JP2002114797A - 三重鎖核酸を形成するための調製物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 三重鎖核酸形成反応を生理的条件下で効率的
に促進するための手段の提供。 【解決手段】 単鎖核酸が二重鎖ＤＮＡあるいはＲＮＡ
における特定部位のヌクレオチド配列に結合して三重鎖
核酸を形成する反応を生体内と同等の条件で約１０００
０倍効率的に促進するための、ホスホロアミデート骨格
を有する単鎖核酸とカチオン性高分子とを有効成分とす
る調製物。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、二重鎖核酸の特定
部位に三重鎖核酸構造を形成するための調製物に関す
る。本発明によれば、生理的条件下で三重鎖核酸の形成
を促進しそして／または安定性を向上することができ
る。

【０００２】

【従来の技術】片方の鎖におけるヌクレオチド配列がＡ
またはＧのプリン塩基のみから成り、反対の鎖のヌクレ
オチド配列がＴ、ＣまたはＵのピリミジン塩基のみから
成る二重鎖ＤＮＡあるいはＲＮＡ上の特定部位のヌクレ
オチド配列に、Ｔ、ＣまたはＵのピリミジン塩基のみか
ら成る単鎖核酸が結合する時に、三重鎖核酸が形成され
ることは既知である（Curr．Opin．Struct．Biol.，3，
345-356；Annu．Rev．Biophys．Biomol．Struct.，23，
541-576；Annu．Rev．Biochem.，64，65-95；Curr．Opi
n．Struct．Biol.，6，327-333など）。

【０００３】この三重鎖核酸形成は、人工的に遺伝子の
発現を制御する際に利用可能である。具体的には、ゲノ
ムＤＮＡなどの二重鎖ＤＮＡあるいはＲＮＡ上の特定部
位のヌクレオチド配列に対して、単鎖核酸を外部から加
えて三重鎖核酸を形成させると、形成された三重鎖核酸
の立体障害により、二重鎖ＤＮＡあるいはＲＮＡへのＤ
ＮＡ結合性タンパク質の結合が調整される。こうして、
遺伝子の複製および転写過程を制御することが可能であ
る。また三重鎖核酸形成は、二重鎖ＤＮＡあるいはＲＮ
Ａの部位特異的切断にも利用可能である。具体的には、
二重鎖ＤＮＡあるいはＲＮＡ上の特定部位のヌクレオチ
ド配列に対して、末端に核酸切断用の官能基を結合した
単鎖核酸を外部から加えて三重鎖核酸を形成させ、核酸
切断用の官能基で二重鎖ＤＮＡあるいはＲＮＡの特定の
部位を化学的に切断するか、あるいは酵素を用いて三重
鎖と二重鎖との境界領域を消化することが可能である。
これは、ゲノムＤＮＡなどの大きい二重鎖ＤＮＡあるい
はＲＮＡをマッピングするのに有効である。さらには、
単鎖核酸を適当な固相に固定して、標的とする二重鎖核
酸との三重鎖核酸の形成を介する核酸のアッセイにも三
重鎖核酸の形成は有用であろう。

【０００４】このように三重鎖核酸形成は幅広い応用範
囲が期待され、注目を集めている。しかし、三重鎖核酸
が生理的条件下（ｐＨ６〜８）、特定のカチオンの存在
下で非常に形成されにくく、また、形成されたとしても
極めて不安定であるため、三重鎖核酸形成の幅広い応用
範囲への利用が制限されている。より具体的には、外部
から加える単鎖核酸のシトシン（Ｃ）塩基がプロトン化
しないと、二重鎖ＤＮＡあるいはＲＮＡ上の特定部位の
グアニン（Ｇ）：シトシン（Ｃ）塩基対合に単鎖核酸が
結合して三重鎖核酸を形成できないことから、生体内と
異なる酸性条件下でのみ三重鎖核酸は安定に形成でき、
生体と同等の中性条件下では、一般に、三重鎖核酸は形
成できない（Methods Enzymol.，211，180-191（199
2)；Biochemistry，31，10995-11003（1992)；Biochemi
stry，32，8963-8969（1993））。

【０００５】生体と同等の中性条件下における三重鎖核
酸の不安定性を克服するために、これまでにいくつかの
試みがなされてきた。例えば、生体と同等の中性条件下
でシトシン（C）塩基よりもプロトン化しやすい５−メ
チルシトシン（Nucleic AcidsRes.，12，6603-6614（19
84)；J．Am．Chem．Soc.，111，3059-3061（1989)；Nuc
leic Acids Res.，19，5625-5631（1991））をはじめと
する人工的に化学修飾した塩基（J．Am．Chem．Soc.，1
13，4032-4033（1991)；Proc．Natl．Acad． Sci．US
A，89，3761-3764（1992)；J．Am．Chem．Soc.，114，1
470-1478（1992)；Biochemistry，32，3249-3254（199
3））が開発され、これらの塩基を導入した単鎖核酸
が、生体と同等の中性条件下での三重鎖核酸形成に使用
された。また、ＤＮＡにインターカレイトする低分子有
機化合物を末端に結合した単鎖核酸が、生体と同等の中
性条件下での三重鎖核酸形成に使用された（Proc．Nat
l．Acad． Sci．USA，88，6023-6027（1991）；Biochem
istry，33，4187-4196（1994））。さらに、スペルミン
やスペルミジンなどのカチオン性ポリアミンを安定化剤
として共存させて、生体と同等の中性条件下での三重鎖
核酸形成が試みられた（Biochemistry，30，4455-4459
（1991））。しかし、たとえばスペルミンを共存させて
も生体と同等の中性条件下での三重鎖核酸形成が約２−
３倍しか効率的に促進されないなど（J．Biol．Chem.，
274，6161-6167（1999））、これらの方法では生体と同
等の中性条件下における三重鎖核酸の形成の促進および
安定性の向上について十分な効果が得られていない。

【０００６】一方、最近、単鎖核酸のホスホロアミデー
ト骨格修飾が、三重鎖核酸の安定化を生体内と同等の条
件下で顕著に高めることが報告された（Proc．Natl．Ac
ad．Sci．USA，92，5798-5802（1995)；Proc．Natl．Ac
ad．Sci．USA，93，4365-4369（1996））。

【０００７】さらに、最近、本発明者をはじめとする研
究者らにより、特定の櫛形のコポリマーが、三重鎖核酸
の形成を促進し、そして安定性を生体内と同等の条件下
で約１００倍効率的に高めることが報告された（Biocon
jugate Chem.，8，3-6（1997)；Bioconjugate Chem.，
9，292-299（1998)；Nucleic Acids Res.，26，3949-39
54（1998)；J．Biol．Chem.，274，6161-6167（199
9））。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】しかし、さらなる三重
鎖核酸の形成の促進および安定性の向上が図れる手段に
対するニーズは依然として存在する。したがって、本発
明は単鎖核酸が二重鎖ＤＮＡあるいはＲＮＡにおける特
定部位のヌクレオチド配列に結合して三重鎖核酸を形成
する反応を行うに際し、これまで必要とした酸性などの
生体内（または生理的条件）と異なる条件を必要とする
ことなく、中性などの生体内と同等の条件下で反応を行
うことを可能とし、また三重鎖核酸形成に必要な単鎖核
酸濃度を低減させるなど、その他の形成反応条件の緩和
を可能とするような手段を提供することを目的とする。

【０００９】

【課題を解決するための手段】上述したように、単鎖核
酸のホスホロアミデート骨格修飾が、生体内と同等の条
件下で三重鎖核酸の安定性を向上することが知られてい
る。また、上述したように、櫛形コポリマーも、生体内
と同等の条件下で三重鎖核酸の形成および安定化を促進
することも知られている。本発明者らは、この単鎖核酸
のホスホロアミデート骨格修飾と櫛形コポリマーとを同
時に使用した場合に、それぞれが有する作用に対し相互
に悪影響を及ぼすことなく、三重鎖核酸の形成および安
定化を生体内と同等の条件下で、相乗的に約１００００
倍効率的に促進しうることを、今回、見い出した。

【００１０】すなわち、本発明はかような知見に基づく
ものである。

【００１１】したがって、本発明によれば、単鎖核酸を
含んで成る、二重鎖ＤＮＡあるいはＲＮＡの特定部位で
三重鎖核酸を形成するための調製物であって、該単鎖核
酸が該特定部位における片方のヌクレオチド配列と塩基
対を形成しうる塩基を有し、かつホスホロアミデート骨
核を有するものであり、そしてカチオン性高分子を該単
鎖核酸と組み合わさった形態でさらなる有効成分として
含んでなる三重鎖核酸を形成するための調製物が提供さ
れる。

【００１２】本発明によれば、単鎖核酸が二重鎖ＤＮＡ
あるいはＲＮＡにおける特定部位のヌクレオチド配列に
結合して三重鎖核酸を形成する反応を生体内と同等の条
件下で約１００００倍効率的に促進し、かつ、形成した
三重鎖核酸の安定性も著しく向上させることができる。

【００１３】

【発明を実施するための好ましい態様】二重鎖ＤＮＡあ
るいはＲＮＡとは、相補的な塩基（またはヌクレオチ
ド）対、例えば、ＤＮＡでは、アデニン（Ａ）とチミン
（Ｔ）およびグアニン（Ｇ）とシトシン（Ｃ）、ＲＮＡ
では、Ａとウラシル（Ｕ）およびＧとＣとの対合により
形成されるＤＮＡ間で、あるいはＲＮＡ間で形成された
高次構造を保ちうる鎖を意味する。本発明の文脈上、こ
のようなＤＮＡあるいはＲＮＡは、生体成分から単離さ
れたものであっても、また単離されることなく、生体組
織中に存在するものであってもよい。勿論のこと、合成
された二重鎖ＤＮＡあるいはＲＮＡも包含される。

【００１４】かような二重鎖ＤＮＡあるいはＲＮＡにお
ける特定部位は、直鎖状になったＤＮＡあるいはＲＮＡ
の末端部位あるいは中間部位等のいかなる部位であって
もよい。そして、該部位におけるヌクレオチド配列は、
片方の鎖のヌクレオチド配列が本質的にＡまたはＧのプ
リン塩基から成り、反対の鎖のヌクレオチド配列が本質
的にＴ、ＣまたはＵのピリミジン塩基から成る場合をい
う。「本質的に・・・から成る」とは、該ヌクレオチド
配列が、必ずしも、１００％記載した塩基で構成されて
いることを意味するものではなく、本発明に従って、単
鎖核酸と有意に安定な三重鎖核酸を形成することができ
る程度（例えば、８０％以上、好ましくは９０％以上、
より好ましくは９５％以上）に上記の塩基によって占め
られていることを意味する。この特定部位は、通常、二
重鎖ＤＮＡあるいはＲＮＡの一部であるが、全てであっ
てもよい。

【００１５】ホスホロアミデート骨格を有する単鎖核酸
とは、通常のホスホジエステル骨格のリン原子に結合す
る５′末端側の酸素原子をＮＨ基に置換した下記の構造
式で表されるＮ３′→Ｐ５′ホスホロアミデート修飾骨
格を有する単鎖核酸をいう。この単鎖核酸におけるヌク
レオチド配列は、それらが、上記特定部位のヌクレオチ
ド配列と塩基対を形成しうるＴ、ＣまたはＵのピリミジ
ン塩基から本質的に成る。かような単鎖核酸は、本発明
に従って三重鎖を形成できる限り、三重鎖形成の目的に
応じて、適当な薬物（例えば、フラレン、ブレオマイシ
ン、ＥＤＴＡ等の金属キレート剤）が、その末端もしく
は末端近傍に結合していてもよく、さらには末端で適当
な固相担体に結合していてもよい。

【００１６】

【化２】

【００１７】Ｎ３′→Ｐ５′ホスホロアミデート修飾骨
格（以下、ＮＰ修飾骨格と略記する） カチオン性高分子は、カチオン性ホモポリマーあるいは
コポリマーが親水性高分子で側鎖修飾された櫛形のグラ
フト型構造を有するものが好ましい。このカチオン性ホ
モポリマーあるいはコポリマーとしては、上記三重鎖核
酸形成反応に資するものであればいかなるポリマーであ
ってもよいが、例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジ
ン等の塩基性アミノ酸、グルコサミン等のアミノ糖、エ
チレンイミン等のアルキレンイミン、ジエチルアミノエ
チルメタクリレート、ジメチルアミノエチルメタクレノ
ート等Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミノアルキル（メタ）アク
リレートの合成モノマー等のカチオン性基を形成しうる
モノマーに由来するカチオン性ホモポリマーおよびコポ
リマーを挙げることができる。また、この親水性高分子
グラフト側鎖としては、ポリエチレングリコール等の水
溶性ポリアルキレングリコール、デキストラン、プルラ
ン、アミロース、アラビノガラクタン等の水溶性多糖、
セリン、アスパラギン、グルタミン、スレオニン等の親
水性アミノ酸を含む水溶性ポリアミノ酸、アクリルアミ
ドおよびその誘導体をモノマーとして用い合成される水
溶性高分子、メタクリル酸及びアクリル酸並びにその誘
導体（例、ヒドロキシエチルメタクリレート）をモノマ
ーとして用い合成される水溶性高分子、ポリビニルアル
コール及びその誘導体からなる群より選ばれる１種以上
の水溶性高分子により形成されるものを挙げることがで
きる。

【００１８】より好ましいカチオン性高分子としては、
限定されるものでないが、例えば Bioconjugate Chem．
9，292-299（1998）に記載されているような下記の一般
的な構造式で表されるものを挙げることができる。

【００１９】

【化３】

【００２０】（上式中、ｍは１〜１００の整数であり、
ｘは５〜２００の整数であり、そしてｎは０．０１〜
０．３である）で表されるデキストラン側鎖修飾ポリ
（Ｌ−リジン）。（以下、ＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘと略記す
る） かようなカチオン性高分子の分子量、また、親水性高分
子側鎖それ自体の鎖長およびグラフトの程度は、具体的
な使用目的により最適な値が変動するので限定できない
が、当業者であれば実験を行うことによって各最適値を
選択することができるであろう。

【００２１】本発明に従えば、上記のＮＰ修飾骨格を有
する単鎖核酸を含有し、カチオン性高分子が該単鎖核酸
と組み合わさった形態でさらに含まれる調製物が提供さ
れる。「組み合わさった形態で」とは、単鎖核酸とカチ
オン性高分子とが、必ずしも単一調製物中に存在するの
ではなく、分離して存在するが、三重鎖形成に際しては
一緒に作用するような形態にあることを意味する。かよ
うな調製物が単一調製物の場合、目的とする三重鎖核酸
形成反応に悪影響を及ぼさない限り、合成された単鎖核
酸の粗製物あるいは精製された単鎖核酸と、合成された
高分子の粗製物あるいは精製された高分子と、必要によ
り、緩衝液、生理食塩水等から構成することができる。
また、高分子は１種または２種以上の混合物であっても
よい。

【００２２】本発明に従うカチオン性高分子は、三重鎖
核酸形成反応においては、一般的に、形成反応に供され
る総（ＮＰ修飾骨格を有する単鎖＋二重鎖）核酸におけ
るアニオン性リン酸基に対するカチオン性基の荷電比が
０．１以上、好ましくは０．５〜１０００となるように
選ばれる。一方、形成反応に供される二重鎖ＤＮＡある
いはＲＮＡに対するＮＰ修飾骨格を有する単鎖核酸のモ
ル比率は１を超えるように選ばれる。

【００２３】本発明に従う上記のＮＰ修飾骨格を有する
単鎖核酸とカチオン性高分子との組み合わさった調製物
は、三重鎖核酸の形成を促進し、そして安定性を効率良
く向上させる。そのため、従来、三重鎖核酸の形成およ
び安定化に酸性などの生体内と異なる条件を必要として
いたが、本発明の調製物は中性などの生体内と同等の条
件で三重鎖核酸の形成および安定化を可能とする点で有
用である。また、従来、三重鎖核酸形成反応は生物細胞
等に悪影響が生じない生理的に許容できる温度（例え
ば、約５℃〜４０℃）よりは低い温度を必要としていた
が、本発明の調製物は生理的に許容できる温度（約５℃
〜４０℃）を含むより高い温度範囲で三重鎖核酸形成反
応を行うことを可能とする点で有用である。

【００２４】本発明に従う上記のＮＰ修飾骨格を有する
単鎖核酸とカチオン性高分子との組み合わさった調製物
は、上記の生理的条件下で三重鎖核酸を効率良く形成す
る。ＮＰ修飾骨格を有する単鎖核酸のオリゴヌクレオチ
ドは、５ｍｅｒ以上であれば理論上いかなる鎖長のもの
でもよい。しかし、好ましくは７ｍｅｒ以上、より好ま
しくは１４ｍｅｒ以上で、上限は、一般に５０ｍｅｒ以
下である。本発明の調製物は、従来三重鎖核酸形成に必
要としていた単鎖核酸の鎖長よりも著しく短い鎖長で三
重鎖核酸形成反応を可能とする点で有用である。また、
三重鎖核酸形成に必要な単鎖核酸濃度を約１００００分
の１に低減きる点で有用である。

【００２５】また、三重鎖核酸形成による遺伝子発現制
御機能や部位特異的切断機能などを向上させる上で、本
発明によるＮＰ修飾骨格を有する単鎖核酸とカチオン性
高分子とを有効成分とする調製物は有用である。さら
に、ゲノムＤＮＡ二重鎖上の特定部位のヌクレオチド配
列と三重鎖核酸を形成させることにより、ＤＮＡ結合性
タンパク質の結合を調整し、複製および転写過程を制御
する上でも有用である。

【００２６】

【実施例】以下、理解を容易にするために、二重鎖オリ
ゴヌクレオチドとＮＰ修飾骨格を有する単鎖オリゴヌク
レオチドとの間の三重鎖核酸形成反応をカチオン性高分
子共存下で行った実例を挙げて本発明を具体的に説明す
る。しかし、これらの反応は長鎖のＤＮＡあるいはＲＮ
ＡとＮＰ修飾骨格を有する単鎖核酸との間でカチオン性
高分子を共存させることによっても、同様に起こるもの
と理解されている。

【００２７】実施例１：ＮＰ修飾骨格を有する単鎖核酸
とカチオン性高分子との同時使用による、生体内と同等
の条件における三重鎖核酸形成の促進（電気泳動による
解析） 下記表−１のオリゴヌクレオチドのうち、Ｐｙｒ１５
Ｔ，Ｐｕｒ２３Ａ，Ｐｙｒ２３Ｔ，Ｐｙｒ１５ＮＳの粗
製品を日清紡株式会社から購入し、高速液体クロマトグ
ラフィーにより精製した。また、Ｐｙｒ１５ＮＰの精製
品を米国のＬｙｎｘ社から購入した。ＵＶ分光光度計
（ＪＡＳＣＯ Ｕｂｅｓｔ−３０）にてＵＶ吸収測定を
することにより、ＤＮＡ濃度を決定した。二重鎖ＤＮＡ
の相補的配列を有するＰｕｒ２３Ａ，Ｐｙｒ２３Ｔをほ
ぼ等モル混合し、９０℃に加熱後、徐冷してアニ−リン
グし、余剰の単鎖ＤＮＡを除去するためにハイドロキシ
アパタイトカラム（ＫＯＫＥＮ）で精製し、二重鎖ＤＮ
Ａを調製した。

【００２８】

【表１】

【００２９】ＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘは、この合成、精製、
分析を Bioconjugate Chem．8，3-6（1997）に従って行
って得られたカチオン性ポリマーを用いた。

【００３０】電気泳動による三重鎖核酸形成反応の解析
は J．Biol．Chem.，274、6161-6167（1999）に従って
以下の手順で行った。５０ｍＭＴｒｉｓ−酢酸（ｐＨ
７．０）、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ塩化マ
グネシウムの緩衝液中、³²Ｐでラジオアイソトープ標識
した二重鎖ＤＮＡ（Ｐｕｒ２３Ａ・Ｐｙｒ２３Ｔ）（約
１０ｐｇ）に対して、最終的に図１の濃度になるように
一連の濃度の単鎖ＤＮＡ（Ｐｙｒ１５ＴあるいはＰｙｒ
１５ＮＰ）を加える。さらに非特異的な単鎖ＤＮＡ（Ｐ
ｙｒ１５ＮＳ）を加えて、各試料溶液中の最終的な単鎖
ＤＮＡの合計（Ｐｙｒ１５Ｔ＋Ｐｙｒ１５ＮＳあるいは
Ｐｙｒ１５ＮＰ＋Ｐｙｒ１５ＮＳ）の濃度が１０μＭに
なるようにする。さらにカチオン性高分子を加える実験
群に対しては、最終的に４μＭの濃度になるようにＰＬ
Ｌ−ｇ−Ｄｅｘを加える。（これは、カチオン性高分子
中アミノ基のＤＮＡ中リン酸基に対するモル比（［アミ
ノ基］_{cationic polymer}／［リン酸基］_DNAの荷電比）
が２であることに相当する。）この各試料溶液９μｌを
３７℃で６時間インキュベートした後、ＤＮＡとポリマ
ーを解離させる目的で、サケ精子ＤＮＡ（６ｍｇ／ｍ
ｌ、１μｌ）を添加した。三重鎖核酸形成効率は、各試
料溶液を５０ｍＭＴｒｉｓ−酢酸（ｐＨ７．０）、１０
ｍＭ塩化マグネシウムの緩衝液中１５％ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動（８Ｖ／ｃｍ、４℃、１６時間）し、
ラジオアイソトープ標識された二重鎖ＤＮＡと三重鎖核
酸のバンドの濃さをバイオイメージングアナライザー
（ＦＵＪＩＸＢＡＳ２０００）で解析することにより求
めた。

【００３１】結果を図１に示す。二重鎖ＤＮＡと三重鎖
核酸のバンドの位置を各々ＤとＴで示してある。５０％
の二重鎖ＤＮＡが三重鎖核酸を形成する単鎖核酸の濃度
は、ＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘ非共存下Ｐｙｒ１５Ｔの場合に
は約１０^-6Ｍであり、ＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘ共存下Ｐｙｒ
１５Ｔの場合およびＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘ非共存下Ｐｙｒ
１５ＮＰの場合には約１０^-8Ｍであるのに対して、ＰＬ
Ｌ−ｇ−Ｄｅｘ共存下Ｐｙｒ１５ＮＰの場合には約１０
^-10Ｍである。つまり、ＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘ共存下で単
鎖核酸としてＰｙｒ１５ＮＰを用いると三重鎖核酸形成
効率が最も高いこと、また、ＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘ非共存
下で単鎖核酸としてＰｙｒ１５Ｔを用いた時に比較して
三重鎖核酸形成効率が約１００００倍上昇していること
が明らかである。

【００３２】実施例２：ＮＰ修飾骨格を有する単鎖核酸
とカチオン性高分子との同時使用による、生体内と同等
の条件下における三重鎖核酸の熱安定性の促進 緩衝液Ａ（１０ｍＭカコジル酸−カコジル酸ナトリウム
（ｐＨ６．８）、２００ｍＭ塩化ナトリウム、２０ｍＭ
塩化マグネシウム）中、二重鎖ＤＮＡ（Ｐｕｒ２３Ａ・
Ｐｙｒ２３Ｔ、実施例１と同じ）と単鎖ＤＮＡ（Ｐｙｒ
１５ＴあるいはＰｙｒ１５ＮＰ、実施例１と同じ）とを
各々最終濃度が１μＭになるように混合する。カチオン
性高分子を加える実験群に対しては、１．７μＭの濃度
になるようにＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘをさらに添加する。
（これは、カチオン性高分子中アミノ基のＤＮＡ中リン
酸基に対するモル比（［アミノ基］_{cationic polymer}／
［リン酸基］_DNAの荷電比）が２であることに相当す
る。）この各試料溶液３．５ｍｌを４℃で１２時間以上
インキュベートした後、１ｃｍ四角型セルに入れ、ＵＶ
分光光度計（ＪＡＳＣＯ Ｕｂｅｓｔ−３０）のペルチ
ェ式セルホルダー（ＥＨＣ−３６３）にセットする。
０．５℃／分の速度で２０℃から９０℃まで温度を上昇
させながら、２６０ｎｍにおける核酸の吸光度の変化を
モニターする。

【００３３】結果を図２に示す。ＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘ非
共存下Ｐｙｒ１５Ｔの場合およびＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘ共
存下Ｐｙｒ１５Ｔの場合には２段階の吸光度の増加が見
られ、低温領域の吸光度の増加が（三重鎖核酸→二重鎖
ＤＮＡ＋単鎖核酸）の融解に相当し、高温領域の吸光度
の増加が（二重鎖ＤＮＡ→単鎖核酸２分子）の融解に相
当する。一方、ＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘ非共存下Ｐｙｒ１５
ＮＰの場合およびＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘ共存下Ｐｙｒ１５
ＮＰの場合には１段階の吸光度の増加しか見られず、
（三重鎖核酸→単鎖核酸３分子）の融解に相当する。図
よりＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘ共存下Ｐｙｒ１５ＮＰの場合
に、三重鎖核酸の融解曲線が最も高温側にあり、三重鎖
核酸の融解が最も高い温度で起こることが明らかであ
る。つまり、ＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘ共存下で単鎖核酸とし
てＰｙｒ１５ＮＰを用いると、三重鎖核酸の熱安定性が
最も高いことになる。

【００３４】吸光度の温度に対する一次微分を温度に対
してプロットし、このプロットのピークの温度を融解温
度と定義し、熱安定性の指標とした。（三重鎖核酸→二
重鎖ＤＮＡ＋単鎖核酸）の融解温度をＴ_m1とし、（二重
鎖ＤＮＡ→単鎖核酸２分子）の融解温度をＴ_m2とし、
（三重鎖核酸→単鎖核酸３分子）の場合は一つの融解温
度としてまとめたのが下記表−２である。

【００３５】

【表２】

【００３６】この表より、ＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘ共存下で
単鎖核酸としてＰｙｒ１５ＮＰを用いると、三重鎖核酸
の熱安定性が最も高いことが明らかである。

【００３７】実施例３：ＮＰ修飾骨格を有する単鎖核酸
とカチオン性高分子との同時使用による、生体内と同等
の条件における三重鎖核酸形成の促進（生体分子間相互
作用解析装置による速度論的解析） 生体分子間相互作用解析装置による三重鎖核酸形成反応
の解析はJ．Biol. Chem.，274，6161-6167（1999）に従
って以下の手順で行った。上記の文献の方法により、生
体分子間相互作用解析装置（Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｓｅｎ
ｓｏｒｓ，ＩＡｓｙｓ Ｐｌｕｓ）のカルボキシメチル
デキストランキュベットに、まずストレプトアビジンタ
ンパク質を固定化し、次に５′末端をビオチンで標識し
たＰｙｒ２３Ｔ（実施例１と同じ）をこれに結合させ、
さらにＰｕｒ２３Ａ（実施例１と同じ）を相補鎖として
これにハイブリダイズさせる。以上によりキュベット中
に二重鎖ＤＮＡ（Ｐｕｒ２３Ａ・Ｐｙｒ２３Ｔ）が固定
化される。これに対して、緩衝液Ａ（実施例２参照）中
に溶かした一連の濃度の単鎖ＤＮＡ（Ｐｙｒ１５Ｔある
いはＰｙｒ１５ＮＰ、実施例１と同じ）を加え、２５℃
において三重鎖核酸の形成過程を単鎖ＤＮＡの結合量
（図３、４の縦軸）として装置でモニターする。カチオ
ン性高分子を加える実験群に対しては、上記の単鎖ＤＮ
Ａを溶かした緩衝液Ａ（実施例２参照）中に３８μＭの
濃度になるようにＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘを添加しておく。
三重鎖核酸の形成過程を３０分間装置でモニターした
後、反応溶液を捨て、代わりに緩衝液Ａ（実施例２参
照）を加えて、三重鎖核酸の解離過程を装置でモニター
する。

【００３８】結果を図３に示す。ＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘ共
存下で単鎖核酸としてＰｙｒ１５ＮＰを用いると、３０
分間での単鎖ＤＮＡの結合量が最も多い、つまり三重鎖
核酸形成効率が最も高いことが明らかである。

【００３９】キュベット中に固定化した二重鎖ＤＮＡ
（Ｐｕｒ２３Ａ・Ｐｙｒ２３Ｔ）に対して、ＰＬＬ−ｇ
−Ｄｅｘ非共存下の緩衝液Ａ（実施例２参照）中に溶か
した一連の濃度のＰｙｒ１５ＮＰを加え、２５℃におい
て三重鎖核酸の形成曲線を装置でモニターしたのが図４
である。Ｐｙｒ１５ＮＰの濃度が上昇すると、３０分間
における三重鎖核酸の形成量が増加するのがわかる。各
々の三重鎖核酸の形成曲線をAnalytical Biochemistr
y，212，457-468（1993）に記載された理論式で解析す
ると、Ｐｙｒ１５ＮＰの各々の濃度に対してｏｎ−ｒａ
ｔｅ定数（ｋ_on）を求めることができる。Ｐｙｒ１５Ｎ
Ｐの各々の濃度に対して、各々の濃度のｋ_onをプロット
したのが図５であり、フィッティングした直線の傾きが
三重鎖核酸形成の結合速度定数（ｋ_assoc）である。一
方、各々の三重鎖核酸の解離曲線をAnalytical Biochem
istry，212，457-468（1993）に記載された理論式で解
析すると、ｏｆｆ−ｒａｔｅ定数（ｋ_off）を求めるこ
とができる。Ｐｙｒ１５ＮＰの複数の濃度に対してｋ
_offを求め、これらを平均した値が三重鎖核酸形成の解
離速度定数（ｋ_dissoc）である。三重鎖核酸形成効率を
示す指標となる結合定数（Ｋ _a）は、ｋ_onのｋ_offに対す
る比（ｋ_on／ｋ_off）として求められる。以上の一連の
解析を残りの３つの場合、つまりＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘ非
共存下Ｐｙｒ１５Ｔの場合、ＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘ共存下
Ｐｙｒ１５Ｔの場合、ＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘ共存下Ｐｙｒ
１５ＮＰの場合についても行い、結果をまとめたのが下
記表−３である。

【００４０】

【表３】

【００４１】この表より、ＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘ共存下で
単鎖核酸としてＰｙｒ１５ＮＰを用いると、三重鎖核酸
形成反応のＫ_aが最も大きく、三重鎖核酸形成効率が最
も高いこと、また、ＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘ非共存下で単鎖
核酸としてＰｙｒ１５Ｔを用いた時に比較して三重鎖核
酸形成効率が約１００００倍上昇していることが明らか
である。さらに、この最も高い三重鎖核酸形成効率はｋ
_assocが最も大きいこととｋ_dissocが最も小さいこと、
つまり三重鎖核酸が形成しやすいことと解離しにくいこ
ととの双方によることが明らかである。

【００４２】

【発明の効果】以上のとおり本発明によれば、単鎖核酸
が二重鎖ＤＮＡあるいはＲＮＡにおける特定部位のヌク
レオチド配列に結合して三重鎖核酸を形成する反応を行
うに当たり、これまで必要とした酸性などの生体内と異
なる条件を必要とすることなく、中性などの生体内と同
等の条件で反応を行うことを可能とし、また三重鎖核酸
形成に必要な単鎖核酸濃度を約１００００分の１に低減
して非特異的な結合を押さえることにより反応の効率を
向上させ、さらには三重鎖核酸形成による遺伝子発現制
御機能や部位特異的切断機能などの向上を可能にする。

【００４３】

【配列表】 ＜110＞ 丸山厚 Atsushi，Maruyama ＜120＞ 三重鎖核酸を形成するための調製物 ＜130＞ ＜160＞ 4 ＜210＞ 1 ＜211＞ 15 ＜212＞ DNA ＜213＞ Artificial Sequence ＜400＞ 1 ctcttctttt ctttc 15 ＜210＞ 2 ＜211＞ 23 ＜212＞ DNA ＜213＞ Artificial Sequence ＜400＞ 2 gcgcgagaag aaaagaaagc cgg 23 ＜210＞ 3 ＜211＞ 23 ＜212＞ DNA ＜213＞ Artificial Sequence ＜400＞ 3 ccggctttct tttcttctcg cgc 23 ＜210＞ 4 ＜211＞ 15 ＜212＞ DNA ＜213＞ Artificial Sequence ＜400＞ 4 tctcctcccc tccct 15

【図面の簡単な説明】

【図１】生体内と同等の条件における三重鎖核酸形成
を、電気泳動によって解析した結果を示す図面に代る写
真である。ＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘ共存下で単鎖核酸として
Ｐｙｒ１５ＮＰを用いると三重鎖核酸形成効率が最も高
いこと、また、ＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘ非共存下で単鎖核酸
としてＰｙｒ１５Ｔを用いた時に比較して三重鎖核酸形
成効率が約１００００倍上昇していることを示す図であ
る。

【図２】生体内と同等の条件における三重鎖核酸の熱安
定性を、温度変化に伴う２６０ｎｍにおける核酸の吸光
度の変化で解析した結果を示す。ＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘ共
存下で単鎖核酸としてＰｙｒ１５ＮＰを用いると、三重
鎖核酸の融解が最も高い温度で起こり、三重鎖核酸の熱
安定性が最も高いことを示す図である。

【図３】生体内と同等の条件における三重鎖核酸形成
を、生体分子間相互作用解析装置により速度論的見地か
ら解析した結果を示す。ＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘ共存下で単
鎖核酸としてＰｙｒ１５ＮＰを用いると、３０分間での
単鎖ＤＮＡの結合量が最も多い、つまり三重鎖核酸形成
効率が最も高いことを示す図である。

【図４】キュベット中に固定化した二重鎖ＤＮＡ（Ｐｕ
ｒ２３Ａ・Ｐｙｒ２３Ｔ）に対して、ＰＬＬ−ｇ−Ｄｅ
ｘ非共存下の一連の濃度のＰｙｒ１５ＮＰを加え、三重
鎖核酸形成を生体分子間相互作用解析装置でモニターし
た結果を示す。Ｐｙｒ１５ＮＰの濃度が上昇すると、３
０分間における三重鎖核酸の形成量が増加するのがわか
る。

【図５】Ｐｙｒ１５ＮＰの各々の濃度に対して、各々の
濃度の三重鎖核酸形成のｋ_onをプロットしたものであ
る。フィッティングした直線の傾きが三重鎖核酸形成の
結合速度定数（ｋ_assoc）である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０８Ｌ 101/12 Ｃ０８Ｌ 101/12 Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA20 CA01 CA09 HA12 4C057 BB02 BB05 CC01 DD01 MM02 MM04 4C090 AA07 AA08 BA08 BA97 BB92 CA46 DA06 DA11 DA32 4J001 DA01 DB01 DB02 DB07 DD05 DD14 DD20 EA14 EA33 EA37 EE25C EE26C EE28C EE30C EE38C EE44C EE54C FA03 FB01 FC01 JA20 4J002 AA00W AD00X BG07W BN17W CL02W CM01W CM04W GB00 GE00 GT00

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 単鎖核酸を含んで成る、二重鎖ＤＮＡあ
   るいはＲＮＡの特定部位で三重鎖核酸を形成するための
   調製物であって、該単鎖核酸が該特定部位における片方
   のヌクレオチド配列と塩基対を形成しうる塩基を有し、
   かつホスホロアミデート骨核を有するものであり、そし
   てカチオン性高分子を該単鎖核酸と組み合わさった形態
   でさらなる有効成分として含んでなる三重鎖核酸を形成
   するための調製物。
2. 【請求項２】 該片方のヌクレオチド配列が本質的にＡ
   またはＧのプリン塩基から成り、単鎖核酸におけるこれ
   らの塩基と塩基対を形成しうる塩基が、それぞれＴまた
   はＣもしくはＵのピリミジン塩基である請求項１記載の
   調製物。
3. 【請求項３】 単鎖核酸とカチオン性高分子とが単一の
   調製物中に含まれている請求項１または２記載の調製
   物。
4. 【請求項４】 カチオン性高分子が、塩基性アミノ酸、
   アミノ糖、アルキレンイミンおよびＮ，Ｎ−ジアルキル
   アミノアルキル（メタ）アクリレートから成る群より選
   ばれる１種または２種以上のモノマーに由来し、そして
   場合によって、複数の親水性高分子側鎖を有していても
   よい請求項１〜３のいずれかに記載の調製物。
5. 【請求項５】 カチオン性高分子がポリリジンに由来す
   る主鎖と、デキストランまたはポリエチレングリコール
   に由来するグラフト型側鎖とから構成される請求項１記
   載の調製物。
6. 【請求項６】 カチオン性高分子が、式 【化１】 （上式中、ｍは１〜１００の整数であり、ｘは５〜２０
   ０の整数であり、そしてｎは０．０１〜０．３であ
   る。）で表されるデキストラン側鎖修飾α−ポリ（リジ
   ン）である請求項１記載の調製物。