CN102199585B - 重组葡激酶二聚体的制备及聚乙二醇定点修饰 - Google Patents
重组葡激酶二聚体的制备及聚乙二醇定点修饰 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102199585B CN102199585B CN2011100923747A CN201110092374A CN102199585B CN 102199585 B CN102199585 B CN 102199585B CN 2011100923747 A CN2011100923747 A CN 2011100923747A CN 201110092374 A CN201110092374 A CN 201110092374A CN 102199585 B CN102199585 B CN 102199585B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- staphylokinase
- preparation
- dimer
- peg
- polyethylene glycol
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种C-末端引入半胱氨酸的葡激酶突变体。与野生型葡激酶相比,该突变体在C-末端多了3个氨基酸,即甘氨酸-甘氨酸-半胱氨酸(-Gly-Gly-Cys)。本发明还公开了该葡激酶突变体二聚体的制备方法。葡激酶的二聚体化是通过同型双功能连接剂1,4-二马来酰亚胺丁烷的2个马来酰亚胺基团与葡激酶的C-末端的半胱氨酸形成稳定的共价键。本发明还公开了该葡激酶突变体二聚体实现N-末端聚乙二醇定点修饰的制备方法。在特定条件下,甲氧基聚乙二醇丙醛与葡激酶二聚体分子中的1个N-末端通过共价键连接。葡激酶二聚体的聚乙二醇修饰产物在生物活性方面要比葡激酶单体的修饰产物要高。
Description
技术领域
本发明属于蛋白质化学领域,涉及一种重组葡激酶二聚体的制备方法及其N-末端的聚乙二醇定点修饰,能够延长葡激酶在体内的循环半衰期和提高葡激酶的生物活性。
背景技术
葡激酶(SAK)是一种含136个氨基酸的单链蛋白,相对分子量为15.5kDa。作为新一代溶栓药物,其溶栓效力与第二代溶血栓药物组织纤溶酶原激活剂(Tissue plasminogenactivator,t-PA)相当,但价格却远低于t-PA及其衍生物。目前,国内外重组葡激酶的研究都已进入III期临床试验阶段。葡激酶作为纤溶酶原(Plasminogen,Plg)的激活因子,能与Plg形成1∶1的复合物,在痕量纤溶酶作用下,纤溶酶原被激活为纤溶酶,发挥溶栓效应。葡激酶通常通过在大肠杆菌的细胞溶质中高效表达来获得。但是,由于葡激酶具有抗原性和免疫原性,并且它在体内的半衰期很短,导致葡激酶需要多次重复注射,并且可能引发病人的不适应反应。
对葡激酶进行聚乙二醇(PEG)化学修饰可以有效解决上述缺陷。PEG是一种无毒、无免疫原性的水溶性高分子物质,可以通过化学反应与蛋白质和多肽等共价结合。PEG修饰可以延长蛋白质药物在血液中的循环半衰期,并且降低其免疫原性和抗原性,从而提高蛋白质药物的药效。另外,PEG修饰可以增强蛋白质药物抵抗蛋白酶水解的能力,增强蛋白质药物的水溶性并且降低肾脏对蛋白质的排泄作用。
Collen等将葡激酶的Ser-3定点突变为Cys-3,Cys能与PEG-马来酰亚胺(Mal-PEG)产生特异性反应,生成定点修饰的均一产物。葡激酶的Cys突变体SY161分别与分子量为5kDa,10kDa和20kDa的Mal-PEG反应。PEG修饰后的SY161保持了完整的比活性、纤维蛋白溶解能力以及人体血浆内的纤维蛋白选择性。仓鼠、兔子和AMI患者的PEG-SY161血浆清除量随着PEG分子量的增大而降低。注射PEG-SY161后,抗体量在3-4周以后才达到中等水平,这远远低于注射野生型葡激酶。因此,PEG修饰大大的降低了葡激酶的免疫原性和抗原性,并且延长了它的循环半衰期。
然而,PEG修饰同时也存在一些问题。例如,PEG修饰导致葡激酶的生物活性降低。由于PEG为链状的大分子,它在屏蔽抗原决定簇的同时,也会干扰葡激酶与其受体纤溶酶原的相互作用,导致葡激酶的活性降低。因此,需要尝试设计和开发新的PEG修饰方法来解决上述问题,使葡激酶具有更好的药用价值。蛋白质的二聚体化可以通过增强蛋白质与其受体间的亲和力,提高蛋白的生物活性。另外,二聚体化后蛋白质的分子量成倍增加,这可以提高它在体内的循环半衰期。为制备定点结合的蛋白二聚体,通常采用基因工程为辅助手段的化学聚合方法。因此,为了使葡激酶在血液的循环半衰期延长,抗原性和免疫原性降低,并且保持较高生物活性,本发明将蛋白质的二聚体化和PEG修饰两种方法有效地结合起来。
发明内容
为了降低葡激酶的抗原性和免疫原性、提高葡激酶在体内的循环半衰期和药效,并且降低用药次数,本发明公开了一种在C-末端引入半胱氨酸的重组葡激酶。
本发明还公开了该重组葡激酶的制备方法。
本发明还公开了用同型双功能连接剂,即两端含有相同官能团的试剂,来制备重组葡激酶二聚体的方法。
本发明还公开了该重组葡激酶二聚体实现N-末端聚乙二醇定点修饰的制备方法。
本发明的重组葡激酶突变体,与野生型葡激酶相比,在C-末端多了3个氨基酸,即甘氨酸-甘氨酸-半胱氨酸(-Gly-Gly-Cys)。由于引入的氨基酸远离葡激酶的活性中心,二聚体化对葡激酶的活性影响较小。
本发明所述重组葡激酶的制备方法包括如下步骤:
构建重组葡激酶突变基因、突变基因与质粒连接构建表达载体、载体转化入大肠杆菌并进行高效表达、重组葡激酶蛋白的分离纯化。本发明采用PCR法构建的葡激酶突变基因与pET15质粒结合,在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了高效表达。表达产物主要集中于菌体细胞超声破碎离心后的上清液中。用Q Sepharose High Performance阴离子交换层析法获得了纯化的重组葡激酶。
本发明所述重组葡激酶二聚体的制备采用以下方案:
所述的同型双功能连接剂为1,4-二马来酰亚胺丁烷(1,4-bismaleimidobutane,BMB),其特征在于能与半胱氨酸的巯基产生特异性反应,生成硫醚键,并且在还原性条件下不会被破坏。所述的葡激酶二聚体化是通过1,4-二马来酰亚胺丁烷的2个马来酰亚胺基团与葡激酶C-末端的半胱氨酸形成稳定的共价键。
葡激酶二聚体的制备条件如下:
1)1,4-二马来酰亚胺丁烷溶于N,N-二甲基甲酰胺,浓度为4.0mM;
2)葡激酶浓度为0.2-0.3mM,所用缓冲体系为PBS缓冲液,pH 7.4;
3)葡激酶与1,4-二马来酰亚胺丁烷以1∶0.5(摩尔比)在4℃反应过夜。
本发明所述N-末端聚乙二醇(PEG)定点修饰的重组葡激酶二聚体(PEG-dSAK)的制备采用以下方案:所述的聚乙二醇为单甲氧基聚乙二醇丙醛,分子量为20kDa,其特征在于能在特定条件下与葡激酶的N-末端通过共价键连接。葡激酶(SAK)二聚体化及其PEG化学修饰示意图如下所示:
PEG-dSAK的制备条件如下:
1)反应缓冲体系为20mM醋酸-醋酸钠缓冲液,pH 5.0;
2)葡激酶二聚体∶PEG∶NaCNBH3的摩尔比为1∶8∶80,葡激酶二聚体的反应终浓度为0.06mM。葡激酶二聚体的浓度计算以样品所含的葡激酶单体的摩尔数为基准;
3)置于4℃反应过夜。
本发明还公开了聚乙二醇修饰葡激酶二聚体的生物活性。葡激酶二聚体的聚乙二醇修饰产物在生物活性方面要比葡激酶单体的修饰产物要高。
附图说明
图1为重组葡激酶的分离纯化及鉴定图。重组葡激酶用Q Sepharose High Performance阴离子交换柱(2.6cm×20cm)分离纯化。上样后用20mM磷酸缓冲液(pH 7.6)洗脱125ml,然后用含0-0.5M NaCl的20mM磷酸缓冲液(pH 7.6)进行梯度洗脱。收集2-4号峰所对应的组分,用SDS-PAGE还原性电泳分析鉴定该组分,确定葡激酶基本上位于2-4号峰,并且不含其它杂质。
图2为葡激酶(SAK)与1,4-二马来酰亚胺丁烷(BMB)不同比例反应图。用分析型色谱柱Superdex 200(1cm×30cm)检测产物的生成情况。分析条件:流动相为含0.1M Na2SO4的20mM磷酸缓冲液(pH 7.6),流速0.5ml/min,室温检测,检测波长为280nm,进样量100μL。图3为葡激酶(SAK)与葡激酶二聚体(dSAK)的PEG20K-醛修饰图。反应比例分别为SAK∶PEG∶NaCNBH3=1∶6∶60,dSAK∶PEG∶NaCNBH3=1∶8∶80。SAK的反应终浓度为0.1mM,dSAK的反应终浓度为0.06mM。用分析型色谱柱Superdex 200(1cm×30cm)检测产物的生成情况。分析条件:流动相为含0.1M Na2SO4的20mM磷酸缓冲液(pH 7.6),流速0.5ml/min,室温检测,检测波长为280nm,进样量100μL。
图4为葡激酶样品纯化后的体积排阻色谱分析图。用分析型色谱柱Superdex 200(1cm×30cm)检测产物的生成情况。分析条件:流动相为含0.1M Na2SO4的20mM磷酸缓冲液(pH 7.6),流速0.5ml/min,室温检测,检测波长为280nm,进样量100μL。
图5为葡激酶样品的纯化后的还原性SDS-PAGE电泳图。泳道1、2、3、4和5分别代表标准蛋白、葡激酶、PEG修饰葡激酶、葡激酶二聚体与PEG修饰葡激酶二聚体。
图6为葡激酶样品的胰蛋白酶切图谱。所用分析柱为反相柱Proteonavi(4.6×250mm)。分析条件:流动相A为含0.1%三氟乙酸的水,流动相B为含0.1%三氟乙酸的乙腈。用5%的流动相B洗脱15分钟,然后用5-50%的流动相B洗脱100分钟。流速为0.5ml/min,蛋白进样量为50-60μg。
图7为葡激酶样品的体外活性图。用溶酶纤维圈实验法,测得各样品的纤维圈直径,以葡激酶为100%,计算得到其它样品的相对活性作图。
具体实施方案
实施例一 C-末端含半胱氨酸的重组葡激酶(SAK)的构建、表达和纯化
1实验方法
1.1重组葡激酶(SAK)基因的构建
设计并合成下列2条引物:
引物(pF)序列:5’-atgcccatgggcaaaggcgatgacgcg-3’
反义引物(pR)序列:5’-gctaggatccttagcagccacctttcttttctataacaacctttgta-3’
以SakSTAR为模版,通过PCR方法在C末端引入-Gly-Gly-Cys,构建重组葡激酶。PCR单次循环的变性、退火和延伸温度分别为94℃、55℃和72℃,每种温度的反应时间为30秒。进行30次循环,得到PCR扩增产物。
1.2重组葡激酶表达载体的构建
采用NcoI/BamHI双酶切反应体系分别对pET15b质粒和重组葡激酶的基因片段进行酶切处理,回收后用T4连接酶进行连接,构建重组表达质粒pET15b-SAK。转化大肠杆菌Top10,培养后提取质粒,酶切鉴定是否含有重组SAK基因序列,对阳性克隆进行测序。
1.3重组葡激酶的诱导表达与鉴定
以E.coli BL21(DE3)为表达菌株。将得到的阳性pET15b-SAK质粒转化入E.coli BL21。在转化平板上挑单菌落,在10ml含氨苄的LB培养基中培养过夜,之后导入1L含100μg/mL氨苄的LB培养基中培养。3小时后,加入400μmol/L IPTG进行诱导表达。诱导3小时后,离心收集所得的菌体。将得到的菌体用100mL的20mM磷酸缓冲液(pH 7.6)重悬,置于0℃超声破碎。离心后分别取上清液和沉淀,用还原性SDS-PAGE电泳进行分析。
1.4重组葡激酶的分离纯化
重组葡激酶用Q Sepharose High Performance阴离子交换柱(2.6cm×20cm)分离纯化。样品体积为30-40ml,蛋白含量为50-60mg。平衡缓冲液为20mM磷酸缓冲液(pH 7.6)。上样后用20mM磷酸缓冲液(pH 7.6)洗脱125ml,然后用含0-0.5MNaCl的20mM磷酸缓冲液(pH 7.6)进行梯度洗脱。收集相应组分,用还原性SDS-PAGE电泳鉴定,以确定葡激酶所在的目标峰。
2结果
对阳性克隆进行测序,结果表明得到了正确的重组葡激酶基因序列。将阳性的pET15b-SAK质粒导入表达菌株E.coli BL21进行转化培养,诱导表达之后,离心收集菌体,用20mM磷酸缓冲液(pH 7.6)重悬之后进行超声破碎。将细胞破碎液进行离心,分别收集上清液和沉淀进行还原性电泳分析,发现葡激酶基本位于超声破碎后的上清液中。
用Q Sepharose High Performance阴离子交换层析处理含葡激酶的上清液。收集相应组分的峰用还原性SDS-PAGE电泳进行组分鉴定。如图1所示,葡激酶主要集中在2-4号穿透峰中,并且该峰基本不含其它杂质。将该峰收集并浓缩,贮存于-20℃。
实施例二 重组葡激酶二聚体的PEG定点修饰及产物鉴定
1实验方法
1.1葡激酶与1,4-二马来酰亚胺丁烷不同比例的二聚体化反应
将1,4-二马来酰亚胺丁烷(BMB)溶于N,N-二甲基甲酰胺,配成浓度4mM的溶液。纯化后的葡激酶浓度为0.2-0.3mM,所用缓冲体系为20mM磷酸缓冲液(pH 7.4)。葡激酶与BMB分别以1∶0.5,1∶1,1∶2和1∶5(摩尔比)在4℃下反应过夜,得到的产物用Superdex 200凝胶过滤柱鉴定。
1.2葡激酶及其二聚体(dSAK)的PEG-醛(20K)定点修饰
反应缓冲体系为20mM醋酸-醋酸钠缓冲液(pH 5.0)。SAK∶PEG∶NaCNBH3=1∶6∶60,dSAK∶PEG∶NaCNBH3=1∶8∶80。葡激酶的反应终浓度为0.1mM,dSAK的反应终浓度为0.06mM。葡激酶二聚体的浓度计算以样品所含的葡激酶单体的摩尔数为基准。置于4℃下反应过夜,得到的产物用Superdex 200凝胶过滤柱(1.0cm×30cm)鉴定。
1.3dSAK,PEG-SAK与PEG-dSAK的分离纯化
所得产物用制备色谱柱Superdex 200(1.6cm×60cm)分离纯化,收集产物进行浓缩。用Superdex 200凝胶过滤柱(1.0cm×30cm)和还原性SDS-PAGE对纯化后的样品进行鉴定。测定蛋白浓度,并贮存于-20℃。
1.4葡激酶及其二聚体(dSAK)的PEG-醛修饰位点鉴定
将葡激酶样品SAK,dSAK,PEG-SAK与PEG-dSAK用含2M脲的50mM NH4HCO3缓冲液替换。用超纯水配制胰蛋白酶溶液,浓度为0.5mg/ml。按胰蛋白酶∶SAK=1∶100(w/w)的比例在37℃下酶切10小时。所处理的样品用C4反相HPLC分析,并用质谱鉴定相应的肽段,以确定PEG的修饰位点。
2结果
不同反应比例下葡激酶二聚体的产率如图2所示。当SAK∶BMB=1∶0.5时,dSAK产率高达67%。而随着BMB用量逐步增大,dSAK产率逐步下降。当SAK∶BMB=1∶5时,产率只有16%。产率的计算依据葡激酶二聚体的峰面积占葡激酶二聚体和葡激酶峰面积之和的百分率。因此,葡激酶二聚体的制备采用蛋白过量的方法,SAK∶BMB=1∶0.5被确定为制备葡激酶二聚体的最佳反应条件。
葡激酶及其二聚体的PEG20K-醛修饰结果如图3所示。在SAK∶PEG∶NaCNBH3=1∶6∶60的条件下,PEG修饰葡激酶的产率较高,而且多修饰产物所占的比例较小,这有利于后续的纯化工作。同样的分析适用于葡激酶二聚体。PEG修饰葡激酶和PEG修饰葡激酶二聚体的产率分别为46%和43%。产率的计算依据PEG修饰葡激酶和PEG修饰葡激酶二聚体的峰面积占所有峰面积之和的百分比。
纯化后样品的分析鉴定如图4和5所示。SAK、dSAK、PEG-SAK和PEG-dSAK样品都具有很高的纯度。由图5可见,由引入葡激酶的C末端的Cys的-SH和BMB的马来酰亚胺基团形成了稳定的硫醚键,并且在还原性条件下也不会被破坏。
胰蛋白酶酶切图谱被用来鉴定PEG的修饰位点。如图6所示,未被修饰葡激酶的谱图展示了胰蛋白酶切后的一系列肽段,并且经过质谱鉴定。图6所示T1肽段即为含14个氨基酸片断的N-末端肽段(MGDDASYFEPTGPY)。与葡激酶相比,葡激酶二聚体的酶切图谱基本上没有发生改变。而PEG修饰葡激酶图谱上T1位置的峰基本上完全消失了。这说明PEG基本上都定点修饰到了SAK的N-末端。与葡激酶二聚体相比,PEG修饰葡激酶二聚体的酶切图谱中的T1片段基本上是原来的50%,而其它肽段的峰基本上没有发生改变。由于葡激酶二聚体中包含2个N-末端,PEG只修饰在其中之一的末端。因此,可以认为PEG完全定点修饰到了葡激酶二聚体的2个N-末端中的1个。因此,我们成功地制备了N-末端定点修饰的葡激酶二聚体,而葡激酶二聚体是通过葡激酶的C-末端定点连接的。
实施例三PEG修饰葡激酶二聚体(PEG-dSAK)的体外活性测定
1实验方法
葡激酶体外活性采用溶酶纤维圈实验完成。实验所用的缓冲液为含0.15M NaCl的50mMTris-盐酸缓冲液(pH 7.5)。称取0.1克人纤维蛋白原,溶于10毫升上述缓冲液中,置于37℃恒温箱1小时,使其充分溶解。称取0.15克琼脂糖,溶于10毫升上述缓冲液中,用微波溶解,并于55℃保存20分钟。将10U的凝血酶加入到完全溶解的纤维蛋白原溶液中,混匀后倒入琼脂糖溶液中,混匀后倒平板。平板放置10分钟,使之充分凝固,在平板上打孔。每孔中加入等量的葡激酶样品(0.2mg/ml×20μl),于37℃倒置20小时,观察溶纤维圈,测量其直径。
2结果
葡激酶样品的生物活性由溶酶纤维圈实验来检测。如图7所示,葡激酶二聚体具有和葡激酶相同的生物活性。与葡激酶相比,PEG修饰葡激酶的活性只有原蛋白的39%,而PEG修饰葡激酶二聚体的活性却为原蛋白的62%。因此,PEG修饰葡激酶二聚体能更好的保留葡激酶的生物活性。
Claims (9)
1.一种重组葡激酶突变体,其特征在于与野生型葡激酶相比,在C-末端多了3个氨基酸,即甘氨酸-甘氨酸-半胱氨酸(-Gly-Gly-Cys)。
2.根据权利要求1所述的重组葡激酶突变体的制备方法,其特征在于包括如下步骤:构建重组葡激酶突变基因;突变基因与质粒连接构建表达载体;载体转化入大肠杆菌并进行高效表达;重组葡激酶蛋白的分离纯化。
3.根据权利要求2的制备方法,其特征在于所述的表达载体为pET15质粒。
4.根据权利要求2的制备方法,其特征在于所述的大肠杆菌为E.coli BL21(DE3)。
5.一种重组葡激酶二聚体的制备方法,其特征在于所用重组葡激酶为权利要求1所述的重组葡激酶突变体,并用同型双功能连接剂制备葡激酶二聚体。
6.根据权利要求5的制备方法,其特征在于所述的同型双功能连接剂为1,4-二马来酰亚胺丁烷。
7.根据权利要求5的制备方法,其特征在于所述的葡激酶二聚体是通过1,4-二马来酰亚胺丁烷的2个马来酰亚胺基团与2个葡激酶分子C-末端的半胱氨酸形成稳定的共价键。
8.一种N-末端聚乙二醇定点修饰的重组葡激酶二聚体的制备方法,其特征在于所述的葡激酶二聚体为权利要求5所述的重组葡激酶二聚体。
9.根据权利要求8的制备方法,其特征在于所述的聚乙二醇为单甲氧基聚乙二醇丙醛,分子量为2.0kDa-40.0kDa。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN2011100923747A CN102199585B (zh) | 2011-04-13 | 2011-04-13 | 重组葡激酶二聚体的制备及聚乙二醇定点修饰 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN2011100923747A CN102199585B (zh) | 2011-04-13 | 2011-04-13 | 重组葡激酶二聚体的制备及聚乙二醇定点修饰 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN102199585A CN102199585A (zh) | 2011-09-28 |
CN102199585B true CN102199585B (zh) | 2012-08-22 |
Family
ID=44660574
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN2011100923747A Expired - Fee Related CN102199585B (zh) | 2011-04-13 | 2011-04-13 | 重组葡激酶二聚体的制备及聚乙二醇定点修饰 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN102199585B (zh) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103626831A (zh) * | 2012-08-22 | 2014-03-12 | 中国科学院过程工程研究所 | 一种聚乙二醇选择性修饰蛋白c端羧基的方法 |
CN104293762A (zh) * | 2014-09-30 | 2015-01-21 | 河北师范大学 | 聚乙二醇-葡激酶突变体偶联物的制备及纯化方法 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1264736A (zh) * | 2000-01-28 | 2000-08-30 | 上海医科大学 | 一种新型重组葡激酶及其制备方法 |
CN1763185A (zh) * | 2004-10-22 | 2006-04-26 | 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 | 一种低毒性葡激酶突变体,其制备方法及用途 |
-
2011
- 2011-04-13 CN CN2011100923747A patent/CN102199585B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1264736A (zh) * | 2000-01-28 | 2000-08-30 | 上海医科大学 | 一种新型重组葡激酶及其制备方法 |
CN1763185A (zh) * | 2004-10-22 | 2006-04-26 | 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 | 一种低毒性葡激酶突变体,其制备方法及用途 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
吴纬.葡激酶及其研究进展.《国外医学输血及血液学分册》.1999,第22卷(第2期),88-90. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN102199585A (zh) | 2011-09-28 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Rodrigues et al. | Functionalizing ferritin nanoparticles for vaccine development | |
Ling et al. | Protein thioester synthesis enabled by sortase | |
ES2916101T3 (es) | Nuevas proteínas de unión a inmunoglobulina y su uso en la purificación por afinidad | |
Doherty et al. | Site-specific PEGylation of engineered cysteine analogues of recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor | |
JP3477196B2 (ja) | 安定化されたタンパク質またはペプチド接合体 | |
Kontos et al. | Improving protein pharmacokinetics by engineering erythrocyte affinity | |
Cao et al. | Butelase-mediated ligation as an efficient bioconjugation method for the synthesis of peptide dendrimers | |
CN110582566A (zh) | 肽连接酶及其用途 | |
WO2013065009A1 (en) | A sortase-click reaction suite for synthesis of multivalent dendrimeric protein assembly | |
Xue et al. | Phenyl linker-induced dense PEG conformation improves the efficacy of C-terminally monoPEGylated staphylokinase | |
US8580274B2 (en) | Drug transporter, and adjuvant and vaccine each utilizing same | |
JP2020530458A (ja) | C末端ヘリカル領域にシステインを有するfc結合タンパク質 | |
Palla et al. | Optimization and expansion of a site-selective N-methylpyridinium-4-carboxaldehyde-mediated transamination for bacterially expressed proteins | |
CN104745553A (zh) | 重组人透明质酸酶及其制备方法和采用聚乙二醇共价修饰的化合物和方法 | |
KR20160094550A (ko) | 단일사슬항체조각과 페리틴을 포함하는 융합단백질 및 그의 용도 | |
Bak et al. | Recombinant peptide production platform coupled with site-specific albumin conjugation enables a convenient production of long-acting therapeutic peptide | |
CN102199585B (zh) | 重组葡激酶二聚体的制备及聚乙二醇定点修饰 | |
Liu et al. | Preparation, characterization and in vitro bioactivity of N-terminally PEGylated staphylokinase dimers | |
CN103626831A (zh) | 一种聚乙二醇选择性修饰蛋白c端羧基的方法 | |
CN108610415A (zh) | 一种抗体复合物的制备方法 | |
Westerlund et al. | Stability enhancement of a dimeric HER2-specific affibody molecule through sortase A-catalyzed head-to-tail cyclization | |
CN104120163B (zh) | 一种聚乙二醇修饰的蛋白质药物的修饰位点的测定方法 | |
CN102740896A (zh) | Igf-i聚乙二醇缀合物 | |
CN116041536A (zh) | 一种多接头自组装蛋白纳米颗粒的制备方法与应用 | |
EP4168439B1 (en) | Binding protein specific for the spike protein of severe acute respiratory syndrome corona virus 2 (sars-cov-2) |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20120822 Termination date: 20200413 |