CN102146485A - 流感病毒一步rt-pcr检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种流感病毒一步RT-PCR检测试剂盒，涉及生物技术领域中的PCR试剂盒。本试剂盒包括一步5xRT-PCR Buffer、阳性对照、阴性对照、三对特异性引物和Enzyme Mix；依据流感病毒A型的M基因设计特异性引物，AF：5'-ATTCTAACCGAGGTCGAAACGT-3'，AR：5'-GACAAAGCGTCTACGCTGCAGTC-3'；依据流感病毒B型的NS基因设计特异性引物；依据流感病毒甲型H1N1型的HA基因设计特异性引物。本发明测时间周期短、检测效率高；检测病毒特异性高，准确率高；能进行病毒定性分析；检测灵敏度比免疫学检测方法灵敏度高；操作简单、易于推广；实验结果重复性好。

Description

流感病毒一步RT-PCR检测试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域中的PCR试剂盒，尤其涉及一种流感病毒一步RT-PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction，反转录酶-聚合酶链锁反应)检测试剂盒。

背景技术

流感病毒属于正粘病毒科，分节段单股负链RNA病毒。根据其核蛋白和基质蛋白抗原性不同，流感病毒主要分为A、B和C型或者称为甲、乙和丙三种类型。其中A型流感病毒可以感染人类、禽类和其他一些哺乳动物，如猪等。而B型和C型流感病毒主要是感染人类。据流行病学调查显示，目前引起人群流行性感冒流感的主要是流感病毒A型和B型。2009年4月在墨西哥暴发并导致全球广泛传播和数百人死亡的流感病毒被命名为甲型H1N1流感病毒，该病毒属于A型流感病毒的H1N1亚型，它是猪流感病毒，人流感病毒和禽流感病毒通过基因片段重组后产生的一种新型混合型病毒株。针对流感病毒建立快速高效的实验室检测技术，对于疑似病人的及时诊断和治疗以及卫生检疫部门和国家疾控部门开展有效的传染病监控和流行病学调查研究等都具有非常重要的意义。根据防控甲流的实际需要，建立了在一个反应管内能同时筛查A型B型和新型甲型H1N1流感病毒的RT-PCR技术，PCR技术的优点有高灵敏度、高特异性、高精确性，为快速检测工作中发挥了重要作用。

目前在感染的早期及时采用抗病毒类药物治疗流感患者效果显著治愈率高因此为了早诊断早治疗针对疑似患者的流感病毒实验室快速筛查技术显得非常重要且意义重大实时荧光定量RT-PCR技术是一项快速准确和特异的流感病毒核酸检测技术。但是该技术的主要缺点是由于荧光标记探针的使用造成检测成本很高。此外当采用荧光RT-PCR技术同时检测A型B型和甲型H1N1等多种流感病毒型别时实验操作将变得非常繁琐成本也会成倍增长。临床医院等在应对全球性流感大流行的疫情监控工作中建立低成本，能同时检测流感病毒多种型别的普通多重RT-PCR技术显得更具实用价值，多重RT-PCR技术是在单一RT-PCR技术的基础上发展起来的新技术通过多对引物组合，可以实现在一个PCR反应体系中同时扩增多个靶序列这样即节约时间和精力又节约了试剂，并且其扩增的特异性和效率与单一PCR相当。因此该技术非常适合于实验室用于应对长时期大样本的临床筛检任务。

发明内容

本发明的目的就在于于克服现有技术存在的缺点和不足，提供一种流感病毒一步RT-PCR检测试剂盒。

本发明的目的是这样实现的：

1、流感病毒一步RT-PCR检测试剂盒(简称试剂盒)

本试剂盒是在对流感病毒核酸序列分析的基础上，选取保守基因序列设计出三对特异性引物，利用PCR技术对流感病毒进行检测。此技术不仅缩短了操作时间，减少了污染，也降低了样品诊断的成本，具有潜在的应用价值。

在按下述方法设计的引物存在下，在PCR仪中，对病毒核酸进行PCR扩增，来实现对流感病毒的检测。

具体地说，本试剂盒包括一步5xRT-PCR Buffer、阳性对照、阴性对照、三对特异性引物和Enzyme Mix；

①依据流感病毒A型的M基因设计特异性引物

AF：5’-ATTCTAACCGAGGTCGAAACGT-3’ 22bp，

AR：5’-GACAAAGCGTCTACGCTGCAGTC-3’23bp；

依据流感病毒B型的NS基因设计特异性引物

BF：5’-AGGGACATGAACAACAAAGATT-3’ 22bp，

BR：5’-GATGTCAGCTATTATGGAGCTC-3’ 22bp；

依据流感病毒甲型H1N1型的HA基因设计特异性引物

H1N1F：5’-AAATAACATTMGAAGCAACTGGT-3’23bp，

H1N1R：5’-GAGGCTGGTGTTTATRGCACCC-3’ 22bp；

②阳性对照

分别连接有设计流感病毒A、B型、甲型H1N1型引物的基因保守序列的pGBKT-7克隆载体；

③阴性对照

RNase Free H₂O；

④5×RT-PCR Buffer配制

配置混合后于冰箱-20℃保存；

⑤Enzyme Mix配制

配置混合后于冰箱-20℃保存。

2、试剂盒的使用方法

①病毒核酸的提取：

A、首先在缓冲液1、2中加入无水乙醇，分别加入25ml和30ml无水乙醇；在漂洗液中加入30μg/ml carrier RNA；

B、取30μl蛋白酶放入1.5ml离心管中；

C、将标本(如咽拭子、痰液等)取200μl加入此管中，充分混匀；

D、再在每管分别加入200μl漂洗液(含30μg/ml carrier RNA)，混匀振荡30s，70℃温育10min；

E、加入250μl无水乙醇，充分混匀振荡30s，室温裂解5min；

F、将上述裂解液加入离心柱中，8000rpm，离心1min，弃收集管中的离心液。滤柱仍放回收集管上，将步骤③剩余的混合液全部吸入滤柱中，离心后弃离心液；

G、滤柱中加入500μl缓冲液1，12000rpm，离心1min，弃收集管中的离心液；

H、另取一支干净的2ml收集管，将离心后的滤柱移到新的收集管上，于滤柱中加入500μl缓冲液2，12000rpm，离心1min，重复步骤⑧一次；

I、将滤柱移到一个干净的收集管中，12000rpm，离心3min，后将滤柱放在37℃15min以干燥滤膜；

J、将滤柱放在1.5ml Eppendorf管上，向滤柱中加入50ulRNase-free H₂O，室温静置2min。12000rpm，离心2min，收集离心液即为提取的核酸。

②一步RT-PCR扩增(每份25ul体系)

取5ul病毒核酸作为模板，同时加入20ul一步RT-PCR反应液至PCR管中进行PCR扩增。

A、一步RT-PCR反应液(mix)的配制：

B、一步RT-PCR反应程序：

a、50℃    30min

b、95℃    5min

c、94℃    30s

d、60℃    30s

e、72℃    1min

f、Go to c，45个循环；

C、检测仪器：

本发明使用ABI Veriti Thermal Cycler PCR仪进行检测。

D、结果判断：

所得到的DNA产物，使用2％的琼脂糖凝胶跑电泳，使用照胶仪来分析检测。

如泳道中无条带显示则为阴性，有条带显示为阳性；

如泳道只有一条带显示为230bp为流感病毒A型；

如泳道只有一条带显示为505bp为流感病毒B型；

如泳道有两条带显示为230bp和155bp为流感病毒甲型H1N1型。

本发明具有下列优点和积极效果：

①测时间周期短、检测效率高；

②检测病毒特异性高，准确率高；

③能进行病毒定性分析；

④检测灵敏度比免疫学检测方法灵敏度高；

⑤操作简单、易于推广；

⑥实验结果重复性好。

具体实施方式：

一、实施例1---流感病毒一步RT-PCR检测试剂盒

检测疑似流感病毒感染患者咽拭子标本12份，各取标本液200μl进行病毒核酸提取。

1、试剂盒的组成：

本试剂盒包括一步5xRT-PCR Buffer、阳性对照、阴性对照、三对特异性引物和Enzyme Mix；

2、依据流感病毒A型的M基因设计特异性引物为：

AF：5’-ATTCTAACCGAGGTCGAAACGT-3’ 22bp，

AR：5’-GACAAAGCGTCTACGCTGCAGTC-3’23bp；

依据流感病毒B型的NS基因设计特异性引物为：

BF：5’-AGGGACATGAACAACAAAGATT-3’ 22bp，

BR：5’-GATGTCAGCTATTATGGAGCTC-3’ 22bp；

依据流感病毒甲型H1N1型的HA基因设计特异性引物为：

H1N1F：5’-AAATAACATTMGAAGCAACTGGT-3’23bp，

H1N1R：5’-GAGGCTGGTGTTTATRGCACCC-3’ 22bp。

3、5×RT-PCR Buffer配制：

配置混合后于冰箱-20℃保存；

4、Enzyme Mix配制：

配置混合后于冰箱-20℃保存。

5、病毒核酸的提取：

①首先在缓冲液1、2中加入无水乙醇，分别加入25ml和30ml无水乙醇；在漂洗液中加入30μg/ml carrier RNA。

②取30μl蛋白酶放入1.5ml离心管中。

③将标本(如鼻/咽拭子、液化的痰液、胸水、灌洗液等)取200μl加入此管中，充分混匀。

④再在每管分别加入200μl漂洗液(含30μg/ml carrier RNA)，混匀振荡30s，70℃温育10min。

⑤加入250μl无水乙醇，充分混匀振荡30s，室温裂解5min。

⑥将上述裂解液加入离心柱中，8000rpm，离心1min，弃收集管中的离心液。滤柱仍放回收集管上，将步骤③剩余的混合液全部吸入滤柱中，离心后弃离心液。

⑦滤柱中加入500μl缓冲液1，12000rpm，离心1min，弃收集管中的离心液。

⑧另取一支干净的2ml收集管，将离心后的滤柱移到新的收集管上，于滤柱中加入500μl缓冲液2，12000rpm，离心1min。重复步骤⑧一次。

⑨将滤柱移到一个干净的收集管中，12000rpm，离心3min，后将滤柱放在37℃15min以干燥滤膜。

⑩将滤柱放在1.5ml Eppendorf管上，向滤柱中加入50ulRNase-free H₂O，室温静置2min。12000rpm，离心2min，收集离心液即为提取的核酸。

6、一步RT-PCR扩增(每份25ul体系)

取5ul病毒核酸作为模板，同时加入20ul一步RT-PCR反应液至PCR管中进行PCR扩增。

A、一步RT-PCR反应液(mix)的配制：

B、一步RT-PCR反应程序：

a、50℃    30min

b、95℃    5min

c、94℃    30s

d、60℃    30s

e、72℃    1min

f、Go to c，45个循环；

C、检测仪器：

本发明使用ABI Veriti Thermal Cycler PCR仪进行检测。

D、结果判断：

所得到的DNA产物，使用2％的琼脂糖凝胶跑电泳，使用照胶仪来分析检测。

胶块有1个泳道只有一条带显示为230bp，则判断为流感病毒A型；

胶块有3个泳道有两条带显示，其中一条显示为230bp，另外一条为155bp，则判断为甲型H1N1流感病毒；

胶块有2个泳道只有一条带显示为505bp，则判断为流感病毒B型。

最终，12份疑似流感病毒感染患者咽拭子标本中检出流感病毒A型阳性1例，流感病毒B型阳性2例，流感病毒甲型H1N1型阳性3例，检出率为100％。

二、实施例2

用上述方法对另外20份疑似流感病毒感染患者痰液标本进行检测，检出流感病毒A型阳性2例，流感病毒B型阳性4例，流感病毒甲型H1N1型阳性5例，检出率为100％。

序列表

<110> 武汉大学

<120> 流感病毒一步RT-PCR检测试剂盒

<140>

<141>

<160> 6

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213>流感病毒A型上游引物

<400>

5'-ATTCTAACCGAGGTCGAAACGT-3'。                            

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213>流感病毒A型下游引物

<400>

5'-GACAAAGCGTCTACGCTGCAGTC-3'。                             

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213>流感病毒B型上游引物

<400>

5'-AGGGACATGAACAACAAAGATT-3'。

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213>流感病毒B型下游引物

<400>

5'-GATGTCAGCTATTATGGAGCTC-3'。

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213>甲型H1N1型流感病毒上游引物

<400>

5'-AAATAACATTMGAAGCAACTGGT-3'。

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213>甲型H1N1型流感病毒下游引物

<400>

5'-GAGGCTGGTGTTTATRGCACCC-3'。

Claims (1)

1.一种流感病毒一步RT-PCR检测试剂盒，其特征在于：

本试剂盒包括一步5xRT-PCR Buffer、阳性对照、阴性对照、三对特异性引物和Enzyme Mix；

①依据流感病毒A型的M基因设计特异性引物

AF：5’-ATTCTAACCGAGGTCGAAACGT-3’ 22bp，

AR：5’-GACAAAGCGTCTACGCTGCAGTC-3’23bp；

依据流感病毒B型的NS基因设计特异性引物

BF：5’-AGGGACATGAACAACAAAGATT-3’22bp，

BR：5’-GATGTCAGCTATTATGGAGCTC-3’22bp；

依据流感病毒甲型H1N1型的HA基因设计特异性引物

H1N1F：5’-AAATAACATTMGAAGCAACTGGT-3’23bp，

H1N1R：5’-GAGGCTGGTGTTTATRGCACCC-3’ 22bp；

②阳性对照

分别连接有设计流感病毒A、B型、甲型H1N1型引物的基因保守序列的pGBKT-7克隆载体；

③阴性对照

RNase Free H₂O；

④5×RT-PCR Buffer配制

配置混合后于冰箱-20℃保存；

⑤Enzyme Mix配制

配置混合后于冰箱-20℃保存。