CZ85495A3 - Oligonucleotide, therapeutical preparation based thereon and inhibition method of hiv-1 proliferation - Google Patents

Oligonucleotide, therapeutical preparation based thereon and inhibition method of hiv-1 proliferation Download PDF

Info

Publication number
CZ85495A3
CZ85495A3 CZ95854A CZ85495A CZ85495A3 CZ 85495 A3 CZ85495 A3 CZ 85495A3 CZ 95854 A CZ95854 A CZ 95854A CZ 85495 A CZ85495 A CZ 85495A CZ 85495 A3 CZ85495 A3 CZ 85495A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
oligonucleotide
hiv
seq
nucleotides
oligonucleotides
Prior art date
Application number
CZ95854A
Other languages
English (en)
Inventor
Sudhir Agrawal
Jin Yan Tang
Original Assignee
Hybridon
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hybridon filed Critical Hybridon
Publication of CZ85495A3 publication Critical patent/CZ85495A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1131—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses
    • C12N15/1132—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses against retroviridae, e.g. HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7125—Nucleic acids or oligonucleotides having modified internucleoside linkage, i.e. other than 3'-5' phosphodiesters
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates

Description

Oligonukleotid, terapeutický prostředek na jeho bázi a způsob inhibice proliferace HIV-1
Oblast technikv
Vynález se týká léčby infekce HIV-1. Zejména se týká chemoterapeutických činidel, která jsou označována názvem antimediátorové oligonukleotidy a farmaceutických prostředků obsahujících tyto oligonukleotidy. Dále se vynález týká také způsobu inhibice replikace HIV a způsobu léčby infekce způsobené HIV-1 za použití těchto antimediátorových oligonukleotidú.
Dosavadní stav technikv
Leukemický lymfotropní virus humánních T-buněk typu III (HTLV-III), nyní častěji označovaný názvem virus humánní imunodeficience typu 1 (HIV-1), je považován za etiologické činidlo syndromu získané imunitní deficience (AIDS). Tento virus je součástí čeledi Retroviridaie, jejíž příslušníci obsahují genom RNA a vykazují aktivitu reversní transkriptasy. Během růstového cyklu kopírují tyto retroviry svou RNA do provirové DNA. Provirová DNA je schopna se integrovat do chromosomové DNA hostitelské buňky, v níž využívá transkripčního a translačního mechanismu hostitele pro expresi virové RNA a proteinů. Viry jsou uvolňovány z buňky vymýváním z cytoplasmické membrány. V případě HIV-1 má replikace viru za následek smrt pomocných (helper) hostitelských T-buněk, což vede ke stavu závažné imunitní nedostatečnosti, k vývoji různých malignancí a postižení náhodnými infekcemi a nakonec ke smrti infikovaného organismu.
Vzhledem k tomu, že nebyla vyvinuta žádná dlouhodobě úspěšná preventivní ani kurativní léčba, přerostl výskyt AIDS v mnoha zemích do epidemických rozměrů. S několika málo terapeutickými činidly, které jsou pro léčbu předepisovány, jako jsou nukleosidové analogy 3'-azido-31-deoxythymidin (AZT), dideoxyinosin (ddl) a dideoxycytosin (ddC), byl zaznamenán jen omezený úspěch. Je tomu tak z části proto, že tato činidla jsou cytotoxická. Kromě toho, některé viry uniknou působení těchto látek díky mutacím, které 'je činí insensitivními k těmto činidlům a obtížnosti antivirového působení způsobené schopností viru integrovat se do genomu hostitele. Existuje proto dlouho pociťovaná potřeba nalézt účinnější terapeutická činidla a vyvinout preventivní léčbu proti AIDS.
Nedávno byla vyvinuta nová chemoterapeutická činidla, která jsou schopna modulovat expresi buněk a cizích genů. Tato činidla označovaná obvykle názvem antimediátorové oligonukleotidy (antisense oligonucleotides) se vážou k cílovým molekulám jednořetězcové nukleové kyseliny podle Watson-Crickova nebo Hoogsteinova pravidla párování bází, a přitom likvidují funkci cílových molekul jedním z několika mechanismů: tím, že zabraňují vazbě faktorů, které jsou potřebné pro normální translaci nebo transkripci; v případě mRNA cíle tím, že spouštějí enzymatickou destrukci informace prostřednictvím RNasy H; nebo tím, že ničí cíl prostřednictvím reaktivních skupin přímo připojených k antimediátorovému oligonukleotidů.
Antimediátorové oligonukleotidy byly vyvinuty pro specifickou inhibici exprese HIV-1 a jiných virů (viz například Agrawal (1992) Trends in Biotechnology 10: 152 až 158; Agrawal et al. v Gene Regulation: Biology of Antisense RNA and DNA (Erickson and Izant, eds.) Raven Press Ltd., New York (1992), str. 273 až 283); Matsukura et al. v Prospects of Antisense Nucleic Acid Therapy of Cancer and AIDS, WileyLiss, lne. (1992), str. 159 až 178; a Agrawal (1991) v Prospects of Antisense Nucleic Acid Therapy of Cancer and AIDS, (Wickstrom, ed.), Liss, New York, str. 145 až 148).
Tak například bylo zjištěno, že antimediátorové oligonukleotidy obsahující nemodifikované fosfodiesterové internukleotidové vazby a sekvence, které jsou komplementární k částem ribonukleové kyseliny (RNA) genomu HIV-1, inhibují replikaci viru v nedávno (akutně) infikovaných buňkách (Zamecnik at al. (1986) Proč. Acad. Sci. USA 83: 4143 až 4147; Goodchild et al. (1988) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85: 5507 až 5511). Tyto molekuly jsou však méně schopné inhibovat replikaci viru v chronicky infikovaných buňkách (Agrawal et al.
(1989) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86: 7790 až 7794), hlavně proto, že jsou citlivé vůči působení nukleasy (Wickstrom (1986) J. Biochem. Biophys. Meth. 13: 97 až 102). Proto byly vyvinuty chemicky modifikované analogy resistentní vůči nuklease, které účinně inhibují replikaci HIV-l v tkáňových kulturách (Sarin et al. (1988) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85: 7448 až 7451; Agrawal et al. (1988) Proč. Nati. Acad.
Sci. USA 85: 7079 až 7083; Matsukura et al. (1988) Gene 72: 343 až 347). Tyto analogy, které zahrnují oligonukleotidy obsahující fosforothioátové internukleotidové vazby odolné proti působení nukleasy, inhibují replikaci HIV-1 jak u akutně infikovaných (Agrawal et al. (1989) Proč. Nati.
Acad. Sci. USA 86: 7790 až 7794), tak u chronicky infikovaných buněčných linií (Agrawal et al. (1991) v Gene Regulation: Biology of Antisense RNA, eds. Erickson et al. (Raven Press, New York) str. 273 až 284; Vickers et al.
(1991) Nucleic Acids Res. 19: 3359 až 3368; Matsukura et al. (1989), Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86: 4244 až 4248; Agrawal et al. (1988) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85: 7079 až 7083). Stále však zůstává potřeba nalézt účinnější oligonukleotidy proti HIV, které by vykazovaly terapeutické účinky, aniž by byly doprovázeny toxicitou vůči buňkám nebo jejichž buněčná toxicita by byla nízká.
Podstata vynálezu
Byla vyvinuta nová chemoterapeutická činidla inhibuj ící replikaci HIV-1. Těmito činidly jsou syntetické oligonukleotidy obsahující nefosfodiesterové internukleotidové vazby a vykazující nukleotidovou sekvenci, 'která je komplementární k části konzervované oblasti gag genomu HIV-l. Gag je součástí strukturního genu HIV-l, který je společný pro všechny retroviry. Je známo, že sekvence umístěné okolo iniciačního kodonu gag jsou důležité pro sbalování viru (packaging). Antimediátorový oligonukleotid působí tím, že se váže k cílové DNA nebo RNA a tím inhibuje iniciaci replikace DNA a exprese DNA a také inhibuje sbalování viru rozbitím sekundární struktury jeho DNA.
Oligonukleotidy podle vynálezu jsou specifičtější, méně toxické a resistentnéjší vůči nuklease, než mnohá jiná chemoterapeutická činidla navržená pro inhibici replikace HIV-1. Sloučeniny podle vynálezu, které obsahují nefosfodiesterové vazby jsou zejména resistentnéjší vůči nukleolytické degradaci než sloučeniny obsahující výhradně fosfodiesterové vazby. Kromě toho jsou účinnější při inhibici replikace viru než jiné známé antimediátorové oligonukleotidy obsahující nukleotidovou sekvenci, která je komplementární k menší sekvenci než 3 24 až 348 HIV-1 gag.
V nej širším smyslu je předmětem vynálezu antimediátorový oligonukleotid vykazující nukleotidovou sekvenci 25 až 30 nukleotidů, která se hybridizuje přinejmenším k nukleotidům 324 až 348 oblasti gag HIV-1.
V jednom přednostním provedení tohoto vynálezu obsahují oligonukleotidy také alespoň jednu fosforothioátovou internukleotidovou vazbu. Takové fosforothioátové vazby obsahují substituci síry za kyslík, čímž je oligonukleotidu dodána resistence vůči nukleolytické degradaci.
V dalším provedení je předmětem vynálezu oligonukleotid obsahující 25 nukleotidů, na jejichž spojení se podílí alespoň jedna fosforothioátová internukleotidová vazba. Tento oligonukleotid je označován názvem 25-mer. Nukleotidová sekvence tohoto 25-meru je uvedena pod označením SEQ ID NO:1 v seznamu sekvencí uvedených dále.
V dalších provedeních jsou předměty vynálezu fosforothioátové oligonukleotidy obsahující 26, 27, 28, 29 nebo 30 nukleotidů, jejichž sekvence jsou komplementární k nukleotidům 324 až 348 HIV-1 kromě jiných lemujících nukleotidů. Sekvence dvou přednostních 26-merů jsou uvedeny v seznamu sekvencí uvedeném dále pod označením SEQ ID NO:2 a SEQ ID NO:3. Sekvence přednostního 27-meru je označena jako SEQ ID NO:4, sekvence přednostních 28-merů jsou označeny jako SEQ ID NO: 5 a SEQ ID NO: 6, sekvence přednostního 29meru je označena jako SEQ ID NO:7 a sekvence přednostních 30-merú jsou označeny jako SEQ ID NO:8 a SEQ ID NO:9.
Předmětem vynálezu jsou také terapeutické prostředky, jejichž podstata spočívá v tom, že obsahují výše popsaný oligonukleotid ve fyziologicky vhodném nosiči. Dále je předmětem vynálezu způsob inhibice proliferace HIV-1 a způsob léčby infekce HIV-1 u savců za použití těchto prostředků.
Následuje podrobnější popis přednostních provedení tohoto vynálezu.
Předmětem vynálezu jsou antimediátorové oligodeoxynukleotidy s nefosfodiesterovou internukleotidovou vazbou, které jsou obzvláště účinné při inhibiči replikace HIV-1 a které jsou odolnější vůči nukleasovému štěpení, než oligonukleotidy s fosfodiesterovými internukleotidovými vazbami. Antimediátorové oligodeoxynukleotidy podle vynálezu jsou také méně toxické než jiná chemoterapeutická činidla proti HIV. Tyto oligonukleotidy (SEQ ID NO;1 až 9) jsou zacíleny na oblast okolo iniciačního kodonu gag genomu HIV-l. Bylo ukázáno, že sekvence umístěné v této oblasti jsou důležité pro sbalování viru. Tyto sekvence vytvářejí stabilní sekundární strukturu (Harrison et al. (1991) v RNA Tumor Viruses (Coffin et al., eds.) Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, str. 135). Oligonukleotidy. podle vynálezu jsou navrženy tak, aby se vázaly k této oblasti a tím ničily její přirozenou stabilitu, což se nakonec projevuje v inhibici sbalování viru a translace gag mRNA.
Tyto oligonukleotidy jsou komplementární přinejmenším k sekvenci 324 až 348 oblasti gag (SEQ ID NO: 11) HIV-1 (obr. 2) (Muessing et al. (1985) Nátuře (Londýn) 313: 450 až 458). Sekvence 324 až 348 je velmi konzervována mezi kmeny HIV-1, jak je to zřejmé dále z tabulky 1.
Tabulka 1
Sekvence
324-348 - TCTTCCTCTCTCTACCCACGCTCTC
Konvenční - CGGAGGCTAGAAGGAGAGAOATGGGTGCGAGAGCGTCAGTA
Km-en
Qí HIVcl
HTLV3/LLAV
HIVLAI
HIVNL43
HIVMN
HIVJH3
HIVOYI
HIVCDC4
HIVRF
HIVMAL
HIVU455
HIVSF2
HIVNDK
G
G
G
G
G
G
G
G
G
A (GA) 4G G
A
A
G
G
A
A
A
A
A(Africký)
A CCTCAG(Ugandský)
G
A
Zaměření antimediátorového oligonukleotidu na takovou konzervovanou oblast obsahující aktivní gen umožňuje účinné inhibovat proliferaci HIV bez toho, že by mohly vzniknout únikové mutanty. Únikové mutanty vznikají, když k mutaci dojde v oblasti genomu, na kterou je zaměřen antimediátorový oligonukleotid. Častěji vznikají v nekódujících oblastech (jako je oblast SA HIV-1) než v oblastech kódujících protein.
Nukleotidové sekvence oligonukleotidů podle vynálezu jsou vždy komplementární přinejmenším k nukleotidům 3 24 až 348 genomu HIV-1. V jednom provedení je předmětem tohoto vynálezu oligonukleotid, který se v podstatě skládá z této sekvence a který je dále označován názvem 25-mer. Sekvence tohoto 25-meru je uvedena jako SEQ ID NO:1 v seznamu sekvencí uvedeném dále. Jiné nárokované oligonukleotidy se schopností inhibovat replikaci HIV-l obsahují sekvenci 25-meru lemovanou v 3' a/nebo 5' směru přídavnými nukleotidy, které jsou komplementární k nukleotidům lemujícím oblast 324 až 348 HIV-1. Sekvence těchto oligonukleotidů jsou uvedeny v tabulce 2 a v seznamu sekvencí uvedeném dále pod označením SEQ ID NO:2 až 9. Pro srovnání je zde také uvedena sekvence 20-meru (Agrawal et al. (1992) Gene Regulation: Biology of Antisense DNA and RNA (Erickson and Izant, eds.) Raven Press Ltd., New York, strana 273 až 283 (SEQ ID NO:10).
glis&nuklsalid.
Tabulka 2
SEQ ID _Sekvence_ __H?.i„
25aer 5'-crCTCGCACCCATCTCTCTCCTTCT-3' 1 26aer CTCTCGCACCCATCTCTCTCCTTCTA 2 26mer GCTCTCGCACCCATCTCTCTCCTTCT 3 27aer GCTCTCGCACCCATCTCTCTCCTTCTA 4 28a«r GCTCTCGCACCCATCTCTCTCCTTCTAG 5 2 3 aer CGCTCTCGCACCCATCTCTCTCCTTCTA 6 29aer CGCTCTCGCACCCATCTCTCTCCTTCTAGC 7 30»·Γ ACGCTCTCGCACCCATCTCTCTCCTTCTAG 3 30aer ACGCTCTCGCACCCATCTCTCTCCTTCTAGC 9 20β·Γ TCCTCTCTCTACCCACGCTC 10
Modifikované oligonukleotidy, jako ty z nich, které obsahují umělé internukleotidové vazby odlišné od fosforothioátových vazeb, podle vynálezu jsou také účinnými inhibitory proliferace HIV-1. Z jiných známých umělých vazeb je možno uvést methylfosfonátové, fosforamidátové, dithioátové, přemostěné fosforothioátové, přemostěné fosforamidátové, sulfonové, sulfátové vazby, ketovazby, fosfátoesterové vazby a fosforbutylaminové vazby (viz například van der Krol et al. (1988) Biotech 6: 958 až 976; a Uhlmann et al. (1990) Chem. Rev. 90: 543 až 585). Užitečné jsou dále též fosforothioátové a jiné umělé oligonukleotidy obsahující přídavné struktury, které jim udělují resistenci proti nuklease, jako jsou sloučeniny s blokovaným 3' a nebo 5' koncem (viz například patentová přihláška USA SN 07/698,568; Letsinger et al. (1989) Biochem. 86: 6553 až 6556; a Reed et al. (1991) Bioconjugate Chem. 2: 217 až 225) a chimérické oligonukleotidy (viz US patent č. 5 149 797), jakož i hybridní oligonukleotidy obsahující oblasti RNA a DNA. Z jiných modifikací udělujících nukleotidům podle vynálezu resistenci vůči nuklease je možno uvést 3'-terminální sekvence, které jsou vzájemně interně komplementární, čímž vzniká na konci struktury dvouřetězcová smyčka. Samozřejmě je také možno provádět jiné modifikace oligonukleotidú, které mají za následek zvýšení resistence vůči nuklease, zvýšení specifičnosti a účinnosti a snížení cytotoxicity.
Oligonukleotidy podle vynálezu je možno syntetizovat různými známými postupy za použití metod v pevné fázi s využitím fosforamiditové nebo H-fosfonátové chemie (viz například Agrawal et al. (1992) Ann. New York Acad. Sci. (v tisku); Agrawal (1991) TIBTECH 10: 152 až 158) a je možno je purifikovat metodou chromatografie s obrácenými fázemi, ionexové chromatografie HPLC nebo hybridizačními afinitními chromatografickými postupy (viz například Metelev a Agrawal (1992) Annal. Biochem. 200: 342 až 346). Studie mechanismu a účinnosti antimediátorových oligonukleotidú při inhibici replikace viru je možno účinně napodobit v několika systémech in vitro. V jednom systému se používá chronicky infikovaných humánních T-lymfocytů, jako buněk CEM. V tomto systému se infikované buňky kultivují za nepřítomnosti nebo v přítomnsti různých koncentraci antimediátorového oligonukleotidu podle vynálezu po měnící se dobu. Nukleotidové analogy, jako je AZT, ddl a ddc neinhibují replikaci HIV v tomto systému na rozdíl od oligonukleotidú podle vynálezu.
Poněvadž však chronicky infikované buňky jsou CD4-, nemůže dojít k reinfekci. Proto taková kultura in vitro nesimuluje dostatečně podmínky in vivo, které se vyskytují u osoby infikované HIV, kde pouze malý procentický podíl buněk CD4+ je infikován a produkuje virus. Buněčná kultura s akutní a nízkomultiplicitní infekcí (MOI) představuje model pro studie účinků léčiv, který se těsněji blíží podmínkám in vivo. V tomto systému pouze zlomek buněčné populace obsahuje virus, zatímco ostatní buňky jsou neinfikovány a jsou CD4+.
Humánní T-buněčné linie, jako jsou CEM nebo H9 (ATCC HTB 176) se infikují HIV po dobu jedné až několika hodin a potom kultivují za nepřítomnosti nebo přítomnosti měnící se koncentrace oligonukleotidu po různou dobu.
Schopnost oligonukleotidu inhibovat replikaci HIV-1 je možno měřit stanovením hladiny exprese HIV a cytotoxického účinku oligonukleotidů na infikované buňky. Expresi HIV je možno monitorovat na základě řady parametrů, jako je tvorba syncytií, exprese proteinu p24, exprese proteinu pl7 a aktivita reversní transkriptasy (viz Agrawal et al. (1991) Adv. Drug Delivery Rev. 6: 251 až 270; Sarin et al. (1985) Biochem. Pharmacol 34: 4075 až 4079; a Sarin et al. (1987)
J. Nati. Cancer Instl. 78: 663 až 666). Inhibice virového cytopathického účinku (CPE) pomocí oligonukleotidů je možno studovat metodou exkluse MTT nebo trypanové modři.
Oligonukleotidů podle vynálezu se může používat pro inhibici proliferace HIV-1 v infikovaných buňkách. Pro tuto inhibici se hodí terapeutické prostředky obsahující antimediátorový oligonukleotid podle vynálezu ve fyziologicky vhodném nosiči. Buňky infikované HIV-1 se přitom léčí terapeutickým prostředkem v takovém množství, které postačuje pro vazbu oligonukleotidu k oblasti gag provirové DNA a/nebo mRNA HIV-1 v infikovaných buňkách. Díky této vazbě oligonukleotidu k DNA nebo mRNA HIV-1 je inhibována exprese a replikace tohoto viru.
Oligonukleotidů podle vynálezu se také může používat pro léčbu infekcí HIV-1 u savců. Pro tuto léčbu se hodí terapeutické prostředky obsahující antimediátorový oligonukleotid podle vynálezu ve fyziologicky vhodném nosiči. Savci infikovaní HIV-1 se přitom léčí terapeutickým prostředkem v takovém množství, které postačuje pro vazbu oligonukleotidu k oblasti gag provirové DNA a/nebo mRNA
-, 11
HIV-1 v infikovaných buňkách. Díky této vazbě oligonukleotidu k DNA nebo mRNA HIV-1 je inhibována exprese a replikace tohoto viru.
Pod pojmem fyziologicky vhodný nosič se rozumějí kterákoliv činidla z řady rozpouštědel, dispergačních médií, povlakotvorných látek, antibakteriálních a antifungálních činidel, isotonických činidel, činidel zpožďujících absorpci apod. Používání takových médií a činidel pro farmaceuticky účinné látky je v tomto oboru dobře známo. Do rozsahu tohoto vynálezu spadají terapeutické prostředky zahrnující kombinace účinné přísady se všemi takovými médii a činidly, za předpokladu, že jsou tato média a činidla kompatibilní s účinnou přísadou. Do prostředků podle vynálezu se také mohou přidávat přídavné účinné přísady a i tato alternativa spadá do rozsahu vynálezu.
Stanovení účinných dávek oligonukleotidů podle vynálezu a způsobů jejich podávání při léčbě AIDS se může provést rutinními pokusy. Z farmaceutických forem, které se hodí pro injekční použití, je možno uvést sterilní vodné roztoky nebo disperse a sterilní prášky pro pozdější výrobu sterilních injekčních roztoků nebo dispersí. Ve všech případech musí být zvolená forma sterilní a musí být stálá za podmínek výroby a skladování. Takové farmaceutické formy je možno chránit proti kontaminačnímu působení mikroorganismů jako jsou bakterie a houby. Nosičem může být rozpouštědlo nebo dispergační médium. Působení mikroorganismů je možno předcházet přídavkem různých antibakteriálních a antifungálních činidel. Prodloužené absorpce injekčních terapeutických prostředků je možno dosáhnout spolupoužitím směsí nebo činidel zpožďujících absorpci.
Oligonukleotidy podle vynálezu v nosiči je možno podávat v podobě intravenosních nebo intraperitoneálních injekcí, ale také je možno použít intranasálního, orálního, transdermálního nebo subkutánního podávání.
Sterilní injekční roztoky se vyrábějí smísením oligonukleotidu s požadovaným množstvím vhodného rozpouštědla, po němž následuje filtrační sterilizace.
HIV vykazuje vysokou rychlost mutace, a proto všechna léčiva navržená pro léčbu virových infekcí, včetně antimediátorových oligonukleotidů, mohou indukovat tvorbu únikových mutantů. Pro překonání tohoto problému je při léčbě pacientů infikovaných HIV navrhována kombinovaná chemoterapie. Tato terapie zahrnuje použití většího počtu léčiv zaměřených proti různým cílům. Tak například je možno inhibitory reversní transkriptasy kombinovat s inhibitory proteasy. Alternativně lze při léčbě používat antimediátorových oligonukleotidů zaměřených na odlišné sekvence, přičemž takové oligonukleotidy se podávají v kombinaci nebo postupně, což má za následek odlišné selekční tlaky na virus, který má málo času pro vývoj únikových mutantů. Při této metodě se první léčba provádí pomocí směsi oligonukleotidů podle vynálezu a potom následuje postupné podávání oligonukleotidů zaměřených na jiné konzervované oblasti genomu HIV-1.
Vynález je blíže objasněn v následujících příkladech provedení. Tyto příklady mají výhradně ilustrativní charakter a rozsah vynálezu v žádném ohledu neomezují.
Příklady provedeni vvnálezu
Příklad 1
Syntéza oligonukleotidových fosforothioátů
Fosforothioátem modifikované oligodeoxynukleotidy se syntetizují pomocí H-fosfonátové chemie za použití automatizovaného syntetizátoru (Millipoře 8 700, Bedford, MA,
USA) v měřítku 5 až 10 mmol. Po sestavení požadované sekvence se CPG-vázaný oligonukleotid H-fosfonát oxiduje sírou v systému pyridin/triethylamin/sirouhlík, aby se vytvořily fosforothioátové vazby. Deprotekce se provede v koncentrovaném amoniaku při 40C během 48 hodin. Purifikace se provádí preparativní chromatografií na obrácených fázích, po níž následuje ionexová chromatografie. Nakonec se purifikované oligonukleotidy dialyzují proti vodě a lyofilizují. Oligonukleotidové fosforothioáty se zkoušejí na čistotu pomocí HPLC a PAGE (Agrawal et al. (1989) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86: 7790 až 7794).
Jako srovnávacího oligonukleotidu se při těchto experimentech použije fosforothioátového 20-meru, jehož nukleotidová sekvence (SEQ ID NO:10) je komplementární k části oblasti gag (nukleotidy 327 až 346) genomu HIV-1 (viz SEQ ID NO:11). Podobně jako oligonukleotidy podle vynálezu obsahuje i tento 20-mer fosforothioátové internukleotidové vazby. Jak je však zřejmé z experimentů uvedených dále, má tento 20-mer nižší inhibiční účinnost proti HIV-1 než nukleotidy podle vynálezu.
Příklad 2
Specifičnost antimediátorových a kontrolních oligonukleotidů
Při stanovení specifičnosti antimediátorových oligonukleotidů je jejich biologický účinek možno srovnávat s biologickým účinkem stejně velkého oligonukleotidu, který není komplementární k žádnému známému buněčnému nebo virovému genu. Byly zvoleny tři takové nespecifické kontrolní oligonukleotidy, z nichž jeden má náhodnou sekvenci, a ten je z teoretického hlediska nejlepší. Náhodná sekvence je syntetizována jako degenerovaný oligonukleotid kondenzací směsi 4 nukleotidů v každém stádiu (teoreticky produkt obsahuje 428 =7,2 . 1016 sekvencí) a měří se tedy rozsah sekvenčně nespecifické inhibice.
Příklad 3
Zkoušení inhibice HIV-1
Pro měření schopnosti oligonukleotidů podle vynálezu inhibovat replikaci HIV-l se použije následujících zkoušek:
A. Stanovení syncytia
Schopnost oligonukleotidů podle vynálezu inhibovat replikaci HIV-1, a tedy tvorbu syncytia ve tkáňové kultuře se zkouší v kulturách T-buněk způsobem popsaným ve výše uvedené publikaci Agrawala a Sarina z roku 1991. V krátkosti lze tuto zkoušku popsat takto: Buňky CEM se infikují viriony HIV-1 (0,01 až 0,1 TCID5Q/buňka) v průběhu 1 hodiny při 37’C. Po jedné hodině se neadsorbované viriony odstraní vymytím a infikované buňky se rozdělí do jednotlivých jamek 24 jamkové misky. K infikovaným buňkám se přidá příslušné množství oligonukleotidu (za použití zásobního roztoku) tak, aby se dosáhlo požadované koncentrace ve 2 ml média. Buňky se 3 dny kultivují a na konci tohoto období se infikované buňky vizuálně zkontrolují na tvorbu syncytia nebo se obarví trypanovou modří nebo CTT za účelem stanovení cytopathického účinku.
B. Zkouška exprese p24
Exprese HIV se může stanovit měřením úrovně exprese virového proteinu p24 v buňkách CEM, což se provádí v podstatě způsobem popsaným v Agrawal a Sarin, Adv. Drug. Delivery Rev. (1991), 6: 251 až 270. V krátkosti lze tuto zkoušku popsat takto: Buňky se peletizují a resuspendují ve fosfátovém fyziologickém roztoku chloridu sodného na koncentraci asi 106/ml. Buňky se tečkováním nanesou na preparát s toxoplasmosou, usuší na vzduchu a 15 minut fixují směsí methanolu a acetonu v poměru 1 : 1 při teplotě místnosti. Potom se preparáty inkubují s 10% normálním kozím sérem 30 minut při teplotě místnosti a následně se opláchnou roztokem chloridu sodného, který je pufrován fosforečnanem (PBS). Do každé jamky se přidá anti-p24 monoklonální protilátka a preparáty se inkubují ve vlhké komoře při 37’C. Potom se preparáty během 30 minut označí kozím protimyším IgG a přes noc se oplachují PBS. Porovnává se procentický podíl fluoreskujících buněk u buněk ošetřených oligonukleotidem a u neošetřených buněk.
C. Cytopathický účinek (CPE)
Cytopatický účinek indukovaný HIV se stanoví měřením poklesu počtu životaschopných buněk po infekci. Buňky se spočítají tak, že se k nim přidá MTT nebo trypanová modř a zjistí se kolik z nich přijme barvivo (mrtvé buňky). Zkouška se opakuje třikrát.
D. Stanovení reversní transkriptasy
Tato zkouška se provádí v podstatě způsobem popsaným v Agrawal et al., Adv. Drug. Delivery Rev. (1991), 6: 251 až 270. Shromáždí se supernatanty z kultur infikovaných virem, jednak za přítomnosti a jednak za nepřítomnosti oligonukleotidu a virové částice se vysrážejí polyethylenglykolem. Virová peleta se suspenduje ve 300 μΐ purfu obsahujícího 50mM Tris-HCl (pH 6,8), 5mM dithiothreitol (DTT), 250mM chlorid draselný a 25% Triton X-100. Aktivita reversní transkriptasy v solubilizované peletě se stanoví v 50 μΐ reakční směsi obsahující 50mM Tris-HCl (pH 7,8), 5mM DTT, lOOmM chlorid draselný, 0,01% Triton X-100, lOmM chlorid hořečnatý, 15mM [3H]dTTP (15 Ci/mmol), která obsahuje 5 μg dtl5.rAn, jako templátový primer a 10 μΐ suspenze rozbitých virů. Potom se provede jednohodinová inkubace při 37’C a přidá se 50 μg kvasinkové tRNA. Počítáním rozpadů v β-scintilačním počítači se měří zavedení [3H]dTTP do frakce DNA, která je nerozpustná v chladné kyselině trichloroctové.
Příklad 3
Inhibice replikace HIV-1 pomocí 25-meru in vitro
Schopnost antimediátorových oligonukleotidů podle vynálezu inhibovat infekci HIV-1 v řadě zavedených buněčných linií je možno zjistit dále popsanými zkouškami s akutně nebo chronicky infikovanými buňkami.
A. Stanovení na akutně infikovaných buňkách
1. V buňkách CEM
Buňky CEM (5 x 104 buněk/ml) se infikují HIV-1 (kmen HTLV-IIIB) 4 hodiny při 37’C. Infikované a neinfiko17 váné buňky se kultivují za přítomnosti a nepřítomnosti oligonukleotidu, tj . 25-meru nebo kontrolního oligonukleotidu nevykazujícího žádnou účinnost (například 20-meru se sekvencí odpovídající SEQ ID NO: 10) po dobu až 6 dnů při 37’C (každá zkouška se opakuje třikrát). Zkoušejí se tyto koncentrace 25-meru: 0,32 μ9/ιη1 (0,05μΜ), 1,00 pg/ml (0,02μΜ), 3,2 μg/ml (0,04μΜ), 10 μg/ml (1,5μΜ), 32 μg/ml (4μΜ) a 100 μg/ml (10,5μΜ). Graficky se stanoví účinná koncentrace způsobující 50% inhibici replikace viru (EC50) Po provedení této zkoušky se měří úroveň exprese HIV-1 zkouškou s tvorbou syncytia (tabulka 3A) a zkouškou exprese p24 (tabulka 3B). Cytotoxicita se měří kolorimetrickou analýzou po přidání MTT do jamek výše uvedeným způsobem (tabulka 3C).
Tabulka 3A
Stanovení inhibice syncytia
Oligo- nukleo- tid Koncen- trace (μg/ml) Průměr-* ný počet syncytií Inhibice syncytií (%) Snížení (%) EC50 (μg/ml)
20-mer 0,32 147 0 4 1,81
1,00 153 0 0
3,2 0 100 98
10 0 100 100
32 0 100 100
100 0 100 100
25-mer 0,32 145 6 6 1,41
1,00 108 30 29
3,2 0 100 100
10 0 100 100
32 0 100 100
100 0 100 100
* Průměrný počet syncytií vytvořených v kontrolních (infikovaných, ale neošetřených) buňkách je 153.
Tyto výsledky ukazují, že oligonukleotid podle vynálezu, 25-mer, zčásti (z 30 %) inhibuje tvorbu syncytií v nižší koncentraci (1,00 μg/ml) než 20-mer. Kromě toho účinná koncentrace oligonukleotidu způsobující 50% inhibici replikace viru (EC50) je nižší v případě 25-meru než v případě 20-meru, což ukazuje, že 25-mer je účinnější.
Tabulka 3B Stanovení antigenů HIV p24
Oligo- nukleo- tid Koncentrace (μg/ml) Potlačení exprese virového p24 (%) Snížení exprese p24 (%)
20-mer 0,32 133 —
1,00 114 —
3,20 93 7
10 44 56
32 53 47
100 62 38
25-mer 0,32 115 —
1,00 115 —
3,20 57 46
10,00 59 41
32 43 57
100 35 65
Z výsledků vyplývá, že 25-mer je schopen snížit ex presi p24 téměř o 50 % při nižší koncentraci než 20-mer. Kromě toho, při vyšší koncentraci (100 μg/ml) je 25-mer téměř dvakrát účinnější při snižování exprese p24 než 20-mer, což ukazuje, že je vysoce účinný při inhibici exprese HIV-1.
Tabulka 3C
Stanovení cytopatického účinku HIV
Oligo- Koncentrace nukleotid (μg/ml)
Snížení cytopatického Ecso účinku viru
20-mer
0,32
1,00
3,2
Experiment 1 0
7,75
25-mer
10,0
32,0
100
0,32
1,00
3,2
2,54
10,0
32,0
100
Tabulka 3C
Stanovení cytopatického účinku HIV
Oligonukleotid
Koncentrace (μg/ml)
Snížení cytopatického účinku viru
EC
20-mer
0,32
1,00
3,2
10,0
32,0
100
Experiment 2
3,91
100
100
100
25-mer 0,32 0
1,00 0
3,2 70
10,0 100
32,0 100
100 100
Tabulka 3C
Stanovení cytopatického účinku HIV
Oligonukleotid
Koncentrace (μg/ml)
Snížení cytopat. účinku viru (%)
EC
EC
EC
20-mer
0,32 1,00 3,2
10,0
32,0
100
Experiment 3
1,36
100
100
100
1,84
3,20
25-mer 0,32 o
1,00 4
3,2 100
10,0 100
32,0 100
100 100
1,29 1,75 3,01
Hodnota EC50 25-meru v případě snižování cytopatického účinku viru je podstatně nižší než obdobná hodnota 20-meru při všech třech provedených experimentech, což uka zuje, že 25-mer je méně toxický než 20-mer.
2. V buňkách H9
Buňky H9 se infikují HIV-1 (kmen HTLV-IIIg nebo HTLV-IIIj^) pomocí 0,01 až 0,1 TCID50/buňka 1 hodinu při 37’C. Hodnota TCID50 se stanoví infekcí buněk H9 virem při limitním zředění a následující kultivací po dobu 2 týdnů. Kultury se připraví se čtyřmi replikacemi při desetinásobném zředění HIV-l. Po infekci se neabsorbované viriony odstraní vymytím. Infikované buňky se kultivují za přítomnosti oligonukleotidú v koncentraci 0,005; 0,02; 0,13 a 0,6μΜ 3 až 4 dny při 37’C. Úroveň exprese HIV-1 se monitoruje měřením obsahu p24 v supernatantu za použití zkoušky zachycování antigenu p24 založené na použití monoklonální protilátky (DuPont). Výsledky jsou shrnuty v tabulce 4. Cytotoxicita se stanoví kultivací neinfikovaných buněk s 25-merem po dobu 3 až 4 dnů, načež se buňky spočítají v Coulterově počítači. Výsledky jsou také uvedeny v tabulce 4 a na obr. 5.
Tabulka 4
Stanovení HIV p24 antigenu
Experiment č. Oligo- nukleoti Koncentrace td /ug/ml /uM bi Přežití tiněk (%) Inhibice p24 (%)
1 25m«r 25,0 2,9 0,93 90
5,0 0,5 1,03 89
1,0 0,1 0,94 15
0,2 0,02 0,97 26
AZT 0,2 0,6 0,95 90
0,04 0,1 0,98 73
0,008 0,02 1,04 44
0,0016 0,005 1,08 6
2 25oer 5,0 0,93 66
11,0 1,01 20
0,2 1,07 21
0,04 1,02
3 25n<r 10,0 1,0 88
1,0 1,0 12
0,1 1,0 --
0,01 1,0 ——
Tyto výsledky ukazují, že 25-mer je účinnější při inhibici exprese p24 a tedy při replikaci HIV-1 při nižší koncentraci než AZT.
3. V chronicky infikovaných buňkách CEM
Chronicky infikované buňky CEM se kultivují za přítomnosti 25-meru v koncentraci 200, 64 a 20 Potom se buňky kultivují při 37 °C. Po 24 až 48 hodinách zkoušky se supernatanty ošetřených buněk odstraní a zkoušejí na úroveň aktivity reversní transkriptasy způsobem popsaným v Sarin et al., J. Nati. Cancer. Inst. (1987), 78: 663 až 666. Tato úroveň se porovná s úrovní aktivity reversní transkriptasy u kontrolních neošetřených infikovaných buněk. Výsledky jsou shrnuty v tabulce 5.
Tabulka 5
Anti-HIV účinnost 25-meru u chronicky infikovaných buněk
Oligomer Koncentrace Doba Inhibice RT* (gg/ml) (h) (%)
25-mer 200
20
200 48 87
53
25-mer je schopen inhibovat aktivitu reversní transkriptasy v tomto systému in vivo dokonce po 2 dnech, na rozdíl od nukleotidových analogů, které, jak se zdá, nemají žádný účinek u chronicky infikovaných buněk.
B. Zkoušky u chronicky infikovaných buněk
Buňky H9 se infikují HIV-1 (HTLV-IIIg) při koncentraci 0,01 až 0,1 TCID50/buňka během dvou hodin a potom se promytím zbaví neabsorbovaných virionů. Potom se buňky zředí na koncentraci 2 x 105 buněk/ml a kultivují při 37’C. Každé 3 až 4 dny se buňky zředí na koncentraci 2 x 105/ml a kultivují v čerstvém médiu obsahujícím 5 Mg/ml (0,7μΜ koncentrace) 25-meru nebo ddC. Po rozbití buněk se oddělí supernatant a zkouškou zachycování antigenů (DuPont) se stanoví úroveň exprese p24. Výsledky jsou znázorněny na obr 7 a shrnuty v tabulce 6.
Tabulka 6
Inhibice replikace HIV-1 25-merem v dlouhou dobu udržované kultuře
Kontrolní
25-mer
0,60 ddC
0,05
Koncentrace (MM)-
Exprese p24 (pg/al)
den 3 489
den 7 188 800
den 10 210 400
den 14 130 400
den 17 95 600
21 (95*) 124 (75*)
790 (99*) 10 800 (94*)
380 (99*) 17 300 (91*)
870 (95*) 60 000 (56*)
800 (94*) 54 000 (44*)
* Inhibice (%) p24 ve srovnání s kontrolním pokusem.
Tyto výsledky ukazují, že 25-mer může inhibovat expresi p24, a tedy replikaci HIV-1 s vyšší účinností než ddC a je mnohem účinnější než ddC při dlouhodobé zkoušce (nad 10 dnů). Může tomu tak být proto, že nukleotidové analogy jsou susceptibilnější ke štěpení nukleasou než oligonukleotidy s fosforothioátovými vazbami.
Oligonukleotidy podle vynálezu jsou tedy specifičtější, méně toxické a vykazují vyšší resistenci proti nuklease než mnohá jiná chemoterapeutická činidla, která byla navržena pro inhibici replikace HIV-1. Kromě toho jsou oligonukleotidy podle vynálezu účinnější při inhibici repli kace viru než jiné známé antimediátorové oligonukleotidy obsahující menší sekvenci než je sekvence 324 až 348 HIV-1 gag. Tak například 20-mer charakterizovaný v seznamu sekven cí pod označením SEQ ID NO: 10 je méně účinný než 25-mer podle vynálezu. Kromě toho 28-mer, který popsali Matsukura et al. (Prospects for Antisense Nucleic Acids Therapy of Cancer and AIDS, Wiley-Liss, Inc. (1991) str. 159 až 188) (viz obr. 3), který je komplementární k části oblasti gag překrývající se s oblastí 324 až 348, je také méně účinný. Může tomu tak být proto, že ribosomové vazebné místo (AUG) i oblasti, které je lemují, jsou bezpečně maskovány pomocí oligonukleotidů podle vynálezu, jejichž délka je alespoň 25 nukleotidů. Také po hybridizaci k této oblasti se oligonukleotidy podle vynálezu nemohou snadno nahradit ribosomem, což představuje účinnou zábranu infekci HIV. Kromě toho, konzervace této oblasti gag má za následek, že nemohou vzniknout únikové mutanty. Tento účinek je možno dále zvýšit tím, že se oligonukleotidu podle vynálezu použije v kombinaci s jinými anti-HIV oligonukleotidy nebo anti-HIV léčivy.
Odborníkům v tomto oboru je zřejmé, že vynález je možno různými způsoby obměňovat, přičemž všechny takové zřejmé modifikace využívající různých ekvivalentů výše popsaných látek a postupů spadají do rozsahu tohoto vynálezu a jsou též kryty následujícími nároky.
SEZNAM SEKVENCÍ (1) OBECNÉ INFORMACE:
(i) PŘIHLAŠOVATEL: Agrawal, Sudhir (ii) NÁZEV VYNÁLEZU: Terapeutické anti-HIV protivirové oligonukleotidy a farmaceutic ké prostředky na jejich bázi (iii) POČET SEKVENCÍ: 11 (iv) ADRESA PRO KORESPONDENCI:
(A) ADRESÁT: Allegretti & Witcoff, Ltd.
(B) ULICE: 10 South Wacker Drive, Suitě 3000 (C) MĚSTO: Chicago (D) STÁT: Illinois (E) ZEMĚ: USA (F) PSČ: 60606 (ZIP) (v) STROJNĚ ČITELNÁ FORMA:
(A) TYP MEDIA: Disketa (B) POČÍTAČ: IBM PC kompatibilní (C) OPERAČNÍ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, verze #1.25 (vi) DATA VZTAHUJÍCÍ SE K TÉTO PŘIHLÁŠCE:
(A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY: US (B) DATUM PODÁNÍ:
(C) ZATŘÍDĚNÍ:
(viii) INFORMACE O ZÁSTUPCI:
(A) JMÉNO: Kerner, Ann-Louise (B) ČÍSLO LICENCE: 33,523 (C) SPISOVÁ ZNAČKA: 92,623 (ix) INFORMACE O TELEKOMUNIKAČNÍM SPOJENÍ (A) TELEFON: 617/345-9100 (B) TELEFAX: 617-345-9111 (2) INFORMACE O SEQ ID N0:l:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 25 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETÉZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) ANTIMEDIÁTOROVÁ: ano (ix) CHARAKTERISTIKA:
(A) NÁZEV: GEM 90 (B) LOKALIZACE: komplementární k bp 324 až 348
HIV-1 DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:1:
CTCTCGCACC CATCTCTCTC CTTCT 25 (2) INFORMACE 0 SEQ ID NO:2:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 26 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETÉZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) ANTIMEDIÁTOROVÁ: ano (ix) CHARAKTERISTIKA:
(B) LOKALIZACE: komplementární k bp 323 až 348 HIV-1 DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:2:
CTCTCGGACC CATCTCTCTC CTTCTA 26 (2) INFORMACE 0 SEQ ID NO: 3:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 26 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETÉZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) ANTIMEDIÁTOROVÁ: ano (ix) CHARAKTERISTIKA:
(B) LOKALIZACE: komplementární k bp 324 až 349 HIV-1 DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 3:
GCTGCTCTCGCAC CCATCTCTCT CCTTCT 26 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:4:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 27 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) ANTIMEDIÁTOROVÁ: ano (ix) CHARAKTERISTIKA:
(B) LOKALIZACE: komplementární k bp 323 až 349 HIV-1 DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 4:
GCTCTCGCAC CCATCTCTCT CCTTCTA 27 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:5:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 28 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) ANTIMEDIÁTOROVÁ: ano (ix) CHARAKTERISTIKA:
(B) LOKALIZACE: komplementární k bp 322 až 349
HIV-1 DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:5:
GCTCTCGCAC CCATCTCTCT CCTTCTAG 28 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:6:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 28 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) ANTIMEDIÁTOROVÁ: ano (ix) CHARAKTERISTIKA:
(B) LOKALIZACE: komplementární k bp 323 až 350 HIV-1 DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:6:
CGCTCTCGCA CCCATCTCTC TCCTTCTA 28 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:7:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 29 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) ANTIMEDIÁTOROVÁ: ano (ix) CHARAKTERISTIKA:
(B) LOKALIZACE: komplementární k bp 322 až 350 HIV-1 DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:7:
CGCTCTCGCA CCCATCTCTC TCCTTCTAG 29 (2) INFORMACE 0 SEQ ID NO:8:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 30 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETÉZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) ANTIMEDIÁTOROVÁ: ano (ix) CHARAKTERISTIKA:
(B) LOKALIZACE: komplementární k bp 321 až 350 HIV-1 DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:8:
CGCTCTCGCA CCCATCTCTC TCCTTCTAGC 30 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:9:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 30 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETÉZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) ANTIMEDIÁTOROVÁ: ano (ix) CHARAKTERISTIKA:
(B) LOKALIZACE: komplementární k bp 322 až 351 HIV-1 DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:9:
ACGCTCTCGC ACCCATCTCT CTCCTTCTAG 30 (2) INFORMACE 0 SEQ ID NO:10:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 20 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETÉZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) ANTIMEDIÁTOROVÁ: ano (ix) CHARAKTERISTIKA:
(A) NÁZEV: GEM 90 (B) LOKALIZACE: komplementární k bp 327 až 346
HIV-1 DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:10:
CTCGCACCCA TCTCTCTCCT (2) INFORMACE O SEQ ID NO:11:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 70 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA až genomová RNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) ANTIMEDIÁTOROVÁ: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ: HIV-1 (viii) POLOHA V GENOMU: 311 až 380 (Xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:11:
ACTAGCGGAG GCTAGAAGGA GAGAGATGGG TGCGAGAGCG TCAGTATTAA GCGGGGGAGA ATTAGATCGA

Claims (22)

1. Oligonukleotid mající nukleotidovou sekvencí, která se hybridizuje alespoň k nukleotidům 324 až 348 konzervované oblasti gag genomu HIV-1, přičemž tento oligonukleotid obsahuje asi 25 až 30 nukleotidů, na jejichž spojení se podílí alespoň jedna nefosfodiesterová internukleotidová vazba, která činí oligonukleotid resistentním vůči štěpení nukleasou.
2. Oligonukleotid podle nároku 1, v němž je alespoň jednou nefosfodiesterovou internukleotidovou vazbou fosforothioátová vazba.
3. Oligonukleotid podle nároku 2, obsahující 25 nukleotidů.
4. Oligonukleotid podle nároku 3, jehož nukleotidová sekvence je uvedena v seznamu sekvencí pod označením SEQ ID N0:l.
5. Oligonukleotid podle nároku 2, obsahující 26 nukleotidů.
6. Oligonukleotid podle nároku 5, jehož nukleotidová sekvence je uvedena v seznamu sekvencí pod označením SEQ ID NO:2.
7. Oligonukleotid podle nároku 5, jehož nukleotidová sekvence je uvedena v seznamu sekvencí pod označením SEQ ID NO:3.
8. Oligonukleotid podle nároku 2, obsahující 27 nukleotidů.
9. Oligonukleotid podle nároku 8, jehož nukleotidová sekvence je uvedena v seznamu sekvencí pod označením SEQ ID NO:4.
10. Oligonukleotid podle nároku 2, obsahující 28 nukleotidů.
11. Oligonukleotid podle nároku 10, jehož nukleoti dová sekvence je uvedena v seznamu sekvencí pod označením SEQ ID NO:5.
12. Oligonukleotid podle nároku 10, jehož nukleoti dová sekvence je uvedena v seznamu sekvencí pod označením SEQ ID NO:6.
13. Oligonukleotid podle nároku 2, obsahující 29 nukleotidů.
14. Oligonukleotid podle nároku 13, jehož nukleoti dová sekvence je uvedena v seznamu sekvencí pod označením SEQ ID NO:7.
15. Oligonukleotid podle nároku 2, obsahující 30 nukleotidů.
16. Oligonukleotid podle nároku 15, jehož nukleoti dová sekvence je uvedena v seznamu sekvencí pod označením SEQ ID NO:8.
17. Oligonukleotid podle nároku 15, jehož nukleoti dová sekvence je uvedena v seznamu sekvencí pod označením SEQ ID NO:9.
18. Terapeutický prostředek, vyznačuj ιοί se tím, že obsahuje oligonukleotid podle nároku 1 ve fyziologicky vhodném nosiči.
19. Terapeutický prostředek, vyznačuj i cí se tím, že obsahuje oligonukleotid podle nároku 4 ve fyziologicky vhodném nosiči.
20. Terapeutický prostředek, vyznačuj í cí se tím, že obsahuje první a druhý anti-HIV-1 antimediátorový oligonukleotid, přičemž prvním oligonukleotidem je oligonukleotid podle nároku 1.
21. Způsob in vitro inhibice proliferace HIV-1, vyznačující se tím, že se (a) vytvoří terapeutický prostředek obsahující oligonukleotid podle nároku 1 ve fyziologicky vhodném nosiči a (b) buňky infikované HIV-1 se ošetří tímto terapeutickým prostředkem v množství postačujícím pro vazbu oligonukleotidu k oblasti gag HIV-1 provirové DNA nebo mRNA v infikovaných buňkách, přičemž vazbou oligonukleotidu k HIV-1 DNA nebo mRNA je inhibována proliferace HIV-1.
22. Způsob podle nároku 21, vyznačující se tím, že ve stupni (a) se vytvoří oligonukleotid obsahující 25 nukleotidů, na jejichž spojení se podílí alespoň jedna fosforothioátová vazba, přičemž sekvence tohoto oligonukleotidu je uvedena v seznamu sekvencí pod označením SEQ ID NO:1. ,—
CZ95854A 1992-10-05 1993-10-04 Oligonucleotide, therapeutical preparation based thereon and inhibition method of hiv-1 proliferation CZ85495A3 (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US95813592A 1992-10-05 1992-10-05

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ85495A3 true CZ85495A3 (en) 1996-03-13

Family

ID=25500631

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ95854A CZ85495A3 (en) 1992-10-05 1993-10-04 Oligonucleotide, therapeutical preparation based thereon and inhibition method of hiv-1 proliferation

Country Status (19)

Country Link
US (1) US5684147A (cs)
EP (1) EP0664833B1 (cs)
JP (1) JPH08504570A (cs)
KR (1) KR950704482A (cs)
AT (1) ATE146819T1 (cs)
AU (1) AU678415B2 (cs)
BR (1) BR9307191A (cs)
CA (1) CA2146364A1 (cs)
CZ (1) CZ85495A3 (cs)
DE (1) DE69306969T2 (cs)
DK (1) DK0664833T3 (cs)
ES (1) ES2096343T3 (cs)
FI (1) FI951600A (cs)
GR (1) GR3022315T3 (cs)
HU (1) HUT72400A (cs)
NO (1) NO951307L (cs)
NZ (1) NZ257434A (cs)
PL (1) PL308261A1 (cs)
WO (1) WO1994008004A1 (cs)

Families Citing this family (44)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030026782A1 (en) 1995-02-07 2003-02-06 Arthur M. Krieg Immunomodulatory oligonucleotides
US6207646B1 (en) 1994-07-15 2001-03-27 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US6239116B1 (en) 1994-07-15 2001-05-29 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US5733781A (en) * 1994-07-19 1998-03-31 Gen-Probe Incorporated Oligonucleotides and methods for inhibiting propagation of human immunodeficiency virus
US6776986B1 (en) 1996-06-06 2004-08-17 Novartis Ag Inhibition of HIV-1 replication by antisense RNA expression
EP1584681A3 (en) * 1997-07-10 2005-11-09 GeneSense Technologies Inc. Antisense oligonucleotide sequences as inhibitors of microorganisms
US6610539B1 (en) * 1997-07-10 2003-08-26 Genesense Technologies, Inc. Antisense oligonucleotide sequences as inhibitors of microorganisms
EP1007657B1 (en) 1997-08-19 2006-02-08 Idera Pharmaceuticals, Inc. Hiv-specific oligonucleotides and methods of their use
WO1999061056A2 (en) 1998-05-22 1999-12-02 Loeb Health Research Institute At The Ottawa Hospital Methods and products for inducing mucosal immunity
ES2296419T3 (es) 1998-11-12 2008-04-16 Invitrogen Corporation Reactivos de transfeccion.
US6977245B2 (en) 1999-04-12 2005-12-20 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Oligodeoxynucleotide and its use to induce an immune response
JP4824236B2 (ja) * 1999-07-09 2011-11-30 ジェン−プローブ・インコーポレーテッド 核酸増幅によるｈｉｖ−１の検出
WO2001046448A1 (en) * 1999-12-23 2001-06-28 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Inhibition of cellular proteases
WO2001051500A1 (en) * 2000-01-14 2001-07-19 The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Oligodeoxynucleotide and its use to induce an immune response
US6582920B2 (en) * 2000-09-01 2003-06-24 Gen-Probe Incorporated Amplification of HIV-1 RT sequences for detection of sequences associated with drug-resistance mutations
JP2002125687A (ja) * 2000-10-30 2002-05-08 Tosoh Corp Ｈｉｖ−１検出のためのオリゴヌクレオチドおよび検出法
US7666674B2 (en) 2001-07-27 2010-02-23 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Use of sterically stabilized cationic liposomes to efficiently deliver CPG oligonucleotides in vivo
AU2002361468A1 (en) 2001-08-14 2003-03-18 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of Health And Human S Method for rapid generation of mature dendritic cells
JP4383534B2 (ja) 2001-08-17 2009-12-16 コーリー ファーマシューティカル ゲーエムベーハー 改善した活性を有する組み合わせモチーフ免疫刺激オリゴヌクレオチド
WO2003054161A2 (en) 2001-12-20 2003-07-03 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services USE OF CpG OLIGODEOXYNUCLEOTIDES TO INDUCE ANGIOGENESIS
US8466116B2 (en) 2001-12-20 2013-06-18 The Unites States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Use of CpG oligodeoxynucleotides to induce epithelial cell growth
US8263091B2 (en) 2002-09-18 2012-09-11 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Method of treating and preventing infections in immunocompromised subjects with immunostimulatory CpG oligonucleotides
KR20050089799A (ko) 2002-10-29 2005-09-08 콜리 파마슈티칼 그룹, 리미티드 Ｃ형 간염 바이러스 감염의 치료에 있어 ＣｐＧ올리고뉴클레오티드의 용도
WO2004053104A2 (en) 2002-12-11 2004-06-24 Coley Pharmaceutical Group, Inc. 5’ cpg nucleic acids and methods of use
EP1627563A1 (en) 2004-08-10 2006-02-22 Academisch Medisch Centrum bij de Universiteit van Amsterdam Means and methods for producing a stabilized cell of interest
EP1647595A1 (en) * 2004-10-15 2006-04-19 Academisch Medisch Centrum bij de Universiteit van Amsterdam Nucleic acids against viruses, in particular HIV
US8399423B2 (en) * 2005-10-12 2013-03-19 Idera Pharmaceuticals, Inc. Immune regulatory oligonucleotide (IRO) compounds to modulate toll-like receptor based immune response
USRE49583E1 (en) 2005-11-17 2023-07-18 Tet Systems Gmbh & Co. Kg Inducible expression systems
US8383364B2 (en) 2005-11-17 2013-02-26 Tet Systems Gmbh & Co. Kg Inducible expression systems
AU2006323315B2 (en) 2005-12-09 2014-02-20 Academisch Medisch Centrum Bij De Universiteit Van Amsterdam Means and methods for influencing the stability of antibody producing cells
WO2007067032A1 (en) 2005-12-09 2007-06-14 Academisch Medisch Cemtrum Bij De Universiteit Van Amsterdam Means and methods for influencing the stability of cells
WO2011008093A1 (en) 2009-07-15 2011-01-20 Aimm Therapeutics B.V. Means and methods for producing high affinity antibodies
CA2793959C (en) 2010-03-25 2019-06-04 Oregon Health & Science University Cmv glycoproteins and recombinant vectors
AU2011334867B2 (en) 2010-12-02 2016-10-13 Kling Biotherapeutics B.V. Means and methods for producing high affinity antibodies
ES2667425T3 (es) 2011-06-10 2018-05-10 Oregon Health & Science University Glucoproteínas y vectores recombinantes de CMV
EP2568289A3 (en) 2011-09-12 2013-04-03 International AIDS Vaccine Initiative Immunoselection of recombinant vesicular stomatitis virus expressing hiv-1 proteins by broadly neutralizing antibodies
ES2631608T3 (es) 2012-06-27 2017-09-01 International Aids Vaccine Initiative Variante de la glicoproteína Env del VIH-1
US9932364B2 (en) 2013-08-26 2018-04-03 The Royal Institution For The Advancement Of Learning/Mcgill University Antisense-based small RNA agents targeting the Gag open reading frame of HIV-1 RNA
US20150065381A1 (en) 2013-09-05 2015-03-05 International Aids Vaccine Initiative Methods of identifying novel hiv-1 immunogens
EP2873423B1 (en) 2013-10-07 2017-05-31 International Aids Vaccine Initiative Soluble hiv-1 envelope glycoprotein trimers
US10611829B2 (en) 2014-01-31 2020-04-07 Aimm Therapeutics B.V. Means and methods for producing stable antibodies
CN106572974B (zh) 2014-07-15 2021-04-23 生命技术公司 用于将分子有效递送到细胞的具有脂质聚集体的组合物和方法
US10174292B2 (en) 2015-03-20 2019-01-08 International Aids Vaccine Initiative Soluble HIV-1 envelope glycoprotein trimers
US9931394B2 (en) 2015-03-23 2018-04-03 International Aids Vaccine Initiative Soluble HIV-1 envelope glycoprotein trimers

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE68929343T2 (de) * 1988-02-16 2002-09-12 Greatbatch Gen Aid Ltd Modifizierte Zellen mit Resistenz gegen Retroviralinfektionen
WO1989008146A1 (en) * 1988-02-26 1989-09-08 Worcester Foundation For Experimental Biology Inhibition of htlv-iii by exogenous oligonucleotides

Also Published As

Publication number Publication date
HU9500995D0 (en) 1995-06-28
US5684147A (en) 1997-11-04
NZ257434A (en) 1997-01-29
CA2146364A1 (en) 1994-04-14
ATE146819T1 (de) 1997-01-15
WO1994008004A1 (en) 1994-04-14
FI951600A0 (fi) 1995-04-04
DK0664833T3 (da) 1997-04-14
DE69306969D1 (de) 1997-02-06
EP0664833A1 (en) 1995-08-02
ES2096343T3 (es) 1997-03-01
NO951307D0 (no) 1995-04-04
FI951600A (fi) 1995-05-10
NO951307L (no) 1995-06-01
EP0664833B1 (en) 1996-12-27
DE69306969T2 (de) 1997-05-07
BR9307191A (pt) 1999-03-30
AU678415B2 (en) 1997-05-29
PL308261A1 (en) 1995-07-24
KR950704482A (ko) 1995-11-20
GR3022315T3 (en) 1997-04-30
AU5402894A (en) 1994-04-26
HUT72400A (en) 1996-04-29
JPH08504570A (ja) 1996-05-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ85495A3 (en) Oligonucleotide, therapeutical preparation based thereon and inhibition method of hiv-1 proliferation
WO1994008004A9 (en) Therapeutic anti-hiv oligonucleotide and pharmaceutical
Agrawal et al. GEM* 91—an antisense oligonucleotide phosphorothioate as a therapeutic agent for AIDS
EP0677056B1 (en) Oligonucleotide alkylphosphonates and alkylphosphonothioates
EP1007657B1 (en) Hiv-specific oligonucleotides and methods of their use
US5652355A (en) Hybrid oligonucleotide phosphorothioates
Lisziewicz et al. Specific inhibition of human immunodeficiency virus type 1 replication by antisense oligonucleotides: an in vitro model for treatment.
US5693773A (en) Triplex-forming antisense oligonucleotides having abasic linkers targeting nucleic acids comprising mixed sequences of purines and pyrimidines
US6683167B2 (en) Hybrid oligonucleotide phosphorothioates
CA2203652C (en) A method of down-regulating gene expression
JPH09501047A (ja) アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびヒト免疫不全ウイルス感染におけるその使用
US5733781A (en) Oligonucleotides and methods for inhibiting propagation of human immunodeficiency virus
EP1966376B1 (en) Prevention of retroviral infectivity through interference with ppt
Anazodo et al. Sequence-specific inhibition of gene expression by a novel antisense oligodeoxynucleotide phosphorothioate directed against a nonregulatory region of the human immunodeficiency virus type 1 genome
CA2211877A1 (en) Human immunodeficiency virus transcription inhibitors and methods of their use
Anazodo et al. Antiviral activity and protection of cells against human immunodeficiency virus type-1 using an antisense oligodeoxyribonucleotide phosphorothioate complementary to the 5′-LTR region of the viral genome
Kusunoki et al. Antisense oligodeoxynucleotide complementary to CXCR4 mRNA block replication of HIV-1 in COS cells
AU678980B2 (en) Method of inhibiting viral replication
Agrawal et al. Antisense oligonucleotide approach for therapy of AIDS
WO1998003646A1 (en) Compositions and methods for treating specific gene expression-related diseases and disorders in humans
WO1997048795A2 (en) Compositions and methods for treating specific gene expression-related diseases and disorders in humans