FR2648045A1 - Composes oligonucleotidiques anomeres alpha inhibant la replication des retrovirus - Google Patents
Composes oligonucleotidiques anomeres alpha inhibant la replication des retrovirus Download PDFInfo
- Publication number
- FR2648045A1 FR2648045A1 FR8907782A FR8907782A FR2648045A1 FR 2648045 A1 FR2648045 A1 FR 2648045A1 FR 8907782 A FR8907782 A FR 8907782A FR 8907782 A FR8907782 A FR 8907782A FR 2648045 A1 FR2648045 A1 FR 2648045A1
- Authority
- FR
- France
- Prior art keywords
- sep
- alpha
- sequence
- oligonucleotide
- group
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
- C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
- C12N15/1131—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses
- C12N15/1132—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses against retroviridae, e.g. HIV
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/33—Chemical structure of the base
- C12N2310/337—Chemical structure of the base in alpha-anomeric form
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- AIDS & HIV (AREA)
- Zoology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
L'invention concerne une application des composés oligonucléotidiques ou oligodésoxynucléotidiques à configuration anomérique alpha et leur application thérapeutique. Ces composés sont utilisés pour l'inhibition de la réplication des virus à ARN, plus particulièrement on utilise l'oligonucléotide alpha d**5**'(ACCGCGGGCTTGTCCCTG)**3**' à l'inhibition de la réplication du virus VIH du SIDA.
Description
La présente invention concerne des composés chimiques constitués par un oligonucléotide ou un oligodésoxynucléotide comportant un enchaînement de nucléotides possédant la configuration anomérique non naturelle alpha par opposition à la configuration anomérique naturelle bêta.
De tels composés chimiques ont fait l'objet de demandes de brevets, en particulier les demandes FR 87 04339 (PCT WO 88/04301) et
FR 88 12264 au nom de la demanderesse auxquelles il conviendra de se reporter en particulier pour y trouver la description de leurs procédés de préparation.
FR 88 12264 au nom de la demanderesse auxquelles il conviendra de se reporter en particulier pour y trouver la description de leurs procédés de préparation.
Plus précisément, la présente invention concerne de tels composés oligonucléotidiques utiles pour inhiber la réplication d'un rétrovirus et, en particulier, un composé oligonucléotidique utile pour inhiber la réplication du virus VIH.
Selon leurs caractéristiques essentielles, les composés selon l'invention consistent en une séquence d'oligoribonucléotide ou oligodésoxyribonucléotide d'anomérie non naturelle alpha, ladite séquence étant complémentaire d'une séquence comprise dans la séquence dite TBS ou PBS (ARNt binding site ou primer binding site) consistant dans le site de fixation de l'amorce ARNt de réplication de l'ARN viral ou dans une séquence de l'ARN viral en amont de la séquence TBS.
Parmi ces séquences en amont de la séquence TBS ou PBS, on peut citer notamment la séquence CAP.
Les composés oligonucléotidiques alpha selon l'invention peuvent éventuellement être liés de façon covalente à un agent effecteur, tel qu'un agent intercalant, un radical chimique réactif ou photoactivable.
Dans un mode de réalisation des composés selon l'invention, ceux-ci présentent la formule suivante
dans laquelle
Les radicaux B peuvent être identiques ou différents et représentent chacun une base d'un acide nucléique éventuellement modifiée et rattachée au cycle glycosidique selon une configuration anomérique alpha non naturelle.
dans laquelle
Les radicaux B peuvent être identiques ou différents et représentent chacun une base d'un acide nucléique éventuellement modifiée et rattachée au cycle glycosidique selon une configuration anomérique alpha non naturelle.
Les radicaux B étant complémentaires un à un des bases de la séquence oligonucléotidiques cibles comprise dans la séquence TBS ou une séquence en amont de l'ARN proviral
Les radicaux X peuvent être identiques ou différents et représentent chacun un oxoanion O , un thioanion S #, un groupe alkyle, un groupe alcoxy, aryloxy, un groupe aminoalkyle, un groupe aminoalcoxy, un groupe thioalkyle ;
R et R', qui peuvent être identiques ou différents, représentent chacun un atome d'hydrogène ou un groupement -Y-Z
Y représente un radical alcoylène droit ou ramifié -alk- ou un radical choisi parmi
avec U = O, N ou S ou bien un radical -Y"-O-Y' où Y" ou Y' peuvent avoir les significations données pour Y
E peut avoir les mêmes significations que X ;
J représente un atome d'hydrogène ou un groupe hydroxy
Z est un radical correspondant à un agent effecteur
n est un nombre entier y compris O
L représente un atome d'oxygène, un atome de soufre ou un groupe -NH-.
Les radicaux X peuvent être identiques ou différents et représentent chacun un oxoanion O , un thioanion S #, un groupe alkyle, un groupe alcoxy, aryloxy, un groupe aminoalkyle, un groupe aminoalcoxy, un groupe thioalkyle ;
R et R', qui peuvent être identiques ou différents, représentent chacun un atome d'hydrogène ou un groupement -Y-Z
Y représente un radical alcoylène droit ou ramifié -alk- ou un radical choisi parmi
avec U = O, N ou S ou bien un radical -Y"-O-Y' où Y" ou Y' peuvent avoir les significations données pour Y
E peut avoir les mêmes significations que X ;
J représente un atome d'hydrogène ou un groupe hydroxy
Z est un radical correspondant à un agent effecteur
n est un nombre entier y compris O
L représente un atome d'oxygène, un atome de soufre ou un groupe -NH-.
Dans cette formule I, on utilise la représentation condensée des nucléosides suivante
qui correspond à la formule développée
sur laquelie ont été mentionnées les extrémités (3') et (5').
qui correspond à la formule développée
sur laquelie ont été mentionnées les extrémités (3') et (5').
Il convient de remarquer que la formule I représente un enchainement de nucléotides qui peuvent être identiques ou différents, n indiquant simplement le nombre de nucléotides compris dans la molécule; n est de préférence un nombre compris entre I et 3C, et de préférence encore entre I et 20 et dépend de la taille de la séquence cible de l'ARN du rétrovirus. En général, par exemple, les séquences TBS ont une vingtaine de nucléotides.
Les radicaux effecteurs correspondent à des agents effecteurs qui sont des composés connus dans les techniques touchant aux acides nucléiques. Il s'agit par exemple des composés capables de "s'intercaler" dans la structure des ADN ou des ARN.
Ces agents d'intercalation sont notamment constitues par des composés polycycliques ayant une configuration plane tels que l'acridine, la furocoumarine, la daunomycine, la l,lO-phénanthroline, la phénanthri dinium, les prophyrines, les dérivés de la dipyrido (1,2-a : 3', 2'-d) imidazole, l'ellipicine ou l'ellipticinium et leurs dérivés.
Ces agents effecteurs peuvent aussi être des radicaux chimiques réactifs tels que des radicaux chimiques de scission, c'est-à-dire que ces radicaux peuvent directement ou indirectement réagir pour scinder une chaîne de nucléotides. De préférence, ces radicaux chimiques réactifs seront activables, par exemple par voie chimique ou photochimique.
Les groupes réactifs de scission activables sont, par exemple, des dérivés de composés tels que
- I'acide éthylène-diamine-tétracétique,
- I'acide diéthylène-triamine-pentaacétique,
- les porphyrines,
- la l,l0-phénanthroline, le psoralène et autres groupes aromatiques
absorbant les radiations du proche U.V. et du visible.
- I'acide éthylène-diamine-tétracétique,
- I'acide diéthylène-triamine-pentaacétique,
- les porphyrines,
- la l,l0-phénanthroline, le psoralène et autres groupes aromatiques
absorbant les radiations du proche U.V. et du visible.
Ces groupements chimiquement activables en présence d'ions métalliques, d'oxygène et d'un agent réducteur, induisent des coupures dans -des séquences d'acides nucléiques situées dans leur voisinage.
Le radical B est constitué par une base d'un acide nucléique liée à la partie sucre du nucléotide par une configuration anomérique alpha. Ce peut être la thymine, I'adénine, la cytosine, la guanine ou l'uracile. Mais il est également possible d'utiliser des bases d'acides nucléiques modifiées, notamment halogénées ou azidées, par exemple la 5-bromo-uracile ou la 8-azidoadénine ; ou des dérivés aminés comme la 2-amino-adénine et ses dérivés substitués, par exemple sur le N6 par un groupe aminoalkylène ou par un groupe azidophénylalkylène ; ou la guanine substituée sur le 09 par exemple par un groupe (z-alkylène)-9-acridine ou la 8- < ta)-aminoalkyl)-amino-adénine et ses dérivés substitués sur le NH2 en
ia par un groupe acridine.
ia par un groupe acridine.
Selon la présente invention, sont donc considérées les bases usuelles, ainsi que la possibilité d'introduction de bases modifiées. Des bases "effectrices", susceptibles de se lier par covalence à un brin bêta complémentaire, pourront être introduites. Ainsi, la fonctionnalisation de C ou T par un groupement aziridine en position 4 conduit à la formation de pontages covalents CH2-CH2 entre les deux brins complémentaires sur respectivement G et A.
Donc, plus particulièrement, le radical B est choisi parmi la thymine, I'adénine, la cytosine, la guanine, la 4-azido-cytosine ou la 4-azido-thymine et la 8-azido-adénine, I'uracile, la 5 bromo-uracile.
Le radical X, bien qu'il représente de préférence un oxoanion, peut avoir d'autres significations ; lorsque le radical X représente un groupement alkyle, il s'agit de préférence d'un groupement alkyle inférieur en C1 à C7 et, par exemple, les groupements éthyle, méthyle ou propyle lorsque le radical X représente un groupe alcoxy, il s'agit de préférence d'un groupement alcoxy inférieur Cl à C7, par exemple le groupement méthoxy ou éthoxy ; lorsque X représente un groupement amino-alkyle ou amino-alcoxy ; il peut s'agir d'un groupement amino-alkyle mono-substitué, disubstitué ou bien d'un radical amino sous forme de sel d'ammonium quaternaire. Dans ces conditions, les substituants sont, de préférence, des radicaux alkyles inférieurs comme définis précédemment ; quant à la chaîne alkyle ou alcoxy reliant le radical amino au phosphore, il s'agit de préférence d'une chaine droite ramifiée comportant de 1 à 10 atomes de carbone Lorsque le radical alkyle ou alcoxy est substitué par un hétérocycle azoté, il s'agit notamment de cycle saturé à 5-6 chainons comportant un atome d'azote qui peut être quaternaire. Enfin, lorsque le radical X est un radical thioalkyle, il s'agit de préférence d'un radical thioalkyle inférieur, c est-à-dire qui comporte entre I et 7 atomes de carbone.
Le radical -alk- est de préférence un radical alcoylène droit ou ramifié ayant de 1 à 10 atomes de carbone.
En particulier, à partir des fonctions alcool terminales 3' ou 5' de l'oligomère alpha, I'effecteur peut donc être introduit via une chaine (CH2)n liée à une fonctionnalisation Z' de natures diverses à la partie osidique de l'oligomère.
A partir de la formule
3'
ou -O-='-(CH2)n-effecreur (Z) on obtiendra, selon ce que représente Z', par exemple
- un phosphate ou méthyl phosphonate de formule
3'
ou -O-='-(CH2)n-effecreur (Z) on obtiendra, selon ce que représente Z', par exemple
- un phosphate ou méthyl phosphonate de formule
U = O, N ou S
- un éther de formule générale
3'
ou - O (-CH2-)(-CH2-)n-1- Z
5'
- un ester de formule générale
- O (-CO)-(CH2-)nZ ou encore
- un carbamate de formule générale
- O -(CO NH)-(CH2)n-Z
Selon la présente invention sont concernes également les composés précédents sous forme de sel avec des bases ou des acides, et les composés sous forme racémique, ou sous forme d'isomères R ou S optiques purifiés ou en mélange.
- un éther de formule générale
3'
ou - O (-CH2-)(-CH2-)n-1- Z
5'
- un ester de formule générale
- O (-CO)-(CH2-)nZ ou encore
- un carbamate de formule générale
- O -(CO NH)-(CH2)n-Z
Selon la présente invention sont concernes également les composés précédents sous forme de sel avec des bases ou des acides, et les composés sous forme racémique, ou sous forme d'isomères R ou S optiques purifiés ou en mélange.
Selon la présente invention sont concernés également les composés précédents dans les séries D ou L.
Dans un mode de réalisation de l'invention, on utilise des oligodésoxynucléotides alpha. II s'agit des composés pour lesquels X =
J, R et R' = H ; B est choisi parmi A, C, T et C, et L est un atome d'oxygène dans la formule I.
J, R et R' = H ; B est choisi parmi A, C, T et C, et L est un atome d'oxygène dans la formule I.
La présente invention a également pour objet des compositions pharmaceutiques antivirales contenant à titre de substance active lesdits composés, et notamment des compositions utiles pour le traitement des affections virales des virus à ARN, tels que le virus VIHI du SIDA.
Enfin, la présente invention a pour objet l'utilisation des composés selon l'invention à la préparation de compositions pharmaceutiques antivirales notamment utiles pour le traitement du SIDA.
Comme mentionné ci-dessus, I'application des composés oligonucléotidiques alpha selon la présente invention consiste à inhiber la réplication des rétrovirus et notamment du virus de l'immunodéficience humaine VIH1 du SIDA.
Le rétrovirus associé à des lymphadénopathies (LAV), également appelé virus HTLV III (HTLV - human T leukemia virus) ou AIDS - related virus (ARV) a été baptisé plus récemment VIHI et est en effet reconnu comme l'agent responsable du SIDA.
Les virus à ARN et notamment le virus du SIDA ont un mécanisme de multiplication qui fait effectivement intervenir l'enzyme
ADN polymérase - ARN dépendante encore appelée transcriptase inverse ou plus communément réverse transcriptase. Cette enzyme copie en ADN monobrin dit complémentaire (ADNc), I'ARN viral. Il faut pour cela qu'elle trouve une amorce oligonucléotidique appariée à l'extrémité 3' de la matrice d'ARN à copier.
ADN polymérase - ARN dépendante encore appelée transcriptase inverse ou plus communément réverse transcriptase. Cette enzyme copie en ADN monobrin dit complémentaire (ADNc), I'ARN viral. Il faut pour cela qu'elle trouve une amorce oligonucléotidique appariée à l'extrémité 3' de la matrice d'ARN à copier.
La transcriptase réverse est à la fois nécesaire à l'établissement de l'état proviral, au démarrage de la réplication du virus, et à l'éventuelle transformation de la cellule.
Chez les rétrovirus. I'amorce est un ARNt d'origine cellulaire présent à l'interieur des virions. Précisément, quand le virus infecte une cellule, la transcriptase reverse (RT > se fixe à L'ART virale et l'ARNt-3' dé la lysine sert de début à l'ADN qui sera synthétisé. Le brin synthétisé est guidé par le sillon d'amorce. Le brin d'ADN ainsi synthétisé est alors sous forme de monobrin, suite à l'activité RNasique liée à la RT et un brin complémentaire d'ADN est synthétisé via l'activité polymérasique DNA dépendante de la RT.
La structure d'un rétrovirus avant et après sont intégration dans le DNA d'une cellule-hôte peut se schématiser comme suit
a) Intégration du rétrovirus dans le DNA de la cellule-hôte ARN ARN viral
transcriptase reverse
DNA 2 brins
DNA cellule-hôte
b) Structure moléculaire du génome du rétrovirus durant les
différentes phases de l'intégration
* ARN génomique 5' R-U5-UU - TBS- NC -région codante- NC - Pur -AA-U3-R 3'
(ARN)
Le ARN d'un rétrovirus est un ARN simple brin dans lequel les régions codantes sont flanquées de séquences essentielles pour la réplication et l'expression virales. Ces séquences sont, de l'extrémité 5' vers 3'
- R (short "repeat") : une courte séquence à l'extrémité 5' qui comprend en début de séquence une séquence CAP nécessaire pour que puisse s'effectuer la traduction. (Les mêmes nucléotides seront répétés à l'extrémité 3'),
- U5 : séquence unique de l'extrémité 5' (constituée d'environ
80 nucléotides),
- UU : 2 nucléotides à uracile,
- TBS ("tRNA binding site"). Il s'agit du site où se lie (par son extrémité 3') I'ARNt qui servira d'amorce lors de la réplication. Les liaisons complémentaires et antiparallèles porteront sur 20 pdb environ,
- NC : une séquence non codante,
région codante : elle est située au centre, elle contient très peu de gènes.
a) Intégration du rétrovirus dans le DNA de la cellule-hôte ARN ARN viral
transcriptase reverse
DNA 2 brins
DNA cellule-hôte
b) Structure moléculaire du génome du rétrovirus durant les
différentes phases de l'intégration
* ARN génomique 5' R-U5-UU - TBS- NC -région codante- NC - Pur -AA-U3-R 3'
(ARN)
Le ARN d'un rétrovirus est un ARN simple brin dans lequel les régions codantes sont flanquées de séquences essentielles pour la réplication et l'expression virales. Ces séquences sont, de l'extrémité 5' vers 3'
- R (short "repeat") : une courte séquence à l'extrémité 5' qui comprend en début de séquence une séquence CAP nécessaire pour que puisse s'effectuer la traduction. (Les mêmes nucléotides seront répétés à l'extrémité 3'),
- U5 : séquence unique de l'extrémité 5' (constituée d'environ
80 nucléotides),
- UU : 2 nucléotides à uracile,
- TBS ("tRNA binding site"). Il s'agit du site où se lie (par son extrémité 3') I'ARNt qui servira d'amorce lors de la réplication. Les liaisons complémentaires et antiparallèles porteront sur 20 pdb environ,
- NC : une séquence non codante,
région codante : elle est située au centre, elle contient très peu de gènes.
Ce sont
"gag", (pour "group specific antigen") ou gène de l'antigène de
groupe, qui code pour une polyprotéine qui, découpée, donne les
protéines du nucléoide. Parmi ces protéines internes, I'une d'entre
elles porte l'antigénicité du groupe,
"pol" (pour "polymérase") qui code pour la transcriptase réverse et
"env" (pour "enveloppe") qui code pour les glycoprotéines de
l'enveloppe. Une d'entre elles porte l'antigénicité de chaque sérotype
viral.
"gag", (pour "group specific antigen") ou gène de l'antigène de
groupe, qui code pour une polyprotéine qui, découpée, donne les
protéines du nucléoide. Parmi ces protéines internes, I'une d'entre
elles porte l'antigénicité du groupe,
"pol" (pour "polymérase") qui code pour la transcriptase réverse et
"env" (pour "enveloppe") qui code pour les glycoprotéines de
l'enveloppe. Une d'entre elles porte l'antigénicité de chaque sérotype
viral.
Dans la région codante peut se trouver aussi un gène codant pour une protéine (ou un segment de protéine) virale spécifique du rétrovirus (Par exemple, chez les rétrovirus oncogènes, on trouve un gène onc. Ce n'est pas le cas du virus du SIDA qui n'est pas un rétrovirus oncogène, il ne cancérise pas les cellules mais les détruit).
- NC : une région non codante,
- Pur : une séquence riche en bases puriques,
- AA : 2 nucléotides à adénine,
- U3 : séquence unique de l'extrémité 3' (environ 300 nucléotides),
- R : (short "repeat"), à l'extrémité 3'.
- Pur : une séquence riche en bases puriques,
- AA : 2 nucléotides à adénine,
- U3 : séquence unique de l'extrémité 3' (environ 300 nucléotides),
- R : (short "repeat"), à l'extrémité 3'.
* DNA viral après action de la transcriptase réverse : DNA viral non
intégré 5' AA-U3-R-U5-TT-TBS-NC- région codante -NC-Pur-.AA-U3-R-U -TT 3'
(DNA) 3' TT-U3-R-U5-AA-TBS-NC- région codante-NC-Pyr-TT-U3-R- U5-AA 5'
Après action de la transcriptase réverse, la molécule de DNA double brin transcrite est plus longue que le DNA génomique correspondant.
intégré 5' AA-U3-R-U5-TT-TBS-NC- région codante -NC-Pur-.AA-U3-R-U -TT 3'
(DNA) 3' TT-U3-R-U5-AA-TBS-NC- région codante-NC-Pyr-TT-U3-R- U5-AA 5'
Après action de la transcriptase réverse, la molécule de DNA double brin transcrite est plus longue que le DNA génomique correspondant.
En effet, il y a addition aux 2 extrémités de 2 séquences
- à l'extrémité 5' est ajoutée une séquence U3,
- à l'extrémité 3' est ajoutée une séquence U5.
- à l'extrémité 5' est ajoutée une séquence U3,
- à l'extrémité 3' est ajoutée une séquence U5.
On appelle "LTR" (long terminal repeat) l'ensemble : U3-R-U5.
Il y a donc 1 LTR à chacune des 2 extrémités.
* DNA viral intégré (provirus)
<tb> <SEP> LTR <SEP> LTR
<tb> 5' <SEP> U3-R-U5FTT-TBS-NC-région <SEP> codante-NC-Pur-ÀA3-R-U <SEP> I <SEP> 3'
<tb> 3' <SEP> UR-UAÀ-TBS-NC-région <SEP> codante-NC-Pyr-TT-R-U <SEP> 5'
<tb>
Le DNA linéaire double brin devient circulaire clos, puis il est à nouveau ouvert pour être intégré dans le DNA de la cellule-hôte. On appelle "provirus" le DNA viral intégré. Lors de l'intégration, les dinucléotides (TT, AA) situés aux extrémités du DNA transcrit (et faisant partie de U3 ou U5) sont éliminés.
<tb> 5' <SEP> U3-R-U5FTT-TBS-NC-région <SEP> codante-NC-Pur-ÀA3-R-U <SEP> I <SEP> 3'
<tb> 3' <SEP> UR-UAÀ-TBS-NC-région <SEP> codante-NC-Pyr-TT-R-U <SEP> 5'
<tb>
Le DNA linéaire double brin devient circulaire clos, puis il est à nouveau ouvert pour être intégré dans le DNA de la cellule-hôte. On appelle "provirus" le DNA viral intégré. Lors de l'intégration, les dinucléotides (TT, AA) situés aux extrémités du DNA transcrit (et faisant partie de U3 ou U5) sont éliminés.
La jonction au niveau du site d'intégration implique
- au niveau du DNA hôte, une séquence directe répétée : DR ("direct
repeat"), à la jonction donc avec le provirus.
- au niveau du DNA hôte, une séquence directe répétée : DR ("direct
repeat"), à la jonction donc avec le provirus.
Toutes les DR sont longues de 4 à 6 pdb. Leurs séquences sont différentes. Pour un même provirus, on trouve d'ailleurs différentes DR dans le DNA d'une cellule-hôte. Le site d'intégration du virus n'est donc pas sépcifique, le virus peut être intégré dans le génome de l'hôte à plusieurs endroits différents.
- au niveau du DNA viral, une séquence inverse répétée ; IR
("inverted repeat") aux extrémités du rétrovirus. Deux séquences
sont dites "inverses répétées" quand l'une est à la fois l'inverse et
le complément de l'autre.
("inverted repeat") aux extrémités du rétrovirus. Deux séquences
sont dites "inverses répétées" quand l'une est à la fois l'inverse et
le complément de l'autre.
On a essayé de lutter contre la réplication du virus du SIDA, avec des oligonucléotides antisens, c'est-à-dire des segments d'ADN complémentaires d'une portion de l'ARN messager du virus qui code directement les protéines devant être synthétisées par le ribosome.
Compte tenu du fait que les oligonucléotides alpha forment des hétéroduplex avec leurs oligonucléotides complémentaires bêta et que ceux-ci ne sont pas substrats pour l'enzyme RNase H, on pouvait penser que l'inhibition de l'expression de protéines par l'oligonucléotide alpha pouvait peut-être s'effectuer par un empêchement du ribosome à traduire l'ARNm en protéine virale.
Toutefois, les expériences qui ont été entreprises en ce sens n ont pas été concluantes.
En revanche, I'approche selon la présente invention visant à utiliser des oligonucléotides complémentaires d'une séquence initiale de l'ARN viral et notamment du site initial de fixation de l'ARNt de.la !usine sur l'ARN proviral, s'est avérée efficace.
Ainsi, la présente invention a pour objet un oligonucléotide alpha dont la séquence est complémentaire du site 182-199 de la séquence
PBS de l'ARN proviral du virus VIH, soit l'oligodésoxynucléotide alpha d5, (ACCGCGGGCTTGTCCCTG)3 ou plus généralement un oligonucléotide alpha de formule ACCGCGGGCXXGXCCCXG avec X = T pour un oligodésoxyribonucléotide alpha ou X = U pour un oligoribonucléotide alpha ou une séquence complémentaire en interchangeant X et A d'une part et C et G d'autre part.
PBS de l'ARN proviral du virus VIH, soit l'oligodésoxynucléotide alpha d5, (ACCGCGGGCTTGTCCCTG)3 ou plus généralement un oligonucléotide alpha de formule ACCGCGGGCXXGXCCCXG avec X = T pour un oligodésoxyribonucléotide alpha ou X = U pour un oligoribonucléotide alpha ou une séquence complémentaire en interchangeant X et A d'une part et C et G d'autre part.
D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront à la lumière des exemples qui vont suivre.
La figure I représente l'inhibition de la production virale de cellule MT4 par l'oligonucléotide alpha d5(ACCGCGGGCTTGTCCCTG)3 (oligo alpha "PBS") par dosage de l'activité (cpm) de transcriptase inverse.
EXEMPLE 1: Cytotoxicité des oligonucléotides alpha
Quel que soit le type doligonucléotide utilisé, ceux-ci finissent plus ou moins rapidement par être dégradés par les enzymes cellulaires. On montre ci-après que les oligonucléotides alpha et leur catabolites nucléosides alpha et nucléotide alpha ne présentent pas de cytotoxicité.
Quel que soit le type doligonucléotide utilisé, ceux-ci finissent plus ou moins rapidement par être dégradés par les enzymes cellulaires. On montre ci-après que les oligonucléotides alpha et leur catabolites nucléosides alpha et nucléotide alpha ne présentent pas de cytotoxicité.
Ainsi, I'oligonucléotide alpha-d(CCTCTCCTTCTTTAC) oligo alpha Tat (complémentaire) de la séquence Tat dirigé, à priori, contre aucun site du génome des cellules MT-4, présente une CD50 supérieure à 250 pg/ml. De même, des alpha oligothymidylates alpha-(dT)n (2 ( n < 12) se sont révélés non cytotoxiques vis-à-vis de la même lignée cellulaire.
Enfin, des alpha nucléosides et alpha nucléotides pouvant résulter de l'hydrolyse lente d'oligonucléotides sont également dépourvus de cytotoxicité contre diverses lignées cellulaires (Hela, Vero, cellules primaire de rein de lapin, MT-4).
CYTOTOXICITE D'ALPHA OLIGODESOXYRIBONUCLEOTIDES ET DES UNITES CONSTITUANTES (NUCLEOSIDES ET NUCLEOTIDES)
Concentration <SEP> de <SEP> cytotoxicité <SEP> minimale1 <SEP> ( g/ml) <SEP> CD502( g/m2)
<tb> COMPOSES <SEP> MT-4
<tb> Hela <SEP> Vero <SEP> Rein <SEP> de <SEP> lapin
<tb> Alpha-2'-déoxyguanosine <SEP> (alpha-dG) <SEP> > 400 <SEP> #200 <SEP> > 400 <SEP> > 250
<tb> Alpha-2'-déoxyadénosine <SEP> (alpha-dl) <SEP> > 400 <SEP> > 400 <SEP> #400 <SEP> > 250
<tb> Alpha-2'-déoxythymidine <SEP> (alpha-dT) <SEP> > 400 <SEP> #400 <SEP> > 400 <SEP> > 250
<tb> 5'-phosphate-alpha-dT(alpha-dTMP) <SEP> > 1 <SEP> 250
<tb> Alpha-d(CCTCTCGTTCTTTAC) <SEP> > 250
<tb> Alpha-d(TT) <SEP> > 100
<tb> Alpha-d(TTTT) <SEP> > 100
<tb> Alpha-d(TTTTTT) <SEP> > 100
<tb> Alpha-d(TTTTTTTTTT) <SEP> > 100
<tb> Alpha-d(TTTTTTTTTTTT) <SEP> > 100
<tb> 1nécessaire pour produire une altération de la morphologie des cellules normales détectable microscopiquement, 2nécessaire pour provoquer la mort de 50 % des cellules
EXEMPLE 2 : Evaluation de l'effet antiviral de ltoligo alpha d5,(ACCCCGGCCTTCTCCCTG)3
1. Protocole
a) méthode
L'évaluation est basée sur l'étude de l'effet cytopathogène du virus VIHI sur la lignée cellulaire MT4, après infection par le virus VIHI, la formation des syncitia est observée 4 à 6 jours après l'infection, suivie par une production de particules virales, puis par la mort des cellules.
<tb> COMPOSES <SEP> MT-4
<tb> Hela <SEP> Vero <SEP> Rein <SEP> de <SEP> lapin
<tb> Alpha-2'-déoxyguanosine <SEP> (alpha-dG) <SEP> > 400 <SEP> #200 <SEP> > 400 <SEP> > 250
<tb> Alpha-2'-déoxyadénosine <SEP> (alpha-dl) <SEP> > 400 <SEP> > 400 <SEP> #400 <SEP> > 250
<tb> Alpha-2'-déoxythymidine <SEP> (alpha-dT) <SEP> > 400 <SEP> #400 <SEP> > 400 <SEP> > 250
<tb> 5'-phosphate-alpha-dT(alpha-dTMP) <SEP> > 1 <SEP> 250
<tb> Alpha-d(CCTCTCGTTCTTTAC) <SEP> > 250
<tb> Alpha-d(TT) <SEP> > 100
<tb> Alpha-d(TTTT) <SEP> > 100
<tb> Alpha-d(TTTTTT) <SEP> > 100
<tb> Alpha-d(TTTTTTTTTT) <SEP> > 100
<tb> Alpha-d(TTTTTTTTTTTT) <SEP> > 100
<tb> 1nécessaire pour produire une altération de la morphologie des cellules normales détectable microscopiquement, 2nécessaire pour provoquer la mort de 50 % des cellules
EXEMPLE 2 : Evaluation de l'effet antiviral de ltoligo alpha d5,(ACCCCGGCCTTCTCCCTG)3
1. Protocole
a) méthode
L'évaluation est basée sur l'étude de l'effet cytopathogène du virus VIHI sur la lignée cellulaire MT4, après infection par le virus VIHI, la formation des syncitia est observée 4 à 6 jours après l'infection, suivie par une production de particules virales, puis par la mort des cellules.
La destruction de lymphocytes T4 indispensables à la défense immunitaire est la premièrè cause de la déficience immunitaire caractéristique de l'infection par le VIH. On sait que ce virus tue les cellules en s'y multipliant ; lorsqu'il s'en échappe, il endommage la membrane cellulaire.
Le VIH tue peut-être aussi .les lymphocytes T4 indirectement, par la protéine gel 20 présente sur la membrane des cellules infectées. En effet, les lymphocytes T4 portent une molécule de surface, le récepteur CD4, à laquelle la protéine GP120 se lie; les lymphocytes T4 sains se fixent à la protéine et fusionnent avec la cellule infectée. L'amas cellulaire qui se forme est un "syncytium", incapable de survivre, et toutes les cellules saines qui le composent meurent avec la cellule infectée. Le VIH peut aussi déclencher des réactions immunitaires normales contre les lymphocytes infectés. Avec ou sans l'aide des anticorps, les cellules cytotoxiques de défense détruisent une cellule infectée portant à sa surface des protéines virales. Enfin, la protéine gel20 circule parfois librement en solution dans le sang des sujets infectés ; elle se lie au récepteur CD4 des cellules saines, simulant une infection et déclenchant une réaction de destruction de cellules non infectées.
Les syncytia sont des structures formées de plusieurs noyaux entourés par une seule membrane cellulaire ; Ce sont des signes d'infection par le VIH dans les cultures cellulaires; Les syncytia se forment lorsque les cellules infectées qui synthétisent la molécule gel 20 et la transportent à leur surface fusionnent avec des cellules saines portant la molécule CD4.
b) Composé testé
alpha-d ACCCCGGGCTTGTCCCTG 0,54 U solution mère à 1 mg/ml en eau bidistillée stérile et conservée à-80DC.
c) Test MT4
Les cellules MT4 au jour 2 après le dernier passage sont pré-incubées 1 heure à 37"C avec les dilutions successives du composé à raison de 3.105 cellules pour 100 pl de composé (en micropaque à 96 puits).
b) Composé testé
alpha-d ACCCCGGGCTTGTCCCTG 0,54 U solution mère à 1 mg/ml en eau bidistillée stérile et conservée à-80DC.
c) Test MT4
Les cellules MT4 au jour 2 après le dernier passage sont pré-incubées 1 heure à 37"C avec les dilutions successives du composé à raison de 3.105 cellules pour 100 pl de composé (en micropaque à 96 puits).
L'infection est réalisée en micropuits en ajoutant 100 ul d'une dilution 10 4 du virus VIHI (la dilution de virus a été déterminée pour induire la formation de syncitia en 4 jours).
Après une incubation de I heure à 370C, les cellules MT4 infectées sont lavées 5 fois avant d'être mises en cultures à la concentration de 3.105 cellules par ml, en microplaque à 24 puits, en présence des différentes dilutions choisies.
Tous les 3 ou 4 jours, les cellules sont diluées 3 ou 4 fois et ajustées à la concentration de 3.105 cellules/ml avec le milieu RPMI 10 %
FCS 1 % PSN I 90 Gluta toujours en présence de l'oligo alpha PBS.
FCS 1 % PSN I 90 Gluta toujours en présence de l'oligo alpha PBS.
Tous les 2 ou 3 jours, I'apparition des syncitia est observée dans les cultures.
d) Dosage de la transcriptase inverse
Le suivi de la production virale des cellules MT4 est réalisé par dosage de l'activité de la transcriptase inverse (figure I RT) dans la culture tous les 3 ou 4 jours. Brièvement, I'activité enzymatique est testée en utilisant une amorce synthétique et un substrat radiomarqué au H3 "in vitro". La quantité de matériel radiomarqué précipité, exprimée en coups par minute, est proportionnelle à l'activité de la transcriptase inverse elle-même proportionnelle à la quantité de virus produit par les cellules
MT4 infectées.
d) Dosage de la transcriptase inverse
Le suivi de la production virale des cellules MT4 est réalisé par dosage de l'activité de la transcriptase inverse (figure I RT) dans la culture tous les 3 ou 4 jours. Brièvement, I'activité enzymatique est testée en utilisant une amorce synthétique et un substrat radiomarqué au H3 "in vitro". La quantité de matériel radiomarqué précipité, exprimée en coups par minute, est proportionnelle à l'activité de la transcriptase inverse elle-même proportionnelle à la quantité de virus produit par les cellules
MT4 infectées.
2. Résultats EVALUATION DE L'INHIBITION DE L'EFFET
DU VIRUS VIHI SUR LA LIGNEE MT4 PAR L'OLIGONUCLEOTIDE "ALPHA PBS"
J3 J4 J5 J7 J10 J11 J12 J14 J18 100 g/ml - - - - - - - - - - - (+) - (-) (+) ++ ++ T 25 g/ml (+) - (+) - (+) - (+) (+) (+) ++ + ++ + -+ ++ ++ T T 10 g/ml - (+) (+) (+) + ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ T T 5 g/ml (+)(+) + + ++ + ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ 1 g/ml (+)(+) (+) (+) + (+) ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ 100 ng/ml (+)(+) (+) ++ + ++ + ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ T ++ 50 ng/ml (+)(+) + ++ + ++ + ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ T
VIH I (+)(+) + + ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ T T
Légende : - : absence de syncitia (+) : syncitia en formation + : apparition de syncitia ++ : syncitia
T : cellules tuées
3. Conclusions
Lors de l'évaluation de l'inhibition de l'effet cytopathogène du virus VIHI sur la lignée MT4 par l'oligo alpha 'PBS", un retard dans la formation des syncitia est observé pour les doses non toxiques de 100 pg/ml à 10 pgiml, ce retard pouvant atteindre le 12ème jour après l'infection àla concentration de 100 pg/ml.
DU VIRUS VIHI SUR LA LIGNEE MT4 PAR L'OLIGONUCLEOTIDE "ALPHA PBS"
J3 J4 J5 J7 J10 J11 J12 J14 J18 100 g/ml - - - - - - - - - - - (+) - (-) (+) ++ ++ T 25 g/ml (+) - (+) - (+) - (+) (+) (+) ++ + ++ + -+ ++ ++ T T 10 g/ml - (+) (+) (+) + ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ T T 5 g/ml (+)(+) + + ++ + ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ 1 g/ml (+)(+) (+) (+) + (+) ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ 100 ng/ml (+)(+) (+) ++ + ++ + ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ T ++ 50 ng/ml (+)(+) + ++ + ++ + ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ T
VIH I (+)(+) + + ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ T T
Légende : - : absence de syncitia (+) : syncitia en formation + : apparition de syncitia ++ : syncitia
T : cellules tuées
3. Conclusions
Lors de l'évaluation de l'inhibition de l'effet cytopathogène du virus VIHI sur la lignée MT4 par l'oligo alpha 'PBS", un retard dans la formation des syncitia est observé pour les doses non toxiques de 100 pg/ml à 10 pgiml, ce retard pouvant atteindre le 12ème jour après l'infection àla concentration de 100 pg/ml.
Parallèlement, le suivi de la production virale par les cellules
MT4 infectées montre (figure 1) que quelques soient les doses d'oligo alpha "PBS" utilisées, la production virale reste inférieure à celle obtenue en présence du virus VIHI, avec un pic de production virale maximale retardée.
MT4 infectées montre (figure 1) que quelques soient les doses d'oligo alpha "PBS" utilisées, la production virale reste inférieure à celle obtenue en présence du virus VIHI, avec un pic de production virale maximale retardée.
L'ensemble de ces résultats indiquent que l'oligo alpha PBS présente un effet antiviral sur le virus VIHI.
EXEMPLE 3 : Comparaison de l'effet antiviral d'oligonucléotides "alpha
PBS", "alpha Tat", "alpha random"
La production de particules virales par les cellules CEN1, infectées par VIHI BRU et cultivées en présence d'oligonucléotides, est suivie par dosage de la Reverse Transcriptase (cpm).
PBS", "alpha Tat", "alpha random"
La production de particules virales par les cellules CEN1, infectées par VIHI BRU et cultivées en présence d'oligonucléotides, est suivie par dosage de la Reverse Transcriptase (cpm).
L'oligonucléotide "alpha Tat" correspond à l'oîigonucléotide alpha d5'GTAAAAGTCTTAACCCAC3', Il est complémentaire de la séquence du gène Tat du virus du SIDA.
L'oligo nucléotide "alpha random" correspond à un oligonucléotide quelconque alpha d5 ACTGACTGACTGACTGAC3.
Les résultats de la Reverse Transcriptase en coups par minute comparés à un contrôle Random sont les suivants.
<tb>
<SEP> RT <SEP> en <SEP> cpm <SEP> 54 <SEP> 57 <SEP> J11 <SEP>
<tb> Oligonucléotide <SEP>
<tb> alpha <SEP> PBS <SEP> 100 <SEP> pg/ml <SEP> 454 <SEP> 464 <SEP> 308
<tb> <SEP> 50 <SEP> g/ml <SEP> 254 <SEP> 510 <SEP> 610
<tb> <SEP> 25 <SEP> pg/ml <SEP> 462 <SEP> 489924 <SEP> 66712
<tb> <SEP> 12,5 <SEP> pglmî <SEP> 266 <SEP> 248890 <SEP> 94386
<tb> <SEP> 6,25 <SEP> g/ml <SEP> 286 <SEP> 248240 <SEP> 342042
<tb> <SEP> 3,1 <SEP> pglml <SEP> 798 <SEP> 281604 <SEP> 19918
<tb> Oligonucléotide <SEP>
<tb> alpha <SEP> Tat <SEP> 100 <SEP> ugiml <SEP> 884 <SEP> 30814 <SEP> 35716
<tb> <SEP> 50 <SEP> g/ml <SEP> 1 <SEP> 238 <SEP> 437786 <SEP> 10450
<tb> <SEP> 25 <SEP> g/ml <SEP> 830 <SEP> 616916 <SEP> 122358
<tb> <SEP> 12,5 <SEP> pg/ml <SEP> 1 <SEP> 128 <SEP> 206544 <SEP> 115284
<tb> <SEP> 6,25 <SEP> g/ml <SEP> 438 <SEP> 376 <SEP> 288
<tb> <SEP> 3,1 <SEP> g/ml <SEP> 5a4 <SEP> 2114 <SEP> 42016
<tb> Oligonucléotide
<tb> Random <SEP> 100 <SEP> pg/ml <SEP> 634 <SEP> 126424 <SEP> 528166
<tb> <SEP> 50 <SEP> g/ml <SEP> 348 <SEP> 21494 <SEP> 374398
<tb> <SEP> 25 <SEP> g/ml <SEP> 468 <SEP> 13504 <SEP> 38114
<tb> <SEP> 12.5 <SEP> g/ml <SEP> 622 <SEP> 2226 <SEP> 53714
<tb> <SEP> 6, 25 <SEP> 728 <SEP> 2188 <SEP> 256500
<tb> <SEP> 3,1 <SEP> 338 <SEP> 392 <SEP> 298
<tb> HIV1-10-4 <SEP> 348 <SEP> 73092 <SEP> 11120
<tb> CEM <SEP> non <SEP> infectées <SEP> 304 <SEP> 1040 <SEP> 1438
<tb>
L'oligonucléotide "alpha PBS" montre une inhibition de la production virale pour des concentrations de 100 pg/ml et 50 ug/ml.
<tb> Oligonucléotide <SEP>
<tb> alpha <SEP> PBS <SEP> 100 <SEP> pg/ml <SEP> 454 <SEP> 464 <SEP> 308
<tb> <SEP> 50 <SEP> g/ml <SEP> 254 <SEP> 510 <SEP> 610
<tb> <SEP> 25 <SEP> pg/ml <SEP> 462 <SEP> 489924 <SEP> 66712
<tb> <SEP> 12,5 <SEP> pglmî <SEP> 266 <SEP> 248890 <SEP> 94386
<tb> <SEP> 6,25 <SEP> g/ml <SEP> 286 <SEP> 248240 <SEP> 342042
<tb> <SEP> 3,1 <SEP> pglml <SEP> 798 <SEP> 281604 <SEP> 19918
<tb> Oligonucléotide <SEP>
<tb> alpha <SEP> Tat <SEP> 100 <SEP> ugiml <SEP> 884 <SEP> 30814 <SEP> 35716
<tb> <SEP> 50 <SEP> g/ml <SEP> 1 <SEP> 238 <SEP> 437786 <SEP> 10450
<tb> <SEP> 25 <SEP> g/ml <SEP> 830 <SEP> 616916 <SEP> 122358
<tb> <SEP> 12,5 <SEP> pg/ml <SEP> 1 <SEP> 128 <SEP> 206544 <SEP> 115284
<tb> <SEP> 6,25 <SEP> g/ml <SEP> 438 <SEP> 376 <SEP> 288
<tb> <SEP> 3,1 <SEP> g/ml <SEP> 5a4 <SEP> 2114 <SEP> 42016
<tb> Oligonucléotide
<tb> Random <SEP> 100 <SEP> pg/ml <SEP> 634 <SEP> 126424 <SEP> 528166
<tb> <SEP> 50 <SEP> g/ml <SEP> 348 <SEP> 21494 <SEP> 374398
<tb> <SEP> 25 <SEP> g/ml <SEP> 468 <SEP> 13504 <SEP> 38114
<tb> <SEP> 12.5 <SEP> g/ml <SEP> 622 <SEP> 2226 <SEP> 53714
<tb> <SEP> 6, 25 <SEP> 728 <SEP> 2188 <SEP> 256500
<tb> <SEP> 3,1 <SEP> 338 <SEP> 392 <SEP> 298
<tb> HIV1-10-4 <SEP> 348 <SEP> 73092 <SEP> 11120
<tb> CEM <SEP> non <SEP> infectées <SEP> 304 <SEP> 1040 <SEP> 1438
<tb>
L'oligonucléotide "alpha PBS" montre une inhibition de la production virale pour des concentrations de 100 pg/ml et 50 ug/ml.
A la concentration de 6,25 u/ml on remarque que l'oligo- nucléotide "alpha Tat" ne présente pas de production virale au jour 11. Il en est de même pour le Random à 3,1.
L'ensemble de ces résultats indique l'oligonucléotide "alpha
PBS" présente un effet antiviral sur le virus HIVI à des concentrations de 100 pg/ml et 50 pg/ML, alors que l'oligonucléotide "alpha Tat" et l'oligonucléotid
PBS" présente un effet antiviral sur le virus HIVI à des concentrations de 100 pg/ml et 50 pg/ML, alors que l'oligonucléotide "alpha Tat" et l'oligonucléotid
Claims (10)
1. Composé oligonucléotidique utile pour inhiber la réplication d'un rétrovirus, caractérisé en ce qu'il consiste en une séquence d'oligoribonucléotide ou oligodésoxyribonucléotide d'anomérie non naturelle alpha, ladite séquence étant complémentaire d'une séquence initiale de l'ARN viral comprise dans la séquence TBS ou une séquence en amont de l'ARN viral, notamment la séquence CAP.
2. Composé oligonucléotidique selon la revendication I, caractérisé en ce qu'il est en outre lié de façon covalente à un agent effecteur.
3. Composé oligonucléotidique selon l'une des revendications I ou 2, caractérisé en ce que les composés ont pour formule
dans laquelle:
Les radicaux B peuvent être identiques ou différents et représentent chacun une base d'un acide nucléique éventuellement modifiée et rattachée au cycle glycosidique selon une configuration anomérique alpha non naturelle,
les radicaux B étant complémentaires un à un des bases de la séquence oligonucléotidiques cibles de la séquence TBS ou d'un séquence en amont de l'ARN viral
Les radicaux X peuvent être identiques ou différents et représentent chacun un oxoanion O #, un thioanion S 0, un groupe alkyle, un groupe alcoxy, aryloxy. un groupe amlnoalkyle, un groupe arninoalcoxy, un groupe thioalkyle
R et R', qui peuvent être identiques ou différents, représentent chacun un atome d'hydrogène ou un groupement -Y-Z
Y représente un radical alcoylène droit ou ramifié -alk- ou un radical choisi parmi
avec U = O, N ou S ou bien un radical -Y"-O-Y' où Y" ou Y' peuvent avoir les significations données pour Y
E peut avoir les mêmes significations que X
J représente un atome d'hydrogène ou un groupe hydroxy
Z est un radical correspondant à un agent effecteur
n est un nombre entier y compris O
L représente un atome d'oxygène, un atome de soufre ou un groupe -NH-.
4. Composé selon l'une des revendications précédentes utile pour l'inhibition de la réplication du virus du SIDA VIH dont la séquence est complémentaire du site 182-199 de l'ARN proviral du virus, soit comporte l'oligonucléotide alpha ACCGCGGGCXXGXCCCXG avec X = T ou U ou sa séquence complémentaire en interchangeant X et A d'une part, et C et G d'autre part.
5. Composé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que les composés sont des oligodésoxynucléotides alpha pour lesquels dans la formule I X = 00; 3, R, R' = H B est choisi parmi A,
C, T et G ; et L est un atome d'oxygène.
6. Composition pharmaceutique antivirale caractérisée en ce qu'elle comporte à titre de substance active un composé selon l'une des revendications précédentes.
7. Composition pharmaceutique utile pour le traitement du
SIDA caractérisée en ce qu'elle comporte à titre de substance active l'olîgonucléotide d'anomérie alpha d5'(ACCGCGGGCTTGTCCCTG)3'.
8. Utilisation des composés selon l'une des revendications précédentes pour la préparation d'une composition pharmaceutique utile pour le traitement des affections virales des virus à ARN contenant lesdits composés à titre de substance active.
9. Utilisation selon la revendication précédente pour la préparation d'une composition pharmaceutique utile pour le traitement du
SIDA.
10. Utilisation de l'oligonucléotide alpha d5 (ACCGCGGGCTTGTCCCTG)3 pour la préparation d'une composition pharmaceutique utile pour le traitement du SIDA.
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8907782A FR2648045B1 (fr) | 1989-06-13 | 1989-06-13 | Composes oligonucleotidiques anomeres alpha inhibant la replication des retrovirus |
| EP90909462A EP0477248A1 (fr) | 1989-06-13 | 1990-06-12 | Composes oligonucleotidiques anomeres alpha inhibant la replication des retrovirus |
| PCT/FR1990/000412 WO1990015813A1 (fr) | 1989-06-13 | 1990-06-12 | Composes oligonucleotidiques anomeres alpha inhibant la replication des retrovirus |
| JP2508923A JPH04506074A (ja) | 1989-06-13 | 1990-06-12 | レトロウイルス複製を阻害するαアノマーオリゴヌクレオチド化合物 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8907782A FR2648045B1 (fr) | 1989-06-13 | 1989-06-13 | Composes oligonucleotidiques anomeres alpha inhibant la replication des retrovirus |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FR2648045A1 true FR2648045A1 (fr) | 1990-12-14 |
| FR2648045B1 FR2648045B1 (fr) | 1991-09-27 |
Family
ID=9382646
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FR8907782A Expired - Fee Related FR2648045B1 (fr) | 1989-06-13 | 1989-06-13 | Composes oligonucleotidiques anomeres alpha inhibant la replication des retrovirus |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0477248A1 (fr) |
| JP (1) | JPH04506074A (fr) |
| FR (1) | FR2648045B1 (fr) |
| WO (1) | WO1990015813A1 (fr) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5166195A (en) * | 1990-05-11 | 1992-11-24 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense inhibitors of the human immunodeficiency virus phosphorothioate oligonucleotides |
| US5523389A (en) * | 1992-09-29 | 1996-06-04 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Inhibitors of human immunodeficiency virus |
| FR2717081B1 (fr) * | 1994-03-14 | 1996-06-21 | Centre Nat Rech Scient | Rétropeptides, anticorps dirigés contre ces derniers, et leurs utilisations pour la vaccination et le diagnostic in vitro. |
| US6776986B1 (en) | 1996-06-06 | 2004-08-17 | Novartis Ag | Inhibition of HIV-1 replication by antisense RNA expression |
| FR2906532B1 (fr) * | 2006-09-28 | 2008-12-12 | Biomerieux Sa | Nouvel oligonucleotide marque |
| FR2933410B1 (fr) | 2008-07-04 | 2010-08-20 | Biomerieux Sa | Nouvelle sonde de detection |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1988004301A1 (fr) * | 1986-12-02 | 1988-06-16 | Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs | OLIGONUCLEOTIDES alpha |
| WO1988008001A1 (fr) * | 1987-04-16 | 1988-10-20 | Aktiebolaget Astra | Nucleosides et analogues de nucleosides, compositions et procedes pharmaceutiques permettant la preparation des composes |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2621816B1 (fr) * | 1987-10-14 | 1990-12-28 | Centre Nat Rech Scient | Application antivirale des ologonucleotides |
-
1989
- 1989-06-13 FR FR8907782A patent/FR2648045B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
1990
- 1990-06-12 WO PCT/FR1990/000412 patent/WO1990015813A1/fr not_active Application Discontinuation
- 1990-06-12 EP EP90909462A patent/EP0477248A1/fr not_active Ceased
- 1990-06-12 JP JP2508923A patent/JPH04506074A/ja active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1988004301A1 (fr) * | 1986-12-02 | 1988-06-16 | Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs | OLIGONUCLEOTIDES alpha |
| WO1988008001A1 (fr) * | 1987-04-16 | 1988-10-20 | Aktiebolaget Astra | Nucleosides et analogues de nucleosides, compositions et procedes pharmaceutiques permettant la preparation des composes |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| NUCLEOSIDES AND NUCLEOTIDES, vol. 8, nos. 5,6, 1989, pages 995-1000, Marcel Dekker, Inc.; R. PAUWELS et al.: "Alpha-oligodeoxynucleotides as inhibitors of HIV reverse transcriptase" * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2648045B1 (fr) | 1991-09-27 |
| JPH04506074A (ja) | 1992-10-22 |
| EP0477248A1 (fr) | 1992-04-01 |
| WO1990015813A1 (fr) | 1990-12-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU636573B2 (en) | Inhibition of htlv-iii by exogenous oligonucleotides | |
| US6291438B1 (en) | Antiviral anticancer poly-substituted phenyl derivatized oligoribonucleotides and methods for their use | |
| EP0412964B1 (fr) | Inhibition de l'htlv-iii par des oligonucleotides exogenes | |
| US5684147A (en) | Therapeutic anti-HIV anti-viral oligonucleotides and pharmaceutical formulations thereof | |
| Zelphati et al. | Antisense oligonucleotides in solution or encapsulated in immunoliposomes inhibit replication of HIV-1 by several different mechanisms | |
| CA2102229A1 (fr) | Oligonucleotides fermes, antisens et sens, et leurs applications | |
| DEGOLS et al. | Poly (L-lysine)-conjugated oligonucleotides promote sequence-specific inhibition of acute HIV-1 infection | |
| FR2648045A1 (fr) | Composes oligonucleotidiques anomeres alpha inhibant la replication des retrovirus | |
| Arts et al. | Preferential incorporation of nucleoside analogs after template switching during human immunodeficiency virus reverse transcription | |
| EP0394112A2 (fr) | Utilisation de dipyrido (4,3-b)(3,4-f) indoles pour la préparation de médicaments utiles pour le traitement du SIDA | |
| EP1966376B1 (fr) | Prevention de l'infectiosite retrovirale par l'interference avec la ppt | |
| RU2049336C1 (ru) | Способ определения hiv | |
| WO1999051751A1 (fr) | Inhibiteurs de cofacteur de vih et compositions pharmaceutiques destinees a prevenir ou traiter l'infection due au vih | |
| Furukawa et al. | Mechanism of inhibition of HIV-1 infection in vitro by guanine-rich oligonucleotides modified at the 5′ terminal by dimethoxytrityl residue | |
| EP0395672B1 (fr) | Application antivirale des oligonucleotides alpha | |
| US20030186911A1 (en) | Inhibition of infectious agents by exogenous oligonucleotides | |
| AU678980B2 (en) | Method of inhibiting viral replication | |
| Pfeifer et al. | Formation of a small ribonucleoprotein particle between Tat protein and trans-acting response element in human immunodeficiency virus-infected cells | |
| EP0427843B1 (fr) | Produit inhibiteur specifique de la transcriptase inverse de retrovirus, et son application comme medicament | |
| US20030191078A1 (en) | Inhibition of infectious agents by exogenous oligonucleotides | |
| RU2021810C1 (ru) | Способ воздействия на развитие заболевания, вызванного hiv-вирусом или вирусом, вызывающим сходную биохимическую или клиническую картину | |
| JP2004283024A (ja) | 新規アンチセンスオリゴヌクレオチド及び抗ｈｉｖ剤 | |
| Lund et al. | Inhibition of HIV-1 replication by chimeric phosphorothioate oligodeoxynucleotides applied in free solution | |
| WO1998018915A2 (fr) | Procede de pontage selectif et irreversible d'oligonucleotides platines sur de l'arn et ses applications | |
| EP0463043A1 (fr) | Procede de stabilisation de l'hybridation de sequences polynucleotiques complementaires. |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| ST | Notification of lapse |