JPH04501052A - 外来性オリゴヌクレオチドによるｈｔｌｖ―３の抑制 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 外米性オリゴヌクレオチドにょるＨＴＬＶ−Ｈの抑制レトロウィルス科のウィル スには、ＲＮＡゲノムとＲＮＡ依？Ｆ性ＤＮＡポリメラーゼ活性（逆転写酵素） とを含むウィルスが包含される。それらの増殖中、レトロウィルス科のウィルス 又は良く呼び慣らされている名称でのレトロウィルスは、それらのＲＮＡをコピ ーしてプロウィルスＤＮＡとする。プロウィルスＤＮＡは、宿主の染色体ＤＮＡ に挿入され（組み込まれ）、宿主においてプロウィルスＤＮＡは宿主の転写及び 翻訳機構を利用してウィルスＲＮＡ及びタンパク質を発現する。ウィルスは、細 胞膜からの出芽により細胞から放出される。大抵の感染は必ずしも細胞を殺さな い。むしろ、感染したｍ胞は、連続的にウィルスを生産し続けながら増殖及び分 化し続けることがある。

３つの主要なりラスのヒトレトロウィルスが同定された。これらは、１　’）Ｔ １ｍ胞リンパ球指向性ウィルス（Ｔ−ｃｅｌｌ　ｌｙｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ　ｖ ｉｒｕｓ）（ＨＴＬＶ）、２）霊長類Ｃ型ウィルスに関連した内在性遺伝子要素 及び３）７オーミーウイルス（ｆｏａｍｙ　ｖｉｒｕｓｅｓ）である。

ヒトＴＪｆＢ！Ｐｊ白血病リンパ球指向性ウィルス（ＨＴＬＶ）は、ＴＩ］ｌ胞 指向性レトロウィルスの一員である。成る種のＴ細胞新生物（Ｔ−ｃｅｌｌ　ｎ ｅｏｐｌａＳ＋＊Ｓ）を引き起こす役割を果たすこのようなウィルスは、一般に ３つの主要なタイプ又はサブグループに分けられる。これらは、ｌ）５！人Ｔｍ 胞白血病リンパ１１（ＡＴＬＬ）を引き起こすと思われるＨＴＬＶ−Ｉ型、２） 毛状細胞白血病（ｈａｉｒｙ　ｃｅｌｌ　ｌｅｕｋｅｍｉａ）のＴ細胞変異体（ Ｔ−ｃｅｌｌ　ｖａｒｉａｎｔ）を有するＨＴＬＶ−１を型（ＨＴＬＶ−ＩＩ） 及び３）後天性免疫不全症候群（エイズ）の病因学的因子として同定されｆ：　 ＨＴ　Ｌ　Ｖ　−Ｉｌｌ型（ＨＴｔｖ−■）である。ＨＴＬＶ−Ｉ［１は、リン パ節障害関連ウィルス（ＬＡＶ）、エイズ関連ウィルス（ＡＲＶ）及びヒト免疫 不全ウィルス（ＨＩＶ−１）としても知られている。ボポビック・エム（Ｐｏｐ ｏｖｉｃ、Ｍ）等、サイエン乙、７エフ・（Ｗｏｎｇ−５ｔａａｌ、Ｆ、）及び ギヤＯ−アール・シー、ネイチャー、主１ヱ、３９５−４０３（１９８５）ｉ及 びクラン、ジエイ・ダブリ、：Ｌ　（Ｃｕｒｒａｎ＋ＩＷ）等、サイエンス、翌 λ旦：１３５２−１３５７（１９８５）−もっと最近では、エイズを有するがＨ ＩＶ−１感染の兆候を示さない患者においてモンタグニール（Ｍｏｎｔａｇｎｉ ｅｒ）によりＨＩＶ−２が発見された。サイエンス、２３６：３９０−３９２（ １９８７）。

エイズは最初１９８１年に認められ、その時以来、この病気は新しい流行病とし て認識されるに至っｔ；。ＲＮＡ！ｌ瘍ウィルス（ＲＮＡ　Ｔｕｍｏｒ　Ｖｉｒ ｕｓｅｓ）（第２編）、２巻、４３７−４４３頁、コールドスプリングハーバ− ラボラトリ−（１９８５）。

エイズを有する患者は、一般にヘルパーＴ細胞リンパ球の喪失、悪性騰瘍及び日 和見感染症を伴う重い免疫不全を含む臨床的症状を示す。この時点での病気は治 癒不可能であり、エイズ患者の死亡率は高い。

この病気は、一般に、重い、生命に危険のある作用を有するので、人々をそれか ら保護しそしてそれにかかる人々を処置する手段を発見することに多大の興味が 寄せられる。現時点では、体組織及び体液（例えば血液及び唾液）中のＨＴＬＶ −Ｉｌｌ（）（ＩＶ−１）の存在を検出する方法の開発及び受血者をＨＴＬＶ− ＩＩＩから保護するワクチンの開発に多くの努力がなされている。しかしながら 、この病気を防止するか又はこのウィルスに感染した人々を処置するための満足 な方法は知られていない。実際、ＨＴＬＶ−ＩＩＩの種々の株で観察されたエン ベロープタンパク質（ウィルスの主要抗原決定基である）に変動があることに照 らして見ると、広いスペクトルの抗ＨＴＬＶ〜■ワクチンを開発しようとする最 近の努力も無駄Ｉこなる可能性が強い。バーン、ジー・エイチ（Ｆａｈｎ、Ｇ、 Ｈ，）等、ウィルスの作用を妨げる他の方法が明らかに必要とされる。

本発明の要約 本発明は、ＨＴＬＶ−ＩＩＩゲノムの領域に対して相補的なそしてＨＴＬＶ−■ 複製又は遺伝子発現を抑制する外来性オリゴヌクレオチド、培養したヒト細胞に おけるＨＴＬＶ−ＩＩＩ複製及びＨＴＬｖ−ＩＩＩ遺伝子発現を抑制する方法、 生物学的試料中のＨＴＬＶ−１［［の存在を検出する方法及びＨＴ　１．　Ｖ　 −ＩＩ［複製又は遺伝子発現を抑制する目的で個体に該オリゴヌクレオチドを投 与する方法（ハイブリダイゼーション阻止）に関する。

オリゴデオキシリボヌクレオチド又はオリゴリボヌクレオチドであることができ る本発明のオリゴヌクレオチドは、高度に保存されており且つＨＴＬＶ−ｍによ る正常な複製又は遺伝子発現にその機能が必要とされるところのＨＴＬＶ−Ｉｉ ［ゲノム上の領域に対して相補的である。このオリゴヌクレオチドはＨＴ　Ｌ　 Ｖ　−ＤＩ複製、遺伝子発現又はその両方を妨げるのに使用することができ、か くしてこのウィルスによる複製及び遺伝子発現を抑制する際の化学療法剤として 使用することができる。更に、それらは、血液、尿及び唾液などの試料中の）（ ＴＬＶ−ＩＩＩの存在を検出するのに使用することができる。

本発明のオリゴヌクレオチドは、ＨＴＬＶ−Ｄｒゲノムの高度に保存された領域 である標的部位に対して相補的である。これらには、キャップ部位；プライマー 結合部位；５′方向においてプライマー結合部位に隣接しｊ：ヌクレオチド配列 ；ｍＲＮ　Ａ供与スプライス部位及び受容スプライス部位；ｇａｇ％　ＳＯｒ％ 　ｔａｔ％　ｅｎＶ及び３’　ＯＲＦ配列のｔ；めの開始コドンを含むＨＴＬＶ −ＩＩ［開始コドン；ａｒｔ遺伝子又はその一部；ポリアデニル化シグナル：及 び転写中ｌこ起こることが知られているフレームシフトの原因となるゲノムの領 域：が包含される。これらのオリゴヌクレオチドは、ＨＴＬＶ−ＩＩＩ惑染細胞 におけるＨＴＬＶ−ＤＩ複製及び／又は遺伝子発現を抑制するのに使用すること ができる。これらは、後天性免疫不全症候群（エイズ）及びエイズ関連複合症（ ＡＲＣ）の化学療法処理の手段として個体に投与してＨＴＬＶ−ＩＩＩ複製及び ／又は遺伝子発現を妨げることができる。本発明の方法はハイブリダイゼーショ ン阻止と呼ばれる。

このようなオリゴヌクレオチドの使用は少なくとも２つの利点を有する。第１に 、観察される抗ウィルス作用が非常に特異的である。例えば、２０個のヌクレオ チドの特定の配列は、ランダムで１０１２に約１回より多く起きることは予想さ れないであろう。ヒトのゲノムには約４×ｌθ′のヌクレオチドの対があり、か ＜　Ｌ、てＨＴＬＶ−ＩＩ［の保存された領域から選ばれた２０ヌクレオチド配 列の特異性は大きいことが予想される。

第２に、このオリゴヌクレオチドの細胞毒性は、大抵のヌクレオシド類似体（例 えば、癌化学療法、移植片−宿主免疫及びウィルス抑制で使用されるもの）と比 較しても低く、このような類似体はヌクレオチドに転化され、これはその後に細 胞ＤＮＡに組み込まれる。

血液、唾液又は尿素などの試料中にＨＴＬＶ−ＩＩＩが存在するかしないかを、 ＨＴＬＶ−ＩＩＩウィルスにより普通は殺される細胞（例えばかリンパ球）にお いてそれらを試験されるべき試料と共に培養するときに細胞の死滅が起こるかど うか及び細胞の死滅がこのオリゴヌクレオチドにより抑制されるかどうかを決定 することにより決定するのＪこ使用ｊることができる。

この同じ方法は、他のレトロウィルス及び他のウィルス（即ち、ＤＮＡウィルス 、ＲＮＡウィルス）の複製、従って宿主細胞での発現を抑制するのにも使用する ことができる。他のレトロウィルスを抑制するのに使用される場合には、本発明 の方法は、正常な複製又は遺伝子発現のためにその機能が必要とされそして高度 に保存されているところのレトロウィルスのゲノムの領域に対して相補的なオリ ゴヌクレオチドを使用するであろう。他のウィルスの場合には、ウィルスＲＮＡ 又はＤＮＡに対して相補的なオリゴヌクレオチドか使用される。

本発明の方法は、他の（非ウィルス）感染作用体、例えばバクテリア、カビ、原 虫類及び虫（ｗｏｒＩＩＩｓ）の活性を抑制するのにも使用することができる。

これらの用途では、感染作用体のＤＮＡ又はＲＮＡの特定の必須の領域に対して 相補的なオリゴヌクレオチドが使用される。

図面の簡単な説明 添付図面は、ＨＴＬＶ−ＤＩの一次ヌクレオチド配列及びオリゴヌクレオチド競 合抑制標的のゲノム上の位置の略図である。

ＨＴＬＶ−Ｉ［＋の抑制 ＨＴＬＶ−ＤＩ／ＬＡＶゲノムの一部ヌクレオチド配列は幾つかのグループの研 究者により決定されｔ；。ラトナー・エル（Ｌａｔｎｅｒ　、　Ｌ）等、ネイチ ャー、３１３：２７７−２８４（１９８５）；ワインーポプリン・ニス（Ｗａ　 １ｎ−Ｈｏｂｓｏｎ　、　Ｓ）等、−１”／Ｌ、４旦：９−１７（１９８５）； サンチェズーペスカドール・アール（Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｐｅｓｃａｄｏｒ、Ｒ） 等、サイエンス　２２ヱ：４８４−４９２（１９８５）；ムユシング・ユム・ニ ー（Ｍｕｅｓｉｎｇ、Ｍ、Ａ）等、ネイチャー　３１３：４５０−４５８（１９ ８５）。

ＨＴＬＶ−Ｉ［＋のゲノムは図面に示されている。ＨＴＬＶ−ＩＩＩゲノムは、 大抵のレトロウィルスのゲノムよりも相当可変性であることが示された。

ＲＮＡ１１５１１Ｆウイルス（第２編）２巻、４４６頁、コールドスプリングハ ーバ−ラボラトリ−（１９８５）。他のレトロウィルスと同様に、ＨＴＬＶ−Ｉ Ｉ［はそのゲノム内にウィルスタンパク質をコードしている３つの遺伝子を有す る。これらは、ｌ）ウィルスのヌクレオキャプシド又は内部構造タンパク質をコ ードしているｇａｇ遺伝子、２）逆転写酵素（ＲＮＡをＤＮＡに転写するのを受 け持つＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼをコードしているｐｏｌ遺伝子、及び３ ）ピリオンのエンベロープ糖タンパク質をコードしているｅｎｖ遺伝子である。

更に、２つの他の読み取り枠が知られている。１つ（ｓｏｒ）はｐｏｌ遺伝子の ３′末端と重なり合い、ゲノムの３′末端に位置した他方（３’　０ＲＦ）は、 僅かにｅｎｖ遺伝子に重なり合いそしてＵ３領域の大部分を通って続いている。

ゲノムは、ｔａｔ−ｍ及びａｒｔを含むことも示された。ｔａｔ−ｍは、ＨＴＬ Ｖ−ＩＩＩのトランス活性化遺伝子である。それは、感染細胞においてウィルス タンパク質合成を著しく促進するトランス活性化タンパク質をコードしている。

ａｒｔ（翻訳−トランスアクティベーター遺伝子の抗抑制）は、ＨＴＬＶ−ｍゲ ノムにおいて最近発見されｔ；ばかりであり、ウィルスのコア及びエンベロープ タンパク質を生産する際にｔａｔと協働して作用するらしい。

ＨＴＬＶ−ＩＩＩのＲＮＡの他の領域は、ゲノムの５′末端（Ｕ５）に存在する キャップヌクレオチド、ＲＮＡの両端で反復している短い配列（Ｒ）；５′末端 に独特な短い配列（Ｕ５）；及びＲ）の３′末端に独特な配列（Ｕ３）である。

最後の３つの成分の各々は、ウィルスＤＮＡ中に２回存在しており、各々は逆転 写の組み込まれていない線状ＤＮＡ生成物の両端に見出だされる長い末端反復（ ＬＴＲ）配列の一部を形成する。ＨＴＬＶ−ｍゲノムはＵ５に隣接した（その３ ′末端で）プライマー結合部位（ＰＢＳ）も含み、このＰＢＳはｔＲＮＡリシン の３′末端に対して相補的でありそしてウィルスＤＮＡの一部の合成のためのプ ライマーとして機能する。供与スプライス（Ｓ、Ｄ、）及び受容スプライス（Ｓ 、Ａ、）部位はウィルスＤＮＡ上にも位置している。供与スプライス部位はウィ ルスゲノムの５′部分がウィルスＲＮＡの３′末端の部分に連結されてスプライ スされたサブゲノムメツセンジャーＲＮＡを形成しているところの配列である。

受容スプライス部位はウィルスＲＮＡの３′末端の部分が供与スプライス部位に 連結してサブゲノムメツセンジャーＲＮＡを形成しているところの配列である。

上述の如く、異なるＨＴＬＶ−１１１株はエンベロープタンパク質において変異 を有することが報告された。これらの変異は広いスペクトルの抗ＨＴＬＶ−ＩＩ Ｉワクチンの開発を危うくする可能性がある。対照的に、プライマー区域の一部 ヌクレオチド配列及びＨＴＬＶ−ＩＩｍゲノム成る他の部分は高度に保存されて いる。ＨＴＬＶ−ｍゲノムのこのような高度に保存された領域を指向する相補的 オリゴデオキシヌクレオチドは、培養したＨＴＬＶ−ＩＩＩ形質形質転換ヒソ１ ２３球けるウィルス複製及び／又は遺伝子発現を抑制することが今回示された。

ＨＴＬＶ−ＩＩＩゲノムの標的とされる領域上述の如く、ＨＴＬＶ−Ｉ［［ゲノ ムの幾つかの領域は高度に保存されており、これらの領域又はその一部は相補的 オリゴヌクレオチド配列による抑制のための標的とされうる。オリゴヌクレオチ ド競合抑制標的と呼ばれるこれらの領域には、１）キャップ部位；２）プライマ ーｔＲＮＡ１ｙ’結合部位に対して５′のヌクレオチドの配列：３）プライマー 結合部位又はそのセグメント：４）プライマーｔＲＮＡ１ｙｓ　結合部位に対す る５′配列及びプライマー結合部位の組み合わせ；５）ｍＲＮＡ供与又は受容ス プライス部位；　６　）ｇａｇｑ　ＳＯｒ　ｓ　ｔａｔｓ　ａｎｖ及び３’　Ｏ ＲＦ配列のための開始コドン；　７　）ａｒｔ遺伝子又はその一部；８）転写中 に起こることが知られているフレームシフトの原因となるゲノムの領域；及び９ ）ポリアデニル化シグナル；が包含される。これらの領域（ａ「【遺伝子を除い て）の位置は図に示されており、ａｒｔ遺伝子はｔａｔ遺伝子に近接して位置し ている。

上記の高度に保存された領域の４つに対して相補的なオリゴデオキシヌクレオチ ドは、培養されたＨＴＬＶ−Ｉ［１形質転換ヒトリンパ球におけるウィルス複製 又は遺伝子発現を抑制することが証明された。即ち、１）プライマリ−ｔＲＮＡ ”　結合部位に対して５′配列；２）プライマー結合部位；３）ｍＲＮＡ供与ス プライス部位の配列又は４　）ｍＲＮ　Ａ受容スプライス部位の配列に対して相 補的なオリゴデオキシヌクレオチドは抑制を引き起こすことが示された。一般に 、ウィルス複製又は遺伝子発現（例えばタンパク質合成）のために必要な情報を フードしているＨＴＬＶ−ｍゲノムの高度に保存された領域は、相補的オリゴデ オキシヌクレオチドのＩ；めの有力な標的である。

相補的オリゴヌクレオチド配列 競合抑制標的に対して相補的なオリゴヌクレオチド配列は、オリゴリボヌクレオ チド配列又はオリゴデオキシリボヌクレオチド配列であることができる。両タイ プ共、本明細書ではオリゴヌクレオチドと呼ばれ、又はバイブリドンと呼ばれる 。本明細書に述べられた如く、オリゴヌクレオチドは、自動ＤＮＡ合成機により 合成された。しかしながら、遺伝子工学的に作り出された生物、例えばバクテリ ア又はウィルスを使用して所望の配列を生産することも可能である。

長さを変えたオリゴデオキシヌクレオチド配列を使用して、ウィルス複製及び遺 伝子発現に対するそれらの抑制効果を評価した０例えば、プライマーｔＲＮＡ” ｓ結合部位に対して５′であるＨＴＬＶ−Ｉ［［ゲノムのヌクレオチド配列に対 して、又はプライマー結合部位と隣接した領域（５′方向における）にまたがる ヌクレオチド配列に対して相補的な幾つかのヌクレオチド配列を合成しそしてそ れらの抑制効果を試験した。実施例３にもっと詳細に述べた如く、１２ヌクレオ チド配列（マー）、２０ヌクレオチド配列及び２６ヌクレオチド配列を製造し、 ウィルス複製及び遺伝子発現Ｉ：対するそれらの抑制効果を測定した。１２ヌク レオチド配列及び２０ヌクレオチド配列は、５′方向におけるプライマー結合部 位に近いＨＴＬＶ−１ゲノムの部分に対して相補的である。２６ヌクレオチド配 列は、プライマー結合部位に対して相補的である。それはウィルス標的に対する ハイブリダイゼーシヨン及びウィルスを抑制するのに特に効果的であることが示 された。

更に、ＨＴＬＶ−ＩｎＩｌｌＲＮＡのスプライス供与部位又はスプライス受容部 位に対して相補的なオリゴチオキシヌクレオチド配列を製造しそしてそれらの抑 制効果を評価した。特に、３′オープン読み取り枠領域（３’ｏｐｅｎ−ｒｅａ ｄｉｎｇ　ｆｒａｍｅ　ｒｉｇｉｏｎ）（図参照）からのスプライス供与部位に 対して相補的な２０ヌクレオチド配列及びａ−１及びａ−１′に対して相補的な ２つの２０ヌクレオチド配列、前者はトランス活性化因子の生産ｌこ必要である 、を合成しそしてそれらの抑制効果を評価した。

ウィルス複製を、逆転写酵素活性レベルとして評価し、ウィルスタンパク質Ｐ１ ５及びＰ２４の生産として遺伝子発現及び融合細胞形成をアッセイしｔ；。ウィ ルス複製の抑制は減少した逆転写酵素酵素活性レベル≦こ反映され、ウィルス遺 伝子発現の抑制はウィルスタンパク質生産（本明細書で使用したＰＩ３及びＰＩ ３は閏じウィルスタンパク質の２つの名称である）の減少により示される。表１ に示されたように、ＨＴＬＶ−■複製及びタンパク質発現は、殆どすべての場合 に抑制されｔ；。最も大きい抑制効果は、スプライス受容部位に対して相補的な ２０ヌクレオチド配列をＨＴＬＶ−１１１感染細胞の培養で試験した場合に証明 された。

実施例４に記載の如く、修飾されていないオリゴマーである同じヌクレオチド配 列の種々のオリゴマー（１５マー又は２０マー）；すべてのインターヌクレオシ ドホスフェートがホスホロチオエート、メチルホスホネート又はホスホロモルホ リゾートとして修飾されたオリゴマー；ａ）丁度３′及び５′末端及び末端から ２番目のインターヌクレオシドホスフェートが上記のの修飾により置換されてい るオリゴマー；又は５′及び／又は３′末端ヒドロキフル基に保護基（ｂｌｏｃ ｋｉｎｇ　ｇｒｏｕｐｓ）を有するオリゴマーを、ＨＩＶの増殖及び発現に対す るそれらの効果について比較しｊ；。実施例４に記載の如くそして表３−７に示 されたように、ＨＩＶゲノム内の種々の部位を標的とした。結果は、実施例４で は相当の変動性が見られるけれども、アッセイしｔ；機能（即ち、ウィルス逆転 写酵素、ＰＩ３及びＰ２４ウィルスタンパク質合成、融合細胞形成及び宿主細胞 の増殖）の８０−９０％間での抑制を示した。

使用することができる他の相補的オリゴヌクレオチド配列を、選ばれた競合抑制 標的により決定した。オリゴヌクレオチド配列は、１つの競合抑制標的に対して 相補的であることができるか又は１つより多くのこのような標的に対して相補的 な配列を含むことができる。例えば、ＨＴＬ　Ｖ　・−ｍプライマー結合部位及 び５′方向におけるその部位に直ぐ隣接しているゲノムの領域に対して相補的な 、又は２つのスプライス供与部位に対して相補的な、又は２つのスプライス受容 部位に対して相補的な、又は競合抑制標的の組み合わせに対して相補的なオリゴ マーを製造することができる。

ウィルスプロセスを抑制するのに使用されるオリゴヌクレオチドの他の特性は、 それらの長さ、それらの修飾及びそれらを修飾するのに使用される基の位Ｉが含 まれる。例えば、使用されるべきオリゴヌクレオチドの長さは、抑制の所望の特 異性、ウィルス機能を妨げるのに必要な寸法及びトランスメンプラン通過に対す る効果などのファクターにより決定されるであろう。例えば、本明細書で述べた 実験では、長さが１４−１６ヌクレオチドの範囲の相補的すリボデオキシヌクレ オチドを利用した。しかしながら、使用されるべきオリゴヌクレオチドの長さに 対する制限は潜在的にはなく、そして長さは、それが核酸ハイブリッドの化学的 安定性及び達成されるウィルス抑制に重要な役割を演じるという事実に照らして 、注意深く決定されなければならない。一般に、ＨＴＬＶ−■を抑制するのに使 用されるオリゴヌクレオチドは長さが８−５０ヌク１／オチドであろう。

使用されるべきオリゴヌクレオチドは、それらの長さに沿って主事油の位置で修 飾することができる。例えば、それらは、５′末端（即ちジデオキシ基）、３′ 末端又は両方（即ちイソウレア基）、及び内部ホスフェート基（即ち、チオホス フェート、モルホリゾート、アルキルアミノホスフェート、ピペラジンホスフェ ート）に又は塩基に基を付加させることにより修飾することができる。これらの 修飾のい〈“つかは、上記で説明されそして実施例４及び表３−７に記載される 。使用されるべきオリゴヌクレオチドが修飾されているならば、修飾の位置は、 例えば、ウィルス活性に対する所望の効果（例えばウィルス複製の抑制、遺伝子 発現又は両方）、感染細胞中への取り込み、細胞内に入ってからのオリゴヌクレ オチドの分解の抑制及び逆転写酵素によるプライマーとしての使用の妨害により 決定されるであろう。例えば、逆転写酵素活性（従ってウィルス複製）を抑制す るためには、プライマー結合部位及び／又は５′方向におけるプライマー結合部 位に隣接した配列５こ対して相補的な配列の３′末端をブロックする（例えば２ ′３′　ジデオキシヌクレオチドにより）ことが必要な場合がある。この方法に おいては、これらの領域のいずれか又は両方に対して相補的なオリゴヌクレオチ ドは、それ自体は転写酵素活性のだめのテンプレートとして作用することはでき ない。

所望の効果が増加するならば、感染細胞へのオリゴヌクレオチドの取り込み、親 油性基の５′末端での付加によるオリゴヌクレオチドの修飾又はポリリシンもし くはポリアルギニンなどの取り込みを高めることが知られている作用物質は有利 であろう。オリゴヌクレオチドの修飾は、塩基又はインターヌクレオホスフェー ト基土で、５′又は３′末端での挿入剤（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ　ａｇｅ ｎｔＸ例えば、アクリジン染料）の付加により行うことジできる。この方法での 修飾は、オリゴヌクレオチドとＨＴＬＶ−■核酸とのより強い結合をもたらすこ とがある。アセリン・ニー（Ａｓｓｅｌｉｎｅ、Ｕ、）等、Ｃ，Ｒ，Ａｃａｄ、 　Ｓｃ、　Ｐａｒｉｓ、　３６９−３７２（１９８３］。

架橋するか、開裂するか又は標的部位を他の方法で修飾することができる化学反 応性基をバイブリドンに結合させることにより、標的部位を恒久的に修飾するこ とが特に望ましい。表１に示されたように、プライマー結合部位に対して５′の ＨＴＬＶ−ｎ［ゲノムの領域に対して相補的な１２ヌクレオチド配列をｄｄＴに より３′末端でブロックした。ラウス肉腫ウィルスの抑制に関する初期の研究は 、５′及び３′末端ブロツクしたバイブリドンはブロックしないバイブリドンよ りも有効な抑制剤であることを示す。バイブリドンは、競合ハイブリダイゼーシ 厘ンによりＤＮＡ又はＲＮＡの機能を変化させる、一本ｌＮＤＮＡ又はＲＮＡに 対して相補的なオリゴヌクレオチドとして定義される。ザメクニツク・ビー（Ｚ ａｍｅｃｎｉｋ、Ｐ、）及びエム・エル・ステ７エンソン（Ｍ、Ｌ、５ｔｅｐｈ ｅｎｓｏｎ）、グロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ ・サイエンス、ニーニスニー、７５：２８０２８４（１９７８）。

ウィルス複製及び遺伝子発現を抑制するのに使用するオリゴヌクレオチドを修飾 するのに使用されるべき連鎖停止剤は、例えば、ｄｄＴ（上記しそして実施例３ に述べられｔ；ように）、イソウレア基、ジメトキシトリチル基、又は実際３′ 修飾された機能（ｆｕｎｃｔｉｏｎ）であることができる。

連鎖停止剤の選択は、例えば、３’　ＯＨ基（逆転写酵素のための基買として作 用しうる）が存在しないこと；細胞毒性がないか又は低いこと：親油性：及びオ リゴヌクレオチドの水素結合特性を損なわないことに基づく。

毒ヘビ又は牌臓からのホスホジェステラーゼなどの３′又は５′エキソヌクレア ーゼは、１つのメチルホスホネートヌクレオシド間結合を通り越して進行するこ とができることが今回見出だされた。引き続く２つのこのような結合は、酵素活 性に対する強い妨害を構成し、このような酵素の存在下でのオリゴマーの半減期 を１００倍も増加させることができることも示された。エキソヌクレアーゼによ るオリゴデオキシヌクレオチドの分解からの良好な保護は、分子の各端部で最後 の２つの位置のメチルホスホネート結合を使用することにより得られる。これは 生体内での化合物の生き残りを高める。

ヌクレアーゼの分解を抑制することが知られている他の修飾は、チオホスフェー トによるヌクレオシド間ホスフェートの置換である。マツズラ・エイチ（Ｍａｔ ｚｕｒａ、Ｈ）及びエフ・エックスタイン（Ｆ、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ）、ヨーロピ アン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー、３：４４８（１９６８）。かく して、オリゴヌクレオチド配列中のホスフェートの一部又はすべてをチオホスフ ェートにより置換してヌクレアーゼによる分解を抑えることができる。

ヌクレオシド間ホスホロモルホリゾート及びホスホロピペラジン誘導体はヌクレ アーゼに対して抵抗性でありそしてＨＩＶ複製及び発現抑制性であることが示さ れた。オリゴヌクレオチドが細胞に入るためには非イオン性であることは必要で はない。故に、入り混じったイオン性及び非イオン性ヌクレオシド間結合を有す る種々のオリゴヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドは、ゲノム標的と有効 にハイブリダイゼーシ茸ンし、そして更に、修飾されていないオリゴマーよりも 特定の利点を有する。例えば、それらは、修飾されていないオリゴマーよりも細 胞ヌクレアーゼに対する大きい抵抗性を有しそして修飾されていないオリゴマー よりも細胞内の異なる分布をもたらす。このような性質は治療効率を高めること ができる。

ＨＴＬＶ−１［［感染細胞の抑制 上記しそして実施例３及び４に記載のオリゴデオキシヌクレオチド配列を使用し て、ＨＴＬＶ−ＩＩ＋複製及び遺伝子発現は組織培養中のＨＴＬＶ−ｍ感染細胞 においては抑制される。前記したオリゴデオキシヌクレオチドを、ＨＴＬＶ−１ １で感染した末梢ヒト血球（Ｐ　Ｂ）及びＨＴＬｖ−■で感染した形質転換した Ｔ−リンパ球（Ｈ９）細胞に加えた。オリゴデオキシヌクレオチドは、通常は時 間０においてのみ加え、抑制効果の観察は９６時間で行った。１つの場合には、 オリゴヌクレオチドを毎日新たな培養培地に３日間加えた。

実施例３に記載されたように、逆転写酵素活性及びウィルスＰ１５及びＰ２４タ ンパク質生産を、それぞれ、ＨＴＬＶ−１１［複製及び遺伝子発現の抑制のイン ティケータとして使用した。表１に示されそして実施例３に詳細に述べられた如 く、スプライス受容部位に対して相補的な２０ヌクレオチド配列をＨＴＬＶ−１ １［感染形質転換Ｔ−リンパ球に加えたとき、抑制は最大であった０本質的に総 ての実験条件下に抑制が観察された（表１参照）。

これに関して重要な考慮事項は、相補的オリゴデオキシヌクレオチドを加える濃 度及びそれらの投与のタイミング（スケジュール）である。表１に示されたよう に、オリゴデオキシヌクレオチドは、５−５０μｇ／ｍＱ培養培地の濃度で加え た。これらの濃度は、一般に抑制効果を生じるのには有効であるが、この範囲は 、これに限定するものと考えるべきではない。述べたように、オリゴデオキシヌ クレオチドは、通常−回でのみ加えられる。しかしながら、１日毎の添加（又は より頻繁な添加）は単一の投与よりは有効であると思われる。ＨＩＶで４日間感 染したＨ９細胞も又バイブリドンでその時点で処理されそしてＰＩ３及びＰ２４ タンパク質合成の抑制が観察されｔ；。

実施例４に記載の如く、Ｈ９細胞の懸濁液組織培養におけるＨＩＶの増殖及び発 現は、ウィルス逆転写酵素Ｐ１７及びＰ２４ウイルスタンノくり質合成、融合細 胞形成及び宿主細胞の増殖のアッセイにより監視した。

上述のオリゴマーで観察された抑制は、１０−１００μｇ／ｍＱの初期濃度で８ ０−９５％という高いものであり又はそのクラスのオリゴマーのすべてそうであ った。

ヒトにおけるＨＴＬＶ−Ｉ［１の抑制 組織培養におけるＨＴＬＶ−Ｉ［１感染細胞の抑制から得られる情報に基づいて 、エイズ患者及びエイズウィルスを持っているがその病気の症状は表れていない 個体におけるＨＴＬＶ−ＩＩＩの同様な抑制の方法を作り出すことが可能である 。

特定の個体を処置するのに使用される方法は、個体の状態及び地理の目的に依存 する。即ち、ＨＴＬＶ−１［［を有することが分かってし）るがエイズの症状を 示さない個体は、投与されるオリゴヌクレオチドの種類及び所定の投与量の両方 の点で、実際にエイズを有する個体とは異なって処理することができる。更に、 処理の目的が未感染細胞を保護すること又は既に感染した細胞に対する効果を与 えることにより処理は異なる。

例えば、ウィルスが潜伏していることが知られているがエイズの兆候はまだ表れ ていない個体は、逆転写を停止させる抑制効果を有するオリゴヌクレオチド（例 えば、プライマー結合部位及び／又は５′方向におけるプライマー結合部位に近 接した配列に対して相補的なオリゴヌクレオチド）の長期又は間欠的投与スケジ ュールを与えられることができる。

この方法では、ウィルス生存又は複製における第１段階が抑制される。

その理由はウィルスＤＮＡが生産されずそしてウィルスは増殖できないからであ る。しかしながら、エイズ患者では、細胞は既に感染しており、そして処理は感 染した細胞中に既に存在している遺伝子（ウィルスＤＮＡ）の発現を抑制しなけ ればならない。この場合に、例えば、ウィルスタンパク質をコードしている遺伝 子のための開始コドンに対して相補的なオリゴヌクレオチドがウィルス構成を防 止するのに必要である。エイズ患者では、未感染細胞は逆転写を妨げることがで きるオリゴヌクレオチドの投与により保護することもできる。

しかしながら、どんな処理状況においても、オリゴヌクレオチドは、最初血流中 にその後に細胞中にオリゴヌクレオチドが入ることができるように個体に投与さ れなければならない。或いは、ヌクレオシド間ホスフェート修飾によりヌクレア ーゼに抵抗性のオリゴヌクレオチドはカプセルの形態で経口的に取り込まれなけ ればならない。結果として、オリゴヌクレオチドは、所望の効果を有することが できる。即ち、ＨＴＬＶ−ｍ感染細胞に入ってウィルス複製を遅くするか又は防 止し及び／又はまだ未感染の細胞に入って保護を与える。

細胞内に存在すると逆転写を止めることができるオリゴヌクレオチド及び細胞内 に存在するとタンパク質合成を抑制するオリゴヌクレオチドは、静脈内注射、静 脈内点滴により又は経口的に投与することができる。

投与されるべき用量は患者のサイズ及び年令、病気の段階及び与えられるべきオ リゴヌクレオチドの種類などの７アクターと共に変わる。

試料中のＨＴＬＶ−ＩＩ［ウィルスの検出本発明のオリゴヌクレオチド配列は、 血液、尿、唾液及び涙などの試料中にＨＴＬＶ−Ｉ［［ウィルスが存在している か又は存在していないかを決定するのに使用することもできる。分析されるべき 試料のアリフォートを普通ＨＴＬＶ−ＩＩＩウィルスにより殺される細胞（例え ばＴ−リンパ球）の培養物に加える。これは対照である。ｖ／ｃ２のアリフォー トを上記のＨＴＬＶ−ＩＩＩゲノムの領域の１つ又はそれより多くに対して相補 的なオリゴヌクレオチドと共に１９２３球の別々の培養物に加える。両培養物は 、増殖に適当な条件下に維持し、ついで１９２３球の増殖について分析する（例 えば視察により／１ｍ徽鏡により）。ＨＴＬＶ−１［［ウィルスが存在する場合 には、対照試料中の１９２３球は殺されるであろう。又もしいなければ１９２３ 球は生き残る。しかしながら、試料中の１９２３球は、培養物に含まれた相補的 オリゴヌクレオチドにより与えられる保護の故に、成育可能であり続けるであろ う、２つの試料の視察による比較は、ＨＴＬＶ−Ｉ［［ウィルスが各々の中に存 在しているか存在していないかを決定することを可能とする。

ＨＴＬＶ−Ｉ［１以外のレトロウィルスの抑制上記の如く、ＨＴ　Ｌ　Ｖ　−Ｉ ＩＩ以外のレトロウィルスの複製を抑制するのに本発明のオリゴヌクレオチド及 び方法を使用することが可能である。

これらの用途では、普通のレトロウィルス複製又は遺伝子発現のためにその機能 が必要であるところの高度に保存されｔ；レトロウィルスゲノムの領域に対して 相補的なオリゴヌクレオチド配列が使用されるであろう。

例えば、ヒトに病気を引き起こす他のレトロウィルスはＨＴＬＶ−Ｉ及びＨＴＬ Ｖ−Ｉｔ（白血病を引き起こす）及びＨＩＶ−２（エイズを引き起こす）である 。

ＨＴＬＶ−Ｉ　ＲＮＡの領域に対して相補的なオリゴマーが製造されそしてＨＴ ＬＶ−ＩＩＩについて述べられたアッセイ（実施例３）と同様なアッセイにより ウィルス増殖を抑制することが示された。この研究に使用した配列は下記のとお りである。

１　、５’−ＡＧＡ　ＡＧＣＣＧＡ　ＡＡＣＡＧＣＡＴ　ＡＣＴ２　、５’−Ｇ ＧＧ　ＣＴＧ　Ａ、ＴＡ　ＡＴＡ　Ａ、ＧＣＡＴＧ　ＣＴ３　、５’−ＧＣＣＧ ＡＴ　ＡＡＣＧＣＧ　ＴＣＣＡＴＣＧＡ４−５’−ＧＧＧ　ＧＡＧ　ＴＡＴ　Ｔ ＴＧ　ＣＧＣＡＴＧ　ＧＣ５、５’−ＡＣＴ　ＧＴＡ　丁ＡＣＴＡＡ　ＡＴＴ６ 　、５’−ＣＣＣＣＡＡ　ＣＴＧ　ＴＧＴ　ＡＣＴオリゴヌクレオチド１４は、 ＨＴＬＶ−Ｉの３′末端近くのいわゆる″Ｘ″領域における推定上タンパク質開 始部位に対して相補的である。

オリゴヌクレオチド５及び６は、プライマー結合部位領域に対して相補的である 。（ＨＴＬＶ−Ｉについてはセイキ・エム（Ｓｅｉｋｉ、Ｍ、）等、！エシーデ インダス・オブ・ザ・ナシ２ナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ、ニーニス ニー、８０：３６１８（＋　９８３）参照）。

これらのすべては、ＨＴＬＶ−１に対して抑制性であることが示された。

スプライス部位、プライマー結合部位、キャップ部位、ポリアデニル化シグナル 、パッケージングングナル及びタンパク質部位はハイブリダイゼーション阻止の Ｉ；めの標的となるらしい。

ＨＩＶ−２は、ヌクレオチド配列には相当な差があるけれども［エム・グアイダ ー（Ｍ、Ｇｕａｙｄｅｒ）等、ネイチャー、旦２６：６６１（１９８７）］、Ｈ ｒＶ−１に対する全体の構造及び生物学的効果におけると同様であることが示さ れＩ；。オリゴヌクレオチドの作用のための類似した標的部位が、ＨＩ　Ｖ−１ の場合の如＜ＨＩＶ−２に存在する。１つの（共通の）オリゴヌクレオチドがＨ ＩＶ−１及びＨＩＶ−２両ウィルスの復製及び遺伝子発現を抑制するのに有効で あるためには、ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２の両者Ｉ；おいてプライマー結合部位 領域の配列のみが類似していさえすればよいらしい。

他のウィルスの抑制 本発明のオリゴヌクレオチド及び方法は、ヒト、動物又は植物に対する病原性ウ ィルスの活性を抑制するのに使用することができる。レトロウィルスの抑制につ いて上記したように、ＤＮＡ及びＲＮＡウィルスのウィルスＲＮＡ又はウィルス ＤＮＡに対して相補的なオリゴヌクレオチドが、ウィルス複製及び遺伝子発現を 抑制するのに使用されるであろう。

成る場合には、ウィルスＤＮＡが相補的なオリゴヌクレオチドの標的となること も可能である。ＲＮＡ上の特に有用な標的部位は、タンパク質の結合又は認識部 位（例えば、スプライス部位、タンパク質量ｔＩｉ！部位、ポリアデニル化シグ ナル、ｍＲＮＡのキャップされた末端、バフケージングシグナル、プライマー結 合部位）として作用する標的部位である。

ウィルスが高すボヌクレアーゼＨ濃度を有する細胞に感染するこれらの場合に、 ウィルスＲＮＡ又はｍＲＮＡ内に存在しそして宿主ＲＮＡには見出だされない配 列は許容できる部位であろう。その部位へのオリゴヌクレオチドの結合は、ハイ ブリダイズしたＲＮＡの酵素による分解をもＩ；らし、従ってウィルスの不活性 化をもたらすであろう。

他のウィルスにおける標的部位の例は下記のとおりである。

１、足及び口腔疾患ウィルス １　、５’−ＣＧＴ　ＧＡＡ　ＴＴＣＣＴＡ　ＣＴＴ　ＴＣＣＴＧ。

２　、　５’−ＡＣＣＣＴＡ　ＧＣＧ　ＣＣＣＣＣＴ　ＴＴＣＡＡ。

オリゴヌクレオチドｌの配列は、このウィルスにより使用される唯一の公知のタ ンパク質開始部位に対して相補的である。ロバートソン・ビー・エイチ（Ｒｏｂ ｓｒｔｓｏｎ、Ｂ、Ｈ，）等、ジャーナル・オブ・ピロロジー、旦４：６５１（ １９８５）。オリゴヌクレオチド２の配列はウィルスのキャンブト末端に対して 相補的である。ハリス・ティ・ジエイ・アール（）Ｉａｒｒｉｓ、Ｔ、Ｊ、Ｒ， 、）等、ジャーナル・オブ・ピロロジー、３６：６５９（１９８０）。

２、黄熱ウィルス １　、　５’−ＣＧＡ　ＣＣＡ　ＧＡＣＡＴＧ　ＴＴＣＴＧＧ　ＴＣ。

２　、　５’−ＡＴＴ　ＡＧＣＡＣＡ　ＣＡＧ　ＧＡＴ　ＴＴＡ　ＣＴ。

オリゴヌクレオチドｌの配列はタンパク質開始部位に対して相補的であり、オリ ゴヌクレオチド２の配列はキャンブト末端に対して相補的である。ライス・シー ・ゴム等、ニエ玉Ｚ五、又λゴレ７２６（１９８５）。

３、水痘−帯９．’ｙ　４　／Ｌ−／Ｃ（Ｖａｒｉｃｅｌ　ｌａ；ｏｓｔｅｒ　 Ｖｉｒｕｓ）水痘−帯状庖疹ウィルスは７０個の遺伝子を有しておりモしてスプ ライス部位を含めて標的部位を十分に持っている。例えば、第１遺伝子のタンパ ク質開始部位に対して相補的な配列５’−ＣＣＴ　ＡＧＧ　ＣＧＴＴＡＣＡＧＧ 　ＴＣＣＣＡを、本発明の方法に従って使用してウィルス機能を抑制することが できる。ダビソン・ニー・ジエイ及びジエ水痘−帯状庖疹ウイルスと動揺に、ヘ ルペス・シンプレックス・ウィルスは、多くの標的部位を有する非常に大きなウ ィルスである。ヘルペス・シンプレックスｌの主要なカプシドタンパク質のタン パク質關始部位に対して相補的な配列は、５’　−ＧＧＡ　ＧＣＧ　ＧＣＣＡＴ ＧＧＧＧ　ＴＣＧ　ＣＧである。ダビソン・エイ・ジエイ及びジエイ・イー・ス コツト、ジャーナル・オブ・ジェネラル・ピロロジー、６７：２２７９（１９８ ６）。

５、植物ウィルス ハイブリダイゼーション阻止技術を適用できる植物ウィルスの例は、キュウリモ ザイクウィルスである。その関連したＣＡＲＮＡ５サテライトＲＮＡは、配列決 定されており、この小さなＲＮＡ分子は植物における致死的壊死を誘発するのに 重要な役割を果たすことが見出だされｔ；。

リチャード・ケー・イー、ピロロジー、８９：３９５（１９８７）。株によるこ の分子の配列変動は、非常に限られている。かくして、エーロゾル又は他の手段 により投与されるバイブリドン治療によるこのウィルスのこの不変の特徴の機能 の妨害は、新しい形態の植物ウィルス化学療法これらの共有結合により閉じｔ； 円形の低分子量の一本ＭＲＮＡ（分子量約１００，０００）は、多分植物及び動 物の感染症の最小の知られた作分子ＲＮＡとウィロイドのスプライス接合部は、 例えば、バイブリドン抑制のための誘引性標的部位を与える。ディーナー・ティ ・オー、プロシーデインダス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイ エンシズ、ニーニスニー、ヱ旦：５０１４（１９８１）。例えば、エーロゾル治 療又は植物根の領域の土壌への添加は治療上有用である。

他の感染性作用因子の抑制 本発明のハイブリダイゼーション阻止法はウィルスに限定されるものではない。

バクテリア、カビ、原虫及び虫を包含する他の感染因子を抑制することができる 。この方法のこれらの用途では、感染因子の生存可能性に必須の感染因子のＲＮ Ａに対して相補的なオリゴヌクレオチドを使用する。オリゴヌクレオチドは、前 記したのと同じタイプの標的部位に対して向けられ、そして宿主ＲＮＡ配列に対 して相補的であるべきではない。トリパノソーマ属　トリパノゾーマ・ブルーセ イ・ガンビエン２（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ　ｂｒｕｃｅｉ　ｇａｍｂｉｅｎｓ ｅ）（アフリカ眠り病の原因となる原虫）を抑制するオリゴヌクレオチドの例は 、１　、　５’−ＴＡＣＣＡＡ　ＴＡＴ　ＡＧＴ　ＡＣＡ　ＧＡＡ　ＡＣ２、５ ’−ＡＣＴ　ＧＴＴ　ＣＴＡ　ＡＴＡ　ＡＴＡ　ＧＣＧ　ＴＴである。

オリゴマー１はこの生物の総てのＲＮＡの５′末端で見出されるミニエクソンに 結合するのに使用されるスプライス供与部位に対して相補的である。オリゴマー ２は、同じミニエクソンの５′末端に対して相補的である。キャンプベル・デー ・ニー（Ｃａｍｐｂｅｌｌ、Ｄ、Ａ、）等、ネイチャー、同様な状況がリーシュ マニアにおいて見出だされる。この場合には、原虫（即ち、トリパノゾーマ・ブ ルーセイとリーシュマニア）間の相当な配列相同性がある。上記のトリパノゾー マ・ブルーセイに対するオリゴ１　、５’−ＴＡＣＣＡＡ　丁ＡＡ　ＡＧＴ　Ａ ＣＡ　ＧＡＡ　ＡＣ２、５’−ＡＣＴ　ＧＡＴ　ＡＣＴ　ＴＡＴ　ＡＴＡ　ＧＣ Ｇ　ＴＴである。

トレマトーダ　７アシオーラ拳へバチ力（ｔｒｅｍａｔｏｄｅ　Ｆａｓｃｉｏｌ ａ　ｈｅｐａｔｉｃａ）、肝臓ジストマ（ｌｉｖｅｒ　Ｎｕｋｅ）の雌生殖複合 体（ｆｅｍａｌｅ　ｇｅｎｉｔａｌ　ｃｏ＋ａｐｌｅｘ）によく見られるタンパ ク質の開始部位に対して相補的なオリゴヌクレオチドは、５’−ＴＣ；Ａ　ＡＡ ＣＴＴＣＡＴＴ　ＴＴＴ　ＣＡＧＴＧである。ズリタ・エム等、プロシーデイン ダス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス、ニーニスニー、 −ムエ：２３４０（１９８７）。

他の標的酵素は杭カビのためのキチンシンセターゼ及び抗バクテリアのためのア ラニンラセマーゼである。

非感染状態の制御のためのバイブリドンの使用バイブリドンは、所定のタンパク 質又は酵素のレベル又は活性を減少させることが望ましい状況で有利である。こ れは、タンパク質又は酵素のためのｍＲＮＡ上の独特の部位に対して相補的なオ リゴヌクレオチド及び前記したこれらの部位についての同じ基準を用いて達成さ れる。この方法が有利である例は下記する。

≧咥！ 精子形成、精子運動、精子の卵子への結合又は精子生存可能性に影響する任意の 他の段階において主として又は排外的に関与する構造タンパク質又は酵素の合成 を抑制するオリゴデオキシヌクレオチドを、男性の避妊薬として使用することが できる。同様に、女性の避妊薬は、排卵、受胎、着床又はこれらのプロセスに関 与したホルモンの生合成に関与したタンパク質又は酵素を抑制するオリゴデオキ シヌクレオチドであることができる。

心臓血管疾患 高血圧は、レニン／アンギオテンシン系においてアンギオテンシン転化酵素又は 関連酵素の合成を抑制するオリゴデオキシヌクレオチドにより制御され得、血小 板凝集は、心筋及び脳循環系疾患、硬塞、動脈硬化症、塞栓症及び血栓症に使用 するためのトロンボキサンＡ２の合成に必要な酵素の合成の抑制により制御する ことができ、動脈壁のコレステロールの付着は、脂肪アシルコエンザイムＡ：動 脈硬化症におけるコレステロールアシルトランスフェラーゼの合成の抑制により 抑制することができ、コリンホスホトランスフェラーゼの合成の抑制はハイボリ ピデミア（ｈｙｐｏｌ　１ｐｉｄｅ＋ｍ１ａ）に有用である。

神経疾患 神経疾患の有害な効果を減少又は排除するために、ハイブリダイゼーション阻止 を使用することができる多数の神経疾患がある。例えば、モノアミンオキシダー ゼの合成の抑制は、パーキンソン病に使用することができる、カテコール０−メ チルトランスフェラーゼの抑制は、抑うつ症をしよちするのｊこ使用することが でき、インドールＮ−メチルトランスフェラーゼの抑制は精神分裂病の処置に使 用することができる。

プロスタグランジ：／ プロスタグランジン及びロイコトリエ冒こ導くアラギドン酸カスケー臼；おける 選ばれた酵素の抑制は、血小板凝集、アレルギー、炎症、どう痛及びぜん息の制 御６二有用である。

癌 種々の抗癌剤に対する耐性の発現を担っておりそして化学療法における主要な障 害である多重薬剤耐性（ｏ＋ｕｌｔｉｄｒｕｇ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅＸｍｄｒ ）遺伝子により発現されるタンパク質の抑制は、癌の処置に有利であることが証 明される。密接に関連したマウスタンパク質におけるタンパク質開始部位番二対 して相補的な配列は、５’　−ＣＣＣＡＧＡ　ＡＴＣＡＴＧＣＡＣＡＧＣＴＴで ある。グロス・ピー（Ｇｒｏｓ、Ｐ、）等、！土、土ヱ：３７１（１９８６）。

この配列又は一度解明されたヒトｍｄｒ遺伝子に対して相補的な配列は、タンパ ク質発現を抑制又は抑止するのに使用することができる。

本発明のハイブリダイゼーション阻止方法及び適性な配列のオリゴヌクレオチド を使用する膿瘍遺伝子によりコードされているタンパク質の抑制も有用であるこ とが証明される。

その他 ハイブリダイゼーション阻止方法の使用が価値があることが証明される他の種々 の疾患がある。例えば、アルドースレダクターゼの合成の抑制は糖尿病の合併症 を防止するのに有利であり、グリコール酸オキシダーゼの抑制は、シュウ酸カル シウムの結晶化［腎臓結石（ｒｅｎａｌ　ｌ１Ｌｈｉａｔｉｏｎ）、原発性高ン ユウ酸尿症（ｐｒｉｍａｒｙ　ｈｙｐｅｒｏｘａｌｕｒｉａｓ）、腎石（ｋｉｄ ｎｅｙ　５ｔｏｎｅｓ）］を防止するのに有利であり、カルボニックアンヒドラ ーゼの抑制は線内症に有用であり、真性赤血球増加症におけるヘモグロビン合成 の抑制は治療上動けとなりうる。

本発明を下記の実施例により更に説明する。：、わらの実施例はいずねにせよ限 定することを意図するものではない。

実施例　ｌ　ヱ且数ヱ！−±玄１２±ノ゛工上９塗！盈ｙ芳ρ汲？未修鮪のオリ ボデオキ・ンヌクレオチドが、自動Ｄ　Ｎ　／’、合成機（パイオサ−・チ［Ｂ ｉｏｓｅａｒｃｔ＋）　Ｓ　Ａ　Ｍ　Ｉ　）を使用して、標準的な；・リエスデ ル（ｔｒｉ−ｅｓｔａｒ）又はホスフォルアミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉ ｄｉｔｅ）化学を用いて、合成された。Ｍ、Ｊ、ターｔ（ＧａＮ）編、Ｏｌｉｇ ｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ、１．Ｒ，Ｉ７．プレス発行参照 。保護基を除去した後、生成物を最初にメルク（Ｍｅｒｅｋ）シリカゲル６０ｉ Ｆｌクロマトグラフィー板上で１−プロパツール：濃アンモニ７二水（５５：　 ３５　；　１０）を用いて精製し、エタノール：水（１：３）で溶離した。必要 な場合は、ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）の５ＡＸＲａｄ−ｉａｌ−ＰＡＫカー トリッジを用いる、高圧液体クロマトグツフィーにより、又はポリアクリルアミ ドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により更に精製を行つｔ；。合成、分離及び分析手 法は詳細に記載されている。上記のＭ、Ｊ、ゲートの文献を参照のこと。末端３ ′−デオキシチミジン（ｄｄＴ）を有するオリゴヌクレオチドは溶液相トリエス テル法によって製造された。この方法はＳ、Ａ、ナラング（Ｎａｒａｎｇ）等に より、Ｌ、グロスマン（Ｇｒｏｓｓｍａｎ）及びに９モルデーブ（Ｍｏｌｄａｖ ｅ）１！、アカデミツク・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）　（１９８ ０年）発行のＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙｓ　６５：６１０− ６２０に詳細に記載されており、その教示を参照して参考とされたい。ｄｄＴ（ シグマ［Ｓｉｇ＋ａａ］　）は保護基のないカンプリング反応で直接に使用され た６ｆｉ終生成物は２闘の厚さのシリカゲル板（アナルテック［Ａｎａｌｔｅｅ ｈｌ　）上で上記のように最初に精製され、続いてＤＥＡＥセルロースを用いた カラム・クロマトグラフィーにより０．０２Ｍ−０，８Ｍのトリニゲ・ルアンモ ニウム炭酸水素ナトリウムを用いるグラジェント溶離法により精製された。

オリゴヌクレオチドはＴ４ポリヌクレオチドキナーゼにより５′−末端標識され 、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により精製され、マクサム−ギ ルバート（Ｍａｘａｍ−Ｇｉ　１ｂｅｒｔ）法又は遊走斑点法（ｗａｎｄｅｒｉ ｎｇｓｐｏｔ　ｍｅｔｈｏｄｓ）のいずれかにより配列を決定した。Ａ、Ｍ、マ クサム及びＧ。

ギルバート著、■１．グロスマン及びに６モルデーブ編、アカデミツク・プレス （１，９８０年）発行のＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙｘ　４９ ９−５６０頁；Ｅ、ジエイ（Ｊａｙ）等、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ ｅａｒｃｈ、ｌ：３３１−３５３（１９７４）参照。この大きさの７ラグメント のマクサム−ギルバート配列決定のｔ；めには、反応時間を３７℃で最高３０分 間まで増やすことが必要であることが見出された。オリゴデオキシヌクレオチド の３′末端におけるｄｄＴの存在は、エキソヌクレアーゼ蛇毒ホスホジェステラ ーゼの作用を阻害するようには見えなＨｅＬａ細胞を懸濁培地中で増殖させ、６ ００Ｘｇで５分間遠心して濃縮し、血清を用いないダルベツコ（Ｄｕ　１ｂｅｅ ｅｏ）改質イーグル（Ｅａｇｌｅ）培地（ＤＭＥ）ｌ窺Ｑ当たり５ＸＩＯ’ない し５×ｌＯ切濃度で再分散し、氷上に保存した。試験される合成オリゴデオキシ ヌクレオチＦ（ｉｍｌ長１０−３０ヌクレオチド）を５′−末端で血清を除いｆ ニー　Ｄ　Ｍ　Ｅ中に２Ｘ１０’ｃｐｍ／ｎｍｏｌに溶解しｌ；ポリヌクレオチ ドキナーゼメこより３：Ｐで標識し、Ｈｅ　Ｌ　ａ懸濁液に添加した（０．７ｍ Ｑの氷冷したＨ　ｅ　Ｌ　ａ懸濁液に４０μａのオリボデオキ／ヌクレオチド溶 液）。一方内部的に標識しＩ；オリゴヌクレオチドを発現させるために、その中 の一つを５′工２Ｐｉｌｌ識しＩ；二つのデカマーを、その一部はデカマーの一 つの５′末端に相補的であり、及びその一部は他のデカマーの３゛末端に相補的 である、オリゴデオキシヌクレオチド（１２ヌクレオチドの鎖長）の存在におい て、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼにより結合した。ＨｅＬａ結合中の標識されたオリゴ デオキシヌクレオチドの濃度は、通常ｌＸｌ０−’ないしｌＸｌ０−７Ｍであっ た。細胞を滅菌条件下で３７℃で最高２０時間インキコベートしｔ；。試料を０ ℃に冷却し、ＤＭＥでｌＱｍＱに希釈し、軽く遠心して細胞をベレット化した。

上澄液を取り出して１天、遠心管を濾紙上にあけた。次いで細胞のベレットを６ 回、各回共９顧の氷冷したＤＭＥ中で洗浄した。上澄液を集めてｓｌの放射能を 検査した。６回の洗浄によって洗液中には実際に放射能は検出されなかった。次 いで細胞ベレットを０゜７ｍＱの氷冷しｌ：　Ｄ　Ｍ　Ｅで再分散し、メルク） ・ロボレーシ５ン（ｅｌｅｃｔ、−ｒｏｐｏｒａｔ　１ｏｎ）容器に移した。エ レクトロボレーシ！Ｉ：／はボッター（Ｐｏｔｔｅｒ）及び共同研究者により、 ボッター等、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃ −ａｄｅｍｙ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ、　８１ニア１５６−７１６５ （１９８４）に記載された技術の変法により、０℃で行われた。上記文献を参照 して参考とされたい。エレクトロボレーン１ンの間に、短い高圧パルスを細胞ベ レットが含まれるエレクトロポレーシ！ン容器に印加した：この方法で、細胞膜 は一時的に漏れ易く又は多孔性となり、オリゴヌクレオチドが細胞の外に出るこ とが可能となっ！；。工し−クトロボレーシ２ン容器はエレクトロポレーン葺ン 後、氷浴中に１５分間保持された。内容物を１．５ｍ（ｌのエツベンドル７　（ Ｅｐｐｅｎａｏｒ　ｆ　）マイクロ遠心（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ）管中に移し、１ ２．０００ｘｇで５分間遠心した。上澄溶液（即ち、細胞に入ったオリゴマー） を取り出し、上澄液とベレット（核及び細胞膜成分を含んだ）の両者の放射能を シンチレーション計数により測定した。

この方法の二つの他の変法も外部的に添加された標識されたオリゴデオキシヌク レオチドがＣＥＦ及びＨｅＬａ細胞に入るか否か測定するために使用された。７ ５ｃｔａ”７アルコン（Ｆａｌｃｏｎ）フラスコ中で単一層で増殖したＣＥＦ細 胞の場合には、血清を含むＤＭＥ培地を取り出し、血清を含まないＤＭＥで細胞 を一回洗浄し：３！Ｐオリゴデオキシヌクレオチドを含む２＋ＱのＤＭＥを添加 し；得られる混合物を３７℃で１５分間インキュベートした。次ぎに細胞を３７ ℃（周囲温度）で６回洗滲し、各回共１？−のＤＭＥを使用した。次いで２顧の ＩＮ蟻酸を添加し、細胞を氷上龜１５分間保持した。ＣＥＦ又はＨｅＬａ細胞に ついても、インキュベーション後、ＩＮの蟻酸の代わりに、細胞を溶解するため に蒸留水を添加した以外は、同じ手順を行った。両方の方法共に結果は類似して いた；放射能の約半分が細胞の非沈降画分と関連していたのと同様に、約半分が 核及び細胞膜画分（１２，ＯＯＯｘｇで５分間遠心することにより沈降した）と 関連していた。

ＩＮの蟻酸又は蒸留水のいずれかを用いる標識された細胞の処理が放射性標識さ れたオリゴマー（細胞の内部に決して侵入しなかった）の細胞膜画分からの解離 を起こす可能性は、既述の上記の改良エレクトロポレーション技術を用いること によって試験された″。エレクトロポレーションを用いる結果は、低張度（ｈｙ ｐｏｔｏｎｉｃｉｔｙ）又はｌＮｍ１酸により細胞が破壊される場合と一致した 。

これらの試験は記載されｔ；ような培養細胞によるＺ２ｐ−オリゴヌクレオチド の取り込みを評価することを可能とする。外因性のオリゴデオキシヌクレオチド によるウィルスの複製の阻害は、細胞によるそれらの充分な量の取り込みに依存 する；これは内因的に転写された又は微量に注射された（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃ ｔｅｄ）抗−センス（ａｎｔ　１−ｓｅｎｓｅ）　ＲＮ　Ａが使用された時には 事情が異なる。培養された哺乳類の細胞のオリゴデオキシヌクレオチドに対する 透過性は、これらの試験により下記の通りであることが示された： ｌ）記載された実験方法下で、内部的に又は末端部のいずれかを１２ｐで標識さ れた２０−ヌクレオチド配列物の細胞中への取り込みは初期の数時間のインキュ ベージ１ンの間に増大したａｌｘｌＯ−ｔＭの外部濃度で、３７℃で４時間のイ ンキュベーション後内部的に標識された２０−ヌクレオチド配列、ＴＡＧＴＣＴ ＣＡＡＴ−”Ｐ−ＧＧＧＣＴＧＡＴＡＡはＨｅＬＡＪＩ！ｌ！の内部で約２８１ Ｏ−”Ｍに達した。上記と同じ条件を用いて行われた他の実験において、２Ｘｌ Ｏ−’Ｍの外部濃度で、３７℃で１５分間のインキュベーション後、内部的に標 識された２０−ヌクレオチ１’配列、ＴＡＧＴＣＴＣＡＡＴ−３”Ｐ−ＧＧＧＣ ＴＧＡＴＡＡはＣＥＦ細胞の内部で見掛は上約１．５ｘｌＯ−＠Ｍの濃度に達し た。

２）エレクトロポレーションにより、１５分間及び４時間の期間において、ニワ トリ胚繊維芽細胞から放出された標識されたオリゴデオキシヌクレオチドは、ホ モ混合物（ｈｏｍｏｍｉｘ）Ｖ中の薄層ＤＥＡＥ板上での移動、Ｅ、ジェイ等、 Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、ｌ：３３１−３５３（１９７ ４）、及びオリゴデオキシヌクレオチド標識物を用いるＰＡＧＥによる双方から 判断して、極めて健全であった。しかし、オリゴデオキシヌクレオチドの分解は インキュベーションの時間毎に増大した。２０時間までに、オリゴデオキシヌク レオチドの両分の多くは細胞内的に及び細胞外的にも分解したが、分解しないオ リゴマーもまだ検出され、所望の阻害効果を得るためには充分長期間を要した。

３）末端を標識されたオリゴデオキシヌクレオチドは、内部的に標識する。これ は部分的に又は完全にイ゛オン性のオリゴマーが細胞内に入ることを示し゛でい る。それらの細胞内の所在はオリゴヌクレオチド上の修飾基の性質に依存する。

細胞侵入（ｅｎｊｒｙ’）の明らかな証拠は、蛍光染料ローダミンに共有結合的 に結合したオリゴマーの使用から得られる。これらの研究は実験的生物学のため のワーセスター財団（Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ　Ｆｏｕｎｄａ−Ｌｉｏｎ　ｆｏｒ’ 　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｙ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）のダヴイッド・ウルツ（Ｄａ ｖｉｄ　Ｗｏｌｆ）博士の協力を得て行われｔｇ。ヌクレオシドに共有結合的に 結合したローダミンはＨｅＬａ細胞に侵入しない。１２−量体のデオキシヌクレ オチドオリゴマーに結合したロニダミンは零時間では細胞に侵入しない。３７℃ で４５分間インキュベーション後、オリゴマーに結合したローダミンはローダミ ン励起波長により誘発される強い蛍光により可視的となり、実際に総てのＨｅ　 Ｌ−Ａ細胞の核仁笈び被膜中に見出される。３７℃でインキュベ−ション後直ち に、細胞をインキュベーション培地内でローダミン−オリゴマーを除くために洗 浄すると、蛍光は細胞表面には見られＨＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡＶゲノムの主要な ヌクレオチド配列は、数グループの研究者により上記のように最近数年間で決定 された。下記のゲノムの領域がオリゴヌクレオチド競合的阻害標的として選択さ れた：ａ）プライマーｔＲＮＡ１１結合（会合）部位へのヌクレオチド５′の配 列：ｂ）プライマー結合部位及び５′の方向に隣接する区域にまたがる（ｓｔｒ ａｄｄ−１ｉｎｇ）配列；ｃ）プライマー結合部位における配列；ｄ）３’読み 取り枠（ｏｐｅｎ　ｒｅａｄｉｎｇ　ｆｒａｍｅ）区域を発現する、プレ（ｐｒ ｅ）　−ｍ　ＲＮ　Ａのスプライス（ｓｐｌ　１ｃｅ）部位（即ちスプライス供 与部位、スプライス受容部位）からの配列。Ｊ、ソドロスキ（Ｓｏｄｒｏｓｋｊ 　）等、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｖｉｒｏ１ｏｇｙ１５５：８３１−８３５（１ ９８５）　；　Ｆ、ワンブースタール（Ｗｏｎｇ−５Ｌａａｌ）及びＲ，Ｃ，ガ ロ（Ｇａ　１１ｏ）、＊狭−ｕｒｅ、３１７：３９５−４０３（１９８５）参照 。ＨＴＬＶ−１［１／ＬＡＶゲノム上ノソレらの位置は第１図に示されている。

ＨＴＬＶ−ｎｌ中のｔＲＮＡ”’プライマー結合部位に、５″一方向に直接隣接 する区域の相補的な、又はプライマー結合部位に相補的な数種の配列が合成され た。これらは１２−ヌクレオチド配列（５’ＣＴＧＣＴＡＧＡＧＡＴｄｄＴ）　 、２０−ヌクレオチド配列（５°−ＣＴＧＣＴＡＧＡＧＡＴＴＴＴＣＣＡＣＡＣ ）　、及び（ｐＡ）ｓ　（５’　ＴＴＣＡＡＧＴＣＣＣＴＧＴＴＣＧＧＧＣＧＣ ＣＡＡＡＡ）の３″末端非相補的的末端部を有する２６−ヌクレオチド配列であ る。第」表に示すように、１２−ヌクレオチド配列はプライマー結合部位に近い （５°の方向に）ヌクレオチドの配列に相補的である：２０−ヌクレオチド配列 も又５′の方向に向かってプライマー結合部位に近い配列に相補的であり、１２ −ヌクレオチド配列の最初の１１ヌクレオチド、並びに他の９の配列を含んでい る。２６−ヌクレオチド配列はプライマー結合部位に相補的である。これらのオ リゴデオキシヌクレオチドは、ＨＴＬＶ−ＩＩＩ−感染細胞の培養物について試 験された；それらは第１表（第３欄）に示すように濃縮物として培養基に添加さ れた。逆転写酵素活性及びウィルス−コード化（ｅｎｃｏｄｅｄ）　ｐ　１５及 びｐ２４蛋白質の生産の両者が、ウィルスの複写の阻害及び遺伝子発現の阻害を 決定するために測定された。

プライス受容部位に相補的である、ＡＣＡＣＣＣＡＡＴＴＣＴＧＡＡＡＡＴＧＧ の配列を有するオリゴヌクレオチドが、５０μｇ／ｒＩＱ（９ｘｌＯ−’Ｍ）添 加されｔ；時に生じた。表に示すように阻害％はオリゴデオキシヌクレオチドを 用いないでインキュベートされたＨＴＬＶ−１［［−感染細胞に対して得られた 対照値との比較を基準としている。第１表（第７−９１１）に示すように、この 配列物が用いられた場合、逆転写活性は６７％だけ、ｐ１５蛋白質生産は９５％ だけ、及びｐ２７蛋白質生産は８８％だけ阻害されｔ；。オリゴデオキシヌクレ オチドは丁度−回（零時間に）添加され、阻害効果は９６時間目に観察された。

第１表に示すように、他のオリゴデオキシヌクレオチドを用いても顕著な阻害が 見出されＩこ。

例えばｔＲＮＡ１１プライマー結合部位に対し、ＨＴ　Ｌ　Ｖ　−ＩＩＩ／Ｌ　 ＡＶゲノムの５′方向に隣接する区域に対し相補的な１２量体配列物が、第１表 に示すような濃度でＨＴＬＶ−Ｉ［［−感染細胞に添加された時に、逆転写活性 はＨ９細胞で１０−１７％、及びＰＢ細胞で３０−４０％阻害された。ウィルス のｐ１５及びｐ２４蛋白質生産はＨ９細胞中で夫々１５％及び３５−５０％だけ 阻害された。ＰＢ細胞中ではｐ１５蛋白質生産の阻害は０−３５％及びｐ２４蛋 白質の生産の阻害は１７−５０％の範囲であった。総ての三つの活性の５０％の 阻害は、ＰＢ細胞においては２０−ヌクレオチド配列物の添加の結果として観察 された。組織培養中におけるラウス肉腫ウィルスの阻害に関する研究によれば、 競合するオリゴデオキシヌクレオチドを毎日添加することは零時間に一回投与す るよりは効果的であるように思われる。Ｐ、Ｃ，ザメクニク（ｚａｍｅｃｎ　ｉ ｋ）及−ｄｅｍｙ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｉｅｓ、　ＵＳＡ％　７５：２８０−２ ８４（１９７８）参照。これは効能の測定は９６時間目に行われるから、又添加 されたオリゴデオキシヌクレオチドの時間的に関連する細胞内的及び細胞外的分 解とも一致する。ＨＴＬｖ−■に対する他の化学的治療剤のアッセイにおける全 体的な変動は±５％の近傍にあるから、オリゴデオキシヌクレオチドが試験され る場合、著しく高度である（第１表参照）。これはＨ９及びＰＢＳ細胞の組織培 養中の細胞内及び細胞外双方の変動するヌクレアーゼ活性に関連させることがで きる。かような効果はオリゴデオキシヌクレオチドの低濃度において一層顕著と なる。ｄｄＴ、イソ尿素基、他の連鎖停止剤により、又はホスホロチオエート、 ホスホロモルホリゾート、ホスホロピペラジン、及びホスホロアミデートのよう な、ヌクレオシド間燐酸修飾により３″末端を保護されたオリゴデオキシヌクレ オチドは、一般に上記のものよりは一層効果的な阻害剤であることを認めること ができる０例えばラウス肉腫ウィルスの阻害に関する研究により、５′及び３′ 末端を保護されたバイブリドン（ｈｙｂｒ　１ｄｏｎ）は未保護の５′及び３′ 末端を有するハイの結合部位に近い場所での複製の開始の防止に関して特に適切 である。

Ｈ９細胞の組織培養中のＨＩＶの増殖及び発現が、ウィルス逆転写酵素、ｐ１７ 及びｐ２４２４蛋白質、融合細胞形成、及び宿主細胞増殖のアッセイにより検査 された。ウィルス及びオリゴデオキシヌクレオチドが零時間に培養基に添加され 、インキュベージ２ンが３７℃で９６時間行われた。同じ配列（１５量体又は２ ０量体のいずれか）の各種のオリゴマーが阻害的性質について比較された；オリ ゴマーが含まれた未修飾のオリゴマーと比較され；総てのヌクレオシド間燐酸が ホスホロチオエート、ホスホロモルホリゾート、又はホスホロピペラジン誘導体 のように修飾されたオリゴマー；及び上記の修飾剤により丁度３″及び５゛末端 比較された。

可能性ある阻害のための標的部位も、又主な焦点をスプライス供与及び受容部位 、及びイニシェーシヨン（ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ）及びキャップ部位に置いて各 積行われｔ；。標的部位及び結果は第３−７表に示されている。−回の実験内で は、これらの修飾された又は未修飾のオリゴマーによるウィルスの増殖の阻害の 度合の比較は再現性がある。種々な時間で繰り返された実験において及び異なる バッチのウィルスを用いて誘発された阻害の度合には顕著な可変性が生じた。こ の変動の理由は不明である。

上記のパラメーターの８０−９５％はども大きいＨＩＶの増殖及び発現の阻害が 、総てのこれらの部類のオリゴマーの１０−１００μｇ／ｗ（１の初期濃度で観 察された。ＧｌＣ及びＴのホモポリマーから成るホスホロチオエート及びランダ ム配列の２０−量体のホスホロチオエートもウィルスの増殖に良好な阻害を与え た。オリゴデオキシヌクレオチドによるウィルスの阻害には、一つ以上の機構が これらの試験管内研究において作用した可能性がある。

傭 つ 同等物 当業者には本文内に特殊な例として記載された特異的な具体化に対する多くの同 等物を認識し、又は日常的な範囲を超えない実験を用いて、探知することができ るであろう。かような同等物は下記の請求の範囲内に包含されるものとして意図 される。

招＠赳 補正書の写しく翻訳文）提出口　（特許法第１８４条の８）平成２年８月２７日 、１つ８あわ　よ、　■ １、特許出願の表示 ＰＣＴ／ＵＳ　８９１００７５２ ２、発明の名称 外来性オリゴヌクレオチドによるＨＴＬＶ−ｍの抑制３、特許出願人 住所　アメリカ合衆国マサチュセッッ州０１５４５シュルーズベリイ・タイプル アベニュー２２２名　称　ウスター・ファウンデーション・フォー・イクスペリ メンタル・バイオロジー ４、代理人　〒１０７ （１）　補正書の写しく翻訳文）　１通請求の範囲 １、ＨＴＬＶ−１１ｒ複製に必要なＨＴＬＶ−ＩＩＩゲノムの高度に保存された 領域に対して相補的なヌクレオチド配列；ＨＴＬＶ−ＩＩＩ遺伝子発現に必要な ＨＴＬＶ−１［［ゲノムの高度に保存された領域に対して相補的なヌクレオチド 配列；及びＨＴＬＶ−１１［複製に必要なＨＴＬＶ−ＩＩＩゲノムの高度に保存 された領域に対して且つＨＴＬＶ−Ｉ１１遺伝子発現に必要なＨＴＬＶ−１［［ ゲノムの高度に保存された領域に対して相補的なヌクレオチド配列、又はそれら の均等物から選ばれたヌクレオチド配列から本質的に成り、該ＨＴＬＶ−ｍゲノ ムの高度に保存された領域が、キャップ部位ニプライマー結合部位；５′方向に おけるプライマー結合部位に隣接したヌクレオチド配列；ｍＲＮＡ供与スプライ ス部位；ｍＲＮＡ受容スプライス部位、ＨＴＬＶ−１［１開始コドン；ＨＴＬＶ −１１［開始コドン；ａｒｔ遺伝子；及びフレームシフトをコードしているＨＴ ＬＶ−ＩＩＩゲノムの領域から成る群より選ばれる、ＨＴＬＶ−Ｉ［［ゲノムの 高度に保存された領域とハイブリダイゼーションすることができる修飾されたオ リゴヌクレオチド。

２、ＨＴＬＶ−ＩＩＩゲノムの高度に保存された領域に対して相補的であり、該 高度に保存された領域が、 ａ）ｔＲＮＡ１１プライマー結合部位；ｂ）５’方向における前記ｔＲＮＡ”’ プライマー結合部位に隣接したＨＴＬＶ−ｍゲノムの領域； Ｃ）前記ｔＲＮＡ”’プライマー結合部位及び５′方向における前記ｔＲＮＡ” ’プライマー結合部位に隣接しｆ−ＨＴ　Ｌ　Ｖ　−ＩＩＩゲノムの領域：ｄ） ｍＲＮＡ供与スプライス部位； ｅ）ＩＩＩＲＮＡ受容スプライス部位：ｆ）ｇａｇ遺伝子のための開始コドン； ｇ）ｅｎｖ遺伝子のための開始コドン：ｈ）ｔａｔ遺伝子のＩ；めの開始コドン ；１）ｓｏｒ遺伝子のための開始コドン；Ｄ３’　ｏｒｆ遺伝子のための開始コ ドン；から成る群より選ばれる、請求の範囲第１項記載の修飾されたオリゴヌク レオチド。

及びこれらの末端から２番目のヌクレオシド間ホスフェートが、ホスボロチオエ ート、メチルホスホネート、ホスホロモルホリゾート、ホスポロピペラジン誘導 体又はそれらの組み合わせとして修飾されているオリゴヌクレオチド、 ｈ）５′方向におけるプライマー結合部位に隣接した３′末端配列が、単独で又 は組み合わせにおいて、この領域がＨＴＬＶ−１［［の逆転写酵素活性のための テンプレートとして作用することができないように、ブロックされている、ＨＴ ＬＶ−１ｆｆプライマ一結合部位に対して相補的なオリゴヌクレオチド、 ｉ）親油性基、ポリリシン、ポリアルギニン又はオリゴヌクレオチドの取り込み を高める他の作用因子の付加により５′末端で修飾されているオリゴヌクレオチ ド、 ｊ）挿入剤の添加により修飾されたオリゴヌクレオチド、ｋ）ＨＴＬＶ−１［［ ゲノムの領域（１つ又は複数）を架橋することができる１個又はそれより多くの 化学反応性基を含んで成る、該ＨＴＬＶ−ＩＩＩゲノムの領域に対して相補的な オリゴヌクレオチド、１）ＨＴＬＶ−ＩＩＩゲノムの領域（１つ又は複数）を開 裂することができる１個又はそれより多くの化学反応性基を含んで成る、該ＨＴ ＬＶ−ＩＩＩゲノムの領域に対して相補的なオリゴヌクレオチド、及びｍ）それ らの均等物、 ５、ＨＴＬＶ−Ｉｌｌゲノムの高度に保存された領域とハイブリダイゼーション することができる修飾されたオリゴデオキシヌクレオチドを、ＨＴＬＶ−Ｉｌｌ を含有する細胞に導入し、その際、該修飾されたオリゴデオキシヌクレオチドを 、ＨＴＬＶ−Ｉ［［複製、ＨＴＬＶ−ＩＩＮ遺伝子発現又はＨＴＬＶ−［１復製 及びＨＴ　Ｌ、　Ｖ　−Ｉ［１遺伝子発現の抑制を引き起こすのｔこ十分な量で 前記細胞に導入することより成り、該修飾されたオリゴデオキシヌクレオチドが 、ＨＴＬＶ−Ｉ［［複製に必要なＨＴ　Ｌ　Ｖ　−Ｉ［１ゲノムの高度に保存さ れた領域に対して相補的なオリゴデオキシヌクレオチド；ｉ（Ｔ　Ｌ　Ｖ　−１ ［［遺伝子発現に必要なＨＴＬＶ−ｍゲノムの高度に保存された領域Ｉこ対して 相補的なオリゴデオキシヌクレオチド；及びＨＴＬＶ−■複製に必要なＨＴＬＶ −Ｉ１１ゲノムの高度に保存された領域に対して且つＨＴＬＶ−Ｉ［１遺伝子発 現に必要なＨＴＬＶ−１１１ゲノムの高度に保存された領域に対して相補的なヌ クレオチド配列から成る群より選ばれ、そして該ＨＴＬＶ−ｍゲノムの高度に保 存された領域が、キャップ部位；プライマー結合部位：５′方向におけるプライ マー結合部位に隣接したヌクレオチド配列；ｍＲＮ　Ａ供与スプライス部位；ｍ ＲＮＡ受容スプライス部位、ＨＴＬＶ−ＩＩＩ開始フドコド及びＨＴＬＶ−１［ １開始コドン；ａｒｔ遺伝子；及びフレームシフトをフードしているＨ　Ｔ　Ｌ 　Ｖ　−ＩＩＩＩｎゲノム域から成る群より選ばれる、ＨＴＬＶ−１１１を含有 する細胞のＨＴＬＶ−Ｉｎ複製、ＨＴＬＶ−ＩＩＩｍｌ遺伝子発現その両方を抑 制する生体外方法。

６、ＨＴＬＶ−１１１を含有する細胞とＨＴＬＶ−Ｉｎゲノムの１個又はそれよ り多くの領域に対して相補的な修飾されたオリゴデオキシヌクレオチドと 接触させることより成り、 該領域が、 ａ）ｔＲＮ　Ａ　”’プライマー結合部位：ｂ）５′方向における前記ｔＲＮ　 Ａ　”’プライマー結合部位に隣接したＨＴＬＶ−ＩＩＩＩｎゲノム域： Ｃ）前記ｔＲＮＡ□ｙ°プライマー結合部位及び５′方向における前記ｔＲＮＡ ””プライマー結合部位に隣接したＨＴＬＶ−ＩＩＩＩｎゲノム域；ｄ）ｍＲＮ 　Ａ供与スプライス部位； ｅ）ｍＲＮ　Ａ受容スプライス部位： ｆ）ｇａｇ遺伝子のための開始コドン；ｇ）ｅｎｖ遺伝子のｊ；めの開始コドン ；＋１）ｔａｔ遺伝子のための開始コドン；１）ｓｏｒ遺伝子のための開始コド ン；ｊ）３’　ｏｒｆ遺伝子のための開始コドン；ｋ）ＨＴＬＶ−Ｉ［１ゲノム のキャップヌクレオチド；１）ａｒｔ選伝遺伝はその一部： から成る群より選ばれる、 ＨＴＬＶ−１［１を含有する細胞（７）　ＨＴ　Ｌ　Ｖ　−Ｉｆｆ複製、ＨＴＬ Ｖ−ＩＩＩｍｌ遺伝子発現その両方を抑制する生体外方法。

８、ＨＴＬＶ−Ｉ［１に感染した１９２３球を含有する生物学的試料を、ＨＴ　 Ｌ　Ｖ　−Ｉ［１複製、ＨＴＬＶ−ＩＩＩｍｌ遺伝子発現その両方を抑制するの に十分な濃度における、ＨＴＬＶ−１［［ゲノムのＩＩＩ又はそれより多くの領 域とハイブリダイゼーションすることができるオリゴヌクレオチドと一緒にする ことより成り、 該オリゴヌクレオチドが、ＨＴＬＶ−ＩＩＩＩｎ複製要なＨＴＬＶ−ＩＩＩＩｎ ゲノム度に保存された領域に対して相補的なオリゴヌクレオチド：ＨＴＬＶ−ｍ 遺伝子発現に必要なＨＴ　Ｔ−Ｖ　−Ｉ［１ゲノムの高度に保存されｔ；領域に 対して相補的なオリゴヌクレオチド；及びＨＴＬＶ−Ｉ［１複製に必要なＨＴＬ Ｖ−ＩＩＩＩｎゲノム度ｊ二保存された領域に対して且つＨＴＬＶ−ｍ遺伝子発 現に必要なＨＴＬＶ−ｍゲノムの高度に保存された領域に対して相補的なオリゴ ヌクレオチドから成る群より選ばれる、ヒトＴリンパ球におけるＨ　Ｔ　Ｌ、　 Ｖ　−Ｉ［１複製、ＨＴＬＶ−ｍｌ遺伝子発現又はその両方を抑制する化学療法 的方法。

９、ＨＴＬＶ−ｍに感染した１９２３球を含有する生物学的試料と、ＨＴＬＶ− ＩＩＩＩｎゲノム個又はそれより多くの領域に対して相補的な且つＨＴＬＶ−Ｉ ＩＩＩｎゲノム個又はそれより多くの領域と）＼イブリダイゼーンヨンすること ができる修飾されたオリゴデオキシヌクレオチドと一緒にすることより成り、該 領域が、 ａ）ｔＲＮＡｌｖ′プライマー結合部位：ｂ）５′方向における前記ｔＲＮＡ” ’プライマー結合部位に隣接したＨＴＬＶ−Ｉｎゲノムの領域； Ｃ）前記ｔＲＮＡ”プライマー結合部位及び５′方向における前記ｔＲＮＡ”’ プライマー結合部位に隣接したＨＴＬＶ−ＩＩＩＩｎゲノム域；ｄ）ｍＲＮ　Ａ 供与スプライス部位； ｅ）ｍＲＮ　Ａ受容スプライス部位： ｆ）ｇａｇ遺伝子のための開始コドン；ｇ）ｅｎｖ遺伝子のための開始コドン１ ｈ）ｔａ＋遺伝子のための開始コドン：１）ｓｏｒ遺伝子のための開始コドン： Ｄ３’　ｏｒｆ遺伝子のための開始コドン：ｋ）キャップヌクレオチド； から成る群より選ばれる、 ヒトＴリンパ球に８けるＨＴＬＶ−ＩＩ！複製、ＨＴＬＶ−ｍ遺伝子発現又はそ の両方を抑制する化学療法的方法。

ｈ）５′方向においてプライマー結合部位に隣接しＩ；３′末端配列が、単独で 又は組み合わせにおいて、この領域がＨＴＬＶ−ＩＩＩの逆転写酵素活性のため のテンプレートとして作用することができないように、ブロックされている、 ｉ）親油性基、ポリリシン、ポリアルギニン又はオリゴヌクレオチドの取り込み を高める他の作用因子の付加により５′末端で修飾されているオリゴヌクレオチ ド、 ｊ）挿入剤の添加により修飾されたオリゴヌクレオチド、ｋ）ＨＴＬＶ−ｍゲノ ムの領域（１つ又は複数）を架橋することができる１個又はそれより多くの化学 反応性基を含んで成る、該ＨＴＬＶ−Ｉ［［ゲノムの領域に対して相補的なオリ ゴヌクレオチド、１）ＨＴＬＶ−ＩＩＩゲノムの領域（１つ又は複数）を開裂す ることができる１個又はそれより多くの化学反応性基を含んで成る、該ＨＴＬＶ −ＩＩＩゲノムの領域に対して相補的なオリゴヌクレオチド、及びｌ１１）それ らの均等物、 １１、ウィルス複製に必要なウィルスＲＮＡ又はウィルスｍＲＮＡの高度に保存 された領域に対して相補的なｓＩｍされたヌクレオチド配列；ウィルス遺伝子発 現に必要なウィルスＲＮＡ又はウィルスｍＲＮＡの高度に保存された領域に対し て相補的な修飾されｔ；ヌクレオチド配列；ウィルス複製に必要なウィルスＲＮ Ａ又はｍＲＮＡの高度に保存された領域に対して及びウィルス遺伝子発現に必要 なウィルスＲＮＡ又はｌｌｌＲＮＡの高度に保存された領域に対して相補的な修 飾されたヌクレオチド配列；又はそれらの均等物から本質的に成る、細胞内のウ ィルスの活性を抑制するのに使用する合成オリゴヌクレオチド。

１２、感染性因子の複製に必要な感染性因子のＲＮＡ又はｍＲＮＡの高度に保存 された領域に対して相補的な修飾されたヌクレオチド配列；感染性因子の遺伝子 の発現に必要な感染性因子のＲＮＡ又はｍＲＮＡの高度に保存された領域に対し て相補的な修飾されたヌクレオチド配列：感染性因子の複製に必要な感染性因子 のＲＮＡ又はｍＲＮＡの高度に保存された領域に対して及び感染性因子の遺伝子 の発現に必要な感染性因子のＲＮＡ又はｍＲＮＡに対して相補的な修飾されたヌ クレオチド配列：又はそれらの均等物から本質的に成る、細胞内の感染性因子の 活性を抑制するのに使用する合成オリゴヌクレオチド。

１３、ＨＴＬＶ−１［１複製に必要なＨＴＬＶ−ＩＩＩゲノムの高度に保存され た領域の少なくとも１つに対して相補的な修飾されたオリゴデオキシヌクレオチ ド、ＨＴＬＶ−１［［遺伝子発現に必要なＨＴＬＶ−Ｉ［［ゲノムの高度に保存 された領域の少なくとも１つに対して相補的な修飾されたオリゴデオキシヌクレ オチドを、単独又は組み合わせで、修飾されたオリゴデオキシヌクレオチドが感 染した細胞に入りそしてＨＴＬＶ−Ｉｆｆゲノムの相補的領域に結合するのに適 当な条件下に、ＨＴＬＶ−ＩＩＩに感染したヒ末梢ヒト赤血球又はＨＴＬＶ−Ｉ ｆｆに感染した１９７３球に導入することより成る、ＨＴＬＶ−ＩＩＩに感染し たヒ末梢ヒト赤血球又はＨＴＬＶ−■に感染した１９７３球におけるＨＴＬＶ− ｍ複製、ＨＴＬＶ−ＩＩＩ遺伝子発現又はその両方を抑制する化学療法的方法。

１４、修飾された相補的オリゴデオキシヌクレオチドが、ＨＴＬＶ−ｍゲノムの 領域に対して相補的な修飾されたオリゴデオキシヌクレオチドから成る群より選 ばれ、該領域が、 ａ）表３に示されたオリゴヌクレオチドホスホロチオエート、ｂ）表４に示され たオリゴヌクレオチドホスホロモルホリゾート、Ｃ）表５に示されたオリゴヌク レオチドホスホロブチルアミデート、ｄ）表６に示されたメチルホスホネートを 含んで成るオリゴヌクレオチド、 ｅ）表７に示された５′修飾を有するオリゴヌクレオチド、ｆ）すべてのヌクレ オシド間ホスフェートが、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロ モルホリゾート、ホスホロピペラジン誘導体又はそれらの組み合わせとして修飾 されているオリゴヌクレオチド、ｇ）３′末端及び末端より２番目のヌクレオシ ド間ホスフェート、５′末端及び末端より２番目のヌクレオシド間ホスフェート 又は３′及び５′末端の両方及びこれらの末端から２番目のヌクレオシド間ホス フェートが、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロモルホリゾー トホスホロピペラジン誘導体又はそれらの組み合わせとして修飾されているオリ ゴヌクレオチド、 ｈ）５′方向においてプライマー結合部位に隣接した３′末端配列が、単独で又 は組み合わせにおいて、この領域がＨＴＬＶ−１］Ｉの逆転写酵素活性のための テンプレートとして作用することができないように、ブロックされている、ＨＴ ＬＶ−ｍプライマー結合部位に対して相補的なオリゴヌクレオチド、 ｉ）親油性基、ポリリシン、ポリアルギニン又はオリゴヌクレオチドの取り込み を高める他の作用因子の付加により５′末端で修飾されているオリゴヌクレオチ ド、 ｊ）挿入剤の添加により修飾されたオリゴヌクレオチド、ｋ）ＨＴＬＶ−１１１ ゲノムの領域（１つ又は複数）を架橋することができる１個又はそれより多くの 化学反応性基を含んで成る、該ＨＴＬＶ−ＩＩＩゲノムの領域に対して相補的な オリゴヌクレオチド、１）　ＨＴ　Ｌ　Ｖ　−ＩＩＩゲノムの領域（１つ又は複 数）を開裂することができる１個又はそれより多くの化学反応性基を含んで成る 、該ＨＴＬＶ−ＩＩゲノムの領域に対して相補的なオリゴヌクレオチド、及びｍ ）それらの均等物、 から成る群より選ばれる、請求の範囲第１３項記載の方法。

国際調査報告 １ｍ＋嗜レーし−＋電（ｓｗ＋ム＆ｅ””””’ＰＣＴ／ＩＪｓ８９１０Ｏ’７ ５２メリカ合衆国マサチュセツツ州０１５４５　シュル−ズベＩＪイ・コモディ ワインドライブ４６ジ−

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. １．ＨＴＬＶ−ＩＩＩ複製に必要なＨＴＬＶ−ＩＩＩゲノムの高度に保存された 領域に対して相補的なヌクレオチド配列、ＨＴＬＶ−ＩＩＩ遺伝子発現に必要な ＨＴＬＶ−ＩＩＩゲノムの高度に保存された領域に対して相補的なヌクレオチド 配列、ＨＴＬＶ−ＩＩＩ複製に必要なＨＴＬＶ−ＩＩＩゲノムの高度に保存され た領域に対して又はＨＴＬＶ−ＩＩＩ遺伝子発現に必要なＨＴＬＶ−ＩＩＩゲノ ムの高度に保存された領域に対して相補的なヌクレオチド配列、又はそれらの均 等物から本質的に成る修飾されたオリゴヌクレオチド。
2. ２．ＨＴＬＶ−ＩＩＩゲノムの高度に保存された領域に対して相補的な請求の範 囲第１項記載の修飾されたオリゴヌクレオチドであって、該高度に保存された領 域が、 ａ）ｔＲＮＡＩＶｌｙｓプライマー結合部位；ｂ）５′方向における前記ｔＲＮ ＡＩＶｌｙｓプライマー結合部位に隣接したＨＴＬＶ−ＩＩＩゲノムの領域； ｃ）前記ｔＲＮＡＩＶｌｙｓプライマー結合部位及び５′方向における前記ｔＲ ＮＡＩＶｌｙｓプライマー結合部位に隣接したＨＴＬＶ−ＩＩＩゲノムの領域； ｄ）ｍＲＮＡ供与スプライス部位； ｃ）ｍＲＮＡ受容スプライス部位； ｆ）ｇａｇ遺伝子のための開始コドン；ｇ）ｅｎＶ遺伝子のための開始コドン； ｈ）ｔａｔ遺伝子のための開始コドン；ｉ）ｓｏｒ遺伝子のための開始コドン； ｊ）３′ｏｒｆ遺伝子のための開始コドン；ｋ）ＨＴＬＶ−ＩＩＩゲノムのキャ ップヌクレオチド；１）ａｒｔ遺伝子又はその一部； ｍ）フレームシフトをコードしているＨＴＬＶ−ＩＩＩゲノムの領域；及びｎ） それらの均等物； から成る群より選ばれる、請求の範囲第１項記載の修飾されたオリゴヌクレオチ ド。
3. ３．少なくとも８ヌクレオチドの長さである請求の範囲第２項記載の修飾された オリゴデオキシヌクレオチド。
4. ４．ａ）表３に示されたオリゴヌクレオチドホスホロチオエート、ｂ）表４に示 されたオリゴヌクレオチドホスホロモルホリデート、ｃ）表５に示されたオリゴ ヌクレオチドホスホロブチルアミデート、ｄ）表６に示されたメチルホスホネー トを含んで成るオリゴヌクレオチド、 ｃ）表７に示された５′修飾を有するオリゴヌクレオチド、ｆ）すべてのヌクレ オシド間ホスフェートが、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロ モルホリデート、ホスホロピペラジン誘導体又はそれらの組み合わせとして修飾 されているオリゴヌクレオチド、ｇ）３′末端及び末端より２番目のヌクレオシ ド間ホスフエート、５′末端及び末端より２番目のヌクレオシド間ホスフェート 又は３′及び５′末端の両方及びこれらの末端から２番目のヌクレオシド間ホス フェートが、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロモルホリデー ト、ホスホロピペラジン誘導体又はそれらの組み合わせとして修飾されているオ リゴヌクレオチド、 ｈ）５′方向においてプライマー結合部位に隣接した３′末端配列が、単独で又 は組み合わせにおいて、この領域がＨＴＬＶ−ＩＩＩの逆転写酵素活性のための テンプレートとして作用することができないように、ブロックされている、ＨＴ ＬＶ−ＩＩＩプライマー結合部位に対して相補的なオリゴヌクレオチド、 ｉ）親油性基、ポリリシン、ポリアルギニン又はオリゴヌクレオチドの取り込み を高める他の作用因子の付加により５′末端で修飾されているオリゴヌクレオチ ド、 ｊ）挿入剤の添加により修飾されたオリゴヌクレオチド、ｋ）ＨＴＬＶ−ＩＩＩ ゲノムの領域（１つ又は複数）を架橋することができる１個又はそれより多くの 化学反応性基を含んで成る、該ＨＴＬＶ−ＩＩＩゲノムの領域に対して相補的な オリゴヌクレオチド、ｌ）ＨＴＬＶ−ＩＩＩゲノムの俵域（１つ又は複数）を開 裂することができる１個又はそれより多くの化学反応性基を含んで成る、該ＨＴ ＬＶ−ＩＩＩゲノムの領域に対して相補的なオリゴヌクレオチド、及びｍ）それ らの均等物、 から成る群より選ばれる合成の修飾されたオリゴデオキシヌクレオチドである、 請求の範囲第２項記載の修飾されたオリゴデオキシヌクレオチド。
5. ５．ＨＴＬＶ−ＩＩＩ複製、ＨＴＬＶ−ＩＩＩ遺伝子発現又はその両方に必要な ＨＴＬＶ−ＩＩＩゲノムの高度に保存された領域に対して相補的な修飾されたオ リゴデオキシヌクレオチドを、ＨＴＬＶ−ＩＩＩを含有する細胞に導入し、その 際、該修飾されたオリゴデオキシヌクレオチドを、ＨＴＬＶ−ＩＩＩ複製、ＨＴ ＬＶ−ＩＩＩ遺伝子発現又はその両方の抑制を引き起こすのに十分な量で前記細 胞に導入することより成る、ＨＴＬＶ−ＩＩＩを含有する細胞のＨＴＬＶ−ＩＩ Ｉ複製、ＨＴＬＶ−ＩＩＩ遺伝子発現又はその両方を抑制する方法。
6. ６．ＨＴＬＶ−ＩＩＩを含有する細胞とＨＴＬＶ−ＩＩＩゲノムの１個又はそれ より多くの領域に対して相補的な修飾されたオリゴデオキシヌクレオチドとを、 該修飾されたオリゴデオキシヌクレオチドがＨＴＬＶ−ＩＩＩ複製、ＨＴＬＶ− ＩＩＩ遺伝子発現又はその両方を抑制するのに十分な量で前記細胞中に入るのに 適当な条件下に接触させることより成り、該領域が、 ８）ｔＲＮＡＩＶｌｙｓプライマー結合部位；ｂ）５′方向における前記ｔＲＮ ＡＩＶｌｙｓプライマー結合部位に隣接したＨＴＬＶ−ＩＩＩゲノムの領域； ｃ）前記ｔＲＮＡＩＶｌｙｓプライマー結合部位及び５′方向における前記ｔＲ ＮＡＩＶｌｙｓプライマー結合部位に隣接したＨＴＬＶ−ＩＩＩゲノムの領域； ｄ）ｍＲＮＡ供与スプライス部位； ｄ）ｍＲＮＡ受容スプライス部位； ｆ）ｇａｇ遺伝子のための開始コドン；ｇ）ｅｎｖ遺伝子のための開始コドン； ｈ）ｔａｔ遺伝子のための開始コドン；ｉ）ｓｏｒ遺伝子のための開始コドン； ｊ）３′ｏｒｆ遺伝子のための開始コドン；ｋ）ＨＴＬＶ−ＩＩＩゲノムのキャ ップヌクレオチド；ｌ）ａｒｔ遺伝子又はその一部； ｍ）フレームシフトをコードしているＨＴＬＶ−ＩＩＩゲノムの領域；及びｎ） それらの均等物； から成る群より選ばれる、 ＨＴＬＶ−ＩＩＩを含有する細胞のＨＴＬＶ−ＩＩＩ複製、ＨＴＬＶ−ＩＩＩ遺 伝子発現又はその両方を抑制する方法。
7. ７．修飾されたオリゴデオキシヌクレオチドが、ａ）表３に示されたオリゴヌク レオチドホスホロチオエート、ｂ）表４に示されたオリゴヌクレオチドホスホロ モルホリデート、ｃ）表５に示されたオリゴヌクレオチドホスホロブチルアミデ ート、ｄ）表６に示されたメチルホスホネートを含んで成るオリゴヌクレオチド 、 ｅ）表７に示された５′修飾を有するオリゴヌクレオチド、ｆ）すべてのヌクレ オシド間ホスフェートが、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロ モルホリデート、ホスホロピペラジン誘導体又はそれらの組み合わせとして修飾 されているオリゴヌクレオチド、ｇ）３′末端及び末端より２番目のヌクレオシ ド間ホスフェート、５′末端及び末端より２番目のヌクレオシド間ホスフェート 又は３′及び５′末端の両方及びこれらの末端から２番目のヌクレオシド間ホス フェートが、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロモルホリデー ト、ホスホロピペラジン誘導体又はそれらの組み合わせとして修飾されているオ リゴヌクレオチド、 ｈ）５′方向においてプライマー結合部位に隣接した３′末端配列が、単独で又 は組み合わせにおいて、この領域がＨＴＬＶ−ＩＩＩの逆転写酵素活性のための テンプレートとして作用することができないように、ブロックされている、ＨＴ ＬＶ−ＩＩＩプライマー結合部位に対して相補的なオリゴヌクレオチド、 ｉ）親油性基、ポリリシン、ポリアルギニン又はオリゴヌクレオチドの取り込み を高める他の作用因子の付加により５′末端で修飾されているオリゴヌクレオチ ド、 ｊ）挿入剤の添加により修飾されたオリゴヌクレオチド、ｋ）ＨＴＬＶ−ＩＩＩ ゲノムの領域（１つ又は複数）を架橋することができる１個又はそれより多くの 化学反応性基を含んで成る、該ＨＴＬＶ−ＩＩＩゲノムの領域に対して相補的な オリゴヌクレオチド、ｌ）ＨＴＬＶ−ＩＩＩゲノムの領域（１つ又は複数）を開 裂することができる１個又はそれより多くの化学反応性基を含んで成る、該ＨＴ ＬＶ−ＩＩＩゲノムの領域に対して相補的なオリゴヌクレオチド、及びｍ）それ らの均等物、 から成る群より選ばれる、請求の範囲射６項記載の方法。
8. ８．ＨＴＬＶ−ＩＩＩ複製又は遺伝子発現に必要なＨＴＬＶ−ＩＩＩゲノムの高 度に保存された領域に対して相補的な修飾されたオリゴヌクレオチドを、ＨＴＬ Ｖ−ＩＩＩ複製、ＨＴＬＶ−ＩＩＩ遺伝子発現又はその両方を抑制するのに十分 な濃度で、個体に投与することより成る、個体におけるＨＴＬＶ−ＩＩＩ複製、 ＨＴＬＶ−ＩＩＩ遺伝子発現又はその両方を抑制する化学療法的方法。
9. ９．ＨＴＬＶ−ＩＩＩゲノムの１個又はそれより多くの領域に対して相補的な修 飾されたオリゴデオキシヌクレオチドを経口投与又は静脈内投与することより成 り、該領域が、 ａ）ｔＲＮＡＩＶｌｙｓプライマー結合部位；ｂ）５′方向における前記ｔＲＮ ＡＩＶｌｙｓプライマー結合部位に隣接したＨＴＬＶ−ＩＩＩゲノムの領域； ｃ）前記ｔＲＮＡＩＶｌｙｓプライマー結合部位及び５′方向において前記ｔＲ ＮＡＩＶｌｙｓプライマー結合部位に隣接したＨＴＬＶ−ＩＩＩゲノムの領域； ｄ）ｍＲＮＡ供与スプライス部位； ｅ）ｍＲＮＡ受容スプライス部位； ｆ）ｇａｇ遺伝子のための開始コドン；ｇ）ｅｎｖ遺伝子のための開始コドン； ｈ）ｔａｔ遺伝子のための開始コドン；ｉ）ｓｏｒ遺伝子のための開始コドン； ｊ）３′ｏｒｆ遺伝子のたりの開始コドン；ｋ）ＨＴＬＶ−ＩＩＩゲノムのキャ ップヌクレオチド；ｌ）ａｒｔ遺伝子又はその一部； ｍ）フレームシフトをコードしているＨＴＬＶ−ＩＩＩゲノムの領域；及びｎ） それらの均等物； から成る群より選ばれる、 個体におけるＨＴＬＶ−ＩＩＩ複製、ＨＴＬＶ−ＩＩＩ遺伝子発現又はその両方 を抑制する化学療法的方法。
10. １０．該オリゴデオキシヌクレオチドが合成オリゴヌクレオチドであり、そして 、 ａ）表３に示されたオリゴヌクレオチドホスホロチオエート、ｂ）表４に示され たオリゴヌクレオチドホスホロモルホリデート、ｃ）表５に示されたオリゴヌク レオチドホスホロブチルアミデート、ｄ）表６に示されたメチルホスホネートを 含んで成るオリゴヌクレオチド、 ｅ）表７に示された５′修飾を有するオリゴヌクレオチド、ｆ）すべてのヌクレ オシド間ホスフェートが、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロ モルホリデート、ホスホロピペラジン誘導体又はそれらの組み合わせとして修飾 されているオリゴヌクレオチド、ｇ）３′末端及び末端より２番目のヌクレオシ ド間ホスフエート、５′末端及び末端より２番目のヌクレオシド間ホスフェート 又は３′及び５′末端の両方及びこれらの末端から２番目のヌクレオシド間ホス フェートが、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロモルホリデー ト、ホスホロピペラジン誘導体又はそれらの組み合わせとして修飾されているオ リゴヌクレオチド、 ｈ）５′方向においてプライマー結合部位に隣接した３′末端配列が、単独で又 は組み合わせにおいて、この領域がＨＴＬＶ−ＩＩＩの逆転写酵素活性のための テンプレートとして作用することができないように、プロックされている、ＨＴ ＬＶ−ＩＩＩプライマー結合部位に付して相補的なオリゴヌクレオチド、 ｉ）親油性基、ポリリシン、ポリアルギニン又はオリゴヌクレオチドの取り込み を高める他の作用因子の付加により５′末端で修飾されているオリゴヌクレオチ ド、 ｊ）挿入剤の添加により修飾されたオリゴヌクレオチド、ｋ）ＨＴＬＶ−ＩＩＩ ゲノムの領域（１つ又は複数）を架橋することができる１個又はそれより多くの 化学反応性基を含んで成る、該ＨＴＬＶ−ＩＩＩゲノムの領域に対して相補なオ リゴヌクレオチド、ｌ）ＨＴＬＶ−ＩＩＩゲノムの領域（１つ又は複数）を開裂 することができる１個又はそれより多くの化学反応性基を含んで成る、該ＨＴＬ Ｖ−ＩＩＩゲノムの領域に対して相補的なオリゴヌクレオチド、及びｍ）それら の均等物、 から成る群より選ばれる、 請求の範囲第９項記載の方法。
11. １１．ウイルス複製に必要なウイルスＲＮＡ又はウイルスｍＲＮＡの領域に対し て相補的な修飾されたヌクレオチド配列；ウイルス遺伝子発現に必要なウイルス ＲＮＡ又はウイルスｍＲＮＡの領域に対して相補的な修飾されたヌクレオチド配 列；ウイルス複製に必要なウイルスＲＮＡ又はｍＲＮＡに対して及びウイルス遺 伝子発現に必要なウイルスＲＮＡ又はｍＲＮＡに対して相補的な修飾されたヌク レオチド配列；又はそれらの均等物から本質的に成る、細胞内のウイルスの活性 を抑制するのに使用する合成オリゴヌクレオチド。
12. １２．感染性因子の複製に必要な感染性因子のＲＮＡ又はｍＲＮＡの領域に対し て相補的な修飾されたヌクレオチド配列；感染性因子の遺伝子の発現に必要な感 染性因子のＲＮＡ又はｍＲＮＡの領域に対して相補的な修飾されたヌクレオチド 配列；感染性因子の複製に必要な感染性因子のＲＮＡ又はｍＲＮＡの領域に対し て及び感染性因子の遺伝子の発現に必要な感染性因子のＲＮＡ又はｍＲＮＡに対 して相補的な修飾されたヌクレオチド配列；又はそれらの均等物から本質的に成 る、細胞内の感染性因子の活性を抑制するのに使用する合成オリゴヌクレオチド 。