JPS62112062A - 網状赤血球の検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、一般に、血液サンプル中の網状赤血球の検出
および計測に関する。さらに詳しくは、本発明は、リボ
核酸およびリボ核酸ポリマー（ＲＮＡ　）を染色するの
に適する染料、特に網状赤血球を染色するのに適する染
料に関する。本発明シまさらに螢光組成物に関する。

（従来の孜術） ＲＮＡまたはＲＮＡ含有物質を検出することが必要なこ
とがよくある。たとえば、網状赤血球はＲＮＡを含有す
ることか知られた物質であり、血液サンプル中の網状赤
血球の検出および計測は臨床医にとって重要である。血
液サンプルの網状赤血球計測は血球増生能の指標として
用いられ、急性出血および溶血性貧血におけろ診断およ
び予診価値乞有し、そして鉄、ビタミンＢ１□および葉
酸治療の効果の判断基準である。当該妖術で知られてい
るように、網状赤血球は成熟赤血球細胞の前躯体であり
、それゆえ用語網状赤血球は、細胞の発生および発達を
包含し、これにより成熟赤血球細胞が生ずる。

これまで血液サンプル中の網状赤血球は、たとえばニュ
ーメチレンブルー（ＮＭＢ）、ブリリアントクレシルブ
ルー（ＢＣＢ）、アクリジンオレンジおよびビロニンＹ
のような適当な染料を用いて手動および自動的方法の両
方で測定されてきていた。

染料ニューメチレンブルーを用いた生体染色は網状赤血
球測定についての参考方法と考えられ、そして使用に際
してはこの染料はＲＮＡを沈でんさせろ。この方法は手
作業であり、顕微鏡を用いて多数（たとえば５００〜１
０００）の細胞を数える必要があり、時間がかかり、面
倒であり、そしてまちがえや丁い。ニューメチレンブル
ーは非螢元性であり、実際に沈でんしたＲＮＡを沈でん
した染料から区別することはしばしば困難である。

アクリジンオレンジは、手作業および自動手段の両方に
より網状赤血球の染色にいくらか使用されてきた。アク
リジンオレンジもまたＲＮＡＹ沈でんさせ、このことに
より潜在的消滅のためＲＮＡ含量の定量的評価が阻害さ
れる。さらに、アクリジンオレンジは染色した細胞を拡
散した螢光分布に導びかない。ＲＮＡ含量が螢光に比例
することに基づ（細胞の年齢曲線の信頼性は確実ではな
い。

アクリジンオレンジは流動細胞計測装置のプラスチック
管に非常に親和性があり、これによりバックグランドが
増え流動細胞計測装置管から染料を除去するために長い
作業乞要する。さらに、アクリジンオレンジ染色細胞は
自然螢光性赤血球細胞ピークから分離するのが困難で、
網状赤血球はニューメチレンブルーで得られるものより
一般に低くなる。

ピロニンＹの使用はホルマリンを用いて予め赤血球？固
定する必要があり、めんどうで、時間がかかり、一般に
結果も思わしくない。さらに、ピロニンＹは非常に低い
量子効率であり、これにより非常に低い螢光信号しか与
えない。

１９８３年１月２４日に出願された米国特許出願第４６
０，１４４号は、網状赤血球を染色するための染料とし
てチオフラビンＴＹ利用する網状赤血球の検出方法て関
する・ （発明が解決しようとする問題点） 網状赤血球を染色するための染料は、好ましくは、次の
性質を有する　： １、染料はＲＮＡの不存在下で螢光乞発丁べき、ではな
（・； ２、染料は良好な螢光量子効率を有すべきである；６、
染料はＲＮＡを含有する細胞膜を透過することかできな
ければならない； ４、染料はＦ１４８８　ｎｍに励起ピークを有すること
が好ましい。

ＲＮＡおよび網状赤血球のための前述した公知染料のい
ずれも上記の好ましい特徴全てを有するものはない。

したがって、網状赤血球を染色するためにより適した染
料を提供しこれにより血液サンプル中の網状赤血球を正
確に測定するための手段を提供する必要性がある。

（発明の構成） 不発明の一面によれば、網状赤血球の検出方法において
、 （Ｉ） （式中、 Ｒ，は炭素原子数１〜６のアルキル基であり、Ｒ２は炭
素原子数１〜６のアルキル基であり；そしてｎはＯまた
は１〜６の整数である。） で表わされる染料を用いて網状赤血球を染色することか
らなる前記方法の杖＆を提供するものである。

本発明の別の面によれば、網状赤血球乞本発明の染料で
染色した後、流動細胞計測装置中で網状赤血球を検出す
る。

本発明のさらに別の面によれば、本発明染料で染色され
た網状赤血球からなる組成物を提供するものである。

不発明染料はチオフラピンＴとは構造的に異なる。チオ
フラビンＴは次の構造式を有する：Ｈ３ 簡便さの１こめに、網状赤血球乞染色するための不発明
の染料は゛チアゾールオレンジ”と称する。

出願人は、チアゾールオレンジが網状赤血球を染色する
ための効果的染料であることを見出した。

チアゾールオレンジを使用すると、リボ核酸と未結合グ
）場合にはチアゾールオレンジは螢光をわずかに示すか
または全く示さず、一方間状赤血球中のリボ核酸と結合
するとチアゾールオレンジは螢光を示すという別の利点
ももたらされる。チアゾールオレンジは４８８０ｍで励
起され、−万チオフラビンＴは最大約４５５１ｍで励起
される。

本発明によれば、血液サンプル中の網状赤血球を染色す
る場合、チアゾールオレンジは水溶液として、特に等張
生理食塩水として使用されてもよく、これは少量のメタ
ノールを含んでいてよい。

血液サンプルは全血液または分画された血敵でもよく、
このサンプルはチアゾールオレンジ浴液と混合すること
によりチアゾールオレンジで染色される。染料としてチ
アゾールオレンジを使用することにより、全血液サンプ
ル中の網状赤血球馨検出し計測することができることが
見出された。

チアゾールオレンジは約４７０１ｍに頻い吸収ピーク（
未結合状態で）を示す；しかしながら、未結合の状態で
は、この染料は検出可能な励起よ１こは発光ピークを示
さない。チアゾールオレンジが網状赤血球中のＲＮＡを
染色する場合、その光学特性は大きく変比する。特に、
ｌ＆収凹曲線より艮い波長へとシフトし、染料はここで
強い螢光性乞示す。最大励起波長は約５１０　ｎｍであ
り、最大発光波長は約５３０ｎｍであり、約２０　ｎｍ
のストークスシフトｙ示す。結合チアゾールオレンジの
励起ピークが約５１０ｎｍの大きさであるという結果と
して、自動流動細胞計測装置を用いろ場合、光源は約４
８５ｎｍにエネルギーラインを有する水銀ランプかまた
は４８８　ｎｍで踵い発光を胃するアルゴンイオンＶ−
ザーが使用できる。俵ハと結合しないときのチアゾール
オレンジ染料の螢光の欠除は低いバックグラウンド乞も
たらし、染色していない対照物を率に流子ことにより自
動流動細胞計測装置に対し螢光限界値（丁なわ）“ゲー
ト°“）を選択することができる。励起は他の波長でも
行われろとはいえ、チアゾールオレンジで染色された網
状赤血球はＦＪ４６０ｎｍ〜約５２０ｎｍの成長で励起
する０）が好ましい。

チアゾールオレンジ染料はＲＮ　Ａ　’！ａ’沈でんさ
せず、その結果としてチアゾールオレンジで染色された
網状赤血球は分子内ＲＮＡの比較的均一な分布を保ち、
これにより個々の網状赤血球ケ測定する螢光信号とその
ＲＮＡ含量の間にほぼ直線状の関係がある。臨床的には
、ＲＮＡ含量が網状赤血球の加令の関数であるのでこれ
により網状赤血球の含量以外にさらに別の情報が謳床医
に与えられる。したがって、チアゾールオレンジを用い
ることにより、臨床医は簡単な網状赤血球計測を行うだ
けでなく、網状赤血球の加令の輪郭をつかむことができ
る。

血液サンプル中で網状赤血球を染色するたのにチアゾー
ルオレンジを使用することは、染色された網状赤血球か
らの螢光信号が成熟赤血球のものと完全に分離し、これ
により広範なデータ処理をすることなく直接自動流動細
胞計測装置で結果を読み取ることができるという別の利
点を提供する。

チアゾールオレンジで染色された網状赤血球は、目動流
動細胞計測装置中で数えられるのが好ましいとはいえ、
手動によりま１こは自動比された鏡検法により計測され
ろこともできる。

自動流動細胞計測装置は当該孜術でよく知られており、
本発明はいずれか特定の流動細胞計測装置の使用に限定
されるものではない。たとえば、チアゾールオレンジで
染色された網状赤血球中、ＦＡＣＳアナライザーＴＭ　
流動細胞計測装置またはＦＡＣ３４４０ＴＭ流動細胞計
測装置中で瑛出し計測することもでき、これらは両方と
もベクトン・デイツキンンン・アンド・コンパニー（Ｂ
ｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎ
ｙ）から販売されている口このような自動流動細胞計測
装置を用いるには、未染色対照サンプルを使用して螢光
ゲートを設定し、次いでこの螢光ゲート乞染色サンプル
に用いる。

チアゾールオレンジで染色した網状赤血球の検出および
計測に自動流動細胞計測装置を使用すると、メチレンブ
ルーまたはアクリジンオレンジを用いた網状赤血球計測
についての公知の一般的方法により得られる結果とほぼ
均似した結果が得られろ。

自動流動細胞計測装置におけるチアゾールオレンジで染
色した網状赤血球の使用は、螢光バックグラウンドが低
くそして未染色対照物の使用により螢光ゲートが簡単に
選択されるという点で特に有利である。さらに、分子内
網状赤血球ＲＮＡが沈でんせず、このたの細胞を固定比
する必要がない。さらに、網状赤血球加−について情報
を与える個々の網状赤血球についての螢光信号との間に
直線状の関係がある。

本発明のさらに有利な点は、チアゾールオレンジで染色
された網状赤血球がより低い感度の自製流動細胞計測装
置で使用されることができ、たとえばアルゴンレーザー
の代りに水嘘アークランプを使用してもよい。

メラメードら（Ｍｅｌａｍｅｄ　ｅｔ　ａ　ｌ　、　）
　　により編集された“フロー・サイトメトリイ・アン
ド・ソーティング（Ｆｌｏｗ　Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ　ａ
ｎｄ　Ｓｏｒｔｉｎｇ）″。

ｐ４５７−５８　（ジョン・ウイリイ・アンド・サンズ
）には、生きている細胞のＲＮＡ染色のためにアクリジ
ンオレンジとチオフラビンＴの両方を使用することが記
載されているが、この文献には自動流動細胞計測装置中
で網状赤血球検出および計測のための染料としてチアゾ
ールオレンジを使用することは記載されていない。

次の実施例により本発明の様々な特徴を示すがいかなる
意味においても特許請求の範囲に述べられた本発明の範
囲を限定するものではない。

実施例 式■中のＲ，とＲ２がＣＨ３でｎが１であるチアゾール
オレンジを網状赤血球染色の手段に用いた。

１ｍｇ／−の染料／メタノール貯蔵液を調製する。ｐＨ
７，２のリン酸緩衝食塩水で貯蔵漱の１：８，０００希
釈を行い、希釈染料溶液１ｍｌへ全血５μｌ’ｒ混入す
る。サンプルを、励起波長４８８　ｎｍと５３０／３０
ｎｍバンドパスフィルターを用いてＦＡＣ３４４０ＴＭ
流動細胞計測装置中で分析する。

第１〜５図に、不例のチアゾールオレンジを用いた正常
および貧血性血液の網状赤血球分析にっ〜・てのデータ
を示す。第１図は、正常な未染色血液についての螢光ヒ
ストグラム８よび螢光と前方散乱（ｆｏｒｗａｒｄ　５
ｃａｔｔｅｒ）ｆｆ：示す。第２図はチアゾールオレン
ジで染色された正常血液についてのデータを示す。第６
図は未染色貧血性血液にューメチレンブルー分析による
１７．３％網状赤血球）を示す；第４図は染色後の貧血
性血液を示す。第５図は、時間を変えて（６０分、７０
分、７時間）本例のチアゾールオレンジを用いて染色し
た貧血性血液にューメチレンブルー分析による８、４％
網状赤血球）のサンプルを示す。

上記記載に照らして本発明の多数の変形および変法が可
能であり、それゆえ特許請求の範囲内で本発明は特に記
載されたもの以外の別の方法で実施されてもよい。

【図面の簡単な説明】

第１図は正常な奥染色血液についての螢光ヒストグラム
および螢光と前方散乱を示す図であり、第２図はチアゾ
ールオレンジで染色し１こ正常血液についての螢光ヒス
トグラムおよび螢光と前号散乱を示す図であり、 第６図は未染色の貧血性血液についての螢光ヒストグラ
ムおよび螢光と前方散乱を示す図であり、第４図はチア
ゾールオレンジで染色した貧血性血液についての螢光ヒ
ストグラムおよび螢光と前方散乱を示す図であり、 第５図は時間を変えてチアゾールオレンジで染色した貧
血性血液の螢光と前方散乱を示す図である。 ＦＩＧ、１．　　ユＩ宅ン１．禾」ご色＊　＝＊左　　
　　　右　　１娑％　　−ト　　ｚ織計　　キカ　　　
　七−Ｅ′　　じ−ク　　　Ｃ９の　　　　　　　７９
　　　　９１１２３　　　　９９．５　　　　９８．２
　　　　　３の、２９　　　　　　ｉｌ、の＠　　　　
　＋２９３　　　６９．６１ＬＬＳ　　　　　　　２５
５　　　　　　ａｅ　　　　　＠、４　　　　　ｓ、ａ
　　　　　＋ｓｓ、＋＠　　　　ｚｓｓ、ａＱ　　　　
　２５　　　４４．６ＦＩＧ、２．　　　ラー７ノ二ル
　λレン、；了゛　イＩさし丁こ」ヒ１り立ｍ、哨（Ｂ
Ｄ＋５ＣＯＮＳＯＲＴｖの−Ｆ？ｅｖＤ８り／８５Ｌ　
　　　　、＆　　４３　　％７°−トー１−轟；ヤ　　
　斗均　　　　を−冒゛　　こ′）　　　Ｃすの７９９
６６９９８．８９６５３３７５＋１の０１１３の６５２
［１９ＺＳ５　　　１２２　　　１．２　　　１．２　
　１１２．７３　　　ａＱ、ＢＯ１７４！ＩＪＦＩＧ、
３・電血性會歳、禾ψさ

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）網状赤血球の検出方法において、チアゾールオレ
   ンジで染色して網状赤血球を検出することからなる前記
   方法。
2. （２）検出を流動細胞計測装置で行う特許請求の範囲第
   １項記載の方法。
3. （３）チアゾールオレンジで染色した網状赤血球が水銀
   アーク灯からの光で波動細胞計測装置中にて励起される
   特許請求の範囲第２項記載の方法。
4. （４）チアゾールオレンジで染色した網状赤血球がアル
   ゴンレーザーからの光で流動細胞計測装置中にて励起さ
   れる特許請求の範囲第２項記載の方法。
5. （５）網状赤血球が全血液からなるサンプル中に存在す
   る特許請求の範囲第２項記載の方法。
6. （６）網状赤血球をそれを固定化をすることなく検出す
   る特許請求の範囲第２項記載の方法。
7. （７）チアゾールオレンジで染色された網状赤血球から
   なる組成物。