CN111175347B - 一种纳米线生物传感器的制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种纳米线生物传感器的制备方法及其应用，属于生物测试技术领域。本发明的纳米线生物传感器的制备方法，根据所要检测的目标设计对应的单链核酸探针，即可对目标核酸进行检测。同时通过电加热的核酸解链和原位释放技术，可以在原位实现对目标核酸的连续动态检测，从而掌握目标核酸分子的浓度变化情况。本发明方法制备的纳米线生物传感器，可以便捷、快速的制备出所需的纳米线生物传感器，用于简单快速的实现生物标志物的解链与原位释放。可针对某一疾病的生物标志物，根据特定生物标志物的浓度变化来对被检测人进行早期诊断与预后，可广泛应用于如肿瘤早筛与预后监测、单细胞研究、辅助生殖中的胚胎培养发育等领域。

Description

一种纳米线生物传感器的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及一种纳米线生物传感器的制备方法及其应用，属于生物测试技术领域。
背景技术
人体生化指标的实时检测可以为医学临床实践提供丰富的具有诊断价值的健康信息，如人体代谢产物、细胞因子、生物标志物等多维度、多层次信息，其中生物标志物的检测尤其对肿瘤早期筛查与预后具有重要意义。目前生物标志物主要由大型医学检测仪器或体外诊断设备通过离体分析血液、组织液、尿液、粪便等体液及排泄物获得，难以实现实时检测，与获取人体连续动态健康信息的需求存在巨大落差。因此，希望以高灵敏度和实时性检测生物标志物的动态变化趋势，具有重大意义。
目前使用的高灵敏度核酸检测方法为使用场效应管(FET)技术为支撑的电生物传感器。其中石墨烯FET生物传感器具有良好的检测性能，其在石墨烯表面预先固定可用于DNA链置换的探针，来特异性的检测目标片段，同时具有检测单个核苷酸突变的能力，既能够检测单核苷酸多态性(SNP)。中国专利申请CN108700535A、发明名称为用于核酸检测和鉴别的纳米传感器，公开了一种基于核酸链置换以单核苷酸分辨率检测或鉴别核酸的方法、系统和纳米传感器装置。该检测方法所使用的石墨烯FET场效应管，加工流程复杂、耗时长，并且加工流程中有石墨烯转印步骤，失败率较高，因此整体加工成本高。虽然石墨烯FET场效应管传感器具有检测单核苷酸多态性(SNP)的能力，但如果未经其它步骤，只能实现对完全匹配核酸片段的单次检测，无法实现对同一核酸片段的多次反复测量，既无法实现一个传感器对目标片段动态变化趋势的检测。
发明内容
本发明的目的是提出一种纳米线生物传感器的制备方法及其应用，使用成熟的微加工技术简便、快速的制备出纳米线生物传感器，通过对其进行修饰，使其具备检测核酸生物标志物的功能，同时利用纳米线的电加热特性对捕获后的核酸生物标志物进行解链与原位释放，以实现对核酸生物标志物的连续动态检测。
本发明提出的纳米线生物传感器的制备方法，有两种不同的制备方法；
第一种制备方法包括以下步骤：
(1)制备硅基底：
(1-1)将硅片先后用丙酮和异丙醇反复冲洗，用氮气吹干表面；
(1-2)将干燥后的硅片放入氧化炉中，在硅片表面生长二氧化硅绝缘层，得到硅基底，二氧化硅绝缘层的厚度为100-1000纳米；
(2)在步骤(1)的硅基底上制备信号采集电极和金属纳米线，包括以下步骤：
(2-1)在铬板上采用制版方法，制备得到带有对齐标志的信号采集电极的掩模铬板，备用；
(2-2)将步骤(1)的硅基底先后用丙酮和异丙醇反复冲洗三次，用氮气吹干表面，再放置于100-120℃的热板上保持1-2分钟，使硅基底完全干燥；
(2-3)将干燥后的硅基底置于匀胶机上，在硅基底的表面旋涂电子束胶，在硅基底的表面形成300-400纳米厚的电子束胶薄层；
(2-4)采用电子束曝光方法，在步骤(2-3)旋涂了电子束胶的硅基底的中央位置和对齐标志位置上，曝光出宽度为100-500纳米、长度为50-200微米的纳米线和对齐标志，将电子束曝光后的硅基底放入电子束显影液中将被曝光部分的电子束胶去除，在硅基底表面得到纳米线槽和对齐标志槽，用去离子水清洗，氮气吹干；
(2-5)采用磁控溅射的方法，向步骤(2-4)的表面带有纳米线槽和对齐标志槽的硅基底上溅射5-20纳米厚的金属连接层，再溅射5-300纳米厚的金属传感层，在硅基底表面制备得到金属纳米线和对齐标志，使用丙酮和超声结合的方式进行清洗，将硅基底表面未被曝光部分的电子束胶与金属剥离，用去离子水冲洗，氮气吹干，在100-120℃的热板上保持90秒，完全干燥；
(2-6)将步骤(2-5)的带有金属纳米线和对齐标志的硅基底置于匀胶机上，旋涂光刻胶，在硅基底表面形成1.3-1.5微米厚的光刻胶薄层；先以100转每分钟旋涂10秒钟，然后以4000转每分钟旋涂40秒；
(2-7)将步骤(2-6)的带有旋涂光刻胶的硅基底放置于光刻机上，将步骤(2-1)信号采集电极的掩模铬板放置涂有光刻胶的硅基底上方，使硅基底上的对齐标志与信号采集电极的掩模铬板上的对齐标志对齐后，并使硅基底与信号采集电极的掩模铬板相互贴合，采用光刻方法，从信号采集电极的掩模铬板的上方进行光刻，再放入显影液中，将被未曝光部分的光刻胶去除，在硅基底表面制备得到信号采集电极槽，用去离子水清洗，氮气吹干；
(2-8)采用磁控溅射方法，对带有信号采集电极槽的硅基底表面进行磁控溅射，先溅射5-20纳米厚的金属连接层，再溅射5-300纳米厚的金属传感层，采用丙酮和超声结合的方法进行清洗，将被曝光部分的光刻胶与金属剥离，用去离子水冲洗，氮气吹干，在硅基底上制备得到信号采集电极和金属纳米线；
(3)制备一个引流块，其结构如图3所示，在引流块中加工第一通孔和第二通孔，引流块的底部加工凹槽，使凹槽的宽度与步骤(2)的金属纳米线的长度相等，凹槽的长度为4-6毫米，凹槽的深度为50-200微米，使该凹槽成为第一通孔与第二通孔之间的底部通道；
(4)将步骤(3)的引流块的底部与步骤(2)的硅基底相对固定，使引流块的底部通道的长度方向与纳米线的长度方向相互垂直，并完全覆盖纳米线；
(5)在步骤(4)的纳米线上连接探针，包括以下步骤：
(5-1)向引流块的第一通孔中通入溶于磷酸缓冲盐溶液的生物素修饰的牛血清蛋白溶液，生物素修饰的牛血清蛋白溶液的质量体积浓度为200微克/毫升，使生物素修饰的牛血清蛋白溶液充满第一通孔、底部通道和第二通孔，使生物素修饰的牛血清蛋白溶液在底部通道中室温下停留2小时，向引流块的第一通孔中通入磷酸缓冲盐溶液，使生物素修饰的牛血清蛋白溶液从第二通孔中流出；
(5-2)向引流块的第一通孔中通入溶于磷酸缓冲盐溶液的链霉亲和素溶液，溶于磷酸缓冲盐溶液的链霉亲和素溶液的质量体积浓度为100微克/毫升，使溶于磷酸缓冲盐溶液的链霉亲和素溶液充满第一通孔、底部通道和第二通孔，溶于磷酸缓冲盐溶液的链霉亲和素溶液在底部通道中37℃下停留1小时，向引流块的第一通孔中通入磷酸缓冲盐溶液，使溶于磷酸缓冲盐溶液的链霉亲和素溶液从引流块的第二通孔中流出；
(5-3)向引流块的第一通孔中通入溶于磷酸缓冲盐溶液的生物素修饰的探针溶液，探针溶液的摩尔浓度为1微摩/毫升，使探针溶液充满第一通孔、底部通道和第二通孔，在室温下停留1小时，向引流块的第一通孔中通入磷酸缓冲盐溶液，使探针溶液从引流块的第二通孔中流出，此时探针连接上纳米线，得到纳米线生物传感器。
或者：
第一种制备方法包括以下步骤：
(1)制备硅基底：
(1-1)将硅片先后用丙酮和异丙醇反复冲洗，用氮气吹干表面；
(1-2)将干燥后的硅片放入氧化炉中，在硅片表面生长二氧化硅绝缘层，得到硅基底，二氧化硅绝缘层的厚度为100-1000纳米；
(2)在步骤(1)的硅基底上制备信号采集电极和金属纳米线，包括以下步骤：
(2-1)在铬板上采用制版方法，制备得到带有对齐标志的信号采集电极的掩模铬板，备用；
(2-2)将步骤(1)的硅基底先后用丙酮和异丙醇反复冲洗三次，用氮气吹干表面，再放置于100-120℃的热板上保持1-2分钟，使硅基底完全干燥；
(2-3)将干燥后的硅基底置于匀胶机上，在硅基底的表面旋涂电子束胶，在硅基底的表面形成300-400纳米厚的电子束胶薄层；
(2-4)采用电子束曝光方法，在步骤(2-3)旋涂了电子束胶的硅基底的中央位置和对齐标志位置上，曝光出宽度为100-500纳米、长度为50-200微米的纳米线和对齐标志，将电子束曝光后的硅基底放入电子束显影液中将被曝光部分的电子束胶去除，在硅基底表面得到纳米线槽和对齐标志槽，用去离子水清洗，氮气吹干；
(2-5)采用磁控溅射的方法，向步骤(2-4)的表面带有纳米线槽和对齐标志槽的硅基底上溅射5-20纳米厚的金属连接层，再溅射5-300纳米厚的金属传感层，在硅基底表面制备得到金属纳米线和对齐标志，使用丙酮和超声结合的方式进行清洗，将硅基底表面未被曝光部分的电子束胶与金属剥离，用去离子水冲洗，氮气吹干，在100-120℃的热板上保持90秒，完全干燥；
(2-6)将步骤(2-5)的带有金属纳米线和对齐标志的硅基底置于匀胶机上，旋涂光刻胶，在硅基底表面形成1.3-1.5微米厚的光刻胶薄层，先以100转每分钟旋涂10秒钟，然后以4000转每分钟旋涂40秒；
(2-7)将步骤(2-6)的带有旋涂光刻胶的硅基底放置于光刻机上，将步骤(2-1)信号采集电极的掩模铬板放置涂有光刻胶的硅基底上方，使硅基底上的对齐标志与信号采集电极的掩模铬板上的对齐标志对齐后，并使硅基底与信号采集电极的掩模铬板相互贴合，采用光刻方法，从信号采集电极的掩模铬板的上方进行光刻，再放入显影液中，将被未曝光部分的光刻胶去除，在硅基底表面制备得到信号采集电极槽，用去离子水清洗，氮气吹干；
(2-8)采用磁控溅射方法，对带有信号采集电极槽的硅基底表面进行磁控溅射，先溅射5-20纳米厚的金属连接层，再溅射5-300纳米厚的金属传感层，采用丙酮和超声结合的方法进行清洗，将被曝光部分的光刻胶与金属剥离，用去离子水冲洗，氮气吹干，在硅基底上制备得到信号采集电极和金属纳米线；
(3)制备一个引流块，在引流块中加工第一通孔和第二通孔，引流块的底部加工凹槽，使凹槽的宽度与步骤(2)的金属纳米线的长度相等，凹槽的长度为4-6毫米，凹槽的深度为50-200微米，使该凹槽成为第一通孔与第二通孔之间的底部通道；
(4)将步骤(3)的引流块的底部与步骤(2)的硅基底相对固定，使引流块的底部通道的长度方向与纳米线的长度方向相互垂直，并完全覆盖纳米线；
(5)在步骤(4)的纳米线上连接探针，包括以下步骤：
(5-1)向引流块的第一通孔中通入溶于纯乙醇的11-巯基十一烷酸溶液，溶于纯乙醇的11-巯基十一烷酸溶液的摩尔浓度为1毫摩尔/升，使溶于纯乙醇的11-巯基十一烷酸溶液充满第一通孔、底部通道和第二通孔，溶于纯乙醇的11-巯基十一烷酸溶液在底部通道7中室温下停留1小时，向引流块的第一通孔中通入纯乙醇，使溶于纯乙醇的11-巯基十一烷酸从引流块的第二通孔中流出；
(5-2)向引流块的第一通孔中通入摩尔浓度为50毫摩尔/升、pH＝5.0的2-(N-吗啉)乙磺酸溶液，该溶液中包含摩尔浓度为100毫摩尔/升的N-乙基-N′-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和摩尔浓度为50毫摩尔/升的N-羟基丁二酰亚胺，使该溶液充满第一通孔、底部通道和第二通孔，在底部通道7中室温下停留30分钟；
(5-3)向引流块的第一通孔中通入溶于磷酸缓冲盐溶液的链霉亲和素溶液，溶于磷酸缓冲盐溶液的链霉亲和素溶液的质量体积浓度为100微克/毫升，使该溶液充满第一通孔、底部通道和第二通孔，在底部通道7中室温下停留1小时，向引流块的第一通孔中通入磷酸缓冲盐溶液，使溶于磷酸缓冲盐溶液的链霉亲和素溶液从引流块的第二通孔中流出；
(5-4)向引流块的第一通孔中通入溶于去离子水的甘氨酸溶液，溶于去离子水的甘氨酸溶液的摩尔浓度为1摩尔/升，使该溶液充满第一通孔、底部通道和第二通孔，在底部通道7中室温下停留20分钟，向引流块的第一通孔中通入去离子水，使溶于去离子水的甘氨酸溶液从引流块的第二通孔中流出；
(5-5)向引流块的第一通孔中通入溶于磷酸缓冲盐溶液的生物素修饰的探针溶液，探针溶液的摩尔浓度为1微摩尔/升，使探针溶液充满第一通孔、底部通道和第二通孔，探针溶液在底部通道7中室温下停留1小时，向引流块的第一通孔中通入磷酸缓冲盐溶液，使探针溶液从引流块的第二通孔中流出，此时探针连接上纳米线，得到纳米线生物传感器。
其中的第二种制备方法：
包括以下步骤：
(1)制备硅基底：
(1-1)将硅片先后用丙酮和异丙醇反复冲洗，用氮气吹干表面；
(1-2)将干燥后的硅片放入氧化炉中，在硅片表面生长二氧化硅绝缘层，得到硅基底，二氧化硅绝缘层的厚度为100-1000纳米；
(2)在步骤(1)的硅基底上制备信号采集电极和金属纳米线，包括以下步骤：
(2-1)在铬板上采用制版方法，制备得到带有对齐标志的信号采集电极的掩模铬板，备用；
(2-2)将步骤(1)的硅基底先后用丙酮和异丙醇反复冲洗三次，用氮气吹干表面，再放置于100-120℃的热板上保持1-2分钟，使硅基底完全干燥；
(2-3)将干燥后的硅基底置于匀胶机上，在硅基底的表面旋涂电子束胶，在硅基底的表面形成300-400纳米厚的电子束胶薄层；
(2-4)采用电子束曝光方法，在步骤(2-3)旋涂了电子束胶的硅基底的中央位置和对齐标志位置上，曝光出宽度为100-500纳米、长度为50-200微米的纳米线和对齐标志，将电子束曝光后的硅基底放入电子束显影液中将被曝光部分的电子束胶去除，在硅基底表面得到纳米线槽和对齐标志槽，用去离子水清洗，氮气吹干；
(2-5)采用磁控溅射的方法，向步骤(2-4)的表面带有纳米线槽和对齐标志槽的硅基底上溅射5-20纳米厚的金属连接层，再溅射5-300纳米厚的金属传感层，在硅基底表面制备得到金属纳米线和对齐标志，使用丙酮和超声结合的方式进行清洗，将硅基底表面未被曝光部分的电子束胶与金属剥离，用去离子水冲洗，氮气吹干，在100-120℃的热板上保持90秒，完全干燥；
(2-6)将步骤(2-5)的带有金属纳米线和对齐标志的硅基底置于匀胶机上，旋涂光刻胶，在硅基底表面形成1.3-1.5微米厚的光刻胶薄层，先以100转每分钟旋涂10秒钟，然后以4000转每分钟旋涂40秒；
(2-7)将步骤(2-6)的带有旋涂光刻胶的硅基底放置于光刻机上，将步骤(2-1)信号采集电极的掩模铬板放置涂有光刻胶的硅基底上方，使硅基底上的对齐标志与信号采集电极的掩模铬板上的对齐标志对齐后，并使硅基底与信号采集电极的掩模铬板相互贴合，采用光刻方法，从信号采集电极的掩模铬板的上方进行光刻，再放入显影液中，将被未曝光部分的光刻胶去除，在硅基底表面制备得到信号采集电极槽，用去离子水清洗，氮气吹干；
(2-8)采用磁控溅射方法，对带有信号采集电极槽的硅基底表面进行磁控溅射，先溅射5-20纳米厚的金属连接层，再溅射5-300纳米厚的金属传感层，采用丙酮和超声结合的方法进行清洗，将被曝光部分的光刻胶与金属剥离，用去离子水冲洗，氮气吹干，在硅基底上制备得到信号采集电极和金属纳米线；
(3)在步骤(2)的纳米线上连接探针，包括以下步骤：
(3-1)将两根导线分别放置于信号采集电极上，使用绝缘物质覆盖放有导线的信号采集电极，使纳米线暴露于外部，形成一个检测单元；
(3-2)将检测单元放入溶有生物素修饰的牛血清蛋白的磷酸缓冲盐溶液中，溶有生物素修饰的牛血清蛋白的磷酸缓冲盐溶液的质量体积浓度为200微克/毫升，室温下静置2小时，取出检测单元，用磷酸缓冲盐溶液冲洗，去除检测单元表面的未反应的生物素修饰的牛血清蛋白；
(3-3)将检测单元通放入溶有链霉亲和素的磷酸缓冲盐溶液中，溶有链霉亲和素的磷酸缓冲盐溶液的质量体积浓度为100微克/毫升，37℃下静置1小时，取出检测单元，用磷酸缓冲盐溶液冲洗，去除检测单元表面的未反应的链霉亲和素；
(3-4)将检测单元放入溶有生物素修饰的探针的磷酸缓冲盐溶液中，该溶液的摩尔浓度为1微摩/毫升，37℃下静置一小时，在检测单元表面暴露的纳米线连接上探针，取出检测单元，用磷酸缓冲盐溶液冲洗，去除检测单元表面的未反应探针此时探针连接上纳米线，得到纳米线生物传感器。
或者：
第二种制备方法，包括以下步骤：
(1)制备硅基底：
(1-1)将硅片先后用丙酮和异丙醇反复冲洗，用氮气吹干表面；
(1-2)将干燥后的硅片放入氧化炉中，在硅片表面生长二氧化硅绝缘层，得到硅基底，二氧化硅绝缘层的厚度为100-1000纳米；
(2)在步骤(1)的硅基底上制备信号采集电极和金属纳米线，包括以下步骤：
(2-1)在铬板上采用制版方法，制备得到带有对齐标志的信号采集电极的掩模铬板，备用；
(2-2)将步骤(1)的硅基底先后用丙酮和异丙醇反复冲洗三次，用氮气吹干表面，再放置于100-120℃的热板上保持1-2分钟，使硅基底完全干燥；
(2-3)将干燥后的硅基底置于匀胶机上，在硅基底的表面旋涂电子束胶，在硅基底的表面形成300-400纳米厚的电子束胶薄层；
(2-4)采用电子束曝光方法，在步骤(2-3)旋涂了电子束胶的硅基底的中央位置和对齐标志位置上，曝光出宽度为100-500纳米、长度为50-200微米的纳米线和对齐标志，将电子束曝光后的硅基底放入电子束显影液中将被曝光部分的电子束胶去除，在硅基底表面得到纳米线槽和对齐标志槽，用去离子水清洗，氮气吹干；
(2-5)采用磁控溅射的方法，向步骤(2-4)的表面带有纳米线槽和对齐标志槽的硅基底上溅射5-20纳米厚的金属连接层，再溅射5-300纳米厚的金属传感层，在硅基底表面制备得到金属纳米线和对齐标志，使用丙酮和超声结合的方式进行清洗，将硅基底表面未被曝光部分的电子束胶与金属剥离，用去离子水冲洗，氮气吹干，在100-120℃的热板上保持90秒，完全干燥；
(2-6)将步骤(2-5)的带有金属纳米线和对齐标志的硅基底置于匀胶机上，旋涂光刻胶，在硅基底表面形成1.3-1.5微米厚的光刻胶薄层，先以100转每分钟旋涂10秒钟，然后以4000转每分钟旋涂40秒；
(2-7)将步骤(2-6)的带有旋涂光刻胶的硅基底放置于光刻机上，将步骤(2-1)信号采集电极的掩模铬板放置涂有光刻胶的硅基底上方，使硅基底上的对齐标志与信号采集电极的掩模铬板上的对齐标志对齐后，并使硅基底与信号采集电极的掩模铬板相互贴合，采用光刻方法，从信号采集电极的掩模铬板的上方进行光刻，再放入显影液中，将被未曝光部分的光刻胶去除，在硅基底表面制备得到信号采集电极槽，用去离子水清洗，氮气吹干；
(2-8)采用磁控溅射方法，对带有信号采集电极槽的硅基底表面进行磁控溅射，先溅射5-20纳米厚的金属连接层，再溅射5-300纳米厚的金属传感层，采用丙酮和超声结合的方法进行清洗，将被曝光部分的光刻胶与金属剥离，用去离子水冲洗，氮气吹干，在硅基底上制备得到信号采集电极和金属纳米线；
(3)在步骤(2)的纳米线上连接探针，包括以下步骤：
(3-1)将两根导线分别放置于信号采集电极上，使用绝缘物质覆盖放有导线的信号采集电极，使纳米线暴露于外部，形成一个检测单元；
(3-2)将检测单元放入溶有11-巯基十一烷酸的纯乙醇溶液中，溶有11-巯基十一烷酸的纯乙醇溶液的摩尔浓度为1毫摩尔/升，室温下静置1小时，取出检测单元，用纯乙醇冲洗检测单元，去除检测单元表面未反应的11-巯基十一烷酸；
(3-3)将检测单元放入摩尔浓度为50毫摩尔/升、pH＝5.0的2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)中，其中包含摩尔浓度为100毫摩尔/升的N-乙基-N′-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和摩尔浓度为50毫摩尔/升的N-羟基丁二酰亚胺(NHS)，室温下静置30分钟，取出检测单元；
(3-4)将检测单元快速放入溶有链霉亲和素的磷酸缓冲盐溶液中，该溶液的质量体积浓度为100微克/毫升，室温下静置1小时，取出检测单元，用磷酸缓冲盐溶液冲洗检测单元，去除检测单元表面未反应的链霉亲和素；
(3-5)将检测单元放入摩尔浓度为1摩尔/升的溶有甘氨酸的去离子水中，室温下静置20分钟，取出检测单元，用去离子水冲洗检测单元，去除检测单元表面未反应的甘氨酸；
(3-6)将检测单元放入摩尔浓度为1微摩/毫升的溶有生物素修饰的探针的磷酸缓冲盐溶液中，37℃下静置一小时，在检测单元表面暴露的纳米线连接上探针，取出检测单元，用磷酸缓冲盐溶液冲洗检测单元，去除检测单元表面未反应的探针，得到纳米线生物传感器。
上述第一种方法制备的纳米线生物传感器的应用，应用过程包括以下步骤：
(1)向纳米线生物传感器中引流块的第一通孔中通入磷酸缓冲盐溶液(PBS)，使磷酸缓冲盐溶液充满第一通孔、底部通道和第二通孔，采集纳米线生物传感器上信号采集电极的第一电压-电流曲线和电化学阻抗谱曲线；
(2)向引流块的第一通孔中通入与纳米线生物传感器中探针相互补的目标序列，静置10分钟后，采集纳米线生物传感器上信号采集电极的第二电压-电流曲线和电化学阻抗谱曲线；
(3)对纳米线生物传感器上的信号采集电极施加一个1-1.5伏的直流电压，施加时间为60-90秒，使目标序列从纳米线上释放，并从引流块的第二通孔中流出，采集信号采集电极的第三电压-电流曲线和电化学阻抗谱曲线；
(4)向引流块的第一通孔中通入与纳米线生物传感器中探针相互补的目标序列，静置10分钟后，采集纳米线生物传感器上信号采集电极的第四电压-电流曲线和电化学阻抗谱曲线；
(5)将上述第一电压-电流曲线和电化学阻抗谱曲线、第二电压-电流曲线和电化学阻抗谱曲线、第三电压-电流曲线和电化学阻抗谱曲线和第四电压-电流曲线和电化学阻抗谱曲线进行对比，实现核酸检测；
(6)重复步骤(1)-(5)，进行目标核酸序列的多次重复检测。
上述第二种制备方法制备的纳米线生物传感器的应用，包括以下步骤：
(1)将纳米线生物传感器放入到细胞培养基中，采集纳米线生物传感器上信号采集电极的第一电压-电流曲线和电化学阻抗谱曲线；
(2)根据设定的时间间隔，采集纳米线生物传感器上信号采集电极的多个电压-电流曲线和电化学阻抗谱曲线，记录多个电压-电流曲线和电化学阻抗谱曲线，通过对多个曲线进行对比，实现目标核酸序列的检测；
(3)对纳米线生物传感器上的信号采集电极施加一个1-1.5伏的直流电压，施加时间为60-90秒，使目标序列从纳米线上释放；
(4)重复步骤(1)-(3)，进行目标核酸序列的多次重复检测。
本发明提出的纳米线生物传感器的制备方法及其应用，其优点是：
本发明提出的纳米线生物传感器的制备方法，具有便捷、快速和价格低廉等优势。根据所检测的目标设计对应的单链核酸探针，经过对该传感器进行修饰后即可实现对目标核酸的检测。然后利用纳米线的电加热特性实现核酸解链和原位释放技术，可以实现在原位对目标核酸进行连续动态检测，从而掌握目标核酸分子的浓度变化情况。与传统的解链方法，改变pH值、使用DNA解旋酶和升温等相比，本发明方法制备的纳米线生物传感器不需要添加任何额外试剂、大型辅助设备等，便于小型化、便携化。纳米线的制备采用金属连接层和金属传感层双层结构，金属连接层常用金属为铬、钛等，可以有效的提高金属传感层与硅基底的粘附性，金属传感层常用金属为金、铂等化学性质稳定、电学性能优异的材料。使用该传感器，通过对特定生物标志物进行检测，从而得到其浓度变化可以用来对被检测人进行早期诊断与预后，可广泛应用于如肿瘤早筛与预后监测、单细胞研究、辅助生殖中的胚胎培养发育等领域,同时该传感器尺寸极小，检测灵敏度高，具有向可穿戴式和植入式设备发展的潜力。
附图说明
图1是本发明方法制备的纳米线生物传感器的结构示意图。
图2是图1所示的纳米线生物传感器的俯视图。
图3是图1所示的纳米线生物传感器中的引流块的结构示意图。
图4是本发明的纳米线生物传感器的第二种结构示意图。
图5是本发明制备的纳米线生物传感器未经修饰时阻抗、电导率与时间的曲线。
图6是本发明制备的纳米线生物传感器经过修饰后，阻抗、电导率和时间的曲线。
图7是本发明制备的纳米线生物传感器每步操作后阻抗的变化曲线。
图8是本发明制备的纳米线生物传感器每步操作后电导率的变化曲线。
图1-图4中，1是硅基底，2是引流块，3是第一通孔，4是信号采集电极，5是第二通孔，6是金属纳米线，7是引流块底部通道，8是探针，9是对齐标志，10是绝缘层，11是导线。
具体实施方式
本发明提出的纳米线生物传感器的制备方法，其制备的纳米线生物传感器的结构如图1和图2所示，制备方法有两种，其中：
第一种制备方法包括以下步骤：
(1)制备硅基底1：
(1-1)将硅片先后用丙酮和异丙醇反复冲洗，用氮气吹干表面；
(1-2)将干燥后的硅片放入氧化炉中，在硅片表面生长二氧化硅绝缘层，得到硅基底，二氧化硅绝缘层的厚度为100-1000纳米，本发明的一个实施例中为500纳米；
(2)在步骤(1)的硅基底1上制备信号采集电极4和金属纳米线6，包括以下步骤：
(2-1)在铬板上采用制版(例如利用直写式光刻设备)方法，制备得到带有对齐标志和信号采集电极的掩模铬板，备用；
(2-2)将步骤(1)的硅基底1先后用丙酮和异丙醇反复冲洗三次，用氮气吹干表面，再放置于100-120℃的热板上保持1-2分钟，使硅基底1完全干燥；
(2-3)将干燥后的硅基底1置于匀胶机上，在硅基底1的表面旋涂电子束胶，在硅基底1的表面形成300-400纳米厚的电子束胶薄层，本发明的一个实施例中使用的电子束胶为聚甲基丙烯酸甲酯；
(2-4)采用电子束曝光方法，本发明的一个实施例中使用的加速电压为30keV、曝光时间为1分钟，在步骤(2-3)旋涂了电子束胶的硅基底的中央位置和对齐标志9位置上，曝光出宽度为100-500纳米、长度为50-200微米的纳米线6和对齐标志9，本发明的一个实施例中为200纳米宽、200微米长，将电子束曝光后的硅基底放入电子束显影液中将被曝光部分的电子束胶去除，在硅基底1表面得到纳米线槽和对齐标志槽，用去离子水清洗，氮气吹干；
(2-5)采用磁控溅射的方法，向步骤(2-4)的表面带有纳米线槽和对齐标志槽的硅基底上溅射5-20纳米厚的金属连接层，本发明的一个实施例中溅射了5纳米厚的金属铬，再溅射5-300纳米厚的金属传感层，本发明的一个实施例中溅射了100纳米厚的金属金，在硅基底表面制备得到金属纳米线和对齐标志，使用丙酮和超声结合的方式进行清洗，将硅基底表面未被曝光部分的电子束胶与金属剥离，用去离子水冲洗，氮气吹干，在100-120℃的热板上保持90秒，本发明的一个实施例中使用120℃，完全干燥；
(2-6)将步骤(2-5)的带有金属纳米线6和对齐标志9的硅基底1置于匀胶机上，旋涂光刻胶(该光刻胶为负胶)，在硅基底1表面形成1.3-1.5微米厚的光刻胶薄层；本发明的一个实施例中使用4340光刻胶，先以100转每分钟旋涂10秒钟，然后以4000转每分钟旋涂40秒；
(2-7)将步骤(2-6)的带有旋涂光刻胶的硅基底放置于光刻机上，将步骤(2-1)信号采集电极的掩模铬板放置涂有光刻胶的硅基底1上方，使硅基底1上的对齐标志9与信号采集电极4的掩模铬板上的对齐标志对齐后，并使硅基底1与信号采集电极4的掩模铬板相互贴合，采用光刻方法，从信号采集电极4的掩模铬板的上方进行光刻，再放入显影液中，将被未曝光部分的光刻胶去除，在硅基底1表面制备得到信号采集电极槽，用去离子水清洗，氮气吹干；
(2-8)采用磁控溅射方法，对带有信号采集电极槽的硅基底表面进行磁控溅射，先溅射5-20纳米厚的金属连接层，再溅射5-300纳米厚的金属传感层，本发明的一个实施例中溅射了5纳米厚的金属连接层铬，再溅射100纳米厚的金属传感层金，采用丙酮和超声结合的方法进行清洗，将被曝光部分的光刻胶与金属剥离，用去离子水冲洗，氮气吹干，在硅基底1上制备得到信号采集电极4和金属纳米线6；
(3)制备一个引流块2，其结构如图3所示，在引流块2中加工第一通孔3和第二通孔5，引流块1的底部加工凹槽，使凹槽的宽度与步骤(2)的金属纳米线的长度相等，凹槽的长度为4-6毫米，凹槽的深度为50-200微米，使该凹槽成为第一通孔3与第二通孔5之间的底部通道7，本发明的一个实施例中为5毫米，本发明实施例中为50微米；
(4)将步骤(3)的引流块2的底部与步骤(2)的硅基底1相对固定，使引流块2的底部通道7的长度方向与纳米线6的长度方向相互垂直，并完全覆盖纳米线6，图5所示为经过步骤(4)制备出的纳米线生物传感器，使磷酸缓冲盐溶液充满第一通孔3、底部通道7和第二通孔5后，通过两个信号采集电极4测量出的阻抗、电导率与时间的曲线。
(5)在步骤(4)的纳米线6上连接探针8，包括以下步骤：
(5-1)向引流块2的第一通孔3中通入溶于磷酸缓冲盐溶液的生物素修饰的牛血清蛋白溶液，生物素修饰的牛血清蛋白溶液的质量体积浓度为200微克/毫升，使生物素修饰的牛血清蛋白溶液充满第一通孔3、底部通道7和第二通孔5，使生物素修饰的牛血清蛋白溶液在底部通道7中室温下停留2小时，向引流块2的第一通孔3中通入磷酸缓冲盐溶液，使生物素修饰的牛血清蛋白溶液从第二通孔5中流出；
(5-2)向引流块2的第一通孔3中通入溶于磷酸缓冲盐溶液的链霉亲和素溶液，溶于磷酸缓冲盐溶液的链霉亲和素溶液的质量体积浓度为100微克/毫升，使溶于磷酸缓冲盐溶液的链霉亲和素溶液充满第一通孔3、底部通道7和第二通孔5，溶于磷酸缓冲盐溶液的链霉亲和素溶液在底部通道7中37℃下停留1小时，向引流块2的第一通孔3中通入磷酸缓冲盐溶液，使溶于磷酸缓冲盐溶液的链霉亲和素溶液从引流块2的第二通孔5中流出；
(5-3)向引流块2的第一通孔3中通入溶于磷酸缓冲盐溶液的生物素修饰的探针溶液，探针溶液的摩尔浓度为1微摩/毫升，使探针溶液充满第一通孔3、底部通道7和第二通孔5，在室温下停留1小时，向引流块2的第一通孔3中通入磷酸缓冲盐溶液，使探针溶液从引流块2的第二通孔5中流出，此时探针8连接上纳米线6，得到纳米线生物传感器。图6为经过步骤(5)修饰完成的纳米线生物传感器，使磷酸缓冲盐溶液充满第一通孔3、底部通道7和第二通孔5后，通过两个信号采集电极4测量出的阻抗、电导率和时间的曲线。
或者：
第一种制备方法，包括以下步骤：
(1)制备硅基底1：
(1-1)将硅片先后用丙酮和异丙醇反复冲洗，用氮气吹干表面；
(1-2)将干燥后的硅片放入氧化炉中，在硅片表面生长二氧化硅绝缘层，得到硅基底1，二氧化硅绝缘层的厚度为100-1000纳米，本发明的一个实施例中为500纳米；
(2)在步骤(1)的硅基底1上制备信号采集电极4和金属纳米线6，包括以下步骤：
(2-1)在铬板上采用制版(例如利用直写式光刻设备)方法，制备得到带有对齐标志和信号采集电极的掩模铬板，备用；
(2-2)将步骤(1)的硅基底1先后用丙酮和异丙醇反复冲洗三次，用氮气吹干表面，再放置于100-120℃的热板上保持1-2分钟，本发明的一个实施例中使用120℃，使硅基底完全干燥；
(2-3)将干燥后的硅基底置于匀胶机上，在硅基底的表面旋涂电子束胶，在硅基底的表面形成300-400纳米厚的电子束胶薄层，本发明的一个实施例中使用的电子束胶为聚甲基丙烯酸甲酯；
(2-4)采用电子束曝光方法，本发明的一个实施例中使用的加速电压为30keV、曝光时间为1分钟，在步骤(2-3)旋涂了电子束胶的硅基底的中央位置和对齐标志位置上，曝光出宽度为100-500纳米、长度为50-200微米的纳米线6和对齐标志9，本发明的一个实施例中为200纳米宽、200微米长，将电子束曝光后的硅基底放入电子束显影液中将被曝光部分的电子束胶去除，在硅基底1表面得到纳米线槽和对齐标志槽，用去离子水清洗，氮气吹干；
(2-5)采用磁控溅射的方法，向步骤(2-4)的表面带有纳米线槽和对齐标志槽的硅基底上溅射5-20纳米厚的金属连接层，本发明的一个实施例中溅射了5纳米厚的金属钛，再溅射5-300纳米厚的金属传感层，本发明的一个实施例中溅射了100纳米厚的金属金，在硅基底1表面制备得到金属纳米线6和对齐标志9，使用丙酮和超声结合的方式进行清洗，将硅基底表面未被曝光部分的电子束胶与金属剥离，用去离子水冲洗，氮气吹干，在100-120℃的热板上保持90秒，本发明的一个实施例中使用120℃，完全干燥；
(2-6)将步骤(2-5)的带有金属纳米线6和对齐标志9的硅基底1置于匀胶机上，旋涂光刻胶(该光刻胶为负胶)，在硅基底1表面形成1.3-1.5微米厚的光刻胶薄层；本发明的一个实施例中使用4340光刻胶，先以100转每分钟旋涂10秒钟，然后以4000转每分钟旋涂40秒；
(2-7)将步骤(2-6)的带有旋涂光刻胶的硅基底放置于光刻机上，将步骤(2-1)信号采集电极的掩模铬板放置涂有光刻胶的硅基底上方，使硅基底1上的对齐标志9与信号采集电极的掩模铬板上的对齐标志对齐后，并使硅基底1与信号采集电极的掩模铬板相互贴合，采用光刻方法，从信号采集电极的掩模铬板的上方进行光刻，再放入显影液中，将被未曝光部分的光刻胶去除，在硅基底1表面制备得到信号采集电极槽，用去离子水清洗，氮气吹干；
(2-8)采用磁控溅射方法，对带有信号采集电极槽的硅基底表面进行磁控溅射，先溅射5-20纳米厚的金属连接层，再溅射5-300纳米厚的金属传感层，本发明的一个实施例中溅射了5纳米厚的金属连接层钛，再溅射100纳米厚的金属传感层金，采用丙酮和超声结合的方法进行清洗，将被曝光部分的光刻胶与金属剥离，用去离子水冲洗，氮气吹干，在硅基底上制备得到信号采集电极4和金属纳米线6；
(3)制备一个引流块2，在引流块2中加工第一通孔3和第二通孔5，引流块2的底部加工凹槽，使凹槽的宽度与步骤(2)的金属纳米线的长度相等，凹槽的长度为4-6毫米，凹槽的深度为50-200微米，使该凹槽成为第一通孔与第二通孔之间的底部通道7，本发明的一个实施例中为5毫米，本发明实施例中为50微米；
(4)将步骤(3)的引流块2的底部与步骤(2)的硅基底1相对固定，使引流块2的底部通道7的长度方向与纳米线6的长度方向相互垂直，并完全覆盖纳米线6；
(5)在步骤(4)的纳米线6上连接探针8，包括以下步骤：
(5-1)向引流块2的第一通孔3中通入溶于纯乙醇的11-巯基十一烷酸溶液，溶于纯乙醇的11-巯基十一烷酸溶液的摩尔浓度为1毫摩尔/升，使溶于纯乙醇的11-巯基十一烷酸溶液充满第一通孔3、底部通道7和第二通孔5，溶于纯乙醇的11-巯基十一烷酸溶液在底部通道7中室温下停留1小时，向引流块2的第一通孔3中通入纯乙醇，使溶于纯乙醇的11-巯基十一烷酸从引流块2的第二通孔5中流出；
(5-2)向引流块2的第一通孔3中通入摩尔浓度为50毫摩尔/升、pH＝5.0的2-(N-吗啉)乙磺酸溶液，该溶液中包含摩尔浓度为100毫摩尔/升的N-乙基-N′-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和摩尔浓度为50毫摩尔/升的N-羟基丁二酰亚胺(NHS)，使该溶液充满第一通孔3、底部通道7和第二通孔5，在底部通道7中室温下停留30分钟；
(5-3)向引流块2的第一通孔3中通入溶于磷酸缓冲盐溶液的链霉亲和素溶液，溶于磷酸缓冲盐溶液的链霉亲和素溶液的质量体积浓度为100微克/毫升，使该溶液充满第一通孔3、底部通道7和第二通孔5，在底部通道7中室温下停留1小时，向引流块2的第一通孔3中通入磷酸缓冲盐溶液，使溶于磷酸缓冲盐溶液的链霉亲和素溶液从引流块2的第二通孔5中流出；
(5-4)向引流块2的第一通孔3中通入溶于去离子水的甘氨酸溶液，溶于去离子水的甘氨酸溶液的摩尔浓度为1摩尔/升，使该溶液充满第一通孔3、底部通道7和第二通孔5，在底部通道7中室温下停留20分钟，向引流块2的第一通孔3中通入去离子水，使溶于去离子水的甘氨酸溶液从引流块2的第二通孔5中流出；
(5-5)向引流块2的第一通孔3中通入溶于磷酸缓冲盐溶液的生物素修饰的探针溶液，探针溶液的摩尔浓度为1微摩尔/升，使探针溶液充满第一通孔3、底部通道7和第二通孔5，探针溶液在底部通道7中室温下停留1小时，向引流块2的第一通孔3中通入磷酸缓冲盐溶液，使探针溶液从引流块2的第二通孔5中流出，此时探针8连接上纳米线6，得到纳米线生物传感器。
本发明的第二种方法制备的纳米线生物传感器，其结构如图4所示，第二种制备方法包括以下步骤：
(1)制备硅基底1：
(1-1)将硅片先后用丙酮和异丙醇反复冲洗，用氮气吹干表面；
(1-2)将干燥后的硅片放入氧化炉中，在硅片表面生长二氧化硅绝缘层，得到硅基底1，二氧化硅绝缘层的厚度为100-1000纳米，本发明的一个实施例中为500纳米；
(2)在步骤(1)的硅基底上制备信号采集电极4和金属纳米线6，包括以下步骤：
(2-1)在铬板上采用制版(例如利用直写式光刻设备)方法，制备得到带有对齐标志和信号采集电极的掩模铬板，备用；
(2-2)将步骤(1)的硅基底1先后用丙酮和异丙醇反复冲洗三次，用氮气吹干表面，再放置于100-120℃的热板上保持1-2分钟，本发明的一个实施例中使用120℃，使硅基底完全干燥；
(2-3)将干燥后的硅基底1置于匀胶机上，在硅基底1的表面旋涂电子束胶，在硅基底1的表面形成300-400纳米厚的电子束胶薄层，本发明的一个实施例中使用的电子束胶为聚甲基丙烯酸甲酯；
(2-4)采用电子束曝光方法，本发明的一个实施例中使用的加速电压为30keV、曝光时间为1分钟，在步骤(2-3)旋涂了电子束胶的硅基底的中央位置和对齐标志位置上，曝光出宽度为100-500纳米、长度为50-200微米的纳米线和对齐标志，本发明的一个实施例中为200纳米宽、200微米长，将电子束曝光后的硅基底放入电子束显影液中将被曝光部分的电子束胶去除，在硅基底表面得到纳米线槽和对齐标志槽，用去离子水清洗，氮气吹干；
(2-5)采用磁控溅射的方法，向步骤(2-4)的表面带有纳米线槽和对齐标志槽的硅基底上溅射5-20纳米厚的金属连接层，本发明的一个实施例中溅射了5纳米厚的金属铬，再溅射5-300纳米厚的金属传感层，本发明的一个实施例中溅射了100纳米厚的金属铂，在硅基底1表面制备得到金属纳米线6和对齐标志9，使用丙酮和超声结合的方式进行清洗，将硅基底表面未被曝光部分的电子束胶与金属剥离，用去离子水冲洗，氮气吹干，在100-120℃的热板上保持90秒，本发明的一个实施例中使用120℃，完全干燥；
(2-6)将步骤(2-5)的带有金属纳米线6和对齐标志9的硅基底1置于匀胶机上，旋涂光刻胶(该光刻胶为负胶)，在硅基底表面形成1.3-1.5微米厚的光刻胶薄层；本发明的一个实施例中使用4340光刻胶，先以100转每分钟旋涂10秒钟，然后以4000转每分钟旋涂40秒；
(2-7)将步骤(2-6)的带有旋涂光刻胶的硅基底放置于光刻机上，将步骤(2-1)信号采集电极的掩模铬板放置涂有光刻胶的硅基底1上方，使硅基底1上的对齐标志9与信号采集电极的掩模铬板上的对齐标志对齐后，并使硅基底1与信号采集电极的掩模铬板相互贴合，采用光刻方法，从信号采集电极的掩模铬板的上方进行光刻，再放入显影液中，将被未曝光部分的光刻胶去除，在硅基底1表面制备得到信号采集电极槽，用去离子水清洗，氮气吹干；
(2-8)采用磁控溅射方法，对带有信号采集电极槽的硅基底表面进行磁控溅射，先溅射5-20纳米厚的金属连接层，再溅射5-300纳米厚的金属传感层，本发明的一个实施例中溅射了5纳米厚的金属连接层铬，再溅射100纳米厚的金属传感层铂，采用丙酮和超声结合的方法进行清洗，将被曝光部分的光刻胶与金属剥离，用去离子水冲洗，氮气吹干，在硅基底1上制备得到信号采集电极4和金属纳米线6；
(3)在步骤(2)的纳米线6上连接探针8，包括以下步骤：
(3-1)将两根导线11分别放置于信号采集电极4上，使用绝缘物质10覆盖放有导线的信号采集电极4，使纳米线6暴露于外部，形成一个检测单元；
(3-2)将检测单元放入溶有生物素修饰的牛血清蛋白的磷酸缓冲盐溶液中，溶有生物素修饰的牛血清蛋白的磷酸缓冲盐溶液的质量体积浓度为200微克/毫升，室温下静置2小时，取出检测单元，用磷酸缓冲盐溶液冲洗，去除检测单元表面的未反应的生物素修饰的牛血清蛋白；
(3-3)将检测单元通放入溶有链霉亲和素的磷酸缓冲盐溶液中，溶有链霉亲和素的磷酸缓冲盐溶液的质量体积浓度为100微克/毫升，37℃下静置1小时，取出检测单元，用磷酸缓冲盐溶液冲洗，去除检测单元表面的未反应的链霉亲和素；
(3-4)将检测单元放入溶有生物素修饰的探针的磷酸缓冲盐溶液中，该溶液的摩尔浓度为1微摩/毫升，37℃下静置一小时，在检测单元表面暴露的纳米线连接上探针，取出检测单元，用磷酸缓冲盐溶液冲洗，去除检测单元表面的未反应探针此时探针连接上纳米线，得到纳米线生物传感器。
或者：
第二种制备方法包括以下步骤：
(1)制备硅基底1：
(1-1)将硅片先后用丙酮和异丙醇反复冲洗，用氮气吹干表面；
(1-2)将干燥后的硅片放入氧化炉中，在硅片表面生长二氧化硅绝缘层，得到硅基底1，二氧化硅绝缘层的厚度为100-1000纳米，本发明的一个实施例中为500纳米；
(2)在步骤(1)的硅基底上制备信号采集电极4和金属纳米线6，包括以下步骤：
(2-1)在铬板上采用制版(利用直写式光刻设备)方法，制备得到带有对齐标志的信号采集电极的掩模铬板，备用；
(2-2)将步骤(1)的硅基底1先后用丙酮和异丙醇反复冲洗三次，用氮气吹干表面，再放置于100-120℃的热板上保持1-2分钟，本发明的一个实施例中使用120℃，使硅基底完全干燥；
(2-3)将干燥后的硅基底1置于匀胶机上，在硅基底1的表面旋涂电子束胶，在硅基底1的表面形成300-400纳米厚的电子束胶薄层，本发明的一个实施例中使用的电子束胶为聚甲基丙烯酸甲酯；
(2-4)采用电子束曝光方法，本发明的一个实施例中使用的加速电压为30keV、曝光时间为1分钟，在步骤(2-3)旋涂了电子束胶的硅基底的中央位置和对齐标志位置上，曝光出宽度为100-500纳米、长度为50-200微米的纳米线和对齐标志，本发明的一个实施例中为200纳米宽、200微米长，将电子束曝光后的硅基底放入电子束显影液中将被曝光部分的电子束胶去除，在硅基底1表面得到纳米线槽和对齐标志槽，用去离子水清洗，氮气吹干；
(2-5)采用磁控溅射的方法，向步骤(2-3)的表面带有纳米线槽和对齐标志槽的硅基底上溅射5-20纳米厚的金属连接层，本发明的一个实施例中溅射了5纳米厚的金属钛，再溅射5-300纳米厚的金属传感层，本发明的一个实施例中溅射了100纳米厚的金属铂，在硅基底1表面制备得到金属纳米线6和对齐标志9，使用丙酮和超声结合的方式进行清洗，将硅基底表面未被曝光部分的电子束胶与金属剥离，用去离子水冲洗，氮气吹干，在100-120℃的热板上保持90秒，本发明的一个实施例中使用120℃，完全干燥；
(2-6)将步骤(2-5)的带有金属纳米线6和对齐标志9的硅基底1置于匀胶机上，旋涂光刻胶(该光刻胶为负胶)，在硅基底1表面形成1.3-1.5微米厚的光刻胶薄层；本发明的一个实施例中使用4340光刻胶，先以100转每分钟旋涂10秒钟，然后以4000转每分钟旋涂40秒；
(2-7)将步骤(2-6)的带有旋涂光刻胶的硅基底放置于光刻机上，将步骤(2-1)信号采集电极的掩模铬板放置涂有光刻胶的硅基底上方，使硅基底1上的对齐标志9与信号采集电极的掩模铬板上的对齐标志对齐后，并使硅基底1与信号采集电极的掩模铬板相互贴合，采用光刻方法，从信号采集电极的掩模铬板的上方进行光刻，再放入显影液中，将被未曝光部分的光刻胶去除，在硅基底1表面制备得到信号采集电极槽，用去离子水清洗，氮气吹干；
(2-8)采用磁控溅射方法，对带有信号采集电极槽的硅基底表面进行磁控溅射，先溅射5-20纳米厚的金属连接层，再溅射5-300纳米厚的金属传感层，本发明的一个实施例中溅射了5纳米厚的金属钛，再溅射100纳米厚的金属铂，采用丙酮和超声结合的方法进行清洗，将被曝光部分的光刻胶与金属剥离，用去离子水冲洗，氮气吹干，在硅基底上制备得到信号采集电极4和金属纳米线6；
(3)在步骤(2)的纳米线6上连接探针8，包括以下步骤：
(3-1)将两根导线11分别放置于信号采集电极4上，使用绝缘物质10覆盖放有导线的信号采集电极4，使纳米线6暴露于外部，形成一个检测单元；
(3-2)将检测单元放入溶有11-巯基十一烷酸的纯乙醇溶液中，溶有11-巯基十一烷酸的纯乙醇溶液的摩尔浓度为1毫摩尔/升，室温下静置1小时，取出检测单元，用纯乙醇冲洗检测单元，去除检测单元表面未反应的11-巯基十一烷酸；
(3-3)将检测单元放入摩尔浓度为50毫摩尔/升、pH＝5.0的2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)中，其中包含摩尔浓度为100毫摩尔/升的N-乙基-N′-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和摩尔浓度为50毫摩尔/升的N-羟基丁二酰亚胺(NHS)，室温下静置30分钟，取出检测单元；
(3-4)将检测单元快速放入溶有链霉亲和素的磷酸缓冲盐溶液中，该溶液的质量体积浓度为100微克/毫升，室温下静置1小时，取出检测单元，用磷酸缓冲盐溶液冲洗检测单元，去除检测单元表面未反应的链霉亲和素；
(3-5)将检测单元放入摩尔浓度为1摩尔/升的溶有甘氨酸的去离子水中，室温下静置20分钟，取出检测单元，用去离子水冲洗检测单元，去除检测单元表面未反应的甘氨酸；
(3-6)将检测单元放入摩尔浓度为1微摩/毫升的溶有生物素修饰的探针的磷酸缓冲盐溶液中，37℃下静置一小时，在检测单元表面暴露的纳米线连接上探针，取出检测单元，用磷酸缓冲盐溶液冲洗检测单元，去除检测单元表面未反应的探针，得到纳米线生物传感器。
上述第一种方法制备的纳米线生物传感器的应用，包括以下步骤：
(1)向纳米线生物传感器中引流块2的第一通孔3中通入磷酸缓冲盐溶液(PBS)，使磷酸缓冲盐溶液充满第一通孔3、底部通道7和第二通孔5，使用电化学工作站连接信号采集纳米线生物传感器上信号采集电极4的第一电压-电流曲线和电化学阻抗谱曲线；
(2)向引流块2的第一通孔3中通入与纳米线生物传感器中探针相互补的目标序列，静置10分钟后，采集纳米线生物传感器上信号采集电极4的第二电压-电流曲线和电化学阻抗谱曲线；
(3)对纳米线生物传感器上的信号采集电极4施加一个1-1.5伏的直流电压，施加时间为60-90秒，本发明的一个实施例中使用1.2伏，持续60秒，使目标序列从纳米线6上释放，并从引流块2的第二通孔5中流出，采集信号采集电极4的第三电压-电流曲线和电化学阻抗谱曲线；图7所示为第一种方法制备的纳米线生物传感器经过每步修饰操作和上述(1)-(3)每步操作后，通过两个信号采集电极4测量出的阻抗的变化曲线。通过图8所示为第一种方法制备的纳米线生物传感器经过每步修饰操作和上述(1)-(3)每步操作后，通过两个信号采集电极4测量出的电导率的变化曲线。图7和图8中，1代表纳米线生物传感器初始状态时通过两个信号采集电极4测量出的数据，2代表纳米线生物传感器经过生物素修饰的牛血清蛋白修饰后，通过两个信号采集电极4测量出的数据，3代表纳米线生物传感器经过链霉亲和素修饰后，通过两个信号采集电极4测量出的数据，4代表纳米线生物传感器经过生物素修饰的探针修饰后，通过两个信号采集电极4测量出的数据，5代表向纳米线生物传感器中通入1飞摩尔目标序列静置15分钟，通入磷酸缓冲盐溶液后，通过两个信号采集电极4测量出的数据，6代表向纳米线生物传感器中通入1皮摩尔目标序列静置15分钟，通入磷酸缓冲盐溶液后，通过两个信号采集电极4测量出的数据，7代表经过对两个信号采集电极4施加1.1伏的直流电压，施加时间为1分钟后，通过两个信号采集电极4测量出的数据，8代表向纳米线生物传感器中通入1皮摩尔目标序列静置15分钟，通入磷酸缓冲盐溶液后，通过两个信号采集电极4测量出的数据。
(4)向引流块2的第一通孔3中通入与纳米线生物传感器中探针相互补的目标序列，静置10分钟后，采集纳米线生物传感器上信号采集电极4的第四电压-电流曲线和电化学阻抗谱曲线；
(5)将上述第一电压-电流曲线和电化学阻抗谱曲线、第二电压-电流曲线和电化学阻抗谱曲线、第三电压-电流曲线和电化学阻抗谱曲线和第四电压-电流曲线和电化学阻抗谱曲线进行对比，实现核酸检测；
(6)重复步骤(1)-(5)，进行目标核酸序列的多次重复检测。
上述第二种方法制备的纳米线生物传感器的应用，包括以下步骤：
(1)将纳米线生物传感器放入到细胞培养基中，采集纳米线生物传感器上信号采集电极4的第一电压-电流曲线和电化学阻抗谱曲线；
(2)根据设定的时间间隔，采集纳米线生物传感器上信号采集电极的多个电压-电流曲线和电化学阻抗谱曲线，记录多个电压-电流曲线和电化学阻抗谱曲线，通过对多个曲线进行对比，实现目标核酸序列的检测；
(3)对纳米线生物传感器上的信号采集电极施加一个1-1.5伏的直流电压，施加时间为60-90秒，使目标序列从纳米线上释放；
(4)重复步骤(1)-(3)，进行目标核酸序列的多次重复检测。
本发明方法的原理是，已有技术中核酸解链方法包含升温、改变pH值和使用解旋酶等，本发明为了在不添加额外试剂的前提下实现核酸解链，升温为最佳方案。金属纳米线符合上述需求，因此选择了金属纳米线作为传感器的核心部件。金属纳米线的制备采用双层方式，下层为金属连接层，常用金属为铬、钛等，上层为金属传感层，常用金属为金、铂等。上述金属都有优异的理化性质，与大部分的化学物都不会发生化学反应，具有良好的稳定性。金、铂金纳米结构都是电化学应用中优秀的纳米电极候选者，可以应用于压力传感器、DNA检测传感器等。同时，金属纳米线可以提供高电流密度、高信噪比和低双电子层电容，十分适合制作成传感器。
由于金属纳米线优异的导电性能与热传导性能，其宽度为纳米级别，长度为微米级别，当给金属纳米线两端施加一定时间的固定电压后，可在金属纳米线表面产生一定的温度，可用来对捕获到的生物标志物进行解链与原位释放，与此同时也要保证金属纳米线表面上所进行的修饰不会被破坏。
本发明中所使用的修饰体系基于亲和素与生物素的结合。通过文献调研可知，腺嘌呤与胸腺嘧啶的键能为8kJ/mol或1.9kcal/mol，鸟嘌呤与胞嘧啶的键能为13kJ/mol或3.1kcal/mol。而亲和素结合生物素的亲和常数为普通抗原-抗体反应的百万倍，两者形成复合物的解离常数很小，且100℃时不会变性，呈现为不可逆反应性，而且酸、碱、变性剂、蛋白溶解酶以及有机溶剂均不影响其结合。
因此在金属纳米线通过对纳米线施加电脉冲信号产生大量热的过程中，亲和素和生物素结合的稳定性远远高于DNA双链与抗原-抗体反应，因此可以通过精确控制金属纳米线表面加热实现对生物标志物的解链与原位释放。以用于对生物标志物含量的动态实时检测，来反应病人的身体健康情况。

Claims (7)

1.一种纳米线生物传感器的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
(1)制备硅基底：
(1-1)将硅片先后用丙酮和异丙醇反复冲洗，用氮气吹干表面；
(1-2)将干燥后的硅片放入氧化炉中，在硅片表面生长二氧化硅绝缘层，得到硅基底，二氧化硅绝缘层的厚度为100-1000纳米；
(2)在步骤(1)的硅基底上制备信号采集电极和金属纳米线，包括以下步骤：
(2-1)在铬板上采用制版方法，制备得到带有对齐标志的信号采集电极的掩模铬板，备用；
(2-2)将步骤(1)的硅基底先后用丙酮和异丙醇反复冲洗三次，用氮气吹干表面，再放置于100-120℃的热板上保持1-2分钟，使硅基底完全干燥；
(2-3)将干燥后的硅基底置于匀胶机上，在硅基底的表面旋涂电子束胶，在硅基底的表面形成300-400纳米厚的电子束胶薄层；
(2-4)采用电子束曝光方法，在步骤(2-3)旋涂了电子束胶的硅基底的中央位置和对齐标志位置上，曝光出宽度为100-500纳米、长度为50-200微米的纳米线和对齐标志，将电子束曝光后的硅基底放入电子束显影液中将被曝光部分的电子束胶去除，在硅基底表面得到纳米线槽和对齐标志槽，用去离子水清洗，氮气吹干；
(2-5)采用磁控溅射的方法，向步骤(2-4)的表面带有纳米线槽和对齐标志槽的硅基底上溅射5-20纳米厚的金属连接层，再溅射5-300纳米厚的金属传感层，在硅基底表面制备得到金属纳米线和对齐标志，使用丙酮和超声结合的方式进行清洗，将硅基底表面未被曝光部分的电子束胶与金属剥离，用去离子水冲洗，氮气吹干，在100-120℃的热板上保持90秒，完全干燥；
(2-6)将步骤(2-5)的带有金属纳米线和对齐标志的硅基底置于匀胶机上，旋涂光刻胶，在硅基底表面形成1.3-1.5微米厚的光刻胶薄层；
(2-7)将步骤(2-6)的带有旋涂光刻胶的硅基底放置于光刻机上，将步骤(2-1)信号采集电极的掩模铬板放置涂有光刻胶的硅基底上方，使硅基底上的对齐标志与信号采集电极的掩模铬板上的对齐标志对齐后，并使硅基底与信号采集电极的掩模铬板相互贴合，采用光刻方法，从信号采集电极的掩模铬板的上方进行光刻，再放入显影液中，将被未曝光部分的光刻胶去除，在硅基底表面制备得到信号采集电极槽，用去离子水清洗，氮气吹干；
(2-8)采用磁控溅射方法，对带有信号采集电极槽的硅基底表面进行磁控溅射，先溅射5-20纳米厚的金属连接层，再溅射5-300纳米厚的金属传感层，采用丙酮和超声结合的方法进行清洗，将被曝光部分的光刻胶与金属剥离，用去离子水冲洗，氮气吹干，在硅基底上制备得到信号采集电极和金属纳米线；
(3)制备一个引流块，在引流块中加工第一通孔和第二通孔，引流块的底部加工凹槽，使凹槽的宽度与步骤(2)的金属纳米线的长度相等，凹槽的长度为4-6毫米，凹槽的深度为50-200微米，使该凹槽成为第一通孔与第二通孔之间的底部通道；
(4)将步骤(3)的引流块的底部与步骤(2)的硅基底相对固定，使引流块的底部通道的长度方向与纳米线的长度方向相互垂直，并完全覆盖纳米线；
(5)在步骤(4)的纳米线上连接探针，包括以下步骤：
(5-1)向引流块的第一通孔中通入溶于磷酸缓冲盐溶液的生物素修饰的牛血清蛋白溶液，生物素修饰的牛血清蛋白溶液的质量体积浓度为200微克/毫升，使生物素修饰的牛血清蛋白溶液充满第一通孔、底部通道和第二通孔，使生物素修饰的牛血清蛋白溶液在底部通道中室温下停留2小时，向引流块的第一通孔中通入磷酸缓冲盐溶液，使生物素修饰的牛血清蛋白溶液从第二通孔中流出；
(5-2)向引流块的第一通孔中通入溶于磷酸缓冲盐溶液的链霉亲和素溶液，溶于磷酸缓冲盐溶液的链霉亲和素溶液的质量体积浓度为100微克/毫升，使溶于磷酸缓冲盐溶液的链霉亲和素溶液充满第一通孔、底部通道和第二通孔，溶于磷酸缓冲盐溶液的链霉亲和素溶液在底部通道中37℃下停留1小时，向引流块的第一通孔中通入磷酸缓冲盐溶液，使溶于磷酸缓冲盐溶液的链霉亲和素溶液从引流块的第二通孔中流出；
(5-3)向引流块的第一通孔中通入溶于磷酸缓冲盐溶液的生物素修饰的探针溶液，探针溶液的摩尔浓度为1微摩/毫升，使探针溶液充满第一通孔、底部通道和第二通孔，在室温下停留1小时，向引流块的第一通孔中通入磷酸缓冲盐溶液，使探针溶液从引流块的第二通孔中流出，此时探针连接上纳米线，得到纳米线生物传感器。
2.一种纳米线生物传感器的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
(1)制备硅基底：
(1-1)将硅片先后用丙酮和异丙醇反复冲洗，用氮气吹干表面；
(1-2)将干燥后的硅片放入氧化炉中，在硅片表面生长二氧化硅绝缘层，得到硅基底，二氧化硅绝缘层的厚度为100-1000纳米；
(2)在步骤(1)的硅基底上制备信号采集电极和金属纳米线，包括以下步骤：
(2-1)在铬板上采用制版方法，制备得到带有对齐标志的信号采集电极的掩模铬板，备用；
(2-2)将步骤(1)的硅基底先后用丙酮和异丙醇反复冲洗三次，用氮气吹干表面，再放置于100-120℃的热板上保持1-2分钟，使硅基底完全干燥；
(2-3)将干燥后的硅基底置于匀胶机上，在硅基底的表面旋涂电子束胶，在硅基底的表面形成300-400纳米厚的电子束胶薄层；
(2-4)采用电子束曝光方法，在步骤(2-3)旋涂了电子束胶的硅基底的中央位置和对齐标志位置上，曝光出宽度为100-500纳米、长度为50-200微米的纳米线和对齐标志，将电子束曝光后的硅基底放入电子束显影液中将被曝光部分的电子束胶去除，在硅基底表面得到纳米线槽和对齐标志槽，用去离子水清洗，氮气吹干；
(2-5)采用磁控溅射的方法，向步骤(2-4)的表面带有纳米线槽和对齐标志槽的硅基底上溅射5-20纳米厚的金属连接层，再溅射5-300纳米厚的金属传感层，在硅基底表面制备得到金属纳米线和对齐标志，使用丙酮和超声结合的方式进行清洗，将硅基底表面未被曝光部分的电子束胶与金属剥离，用去离子水冲洗，氮气吹干，在100-120℃的热板上保持90秒，完全干燥；
(2-6)将步骤(2-5)的带有金属纳米线和对齐标志的硅基底置于匀胶机上，旋涂光刻胶，在硅基底表面形成1.3-1.5微米厚的光刻胶薄层，先以100转每分钟旋涂10秒钟，然后以4000转每分钟旋涂40秒；
(2-7)将步骤(2-6)的带有旋涂光刻胶的硅基底放置于光刻机上，将步骤(2-1)信号采集电极的掩模铬板放置涂有光刻胶的硅基底上方，使硅基底上的对齐标志与信号采集电极的掩模铬板上的对齐标志对齐后，并使硅基底与信号采集电极的掩模铬板相互贴合，采用光刻方法，从信号采集电极的掩模铬板的上方进行光刻，再放入显影液中，将被未曝光部分的光刻胶去除，在硅基底表面制备得到信号采集电极槽，用去离子水清洗，氮气吹干；
(2-8)采用磁控溅射方法，对带有信号采集电极槽的硅基底表面进行磁控溅射，先溅射5-20纳米厚的金属连接层，再溅射5-300纳米厚的金属传感层，采用丙酮和超声结合的方法进行清洗，将被曝光部分的光刻胶与金属剥离，用去离子水冲洗，氮气吹干，在硅基底上制备得到信号采集电极和金属纳米线；
(3)制备一个引流块，在引流块中加工第一通孔和第二通孔，引流块的底部加工凹槽，使凹槽的宽度与步骤(2)的金属纳米线的长度相等，凹槽的长度为4-6毫米，凹槽的深度为50-200微米，使该凹槽成为第一通孔与第二通孔之间的底部通道；
(4)将步骤(3)的引流块的底部与步骤(2)的硅基底相对固定，使引流块的底部通道的长度方向与纳米线的长度方向相互垂直，并完全覆盖纳米线；
(5)在步骤(4)的纳米线上连接探针，包括以下步骤：
(5-1)向引流块的第一通孔中通入溶于纯乙醇的11-巯基十一烷酸溶液，溶于纯乙醇的11-巯基十一烷酸溶液的摩尔浓度为1毫摩尔/升，使溶于纯乙醇的11-巯基十一烷酸溶液充满第一通孔、底部通道和第二通孔，溶于纯乙醇的11-巯基十一烷酸溶液在底部通道（ 7）中室温下停留1小时，向引流块的第一通孔中通入纯乙醇，使溶于纯乙醇的11-巯基十一烷酸从引流块的第二通孔中流出；
(5-2)向引流块的第一通孔中通入摩尔浓度为50毫摩尔/升、pH＝5.0的2-(N-吗啉)乙磺酸溶液，该溶液中包含摩尔浓度为100毫摩尔/升的N-乙基-N′-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和摩尔浓度为50毫摩尔/升的N-羟基丁二酰亚胺，使该溶液充满第一通孔、底部通道和第二通孔，在底部通道7中室温下停留30分钟；
(5-3)向引流块的第一通孔中通入溶于磷酸缓冲盐溶液的链霉亲和素溶液，溶于磷酸缓冲盐溶液的链霉亲和素溶液的质量体积浓度为100微克/毫升，使该溶液充满第一通孔、底部通道和第二通孔，在底部通道7中室温下停留1小时，向引流块的第一通孔中通入磷酸缓冲盐溶液，使溶于磷酸缓冲盐溶液的链霉亲和素溶液从引流块的第二通孔中流出；
(5-4)向引流块的第一通孔中通入溶于去离子水的甘氨酸溶液，溶于去离子水的甘氨酸溶液的摩尔浓度为1摩尔/升，使该溶液充满第一通孔、底部通道和第二通孔，在底部通道中室温下停留20分钟，向引流块的第一通孔中通入去离子水，使溶于去离子水的甘氨酸溶液从引流块的第二通孔中流出；
(5-5)向引流块的第一通孔中通入溶于磷酸缓冲盐溶液的生物素修饰的探针溶液，探针溶液的摩尔浓度为1微摩尔/升，使探针溶液充满第一通孔、底部通道和第二通孔，探针溶液在底部通道7中室温下停留1小时，向引流块的第一通孔中通入磷酸缓冲盐溶液，使探针溶液从引流块的第二通孔中流出，此时探针连接上纳米线，得到纳米线生物传感器。
3.一种纳米线生物传感器的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
(1)制备硅基底：
(1-1)将硅片先后用丙酮和异丙醇反复冲洗，用氮气吹干表面；
(1-2)将干燥后的硅片放入氧化炉中，在硅片表面生长二氧化硅绝缘层，得到硅基底，二氧化硅绝缘层的厚度为100-1000纳米；
(2)在步骤(1)的硅基底上制备信号采集电极和金属纳米线，包括以下步骤：
(2-1)在铬板上采用制版方法，制备得到带有对齐标志的信号采集电极的掩模铬板，备用；
(2-2)将步骤(1)的硅基底先后用丙酮和异丙醇反复冲洗三次，用氮气吹干表面，再放置于100-120℃的热板上保持1-2分钟，使硅基底完全干燥；
(2-3)将干燥后的硅基底置于匀胶机上，在硅基底的表面旋涂电子束胶，在硅基底的表面形成300-400纳米厚的电子束胶薄层；
(2-4)采用电子束曝光方法，在步骤(2-3)旋涂了电子束胶的硅基底的中央位置和对齐标志位置上，曝光出宽度为100-500纳米、长度为50-200微米的纳米线和对齐标志，将电子束曝光后的硅基底放入电子束显影液中将被曝光部分的电子束胶去除，在硅基底表面得到纳米线槽和对齐标志槽，用去离子水清洗，氮气吹干；
(2-5)采用磁控溅射的方法，向步骤(2-4)的表面带有纳米线槽和对齐标志槽的硅基底上溅射5-20纳米厚的金属连接层，再溅射5-300纳米厚的金属传感层，在硅基底表面制备得到金属纳米线和对齐标志，使用丙酮和超声结合的方式进行清洗，将硅基底表面未被曝光部分的电子束胶与金属剥离，用去离子水冲洗，氮气吹干，在100-120℃的热板上保持90秒，完全干燥；
(2-6)将步骤(2-5)的带有金属纳米线和对齐标志的硅基底置于匀胶机上，旋涂光刻胶，在硅基底表面形成1.3-1.5微米厚的光刻胶薄层，先以100转每分钟旋涂10秒钟，然后以4000转每分钟旋涂40秒；
(2-7)将步骤(2-6)的带有旋涂光刻胶的硅基底放置于光刻机上，将步骤(2-1)信号采集电极的掩模铬板放置涂有光刻胶的硅基底上方，使硅基底上的对齐标志与信号采集电极的掩模铬板上的对齐标志对齐后，并使硅基底与信号采集电极的掩模铬板相互贴合，采用光刻方法，从信号采集电极的掩模铬板的上方进行光刻，再放入显影液中，将被未曝光部分的光刻胶去除，在硅基底表面制备得到信号采集电极槽，用去离子水清洗，氮气吹干；
(2-8)采用磁控溅射方法，对带有信号采集电极槽的硅基底表面进行磁控溅射，先溅射5-20纳米厚的金属连接层，再溅射5-300纳米厚的金属传感层，采用丙酮和超声结合的方法进行清洗，将被曝光部分的光刻胶与金属剥离，用去离子水冲洗，氮气吹干，在硅基底上制备得到信号采集电极和金属纳米线；
(3)在步骤(2)的纳米线上连接探针，包括以下步骤：
(3-1)将两根导线分别放置于信号采集电极上，使用绝缘物质覆盖放有导线的信号采集电极，使纳米线暴露于外部，形成一个检测单元；
(3-2)将检测单元放入溶有生物素修饰的牛血清蛋白的磷酸缓冲盐溶液中，溶有生物素修饰的牛血清蛋白的磷酸缓冲盐溶液的质量体积浓度为200微克/毫升，室温下静置2小时，取出检测单元，用磷酸缓冲盐溶液冲洗，去除检测单元表面的未反应的生物素修饰的牛血清蛋白；
(3-3)将检测单元通放入溶有链霉亲和素的磷酸缓冲盐溶液中，溶有链霉亲和素的磷酸缓冲盐溶液的质量体积浓度为100微克/毫升，37℃下静置1小时，取出检测单元，用磷酸缓冲盐溶液冲洗，去除检测单元表面的未反应的链霉亲和素；
(3-4)将检测单元放入溶有生物素修饰的探针的磷酸缓冲盐溶液中，该溶液的摩尔浓度为1微摩/毫升，37℃下静置一小时，在检测单元表面暴露的纳米线连接上探针，取出检测单元，用磷酸缓冲盐溶液冲洗，去除检测单元表面的未反应探针此时探针连接上纳米线，得到纳米线生物传感器。
4.一种纳米线生物传感器的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
(1)制备硅基底：
(1-1)将硅片先后用丙酮和异丙醇反复冲洗，用氮气吹干表面；
(1-2)将干燥后的硅片放入氧化炉中，在硅片表面生长二氧化硅绝缘层，得到硅基底，二氧化硅绝缘层的厚度为100-1000纳米；
(2)在步骤(1)的硅基底上制备信号采集电极和金属纳米线，包括以下步骤：
(2-1)在铬板上采用制版方法，制备得到带有对齐标志的信号采集电极的掩模铬板，备用；
(2-2)将步骤(1)的硅基底先后用丙酮和异丙醇反复冲洗三次，用氮气吹干表面，再放置于100-120℃的热板上保持1-2分钟，使硅基底完全干燥；
(2-3)将干燥后的硅基底置于匀胶机上，在硅基底的表面旋涂电子束胶，在硅基底的表面形成300-400纳米厚的电子束胶薄层；
(2-4)采用电子束曝光方法，在步骤(2-3)旋涂了电子束胶的硅基底的中央位置和对齐标志位置上，曝光出宽度为100-500纳米、长度为50-200微米的纳米线和对齐标志，将电子束曝光后的硅基底放入电子束显影液中将被曝光部分的电子束胶去除，在硅基底表面得到纳米线槽和对齐标志槽，用去离子水清洗，氮气吹干；
(2-5)采用磁控溅射的方法，向步骤(2-4)的表面带有纳米线槽和对齐标志槽的硅基底上溅射5-20纳米厚的金属连接层，再溅射5-300纳米厚的金属传感层，在硅基底表面制备得到金属纳米线和对齐标志，使用丙酮和超声结合的方式进行清洗，将硅基底表面未被曝光部分的电子束胶与金属剥离，用去离子水冲洗，氮气吹干，在100-120℃的热板上保持90秒，完全干燥；
(2-6)将步骤(2-5)的带有金属纳米线和对齐标志的硅基底置于匀胶机上，旋涂光刻胶，在硅基底表面形成1.3-1.5微米厚的光刻胶薄层，先以100转每分钟旋涂10秒钟，然后以4000转每分钟旋涂40秒；
(2-7)将步骤(2-6)的带有旋涂光刻胶的硅基底放置于光刻机上，将步骤(2-1)信号采集电极的掩模铬板放置涂有光刻胶的硅基底上方，使硅基底上的对齐标志与信号采集电极的掩模铬板上的对齐标志对齐后，并使硅基底与信号采集电极的掩模铬板相互贴合，采用光刻方法，从信号采集电极的掩模铬板的上方进行光刻，再放入显影液中，将被未曝光部分的光刻胶去除，在硅基底表面制备得到信号采集电极槽，用去离子水清洗，氮气吹干；
(2-8)采用磁控溅射方法，对带有信号采集电极槽的硅基底表面进行磁控溅射，先溅射5-20纳米厚的金属连接层，再溅射5-300纳米厚的金属传感层，采用丙酮和超声结合的方法进行清洗，将被曝光部分的光刻胶与金属剥离，用去离子水冲洗，氮气吹干，在硅基底上制备得到信号采集电极和金属纳米线；
(3)在步骤(2)的纳米线上连接探针，包括以下步骤：
(3-1)将两根导线分别放置于信号采集电极上，使用绝缘物质覆盖放有导线的信号采集电极，使纳米线暴露于外部，形成一个检测单元；
(3-2)将检测单元放入溶有11-巯基十一烷酸的纯乙醇溶液中，溶有11-巯基十一烷酸的纯乙醇溶液的摩尔浓度为1毫摩尔/升，室温下静置1小时，取出检测单元，用纯乙醇冲洗检测单元，去除检测单元表面未反应的11-巯基十一烷酸；
(3-3)将检测单元放入摩尔浓度为50毫摩尔/升、pH＝5.0的2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)中，其中包含摩尔浓度为100毫摩尔/升的N-乙基-N′-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和摩尔浓度为50毫摩尔/升的N-羟基丁二酰亚胺(NHS)，室温下静置30分钟，取出检测单元；
(3-4)将检测单元快速放入溶有链霉亲和素的磷酸缓冲盐溶液中，该溶液的质量体积浓度为100微克/毫升，室温下静置1小时，取出检测单元，用磷酸缓冲盐溶液冲洗检测单元，去除检测单元表面未反应的链霉亲和素；
(3-5)将检测单元放入摩尔浓度为1摩尔/升的溶有甘氨酸的去离子水中，室温下静置20分钟，取出检测单元，用去离子水冲洗检测单元，去除检测单元表面未反应的甘氨酸；
(3-6)将检测单元放入摩尔浓度为1微摩/毫升的溶有生物素修饰的探针的磷酸缓冲盐溶液中，37℃下静置一小时，在检测单元表面暴露的纳米线连接上探针，取出检测单元，用磷酸缓冲盐溶液冲洗检测单元，去除检测单元表面未反应的探针，得到纳米线生物传感器。
5.如权利要求1、2、3或4所述的纳米线生物传感器的制备方法，其特征在于其中所述的步骤(2-8)中的金属连接层为铬或钛，金属传感层为金或铂。
6.一种如权利要求1或2所述的一种纳米线生物传感器的制备方法所制备的纳米线生物传感器的应用，其特征在于该应用包括以下步骤：
(1)向纳米线生物传感器中引流块的第一通孔中通入磷酸缓冲盐溶液(PBS)，使磷酸缓冲盐溶液充满第一通孔、底部通道和第二通孔，采集纳米线生物传感器上信号采集电极的第一电压-电流曲线和电化学阻抗谱曲线；
(2)向引流块的第一通孔中通入与纳米线生物传感器中探针相互补的目标序列，静置10分钟后，采集纳米线生物传感器上信号采集电极的第二电压-电流曲线和电化学阻抗谱曲线；
(3)对纳米线生物传感器上的信号采集电极施加一个1-1.5伏的直流电压，施加时间为60-90秒，使目标序列从纳米线上释放，并从引流块的第二通孔中流出，采集信号采集电极的第三电压-电流曲线和电化学阻抗谱曲线；
(4)向引流块的第一通孔中通入与纳米线生物传感器中探针相互补的目标序列，静置10分钟后，采集纳米线生物传感器上信号采集电极的第四电压-电流曲线和电化学阻抗谱曲线；
(5)将上述第一电压-电流曲线和电化学阻抗谱曲线、第二电压-电流曲线和电化学阻抗谱曲线、第三电压-电流曲线和电化学阻抗谱曲线和第四电压-电流曲线和电化学阻抗谱曲线进行对比，实现核酸检测；
(6)重复步骤(1)-(5)，进行目标核酸序列的多次重复检测。
7.一种如权利要求3或4所述的一种纳米线生物传感器的制备方法所制备的纳米线生物传感器的应用，其特征在于该应用包括以下步骤：
(1)将纳米线生物传感器放入到细胞培养基中，采集纳米线生物传感器上信号采集电极的第一电压-电流曲线和电化学阻抗谱曲线；
(2)根据设定的时间间隔，采集纳米线生物传感器上信号采集电极的多个电压-电流曲线和电化学阻抗谱曲线，记录多个电压-电流曲线和电化学阻抗谱曲线，通过对多个曲线进行对比，实现目标核酸序列的检测；
(3)对纳米线生物传感器上的信号采集电极施加一个1-1.5伏的直流电压，施加时间为60-90秒，使目标序列从纳米线上释放；
(4)重复步骤(1)-(3)，进行目标核酸序列的多次重复检测。
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