのストック」の中のプロトコルに従ってプラスミドデータベースにストックした。
注:sprG2については、それぞれの配列プラスミド上に単一の点変異が存在していた(表4参照)。その変異にもかかわらず1つを取り上げて調べた
8)工程6から生成した培養物に対して6時間増殖アッセイを実施し、挿入された遺伝子が宿主細胞に対して及ぼす効果を調べた。
a)配列を確認した調べるべきクローンの培養物5 mLから出発し、適切な抗生剤を添加してプラスミドが維持されていることを確認する。培養物を250 rpmで震盪させながら37℃で一晩増殖させる。
b)翌日、培養物の吸光度をOD600の測定によって測定する。
c)新鮮な5 mLの培養物に0.05のOD600で接種するのに必要な一晩培養物の体積を計算する。
d)開始したそれぞれの一晩培養物について、工程8cで計算した体積を用いて2つの新鮮な培養物に接種する。
e)これら培養物を混合し、ODを測定してアッセイ開始時の培養物の密度を求める。培養チューブを37℃の培養器の中に入れて250 rpmで震盪させる。
i)培養物のODを上記のようにして毎時間、6時間にわたって測定する。
ii)この2時間OD測定の後、ATc(10 ug/mL)を1セットの培養チューブに添加することによってsprG2/sprG3遺伝子の過剰発現を誘導し、全チューブを培養器に戻す。
iii)アッセイが終了するまで1時間ごとにODを測定し続ける。
9)Report_SOP029の中の形質転換プロトコルに従い、配列を確認したプラスミドでBP_001 も形質転換し、BHI(chlor/x-gal)に播種し、37℃で一晩インキュベートした。
10)3つの陽性コロニーを採取し、5 mLのTSB(+クロラムフェニコール、10 ug/mL)の中で一晩増殖させ、工程8におけるのと同じプロトコルを利用して6時間増殖アッセイを実施した。
株と、大腸菌と黄色ブドウ球菌におけるsprG2とsprG3に関するATc誘導毒素アッセイの平均結果の結果が表47に示されている。
表47は、それぞれの時点で取得した三連のOD600の平均値と標準偏差を示しているが、大腸菌の中のsprG3は別である(n=1)。
ATcを添加する(t=2時間の時点で添加)と作用遺伝子sprG2*(*V1M、I2L)の過剰発現につながり、大腸菌(BPEC_025)と黄色ブドウ球菌(BP_165)の両方で静菌を誘導することができた(図36)。
ATcを添加する(t=2時間の時点で添加)と作用遺伝子sprG3は黄色ブドウ球菌(BP_164)で静菌を誘導できたが、大腸菌(BPEC_024)では静菌を一時的かつより少ない有効性でしか誘導できなかった(図37)。
この実施例では、pRAB11骨格を用いた2つのプラスミドを、プラスミド上に位置するATc誘導性プロモータの後ろに遺伝子sprG2とsprG3を付加することによって調製した(それぞれp305およびp306と名づける)。
プラスミドp305と306それぞれからの遺伝子sprG2とsprG3の過剰発現によって黄色ブドウ球菌と大腸菌で静菌が起こったが、sprG3は大腸菌の増殖を誘導後の短期間遅延させることしかできなかった
この実施例は、例えば黄色ブドウ球菌または大腸菌の増殖を阻止するため有効な静菌スイッチを含む合成微生物を設計できることを実証している。厳密に調節されるPXYL/tetプロモータを含有するpRAB11ベクターにより、上記遺伝子の容易な誘導と過剰発現が可能になった。将来は、pIMAYz大腸菌/黄色ブドウ球菌シャトルベクターを用いてこれら遺伝子を黄色ブドウ球菌のゲノムに挿入し、環境変化に敏感な代替プロモータを用いて発現させることができる可能性がある。
実施例22.p174とp229に関するプラスミド構築
実施例22.p174とp229に関するプラスミド構築
この実施例では、プラスミドp229とp174の作製に成功し、S.アガラクティエを形質転換するのに使用した。シークエンシングの結果は変異を示さなかった。
pRAB11プラスミドはPxyl/tetプロモータの下流の遺伝子を厳密に調節する高コピーベクターであるため、この系は、プロモータの下流の遺伝子から容易に検出可能な応答を生じさせる。プラスミドp174では、毒素遺伝子sprA1をpRAB11プラスミドに付加し、ATc依存性TetR誘導のためPxyl/tetに機能可能に連結した。プラスミドp229では、緑色蛍光タンパク質(GFPmut2)をpRAB11プラスミドに付加し、ATc依存性TetR誘導のためPxyl/tetに機能可能に連結した。
pRAB11プラスミドは、大腸菌または黄色ブドウ球菌の中で無水テトラサイクリン(ATc)依存性遺伝子発現をさせるのに用いる高コピー発現ベクターである。プラスミドpRAB11は、プラスミドpRMC2内のTetRによって調節されるプロモータPxyl/tetに別のtetOオペレータを付加することによって作製した。Helle, Leonie, et al., Microbiology 157.12 (2011): 3314-3323。
TetRは、tetO配列が存在する場合にDNAに結合する転写リプレッサタンパク質である。pRAB11の中のPXYL/tetプロモータは、このプロモータのすぐ下流の任意の遺伝子の転写を抑制する転写開始部位に隣接した2つのtetO配列を持つ。ATcは培養物に添加されるとリプレッサタンパク質TetRに結合してプロモータ内のtetOに結合するそのタンパク質の能力を阻害する。TetRタンパク質が脱活性化されるとその構成的プロモータは抑制が外れ、RNAポリメラーゼをリクルートして推定毒素を高速で転写するとき阻害されなくなる。
p174を構成するため、毒素遺伝子sprA1をpRAB11に付加し、ATc依存性TetR誘導のためPxyl/tetに機能可能に連結させた。sprA1遺伝子は黄色ブドウ球菌にもともと備わっており、I型毒素抗毒素系の一部である。sprA1遺伝子はPepA1と呼ばれる膜ポリンタンパク質をコードしており、それが細胞の膜内に蓄積して分裂中の細胞のアポトーシスを誘導する。ここで使用したsprA1遺伝子は、BioPlxのデータベースでBP_001と名づけられている502a様株のゲノムからPCRで増幅した。
p229を構成するため、緑色蛍光タンパク質(GFPmut2)をATc依存性発現のためのPxyl/tetプロモータの後ろの位置でpRAB11に付加した。両方のタンパク質の発現は、TetRタンパク質によって転写が抑制されている状態から、ATcをその系に添加したとき誘導されて発現する状態へと移行するはずである。
表48は、プラスミドp174とp229の構築またはシークエンシングの間に使用したプライマーの一本鎖DNA配列を示す。すべての配列が5'から3'の方向である。
表49は、p174とp229の構築に使用したDNA配列を示す。配列は二本鎖DNA断片の1つの鎖を表わす。
以下のPCR反応を、Q5 High Fidelity Hot Startマスターミックス(NEB)を製造者の指示に従って用いて実施した。
BP_DNA_095 - p151骨格断片(p174)
- BP_670/BP_671
BP_DNA_095 - p174骨格断片(p229)
- DR_244/DR_245
BP_DNA_ - sprA1(挿入された配列)(p174)
- BP_672/BP_677
BP_DNA_077 - GFPmut2(挿入された配列)(p229)
- DR_476/DR_247
BP_DNA_095 - p151骨格断片(p174)
- BP_670/BP_671
BP_DNA_095 - p174骨格断片(p229)
- DR_244/DR_245
BP_DNA_ - sprA1(挿入された配列)(p174)
- BP_672/BP_677
BP_DNA_077 - GFPmut2(挿入された配列)(p229)
- DR_476/DR_247
上記のPCR断片を1%アガロースゲル上でチェックしてクリーンなバンドであることを確認した後、Qiaquick PCR精製キット(Qiqagen)を製造者の指示に従って用いて精製した。p174断片をDpnI(NEB)で処理してPCRのための鋳型として使用されるpRAB11プラスミドを除去し、PCRクリーンアップキット(NEB)を製造者の指示に従って用いて再び精製した。DNA断片をギブソン・アセンブリ(NEB)を製造者の指示に従って使用して環状プラスミドを作製した。次いで組み立てられたプラスミドでIM08Bを形質転換し、LB(カルベニシリン)に播種し、37℃で一晩インキュベートした。翌日、コロニーをコロニーPCRによってスクリーニングして完全に組み立てられたプラスミドを探し、コロニー内のpRAB11プラスミド上のGFPまたはsprA1の存在をチェックした。3つの陽性コロニーを採取し、5 mLのLB(+カルベニシリン、100 ug/mL)の中で一晩増殖させ、ZymoPUREプラスミドminiprepキットを製造者の指示に従って用いてプラスミドを抽出した。次いでそのプラスミドをシークエンシングしてGFPmut2またはsprA1遺伝子のDNA配列を確認した。シークエンシングをBenchlingの中の配列アラインメントツールを用いてインシリコでアラインメントさせた。シークエンシングのアラインメントが参照地図の配列への完全なアラインメントを示した各コロニーの1つを取り上げてプラスミドデータベースにストックした。
実施例23.エレクトロコンピテントストレプトコッカス・アガラクティエ細胞の形質転換
実施例23.エレクトロコンピテントストレプトコッカス・アガラクティエ細胞の形質転換
ストレプトコッカス・アガラクティエ をFramsonらとDunyら(Framson, et al., Appl. Environ. Microbiol. 1997, 63 (9), 3539-3547、Dunny et al., Appl. Environ. Microbiol. 1991, 57 (4), 1194-1201)からの手続きのバリエーションによって形質転換した。
簡単に述べると、エレクトロコンピテントセルのプロトコルは、S.アガラクティエA909(BPST_002)の単一の一晩培養物を1%カサミノ酸と0.3%の酵母エキス(M9-YE)を含むM9培地に接種し、37℃で一晩インキュベートすることから始まる。翌日、その培養物を用い、1.2%グリシンが含まれること以外は同じであるより多い体積の培地に接種する。この新たな培養物を静かに37℃で12~15時間インキュベートした。グリシンは、ペプチド架橋剤の中のL-アラニンと置き換わることによってペプチドグリカン細胞壁の生合成を妨害する。するとエレクトロコンピテントセルに孔が形成され、したがって形質転換中のDNA取り込みの可能性が増大する。インキュベーション期間の後、グリシンを含む培養物をより多い体積の新鮮なM9-YE+1.2%グリシンに添加し、37℃で1時間インキュベートした。増殖期間の後、ODをチェックし、標的範囲の0.1~0.25 ODであることを見いだした。培養物が標的ODに到達した後、その培養物を遠心分離することによって細胞をペレットにし、得られた上清を除去した。細胞ペレットを浸透圧保護溶液(0.625 Mのスクロース、pH 4)の中に再懸濁させ、遠心分離によって再びペレットにし、上清を除去した。細胞を小体積の浸透圧保護溶液に再懸濁させた。最終再懸濁の後、細胞を電気穿孔で用いるため氷の上で30~60分間冷やすか、ただちに-80℃の冷凍庫の中で保管した。
電気穿孔プロトコルはDunyらによる手続きに従ったが、Framsonらのプロトコルからのリカバリー培地を使用した。
簡単に述べると、コンピテントS.アガラクティエ細胞を氷の上で解凍し、2-mm電気穿孔キュベットに移し、そこで少なくとも300 ngのプラスミドDNAをコンピテント細胞に直接添加し、その細胞に200 Ωの抵抗にして2.0 kVで電気穿孔する。その後、キュベットをしばらく氷の上に置き、0.5 Mのスクロースを含むTHBを細胞に添加し、懸濁液を培養チューブに移す。形質転換体を37℃で1時間静かに回復させた後、適切な抗生剤選択とともにTHB寒天プレートに播種する。プレートを37℃で一晩インキュベートするとき、コロニーの存在は、プラスミドがS.アガラクティエによって取り込まれたことを示す。
実施例24.誘導性遺伝子の発現を利用したS.アガラクティエにおける毒素の有効性試験
実施例24.誘導性遺伝子の発現を利用したS.アガラクティエにおける毒素の有効性試験
実施例23の方法により、pRAB11ベクター上のPXYL/Tetプロモータの制御下にある推定黄色ブドウ球菌毒素遺伝子sprA1でストレプトコッカス・アガラクティエA909(BPST_002)を形質転換した。
この実施例では、黄色ブドウ球菌(S. aureus)からのsprA1毒素遺伝子がpRAB11プラスミドで形質転換したストレプトコッカス・アガラクティエ(S.アガラクティエ)から発現されたときに細胞死を引き起こすか細胞増殖を阻止する能力を調べた。pRAB11上の強力な誘導性があって厳密に制御されるプロモータ系PXYL/Tetを使用した。S.アガラクティエの増殖に対するsprA1過剰発現の効果を増殖期間にわたって培養物の光学密度(OD)を測定することによって観察した。
sprA1遺伝子の過剰発現はBPST_002細胞培養物の増殖を阻止した。これは、宿主細胞にとっての静菌毒素としてのPepA1機能が生じたことを示す。PXYL/Tetプロモータを検証するため、GFPがPXYL/Tetプロモータに機能可能に連結されたプラスミドも用いてS.アガラクティエA909(BPST_002)を形質転換した。GFP含有プラスミドの誘導は、誘導された培養物と誘導されていない培養物の間で蛍光の量の10倍増加を示した。
PXYL/Tetプロモータ系の制御下にある毒素と緑色蛍光タンパク質(GFP)をそれぞれ含有するpRAB11プラスミドであるp174とp229でBPST_002を形質転換した。
プラスミドp174では、sprA1遺伝子をプロモータ系の後ろに直接付加した。毒素は黄色ブドウ球菌にとって天然のものであり、I型毒素抗毒素系の一部である。ここで使用したsprA1遺伝子は黄色ブドウ球菌502a様株BP_001のゲノムからPCRで増幅した。
プラスミドp229では、GFPmut2をpRAB11のPxyl/tetプロモータの後ろに付加した。両方のタンパク質の発現は、TetRタンパク質によって転写が抑制されている状態から、系にATcを添加すると誘導されて発現する状態へと移行することが期待された。
この系を利用して、sprA1毒素PepA1の過剰発現がBPST_002(S.アガラクティエA909)の増殖に及ぼす効果を調べた。sprA1遺伝子は、細胞の膜に蓄積して分裂中の細胞のアポトーシスを誘導するPepA1と呼ばれる膜ポリンタンパク質をコードする。この効果は、OD600によって測定するとき、Atcで誘導されて細胞死を引き起こすか、培養物の中で細胞を増殖できなくすることが予想された。PXYL/tetプロモータの有効性を確認するため、誘導された培養物と誘導されていない培養物の蛍光をプレートリーダーを用いて測定した。
表50は、BPST_002を形質転換したプラスミドの番号と説明を示す。
形質転換とPCRスクリーン
プラスミドをBPST_002エレクトロコンピテントセルに電気穿孔し、DR_216/DR_217を用いてコロニーをPCRでスクリーニングしてプラスミドの存在を探した。上記のプロトコルを利用してプラスミドp229とp174でS.アガラクティエBPST_002エレクトロコンピテントセルを形質転換した。形質転換体を37℃で1時間静かに回復させ、1 ug/mLのクロラムフェニコールとともにTHB寒天プレートに播種した。プレートを16~24時間インキュベートした。コロニーを目視できるようになったとき、減菌接種ループを用いてそれぞれの形質転換から単一コロニーを取り上げて再び画線塗布し、1 μg/mLのクロラムフェニコールを含む新鮮なTHB寒天プレート上で単一コロニー単離を探した。プレートを37℃で12~16時間インキュベートした。
翌日、DR_215/DR_216を用いて新しい画線塗布プレート上のコロニーをPCRでスクリーニングし、プラスミドの存在を探した。PCR産物の1%アガロースゲル電気泳動を実施し、組み込みがなされたコロニーをチェックした。すべてのコロニーにプラスミドが存在する場合、増殖アッセイのため画線塗布プレートを用いて培養を開始した。
静止期の培養物を用いた増殖アッセイ
1.新鮮な寒天プレート上の単一コロニーからの調べるべき各プラスミドのための3つの5 mLのTHB+クロラムフェニコール(1 μg/mL)培養物で開始する。37℃で8時間にわたって静かにインキュベートする。
2.インキュベーション期間の後、培養物のOD600を測定する。
3.5 μLの無水テトラサイクリン(ATc)(1 ug/mL)を3つのサンプルのうちの2つに添加する。添加なしのサンプルは対照である。
4.培養チューブを37℃で1時間にわたって静かにインキュベートする。
5.インキュベーション期間の後、培養物のOD600を測定する。
6.記録したODを表に記入し、調べたすべての株に関する増殖曲線を示すためデータをグラフにプロットする。
1.新鮮な寒天プレート上の単一コロニーからの調べるべき各プラスミドのための3つの5 mLのTHB+クロラムフェニコール(1 μg/mL)培養物で開始する。37℃で8時間にわたって静かにインキュベートする。
2.インキュベーション期間の後、培養物のOD600を測定する。
3.5 μLの無水テトラサイクリン(ATc)(1 ug/mL)を3つのサンプルのうちの2つに添加する。添加なしのサンプルは対照である。
4.培養チューブを37℃で1時間にわたって静かにインキュベートする。
5.インキュベーション期間の後、培養物のOD600を測定する。
6.記録したODを表に記入し、調べたすべての株に関する増殖曲線を示すためデータをグラフにプロットする。
指数増殖期の培養物を用いた増殖アッセイ
1.新鮮な寒天プレート上の単一コロニーからの調べるべき各プラスミドのための3つの5 mLのTHB+クロラムフェニコール(1 μg/mL)培養物で開始する。37℃で8時間にわたって静かにインキュベートする。
2.インキュベーション期間の後、培養物のOD600を測定する。
3.500 μLの培養物を4.5 mLの新鮮なTHB+クロラムフェニコール(1 μg/mL)に添加し、この培養物を混合するため軽く撹拌する。
4.500 μLの各培養物を取り出し、OD600を測定する。
5.4.5 μLの無水テトラサイクリン(ATc)(1 mg/mL)を3つのサンプルのうちの2つに添加する。添加なしのサンプルは対照である。
6.ATcを添加した直後、かつチューブを37℃の培養器に入れる前に、培養物を混合するため軽く撹拌する。
7.培養チューブを37℃で1時間にわたって静かにインキュベートする。
8.1時間後、OD600の読みを測定して記録し、
9.培養物を37℃の培養器に戻し、OD600値を1時間ごとに合計3時間にわたって測定して記録する。
1.新鮮な寒天プレート上の単一コロニーからの調べるべき各プラスミドのための3つの5 mLのTHB+クロラムフェニコール(1 μg/mL)培養物で開始する。37℃で8時間にわたって静かにインキュベートする。
2.インキュベーション期間の後、培養物のOD600を測定する。
3.500 μLの培養物を4.5 mLの新鮮なTHB+クロラムフェニコール(1 μg/mL)に添加し、この培養物を混合するため軽く撹拌する。
4.500 μLの各培養物を取り出し、OD600を測定する。
5.4.5 μLの無水テトラサイクリン(ATc)(1 mg/mL)を3つのサンプルのうちの2つに添加する。添加なしのサンプルは対照である。
6.ATcを添加した直後、かつチューブを37℃の培養器に入れる前に、培養物を混合するため軽く撹拌する。
7.培養チューブを37℃で1時間にわたって静かにインキュベートする。
8.1時間後、OD600の読みを測定して記録し、
9.培養物を37℃の培養器に戻し、OD600値を1時間ごとに合計3時間にわたって測定して記録する。
蛍光サンプルの調製と測定
10.3時間インキュベートした後、3500 rpmで5分間かけてBPST_002培養物の中のp229を沈降させる。
11.上清を除去し、5 mLのPBSを添加する。軽く撹拌して培養物を再懸濁させる。
12.培養物を2800×gで5分間かけて再度遠心分離する。
13.上清を除去し、細胞ペレットを1 mLのPBSの中に再懸濁させる。
14.200 uLの各細胞懸濁液を96ウエルのプレート(Greiner Bio、部品番号655900)に三連で添加する。三連の中にブランクとしてPBSを含める。
15.プレートを以下の設定で読む:
a.Ex:485/20
b.Em:530/25
c.感度:80
16.実験サンプルからブランクの読みを差し引き、すべての値を記録する。
結果:
10.3時間インキュベートした後、3500 rpmで5分間かけてBPST_002培養物の中のp229を沈降させる。
11.上清を除去し、5 mLのPBSを添加する。軽く撹拌して培養物を再懸濁させる。
12.培養物を2800×gで5分間かけて再度遠心分離する。
13.上清を除去し、細胞ペレットを1 mLのPBSの中に再懸濁させる。
14.200 uLの各細胞懸濁液を96ウエルのプレート(Greiner Bio、部品番号655900)に三連で添加する。三連の中にブランクとしてPBSを含める。
15.プレートを以下の設定で読む:
a.Ex:485/20
b.Em:530/25
c.感度:80
16.実験サンプルからブランクの読みを差し引き、すべての値を記録する。
結果:
プラスミドp174とp229の両方を用いたストレプトコッカス・アガラクティエBPST_002の形質転換が成功し、それをDR_215とDR_216を用いてPCRで確認した。単一コロニーから直接開始した培養物を用いて増殖アッセイを1日だけ実施した。アッセイは、毎回上記のプロトコルに従って正確に同じやり方で実施した。
表51は、THBの中で増殖させたBPST_002内のp174とp229に関するOD600の読みを示す。sprA1毒素またはGFPレポータ遺伝子の発現を誘導するためにATcが添加されて誘導された培養物に関するOD600を、誘導されていない培養物(対照、ATcなし)と比較した。
表51からのデータが図38のグラフにプロットされている。図38は、プラスミドp174(sprA1)またはp229(GFP)で形質転換したストレプトコッカス・アガラクティエ(BPST_002)に関する3時間にわたるOD600増殖曲線のグラフを示す。出発培養物に静止期の培養物からの1:10希釈液を接種した。ATcで誘導する前にt=0時間のODを取得した。点線はATcで誘導した培養物を表わし、実線は対照培養物を表わす。sprA1 毒素遺伝子の過剰発現は指数増殖期のS.アガラクティエの細胞増殖を阻害することができたどのデータ点も単一の培養物を表わす。
結果は、sprA1毒素遺伝子の過剰発現がS.アガラクティエの細胞増殖を指数増殖期に阻害できることを示している。ATcを添加したサンプルのOD600値はATcの添加後に増加しなかったのに対し、対照サンプルは増殖を続けた。これは、黄色ブドウ球菌からのsprA1 遺伝子が、過剰発現したときに増殖を阻害し、おそらくはS.アガラクティエ細胞を殺傷できることを示している。
ATcが本来的には細胞にとって毒性でなく、したがって細胞増殖の阻害に責任がないことを示すため、野生型BPST_002の培養物を一晩増殖させた。1つの培養物をATcで誘導し、得られたODを誘導されていない培養物と比較した。ATc培養物は対照培養物よりもOD600が10%大きかった(データは示さない)。したがって1 ug/mLの濃度で添加したATc は、BPST_002細胞の増殖にとって毒性ではなかった。
図39は、プラスミドp229(GFP)で形質転換したストレプトコッカス・アガラクティエ(BPST_002)の誘導後3時間の時点における蛍光値の棒グラフを示す。出発培養物は静止期の培養物からの1:10希釈で接種した。培養物を二連で増殖させ、蛍光を三連で読んだ。誘導されたp229培養物の増加した蛍光値は、pRAB11のPXYL/Tetプロモータ系がS.アガラクティエの中でATc誘導性プロモータとして機能できることを示す。
実施例25.黄色ブドウ球菌、ストレプトコッカス・アガラクティエ、および大腸菌の混合物の安定性
実施例25.黄色ブドウ球菌、ストレプトコッカス・アガラクティエ、および大腸菌の混合物の安定性
PBSの中での合成黄色ブドウ球菌(BP_123)、合成大腸菌(BPEC_006)、およびストレプトコッカス・アガラクティエ(BPST_002、WT A909)の混合物の安定性を求めた。
PBSの中のBP_123、BPST_002、およびBPEC_006の細胞懸濁液は、CFU播種によって評価するとき、4℃で24時間保管した後に比較的安定であった。24時間後、BP_123は、 BPST_002およびBPEC_009との混合物の中で25%減少したが、BP_123だけを含有する懸濁液の中でも減少した。BPST_002とBPEC_009は3つのタイプの細菌すべてを用いた細胞懸濁液混合物の中で原初のt=0サンプルの±10%以内にとどまった。コロニーはTSB上の増殖の特徴によって視覚的に区別され、PCR株スクリーンのデータによって裏付けられた。
SSTI(乳腺炎など)は、3つの主要な細菌種、すなわち黄色ブドウ球菌、ストレプトコッカス・アガラクティエ、および大腸菌によって起こる可能性がある。これら細菌はマイクロバイオームまたは環境の中で自然に生存することができるが、日和見感染が例えば乳房で起こる場合には乳腺炎を引き起こす可能性がある。
殺傷スイッチ技術を利用して安全性スイッチをゲノムに組み込むことによってこれらの種すべての合成株を調製し、血流または組織に入るとただちに細菌細胞死を引き起こすようにすることができる。
3つのタイプすべての細菌の混合物を含有する生きた生物学的組成物は、それら細菌それぞれの生存が、まとめて混合するときに安定なままに留まることを保証せねばなたない。この実施例は、対象で例えばSSTIの治療のために介入する生物学的製剤として将来使用するため、リン酸塩緩衝化生理食塩水(PBS)の中にまとめて懸濁させたときの黄色ブドウ球菌(BP_123)、S.アガラクティエ(BPST_002)、および大腸菌(BPEC_006)の安定性を評価する。
簡単に述べると、BP_123、BPEC_006、およびBPST_002を一晩培養物の中で増殖させた。翌日、細胞を回収し、PBSの中で3回洗浄し、濃縮した。細胞懸濁液の段階希釈を実施して生きているコロニー形成単位(CFU)の濃度を求め、いくつかの異なる懸濁液を非選択的寒天プレートに播種し、翌日コロニーをカウントして細胞濃度を計算した。その後、洗浄した培養物を適切な体積のPBSの中に再懸濁させて1×107 CFU/mLの標的濃度に到達させた。安定性懸濁液をTSBプレートに播種し、懸濁液を4℃で保管した。24時間保管した後、安定性懸濁液を再度播種し、最終CFU/mLをt=0のCFU/mLと比較した。
表52は、安定性研究で使用した株の番号と株の説明を示す
表53は、安定性懸濁液混合物、最終標的濃度、およびPBSの最終体積を示す。
BP_123、BPST_002、およびBPEC_006を含有する安定性懸濁液Dの10-5希釈液をTSBに播種した。コロニーは目視で異なっていたため、BP_123コロニーをBPST_002およびBPEC_006から識別でき、逆も同様であった。
株の素性をPCRを利用して確認した。安定性懸濁液D TSBプレートから溶解させたコロニーからの株スクリーンのPCR産物の1%アガロースゲル電気泳動を実施した。SA溶解手続きを利用して全コロニーを単一の10-5 平板希釈からスクリーニングした。目視で似ているコロニーをまとめ、すべてのライセートでPCRを3回実施した。プライマーを表54に示す。
安定性の結果が、BP_123、BPST_002、BPEC_006を含有する安定性懸濁液Dの0時間と24時間の時点におけるCFU/mLデータから計算した棒グラフを示す図40に示されている。すべての希釈液を二連でTSBプレートに播種した。CFU/mLデータは10-4希釈液から計算した。
t=0時間と24時間の時点で観察されたCFU/mLは、黄色ブドウ球菌、S.アガラクティエ、および大腸菌の混合物を含有する細胞懸濁液の安定性を裏付ける。安定性懸濁液Dでは、BPST_002とBPEC_006のCFU/mLが24時間の期間の後に安定なままであったが、BP_123の生存率は図40に見られるように大まかに25%低下した。BP_123だけを含有する細胞懸濁液Aもt=0時間から有意に低下した。このデータに基づくと、BP_123は、BPEC_006またはBPST_002と混合することとは独立に減少した。安定性懸濁液Dの中のBPST_002とBPEC_006のCFU/mLは、1つのタイプの細菌だけを含有する安定性懸濁液BおよびCと同等であった。これも、混合された細胞集団が、異なるタイプの細菌のCFU/mLに影響を与えることはないという結論につながる。これは、例えば対象のSSTIを治療するための生物学的組成物の開発にとって重要である。
Claims (106)
- 合成微生物を調製する方法であって、
標的微生物の形質転換を、上流相同アームと下流相同アームに隣接した作用遺伝子を含む合成核酸配列を含むプラスミド(ただし前記上流相同アームと前記下流相同アームはそれぞれ第1と第2の相補的な核酸配列を含む)の存在下で実施し、前記標的微生物のゲノム内の天然の誘導性プロモータ遺伝子の後ろを標的として前記作用遺伝子を挿入することを含む方法。 - 前記作用遺伝子を含む前記合成核酸配列を標的を定めて挿入するため前記標的株の中の天然の誘導性プロモータ遺伝子を選択し、
第1の環境条件で増殖させるときの前記標的微生物の中での天然の誘導性遺伝子の相対的RNA転写レベルを第2の環境条件と比較することをさらに含み、前記標的微生物が、前記第2の環境条件で増殖させるときには前記第1の環境条件と比べて同等な期間にわたって少なくとも10倍増加したRNA転写レベルを示す、請求項1の方法。 - 前記期間を、少なくとも約15分間、20分間、30分間、40分間、45分間、50分間、60分間、75分間、90分間、120分間、180分間、210分間、240分間、270分間、300分間、330分間、および360分間、またはこれらの間の任意の時間からなるグループから選択し、場合により、前記標的微生物の中での前記RNA転写レベルをRNA-seqアッセイを利用して評価する、請求項2の方法。
- 前記標的微生物が、第1の環境ニッチに定着することのできる細菌種であり、ブドウ球菌、レンサ球菌、大腸菌、バシラス、アシネトバクター、マイコバクテリウム、マイコプラズマ、エンテロコッカス、コリネバクテリウム、クレブシエラ、エンテロバクター、トゥルエペレラ、およびシュードモナスから選択される属のメンバーである、請求項1~3のいずれか1項の方法。
- 前記第1の環境条件が、完全培地であるか、対象内の皮膚、胃腸、泌尿生殖器、または粘膜のニッチである、請求項4の方法。
- 前記第2の環境条件が、血液、血漿、血清、間質液、滑液、汚染された脳脊髄液、ラクトース、グルコース、またはフェニルアラニンへの曝露、またはこれらの濃度上昇を含む、請求項5の方法。
- 前記合成微生物が、
前記標的微生物のゲノムに挿入された第1の分子改変を含み、前記分子改変は、前記作用遺伝子を含む第1の組み換えヌクレオチドを含み、
前記第1の組み換えヌクレオチドは、天然の第1の誘導性プロモータ遺伝子を含む内在性の第1の調節領域と機能可能に関連しており、
前記天然の第1の誘導性プロモータは、前記第2の環境条件への曝露に応答して、前記第1の組み換えヌクレオチドを前記第1の環境条件と比べて少なくとも10倍に増加した高レベルで遺伝子を条件付き転写させる、請求項1~6のいずれか1項の方法。 - 前記作用遺伝子が、細胞死作用遺伝子、毒力阻止作用遺伝子、代謝改変作用遺伝子、ナノファクトリー作用遺伝子、転写調節因子TetR-ファミリー遺伝子、β-ガラクトシダーゼ(ラクターゼまたはβ-gal)をコードするlacZ遺伝子、または酵素またはホルモンをコードしていて、場合により、ソルターゼA(srt A)、好気性グリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子(glpD)、チミジンキナーゼ(tdk)、グルテナーゼ、エンドペプチダーゼ、プロリルエンドペプチダーゼ(PEP)、エンドペプチダーゼ40、インスリン、およびインスリン前駆体からなるグループから選択される遺伝子からなるグループから選択される、請求項7の方法。
- 前記作用遺伝子が細胞死遺伝子である、請求項8の方法。
- 前記プラスミドが、通過微生物と前記標的微生物の両方で使用するのに適したシャトルベクターに由来する、請求項9の方法。
- 前記通過微生物が、
(a)前記標的微生物に由来するDNAメチル化酵素および/またはアセチル化酵素をコードする第1の合成核酸配列を含む第1のゲノム改変と;
(b)前記細胞死遺伝子の少なくとも一部とハイブリダイズすることのできるアンチセンスRNA配列をコードする抗毒素遺伝子を含む第2の合成核酸配列を含む第2のゲノム改変
を含む合成通過株である、請求項10の方法。 - 前記通過株の中に前記アンチセンスゲノム改変が存在することで、その通過株が前記細胞死遺伝子を含む前記プラスミドを増殖させることを可能にするとともに、その通過株が前記プラスミドの中での前記毒素遺伝子の漏れ発現から生き延びることを可能にする、請求項11の方法。
- 前記通過株の中に前記DNAメチル化酵素および/またはアセチル化酵素をコードする前記ゲノム改変が存在することで、その通過株が、
前記標的微生物の前記メチル化パターンおよび/またはアセチル化パターンと十分似たメチル化パターンおよび/またはアセチル化パターンを前記プラスミドDNAに与えることができて、その通過株の中での増殖した前記プラスミドを用いた前記標的株の形質転換を可能にするかその効率を高めることができる、請求項12の方法。 - 前記通過株が大腸菌株または酵母株である、請求項10~13のいずれか1項の方法。
- 前記標的微生物が、前記対象で菌血症またはSSTIを引き起こすことのできる望ましくない微生物と同じ属と種を持つ、請求項14の方法。
- 望ましくない微生物が前記対象で菌血症またはSSTIを引き起こすことができる、請求項15の方法。
- 前記合成微生物の測定可能な平均細胞死が、前記第2の環境条件への曝露後、少なくとも事前設定期間内に起こる、請求項9~16のいずれか1項の方法。
- 前記測定可能な平均細胞死が、前記第2の環境条件への曝露から少なくとも約15、30、60、90、120、180、240、300、または360分以内からなるグループから選択される事前設定期間内に起こる、請求項17の方法。
- 前記第1の環境条件が、完全培地であるか、対象内の皮膚または粘膜のニッチである、請求項18の方法。
- 前記第2の環境条件が、血液、血漿、血清、間質液、滑液、または汚染された脳脊髄液への曝露、またはこれらの濃度上昇を含む、請求項19の方法。
- 前記測定可能な平均細胞死が、前記事前設定期間の後の少なくとも50%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、少なくとも99.8%、または少なくとも99.9%のcfuカウント減少である、請求項20の方法。
- 前記合成微生物が対象で菌血症またはSSTIを引き起こすことができない、請求項21の方法。
- 標的微生物が黄色ブドウ球菌株に由来する、請求項1~22のいずれか1項の方法。
- 前記作用遺伝子が、sprA1、sprA2、sprG、mazF、relE、relF、hokB、hokD、yafQ、rsaE、yoeB、yefM、kpn1、sma1、またはリゾスタフィンという毒素遺伝子からなるグループから選択されるか、このグループに由来する細胞死遺伝子である、請求項23の方法。
- 前記作用遺伝子が、以下の配列番号、すなわちBP_DNA_003(配列番号3)、BP_DNA_008(配列番号8)、BP_DNA_0032、BP_DNA_035(配列番号25)、BP_DNA_045(配列番号29)、BP_DNA_065(配列番号34)、BP_DNA_067(配列番号35)、BP_DNA_068(配列番号36)、BP_DNA _069(配列番号37)、BP_DNA_070(配列番号38)、BP_DNA_071(配列番号39)、または実質的に同じヌクレオチド配列からなるグループから選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項24の方法。
- 前記標的微生物が黄色ブドウ球菌株であり、前記第1の誘導性プロモータ遺伝子が、isdA(鉄によって調節される表面決定タンパク質A)、isdB(鉄によって調節される表面決定タンパク質B)、isdG(ヘム分解モノオキシゲナーゼ)、hlgA(ガンマ-ヘモリシンコンポーネントA)、hlgA1(ガンマ-ヘモリシン)、hlgA2(ガンマ-ヘモリシン)、hlgB(ガンマ-ヘモリシンコンポーネントB)、hrtAB(ヘムによって調節されるトランスポーター)、sbnC(luc Cファミリーシデロホア生合成タンパク質)、sbnD、sbnI、sbnE(lucA/lucCファミリーシデロホア生合成タンパク質)、isdI、lrgA(ムレインヒドロラーゼ調節因子A)、lrgB(ムレインヒドロラーゼ調節因子B)、ear(Earタンパク質)、fhuA(フェリクロム輸送ATP結合タンパク質fhuA)、fhuB(フェリクロム輸送パーミアーゼ)、hlb(ホスホリパーゼC)、ヘムABCトランスポーター2遺伝子、ヘムABCトランスポーター遺伝子、isd ORF3、sbnF、アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ遺伝子、鉄ABCトランスポーター遺伝子、トレオニン脱水酵素遺伝子、シデロホアABCトランスポーター遺伝子、SAM依存性Metrans遺伝子、HarA、splF(セリンプロテアーゼSplF)、splD(セリンプロテアーゼSplD)、dps(一般ストレスタンパク質20U)、SAUSA300_2617(推定コバルトABCトランスポーター、ATP結合タンパク質)、SAUSA300_2268(ナトリウム/胆汁酸シンポーターファミリータンパク質)、SAUSA300_2616(コバルトファミリー輸送タンパク質)、srtB(ソルターゼB)、sbnA(おそらくシデロホア生合成タンパク質sbnA)、sbnB、sbnG、leuA(2-イソプロピルリンゴ酸シンターゼアミノ酸生合成酵素)、sstA(鉄輸送膜タンパク質)、sirA(鉄ABCトランスポーター基質結合タンパク質)、isdA(ヘムトランスポーター)、およびspa(ブドウ球菌のタンパク質A)からなるグループから選択される、請求項23~25のいずれか1項の方法。
- 前記第1の誘導性プロモータ遺伝子が、BP_DNA_001(配列番号1)、BP_DNA_002(配列番号2)、BP_DNA_004(配列番号4)、BP_DNA_006(配列番号6)、BP_DNA_007(配列番号7)、BP_DNA_010(配列番号9)、BP_DNA_BP_DNA_012(配列番号10)、BP_DNA_013(配列番号11)、BP_DNA_014(配列番号12)、BP_DNA_016(配列番号13)、BP_DNA_017(配列番号14)、BP_DNA_029(配列番号20)、BP_DNA_031(配列番号22)、BP_DNA_033(配列番号24)、BP_DNA_041(配列番号27)、およびBP_DNA_057(配列番号31)、またはこれらと実質的に同じヌクレオチド配列からなるグループから選択される核酸配列を持つ上流または下流の相同アームと相補的なヌクレオチド配列を含む、請求項26の方法。
- 少なくとも第2の分子改変(発現クランプ)を前記標的微生物のゲノムの中に挿入することをさらに含み、前記第2の分子改変は、
前記制御アームまたは作用遺伝子に対して特異的な短鎖非コードRNA(sRNA)をコードする(抗作用)調節因子遺伝子を含み、その調節因子遺伝子は、
前記合成微生物を前記第1の環境条件で増殖させるときは転写活性(構成的)だが、少なくとも120分の期間にわたって前記第2の環境条件に曝露された後は、誘導されない、誘導が1.5倍未満である、または抑制される第2のプロモータ遺伝子を含む第2の調節領域と機能可能に関連している、請求項1~27のいずれか1項の方法。 - 調節因子遺伝子が、前記作用遺伝子の少なくとも一部とハイブリダイズすることのできるsRNA配列をコードする、請求項28の方法。
- 前記第2の分子改変が、sprA1抗毒素遺伝子、sprA2抗毒素遺伝子、sprG抗毒素遺伝子またはsprF、ホリン抗毒素遺伝子、187-lysK抗毒素遺伝子、yefM抗毒素遺伝子、リゾスタフィン抗毒素遺伝子、またはmazE抗毒素遺伝子、kpn1抗毒素遺伝子、sma1抗毒素遺伝子、relF抗毒素遺伝子、rsaE抗毒素遺伝子、またはyoeB抗毒素遺伝子のそれぞれからなるグループを含むか、そのグループに由来する、請求項28または29の方法。
- 前記第2の分子改変が、BP_DNA_005(配列番号5)または実質的に同じヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列を含む、請求項30の方法。
- 前記第2のプロモータが、PsprA1as(sprA1as天然プロモータ)、clfB(クランピング因子B)、sceD(オートリシン、エキソプロテインD)、walKR(毒力調節因子)、atlA(主要オートリシン)、oatA(O-アセチルとランスフェラーゼA);ホスホリボシルグリシンアミドホルミルトランスフェラーゼ遺伝子、ホスホリボシルアミノイミダゾールシンターゼ遺伝子、アミドホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子、ホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシンターゼ遺伝子、ホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシンターゼ遺伝子、ホスホリボシルアミノイミダゾール-スクシノカルボキサミド遺伝子、トレハロースパーミアーゼIIC gen、DeoRファミリー転写調節因子遺伝子、ホスホフルクトキナーゼ遺伝子、PTSフルクトーストランスポーターサブユニットIIC遺伝子、ガラクトース-6-リン酸イソメラーゼ遺伝子、NarZ、NarH、NarT、アルキルヒドロペルオキシダーゼ遺伝子、仮定的タンパク質遺伝子、DeoRトランス因子遺伝子、リゾホスホリパーゼ遺伝子、タンパク質分解シャペロン遺伝子、アルキルヒドロペルオキシダーゼ遺伝子、ホスホフルクトキナーゼ遺伝子、gyrB、sigB、およびローからなるグループから選択される遺伝子を含むか、その遺伝子に由来する、請求項28~31のいずれか1項の方法。
- 前記作用遺伝子がβ-ガラクトシダーゼ(ラクターゼまたはβ-gal)酵素をコードする、請求項8の方法。
- 前記β-ガラクトシダーゼ酵素が原核生物のβ-ガラクトシダーゼ酵素である、請求項33の方法。
- 前記β-ガラクトシダーゼ酵素が、配列番号94、268、および270からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含む、請求項33の方法。
- 前記作用遺伝子がグルテナーゼをコードする、請求項8の方法。
- 前記グルテナーゼがプロピルエンドペプチダーゼである、請求項36の方法。
- 前記プロピルエンドペプチダーゼが配列番号92と93からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含む、請求項37の方法。
- 前記作用遺伝子がインスリンまたはインスリン前駆体をコードする、請求項8の方法。
- 前記インスリンまたはインスリン前駆体が配列番号105のアミノ酸配列を含む、請求項39の方法。
- 標的微生物のゲノムに挿入された第1の分子改変を含む合成微生物であって、前記分子改変は、作用遺伝子を含む第1の組み換えヌクレオチドを含み、
その第1の組み換えヌクレオチドは、天然の第1の誘導性プロモータ遺伝子を含む内在性の第1の調節領域と機能可能に関連しており、
前記天然の第1の誘導性プロモータは、状態変化への曝露に応答して基礎生産性と比べて少なくとも3倍という前記第1の組み換えヌクレオチドの条件的な高レベルの遺伝子転写をさせる、合成微生物。 - 標的微生物のゲノムに挿入された第1の分子改変を含む合成微生物であって、前記分子改変は、第1の誘導性プロモータ遺伝子を含む第1の調節領域を含む組み換えヌクレオチドを含み、
前記第1の誘導性プロモータ遺伝子は内在性作用遺伝子と機能可能に関連しており、
前記第1の誘導性プロモータは、状態変化への曝露に応答して基礎生産性と比べて少なくとも3倍という前記内在性作用遺伝子の条件的な高レベルの遺伝子転写をさせる、合成微生物。 - ある期間にわたって第1の環境条件下で増殖させるとき、前記基礎生産性が、前記第1の誘導性プロモータ遺伝子および/または作用遺伝子の遺伝子転写レベルによって決まる、請求項41または42の合成微生物。
- 前記第1の誘導性プロモータ遺伝子が、第2の環境条件への曝露を含む状態の変化から少なくとも120分の期間内に少なくとも10倍上方調節される、請求項43の合成微生物。
- 前記標的微生物が望ましくない微生物と同じ属と種を持つ、請求項41または42の合成微生物。
- 前記標的微生物が野生型微生物または合成微生物である、請求項41または42の合成微生物。
- 前記第1の環境条件下で増殖させるとき、前記第1のプロモータ遺伝子が、誘導されない、誘導が1.5倍未満である、または抑制される、請求項44の合成微生物。
- 前記第1の組み換え遺伝子が、前記作用遺伝子の直近にある制御アームをさらに含む、請求項41の合成微生物。
- 前記制御アームが、前記作用遺伝子に対して5'の非翻訳領域(UTR)および/または3'のUTRを含む、請求項48の合成微生物。
- 請求項48または49の合成微生物において、前記制御アームが前記合成微生物のゲノムによってコードされるアンチセンスオリゴヌクレオチドと相補的である、合成微生物。
- 請求項50の合成微生物において、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、前記合成微生物のゲノムに内在性であるか挿入された遺伝子によってコードされる、合成微生物。
- 前記第1のプロモータ遺伝子が、前記第2の環境条件への曝露に応答して基礎生産性の少なくとも3倍の増加という前記作用遺伝子の条件的な高レベルの遺伝子発現を誘導する、請求項41または42の合成微生物。
- 前記作用遺伝子と前記第1のプロモータ遺伝子が同じオペロンの中にある、請求項41または42の合成微生物。
- 前記作用遺伝子が、前記第1のプロモータ遺伝子と同じオペロンの中に位置する任意の遺伝子の終止コドンと前記転写ターミネータの間に組み込まれる、請求項53の合成微生物。
- 請求項41~54のいずれか1項の合成微生物において、この合成微生物は、前記制御アームまたは作用遺伝子に対して特異的な短鎖非コードRNA(sRNA)をコードする(抗作用)調節因子遺伝子を含む少なくとも第2の分子改変(発現クランプ)をさらに含み、前記調節因子遺伝子は、この合成微生物を前記第1の環境条件で増殖させるときには転写活性(構成的)だが、少なくとも120分の期間にわたって前記第2の環境条件に曝露された後は誘導されない、誘導が1.5倍未満である、または抑制される第2のプロモータ遺伝子を含む内在性の第2の調節領域に機能可能に関連している、合成微生物。
- 前記第1の環境条件下で増殖させるとき、前記調節因子遺伝子の転写により、前記sRNAが前記作用遺伝子の発現を阻止または抑制するのに十分な量で生成する、請求項55の合成微生物。
- 前記第1の分子改変が、殺傷スイッチ分子改変、毒力阻止分子改変、代謝性分子改変、およびナノファクトリー分子改変からなるグループから選択される、請求項41または42の合成微生物。
- 前記第1の分子改変のゲノム安定性と前記作用遺伝子の機能的安定性を少なくとも500世代にわたって示す、請求項57の合成微生物。
- 前記殺傷スイッチ分子改変が、前記第1の誘導性プロモータ遺伝子と機能可能に関連した第1の細胞死遺伝子を含む作用遺伝子を含む、請求項57の合成微生物。
- 天然の作用(毒素)遺伝子の少なくとも一部の欠失をさらに含む、請求項59の合成微生物。
- 前記天然の作用(毒素)遺伝子の少なくとも一部の欠失が、シャイン-ダルガノ配列、リボソーム結合部位、および前記天然毒素遺伝子の転写開始部位からなるグループから選択される天然核酸配列の欠失を含む、請求項60の合成微生物。
- 前記天然毒素遺伝子に対して特異的な天然の抗毒素遺伝子の少なくとも一部の欠失をさらに含む、請求項60または61の合成微生物。
- 前記天然の抗毒素遺伝子が、前記天然毒素遺伝子、mRNA、またはそれによってコードされる毒素に対して特異的なmRNAアンチセンスまたは抗毒素ペプチドをコードする、請求項62の合成微生物。
- 請求項59~63のいずれか1項の合成微生物において、前記第2の環境条件に曝露されるとき、前記合成微生物の測定可能な平均細胞死が、状態が変化してから少なくとも事前設定期間内に起こり、場合により、前記測定可能な平均細胞死が、前記第2の環境条件への曝露から少なくとも約15、30、60、90、120、180、240、300、または360分以内からなるグループから選択される少なくとも事前設定期間内に起こる、合成微生物。
- 前記測定可能な平均細胞死が、前記事前設定期間の後の少なくとも50%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、少なくとも99.8%、または少なくとも99.9%のcfuカウント減少である、請求項64の合成微生物。
- 請求項57~65のいずれか1項の合成微生物において、前記殺傷スイッチ分子改変が、前記第2の環境条件内での前記合成微生物の感染性増殖を減らす、または阻止する、合成微生物。
- 前記第1の環境条件が、皮膚条件、粘膜条件、泌尿生殖器条件、胃腸条件、または完全培地からなるグループから選択される、請求項41~66のいずれか1項の合成微生物。
- 前記第2の環境条件が、血液、血漿、血清、間質液、滑液、汚染された脳脊髄液、ラクトース、グルコース、またはフェニルアラニンへの曝露、またはこれらの濃度上昇を含む、請求項41~67のいずれか1項の合成微生物。
- 前記標的微生物が少なくとも1つの抗微生物剤に対して感受性である、請求項41~68のいずれか1項の合成微生物。
- 前記標的微生物が細菌標的微生物と酵母標的微生物からなるグループから選択される、請求項41~69のいずれか1項の合成微生物。
- 前記標的微生物が、ブドウ球菌、レンサ球菌、大腸菌、バシラス、アシネトバクター、マイコバクテリウム、マイコプラズマ、エンテロコッカス、コリネバクテリウム、クレブシエラ、エンテロバクター、トゥルエペレラ、およびシュードモナスからなるグループから選択される属を持つ細菌種である、請求項70の合成微生物。
- 前記標的微生物が、黄色ブドウ球菌、大腸菌、およびレンサ球菌属の種からなるグループから選択される、請求項71の合成微生物。
- 前記作用遺伝子が、sprA1、sprA2、sprG、mazF、relE、relF、hokB、hokD、yafQ、rsaE、yoeB、yefM、kpn1、sma1、およびリゾスタフィン毒素遺伝子からなるグループから選択されるか、このグループに由来する細胞死遺伝子である、請求項72の合成微生物。
- 前記作用遺伝子が、以下の配列番号、すなわちBP_DNA_003(配列番号3)、BP_DNA_008(配列番号8)、BP_DNA_0032、BP_DNA_035(配列番号25)、BP_DNA_045(配列番号29)、BP_DNA_065(配列番号34)、BP_DNA_067(配列番号35)、BP_DNA_068(配列番号36)、BP_DNA_069(配列番号37)、BP_DNA_070(配列番号38)、BP_DNA_071(配列番号39)、または実質的に同じヌクレオチド配列からなるグループから選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項73の合成微生物。
- 前記標的微生物が黄色ブドウ球菌株であり、前記第1の誘導性プロモータ遺伝子が、isdA(鉄によって調節される表面決定タンパク質A)、isdB(鉄によって調節される表面決定タンパク質B)、isdG(ヘム分解モノオキシゲナーゼ)、hlgA(ガンマ-ヘモリシンコンポーネントA)、hlgA1(ガンマ-ヘモリシン)、hlgA2(ガンマ-ヘモリシン)、hlgB(ガンマ-ヘモリシンコンポーネントB)、hrtAB(ヘムによって調節されるトランスポーター)、sbnC(luc Cファミリーシデロホア生合成タンパク質)、sbnD、sbnI、sbnE(lucA/lucCファミリーシデロホア生合成タンパク質)、isdI、lrgA(ムレインヒドロラーゼ調節因子A)、lrgB(ムレインヒドロラーゼ調節因子B)、ear(Earタンパク質)、fhuA(フェリクロム輸送ATP結合タンパク質fhuA)、fhuB(フェリクロム輸送パーミアーゼ)、hlb(ホスホリパーゼC)、ヘムABCトランスポーター2遺伝子、ヘムABCトランスポーター遺伝子、isd ORF3、sbnF、アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ遺伝子、鉄ABCトランスポーター遺伝子、トレオニン脱水酵素遺伝子、シデロホアABCトランスポーター遺伝子、SAM依存性Metrans遺伝子、HarA、splF(セリンプロテアーゼSplF)、splD(セリンプロテアーゼSplD)、dps(一般ストレスタンパク質20U)、SAUSA300_2617(推定コバルトABCトランスポーター、ATP結合タンパク質)、SAUSA300_2268(ナトリウム/胆汁酸シンポーターファミリータンパク質)、SAUSA300_2616(コバルトファミリー輸送タンパク質)、srtB(ソルターゼB)、sbnA(おそらくシデロホア生合成タンパク質sbnA)、sbnB、sbnG、leuA(2-イソプロピルリンゴ酸シンターゼアミノ酸生合成酵素)、sstA(鉄輸送膜タンパク質)、sirA(鉄ABCトランスポーター基質結合タンパク質)、isdA(ヘムトランスポーター)、およびspa(ブドウ球菌のタンパク質A)からなるグループから選択される、請求項72~74のいずれか1項の合成微生物。
- 前記第1の誘導性プロモータ遺伝子が、BP_DNA_001(配列番号1)、BP_DNA_002(配列番号2)、BP_DNA_004(配列番号4)、BP_DNA_006(配列番号6)、BP_DNA_007(配列番号7)、BP_DNA_010(配列番号9)、BP_DNA_BP_DNA_012(配列番号10)、BP_DNA_013(配列番号11)、BP_DNA_014(配列番号12)、BP_DNA_016(配列番号13)、BP_DNA_017(配列番号14)、BP_DNA_029(配列番号20)、BP_DNA_031(配列番号22)、BP_DNA_033(配列番号24)、BP_DNA_041(配列番号27)、およびBP_DNA_057(配列番号31)、またはこれらと実質的に同じヌクレオチド配列からなるグループから選択される核酸配列を持つ上流または下流の相同アームと相補的なヌクレオチド配列を含む、請求項75の合成微生物。
- 前記作用遺伝子の少なくとも一部にハイブリダイズすることのできるsRNA配列をコードするか、前記作用遺伝子によってコードされるタンパク質の少なくとも一部に対して特異的なペプチドをコードする第2の分子改変を含む、請求項75または76の合成微生物。
- 前記第2の分子改変が、sprA1抗毒素遺伝子、sprA2抗毒素遺伝子、sprG抗毒素遺伝子またはsprF、ホリン抗毒素遺伝子、187-lysK抗毒素遺伝子、yefM抗毒素遺伝子、リゾスタフィン抗毒素遺伝子、またはmazE抗毒素遺伝子、kpn1抗毒素遺伝子、sma1抗毒素遺伝子、relF抗毒素遺伝子、rsaE抗毒素遺伝子、またはyoeB抗毒素遺伝子のそれぞれからなるグループを含むか、そのグループに由来する、請求項77の合成微生物。
- 前記第2の分子改変が、BP_DNA_005(配列番号5)を含むヌクレオチド配列、または実質的に同じヌクレオチド配列を含む、請求項78の合成微生物。
- 前記第2のプロモータが、PsprA1as(sprA1as天然プロモータ)、clfB(クランピング因子B)、sceD(オートリシン、エキソプロテインD)、walKR(毒力調節因子)、atlA(主要オートリシン)、oatA(O-アセチルとランスフェラーゼA);ホスホリボシルグリシンアミドホルミルトランスフェラーゼ遺伝子、ホスホリボシルアミノイミダゾールシンターゼ遺伝子、アミドホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子、ホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシンターゼ遺伝子、ホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシンターゼ遺伝子、ホスホリボシルアミノイミダゾール-スクシノカルボキサミド遺伝子、トレハロースパーミアーゼIIC gen、DeoRファミリー転写調節因子遺伝子、ホスホフルクトキナーゼ遺伝子、PTSフルクトーストランスポーターサブユニットIIC遺伝子、ガラクトース-6-リン酸イソメラーゼ遺伝子、NarZ、NarH、NarT、アルキルヒドロペルオキシダーゼ遺伝子、仮定的タンパク質遺伝子、DeoRトランス因子遺伝子、リゾホスホリパーゼ遺伝子、タンパク質分解シャペロン遺伝子、アルキルヒドロペルオキシダーゼ遺伝子、ホスホフルクトキナーゼ遺伝子、gyrB、sigB、およびローからなるグループから選択される遺伝子を含むか、その遺伝子に由来する、請求項78または79の合成微生物。
- 前記ナノファクトリー分子改変が、酵素またはホルモンをコードする作用遺伝子を含む、請求項49の合成微生物。
- 前記酵素またはホルモンが、β-ガラクトシダーゼ酵素、グルテナーゼ、およびインスリンまたはインスリン前駆体からなるグループから選択される、請求項81の合成微生物。
- 前記β-ガラクトシダーゼ酵素が原核生物のβ-ガラクトシダーゼ酵素である、請求項82の合成微生物。
- 前記β-ガラクトシダーゼ酵素が配列番号94、268、および270からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含む、請求項82または83の合成微生物。
- 前記グルテナーゼがプロリルエンドペプチダーゼである、請求項82の合成微生物。
- 前記プロリルエンドペプチダーゼが配列番号92と93からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含む、請求項85の合成微生物。
- 請求項41~86のいずれか1項の合成微生物の有効量と、医薬として許容可能な基剤および/または賦形剤とを含む医薬組成物。
- 医薬として許容可能な前記賦形剤が、希釈剤、皮膚軟化剤、結合剤、賦形剤、潤滑剤、甘味剤、香味剤、湿潤剤、保存剤、バッファ、または吸収剤、またはこれらの組み合わせを含む、請求項87の医薬組成物。
- 栄養素、プレバイオティック細菌種、片利共生細菌種、および/またはプロバイオティック細菌種をさらに含む、請求項87または88の医薬組成物。
- 請求項87~89のいずれか1項の医薬組成物を含む単回投与単位。
- 少なくとも105、少なくとも106、少なくとも107、少なくとも108、少なくとも109、少なくとも1010 CFU、または少なくとも1011の前記合成微生物と、医薬として許容可能な賦形剤とを少なくとも含む、請求項90の単回投与単位。
- 局所投与のために製剤化される、請求項91の投与単位。
- 対象内の望ましくない微生物の根絶、予防、およびまたは再発防止のための薬を製造するのに使用するための、請求項41~86のいずれか1項の合成微生物、または請求項87~92のいずれか1項の医薬組成物
- 対象内の皮膚・軟部組織感染症(SSTI)または菌血症の根絶、予防、およびまたは再発防止のための薬を製造するのに使用するための、請求項41~80のいずれか1項の合成微生物の有効量を含む生きた生物学的組成物。
- ゲノム的に安定でゲノムに組み込まれた殺傷スイッチ(KS)分子改変を含む合成微生物を調製する方法であって、
標的微生物を同定し;
標的微生物の中でKSを活性化させるための興味ある体液または環境を選択し;
KSを組み込むため前記標的微生物のゲノムの少なくとも一部をマッピングし;
前記標的微生物を前記興味ある体液または環境に曝露することによって前記標的微生物のゲノム内の上方調節された遺伝子領域またはプロモータ領域を発見し;
前記標的微生物にとって天然または非天然の候補毒素遺伝子を同定し;
誘導性プロモータの制御下にある前記候補毒素遺伝子を含有するプラスミドを作製し;
前記プラスミドで前記標的微生物を形質転換し、前記誘導可能なプロモータを誘導した後、細胞死をスクリーニングし;
前記興味ある体液または環境において前記上方調節された遺伝子領域またはプロモータ領域の調節下にある致死性候補毒素遺伝子を前記標的微生物のゲノムに組み込むために選択し;
前記標的微生物のゲノム内にあって興味ある体液または環境において上方調節される前記遺伝子領域またはプロモータ領域の近くに前記候補毒素遺伝子を挿入し、ゲノム的に安定でゲノムに組み込まれた殺傷スイッチ(KS)分子改変を含む前記合成微生物を創出することを含む方法。 - 前記発見が、興味ある体液または環境に応答して前記標的微生物の中で転写されたRNAのレベルをRNA-Seqまたはマイクロアレイ装置を利用して定量し、前記標的微生物の上方調節された遺伝子を発見することを含む、請求項95の方法。
- 前記細胞死が、CFU播種によって、または分光光度計を用いた光学密度の測定によって測定される、請求項95の方法。
- 前記挿入が、前記候補毒素遺伝子を、前記標的微生物のゲノム内にあって興味ある体液または環境の中で上方調節される前記遺伝子またはプロモータ領域の前100塩基以内、中、または終端から100塩基以内に挿入することを含む、請求項95の方法。
- 前記候補毒素が前記標的微生物にとって天然の毒素/抗毒素系を含む、請求項95の方法。
- 前記興味ある体液または環境が、血液、血漿、血清、間質液、滑液、および脳脊髄液からなるグループから選択される、請求項95の方法。
- 前記殺傷スイッチ(KS)分子改変が、前記興味ある体液または環境において前記合成微生物の感染性増殖を減らす、または予防する、請求項95の方法。
- 前記合成微生物が、前記KS分子改変のゲノム安定性を少なくとも500世代にわたって示す、請求項101の方法。
- 前記殺傷スイッチ分子改変が、前記標的微生物のゲノム内にあって興味ある体液または環境の中で上方調節される前記遺伝子またはプロモータ領域と機能可能に関連している、請求項101の方法。
- 前記標的微生物が、細菌標的微生物と酵母標的微生物からなるグループから選択される、請求項95~103のいずれか1項の方法。
- 前記標的微生物が、ブドウ球菌、レンサ球菌、大腸菌、バシラス、アシネトバクター、マイコバクテリウム、マイコプラズマ、エンテロコッカス、コリネバクテリウム、クレブシエラ、エンテロバクター、トゥルエペレラ、およびシュードモナスから選択される属を持つ細菌種である、請求項104の方法。
- 前記標的微生物が、黄色ブドウ球菌、大腸菌、およびレンサ球菌属の種から選択される、請求項105の方法。
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