JP2012514211A - 高解像度核酸融解分析用の非対称シアニン色素 - Google Patents

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Abstract

本発明は、新規な非対称シアニン色素、及び係る色素の存在下で核酸分析を実施する方法に関する。より詳細には、本発明は、２本鎖核酸に対する高い親和性を有し、また増幅反応、とりわけポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を阻害しない新規な非対称シアニン色素に関する。

Description

本発明は、新規な非対称シアニン色素、及び係る色素の存在下で核酸分析を実施する方法に関する。より詳細には、本発明は、２本鎖核酸に対する高い親和性を有し、また増幅反応、とりわけポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を阻害しない新規な非対称シアニン色素に関する。
核酸の検出は、医療、法医科学、産業プロセス処理、作物栽培及び家畜繁殖、並びに他の多くの分野の中核をなす。病状（例えば、癌）、感染性微生物（例えば、ＨＩＶ）、遺伝子系統、遺伝子マーカー等を検出する能力は、疾患の診断及び予後診断、マーカー利用選抜、事件現場の特徴の正確な鑑識、産業生物を増殖させる能力、及び他の多くの技法のためのユビキタス技術である。対象とされる核酸の完全性の判定は、感染症又は癌の病理に関連し得る。少量の核酸を検出する最も有力かつ基本的な技術の１つは、核酸配列の一部又は全てを何度も複製し、その後、増幅産物を分析することである。ＰＣＲはおそらく、多数の様々な増幅技法の中で最もよく知られたものである。
ＰＣＲは、ＤＮＡの短い区間を増幅する有力な技法である。ＰＣＲを用いれば、単一の鋳型ＤＮＡ分子から始めて、何百万ものＤＮＡのコピーを迅速に生成することができる。ＰＣＲは、ＤＮＡの１本鎖への変性と、変性させた鎖に対するプライマーのアニーリングと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ酵素によるプライマーの伸長との３段階の温度サイクルを含む。このサイクルは、検出及び分析されるコピーが十分に存在するまで繰り返される。原則として、ＰＣＲの各サイクルはコピーの数を２倍にすることができると考えられる。実際のところ、各サイクル後に達成される増殖は常に２倍に満たない。さらに、ＰＣＲサイクルを続けると、必要な反応物質の濃度が減少するため、最終的に、増幅ＤＮＡ産物の構築が停止する。ＰＣＲに関する包括的な詳細については、非特許文献１、非特許文献２及び非特許文献３を参照されたい。
リアルタイムＰＣＲの開発が近年さかんに行われている。リアルタイムＰＣＲとは、反応が進行するのに伴い（一般にＰＣＲ１サイクルにつき１回）増幅されたＤＮＡ産物の構築を測定する一連の技法を指す。経時的に産物の蓄積をモニタリングすることにより、反応の効率を判定すると共に、鋳型ＤＮＡ分子の初期濃度を推定することが可能である。リアルタイムＰＣＲに関するhttp://techterm.astamuse.com/ja/全般的?from=patent_techterm包括的な詳細については、非特許文献４を参照されたい。
融解曲線分析は、核酸を分析するのに重要な技法である。この方法では、２本の鎖が結合しているか又はしていないかを示す色素の存在下で、２本鎖核酸を変性させる。このような指示色素としては、色素が２本鎖ＤＮＡに結合しているか否かによってその蛍光収率が大きく左右される、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｉ等の非特異的結合色素が挙げられる。混合物の温度を上げると、色素由来の蛍光が低減することにより、核酸分子が、部分的に又は完全に融解した、すなわち、その２本鎖がほどかれた（unzipped）ことが示される。それゆえ、温度に応じて色素蛍光を測定することによって、二重鎖の長さ、ＧＣ含量、又はさらには、正確な配列に関する情報が得られる。例えば、Ririe et al.（非特許文献５）、Wittwer et al.（非特許文献６）、Liew et al.（非特許文献７）、Herrmann et al.（非特許文献８）、Knapp et al.（特許文献１）、Wittwer et al.（特許文献２）、Wittwer et al.（特許文献３）、Wittwer et al.（特許文献４）及びSundberg et al.（特許文献５）を参照されたい。
非対称シアニン色素は、核酸及びタンパク質の染色に用いられてきた色素の一群である。ＲＮＡ及び／又はＤＮＡに結合するように用いられるさらなる非対称シアニン色素も開発されている。例えば、Lee et al.（特許文献６）、Lee et al.（特許文献７）、Yue et al.（特許文献８）、Wittwer et al.（特許文献３）、Wittwer et al.（特許文献４）、Haugland et al.（特許文献９）、Yamamoto et al.（特許文献１０）、Yue et al.（特許文献１１）、Mizukami et al.（特許文献１２）、Bieniarz et al.（特許文献１３）、Glazer et al.（特許文献１４）、Lee et al.（特許文献１５）、Kubista et al.（特許文献１６）、Deka et al.（特許文献１７）、及びHaugland et al.（特許文献１８）を参照されたい。
米国特許出願公開第２００２／０１９７６３０号 米国特許出願公開第２００５／０２３３３３５号 米国特許出願公開第２００６／００１９２５３号 米国特許出願公開第２００７／００２０６７２号 米国特許出願公開第２００７／００２６４２１号 米国特許第４，８８３，８６７号 米国特許第４，９３７，１９８号 米国特許第５，３２１，１３０号 米国特許第５，４３６，１３４号 米国特許第５，５６３，０７０号 米国特許第５，６５８，７５１号 米国特許第６，００４，８１６号 米国特許第６，０１５，９０２号 米国特許第６，０５４，２７２号 米国特許第６，０８０，８６８号 米国特許第６，３２９，１４４号 米国特許第６，３６８，８６４号 米国特許第６，６６４，０４７号
Sambrook and Russell, Molecular Cloning -- A Laboratory Manual (3rd Ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (2000) Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (２００５年に追補) PCR Protocols A Guide to Methods and Applications , M. A. Innis et al., eds., Academic Press Inc. San Diego, Calif. (1990) Real-Time PCR: An Essential Guide, K. Edwards et al., eds., Horizon Bioscience, Norwich, U.K. (2004) Anal Biochem 245: 154-160, 1997 Clin Chem 49: 853-860, 2003 Clin Chem 50: 1156-1164 (2004) Clin Chem 52: 494-503, 2006
既知の非対称シアニン色素に関する問題が幾つか存在する。例えば、或る特定の非対称シアニン色素はＰＣＲ反応を損なわせるおそれがある。他の非対称シアニン色素は核酸との結合が弱いという問題がある。さらに他の非対称シアニン色素は、ＰＣＲ反応を損なわせると共に、核酸に弱くしか結合しない。非対称シアニン色素のこれらの及び他の欠点はいまだ存在している。
本発明は、新規な非対称シアニン色素、及び係る色素の存在下で核酸分析を実施する方法に関する。より詳細には、本発明は、２本鎖核酸に対する高い親和性を有し、また増幅反応、とりわけポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を阻害しない新規な非対称シアニン色素に関する。
それゆえ、第一の態様では、本発明は新規な非対称シアニン色素を提供する。一実施の形態では、非対称シアニン色素は、式Ｉ
Figure 2012514211
（式中、
Ａは、
Figure 2012514211
又は
Figure 2012514211
（式中、
ＸはＯ又はＳであり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は独立して水素、ハロゲン、チオール、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたポリアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたポリアルキニル、任意に置換されたチオアルキル、任意に置換されたアミノアルキル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリール、及び任意に置換されたアリールアルキルであり、
Ｒ１及び／又はＲ２は、Ｒ１及びＲ２上の正電荷（複数可）の合計が１、２又は３となるように、１つ又は複数の正電荷を帯びており、
Ｒ３及び／又はＲ４及び／又はＲ５及び／又はＲ６及び／又はＲ７は、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７上の正電荷（複数可）の合計が１、２又は３となるように、１つ又は複数の正電荷を帯びている）
である）
の化合物である。
アルキルは直鎖又は分岐鎖であり得る、かつ１個〜１２個の炭素を含有し得る。アルコキシは直鎖又は分岐鎖であり得る、かつ１個〜１２個の炭素を含有し得る。アルケニルは直鎖又は分岐鎖であり得る、かつ２個〜１２個の炭素を含有し得る。アルキニルは直鎖又は分岐鎖であり得る、かつ２個〜１２個の炭素を含有し得る。ポリアルケニルは直鎖又は分岐鎖であり得る、かつ４個〜１２個の炭素を含有し得る。ポリアルキニルは直鎖又は分岐鎖であり得る、かつ４個〜１２個の炭素を含有し得る。チオアルキルは直鎖又は分岐鎖であり得る、１個〜１２個の炭素を含有し得る、かつアルキル基を介して親分子に繋がる。アミノアルキルは直鎖又は分岐鎖で含有し得る、１個〜１２個の炭素を含有し得る、かつアルキル基を介して親分子に繋がる。アリールは約６個〜約１４個の炭素原子を含む芳香族の単環式又は多環式環系であり得る。ヘテロアリールは約５個〜約１４個の環原子を含む芳香族の単環式又は多環式環系であり得る、ここで１つ又は複数の環原子は、単独又は組み合わせで、炭素ではない元素、例えば、窒素、酸素又は硫黄である。アリールアルキル中のアルキルは直鎖又は分岐鎖であり得る、かつ１個〜１２個の炭素を含有し得る。アリールアルキルは、アルキル基を介して親分子と繋がる。
任意の置換基は、例えば１つ又は複数の置換基、それぞれ独立してハロゲン（halo）、ヒドロキシル、アミノ、チオール、アルキル、シクロアルキル、ハロアルキル、ハロシクロアルキル、アルコキシ、シクロアルコキシ、ハロアルコキシ、アルキルアミノジアルキル、アルキルアミノトリアルキル、アルキルチオ、ハロアルキル、シクロアルキル、アリールカルボニル、アリールスルホニル、任意に置換されたヘテロシクリル及びカルボキシル誘導体（カルボン酸、エステル、及びアミド等）、又は本明細書中に記載される他の置換基が挙げられ得る。ヘテロシクリルは約３個から約１０個の環原子を含む芳香族ではない飽和単環式又は多環式環系であり得る、ここで環系中の１つ又は複数の原子は、単独又は組み合わせで、炭素ではない元素、例えば、窒素、酸素又は硫黄である。
一実施の形態ではＲ１及びＲ２上、又はＲ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７上の正電荷（複数可）は、自然の構成において正電荷を有する非対称のシアニン色素上の置換基に起因する。別の実施の形態では、Ｒ１及びＲ２上、又はＲ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７上の正電荷（複数可）は、ポリメラーゼ連鎖反応等の増幅反応が行われるｐＨで正電荷を有する置換基（単数又は複数）に起因する。
一実施の形態では、Ａは式ＩＩの構造を有する。実施の形態によっては、Ｒ１が、アリール、ジアルキルアミノで置換されたアルキル、トリアルキルアミノで置換されたアルキル、アルコキシで置換されたアルキル、ジアルキルアミノで置換されたアルコキシで置換されたアルキル、又はＮ置換ヘテロシクリルで置換されたアルキルであり、Ｒ２が、水素、アルキル、チオール、トリアルキルアミノで置換されたアルキル、又はアルコキシで置換されたアルキルである。
別の実施の形態では、Ａは式ＩＩＩの構造を有する。実施の形態によっては、Ｒ３が、水素、メチル、トリアルキルアミノで置換されたアルキル、又はＮ置換ヘテロシクリルで置換されたアルキルであり、Ｒ４が、水素、アルキル、アリール、チオール、ジアルキルアミノで置換されたアルキル、トリアルキルアミノで置換されたアルキル、ジアルキルアミノで置換されたアルコキシで置換されたアルキル、又はＮ置換ヘテロシクリルで置換されたアルキルであり、Ｒ５が、水素、ハロゲン、アルキル、アリール又はジアルキルアミノで置換されたアルコキシで置換されたアルキルであり、Ｒ６が、水素、アルキル、トリアルキルアミノで置換されたアルキル、又はＮ置換ヘテロシクリルで置換されたアルキルであり、Ｒ７が、水素、アルキル、又はアルコキシで置換されたアルキルである。
第２の態様において、本発明は、本発明の新規な非対称シアニン色素の存在下で核酸分析を実施する方法を提供する。一実施の形態において、本方法は、本発明の非対称シアニン色素を、標的核酸と標的核酸を増幅するように構成される１つ又は複数のプライマーとを含む試料と混合する工程と、非対称シアニン色素の存在下で標的核酸を増幅する工程と、非対称シアニン色素の蛍光をモニタリングする工程とを含む。別の実施の形態では、モニタリング工程が、増幅された標的核酸を融解して融解曲線を作成することを含む。さらなる実施の形態では、標的核酸が一塩基多型を含む。付加的な実施の形態において、本方法は、モニタリングされた蛍光に基づき遺伝子型を同定することをさらに含む。一実施の形態では、遺伝子型が融解曲線に基づき同定される。別の実施の形態では、増幅及びモニタリングをマイクロ流体チャネルにおいて行う。一実施の形態において、モニタリング工程を増幅工程中に行う。別の実施の形態では、モニタリング工程を増幅工程に続いて行う。さらなる実施の形態では、モニタリングを増幅工程中及び増幅工程に続いて行う。一実施の形態において、増幅工程に続くモニタリング工程は、増幅された標的核酸を融解して融解曲線を作成することを含む。
本発明は、複数の実施形態を有し、また当業者に既知の詳細については特許、特許出願及び他の引用文献に依拠する。したがって、特許、特許出願又は他の引用文献を本明細書中で引用する又は繰り返す場合、あらゆる目的でまた記載される陳述についてその全体が参照により援用されることを理解されたい。
本発明の実施は、他に指定のない限り、当業者の範囲内である、有機化学、高分子技術、分子生物学（組み換え技法を含む）、細胞生物学、生化学及び免疫学の従来の技法及び記述を採用し得る。このような従来の技法としては、ポリマーアレイ合成、ハイブリダイゼーション、ライゲーション、及び標識を用いたハイブリダイゼーションの検出が挙げられる。好適な技法の具体例は以下の本明細書中の実施例を参照してもたらされ得る。しかしながら、他の等価な従来の手法も当然のことながら使用することができる。このような従来の技法及び記述は、Genome Analysis: A Laboratory Manual Series (Vols. I-IV)（Antibodies: A Laboratory Manual、Cells: A Laboratory Manual、PCR Primer: A Laboratory Manual及びMolecular Cloning: A Laboratory Manualを使用）（全てCold Spring Harbor Laboratory Press出版）、Stryer, L. (1995) Biochemistry (4th Ed.) Freeman, N.Y., Gait, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, 1984, IRL Press, London、Nelson and Cox (2000), Lehninger, Principles of Biochemistry 3rd Ed., W.H. Freeman Pub., New York, N.Y.、並びにBerg et al. (2002) Biochemistry, 5th Ed., W.H. Freeman Pub., New York, N.Y.（あらゆる目的でその全体が参照により本明細書中に援用される）等の基本的な手引書に見ることができる。
本発明は、新規な非対称シアニン色素、及び係る色素の存在下で核酸分析を実施する方法に関する。より詳細には、本発明は、２本鎖核酸に対する高い親和性を有し、また増幅反応、とりわけポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を阻害しない新規な非対称シアニン色素に関する。
それゆえ、一態様では、本発明は、新規の非対称シアニン色素を提供する。一実施形態では、非対称シアニン色素は、式Ｉ：
Figure 2012514211
（式中、
Ａは、
Figure 2012514211
又は
Figure 2012514211
（式中、
ＸはＯ又はＳであり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は独立して水素、ハロゲン、チオール、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたチオアルキル、任意に置換されたアミノアルキル、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたポリアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたポリアルキニル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリール、任意に置換されたアリールアルキル、及び任意に置換されたヘテロアリールアルキルであり、
Ｒ１及び／又はＲ２は、Ｒ１及びＲ２上の正電荷（複数可）の合計が１、２又は３となるように、１つ又は複数の正電荷を帯びており、
Ｒ３及び／又はＲ４及び／又はＲ５及び／又はＲ６及び／又はＲ７は、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７上の正電荷（複数可）の合計が１、２又は３となるように、１つ又は複数の正電荷を帯びている）
である）
の化合物である。
「アルキル」は、直鎖又は分岐鎖であり得る、かつ鎖状の約１個から約１２個、好ましくは鎖状の約１個から約８個の炭素原子を含む脂肪族炭化水素基を意味する。分岐鎖は、例えばメチル、エチル又はプロピルのような１つ又は複数の低級アルキル基が、直線状のアルキル鎖に付いていることを意味する。「低級アルキル」は、直鎖又は分岐鎖であり得る鎖状の約１個から約５個の炭素原子を有する基を意味する。「アルキル」は、置換されていないか、又は任意に、同じ又は異なっていてもよい１つ又は複数の置換基で置換されていてもよい（各置換基は独立して、本明細書中に記載される置換基から選択される）。
「アルケニル」は、直鎖又は分岐鎖であり得る、かつ鎖状の約２個から約１２個、好ましくは鎖状の約２個から約８個の鎖状の炭素原子を含む、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含有する脂肪族炭化水素基を意味する。分岐鎖は、例えばメチル、エチル又はプロピルのような１つ又は複数の低級アルキル基が、直線状のアルケニル鎖に付いていることを意味する。「低級アルケニル」は、直鎖又は分岐鎖であり得る鎖状の約２個から約５個の炭素原子を意味する。「アルケニル」は、置換されていないか、又は任意に、同じ又は異なっていてもよい１つ又は複数の置換基で置換されていてもよい（各置換基は独立して、本明細書中に記載される置換基から選択される）。
「アルキニル」は、直鎖又は分岐鎖であり得る、かつ鎖状の約２個から約１２個、好ましくは鎖状の約２個から約８個の炭素原子を含む、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を含有する脂肪族炭化水素基を意味する。分岐鎖は、例えばメチル、エチル又はプロピルのような１つ又は複数の低級アルキル基が、直線状のアルキニル鎖に付いていることを意味する。「低級アルキニル」は、直鎖又は分岐鎖であり得る鎖状の約２個から約５個の鎖状の炭素原子を意味する。「アルキニル」は、置換されていないか、又は任意に、同じ又は異なっていてもよい１つ又は複数の置換基で置換されていてもよい（各置換基は独立して、本明細書中に記載される置換基から選択される）。
「アリール」は約６個から約１４個の炭素原子、好ましくは約６個から約１０個の炭素原子を含む芳香族の単環式又は多環式環系を意味する。アリール基は、任意に、１つ又は複数の同じ又は異なっていてもよい置換基で置換され得る（各置換基は独立して、本明細書中に記載される置換基から選択される）。好適なアリール基の非限定的な例は、例えば、フェニル及びナフチルが挙げられる。
「ヘテロアリール」は約５個から約１４個の環原子、好ましくは約５個から約１０個の環原子を含む芳香族の単環式又は多環式環系を意味する、ここで１つ又は複数の環原子は、単独又は組み合わせで、炭素ではない元素、例えば窒素、酸素又は硫黄である。「ヘテロアリール」は、任意に、同じ又は異なっていてもよい１つ又は複数の置換基で置換され得る（各置換基は独立して、本明細書中に記載される置換基から選択される）。好適なヘテロアリールの非限定的な例としては、ピリジル、ピラジニル、フラニル、チエニル、ピリミジニル、ピリドン（Ｎ置換ピリドン類を含む）、イソキサゾリル、イソチアゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、ピラゾリル、フラザニル、ピロリル、ピラゾリル、トリアゾリル、１，２，４−チアジアゾリル、ピラジニル、ピリダジニル、キノキサリニル、フタラジニル、オキシインドリル、イミダゾ［１，２−ａ］ピリジニル、イミダゾ［２，１−ｂ］チアゾリル、ベンゾフラザニル、インドリル、アザインドリル、ベンズイミダゾリル、ベンゾチエニル、キノリニル、イミダゾリル、チエノピリジル、キナゾリニル、チエノピリミジル、ピロロピリジル、イミダゾピリジル、イソキノリニル、ベンゾアザインドリル、１，２，４−トリアジニル、ベンゾチアゾリル等が挙げられる。「ヘテロアリール」という用語はまた、例えば、テトラヒドロイソキノリル、テトラヒドロキノリル等のような部分的に飽和したヘテロアリール部も示す。
「アリールアルキル」はアリール−アルキル基を意味する。ここでアリール及びアルキルは上で説明したとおりである。親部位への結合はアルキルを介する。
「シクロアルキル」は、約３個から約１０個の炭素原子を含む、芳香族ではない単環式又は多環式環系を意味する。シクロアルキルは、任意に１つ又は複数の同じ又は異なっていてもよい置換基で置換され得る（各置換基は独立して、本明細書中に記載される置換基から選択される）。
「ハロゲン」は、フッ素、塩素、臭素、又はヨウ素を意味する。
「ヘテロアリールアルキル」は、ヘテロアリール−アルキル基を意味する。ここでヘテロアリール及びアルキルは上で説明したとおりである。親部位との結合はアルキルを介する。
「ヘテロシクリル」は約３個から約１０個の環原子、好ましくは約５個から約１０個の環原子からなる、芳香族ではない飽和単環式又は多環式環系を意味する。ここで環系中の１つ又は複数の原子は、単独又は組み合わせで、炭素ではない元素、例えば窒素、酸素又は硫黄である。ヘテロシクリルは、任意に、同じ又は異なっていてもよい１つ又は複数の置換基で置換され得る（各置換基は独立して、本明細書中に記載される置換基から選択される）。好適な単環式ヘテロシクリル環の非限定的な例としては、ピペリジル、ピロリジニル、ピペラジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、チアゾリジニル、１，４−ジオキサニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチオフェニル、ラクタム、ラクトン等が挙げられる。「ヘテロシクリル」は、また、環系の同じ炭素原子上にある２つの置換可能な水素が同時に置換されている単一の部分（例えばカルボニル）も意味する。
「アルコキシ」はアルキル−Ｏ−基を意味する。ここでアルキル基は、上で説明したとおりである。アルコキシは、任意に、同じ又は異なっていてもよい１つ又は複数の置換基で置換され得る（各置換基は独立して、本明細書中に記載される置換基から選択される）。好適なアルコキシ基の非限定的な例としては、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ及びｎ−ブトキシ等が挙げられる。親部位への結合はエーテル酸素を介する。
「アリールオキシ」はアリール−Ｏ−基を意味する。ここでアリール基は、上で説明したとおりである。親部位への結合はエーテル酸素を介する。
「アリールアルコキシ」はアリールアルキル−Ｏ−基を意味する。ここでアリールアルキル基は、上で説明したとおりである。親部位への結合はエーテル酸素を介する。
「シクロアルキルオキシ」はシクロアルキル−Ｏ−基を意味する。ここでシクロアルキル基は、上で説明したとおりである。親部位への結合はエーテル酸素を介する。
「ヘテロアリールオキシ」はヘテロアリール−Ｏ−基を意味する。ここでヘテロアリール基は、上で説明したとおりである。親部位への結合はエーテル酸素を介する。
「ヘテロアリールアルキルオキシ」はヘテロアリールアルキル−Ｏ−基を意味する。ここでヘテロアリールアルキル基は、上で説明したとおりである。親部位への結合はエーテル酸素を介する。
「アルキルチオ」はアルキル−Ｓ−基を意味する。ここでアルキルチオ基は、上で説明したとおりである。アルキルチオは、任意に、同じ又は異なっていてもよい１つ又は複数の置換基で置換され得る（各置換基は独立して、本明細書中に記載される置換基から選択される）。好適なアルキルチオ基の非限定的な例としては、メチルチオ及びエチルチオが挙げられる。親部位への結合は硫黄を介する。
「アリールチオ」はアリール−Ｓ−基を意味する。ここでアリール基は、上で説明したとおりである。親部位への結合は硫黄を介する。
「アリールアルキルチオ」はアリールアルキル−Ｓ−基を意味する。ここでアリールアルキル基は、上で説明したとおりである。親部位への結合は硫黄を介する。
「シクロアルキルチオ」はシクロアルキル−Ｓ−基を意味する。ここでシクロアルキル基は、上で説明したとおりである。親部位への結合は硫黄を介する。
「ヘテロアリールチオ」はヘテロアリール−Ｓ−基を意味する。ここでヘテロアリール基は、上で説明したとおりである。親部位への結合は硫黄を介する。
「ヘテロアリールアルキルチオ」はヘテロアリールアルキル−Ｓ−基を意味する。ここでヘテロアリールアルキル基は、上で説明したとおりである。親部位への結合は硫黄を介する。
「アルキルカルボニル」はアルキル−Ｃ（Ｏ）−基を意味する。ここでアルキル基は、上で説明したとおりである。親部位への結合はカルボニルを介する。
「アリールカルボニル」はアリール−Ｃ（Ｏ）−基を意味する。ここでアリール基は、上で説明したとおりである。親部位への結合はカルボニルを介する。
「アリールアルキルカルボニル」はアリールアルキル−Ｃ（Ｏ）−基を意味する。ここでアリールアルキル基は、上で説明したとおりである。親部位への結合はカルボニルを介する。
「ヘテロアリールカルボニル」はヘテロアリール−Ｃ（Ｏ）−基を意味する。ここでヘテロアリール基は、上で説明したとおりである。親部位への結合はカルボニルを介する。
「ヘテロアリールアルキルカルボニル」はヘテロアリールアルキル−Ｃ（Ｏ）−基を意味する。ここでヘテロアリールアルキル基は、上で説明したとおりである。親部位への結合はカルボニルを介する。
「アルキルスルホニル」はアルキル−ＳＯ２−基を意味する。ここでアルキル基は、上で説明したとおりである。親部位への結合はスルホニルを介する。
「アリールスルホニル」はアリール−ＳＯ２−基を意味する。ここでアリールは、上で説明したとおりである。親部位への結合はスルホニルを介する。
「アリールアルキルスルホニル」はアリールアルキル−ＳＯ２−基を意味する。ここでアリールアルキル基は、上で説明したとおりである。親部位への結合はスルホニルを介する。
「ヘテロアリールスルホニル」はヘテロアリール−ＳＯ２−基を意味する。ここでヘテロアリール基は、上で説明したとおりである。親部位への結合はスルホニルを介する。
「ヘテロアリールアルキルスルホニル」はヘテロアリールアルキル−ＳＯ２−基を意味する。ここでヘテロアリールアルキル基は、上で説明したとおりである。親部位への結合はスルホニルを介する。
「アルコキシカルボニル」はアルキル−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−基を意味する。ここでアルキル基は、上で説明したとおりである。親部位への結合はカルボニルを介する。
「アリールオキシカルボニル」はアリール−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−基を意味する。ここでアリール基は、上で説明したとおりである。親部位への結合はカルボニルを介する。
「アリールアルコキシカルボニル」はアラルキル−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−基を意味する。ここでアリールアルキル基は、上で説明したとおりである。親部位への結合はカルボニルを介する。
「ヒドロキシアルキル」はＨＯ−アルキル−基を意味する。ここでアルキルは、上で定義したとおりである。親部位への結合はアルキルを介する。
「アミノアルキル」はＮＨ２−アルキル基を意味する。ここでアルキルは上で定義したとおりである。親部位との結合はアルキル基を介する。アミノアルキル上での置換は、アルキル水素及び／又はアミン水素で起こり得る。
「ポリアルケニル」は、直鎖又は分岐鎖であり得る、かつ鎖状の約４個から約１２個、好ましくは約４個から約８個の炭素原子を含む、少なくとも２つの炭素−炭素二重結合を含有する脂肪族炭化水素基を意味する。分岐鎖は、例えば１つ又は複数の、メｓチル、エチル若しくはプロピルのような低級アルキル基、又は低級アルケニル基が、直線状のアルケニル鎖に付いていることを意味する。「ポリアルケニル」は、任意に、同じ又は異なっていてもよい１つ又は複数の置換基で置換されていてもよい（各置換基は独立して、本明細書中に記載される置換基から選択される）。
「ポリアルキニル」は、直鎖又は分岐鎖であり得る、かつ鎖状の約４個から約１２個、好ましくは約４個から約８個の炭素原子を含む、少なくとも２つの炭素−炭素三重結合を含有する脂肪族炭化水素基を意味する。分岐鎖は、例えばメチル、エチル若しくはプロピルのような１つ又は複数の低級アルキル基、又は低級アルキニル基が、直線状のアルキニル鎖に付いていることを意味する。「ポリアルキニル」は、任意に、同じ又は異なっていてもよい１つ又は複数の置換基で置換されていてもよい（各置換基は独立して、本明細書中に記載される置換基から選択される）。
「置換基」はハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、チオール、アルキル、アルケニル、ポリアルケニル、アルキニル、ポリアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ハロアルキル、ハロアルケニル、シクロアルキル、ハロシクロアルキル、ヘテロシクリル、ヒドロキシアルキル、アルコキシ、アリールオキシ、アリールアルコキシ、シクロアルキルオキシ、ハロアルコキシ、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、アリールアルコキシカルボニル、ヘテロアリールオキシカルボニル、ヘテロアリールアルコキシカルボニル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アリールアルキルスルホニル、ヘテロアリールスルホニル、ヘテロアリールアルキルスルホニル、アルキルチオ、シクロアルキルチオ、アリールチオ、ヘテロアリールチオ、アリールアルキルチオ、ヘテロアリールアルキルチオ、−ＮＨＹ１、−ＮＹ１Ｙ２又は−Ｎ+Ｙ１Ｙ２Ｙ３（ここで、Ｙ１、Ｙ２及びＹ３は同じ又は異なっており、それぞれが本明細書中に記載されるようなアルキルである）を意味する。
「置換された」とは、指定の原子上の１つ又は複数の水素を、示した基から選択されるものと置き換えることを意味するが、但し、現状における指定の原子の正常な原子価を超えることなく、また、置換によって安定な化合物がもたらされる。置換基及び／又は変動要素の組合せは、このような組合せによって安定な化合物がもたらされる場合にのみ許容可能である。「安定な化合物」又は「安定な構造」とは、反応混合物からの有用な純度での単離、及び本明細書中に記載されるような使用に耐えるように十分に堅牢である化合物を意味する。
「任意に置換された」とは、特定の基、ラジカル又は部位による任意の置換を意味する。
当然のことながら、本明細書中に記載の非対称シアニン色素は、キラル中心を含有していてもよい。そのような場合、他に指定のない限り、立体異性体全てが、これらのシアニン色素構造の説明に含まれると理解される。このような立体異性体としては、純粋な光学活性異性体、ラセミ混合物、及び任意の相対量の１つ又は複数の立体異性体配置を含有するジアステレオマーの混合物が挙げられる。
また当然のことながら、本明細書中に記載の非対称シアニン色素が、幾何学的中心を含有していてもよい。そのような場合、他に指定のない限り、幾何異性体全てが、シアニン色素構造の説明に含まれると理解される。このような幾何異性体としては、幾何配置の純粋な型、又は様々な混合物のいずれかの、シス異性体、トランス異性体、Ｅ異性体及びＺ異性体が挙げられる。また、シアニン色素の構造に含まれる二重結合の性質に応じて、係る二重結合異性体が、シスとトランスとの間、又はＥと、溶媒組成、溶媒極性、イオン強度等の条件に応じた構成との間で相互に交換し得ることが理解される。
さらに当然のことながら、本明細書中に記載の非対称シアニン色素のベンズアゾリウム（benzazolium）部分上の正電荷が１であり、本明細書中に記載の非対称シアニン色素のプリニウム（purinium）部分又はキナゾリニウム（quinazolinium）部分（protion）上の正電荷が１〜３であることによって、係る互変異性体の混合物を含む、式Ｉの化合物の幾つかの互変異性体が存在し得る。例示的に、電荷は、式Ｉに示されるように窒素原子上に、若しくは２つのヘテロ環に結合する、アルキレンリンカーを形成する炭素原子の１つの上に形式的に局在化していてもよく、又は代替的に、電荷は、プリニウム若しくはキナゾリニウムのヘテロ環上に局在化していてもよい。式Ｉの荷電化合物の互変異性体は、式Ｉの化合物の二重結合−単結合構成の配置を入れ替えることによって示され得る。本明細書中に記載の非対称シアニン色素としては、幾つかの見込まれる互変異性体、又はそれらの互変異性体の様々な平衡混合物のいずれもが挙げられる。形式電荷の位置は、色素の部位の性質の影響を受けることが理解される。さらに、好まれる互変異性体又は互変異性体の平衡混合物は、溶媒組成、溶媒極性、イオン強度、配合等の条件に応じて決定され得ることが理解される。「共鳴構造」という用語も、これらの様々な電荷の局在を指し、かつ上記に例示される式について同様に示されるものであることが理解される。
また、式Ｉの化合物が正味電荷を帯びているため、式Ｉのこれらの化合物は対イオンを付随することが理解される。任意の一価、二価又は多価の対イオンが、本明細書中に包含されるシアニン色素構造の説明に含まれる。例示的な対イオンとしては、負に帯電した対イオン、例えば、ヨウ化物、塩化物、臭化物、水酸化物、酸化物、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、一リン酸塩、二リン酸塩、三リン酸塩等が挙げられる。このような対イオンは、使用される合成方法、精製プロトコル、又は他のイオン交換プロセスに起因し得る。
対イオンの性質及びタイプは、本明細書中に記載のシアニン色素の機能性に影響するようにはみえないと考えられる。当然のことながら、本明細書中に記載の色素を、溶媒又はＰＣＲ等の増幅反応を実施するのに用いられる他の媒体に溶解する場合、付随する対イオンが、溶媒又は他の媒体中に存在する他の対イオンと交換されてもよい。このような付加的な対イオンは、溶媒イオン、塩、バッファ及び／又は金属であってもよい。
本明細書中の内容、スキーム、実施例及び表における、原子価が充足されていない任意の炭素及びヘテロ原子は、原子価を充足するのに十分な数の水素原子（複数可）を有することを前提としていることに留意されたい。加えて、互変異性体形態が、本発明の或る特定の実施形態では等価であるとみなされることも留意されたい。
一実施形態において、Ｒ１及び／若しくはＲ２上、又はＲ３及び／若しくはＲ４及び／若しくはＲ５及び／若しくはＲ６及び／若しくはＲ７上の正電荷（複数可）は、自然の構成において正電荷を有する非対称シアニン色素上の置換基に起因する。別の実施形態では、Ｒ１及び／若しくはＲ２上、又はＲ３及び／若しくはＲ４及び／若しくはＲ５及び／若しくはＲ６及び／若しくはＲ７上の正電荷（複数可）は、ポリメラーゼ連鎖反応等の増幅反応が行われるｐＨで正電荷を有する置換基（単数又は複数）に起因する。
一実施形態において、Ａは式ＩＩの構造を有する。実施形態によっては、Ｒ１が、アリール、ジアルキルアミノで置換されたアルキル、トリアルキルアミノで置換されたアルキル、アルコキシで置換されたアルキル、ジアルキルアミノで置換されるアルコキシで置換されたアルキル、又はＮ置換ヘテロシクリルで置換されたアルキルであり、Ｒ２が、水素、アルキル、チオール、トリアルキルアミノで置換されたアルキル、又はアルコキシで置換されたアルキルである。
別の実施形態では、Ａが式ＩＩＩの構造を有する。実施形態によっては、Ｒ３が、水素、メチル、トリアルキルアミノで置換されたアルキル、又はＮ置換ヘテロシクリルで置換されたアルキルであり、Ｒ４が、水素、アルキル、アリール、チオール、ジアルキルアミノで置換されたアルキル、トリアルキルアミノで置換されたアルキル、ジアルキルアミノで置換されるアルコキシで置換されたアルキル、又はＮ置換ヘテロシクリルで置換されたアルキルであり、Ｒ５が、水素、ハロゲン、アルキル、アリール、又はジアルキルアミノで置換されるアルコキシで置換されたアルキルであり、Ｒ６が、水素、アルキル、トリアルキルアミノで置換されたアルキル、又はＮ置換ヘテロシクリルで置換されたアルキルであり、Ｒ７が、水素、アルキル、又はアルコキシで置換されたアルキルである。
本発明の非対称シアニン色素は、分子のベンズアゾリウム部分を、メチン基（−Ｃ（Ｈ）＝）を介してプリニウム部分又はキナゾリニウム部分に結合させる一般的な方法によって、調製することができる。本明細書中に記載の非対称シアニン色素の合成では、式Ｉの化合物を生成するような前駆体の組合せを使用する。例えば、ベンズアゾリウム前駆体は式ＩＶの化合物であり、
Figure 2012514211
これは、式Ｖのプリニウム化合物
Figure 2012514211
、又は式ＶＩのキナゾリニウム化合物
Figure 2012514211
（式中、Ｂ又はＤの一方はメチルであり、Ｂ又はＤのもう一方は、典型的にはメチルチオ、メチルスルホニル又はクロロである反応性脱離基であるが、反応を完了させるのに十分な反応性をもたらす如何なる脱離基であってもよい）と反応する。
これらの前駆体を調製及び化合するのに必要とされる化学的性質は、当業者により十分に理解されている（例えば、特許文献７；Neiman et al., Israel J Chem 3: 161 (1965)；Brooker et al., J Am Chem Soc 67: 1889 (1945)；Brooker et al., J Am Chem Soc 64: 199 (1942)）。例えば、ベンズアゾリウム部分は、当該技術分野で既知の技法（例えば、Brooker et al., J Am Chem Soc 64: 199 (1942)）により調製してもよく、又は商業的に入手してもよい。プリニウム部分又はキナゾリニウム部分は、当該技術分野で既知の技法により調製することができる。典型的に、プリニウム部分については６（メチル）プリン又は６（メチルチオ）プリン、又はキナゾリニウム部分については任意に置換された４（メチル）キナゾリン又は任意に４（メチルチオ）キナゾリンを、好適なアルキル化剤、例えば、Ｒ１−Ｚ、Ｒ２−Ｚ又はＲ３−Ｚ（式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、前述の通りであり、Ｚは電気陰性基である）を用いて親ヘテロ環をアルキル化する等の従来の技法によって、ベンズアゾリウム部分と化合させる前にアルキル化する。電気陰性基は典型的に、ヨウ化物、メタンスルホン酸塩、硫酸メチル、トリフルオロメタンスルホン酸塩、又はｐ−トルエンスルホン酸塩であるが、反応を完了させるのに十分な反応性をもたらす如何なる電気陰性基であってもよい。
第２の態様において、本発明は、本発明の新規な非対称シアニン色素の存在下で核酸分析を実施する方法を提供する。一実施形態において、本方法は、本発明の非対称シアニン色素を、標的核酸と標的核酸を増幅するように構成される１つ又は複数のプライマーとを含む試料と混合する工程と、非対称シアニン色素の存在下で標的核酸を増幅する工程と、非対称シアニン色素の蛍光をモニタリングする工程とを含む。別の実施形態では、モニタリング工程が、増幅された標的核酸を融解して融解曲線を作成することを含む。さらなる実施形態では、標的核酸が一塩基多型を含む。付加的な実施形態において、本方法は、モニタリングされた蛍光に基づき遺伝子型を同定することをさらに含む。一実施形態では、遺伝子型が融解曲線に基づき同定される。別の実施形態では、増幅及びモニタリングをマイクロ流体チャネルにおいて行う。一実施形態では、モニタリング工程を増幅工程中に行う。別の実施形態では、モニタリング工程を増幅工程に続いて行う。さらなる実施形態では、モニタリングを増幅工程中及び増幅工程に続いて行う。一実施形態において、増幅工程に続くモニタリング工程は、増幅された標的核酸を融解して融解曲線を作成することを含む。
核酸分析のこのような様々な実施形態は、当該技術分野で既知の技法において、用いられる色素の代わりに本発明の新規な非対称シアニン色素を代用することによって、実施される。例えば、本発明の色素を用いた融解分析は、Knight et al.（米国特許出願公開第２００７／０２３１７９９号）、Knapp et al.（特許文献１）、Wittwer et al.（特許文献２）、Wittwer et al.（特許文献３）、Wittwer et al.（特許文献４）及びSundberg et al.（特許文献５）により記載されているような、機器又はマイクロチャンネルにおいて実施することができる。本発明の色素を用いた核酸の増幅は、Knight et al.（米国特許出願公開第２００７／０２３１７９９号）、Hasson et al.（米国特許出願公開第２００８／０００３５８８号）、Hasson et al.（米国特許出願公開第２００８／０１３０９７１号）、Owen et al.（米国特許出願公開第２００８／０１７６２３０号）、Wittwer et al.（特許文献４）、及びSundberg et al.（特許文献５）に記載されているような、機器又はマイクロチャンネルにおいて実施することができる。核酸の増幅及び各段階中のモニタリングによる融解分析は、Knight et al.（米国特許出願公開第２００７／０２３１７９９号）、Hasson et al.（米国特許出願公開第２００８／０１３０９７１号）、及びOwen et al.（米国特許出願公開第２００８／０１７６２３０号）により記載されているような、機器又はマイクロチャンネルにおいて実施することができる。本発明の色素は、これまでに指定した公開された米国特許出願に記載されているような、マルチプレックス反応のための他の既知の色素と併せて使用してもよい。これらの技法は、特定の核酸の有無の同定、一塩基多型の存在の同定、遺伝子型の同定、ホモ接合体及びヘテロ接合体の識別、核酸の遺伝子型判定、突然変異の検出等を決定するのに有用である。
実例としてもたらされ、また本発明を何ら限定するよう意図されるものでない以下の実施例を参照して本発明を説明する。当該技術分野で既知の基本的な技法、又は以下で詳細に説明する技法を利用した。
実施例１
プリニウムをベースとした新たな色素Ｓ１（４）の合成
１． ２−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］ｐ−トルエンスルホン酸塩（１）の合成
丸底フラスコに、５０ｍｌのＣＨ２Ｃl２溶媒に溶解した１．３３ｇの２−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］エタノール（Sigma）及び１．９ｇのｐ−トルエンスルホニルクロリドを充填する。混合物を４０℃の油浴中で１時間加熱する。白色の結晶性固体が溶液から析出する。結晶性固体は、２−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］ｐ−トルエンスルホン酸塩（１）である。
２． ３−｛２−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］｝−６−（メチルチオ）プリン（２）の合成
５．７４ｇの２−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］ｐ−トルエンスルホン酸塩（１）、３．７ｇの６（メチルチオ）プリン（sigma製）、及び２０ｍｌのジメチルホルミド（dimethylformide）を、丸底フラスコ内で混合し、１１０℃の油浴中で３時間加熱する。冷却後、１０ｍｌの水を溶液に添加し、その後、２０ｍｌのベンジル酢酸塩で３回抽出して、未反応の出発試薬を除去する。水溶液のｐＨを、ＮａＯＨを添加して１１に調整する。未反応の出発原料である白色の固体結晶性物質が溶液から析出する。この結晶性の未反応出発原料を除去した後、溶液のｐＨを１４に調整する。２−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］−６−（メチルチオ）プリン（２）である白色の結晶性固体が溶液から析出する。
３． ３−｛２−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］｝７−メチル−６−（メチルチオ）プリン（３）の合成
丸底フラスコ内で、３．１ｇの３−｛２−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］｝−６−（メチルチオ）プリン（２）を、溶媒中で１．９ｇのｐ−トルエンスルホン酸メチルと混合する。混合物を１００℃の油浴中で２時間加熱する。溶液を冷やし、アセトン及びエーテルで洗浄する。白色の非晶質固体物質が有機洗浄液から析出する。固体は３−｛２−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］｝７−メチル−６−（メチルチオ）プリン（３）である。
４． 構造（４）のプリニウムをベースとした新たな色素Ｓ１の合成
丸底フラスコ内で、３．０ｇの−｛２−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］｝７−メチル−６−（メチルチオ）プリン（３）を、１．４ｇの２，３−ジメチルベンゾチアゾリウムヨージド（Sigma）、２０ｍｌのメタノール、及び０．５ｍｌのトリエチルアミンと混合する。混合物を１時間還流させる。冷却後、混合物を濾過し、メタノール及び酢酸ベンジルで洗浄して、上記に挙げた化合物を黄色みがかった橙色の固体として生成する。新たな色素の合成をスキーム１に示す。
Figure 2012514211
Figure 2012514211

Figure 2012514211
実施例２〜実施例１３
プリニウムをベースとした新たな色素の合成
表１に示される置換基を有する、下記式を有するプリニウムをベースとした色素を、好適な出発原料を用いて実施例１の新たな色素と同様に合成する。Ｒ１及び／又はＲ２は、（ポリメラーゼ連鎖反応のｐＨ（典型的にはおよそ７〜８）で正電荷を有すると考えられる。
Figure 2012514211
Figure 2012514211

Figure 2012514211


Figure 2012514211
実施例１４
キナゾリニウムをベースとした新たな色素Ｓ９（５）の合成
工程２で６（メチルチオ）プリンの代わりに４（メチルチオ）キナゾリンを使用する以外は実施例１の工程（１）、工程（２）及び工程（４）と同様に新たなキナゾリニウム色素Ｓ９を調製すると、構造５の色素が得られる。
Figure 2012514211
実施例１５〜実施例２６
キナゾリニウムをベースとした新たな色素の合成
表２から表４に示される置換基を有する、下記式を有する色素を、適切な出発原料を用いて実施例１４の色素と同様に合成する。Ｒ３及び／又はＲ４及び／又はＲ５及び／又はＲ６及び／又はＲ７は、ポリメラーゼ連鎖反応のｐＨ（典型的にはおよそ７〜８）で正電荷を有すると考えられる。
Figure 2012514211
Figure 2012514211

Figure 2012514211
Figure 2012514211
Figure 2012514211
本発明を説明する文脈における（中でも、別添の特許請求の範囲の文脈における）「１つの（”a” and ”an”）」及び「前記／該（”the”）」という用語並びに類似の指示語の使用は、本明細書中に他に指定されるか又は文脈により明らかに否定されない限り、単数及び複数の両方を包含すると解釈される。「含む（comprising）」、「有する（having）」、「挙げられる（including）」及び「含有する（containing）」という用語は、特に断りのない限り、非限定（open-ended：オープンエンド）用語（すなわち、「挙げられる（含まれる）が、これらに限定されない」を意味する）として解釈される。本明細書中の値の範囲の記述は、本明細書中に他に指定のない限り、この範囲内にある各別個の値について個々に言及する省略方法として機能するよう意図されるものに過ぎず、各別個の値は、それが本明細書中に個々に記述されているかのように本明細書中に盛り込まれる。それゆえ例えば、範囲１０〜１５を開示する場合には、１１、１２、１３及び１４も開示される。本明細書中に記載の方法は全て、本明細書中に他に指定のない限り又は文脈により明らかに否定されない限り、任意の好適な順序で実施することができる。本明細書中に提示されるありとあらゆる例又は例示的な言葉（例えば「等（such as）」）の使用は、他に主張のない限り、単に本発明をより良く明白にする（illuminate）ように意図されるものに過ぎず、本発明の範囲に限定をもたらすものではない。本明細書中の言葉は、特許請求がされていない任意の要素を本発明の実施に不可欠なものとして示すものとは解釈されるべきでない。
当然のことながら、本発明の方法及び組成は、様々な実施形態の形で組み込むことができ、そのほんの一部が本明細書中に開示されているに過ぎない。それらの実施形態の変形形態は、上述の説明を読めば当業者には明らかになり得る。本発明者らは、熟練者がこのような変形形態を必要に応じて採用するものと見込んでおり、また本発明者らは、本明細書中に詳細に記載したものとは別の方法で本発明が実施されることを意図している。したがって、本発明は、適用法により認められるような、本明細書に添付される特許請求の範囲に記載される主題の変更形態及び均等物を全て含む。その上、本明細書中に他に指定のない限り又は文脈により明らかに否定されない限り、その全ての可能な変形形態における上記要素の任意の組合せが本発明により網羅される。

Claims (24)

  1. 非対称シアニン色素であって、式Ｉ
    Figure 2012514211
     （式中、
    Ａは、
    Figure 2012514211
     又は
    Figure 2012514211
     （式中、
    ＸはＯ又はＳであり、
    Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は独立して水素、ハロゲン、チオール、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたポリアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたポリアルキニル、任意に置換されたチオアルキル、任意に置換されたアミノアルキル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリール、及び任意に置換されたアリールアルキルであり、
    Ｒ１及び／又はＲ２は、Ｒ１及びＲ２上の正電荷（複数可）の合計が１、２又は３となるように、１つ又は複数の正電荷を帯びており、
    Ｒ３及び／又はＲ４及び／又はＲ５及び／又はＲ６及び／又はＲ７は、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７上の正電荷（複数可）の合計が１、２又は３となるように、１つ又は複数の正電荷を帯びている）
    である）
    を有する、非対称シアニン色素。
  2. Ａが、
    Figure 2012514211
     である、請求項１に記載の非対称シアニン色素。
  3. Ａが、
    Figure 2012514211
     である、請求項１に記載の非対称シアニン色素。
  4. Ｒ２が、水素、アルキル、チオール、トリアルキルアミノで置換されたアルキル又はアルコキシで置換されたアルキルである、請求項２に記載の非対称シアニン色素。
  5. Ｒ１が、アリール、ジアルキルアミノで置換されたアルキル、トリアルキルアミノで置換されたアルキル、アルコキシで置換されたアルキル、ジアルキルアミノで置換されるアルコキシで置換されたアルキル、又はＮ置換ヘテロシクリルで置換されたアルキルである、請求項２に記載の非対称シアニン色素。
  6. Ｒ１が、アリール、ジアルキルアミノで置換されたアルキル、トリアルキルアミノで置換されたアルキル、アルコキシで置換されたアルキル、ジアルキルアミノで置換されるアルコキシで置換されたアルキル、又はＮ置換ヘテロシクリルで置換されたアルキルであり、
    Ｒ２が、水素、アルキル、チオール、トリアルキルアミノで置換されたアルキル、又はアルコキシで置換されたアルキルである、請求項２に記載の非対称シアニン色素。
  7. Ｒ３が、水素、メチル、トリアルキルアミノで置換されたアルキル、又はＮ置換ヘテロシクリルで置換されたアルキルである、請求項３に記載の非対称シアニン色素。
  8. Ｒ４が、水素、アルキル、アリール、チオール、ジアルキルアミノで置換されたアルキル、トリアルキルアミノで置換されたアルキル、ジアルキルアミノで置換されるアルコキシで置換されたアルキル、又はＮ置換ヘテロシクリルで置換されたアルキルである、請求項３に記載の非対称シアニン色素。
  9. Ｒ５が、水素、ハロゲン、アルキル、アリール、又はジアルキルアミノで置換されるアルコキシで置換されたアルキルである、請求項３に記載の非対称シアニン色素。
  10. Ｒ６が、水素、アルキル、トリアルキルアミノで置換されたアルキル、又はＮ置換ヘテロシクリルで置換されたアルキルである、請求項３に記載の非対称シアニン色素。
  11. Ｒ７が、水素、アルキル、又はアルコキシで置換されたアルキルである、請求項３に記載の非対称シアニン色素。
  12. Ｒ３が、水素、メチル、トリアルキルアミノで置換されたアルキル、又はＮ置換ヘテロシクリルで置換されたアルキルであり、
    Ｒ４が、水素、アルキル、アリール、チオール、ジアルキルアミノで置換されたアルキル、トリアルキルアミノで置換されたアルキル、ジアルキルアミノで置換されるアルコキシで置換されたアルキル、又はＮ置換ヘテロシクリルで置換されたアルキルであり、
    Ｒ５が、水素、ハロゲン、アルキル、アリール、又はジアルキルアミノで置換されるアルコキシで置換されたアルキルであり、
    Ｒ６が、水素、アルキル、トリアルキルアミノで置換されたアルキル、又はＮ置換ヘテロシクリルで置換されたアルキルであり、
    Ｒ７が、水素、アルキル、又はアルコキシで置換されたアルキルである、請求項３に記載の非対称シアニン色素。
  13. １つ又は複数の正電荷が天然の色素中に存在する、請求項１に記載の非対称シアニン色素。
  14. １つ又は複数の正電荷が増幅反応のｐＨで色素中に存在する、請求項１に記載の非対称シアニン色素。
  15. 核酸分析の方法であって、
    請求項１に記載の非対称シアニン色素を、標的核酸と該標的核酸を増幅するように構成される１つ又は複数のプライマーとを含む試料と混合する工程と、
    前記非対称シアニン色素の存在下で前記標的核酸を増幅する工程と、
    前記非対称シアニン色素の蛍光をモニタリングする工程とを含む、核酸分析の方法。
  16. 前記モニタリング工程が、前記増幅された標的核酸を融解して融解曲線を作成することを含む、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記標的核酸が一塩基多型を含む、請求項１５に記載の方法。
  18. 前記モニタリングされた蛍光に基づき遺伝子型を同定することをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
  19. 前記融解曲線に基づき遺伝子型を同定することをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
  20. 前記増幅及びモニタリングをマイクロ流体チャネルにおいて行う、請求項１５に記載の方法。
  21. 前記モニタリング工程を前記増幅工程中に行う、請求項１５に記載の方法。
  22. 前記モニタリング工程を前記増幅工程に続いて行う、請求項１５に記載の方法。
  23. 前記モニタリングを前記増幅工程中及び該増幅工程に続いて行う、請求項１５に記載の方法。
  24. 前記増幅工程に続く前記モニタリング工程が、前記増幅された標的核酸を融解して融解曲線を作成することを含む、請求項２３に記載の方法。
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