CN102690807A

CN102690807A - 一种快速双向多位点基因突变的方法

Info

Publication number: CN102690807A
Application number: CN2012101400017A
Authority: CN
Inventors: 王书崎; 隗慧林; 徐峰
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2012-05-08
Filing date: 2012-05-08
Publication date: 2012-09-26

Abstract

本专利涉及一种快速双向多位点基因突变的方法。本方法以改进的重叠延伸PCR方法为基础，利用带有突变位点的序列特异性引物，通过两轮PCR扩增和DNA片段连接实现DNA双向多位点基因突变。本方法可广泛用于目的基因定点突变，基因合成，蛋白结构-功能研究、蛋白质表达优化和目的基因包装。本方法按照需要实现突变的DNA片段序列特点，设计出三个DNA片段和三对相应特异性扩增引物。通过两步PCR扩增和特定的扩增程序设定，得到引入所需突变位点的目的基因片段。

Description

一种快速双向多位点基因突变的方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种快速高效的基因突变方法。本方法以改进的重叠延伸PCR方法为基础，利用带有突变位点的特异性引物，通过两轮PCR 扩增和DNA片段连接实现DNA双向多位点基因突变。

背景技术

随着分子生物学研究的不断发展，基因定点突变技术成为一种常用的改造和优化基因的方法，在基因合成，基因表达及蛋白质结构与功能之间的关系等方面的研究中得到广泛的应用。PCR介导的点突变是使用最为普遍的基因定点突变技术。PCR诱导定点突变包括重叠延伸突变及一步快速突变等，具有准确、高效的特点，其中重叠延伸突变PCR可以在DNA区段的任何位置实现定点突变，但耗时长且突变位点有限。本发明对传统重叠延伸PCR法进行定点突变的实验方法进行了改进，可以在同管内实现双向多位点快速基因突变。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基因多位点突变方法，采用此方法可以快速、准确地实现双向多位点基因突变和新目的基因片段合成。

所述快速双向多位点基因突变方法包括以下步骤：

1）根据目的基因待突变位点及其上下游序列特点，确定上中下三个DNA片段，根据上述三个DNA片段的序列特点和待突变位点，设计三对特异性引物，分别表示为F1F和F1RT，F2FT和F2RT，以及F3FT和F3R，其中Fi（i=1，2和3）表示3个DNA片段，F表示上游引物，R表示下游引物，T表示延伸序列；

2）进行第一轮PCR，以目的基因为模板，利用步骤1）中的三对特异性引物分别扩增得F1，F2 和F3 三个DNA片段；

3）进行第二轮PCR，分离纯化步骤2）所得的扩增产物F1，F2 和F3，并将其作为扩增模板，采用重叠延伸PCR 方法，利用三个片段间重叠部分的片段作为铰链，将含有突变序列的三个片段相连接，以F1F和F3R为引物进行扩增，即可扩增得到双向多位点突变的基因产物；

4）在步骤1）中，F1片段的下游引物F1RT和F2片段的上游引物F2FT含有相同待突变片段和部分重叠序列，F2片段的下游引物F2RT和F3片段的上游引物F3FT亦含有相同待突变片段和部分重叠序列；

5）在步骤2）中，第一轮PCR扩增产物F1片段的3’端和F2片段的5’端部分序列相同并含有相同的突变序列，F2片段的3’端序列和F3片段的5’端部分序列相同并含有相同的另一段突变序列。

附图说明

图1 基因双向多位点突变原理示意图。以目的基因为模板，利用三对引物进行第一轮PCR扩增，得F1、F2和F3三个片段；再以上述三个DNA片段为模版，以F1F和F3R为引物进行第二轮PCR扩增，即获得双向多位点突变基因。

图2 PCR产物电泳图。图A、B分别为第一、二轮PCR扩增产物的电泳图。

具体实施方式

实施例 1 ：长度为 324 bp, 含有两个突变 DNA 片段的获得

一、引物的设计

根据所选DNA 片段（见序列表SEQ ID No. 1）的拟突变位点及其序列特征，设计三对特异性引物，分别用于扩增选定的DNA片段和其相邻上下游片段（F1：上游片段，F2：靶序列，F3：下游片段）。所设计的引物序列如表1所示，其中划线部分为延伸序列，即重叠部分。

表1 引物序列

名称	引物序列（ 5’-3’ ）	长度（ nt ）
			F1F	AGATCTGAGCCTGGGAG	17
F1RT	GGTTCCGTTATTCCCAAGTTTTAAGCAGTGGGTTCCCTAG	40
			F2FT	AACTTGGGAATAACGGAACCGAGTGCTTCACTTGATACAG	40
F2RT	GCCAATCTCTCAATCGCGGCATTTTCCACACTGACTAAAAG	41
			F3FT	GCCGCGATTGAGAGATTGGCCAGGGACCTGAAAGCGAAAG	40
F3R	CACCCATCTCTCTCCTTCTA	20

二、第一轮PCR

1）以含有未突变靶序列的质粒为模板，反应体系为100µL，由10ng重组质粒模板、2.5mM氯化镁、100µM dNTP、0.2µM 上下游引物和0.4U AmpliTaq Gold™ DNA 聚合酶构成。反应程序为：94°C 5分钟；95°C 30秒，52°C 30 秒，72°C 30 秒，共35个循环；72°C 5分钟后4°C 保存；

2）取步骤1）所得溶液，以1.5% 琼脂糖凝胶电泳，然后用QIA quick Gel Extraction Kit分离纯化PCR扩增产物F1（79bp，图2A 泳道1，2），F2（125bp，图2A 泳道3，4）和F3（191bp，图2A 泳道5，6）片段。其中F1片段3’端和F2片段5’端含有一段相同的突变序列，F1片段3’端和F3片段5’端含有一段相同的突变序列。

三、第二轮PCR

1）以扩增产物F1，F2 和F3 为模板，反应体系由DNA 片段模板、2.5mM氯化镁、100µM dNTP、0.2µM 上下游引物和0.4U AmpliTaq Gold™ DNA 聚合酶构成。反应程序如下：首先，将F1和F2 加入无引物的PCR 反应混合物中，按照95°C 30秒，52°C秒和72°C 30秒的程序反应5个循环；其次，将F3片段加入反应管中，按照95°C 30秒52°C秒和72°C 30秒的程序反应5个循环；然后，将引物F1F和F3R 加入反应管中，按照95°C 30秒，52°C 30秒和72°C 30秒的程序反应35个循环。35个循环后，产物在72°C孵育5分钟后于4°C保存；

2）取步骤1）所得溶液，用1.5%琼脂糖凝胶电泳，然后用QIAquick Gel Extraction Kit分离纯化PCR 扩增产物。该片段长度为324bp（图2 B，泳道2，3) ，片段两端各含有一段突变序列（见序列表SEQ. ID. No.8）。

实施例 2 ：长度为 324 bp, 含有两个突变 DNA 片段的获得

本实施例除模板和引物外，两轮PCR扩增条件同实施例1。最终产物长度也为324bp，两端各含有一段点突变序列。其引物如表2所示，划线部分表示重叠部分。突变产物见序列表SEQ. ID. No.13。

表2 引物序列

名称	引物序列（ 5’-3’ ）	长度（ nt ）
			F1F	AGATCTGAGCCTGGGAG	17
F1RT 4m	GGTACCGTTATTCCCAAGTTTTAAGCAGTGGGTTCCCTAG	40
			F2FT 4m	AACTTGGGAATAACGGTACCGAGTGCTTCACTTGATACAG	40
F2RT 4m	GCCAATCTCTCAATCCCGGCATTTTCCACACTGACTAAAAGG	42
			F3FT 4m	GCCGGGATTGAGAGATTGGCCAGGGACCTGAAAGCGAAAG	40
F3R	CACCCATCTCTCTCCTTCTA	20

<110> 王书崎

<120> 一种快速双向多位点基因突变的方法

<130> 20120503104206

<160> 13

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> 拟突变DNA，实施例中第一轮PCR模板

<400> 1

agatctgagc ctgggagctc tctggctaac tagggaaccc actgcttaag cctcaataaa 60

gcttgccttg agtgcttcac ttgatacagc aacactgtga atacgactct ggtaactaga 120

gatccctcag acccttttag tcagtgtgga aaatctctag cagtggcgcc cgaacaggga 180

cctgaaagcg aaagggaaac cagaggagct ctctcgacgc aggactcggc ttgctgaagc 240

gcgcacggca agaggcgagg ggcggcgact ggtgagtacg ccaaaaattt tgactagcgg 300

aggctagaag gagagagatg ggtg 324

<210> 2

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> 实施例中F1片段上游引物F1F

<400> 2

agatctgagc ctgggag 17

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> 实施例1中F1片段下游引物F1RT

<400> 3

ggttccgtta ttcccaagtt ttaagcagtg ggttccctag 40

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> 实施例1中F2片段上游引物F2FT

<400> 4

aacttgggaa taacggaacc gagtgcttca cttgatacag 40

<210> 5

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> 实施例1中F2片段下游引物F2RT

<400> 5

gccaatctct caatcgcggc attttccaca ctgactaaaa g 41

<210> 6

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> 实施例1中F3片段上游引物F3FT

<400> 6

gccgcgattg agagattggc cagggacctg aaagcgaaag 40

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> 实施例中F3片段下游引物F3R

<400> 7

cacccatctc tctccttcta 20

<210> 8

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> 实施例1中突变DNA产物

<400> 8

agatctgagc ctgggagctc tctggctaac tagggaaccc actgcttaaa acttgggaat 60

aacggaaccg agtgcttcac ttgatacagc aacactgtga atacgactct ggtaactaga 120

gatccctcag acccttttag tcagtgtgga aaatgccgcg attgagagat tggccaggga 180

cctgaaagcg aaagggaaac cagaggagct ctctcgacgc aggactcggc ttgctgaagc 240

gcgcacggca agaggcgagg ggcggcgact ggtgagtacg ccaaaaattt tgactagcgg 300

aggctagaag gagagagatg ggtg 324

<210> 9

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> 实施例2中F1片段下游引物F1RT 4m

<400> 9

ggtaccgtta ttcccaagtt ttaagcagtg ggttccctag 40

<210> 10

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> 实施例2中F2片段上游引物F2FT 4m

<400> 10

aacttgggaa taacggtacc gagtgcttca cttgatacag 40

<210> 11

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> 实施例2中F2片段下游引物F2RT 4m

<400> 11

gccaatctct caatcccggc attttccaca ctgactaaaa gg 42

<210> 12

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> 实施例2中F3片段上游引物F3FT 4m

<400> 12

gccgggattg agagattggc cagggacctg aaagcgaaag 40

<210> 13

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> 实施例2中突变DNA产物

<400> 13

agatctgagc ctgggagctc tctggctaac tagggaaccc actgcttaaa acttgggaat 60

aacggtaccg agtgcttcac ttgatacagc aacactgtga atacgactct ggtaactaga 120

gatccctcag acccttttag tcagtgtgga aaatgccggg attgagagat tggccaggga 180

cctgaaagcg aaagggaaac cagaggagct ctctcgacgc aggactcggc ttgctgaagc 240

gcgcacggca agaggcgagg ggcggcgact ggtgagtacg ccaaaaattt tgactagcgg 300

aggctagaag gagagagatg ggtg 324

Claims

1.一种快速双向多位点基因突变的方法，其特征在于以下步骤：

1）在需突变基因的序列范围及其上下游选定三个DNA 片段，设计三对引物，引物分别表示为F1F和F1R，F2F和F2R，以及F3F和F3R（Fi（i=1，2和3）表示3个DNA片段，F表示上游引物，R表示下游引物），其中F1R，F2F，F2R和F3F含有突变序列；

2）进行第一轮PCR，以待突变基因为模板，利用上述三对引物扩增，得到含有突变序列的DNA片段产物F1，F2 和F3，其序列特点为F1片段的3’端和F2片段的5’端部分序列相同并含有相同的突变序列，F2片段的3’端序列和F3片段的5’端部分序列相同并含有相同的另一段突变序列；

3）以F1，F2 和F3三个片段作为扩增模板，采用重叠延伸PCR方法，利用三个片段间重叠部分的片段作为铰链，将含有突变序列的三个片段相连接并以F1T和F3R为引物进行第二轮PCR，扩增即可得到目的基因产物。

2.按照权利要求1 所述的基因双向多位点突变的方法，其特征在于运用两轮PCR，且第二轮PCR利用了重叠延伸的方法。

3.根据权利要求1和2所述的基因双向多位点突变方法，其特征为确定含有待突变序列的DNA 片段F2和其上游片段F1和下游片段F3。

4.根据权利要求1，2 和3所述的基因双向多位点突变方法，其特征是所用的部分特异性引物含有待突变序列和重叠序列。

5.根据权利要求1，2，3和4所述的基因双向多位点突变方法，其特征是所用的源模板是通过基因修饰方法获得的含有突变基因的DNA序列。

6.根据权利要求5所述和基因双向多位点突变方法，其特征是采用改进的重叠延伸PCR 方法连接多个含有突变基因序列的片段。

7.根据权利要求5和6所述和基因双向多位点突变方法，其特征是采用改进的重叠延伸PCR 方法快速合成含有突变基因序列的片段。