CN110488013B - 结合纳米孔技术的肿瘤标志miRNA检测装置及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种结合纳米孔技术的肿瘤标志miRNA检测装置及方法，主要由门电压控制模块和纳米孔检测模块构成。其中门电压控制模块由门电压控制器和电池组组成；纳米孔检测模块由集成门电极的纳米孔传感器、膜片钳放大器和计算机组成。本方法结合纳米孔检测技术，在不需要扩增以及荧光标记被检测物的基础上，可以有效提高肿瘤标志miRNA的检测效率。

Description

结合纳米孔技术的肿瘤标志miRNA检测装置及方法
技术领域
本发明涉及一种结合纳米孔技术的肿瘤标志miRNA检测方法，属于微机械电子技术领域。
背景技术
目前，癌症已经成为危害我国人民健康的主要疾病。随着老龄化进程的加快，我国癌症发病、死亡率还将不断上升，对国家、社会和个人造成沉重的经济负担，而应对癌症高发的唯一出路是“早发现、早诊断、早治疗”。
但是目前，大多数肿瘤疾病在临床上主要通过影像学和组织病理分析进行诊断，而这两种技术手段并不具备癌症早期筛查的能力，所以利用这两类传统方法确诊为癌症时，患者的病情往往已经发展至中晚期，从而导致治疗方案无法优化，使得患者生命难以得到延续。为了能够在更早期筛查癌症，需要将检测手段从现有的影像学和组织病理分析深入发展至细胞水平甚至分子基因水平。虽然目前已有几种血清学肿瘤标志物(AFP、CEA、CA19-9等)成为常规体检的检测项目，但是这些标志物容易受生理状态的影响，波动性很大，尤其在癌症早期，不具有很好的灵敏性和特异性，仅具有参考意义，并不能作为癌症的诊断依据。
研究发现，癌细胞中的miRNA表达常常失调，致癌miRNA的表达上升，抑癌miRNA的表达则被下调。目前已经在肺癌、胰腺癌、口腔癌、乳腺癌、胃癌等癌症患者体内发现多种特定的miRNA的表达量与健康人群不同。现有常规的miRNA检测手段为反转录酶链式扩增反应(RT-PCR)和基因芯片(Microarray)，但是由于miRNA的序列过短，故这两种miRNA检测技术存在扩增易出错、交叉杂化等问题，限制了其在临床诊断的有效应用。
纳米孔传感器作为新一代的单分子检测技术，已经成功的应用于多种生物分子的辨识。与现有技术相比，纳米孔技术既不需要扩增，也不需要荧光标记被检测物，具有低成本、高通量的特性。而且纳米孔技术拥有优异的检测性能，在空间分辨率上，利用纳米孔技术最小可以辨识单核苷酸分子；在检测灵敏度上，最低能够实现1fM的miRNA分子检测。
针对现有肿瘤标志miRNA检测技术存在的问题以及基于纳米孔技术具有的优异检测性能，提出一种结合纳米孔技术的肿瘤标志miRNA检测方法。
发明内容
本发明的目的是为克服现有肿瘤标志miRNA检测技术中存在的诸多问题，对于癌症患者，能够做到“早发现”和“早诊断”，提出一种结合纳米孔技术的肿瘤标志miRNA检测装置及方法。
为达到上述目的，本发明采用的方法是：一种结合纳米孔技术的肿瘤标志miRNA检测装置，包括门电压控制模块和纳米孔检测模块；所述的门电压控制模块由门电压控制器和电池组组成，门电压控制器的电压由电池组提供；所述的纳米孔检测模块由集成门电极纳米孔传感器、膜片钳放大器和计算机组成，所述的集成门电极纳米孔传感器包括Si基底、SiN薄膜、金属金和氧化铝绝缘层，所述的Si基底、SiN薄膜、金属金和氧化铝绝缘层由下到上依次分布，所述的金属金表面与门电压控制器相连；在所述的纳米孔检测模块上还设置有纳米孔；所述的膜片钳放大器的两个Ag/AgCl电极分别置于集成门电极纳米孔传感器的两端，膜片钳放大器可以将采集到的信号进行放大，再通过数据传输线将膜片钳设备与计算机相连。
本发明还公开了上述结合纳米孔技术的肿瘤标志miRNA检测装置的检测方法，包括如下步骤：
一、校准步骤：
（1）将膜片钳放大器的Ag/AgCl负电极置于集成门电极纳米孔传感器的上端，Ag/AgCl正电极置于集成门电极纳米孔传感器的下端，外加电场通过两个Ag/AgCl电极施加，将集成门电极纳米孔传感器周边充满中性电解液，中性电解液中的离子在外加电场作用下通过集成门电极纳米孔传感器中的纳米孔，此时通过膜片钳放大器，在计算机上得到的电流信号即为基准信号；
（2）将绑有亲和素的PNA探针加入到Ag/AgCl负电极一端；
（3）通过门电压控制器对集成门电极纳米孔传感器的表面电性和带电量进行调节，通过膜片钳放大器，在计算机上观察得到的电流信号，与基准信号进行比对，信号一致；
（4）将肿瘤标志miRNA分子与绑有亲和素的PNA探针在合适的条件下相互混合，进行杂化反应；
（5）往Ag/AgCl负电极一端加入肿瘤标志miRNA分子与绑有亲和素的PNA探针杂化反应后的溶液，由于肿瘤标志miRNA分子能与带有亲和素的PNA探针特异性结合，此时亲和素整体在外加电场和电渗力的作用下，会通过集成门电极纳米孔传感器的纳米孔，通过膜片钳放大器，得到电流脉冲信号，在计算机上得到的电流脉冲信号即为参考信号，此时完成校准。
二、检测步骤：
（6）将待测物质与绑有亲和素的PNA探针在合适的条件下进行杂化反应；
（7）往Ag/AgCl负电极一端加入待测物质与绑有亲和素的PNA探针杂交反应后的溶液，通过膜片钳放大器，在计算机上观察得到的电流脉冲信号，与参考信号进行比对，如果出现和参考信号相同的电流脉冲信号，则代表含有肿瘤标志miRNA分子。
有益效果：
与现有技术相比，本发明提出的一种结合纳米孔技术的肿瘤标志miRNA的检测方法，该方法采用纳米孔传感器技术，一种新一代单分子检测技术，本发明所采用的纳米孔传感器表面镀上金属金，可以通过外接门电压控制模块改变纳米孔传感器表面电性和带电量，同时采用在亲和素上结合可以与肿瘤标志miRNA相结合的PNA作为探针。其工作原理：集成门电极纳米孔传感器周边充满电解液，其中金属金表面有氧化铝保护，先将结合有PNA探针的亲和素加入到集成门电极纳米孔传感器其中一端时，在外加偏置驱动电压和门电压控制模块的作用下，结合有PNA探针的亲和素所受电渗力和电泳力的合力方向与亲和素通过纳米孔方向相反，此时亲和素整体无法通过纳米孔，然后将肿瘤标志miRNA分子加入到亲和素一端，由于PNA探针能与肿瘤标志miRNA分子结合，从而使得此时亲和素整体所受电渗力和电泳力合力方向与亲和素进入纳米孔方向相同，所以生物分子会通过集成门电极纳米孔传感器的纳米孔，由于物理占位效应，引起电流信号变化，然后通过膜片钳设备进行信号放大，根据变化的电流信号进行检测，相比于现有的miRNA检测技术，其既不需要扩增，也不需要荧光标记被检测物以及低成本高通量。
附图说明
图1为本发明的结构示意图；
图2A至2F为肿瘤标志miRNA检测过程示意图。
其中，图中序号如下：1-门电压控制器、2-金属金、3-氧化铝绝缘层、4-肿瘤标志miRNA分子、5-PNA探针、6-亲和素分子、7-Ag/AgCl负电极、8-膜片钳放大器、9-计算机、10-Ag/AgCl正电极、11-纳米孔、12-Si基底、13-SiN薄膜、14-电池组、15-生物分子所受电渗力方向、16-生物分子所受电泳力方向、17-集成门电极纳米孔传感器、18-基准准信号、19-参考信号、20-其他信号。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的一种结合纳米孔技术的肿瘤标志miRNA分子检测方法做详细说明：
如图1所示，本发明公开了一种结合纳米孔技术的肿瘤标志miRNA检测装置，包括门电压控制模块和纳米孔检测模块；所述的门电压控制模块由门电压控制器1和电池组14组成，门电压控制器1的电压由电池组14提供；所述的纳米孔检测模块由集成门电极纳米孔传感器、膜片钳放大器8和计算机9组成。
所述的集成门电极纳米孔传感器包括Si基底12、SiN薄膜13、金属金3和氧化铝绝缘层4，所述的Si基底12、SiN薄膜13、金属金3和氧化铝绝缘层4由下到上依次分布，所述的金属金3表面与门电压控制器1相连。
在所述的纳米孔检测模块上还设置有纳米孔11；所述的膜片钳放大器8的两个Ag/AgCl电极7、10分别置于集成门电极纳米孔传感器的两端，膜片钳放大器8可以将采集到的信号进行放大，再通过数据传输线将膜片钳设备与计算机9相连。
通过上述装置进行肿瘤标志miRNA检测具体过程为：膜片钳放大器8的Ag/AgCl负电极7置于集成门电极纳米孔传感器17的上端，Ag/AgCl正电极10置于镀金纳米孔传感器17的下端，外加电场通过两个Ag/AgCl电极施加，集成门电极纳米孔传感器17周边充满中性电解液。一开始，将绑有亲和素6的PNA探针5加入到Ag/AgCl负电极7一端，亲和素6在中性溶液中带微弱正电，PNA探针5不带电，且PNA探针5可以与肿瘤标志miRNA分子4特异性结合，在外加偏置电场作用下，此时绑有亲和素6的PNA探针5受到的电场力方向如15所示，此时通过门电压控制器1对集成门电极纳米孔传感器17的表面电性和带电量进行调节，此时绑有亲和素6的PNA探针5受到的电渗力如图中标号16所示，由于此时亲和素整体所受合力方向与进入纳米孔的方向相反，所以亲和素整体处于如图2A所示的状态，由于绑有亲和素6的PNA探针5没有通过纳米孔11，只有中性电解液中的离子通过纳米孔11，此时通过膜片钳放大器8，在计算机9上观察到如图2B中18所示的电流信号。
然后将肿瘤标志miRNA分子4与绑有亲和素的PNA探针5在合适的条件下混合，进行杂化反应，将杂化之后的溶液加入到Ag/AgCl负电极7一端，通过膜片钳放大器8，在计算机9上观察到如图2D中19所示的电流脉冲信号，即完成校准。
将待测物质与绑有亲和素的PNA探针在合适的条件下混合，并静置一段时间之后，往Ag/AgCl负电极7一端加入待测物质与绑有亲和素的PNA探针混合静置的溶液，如果待测物质中含有肿瘤标志miRNA分子4因为肿瘤标志miRNA分子4会与PNA探针5特异性结合，肿瘤标志miRNA分子4带强负电，所以与肿瘤标志miRNA分子4杂化的PNA探针5，显强负电荷，此时电场力方向如图2C中所示，由于集成门电极纳米孔传感器17表面依然带正电，所以与肿瘤标志miRNA分子4杂化的PNA探针5，所受到的电渗力方向16不变，此时亲和素整体所受电渗力和电泳力的合力方向与进孔方向相同，在这两个力的作用下，杂化有肿瘤标志miRNA分子4的PNA探针5通过纳米孔11，通过膜片钳放大器8，此时在计算机9上可以观察到如图2D中19所示的参考电流脉冲信号，即检测到肿瘤标志miRNA分子4。
如果待测物质中不含有肿瘤标志miRNA分子，只有其他RNA分子20，然而其他RNA分子20并不会和PNA探针5特异性结合，但是由于RNA分子带强负电荷，所以其他RNA分子受到的电场力和电渗力方向如图2E所示，此时其他RNA分子所受电渗力和电泳力的合力方向与进入纳米孔方向相同，在这两个力的作用下，其他RNA分子依然会通过纳米孔11，通过膜片钳放大器8，在计算机9上观察到如图2F中21所示的电流脉冲信号，与参考信号19不同，即待测物质中不含有肿瘤标志miRNA分子。

Claims (2)

1.一种结合纳米孔技术的肿瘤标志miRNA检测装置，其特征在于：包括门电压控制模块和纳米孔检测模块；所述的门电压控制模块由门电压控制器和电池组组成，门电压控制器的电压由电池组提供；所述的纳米孔检测模块由集成门电极纳米孔传感器、膜片钳放大器和计算机组成，所述的集成门电极纳米孔传感器包括Si基底、SiN薄膜、金属金和氧化铝绝缘层，所述的Si基底、SiN薄膜、金属金和氧化铝绝缘层由下到上依次分布，所述的金属金表面与门电压控制器相连；在所述的纳米孔检测模块上还设置有纳米孔；所述的膜片钳放大器的两个Ag/AgCl电极分别置于集成门电极纳米孔传感器的两端，将绑有亲和素的PNA探针加入到Ag/AgCl负电极一端,膜片钳放大器将采集到的信号进行放大，再通过数据传输线将膜片钳设备与计算机相连。
2.根据权利要求1所述的结合纳米孔技术的肿瘤标志miRNA检测装置的校准方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将膜片钳放大器的Ag/AgCl负电极置于集成门电极纳米孔传感器的上端，Ag/AgCl正电极置于集成门电极纳米孔传感器的下端，外加电场通过两个Ag/AgCl电极施加，将集成门电极纳米孔传感器周边充满中性电解液，中性电解液中的离子在外加电场作用下通过集成门电极纳米孔传感器中的纳米孔，此时通过膜片钳放大器，在计算机上得到的电流信号即为基准信号；
（2）将绑有亲和素的PNA探针加入到Ag/AgCl负电极一端；
（3）通过门电压控制器对集成门电极纳米孔传感器的表面电性和带电量进行调节，通过膜片钳放大器，在计算机上观察得到的电流信号，与基准信号进行比对，信号一致；
（4）将肿瘤标志miRNA分子与绑有亲和素的PNA探针在合适的条件下相互混合，进行杂化反应；
（5）往Ag/AgCl负电极一端加入肿瘤标志miRNA分子与绑有亲和素的PNA探针杂交反应后的溶液，由于肿瘤标志miRNA分子能与带有亲和素的PNA探针特异性结合，此时亲和素整体在外加电场和电渗力的作用下，会通过集成门电极纳米孔传感器的纳米孔，通过膜片钳放大器，得到电流脉冲信号，在计算机上得到的电流脉冲信号即为参考信号，此时完成校准。
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