JP2005283304A - プローブアレイ - Google Patents

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Abstract

【課題】 簡便な操作により再現性よく標的物質を検出することができるプローブアレイを提供する。
【解決手段】 円筒状の第一部材１１と、第一部材１１の中空部に収容された円柱状の第二部材１２と、第二部材１２の外周面に固定されたプローブとを備えたプローブアレイ１において、第一部材１１の内周面と第二部材１２の外周面との接触を防止するスペーサー部１３ａを第二部材１２の外周面に設ける。
【選択図】 図１

Description

本発明はプローブアレイに関する。
近年、標的物質と反応できるプローブ（例えば、ＤＮＡ、タンパク質等の生体物質）をガラス、シリコン等のプレート状担体に固定化し、標的物質の検出を行うＤＮＡチップ、プロテインチップ等のプローブアレイが開発されている（例えば、特許文献１参照）。プローブアレイによる標的物質の検出は、標的物質を含む液体試料をプレート状担体上に添加し、乾燥を防ぐためにカバーグラス等を被せ、プローブと標的物質とを反応させた後、洗浄してプローブと反応した標的物質以外の物質を除去し、予め標的物質に結合させておいた標識物質（例えば、蛍光物質、酵素等）を検出することにより行われる。
特開平１１−１０８９２８号公報
しかしながら、従来のプローブアレイは、微量な液体試料をマイクロピペットで吸い取り、均一にプレート状担体に添加し、カバーグラスを被せ、反応後にカバーグラスを外して均一にプレート状担体を洗浄するという操作を手作業で行わなければならず、各作業は非常に繊細であるため、作業する者によって結果に大きな差が生じ、再現性のある結果を得ることが困難であった。また、検出を自動的に行う装置も開発されているが、非常に高価であり容易に入手することはできない。
そこで、本発明は、簡便な操作により再現性よく標的物質を検出することができるプローブアレイを提供することを目的とする。
上記課題を解決するために、本発明は、筒状の第一部材と、前記第一部材の中空部に収容された第二部材と、前記第二部材の外周面に固定されたプローブとを備えたプローブアレイであって、前記第一部材の内周面と前記第二部材の外周面との接触を防止するスペーサー部が、前記第一部材の内周面又は前記第二部材の外周面に設けられている前記プローブアレイを提供する。
本発明のプローブアレイにおいて、第一部材の中空部には、第一部材の開口部を通じて液体試料、洗浄液等の液体を流入及び流出させることができるようになっている。また、本発明のプローブアレイにおいて、第二部材の外周面に固定されたプローブは、第一部材の中空部に露出しており、第一部材の中空部に流入した液体と接触できるようになっている。特に、本発明のプローブアレイにおいては、スペーサー部により第一部材の内周面と第二部材の外周面との接触が防止されているので、プローブは第一部材の中空部に流入した液体と確実に接触できるようになっている。
したがって、本発明のプローブアレイによれば、第一部材の中空部に対する液体試料、洗浄液等の流入及び流出という簡便な操作により、再現性よく標的物質を検出することができる。
本発明のプローブアレイによれば、第一部材の中空部に対する液体試料、洗浄液等の流入及び流出という簡便な操作により、再現性よく標的物質を検出することができる。
以下、本発明を図面に基づいて詳細に説明する。
図１（ａ）は一実施形態に係るプローブアレイの斜視図、図１（ｂ）は同プローブアレイの断面図である。
図１に示すように、本実施形態に係るプローブアレイ１は、円筒状の第一部材１１と、第一部材１１の中空部に収容された円柱状の第二部材１２と、第二部材１２の外周面に固定されたプローブ群Ｐと、第二部材１２の外周面に設けられたスペーサー部１３ａとを備えている。
図１に示すように、第一部材１１は、中空部及び該中空部に通じる２つの開口部を有しており、第一部材１１の中空部には、開口部を通じて液体を流入及び流出させることができるようになっている。
図１に示すように、第一部材１１は円筒状であるが、第一部材１１の形状は筒状である範囲において変更が可能であり、円筒状以外の筒状（例えば角筒状等）であってもよい。第一部材１１の長さは例えば１〜３０ｃｍであり、内径は例えば１ｍｍ〜１ｃｍであるが、適宜変更が可能である。
第一部材１２の材質は、液体試料、洗浄液等に不溶性である材質である限り特に限定されるものではなく、例えば、ポリエチレン、ポリエチレン共重合体（例えば、エチレン−アクリル酸エチル共重合体、エチレン−酢酸ビニル共重合体）等のポリエチレン系樹脂；ポリプロピレン；ポリスチレン、ポリスチレン共重合体（例えばアクリロニトリル−スチレン共重合体、アクリロニトリル−スチレン−ブタジエン共重合体）等のポリスチレン系樹脂；塩化ビニル樹脂；塩化ビニリデン樹脂；ポリテトラフルオロエチレン等のフッ素樹脂；ポリメタクリル酸メチル、ポリアクリロニトリル等のアクリル樹脂；ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレンナフタレート、ポリブチレンテレフタレート等のポリエステル；ポリカーボネート等の熱可塑性樹脂等のプラスチック；鉄、銅、アルミニウム等の金属；ガラス；セラミックス；これらの複合材料等が挙げられる。
第一部材１１の材質は透明又は半透明である（光透過性を有する）ことが好ましい。これにより、標的物質に結合している標識物質（例えば、蛍光物質等）をプローブアレイ１の外部にて検出することができるので、第一部材１１の中空部から第二部材１２を取り出すことなく標的物質を検出することができる。
図１に示すように、第二部材１２は円柱状であるが、第二部材１２の形状は、第一部材１１の中空部に収容でき、かつ第二部材１２が収容された状態にある第一部材１１の中空部に液体を流入させることができる範囲内において変更が可能であり、例えば、シート状部材、平板状部材、円筒状部材、円錐状部材、角筒状部材、角筒状部材、角錐状部材、可撓性シート状部材を湾曲又は曲折させた部材等であってもよい。
第二部材１２の材質は、液体試料、洗浄液等に不溶性である限り特に限定されるものではなく、例えば、上記熱可塑性樹脂等のプラスチック；鉄、銅、アルミニウム等の金属；ガラス；セラミックス；これらの複合材料等が挙げられる。
第二部材１２は、多孔質であってもよいし無孔質であってもよいが、多孔質である場合には、第二部材１２の表面積が増加するので、第二部材１２の表面により多くのプローブを固定することができる。
図１に示すように、第二部材１２の外周面には、複数のプローブ群Ｐがそれぞれスポット状に固定されており、各プローブ群に含まれるプローブの種類は、各プローブ群の固定位置に基づいて識別できるようになっている。各プローブ群は、プローブの種類と位置とが対応付けられる限りいかなる形態で固定されていてもよく、各プローブ群は、例えば筋状に固定されていてもよい。また、第二部材１２の外周面に固定されるプローブ群Ｐの数は特に限定されるものではなく、適宜変更が可能である。また、各プローブ群の配置、スポットの大きさ等は適宜変更が可能である。
１つのプローブ群には同一種類の複数のプローブが含まれている。各プローブ群に含まれるプローブは、例えば、核酸、タンパク質、抗原、抗体、酵素、糖鎖等の生体物質である。異なるプローブ群に含まれるプローブの種類は同一種類であってもよいし異なる種類であってもよいが、プローブ群全体で複数種類のプローブが含まれることが好ましい。第二部材１２に複数種類のプローブが固定されていることにより、複数種類の標的物質を同時に並列して検出することができる。
各プローブ群は、例えば、静電結合、共有結合、タンパク質−タンパク質相互作用、タンパク質−低分子相互作用等を利用して第二部材１２の表面に固定することができ、このような固定化が可能となるように、公知の技術を用いて第二部材１２の表面又はプローブに適当な化学修飾を施すことができる。
静電結合を利用する場合には、例えば、第二部材１２の表面をポリカチオン性物質でコーティングする。「カチオン性物質」とは、分子中にカチオン性基を有する物質を意味し、カチオン性物質は静電的相互作用により核酸と複合体を形成することができる。カチオン性基としては、例えば、アミノ基；メチルアミノ基、エチルアミノ基等のモノアルキルアミノ基；ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基等のジアルキルアミノ基；イミノ基；グアニジノ基等が挙げられ、カチオン性物質としては、例えば、カチオン性基を有する高分子；ポリリジン、ポリアルギニン、リジンとアルギニンの共重合体等の塩基性アミノ酸の単独重合体若しくは共重合体又はこれらの誘導体；ポリエチレンイミン等のポリカチオン性ポリマー等が挙げられる。
共有結合を利用する場合には、例えば、第二部材１２の表面又はプローブに存在する官能基を利用して共有結合を形成させる。共有結合を形成し得る官能基の具体例として、カルボキシル基、アミノ基、水酸基等が挙げられる。第二部材１２の表面にカルボキシル基が存在する場合には、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩（EDC）等のカルボジイミド類でカルボキシル基を活性化させた後、プローブに存在するアミノ基と反応させることにより、第二部材１２とプローブとをアミド結合させることができる。また、第二部材１２の表面にアミノ基が存在する場合には、無水コハク酸等の環状酸無水物を用いてアミノ基をカルボキシル基に変換した後、プローブに存在するアミノ基と反応させることにより、第二部材１２とプローブとをアミド結合させることができる。
この他、ストレプトアビジン又はアビジン／ビオチン、マルトース結合タンパク質／マルトース、ポリヒスチジンペプチド／ニッケルやコバルト等の金属イオン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／グルタチオン、カルモジュリン／カルモジュリン結合ペプチド、ＡＴＰ結合タンパク質／ＡＴＰ、核酸／相補的核酸、受容体タンパク質／リガンド、酵素／基質、抗体／抗原、ＩｇＧ／プロテインＡ等の特異的相互作用を利用して、プローブを第二部材１２に固定することができる。
図１に示すように、第二部材１２の外周面には、第一部材１１の内周面と第二部材１２の外周面との接触を防止するスペーサー部１３ａが設けられている。スペーサー部１３ａは、第二部材１２の外周面のうち少なくともプローブ群Ｐが固定された領域と、第一部材１１の内周面との接触を防止できればよく、プローブ群Ｐが固定されていない領域と第一部材１１の内周面との接触を防止できなくてもよい。
図１に示すように、スペーサー部１３ａは突起状であるが、スペーサー部１３ａの形状は第一部材１１の内周面と第二部材１２の外周面との接触を防止できる範囲内で変更が可能である。スペーサー部１３ａの形状は、例えば、略円錐状、略角錐状、略円柱状、略角柱状等の突起状とすることができる。また、スペーサー部１３ａは、例えば、図２に示すスペーサー部１３ｂのように、板状（薄板状）状であってもよい。
図１に示すように、スペーサー部１３ａの大きさは、第二部材１２が第一部材１１の中空部に収容されたとき、全てのスペーサー部１３ａの端部が第一部材１１の内周面に接触するように調節されているが、スペーサー部１３ａの大きさは、第一部材１１の内周面と第二部材１２の外周面との接触を防止できる範囲内において適宜変更が可能である。
図１に示すように、スペーサー部１３ａは第二部材１２の外周面に設けられているが、第一部材１１の内周面に設けられていてもよい。
スペーサー部１３ａの個数、配置等は、第一部材１１の内周面と第二部材１２の外周面との接触を防止できる範囲内において適宜変更が可能である。
スペーサー部１３ａの材質は、液体試料に不溶性である限り特に限定されるものではなく、例えば、上記熱可塑性樹脂等のプラスチック；鉄、銅、アルミニウム等の金属；ガラス；セラミックス；これらの複合材料等が挙げられる。
スペーサー部１３ａが第二部材１２の外周面に設けられている場合、スペーサー部１３ａと第二部材１２とは一体に成形されていてもよいし、別個の部材として成形されていてもよい。また、スペーサー部１３ａが第一部材１１の内周面に設けられている場合、スペーサー部１３ａと第一部材１１とは一体に成形されていてもよいし、別個の部材として成形されていてもよい。別個の部材として成形されている場合、両部材は、例えば、接着剤を利用して接着させることができる。
スペーサー部１３ａが第二部材１２の外周面に設けられている場合、スペーサー部１３ａは第二部材１２の外周面に直接設けられていてもよいし、他の部材を介して間接的に設けられていてもよい。また、スペーサー部１３ａが第一部材１１の内周面に設けられている場合、スペーサー部１３ａは第一部材１１の内周面に直接設けられていてもよいし、他の部材を介して間接的に設けられていてもよい。スペーサー部１３ａが他の部材を介して間接的に設けられている場合としては、例えば、スペーサー部１３ａを有する可撓性シート状部材（例えば、上記熱可塑性樹脂等のプラスチックからなるシート状部材）が第二部材１２に巻装されている場合等が挙げられる。
第二部材１２の外周面に設けられたスペーサー部１３ａが、第一部材１１の内周面と接触する端部を有する場合、スペーサー部１３ａの端部と第一部材１１の内周面とは接着剤を利用して接着されていてもよい。また、第一部材１１の内周面に設けられたスペーサー部１３ａが、第二部材１２の外周面と接触する端部を有する場合、スペーサー部１３ａの端部と第二部材１２の外周面とは接着剤を利用して接着されていてもよい。
プローブアレイ１を利用した標的物質の検出は、例えば、次のようにして行うことができる。
第１工程：標識物質が結合した標的物質を含有する液体試料を第一部材１１の中空部に流入させ、標的物質とプローブ群Ｐとを接触させる。
標的物質の種類は特に限定されるものではないが、例えば、核酸、タンパク質、抗原、抗体、酵素、糖鎖等の生体物質が挙げられ、プローブ及び標的物質の組み合わせとしては、例えば、核酸／相補的核酸、受容体タンパク質／リガンド、酵素／基質、抗体／抗原等が挙げられる。なお、核酸には、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びこれらの類似体又は誘導体（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロチオエートＤＮＡ等）が含まれる。
標識物質としては、例えば、フルオレセイン、ローダミン、フィコエリトリン等の蛍光物質、；アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ等の酵素；ルミノール、ルシゲニン、アクリジウムエステルの化学発光物質；ルシフェラーゼ、ルシフェリン等の生物発光物質等が挙げられる。液体試料の溶媒は、例えば、水、緩衝液、有機溶媒であり、標的物質の種類に応じて適宜選択することができる。液体試料は、例えば、毛細管現象、シリンジ等を利用して第一部材１１の中空部に流入させることができる。
第２工程：第一部材１１の中空部から液体試料を流出させた後、第一部材１１の中空部に対して洗浄液を流入及び流出させ、プローブ群Ｐを洗浄する。これにより、プローブ群Ｐと反応した標的物質以外の物質を除去することができる。
第３工程：標的物質に結合している標識物質を検出する。
標識物質が蛍光物質である場合、第二部材１２の外周面に励起光を照射し、第二部材１２の外周面から発せられる蛍光を蛍光検出器で検出することによって、標的物質を検出することができる。標識物質が酵素である場合には酵素呈色反応により標的物質を検出することができる。
標識物質の検出は、第二部材１２を第一部材１１の中空部から取り出した後に行うことができるが、第一部材１１が光透過性を有する場合、第二部材１２を第一部材１１の中空部から取り出すことなく行うことができる。
第一部材１１の内周面と第二部材１２の外周面との接触を防止するスペーサー部１３ａが設けられていることにより、第二部材１２の外周面に固定された各プローブ群は、第一部材１１の中空部に流入した液体試料、洗浄液等と確実に接触することができ、これにより反応効率及び洗浄効率を向上し、標的物質を精度よく検出することができる。
以下、本発明を実施例に基づいて詳細に説明する。
（１）突起部を有するプラスチックフィルムの作製
ポリエステル（８０メッシュ）のスクリーンに直径１ｍｍの円形パターンを複数形成し、スクリーン版を作製した。この際、円形パターン間の距離は中心間の距離が４ｍｍとなるように調整した。上記スクリーン版及びＵＶ硬化型スクリーン印刷用インキ（東洋インキ製造（株）製，ＳＳ点字用インキ）を用いてスクリーン印刷し、縦１９ｍｍ×横１２ｍｍのポリエステルフィルム（東レ（株）製，ルミラー，厚さ５０μｍ）上に複数の突起部を形成させた。この際、硬化はメタルハライドランプ１灯、１２０Ｗ／ｃｍ、１０ｍ／分の条件で行った。
こうして、図３に示すように、複数の突起部（高さ：５００μｍ）を有するプラスチックフィルムを作製した。
（２）プラスチックフィルム上へのプローブＤＮＡの固定
上記（１）で作製した突起部を有するプラスチックフィルムをポリＬ−リジン溶液（濃度：０．０１％、溶媒：０．１×ＰＢＳ）に浸して、１時間振盪した。次いで、超純水中で４回激しく洗浄し、余分なポリＬ−リジンを洗い流した。次いで、バキュムオーブンにより６０℃で４時間乾燥させ、ポリＬ−リジンをプラスチックフィルムに密着させた。
ポリＬ−リジンでコーティングしたプラスチックフィルムに、ポジティブコントロール用プローブＤＮＡ及びネガティブコントロール用プローブＤＮＡ（濃度：１００ｐｍｏｌ／μＬ、溶媒：超純水）を各１０μＬずつスポッティングした。スポッティングは、図３に示すように、突起部が形成された面のうち突起部が形成されていない領域に、１点ずつ１ｃｍの間隔で２列となるように行った。なお、ポジティブコントロール用プローブＤＮＡとしては２００〜５００ｍｅｒのポリ（ｄＡ）を使用し、ネガティブコントロール用プローブＤＮＡとしては２００〜５００ｍｅｒのポリ（ｄＴ）を使用した。次いで、スポッティング液を乾燥させ、ＵＶクロスリンカーにより紫外線を６００ｍＪ照射した。次いで、プラスチックフィルム表面をブロッキングするために、プラスチックフィルムをブロッキング溶液（１−メチル−２−ピロリドン ９５．７ｍＬ、無水コハク酸 １．６ｇ、１Ｍ ホウ酸ナトリウム水溶液（ｐＨ８．０） ４．３ｍＬ）に浸漬して２０分間振盪させた後、９５℃の超純水ですすぎ、９５％エタノールに浸漬して１〜２分間振盪させた後、乾燥させた。
（３）キャピラリー型プローブアレイの作製
上記（２）で作製したプローブＤＮＡ固定化プラスチックフィルムを、プローブＤＮＡ固定化面が外周面を構成するように、直径２．８ｍｍ×長さ３ｃｍのガラス棒に巻き付けた後、内径４ｍｍ×長さ３ｃｍ×厚み１００μｍのポリエチレンテレフタレート製透明プラスチック筒に挿入した。このとき、プラスチックフィルム上に形成された突起部が、プローブＤＮＡ固定化面とプラスチック筒の内周面との接触を防止するスペーサー部としての役割を果たす。
（４）ハイブリダイゼーション
上記（３）で作製したキャピラリー型プローブアレイの中空部に、標的オリゴヌクレオチドを含むハイブリダイゼーション溶液（標的オリゴヌクレオチド濃度：１ｐｍｏｌ／μＬ、イーストｔＲＮＡ濃度：１μｇ／μＬ、溶媒：０．２％ＳＤＳ含有３×ＳＳＣ）１００μＬを吸い上げ、キャピラリー型プローブアレイの両端をパラフィルムで閉じて４０℃の恒温槽内で一晩加温した。なお、標的オリゴヌクレオチドとしては５’末端にビオチンを結合させた２２ｍｅｒのポリ（ｄＴ）を使用した。
（５）ポストハイブリダイゼーション洗浄
恒温槽からキャピラリー型プローブアレイを取り出し、ハイブリダイゼーション溶液を排出した後、非特異的に吸着した標的オリゴヌクレオチドを洗い流すために、キャピラリー型プローブアレイの中空部を洗浄バッファー１（２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）で満たして１０秒間放置した。洗浄バッファー１を排出した後、洗浄バッファー２（１×ＳＳＣ）を満たして１０秒間放置し排出する操作を３回繰り返した。次いで、洗浄バッファー３（０．２×ＳＳＣ）についても洗浄バッファー２と同様の操作を行った。
（６）ブロッキング及び標的オリゴヌクレオチドの検出
キャピラリー型プローブアレイの中空部をブロッキング溶液（１％カゼイン、３×ＳＳＣ）で満たし、室温で３０分間ブロッキングを行った。ブロッキング溶液を排出した後、ストレプトアビジン／アルカリフォスファターゼ複合体溶液（原液を０．２Ｍ ＮａＣｌ、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ、１％ カゼイン溶液で２０００倍に希釈したもの）を満たし、室温で３０分間反応させた。ストレプトアビジン／アルカリフォスファターゼ複合体溶液を排出した後、緩衝液Ａ（０．２Ｍ ＮａＣｌ、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ）を満たし、５分間放置した後、排出した。これを２回繰り返し、標的オリゴヌクレオチドに結合しているビオチンに結合しなかったストレプトアビジン／アルカリフォスファターゼ複合体を除去した。次いで、緩衝液Ｂ（０．２Ｍ ＮａＣｌ、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４））を満たして１０秒間放置した後、排出した。最後に基質溶液（緩衝液Ｂ １０ｍＬ、ＢＣＩＰ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルフォスフェート）溶液９μＬ、ＮＢＴ（ニトロブルーテトラゾリウム）溶液１８μＬ）を満たし、室温で３時間放置し、発色反応を行った。
その結果、標的オリゴヌクレオチドと相補的であるポジティブコントロール用プローブＤＮＡを固定化した部分には明瞭なシグナルが現れたが、標的オリゴヌクレオチドと相補的でないネガティブコントロール用プローブＤＮＡを固定化した部分にはシグナルが全く現れなかった。
（ａ）は一実施形態に係るプローブアレイの斜視図であり、（ｂ）は同プローブアレイの断面図である。 （ａ）は別の実施形態に係るプローブアレイの斜視図であり、（ｂ）は同プローブアレイの断面図である。 実施例において、ガラス棒の外周面に突起部（スペーサー部）を設ける際に使用するプラスチックフィルムの平面図である。
符号の説明
１・・・プローブアレイ
１１・・・円筒状の第一部材
１２・・・円柱状の第二部材
Ｐ・・・プローブ群
１３ａ，１３ｂ・・・スペーサー部

Claims (1)

  1. 筒状の第一部材と、前記第一部材の中空部に収容された第二部材と、前記第二部材の外周面に固定されたプローブとを備えたプローブアレイであって、
    前記第一部材の内周面と前記第二部材の外周面との接触を防止するスペーサー部が、前記第一部材の内周面又は前記第二部材の外周面に設けられている前記プローブアレイ。
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