WO1998018915A2 - Procede de pontage selectif et irreversible d'oligonucleotides platines sur de l'arn et ses applications - Google Patents

Procede de pontage selectif et irreversible d'oligonucleotides platines sur de l'arn et ses applications Download PDF

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WO1998018915A2
WO1998018915A2 PCT/FR1997/001924 FR9701924W WO9818915A2 WO 1998018915 A2 WO1998018915 A2 WO 1998018915A2 FR 9701924 W FR9701924 W FR 9701924W WO 9818915 A2 WO9818915 A2 WO 9818915A2
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platinum
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rna
adduct
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PCT/FR1997/001924
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Marc Leng
Rozenn Dalbies
Marc Boudvillain
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Centre National De La Recherche Scientifique Cnrs
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
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    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
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    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3511—Conjugate intercalating or cleaving agent

Definitions

  • the present invention relates to the field of molecular biology and relates more particularly to the identification and method of using molecules capable of binding to specific nucleic acid sequences, mainly for medical and research applications.
  • Oligonucleotides are a particularly interesting class of molecules because of their ability to form specific complexes by hybridization with complementary nucleic acid sequences. These complexes can be in the form of duplexes resulting from the hybridization of oligonucleotides with single-stranded DNA sequences or with RNA sequences, such as mRNA, or alternatively in the form of triplexes, by hybridization with double stranded DNA molecules (1-6).
  • the binding of oligonucleotides to the mRNA leads to the inhibition of the translation of said mRNA according to two general processes, on the one hand the degradation of this mRNA by RNase H, on the other hand the steric blocking of the cellular machinery ( 1-9).
  • This blocking can only be done using chemically modified oligonucleotides which do not induce cleavage of the mRNA by RNase H.
  • chemically modified oligonucleotides also makes it possible to improve their incorporation by the cell. and their resistance to nucleases (10).
  • the major constraint in the use of these modified oligonucleotides lies in the fact that the hybridization complexes between the RNA and the oligonucleotide must be sufficiently stable not to be dissociated by the cellular machinery.
  • the antisense oligonucleotides are directed towards the coding region, they are separated from their target by the translation ribosomes (11-15). This dissociation can be avoided by combining with the oligonucleotides reagents capable of reacting spontaneously, or after irradiation, with the target RNA (3-6, 10, 14).
  • French Patent Application published under No. 2,540,122 describes, as new chemical compounds, a sequence of oligonucleotides linked to an intercalating agent. These chemical compounds bind selectively to any complementary nucleotide sequence and the presence of an intercalating agent, which has a strong affinity for the base plates, makes it possible to stabilize the hybrid formed which however can be dissociated. In addition, the presence of intercalating agents endowed with properties distinct from nucleotides allows their detection.
  • the intercalating agents proposed in the Patent Application mentioned above are compounds known in the techniques relating to nucleic acids, they are generally polycyclic compounds having a plane configuration such as acridine, furocoumarin or ellipticine and their derivatives.
  • psoralen (or furocoumarin) and its derivatives, designated hereinafter by photoactivatable intercalating agent in addition to their capacity to be inserted between the base plates of the two DNA strands, have the property of forming bonds. covalent between the double bond 3-4 of the pyrone ring or 4 '-5' of the furan ring, with the double bond 5.6 of the pyrimidine bases, in particular thymine, under irradiation at approximately 360 nm.
  • the photoactivatable intercalating agent coupled to an oligonucleotide via an adequate carbon arm, as described in French Patent Application No.
  • French Patent Application No. 2,568,254 describes the application of oligonucleotide compounds linked to an intercalating agent for the selective blocking of a nucleic acid sequence, and more particularly the application of these compounds to selective blocking in vivo expression of a gene or sequence involved in the initiation, propagation or termination of the replication of a nucleic acid, the transcription of one or more genes and / or their translation.
  • the object of the present invention is precisely to overcome the drawbacks of the methods described in the prior art by providing a method making it possible to irreversibly and specifically fix an oligonucleotide on an RNA sequence which is complementary thereto.
  • oligonucleotides modified by transplatin trans-diamminedi chloropla t ine (II)
  • platinum oligonucleotides which have the property of forming intra-strand adducts stable as long as the platinum oligonucleotides are single strands, and which rearrange into interbrand adducts when the Platinized oligonucleotides are paired with a complementary nucleic acid sequence.
  • the experimental method comprises two major steps, on the one hand the formation of intra-bypass bridges within the single stranded oligonucleo, and on the other hand, the rearrangement of the intrabrand bridges into interbrand bridging in the duplexes.
  • the reaction between transplatin and the oligonucleotides containing the sequence d (GNG) leads to the interbrand adducts of general formula: 1,3-t ra ns ⁇ Pt (NH 3 ) 2. d (GNG)] ⁇ (24).
  • these adducts are kinetically inert as long as the oligonucleotides are single stranded (16-18, 24).
  • the pairing of the platinum oligonucleotides with their complementary strand promotes the rearrangement of the intrabrand adducts-1, 3 into interbrand adducts (16).
  • the inventors have now arrived at a process for the specific and irreversible attachment of an oligonucleotide to an RNA, characterized in that a platinum oligonucleotide containing an intrabrin adduct of transplatin or its analogues is brought into contact with an RNA comprising or consisting of a specific complementary sequence of said oligonucleotide, under conditions allowing the formation of hybrids, so as to rapidly obtain a bridged hybrid by means of an interbrand adduct.
  • the method of the invention can be implemented with a mixture of identical or different platinum oligonucleotides and / or a mixture of identical or different target RNAs whose size is greater than or equal to that of the platinum oligonucleotide .
  • the rearrangement of the intrabrand adducts into interbrand adducts is carried out in a few minutes with a target nucleic acid which is an RNA, by the sole contacting of the platinum oligonucleotide and said target RNA without additional reaction such as than irradiation.
  • Another advantage of the method of the invention is to exclude non-specific reactions since the bridging between the oligonucleotide and its target is only carried out during pairing.
  • the platinum oligonucleotide comprises a sequence of nucleotides complementary to a specific RNA sequence and contains an intrabrin adduct at a site with a 5 'GNG sequence, in which N represents a residue of any nucleotide, G represents a guanine residue and 5 'indicates the direction of the sequence of the nucleotides in the oligonucleotide.
  • a platinum oligonucleotide advantageously used in this method comprises a sequence of nucleotides complementary to a specific RNA sequence, the portion of sequence corresponding to the intrabrand adduct of sequence 5 'GNG of the platinum oligonucleotide, is a 5 'XA (Y) sequence, in which:
  • X is chosen from uracil, cytosine, adenine, guanine residues,
  • Y if present, is any nucleotide, and in this case X is a uracil residue.
  • Particularly preferred 5'X A (Y) sequences are as follows: 5'UA, 5'CA, 5 'UAC, 5' UAU.
  • the process of the invention therefore consists schematically, of reacting, under conditions allowing the formation of a specific hybridization complex, a platinum oligonucleotide containing an intrabrin adduct, corresponding for example to the formula:
  • Ni ', N 2 ', N3 ', N', N 5 ', N 6 ', N7 ', N 8 ', Ng ', NIO' and u ' represent the bases complementary to the bases Ni, N 2 respectively , N3, N 4 , N 5 , N ⁇ , N7, NQ, N, N o and Nu of the oligonucleotide of formula (I),
  • A represents an adenine base
  • U represents an uracil base
  • C represents a cytosine base
  • the dashes represent the other bases of the target RNA, to obtain a hybridization complex containing an interbrand adduct corresponding to one of the following two formulas:
  • the size of the platinum oligonucleotide containing the intrabrin adduct used in the process of the invention can have a variable size, and advantageously it consists of a sequence of at least 10 nucleotides.
  • the method of the invention can be carried out with an RNA sequence larger than the platinum oligonucleotide or with a mixture of RNA.
  • the platinum oligonucleotide containing the intrabrin adduct may consist of a chain of natural and / or modified ribonucleotides or deoxyribonucleotides.
  • modified nucleotides mention may be made of 2 ′ -O-alkyl nucleotides, ethylphosphonate nucleotides, and advantageously, all the modified nucleotides and combinations of nucleotides capable of conferring on the oligonucleotide that they compose resistance to enzymes capable of degrading said oligonucleotide in vivo.
  • the method of the invention can be applied, in a non-exhaustive manner:
  • the method of the invention described above is characterized in that the specific target RNA sequence of the platinized oligonucleotide is contained in said determined RNA sequence to be purified;
  • the method of the invention described above is characterized in that the specific RNA sequence of the target of the platinized oligonucleotide is contained in said determined RNA sequence to detect, and the platinum oligonucleotide is advantageously labeled by any suitable means;
  • the method of the invention described above is characterized in that the specific RNA sequence target of the platinum oligonucleotide is contained in said RNA sequence determined to block specifically.
  • Such an application is particularly suitable for selectively blocking the expression of a gene by inhibiting the translation of its mRNA, or to selectively block the replication and / or the development of viruses, bacteria or parasites.
  • the invention also relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising as active ingredient an adequate quantity of platinum oligonucleotides used in the process of the invention capable of rapidly fixing on at least one specific RNA sequence so as to form complexes of irreversibly bridged hybridization through interbrand adducts.
  • the invention relates to platinum oligonucleotides containing an intrabrin adduct, for their use as an antisense product making it possible to rapidly, selectively and irreversibly block the translation of a specific mRNA containing a sequence substantially complementary to that of said platinum oligonucleotide.
  • oligodeoxynucleotides, oligoribonucleotides and oligoribonucleotides-2 '-0-methyl used in the examples below are of commercial origin and were purified by chromatography on an anion exchange column (monoQ column from Pharmacia) as described in literature (16, 17).
  • the reagents used listed below were acquired commercially:
  • T4 polynucleotide kinase and ribonuclease Tl (Boehringer Mannheim).
  • the platinum oligonucleotides were mixed with the complementary strands at 0 ° C and then incubated under various conditions. At regular time intervals, aliquots were removed and analyzed by polyacrylamide gel electrophoresis under denaturing conditions. The disappearance of the intra-strand-1, 3 bypasses as a function of time was evaluated by quantifying with a "Molecular Dynamics Phospholmager" apparatus (Image Quant Software version 3.3 of data management) the fraction of product which did not react. Hybrids containing interbrand bridging were purified by electrophoresis on 20% polyacrylamide gel under denaturing conditions, then mixed with 2 ⁇ g of tRNA and incubated at 90 ° C in 10 mM NaOH for 10 minutes. The reaction products were resolved on a 24% polyacrylamide sequencing gel.
  • the melting curves of the hybrids were recorded by measuring the absorbance at 260 nm as a function of the temperature, using a Kontron Uvikon 810 spectrophotometer. The increase in temperature was 1 ° C. per minute.
  • the melting temperatures (Tm) were obtained from. midpoint of the sigmoid plots of the absorbance as a function of the temperature, with an accuracy of ⁇ 0.5 ° C.
  • the volumes of the solutions were adjusted to 25 ⁇ l and the mixtures were incubated for 30 minutes at 37 ° C. Aliquots were taken and denatured by heating in the presence of SDS and ⁇ -mercaptoethanol, then loaded onto a 10% SDS 0.1% polyacrylamide gel.
  • oligonucleotides were incubated in a 24-well plate with HBL10OOrasl cells (75.10 3 cells per well) in 500 ⁇ l of complete culture medium
  • n t - ni (n t - n Q ) x 100, in which, n t is the number of cells not treated after 24 hours of incubation, nor is the number of cells treated and n D is the number of cells counted at the start of the experiment. 8) RT-PCR.
  • the treated and untreated cells (1-2.10 6 ) were incubated for 5 minutes at 4 ° C in 500 ⁇ l of lysis buffer (0.15 M NaCl; 10 mM Tris.HCl; pH 7.5 ; 1.5 M MgCl 2 ; 0.65% NP-40).
  • the supernatants were mixed with 500 ⁇ l of Urea / SDS buffer (7 M urea; 10 mM Tris.HCl; pH 7.5, 10 mM EDTA; 1% SDS).
  • the samples were centrifuged and the total RNA was precipitated with ethanol.
  • the RNA (2 ⁇ g) was subjected to reverse transcription and the resulting cDNAs were co-amplified by PCR in accordance with the manufacturer's recommendations (Perkin Elmer Cetus) using the following pairs of specific Ha-ras primers:
  • the number of cycles was 25: 50 seconds at 94 ° C, 50 seconds at 57 ° C, 20 seconds at 72 ° C).
  • the reaction products were separated by electrophoresis on a 10% polyacrylamide gel and visualized by staining with ethidium bromide.
  • the quantification of the intensity of the bands was carried out with a Videocopy system (Bioprobe Systems) using Densylab software (Microvision Instruments) for the data processing.
  • FIG. 1 is a schematic representation of the experimental method with oligonucleotides represented by their central sequence. In this figure, the location of the interbrand bridging corresponds to DNA-DNA type duplexes (16). The study of this rearrangement of intrabrand adducts into interbrand adducts has led the inventors to confer a major role on the conformation of hybrids on the speed of rearrangement. This study was therefore continued:
  • modified platinum oligonucleotides for example by replacing the deoxyribonucleot ides by 2'-0-methyl-ribonucleotide residues
  • modifying the complementary target RNA strand for example by replacing the triplet of bases opposite to the intrabrand adduct by a triplet not responding to the matching law or by a doublet of bases.
  • the RNAs corresponding to these two modifications have been designated in the following, respectively, RNA or RNA (-l).
  • the platinized strands comprising 18 nucleotides and having a unique intrabrin-1, 3 bridging located in the middle of the sequence were incubated with complementary RNA or RNA (-l) strands, containing respectively 18 or 17 nucleotides, labeled at their 5 'end. Aliquots were taken at regular time intervals and analyzed by gel electrophoresis under denaturing conditions.
  • Figure 2 presents the results of the rearrangement of intra-strand adducts-1, 3 in the cases, from left to right:
  • - platinum hybrids comprising a mismatch, between 2 '-OMe-RNA and RNA, - platinum hybrids between DNA and RNA (-l), of platinum hybrids between 2 '-OMe-RNA and
  • the autoradiograms of the 20% denaturing polyacrylamide gel of FIG. 2 were obtained from the strands of RNA marked at their end 5 'below: 5'- AGGAGAUAUAGAGGAG A- 3' (RNA) 5'-AAGGAGAAUAGAGGAG A- 3 '(RNA (-l) with 1' platinum oligodeoxyribonucleotide of formula: 5'-TCTCCTCTGTGTCTCCT T-3 '(DNA bands) or 1' oligo-2 '-O-methyl-ribonucleotide of formula: 5'-UCUCCUCUGUGUCUCCU U -3 '(2'-0-Me bands)
  • the samples (2 ⁇ M) were incubated at 37 ° C in: 150 ml of NaClO 4 ; 5 mM phosphate buffer; pH 7.5
  • Replacing the platinum strand of DNA with a 2 '-OMe-RNA strand platinized in hybrids has the advantage of increasing the speed of the interbrand bridging reaction and the thermal stability by about 13 ° C.
  • the better resistance of oligo-2 '-Omethyl-ribonucleotides to nucleases constitutes a remarkable advantage from the perspective of an antisense strategy (25-27).
  • the hybrids were subjected to light alkaline hydrolysis to obtain a cleavage of the RNA and the resulting fragments were analyzed on an electrophoresis gel under denaturing conditions.
  • Figure 3 in the appendix relates to the identification of the ribonucleotide bridged in the hybrid
  • DNA / RNA (-1) containing an interbrand adduct The autoradiogram of FIG. 3 represents the analysis on 24% denaturing polyacrylamide gel:
  • the band profile reflects the cleavage at the G residues induced by partial digestion of the RNA strand (-l) labeled at its 5 ′ end with RNase Tl (28).
  • the results presented in FIG. 3 relate to the hybrids possessing the central sequence d (GTP). r (UA). The fragments preceding (in position 5 ′) the bridged residue are detected and to conclude from this that the bridged residue is residue A opposite to the initial intrabrin bridging. Similar results have been obtained with hybrids having the following central sequences d (GTG) .r (UAU), 2 '-OMe (GTG). rUAU or 2 '-OMe (GTG). rUA.
  • the interbrand bridging is essentially established between the 5 ′ G residue of the initial intrabrin adduct and the complementary residue C (16).
  • the fingerprint experiments carried out within the framework of the present invention made it possible to conclude that in platinum hybrids, the interbrand bridging is essentially established between the nitrogen atom in position 7 of the 5 ′ G residue (upper strand) and residue A of the UAU triplet or the AU doublet of the RNA strand.
  • the replacement of the AU doublet by the UG doublet lowering the interbrand bridging rate it seems more likely that the platinum residue is attached to the nitrogen atom in position 1 than to the nitrogen atom in position 7 of the residue A.
  • the capped Ha-ras mRNA comprising 820 nucleotides, was incubated for 10 minutes with an oligo-2 '- O-methyl-ribonucleotide of 17 nucleotides, called Ras 1, complementary to the sequence located between positions +130 and +145 with respect to base A of the initiation codon AUG of the Ha-ras mRNA.
  • Ras 1 an oligo-2 '- O-methyl-ribonucleotide of 17 nucleotides, called Ras 1, complementary to the sequence located between positions +130 and +145 with respect to base A of the initiation codon AUG of the Ha-ras mRNA.
  • This 16-nucleotide sequence has at its center the 5 'CA doublet and the 14 nucleotide residues from the 3' end are in a loop as suggested in the secondary structure model of the computer generated Ha-ras mRNA (30 ).
  • FIG. 4 relates to the analysis of the sequence specificity of the bridging reaction:
  • line Ras 1 corresponds to 1 'oligo-2' -0- methyl-ribonucleotide of sequence: 5'-C C C A U C A A G U G A C C A C-3 ', complementary to the sequence:
  • the polymerization reaction is completely stopped by the bridged oligonucleotide.
  • two stops are detected, the most important in terms of bypassing and the lowest in terms of the 5 'end of the oligonucleotide.
  • the specificity of the binding has been proven by competitive experiments.
  • the platinum oligonucleotide was incubated for 10 minutes with a mixture of Ha-ras mRNA and luciferase mRNA (30 times in excess) and then reverse transcriptase was added. The results with or without luciferase mRNA are identical.
  • the same non-platinum oligonucleotide appears to be a weak inhibitor of reverse transcriptase. A weak stop is detected at the targeted sequence, which is in agreement with other results (31).
  • Non-complementary platinum and non-platinum oligonucleotides, designated Scr do not affect cDNA synthesis.
  • the specificity of the bridging reaction was then tested by observing the efficacy of the bridged oligonucleotides on the inhibition of protein synthesis in an acellular system.
  • the experiment was carried out on Ha-ras mRNA capped after reaction with the oligo2 '-O-methyl-ribonucleotide Ras 1. It was first verified that the kinetics of the bridging reaction were not not modified by the addition of a rabbit reticulocyte lysate and that there was no degradation of the Ha-ras mRNA even after the addition of RNase H.
  • the platinum oligonucleotide was mixed with Ha-ras and luciferase mRNAs, the whole was incubated for 10 minutes at 37 ° C., then the amino acids and the rabbit reticulocyte lysate were added. The translation products were analyzed by SDS-PAGE.
  • FIG. 5 relates to the in vitro inhibition of the translation of the Ha-ras mRNA capped by a non-platinum (line -Pt) or platinumated (line + Pt) oligo-2 ′ -O-methyl-ribonucleotide.
  • the Ras 1 and Scr lines refer to the oligonucleotides tested in the reverse transcription experiments.
  • the oligonucleotide / Hamar mRNA ratios are indicated at the top of the figure.
  • Translation efficiency is expressed as a percentage of Ha-ras protein translated compared to that of luciferase (internal control).
  • the ratio of the intensities of Ha-ras and luciferase bands was fixed at 100% translation when no oligonucleotide was present (line 0). It is observed that the platinum-coated Ras 1 oligonucleotide completely inhibits the translation of Ha-ras mRNA, but does not affect the translation of luciferase mRNA. The same non-platinum oligonucleotide and platinum or non-platinum Scr oligonucleotides have no effect on translation of Ha-ras mRNA.
  • the ability of the Ras 1 oligonucleotide to inhibit translation was also tested using the widely described HBLlOOras 1 cell system.
  • This clone was obtained from the human cell line HBL100 which was transformed with the Ha-ras gene mutated on the twelfth codon (32).
  • the oncogenic Ras p21 proteins trapped in their activated form linked to GTP for a long time send to the cells numerous signals stimulating growth.
  • the selective deprivation of the Ha-ras protein in HBLlOOras 1 cells leads to inhibiting cell division.
  • Several experiments have shown that the proliferation of HBLlOOras 1 cells is specifically inhibited by antisense oligonucleotides targeted towards the Ha-ras messenger, probably by a mechanism dependent on RNase H (22, 23).
  • FIG. 6 represents the inhibition of the proliferation of HBL10OOrasl cells as a function of the concentration of oligonucleotide:
  • Each point corresponds to an average value (error ⁇ 15%) of at least two triplicate cultivation experiments.
  • the treatment of HBLlOOras 1 cells with the platinum oligonucleotide Rasl induces a dose-dependent inhibition of cell proliferation beyond 0 to 4 ⁇ M (50% inhibition at the concentration of approximately 0, 4 ⁇ M).
  • the same non-platinum oligonucleotide has a slight cytostatic effect on the cells, but the inhibition of growth does not exceed 30% at 4 ⁇ M, while the oligonucleotide Scr or not platinum has no effect.
  • high cell viability > 95%) was observed using the trypan blue exclusion method.
  • FIG. 7 relates to the expression of the mRNA of Ha-ras and of ⁇ 2 -microglobulin in the cells
  • HBLlOOras 1 exposed 24 hours to one oligonucleotide ras 1 not platinized (line 3) or platinized (lines 2 and 5).
  • Lines 1 to 4 relate to untreated cells.
  • the location of the 72 bp and 183 bp Ha-ras fragments obtained by RT-PCR, with respect to the portion of mRNA capable of being bridged with platinized Ras 1, is schematically indicated above the lines. As the relative intensities of the bands of lines 4 and 5 of FIG.
  • the platinum oligonucleotide Ras 1 show that the synthesis of the 183 bp fragments of Ha-ras is greatly reduced

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Abstract

L'invention concerne un procédé de fixation spécifique et irréversible d'un oligonucléotide sur un ARN, caractérisé en ce que l'on met en contact un oligonucléotide platiné contenant un adduit intrabrin du transplatine ou de ses analogues, avec un ARN comprenant ou constitué par une séquence complémentaire spécifique dudit oligonucléotide, dans des conditions permettant la formation d'hybrides, de façon à obtenir rapidement un hybride ponté par le biais d'un adduit interbrin. L'invention concerne aussi l'application du procédé à la purification, la détection et au blocage d'ARN et des oligonucléotides antisens.

Description

PROCEDE DE PONTAGE SELECTIF ET IRREVERSIBLE D' OLIGONUCLEOTIDES PLATINÉS SUR DE L ' ARN ET SES APPLICATIONS .
La présente invention concerne le domaine de la biologie moléculaire et se rapporte plus particulièrement à l'identification et la méthode d'utilisation de molécules capables de se fixer sur des séquences spécifiques d'acides nucléiques, principalement pour des applications médicales et de recherche.
Les oligonucleotides constituent une classe de molécules particulièrement intéressante du fait de leur aptitude à former par hybridation des complexes spécifiques avec des séquences d'acides nucléiques complémentaires. Ces complexes peuvent se présenter sous la forme de duplexes résultant de l'hybridation d ' oligonucleotides avec des séquences d'ADN simples brins ou avec des séquences d'ARN, comme de l'ARNm, ou encore sous forme de triplexes, par hybridation avec des molécules d'ADN doubles brins (1-6). La fixation d ' oligonucleotides sur l'ARNm conduit à 1 ' inhibition de la traduction dudit ARNm selon deux processus généraux, d'une part la dégradation de cet ARNm par la RNase H , d'autre part le blocage stérique de la machinerie cellulaire (1-9) . Ce bloquage ne peut se faire qu'à l'aide d ' oligonucleotides chimiquement modifiés n'induisant pas la coupure de l'ARNm par la RNase H. L'utilisation d ' oligonucleotides chimiquement modifiés permet aussi d'améliorer leur incorporation par la cellule et leur résistance aux nucléases (10) . La contrainte majeure de l'utilisation de ces oligonucleotides modifiés réside dans le fait que les complexes d'hybridation entre l'ARN et 1 ' oligonucleotide doivent être suffisamment stables pour ne pas être dissociés par la machinerie cellulaire. Ainsi, lorsque les oligonucleotides antisens sont dirigés vers la région codante, ils sont séparés de leur cible par les ribosomes de la traduction (11-15). Cette dissociation peut être évitée en associant aux oligonucleotides des réactifs capables de réagir spontanément, ou après irradiation, avec 1' ARN cible (3-6, 10, 14).
La Demande de Brevet Français publiée sous le N° 2 540 122 décrit à titre de nouveaux composés chimiques, une séquence d' oligonucleotides liée à un agent intercalant. Ces composés chimiques se lient de façon sélective à toute séquence complémentaire nucléotidique et la présence d'un agent intercalant, qui possède une forte affinité pour les plateaux de bases, permet de stabiliser l'hybride formé qui cependant peut être dissocié. En outre, la présence des agents intercalants dotés de propriétés distinctes des nucléotides permet leur détection. Les agents intercalants proposés dans la Demande de Brevet mentionnée ci-dessus sont des composés connus dans les techniques touchant aux acides nucléiques, il s'agit en général de composés polycycliques ayant une configuration plane tels que l'acridine, la furocoumarine ou 1 ' ellipticine et leurs dérivés. Parmi ceux- ci, le psoralène (ou furocoumarine) et ses dérivés, désignés ci-après par agent intercalant photoactivable, outre leur capacité à s'intercaler entre les plateaux de bases des deux brins d'ADN, présentent la propriété de former des liaisons covalentes entre la double liaison 3-4 du cycle pyrone ou 4 '-5' du cycle furane, avec la double liaison 5,6 des bases pyrimidiques, en particulier la thymine, sous irradiation à environ 360 nm . Ainsi l'agent intercalant photoactivable couplé à un oligonucleotide par l'intermédiaire d'un bras carboné adéquat, comme décrit dans la Demande de Brevet Français n° 2 540 122, s'intercalera entre les plateaux de bases formés par 1 ' oligonucleotide et toute séquence d'acide nucléique complémentaire; l'irradiation à 360 nm des hybrides obtenus permettra de créer des liaisons covalentes entre l'agent intercalant ainsi activé et la séquence d'acide nucléique complémentaire de manière à créer un hybride ponté stable. On connaît également la Demande de Brevet Internationale publiée sous le n° WO 90/12020 qui propose de coupler la furocoumarine à un oligonucleotide par l'intermédiaire d'un sucre ribose ou déoxyribose. Les Demandes de Brevet Européenne n° 316 016,
Internationale n° WO 89/06702 et Allemande n° 3928900 décrivent l'utilisation de conjugués de psoralène et d ' oligonucleotides pour bloquer l'expression génétique.
La demande de Brevet Français n° 2 568 254, décrit l'application de composés oligonucleotides liés à un agent intercalant pour le blocage sélectif d'une séquence d'acide nucléique, et plus particulièrement l'application de ces composés au blocage sélectif in vivo de l'expression d'un gène ou d'une séquence impliquée dans l'initiation, la propagation ou la terminaison de la réplication d'un acide nucléique, de la transcription d'un ou plusieurs gènes et/ou de leur traduction.
Toutefois, ces méthodes chimiques présentent des inconvénients, car, l'induction de pontages par des agents chimique s'accompagne souvent de réctions non spécifiques, et l'activation photochimique est difficile à mettre en oeuvre in vivo.
Le but de la présente invention est précisément de palier aux inconvénients des méthodes décrites dans l'art antérieur en offrant un procédé permettant de fixer de façon irréversible et spécifique un oligonucleotide sur une séquence d ' ARN qui lui est complémentaire.
Ce but est atteint en utilisant des oligonucleotides modifiés par le transplatine (trans- diamminedi chloropla t ine ( I I ) ) ou ses analogues f onc t ionnel 1 ement équivalent, ci-après désignés oligonucleotides platinés, qui présentent la propriété de former des adduits intrabrins stables tant que les oligonucleotides platinés sont des simples brins, et qui se réarrangent en adduits interbrins lorsque les oligonucleotides platinés sont appariés avec une séquence d'acide nucléique complémentaire. Ainsi, de manière remarquable, le réarrangement des adduits intrabrins en adduits interbrins est déclenché par la formation de la double hélice de l'hybride (16) .
Les travaux déjà réalisés avec des oligonucleotides platinés ont permis de montrer que l'hybridation d ' ol igodésoxyribonucléot ides platinés contenant un seul pontage intrabrin entre deux résidus de guanine séparés par une base quelconque N, désigné intrabrin
(Gl, G3 ) ou intrabrin- 1 , 3 , avec des brins d'ADN ou d 'ARN s'accompagne d'un réarrangement des pontages intrabrins en pontages interbrins. Comme indiqué précédemment, le procédé expérimental comprend deux étapes majeures, d'une part la formation des pontages intrabins au sein de 1 ' oligonucleo ide simple brin, et d'autre part, le réarrangement des pontages intrabrins en pontages interbrins dans les duplexes . La réaction entre le transplatine et les oligonucleotides contenant la séquence d(GNG) conduit aux adduits interbrins de formule générale : 1,3- t ra n s { Pt ( NH3 ) 2.d ( GNG ) ] } (24) . Dans des conditions physiologiques, ces adduits sont cinétiquement inertes tant que les oligonucleotides sont simples brins (16-18, 24) . Comme montré sur la figure 1, 1 ' appariement des oligonucleotides platinés avec leur brin complémentaire favorise le réarrangement des adduits intrabrins-1 , 3 en adduits interbrins (16) . Le réarrangement des adduits intrabrins en adduits interbrins présente l'inconvénient de se produire lentement dans le cas d'hybrides avec des séquences d'ADN (τ1 2 de l'ordre de 1 à 14 heures à 37°C) et très lentement dans le cas d'hybrides avec des séquences d ' ARN (Xχ/2 de l'ordre de 15 à 50 heures), ce qui limite considérablement les possibilités d'utilisation de ce phénomène notamment dans le domaine thérapeutique pour la mise en oeuvre de stratégies thérapeutiques antisens .
Les inventeurs sont maintenant parvenus à un procédé de fixation spécifique et irréversible d'un oligonucleotide sur un ARN, caractérisé en ce que l'on met en contact un oligonucleotide platiné contenant un adduit intrabrin du transplatine ou de ses analogues, avec un ARN comprenant ou constitué par une séquence complémentaire spécifique dudit oligonucleotide, dans des conditions permettant la formation d'hybrides, de façon à obtenir rapidement un hybride ponté par le biais d'un adduit interbrin.
Bien entendu, le procédé de l'invention peut être mis en oeuvre avec un mélange d ' oligonucleotides platinés identiques ou différents et/ou un mélange d'ARN cibles identiques ou différents dont la taille est supérieure ou égale à celle de 1 ' oligonucleotide platiné.
Grâce au procédé de l'invention, le réarrangement des adduits intrabrins en adduits interbrins est réalisé en quelques minutes avec un acide nucléique cible qui est un ARN, par la seule mise en contact de 1 ' oligonucleotide platiné et dudit ARN cible sans réaction additionnelle telle qu'une irradiation.
Un autre avantage du procédé de 1 ' invention est d'exclure les réactions non spécifiques car le pontage entre 1 ' oligonucleotide et sa cible n'est réalisé que lors de 1 ' appariement .
Selon une forme de mise en oeuvre préféré du procédé de l'invention, 1 ' oligonucleotide platiné comprend un enchaînement de nucléotides complémentaires d'une séquence spécifique d'ARN et contient un adduit intrabrin au niveau d'un site de séquence 5 'G N G, dans laquelle N représente un résidu de nucléotide quelconque, G représente un résidu guanine et 5' indique le sens de l'enchaînement des nucléotides dans 1 ' oligonucleotide.
Les travaux de recherche des Inventeurs ont permis de déterminer des aspects conformationnels de 1 ' oligonucleotide assurant au procédé de l'invention une efficacité remarquable. Ainsi, un oligonucleotide platiné avantageusement mis en oeuvre dans ce procédé comprend un enchaînement de nucléotides complémentaires d'une séquence spécifique d'ARN dont la portion de séquence correspondant à 1' adduit intrabrin de séquence 5 'G N G de 1 ' oligonucleotide platiné, est une séquence 5' X A (Y), dans laquelle :
- A représente un résidu adénine,
- Y peut être absent, et dans ce cas X est choisi parmi les résidus uracile, cytosine, adénine, guanine,
Y s'il est présent, est un nucléotide quelconque, et dans ce cas X est un résidu uracile.
Des séquences 5'X A (Y) toutes particulièrement préférées sont les suivantes : 5'UA, 5'CA, 5 ' UAC , 5 ' UAU .
Le procédé de l'invention consiste donc schématiquemen , à faire réagir, dans des conditions permettant la formation d'un complexe d'hybridation spécifique, un oligonucleotide platiné contenant un adduit intrabrin, répondant par exemple à la formule :
5'N-L N2 3 N4 N5 6 G N G N7 N8 Ng N1Q Nχι 3' (I) dans laquelle : Ni, N2 , N3 , N4 , N5 , Nβ , N7 , Ng , Ng , 10, Nu, N représentent des résidus de nucléotides ou de désoxynucléotides naturels et/ou modifiés, G représentant un une guanine ou désoxyguanine naturelle ou modifiée, et le sigle "A" couvrant le triplet G N G représente le pontage intrabrin (G1,G3) , avec une séquence d'ARN répondant par exemple à l'une des formules suivantes :
3'- - - N-L 'N2 'N3 'N4 'N5'N6 ' A U N7 'Ng ' N 'Nχ 0 'Nχι ' - - -5' (II) ou
3'- - - Nχ 'N2 'N3 'N4'N5'N6 ' A C N? 'N8 ' Ng 'Nχ g 'Nχι ' - - -5' (III)
dans lesquelles : Ni', N2 ' , N3 ' , N ' , N5 ' , N6 ' , N7 ' , N8 ' , Ng ' , NIO ' et u ' représentent les bases complémentaires respectivement des bases Ni, N2 , N3 , N4 , N5 , Nβ , N7 , NQ , N , N o et Nu de 1 ' oligonucleotide de formule (I), A représente une base adénine, U une base uracile et C une base cytosine, et les tirets représentes les autres bases de 1 'ARN cible, pour obtenir un complexe d'hybridation contenant un adduit interbrin répondant à l'une des deux formules suivantes :
5 ' ]_ N2 N3 N4 N5 Ng G N G N? Ng Ng Nχ Q N11 3'
3 ' - - - Nχ ' N2 ' N3 ' N4 ' N5 ' N6 ' A U N7 ' Ng ' Ng , N]_ g , N11 - -5' ou
5 ' N^_ N2 N3 N N5 N6 G N G N7 Ng Ng N1 Q N- - (v)
3'- - - Nτ_ 'N2 'N3 'N4 'N5 ' N6 ' A C N? 'Ng ' Ng 'Nχ Q ' χl ' - - -5' dans lesquelles i , N , N3 , N4 , N5 , β , N7 , N8 , N , Nio, Nu, Ni', N2 ' , N3 ' , N4 ' , N5', N6 ' , N7\ N8 ' , Ng ' , Nι0', Nu' G, N, C et A ont les mêmes significations que dans les formules (I), (II) et (III), et le sigle "Z" représente le pontage interbrin entre le triplet 5 'G N G de 1 ' oligonucleotide platiné et le doublet non complémentaire 3 'A C ou 3 'A U qui lui fait face.
La taille de 1 ' oligonucleotide platiné contenant 1' adduit intrabrin mis en oeuvre dans le procédé l'invention peut avoir une taille variable, et avantageusement il est constitué d'un enchaînement d'au moins 10 nucléotides. Le procédé de 1 ' invention peut être mis en oeuvre avec une séquence d'ARN de plus grande taille que 1 ' oligonucleotide platiné ou encore avec un mélange d'ARN.
L ' oligonucleotide platiné contenant l' adduit intrabrin peut être constitué d'un enchaînement de ribonucléotides ou de désoxyribonucléotides naturels et/ou modifiés. Parmi les nucléotides modifiés, on peut citer les 2 ' -O-alkyl-nucléotides , les nucléotides éthylphosphonates , et de façon avantageuse, tous les nucléotides modifiés et les combinaisons de nucléotides capables de conférer à 1 ' oligonucleotide qu'ils composent une résistance aux enzymes susceptibles de dégrader ledit oligonucleotide in vivo . Le procédé de l'invention peut être appliqués, de manière non exhaustive :
A la purification d'une séquence d'ARN déterminée, dans ce cas le procédé de l'invention décrit précédemment est caractérisé par le fait que la séquence spécifique d'ARN cible de 1 ' oligonucleotide platiné est contenue dans ladite séquence d'ARN déterminée à purifier;
A la détection d'une séquence d'ARN déterminée, dans ce cas le procédé de l'invention décrit précédemment est caractérisé par le fait que la séquence spécifique d'ARN cible de 1 ' oligonucleotide platiné est contenue dans ladite séquence d'ARN déterminée à détecter, et 1 ' oligonucleotide platiné est avantageusement marqué par tout moyen approprié;
- Au blocage sélectif d'une séquence d'ARN déterminée, dans ce cas le procédé de l'invention décrit précédemment est caractérisé par le fait que la séquence spécifique d'ARN cible de 1 ' oligonucleotide platiné est contenue dans ladite séquence d'ARN déterminée à bloquer spécifiquement. Une telle application est tout particulièrement adaptée pour bloquer sélectivement l'expression d'un gène par inhibition de la traduction de son ARNm, ou encore pour bloquer sélectivement la replication et /ou le développement de virus, de bactéries ou de parasites.
L'invention concerne aussi une composition pharmaceutique comprenant comme principe actif une quantité adéquate d ' oligonucleotides platinés mis en oeuvre dans le procédé de 1 ' invention susceptibles de se fixer rapidement sur au moins une séquence spécifique d'ARN de façon à former des complexes d'hybridation pontés de façon irréversible par le biais d' adduits interbrins.
L'invention concerne enfin des oligonucleotides platinés contenant un adduit intrabrin, pour leur utilisation à titre de produit antisens permettant de bloquer rapidement, sélectivement et de façon irréversible la traduction d'un ARNm spécifique contenant une séquence substantiellement complémentaire de celle dudit oligonucleotide platiné.
D'autres avantages et caractéristiques de 1 ' invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent, donnés à titre non limitatifs, et concernant la préparation d ' oligonucleotides platinés ainsi que leur utilisation pour préparer des complexes d'hybridation spécifiques stabilisé de façon irréversible par covalence.
I - Matériels et méthodes .
1) Matériels.
Les oligodésoxynucléotides , les oligoribo- nucléotides et les oligoribonucléotides-2 ' -0-méthyle utilisés dans les exemples ci-après sont d'origine commerciale et ont été purifiés par chromatographie sur colonne échangeuse d'anions (colonne monoQ de Pharmacia) comme décrit dans la littérature (16, 17) . Le réactifs utilisés listés ci-dessous ont été acquis dans le commerce :
- T4 polynucléotide kinase et ribonucléase Tl (Boehringer Mannheim) . - AMV reverse transcriptase, RNase H, lysat de réticulocytes de lapin, luciférase ARNm, rNTP et dNTP (N étant un nucléotide) et acides aminés (Promega) .
- Produits radioactifs (Amersham) .
- Composés chimiques (Merck) . - transplatine ( Johnson-Mattey, UK) .
2 ) Platination des oligonucleotides. La réaction entre les oligonucleotides et le transplatine a été réalisée comme décrit dans la littérature (16-18) . Les oligonucleotides simples brins (c = 30 μM) contenant une séquence centrale unique G N G ont été incubés avec 1 équivalent de transplatine dans 10 mM de NaClθ4 à pH 3,1 ajusté HNO3 (Ultrapure) à 37°C pendant 24 heures. Le mélange reactionnel a été ensuite traité avec de 10 mM de thio-urée pendant 10 minutes à 37°C afin d'éliminer les adduits monofonctionnels (16,17) . Les oligonucleotides contenant un seul pontage intrabrin-1 , 3 ont été purifiés sur une colonne monoQ avec un gradient de NaCl de 0,2 à 0,7 M.
3) Réarranαement du pontage .
Les oligonucleotides platinés ont été mélangés avec les brin complémentaires à 0°C puis incubés dans diverses conditions. A intervalles de temps réguliers, des aliquotes ont été prélevés et analysés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide dans des conditions dénaturantes. La disparition des pontages intrabrins-1 , 3 en fonction du temps a été évaluée en quantifiant avec un appareil "Molecular Dynamics Phospholmager " (Image Quant Software version 3.3 de gestion de données) la fraction de produit n ' ayant pas réagi . Les hybrides contenant un pontage interbrin ont été purifiés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide 20% en conditions dénaturantes, puis mélangés avec 2 μg d'ARNt et incubés à 90°C dans 10 mM de NaOH pendant 10 minutes. Les produits de la réaction ont été résolus sur un gel de séquençage de polyacrylamide à 24%.
4) Courbes de fusion.
Les courbes de fusion des hybrides ont été enregistrées en mesurant 1 ' absorbance à 260 nm en fonction de la température, à l'aide d'un spectrophotomètre Kontron Uvikon 810. L'augmentation de la température était de 1°C par minute. Les températures de fusion (Tm) ont été obtenues à partir du . point milieu des tracés sigmoïdes de 1 ' absorbance en fonction de la température, avec une précision de ±0 , 5°C .
5) Transcription inverse.
Les mélanges d 'ARNm Ha-ras coiffé (0,4 pmole), obtenus par transcription in vi tro d'une construction plasmidique contenant la séquence entière Ha-ras (19), et des oligonucleotides (3 et 20 équivalents molaires respectivement pour les oligonucleotides complémentaires et non complémentaires sont incubés dans un tampon de transcription inverse (1 fois) pendant 10 minutes à 42°C. Après addition d'une amorce marquée à son extrémité 5' (3 p oles) complémentaire de la séquence de l'ARNm située entre les nucléotides en positions +209 et +226 par rapport au codon d'initiation AUG . Les mélanges sont ensuite incubés pendant 10 minutes, puis, les dNTPs, à raison de 1,5 μmoles de chaque, et 2 U de reverse transcriptase AMV sont ajoutés. Les mélanges, d'un volume final de 10 μl sont incubés 70 minutes à 42°C. Les transcrits sont précipités deux fois avec de 1 ' éthanol avant d'être chargés sur un gel dénaturant de polyacrylamide à 8%. Les tailles des transcrits complets et tronqués ont été contrôlées en comparant leurs migrations avec celles de marqueurs de séquences préparés par la méthode didéoxy de Sanger.
6) Traduction in vi tro . Les expériences de traduction ont été effectuées en présence d'un lysat de réticulocytes de lapin comme décrit dans la littérature (20, 21) . Les oligonucleotides ont été incubés 10 minutes à 37°C dans 50 mM de NaCl, 5 mM de tampon phosphate, à pH 7,5 avec 0,4 pmole d'ARNm Ha-ras coiffé et 0,1 pmole d'ARNm de luciférase comme contrôle. Le mélange d'acides aminés, contenant de la méthionine marquée au S35, à raison de 50 μM de chaque en volume final, puis 17 μl d'un lysat de réticulocytes de lapin ont été ajoutés. Les volumes des solutions ont été ajustés à 25 μl et les mélanges ont été incubés pendant 30 minutes à 37°C. Des aliquotes ont été prélevés et dénaturés par chauffage en présence de SDS et de β-mercaptoéthanol, puis chargés sur un gel de polyacrylamide 10% SDS 0,1%.
7) Tests de prolifération des cellules HBL 100.
Les oligonucleotides ont été incubés dans une plaque 24 puits avec des cellules HBLlOOrasl (75. 103 cellules par puits) dans 500 μl de milieu de culture complet
(Milieu d'Eagle modifié supplémenté avec 7% sérum de veau foetal inactivé, 50 U/ml de pénicilline, 50 U/ml de streptomycine et 4 mM de glutamine) à 37°C en atmosphère humide, 5% C02 • Après 24 heures d'incubation, les cellules sont tripsinisées et comptées. Les pourcentages d'inhibition sont déterminés par la formule : (nt - ni) (nt - nQ) x 100, dans laquelle, nt est le nombre de cellules non traitées après 24 heures d'incubation, ni est le nombre de cellules traitées et nD est le nombre de cellules comptées au début de l'expérience. 8) RT-PCR.
L ' ARN total a été extrait des cellules comme décrit dans la littérature (22, 23) . Les cellules traitées et non traitées (1-2. 106) ont été incubées pendant 5 minutes à 4°C dans 500 μl d'un tampon de lyse (0,15 M NaCl ; 10 mM Tris.HCl ; pH 7,5 ; 1,5 M MgCl2 ; 0,65% NP-40). Après centrifugation, les surnagants ont été mélangés avec 500 μl d'un tampon Urée/SDS (7 M urée ; 10 mM Tris.HCl ; pH 7 , 5 ; 10 mM EDTA ; 1% SDS) . Les échantillons ont été centrifugés et 1 ' ARN total a été précipité avec de 1 ' ethanol . L ' ARN (2 μg) a été soumis à une transcription inverse et les ADNc résultant ont été co-amplifiés par PCR conformément aux recommandations du fabriquant (Perkin Elmer Cetus) en utilisant les paires d'amorces spécifiques de Ha-ras suivantes :
- pour les fragments de 72 pb : d (CTGTTGGACATCCTGGATAC) et d (CCCGGTGCGCATGTACTG)
- pour les fragments de 183 pb : d (TGAGGAGCGATGACGGAATA) et d (GTATCCAGGATGTCCAACAG) - pour la β -microglobuline : d(AAGATGAGTATGCCTGCCGT) et d (ATGCTGCTTACATGTCTCGAT) .
Le nombre de cycles a été de 25 : 50 secondes à 94°C, 50 secondes à 57°C, 20 secondes à 72°C) . Après précipitation avec de l' ethanol, les produits de la réaction ont été séparés par électrophorèse sur un gel de polyacrylamide 10% et visualisés par coloration au bromure d'éthidium. La quantification de l'intensité des bandes a été effectuée avec un système Videocopy (Bioprobe Systems) en utilisant un logiciel Densylab (Microvision Instruments) pour le traitement des données.
II - Résultats .
1) Réaction de pontage interbrin. La figure 1 est une représentation schématique du procédé expérimental avec des oligonucleotides représentés par leur séquence centrale. Sur cette figure, la localisation du pontage interbrin correspond à des duplexes de type ADN-ADN (16) . L'étude de ce réarrangement des adduits intrabrins en adduits interbrins a conduit les inventeurs à conférer un rôle majeur à la conformation des hybrides sur la vitesse du réarrangement. Cette étude a donc été poursuivie :
- d'une part, en utilisant des oligonucleotides platinés modifiés, par exemple en remplaçant les deoxyribonucleot ides par des résidus 2'-0-méthyl- ribonucléotides, et en modifiant le brin d'ARN cible complémentaire, par exemple en remplaçant le triplet de bases opposé à 1 ' adduit intrabrin par un triplet ne répondant pas à la loi d ' appariement ou par un doublet de bases. Les ARN correspondant à ces deux modifications ont été désignés dans ce qui suit, respectivement, ARN ou ARN(-l) .
Les brins platinés comprenant 18 nucléotides et présentant un pontage intrabrin-1 , 3 unique localisé au milieu de la séquence ont été incubés avec des brins d'ARN ou d'ARN(-l) complémentaires, contenant respectivement de 18 ou 17 nucléotides, marqués à leur extrémité 5' . Des aliquotes ont été prélevés à intervalles de temps réguliers et analysés par électrophorèse sur gel en conditions dénaturantes .
La figure 2 présente les résultats du réarrangement d' adduits intrabrins-1 , 3 dans les cas, de la gauche vers la droite :
- d'hybrides platinés contenant un mismatch (ou misappariement) entre ADN et ARN,
- d'hybrides platinés, comprenant un mismatch, entre 2 ' -OMe-ARN et ARN, - d'hybrides platinés entre ADN et ARN(-l), d'hybrides platinés entre 2 ' -OMe-ARN et
ARN(-l)
Les autoradiogrammes du gel de polyacrylamide 20% dénaturant de la figure 2 ont été obtenus à partir des brins d'ARN marqués à leur extrémité 5' ci-dessous : 5'- A G G A G A U A U A G A G G A G A- 3 ' (ARN) 5'-A A G G A G A A U A G A G G A G A- 3 ' (ARN(-l) avec 1 ' oligodéoxyribonucléotide platiné de formule : 5'-T C T C C T C T G T G T C T C C T T-3 ' (bandes ADN) ou 1 ' oligo-2 ' -O-méthyl-ribonucléotide platiné de formule : 5'-U C U C C U C U G U G U C U C C U U-3 ' (bandes 2'-0-Me)
Les échantillon (2 μM) ont été incubés à 37°C dans : 150 ml de NaClÛ4 ; 5 mM de tampon phosphate ; pH 7,5
0,2 mM EDTA. Les temps d'incubations sont indiqués en minutes au-dessus des bandes. Les bandes U représentent les
ARN simples brins marqués à leur extrémité 5 ' : à gauche l'ARN et à droite l'ARN(-l). Comme le montre, la figure 2, pour chaque échantillon, l'intensité de la bande correspondant à l'ARN simple brin diminue et une nouvelle bande apparaît. Cette nouvelle bande migre plus doucement que le matériel de départ et correspond à un produit contenant un pontage intrabrin. Après 15 minutes d'incubation : environ 10% des adduits intrabrins sont transformés en adduits interbrins dans le cas des hybrides ADN/ADN platinés comportant un mismatch,
- 50% des adduits intrabrins sont transformés en adduits interbrins dans le cas des hybrides 2 ' -OMe-ARN/ARN platinés comportant un mismatch, et
- pratiquement 100% des adduits intrabrins sont transformés en adduits interbrins dans le cas des hybrides ADN/ARN(-1) platinés, comme dans le cas des hybrides 2 ' -OMe- ARN/ARN(-1) platinés. Dans les mêmes conditions expérimentales , le pourcentage d ' adduits interbrins dans l ' hybride ADN/ARN sans mismatch ( la séquence centrale étant d ( GTG ) . r ( CAC ) ) es t inférieur à 5% ) . Les trois types de modification testés
(mismatch, doublet, oligo-2 ' -O-Me-nucléotide) favorisent la formation d' adduits interbrins. Le réarrangement le plus rapide apparaît avec l'hybride platiné 2 ' -OMe-ARN/ARN ( -1) .
En outre, aucun clivage des adduits interbrins n'a été observé après incubation des échantillons purifiés pendant
48 heures à 37°C dans 100 ou 500 mM Nacl.
Une étude systématique des facteurs susceptibles d'interférer avec le pontage dans les hybrides platinés 2 ' -OMe-ARN/ARN ( -1) a été effectué. La vitesse de pontage n'a pas été modifiée dans NaCl ou NaClθ4, même à des fortes concentrations comprises entre 50 et 500 mM, ou par addition de Mg++ ou Mn+ *" jusqu'à 10 mM. Le pontage est indépendant du nucléotide N (A, U ou C) situé entre les deux résidus de guanines (G) chélatées; de même, il est indépendant de la nature des bases adjacentes du site de l' adduit interbrin, mais dépend de la nature du doublet du brin d'ARN opposé audit adduit. Des vitesses de réarrangement similaires ont été obtenus lorsque le doublet 5 ' -UA a été remplacé par le double 5'-CA. Le remplacement par les doublets 5 ' -AA ou 5'- GA diminue la vitesse de formation du pontage interbrin de 20 fois et le remplacement par les doublets 5 ' -AU ou 5 ' -AC diminue cette vitesse d'au moins 1000 fois.
2 ) Stabilité thermique des hybrides .
L'inefficacité des doublets 5 ' -AU et 5 ' -AC à induire un réarrangement n'est pas due à une dissociation partielle des hybrides comme vérifié par des tests sur gel retard. Cependant, à la fois les pontages intrabrins et la délétion d'un résidu de nucléotide dans le brin d'ARN déstabilisent les hybrides. Les stabilités thermiques de 4 hybrides 2 ' -OMe-ARN/ARN de 18 ou 17 nucléotides comme représentés à la figure 2, avec des séquences centrales GTG.CAC, GTG.CAC platinée, GTG.AU et GTG.AU platinée, ont été suivies par absorption u.v. Les quatre échantillons fondent coopérativement et les valeurs des Tm sont 67,5°C, 48°C, 47°C et 43°C dans 10 mM NaC10 , 3 mM Tris-HCl, pH 7,5. Les deux modifications, adduit intrabin-1,3 et doublet, abaissent le Tm d'environ 20°C mais dès que l'hybride contient une modification, la seconde modification n'engendre qu'une faible déstabilisation. Dans 100 mM NaClθ4 ou NaCl, le Tm des quatre échantillons a augmenté de 13 à 15°C. Le remplacement du brin d'ADN platiné par un brin 2 ' -OMe-ARN platiné dans les hybrides présente l'avantage d'augmenter la vitesse de réaction de pontage interbrin et la stabilité thermique d'environ 13°C. En outre, la meilleure résistance d ' oligo-2 ' -Ométhyl-ribonucléotides aux nucléases constitue un avantage remarquable dans la perspective d'uns stratégie antisens (25-27) .
3 ) Identification de l' adduit interbrin .
Deux type d'expériences ont été réalisées pour identifier les bases impliquées dans les pontages interbrins résultant du réarrangement des adduits intrabrins-1 , 3.
Les hybrides pontés marqués au P32 soit à l'extrémité 5' du brin supérieur (brin portant l' adduit intrabrin-1 , 3 initial) ou du brin inférieur, ont été élues des bandes de plus lentes migrations comme celles apparaissant à figure 2.
Dans une première série d'expériences, les hybrides ont été soumis à une hydrolyse alcaline légère pour obtenir une coupure de l'ARN et les fragments résultant ont été analysés sur gel d ' électrophorèse dans des conditions dénaturantes .
La figure 3 en annexe se rapporte à l'identification du ribonucléotide ponté dans l'hybride
ADN/ARN(-1) contenant un adduit interbrin. L ' autoradiogramme de la figure 3 représente l'analyse sur gel de polyacrylamide 24% dénaturant :
- des produits résultant de l'hydrolyse alcaline (lignes OH) , - de l'ARN(-l) libre marqué à son extrémité 5'
( lignes -Pt ) ,
- de l'ARN(-l) ponté au brin d'ADN (ligne +Pt) . La ligne 0 représente le brin d'ARN(-l) marqué à son extrémité 5' non traité. Dans la piste Tl , le profil des bandes reflète le clivage au niveau des résidus G induit par une digestion partielle du brin d'ARN(-l) marqué à son extrémité 5' par la RNase Tl (28).
Les résultats présentés à la figure 3 concernent les hybrides possédant la séquence centrale d(GTP) . r(UA) . Les fragments précédant (en position 5') le résidu ponté sont détectés et d'en conclure que le résidu ponté est le résidu A opposé au pontage initial intrabrin. Des résultats similaires ont été obtenus avec les hybrides ayant les séquences centrales suivantes d(GTG) .r(UAU) , 2 ' -OMe (GTG) . rUAU ou 2 ' -OMe (GTG) . rUA.
Les résidus pontés dans le brin supérieur ont été déduits par la méthode d'empreinte de Maxam-Gilbert avec du diméthylsulfate comme décrit dans la littérature (16-18) .
Les expériences ont été réalisées sur les deux hybrides ayant les séquences centrales, d(GTG) . r (UA) et d(GTG) . r(UAU) . Dans les deux cas, le résidu ponté était le résidu 5 'G du pontage intrabrin initial.
4) Mécanisme du réarrangement. Bien que le mécanisme de la réaction d ' isomérisation du pontage ne soit pas encore totalement compris, les vitesses de réaction de pontage dans les hybrides platinés ADN/ARN(-1) et 2 ' -OMe-ARN/ARN indiquent qu'il s'agit d'une attaque nucléophile sur le résidu de platine par une base du brin opposé (16) et éliminent la possibilité d'une réaction via un intermédiaire d'association avec un solvant comme cela est généralement observé dans la réaction entre les dérivés du platine (II) et 1 ' ADN (24). Une différence majeure entre les résultats rapportés dans le cadre de la présente invention et ceux concernant les duplexes platinés ADN/ADN réside dans la nature de la base attaquant le résidu de platine. Dans le cas de duplexes platinés ADN/ADN, les pontages interbrins s'établissent essentiellement entre le résidu 5 'G de 1' adduit intrabrin initial et le résidu complémentaire C (16) . Les expériences d'empreinte réalisées dans le cadre de la présente invention ont permis de conclure que dans les hybrides platinés, les pontages interbrins s'établissent essentiellement entre l'atome d'azote en position 7 du résidu 5 'G (brin supérieur) et le résidu A du triplet UAU ou du doublet UA du brin d'ARN. Le remplacement du doublet UA par le doublet UG abaissant le taux de pontage interbrin, il semble plus probable que le résidu de platine soit fixé à l'atome d'azote en position 1 qu'à l'atome d'azote en position 7 du résidu A. Les études réalisées sur la réactivité des complexes du platine (II) avec les nucléosides (guanosine, adénosine ou cytosine) indique un ordre de réactivité : G > A ~ C (24, 29) . Ceci laisse supposer que les différences des vitesses de pontage dans les hybrides platinés ADN/ADN, ADN/ARN(-1) et 2 ' -O-Me-ARN/ARN sont dues aux positions relatives du nucléotide attaquant le résidu de platine plus qu'à la nature chimique du nucléotide. Ces positions relatives sont déterminées par la conformation locale de la double hélice, laquelle, peut en outre interférer avec la vitesse de la réaction en raison de contributions d'entropie et/ou d'enthalpie sur la déstabilisation de l'état fondamental et/ou sur la stabilisation de l'état de transition. 5) Spécificité de la réaction de pontage. Afin de démontrer que la réaction de pontage n'induit pas de fixation non spécifique entre 1 ' oligonucleotide platiné et sa cible, l'ARNm Ha-ras coiffé, comprenant 820 nucléotides, a été incubé pendant 10 minutes avec un oligo-2 ' -O-méthyl-ribonucléotide de 17 nucléotides, dénommé Ras 1, complémentaire de la séquence située entre les positions +130 et +145 par rapport à la base A du codon d'initiation AUG de l'ARNm Ha-ras. Cette séquence de 16 nucléotides comporte en son centre le doublet 5 ' CA et les 14 résidus de nucléotide à partir de l'extrémité 3' sont en boucle comme suggéré dans le modèle de structure secondaire de l'ARNm Ha-ras généré informatiquement (30) .
La localisation de la fixation irréversible de 1 ' oligonucleotide a été révélée par extension d'amorces avec la transcriptase inverse AMV. La figure 4 se rapporte à l'analyse de la spécificité de séquence de la réaction de pontage :
- lignes -Pt : transcription inverse en présence d ' oligonucleotides non platinés;
- lignes +Pt : transcription inverse en présence d' oligonucleotides platinés; ligne Ras 1 : correspond à 1 ' oligo-2 ' -0- méthyl-ribonucléotide de séquence : 5'-C C C A U C A A G U G A C C A C C-3 ' , complémentaire de la séquence :
5'-G G U G G U C A U U G A U G G G-3 ' , situé entre les positions +130 et +145, par rapport au codon d'initiation AUG, de la région codante de Ha-ras; - lignes Scr : correspond à 1 ' oligo-2 ' -O-méthyl- ribonucléotide non complémentaire de séquence :
5'-C C A C A C U G C G A A C C U A C-3 ' .
Comme montré sur cette figure 4, la réaction de polymérisation est totalement arrêtée par 1 ' oligonucleotide ponté. En fait, deux arrêts sont détectés, le plus important au niveau du pontage et le plus faible au niveau de l'extrémité 5' de 1 ' oligonucleotide . La spécificité de la fixation a été prouvée par des expériences de compétition. L ' oligonucleotide platiné a été incubé pendant 10 minutes avec un mélange d'ARNm de Ha-ras et d'ARNm de luciférase (30 fois en excès) puis la transcriptase inverse a été ajoutée. Les résultats avec ou sans ARNm de luciférase sont identiques. Au contraire, le même oligonucleotide non platiné apparaît comme un faible inhibiteur de la transcriptase inverse. Un faible arrêt est détecté au niveau de la séquence ciblée ce qui est en accord avec d'autres résultats (31) . Des oligonucleotides platinés et non platinés non complémentaires, désignés Scr, n'affectent pas la synthèse d ' ADNc .
La spécificité de la réaction de pontage a été ensuite testée en observant l'efficacité des oligonucleotides pontés sur l'inhibition de la synthèse de protéine dans un système acellulaire. L'expérience a été effectuée sur de l'ARNm Ha-ras coiffé après réaction avec 1 ' oligo2 ' -O-méthyl-ribonucléotide Ras 1. Il a tout d'abord été vérifié que les cinétiques de la réaction de pontage n'étaient pas modifiées par l'addition d'un lysat de réticulocytes de lapin et qu'il n'y avait pas de dégradation de l'ARNm Ha-ras même après l'addition de RNase H. Dans une seconde expérience, 1 ' oligonucleotide platiné a été mélangé aux ARNm de Ha-ras et de luciférase, l'ensemble a été mis à incuber 10 minutes à 37°C, puis les acides aminés et le lysat de réticulocytes de lapin ont été ajoutés. Les produits de traduction ont été analysés par SDS-PAGE.
La figure 5 concerne l'inhibition in vi tro de la traduction de l'ARNm Ha-ras coiffé par un oligo-2 ' -O-méthyl- ribonucléotide non-platiné (ligne -Pt) ou platiné (ligne +Pt) . Les lignes Ras 1 et Scr se réfèrent aux oligonucleotides testés dans les expériences de transcription inverse. Les ratios oligonucléotide/ARNm Ha- ras sont indiqués en haut de la figure. L'efficacité de la traduction est exprimée en pourcentage de protéine Ha-ras traduite par rapport à celui de la luciférase (témoin interne) . Le rapport des intensités de bandes de Ha-ras et de luciférase a été fixé à 100% de traduction lorsqu ' aucun oligonucleotide n'était présent (ligne 0). On observe que 1 ' oligonucleotide Ras 1 platiné inhibe totalement la traduction de l'ARNm de Ha-ras, mais n'affecte pas la traduction de l'ARNm de luciférase. Le même oligonucleotide non platiné et les oligonucleotides Scr platinés ou non n'ont pas d'effet sur la traduction de l'ARNm Ha-ras. Ces résultats confirment que les oligo-2 ' -O- alkyl-ribonucléotides dirigés contre la région codante des ARNm n'arrêtent pas les ribosomes de traduction si ils ne sont pas fixés de manière covalente à l'ARN (14, 15) .
Les expériences de traduction et de transcription inverse ont été répétées avec un autre oligonucleotide platiné reconnaissant la région codante de l'ARNm de Ha-ras située entre les positions +4 et +19 par rapport au codon d'initiation AUG. Des résultats similaires ont été obtenus et d'en conclure que in vitro, les oligonucleotides platinés se fixent spécifiquement à leurs cibles et ne sont pas déplacés par les ribosomes au cours de latraduction .
6 ) Inhibition de la prolifération de cellules HBLlOOras 1.
La capacité de 1 ' oligonucleotide Ras 1 d'inhiber la traduction a également été testée en utilisant le système cellulaire HBLlOOras 1 largement décrit. Ce clone a été obtenu à partir de la lignée cellulaire humaine HBL100 qui a été transformée avec le gène Ha-ras muté sur le douzième codon (32) . Dans les cellules transfectées , les protéines p21 de Ras oncogènes piégées dans leur forme activée liée au GTP pour une longue durée, adressent aux cellules de nombreux signaux stimulant la croissance. Ainsi, la privation sélective des protéine Ha-ras dans les cellules HBLlOOras 1 conduit à inhiber la division cellulaire. Plusieurs expériences ont montré que la prolifération des cellules HBLlOOras 1 était spécifiquement inhibée par des oligonucleotides antisens ciblé vers le messager Ha-ras, probablement par un mécanisme dépendant de la RNase H (22, 23) .
La figure 6 représente l'inhibition de la prolifération des cellules HBLlOOrasl en fonction de la concentration en oligonucleotide :
- oligonucleotide Ras 1 non platiné (•) , - oligonucleotides Ras 1 platiné (I),
- Scr non complémentaire non platiné (O) ,
- Scr non complémentaire platinés (o) .
Chaque point correspond à une valeur moyenne (erreur < 15%) d'au moins deux expériences de culture en triplicata.
Comme montré par la figure 6, le traitement des cellules HBLlOOras 1 avec 1 ' oligonucleotide platiné Rasl induit une inhibition dose-dépendante de la prolifération cellulaire au delà de 0 à 4 μM (50% d'inhibition à la concentration d'environ 0,4 μM) . Le même oligonucleotide non platiné présente un léger effet cytostatique sur les cellules, mais l'inhibition de la croissance n'excède pas 30% à 4 μM, alors que 1 ' oligonucleotide Scr platiné ou non ne présente aucun effet. Dans chaque test, il a été observé une forte viabilité des cellules (>95%) en utilisant la méthode d'exclusion par le bleu de trypan.
Afin de renforcer la preuve du pontage de 1 ' oligonucleotide platiné Ras 1 sur l'ARNm Ha-ras, le niveau de messager intact dans les cellules a été déterminé par des expériences de RT-PCR sur l'ARN total. L'amplification d'ARN après transcription inverse en présence, soit d'une paire d'amorces qui s'hybrident à des séquences flanquant la cible Ha-ras, soit d'une paire d'amorces qui s'hybrident à des séquences du côté 3' de la cible, a permis d'obtenir des fragments d'ADN respectivement de 183 et 72 pb. La figure 7 se rapporte à l'expression de l'ARNm de Ha-ras et de β2 -microglobuline dans les cellules
HBLlOOras 1 exposées 24 heures à 1 ' oligonucleotide ras 1 non platiné (ligne 3) ou platiné (lignes 2 et 5) . Les lignes 1 à 4 concernent les cellules non traitées. La localisation des fragment de Ha-ras de 72 pb et 183 pb obtenus par RT-PCR, par rapport à la portion d'ARNm susceptible d'être pontée avec Ras 1 platiné, est schématiquement indiqué au-dessus des lignes. Comme les intensités relatives des bandes des lignes 4 et 5 de la figure 7 correspondant aux fragment Haras de 72 pb et aux fragment de β2-microglobuline (contrôle interne) provenant respectivement de cellules non traitées et de cellules traités par 1 ' oligonucleotide Ras 1 platiné, sont identiques, il est possible d'en déduire que 1 ' oligonucleotide Ras 1 platiné n'a pas d'effet sur la quantité d'ARNm Ha-ras. Au contraire, la comparaison des intensités relatives des bandes des lignes 1 et 2 de la figure 7 correspondant aux fragments Ha-ras de 183 pb et aux fragment de β2 -microglobuline provenant respectivement de cellules non traitées et de cellules traitées avec
1 ' oligonucleotide platiné Ras 1, montrent que la synthèse des fragments de 183 pb de Ha-ras est fortement diminuée
(70%) .. Il convient d'en conclure que 1 ' oligonucleotide platiné Ras 1 est ponté à une large population d'ARNm de Haras. Il a été vérifié que 1 ' oligonucleotide Rasl non platiné (ligne 3 de la figure 5), les oligonucleotides Scr platinés ou non platinés n'affecte pas le niveau de messager intact de Ha-ras. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
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Claims

REVENDICATIONS
1) Procédé de fixation spécifique et irréversible d'un oligonucleotide sur un ARN, caractérisé en ce que l'on met en contact un oligonucleotide platiné contenant un adduit intrabrin du transplatine ou de ses analogues, avec un ARN comprenant ou constitué par une séquence complémentaire spécifique dudit oligonucleotide, dans des conditions permettant la formation d'hybrides, de façon à obtenir rapidement un hybride ponté par le biais d'un adduit interbrin.
2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que 1 ' oligonucleotide platiné comprend un enchaînement de nucléotides complémentaires d'une séquence spécifique d'ARN et contient un adduit intrabrin au niveau d'un site de séquence 5 'G N G, dans laquelle N représente un résidu de nucléotide quelconque, G représente un résidu guanine et 5' indique le sens de l'enchaînement des nucléotides dans 1 ' oligonucleotide.
3) Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que 1 ' oligonucleotide platiné comprend un enchaînement de nucléotides complémentaires d'une séquence spécifique d'ARN dont la portion de séquence correspondant à l' adduit intrabrin de séquence 5 'G N G de 1 ' oligonucleotide platiné, est une séquence 5 ' X A (Y) , dans laquelle :
- A représente un résidu adénine,
- Y peut être absent, et dans ce cas X est choisi parmi les résidus uracile, cytosine, adénine, guanine,
Y s'il est présent, est un nucléotide quelconque, et dans ce cas X est un résidu uracile.
4) Procédé selon l 'une quelconque des evendications 1 à 3, caractérisé en ce que 1 ' oligonucleotide platiné contenant l' adduit intrabrin est constitué d'un enchaînement d'au moins 10 nucléotides.
5) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que
1 ' oligonucleotide platiné contenant l' adduit intrabrin est constitué d'un enchaînement de ribonucleotides ou de désoxyribonucléotides naturels et/ou modifiés.
6) Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que 1 ' oligonucleotide platiné contenant l' adduit intrabrin est un oligo-2 ' -O-alkyl-ribonucléotide .
7) Application du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 pour la purification d'un ARN contenant une séquence spécifique capable de s'hybrider avec 1 ' oligonucleotide platiné.
8) Application du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 pour la détection d'une séquence d'ARN spécifique capable de s 'hybrider avec 1 ' oligonucleotide platiné éventuellement marqué.
9) Application du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 pour le blocage sélectif d'une séquence d'ARN spécifique capable de s'hybrider avec 1 ' oligonucleotide platiné.
10) Application selon la revendication 9 pour bloquer sélectivement l'expression d'un gène par inhibition de la traduction de son ARNm.
11) Procédé selon la revendication 9 pour bloquer sélectivement la replication et/ou le développement de virus, de bactéries ou de parasites. 12) Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend comme principe actif une quantité adéquate d ' oligonucleotides platinés contenant un adduit intrabrin, susceptibles de se fixer rapidement sur au moins une séquence spécifique d'ARN de façon à former des complexes d'hybridation pontés de façon irréversible par le biais d' adduits interbrins.
13) Oligonucleotide platiné pour son utilisation à titre de produit antisens permettant de bloquer rapidement, sélectivement et de façon irréversible la traduction d'un ARNm contenant une séquence substantiellement complémentaire de celle dudit oligonucleotide platiné.
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