CN102433391A - 一种甲型流感病毒甄别与耐药检测基因芯片的制备和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种流感病毒甄别与耐药检测基因芯片，其制备方法包括制备通用引物，制备亚型核酸分型探针及耐药探针，制备寡核苷酸芯片，建立RT-PCR体系，建立杂交体系。利用本发明制备的基因芯片可同时甄别5种亚型的甲型流感病毒，包括甲型H1N1、季节性H1N1、季节性H3N2、禽H5N1、猪H1N1流感病毒，并可提示甲型流感病毒达菲耐药情况。该基因芯片具有快速、准确、高通量、特异性高的优势，可为流感病毒的监测、临床诊断及治疗提供指导。

Description

一种甲型流感病毒甄别与耐药检测基因芯片的制备和用途

技术领域

本发明涉及甲型流感病毒甄别与耐药检测基因芯片的制备和用途，属于基因芯片检测技术领域。

背景技术

流感病毒(influenza virus)在病毒分类学上属正粘病毒科(Orthomyxoviridae)。它的基因组是分节段的单股负链RNA。根据病毒核蛋白(NP)和膜蛋白(MP)抗原特性及其基因特性不同，把流感病毒分为甲、乙、丙三型。甲型流感病毒根据其表面血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)蛋白结构及其基因特性又可分成许多亚型，至今甲型流感病毒已发现的血凝素有16个亚型(H1-16)，神经氨酸酶有9个亚型(N1-9)。由于基因组是分节段的，故易产生同型不同株间基因重配。尤其是人甲型流感病毒HA基因能经常不断的发生点突变，导致其编码的HA蛋白分子上氨基酸序列发生替换，造成其抗原性经常不断的发生漂移，每次抗原性漂移常带来不同程度的流感流行。

正确判断流感病毒型别，是流行病学调查和疫情防控的重要环节。近100年来，已经出现了数次不同亚型的流感病毒全球大流行。1918年西班牙流感(H1N1型)，造成5000-6000万人死亡；1957年亚洲流感(H2N2)，死亡至少200万人；1968年香港流感(H3N2型)，死亡人数超过100万；1997年香港禽流感(H5N1型)，死亡人数虽少于前几次流感，但死亡率高达33％。甲型H1N1流感自2009年3月在墨西哥暴发以来，迅速在全球流行，成为国际性的公共卫生事件。世界卫生组织(WHO)于2009年6月11日将甲型H1N1流感病毒大流行的预警级别提升至最高的6级，全球共有超过214个国家和地区向WHO报告了经实验室确诊的甲型H1N1流感病例，至少18001人死亡。随着全球人口流动性的不断增加，流感病毒交替、混合流行将成为常态。

流感病毒耐药性监测，是指导疫情防控和临床用药的必然要求。目前有两类正式上市的药物可用于治疗流感，一类是神经氨酸酶抑制剂，包括磷酸奥司他韦(oseltamivir//

达菲)和扎那米韦(zanamivir/

/乐感清)；另一类是M2通道阻滞剂，包括金刚烷胺(amantadine)和金刚乙胺(rimantadine)。病毒耐药性的产生是抗病毒治疗失败的主要原因之一。由于流感病毒为节段型RNA病毒，突变发生率很高；随着抗病毒治疗的展开，药物选择压力等因素导致病毒耐药性不可避免地出现。据调查显示，目前北美地区98％的季节性流感病毒H3N2对金刚烷胺耐药，98％的季节性流感病毒H1N1对达菲耐药；禽流感病毒H5N1对达菲耐药的病例也屡有报道。自2009年6月丹麦报告了全球第一例甲型H1N1流感达菲耐药病例后，截至2010年2月3日，全球已有20个国家报告了达菲耐药的甲型H1N1流感病例至少225例。随着达菲的广泛使用，更多耐药株的出现将不可避免。耐药型病毒的产生和传播可导致抗病毒治疗失败和民众恐慌。尽管甲型H1N1流感病毒耐药病例为数不多并呈散发状，但仍引起了公众和研究者的关注。因此，对甲型H1N1流感病毒耐药性的监测和研究具有重要的意义。

甲型流感病毒具有多种高致病性亚型，而且各种亚型之间只是在蛋白或核酸水平具有细微差异，而临床上存在甄别流感病毒各种亚型的需求。这种情况对准确甄别几种重要的亚型提出了很高的技术和方法上的要求。针对不同的检测对象，通常分为病毒核酸检测和蛋白检测，病毒核酸检测因其灵敏度较高而被广泛应用。

基因芯片技术作为核酸检测方法中的重要一员，近年来被用于流感病毒的分型。国内外文献及专利文件中提及的基因芯片技术用于流感病毒的分型检测，多为针对某一种流感病毒的分型研究，而同时甄别不同亚型流感病毒的方法报道很少，且操作步骤较为繁琐，尚未标准化，成本偏高。公开号为CN1858249A，公开日为2006年11月8日的中国专利申请公开了一种基于液相芯片检测禽流感病毒H5N1亚型的方法，但该方法只能对H5N1亚型进行检测，并不能同时对H1N1、H3N2等甲型流感病毒进行甄别，而且该方法需要将第一轮RT-PCR反应产物作为第二轮PCR的模板，两轮PCR反应极容易产生污染且检测需时较长。Li X报道了一种可以同时检测H1N1、H1N2，、H3N2、H5N1和H9N2的芯片，该芯片灵敏度为10⁵copies/体系。公开号为CN101392298A，公开日为2009年3月25日的中国专利申请公开了一种借助液相芯片检测流感和H5N1亚型禽流感病毒的方法，可以检测包括H5N1亚型高致病性禽流感病毒在内的多种甲、乙型流感病毒。该方法需通过四重RT-PCR反应扩增病毒RNA，灵敏度为1pg RNA。Michal报道了一种Fluchip可以同时甄别H1N1、H3N2和H5N1流感病毒，但整个过程需要12小时，每个样本的检测费用约为20美元，耗时长且费用较高。自2009年3月甲型H1N1流感暴发以来，可以同时甄别甲型H1N1流感病毒与常见的季节性H1N1、H3N2及禽H5N1、猪H1N1流感的基因芯片鲜见报道。Lu简单报道了一种芯片可以甄别甲型H1N1和季节性流感病毒，通过两步法扩增病毒RNA产物与芯片杂交，耗时较长，且并无该方法特异性及灵敏度的实验数据。

发明内容

本发明的目的在于针对流感病毒分型及耐药检测领域存在的一些不足，研制一种高通量、特异、敏感、快速的甲型流感病毒甄别及耐药检测基因芯片，能同时对常见的甲型流感病毒进行核酸分型，并检测其达菲耐药位点的突变情况。

为了达到上述目的，本发明开发了检测甲型流感病毒核酸亚型和耐药性的基因芯片，其制备方法如下：

1.步骤一：制备通用引物

选择流感病毒NA基因作为检测靶基因，可以通过一次反应实现甲型H1N1、季节性H1N1、季节性H3N2、禽H5N1和猪H1N1流感病毒的通用扩增，优选3对引物序列及其对应的扩增靶病毒种类，如表1所示：

表1引物序列及对应的扩增靶病毒

2.步骤二：制备亚型核酸分型探针及耐药探针

根据5个亚型流感病毒NA基因序列间的比对及每型流感病毒内的序列比对，在上下游引物范围内的序列相对特异区进行分型探针的设计。每两条流感病毒核酸分型寡核苷酸探针对应一种亚型的流感病毒，流感亚型核酸分型探针序列及对应的靶病毒，如表2所示：

表2流感亚型核酸分型探针序列及对应的靶病毒

N1型流感病毒NA基因上H274Y密码子由CAT或CAC突变为TAT，N2的NA基因E119V密码子由GAA突变为GTA。以耐药性突变碱基为中心，设计耐药检测探针，野生、突变探针各一条为一组。通过实验筛选出可以对不同亚型的流感病毒野生型及耐药型可以准确区分的探针。甲型H1N1、禽流感H5N1及猪流感H1N1共用一对耐药突变检测探针，季节性H3N2和季节性H1N1分别使用一对耐药突变检测探针。所述耐药检测探针序列及对应的靶病毒，如表3所示：

表3耐药检测探针序列及对应的靶病毒

3.步骤三：制备寡核苷酸芯片

一个优选的实施方案，步骤二中的各个寡核苷酸探针在点样时，用2×点样液(6×SSC，0.1％SDS)稀释至终浓度50μM。用市售的基因芯片点样仪将探针点到空白的醛基化修饰玻片上，探针的点样量均为3nl。寡核苷酸芯片制备完毕后，使用前至少在室温放置干燥18小时。该芯片特征在于寡核苷酸探针阵列中同时包括流感亚型核酸分型探针和耐药检测探针，其探针阵列，如表4所示。其中片基质控探针为20T序列，5’端cy3标记、3’端NH2修饰，用来监测醛基片片基质量；阴性探针为与病毒无关的植物基因序列，用来指示特异性；通用序列为甲型流感病毒保守序列；引物1、2、3分别为引物NR21、NR22和NF5的反向互补序列，每条序列3’端NH₂修饰。

表4寡核苷酸探针阵列

片基质控

引物1

引物2

引物3

通用序列

阴性探针

阴性探针

片基质控

NEW-1

NEW-2

H1N1-1

H1N1-2

H3N2-1

H3N2-2

AIV-1

AIV-2

NEW-1

NEW-2

H1N1-1

H1N1-2

H3N2-1

H3N2-2

AIV-1

AIV-2

NEW-1

NEW-2

H1N1-1

H1N1-2

H3N2-1

H3N2-2

AIV-1

AIV-2

OSE-1

OSE-2

OSE-3

OSE-4

OSE-5

OSE-6

SIV-1

SIV-2

OSE-1

OSE-2

OSE-3

OSE-4

OSE-5

OSE-6

SIV-1

SIV-2

OSE-1

OSE-2

OSE-3

OSE-4

OSE-5

OSE-6

SIV-1

SIV-2

片基质控

阴性探针

阴性探针

通用序列

引物3

引物2

引物1

片基质控

4.步骤四：建立RT-PCR体系

本发明基因芯片中RT-PCR体系的特征为三重不对称RT-PCR反应体系。合适的RT-PCR体系可以进一步提高芯片检测的灵敏度。对标记引物和非标记引物的绝对浓度和相对比例、Taq酶的用量等因素进行了优化，优选的RT-PCR体系，如表5所示：

表5RT-PCR体系配方

优选的RT-PCR扩增条件为：50℃逆转录30min，94℃变性2min；扩增45个循环，94℃变性20s，55℃退火20s，72℃延伸20s；72℃延伸2min。

5.步骤五：建立杂交体系

合适的杂交体系对芯片的特异性及灵敏度改善也有很大作用。通过优化得到了同时可以保证特异性及灵敏度的杂交液成分、杂交条件和杂交后洗涤条件。在杂交体系中RT-PCR产物与杂交液等体积混合，优选的杂交液各成分终浓度为4×SSC，0.3％SDS，5％甲酰胺，16μM20T-NH₂。优选的杂交条件为45℃水浴杂交1小时。优选的洗涤条件为常温下洗液A(1×SSC，0.2％SDS)，洗液B(0.2×SSC)和洗液C(0.1×SSC)中各洗涤20s。

以上制备的甲型流感病毒甄别及耐药检测基因芯片包括寡核苷酸芯片、RT-PCR体系、杂交液、洗液A、洗液B和洗液C。

一个优选的实施方案使用市售的RNA提取试剂盒提取病毒RNA，如Qiagen公司的QIAampviral RNA mini kit，提取参照相应的RNA提取试剂盒说明书进行。提取病毒RNA使用RT-PCR体系按照步骤四中的扩增条件进行进行扩增。RT-PCR产物与杂交液等体积混合，加入寡核苷酸芯片中，按照步骤五的杂交条件进行杂交，再按照步骤五的洗涤条件进行洗涤。

洗涤后的芯片使用市售的芯片扫描仪(如GenePix 4000B)进行扫描，并运用分析软件判读结果。选择各型流感病毒及副流感病毒、常见的呼吸道病毒作为样本，利用上述制备的基因芯片进行检测，考察芯片的特异性。选择5个亚型流感病毒野生型及突变型共10种灵敏度参考品，考察芯片的最低检测限。同时使用甲型H1N1流感病毒梯度稀释后提取RNA进行芯片检测，来评价芯片的灵敏度。结果：芯片对每个亚型流感病毒均能够检测到10³copie/体系的体外转录RNA，对于甲型H1N1流感病毒样本，芯片的灵敏度达到10³PFU/ml。

使用本发明制备的基因芯片，共检测了302医院等单位收治的甲型H1N1流感疑似病人咽拭子RNA 130例，芯片检测甲型H1N1流感病毒阳性41例，这41例使用实时荧光定量PCR试剂和测序方法进行复核，均为甲型H1N1流感病毒阳性。

本发明建立了一种基于荧光法的基因芯片，可以对常见的5个亚型的甲型流感病毒进行分型，包括甲型H1N1、季节性H1N1、季节性H3N2、禽H5N1和猪H1N1流感病毒，同时可以对上述流感病毒进行耐药性突变位点的检测，包括4种N1型流感病毒耐药性突变位点H274Y，H3N2型流感病毒耐药性突变位点E119V。性能考察表明，本发明的基因芯片可以将甲型流感病毒与乙型、副流感病毒及常见的其他呼吸道病毒进行准确区分，并可以对5种不同亚型的甲型流感病毒进行准确分型，特异性良好。本发明对5个亚型的流感病毒均能够检测到10³copies/体系的体外转录RNA。通过流感疑似病人咽拭子的检测，本发明的方法与实时荧光定量RT-PCR法及测序方法具有较高的一致率。

本发明的基因芯片和相应的制备方法属于流感病毒核酸检测领域。与常规培养方法比较，具有快速、准确的优势，与免疫学方法和其他核酸检测方法相比，具有高通量、特异性高的优势。本发明的另一个突出优势是在对流感病毒高通量分型的同时，可以检测病毒的达菲耐药性。本发明的基因芯片具有很较强的实用性，可为流感病毒的监测、临床诊断及治疗提供指导。

附图说明

图1 5个亚型流感病毒的通用扩增产物琼脂糖电泳图。图中M为分子量标准(从上到下条带大小依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp)；1为甲型H1N1流感病毒；2为季节性H1N1流感病毒；3为阴性对照；4为H5N1禽流感病毒；5为H1N1猪流感病毒；6为季节性H3N2流感病毒。

图2甲型流感病毒核酸甄别及耐药检测基因芯片最终的探针阵列图。图中一个原点代表探针的一次点样，垂直方向的3个圆点为一条探针的3次重复点样。A-F区域对应的是每种亚型流感病毒的亚型特异性探针，其中A区域的两条探针对应甲型H1N1流感病毒，B区域的两条探针对应季节性H1N1流感病毒，C区域的两条探针对应季节性H3N2流感病毒，E区域的两条探针对应H5N1禽流感病毒，F区域的两条探针对应H1N1猪流感病毒。F-H三个区域对应的是耐药检测探针，W代表野生型，M代表耐药突变型。其中F区域对应甲型H1N1流感病毒、H5N1禽流感病毒和H1N1猪流感病毒耐药检测探针，G区域对应季节性H1N1流感病毒耐药检测探针，H区域对应季节性H3N2流感病毒耐药检测探针。其他圆点代表阴性探针、阳性探针、引物互补序列探针、片基质控探针。

图3甲型流感病毒核酸甄别及耐药检测基因芯片特异性评价结果图。图中1-4为甲型H1N1流感病毒；5为H5N1禽流感病毒；6-8为季节性H1N1流感病毒；9-12为季节性H3N2流感病毒；13为流行性腮腺炎病毒；14为腺病毒；15为麻疹病毒；16为风疹病毒；17为副流感病毒；18-24为乙型流感病毒。

图4芯片检测季节性H1N1流感病毒达菲耐药突变及测序比对图。其中A为本发明芯片检测结果，红色框内表示季节性H1N1耐药突变探针阳性，说明该株流感病毒为达菲耐药型。B为测序峰图，其中方框内的碱基为T，说明该序列由野生型的CAT突变为TAT。C为测序结果比对图，方框内的碱基T为测序结果，与其上方的序列前4条为突变型(T)，后11条为野生型(C)。

图5 5个亚型流感病毒耐药性突变位点测序及比对图。图中A为甲型H1N1流感病毒耐药突变位点：CAC突变为TAC；B为H5N1禽流感病毒耐药突变位点：CAC突变为TAC；C为H1N1猪流感病毒耐药突变位点：CAC突变为TAC；D为季节性H3N2流感病毒耐药突变位点：GAA突变为GTA；E为季节性H1N1流感病毒耐药突变位点：CAT突变为TAT。

图610种灵敏度参考品芯片检测结果图。其中图中-1和-2分别表示10⁴copie/体系和10³copie/体系。1：甲型H1N1流感病毒野生型；2：甲型H1N1流感病毒突变型；3：季节性H1N1流感病毒野生型；4：季节性H1N1流感病毒突变型；5：季节性H3N2流感病毒野生型；6：季节性H3N2流感病毒突变型；7：H5N1禽流感病毒野生型；8：H5N1禽流感病毒突变型9：H1N1猪流感病毒野生型；10：H1N1猪流感病毒突变型。

图7甲型H1N1流感病毒梯度稀释后RT-PCR产物琼脂糖电泳图。图中M：DL2000分子量标准(从上到下条带大小依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp)；1：病毒培养液10倍稀释；2：病毒培养液100倍稀释；3：病毒培养液1000稀释；4：病毒培养液10000倍稀释；5：病毒培养液100000倍稀释。

图8甲型H1N1流感病毒梯度稀释后芯片检测结果图。图中1：病毒培养液10倍稀释；2：病毒培养液100倍稀释；3：病毒培养液1000稀释；4：病毒培养液10000倍稀释；5：病毒培养液100000倍稀释；6：阴性对照。

图9咽拭子中部分芯片检测为甲型H1N1流感病毒的结果图。其中数字代表样品编号，NTC代表阴性对照。

具体实施方式

下列实施例旨在举例说明而不是限制本发明。

实施例1：甲型流感病毒核酸甄别及耐药检测基因芯片的研制

一、通用引物设计和筛选

为了实现对4个亚型N1型流感病毒和1个H3N2型流感病毒的同时通用扩增，使用2对引物扩增4个N1亚型病毒，1对引物扩增H3N2，引物序列及对应的靶病毒信息见表1。NF11/NF12和NR21/NF22组合扩增4个N1亚型，扩增片段为452bp，包含耐药性突变位点H274Y；NF5和NR5扩增H3N2，扩增片段为281bp，包含耐药性突变位点E119V。扩增产物的琼脂糖电泳结果见附图1。

二、特异性探针的筛选

分型探针的筛选首先排除探针与呼吸道其他病毒之间的非特异性交叉，然后使用5个亚型的流感病毒RNA为模板的RT-PCR产物与备选探针分别杂交，考察探针在流感病毒不同亚型间的分型能力。最终筛选到10条亚型特异性探针，每种亚型对应2条亚型特异性探针。探针序列及对应的靶病毒见表2。

在耐药性突变位点检测探针筛选中，最终确定21nt和20nt的探针区分能力在2.5倍以上。甲型H1N1、禽流感H5N1及猪流感H1N1共用一对耐药突变检测探针(野生型和突变型)，季节性H3N2和季节性H1N1分别使用一对耐药突变检测探针。探针序列及对应的靶病毒见表3。

三、寡核苷酸芯片制备及探针阵列

完成探针筛选后，确定了最终的探针阵列，见表4和附图2。其中阵列的四个角为片基质控，引物1、2、3分别为NR21、NR22和NR5的反向互补序列。阴性探针为来自水稻基因的一段序列：5’-TGC ATG AGG ATT TAT CCG TAT GGA TGC CTG CTA CTT GTC G-3’(SEQ ID NO：23)。通用序列为甲型流感病毒保守序列：CATGGCTCGAATCGACCGTGGGTG(SEQ ID NO：24)

四、RT-PCR体系

本发明中RT-PCR体系的特征为三重不对称RT-PCR体系。合适的RT-PCR体系可以进一步提高芯片检测的灵敏度。对标记引物和非标记引物的绝对浓度和相对比例、Taq酶的用量等因素进行了优化。当上下游引物终浓度为0.1μM：0.5μM，Taq酶用量为3U/体系时，参考品的探针荧光值较强，且低拷贝模板10³copie/μl仍然可以检出。最终确定的RT-PCR体系见表5，RT-PCR扩增条件为：50℃逆转录30min，94℃变性2min；扩增45个循环，94℃变性20s，55℃退火20s，72℃延伸20s；72℃延伸2min。

五、建立并优化杂交体系

通过优化得到同时可以保证特异性及灵敏度的杂交液成分、杂交条件和杂交后洗涤条件。在杂交体系中RT-PCR产物与杂交液等体积混合，杂交液各成分终浓度为4×SSC，0.3％SDS，5％甲酰胺，16μM 20T-NH₂。杂交条件为45℃水浴杂交1小时。洗涤条件为常温下洗液A(1×SSC，0.2％SDS)，洗液B(0.2×SSC)和洗液C(0.1×SSC)中各洗涤20s。

实施例2：基因芯片阳性判定标准的确定

Cutoff值是判断基因芯片信号值是否为阳性的标准。每条分型探针分别选取非流感病毒(即阴性毒株)、空白对照进行基因芯片杂交，通过反复的实验和数据统计，将阴性毒株和空白对照的背景统计平均值+2SD作为每条探针的Cutoff值，见表6。将各突变检测探针的区分能力在2.5倍以上作为耐药性位点是否出现突变的判断标准。

表6各探针Cutoff值的确定

实施例3：甲型流感病毒核酸甄别及耐药检测基因芯片特异性评价

特异性是诊断方法最重要的考核指标，本发明的基因芯片使用优化好的体系和条件，检测了各型流感病毒及副流感病毒、常见呼吸道病毒等24株，检测结果见附图3。由图可以看出，利用本发明不仅可以将甲型流感病毒与常见的呼吸道其它病毒及乙型流感病毒正确区分，还可以将甲型流感病毒中的甲型H1N1、季节性H1N1，季节性H3N2和禽流感H5N1正确区分，特异性良好。另外，实验筛选到一株季节性H1N1流感病毒达菲耐药性突变位点发生突变，经过测序验证，结果与芯片结果一致，说明芯片耐药性突变位点检测探针分型能力良好，该毒株的芯片检测结果和测序验证结果见附图4。

实施例4：甲型流感病毒核酸甄别及耐药检测基因芯片灵敏度评价

通过PCR重叠延伸法构建了5个亚型的N1型流感病毒的突变型质粒，突变型质粒经过测序验证为正确序列后作为模板制备体外转录RNA，以构建流感病毒灵敏度参考品。突变型质粒的序列比对及测序结果见附图5，由比对图和测序峰图可以看出，5个亚型的流感病毒耐药性位点突变构建成功。

利用构建好的流感病毒灵敏度参考品分别评价芯片对5个亚型流感病毒的检测灵敏度。由于实验涉及的参考品包括野生型和突变型共10种，每种参考品均选择10⁴copies/μl、10³copies/μl的体外转录RNA进行芯片检测，结果见附图6。由图可以看出，芯片对每个亚型流感病毒均能够检测到10³copies/体系的体外转录RNA，芯片的检测限为10³copise/体系体外转录RNA。甲型H1N1流感病毒还使用了另外的方式进行灵敏度评价，病毒滴度为2⁸PFU/ml的病毒培养液经过10倍梯度稀释后提取RNA，使用优化好的芯片方法检测，结果当病毒经过100000倍稀释后提取的RNA，芯片检测甲型H1N1探针信号值仍大于相应的cutoff值，即浓度为2⁸PFU/ml甲型H1N1流感病毒可以使用本芯片的方法检出。RT-PCR产物电泳结果见附图7，相应的芯片检测结果见附图8。

实施例5：甲型流感病毒核酸甄别及耐药检测基因芯片临床样本检测

使用本发明的基因芯片检测了130例疑似流感患者的咽拭子或咽拭子RNA。其中芯片检测甲型H1N1流感病毒阳性41例，这41例经过“甲型H1N1流感病毒实时荧光RT-PCR试剂盒(复合探针法)”及测序方法的复核，均为甲型H1N1流感病毒阳性，实时荧光RT-PCR的结果见表7，部分芯片检测的结果见附图9。结果表明本发明的基因芯片，在灵敏度上与实时荧光RT-PCR相当。

表7实时荧光RT-PCR检测阳性的结果

除上述实施例外，本发明还有其他实施方式。凡是采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均在本发明要求的保护范围内。

Claims (2)

1.一种检测甲型流感病毒核酸亚型和耐药性的基因芯片，其制备方法包括：

1)步骤一：

制备3对通用引物，序列如表1所示：

表1引物序列

2)步骤二：

制备10条流感亚型核酸分型探针，序列如表2所示：

表2流感亚型核酸分型探针序列

制备6条耐药检测探针，序列如表3所示：

表3耐药检测探针序列

3)步骤三：

将步骤二中的各个寡核苷酸探针用6×SSC，0.1％SDS稀释至终浓度50μM，并点到空白的醛基化修饰玻片上，阵列如表4所示，其中片基质控探针为20T序列，5’端cy3标记、3’端NH2修饰；阴性探针为与病毒无关的植物基因序列；通用序列为甲型流感病毒保守序列；引物1、2、3分别为引物NR21、NR22和NF5的反向互补序列，每条序列3’端NH₂修饰，所有探针的点样量均为3nl，使用前至少在室温放置干燥18小时；

表4寡核苷酸探针阵列

  片基质控   引物1   引物2   引物3   通用序列   阴性探针   阴性探针   片基质控   NEW-1   NEW-2   H1N1-1   H1N1-2   H3N2-1   H3N2-2   AIV-1   AIV-2   NEW-1   NEW-2   H1N1-1   H1N1-2   H3N2-1   H3N2-2   A1V-1   A1V-2   NEW-1   NEW-2   H1N1-1   H1N1-2   H3N2-1   H3N2-2   AIV-1   AIV-2   OSE-1   OSE-2   OSE-3   OSE-4   OSE-5   OSE-6   SIV-1   SIV-2   OSE-1   OSE-2   OSE-3   OSE-4   OSE-5   OSE-6   SIV-1   SIV-2   OSE-1   OSE-2   OSE-3   OSE-4   OSE-5   OSE-6   SIV-1   SIV-2   片基质控   阴性探针   阴性探针   通用序列   引物3   引物2   引物1   片基质控

4)步骤四：

制备RT-PCR体系，配方如表5所示：

表5R TPCR体系配方

5)步骤五：

制备杂交液，其组成为4×SSC，0.3％SDS，5％甲酰胺，16μM 20T-NH₂；制备洗液A，其组成为1×SSC，0.2％SDS；制备洗液B，其组成为0.2×SSC；制备洗液C，其组成为0.1×SSC。

2.根据权利要求1所述的基因芯片，其特征还在于用于甲型流感病毒核酸分型和甲型流感病毒达菲耐药性检测。

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