FR2839783A1 - Nouvelle disposition des sites de liaison d'une biopuce - Google Patents
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Abstract
Nouvelle disposition des sites de liaison d'une biopuce 1) Biopuce (1) comprenant un support (2) dont une face utile (2a) comprend une surface opératoire (3), un réseau de sites élémentaires (Xn) disposé sur ladite surface opératoire, et une multiplicité de ligands fixés chacun en nombre multiple en des sites élémentaires respectivement différents, caractérisée en ce que la face utile du support comprend ladite surface opératoire constituée par au moins une couronne opératoire (31) sur laquelle des sites élémentaires (Xn) sont distribués, et une surface non opératoire (4), pratiquement exempte de tout site élémentaire, disposée à l'intérieur ou au centre de ladite couronne opératoire.
Description
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La présente invention concerne les biopuces, et plus particulièrement le mode d'organisation de ses sites de liaison, pour servir d'outils en analyse biologique moléculaire.
Par biopuce , on entend un ensemble fonctionnel, à usage unique ou non, généralement mis en #uvre aux fins d'une détermination biologique moléculaire, , agencé pour et/ou destiné à coopérer avec au moins un appareil ou instrument distinct et complémentaire, et recevant un échantillon d'intérêt, liquide ou fluide, immobile ou en mouvement, comprenant au moins une espèce cible, en suspension ou en solution, par exemple une biomolécule, éventuellement marquée, et délivrant au moins un signal de sortie en relation avec la présence, et/ou la nature, et/ou la structure et/ou la quantité de ladite espèce cible.
Cette biopuce comprend au moins : - un support comportant une face utile comprenant une surface opératoire au contact de l'échantillon ; le matériau ou la matière du support est inerte, et non substantiellement conducteur de l'électricité, au moins selon ladite surface opératoire, au sens où ledit matériau n'interagit pratiquement pas avec l'échantillon, et en particulier l'espèce cible, par liaison forte du type liaison chimique covalente, ou par liaison faible, par exemple liaison hydrogène, d'autres interactions de type physique, telles que tension superficielle, n'étant pas par ailleurs exclues ; le matériau constitutif d'un tel support est par exemple du silicium, un verre, ou une matière plastique, par exemple une résine de synthèse thermodurcie ou thermoplastique, par exemple un polypropylène ou une résine polyacrylamide, - un réseau, par exemple matrice, de sites élémentaires distribués de manière méthodique ou ordonnée sur la surface opératoire, à la manière de pixels, par exemple selon au moins deux axes de référence, chaque site élémentaire étant adressé, c'est-à-dire identifié par des coordonnées qui lui sont uniques dans tout repère approprié, formé par exemple par des axes de références ; ces sites élémentaires sont eux-mêmes traités ou non, en vue de la fixation ou de l'ancrage des ligands, dont il sera question ci-après ; ce traitement peut par exemple consister en un revêtement avec une couche d'un polymère conducteur électronique, par exemple polypyrole modifié, selon les techniques exposées dans les documents FR 2 703 359, W09422889, et EPO 691 978, FR 2 787 582, EP 1 141 391, et WO 0036145.
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- le cas échéant, un ensemble de connexions, ou circuit, par exemple électrique, avec respectivement les différents sites élémentaires, ledit ensemble de connexions étant agencé pour relier individuellement chaque site élémentaire, de manière indépendante par rapport aux autres sites élémentaires, par exemple par adressage (conférer le document FR- A- 2741475) ; ledit ensemble de connexions est par exemple un circuit électrique multiplexé d'électrodes et contre-électrodes, disposées respectivement dans lesdits sites élémentaires ; - une multiplicité de ligands, ou sondes, identiques, attachés ou ancrés, par tous moyens appropriés, dans chaque site élémentaire, par exemple selon les techniques exposées dans les documents FR2679255 et EP0524864 ; - éventuellement, des moyens formant avec la surface opératoire une cavité de circulation ou séjour de l'échantillon liquide, comportant au moins une entrée et une sortie pour ce dernier ; - éventuellement, des moyens d'observation, transmission, ou émission du signal ou des signaux de sortie, correspondant à la liaison de l'espèce cible avec les ligands, respectivement en un ou plusieurs sites de liaison ;
Cette biopuce peut en outre comprendre, de manière intégrée ou non avec la surface opératoire et ses ligands ou sondes, différents moyens, ramenés à l'échelle de la biopuce, classiquement utilisés en laboratoire, pour : - obtenir ou préparer l'échantillon d'intérêt, à partir d'un autre échantillon dit de départ, par dénaturation, séparation, concentration, purification, etc. ; - traiter l'échantillon d'intérêt, par exemple par amplification, et/ou marquage avec un marqueur, avant sa mise en contact avec les ligands ou sondes ; - traiter le ou les complexes formés entre l'espèce cible et respectivement le ou les ligands, par exemple par marquage, afin d'obtenir, simultanément ou postérieurement à la formation des complexes, respectivement un ou des signaux de sortie.
Cette biopuce peut en outre comprendre, de manière intégrée ou non avec la surface opératoire et ses ligands ou sondes, différents moyens, ramenés à l'échelle de la biopuce, classiquement utilisés en laboratoire, pour : - obtenir ou préparer l'échantillon d'intérêt, à partir d'un autre échantillon dit de départ, par dénaturation, séparation, concentration, purification, etc. ; - traiter l'échantillon d'intérêt, par exemple par amplification, et/ou marquage avec un marqueur, avant sa mise en contact avec les ligands ou sondes ; - traiter le ou les complexes formés entre l'espèce cible et respectivement le ou les ligands, par exemple par marquage, afin d'obtenir, simultanément ou postérieurement à la formation des complexes, respectivement un ou des signaux de sortie.
Lorsque la biopuce, ou biochip , ou "micro-array", est associée ou comprend en outre ces moyens de laboratoire, dans le secteur technique concerné, on parlera alors de labopuce (ou lab on a chip ). En pareil cas, le support comprend un ensemble de canaux et/ou puits, par exemple réactionnels, reliés entre eux et avec la cavité de circulation ou séjour, ainsi
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que divers réactifs ou agents de traitement, à l'état sec ou liquide, disposés sur le support en fonction de la circulation et du ou des traitements retenus pour l'échantillon de départ ou l'échantillon d'intérêt.
Les dimensions de ces biopuces, par exemple de l'ordre de 1 mm2 à quelques cm2, requièrent normalement pour leur réalisation ou production, la mise en oeuvre de techniques dites micro ou nano-technologies , par exemple par lithographie ou micro-usinage.
Mais la Demanderesse n'entend pas être limitée à des dimensions particulières, notamment de l'ordre du m ou du nm, lorsqu'elle utilise le terme biopuce dans la présente description et dans les revendications en annexe, considérant que la même structure ou le même agencement que celui défini ciaprès peut être mis en #uvre avec des dimensions de l'ordre de quelques mm2,comme avec des dimensions beaucoup plus importantes.
Bien entendu, une biopuce telle que considérée par la présente invention ne peut fonctionner de manière autonome, sauf à embarquer avec elle sa propre source d'énergie. Par conséquent, cette biopuce est agencée pour coopérer, par exemple de façon amovible, d'une part avec des moyens extérieurs permettant de faire circuler ou séjourner, en contact de la surface opératoire et des ligands, l'échantillon liquide d'intérêt, mais aussi d'autres fluides ou liquides,tels que liquide de lavage, et d'autre part avec des moyens de détection et de traitement du ou des signaux de sortie, le tout étant en général contrôlé et commandé, par des moyens électroniques extérieurs, analogiques ou informatiques, par exemple selon toute logique ou organigramme de traitement.
Par biomolécule , on entend toute entité, en particulier biochimique, ou biologique, identique à ou dérivée de toute espèce moléculaire existant dans la nature. Au rang des biomolécules considérées par la présente invention, on peut citer certains biopolymères, par exemple l'ADN, l'ARN, les oligo et polynucléotides, les protéines fonctionnelles ou structurales, les peptides, les oligo et polypeptides, les polysaccharides, etc.
Par marquage ou marqué , on entend la caractéristique selon laquelle on fixe sur une entité, par exemple l'espèce cible, de manière covalente ou autre, un marqueur, c'est-à-dire un substituant ou reste permettant, avec ou sans l'aide d'un moyen extérieur, tel qu'illumination, avec ou sans étape postérieure, telle que mise en contact avec un substrat, de produire un signal, dit précédemment signal de sortie.
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Les marqueurs préférés selon la présente invention sont : - les haptènes : (exemple : la biotine fixant un conjugué streptavidine-phycoéryhrine - les fluorophores : par exemple fluorescéine, cyanine, phycoérythrine - les luminophores : luminol, isoluminol, ABEI (N-4-amino-butyl-N- éthyl-isoluminol) - les enzymes : par exemple d'oxydation d'un chromogène ; conférer peroxydase de raifort, phosphatase alcaline
Par détermination , on entend l'identification, qualitative et/ou quantitative, la détection, la description (par exemple séquençage), la séparation, ou l'enrichissement de l'espèce cible, pouvant être appelée analyte dans le cas d'une identification qualitative et/ou quantitative. Ressort selon la présente invention de l'expression détermination , tout séquençage d'une biomolécule du type ADN ou polypeptide.
Par détermination , on entend l'identification, qualitative et/ou quantitative, la détection, la description (par exemple séquençage), la séparation, ou l'enrichissement de l'espèce cible, pouvant être appelée analyte dans le cas d'une identification qualitative et/ou quantitative. Ressort selon la présente invention de l'expression détermination , tout séquençage d'une biomolécule du type ADN ou polypeptide.
Le ou les signaux de sortie considérés par la présente invention peuvent avoir toute nature appropriée, en fonction des marqueurs mis en #uvre, et du type de détection requis. Il peut s'agir de signaux lumineux, visibles ou invisibles, électriques, électro-optiques, électrochimiques, etc.... Par ailleurs, ces signaux peuvent le cas échéant être détectés séparément, compte tenu, d'une part de l'adressage des sites élémentaires de la biopuce, et d'autre part de l'ensemble de connexions respectivement avec les différents sites élémentaires, éventuellement présents sur la biopuce.
Par ligand , on entend toute entité, cellulaire, biologique, ou biomolécule ayant une affinité, spécifique ou non, pour une espèce cible.
Affinité exprimant qu'il se forme, dans les conditions (notamment température, pH, force ionique, etc. ) de la mise en contact de l'espèce cible avec le ligand, un appariement ou complexe stable entre ladite espèce cible et ledit ligand. A titre d'exemple de ligand, on citera tout oligonucléotide susceptible de se lier par liaisons faibles, on dira dans ce cas de s'hybrider, avec un brin d'ADN (espèce cible), comportant une séquence complémentaire avec celle du ligand.
Chaque ligand est attaché ou ancré en chaque site élémentaire de la biopuce, éventuellement après fonctionnalisation de la surface opératoire du
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support, par tout moyen approprié, par exemple chimique, par liaison covalente, par exemple par l'intermédiaire d'un bras espaceur, ou par adsorption, absorption, etc.
S'agissant de sites élémentaires revêtus comme indiqué précédemment avec un polymère de type polypyrrole modifié ou polythiophène, et électriquement adressés, la fixation des ligands peut être effectuée selon les techniques électrochimiques décrites par les documents FR 2789401, EP 1 152 821 et WO 0047317 ; FR2 742 451, EP 0 868 464 et WO 9722648.
Par "espèce cible", on entend toute espèce cellulaire, biologique, ou biochimique, susceptible de se lier par liaison faible à un ou plusieurs ligands.
S'agissant d'une biopuce, en l'état actuel du secteur technique considéré, on peut distinguer deux voies d'obtention de ligands respectivement différents, fixés chacun en nombre multiple respectivement sur les différents sites élémentaires : - une voie in situ, qui consiste, par une série d'opérations successives, incrémentées, à synthétiser sur la surface opératoire elle-même, les différents ligands, ensemble, motif élémentaire par motif élémentaire, par exemple mer par mer, à partir d'un premier motif fixé en différents sites élémentaires, et ce dans l'ordre des séquences respectivement retenues pour les différents ligands ; à cet égard, on se référera aux documents
FR 2703359, EP 0 691 978, et WO 9422889 ; US 5 744 305, US 6 015
880, WO 09525116, et EP 0 750 629, - et une voie ex situ, qui consiste à synthétiser ou obtenir les ligands respectivement différents en dehors de la surface opératoire, et à fixer les différents ligands chacun en nombre multiple, dans leurs sites élémentaires respectivement différents, et ce par des méthodes d'impression (avec ou sans contact), ou par activation électrique différenciée, car adressée, desdits sites élémentaires ; conférerles documents FR 2703359, EP 0 691 978, et W09422889 ; WO 00151689,
US 6 090 933.
FR 2703359, EP 0 691 978, et WO 9422889 ; US 5 744 305, US 6 015
880, WO 09525116, et EP 0 750 629, - et une voie ex situ, qui consiste à synthétiser ou obtenir les ligands respectivement différents en dehors de la surface opératoire, et à fixer les différents ligands chacun en nombre multiple, dans leurs sites élémentaires respectivement différents, et ce par des méthodes d'impression (avec ou sans contact), ou par activation électrique différenciée, car adressée, desdits sites élémentaires ; conférerles documents FR 2703359, EP 0 691 978, et W09422889 ; WO 00151689,
US 6 090 933.
Aujourd'hui, les biopuces sont des outils, simples ou complexes, bien adaptés à toutes sortes d'analyse de biologie moléculaire ; conférer "DNA chips : a new tool for genetic analysis and diagnostics". M. Cuzin. Transfusion
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clinique et Biologique 2001 ; 8:291-6 ; et "How to make a DNA chip" Mickael C Pirrung. Angew.chem.lnt.ed 2002, 41, 1276, 1289.
De manière générale, une biopuce telle que décrite précédemment est disposée au fond d'un puits, par exemple d'une plaque de micro-titration, au sein duquel l'échantillon liquide comprenant l'espèce cible est introduit, séjourne, puis est évacué. Préférentiellement, le fond d'un puits constitue directement le support de la biopuce.
La présente invention concerne donc une biopuce telle que précédemment définie, comprenant un support dont une face utile comprend une surface opératoire, un réseau de sites élémentaires disposé sur ladite surface opératoire, et une multiplicité de ligands fixés chacun en nombre multiple en des sites élémentaires respectivement différents.
Généralement la surface opératoire a une forme matricielle rectangulaire ou carrée, compte tenu de la dispositon en lignes et colonnes des sites élémentaires liés respectivement aux ligands. Une telle forme génère une hétérogénéité de comportement ou traitement des sites élémentaires, et donc des ligands qui leur sont liés, en particulier dans les extrémités angulaires de la matrice, sur la surface opératoire, comme montré par les considérations suivantes.
S'agissant du lavage des sites élémentaires, celui-ci est effectué en général avec un flux liquide unidirectionnel, présentant une vitesse plus importante au centre qu'à l'extérieur, sur la base d'un jet centré sur toute la surface opératoire à laver. Après hybridation, le lavage permet d'éliminer les cibles non spécifiques, non liées aux sondes. Le jet est unidirectionnel et central au niveau de la surface opératoire, résultant en une efficacité de lavage différente entre les sites centraux et périphériques. De plus, la présence de sites au centre de la face utile du support diminue la flexibilité et la compatibilité avec des laveurs qui viennent en contact, abîmant les sites élémentaires centraux.
S'agissant de l'agitation de l'échantillon liquide d'intérêt, contenant l'espèce cible, pour la complexation de cette dernière avec un ou plusieurs ligands de la biopuce, celle-ci est souvent effectuée au sein de la cavité réactionnelle, par exemple puits d'une plaque de micro-tritration, sous une forme hydrodynamique telle que tourbillon ou vortex. A cet égard, les sites
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élémentaires périphériques sont alors plus balayés avec l'échantillon liquide d'intérêt, que les sites situés au centre.
S'agissant encore de la lecture des différents signaux de sortie, émis par les ligands marqués, et lorsque ceux-ci sont de nature lumineuse, la biopuce est éclairée par exemple avec un faisceau lumineux présentant une hétérogénéité, par exemple une intensité plus importante au centre que sur ses bords ; de telle sorte que, à ligands marqués identiques, l'intensité lumineuse émise ou réémise peut être plus importante pour les sites élémentaires au centre qu'à la périphérie de la biopuce.
La présente invention a donc pour objet de remédier aux inconvénients précédents.
Plus particulièrement, la présente invention a pour objet une biopuce, ayant un comportement essentiellement homogène, d'un site élémentaire à l'autre, présent sur le support.
Conformément à la présente invention, la face utile du support de la biopuce comprend, d'une part une surface opératoire constituée par au moins une couronne opératoire sur laquelle les sites élémentaires sont distribués, et une surface non opératoire, pratiquement exempte de tous sites élémentaires, disposée au centre de ladite couronne opératoire.
Plus généralement, s'agissant d'une biopuce comprenant un support dont une face utile comprend un réseau de sites élémentaires, et une multiplicité de ligands fixés chacun en nombre multiple en des sites élémentaires respectivement différents, selon la présente invention, les sites élémentaires sont distribués sur la face utile selon au moins une ligne circulaire.
La présente invention comporte les modes d'exécution suivants : - sur la couronne opératoire, ou sur chaque couronne opératoire, les sites élémentaires sont distribués de manière régulière, ou irrégulière - la surface opératoire comprend au moins deux couronnes opératoires concentriques - un site élémentaire, dit détrompeur, est disposé, ou dans la surface non opératoire, ou dans la surface opératoire, du côté de la couronne opératoire, de manière à repérer la biopuce en position relative
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- la surface opératoire et la surface non opératoire sont traitées de manière respectivement différentes, vis-à-vis de la détection ou du traitement des signaux de sortie émis par des ligands marqués, fixés en des sités élémentaires respectivement différents - la surface opératoire est en élévation ou en dépression par rapport à la surface non opératoire, par exemple pour favoriser un lavage efficace de la surface opératoire - la surface opératoire et/ou la surface non opératoire ne sont pas planes et ont par exemple la forme d'une cuvette - la surface non opératoire est affectée à au moins une fonction autre que la détermination directe de l'espèce cible, par exemple au stockage d'un réactif requis pour cette détermination - la surface opératoire comprend des ligands de nature différente, par exemple peptidique et oligonucléotidique.
Préférentiellement, une biopuce selon la présente invention s'intègre dans un dispositif, par exemple à usage unique, pour la détermination d'au moins une espèce cible. Par exemple, un tel dispositif est une plaque de micro-titration, comprenant une pluralité de puits élémentaires pour la réception d'au moins un échantillon d'intérêt, et au moins une biopuce est disposée dans un dit puits ou sur le fonds d'un dit puits. Préférentiellement, le fond d'au moins un puits constitue directement le support de la biopuce.
La présente invention est maintenant décrite par référence au dessin annexé, dans lequel : - la figure 1 représente une biopuce selon la présente invention, vue de dessus et de manière schématique - la figure 2 représente une biopuce selon une variante de la présente invention
Par référence à la figure 1, une biopuce (1) conforme à l'invention comprend un support (2) dont une face utile (2a) comprend une surface dite opératoire (3), un réseau de sites élémentaires (Xn) référencés chacun par une lettre et un chiffre selon tout repère approprié, ce réseau étant disposé sur la surface opératoire (3), ainsi qu'une multiplicité de ligands (non représentés) fixés chacun en nombre multiple en des sites élémentaires respectivement
Par référence à la figure 1, une biopuce (1) conforme à l'invention comprend un support (2) dont une face utile (2a) comprend une surface dite opératoire (3), un réseau de sites élémentaires (Xn) référencés chacun par une lettre et un chiffre selon tout repère approprié, ce réseau étant disposé sur la surface opératoire (3), ainsi qu'une multiplicité de ligands (non représentés) fixés chacun en nombre multiple en des sites élémentaires respectivement
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différents. La face utile (2a) du support (2) comprend, d'une part la surface opératoire (3) constituée par au moins une couronne opératoire (31) sur laquelle les sites élémentaires (Xn) sont distribués, et une surface non opératoire (4), pratiquement exempte de tous sites élémentaires, disposée au centre de ladite couronne opératoire.
Comme montré en particulier par la figure 2, la surface opératoire (3) comprend deux couronnes opératoires concentriques (31 et 32).
Sur chaque couronne opératoire (31 et 32), les sites élémentaires (Xn) peuvent être distribués de manière régulière ou irrégulière.
Un site élémentaire (5), dit détrompeur, est disposé dans la surface non opératoire (4), du côté de la couronne opératoire (31) ou du côté de la couronne opératoire (32).
Avantageusement, grâce à l'invention, la surface opératoire (3) et la surface non opératoire (4) sont traitées de manière respectivement différente, par exemple en ce qui concerne leurs réflectances respectives vis-à-vis de la détection ou du traitement des signaux de sortie émis par les ligands marqués, fixés en des sites élémentaires (Xn) respectivement différents.
De manière non représentée, la surface opératoire (3), c'est-à-dire chacune des couronnes opératoires 31 ou 32, est en élévation ou en dépression par rapport à la surface non opératoire (4).
De manière non représentée, la surface non opératoire (4) est affectée à au moins une fonction autre que la détermination de l'espèce cible, par exemple au stockage d'un réactif intervenant dans la détermination de cette dernière.
Par conséquent, de manière générale, selon l'invention, la biopuce comporte le support (2) dont la face utile (2a) comprend un réseau de sites élémentaires (Xn) et une multiplicité de ligands fixés chacun en nombre multiple en des sites élémentaires respectivement différents, et ces derniers sont distribués sur la face utile (2a) selon au moins une ligne circulaire.
Bien entendu, une biopuce telle que décrite précédemment appartient à un dispositif, par exemple à usage unique, pour la détermination d'au moins une espèce cible, ce dispositf pouvant être une plaque de microtitration, comprenant une pluralité de puits élémentaires pour la réception d'au moins un échantillon d'intérêt ; dans ce dernier cas, au moins une biopuce est déposée dans undit puits, ou sur le fonds de ce dernier. Préférentiellement, le fond d'au moins un puits constitue directement le support de la biopuce.
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On décrit ci-après plusieurs exemples, par référence à la biopuce représentée à la figure 1.
Cette biopuce comporte par conséquent, selon la couronne opératoire (31), seize sites élémentaires.
EXEMPLE 1 Un oligonucléotide de capture synthétique fonctionnalisé en 5' par un groupement NH2, formant donc un ligand, est dilué à une concentration de 1 M dans du PBS 3X (0. 45 M Nacl, 0. 15M phosphate de sodium, pH 7). Ce ligand est déposé de façon discrète selon le plan de dépôt de la présente invention dans le fond d'au moins un puits d'une microplaque de 96 puits (Greiner) à l'aide d'un système automatisé.
La microplaque est incubée une nuit à 4 C puis lavée 2 fois par 300 l de PBS Tween (0. 15 M NaCl, 0. 05 M de phosphate de sodium, pH 7,0.5% de Tween 20 (Merck)).
1,5 l d'une espèce cible d'ADN dénaturée à une concentration 1 M, dans 30 l de tampon d'hybridation (PBS 3X + ADN de sperme de saumon 10 mg/ml Sigma #) est ajouté dans les puits, suivis de 1.5 l d'une solution de conjugués oligonucléotide-peroxydase, servant d'oligonucléotide de détection, diluée à une concentration de 50 pmol/ml dans un tampon phosphate pH 7 (Na2HP04, KH2P04, BSA 0,1%).
La microplaque est incubée 1 heure à 37 C et lavée 2 fois avec 300 l de PBS Tween. 100 l de substrat colorimétrique et précipitant TMB (BioFx) (3,3',5,5'tétraméthylbenzidine (TMB) = substrat de la peroxydase de raifort), sont ajoutés par puits. Après 10 minutes de réaction, la lecture est effectuée sur un microscope (ZEISS # axioscope Il) équipé d'une caméra haute définition (Hamamatsu #), et d'un objectif de grossissement X4 permettant d'imager la totalité d'un fond de puits d'une microplaque 96 puits.
On obtient l'image selon la Figure 3, montrant des spots colorés, d'égale intensité et de surface identique, démontrant au passage la fixation du ligand en quantité homogène d'un site élémentaire à l'autre.
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EXEMPLE 2
Conformément au protocole général décrit dans l'exemple 1, on a effectué la détection de deux fragments d'acide nucléique cible déterminés respectivement par les séquences suivantes :
5'CATGfGCTACITCACCMCGGGACGGAGCGCGfGCGITATGfGACCAGATACAT CTATAACCGAGAGGAGTACGGCTTCGACAGCGACGTGGAGGTGTACCGGGCGGT GACGCCGCTGGGGCCGCCTGCCGCCGAGTACTGGAACAGCCAGAAGGAAGTCCT GGAGAGGACCCGGGCGGAGTTGGACACGGTGTGCAGACACAACTACCAG -3' (S2)
1 CTGGTAGTTG TGTCTGCACA CCGTGTCCAA CTCCGCCCGG GTCCTCTCCA
51 GGACTTCCTT CTGGCTGTTC CAGTACTCGG CGGCAGGCGG CCCCAGCGGC 101GTCACCGCCC GGTACACCTC CACGTCGCTG TCGAAGCCGT ACTCCTCTCG 151 GTTATAGATG TATCTGGTCA CATAACGCAC GCGCTCCGTC CCGTTGGTGA 201 AGTAGCACAT G
Conformément au protocole général décrit dans l'exemple 1, on a effectué la détection de deux fragments d'acide nucléique cible déterminés respectivement par les séquences suivantes :
5'CATGfGCTACITCACCMCGGGACGGAGCGCGfGCGITATGfGACCAGATACAT CTATAACCGAGAGGAGTACGGCTTCGACAGCGACGTGGAGGTGTACCGGGCGGT GACGCCGCTGGGGCCGCCTGCCGCCGAGTACTGGAACAGCCAGAAGGAAGTCCT GGAGAGGACCCGGGCGGAGTTGGACACGGTGTGCAGACACAACTACCAG -3' (S2)
1 CTGGTAGTTG TGTCTGCACA CCGTGTCCAA CTCCGCCCGG GTCCTCTCCA
51 GGACTTCCTT CTGGCTGTTC CAGTACTCGG CGGCAGGCGG CCCCAGCGGC 101GTCACCGCCC GGTACACCTC CACGTCGCTG TCGAAGCCGT ACTCCTCTCG 151 GTTATAGATG TATCTGGTCA CATAACGCAC GCGCTCCGTC CCGTTGGTGA 201 AGTAGCACAT G
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5'CATGTGCTACTTCACCAACGGGACAGAGCGCGTGCGTCTTGTGAGCAGAAGCA TCTATAACCGAGAAGAGATCGGCTTCGACAGCGACGTGGGGGAGTTCCGGGCGG TGACGCTGCTGGGGCTGCCTGCCGCCGAGTACTGGAACAGCCAGAAGGACATCCT GGAGAGGAAACGGGCGGCGGTGGACACGGTGTGCAGACACAACTACCAG-3' (S1)
1 CTGGTAGTTG TGTCTGCACA CCGTGTCCAA CTCCGCCCGG GTCCTCTCCA
51 GGACTTCCTT CTGGCTGTTC CAGTACTCGG CGGCAGGCGG CCCCAGCGGC 101 GTCACCGCCC GGTACACCTC CACGTCGCTG TCGAAGCCGT ACTCCTCTCG 151 GTTATAGATG TATCTGGTCA CATAACGCAC GCGCTCCGTC CCGTTGGTGA 201 AGTAGCACAT G respectivement à une concentration de 1 M, en utilisant un même oligonucléotide de capture complémentaire des deux fragments d'ADN (ligand C+), un oligonucléotide de capture non complémentaire à chacun des deux fragments d'ADN (ligand C-), un oligonucléotide de capture (ligand 26c) complémentaire du fragment d'acide nucléique (S1), et un autre oligonucléotide de capture (45a) complémentaire du fragment d'acide nucléique (S2), qui ont respectivement pour séquences : 5' CGCTTCGACAGCGACGTGGGG 3' C+ 5' TATGAAACTTATGGGGATAC 3' C- 5' TCTTGTGAGCAGAAGC 26c
5' GACGTGGAGGTGTACC 45a et un oligonucléotide de détection conjugué à la peroxydase de séquence :
5' TGGAACAGCCAGAAGGA 3'
Dans chacun des puits de la microplaque on trouve donc 16 sites élémentaires correspondant aux ligands C+, C-, 26c et 45a dans les positions suivantes par référence à la figure 3 : ligand C+ : 1 ; 2 ; 9 ; 10 ligand C- : 5 ; 6; 13 ; 14 ligand 26c : 3 ; 4; 11; 12 ligand 45 a: 7; 8; 15; 16.
1 CTGGTAGTTG TGTCTGCACA CCGTGTCCAA CTCCGCCCGG GTCCTCTCCA
51 GGACTTCCTT CTGGCTGTTC CAGTACTCGG CGGCAGGCGG CCCCAGCGGC 101 GTCACCGCCC GGTACACCTC CACGTCGCTG TCGAAGCCGT ACTCCTCTCG 151 GTTATAGATG TATCTGGTCA CATAACGCAC GCGCTCCGTC CCGTTGGTGA 201 AGTAGCACAT G respectivement à une concentration de 1 M, en utilisant un même oligonucléotide de capture complémentaire des deux fragments d'ADN (ligand C+), un oligonucléotide de capture non complémentaire à chacun des deux fragments d'ADN (ligand C-), un oligonucléotide de capture (ligand 26c) complémentaire du fragment d'acide nucléique (S1), et un autre oligonucléotide de capture (45a) complémentaire du fragment d'acide nucléique (S2), qui ont respectivement pour séquences : 5' CGCTTCGACAGCGACGTGGGG 3' C+ 5' TATGAAACTTATGGGGATAC 3' C- 5' TCTTGTGAGCAGAAGC 26c
5' GACGTGGAGGTGTACC 45a et un oligonucléotide de détection conjugué à la peroxydase de séquence :
5' TGGAACAGCCAGAAGGA 3'
Dans chacun des puits de la microplaque on trouve donc 16 sites élémentaires correspondant aux ligands C+, C-, 26c et 45a dans les positions suivantes par référence à la figure 3 : ligand C+ : 1 ; 2 ; 9 ; 10 ligand C- : 5 ; 6; 13 ; 14 ligand 26c : 3 ; 4; 11; 12 ligand 45 a: 7; 8; 15; 16.
Dans le premier puits où l'on introduit le fragment d'acide nucléique S2 on observe la coloration des spots de C+ et 45A, alors que les spots de C- et 26c ne présentent aucune coloration. (conférer figure 4).
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Dans le second puits où l'on indroduit le fragment d'acide nucléique S1, on observe la coloration des spots de C+ et 26c, alors que les spots de C- et 45a ne présentent aucune coloration ; conférer figure 5. On constate que le format de test proposé dans cet exemple possède une très bonne spécificité vis-à-vis du fragment d'acide nucléique que l'on cherche à détecter, et qu'il ne génère pas de bruit de fond.
EXEMPLE 3 Conformément au protocole décrit dans l'exemple 1, des oligonucléotides de capture sont déposés de façon discrète dans le fond d'un puits d'une microplaque 96 puits, selon un plan de dépôt en matrice (fig. 6) et, également, selon un plan de dépôt de la présente invention (fig.7).
1.5 l d'une séquence cible d'ADN, dénaturée à une concentration d'1 M, biotynilée par utilisation d'amorces biotynilée pendant la PCR, est diluée à une concentraton de 1 M dans 30 l de tampon d'hybridation (PBS 3X+ADN de sperme de saumon 10mg/ml Sigma) et 5 l de Streptavidine-Phycoérythrine de concentration 10 g/ml (Sigma) sont ensuite ajoutés. Cette solution est déposée dans les puits de la microplaque, incubée pendant 1 h à 37 C et lavée deux fois avec 300 l de PBS Tween.
La lecture en fluorescence est effectuée à 532mm.
On constate que le dépôt selon une disposition matricielle présente des sites élémentaires d'intensités lumineuses variables. En revanche, le dépôt en disposition circulaire présente des sites élémentaires d'intensités équivalentes.
Etant donné la symétrie circulaire de l'éclairage des lecteurs, la disposition en cercle favorise une homogénéité de l'intensité lumineuse des sites élémentaires.
EXEMPLE 4 Conformément au protocole général décrit dans l'exemple 1, on a effectué la détection de la séquence cible en utilisant un plan de dépôt en matrice (fig. 8) et le plan de dépôt de la présente invention (fig.3).
On constate que le dépôt selon une disposition matricielle présente des sites élémentaires centraux dont la baisse d'intensité peut résulter de l'action des appareils de lavage dont l'intensité du flux et l'aspiration sont très variables et s'exercent au centre du puits.
La disposition en cercle favorise donc une homogénéité de traitement par les laveurs des sites élémentaires.
Claims (12)
1) Biopuce (1) comprenant un support (2) dont une face utile (2a) comprend une surface opératoire (3), un réseau de sites élémentaires (Xn) disposé sur ladite surface opératoire, et une multiplicité de ligands fixés chacun en nombre multiple en des sites élémentaires respectivement différents, caractérisée en ce que la face utile du support comprend ladite surface opératoire constituée par au moins une couronne opératoire (31 ) sur laquelle des sites élémentaires (Xn) sont distribués, et une surface non opératoire (4), pratiquement exempte de tout site élémentaire, disposée à l'intérieur ou au centre de ladite couronne opératoire.
2) Biopuce selon la revendication 1, caractérisée en ce que sur la couronne opératoire (31), les sites élémentaires sont distribués de manière régulière, ou irrégulière
3) Biopuce selon la revendication 1, caractérisée en ce que la surface opératoire (3) du support comprend au moins deux couronnes opératoires (31,32) concentriques
4) Biopuce selon la revendication 1, caractérisée en ce que un site élémentaire dit détrompeur, est disposé dans la surface non opératoire, à proximité ou du côté de la dite couronne opératoire (31)
5) Biopuce selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'un site élémentaire détrompeur est disposé dans la surface opératoire, à proximité ou du côté de ladite couronne opératoire (31).
6) Biopuce selon la revendication 1, caractérisée en ce que, la surface opératoire (3) et la surface non opératoire (4) sont traitées de manière respectivement différente, vis-à-vis de la détection ou du traitement des signaux de sortie émis par des ligands marqués fixés en des sites élémentaires (Xn) respectivement différents
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7) Biopuce selon la revendication 1, caractérisée en ce que la surface opératoire (3) est en élévation (évélation) ou en dépression par rapport à la surface non opératoire (4)
8) Biopuce selon la revendication 1, caractérisée en ce que la surface non opératoire est affectée à au moins une fonction autre que la détermination de l'espèce cible, par exemple le stockage d'un réactif
9) Biopuce pour la détermination d'au moins une espèce cible, comprenant un support (2) dont une face utile (2a) comprend un réseau de sites élémentaires (Xn), et une multiplicité de ligands fixés chacun en nombre multiple en des sites élémentaires (Xn) respectivement différents, caractérisée en ce que les sites élémentaires sont distribués sur la face utile selon au moins une ligne circulaire
10) Dispositif, par exemple à usage unique, pour la détermination d'au moins une espèce cible, compenant au moins une biopuce (1) selon l'une quelconque des revendications 1 à 9
11) Dispositif selon la revendication 10, par exemple plaque de micro-titration, comprenant une pluralité de puits élémentaires pour la réception d'au moins un échantillon d'intérêt, caractérisé en ce que au moins une biopuce est disposée dans undit puits, ou sur le fond d'undit puits.
12) Dispositif selon la revendication 11, caractérisé en ce que le fond d'au moins un puits constitue directement le support de la biopuce.
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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