JPH04505615A - 潜伏性または慢性ウイルス感染の誘導を阻害する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 潜伏性または慢性ウィルス感染の誘導を阻害する方法発明の背景 本発明は、潜伏性または慢性に感染した細胞におけるウィルスの、活発に複製を 行なう型への誘導を阻害するための方法を目的とするものである。

レトロウィルスは、その生活環において通常の遺伝情報の流れ（ＤＮＡからｍ　 ＲＮ　Ａへ、次いで蛋白へ）が逆転していることからこのように命名された。細 胞において遺伝学的物質はＤＮＡであって、遺伝子が発現されるとき、このＤＮ ＡがまずメツセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に転写され、次にこのｍＲＮＡが蛋 白産生のための鋳型の役割をする。ところがレトロウィルスの遺伝子はＲＮＡ中 にコードされており、この遺伝子は、発現される前にＤＮＡに変換されねばなら ない。その場合にのみこのウィルス遺伝子は通常の流れの中でｍＲＮＡに転写さ れ、蛋白に翻訳される。

レトロウィルスは、細胞の外側に結合し、ウィルスの芯を注入することによって 細胞に感染する。この芯は、ウィルスゲノム並びに構造蛋白（ｇａｇ遺伝子）、 ウィルスの酵素及び調節蛋白（ｔ　ａ　ｔ。

ｒｅｖ、ｎｅｆ）をコードしているＲＮＡを含む。一つの酵素はウィルスの遺伝 情報をＤＮＡに変換する働きを行なう。このＤＮＡポリメラーゼ（ｐ○１遺伝子 ）は、まずウィルスＲＮＡの一重鎖ＤＮＡコピーを作成する。付随する酵素リボ ヌクレアーゼが元のＲＮＡ）　を破壊し、ポリメラーゼは最初のＤＮＡを鋳型と して使用して第二のＤＮＡ鎖を作成する（このポリメラーゼ及びリボヌクレアー ゼは、しばしばまとめて「逆転写酵素」と呼ばれる）。かくして二本ｆｌｌｌｌ ＤＮＡの形（細胞が自身の遺伝子を担っているのと同じ形）となったウィルスゲ ノムは細胞の核に移動する。次いで、インテグラーゼと呼ばれる第三のウィルス 酵素が、ウィルスゲノム（その遺伝情報の完全な相補体）を宿主細胞のＤＮＡ中 に挿入することができる。いったんこのように組み込まれると、ウィルスＤＮＡ （ｒプロウィルス」）は、細胞が分裂する度にその細胞自身の遺伝子と共に複製 されるであろう。このように確立されると、感染は、その細胞の永続的一部分と なる。この潜伏性のまたは慢性の感染相の間は、一般に新たなウィルス粒子は生 産されない。

このウィルスＤＮＡの長末端反復（ＬＴＲ）領域中のヌクレオチド配列が、宿主 細胞に属する酵素に、統合されたウィルスのＤＮＡをＲＮＡへと複製するよう指 令したときに、新たなウィルス粒子（ピリオン）の生産が始まる。ＲＮＡの幾ら かは、新しい世代のウィルスのための遺伝情報を提供するであろう。この他の成 るＲＮＡ鎖は、細胞という装置を新たなウィルスの構造蛋白及び酵素の生産へと 導（ｍＲＮＡとしての役割を果たす。潜伏性のプロウィルス期から活発な複製期 へのウィルスの変換を、誘導またはレスキューと称する。

レトロウィルスの他にも、ヘルペスウィルス及びＢ型肝炎ウィルスといった他の ウィルスが、潜伏性または慢性感染相及び活発な複製権を伴う同様のサイクルを 有する。

多くのウィルス、とりわけレトロウィルスでは、最初に細胞に感染した後、ウィ ルスゲノムは、いわゆるプロウィルスの形でその細胞の核のＤＮＡ中に統合され る。このプロウィルスは、慢性または潜伏性感染で長期間細胞のＤＮＡの中に統 合されたままとなり得る。

この潜伏性または慢性感染期は、プロウィルス（ウィルス）が誘導され、活発な 複製権に入る時に終了する。しばしば長期の潜伏（または慢性感染）及び活発な 複製権を有するこのような生活環を示す哺乳類のウィルスは、ＡＩＤＳウィルス （ヒト免疫不全ウィルスまたはＨＩＶ）のようなレトロウィルス、種々のヘルペ スウィルス及びＢ型肝炎を包含する。この慢性または潜伏性感染相の最中は、人 間（または動物）は事実上無症候であり、活発な複製権の惨害を被ることは殆ど 無いことから、いったん人間が感染したら、このウィルスをプロウィルス型に維 持し、活発な複製権への変換（誘導またはレスキュー）を阻止するのが好都合で ある。

ＡＩＤＳウィルス、ＨＩＶは、プロウィルス型に維持することが好都合であるウ ィルスの一例である。ＨＩＶによる最初の感染の後、このウィルスはしばしば多 量に複製を行ない、遊離のウィルスが脳及びを髄並びに血流中に現われることが ある。発熱、発疹、インフルエンザ様症候及び時には神経学的愁訴が、このＨＩ Ｖ複製の第−波に随伴し得る。次いで数週間以内に、循環及び脳を髄液中のウィ ルス量が突然低下し、最初の症状が消失する。しかしながらウィルスは依然とし て存在している（主としてプロウィルスの形で）。ウィルスは、Ｔ４リンパ球、 当初その唯一の標的であると考えられていた免疫系細胞のサブセットの中だけで なく、免疫系細胞の他のクラス、神経系及び腸の細胞並びに恐らくは幾らかの骨 髄細胞の中に見いだすことができる。この無症候性期間の開始から約２ないし１ ０年後に、ウィルスの複製が再び突発し、感染は、一般には最終段階である活発 な複製相に入る。

この可変的な感染の経過は、ＨＩＶ及び宿主細胞間の複雑な相互作用が基礎とな っている。このウィルスは、宿主細胞の種類及び細胞自身の活性の度合によって 異なる挙動をする。Ｔ細胞中では、ＨＩＶはいつまでも潜伏状態にあり、細胞か ら離脱できないが、患者の免疫系から隠れている。しかしながら、細胞が刺激さ れる（誘導）と、これは−挙に複製して細胞を破壊し得る。マクロファージと呼 ばれる免疫系細胞及び単球と呼ばれるその前駆体のような他の細胞においては、 ウィルスは、細胞を生かしつつではあるが恐らくその機能に変化を加えながら、 潜伏、または絶えず徐々に成長する事ができる。

ＨＩＶにおいては、ｔａｔとして知られるトランスアクティベーターのための調 節遺伝子が、例えば抗原との遭遇により刺激されたＴ細胞において見られる、ウ ィルス複製の突発の原因となる一つの遺伝子である。ｔａｔ遺伝子は、その構造 及び効果の両面において特異である。これは２個の遠く離れたヌクレオチド配列 から成り立っており、これがｍＲＮＡに転写された後、間にある遺伝学的物質は 、転写が蛋白へと行なわれる前に、スプライシングされて除かれねばならない。

ｔａｔ遺伝子は、非転写物質のスプライスをさせるスプライス／アクセプター（ Ｓ／Ａ）及びスプライス／ドナー（Ｓ／Ｄ）と呼ばれる部位を有する。得られた 小蛋白（ｔａｔ由来）の効果は劇的であって、これは、ウィルス遺伝子の発現レ ベルを基準の発現レベルの１０００倍に増加させることができる。

選択された外来核酸配列に対し相補的な非イオン性オリゴヌクレオシドアルキル −及びアリール−ホスホナート類似体は、その特定の核酸と結合またはこれに干 渉することにより、細胞に存在する他の核酸の機能または発現を妨げる事なく、 特定の核酸の機能または発現を選択的に阻害することができる（例えば米国特許 第４４６９８６３号及び４５１１７１３号参照）。ある状況において、ヘルペス ・シンプレックスウィルス−１を含むウィルス蛋白の合成を阻害するための、哺 乳類の細胞により取り上げられた、相補的ヌクレアーゼ耐性非イオン性オリゴヌ クレオシドメチルホスホナートの使用が、米国特許第４７５７０５５号に開示さ れている。

ウィルスＤＮＡから蛋白への転写及び翻訳を妨げるための、ウィルスｍＲＮＡの 一部分に対し相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはホスホロチオアー ト類似体の使用が提唱された。このアンチセンス構造物は、ウィルスＲＮＡに結 合することができ、細胞のりボゾームがＲＮＡへと移動することを妨げ、これに よって「翻訳の抑止」または「リポゾーム性−ハイブリダイゼーションの抑止」 と呼ばれるｍＲＮＡから蛋白への翻訳の停止をさせると考えられた（ヤーチョア ン等、ｒＡＩＤＳセラピーズ」、サイエンティフィック・アメリカン１１０−１ １９頁（１９８８年１０月）参照）。

ＨＴＬＶ−Ｉ　Ｉ　Ｉの複製及び／または発現ニ必要なＨＴＬＶ−ＩＩＩゲノム の高度保存領域に対し相補的なオリゴヌクレオチドの投与による細胞のＨＴＬＶ −Ｉ　Ｉ　Ｉｇ染の阻止が、米国特許第４８０６４６３号に開示されている。こ のオリゴヌクレオチドは、逆転写酵素活性（複製）及びウィルス蛋白ｐ１５及び ｐ２４の産生（遺伝子の発現）による検定で、ウィルスの複製及び／または遺伝 子の発現に影響することが発見された。

ヌクレオシド間のメチルホスホナート結合を含む幾つかのアンチセンスオリゴデ オキシヌクレオチドがＨＩＶ誘導誘導性シンクチウム形成発現を阻害ｒる能力が 研究された（サリン等、ＰＮＡＳ第８５巻７４４８−７４５１頁（１９８８）） 。

発明の要約 本発明は、ウィルス感染が潜伏性または慢性感染から活発な複製を行なう感染へ と誘導されるのを阻害または制御する方法を目的とする。さらに本発明は、係る ウィルスの誘導の阻害に有用な、新規なメチルホスホナートヌクレオシドオリゴ マー類を目的とするものである。

したがって本発明は、潜伏性または慢性のウィルス感染から活発な複製を行なう 感染への誘導を阻害するためにウィルス感染した細胞を処理する方法であって、 当該細胞またはその増殖環境を、下記に定義されるエンハンサ−サイトに対し相 補的なオリゴマーで処理することからなる方法を目的とする。好適なヌクレオシ ドオリゴマーは、オリゴヌクレオチド、非イオン性オリゴヌクレオシドアルキル −及びアリール−ホスホナート類似体、ホスホロチオアート類似体、オリゴヌク レオチドの中性燐酸エステル類似体、ホスホロアミダート類似体または他のオリ ゴヌクレオチド類似体及び修飾オリゴヌクレオチド類を包含する。

さらに本発明は、単離された細胞、または、その細胞もしくは体液が係る潜伏性 もしくは慢性のウィルス感染を有する、または潜伏性もしくは慢性感染状態に入 ることのできるウィルスを含む、人間または動物の処置を目的とするものである 。

とりわけ本発明方法は、特に悪性の活発な複製相が後に続く潜伏性または慢性感 染の期間を典型的に有する感染の処置に特に適してイル。コノヨウナウイルスハ 、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ−１１などのようなレトロウィルス：ヘルペ スウィルス；Ｂ型肝炎ウィルスなどを包含する。種々のヌクレオシド間燐酸結合 を有するオリゴマーを本発明に従って使用することもできるが、酵素的代謝に対 するこれらの耐性が強いことから、本発明方法には、オリゴヌクレオシドアルキ ル−およびアリール−ホスホナート類似体の使用が特に好ましい。

さらに本発明は、潜伏性及び／または慢性のウィルス感染におけるウィルス複製 の誘導の阻害に際し特に活性な、成る新規なオリゴヌクレオシドメチルホスホナ ート類似体（ｒＭＰ−オリゴマー」）を提供する。

さらに本発明は、慢性もしくは潜伏性感染を維持している、または維持すること のできるウィルスのウィルスＤＮＡのエンハンサ−サイトに、または、該ウィル スＤＮＡに対応するウィルスＲＮＡ配列にハイブリダイズすることのできるオリ ゴマーを提供する。

さらに本発明は、慢性もしくは潜伏性感染を維持している、または維持すること のできるウィルスのためのハイブリダイゼーションプローブであって、少なくと も８個のヌクレオシドからなるオリゴマー（ここで該オリゴマーは、該ウィルス のエンハンサ−サイトに対し実質的に相補的である）を含むプローブを提供する 。

さらに本発明の提供するものは診断法であって、慢性もしくは潜伏性感染を維持 している、または維持することのできるウィルスの被験試料におけるその存在を 検出する方法を含む。

定義 本明細書中使用される以下の語は、これに反する説明的記載のない限り、以下の 意味を有する。

「潜伏性感染」という語は、プロウィルスが宿主細胞の遺伝的核構造体（ＤＮＡ ）の中に統合され、且つ、非統合ウィルスＤＮＡ。

ウィルスＲＮＡ及びウィルス蛋白の無い、ウィルス感染を意味する。

「慢性感染」という語は、宿主細胞の核または細胞質中にプロウィルスまたはウ ィルス物質を有し、且つ、誘導されるまでは、検出可能なウィルスＲＮＡまたは 蛋白を持たない、もしくは殆ど持たないウィルス感染を意味する。

「エンハンサ−サイト」という語は、ウィルスＤＮＡ上のレトロウィルスのＵ３ の全配列、または、ウィルスの複製に影響を及ぼすウィルスＲＮＡの対応配列、 及び、同等の活性を有するヘルペスまたはＢ型肝炎ウィルス中の類似の部位、を 意味する。

「オリゴマー」という語は、オリゴヌクレオチド、非イオン性オリゴヌクレオシ ドアルキル−およびアリール−ホスホナート類似体、オリゴヌクレオチドのホス ホロチオナート類似体、オリゴヌクレオチドのホスホアミダート類似体、中性燐 酸エステルオリゴヌクレオチド類似体、ならびにその他のオリゴヌクレオチド類 似体及び修飾オリゴヌクレオチドを意味する。

「メチルホスホナートオリゴマー」（またはｒＭＰ−オリゴマー」）という語は 、少なくとも一個のメチルホスホナートヌクレオシド間結合がホスホジエステル ヌクレオシド間結合にとってかわっている、ヌクレオシド間燐酸基結合を有する ヌクレオチドオリゴマー（またはオリゴヌクレオチド類似体）を意味する。

「ヌクレオシド」という語はヌクレオンジル単位を包含し、これと互換的に使用 される。

本明細書中に列記される種々のオリゴマー配列において、「ｐ」は、例えばＡｐ Ａにおけるようにホスホジエステル結合を表わし、図面の簡単な説明 第１図は、その誘導が本発明に従って阻害できる、レトロウィルスの一般化した 遺伝学的地図を示す。

第２図はＨＩＶの遺伝学的地図を示す。

第３図は、被験オリゴマーの幾つかに対し相補的な配列の、ＨＩＶゲノムにおけ る位置を示す。

発明の詳細な記述 本発明は、ウィルスＤＮＡ上のエンハンサ−サイトまたはウィルスＲＮＡの対応 配列に対し相補的であり、且つこれと結合するオリゴマーを使用して、ウィルス 感染の誘導を阻害する方法を目的とするものである。

これらのオリゴマーは、ウィルスの核酸の（＋）または「センス」鎖に対し相補 的であるので、「アンチセンスオリゴマー」と呼ばれる。これらのオリゴマーは 、ウィルスの核酸の特定の領域に対し相補的であるよう組み立てられる。したが ってこのようなアンチセンスオリゴマーは、ｔａｔ遺伝子の第一のスプライスア クセプター領域（Ｓ／Ａ−１）に対し相補的である場合は「アンチ−ｔａｔ　Ｓ ／Ａ−ＩＪまたはアンチ−８／Ａ−１と名付けられ、ｔａｔ遺伝子の第二のスプ ライスアクセプター領域（Ｓ／、Ａ−２）に対し相補的である場合は［アンチ− ｔ　ａ　ｔ−Ｓ／Ａ−２Ｊまたはアンチ−８／Ａ−２と名付けられ、ｔａｔの標 的領域（ＴＡＲ）に対し相補的である場合は「アンチ−ＴＡＲＪと名付けられ、 または、ｅｎｖのイニンエーター領域に対し相補的である場合は「アンチ−ｅｎ ｖＪと名付けられるなどである。

好ましいのは少なくとも８個のヌクレオシドを有するオリゴマーであり、通常こ れが所望の核酸配列への特異的結合を可能にする十分な数である。より好ましい のは、約８ないし約４０個のヌクレオチドを有するオリゴマーであり、特に好ま しいのは、約１０ないし約２５個のヌクレオシドを有するオリゴマーである。合 成の容易さ、選ばれた配列に対する特異性、折り畳み及び巻付きのようなオリゴ マー内のヌクレオシド間相互作用を最小限とすることを組み合わせて考慮すると 、約１２ないし約１５個のヌクレオシドを有するオリゴマーが、とりわけ好まし い群を包含する。

好ましいオリゴマー これらのオリゴマーはオリゴリボヌクレオシドまたはオリゴデオキシリポヌクレ オシドを包含し得るが、オリゴデオキシリポヌクレオシドが好ましい。

ヌクレオチドオリゴマー（即ち、天然ヌクレオチドオリゴマー中に存在するホス ホジエステルヌクレオシド間結合を有するもの、及び、他のオリゴヌクレオチド 類似体）を本発明に従って使用することはできるが、好ましいオリゴマーは、オ リゴヌクレオシドアルキル及びアリール−ホスホナート類似体、ホスホロチオア ートオリゴヌクレオシド類似体、ホスホロアミダート類似体及び中性燐酸エステ ルオリゴヌクレオチド類似体を包含する。しかしながら、特に好ましいのは、２ つのヌクレオシドをつなぐホスホジエステル結合の代わりにホスホナート結合を 含んでいる、オリゴヌクレオシドアルキル−及びアリール−類似体である。この ようなオリゴヌクレオシドアルキル及びアリール−ホスホナート類似体の製造並 びに予め選択された核酸配列の発現を阻害するためのこれらの使用は、米国特許 第４４６９８６３．４５１１７１３．４７５７０５５．４５０７４３３、及び４ ５９１６１４号に開示されており、その記載は引用して本明細書の一部としであ る。これらのホスホナート類似体のうち特に好ましい群はメチルホスホナートオ リゴマー類である。

メチルホスホナートオリゴマー（ｒＭＰ−才リゴマ−」）の好マしい合成方法は 、リー・Ｂ、　Ｌ、等、バイオケミストリー第２７巻３１９７−３２０３頁（１ ９８８）及びミラー−Ｐ、　Ｓ、　等、バイオケミストリー第２５巻５０９２− ５０９７頁（１９８６）に記載されており、その記載は引用して本明細書の一部 としである。

好ましいのは、ホスホジエステルヌクレオシド間結合のうち少なくともＩＩＩＩ が３’−５’をつなぐヌクレオシド間メチルホスボニル（ＭＰ）基（またはメチ ルホスホナート）により置換されている、オリゴヌクレオシドアルキル−及びア リール−ホスホナート類似体である。メチルホスホナート結合は、オリゴヌクレ オチドのホスファート基について等配電子である。したがってこれらのメチルホ スホナートオリゴマー（ｒＭＰ−才リゴマ−」）は、相補的ポリヌクレオチドま たは核酸分子の一本鎖領域との相互作用への立体的制約を最小限に呈するべきで ある。メチルホスホニル基は天然に存在する核酸分子には見いだされないため、 これらのＭＰ−才リゴマ−は、種々のヌクレアーゼ及びエステラーゼの働きによ る加水分解に対し、より抵抗性である。成るＭＰ−オリゴマーはヌクレアーゼ加 水分解に対し、より抵抗性であって、培養中の補乳雇の細胞にそのままの形で取 り込まれ、細胞ＤＮＡ及び蛋白合成への特異的阻害効果を発揮することができる （米国特許第４４６９８６３号参照）。

所望ならば、ソラレンのような標識基、化学ルミネセント基、架橋試薬、アクリ ジンのような挿入試薬、または、０−フエナントロ【　リンー銅もしくはＥＤＴ Ａ−鉄のような分子ばさみのようなウィルス核酸の標的部分を開裂し得る基をＭ Ｐ−オリゴマーに組み込むことができる。

好ましいのは、所望の核酸配列への特異的結合をさせるに通常充分な、少なくと も約８個のヌクレオシドを有するＭＰ−オリゴマーである。より好ましいのは、 約８ないし約４０個のヌクレオシドを有するＭＰ−オリゴマーであり、特に好ま しいのは約１０ないし約２５個のヌクレオシドを有するものである。製造の容易 さ、選ばれた配列に対する特異性、並びに折り畳み及び巻付きのようなオリゴマ ー内のヌクレオシド間相互作用を最小限とすることを組み合わせて考慮すると、 特に好ましいのは約１２ないし約１５個のヌクレオシドを有するＭＰ−才リゴマ −である。

特に好ましいのは、５°−ヌクレオシド間結合がホスホジエステル結合であり、 残りのヌクレオシド間結合がメチルホスホニル結合であるＭＰ−オリゴマーであ る。ＭＰ−オリゴマーの５′端にホスホジエステル結合を有することによりオリ ゴマーのキナーゼ標識及び電気泳動が可能となり、さらにはその溶解度が改善さ れる。

上記の特許に開示される方法により、ウィルス核酸の標的領域の配列決定を行な い、これらの領域のセンスストランドに対し相補的なＭＦ−オリゴマーを製造し た。

特に、レトロウィルスにおいては、このウィルスＤＮＡのＵ３のエンハンサ−サ イトまたはこのウィルスＲＮＡ中の対応配列に対し相補的なＭＰ−オリゴマーが 特に好ましいことを、本発明者等は見いだした。一つの好ましいＭＰ−才リゴマ −の群は、以下の配列：ＡＡＡＡＧＡＡＡＡＧＧＧＧＧＧＡＣＴ一 を有する５′ちょうどからＵ３に至る領域の全体または一部分に対し相補的な配 列を含み得る。

本発明の１態様において本発明者らは、ＮＦ−にＢ蛋白と結合するウィルスＤＮ Ａ中のＵ３領域のエンハンサ−サイトの部分またはウィルスＲＮＡ中の対応配列 に対し相補的なＭＰ−才リゴマ−が、たとえその細胞が蛋白キナーゼＣアクティ ベーターであるホルボールミリスタートアセタート（ＰＭＡ）のような強い誘導 剤で処理された場合でも、慢性に感染した細胞中のＨＩＶの誘導を阻害するのに 特に有効であることを見いだした。このようなＭＰ−才リゴマ−は、細胞の増殖 または他の正常な細胞機能を有意に阻害することなく、ウィルスの誘導を阻害す るのに有効であった。この事は、ＨＩＶゲノムのどこか他の領域に対し相補的な ＭＰ−オリゴマーとは対照的であつて、その場合、ＨＩＶによる感染を低下させ る活性は、細胞の増殖及び他の正常な細胞機能を阻害する活性と対応するように 思われた。

このように、成る態様において本発明は、ＨＩＶのエンハンサーサイトに対し相 補的であって、細胞の増殖を有意に阻害することな（、慢性に感染した細胞の誘 導を阻害することのできる、新規なＭＰ−オリゴマーを特徴とする特に、本発明 に係るこのような好ましいＭＰ−オリゴマーの例は、 ｄＴＰＡＨＡ］２ＡＩＩＧＲＴＱｃ１２ｃｍ謹がｌ’ＨＡＨＧ［ここで、ｐ＝ホ スホジエステル結合、上＝メチルホスホナート結合である］ を含む。

ＨＩＶの阻害 一つの態様において本発明は、慢性または潜伏性ＨＩＶ感染を有する細胞におけ るＨＩＶウィルスの誘導を阻害する方法を目的とするものである。

ＡＩＤＳウィルスＨＩＶの異なった領域に対し相補的なヌクレオチドを修飾する 種々の方法が調べられてきた。

かつて、このウィルスの構造遺伝子に対し相補的、または調節遺伝子に対し相補 的なヌクレオチドオリゴマー、または修飾オリゴマーを作成するという２つの戦 略が試みられてきた。ウィルスの調節遺伝子に対し相補的なオリゴマーは、可能 性のある２つの標的：（ａ）特定の遺伝子の開始コドンＡＵＧ及びこれに続く配 列、または（ｂ）Ｓ／Ａで略記されるスプライス／アクセプターサイトとして知 られる部位の付近の配列、を指向するものであり、これらは２つの異なるメツセ ージの発現を同時にブロックできる可能性という、さらなる利点をもたらすもの であった。特定の部位に対し相補的な配列が、そのウィルスに結合し、その発現 を阻害し得るということがわかった。しかしながら、これらの部位に結合しウィ ルスを阻害するオリゴマーは、細胞分割を含む正常な細胞機能を阻害することが わかった。例えば、自律的に（即ち成長因子を添加することな（）増殖するＴ細 胞のセルラインまたはマクロファージセルラインを使用する場合、ウィルスの複 製が５０％ブロックされると、これらの細胞の増殖が５０％ブロックされること がわかった。正常なＴ細胞または他の正常な血液成分においては、これら抗−８ ／Ａオリゴマーは、たとえウィルス核酸配列に特異的なはずであったとしても、 重要な細胞機能に影響を及ぼすと思われる。本発明者等は、これらのオリゴマー 、とりわけウィルスケツムの調節領域に対し相補的なオリゴマーは、ウィルスの Ｓ／Ａ配列に類似の正常なヒトのゲノム中の一致Ｓ／Ａ配列をも阻害すると信す るものである。この作用は、かかるオリゴマーが、一方でウィルスの複製を阻害 しつつ、何故細胞の重要な生活機能を阻害するかを説明するであろう。

本発明方法によれば本発明者等は、ウィルスＲＮＡおよびＤＮＡの両者に結合で きるオリゴマーを使用して、このウィルスの誘導、そしてそれ故に複製を阻害す ることができる。ＨＩＶ及び他のレトロウィルスの遺伝学的材料はＲＮＡである 。いったんウィルスが細胞に感染すると、これは、プロウィルスとして細胞のゲ ノム中に組み込まれる、そのゲノムの二本鎖ＤＮＡの合成をめざす。本発明者等 は、ウィルスＲＮＡの最も遠い下流部分である、Ｕ３領域として知られるウィル スゲノムの領域を標的とすることにした。何故なら、ＲＮＡ中にいったん表現さ れたＤＮＡエンハンサ−サイトに対し相補的なオリゴマーは、ウィルスのメツセ ージに直接結合して逆転写酵素をブロックし、また、もしウィルスＤＮＡ合成が 開始していれば、オリゴマーはこのＤＮＡコピーに結合するであろうからである （これらのウィルスの一つが細胞に感染すると、感染後初めの２ないし３時間以 内にＤＮＡ合成が始まる）。レトロウィルスにおけるウィルス指向のＤＮＡ合成 では、Ｕ３領域が複製され、コピーはウィルスの遺伝子配列のどちらかの端で形 成される。Ｕ３を含む領域はロング・ターミナル・リピートまたはＬＴＲと呼ば れ、ウィルスにとって重要なエンハンサ−サイトを含んでいる。成る細胞のまた はウィルスの蛋白はウィルスＤＮＡのエンハンサ−サイトに結合し、ウィルス複 製の量を移しく増加させる。したがって、これらの蛋白のエンハンサ−サイトへ の結合をブロックできる、これらエンハンサ−サイトに対し相補的なオリゴマー は、慢性または潜伏性ウィルス感染が活発な複製状態へと変換するのを阻害する であろう。ウィルスの複製機構におけるこの初期工程をブロックすることによっ て、本発明者等は逆転写酵素をも同様にブロックできる。ＬＴＲ領域は情報の豹 ４００ｂｐまでと長いため、ＤＮアーゼＩ保護反応を用いて、ウィルスＤＮＡの どのＵ３領域部分が解放され、且つ蛋白により保護されていないか、（ウー・Ｆ ３等、ジャーナル・サブ・パイロロジー第６２巻２１８−２２５頁（１９８８） ）そして故にオリゴマーによる結合に利用できるかを決定した。それらの解放領 域を、本発明者等が他の細胞におけるウィルスの複製に関連すると信する領域と 比較することにより、本発明者等は成る領域を選択し、これらの領域に対し相補 的なオリゴマーを作成した。本発明者等は、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方の型のオ リゴマーを結合させる能力を有するエンハンサ−サイトを含む領域を選択した。

ウィルスの核酸に対し相補的なオリゴマーに関するかっての研究は、転写をブロ ックする試みの中でメツセンジャーＲＮＡ配列を標的にするのみであった。ウィ ルスＤＮＡはスーパーコイル状であり、二本鎖であり、または蛋白に結合してい て利用不可能であるため、通常このウィルスＤＮＡ配列はオリゴマーによる結合 には利用できない。しかしながら本発明者等は、他の多くの配列と同様ＲＮＡ型 でオリゴマーの結合に利用でき、それでいてＤ　Ｎ　Ａ型における結合にも利用 できる配列を発見した。

本発明方法によれば、これらのオリゴマーは単にＲＮＡに結合して転写をブロッ クするのではなく、エンハンサ−蛋白のための結合領域に対し相補的であり、且 つこれに結合することができる。したがって、エンハンサ−領域に対し相補的な これらのオリゴマーは、２つの手段によってウィルスの複製を阻害することがで きる。第一に、これらはＲＮＡにおいて表現された配列を標的とすることにより 転写をブロックすることができ、そして第二に、調節蛋白がその領域に結合する のをブロックして誘導を阻害するために、これらはＵ３のエンハンサ−サイトに おいてウィルスＤＮＡに結合することにより、誘導、そして故に複製を阻害する ことができる。本発明者等は、これらオリゴマーのうち１つを非細胞毒性の、そ して細胞の複製を有意に低下させない濃度でウィルスアクティベーターの添加と 共に細胞培養中に入れると、そのオリゴマーは５０μｍの濃度において、ＨＩＶ 付随ｔａｔ活性を９０％以上、そしてウィルスの複製を５０％以上ブロックする ことを発見した（幾つかの異なったウィルスアクティベーターが使用できるが、 その強力で普遍的な効果の故に、好ましいのはホルボールエステルとして知られ る蛋白キナーゼＣ−アクティベーターである）。

ＨＩＶにとって最も重要な制御領域はｔａｔ遺伝子であり、この遺伝子の発現を 阻害することによりウィルスの複製が阻害できると一般に考えられていた。しか しながら上に記載したように、この遺伝子の発現を阻害することが見いだされた 抗−５／Ａオリゴマーは正常な細胞の過程を阻害することも発見された。細胞機 能の阻害というこの問題を克服する試みにおいて、本発明者等は、さらに、この 遺伝子自身ではなく、この遺伝子のための標的（ｒＴＡＲＪ　）を、ＴＡＲに対 し相補的な一つのオリゴマーを用いて阻害しようと試みた。ＴＡＲに対し相補的 なこのオリゴマーはウィルスの複製を阻害しなかった。

さらに別の側面において本発明は、慢性もしくは潜伏性感染状態を維持するもし くは維持することのできるウィルスの存在もしくは不在、または、単離された細 胞、組織試料もしくは体液を含む試料中の、かかる慢性もしくは潜伏性ウィルス 感染の存在を決定する際の、これらのオリゴマーの使用を目的とするものである 。例えば、これらのオリゴマーはＨＩＶまたはＨＩＶによる感染の存在または不 在の決定に使用することができる（米国特許第４８０６４６３号参照）。

したがって成る側面において、本発明は、これらのオリゴマーを含むハイブリダ イゼーション検定プローブ及びこれらのオリゴマーを用いる検出検定を目的とす る。これらのプローブは診断キットにも使用できる。

これらのオリゴマーは幾つかの周知の方法のいずれかによって標識できる。有用 な標識は、放射性同位元素及び非放射性のリポータ−グループを包含する。同位 元素の標識は、３Ｈ１３５８、！！ｐ、１０１、コバルトおよび＋４０を含む。

同位元素による標識の殆どの方法は酵素の使用を含み、また、既知の、ニック翻 訳、末端標識、第二鎖合成、及び逆転写の方法を含んでいる。放射標識プローブ を使用する場合、ハイブリダイゼーションはオートラジオグラフィー、シンチレ ーションカウント、またはガンマカウントによって検出することができる。選択 される検出方法は、ハイブリダイゼーションの条件及び標識に使用される特定の 放射性同位元素に依存して変わる。

非同位元素材料もまた標識に使用でき、酵素の使用による、修飾１　されたヌク レオシドまたはヌクレオシド類似体の取り込みによって、または、オリゴマーの 化学的修飾、例えば非ヌクレオチドリンカー原子団の使用によって、導入するこ とができる。非同位元素による標識は、蛍光性分子、化学ルミネセント分子、酵 素、補因子、酵素の基質、ハブテンまたは他のリガンドを包含する。一つの好ま しい標識方法はアクリジニウムエステル類である。

このような標識されたオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション検定のプ ローブとして、そしてハイブリダイゼーション検定における使用のために、特に 適している。

本発明の理解を助けるために、一連の実験結果を記載した以下の実施例を述べる 。本発明に関連する以下の実施例は、勿論、本発明を個別に限定するものと解し てはならず、当業者の視野の中にあるであろう現在知られるまたは後に開発され る本発明の変形は、以下に特許請求される本発明の範囲内にあると考えられる。

実施例 実施例Ｉ　ＨＩＶの複製の阻害における成るＭＰ−オリゴマーの活性 ｇａｇ−ｐｏｌポリペプチド及びｔａｔのイニシエーターコドン領域に対し相補 的なオリゴヌクレオチドメチルホスホナート類似体を、ＨＩＶ複製の特異的阻害 剤としての効果について試験した。Ｂ−グロブリンｍＲＮＡに対し特異的なオリ ゴマー及びｄ−ＡＴポリマーを負の対照として使用した。種々の濃度のメチルホ スホナート（ｒＭＰＪ　）オリゴマーを、フィトヘマグルチン（ｒＰＨＡＪ　） 刺激ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）と共に３７℃で２時間インキュベートシ、 次いでＨＴＬＶ−Ｉ　Ｉ　ＩＢ感染Ｈ９細胞からの１００ＩＤ−５０のストック ＨＩＶに暴露させた。１８時間後に新鮮な培地及び追加のオリゴマーを加えた。

７日後に細胞を収穫し、ＨＩＶ感染したヒトの血清から単離したＩｇＧを用いる 間接的免疫蛍光検定において、ＨＩＶ特異性蛋白について評価した。平行して、 標準的技術により、培養上清中の逆転写酵素（ＲＴ）活性を測定した（ローレン ス・Ｊ等、サイエンス第２３５巻１５０１−１５０４頁（１９８７））。

表工に結果を記す。表Ｉかられかるように、ｇａｇ−ｐｏｔ及びｔａｔのイニシ エーターコドン領域に対して特異的なオリゴマーは、２００μＭまでの濃度では 活性化されたＰＢＭＣに対して非細胞毒性であるが、これは、ＨＩＶ複製の阻害 には無効であった。

実施例２　ＨＩＶ関連トランス活性化に及ぼす抗ＴａｔＭＰ−オリゴマーの効果 ｔａｔ開始及びスプライス／アクセプター領域に対し相補的なメチルホスホナー トオリゴマーを、ＣＡＴプラスミドのみ、またはｔａｔプラスミドとＣＡＴプラ スミドによってヒトＴ４＋リンパ芽球様Ｔ細胞ラインがトランスフェクトされる 際にｔａｔがクロラムフェニコールアセチルトランスファー遺伝子（ＣＡＴ）の 発現を促進する能力によって測定される、ＨＩＶ−関連トランスアクティベーシ ョンを阻害する能力について試験した（ローレンス・Ｊ等、ジャーナル・サブ・ クリニカル・インベスティゲーション第８０巻１６３１−１６３９頁（１９８７ 年１２月）参照）。ＣＡＴプラスミドｐＣ１５ＣＡＴ、及びスプライス／アクセ プターサイトを欠く対照のｔａｔプラスミドｐｃｖ−１は、ＮＣＩのウォジース タール博士により提供された。２つのｔａｔ−関連エクソンを含む実験的ｔａｔ プラスミドｐＢＲ３２２／ｐＩＩＩｅｘｔａｔ＋＋＋は、バーバード大学医学部 のベーゼルティン博士により提供された。

ＣＡＴ活性は、標準技術によるアセチル化型の［＋４（：］−クロラムフェニコ ツーのＴＬＣ分析によって評価した（ローレンス・Ｊ等、ジャーナル・サブ・ク リニカル・インベスティゲーシコン第８０巻１６３１−１６３９頁（１９８７） 参照）。

結果を表ＩＩに示す。抗ｔａｔイニシェーションサイトを指向するＭＰ−才リゴ マ−は効果が無かったが、一方、抗スプライス／アクセプターサイトを指向する ＭＰ−オリゴマーは５０μＭでトランスアクティベーションの阻害を示した。

実施例３　インビトロでのＨＩＶ複製に及ぼすＭＰ−オリゴマーの効果 抗ｔａｔＭＰ−オリゴマーを、標的細胞のＨＩＶ感染をブロックする能力につい て試験した（その活性がトランスアクティベーションに抗する活性と平行してい るかどうかを確認するため）。

細胞及びオリゴマーを、実施例１に記載のようにＨＩＶの存在下正常な細胞機能 、Ｔ−リンパ球の生存力およびＰＨＡの介在する増殖に及ぼすオリゴマーの効果 を測定したくローレンス等、ジャーナル・サブ・クリニカル・インベスティゲー ション第８０巻１６３１−１６３９頁（１９８７）参照）。トリパンブルーを排 除する能力によって測定される生存力への望ましくない作用は見られなかった。

しかしながら、３つの異なる抗−ｔａｔ−スプライス／アクセプターオリゴマー （Ｓ／Ａ−１、Ｓ／Ａ−ＩＡ及びＳ／Ａ−２、下記参照）が、３つの別個の実験 において〉２５μＭの濃度でＰＨＡ介在無性生殖を約４０ないし５０％低下させ た。

オリゴマーのＨＩＶ感染阻害の結果を表ＩＩＩに報告する。

ｐ＝ホスホジエステル結合 ｐ＝メチルホスホナート結合 実施例４　ＨＩＶのＰＭＡ−誘導に及ぼすＭＰ−オリゴマーの効果 ＭＰ−才リゴマ−を、ホルボールエステル（１３−ホルボール−１２−ミリスタ ートアセタートまたはｒＰＭＡｊ　）の介在するＨＩＶの誘導に及ぼす効果につ いて検定した。

成る細胞（Ｔ４＋　Ｔ細胞を含む）においては、転写を調節しＨＩＶエンハンサ −に結合する因子であるＮＦ−にＢは、ホルホ−）レーエステル及び細胞分裂促 進物質または抗原活性化をも媒介する。

ｔａｔ結合標的要素ＴＡＲに対し、モしてＮＦ−にＢを結合するＵ３中のエンハ ンサ−領域に対し相補的なＭＰ−オリゴマーを、ＨＩＶ複製関連効果のＰＭＡ誘 導を阻害する能力について試験した。

ＲＰＭＩ−１６４０中に希釈した無水エタノール中で１００μｇ／ｍｌのＰＭＡ 　（シグマ）の保存溶液を作成し、５ないし５００μｇ／ｍ１の最終濃度で使用 した。Ｕｌ、１細胞はＮＩＨのＴ、　Ｍ。

フォークスから取得した。これは、ＨＩＶのリンパ腺症を伴うウィルス（ＬＡＶ ）菌株に感染させであるヒト単球セルラインＵ９３７のクローンであるＵｌから サブクローニングした。ＨＩＶの複製を許容し、その細胞毒性効果に対して部分 的に抵抗性のＨ９、ヒトＣＤ　３　＋、ＣＤ４＋リンパ芽球様細胞ラインを、Ｎ ＩＨのＲ，、Ｃ，ガロから取得した。これらの細胞の保存試料を、１０％牛脂児 血清（ＦＢＳ）を加えたＲＰＭＩ−１６４０（フロー・ラボラトリーズ、マクリ ーン、ＶＡ）中１．５Ｘ１０５細胞／ｍｌの濃度で培養した。

細胞をＰＭＡ　（５μｇ／ｍｌ）に暴露するに先立ち、異なる濃度のオリゴマー （２ないし１００μＭ）をＵｌ、１細胞（慢性感染したマクロファージセルライ ン）と共に３７℃で１時間インキュベートした。培養を４８時間後にＨｒＶ活性 について評価した。

上清中のＨｒＶ抗原を、ウィルスのｐ２４コア蛋白についてのＥＬＩＳＡを基礎 とする検定により定量した。ポリスチレンビーズ中に入れたｐ２４エピトープに 対するヒト免疫グロブリン（アボット・ラブダ、シカゴ、ＩＬ）を上清に添加し 、室温で一夜維持した。平板をクエン酸塩燐酸塩緩衝液で洗浄し、ウサギ抗ＨＩ Ｖ　ＩｇＧ。

引続き西洋ワサビ過酸化酵素で標識したヤギ抗ウサギ抗体（アボット）を添加し た。○−フェニレンジアミンを基質として発色させ、次いで硫酸中で反応を停止 させた。吸収を４９２ｎｍで読み取り、データをｐｇ／１０’細胞として表わし た。この検定の感度は≦６０ｐｇ／ｍ１であった。

結果を表ＩＶに作表した。見られるように、Ｕ３におけるエンハンサ−配列（Ｎ Ｆ−にＢを結合する）に対し相補的な１１量体のＭＰ−オリゴマーは、５０μＭ でＨＩＶの誘導をほぼ６０％ブロックすることができた。この濃度は、３Ｈ−チ ミジンの取り込みによって測定されるＵｌ、１細胞の複製を２０％より少なく阻 害した。

以下の手法に従ってＤＮＡ合成反応を検定した。細胞を集め、ＰＢＳで３回洗浄 し、生存力をトリバンブルー染料の排除により評価した。ｌＸｌ０’の生存細胞 を、ポリスチレン平底マイクロウェル平板中の薬物０．２ｍｌに再懸濁した。選 択した培養を誘導試薬で処理した。全ての群を３個ずつ検定した。細胞を４８時 間インキュベートし、培養終了の１８時間前に、０．１ｍＣ１の［３Ｈ−メチル コーチミジン（１，９Ｃｉ／μＭ　ｓｐ、ａｃｔ、　、ニュー・イングランド・ ヌクレアー）をこれらに適用した。各ウェルの内容物を収穫し、放射活性の取り 込みを液体シンチレーションカウントによって測定した。

さらにこの細胞は、ＨＩＶ−ＬＴＲにより刺激されるＣＡＴ活性の、２Ｍ人で誘 導される上昇について検定した。クロラムフェニコールアセチルトランスフェラ ーゼ（ＣＡＴ）がＨＩＶのＬＴＲに結合している場合にＨＩＶのｔａｔ転写単位 がＣＡＴ遺伝子の発現を促進する能力を、ローレンス・Ｊ等、ジャーナル・サブ ・クリニカル・インベスティゲーション第８０巻１６３１−１６３９頁（１９８ ７）に記載の方法に以下の修飾を施して測定した。条件当り２Ｘ１０６のＵｌ、 １細胞を、血清を含有しないＲＰＭＩ−１６４０で洗浄し、ＤＥＡＥ−デキスト ラン（シグマ）２５０μｇ／ｍｌ及び２または４μｇの総プラスミドＤＮＡを含 有する５ｍＭ）リス（ｐＨ７，３）１ｍｌに再懸濁した。２つのプラスミド（ア リャ・Ｓ。

Ｋｏ等、サイエンス第２２９巻６９頁（１９８５）参照。プラスミドは実施例２ に記載の供給源より取得した。）は単独で（ＨＩ　Ｖ−ＬＴＲ−ＣＡＴのみ）ま たは−緒に（ＣＡＴ及びｔａｔ含有ベクターの同時トランスフェクション）使用 した。ｔａｔプラスミドｐＣｖ−１は、ｔａｔ遺伝子を含むＨＩＶ−１ｃＤＮＡ の１．８ｋｂフラグメントを含んでいる。ＣＡＴプラスミドｐｃ１５ｃＡＴは、 Ｓ■−４０調節配列、並びにＨＩＶ−１のＬＴＲ及び一部のｎｅｆ（３’−ｏｒ ｆ）を含んでいる。トランスフェクション後、細胞を、血清を含まないＲＰＭｒ −１６４０で洗浄し、培養培地０．　５ｍｌ中で３７℃でインキュベートした。

成る培養にはＰＭＡ（５０ｎｇ／ｍｌ）も入れた。細胞を収穫し、ＰＢＳで洗浄 し、０．２５Ｍトリス（ｐＨ７，０８）１００μｍに再懸濁し、凍結（エタノー ル及びドライアイス中）及び３７℃での融解を３サイクル行なうことによって細 胞抽出物を作成した。細胞抽出物の等分試料５０μｌを［１４Ｃ］−クロラムフ ェニコール（二ニー・イングランド・ヌクレアー）及び２．５Ｍアセチル補酵素 Ａ（ＰＬバイオケミカルズ・■ｎｃ、、ピスキャタウェイ、ＮＪ）と共に３７℃ で２時間インキュベートし、酢酸エチルで抽出することにより、ＣＡＴ活性を測 定した。クロロホルム及びメタノール（１９：１、Ｖ　／　Ｖ　）を含む小室中 でクロマトグラムシート（イーストマン・コダック、ロチェスタ、ＮＹ）を使用 する薄層クロマトグラフィーで展開することにより、クロラムフェニコールのア セチル化型を非アセチル化型から分離した。次いでこのクロマトグラムをオート ラジオグラフィーにかけた。

放射活性を有する部分に印をつけ、シートから切抜き、シンチレーション液中で 計数した。

結果を表Ｖに作表した。

ｄＡｐＡＨＡＨＡｐ４ＴＨＧＨＧＨＡＨ’１ＡＨＡＨＡ　５コ５６−５３４３　 上土エ　スプライスアクセプタ一 部位海アンチｔａｔ のＵ３のＮＦ−にＢ反復エレメント） ■アンチエンハンサーＴＡＲ− ｄ（４ＴＲＣＨ’ＮＧＨＧＲＧＲＴＩ２ＣＲＴＨＡＨｘ　７　ン＋　Ｔ　Ａ　Ｒ ｐ＝ホスホジエステル結合 −Ｐ−：ノー：ホスホナート結合 実施例５　オリゴマーが自発的細胞増殖及びＤＮＡ合成反応に及ぼす効果 ＨＩＶのＳ／Ａ−１領域に対し相補的なＭＰ−オリゴマー、及びｅｎｖのイニシ ェークーコドンに対し相補的なＭＰ−オリゴマーの存在下における、不死のＴ４ ＋細胞ライン（ＳＫ７）　、及び正常な、細胞分裂促進物質に暴露させた末梢血 単核細胞（ＰＢＭＣ）の、３Ｈ−チミジンの取り込みによって測定される自発的 増殖及びＤ　Ｎ　Ａ合成反応を、実施例４に記載のように測定した。

結果を表ＶＩ−Ａ（ＳＫ７）及びＶＩ−Ｂ　（ＰＭＢＣ）に作表した。見られる 通り、抗Ｓ／Ａ−１オリゴマーは両方のセルラインにおいて細胞増殖を有意に阻 害した。抗ｅｎｖオリゴマーは細胞増殖阻害作用がより小さかったが、本発明者 等は、抗ｅｎｖＭＰ−オリゴマーの抗ウィルス活性が僅かであることを見いだし た。

表Ｉ　ＨＩＶ−特異性イニジニージョンコドンに対し相補的なＭＰ−オリゴマー がウィルス感染に及ぼす効果ＨＩＶ反復アッセイ ミー一閣１仁−−− オリゴマー　蛍光 表ＩＩ　ＨＩＶ−関連トランスアクテイベーションに及ぼす抗ＴａｔＭＰ−オリ ゴマーの効果 ＣＡＴ阻害％ ＭＰ−オ’Ｊゴマ−ＭＰ−オリゴ、−第１ノイ、−対照　試験表ＩＩＩ　インビ トロでのＨＩＶ−関連複製に及ぼす抗ＴａｔＭＰ−オリゴマーの効果 ＨＩＶ逆転写 酵素活性 ＭＰ−オリゴマー　ＭＰ−オリゴマー　オリゴマー　平均卯璽表ＩＶ　慢性に感 染した細胞からのＨＩＶの誘導に及ぼすＭＰ−オリゴマーの効果＊ ＨＩＶ　ｐ２４ ＨＩＶ　抗原／１０４細胞 ＭＰ−オリゴマーＭＰ−オリゴマー濃ＨＰＭＡ　濃度アンチ−比−５／Ａ−ＩＷ Ｓ／Ａ３０−０−アンチ−；ノハン号−エノハンｔ−５ｏ−ｏ−７ｙｆ　−ｊ、 １＄−５／Ａ−４迅　Ｓ／Ａ　５０　＋　１．２５０　３４．７アンチ＝１ノパ ノ雫−ニンハノ１−５０＋７１３５５９．０１０．２ｍｌのＲＰＭ１１６４０　 ＋　１０％ＦＢＳ中１×１０４のＵｌ、１細胞を平底マイクロウェルに蒔く。選 択された培養を、ＭＰ−オリゴマーの添加前にＰＭＡ　（ホルボールミリスター トアセタート５０ｇ／ｍ１）に３０分間暴露した。細胞を含有しない上清を、ｐ ２４抗原の測定（アボット・ラブ・キット）のために４８時間の時点で収穫した 。

表Ｖ　ＴａｔによるＨＩＶ−ＬｔｒのＣＡＴで刺激される促進的調節に及ぼすＭ Ｐ−オリゴマーの効果＊−アンチ　−エ」Ｌζ−５／Ａ−１５０＋　＋　１０． ：１−　アンチ　−エｉと一−Ｓ／入−１１００＋　＋　４．７−　７７チ　− ＴＡＲ１００＋　＋　９−４Ｂ　＋＋　−＋　＋１４＋５ ＋　７ンｆ　−ＴＡＲ１００＋　＋　１４−７＋　７７チエ／バッサ−１００＋ 　＋　０＋３表ＶＩ３Ｈ−チミジンの取り込みにより測定された細胞増殖に及ぼ すオリゴマーの効果 ｔリゴ７−　−　−　Ｓ／Ａ−Ｉ　Ｓ／Ａ−１ｊｉｎＭ量　−−１０＄　５０μ Ｍ　５０μＭ ＣＰＭ☆　７８０　７７０　６７０　４：ＬＯ６６０阻害％　１４　５０　１６ 表　Ｖｒ−Ｂ　−ＰＭＢＣに対する効果ＨＴＬＶ−エエＸ　、＋　十　＋　＋ ｔｌｌｌｖ−（５０μｍ哩）　−−Ｓ／Ａ−４ＭＩＭＣＰＭ＊　８６００　９５ ３０　５２４０　８５００阻害％　−−４５１１ ＊　２重試料の平均 ／＝ケ！。

／２へ？ 国際調査報告 ｌｎｍ１ｍ１ｌＡ＠−一−−ヒｊ−嗜市ｍ１ｌａ、ＰＣＴ／ｌコ＋５９０１０２ ０１１

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ウイルスの慢性または潜伏性感染を有する細胞において、潜伏性または慢性 ウイルス感染から、活発に複製を行なう型への誘導を防止する方法であって、当 該細胞またはその増殖環境を、ウイルスＤＮＡのエンハンサーサイトまたはウイ ルスＲＮＡの対応配列に対し相補的であり、且つこれと結合、または相互作用す ることのできるオリゴマーで処理することからなる方法。 ２．該ウイルスがレトロウイルス、ヘルペスウイルスまたはＢ型肝炎ウイルスで ある、請求項１に記載の方法。 ３．該オリゴマーが、非イオン性オリゴヌクレオシドアルキル−もしくはアリー ル−ホスホナート類似体、ホスホロチオアートオリゴヌクレオチド類似体、ホス ホロアミダートオリゴヌクレオチド類似体、または中性燐酸エステルオリゴヌク レオチド類似体を含む、請求項２に記載の方法。 ４．該ウイルスがレトロウイルスを含む請求項３に記載の方法。 ５．該オリゴマーがオリゴヌクレオシドアルキル−またはアリールーホスホナー ト類似体を含む請求項４に記載の方法。 ６．該オリゴマーがメチルホスホナートオリゴマーを含む請求項５に記載の方法 。 ７．該ウイルスがＨＩＶである請求項６に記載の方法。 ８．該オリゴマーが少なくとも１０個のヌクレオシドからなる請求項７に記載の 方法。 ９．該オリゴマーが約１０ないし約２５のヌクレオシドからなる請求項８に記載 の方法。 １０．オリゴマーがその５′末端にホスホジエステルヌクレオシド間結合を持ち 、残りのヌクレオシド間結合はメチルホスホナート結合である、請求項９に記載 の方法。 １１．該オリゴマーが、ＮＦ−κＢに結合するＵ３のエンハンサーサイトに対し 相補的である、請求項１０に記載の方法。 １２．該オリゴマーが約１２ないし約１５のヌクレオシドを有する請求項１１に 記載の方法。 １３．該オリゴマーが、配列： 【配列があります】 ［ここでｐはホスホジエステルヌクレオシド間結合であり、ｐはメチルホスホナ ート結合である］ を有する請求項１２に記載の方法。 １４．慢性もしくは潜伏性感染を維持するまたは維持することのできるウイルス のウイルスＤＮＡのエンハンサーサイトに対し、または、該ウイルスＤＮＡに対 応するウイルスＲＮＡ配列に対し相補的な、メチルホスホナートオリゴマー。 １５．該ウイルスがレトロウイルス、またはヘルペスウイルスまたはＢ型肝炎ウ イルスを含む、請求項１４に記載のオリゴマー。 １６．オリゴデオキシリボヌクレオシドを含む請求項１５に記載のオリゴマー。 １７．少なくとも約８個のヌクレオシドからなる請求項１６に記載のオリゴマー 。 １８．約１０ないし約２５のヌクレオシドからなる請求項１７に記載のオリゴマ ー。 １９．該ウイルスがレトロウイルスである請求項１８に記載のオリゴマー。 ２０．該ウイルスがＨＩＶである請求項１９に記載のオリゴマー。 ２１．５′ちょうどからＵ３に至る領域の少なくとも一部に対し相補的である、 請求項２０に記載のオリゴマー。 ２２．該領域が、配列： 【配列があります】Ｕ３ を有する請求項２１に記載のオリゴマー。 ２３．約１２ないし約１５のヌクレオシドからなる請求項１８に記載のオリゴマ ー。 ２４．以下の配列： 【配列があります】 ［ここで、ｐはホスホジエステルヌクレオシド間結合であり、ｐはメチルホスホ ナートヌクレオシド間結合である］を有する請求項２３に記載のオリゴマー。 ２５．レトロウイルスのＬＴＲのＵ３におけるＮＦ−κＢを結合することのでき るエンハンサーサイトに対し相補的なメチルホスホナートオリゴマー。 ２６．該ウイルスがＨＩＶである請求項２５に記載のオリゴマー。 ２７．その５′末端に５′−ホスホジエステルヌクレオシド間結合を持ち、残り のヌクレオシド間結合がメチルホスホナート結合である、請求項２６に記載のオ リゴマー。 ２８．デオキシヌクレオシドオリゴマーからなる請求項２７に記載のオリゴマー 。 ２９．少なくとも約８個のヌクレオシドを有する請求項２８に記載のオリゴマー 。 ３０．慢性もしくは潜伏性ウイルス感染を有する生物もしくはその単離された細 胞、または、慢性もしくは潜伏性感染に入ることのできるウイルスを有する該生 物もしくは細胞からの液体を、該感染を慢性または潜伏性相に維持し、且つ活発 な複製相へのその誘導を阻害するために処理する方法であって、該ウイルスの誘 導を阻害するに有効な、該ウイルスのエンハンサーサイトの塩基配列に対し相補 的なオリゴマーの治療的有効量を、該生物に投与することからなる方法。 ３１．該ウイルスが、慢性または潜伏性感染を維持するウイルスを含む、請求項 ３０に記載の方法。 ３２．該ウイルスが、レトロウイルス、ヘルペスウイルスまたはＢ型肝炎ウイル スを含む、請求項３１に記載の方法。 ３３．該オリゴマーが、非イオン性オリゴヌクレオシドアルキルーもしくはアリ ール−ホスホナート類似体、ホスホロチオアートオリゴヌクレオチド類似体、ホ スホロアミダートオリゴヌクレオチド類似体、または中性燐酸エステルオリゴヌ クレオチド類似体を含む、請求項３２に記載の方法。 ３４．該ウイルスがレトロウイルスを含む請求項３３に記載の方法。 ３５．該オリゴマーがオリゴヌクレオシドアルキル−またはアリールーホスホナ ート類似体を含む、請求項３４に記載の方法。 ３６．該オリゴマーがメチルホスホナートオリゴマーを含む請求項３５に記載の 方法。 ３７．該ウイルスがＨＩＶである請求項３６に記載の方法。 ３８．該オリゴマーが少なくとも８個のヌクレオシドを含む、請求項３７に記載 の方法。 ３９．該オリゴマーが約１０ないし約２５のヌクレオシドを含む、請求項３８に 記載の方法。 ４０．該オリゴマーが、その５′末端にホスホジエステルヌクレオシド間結合を 持ち、残りのヌクレオシド間結合がメチルホスホナート結合である、請求項３９ に記載の方法。 ４１．該オリゴマーが、ＮＦ−κＢに結合するＵ３のエンハンサーサイトに対し 相補的である、請求項４０に記載の方法。 ４２．該オリゴマーが約１２ないし約１５のヌクレオシドを有する請求項４１に 記載の方法。 ４３．該オリゴマーが、配列： 【配列があります】 ［ここで、ｐはホスホジエステルヌクレオシド間結合であり、ｐはメチルホスホ ナート結合である］ を有する請求項４２に記載の方法。 ４４．慢性もしくは潜伏性感染を維持するまたは維持することのできるウイルス のウイルスＤＮＡのエンハンサーサイト、または該ウイルスＤＮＡに対応するウ イルスＲＮＡ配列とハイブリダイズすることのできるオリゴマー。 ４５．該ウイルスが、レトロウイルス、またはヘルペスウイルスまたはＢ型肝炎 ウイルスを含む、請求項４４に記載のオリゴマー。 ４６．オリゴデオキシリボヌクレオシドを含む請求項４５に記載のオリゴマー。 ４７．少なくとも約８個のヌクレオシドを含む請求項４６に記載のオリゴマー。 ４８．約１０ないし約２５のヌクレオシドを含む請求項４７に記載のオリゴマー 。 ４９．該ウイルスがレトロウイルスである請求項４８に記載のオリゴマー。 ５０．該ウイルスがＨＩＶである請求項４９に記載のオリゴマー。 ５１．５′ちょうどからＵ３に至る領域の少なくとも一部に対し相補的な、請求 項５０に記載のオリゴマー。 ５２．該領域が、配列： 【配列があります】Ｕ３ を有する請求項５１に記載のオリゴマー。 ５３．約１２ないし約１５のヌクレオシドを含む請求項４８に記載のオリゴマー 。 ５４．以下の配列： 【配列があります】 を有する請求項５３に記載のオリゴマー。 ５５．Ｕ３においてＮＦ−κＢを結合することのできるエンハンサーサイトに対 し相補的な、請求項５３に記載のオリゴマー。 ５６．少なくとも８個のヌクレオシドからなるオリゴマーを含み、該オリゴマー は該ウイルスのエンハンサーサイトに対し実質的に相補的である、慢性もしくは 潜伏性感染を維持するまたは維持することのできるウイルスのためのハイブリダ イゼーションプローブ。 ５７．該ウイルスがレトロウイルス、またはヘルペスウイルスまたはＢ型肝炎ウ イルスを含む、請求項５６に記載のプローブ。 ５８．オリゴデオキシリボヌクレオシドを含む請求項５７に記載のプローブ。 ５９．少なくとも約８個のヌクレオシドを含む請求項５８に記載のプローブ。 ６０．約１０ないし約２５のヌクレオシドを含む請求項５９に記載のプローブ。 ６１．該ウイルスがレトロウイルスである請求項６０に記載のプローブ。 ６２．該ウイルスがＨＩＶである請求項６１に記載のプローブ。 ６３．５′ちょうどからＵ３に至る領域の少なくとも一部分に対し相補的である 、請求項６２に記載のプローブ。 ６４．該領域が、配列： 【配列があります】Ｕ３ を有する請求項６３に記載のプローブ。 ６５．約１２ないし約１５のヌクレオシドを含む請求項６０に記載のプローブ。 ６６．ＮＦ−κＢを結合することのできるエンハンサーサイトに対し相補的な、 請求項６５に記載のプローブ。 ６７．（ａ）被験試料の核酸、及びウイルスＤＮＡのエンハンサ７１．該オリゴ マーがメチルホスホナートオリゴマーを含む請求項７２に記載の方法。 ７２．該ウイルスがＨＩＶである請求項７１に記載の方法。 ７３．該オリゴマーが少なくとも約８個のヌクレオシドを含む請求項７２に記載 の方法。 ７４．該オリゴマーが約１０ないし約２５のヌクレオシドを含む請求項７３に記 載の方法。 ７５．該オリゴマーが、その５′末端にホスホジエステルヌクレオシド間結合を 持ち、残りのヌクレオシド間結合がメチルホスホナート結合である、請求項７４ に記載の方法。 ７６．慢性もしくは潜伏性感染を維持するまたは維持することのできるウイルス のウイルスＤＮＡのエンハンサーサイト、または該ウイルスＤＮＡに対応するウ イルスＲＮＡ配列とハイブリダイズすることのできる、検出できるよう標識され たオリゴマー。 ７７．慢性もしくは潜伏性感染を維持するまたは維持することのできるウイルス のウイルスＤＮＡのエンハンサーサイト、または該−サイトもしくは該ウイルス ＤＮＡに対応するウイルスＲＮＡ配列とハイブリダイズするに充分相補的なオリ ゴマーを混合し、（ｂ）該オリゴマー及び被験試料を、該オリゴマーがウイルス 核酸とのみハイブリダイズし、細胞の核酸とは検出できる程にはハイブリダイズ しないような特異的ハイブリダイゼーション条件下にインキュベートし、そして 、 （ｃ）被験試料へのオリゴマーのハイブリダイゼーションを検定する、 ことからなる、被験試料中の、慢性もしくは潜伏性感染を維持するまたは維持す ることのできるウイルスの存在を検出する方法。 ６８．該ウイルスがレトロウイルス、ヘルペスウイルスまたはＢ型肝炎ウイルス である、請求項６７に記載の方法。 ６９．該ウイルスがレトロウイルスを含む請求項６８に記載の方法。 ７０．該オリゴマーがオリゴヌクレオシドアルキル−またはアリールーホスホナ ート類似体を含む、請求項６９に記載の方法。 ウイルスＤＮＡに対応するウイルスＲＮＡ配列に対し相補的な、検出できるよう 標識されたメチルホスホナートオリゴマー。 ７８．請求項１４、４４、７６または７７に記載のオリゴマーを含む、慢性もし くは潜伏性感染を維持するまたは維持することのできるウイルスの存在または不 在を検出するための診断キット。 潜伏性または慢性ウイルス感染の誘導を阻害する方法