CN102140539A - 甲型h1n1流感病毒检测试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种甲型H1N1流感病毒检测试剂盒及检测方法。本发明的试剂盒对甲型H1N1流感病毒的HA基因上的2个不同区域(HA-1和HA-2)和NP基因上的2个不同区域(NP-1和NP-2)分别进行特异性检测，即平行检测其4个位点，降低了由于病毒突变而造成的假阴性率，以达到提高检出率的目的。
Description
技术领域
本发明涉及一种流感病毒检测试剂盒及检测方法，尤其涉及甲型H1N1流感病毒检测试剂盒及检测方法。
背景技术
2009年3月底至4月中旬，墨西哥、美国等地接连爆发新型甲型H1N1流感疫情。在不足一个月的时间里，疫情已经蔓延至全球34个国家或地区，确诊感染人数达到了6044例，其中63例死亡(截止至2009年5月13日)。目前，中国已经发现和确诊了输入性甲型H1N1流感病患，由此可见，快速灵敏的甲型H1N1流感病毒检测技术成为了保护人民生命健康、防控疫情在国内大范围流行的第一道屏障。
流感病毒属于正粘病毒科。按照病毒的核蛋白(NP)和基质蛋白(M)的特征，可以分为甲(A)、乙(B)、丙(C)三个类型。感染鸟类、猪等其他动物的流感病毒，其核蛋白的抗原性与人甲型流感病毒相同，但是由于甲型、乙型和丙型流感病毒的分类只是针对人流感病毒的，因此通常不将禽流感病毒等非人类宿主的流感病毒称作甲型流感病毒。甲型流感病毒根据血凝素(HA)不同，分为16个亚型，即H1～H16；根据神经氨酸酶(NA)不同分为9个亚型，N1～N9。
甲型H1N1流感病毒是单股负链RNA病毒，含有8个基因片段；聚合酶B1(polymerase B1，PB1)、聚合酶B2(polymerase B2，PB2)、聚合酶A(polymerase A，PA)、血凝素(hemagglutinin，HA)、核蛋白(nucleoprotein，NP)、神经氨酸酶(neuraminidase，NA)、基质蛋白(matrix protein，MP)、非结构蛋白(nonst ructural protein，NS)。
HA由病毒RNA第4区段编码，全长1742～1778nt，是甲型流感病毒主要抗原基因之一。其合成首先是在内质网中合成HA蛋白前体HA0，HA0可以水解成为HA1和HA2两个多肽。这个分解对于流感病毒成功感染宿主细胞至关重要。HA蛋白的胞外区头部具有病毒受体结合部位，可以识别细胞表面的N-乙酰神经氨酸。HA2多肽的氨基末端为融合肽，可以插入细胞膜内，介导病毒包膜与细胞膜的融合从而使病毒核酸释放进入细胞质内。HA0能否被分解成为HA1和HA2两条多肽是决定病毒有无感染能力的先决条件。HA不仅可以诱导特异性中和抗体的产生，而且还可以刺激机体产生细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes，CTL)反应。HA抗原具有免疫原性，能使人体产生保护性抗体，但其容易变异，是流感流行的主要原因之一。
NP由病毒RNA第5基因片段的NP基因编码，为单体磷酸化蛋白，与3种RNA多聚酶成分一起形成核糖核蛋白体(RNP)，RNP与病毒的RNA片段形成病毒的核衣壳，而NP是与RNA结合的主要成分。NP参与病毒复制周期的多个阶段，影响病毒的转录、复制、装配及转运功能：此外，NP也是CTL识别的主要抗原，CTL通过识别MHC-I类分子递呈的核蛋白抗原肽而清除感染的流感病毒，因而能对不同亚型的病毒株产生交叉保护性。
目前国内外检验确诊的方法主要有：(1)甲型H1N1流感病毒的核酸扩增，即用RT-PCR(逆转录-聚合酶链式反应)来扩增出此病毒的特异性核酸片段，按照核酸片段的大小加以鉴定，可在取样后3个小时得出结论。但此方法需要多次开盖及凝胶电泳，容易造成检验环境的污染，凝胶电泳对条带大小的区分率低，易造成判读。(2)细胞培养的方法分离鉴定甲型H1N1流感病毒。这种方法需要的时间较长，技术要求也高，但这是最可靠的确诊方法。(3)甲型H1N1流感抗原检查，即用免疫学技术，以已知的抗体，来检查标本中的病毒抗原，但病毒变异如此之快，很难找到与之相匹配的已知的抗体。(4)血清学检查，但患者发病初期血液中甲型H1N1流感病毒抗体多为阴性或抗体滴度很低，经两周后抗体滴度才有明显的提高。很显然以上现有的方法都不适用于甲型H1N1流感患者的快速检验诊断。
而目前对于流感病毒最快速、最有效、最灵敏的方法就是实时荧光定量PCR，美国CDC在流感爆发初期已公布了检验甲型H1N1流感病的实时荧光定量PCR的引物和方法。为了避免专利知识产权的纠纷，我国也急需开发出具有自主知识产权的实时荧光定量PCR检查方法及试剂盒。
实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
TaqMan荧光探针的工作原理为：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，PCR扩增时，Taq聚合酶的5′-3′外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
现有技术中，存在以下方法：甲型HINI流感病毒荧光定量检测试剂盒及检测方法(中国专利号200910101243.3)、一种甲型H1N1流感病毒RNA检测试剂盒(中国专利号200910162428.5)、荧光定量PCR检测新型甲型H1N1病毒试剂盒及检测方法(中国专利号200910089668.7)、流感病毒rRT-PCR检测引物和探针及检测流感病毒方法(中国专利号200910085475.4)、流感病毒RT-PCR检测引物及检测流感病毒的方法(中国专利号200910085476.9)、一种检测甲型H1N1流感病毒的试剂盒及专用引物和靶序列(中国专利号200910087632.5)。然而，他们存在以下缺点：检测位点少，灵敏度低，假阳性率高。
对于甲型H1N1流感病毒检测技术的需求不仅仅限于对可能的病患人群进行诊断，可能携带或感染病毒的动物类入境货品同样需要有效的检测手段。因此，本发明的产品将针对医疗诊断、卫生检疫和动物检疫等诸多环节。
发明内容
针对现有技术中的不足，根据疫情的发生规律，本发明人在完成新发人猪流感病毒实时荧光定量PCR检测技术研发的同时，对能收集到的病原样本进行全基因组测序，补充和丰富本项目的数据收集，并对H1NI流感病毒开发快速检测技术和试剂。
通过对截止至2009年5月4日所公布的甲型H1N1流感病毒共计24株病毒的HA基因和NP基因进行的核酸序列比对分析，得到其保守性区域，并分析所有甲型流感病毒的六千余条HA基因和三千余条NP序列，寻找甲型H1N1流感病毒的特异性位点，设计实时荧光定量PCR引物和TaqMan探针，以及涵盖有靶序列位点的核酸片段序列。
因此，本发明的一个目的是提供一种甲型H1N1流感病毒检测试剂盒。
本发明的另一个目的是提供一种甲型H1N1流感病毒检测方法。
根据本发明的一个目的，本发明提供的一种甲型H1N1流感病毒检测试剂盒是对甲型H1N1流感病毒的HA基因上的2个不同区域(HA-1和HA-2)和NP基因上的2个不同区域(NP-1和NP-2)分别进行特异性检测，即平行检测其4个位点，降低了由于病毒突变而造成的假阴性率，以达到提高检出率的目的。本发明的平行检测上述4个位点的引物和探针序列如下表1所示。
表1
利用发明人在荧光定量PCR检测技术方面丰富的工作经验，根据新发布甲型H1N1流感病毒的基因组序列，分析其保守性和特异性核酸位点，设计TaqMan探针和PCR引物，并通过全基因合成得到的病毒基因片段进行灵敏度验证和比较，通过对其他分型流感病毒的检测进行特异性验证，筛选适合的引物和探针，优化反应条件，形成高灵敏度、高特异性的甲型H1N1流感病毒荧光定量PCR检测试剂产品。
因此，本发明进一步提供了一种甲型H1N1流感病毒检测试剂盒。本发明的试剂盒包括以下各项：
| 序号 | 组分名称 | 对应靶基因片段 | 组成成分 |
| 管1 | PCR反应液I | HA-1 | 缓冲液、组合1、Mg2+ |
| 管2 | PCR反应液II | HA-2 | 缓冲液、组合2、Mg2+ |
| 管3 | PCR反应液III | NP-1 | 缓冲液、组合3、Mg2+ |
| 管4 | PCR反应液IV | NP-2 | 缓冲液、组合4、Mg2+ |
| 管5 | RT/Taq MIX | - | Taq与RT混合酶 |
| 管6 | 强阳性对照 | - | 合成DNA模板 |
| 管7 | 弱阳性对照 | - | 合成DNA模板 |
| 管8 | 阴性对照 | - | 去离子水 |
具体地，本发明的试剂盒包括以下各项：
| 序号 | 组分名称 | 对应靶基因片段 | 装量/管 | 用量/反应 | 组成成分 |
| 管1 | PCR反应液I | HA-1 | 365μL | 14.5μL | 缓冲液、组合1、Mg2+ |
| 管2 | PCR反应液II | HA-2 | 365μL | 14.5μL | 缓冲液、组合2、Mg2+ |
| 管3 | PCR反应液III | NP-1 | 365μL | 14.5μL | 缓冲液、组合3、Mg2+ |
| 管4 | PCR反应液IV | NP-2 | 365μL | 14.5μL | 缓冲液、组合4、Mg2+ |
| 管5 | RT/Taq MIX | - | 50μL | 0.5μL | Taq与RT混合酶 |
| 管6 | 强阳性对照 | - | 20μL | 2.5μL | 合成DNA模板 |
| 管7 | 弱阳性对照 | - | 20μL | 2.5μL | 合成DNA模板 |
| 管8 | 阴性对照 | - | 20μL | 2.5μL | 去离子水 |
具体地，在本发明的试剂盒中，1-4管中每种引物浓度：345nM；1-4管中探针浓度：172nM；1-4管中缓冲液(Buffer)：Invitrogen公司Cat NO：11732-088试剂盒中2×Reaction Mix；Mg2+：为MgSO4，50mM；RT/Taq MIX：Invitrogen公司Cat NO：11732-088试剂盒中SuperScriptTM III
Taq Mix；强阳性对照的合成DNA模板：pGMT-HA与pGMT-NP质粒等摩尔混合物，浓度为20μM；弱阳性对照的合成DNA模板：pGMT-HA与pGMT-NP质粒等摩尔混合物，浓度为20pM。
其中，质粒pGMT-HA中HA序列：
ATGAAGGCAA TACTAGTAGT TCTGCTATAT ACATTTGCAA CCGCAAATGC
AGACACATTA TGTATAGGTT ATCATGCGAA CAATTCAACA GACACTGTAG
ACACAGTACT AGAAAAGAAT GTAACAGTAA CACACTCTGT TAACCTTCTA
GAAGACAAGC ATAACGGGAA ACTATGCAAA CTAAGAGGGG TAGCCCCATT
GCATTTGGGT AAATGTAACA TTGCTGGCTG GATCCTGGGA AATCCAGAGT
GTGAATCACT CTCCACAGCA AGCTCATGGT CCTACATTGT GGAAACACCT
AGTTCAGACA ATGGAACGTG TTACCCAGGA GATTTCATCG ATTATGAGGA
GCTAAGAGAG CAATTGAGCT CAGTGTCATC ATTTGAAAGG TTTGAGATAT
TCCCCAAGAC AAGTTCATGG CCCAATCATG ACTCGAACAA AGGTGTAACG
GCAGCATGTC CTCATGCTGG AGCAAAAAGC TTCTACAAAA ATTTAATATG
GCTAGTTAAA AAAGGAAATT CATACCCAAA GCTCAGCAAA TCCTACATTA
ATGATAAAGG GAAAGAAGTC CTCGTGCTAT GGGGCATTCA CCATCCATCT
ACTAGTGCTG ACCAACAAAG TCTCTATCAG AATGCAGATA CATATGTTTT
TGTGGGGTCA TCAAGATACA GCAAGAAGTT CAAGCCGGAA ATAGCAATAA
GACCCAAAGT GAGGGATCAA GAAGGGAGAA TGAACTATTA CTGGACACTA
GTAGAGCCGG GAGACAAAAT AACATTCGAA GCAACTGGAA ATCTAGTGGT
ACCGAGATAT GCATTCGCAA TGGAAAGAAA TGCTGGATCT GGTATTATCA
TTTCAGATAC ACCAGTCCAC GATTGCAATA CAACTTGTCA AACACCCAAG
GGTGCTATAA ACACCAGCCT CCCATTTCAG AATATACATC CGATCACAAT
TGGAAAATGT CCAAAATATG TAAAAAGCAC AAAATTGAGA CTG
质粒pGMT-NP中NP序列：
ATGGCGTCTC AAGGCACCAA ACGATCATAT GAACAAATGG AGACTGGTGG
GGAGCGCCAG GATGCCACAG AAATCAGAGC ATCTGTCGGA AGAATGATTG
GTGGAATCGG GAGATTCTAC ATCCAAATGT GCACTGAACT CAAACTCAGT
GATTATGATG GACGACTAAT CCAGAATAGC ATAACAATAG AGAGGATGGT
GCTTTCTGCT TTTGATGAGA GAAGAAATAA ATACCTAGAA GAGCATCCCA
GTGCTGGGAA GGACCCTAAG AAAACAGGAG GACCCATATA TAGAAGAGTA
GACGGAAAGT GGATGAGAGA ACTCATCCTT TATGACAAAG AAGAAATAAG
GAGAGTTTGG CGCCAAGCAA ACAATGGCGA AGATGCAACA GCAGGTCTTA
CTCATATCAT GATTTGGCAT TCCAACCTGA ATGATGCCAC ATATCAGAGA
ACAAGAGCGC TTGTTCGCAC CGGAATGGAT CCCAGAATGT GCTCTCTAAT
GCAAGGTTCA ACACTTCCCA GAAGGTCTGG TGCCGCAGGT GCTGCGGTGA
AAGGAGTTGG AACAATAGCA ATGGAGTTAA TCAGAATGAT CAAACGTGGA
ATCAATGACC GAAATTTCTG GAGGGGTGAA AATGGACGAA GGACAAGGGT
TGCTTATGAA AGAATGTGCA ATATCCTCAA AGGAAAATTT CAAACAGCTG
CCCAGAGGGC AATGATGGAT CAAGTAAGAG AAAGTCGAAA CCCAGGAAAC
GCTGAGATTG AAGACCTCAT TTTCCTGGCA CGGTCAGCAC TCATTCTGAG
GGGATCAGTT GCACATAAAT CCTGCCTGCC TGCTTGTGTG TATGGGCTTG
CAGTAGCAAG TGGGCATGAC TTTGAAAGGG AAGGGTACTC ACTGGTCGGG
ATAGACCCAT TCAAATTACT CCAAAACAGC CAAGTGGTCA GCCTGATGAG
ACCAAATGAA AACCCAGCTC ACAAGAGTCA ATTGGTGTGG ATGGCATGCC
ACTCTGCTGC ATTTGAAGAT TTAAGAGTAT CAAGTTTCAT AAGAGGAAAG
AAAGTGATTC CAAGAGGAAA GCTTTCCACA AGAGGGGTCC AGATTGCTTC
AAATGAGAAT GTGGAAACCA TGGACTCCAA TACCCTGGAA CTGAGAAGCA
GATACTGGGC CATAAGGACC AGGAGTGGAG GAAATACCAA TCAACAAAAG
GCATCCGCAG GCCAGATCAG TGTGCAGCCT ACATTCTCAG TGCAGCGGAA
TCTCCCTTTT GAAAGAGCAA CCGTTATGGC AGCATTCAGC GGGAACAATG
AAGGACGGAC ATCCGACATG CGAACAGAAG TTATAAGAAT GATGGAAAGT
GCAAAGCCAG AAGATTTGTC CTTCCAGGGG CGGGGAGTCT TCGAGCTCTC
GGACGAAAAG GCAACGAACC CGATCGTGCC TTCCTTTGAC ATGAGTAATG
AAGGGTCTTA TTTCTTCGGA GACAATGCAG AGGAGTATGA CAGTTGA
本试剂盒样品有以下特点：
a.常规试剂只能检测病毒基因组的一个区域，A(H1N1)流感病毒的突变率很高，单位点检测试剂的敏感性受到很大影响，漏检率高。我们的试剂可以同时检测病毒的4个区域。
b.当前疫情控制中，主要是根据疾病的临床特征筛选疑似病例，然后进行确诊。A(H1N1)流感的临床症状与其它呼吸道病毒并无太大区别，如禽流感病毒(H5N1)、流感病毒A、流感病毒B、SARS等，检测时就会影响病例的确诊。
c.经过摸索和优化，整个PCR体系敏感性最高可达到1～2个病毒拷贝，特异性100％，重复性稳定。
d.因为流感病毒容易变异，传播速度很快，所以我们在已测流感病毒序列的保守区多位点设计引物和探针，在一定程度上提高了试剂盒使用时限和有效性。
e.甲型H1N1流感的主要传染源是受病毒感染者，所以难以发现和控制传染源。而本试剂盒多位点检测的高灵敏性，可以有助于提前发现感染新甲型H1N1流感病毒者在出现症状前的潜伏期内及不发病的隐性感染者。
根据本发明的另一个目的，本发明提供的一种甲型H1N1流感病毒检测方法是对甲型H1N1流感病毒的HA基因上的2个不同区域HA-1和HA-2以及NP基因上的2个不同区域NP-1和NP-2分别进行特异性检测，从而平行检测其4个位点。
具体地，使用本发明的试剂盒检测甲型H1N1流感病毒的方法如下：
1、检测样本的制备；
本发明的试剂盒针对病毒RNA提取液进行检测。人鼻咽拭子、组织等标本的RNA提取流程需要参考WHO发布标准进行，推荐使用Roche公司的High Pure Viral RNA Kit(目录号：11858882001)或Qiagen公司的OIAamp Viral RNA Mini Kit(目录号：52904)进行病毒样本的RNA提取操作。
2、使用本发明的试剂盒对检测样本进行检测；
3、结果分析。
本发明的试剂盒的储存条件和有效期为-20℃保存6个月。
附图说明
图1为本试剂盒检测的实时荧光定量PCR结果。图1中曲线从左到右表示：组合3、组合1、组合2、CDC推荐引物探针组合、组合4。
具体实施方式
本发明的试剂盒的工作原理是根据核酸聚合酶链式反应(PCR)，通过设计甲型H1N1特异性TaqMan探针及配套引物组成的荧光PCR反应体系，实现对甲型H1N1流感病毒核酸的检测。本发明的引物和探针可用于对甲型H1N1流感病毒的HA基因和NP基因的特异性检测。
实施例1引物、探针、验证模板设计
通过对截止至2009年5月4日所公布的甲型H1N1流感病毒共计24株病毒的HA基因和NP基因进行的核酸序列比对分析，得到其保守性区域，并分析所有甲型流感病毒的六千余条HA基因和三千余条NP序列，寻找甲型H1N1流感病毒的特异性位点，设计实时荧光定量PCR引物和TaqMan探针，以及靶基因保守片段序列。共计得到HA基因上的2个保守片段序列和NP基因上的2个保守片段序列，以及引物序列8条、探针序列4条。应用分析软件包括Vector NTI和AlleleID等生物信息分析软件。
靶基因片段序列如下所示((5’-3’))：
HA-1
TTGAGCTCAGTGTCATCATTTGAAAGGTTTGAGATATTCCCCAAGACAAGTTCATGGCCCAATCATGACTCGAACAAAGGTGTAACGGCAGCATGTCCTCATGCTGGAGCAAAAAGCTTCTACAAAAATTTAATATGGCTAGTTAAAAAAGGAAATTCATACCCAAAGCTCAGCA
HA-2
TCATACCCAAAGCTCAGCAAATCCTACATTAATGATAAAGGGAAAGAAGTCCTCGTGCTATGGGGCATTCACCATCCATCTACTAGTGCTGACCAACAAAGTCTCTATCAGAATGCAGATACATATGTTTTTGTGGGGTCATCAAGATACA
NP-1
ATCCTGCCTGCCTGCTTGTGTGTATGGGCTTGCAGTAGCAAGTGGGCATGACTTTGAAAGGGAAGGGTACTCACTGGTCGGGATAGACCCATTCAAATTACTCCAAAACAGCCAAGTGGTCAGCCTGATGAGACCAAATGAAAACCCAGCTCACAAGAGTCAATTGGTGTGGATGGCATGCCAT
NP-2
GCAGATACTGGGCCATAAGGACCAGGAGTGGAGGAAATACCAATCAACAAAAGGCATCCGCAGGCCAGATCAGTGTGCAGCCTACATTCTCAGTGCAGCGGAATCTCCCTTTTGAAAGAGCAACCGTTATGGCAGCATTCAGCGGGAACAATGAAGGACGGACATCCGACATGCGAACAGAAGTTATAAGAATGATGGAAAGTGCAAAGCCAGAAGATTTGTCCTTCCAGGGGCGGGGAGTCTTCGAGCTCTCGGACGAAAAGGCAACGAACCCGATCGTGCCTTCCTTTGACATGAGTAATGAAGGGTCTTATTTCTTCGGAGACAATGCAGAGGAG
引物和探针的设计原则如下：
引物设计原则：
1.序列选取应在基因的保守区段；
2.避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对；
3.避免引物自身形成环状发卡结构；
4.典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。Tm值在55-65℃，GC含量在40％-60％；
5.引物之间的TM相差避免超过2℃；
6.引物的3’端避免使用碱基A；
7.引物的3’端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基；
8.为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显子。
探针设计原则：
1.探针位置尽可能地靠近上游引物；
2.探针长度通常在25-35bp，Tm值在65-70℃，通常比引物TM高5-10℃，GC含量在40％-70％；
3.探针的5’端应避免使用碱基G；
4.整条探针中，碱基C的含量要明显高于G的含量；
5.为确保引物探针的特异性，最好将设计好的序列在数据中核实一次，如果发现有非特异性互补区，建议重新设计引物探针。
实施例2实时PCR体系建立
设备：Roche LightCycler实时荧光定量PCR仪。
试剂：引物、阳性对照模板(pGMT-HA与pGMT-NP质粒等摩尔混合物)合成：北京奥科生物技术有限责任公司，PAGE纯化。验证模板为质粒DNA。
探针合成：宝生物工程(大连)有限公司，5’端连接6-Fam基团，3’端连接BHQ-1基团，HPLC纯化。
dNTP Mixture、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR缓冲液：普洛麦格(北京)生物技术有限公司。
无菌去离子水：自制。
环境：各自独立的样品处理、试剂配置、PCR反应实验室。
反应体系：
| 试剂 | 体积 |
| 10×Buffer | 2.0μL |
| 10mM各种dNTP | 0.4μL |
| 25mM Mg2+ | 3.2μL |
| 10pM上游引物 | 0.8μL |
| 10pM下游引物 | 0.8μL |
| 10pM TaqMan探针 | 0.4μL |
| Taq DNA聚合酶 | 0.4μL |
| 无菌去离子水 | 10μL |
| 模板DNA | 2μL |
| 总计 | 20μL |
反应条件：
94℃ 3min
分析软件：Roche LightCycler Software version 3。
实施例3引物、探针组合筛选
如图1所示，通过前期对500余种引物对和探针的组合中的300余种完成的筛选实验，目前可以确定4套组合，其灵敏度和特异性指标满足预期要求。
4套组合具体如下。
实施例4本发明的甲型H1N1流感病毒检测试剂盒的制备
本发明的试剂盒组成如下：
| 序号 | 组分名称 | 对应靶基因片段 | 装量/管 | 用量/反应 | 组成成分 |
| 管1 | PCR反应液I | HA-1 | 365μL | 14.5μL | 缓冲液、组合1、Mg2+ |
| 管2 | PCR反应液II | HA-2 | 365μL | 14.5μL | 缓冲液、组合2、Mg2+ |
| 管3 | PCR反应液III | NP-1 | 365μL | 14.5μL | 缓冲液、组合3、Mg2+ |
| 管4 | PCR反应液IV | NP-2 | 365μL | 14.5μL | 缓冲液、组合4、Mg2+ |
| 管5 | RT/Taq MIX | - | 50μL | 0.5μL | Taq与RT混合酶 |
| 管6 | 强阳性对照 | - | 20μL | 2.5μL | 合成DNA模板 |
| 管7 | 弱阳性对照 | - | 20μL | 2.5μL | 合成DNA模板 |
| 管8 | 阴性对照 | - | 20μL | 2.5μL | 去离子水 |
其中，1-4管中每种引物浓度：345nM；1-4管中探针浓度：172nM；1-4管中缓冲液(Buffer)：Invitrogen公司Cat NO：11732-088试剂盒中2×Reaction Mix；Mg2+：为MgSO4，50mM；RT/Taq MIX：Invitrogen公司Cat NO：11732-088试剂盒中SuperScriptTM III
Taq Mix；强阳性对照的合成DNA模板：pGMT-HA与pGMT-NP质粒等摩尔混合物，浓度为20μM；弱阳性对照的合成DNA模板：pGMT-HA与pGMT-NP质粒等摩尔混合物，浓度为20pM。
质粒pGMT-HA中HA序列：
ATGAAGGCAA TACTAGTAGT TCTGCTATAT ACATTTGCAA CCGCAAATGC
AGACACATTA TGTATAGGTT ATCATGCGAA CAATTCAACA GACACTGTAG
ACACAGTACT AGAAAAGAAT GTAACAGTAA CACACTCTGT TAACCTTCTA
GAAGACAAGC ATAACGGGAA ACTATGCAAA CTAAGAGGGG TAGCCCCATT
GCATTTGGGT AAATGTAACA TTGCTGGCTG GATCCTGGGA AATCCAGAGT
GTGAATCACT CTCCACAGCA AGCTCATGGT CCTACATTGT GGAAACACCT
AGTTCAGACA ATGGAACGTG TTACCCAGGA GATTTCATCG ATTATGAGGA
GCTAAGAGAG CAATTGAGCT CAGTGTCATC ATTTGAAAGG TTTGAGATAT
TCCCCAAGAC AAGTTCATGG CCCAATCATG ACTCGAACAA AGGTGTAACG
GCAGCATGTC CTCATGCTGG AGCAAAAAGC TTCTACAAAA ATTTAATATG
GCTAGTTAAA AAAGGAAATT CATACCCAAA GCTCAGCAAA TCCTACATTA
ATGATAAAGG GAAAGAAGTC CTCGTGCTAT GGGGCATTCA CCATCCATCT
ACTAGTGCTG ACCAACAAAG TCTCTATCAG AATGCAGATA CATATGTTTT
TGTGGGGTCA TCAAGATACA GCAAGAAGTT CAAGCCGGAA ATAGCAATAA
GACCCAAAGT GAGGGATCAA GAAGGGAGAA TGAACTATTA CTGGACACTA
GTAGAGCCGG GAGACAAAAT AACATTCGAA GCAACTGGAA ATCTAGTGGT
ACCGAGATAT GCATTCGCAA TGGAAAGAAA TGCTGGATCT GGTATTATCA
TTTCAGATAC ACCAGTCCAC GATTGCAATA CAACTTGTCA AACACCCAAG
GGTGCTATAA ACACCAGCCT CCCATTTCAG AATaTACATC CGATCACAAT
TGGAAAATGT CCAAAATATG TAAAAAGCAC AAAATTGAGA CTG
质粒pGMT-NP中NP序列：
ATGGCGTCTC AAGGCACCAA ACGATCATAT GAACAAATGG AGACTGGTGG
GGAGCGCCAG GATGCCACAG AAATCAGAGC ATCTGTCGGA AGAATGATTG
GTGGAATCGG GAGATTCTAC ATCCAAATGT GCACTGAACT CAAACTCAGT
GATTATGATG GACGACTAAT CCAGAATAGC ATAACAATAG AGAGGATGGT
GCTTTCTGCT TTTGATGAGA GAAGAAATAA ATACCTAGAA GAGCATCCCA
GTGCTGGGAA GGACCCTAAG AAAACAGGAG GACCCATATA TAGAAGAGTA
GACGGAAAGT GGATGAGAGA ACTCATCCTT TAtGACAAAG AAGAAATAAG
GAGAGTTTGG CGCCAAGCAA ACAATGGCGA AGATGCAACA GCAGGTCTTA
CTCATATCAT GATTTGGCAT TCCAACCTGA ATGATGCCAC ATATCAGAGA
ACAAGAGCGC TTGTTCGCAC CGGAATGGAT CCCAGAATGT GCTCTCTAAT
GCAAGGTTCA ACACTTCCCA GAAGGTCTGG TGCCGCAGGT GCTGCGGTGA
AAGGAGTTGG AACAATAGCA ATGGAGTTAA TCAGAATGAT CAAACGTGGA
ATCAATGACC GAAATTTCTG GAGGGGTGAA AATGGACGAA GGACAAGGGT
TGCTTATGAA AGAATGTGCA ATATCCTCAA AGGAAAATTT CAAACAGCTG
CCCAGAGGGC AATGATGGAT CAAGTAAGAG AAAGTCGAAA CCCAGGAAAC
GCTGAGATTG AAGACCTCAT TTTCCTGGCA CGGTCAGCAC TCATTCTGAG
GGGATCAGTT GCACATAAAT CCTGCCTGCC TGCTTGTGTG TATGGGCTTG
CAGTAGCAAG TGGGCATGAC TTTGAAAGGG AAGGGTACTC ACTGGTCGGG
ATAGACCCAT TCAAATTACT CCAAAACAGC CAAGTGGTCA GCCTGATGAG
ACCAAATGAA AACCCAGCTC ACAAGAGTCA ATTGGTGTGG ATGGCATGCC
ACTCTGCTGC ATTTGAAGAT TTAAGAGTAT CAAGTTTCAT AAGAGGAAAG
AAAGTGATTC CAAGAGGAAA GCTTTCCACA AGAGGGGTCC AGATTGCTTC
AAATGAGAAT GTGGAAACCA TGGACTCCAA TACCCTGGAA CTGAGAAGCA
GATACTGGGC CATAAGGACC AGGAGTGGAG GAAATACCAA TCAACAAAAG
GCATCCGCAG GCCAGATCAG TGTGCAGCCT ACATTCTCAG TGCAGCGGAA
TCTCCCTTTT GAAAGAGCAA CCGTTATGGC AGCATTCAGC GGGAACAATG
AAGGACGGAC ATCCGACATG CGAACAGAAG TTATAAGAAT GATGGAAAGT
GCAAAGCCAG AAGATTTGTC CTTCCAGGGG CGGGGAGTCT TCGAGCTCTC
GGACGAAAAG GCAACGAACC CGATCGTGCC TTCCTTTGAC ATGAGTAATG
AAGGGTCTTA TTTCTTCGGA GACAATGCAG AGGAGTATGA CAGTTGA
实施例5本发明的甲型H1N1流感病毒检测试剂盒对样本的检测
本发明的试剂盒适用于具有FAM荧光检测通道的全自动荧光PCR检测仪及相关软件。
1、检测样本的制备；
本发明的试剂盒针对病毒RNA提取液进行检测。人鼻咽拭子、组织等标本的RNA提取流程需要参考WHO发布标准进行，推荐使用Roche公司的High Pure Viral RNA Kit(目录号：11858882001)或Qiagen公司的OIAampViral RNA Mini Kit(目录号：52904)进行病毒样本的RNA提取操作。每份样本均需同时使用本试剂盒的四种反应液分别进行检测。
2、使用本发明的试剂盒对检测样本进行检测，其包括以下步骤：
(1)试剂配制
样本数n＝待检标本数+对照品(强阳，弱阳和阴性)3个+1，按样本数n配制每组反应液(I、II、III、IV，共4组)。
每组取相应的PCR反应液(n×14.5μL)、RT/Taq MIX(n×0.5μL)于一离心管中混匀；低速离心数秒，按15μL/管分装到反应管中。分装后反应管可在2～8℃放置1小时。
(2)样本、对照品的加样
取样本提取液(冻存样本使用前室温充分融化，振荡混匀数秒，13,000rpm离心2分钟)各10μL分别加入4组反应管中，低速离心数秒，取出置于全自动荧光PCR仪上。
取对照品各2.5μL分别加入4组反应管中，每管补充7.5μL水，低速离心数秒，取出置于全自动荧光PCR仪上。
样本处理和加样等步骤须在生物安全柜或其它基本防护设施中进行。
(3)PCR扩增
根据PCR仪设置扩增程序：
Roche LightCycler：50℃反应15分钟，然后95℃保温2分钟，再按94℃5秒→60℃30秒，循环50次，60℃采集FAM荧光通道信号。
ABI 7500/7300：50℃反应15分钟，然后95℃保温2分钟，再按94℃5秒→60℃40秒，循环50次，60℃采集FAM荧光通道信号。
(4)质量控制
试剂盒中提供强阳性对照、弱阳性对照和阴性对照各一个。
如试剂质量完好且操作正确，相应的结果应满足下表条件。
| 对照品 | 质控要求 |
| 强阳性对照 | 阳性，且Ct＜30 |
| 弱阳性对照 | 阳性，且Ct＜40 |
| 阴性对照 | 阴性 |
检测结果应达到上表要求的标准，否则实验无效，应检查仪器、试剂、扩增条件等方面的误差。
每次检测中至少应设置阴性对照品。
(5)结果判断
1)反应管结果判断：
取高于样本噪声线和阴性对照的荧光值作为检测阈值。根据FAM通道的Ct值判断反应管结果。
具体判断如下表：
| Ct值 | 反应管结果判断 |
| Ct≤45 | 阳性 |
| 45＜Ct＜50 | 检测灰区，建议复检 |
| Ct＝50 | 阴性 |
若Ct＝50，某些软件可能显示为＞50、无值或UNDET等。
45＜Ct＜50为检测灰区，建议重复检测2次，如检测结果至少一次Ct＜50判断为阳性。否则判断该管为阴性。
2)样本结果判断：
如果反应管IV结果为阳性，样本判定为阳性；
如果反应管IV结果为阴性，而反应管I、II、III三个中的任意两个为阳性，样本判定为阳性。
如果反应管IV结果为阴性，而反应管I、II、III三个中只有一个为阳性，则判定为灰区，建议对产物进行测序分析。
如果4个反应管均为阴性，样本判定为阴性。
本发明的试剂盒检测到阳性结果表明在样本中存在甲型H1N1流感病毒RNA，但不表明是否存在活性病毒。
本发明的试剂盒的灵敏度：根据合成验证模板序列吸光度测定，计算得到模板的近似拷贝数，对反应体系进行灵敏度测试，分别证明组合1灵敏度为200拷贝，组合2灵敏度为2000拷贝，组合3灵敏度为1～2拷贝，组合4灵敏度为20000拷贝。CDC推荐引物探针检出范围为2000～20000拷贝，较现有组合灵敏度低1～4个数量级。数据如下。
如图1，实验证明本发明研发的甲型H1N1流感病毒实时荧光定量PCR检测技术，同一模板浓度下检测Ct值要提前5-10个Ct值，检测敏感性至少可以较CDC推荐引物探针提高100倍以上。
CDC推荐引物探针组合：
引物1：GGCACGGTCAGCACTCATTC
引物2：GGGGTCTATCCCGACCAGTGA
探针：6-FAM-CYACTGCAAGCCCATACACACAAGCAGGCA-BHQ-1
本发明的试剂盒的特异性：通过对收集到的3株猪源性H1N1流感病毒和2株人源性H5N1随机流感病毒的逆转录cDNA进行测试，其中HA-1组合对3株猪源性H1N1流感病毒中的2株获得阳性的结果，其他均为阴性结果，数据不再列举。对于猪源性H1N1流感病毒表现阳性的原因可能由于HA-1组合其特异性不足，但根据紧急疫情下的处理经验来讲，无论在待检样品中检出何种来源的H1N1阳性，均具有一定的检验或检疫意义。
这个实验结果是为了证明本发明的组合的特异性只针对于人源的H1NI病毒，对于猪源的HINI病毒和人源的H5NI病毒检测不出。说明本发明的组合和试剂盒检测的特异性，结果不会受到其他相近物种病毒的干扰。
Claims (5)
1.一种甲型H1N1流感病毒检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒对甲型H1N1流感病毒的HA基因上的2个不同区域HA-1和HA-2以及NP基因上的2个不同区域NP-1和NP-2分别进行特异性检测，从而平行检测其4个位点，平行检测上述4个位点的引物和探针序列如下：
2.根据权利要求1所述的甲型H1N1流感病毒检测试剂盒，其特征在于，其包括以下各项：
。
3.根据权利要求2所述的甲型H1N1流感病毒检测试剂盒，其特征在于，其包括以下各项：
。
4.一种甲型H1N1流感病毒检测方法，其特征在于，该方法对甲型H1N1流感病毒的HA基因上的2个不同区域HA-1和HA-2以及NP基因上的2个不同区域NP-1和NP-2分别进行特异性检测，从而平行检测其4个位点；平行检测上述4个位点的引物和探针序列如下：
。
5.一种甲型H1N1流感病毒检测方法，该方法包括以下步骤：
(1)检测样本的制备；
(2)使用权利要求1～3中任一项所述的试剂盒对上述检测样本进行检测；
(3)结果分析。
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Assignee: Jiangsu Todaysoft Technology Co., Ltd. Assignor: Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences Contract record no.: 2012990000174 Denomination of invention: Kit for detecting influenza A H1N1 viruses and detection method Granted publication date: 20120307 License type: Exclusive License Open date: 20110803 Record date: 20120331 |
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