JPH08504570A - 治療用抗ｈｉｖオリゴヌクレオチドと薬剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ＨＩＶ−１ゲノムの保存されたｇａｇ領域の少なくとも３２４から３４８までのヌクレオチドに対してハイブリッド形成するヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドを開示するものである。これらのオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの非リン酸ジエステルのヌクレオチド間連鎖により結合された２５から３０個のヌクレオチドを有し、それらによりヌクレアーゼ消化に対する抵抗力がついている。さらに、このようなオリゴヌクレオチドを使用した治療用組成物、ならびに哺乳類におけるＨＩＶ−１の増殖阻害方法とＨＩＶ−１感染治療方法も本発明に含まれる。

Description

【発明の詳細な説明】 治療用抗ＨＩＶオリゴヌクレオチドと薬剤発明の分野 本発明は、ＨＩＶ−１感染の治療に関するものである。より具体的にいえば、 本発明はアンチセンスオリゴヌクレオチドと呼ばれる化学療法薬、およびそのよ うなオリゴヌクレオチドを含有する薬剤の組成に関するものである。本発明は、 そのようなアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用したＨＩＶ複製の阻害方法お よびＨＩＶ−１感染治療方法にも関係する。発明の背景 ヒトＴ細胞リンパ球性ウイルスＩＩＩ型（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ）は、現在ではヒ ト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）としてよりよく知られているが、後天性 免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の原因ウイルスと考えられている。このウイルスは 、Retroviridaie（レトロウイルス）科に属し、この科のウイルスはＲＮＡゲノ ムと逆転写酵素活性を有する。レトロウイルスはその成長周期中で、自らのＲＮ ＡをプロウイルスのＤＮＡにコピーする。プロウイルスＤＮＡは、宿主細胞の染 色体ＤＮＡに組み込むことができ、そこで宿主細胞の転写および翻訳の機構を利 用してウイルスのＲＮＡと蛋白を発現する。ウイルスは細胞質膜から出芽して細 胞から放出される。ＨＩＶ−１の場合、ウイルスが複製されると、ヘルパーＴ細 胞宿主細胞の死を招き、その結果、重度の免疫不全状態にな り、様々な悪性腫瘍や日和見感染を生じ、最終的には感染した生物は死亡してし まう。 ＡＩＤＳの発生率は多くの国で大流行ともいうべき勢いで伸びているが、長期 的に効果を示せる予防療法や治療法は開発されていない。これまで処方されてき た数少ない治療薬としては、ヌクレオシド類似体の３’−アジド−３’−デオキ シチミジン（ＡＺＴ）、ジデオキシイノシン（ｄｄＩ）、ジデオキシシトシン（ ｄｄＣ）があるが、いずれも限られた成果しか挙げていない。その理由の一部は これらの薬剤の細胞毒性である。さらに、ウイルスの中には突然変異のためこれ らの薬剤に対して不感性になるため、また、ウイルスが宿主のゲノムに入り込む 能力があるために抗ウイルス作用が困難となるために、薬剤の作用からのがれて しまうものがある。したがって、より効果的なＡＩＤＳの治療薬や予防療法の必 要性が、長い間認識されてきた。 最近、細胞および異種ＤＮＡの発現を調整することができる新しい化学療法薬 が開発されてきている。これらの薬剤はアンチセンスオリゴヌクレオチドと呼ば れ、ワトソン・クリックまたはフーグスティーンの塩基対の規則に従って標的で ある１本鎖核酸分子に結合し、そうすることで１ないし複数の機構を通じて標的 の機能を損なう。その機構とは、正常な翻訳または転写に必要な因子の結合を防 止すること、またｍＲＮＡが標的の場合には、リボヌクレアーゼＨが出すメッセ ージの酵素による破壊 をトリガーすることによって、あるいはアンチセンスオリゴヌクレオチドに直接 付着している反応群を通じて標的を破壊することによるものである。 ＨＩＶ−１や他のウイルスの発現を特異的に阻害するためのものとして、アン チセンスオリゴデオキシヌクレオチドが考案されてきた（たとえば、アグラワル によるTrends in Biotechnology 10巻152〜158頁（1992年）、アグラワルらによ るGene Regulation: Biology of Antisense RNA and DNA（エリクソンとイザン ト編）Raven Press Ltd、New York 273〜283頁（1992年）、松倉らのProspects for Antisense Nucleic Acid Therapy of Cancer and AIDS，Wiley-Liss，Inc． 159〜178頁（1992年）、およびアグラワルのProspects for Antisense Nucleic Acid Therapy for Cancer and AIDS（ウイックストローム編）Liss，New York、 145〜148頁（1991年）を参照）。たとえば、修飾されていないリン酸ジエステル ・ヌクレオシド間結合とゲノムＨＩＶ−１リボ核酸（ＲＮＡ）と相補的な配列を 有するアンチセンスオリゴヌクレオチドが、早期感染細胞においてウイルス複製 を阻害することが明らかにされている（ザメクニックらによるProc．Acid．Sci ．USA 83巻4143〜4147頁（1986年）、グッドチャイルドらによるProc．Natl．Ac ad．Sci USA 85巻5507〜5511頁（1988年））。ただし、これらの分子は慢性的に 感染した細胞でのウイルス複製を阻害する能力はそれほどなく（アグラワルらに よるProc．Natl．Acad． Sci USA 86巻7790〜7794頁（1989年））、これは主としてヌクレアーゼに対する 感受性が原因である（ウイックストロームによるJ．Biochem．Biolphys．Meth． 13巻97〜102頁（1986年））。したがって、化学的に修飾された、ヌクレアーゼ に対して抵抗性のある類似体が開発され、それらは組織培養においてＨＩＶ−１ の複製阻害に効果を示している（サリンらによるProc．Natl．Acad．Sci．USA 8 5巻7448〜7451頁（1988年）、アグラワルらによるProc．Natl．Acad．Sci．USA 85巻7079〜7083頁（1988年）、松倉によるGene 72巻343〜347頁（1988年））。 これらの類似体には、ヌクレアーゼ抵抗性チオリン酸ヌクレオチド間連鎖を有す るオリゴヌクレオチドがあり、これらはＨＩＶ−１複製を急性感染でも（アグラ ワルらによるProc．Natl．Acad．Sci USA 86巻7790〜7794頁（1989年））、慢性 的に感染した細胞系でも阻害することが明らかになっている（アグラワルらによ るGene Regulation：Biology of Antisense RNA（エリックソンら編、Raven Pre ss，New York）273〜284頁（1991年）、ビッカーズらによるNucleic Acids Res ．19巻3359〜3368頁（1991年）、松倉らによるProc．Natl Acad．Sci．86巻4244 〜4248頁（1989年）、アグラワルらによるProc．Natl．Acad．Sci．USA 85巻707 9〜7083頁（1988年））。しかし、治験効果を持ちながら、細胞毒性が小さいか もしくはまったくない、より有効な抗ＨＩＶオリゴヌクレオチドがなお必要とさ れている。発明の概要 ＨＩＶ−１複製を阻害する新たな化学療法薬が考案されている。これらの薬剤 は合成オリゴヌクレオチドで、非リン酸ジエステルのヌクレオチド間連鎖、なら びにＨＩＶ−１ゲノムの保存ｇａｇ領域の部分に相補的なヌクレオチド配列を有 する。ｇａｇは、ＨＩＶ−１の構造遺伝子の一部であり、あらゆるレトロウイル スに共通する。ｇａｇ開始コドンの周辺におかれた配列は、ウイルスのパッケー ジングにとって必須のものであることがわかっている。アンチセンスオリゴヌク レオチド薬は、標的ＤＮＡまたはＲＮＡに結合することで作用し、それによりＤ ＮＡ複製とＤＮＡ発現の開始を阻害し、またそのＤＮＡの二次構造を崩壊させる ことでウイルスパッケージングを阻害する。 本発明のオリゴヌクレオチドは、ＨＩＶ−１複製を阻害するために考え出され た他の多くの化学療法薬に比べて、より特異性が高く、毒性が少なく、ヌクレア ーゼに対する抵抗性が大きい。特に、本発明による化合物は、非リン酸ジエステ ル連鎖を有し、リン酸ジエステル連鎖のみを有する化合物に比べて核酸分解変性 に対する抵抗性がより大きい。さらに、ウイルス複製阻害作用も、３２４から３ ４８までのＨＩＶ−１ ｇａｇ領域よりも少ない配列に対して相補的なヌクレオ チド配列を含有する他の既知のアンチセンスオリゴヌクレオチドに比べてより大 きい。 一言でいえば、本発明はＨＩＶ−１のｇａｇ領域の少なくとも３２４から３４ ８までのヌクレオチドに対してハイブリッド形成する２５から３０個のヌクレオ チドの配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドについて述べたものである 。本発明の好ましい実施例の１つは、少なくとも１つのチオリン酸ヌクレオチド 間連鎖を有するオリゴヌクレオチドである。このようなチオリン酸連鎖のために は酸素を硫黄で置換するので、これによりオリゴヌクレオチドに核酸分解変性に 対する抵抗性がつく。 本発明のもう１つの実施例は、少なくとも１つのチオリン酸ヌクレオチド間連 鎖により結合した２５のヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドである。この オリゴヌクレオチドを「２５量体」と呼ぶ。この２５量体のヌクレオチド配列は 、配列リストでＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として定められている。本発明のその他 の実施例としては、２６、２７、２８、２９、または３０のヌクレオチドを有す るチオリン酸オリゴヌクレオチドがあるが、これらの配列は他の隣接ヌクレオチ ドに加えてＨＩＶ−１のヌクレオチド３２４から３４８までに相補的である。望 ましい２種の２６量体の配列は、配列リストの中ではＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２お よびＮＯ：３として、また２７量体の配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、２８量体 の配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５およびＮＯ：６、２９量体の配列はＳＥＱ Ｉ Ｄ ＮＯ：７、３０量体の配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８およびＮＯ：９として 示す。 本発明では、前記のオリゴヌクレオチドを生理学的に受け入れられる担体の形 で使用する治療処方、ならびにこれらの処方を使用して哺乳類におけるＨＩＶ− １の増殖を阻害する方法とＨＩＶ−１感染を治療する方法も明らかにする。図面の簡単な説明 本発明の前記のものをはじめとする目的、その様々な特性、ならびに発明それ 自体については、添付の図とともに下記の説明を読めばよりよく理解できるであ ろう。 図１は、ＨＩＶ−１ゲノムの標的となるｇａｇ開始領域、ならびに本発明のア ンチセンスチオリン酸ヌクレオチドがそれに対して相補的であることを図式化し たものである。 図２は、標的ｇａｇ開始領域と本発明の２５量体を図式化したものである。 図３は、標的ｇａｇ開始領域と松倉らの２８量体を図式化したものである。 図４は、標識ｇａｇ開始領域と本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドが対 象とする部位を図式化したものである。 図５は、表でｐ２４発現の阻害率（％）として示したＨＩＶ−１活性をグラフ にしたものである。 図６は、表でＣＰＥの減少率（％）として示したＨＩＶ−１活性をグラフにし たものである。 図７は、長期保護実験の結果をグラフにしたもので、 １７日目までのｐ２４発現阻害における２５量体の有効性とｄｄＣの無効性を実 証している。好ましい実施例の詳細な説明 本発明は、非リン酸ジエステル・ヌクレオチド間連鎖を有するアンチセンスオ リゴヌクレオチドであって、ＨＩＶ−１の複製阻害に特によく働き、しかもリン 酸ジエステル・ヌクレオチド間連鎖を有するオリゴヌクレオチドに比べてヌクレ アーゼ消化に対する抵抗性がより大きく、かつ他の抗ＨＩＶ化学療法薬よりも細 胞毒性が小さいものである。これらのオリゴヌクレオチド（ＳＥＱＩＤ ＮＯ： １〜９）は、ＨＩＶ−１ゲノムのｇａｇ開始コドン周囲の領域を標的とする。こ の領域に置かれている配列は、ウイルスパッケージングにとって必須であること がすでに立証されている。これらの配列は安定した二次構造を形成する（ハリソ ンらによるRNA Tumor Viruses（コツフィンら編）Cold Spring Harbor Laborato ry、Cold Spring Harbor、NY 235頁（1991年））。本発明のオリゴヌクレオチド は、この領域に結合するように作られており、それによってその自然の安定性を 崩し、その結果として最終的にはウイルスパッケージングとｇａｇ ｍＲＮＡの 翻訳を阻害する。 オリゴヌクレオチドは少なくともＨＩＶ−１のｇａｇ領域（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ Ｏ：１１）の３２４から３４８までの配列に対して相補的である（図２）（ミュ ーシングらによるNature（ロンドン）313巻450〜458頁（1985 年））。配列３２４〜３４８は、表１に示すように、ＨＩＶ−１の様々な株で非 常によく保存される。 このような保存領域をアンチセンスオリゴヌクレオチドの標的とすると、活性 状態の遺伝子が「逃避突然変異体」を生成することなくＨＩＶ増殖を効率よく阻 害できるようになる。逃避突然変異体は、アンチセンスオリゴヌクレオチドが標 的とするゲノムの領域で生じる。これは、蛋白質をコード化する領域よりも非コ ーディング領 域（ＨＩＶ−１のＳＡ領域など）のほうでより高い頻度で生じる。 本発明のオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列はそれぞれ、ＨＩＶ−１ゲノ ムの少なくともヌクレオチド３２４〜３４８の配列に対して相補的である。本発 明の１つの側面は、基本的にこの配列から成るオリゴヌクレオチドであり、これ については今後２５量体と呼ぶ。２５量体の配列は、配列リストでＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として示す。ＨＩＶ−１複製を阻害する能力を有する請求項の他のオ リゴヌクレオチドには、ＨＩＶ−１の３２４から３４８までの領域に隣接するヌ クレオチドに相補的なヌクレオチドを追加することにより、２５量体の３’また は５’またはその両者の方向に、隣接された配列を含む。これらのオリゴヌクレ オチドの配列は表２に、また配列リストでＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２〜９として示 す。比較のために２０量体の配列（アグラワルらによるGene Regulation： Biol ogy of Antisense DNA and RNA （エリクソンとイザント編）Raven Press，Ltd .、New York、273〜283頁（1992年）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０））も列挙す る。 本発明のオリゴヌクレオチドを修飾したものもＨＩＶ−１増殖の阻害薬として 有用であり、これにはチオリン酸連鎖以外の人工的なヌクレオチド間連鎖が含ま れる。その他の既存の人工連鎖としては、リン酸メチル、ホスホルアミデート、 ジチオエート、架橋チオリン酸、架橋ホスホルアミデート、スルホン、硫酸、ケ トース、リン酸エステル、ホスホルブチルアミンがある（例えば、フアン・デル ・クロルらによるBiotech 6巻958〜976頁（1988年）およびウルマンらによるChe m．Rev．90巻543〜585頁（1990年）を参照）。さらに、チオリン酸およびそ の他の人工オリゴヌクレオチドでヌクレアーゼ抵抗性をもたらす追加構造を有す るものも有用であり、これには３’キャップ末端または５’キャップ末端あるい はその両者（たとえば、米国特許出願番号第07/698,568号、レシンジャーらによ るBiochem 86巻6553〜6556頁（1989年）、およびリードらによるBioconjugate C hem．２巻217〜225頁（1991年）を参照）、ならびにキメラオリゴヌクレオチド （米国特許第5,149,797号、これにはＲＮＡおよびＤＮＡ領域を有するハイブリ ッドオリゴヌクレオチドも含まれる）がある。この他に本発明のオリゴヌクレオ チドにヌクレアーゼ抵抗性をもたらす修飾としては、互いに内部相補的な３’末 端配列があり、これにより構造の末端で二重鎖ループが形成される。もちろんこ れ以外にもヌクレアーゼ抵抗性、特異性、活性を増強し、かつ細胞毒性を低下さ せるようなオリゴヌクレオチドの修飾も行うことができる。 本発明のオリゴヌクレオチドは、既存の様々な手順で合成することができ、た とえばホスホルアミデートまたはＨ−リン酸化学品を利用した固相法（たとえば 、アグラワルらによるAnn．New York Acad．Sci．（1992年印刷中）、アグラワ ルらによるTIBTECH 10巻152〜158頁（1991年）参照）があり、また既存の逆相ま たはイオン交換ＨＰＬＣもしくはハイブリダイゼーションアフィニティークロマ トグラフィー法（たとえば、メトレヴとアグラワルによるAnal．Biochem．200巻 342〜346頁（1992年） を参照）により精製できる。 アンチセンスオリゴヌクレオチドのウイルス複製阻害の機構と有効性は、いく つかのインビトロ系で効率よく調べることができる。１つの系はＣＥＭ細胞など 慢性的に感染したヒトＴリンパ球を使用する。このような試験系では、感染細胞 を本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドが存在しない場合、および様々な濃 度で存在する場合について、様々な期間で培養する。本発明のオリゴヌクレオチ ドとは異なり、ＡＺＴ、ｄｄＩ、およびｄｄＣなどのヌクレオチド類似体はこの 系ではＨＩＶ複製を阻害しない。 ただし慢性的感染細胞はＣＤ４−なので再感染は起こらない。したがって、こ のようなインビトロ培養はＨＩＶ感染者で実際に生じているインビボの条件をそ のまま表しているわけではない。感染者の体内ではＣＤ４＋細胞のごく一部のみ が感染してウイルスを産生しているのである。インビボ条件により肉薄した薬剤 試験モデルは、急性で多様性が比較的少ない感染（ＭＯＩ）による細胞培養であ る。この系では、細胞集団の一部のみにウイルスが宿り、他の細胞は感染されず かつＣＤ４＋である。ＣＥＭまたはＨ９（ＡＴＣＣ ＨＴＰ １７６）などのヒ トＴ細胞系をＨＩＶに１ないし数時間感染させ、それからオリゴヌクレオチドが ない場合と様々な濃度でオリゴヌクレオチドがある場合について様々な期間で培 養する。 オリゴヌクレオチドのＨＩＶ−１複製阻害能は、ＨＩＶ発現レベルおよび感染 細胞に対するオリゴヌクレオチドの細胞毒性作用を調べることで測定できる。Ｈ ＩＶの発現は、シンシチウム形成、ｐ２４発現、ｐ１７発現、および逆転写酵素 活性など多数のパラメーターによってモニターすることができる（アグラワルら によるAdv．Drug Delivery Rev．６巻251〜270頁（1991年）、サリンらによるBi ochem．Pharmacol．34巻4075〜4079頁（1985年）、サリンらによるJ．Natl．Can cer Inst．78巻663〜666頁（1987年）参照）。オリゴヌクレオチドによるウイル ス寒冷曝露作用（ＣＰＥ）の阻害については、ＭＴＴまたはトリパンブルー除外 法により調べることができる。 本発明のオリゴヌクレオチドを使って、感染細胞におけるＨＩＶ−１の増殖を 阻害することもできる。この方法では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチ ドを使用する治療処方を、生理学的に受け入れられる担体により提供する。それ からＨＩＶ−１感染細胞を、感染細胞におけるＨＩＶ−１プロウイルスＤＮＡま たはｍＲＮＡあるいはその両者のｇａｇ領域にオリゴヌクレオチドを結合させる のに十分な量で処置する。このようにして、ＨＩＶ−１ ＤＮＡまたはｍＲＮＡ にオリゴヌクレオチドを結合させることで、ウイルスの発現や複製を阻害する。 本発明のオリゴヌクレオチドを使って、哺乳類におけ るＨＩＶ−１感染を治療することもできる。この方法では、本発明のアンチセン スオリゴヌクレオチドを使用する治療処方を、生理学的に受け入れられる担体に より提供する。それから哺乳類を、感染細胞におけるＨＩＶ−１プロウイルスＤ ＮＡまたはｍＲＮＡあるいはその両者のｇａｇ領域にオリゴヌクレオチドを結合 させるのに十分な量で処置する。このようにオリゴヌクレオチドを結合させるこ とで、ＨＩＶ−１ ＤＮＡの発現およびウイルスの複製を阻害する。 ここでいう「生理学的に受け入れられる担体」には、あらゆる溶媒、分散媒、 被覆剤、抗菌薬と抗真菌薬、等張液や薬剤の作用を遅らせる吸収薬などがある。 このような媒体や薬剤を薬剤活性物質に使用することは、一般によく知られてい る技法である。従来の媒体または薬剤が有効成分と並存できないのでない限り、 治療薬組成に使用することは予期されている。補助的活性成分も、組成に含める ことができる。 ＡＩＤＳ治療におけるオリゴヌクレオチドの有効量および有効な投与法は、通 常の実験により明らかにできる。注射するのに適した剤形としては、滅菌水性溶 液または分散薬、および滅菌注射溶液または分散薬の即時調合薬用滅菌粉末があ る。いずれの場合も、滅菌した形でなければならない。製造および貯蔵の条件下 で安定していなければならず、また細菌や真菌などの微生物の汚染作用から保護 しなければならない。担体は溶媒でも分散媒で もよい。様々な抗菌薬や抗真菌薬により微生物の作用を防ぐことができる。吸収 を遅くするような薬剤組成を用いることで、注射用治療薬の吸収時間を長くする ことができる。 担体中のオリゴヌクレオチドは、静注または腹腔注、あるいは経鼻、経口、経 皮、皮下投与することができる。 滅菌注射用液は、必要量のオリゴヌクレオチドを適当な溶媒に入れてから濾過 滅菌して調製する。 ＨＩＶは突然変異率が高いので、アンチセンスオリゴヌクレオチドをはじめウ イルス感染治療のためのあらゆる薬剤は、逃避突然変異体をもたらす可能性があ る。この問題を克服するために、ＨＩＶ感染患者の治療には併用化学療法が提案 されている。この療法では、たとえば逆転写酵素インヒビターとプロテアーゼイ ンヒビターを組み合わせるなど、異なる標的に向けた複数の薬剤を使用する。そ の代わりとして、異なる配列を標的とするアンチセンス治療法を併用したり、あ るいは順次投与するスケジュールで実施することもでき、これは結果としてウイ ルスに対して逃避突然変異体を作製する時間をほとんど与えないように様々な選 択的な圧力を与えるものとなる。したがって、最初の治療では本発明のオリゴヌ クレオチドの混合物を使用し、次いでＨＩＶ−１ゲノムの他の保存領域を標的と するオリゴヌクレオチドを順次投与する。 以下の実施例は本発明についてさらに理解を深めるた めのものであり、これによって限定されるものではない。 実施例１ チオリン酸オリゴデオキシヌクレオチドの合成 チオリン酸で修飾したオリゴデオキシヌクレオチドを、Ｈ−リン酸化学品を用 いて自動化合成装置(Millipore8700、Bedford、MA)で５〜１０ミリモルのスケー ルで合成する。必要な配列を作製した後に、ＣＰＧと結合したオリゴヌクレオチ ドＨ−リン酸を、ピリジン／トリエチルアミン／二硫化炭素中で硫黄で酸化し、 チオリン酸連鎖を生成する。濃アンモニア中で４０℃で４８時間かけて脱保護を 完了する。分取逆相クロマトグラフィー、次いでイオン交換クロマトグラフィー を行って精製する。最後に、精製されたオリゴヌクレオチドを水で透析し、凍結 乾燥する。チオリン酸オリゴヌクレオチドの純度をＨＰＬＣおよびＰＡＧＥによ りチェックする（アグラワルらによるProc．Natl．Acad．Sci USA 86巻7790〜77 94頁（1989年））。 これらの実験で比較のために使用するオリゴヌクレオチドは、チオリン酸２０ 量体であり、そのヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）はＨＩＶ−１ ゲノムのｇａｇ領域の部分（ヌクレオチド番号３２７〜３４６）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１参照）に対して相補的である。本発明のオリゴヌクレオチドと同様 に、この２０量 体にはチオリン酸ヌクレオチド間連鎖がある。ただし、後に例示する実験でわか るように、２０量体は本発明のオリゴヌクレオチドに比べてＨＩＶ−１阻害活性 が小さい。 実施例２ アンチセンスオリゴヌクレオチドと 対照オリゴヌクレオチドの特異性 アンチセンスオリゴヌクレオチドの特異性を明らかにするために、既知の細胞 遺伝子またはウイルス遺伝子に対して相補的でない同一サイズにしたオリゴヌク レオチドと生物学的作用を比較することができる。ここで使用する非特異的対照 オリゴヌクレオチドとして３種類を選んだが、そのうちの１つは「ランダム」配 列を持っていて理論的に最良である。ランダム配列は、各段階で４つのヌクレオ チドの混合物をカップリングすることにより縮重オリゴヌクレオチドとして合成 され（理論的には４²⁸＝７．２×１０¹⁶配列を含む）、したがって、配列の非特 異的阻害の程度を測定できる。 実施例３ ＨＩＶ−１阻害アッセイ 以下のアッセイを使用して、本発明のオリゴヌクレオチドのＨＩＶ−１複製阻 害能を測定した。 Ａ．シンシチウム・アッセイ 組織培養における本発明のオリゴヌクレオチドのＨＩＶ−１複製阻害能、いい かえればシンシチウム生成能を、アグラワルとサリン（前出、1991年）の方法に 従ってＴ細胞培養で試験する。簡単に説明すると、まずＣＥＭ細胞を３７℃で１ 時間、ＨＩＶ−１ビリオン（０．０１〜０．１ ＴＣＩＤ₅₀／細胞）に感染させ る。１時間後に吸収されていないビリオンを洗い流し、感染細胞を２４のウエル プレートのウエルに分割する。感染細胞に適当な濃度の（原液からの）オリゴヌ クレオチドを加え、２ｍｌ媒体中で必要な濃度にする。それからその細胞を３日 間培養する。３日目の終わりに、シンシチウムが生成されていないか目視検査す るか、あるいはトリパンブルーまたはＣＴＴで染色して細胞変性効果を決定する 。 Ｂ．ｐ２４発現アッセイ ＨＩＶ発現は、ＣＥＭ細胞におけるウイルス蛋白ｐ２４発現のレベルを測定す ることで明らかにでき、これについては基本的にアグラワルとサリンが述べたと おりである（Adv．Drug Delivery Rev．6巻251〜270頁（1991年））。簡単に説 明すると、まず細胞をペレット化し、それから約１０⁶／ｍｌの濃度でリン酸塩 液中で再懸濁する。細胞をトキソプラスマスライドに点滴し、空気乾燥させてか ら室温（ＲＴ）で１５分間、メタノール／アセトン（１：１）を使って固定する 。それからスライドを室温で３０分間１０％正常ヤギ血清とインキュベート し、リン酸緩衝塩液（ＰＢＳ）で洗浄する。各ウエルに抗ｐ２４モノクロナール 抗体を加えてから、スライドを３７℃の加湿室でインキュベートする。スライド をヤギ抗マウスＩｇＧで３０分間標識してから、ＰＢＳで一晩洗浄する。オリゴ ヌクレオチド処理した細胞と未処理細胞の細胞蛍光率を比較する。 Ｃ．細胞変性効果（ＣＰＥ） ＨＩＶが誘発する細胞変性効果を、感染後の生存細胞数減少を測定して明らか にする。細胞にＭＴＴまたはトリパンブルー染料を加え、染料を取り込んだ（死 亡した）細胞がどのくらいあるか調べて細胞数を計数する。このアッセイは３回 行う。 Ｄ．逆転写酵素アッセイ このアッセイは、基本的にはアグラワルらの述べる方法（Adv．Drug Delivery Rev．6巻251〜270頁（1991年））に従って実施する。オリゴヌクレオチドが存 在した場合と存在しない場合とでウイルス感染した培養物から得た上清液を採取 し、ウイルス粒子をポリ（エチレングリコール）で沈澱させる。ウイルスペレッ トをトリス−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）５０ｍＭ、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）５ ｍＭ、ＫＣｌ ２５０ｍＭ、および２５％トリトン Ｘ−１００を含有する緩衝 液３００μｌに懸濁する。溶解したペレットにおける逆転写酵素活性を、トリス −ＨＣｌ（ｐＨ７．８）５０ｍＭ、ＤＴＴ ５ｍＭ、ＫＣｌ １００ｍＭ、０． ０１％トリトン Ｘ−１００、 テンプレートプライマーとしてｄｔ１５．ｒＡｎ ５μｇ、ＭｇＣｌ₂ １０ｍ Ｍ、［³Ｈ］ｄＴＴＰ １５μＭ（１５Ｃｉ／ｍｍｏｌ）、および崩壊したウイ ルスの懸濁液１０μｌを含有する反応混合液５０μｌでアッセイした。３７℃で １時間インキュベートした後に酵母ｔＲＮＡ ５０μｇを加えてから、βシンチ レーションカウンタで計数して冷トリクロロ酢酸不溶性ＤＮＡ画分への取込み量 をアッセイする。 実施例３ インビトロにおける２５量体による ＨＩＶ−１複製の阻害 多数の確立された細胞系における本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの ＨＩＶ−１感染阻害能は、以下に述べる短期（急性感染）および長期アッセイを 実施することで確定できる。 Ａ．短期（急性感染）アッセイ １．ＣＥＭ細胞 ＣＥＭ細胞（５×１０⁴細胞／ｍｌ）を、３７℃で４時間ＨＩＶ−１（ＨＴＬ Ｖ ＩＩＩＢ株）に感染させる。それから感染細胞と未感染細胞を、２５量体な どのオリゴヌクレオチドまたは活性のない対照オリゴヌクレオチド（たとえば、 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０を有する２０量体）が存在する場合と存在しない場合 とで、３７℃で 最高６日間培養する（３回実施）。試験する２５量体の濃度は０．３２μｇ／ｍ ｌ（０．０５μＭ）、１．００μｇ／ｍｌ（０．２μＭ）、３．２μｇ／ｍｌ（ ０．０４μＭ）、１０μｇ／ｍｌ（１．５μＭ）、３２μｇ／ｍｌ（４μＭ）お よび１００μｇ／ｍｌ（１０．５μＭ）である。ウイルス複製を５０％阻害する ための有効濃度（ＥＣ₅₀）をグラフから求める。実験の後で、ＨＩＶ−１発現レ ベルを、シンシチウム生成アッセイ（表３Ａ）およびｐ２４発現アッセイ（表３ Ｂ）で測定する。前記のようにウエルにＭＴＴを加えた後に比色分析により細胞 毒性を測定する（表３Ｃ）。 これらの結果から、本発明のオリゴヌクレオチドである２５量体は、２０量体 に比べてより低い濃度（１．００μｇ／ｍｌ）でシンシチウム生成を一部（３０ ％）阻害することがわかる。さらに、ウイルス複製を５０％阻害するオリゴヌク レオチドの有効濃度（ＥＣ₅₀）は、２０量体の場合よりも２５量体のほうが低く 、２５量体のほうがより活性が強かった。 ２５量体は２０量体よりも低い濃度で、ｐ２４発現をほぼ５０％減少させるこ とができた。さらに、より高い濃度（１００μｇ／ｍｌ）では、２５量体は２０ 量体の２倍も有効にｐ２４発現を減少させることができ、ＨＩＶ−１発現の阻止 にあたって活性が強いことが示唆された。 表３Ｃ ウイルスの細胞変性効果を低下させるのに必要な２５量体のＥＣ₅₀は、実施し た３種類の実験のいずれにおいても２０量体に比べて有意に低く、２０量体より も細胞毒性が弱いことがわかった。 ２．Ｈ９細胞 Ｈ９細胞を、０．０１−０．１ ＴＣＩＤ₅₀／細胞のＨＩＶ−１（ＨＴＬＶＩ ＩＩ_B株またはＨＴＬＶＩＩＩ_MM株）に３７℃で１時間感染させる。ＴＣＩＤ₅₀ はウイルスの限界希釈によって、Ｈ９細胞を感染させてから２週間培養して決定 した。ＨＩＶ−１の１０倍希釈で４つの培養物を用意する。感染させた後に、吸 収されていないビリオンは洗い流す。感染細胞を様々な濃度（０．００５、０． ０２、０．１３、および０．６μＭ）のオリゴヌクレオチドの存在下で、３７℃ で３ないし４日間培養する。モノクロナール抗体に基づくｐ２４抗原捕捉試験（ デュポン）で上清液中のｐ２４を測定することで、ＨＩＶ−１発現のレベルをモ ニターする。結果は表４にまとめて示す。未感染細胞を２５量体とともに３ない し４日間培養し、コールターカウンターで細胞を計数して細胞毒性を調べる。結 果は同じく表４および図５に示す。 表４ これらの結果から、２５量体はＡＺＴに比べてより低い濃度でｐ２４発現の阻 害に、したがってＨＩＶ−１複製の阻害に有効である。 ３．慢性感染ＣＥＭ細胞 慢性感染したＣＥＭ細胞を、２００、６４および２０μｇ／ｍｌの濃度の２５ 量体存在下で培養する。それから細胞を３７℃で培養する。２４時間および４８ 時間処置してから、処置済み細胞の上清液を取り除き、サリン ら（J．Natl．Cancer Inst．78巻663〜666頁（1987年））が述べる方法で逆転写 酵素（ＲＴ）活性のレベルを定量する。そのレベルを対照未処置感染細胞のＲＴ レベルと比較する。結果を表５に示す。 ヌクレオチド類似体が慢性感染細胞になんら影響を及ぼさないようであるのに 対して、２５量体はこのインビボ系では２日経った後にもＲＴ活性を阻害できた 。 Ｂ．長期感染アッセイ Ｈ９細胞を、０．０１〜０．１ ＴＣＩＤ₅₀／細胞で２時間ＨＩＶ−１（ＨＴ ＬＶＩＩＩ_B）で感染させ、吸収されなかったビリオンを洗い流し、２×１０⁵細 胞／ｍｌまで希釈し、３７℃で培養する。３ないし４日毎に細胞を２×１０⁵／ ｍｌに希釈してから、２５量体また はｄｄＣを５μｇ／ｍｌ（０．７μＭ）含有する新鮮培地で培養する。細胞分割 時に上清液を取り、坑原捕捉アッセイ（デュポン）によりｐ２４発現レベルを測 定する。結果を図７に図示し、また表６にまとめて示す。 これらの結果から、２５量体はｄｄＣに比べてより有効にｐ２４発現を阻害で きる、すなわちＨＩＶ−１複製を阻害でき、長期（＞１０日）にわたってｄｄＣ よりもはるかに活性が強いことがわかる。これは、ヌクレオチド類似体はチオリ ン酸連鎖を有するオリゴヌクレオチド に比べてヌクレアーゼ消化をより受けやすいためであろう。 したがって、本発明のオリゴヌクレオチドは、ＨＩＶ−１複製を阻害するため に考案された他の多くの化学療法薬に比べてより特異的で毒性が少なく、ヌクレ アーゼに対する抵抗性が大きい。さらに、ＨＩＶ−１の３２４から３４８までの ｇａｇ配列よりも少ない配列を含有する他の既知のアンチセンスオリゴヌクレオ チドに比べてウイルス複製阻害活性がより強い。たとえば、配列リストでＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０と示されている２０量体は、本発明の２５量体よりも活性が 弱い。さらに、松倉ら（Prospects for Antisense Nucleic Acid Therapy of Ca ncer and AIDS、Wiley-Liss，Inc.、159〜178頁（1991年））が記述している２ ８量体（図３）は、ｇａｇ領域のうち３２４〜３４８の領域にオーバーラップす る部分に対して相補的であるが、やはりはるかに活性が弱い。これは、リボソー ム結合部位（ＡＵＧ）とそれを隣接する領域が、少なくとも２５ヌクレオチドの 長さがある本発明のオリゴヌクレオチドによってしっかりとマスクされるためだ ろう。同様に、この領域でハイブリッド形成すると、本発明のオリゴヌクレオチ ドはリボソームによって容易に置換されることはなく、したがってＨＩＶ感染を 妨げる。さらに、このｇａｇ領域が保存される結果、逃避突然変異体の生成が回 避される。本発明のオリゴヌクレオチドを他の抗ＨＩＶオリゴヌクレオチドま たは抗ＨＩＶ薬と併用すると、この効果をさらに増強することができる。 関連技術の当業者であれば、通常の実験の範囲を超えるものを使わなくても、 ここで述べた個々の物質や手順と同等のものを多数認識するか、もしくは得られ るであろう。そのような均等物も本発明の対象範囲と思想の範囲内にあると考え られ、本請求の範囲に入る。 配列リスト （１）一般情報： （ｉ）出願人：アグラワル、スジール （ii）発明の名称：治療用抗ＨＩＶ抗ウイルスオリゴ ヌクレオチドとその薬剤処方 （iii）配列の数：１１ （iv）連絡先住所： （A）住所：アルグレッティ アンド ウィット コフ社 （B）通り：１０ サウス ウォッカー ドライブ、 ３０００号室 （C）市：シカゴ （D）州：イリノイ （E）国：アメリカ合衆国 （F）郵便番号：６０６０６ （ｖ）電算機読取可能形式： （A）媒体の種類：フロッピー・デイスク （B）コンピュータ：ＩＢＭ ＰＣ 互換機 （C）オペレーティング・システム： ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ （D）ソフトウェア：ＰａｔｅｎｔＩｎ リリー ス＃１．０、バージョン＃１．２５ （vi）出願データ： （A）出願番号：ＵＳ （B）出願日： （C）分類： （viii）弁理士／代理人に関する情報： （A）氏名：アン ルイス カーナー （B）登録番号：３３，５２３ （C）参照／登録簿番号：９２，６２３ （ix）電話連絡に関する情報： （A）電話番号：６１７−３４５−９１００ （B）ファックス番号：６１７−３４５−９１１１ （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に関する情報 （ｉ）配列の特徴 （A）長さ：２５塩基対 （B）種類・核酸 （C）鎖：１本 （D）位相：線形 （ii）分子の種類：ｃＤＮＡ （iii）仮説的：いいえ （iv）アンチセンス：はい （ix）特性 （A）名称：ＧＥＭ ９０ （B）場所：ＨＩＶ−１ ＤＮＡの塩基対３２４ −３４８に相補的 （xi）配列記述：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１： ＣＴＣＴＣＧＣＡＣＣ ＣＡＴＣＴＣＴＣＴＣ ＣＴＴＣＴ （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に関する情報 （ｉ）配列の特徴 （A）長さ：２６塩基対 （B）種類：核酸 （C）鎖：１本 （D）位相：線形 （ii）分子の種類：ｃＤＮＡ （iii）仮説的：いいえ （iv）アンチセンス：はい （ix）特性 （B）場所：ＨＩＶ−１ ＤＮＡの塩基対３２３ −３４８に相補的 （xi）配列記述：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２： ＣＴＣＴＣＧＣＡＣＣ ＣＡＴＣＴＣＴＣＴＣ ＣＴＴＣＴＡ （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に関する情報 （ｉ）配列の特徴 （A）長さ：２６塩基対 （B）種類・核酸 （C）鎖：１本 （D）位相：線形 （ii）分子の種類：ｃＤＮＡ （iii）仮説的：いいえ （iv）アンチセンス：はい （ix）特性 （B）場所：ＨＩＶ−１ ＤＮＡの塩基対３２４ −３４９に相補的 （xi）配列記述：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３： ＧＣＴＣＴＣＧＣＡＣ ＣＣＡＴＣＴＣＴＣＴ ＣＣＴＴＣＴ （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に関する情報 （ｉ）配列の特徴 （A）長さ：２７塩基対 （B）種類：核酸 （C）鎖：１本 （D）位相：線形 （ii）分子の種類：ｃＤＮＡ （iii）仮説的：いいえ （iv）アンチセンス：はい （ix）特性 （B）場所：ＨＩＶ−１ ＤＮＡの塩基対３２３ −３４９に相補的 （xi）配列記述：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４： ＧＣＴＣＴＣＧＣＡＣ ＣＣＡＴＣＴＣＴＣＴ ＣＣＴＴＣＴＡ （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に関する情報 （ｉ）配列の特徴 （A）長さ：２８塩基対 （B）種類：核酸 （C）鎖：１本 （D）位相：線形 （ii）分子の種類：ｃＤＮＡ （iii）仮説的：いいえ （iv）アンチセンス：はい （ix）特性 （B）場所：ＨＩＶ−１ ＤＮＡの塩基対３２２ −３４９に相補的 （xi）配列記述：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５： ＧＣＴＣＴＣＧＣＡＣ ＣＣＡＴＣＴＣＴＣＴ ＣＣＴＴＣＴＡＧ （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に関する情報 （ｉ）配列の特徴 （A）長さ．２８塩基対 （B）種類：核酸 （C）鎖：１本 （D）位相：線形 （ii）分子の種類：ｃＤＮＡ （iii）仮説的：いいえ （iv）アンチセンス：はい （ix）特性 （B）場所：ＨＩＶ−１ ＤＮＡの塩基対３２３ −３５０に相補的 （xi）配列記述：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６： ＣＧＣＴＣＴＣＧＣＡ ＣＣＣＡＴＣＴＣＴＣ ＴＣＣＴＴＣＴＡ （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に関する情報 （ｉ）配列の特徴 （A）長さ：２９塩基対 （B）種類：核酸 （C）鎖：１本 （D）位相：線形 （ii）分子の種類：ｃＤＮＡ （iii）仮説的：いいえ （iv）アンチセンス：はい （ix）特性 （B）場所：ＨＩＶ−１ ＤＮＡの塩基対３２２ −３５０に相補的 （xi）配列記述：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７： ＣＧＣＴＣＴＣＧＣＡ ＣＣＣＡＴＣＴＣＴＣ ＴＣＣＴＴＣＴＡＧ （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に関する情報 （ｉ）配列の特徴 （A）長さ：３０塩基対 （B）種類：核酸 （C）鎖：１本 （D）位相：線形 （ii）分子の種類：ｃＤＮＡ （iii）仮説的：いいえ （iv）アンチセンス：はい （ix）特性 （B）場所：ＨＩＶ−１ ＤＮＡの塩基対３２１ −３５０に相補的 （xi）配列記述：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８： ＣＧＣＴＣＴＣＧＣＡ ＣＣＣＡＴＣＴＣＴＣ ＴＣＣＴＴＣＴＡＧＣ （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に関する情報 （ｉ）配列の特徴 （A）長さ：３０塩基対 （B）種類：核酸 （C）鎖：１本 （D）位相：線形 （ii）分子の種類：ｃＤＮＡ （iii）仮説的：いいえ （iv）アンチセンス：はい （ix）特性 （B）場所：ＨＩＶ−１ ＤＮＡの塩基対３２２ −３５１に相補的 （xi）配列記述：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９： ＡＣＧＣＴＣＴＣＧＣ ＡＣＣＣＡＴＣＴＣＴ ＣＴＣＣＴＴＣＴＡＧ （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に関する情報 （ｉ）配列の特徴 （A）長さ：２０塩基対 （B）種類：核酸 （C）鎖：１本 （D）位相：線形 （ii）分子の種類：ｃＤＮＡ （iii）仮説的：いいえ （iv）アンチセンス：はい （ix）特性 （A）名称：ＧＥＭ ９０ （B）場所：ＨＩＶ−１ ＤＮＡの塩基対３２７ −３４６に相補的 （xi）配列記述：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０： ＣＴＣＧＣＡＣＣＣＡ ＴＣＴＣＴＣＴＣＣＴ （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に関する情報 （ｉ）配列の特徴 （A）長さ：７０塩基対 （B）種類：核酸 （C）鎖：１本 （D）位相：線形 （ii）分子の種類：ゲノムＲＮＡに対するｃＤＮＡ （iii）仮説的：いいえ （iv）アンチセンス：いいえ （vi）由来：ＨＩＶ−１ （viii）ゲノムにおける位置：３１１−３８０ （xi）配列記述：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１： ＡＣＴＡＧＣＧＧＡＧ ＧＣＴＡＧＡＡＧＧＡ ＧＡＧＡＧＡＴＧＧＧ ＴＧＣＧＡＧＡＧＣＧ ＴＣＡＧＴＡＴＴＡＡ ＧＣＧＧＧＧＧＡＧＡ ＡＴＴＡＧＡＴＣＧＡ

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 9453−4Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＺ，ＦＩ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，Ｌ Ｖ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＶＮ (72)発明者 タン、 ジン−ヤン アメリカ合衆国 01604 マサチューセッ ツ州 ワーセスター ナンバー２エル ウ ェルズ ストリート 16

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． ＨＩＶ−１ゲノムの保存ｇａｇ領域の少なくとも３２４から３４８までの ヌクレオチドに対してハイブリッド形成するヌクレオチド配列を有するオリゴヌ クレオチドで、オリゴヌクレオチドは少なくとも１つの非リン酸ジエステルのヌ クレオチド間連鎖により連結される約２５から３０のヌクレオチドを有するオリ ゴヌクレオチドであって、その連鎖によりヌクレアーゼ消化に対する抵抗性がも たらされているオリゴヌクレオチド。 ２． 非リン酸ジエステルのヌクレオチド間連鎖の少なくとも１つがチオリン酸 連鎖である、請求の範囲第１項に記載のオリゴヌクレオチド。 ３． オリゴヌクレオチドが２５のヌクレオチドである、請求の範囲第２項に記 載のオリゴヌクレオチド。 ４． 配列リストでＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として示されるヌクレオチド配列を 有する、請求の範囲第３項に記載のオリゴヌクレオチド。 ５． オリゴヌクレオチドが２６のヌクレオチドである、請求の範囲第２項に記 載のオリゴヌクレオチド。 ６． 配列リストでＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２として示されるヌクレオチド配列を 有する、請求の範囲第５項に記載のオリゴヌクレオチド。 ７． 配列リストでＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３として示されるヌクレオチド配列を 有する、請求の範囲第５項に記 載のオリゴヌクレオチド。 ８． オリゴヌクレオチドが２７のヌクレオチドである、請求の範囲第２項に記 載のオリゴヌクレオチド。 ９． 配列リストでＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４として示されるヌクレオチド配列を 有する、請求の範囲第８項に記載のオリゴヌクレオチド。 １０． オリゴヌクレオチドが２８のヌクレオチドである、請求の範囲第２項に 記載のオリゴヌクレオチド。 １１． 配列リストでＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５として示されるヌクレオチド配列 を有する、請求の範囲第１０項に記載のオリゴヌクレオチド。 １２． 配列リストでＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６として示されるヌクレオチド配列 を有する、請求の範囲第１０項に記載のオリゴヌクレオチド。 １３． オリゴヌクレオチドが２９のヌクレオチドである、請求の範囲第２項に 記載のオリゴヌクレオチド。 １４． 配列リストでＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７として示されるヌクレオチド配列 を有する、請求の範囲第１３項に記載のオリゴヌクレオチド。 １５． オリゴヌクレオチドが３０のヌクレオチドである、請求の範囲第２項に 記載のオリゴヌクレオチド。 １６． 配列リストでＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８として示されるヌクレオチド配列 を有する、請求の範囲第１５項に記載のオリゴヌクレオチド。 １７． 配列リストでＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９として示 されるヌクレオチド配列を有する、請求の範囲第１５項に記載のオリゴヌクレオ チド。 １８． 生理学的に受け入れられる担体中における請求の範囲第１項に記載のオ リゴヌクレオチドから成る治療用組成物。 １９． 生理学的に受け入れられる担体中における請求の範囲第４項に記載のオ リゴヌクレオチドから成る治療用組成物。 ２０． 第１および第２の抗ＨＩＶ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドから成 る治療用組成物で、第１のオリゴヌクレオチドが請求の範囲第１項に記載のオリ ゴヌクレオチドである治療用組成物。 ２１． ＨＩＶ−１の増殖を阻害する方法であって、 （ａ）生理学的に受け入れられる担体中における請求の範囲第１項に記載のオ リゴヌクレオチドから成る治療用組成物を提供する段階と； （ｂ）感染細胞のあらゆるＨＩＶ−１プロウイルスＤＮＡまたはｍＲＮＡのｇ ａｇ領域にオリゴヌクレオチドを結合させるのに十分な量の治療用組成物によっ てＨＩＶ−１感染細胞を処置し、それによってＨＩＶ−１ ＤＮＡまたはｍＲＮ Ａに結合したオリゴヌクレオチドがＨＩＶ−１の増殖を阻害する段階と； を備えるＨＩＶ−１の増殖を阻害する方法。 ２２． 治療用組成物を提供する段階が、少なくとも１つのチオリン酸連鎖によ り結合された２５のヌクレオチ ドを有するオリゴヌクレオチドであって、オリゴヌクレオチドの配列は配列リス トでＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として示されているオリゴヌクレオチドを提供する ことを備えている請求の範囲第２１項に記載のＨＩＶ−１の増殖を阻害する方法 。 ２３． 哺乳類におけるＨＩＶ−１感染を治療する方法であって、 （ａ）生理学的に受け入れられる担体中における請求の範囲第１項に記載のオ リゴヌクレオチドから成る治療用組成物を提供する段階と； （ｂ）感染細胞のあらゆるＨＩＶ−１プロウイルスＤＮＡまたはｍＲＮＡのｇ ａｇ領域にオリゴヌクレオチドを結合させるのに十分な量の治療用組成物でＨＩ Ｖ−１感染細胞を処置し、それによってＨＩＶ−１ ＤＮＡまたはｍＲＮＡに結 合したオリゴヌクレオチドが哺乳類におけるＨＩＶ−１ ＤＮＡの発現および複 製を阻害する段階と； を備える哺乳類におけるＨＩＶ−１感染を治療する方法。 ２４． 治療用組成物を提供する段階が少なくとも１つのチオリン酸連鎖により 結合された２５のヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドであって、オリゴヌ クレオチドの配列が配列リストでＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として示されているオ リゴヌクレオチドを提供することを備えている請求の範囲第２３項に記載の哺乳 類におけるＨＩＶ−１感染を治療する方法。