CN1763185A - 一种低毒性葡激酶突变体，其制备方法及用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新型低毒性葡激酶突变体，还公开了其制备方法及用途。本发明的葡激酶突变体与野生型葡激酶相比，36位氨基酸为甘氨酸，130位氨基酸为苏氨酸，135位氨基酸为精氨酸。制备该突变体的方法包括葡激酶基因定点突变、与表达载体连接、在大肠杆菌中高效表达、分离纯化等步骤。本发明的葡激酶突变体可以作为一种溶栓药物使用。与野生型葡激酶相比，溶栓活性相当，但毒性明显降低，不具野生型葡激酶的出血毒性，且免疫原性更低。

Description

一种低毒性葡激酶突变体，其制备方法及用途

技术领域

本发明涉及一种葡激酶突变体其制备方法及用途，具体的说，本发明涉及一种低毒性葡激酶突变体，其制备方法及其在制备溶栓药物上的应用。

背景技术

研制溶栓药物使血管再通是治疗心肌梗塞和脑梗塞的有效途径。溶栓剂通过激活纤维蛋白酶原使之变为有活性的纤维蛋白溶酶活化纤溶系统，从而降解纤维蛋白(血栓)。目前，已经应用于临床的溶栓药物有组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)、尿激酶，链激酶(SK)等，但这些药物在溶栓效力、血栓选择性等方面存在一定缺陷，需要研制新一代溶栓药物。

相对早期溶栓药物，理想的溶栓药物应该具有溶栓效力强，血栓选择性高、再梗塞率低、半衰期长、价格便宜等优点。葡激酶(staphylokinase，SAK)是一种由金黄色葡萄球菌分泌的含有136个氨基酸残基的蛋白质。它作为新一代溶栓药物，具有上述优点，作为血栓特异性溶栓药物，溶栓效力与当前最理想的溶栓药t-PA及其衍生物相当。在一项多中心随机开放实验中，100个急性心肌梗死(AMI)病人用剂量相当的SAK和alteplase(t-PA的一种衍生物)比较治疗发现，给药90分钟后，用alteplase的病人组58％获得完全再通，而用SAK的病人组再通率达62％。说明SAK与alteplase治疗对早期冠状动脉再通至少同样有效。此外，葡激酶可以通过原核基因工程制备，价格却远远低于t-PA及其衍生物(王晓文，杨子义，新型葡激酶的研究进展，解放军药学学报，第19卷第3期)。目前葡激酶在我国已经在完成III期临床试验后获得新药证书上市，国外则正在进行II/III临床研究。

但遗憾的是在葡激酶的临床试验中，葡激酶暴露了两大临床缺陷，一是其免疫原性，二是较为严重的出血毒性。临床实验表明：AMI大部分病人(＞80％)注射SAK后第14～35d后出现中和性抗体，高滴度的抗体可持续2周到1年半。中和抗体的产生严重影响了它的重复应用，若以后再堵导致应用同样药物无效，不得不改用其它溶栓药物，减弱了它的应用效果，甚至会诱发急性过敏反应(王晓文，杨子义，新型葡激酶的研究进展，解放军药学学报，第19卷第3期)；更为严重的是，尽管从理论上讲葡激酶对血栓的选择性较强，但在临床试验中观察到了其较为严重的出血副作用，以皮肤粘膜为主(陆化，盛瑞兰，徐卫等，冻干重组葡激酶对正常人凝血、纤溶系统影响的研究，中国药理学通报，2000；17(1)：47～50)，国外和国内报告葡激酶导致的出血发生率(如牙龈出血)高达20％左右(杨胜荣，周丽娟，丛洪良等，国产重组葡激酶耐受性和安全性的临床试验，河北医药2001年第23卷第5期)。国外临床试验还观察到葡激酶导致严重的脏器出血和颅内出血，甚至危及生命(Armstrong PW，Burton JR，Palisaitis D，Collaborativeangiographic patency trial of recombinant staphylokinase(CAPTORS)，Am Heart J.2000；139(5)：820-3.)。

为降低葡激酶的副作用，使之更加适合临床使用，国内外学者进行了SAK结构改造研究，目前研究集中在降低免疫原性方面，主要是利用基因工程、蛋白质工程等途径设计、改造野生型葡激酶蛋白，力求得到免疫原性小、溶栓活性高的SAK。Collen发现，构建了重组SAK的两个变异体：M 38和M 89，它们分别是Lys 35、Glu 38、Lys 74、Glu 75、Arg 77用Ala替代和Lys 74、Glu 75、Arg 777、Glu 80、Asp 82用Ala替代获得的变异体。与野生型相比，在仓鼠、兔、狒狒和人体中诱导产生的中和性抗体都明显减少，但它们活性也降低了50％。为解决活性下降问题，Collen将M38、M89突变体回复，在此基础上建立了14个新的突变体，筛选后发现，Lys 74是重要的抗原表位。进一步的实验表明，两个变异体SAK(K74A)和SAK(K74A，E75A，R77A)在人体具有完整的溶栓活性，同时也有较低的免疫原性。Laroche用顺序加成突变构建了大量sak突变体。即首先将1个或2个氨基酸突变为Ala，突变的范围包括除了Gly、Ala、Pro之外的所有氨基酸，比较各突变体的特异活性和抗体吸收(对野生型SAK诱导的抗体的吸收)情况，选择出13个突变体。然后做顺序加成，再次比较各突变体纤溶特性和抗体吸收指标。实验显示，突变体诱导的中和抗体比例(47％)低于野生型(81％)；野生型SAK产生的抗体可以全部被野生型SAK吸收，但只能被变异体不完全吸收，说明突变体中缺少了野生型的某些表位；变异体诱导出的抗体可完全被野生型吸收，说明氨基酸替换没有产生新表位(Laroche Y，Heymans S，Capaert S，Recombinant staphylokinase variants with reducedantigenicity due to elimination of B-lymphocyte epitopes，Blood，2000，96：1425)。获得的SAK突变体SY161经进一步PEG修饰，已经进入临床研究，它保留了溶栓活性同时，SY161-P5抗原性有所降低(王晓文，杨子义，新型葡激酶的研究进展，解放军药学学报，第19卷第3期)。从上述结果来看，除了已经证明的Lys 74是重要免疫表位，对SAK免疫原性的贡献较大以外，并未发现其它显著影响SAK的免疫原性的位点。

另外，尽管SAK的出血副作用是其临床应用的另一障碍，但现有技术没有通过点突变降低SAK的出血副作用的报道。

发明内容

为克服野生型葡激酶的上述临床缺陷，降低其毒副作用，本发明公开了一种新型低毒性葡激酶突变体。

本发明还公开了该葡激酶突变体的制备方法。

本发明还公开了该葡激酶突变体在制备溶栓药物中的应用。

本发明的新型低毒性葡激酶突变体，与野生型葡激酶相比，36位氨基酸为甘氨酸，130位氨基酸为苏氨酸，135位氨基酸为精氨酸。与野生型葡激酶相比，溶栓活性相当，但毒性明显降低，动物实验显示，上述葡激酶突变体不具野生型葡激酶通常表现的出血毒性，且免疫原性更低。

本发明的葡激酶突变体分子具有序列表中序列1所示氨基酸序列。

本发明还公开了一种编码上述葡激酶突变体的基因，该基因具有序列表中序列2所示的核苷酸序列。

本发明所述葡激酶突变体的制备方法包括如下步骤：

(1)制备葡激酶突变体编码基因；

(2)突变基因与表达载体进行连接；

(3)在大肠杆菌中进行高效表达；

(4)葡激酶突变体的分离纯化。

制备葡激酶突变体编码基因可以按照实验室常规方法进行，优选PCR法。与野生型葡激酶基因相比，编码本发明的葡激酶突变体的基因，其编码基因的第108位的碱基A替换成碱基G，使得第36位精氨酸残基替换为甘氨酸残基；第391位碱基A替换成碱基G，使得第130位赖氨酸残基替换为苏氨酸残基；第406位碱基A替换成碱基G，使得第130位赖氨酸残基替换为精氨酸残基。

上述制备方法中所述表达载体可以是常规的原核系统表达载体，如商业PET系列载体和国内广泛使用的PBV220载体，优选PBV220载体。大肠杆菌可以是适合原核系统表达的配套大肠杆菌，当使用PET类载体，宿主菌优选E.coli BL21(DE3)系列；当使用PBV220载体时宿主菌可选择多种商业上提供的大肠杆菌，优选E.coli DH5α。

本发明构建的SAK突变体基因与pBV220相连接，在大肠杆菌DH5α中实现了高效表达。表达产物主要以可溶性状态存在。经分离纯化，获得了电泳纯的SAK突变体。纯化蛋白用BCA方法进行蛋白定量(汪家政，范明.蛋白质技术手册[M].北京：科学出版社，2000，51-54.)。以相同方法制备的野生型SAK为对照，采用溶圈法进行溶栓活性鉴定，并通过豚鼠试验观测其出血活性和免疫原性。经纤维蛋白溶圈法测定，该突变体与野生型葡激酶相比，溶栓活性相当。但毒性明显降低，野生型葡激酶腹腔注射豚鼠，几乎全部表现出皮肤出血，而该突变体无此现象。肺部病理切片显示，葡激酶突变体导致的出血也显著低于野生型葡激酶。另外与野生型葡激酶相比，突变体的免疫原性显著更低。

本发明还公开了该葡激酶突变体在制备溶栓药物中的应用，本发明的葡激酶突变体可用于急性心肌梗塞、外周动脉血栓和深部静脉血栓等血栓性疾病的抢救和治疗。

附图说明

图1为葡激酶突变体的PCR扩增图谱(箭头所示为目的片段)

图2为重组表达质粒pBV220-mSAK的酶切图谱(箭头所示为目的片段)

图3为葡激酶突变体表达蛋白的SDS-PAGE分析(箭头所示为目的产物)

图4为葡激酶突变体表达蛋白经过一步层析后的SDS-PAGE分析(箭头所示为目的产物)

图5为葡激酶突变体表达蛋白经过两步层析后的SDS-PAGE分析(箭头所示为目的产物)

图6为mSAK突变体蛋白与wt-sak的抗体反应性比较

图7为不同时间葡激酶及突变体刺激的抗体效价

图8为葡激酶及突变体诱导的皮肤出血情况比较

图9为葡激酶及突变体诱导的肺出血情况比较。

具体实施方式

实施例一  葡激酶突变基因构建、表达质粒的鉴定及表达

1.材料和方法

1.1材料

大肠杆菌DH5α，表达载体pBV220、重组葡激酶(rSAK)质粒和菌株由本室制备(发明名称利用基因工程技术生产葡激酶的方法，中国发明专利号98102132)，抗SAK多克隆抗体均由本室按照常规方法制备并保存，葡激酶标准品、溶栓活性测定试剂均购自中国生物制品检定所，Taq DNA聚合酶购自大连宝生物公司、T4 DNA连接酶、质粒提取试剂盒、限制性内切酶EcoRI、BamH I均购自Promega公司，DNA纯化试剂盒购自鼎国生物技术公司，其他试剂均为国产分析纯。蛋白定量试剂盒BCA为PIERCE公司产品。

1.2方法

1.2.1葡激酶突变体构建：

以金黄色葡萄球菌标准菌株FRI S-6(购于美国ATCC)DNA为模板，通过PCR法引入突变位点，反应条件为：96℃ 10min预变性，然后94℃ 60s，50℃ 60s，72℃ 60s，进行30个循环，最后72℃延伸10min。上游引物：P1：5，-CAC GAA TTC ATG TCA AGT TCA TTC GAC AAA-3，(含加入的酶切位点EcoR I)；下游引物：P10：5′-GGC GGA TCC TTA TTT CCTTTC TAT AAC AAC CGT TGT AAT TAA G-3，(含引入的BamH I酶切位点及突变位点K135R，K130T)。通过扩增获得突变SAK基因片段。

1.2.2表达载体的构建：

DNA片段的回收、质粒的提取与纯化、均按试剂盒说明书进行；SAK突变体基因经EcoRI、BamH I酶切回收后与相同酶切回收pBV220载体连接，构建重组表达质粒pBV220-mSAK，然后转化大肠杆菌DH5α，同时培养后提取质粒，酶切鉴定是否含有mSAK基因序列，阳性克隆送上海博亚公司测序。

1.2.3 mSAK蛋白的诱导表达与鉴定：

挑取单菌落，在5ml LB培养基(含100mg/l的氨苄西林)中37℃培养过夜，按1％比例接种到200ml含氨苄西林的LB培养基中，30℃振荡培养至OD600约为0.8时，升温至42℃诱导培养4hr；完毕后离心收集菌体并超声破碎，离心分别收集上清和沉淀进行蛋白SDS-PAGE分析。

1.2.4表达产物的纯化：采用离子交换层析与凝胶过滤两步纯化。

Q-Sepharose FF离子交换层析：Tris-HCl(pH8.0)平衡后，超声破碎收集的上清，用10mmol/L Tris-HCl缓冲液稀释至1～2mg/ml后上层析柱。上样结束后，用3倍柱床体积的上述缓冲液洗脱未结合蛋白，洗脱峰恢复至基线后，用0.5mol/L NaCl 10mmol/L Tris-HCl洗脱，收集洗脱峰各组分并测定各组分SAK活性及蛋白浓度，SDS-PAGE分析各组分中蛋白含量。

凝胶过滤：分子筛凝胶柱Sephacryl-s-200用0.02mol/L磷酸盐缓冲液平衡备用。将离子交换柱收集的活性组分合并，进一步浓缩后，上凝胶柱，流速1ml/min，检测蛋白峰，用纤维蛋白溶解法测定各组分中mSAK活性，收集活性主峰，用SDS-PAGE初步测定mSAK纯度。

2.结果

2.1葡激酶突变体基因获得：

进行PCR扩增，电泳结果显示，在相应位置出现条带(图1)。

2.2表达质粒的构建与鉴定：

PCR筛选阳性转化子，提取重组质粒，用EcoR I、BamH I酶切，可见载体片段与约400bp的插入片段，它与DNA Marker相应片段的大小基本一致(图2)。测序结果表明(见序列表2)，与野生型葡激酶基因相比，编码本发明的葡激酶突变体的基因，其编码基因的第108位的碱基A替换成碱基G，使得第36位精氨酸残基替换为甘氨酸残基；第391位碱基A替换成碱基G，使得第130位赖氨酸残基替换为苏氨酸残基；第406位碱基A替换成碱基G，使得第130位赖氨酸残基替换为精氨酸残基。除相应130、135位氨基酸已经突变，且在36位氨基酸增加了一处突变，为模板内含的突变。

2.3 mSAK工程菌的诱导表达和表达产物存在形态鉴定：

热激诱导含有重组质粒的E.coli DH5α，重组蛋白获得高效表达，其分子量与提纯的重组野生型SAK相同，约15kDa；色谱扫描仪检测显示，重组蛋白占菌体总蛋白的40-50％(图3)，离心收集菌体，PBS洗涤，超声处理后进行SDS-PAGE分析，表达蛋白主要以可溶性产物为主。

2.4 mSAK突变体蛋白的纯化：

诱导后离心收集菌体，10mmol/L Tris-HCl缓冲液重悬后超声破碎后离心收集上清，SDS-PAGE分析估计蛋白浓度，稀释至1～2mg/ml后上Q-Sepharose FF离子交换层析柱，线性梯度洗脱，SDS-PAGE分析显示，离子交换层析可以去除大部分杂蛋白(图4)，收集样品峰进一步浓缩透析后上凝胶柱Sephacryl-s-200纯化，蛋白电泳结果mSAK呈现单一条带(图5)。以上结果表明，通过以上两步的组合，可以对构建的葡激酶的突变体进行有效的纯化。用BCA试剂盒法测定纯化突变体蛋白的含量。

             实施例二  葡激酶突变体的活性分析

1.材料方法

1.1材料：野生型葡激酶的制备与纯化，与实施例一中葡激酶突变体的制备方法相同，其它材料见实施例一。

1.2方法：

1.2.1葡激酶突变体的溶栓活性测定：以野生型葡激酶为对照，采用纤维蛋白溶圈法，参照中国生物制品检定规程2001版，即在含有纤维蛋白原、人纤溶酶和凝血酶的凝胶板上打孔，将mSAK蛋白稀释后加入各孔，每孔加样10μl，置于潮湿平皿中37℃孵箱中过夜，测量溶圈直径，同时采用系列稀释的葡激酶标准品做一标准曲线，计算回归方程从而推算mSAK的溶栓活性。

                  表1 mSAK活性测定标准曲线

SAK标准品(U)0.156溶圈直径(mm)

2.526.88

1.2524.30

0.62522.36

0.31320.12

18.92

经直线回归，r＝0.997，A＝1.299，B＝0.258

1.2.2抗体反应性比较：以野生型葡激酶为对照，用不同量的突变体蛋白与相同稀释度的兔抗SAK抗血清温育，用溶圈法测定剩余抗原的溶栓活性。

1.2.3豚鼠免疫原性检测及出血倾向观察：以野生型葡激酶为对照，选用健康雄性豚鼠，体重280±20g，购自本院动物中心，每只豚鼠腹腔注射0.5ml，每周一次，第一次125μg/只，第二次与第三次各250μg/只，每次注射后一周耳静脉取血，ELISA检测血清中抗体水平，同时观察豚鼠的活动状态，局部如眼睑、鼻周围皮肤等出血情况，并做重要脏器病理切片。

2.结果：

2.1 SAK突变体蛋白溶栓活性测定：

测量突变体蛋白的溶圈直径，代入回归方程中计算各突变体蛋白的总溶栓活性，用BCA试剂盒法测定各突变体蛋白的含量，用溶栓活性除以蛋白含量计算出样品中mSAK的比活性，同时设wt-SAK作为参考，结果所获突变体蛋白的比活性与野生型葡激酶相当。

表2  mSAK与wt-SAK活性测定结果比较表

样品	蛋白浓度(mg/ml)	总活性(×105U)	比活性(×105U/mg蛋白)
				wt-SAKmSAK	2.513.78	27.4833.15	10.918.77

2.2SAK突变体蛋白与wt-sak的抗体反应性比较：以野生型SAK为对照，测定经wt-SAK抗血清温育后的wt-SAK、mSAK的残余纤溶活性。wt-SAK的活性明显受到抗wt-SAK血清的抑制，低浓度时几乎完全被抑制，而mSak突变体所受影响很小，在低浓度和高浓度时变化不大(图6)。

2.3豚鼠免疫原性检测：每次免疫后一周耳静脉取血，以wt-SAK、mSAK为抗原ELISA检测血清中的抗体水平，前两次免疫二者的抗体滴度上升的不快，相差也不明显，第三次免疫后，wt-SAK抗体滴度迅速接近10⁵，而mSAK仅达到10³左右(图7)。

2.4动物出血倾向观察

在豚鼠试验意外的观察到，野生型葡激酶几乎在所有豚鼠中均导致严重的局部皮肤出血(表3)，而类似的现象在葡激酶突变体没有观察到(图8)。同时肺部病理切片结果表明，肺部出血葡激酶野生型也较突变体严重的多(图9)。说明获得的葡激酶突变体可以有效的降低野生型葡激酶的出血倾向。

表3  动物出血数比较

葡激酶编号Wt-SAK1-5

动物数66

存活数66

眼部出血60

鼻出血50

              一种低毒性葡激酶突变体，其制备方法及用途

              序列表

<110>中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所

<120>一种低毒性葡激酶突变体，其制备方法及用途

<130>

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>136

<212>PRT

<213>

<400>1

Ser Ser Ser Phe Asp Lys Gly Lys Tyr Lys Lys Gly Asp Asp Ala Ser

1               5                   10                  15

Tyr Phe Glu Pro Thr Gly Pro Tyr Leu Met Val Asn Val Thr Gly Val

            20                  25                  30

Asp Gly Lys Gly Asn Glu Leu Leu Ser Pro Arg Tyr Val Glu Phe Pro

        35                  40                  45

Ile Lys Pro Gly Thr Thr Leu Thr Lys Glu Lys Ile Glu Tyr Tyr Val

    50                  55                  60

Glu Trp Ala Leu Asp Ala Thr Ala Tyr Lys Glu Phe Arg Val Val Glu

65                  70                  75                  80

Leu Asp Pro Ser Ala Lys Ile Glu Val Thr Tyr Tyr Asp Lys Asn Lys

                85                  90                  95

Lys Lys Glu Glu Thr Lys Ser Phe Pro Ile Thr Glu Lys Gly Phe Val

            100                 105                 110

Val Pro Asp Leu Ser Glu His Ile Lys Asn Pro Gly Phe Asn Leu Ile

        115                 120                 125

Thr Thr Val Val lle Glu Arg Lys

    130                 135

<210>2

<211>408

<212>DNA

<213>

<400>2

tcaagttcat tcgacaaagg aaaatataaa aaaggcgatg acgcgagtta ttttgaacca         60

acaggcccgt atttgatggt aaatgtgact ggagttgatg gtaaaggaaa tgaattgcta        120

tcccctcgtt atgtcgagtt tcctattaaa cctgggacta cacttacaaa agaaaaaatt        180

gaatactatg tcgaatgggc attagatgcg acagcatata aagagtttag agtagttgaa        240

ttagatccaa gcgcaaagat cgaagtcact tattatgata agaataagaa aaaagaagaa        300

acgaagtctt tccctataac agaaaaaggt tttgttgtcc cagatttatc agagcatatt        360

aaaaaccctg gattcaactt aattacaacg gttgttatag aaaggaaa                     408

Claims (7)

1.一种葡激酶突变体，其特征在于与野生型葡激酶相比，36位氨基酸为甘氨酸，130位氨基酸为苏氨酸，135位氨基酸为精氨酸。

2.根据权利要求1的葡激酶突变体，其特征在于具有序列表中序列1所示的氨基酸序列。

3.编码权利要求1的葡激酶突变体的基因，其特征在于具有序列表中序列2所示的核苷酸序列。

4.权利要求1或2所述的葡激酶突变体的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)对野生型葡激酶基因进行定点突变；

(2)突变基因与表达载体进行连接；

(3)在大肠杆菌中进行高效表达；

(4)葡激酶突变体的分离纯化。

5.根据权利要求4的制备方法，其特征在于所述表达载体是PBV220。

6.根据权利要求4的制备方法，其特征在于所述大肠杆菌是E.coli DH5α。

7.权利要求1或2所述的葡激酶突变体在制备溶栓药物中的应用。

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