CN106834540B - 用于高致病性h7禽流感病毒检测的试剂、方法和应用 - Google Patents

用于高致病性h7禽流感病毒检测的试剂、方法和应用 Download PDF

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Abstract

本申请公开了一种用于高致病性H7禽流感病毒检测的试剂、方法和应用。本申请用于高致病性H7禽流感病毒检测的试剂，包括引物对和/或探针，引物对和/或探针针对高致病性H7禽流感病毒的特异识别序列而设计，特异识别序列为Seq ID No.1所示序列，或Seq ID No.1所示序列反向互补序列，或者Seq ID No.1所示序列或Seq ID No.1所示序列反向互补序列的同义突变序列或1‑4个碱基取代的序列。本申请的试剂，能有效区分高致病性H7禽流感病毒和低致病性H7禽流感病毒，为及时采取有效的防控措施提供了技术支撑与指导，减少了因无法区分H7禽流感致病性高低而造成的畜禽养殖业的经济损失。

Description

用于高致病性H7禽流感病毒检测的试剂、方法和应用
技术领域
本申请涉及禽流感病毒检测领域，特别是涉及一种用于高致病性H7禽流感病毒检测的试剂、方法和应用。
背景技术
禽流感是由甲型流感病毒的一种亚型，即禽流感病毒，引起的一种急性传染病，也能感染人类，被国际兽疫局定为甲类传染病。H7亚型禽流感病毒是一种新型的禽流感病毒，可感染禽和人；其中比较出名的就是H7N9毒株。根据世界卫生组织(WHO)报告统计，自2013年3月中国首次报道人感染H7N9亚型禽流感以来，截止到2017年1月18日，共有918例人感染H7N9亚型禽流感实验室确诊病例，死亡率超过10％。2016年入冬以来，我国出现人感染该亚型病毒病例数直线上升的情况，特别是2016年12月的最后两周，全国新增人间病例92例，死亡10例，这说明该亚型病毒对人的健康威胁仍然很大。活禽零售市场环境污染率与人感染病例数在时空维度表现一致，即随着污染水平升高，人的感染风险也增加。值得关注的是，2015年-2016年间报告人感染病例数位居前列的广东、浙江、江苏、福建等省份市也已在养鸡场中发现H7N9亚型禽流感病毒。虽然目前只是散发，但对其流行态势要高度关注。
H7禽流感病毒包括H7N9毒株虽然对禽和人都能够感染，但是，本申请人在对H7禽流感病毒进行研究的过程中发现，H7禽流感病毒又分为高致病性毒株和低致病性毒株。低致病性毒株H7禽流感病毒对家禽或人的致病性很低或者根本无致病性。而现有的检测鉴定方法通常只能够鉴定出H7亚型和N亚型，无法对H7禽流感病毒的高致病性毒株和低致病性毒株进行区分。
发明内容
本申请的目的是提供一种用于高致病性H7禽流感病毒检测的试剂、检测方法和应用。
本申请采用了以下技术方案：
本申请的一方面公开了一种用于高致病性H7禽流感病毒检测的试剂，该试剂包括引物对和/或探针，其引物对和/或探针针对高致病性H7禽流感病毒的特异识别序列而设计，特异识别序列为Seq ID No.1所示序列，或者Seq ID No.1所示序列反向互补序列，或者Seq ID No.1所示序列或Seq ID No.1所示序列反向互补序列的同义突变序列或1-4个碱基取代的序列；
Seq ID No.1：5’-AAACGGACTGCG-3’。
需要说明的是，本申请的发明人在对禽流感病毒进行大量的检测和研究过程中发现，H7禽流感病毒，即H7亚型禽流感病毒，存在高致病性和低致病性两种情况，通过比较高致病性毒株和低致病性毒株，发现其H基因存在突变，即高致病性H7禽流感病毒的H基因上多了一段Seq ID No.1所示序列，即高致病性H7禽流感病毒的特异识别序列；基于该研究发现，本申请提出了特异性检测高致病性H7禽流感病毒检测的试剂，该试剂是针对高致病性H7禽流感病毒的特异识别序列而设计的特异性的引物对和/或探针。
还需要说明的是，具体引物或探针的设计，可以参考现有的引物和探针设计方案或软件，在此不做具体限定。可以理解，针对Seq ID No.1所示序列，或者Seq ID No.1所示序列反向互补序列，或者Seq ID No.1所示序列或Seq ID No.1所示序列反向互补序列的同义突变序列或1-4个碱基取代的序列，可以设计高致病性H7禽流感病毒的特异性引物对或者探针；但是，严谨的来说，所设计的引物对或探针还必须经过常规的BLSAT比对或者试验才能确定其特异性。本申请的关键在于高致病性H7禽流感病毒的特异识别序列的发现，按照常规的引物或探针设计方案，针对该特异识别序列可以设计出多对引物或探针，在此不做具体限定。
需要补充说明的是，本申请针对高致病性H7禽流感病毒的特异识别序列设计的引物对或探针，两者可以配对使用也可以不配对使用，就本申请而言，两者是不配对使用的。可以理解，本申请的特异识别序列只有12bp长度，如果针对该特异识别序列设计了引物，则可能没有探针的设计位点；因此，本申请的引物对或探针通常不配对使用；针对该特异识别序列设计引物对可以特异性的PCR扩增检测高致病性H7禽流感病毒；针对该特异识别序列设计探针，则需要配合H7禽流感病毒的常规引物进行实时荧光RT-PCR检测。
优选的，本申请设计的引物对和/或探针的序列中含有Seq ID No.1所示序列、SeqID No.1所示序列反向互补序列，或者Seq ID No.1所示序列或Seq ID No.1所示序列反向互补序列的同义突变序列或1-4个碱基取代的序列；Seq ID No.1：5’-AAACGGACTGCG-3’。
可以理解，针对高致病性H7禽流感病毒的特异性的Seq ID No.1所示序列，可以设计特异性引物对，也可以设计特异性探针；只要引物对和/或探针的序列中含有Seq IDNo.1所示序列能够保障特异性检测即可。其中，引物对的序列中含有Seq ID No.1所示序列，具体来说，只要引物对的上游引物或者下游引物中含有Seq ID No.1所示序列即可，在此不做具体限定。
需要说明的是，在病毒RNA的检测中，通常采用RT-PCR，即先将RNA转录成DNA，然后再进行PCR扩增；而PCR扩增通常是双链扩增，因此，引物对和/或探针的序列中含有的也可以是Seq ID No.1所示序列反向互补序列。此外，可以理解，在设计引物或探针对靶标进行检测时，1-4个碱基取代，并不会对特异性检测造成太大影响，因此，所设计的引物或探针里面可以包含完整的Seq ID No.1所示序列，也可以是其1-4个碱基取代的序列。在设计特异性引物时，甚至只需要引物的5’端的末位1-4个碱基是Seq ID No.1所示序列或者反向互补序列的一段即可保障特异性扩增；但是，在本申请优选的方案中，是将Seq ID No.1所示序列或其反向互补序列设计为特异性探针。
优选的，本申请的试剂包括通用引物对和特异性探针，通用引物对的上游引物为Seq ID No.2所示序列，下游引物为Seq ID No.3所示序列，特异性探针为Seq ID No.4所示序列；
Seq ID No.2：5’-GCAACAGGGATGAAGAATGTTCC-3’
Seq ID No.3：5’-CCATACCAACCATCAATTAGGCC-3’
Seq ID No.4：5’-GAGAAAACGGACTGCGAGAGGCC-3’。
需要说明的是，本申请的通用引物对并非针对高致病性H7禽流感病毒的特异识别序列而设计，只是H7禽流感病毒的扩增引物；而Seq ID No.4所示序列的特异性探针才是针对高致病性H7禽流感病毒的特异识别序列而设计的，能够特异性的检测出高致病性H7禽流感病毒。
优选的，特异性探针的5’端具有FAM荧光基团，3’端具有BHQ1淬灭基团。
本申请的另一面公开了本申请的试剂在高致病性H7禽流感病毒检测中的应用。
本申请的另一面公开了一种高致病性H7禽流感病毒检测的方法，包括对待测禽流感病毒的核酸样品进行特异性PCR扩增，或者核酸测序确认待测禽流感病毒的核酸样品序列中是否含有高致病性H7禽流感病毒的特异识别序列，该特异识别序列即Seq ID No.1所示序列，也可以是Seq ID No.1所示序列反向互补序列，或者Seq ID No.1所示序列或SeqID No.1所示序列反向互补序列的同义突变序列或1-4个碱基取代的序列。
其中，特异性PCR扩增即针对Seq ID No.1所示序列设计的特异性PCR引物对或探针的PCR扩增，优选的，即采用本申请的试剂对待测禽流感病毒的核酸样品进行特异性PCR扩增。
可以理解，Seq ID No.1所示序列是高致病性H7禽流感病毒的特异识别序列，因此，除了针对这段序列设计特异性引物对或探针以外，也可以采用常规的测序方法，测定待测禽流感病毒的核酸样品中是否含有Seq ID No.1所示序列，或者Seq ID No.1所示序列反向互补序列，或者Seq ID No.1所示序列或Seq ID No.1所示序列反向互补序列的同义突变序列或其1-4个碱基取代的序列，即可判断待测禽流感病毒是否为高致病性H7禽流感病毒。
本申请的再一面公开了一种高致病性H7禽流感病毒的特异识别序列，该特异识别序列为Seq ID No.1所示序列、Seq ID No.1所示序列反向互补序列，或者Seq ID No.1所示序列或Seq ID No.1所示序列反向互补序列的同义突变序列或1-4个碱基取代的序列。
本申请的再一面公开了本申请的特异识别序列在高致病性H7禽流感病毒检测中的应用，该应用包括针对特异识别序列设计引物或探针，或者设计通用引物对特异识别序列进行核酸测序检测。
需要说明的是，在发现一个新的特异识别序列后，通常可以采用两种方式对其进行检测，一种即针对特异识别序列设计特异性引物对和/或探针，进行特异性PCR扩增，包括常规PCR、实时荧光PCR等；另一种即通过测序检测特异识别序列。
本申请的有益效果在于：
本申请的试剂中，其引物对或探针特异性的针对高致病性H7禽流感病毒的特异识别序列而设计，能够有效的区分高致病性H7禽流感病毒和低致病性H7禽流感病毒，为政府部门及时采取有效的防控措施提供了技术支撑与指导，减少了因无法区分H7禽流感病毒致病性的高低而造成的畜禽养殖业的经济损失。本申请的试剂和方法对于控制高致病性H7禽流感病毒的流行、减少经济损失、最大限度的保护全社会人群的健康和生命安全具有重大意义。
附图说明
图1是本申请实施例中高致病性H7禽流感病毒的特异性检测结果；
图2是本申请实施例中高致病性H7禽流感病毒的灵敏度检测结果。
具体实施方式
本申请人对禽流感病毒的长期检测和研究发现，2013年至2016年H7禽流感病毒在HA上主要发生了8个氨基酸位点的变化，并且呈逐年递增趋势。特别值得注意的是，有个别分离自养鸡场毒株的HA裂解位点处已出现2个或4个连续碱性氨基酸的插入，呈现有向强毒裂解位点逐步演变的明显趋势，很有可能在家禽中引起高致病性禽流感的爆发，而H7亚型禽流感病毒高致病性的出现也将对人感染H7亚型禽流感病毒，例如H7N9，带来极大风险。目前国际上尚没有高致病性H7禽流感病毒及其检测方法的研究和报道。为此，本申请人通过比较分析分离获得的高致病性的H7禽流感病毒和低致病性H7禽流感病毒的核酸序列，发现高致病性H7禽流感病毒的H基因上具有一段特异性序列，即Seq ID No.1所示序列，通过对这段序列进行特异性引物对或探针设计，可以特异性的检测出高致病性H7禽流感病毒，从而将其与低致病性H7禽流感病毒区分开来。
下面通过具体实施例对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。
实施例一
本例根据Seq ID No.1所示序列的高致病性H7禽流感病毒特异识别序列设计了特异性检测探针，对高致病性H7禽流感病毒实进行时荧光RT-PCR检测，详细如下。
(1)样品RNA的提取
本例分别提取了H1亚型禽流感病毒、H3亚型禽流感病毒、H4亚型禽流感病毒、H5亚型禽流感病毒、H6亚型禽流感病毒、H8亚型禽流感病毒、H9亚型禽流感病毒、H11亚型禽流感病毒、高致病性H7亚型禽流感病毒、低致病性H7亚型禽流感病毒、新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡传染性喉气管炎病毒和呼肠孤病毒的RNA，进行试验。所有病毒样品均由华南农业大学提供。RNA提取方法如下：
①取1.5mL灭菌无RNA酶的干净离心管，加入600μl Trizol裂解液，然后加入200μL经前处理的样品液，吸打混匀，再加入200μL氯仿，振荡混匀，静置5min，12000rpm离心10min。
②吸取管中的上层液相转移至新的无RNA酶污染的离心管中，加入400μL-20℃预冷的异丙醇，颠倒混匀，静置5min，12000rpm离心10min。
③轻轻倒去上清，将离心管倒置于吸水纸上，凉干，加入750μL 75％乙醇，颠倒洗涤，12000rpm离心5min，轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，尽量吸干液体，室温干燥1-5min。
④加入15μL DEPC水，轻弹混匀，溶解RNA，经紫外分光光度计测定其纯度和浓度。测定OD260/OD280值均为2.0左右，说明RNA纯度较高符合RT-PCR扩增要求。-20℃以下保存备用。
(2)实时荧光RT-PCR检测引物与探针的设计
经鸡胚接种方法分离到高致病性H7禽流感病毒，并进行全基因组测序，与已经披露的禽流感H7亚型毒株进行序列比对分析，发现高致病性H7禽流感病毒具有一段特异性的插入序列变异，即Seq ID No.1所示序列。本例根据Seq ID No.1所示序列设计了特异性检测高致病性H7禽流感病毒的探针，探针序列如Seq ID No.4所示序列，并设计了H7禽流感病毒的扩增引物，上游引物为Seq ID No.2所示序列，下游引物为Seq ID No.3所示序列；
Seq ID No.2：5’-GCAACAGGGATGAAGAATGTTCC-3’
Seq ID No.3：5’-CCATACCAACCATCAATTAGGCC-3’
Seq ID No.4：5’(FAM)-GAGAAAACGGACTGCGAGAGGCC-(BHQ1)3’。
(3)高致病性H7禽流感病毒实时荧光RT-PCR检测
利用设计的引物和特异性探针，以高致病性H7禽流感病毒RNA为模板进行RT-PCR扩增。
实时荧光RT-PCR反应体系为25μL，包括2×real time PCR Buffer(包含有dNTPs，Mg2+等)12.5μL，混合酶1μL，上下游引物F/R各1μL(终浓度为0.4μM)，特异性探针0.4μL(终浓度为0.16μM)，RNA模板2μL，用DEPC水补至25μL。
实时荧光RT-PCR反应程序为：反转录45℃10min，预变性95℃10min；然后进入40次循环：95℃15sec，60℃45sec，60℃时收集荧光信号。
(4)实时荧光RT-PCR的特异性验证
利用所设计的引物与探针，按照(3)的体系和反应程序，对本例提取的RNA样品进行特异性检测，并设置一个水空白对照。RNA样品包括H1亚型禽流感病毒RNA、H3亚型禽流感病毒RNA、H4亚型禽流感病毒RNA、H5亚型禽流感病毒RNA、H6亚型禽流感病毒RNA、H8亚型禽流感病毒RNA、H9亚型禽流感病毒RNA、H11亚型禽流感病毒RNA、高致病性H7亚型禽流感病毒RNA、低致病性H7亚型禽流感病毒RNA、新城疫病毒RNA、鸡传染性支气管炎病毒RNA、鸡传染性喉气管炎病毒RNA、呼肠孤病毒RNA。
检测结果如图1所示，结果显示，只有高致病性H7亚型禽流感病毒RNA样品出现阳性扩增曲线，而其它RNA样品包括低致病性H7亚型禽流感病毒RNA都没有扩增曲线；可见，本例设计的引物和探针具有良好的特异性，能够特异性的检测出高致病性H7亚型禽流感病毒。
(5)实时荧光RT-PCR的灵敏度验证
将提取的高致病性H7亚型禽流感病毒的RNA样品测定核酸浓度，并进行10倍梯度稀释，作为检测样品模板，按(3)的体系和反应程序进行实时荧光RT-PCR。本例分别采用了浓度为0.02ng/μL、2pg/μL、0.2pg/μL、0.02pg/μL、0.002pg/μL、0.2fg/μL和0.02fg/μL的高致病性H7亚型禽流感病毒RNA样品进行灵敏度试验，并设置一个水空白对照。
检测结果如图2所示，图中，1为高致病性H7禽流感病毒RNA浓度0.02ng/μL、2为高致病性H7禽流感病毒RNA浓度2pg/μL、3为高致病性H7禽流感病毒RNA浓度0.2pg/μL、4为高致病性H7禽流感病毒RNA浓度0.02pg/μL、5为高致病性H7禽流感病毒RNA浓度0.002pg/μL、6为高致病性H7禽流感病毒RNA浓度0.2fg/μL、7为高致病性H7禽流感病毒RNA浓度0.02fg/μL；8为水空白对照。图2的结果显示，本例的检测方法，其检测低限至少可达RNA浓度为0.002pg/μL，可见本例的引物、探针和检测方法具有较高的灵敏度。
实施例二
本例在实施例一的基础上，根据Seq ID No.1所示序列的高致病性H7禽流感病毒特异识别序列设计了特异扩增引物对，上游引物为Seq ID No.5所示序列，下游引物为SeqID No.6所示序列，另外设计了一个H7禽流感病毒探针，如Seq ID No.7所示序列；
Seq ID No.5：5’-CCAAAGAGAAAACGGACTGCG-3’
Seq ID No.6：5’-CCATACCAACCATCAATTAGGCC-3’。
Seq ID No.7：5’(FAM)-GGCCTATTTGGTGCTATAGCGGGTT-(BHQ1)3’
需要说明的是，其中Seq ID No.5所示序列的上游引物是针对高致病性H7禽流感病毒的特异识别序列设计的，即Seq ID No.5所示序列的上游引物中包含了Seq ID No.1所示序列，这样可以保障扩增的特异性；至于下游引物和探针则是H7禽流感病毒的扩增和检测探针。采用实施例一相同的方法进行特异性检测。
结果显示，根据高致病性H7禽流感病毒特异识别序列设计的引物对，只对高致病性H7亚型禽流感病毒RNA样品有扩增，而其它RNA样品包括低致病性H7亚型禽流感病毒RNA都没有扩增；可见，本例设计的引物对具有良好的特异性，能够特异性的检测出高致病性H7亚型禽流感病毒。
以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本申请的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 华南农业大学
深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心
<120> 用于高致病性H7禽流感病毒检测的试剂、方法和应用
<130> 17I23993
<160> 7
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
aaacggactg cg 12
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gcaacaggga tgaagaatgt tcc 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ccataccaac catcaattag gcc 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gagaaaacgg actgcgagag gcc 23
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ccaaagagaa aacggactgc g 21
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ccataccaac catcaattag gcc 23
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ggcctatttg gtgctatagc gggtt 25

Claims (3)

1.一种用于高致病性H7禽流感病毒检测的试剂，其特征在于：所述试剂包括通用引物对和特异性探针，所述通用引物对的上游引物为Seq ID No.2所示序列，下游引物为Seq IDNo.3所示序列，所述特异性探针为Seq ID No.4所示序列；
Seq ID No.2：5’- GCAACAGGGATGAAGAATGTTCC-3’
Seq ID No.3：5’-CCATACCAACCATCAATTAGGCC -3’
Seq ID No.4：5’-GAGAAAACGGACTGCGAGAGGCC-3’。
2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于：所述特异性探针的5’端具有FAM荧光基团，3’端具有BHQ1淬灭基团。
3.一种高致病性H7禽流感病毒非诊断治疗目的的检测方法，其特征在于：包括采用权利要求1或2所述的试剂对待测禽流感病毒的核酸样品进行特异性PCR扩增。
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