KR101718709B1 - 전기화학적 검출신호를 이용한 어패류의 종 및 원산지 판별방법 - Google Patents

전기화학적 검출신호를 이용한 어패류의 종 및 원산지 판별방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 어패류의 종 및 원산지 판별을 위한 전기화학적 검출신호를 비교 분석하는 유전자 판독방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 목적 유전자를 증폭한 후, 다양한 탐침 유전자가 고정화된 유전자 판독칩에 목적 유전자와 탐침 유전자의 혼성화에 이어, 전기화학적인 방법을 이용하여 혼성화 반응 전후의 전기화학적 신호 차이를 비교하여 어류의 종 및 원산지를 판별할 수 있는 유전자 판독방법에 관한 것이다. 이에 본 발명은 전기화학적 검출신호를 이용한 어패류의 종 및 원산지 판별방법에 있어서, ⅰ) 종 및 원산지에 대해 알고자하는 어패류의 목적 DNA를 중합효소연쇄반응(PCR)을 이용하여 유전자 증폭튜브에서 증폭하는 단계; ⅱ) 유전자 판독칩에 어패류의 종 및 원산지 정보가 알려진 탐침 DNA를 고정화하는 단계; ⅲ) 상기 탐침 DNA가 탑재된 유전자 판독칩의 전극에 전기화학적 신호를 측정하는 단계; ⅳ) 상기 목적 DNA를 유전자 증폭튜브에서 추출하여 상기 유전자 판독칩에 올려 상기 탐침 DNA와 혼성화하는 단계; ⅴ) 상기 탐침 DNA와 목적 DNA가 탑재된 유전자 판독칩의 전극에 전기화학적 신호를 측정하는 단계; ⅵ) 상기 측정된 전기화학적 신호를 비교 및 판독하는 단계; 를 포함하며, 상기 ⅲ)단계 및 ⅴ)단계는 전자전달 매개체로 Ferricyanide([Fe(CN)6]3-)를 사용하는 것을 특징으로 하는 전기화학적 검출신호를 이용한 어패류의 종 및 원산지 판별방법을 제공한다.

Description

전기화학적 검출신호를 이용한 어패류의 종 및 원산지 판별방법 {Identifying Method Of Species Or Origin About Fish And Shellfish Using Electrochemical Detecting Signal}
본 발명은 어패류의 종 및 원산지 판별을 위한 전기화학적 검출신호를 비교 분석하는 유전자 판독방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 목적 유전자를 증폭한 후, 다양한 탐침 유전자가 고정화된 유전자 판독칩에 목적 유전자와 탐침 유전자의 혼성화에 이어, 전기화학적인 방법을 이용하여 혼성화 반응 전후의 전기화학적 신호 차이를 비교하여 어류의 종 및 원산지를 판별할 수 있는 유전자 판독방법에 관한 것이다.
일반적으로 데옥시리보핵산(DNA: Deoxyribonucleic acid)과 리보핵산(RNA: Ribonucleic acid)등의 핵산분석법은 생물학 연구나 의료진단, 신약탐색, 법의학 등의 분야에 사용되고 있다.
특정한 염기서열을 가진 DNA를 찾아내는 방법은 전기영동에 의해 분리된 DNA 조각을 니트로셀룰로스나 나일론막과 같은 고체 기판 위로 옮겨서 상대적인 위치를 유지시킨 후, 방사선 동위원소로 표지된(labeld) 관찰하고자 하는 염기서열의 DNA를 탐침(probe)으로 넣어 혼성화(hybridization)를 통하여 상보적 결합을 하는 DNA 조각의 위치를 확인하는 방법이다. 이 방법은 숙련된 기술과 많은 시간과 자원을 필요로 한다.
이러한 문제점을 해결하기 위하여 다수의 DNA를 이미 알고있는 위치에 마이크로 사이즈의 크기로 2차원 배열한 DNA 마이크로어레이(microarray) 칩이 개발되었드며, 빠른 시간에 수십만 개 이상의 DNA를 검색할 수 있다. 좁은 기판 위에 고밀도로 집적된 DNA는 관찰하고자 하는 DNA와 혼성화하는 경우 형광표지자에 의해 형광을 발생하도록 되어 있으므로, 마이크로 크기의 2차원 형광패턴을 인식하는 광학 시스템을 필요로 한다.
한편 표면플라즈몬공명법(SPR: Surface Plasmon Resonance)은 금속 박막 표면에 고정된 DNA가 혼성화되는 것을 표면의 굴절률 변화로 감지하므로, 형광표지자 없이도 DNA 혼성화를 검출할 수 있다. 그러나 감도가 좋지 못하여 1011/㎠의 농도 이상의 탐침 DNA가 고정화되어 있어야 한다.
대한민국 공개특허 특2002-0067132호는 분석대상 핵산과 상보적인 DNA가 배열된 DNA 포획칩을 시료용액에 담궈 분석대상 핵산을 DNA 포획칩상의 DNA와 혼성화시키고, 이를 탐지 DNA 기판으로 이동시키고, 분석대상 핵산에 상보적인 서열을 가지며 형광 표지된 프로브 DNA를 혼성화시키고, 탐지 DNA 기판의 형광을 분석하여 시료중 핵산의 정보를 분석하는 방법에 관한 것으로서, 하나이상의 분석대상 핵산이 결합된 DNA 탐지칩을 제조함으로써 시료내 핵산이 고정된 별도의 DNA 탐지칩을 제조할수 있어 분석대상 생명체의 유전자를 하나의 기판에 올린 DNA칩을 제조할 수 있고, 하나의 DNA칩으로 다수의 유전자 부위를 분석하여 DNA분석에 필요한 시간과 비용을 줄일 수 있다. 또한 상기 DNA 탐지칩에 별도로 제조된 형광표지 프로브 DNA을 결합시켜 유전정보를 분석하므로, 본 발명의 유전자 분석방법은 변이유전자의 분석을 위해 시료 DNA나 DNA 포획칩 상에 고정된 핵산에 리포터 물질을 추가하는 단계가 필요하지 않으며, 또한 검출되는 신호수준이 비슷하고 간섭을 줄일 수 있어 복잡한 이미지 분석과정 없이도 유전자에 대한 정보를 얻을 수 있다. 그러나 본 발명은 목적 유전자를 증폭한 후, 다양한 탐침 유전자가 고정화된 유전자 판독칩에 목적 유전자와 탐침 유전자의 혼성화에 이어, 전기화학적인 방법을 이용하여 혼성화 반응 전후의 전기화학적 신호 차이를 비교하여 어류의 종 및 원산지를 판별할 수 있다는 점에서 상기 발명과는 차이가 있다.
어패류의 종 또는 원산지를 속이는 불법유통 사례가 날로 증가하고 있는 요즘, 해상 불법조업의 단속과 같이 유전자 감식을 통한 검증을 요구하는 사례가 증가하고 있다. 현재, 실용화되어 있는 DNA칩으로서는 DNA 고정화 기판으로서 니트로셀로로스막, 실리콘기판, 유리기판, 고분자, 전극 등을 이용하고 있다. 또한 DNA의 기판상에의 고정화 방법도 화학적 결합법과 DNA가 부전하를 띠고 있는 성질을 이용해서 특정 위치에 정전위를 인가함으로써 전극상에 프로브 DNA를 고정화하는 전기화학적 고정화법이 알려져 있다.
이와 같은 DNA칩은 일반적으로 배열이 다른 다수의 프로브 DNA가 정열·고정화되어 있다. 이것에 형광표식된 목표 DNA를 반응시키면 서로 상호적인 유전자만이 이중나선의 DNA를 형성하므로, 그 부분의 형광강도를 측정함으로써 유전자 기능의 해석과 질환에 관여하는 유전자를 검출할 수 있다. 그러나, 이와 같은 종래의 형광검출형 DNA칩은 미리 fluorescence, Rhodymine, Cy3, Cy5 등의 형광색소를 목표 DNA를 표식하여 둘 필요가 있으므로, 작업성이 복잡한 문제점이 있다. 또한 DNA칩상에서 발생하는 형광신호는 공초점 레이저 현미경, 형광스캐너 등을 탑재한 해석장치로 검출, 화상화, 해석되므로 대형이며, 이러한 설비를 필요로 한다는 문제점도 있다.
이를 해결하기 위한 대안으로써 전기화학적인 방식으로 DNA 혼성화를 검출하는 것은 상기에서 열거한 방식에 비하여 간단한 전기적인 회로를 구성하여 전류, 정전용량 또는 임피던스를 측정하기 때문에 조작방법이 비교적 용이하며 저가형 검출장치를 제조할 수 있다.
이에 본 발명은 표지자를 사용하지 않고 전기화학적 검출신호를 이용한 어패류의 종 및 원산지 판별방법에 있어서,
ⅰ) 종 및 원산지에 대해 알고자하는 어패류에 관련되고, 표지되지 않은(label-free) 목적 DNA를 중합효소연쇄반응(PCR)을 이용하여 유전자 증폭튜브에서 증폭하는 단계;
ⅱ) 유전자 판독칩에 어패류의 종 및 원산지 정보가 알려진 탐침 DNA를 고정화하는 단계;
ⅲ) 상기 탐침 DNA가 탑재된 유전자 판독칩의 전극에 전기화학적 신호를 측정하는 단계;
ⅳ) 상기 목적 DNA를 유전자 증폭튜브에서 추출하여 상기 유전자 판독칩에 올려 상기 탐침 DNA와 혼성화하는 단계;
ⅴ) 상기 탐침 DNA와 목적 DNA가 탑재된 유전자 판독칩의 전극에 전기화학적 신호를 측정하는 단계;
ⅵ) 상기 측정된 전기화학적 신호를 비교 및 판독하는 단계;
를 포함하며,
상기 ⅲ)단계 및 ⅴ)단계는 전자전달 매개체로 Ferricyanide([Fe(CN)6]3-)를 사용하고,
상기 ⅴ)단계는 상기 목적 DNA와 상기 탐침 DNA의 상보적 결합이 증가할수록 Ferricyanide([Fe(CN)6]3-)에 대한 척력이 증가하여 전기화학적 신호가 감소되게 수행되며,
상기 ⅲ) 단계 또는 상기 ⅴ) 단계에서, 전기화학적으로 신호를 검출하는 방법은 전압전류법(voltammetry), 전류법(amperometry), 전위차법(potentiometry), 전도도법(conductometry), 전기량법(coulometry), 전해무게분석법(electrogravimetry) 중에서 선택된 적어도 어느 하나의 방법인 것을 특징으로 하는 전기화학적 검출신호를 이용한 어패류의 종 및 원산지 판별방법을 제공한다.
본 발명의 전기화학적 검출신호를 이용한 어패류의 종 및 원산지 판별방법을 적용하면, 표지자를 사용하지 않고(label-free), 전극의 개질이 없는, 산화환원 매개체 방식의 전지화학적 방법을 적용함으로써, 여타의 DNA칩에 비하여 간편성, 휴대성, 개발비용의 면에서 우수한 DNA칩을 제작할 수 있다. 또한 탐침 DNA와 목표 DNA의 표식이 필요 없으며, 상호적 DNA의 염기쌍을 간편하고, 정확하게 검출할 수 있다. 또한 본 발명의 방법에 의하여 제조되는 DNA칩을 소형화할 수 있고, 생산 가격을 낮출 수 있는 효과가 있다. 특히 전기화학적으로 반응을 검출할 수 있으므로, 측정에는 범용의 장치를 이용할 수 있다. 따라서 복잡한 조작이나 시약, 설비 등을 필요로 하지 않는다.
도 1은 본 발명인 전기화학적 검출신호를 이용한 어패류의 종 및 원산지 판별방법의 순서도.
도 2는 본 발명의 일실시예인 유전자 증폭튜브와 챔버의 실제 예시도.
도 3은 본 발명의 일실시예인 유전자 판독칩의 실제 예시도.
도 4는 본 발명의 일실시예인 어패류의 종 및 원산지 정보가 알려진 탐침 DNA를 유전자 판독칩에 고정화하는 방법의 순서도.
도 5는 본 발명의 일실시예인 순환전압전류법(CV: cyclic voltammetry)의 신호 판독결과 perfect-match(PM)의 볼타모그램(voltamo-gram).
도 6은 본 발명의 일실시예인 순환전압전류법(CV: cyclic voltammetry)의 신호 판독결과 mis-match(MM)의 볼타모그램(voltamo-gram).
어패류의 종 또는 원산지를 속이는 불법유통 사례가 날로 증가하고 있는 요즘, 해상 불법조업의 단속과 같이 유전자 감식을 통한 검증을 요구하는 사례가 증가하고 있다. 종래에 특정한 염기서열을 가진 DNA를 찾아내는 방법으로는 전기영동에 의해 분리된 DNA 조각을 니트로셀룰로오스나 나일론막과 같은 고체 기판 위로 옮겨서 상대적인 위치를 유지시킨 후, 방사선 동위원소로 표지된(labeld) 관찰하고자 하는 염기서열의 DNA를 탐침(probe)으로 넣어 혼성화(hybridization)를 통하여 상보적 결합을 하는 DNA 조각의 위치를 확인하는 방법이다. 이 방법은 숙련된 기술과 많은 시간과 자원을 필요로 한다.
이러한 문제점을 해결하기 위하여 다수의 DNA를 이미 알고 있는 위치에 마이크로 사이즈의 크기로 2차원 배열한 DNA 마이크로어레이(microarray) 칩이 개발되었으며, 빠른 시간에 수십만 개 이상의 DNA를 검색할 수 있다. 좁은 기판 위에 고밀도로 집적된 DNA는 관찰하고자 하는 DNA와 혼성화하는 경우 형광표지자에 의해 형광을 발생하도록 되어 있으므로, 마이크로 크기의 2차원 형광패턴을 인식하는 광학 시스템을 필요로 한다.
한편 표면플라즈몬공명법(SPR: Surface Plasmon Resonance)은 금속 박막 표면에 고정된 DNA가 혼성화되는 것을 표면의 굴절률 변화로 감지하므로, 형광표지자 없이도 DNA 혼성화를 검출할 수 있다. 그러나 감도가 좋지 못하여 1011/㎠의 농도 이상의 탐침 DNA가 고정화되어 있어야 한다.
이를 해결하기 위한 대안으로써 전기화학적인 방식으로 DNA 혼성화를 검출하는 것은 상기에서 열거한 방식에 비하여 간단한 전기적인 회로를 구성하여 전류, 정전용량 또는 임피던스를 측정하기 때문에 조작방법이 비교적 용이하며 저가형 검출장치를 제조할 수 있다.
본 발명은 어패류의 종 및 원산지 판별을 위한 전기화학적 검출신호를 비교 분석하는 유전자 판독방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 목적 유전자를 증폭한 후, 다양한 탐침 유전자가 고정화된 유전자 판독칩에 목적 유전자와 탐침 유전자의 혼성화에 이어, 전기화학적인 방법을 이용하여 혼성화 반응 전후의 전기화학적 신호 차이를 비교하여 어류의 종 및 원산지를 판별할 수 있는 유전자 판독방법에 관한 것이다. 이하 첨부되는 도면과 함께 본 발명을 상세히 설명한다.
이에 본 발명은 전기화학적 검출신호를 이용한 어패류의 종 및 원산지 판별방법에 있어서, 도 1에 도시된 바와 같이,
ⅰ) 종 및 원산지에 대해 알고자하는 어패류에 관련되고, 표지되지 않은(label-free) 목적 DNA를 중합효소연쇄반응(PCR)을 이용하여 유전자 증폭튜브(10)에서 증폭하는 단계(s100);
ⅱ) 유전자 판독칩(20)에 어패류의 종 및 원산지 정보가 알려진 탐침 DNA를 고정화하는 단계(s200);
ⅲ) 상기 탐침 DNA가 탑재된 유전자 판독칩(20)의 전극에 전기화학적 신호를 측정하는 단계(s300);
ⅳ) 상기 목적 DNA를 유전자 증폭튜브(10)에서 추출하여 상기 유전자 판독칩(20)에 올려 상기 탐침 DNA와 혼성화하는 단계(s400);
ⅴ) 상기 탐침 DNA와 목적 DNA가 탑재된 유전자 판독칩(20)의 전극에 전기화학적 신호를 측정하는 단계(s500);
ⅵ) 상기 측정된 전기화학적 신호를 비교 및 판독하는 단계(s600);
를 포함하며,
상기 ⅲ)단계 및 ⅴ)단계는 전자전달 매개체로 Ferricyanide([Fe(CN)6]3-)를 사용하고,
상기 ⅴ)단계는 상기 목적 DNA와 상기 탐침 DNA의 상보적 결합이 증가할수록 Ferricyanide([Fe(CN)6]3-)에 대한 척력이 증가하여 전기화학적 신호가 감소되게 수행되는 것을 특징으로 하는 전기화학적 검출신호를 이용한 어패류의 종 및 원산지 판별방법을 제공한다.
ⅰ) 단계는, ⅱ) 단계 또는 ⅲ) 단계를 수행한 이후에 수행하는 것 또한 가능하다.
본 발명의 일실시예에 따르면 ⅰ) 종 및 원산지에 대해 알고자하는 어패류의 목적 DNA를 중합효소연쇄반응(PCR)을 이용하여 유전자 증폭튜브(10)에서 증폭하는 단계(s100) 이전에,
a) 종 및 원산지에 대해 알고자하는 어패류의 조직과 유전자 추출시약을 추출용기에 넣고 50-70분 흔들어 유전자를 추출하는 단계;
를 더 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명의 일실시예에서는 ⅰ) 종 및 원산지에 대해 알고자하는 어패류의 목적 DNA를 중합효소연쇄반응(PCR)을 이용하여 유전자 증폭튜브(10)에서 증폭하는 단계(s100)는, 도 2에 도시된 바와 같이,
상기 목적 DNA를 주사바늘의 투과가 가능한 정도의 유연한 경도의 마개를 가지는 증폭유전자 증폭튜브(10)에 담아 챔버에 삽입하여 마개를 열지 않고 주사바늘이 마개를 통과하여 유전자를 주입 또는 추출할 수 있어 유전자 증폭을 편리하게 수행하는 것이 가능하며, 또한 온도를 히터블럭을 이용하여 Denature(약 95도), Annealing(약 50도), Extension(약 72도) 순으로 변환시키면서 유전자 증폭 유전자 증폭튜브(10) 내부에 있는 유전자를 증폭하는 것이 바람직하다.
상기 ⅱ) 유전자 판독칩(20)에 어패류의 종 및 원산지 정보가 알려진 탐침 DNA를 고정화하는 단계(s200)에서, 도 3에 도시된 바와 같이, 본 발명의 일실시예로서,
상기 유전자 판독칩(20)은 기준전극, 작업전극, 상대전극으로 사용되는 금전극층이 패터닝되어 증착된 형상이며, 상기 금전극층 표면에 어패류의 종 및 원산지 정보가 알려진 탐침 DNA를 고정화하여 전기화학 검출신호의 감도를 높이는 것이 가능하다.
상기 ⅱ) 유전자 판독칩(20)에 어패류의 종 및 원산지 정보가 알려진 탐침 DNA를 고정화하는 단계(s200)는, 도 4에 도시된 바와 같이,
ⅱ-1) 금전극층이 형성된 기판을 5 내지 20 중량% 아세톤과 80 내지 95중량% DI water의 혼합액으로 세척하는 단계(s210);
ⅱ-2) 작업전극으로 사용할 금전극층 표면에 5' 말단에 작용기 A를 가지는 5-15uM의 탐침 DNA 2-6uL를 30-90분 동안 올리는 단계(s220);
ⅱ-3) PBS(phosphate buffer saline)으로 2-4회 세척하는 단계(s230);
ⅱ-4) 상기 탐침 DNA가 고정된 표면에 5-20uM의 mercaptohexanol(MCH)를 45-90분 동안 올리는 단계(s240);
를 포함하며,
상기 작용기 A를 가지는 탐침 DNA는 티올기를 가지는(thiol-modified) 탐침 DNA 또는 디설파이드기를 가지는(disulfide-modified) 탐침 DNA인 것을 특징으로 하는 전기화학적 검출신호를 이용한 어패류의 종 및 원산지 판별방법을 제공한다.
또한 ⅲ) 상기 탐침 DNA가 탑재된 유전자 판독칩(20)의 전극에 전기화학적 신호를 측정하는 단계(s300) 또는
ⅴ) 상기 탐침 DNA와 목적 DNA가 탑재된 유전자 판독칩(20)의 전극에 전기화학적 신호를 측정하는 단계(s500)에서,
전기화학적으로 신호를 검출하는 방법은 전압전류법(voltammetry), 전류법(amperometry), 전위차법(potentiometry), 전도도법(conductometry), 전기량법(coulometry), 전해무게분석법(electrogravimetry) 중에서 선택된 적어도 어느 하나의 방법인 것이 바람직하며,
상기 전압전류법(voltammetry) 중에서, 순환전압전류법(CV: cyclic voltammetry)은,
상기 Ferricyanide([Fe(CN)6]3-)의 산화환원 반응에 의해 도출되는 산화피크 또는 환원피크 값을 검출하여 비교분석 하는 것이 바람직하다.
상기 ⅳ) 상기 목적 DNA를 유전자 증폭튜브(10)에서 추출하여 상기 유전자 판독칩(20)에 올려 상기 탐침 DNA와 혼성화하는 단계(s400)에서,
주사기 바늘로 상기 유전자 증폭튜브(10)의 마개에 투과시켜 추출한 후, 상기 유전자 판독칩(20)의 시료주입구에 인산 완충 버퍼(PBS: Phosphate buffer saline)와 함께 주입하는 것이 바람직하며,
탐침 DNA의 서열에 따른 Tm에서 5-10℃ 낮은 온도조건에서 45-70분 혼성화하는 것이 바람직하다.
탐침 DNA가 고정화되어 있는 전극표면은 (-)전하를 띠고, 본 발명의 실시예로서 전자전달매개체인 Ferricyanide([Fe(CN)6]3-) 또한 (-)전하를 띠고 있으므로, 두 물질 간의 척력으로 전극표면에 고정화되어 있는 탐침 DNA가 많을수록 (-)전하가 강해지고, 따라서 전자전달매개체가 전극표면으로 접근하는 양도 적어진다. 전극표면에서의 전자전달매개체가 적어지면 그 양만큼 전자전달매개체의 산화환원반응을 통해 나오는 전자들이 적어진다. 즉 전극표면이 (-)전하가 강할수록 전지적 신호가 줄어든다. 이와 같은 원리로 목적 DNA와 탐침 DNA의 상보적 결합으로 전극표면은 더 강한 (-)전하를 띠게 되고, 따라서 전기적 검출 신호 또한 줄어들게 된다. 하지만 목적 DNA가 탐침 DNA와 상보적으로 결합을 하지 못한 경우는 전극표면에 탐침 DNA만 남아있게 되고, 이때 전기적 신호는 변하지 않으므로, 목적 DNA의 perfect-match(PM)와 mis-match(MM)를 구분하게 된다.
그러므로 도 5 내지 도 6에 도시된 바와 같이,
ⅵ) 상기 측정된 전기화학적 신호를 비교 및 판독하는 단계(s600)에서,
혼성화 이전/이후의 신호를 볼타모그램(voltamo-gram)으로 비교하여 혼성화 이후의 산화피크와 환원피크의 감소시 상기 목적 DNA는 탐침 DNA와 perfect-match(PM)임을 확인하거나,
혼성화 이후의 산화피크와 환원피크의 불변시 상기 목적 DNA는 탐침 DNA와 mis-match(MM)임을 확인하는 것이 가능하다.
이에 나아가 본 발명은 상기 ⅰ)단계 내지 ⅵ)단계 중,
적어도 3개 이상의 단계를 포함하여 하나의 시스템에서 수행함으로써 휴대성과 현장성을 높이는 전기화학적 검출신호를 이용한 어패류의 종 및 원산지 판별방법을 제공한다.
본 발명의 전기화학적 검출신호를 이용한 어패류의 종 및 원산지 판별방법을 적용하면, 표지자를 사용하지 않고(label-free), 전극의 개질이 없는, 산화환원 매개체 방식의 전지화학적 방법을 적용함으로써, 여타의 DNA칩에 비하여 간편성, 휴대성, 개발비용의 면에서 우수한 DNA칩을 제작할 수 있다. 또한 탐침 DNA와 목표 DNA의 표식이 필요 없으며, 상호적 DNA의 염기쌍을 간편하고, 정확하게 검출할 수 있다. 또한 본 발명의 방법에 의하여 제조되는 DNA칩을 소형화할 수 있고, 생산 가격을 낮출 수 있는 효과가 있다. 특히 전기화학적으로 반응을 검출할 수 있으므로, 측정에는 범용의 장치를 이용할 수 있다. 따라서 복잡한 조작이나 시약, 설비 등을 필요로 하지 않는다.
본 발명을 첨부된 도면과 함께 설명하였으나, 이는 본 발명의 요지를 포함하는 다양한 실시 형태 중의 하나의 실시예에 불과하며, 당업계에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 하는 데에 그 목적이 있는 것으로, 본 발명은 상기 설명된 실시예에만 국한되는 것이 아님은 명확하다. 따라서, 본 발명의 보호범위는 하기의 청구범위에 의해 해석되어야 하며, 본 발명의 요지를 벗어나지 않는 범위 내에서의 변경, 치환, 대체 등에 의해 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술 사상은 본 발명의 권리범위에 포함될 것이다. 또한 도면의 일부 구성은 구성을 보다 명확하게 설명하기 위한 것으로 실제보다 과장되거나 축소되어 제공된 것임을 명확히 한다.
10. 유전자 증폭튜브
20. 유전자 판독칩

Claims (13)

  1. 표지자를 사용하지 않고 전기화학적 검출신호를 이용한 어패류의 종 및 원산지 판별방법에 있어서,
    ⅰ) 종 및 원산지에 대해 알고자하는 어패류에 관련되고, 표지되지 않은(label-free) 목적 DNA를 중합효소연쇄반응(PCR)을 이용하여 유전자 증폭튜브(10)에서 증폭하는 단계(s100);
    ⅱ) 유전자 판독칩(20)에 어패류의 종 및 원산지 정보가 알려진 탐침 DNA를 고정화하는 단계(s200);
    ⅲ) 상기 탐침 DNA가 탑재된 유전자 판독칩(20)의 전극에 전기화학적 신호를 측정하는 단계(s300);
    ⅳ) 상기 목적 DNA를 유전자 증폭튜브(10)에서 추출하여 상기 유전자 판독칩(20)에 올려 상기 탐침 DNA와 혼성화하는 단계(s400);
    ⅴ) 상기 탐침 DNA와 목적 DNA가 탑재된 유전자 판독칩(20)의 전극에 전기화학적 신호를 측정하는 단계(s500); 및
    ⅵ) 상기 측정된 전기화학적 신호를 비교 및 판독하는 단계(s600);
    를 포함하며,
    상기 ⅲ)단계 및 ⅴ)단계는 전자전달 매개체로 Ferricyanide([Fe(CN)6]3-)를 사용하고,
    상기 ⅴ)단계는 상기 목적 DNA와 상기 탐침 DNA의 상보적 결합이 증가할수록 Ferricyanide([Fe(CN)6]3-)에 대한 척력이 증가하여 전기화학적 신호가 감소되게 수행되며,
    상기 ⅲ) 단계(s300) 또는 상기 ⅴ) 단계(s500)에서, 전기화학적으로 신호를 검출하는 방법은 전압전류법(voltammetry), 전류법(amperometry), 전위차법(potentiometry), 전도도법(conductometry), 전기량법(coulometry), 전해무게분석법(electrogravimetry) 중에서 선택된 적어도 어느 하나의 방법이고,
    상기 ⅵ)단계(s600)는, 혼성화 이전/이후의 신호를 볼타모그램(voltamo-gram)으로 비교하여 혼성화 이후의 산화피크와 환원피크의 감소시 상기 목적 DNA는 탐침 DNA와 perfect-match(PM)임을 확인하고, 혼성화 이후의 산화피크와 환원피크의 불변시 상기 목적 DNA는 탐침 DNA와 mis-match(MM)임을 확인하는 것을 특징으로 하는 전기화학적 검출신호를 이용한 어패류의 종 및 원산지 판별방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    ⅰ) 단계는, ⅱ) 단계 또는 ⅲ) 단계를 수행한 이후에 수행하는 것을 특징으로 하는 전기화학적 검출신호를 이용한 어패류의 종 및 원산지 판별방법.
  3. 제 1항에 있어서,
    ⅰ) 종 및 원산지에 대해 알고자하는 어패류의 목적 DNA를 중합효소연쇄반응(PCR)을 이용하여 유전자 증폭튜브(10)에서 증폭하는 단계(s100) 이전에,
    a) 종 및 원산지에 대해 알고자하는 어패류의 조직과 유전자 추출시약을 추출용기에 넣고 50-70분 흔들어 유전자를 추출하는 단계;
    를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 전기화학적 검출신호를 이용한 어패류의 종 및 원산지 판별방법.
  4. 제 1항에 있어서,
    ⅰ) 종 및 원산지에 대해 알고자하는 어패류의 목적 DNA를 중합효소연쇄반응(PCR)을 이용하여 유전자 증폭튜브(10)에서 증폭하는 단계(s100)는,
    상기 목적 DNA를 주사바늘의 투과가 가능한 정도의 유연한 경도의 마개를 가지는 증폭유전자 증폭튜브(10)에 담아 챔버에 삽입하여 온도를 순차적으로 변환시키면서 유전자 증폭 유전자 증폭튜브(10) 내부에 있는 유전자를 증폭하는 것을 특징으로 하는 전기화학적 검출신호를 이용한 어패류의 종 및 원산지 판별방법.
  5. 제 1항에 있어서,
    ⅱ) 유전자 판독칩(20)에 어패류의 종 및 원산지 정보가 알려진 탐침 DNA를 고정화하는 단계(s200)에서,
    상기 유전자 판독칩(20)은 기준전극, 작업전극, 상대전극으로 사용되는 금전극층이 패터닝되어 증착된 형상이며, 상기 금전극층 표면에 어패류의 종 및 원산지 정보가 알려진 탐침 DNA를 고정화하는 것을 특징으로 하는 전기화학적 검출신호를 이용한 어패류의 종 및 원산지 판별방법.
  6. 제 1항에 있어서,
    ⅱ) 유전자 판독칩(20)에 어패류의 종 및 원산지 정보가 알려진 탐침 DNA를 고정화하는 단계(s200)는,
    ⅱ-1) 금전극층이 형성된 기판을 5 내지 20 중량% 아세톤과 80 내지 95중량% DI water의 혼합액으로 세척하는 단계(s210);
    ⅱ-2) 작업전극으로 사용할 금전극층 표면에 5' 말단에 작용기 A를 가지는 5-15uM의 탐침 DNA 2-6uL를 30-90분 동안 올리는 단계(s220);
    ⅱ-3) PBS(phosphate buffer saline)으로 2-4회 세척하는 단계(s230);
    ⅱ-4) 상기 탐침 DNA가 고정된 표면에 5-20uM의 mercaptohexanol(MCH)를 45-90분 동안 올리는 단계(s240);
    를 포함하며,
    상기 작용기 A를 가지는 탐침 DNA는 티올기를 가지는(thiol-modified) 탐침 DNA 또는 디설파이드기를 가지는(disulfide-modified) 탐침 DNA인 것을 특징으로 하는 전기화학적 검출신호를 이용한 어패류의 종 및 원산지 판별방법.
  7. 삭제
  8. 제 1항에 있어서,
    상기 전압전류법(voltammetry)은 순환전압전류법(CV: cyclic voltammetry)을 포함하며,
    상기 순환전압전류법은 Ferricyanide([Fe(CN)6]3-)의 산화환원 반응에 의해 도출되는 산화피크 또는 환원피크 값을 검출하는 것을 특징으로 하는 전기화학적 검출신호를 이용한 어패류의 종 및 원산지 판별방법.
  9. 제 1항에 있어서,
    ⅳ) 상기 목적 DNA를 유전자 증폭튜브(10)에서 추출하여 상기 유전자 판독칩(20)에 올려 상기 탐침 DNA와 혼성화하는 단계(s400)에서,
    주사기 바늘로 상기 유전자 증폭튜브(10)의 마개에 투과시켜 추출한 후, 상기 유전자 판독칩(20)의 시료주입구에 인산 완충 버퍼(PBS: Phosphate buffer saline)와 함께 주입하는 것을 특징으로 하는 전기화학적 검출신호를 이용한 어패류의 종 및 원산지 판별방법.
  10. 제 1항에 있어서,
    ⅳ) 상기 목적 DNA를 유전자 증폭튜브(10)에서 추출하여 상기 유전자 판독칩(20)에 올려 상기 탐침 DNA와 혼성화하는 단계(s400)에서,
    탐침 DNA의 서열에 따른 Tm에서 5-10℃ 낮은 온도조건에서 45-70분 혼성화하는 것을 특징으로 하는 전기화학적 검출신호를 이용한 어패류의 종 및 원산지 판별방법.
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 제 1항에 있어서,
    상기 ⅰ)단계 내지 ⅵ)단계 중,
    적어도 3개 이상의 단계를 포함하여 하나의 시스템에서 수행하는 것을 특징으로 하는 전기화학적 검출신호를 이용한 어패류의 종 및 원산지 판별방법.






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