CN102154515A - 人类疱疹病毒6型实时荧光定量pcr试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明是人类疱疹病毒6型实时荧光定量PCR试剂盒，涉及生物技术领域中的PCR试剂盒。本试剂盒包括人类疱疹病毒6型的一对特异性引物、一条特异性荧光探针、阳性对照、阴性对照、5×PCR Buffer和Enzyme Mix；设计特异性引物：F：5'-ACAAAGCGAAATTATCCAGAGCGT-3'；R：5'-GCGCTAGGTTGAGGATGATCGC-3'；设计特异性探针：FP:5'FAM-ACACCAGACGTCACACCCGAAGGAATT-TAMARA3'。本发明检测周期短、效率高；检测病毒特异性强，准确率高；病毒定性分析的同时还能定量分析；灵敏度比普通PCR和免疫学检测方法高；操作简单、易于推广；实验结果重复性好。

Description

人类疱疹病毒6型实时荧光定量PCR试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域中的PCR((Polymerase Chain Reaction，聚合酶链反应)试剂盒，尤其涉及一种人类疱疹病毒6型实时荧光定量PCR试剂盒。

背景技术

人类疱疹病毒6型(Human Herpers Viruses，HHV-6)，属疱疹病毒科β亚科，线状双链DNA病毒。人类疱疹病毒6型是一种普遍存在的病原体，1986年该病毒株在一个患淋巴组织增生病的病人身上分离出来。血清流行病学调查显示人类疱疹病毒6型在人群中是高度流行的，主要的感染人群是6个月到2岁的婴幼儿。病毒感染导致婴幼儿发热和出疹，偶尔还会引起脑膜炎或者慢性肝炎等。

在免疫功能正常的成年人中，人类疱疹病毒6型病因已被提出几个病理实体，如脑炎、爆发性肝炎、慢性疲劳综合症，还有最近的多发性硬化症。大量的证据表明，人类疱疹病毒在有免疫缺陷的病人可能扮演着一种机会性致病特征，特别是在有骨髓或者器官移植经历的人群中。此外，人类疱疹病毒6型可能作为一种辅因子在人类免疫缺陷感染转向晚期AIDS的进程中扮演着重要的作用。

尽管有越来越多的临床报告，不管怎样，疱疹病毒6型与其它疾病的联系尚不明确，主要是由于急性人疱疹病毒6型感染缺乏可靠的标记。事实上，抗人类疱疹病毒免疫球蛋白G抗体的血清测定只有有限的价值，这是由于人类疱疹病毒在人群中感染的高患病率和抗原与其它疱疹病毒的交叉感染，如人类巨细胞病毒和人类疱疹病毒7等。虽然抗人类疱疹病毒IgM抗体滴度要么广泛的发生作用，要么特异性的识别病毒抗原p41，缺乏稳定性。类似于IgG抗体滴定的定性PCR技术在对外周血白细胞进行检测时，不能检测出潜伏于大多数健康人群中的病毒感染，只有定量PCR技术可能适用于体液中人类疱疹病毒6型病毒DNA的检测。

在此，我们开发了一种新型可靠的PCR技术来检测细胞组织液或者体液中的人类疱疹病毒6型。这项技术，依托实时荧光定量PCR，即一个步骤结合了检测和计算机辅助定量的PCR扩增反应，因此一个可靠和实用的PCR技术将适用于临床上大数量样本的检测。

发明内容

本发明的目的就在于提供一种人类疱疹病毒6型实时荧光定量PCR试剂盒。

本发明的目的是这样实现的：

1、人类疱疹病毒6型实时荧光定量PCR试剂盒(简称试剂盒)

本试剂盒是在对人类疱疹病毒6型核酸序列分析的基础上，选取保守基因序列设计出一对特异性引物和一条特异性的荧光探针，利用实时荧光定量PCR技术对人类疱疹病毒6型进行检测。此技术不仅缩短了操作时间，减少了污染，也降低了样品诊断的成本，具有潜在的应用价值。

在按下述方法设计的引物和探针存在下，在荧光定量PCR仪中，对病毒核酸进行PCR扩增，来实现对人类疱疹病毒6型的检测。

具体地说，本试剂盒包括人类疱疹病毒6型的一对特异性引物(F和R)、一条特异性荧光探针(FP)、阳性对照、阴性对照、5×PCR Buffer和Enzyme Mix；

①人类疱疹病毒6型的一对特异性引物(F和R)

依据HHV6的U67开放阅读框设计特异性引物：

F：5’-ACAAAGCGAAATTATCCAGAGCGT-3’  24bp

R：5’-GCGCTAGGTTGAGGATGATCGC-3’    22bp

②人类疱疹病毒6型的一条特异性荧光探针(FP)

依据HHV6的U67开放阅读框设计特异性探针：

FP：5’FAM-ACACCAGACGTCACACCCGAAGGAATT-TAMARA3’27bp

荧光探针5’端标记荧光报告基团FAM，3’端标记荧光淬灭基团TAMARA。

③阳性对照

人类疱疹病毒6型标准品

④阴性对照

RNase Free H₂O

⑤5×PCR Buffer配制：

配置混合后于冰箱-20℃保存。

⑥Enzyme Mix配制：

配置混合后于冰箱-20℃保存。

2、本试剂盒的使用方法

①病毒核酸的提取：

A、首先在缓冲液1、2中加入无水乙醇，分别加入25ml和30ml无水乙醇；在漂洗液中加入30μg/ml carrier RNA；

B、取30μl蛋白酶放入1.5ml离心管中；

C、将标本(如疱疹液等)取200μl加入此管中，充分混匀；

D、再在每管分别加入200μl漂洗液(含30μg/ml carrier RNA)，混匀振荡30s，70℃温育10min；

E、加入250μl无水乙醇，充分混匀振荡30s，室温裂解5min；

F、将上述裂解液加入离心柱中，8000rpm，离心1min，弃收集管中的离心液。滤柱仍放回收集管上，将步骤③剩余的混合液全部吸入滤柱中，离心后弃离心液；

G、滤柱中加入500μl缓冲液1，12000rpm，离心1min，弃收集管中的离心液；

H、另取一支干净的2ml收集管，将离心后的滤柱移到新的收集管上，于滤柱中加入500μl缓冲液2，12000rpm，离心1min，重复步骤⑧一次；

I、将滤柱移到一个干净的收集管中，12000rpm，离心3min，后将滤柱放在37℃15min以干燥滤膜；

J、将滤柱放在1.5ml Eppendorf管上，向滤柱中加入50ulRNase-free H₂O，室温静置2min。12000rpm，离心2min，收集离心液即为提取的核酸。

②实时荧光定量PCR扩增(每份25ul体系)

取5ul病毒核酸作为模板，同时加入20ul实时荧光定量PCR反应液至八联管中进行荧光定量PCR扩增。

A、实时荧光定量PCR反应液(mix)的配制：

B、一步实时荧光定量PCR反应程序：

a、90℃                            2min

b、95℃                            5min

c、65℃                            15s

d、58℃                            1min

e、Go to c，40个循环。

C、检测仪器：

本发明使用LightCycle 480II荧光定量PCR仪，在FAM通道进行检测。

D、结果判断：

在荧光定量PCR仪运转正常，阴性对照和阳性对照均正常的情况下，

(1)当C_t≤35时，判断样品为HHV6阳性；

(2)当35＜C_t≤40时，重复一次实验，如果C_t≤40就判断样品为HHV6阳性，否则为阴性；

(3)当C_t＞40时，判断样品为HHV6阴性。

本发明具有下列优点和积极效果：

①检测周期短、效率高；

②检测病毒特异性强，准确率高；

③病毒定性分析的同时还能定量分析；

④灵敏度比普通PCR和免疫学检测方法高；

⑤操作简单、易于推广；

⑥实验结果重复性好。

附图说明

图1是人类疱疹病毒6型阳性标本扩增曲线。

具体实施方式

下面结合附图和实施例详细说明：

1、实施例1---人类疱疹病毒6型实时荧光定量PCR试剂盒

1)试剂盒的组成：

一对特异性引物F和R、一条特异性荧光探针FP、HSV型阳性对照、RNase FreeH₂O阴性对照、5xPCR Buffer、Enzyme Mix

2)人类疱疹病毒6型的特异性扩增基因序列设计引物为：

依据HHV6的U67开放阅读框设计特异性引物为：

F：5’-ACAAAGCGAAATTATCCAGAGCGT-3’ 24bp

R：5’-GCGCTAGGTTGAGGATGATCGC-3’   22bp

扩增的基因序列总长度为133bp；

依据HHV6的U67开放阅读框设计特异性探针为：

FP：5’FAM-ACACCAGACGTCACACCCGAAGGAATT-TAMARA3’27bp

3)5xPCR Buffer配制：

配置混合后于冰箱-20℃保存；

4)Enzyme Mix配制：

配置混合后于冰箱-20℃保存；

5)病毒核酸的提取：

①首先在缓冲液1、2中加入无水乙醇，分别加入25ml和30ml无水乙醇；在漂洗液中加入30μg/ml carrier RNA；

②取30μl蛋白酶放入1.5ml离心管中；

③将标本(如疱疹液等)取200μl加入此管中，充分混匀；

④再在每管分别加入200μl漂洗液(含30μg/ml carrier RNA)，混匀振荡30s，70℃温育10min；

⑤加入250μl无水乙醇，充分混匀振荡30s，室温裂解5min；

⑥将上述裂解液加入离心柱中，8000rpm，离心1min，弃收集管中的离心液。滤柱仍放回收集管上，将步骤③剩余的混合液全部吸入滤柱中，离心后弃离心液；

⑦滤柱中加入500μl缓冲液1，12000rpm，离心1min，弃收集管中的离心液；

⑧另取一支干净的2ml收集管，将离心后的滤柱移到新的收集管上，于滤柱中加入500μl缓冲液2，12000rpm，离心1min；重复步骤⑧一次；

⑨将滤柱移到一个干净的收集管中，12000rpm，离心3min，后将滤柱放在37℃15min以干燥滤膜；

⑩将滤柱放在1.5ml Eppendorf管上，向滤柱中加入50ulRNase-free H₂O，室温静置2min。12000rpm，离心2min，收集离心液即为提取的核酸。

6)实时荧光定量PCR扩增(每份25ul体系)

取5ul病毒核酸作为模板，同时加入20ul一步实时荧光定量PCR反应液至八联管中进行荧光定量PCR扩增。

a)实时荧光定量PCR反应液(mix)的配制：

b)实时荧光定量PCR反应程序：

①90℃                    2min

②95℃                    5min

③65℃                    15s

④58℃                    1min

⑤Go to 3，40 cycles

步骤③开始开始荧光检测。

c)检测：

本发明使用LightCycle 480II荧光定量PCR仪进行检测。

d)结果判断：

在荧光定量PCR仪运转正常，阴性对照和阳性对照均正常的情况下，

①当C_t≤35时，判断样品为HHV6阳性；

②当35＜C_t≤40时，重复一次实验，如果C_t≤40就判断样品为HHV6阳性，否则为阴性；

③当C_t＞40时，判断样品为HHV6阴性。

2、实施例2---临床检测

用上述方法对40例临床样品进行检测，检出阳性标本12例，检出阳性率30％，能对人类疱疹病毒6型进行快速准确的检测，远远优于抗原抗体检测，具体扩增曲线见图1，本发明具有灵敏度高，特异性好，快速，准确，可以替代一直沿用的抗原检测等诊断方法。在提取病毒核酸时使用的硅基质核酸吸附柱能保证核酸的纯度，减少了污染，也降低了样品诊断的成本，具有潜在的应用价值。

序列表

<110> 武汉大学

<120> 人类疱疹病毒6型实时荧光定量PCR试剂盒

<140>

<141>

<160> 3

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人类疱疹病毒6型的上游引物

<400>

5'-ACAAAGCGAAATTATCCAGAGCGT-3'。      

                          

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213>人类疱疹病毒6型的下游引物

<400>

5'-GCGCTAGGTTGAGGATGATCGC-3'。

                            

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 荧光探针序列

<400>

5'FAM-ACACCAGACGTCACACCCGAAGGAATT-TAMARA3'。

Claims (1)

1.一种人类疱疹病毒6型实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：

本试剂盒包括人类疱疹病毒6型的一对特异性引物、一条特异性荧光探针(FP)、阳性对照、阴性对照、5×PCR Buffer和Enzyme Mix；

①人类疱疹病毒6型的一对特异性引物

依据HHV6的U67开放阅读框设计特异性引物：

F：5’-ACAAAGCGAAATTATCCAGAGCGT-3’，

R：5’-GCGCTAGGTTGAGGATGATCGC-3’；

②人类疱疹病毒6型的一条特异性荧光探针

依据HHV6的U67开放阅读框设计特异性探针：

FP：5’FAM-ACACCAGACGTCACACCCGAAGGAATT-TAMARA3’；

荧光探针5’端标记荧光报告基团FAM，3’端标记荧光淬灭基团TAMARA；

③阳性对照

人类疱疹病毒6型标准品；

④阴性对照

RNase Free H₂O；

⑤5×PCR Buffer配制

配置混合后于冰箱-20℃保存；

⑥Enzyme Mix配制

配置混合后于冰箱-20℃保存。

Images