WO2003098217A2 - Nouvelle disposition des sites de liaison d'une biopuce - Google Patents

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WO2003098217A2
WO2003098217A2 PCT/FR2003/001502 FR0301502W WO03098217A2 WO 2003098217 A2 WO2003098217 A2 WO 2003098217A2 FR 0301502 W FR0301502 W FR 0301502W WO 03098217 A2 WO03098217 A2 WO 03098217A2
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biochip
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operating
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Bernard Mandrand
Philippe Cleuziat
David Duracher
Emmanuel Bufflier
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Apibio
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54386—Analytical elements

Definitions

  • the present invention relates to biochips, and more particularly the mode of organization of its binding sites, to serve as tools in molecular biological analysis.
  • biochip is meant a functional unit, for single use or not, generally implemented for the purposes of molecular biological determination, arranged for and / or intended to cooperate with at least one distinct and complementary device or instrument, and receiving a sample of interest, liquid or fluid, immobile or in motion, suspected of containing at least one target species, in suspension or in solution, for example a biomolecule, possibly labeled, and delivering at least one output signal in relation to the presence, and / or the nature, and / or the structure and / or the quantity of said target species.
  • This biochip includes at least:
  • the material or the material of the support is inert, and not substantially electrically conductive, at least according to said operating surface, in the sense that said material practically does not interact with the sample, and in particular the target species, by strong bond of the covalent chemical bond type, or by weak bond, for example hydrogen bond, other interactions of physical type, such as surface tension, not being otherwise excluded;
  • the material constituting such a support is for example silicon, a glass, or a plastic material, for example a thermoset or thermoplastic synthetic resin, for example a polypropylene, a polystyrene or a polyacrylamide resin,
  • a network for example a matrix, of elementary sites distributed in a methodical or orderly manner over the operating surface, in the manner of pixels, for example along at least two reference axes, each elementary site being addressed, that is to say say identified by coordinates which are unique to it in any appropriate reference frame, formed for example by reference axes; these elementary sites are themselves treated or not, with a view to fixing or anchoring the ligands, which will be discussed below; this treatment can for example consist of a coating with a layer of an electronic conductive polymer, for example modified polypyrole, according to the techniques set out in documents FR 2 703 359, WO 9422889, and EPO 691 978, FR 2 787 582, EP 1 141 391, and WO 0036145.
  • a set of connections, or circuit, for example electrical, with the various elementary sites respectively said set of connections being arranged to connect each elementary site individually, independently from the other elementary sites, for example by addressing (see document FR-A-2741475); said set of connections is for example an electrical circuit multiplexed with electrodes and counter-electrodes, disposed respectively in said elementary sites;
  • This biochip can also comprise, in an integrated manner or not with the operating surface and its ligands or probes, various means, brought to the scale of the biochip, conventionally used in the laboratory, for:
  • the support comprises a set of channels and / or wells, for example reaction tubes, connected together and with the circulation cavity or stay, as well as various reagents or treatment agents, in the dry or liquid state, arranged on the medium depending on the circulation and the treatment (s) chosen for the initial sample or the sample of interest.
  • biochips for example of the order of 1 mm 2 to a few cm 2 , normally require, for their production or production, the implementation of techniques called “micro” or “nanotechnologies”, for example by lithography or micro-machining.
  • the Applicant does not intend to be limited to particular dimensions, in particular of the order of ⁇ m or of nm, when it uses the term "biochip" in the present description and in the appended claims, considering that the same structure or the same arrangement as that defined below can be implemented with dimensions of the order of a few mm 2 , as with much larger dimensions.
  • biochip as considered by the present invention can not function autonomously, except to embark with it its own source of energy. Consequently, this biochip is designed to cooperate, for example removably, on the one hand with external means making it possible to circulate or remain, in contact with the operating surface and the ligands, the liquid sample of interest, but also other fluids or liquids such as washing liquid, and on the other hand with means for detecting and processing the output signal (s), the whole being generally controlled and controlled, by external electronic means, analog or IT, for example according to any processing logic or flowchart.
  • biomolecule is meant any entity, in particular biochemical, or biological, identical to or derived from any molecular species existing in nature.
  • biopolymers for example DNA, RNA, oligo and polynucleotides, functional or structural proteins, peptides, oligo and polypeptides, polysaccharides, etc.
  • marking or “marked” is meant the characteristic according to which a marker, that is to say a substituent or residue allowing, is fixed on an entity, for example the target species, covalently or otherwise, with or without the help of an external means, such as illumination, with or without a posterior step, such as bringing into contact with a substrate, to produce a signal, previously called the output signal.
  • the preferred markers according to the present invention are: - haptens: (example: biotin fixing a streptavidin-phycoerythrine conjugate - fluorophores, for example fluorescein, cyanine, phycoerythrin
  • - enzymes for example oxidation of a chromogen; confer horseradish peroxidase, alkaline phosphatase.
  • determination is meant the identification, qualitative and / or quantitative, the detection, the description (for example sequencing), the separation, or the enrichment of the target species, which can be called “analyte” in the case qualitative and / or quantitative identification.
  • the expression “determination” any sequencing of a biomolecule of the DNA or polypeptide type.
  • the output signal or signals considered by the present invention may have any suitable nature, depending on the markers used, and the type of detection required. They may be light signals, visible or invisible, electrical, electro-optical, electrochemical, etc.
  • ligand is meant any entity, cellular, biological, or biomolecule having an affinity, specific or not, for a target species.
  • a ligand mention will be made of any oligonucleotide capable of binding by weak bonds, we will say in this case of hybridizing, with a strand of DNA (target species), comprising a sequence complementary to that of the ligand.
  • Each ligand is attached or anchored at each elementary site of the biochip, optionally after functionalization of the operating surface of the support, by any suitable means, for example chemical, by covalent bond, for example by means of a spacer arm, or by adsorption, absorption, etc.
  • the fixing of the ligands can be carried out according to the electrochemical techniques described by documents FR 2789401, EP 1 152 821 and WO 0047317; FR2 742 451, EP 0 868 464 and WO 9722648.
  • target species any cell, biological or biochemical species capable of binding by weak bond to one or more ligands.
  • a biochip as described above is placed at the bottom of a well, for example a micro-titration plate, into which the liquid sample comprising the target species is introduced, stays, then is evacuated .
  • a well for example a micro-titration plate, into which the liquid sample comprising the target species is introduced, stays, then is evacuated .
  • the bottom of a well directly constitutes the support of the biochip.
  • the present invention therefore relates to a biochip as defined above, comprising a support, one useful face of which comprises an operating surface, a network of elementary sites disposed on said operating surface, and a multiplicity of ligands each fixed in multiple number at elementary sites respectively. different.
  • the operating surface has a rectangular or square matrix shape, taking into account the arrangement in rows and columns of the elementary sites linked respectively to the ligands.
  • Such a form generates a heterogeneity of behavior or treatment of the elementary sites, and therefore of the ligands which are linked to them, in particular in the angular ends of the matrix, on the operating surface, as shown by the following considerations.
  • washing is generally carried out with a unidirectional liquid flow, having a greater speed in the center than outside, on the basis of a jet centered on the entire operating surface to wash.
  • washing makes it possible to eliminate non-specific targets, not linked to the probes.
  • the jet is unidirectional and central at the operating surface, resulting in a different washing efficiency between the central and peripheral sites.
  • the presence of sites in the center of the useful face of the support reduces flexibility and compatibility with scrubbers which come into contact, damaging the elementary central sites.
  • the biochip is illuminated for example with a light beam having a heterogeneity, for example a greater intensity in the center than on its edges; so that, with identical marked ligands, the light intensity emitted or re-emitted may be greater for the elementary sites in the center than at the periphery of the biochip.
  • the present invention therefore aims to remedy the above drawbacks.
  • the present invention relates to a biochip, having an essentially homogeneous behavior, from one elementary site to another, present on the support.
  • the useful face of the biochip support comprises, on the one hand an operating surface constituted by at least one operating crown on which the elementary sites are distributed, and a non-operating surface, practically free of all elementary sites , placed in the center of said operating crown.
  • the elementary sites are distributed on the useful face along at least one circular line.
  • the elementary sites are distributed regularly, or irregularly;
  • the operating surface includes at least two concentric operating crowns
  • An elementary site known as a keying device, is arranged, either in the non-operating surface, or in the operating surface, on the side of the operating crown, so as to locate the biochip in relative position;
  • the operating surface and the non-operating surface are treated in a different manner respectively, with respect to the detection or the processing of the output signals emitted by labeled ligands, fixed at respectively different elementary sites; -
  • the operating surface is elevated or depressed relative to the non-operating surface, for example to promote effective washing of the operating surface;
  • the operating surface and / or the non-operating surface are not flat and have, for example, the shape of a bowl;
  • the non-operative surface is assigned to at least one function other than the direct determination of the target species, for example the storage of a reagent required for this determination; -
  • the operating surface includes ligands of different nature, for example peptide and oligonucleotide.
  • a biochip according to the present invention can be integrated into a device, for example for single use, for determining at least one target species.
  • a device for example, such a device is a micro-titration plate, comprising a plurality of elementary wells for receiving at least one sample of interest, and at least one biochip is placed in a said well or on the bottom of a said well.
  • the bottom of at least one well directly constitutes the support of the biochip.
  • FIG. 1 shows a biochip according to the present invention, seen from above and schematically;
  • FIG. 2 shows a biochip according to a variant of the present invention.
  • a biochip (1) comprises a support (2) of which a useful face (2a) comprises a so-called operating surface (3), a network of elementary sites (Xn) each referenced by a letter and a number according to any appropriate reference, this network being arranged on the operating surface (3), as well as a multiplicity of ligands (not shown) each fixed in multiple number at respectively different elementary sites.
  • the useful face (2a) of the support (2) comprises, on the one hand the operating surface (3) constituted by at least one operating crown (31) on which the elementary sites (Xn) are distributed, and a non-operating surface ( 4), practically free from all elementary sites, located in the center of said operating crown.
  • the operating surface (3) comprises two concentric operating crowns (31 and 32).
  • the elementary sites (Xn) can be distributed regularly or irregularly.
  • An elementary site (5), said polarizing, is arranged in the non-operating surface (4), on the side of the operating crown (31) or on the side of the operating crown (32).
  • the operating surface (3) and the non-operating surface (4) are treated respectively differently, for example with regard to their respective reflectances with respect to the detection or treatment of output signals emitted by the labeled ligands, fixed at respectively different elementary sites (Xn).
  • the operating surface (3) that is to say each of the operating crowns 31 or 32, is in elevation or in depression relative to the non-operating surface (4).
  • the non-operating surface (4) is assigned to at least one function other than determining the target species, for example the storage of a reagent involved in determining the latter.
  • the biochip comprises the support (2) whose useful face (2a) comprises a network of elementary sites (Xn) and a multiplicity of ligands each fixed in multiple number at elementary sites. respectively different, and the latter are distributed on the useful face (2a) along at least one circular line.
  • a biochip as described above belongs to a device, for example for single use, for determining at least one target species, this device possibly being a micro-titration plate, comprising a plurality of elementary wells for the receiving at least one sample of interest; in the latter case, at least one biochip is deposited in said well, or on the bottom of the latter.
  • the bottom of at least one well directly constitutes the support of the biochip.
  • This biochip therefore comprises, according to the operating crown (31), sixteen elementary sites.
  • EXAMPLE 1 A synthetic capture oligonucleotide functionalized in 5 ′ by an NH2 group, therefore forming a ligand, is diluted to a concentration of 1 ⁇ M in PBS 3X (0.45 M Nacl, 0.15M sodium phosphate, pH 7). This ligand is discreetly deposited according to the deposition plan of the present invention in the bottom of at least one well of a 96-well microplate (Greiner) using an automated system.
  • microplate is incubated overnight at 4 ° C. and then washed twice with 300 ⁇ l of PBS Tween (0.15 M NaCl, 0.05 M sodium phosphate, pH 7, 0.5% of Tween 20 (Merck)).
  • the microplate is incubated for 1 hour at 37 ° C. and washed twice with 300 ⁇ l of PBS Tween.
  • TMB horseradish peroxidase
  • EXAMPLE 2 In accordance with the general protocol described in Example 1, two target nucleic acid fragments were determined, determined respectively by the following sequences: 5'CATCTG rAOTTA ⁇ AACGGACC-K- ⁇ A ⁇ GCGT ⁇ GTTATGTGACCAGATACNr CTATAACCGAGGAGTACGGCGCGAGGGGGGGGGGACTGGACGACTG
  • AGTAGCACAT G (S1) respectively at a concentration of 1 ⁇ M, using the same capture oligonucleotide complementary to the two DNA fragments (ligand C +), a capture oligonucleotide not complementary to each of the two DNA fragments (ligand C-), an oligonucleotide from capture (ligand 26c) complementary to the nucleic acid fragment (S1), and another capture oligonucleotide (45a) complementary to the nucleic acid fragment (S2), which respectively have the following sequences:
  • capture oligonucleotides are discretely deposited in the bottom of a well of a 96-well microplate, according to a matrix deposition plan
  • a DNA target sequence denatured at a concentration of 1 ⁇ M, biotynilated by using biotynilized primers during the PCR, is diluted to a concentration of 1 ⁇ M in 30 ⁇ l of hybridization buffer (PBS 3X + Salmon sperm DNA 10 mg / ml Sigma) and 5 ⁇ l of Streptavidin- Phycoerythrin of concentration 10 ⁇ g / ml (Sigma) are then added.
  • PBS 3X + Salmon sperm DNA 10 mg / ml Sigma
  • Streptavidin- Phycoerythrin of concentration 10 ⁇ g / ml
  • This solution is placed in the wells of the microplate, incubated for 1 h at 37 ° C and washed twice with 300 ⁇ l of PBS Tween. The fluorescence reading is performed at 532mm.
  • the deposition according to a matrix arrangement presents elementary sites of varying light intensities.
  • the deposit in circular layout presents elementary sites of equivalent intensities.
  • the detection of the target sequence was carried out using a matrix deposition plan (FIG. 8) and the deposition plan of the present invention (FIG. 3). It can be seen that the deposition according to a matrix arrangement presents elementary central sites, the drop in intensity of which can result from the action of the washing apparatuses, the flux and suction intensity of which are very variable and are exerted at the center of the well. The arrangement in a circle therefore favors a homogeneity of treatment by the washers of the elementary sites.
  • the first approach uses synthetic targets labeled with 5 'biotin.
  • the second in vivo approach uses a referenced biological model (cadmium yeast cell stress [Saccharomyces cerevisiae]).
  • yeast lies on the one hand in that it is an ancestral eukaryotic organism, and on the other hand in its organizational proximity of the genome with that of higher eukaryotic cells. In addition, it is easy to manipulate and its genome is fully sequenced (6430 genes distributed on 16 chromosomes). It is also well documented and widely used as a biological model in pharmacology, toxicology and oncology studies.
  • RNAs (approximately 20 ⁇ g) of the test and reference samples are retro-transcribed using the Superscript II Reverse-Transcription kit (Invitrogen Corporation; Carlsbad-CA) in the presence of dNTPs and a dNTP-biotin.
  • the cDNAs thus labeled are purified on Microcon filters according to the manufacturer's recommendations (Milipore Corp., Canton, Massa.).
  • oligonucleotide probes derived from the yeast actl and seo genes are deposited at the bottom of each well of a microtiter plate. Each well contains 9 and 8 spots of the Act and Seo genes, respectively. A unique and specific signal is obtained for each target hybridized to its corresponding probe. Modeling of oligonucleotides
  • oligonucleotide probes from 60 seas of Saccharomyces cerevisiae corresponding specifically to each of the 10 genes involved in the cadmium detoxification system, are optimized using a proprietary bioinformatics tool.
  • the spots are spaced from each other by 600 ⁇ m and have a diameter of 200 to 300 ⁇ m.
  • Biotynilized targets are chemically denatured in a volume not exceeding 3 ⁇ l. This volume is made up to 30 ⁇ l with hybridization buffer (PBS 3X, salmon sperm DNA 10 mg / ml Sigma®), then deposited at the bottom of the well and incubated at 37 ° C for 1 hour. The wells are then washed four times with 300 ⁇ l of washing buffer each time (NaCI, KCI, Na2HPO4, KH2PO4, Tween 20 and EDTA). The Streptavidin-Alkaline Phosphate conjugate is deposited at a rate of 10 ng per well and then incubated at 25 ° C for 15 minutes.
  • hybridization buffer PBS 3X, salmon sperm DNA 10 mg / ml Sigma®
  • the wells are washed a second time as described above, 50 ⁇ l of the substrate precipitating alkaline phosphatase are added to each well and then incubated at 25 ° C for 15 to 60 minutes. This last step can be stopped at any time by adding 40mM of EDTA.
  • a uniform scale factor is applied assuming that the arithmetic median of the ratios for housekeeping genes between growth conditions is 1 to normalize the data. In addition, this normalization factor is applied to other genes.
  • mRNAs derived from yeast cells cultivated under more or less cadmium conditions are back-transcribed into cDNAs labeled according to the protocol described above.
  • 0.2 ⁇ g of biotynilized cDNA is hybridized to yeast probes (corresponding to the yeast genes involved in the cadmium detoxification system) deposited at the bottom of the biochip wells.
  • yeast probes corresponding to the yeast genes involved in the cadmium detoxification system
  • the monoclonal antibodies ⁇ TSH, ⁇ FSH, ⁇ LH and ⁇ LH and ⁇ HCG are diluted to 100 ⁇ g / ml in 50 mM carbonate buffer pH9.7 and spotted in white 96-well microtiter plates according to the format of FIG. 12.
  • the plates are incubated under controlled temperature and pressure conditions, then washed and treated with a PBS solution containing BSA (0.1%) and trehalose (2%). They are then dried and stored.
  • the TSH, FSH, LH and HCG antigens (Scripps) are diluted in PBS tween 0.1% 10% horse serum buffer. 30 ⁇ l of solution containing the mixed antigens are added to each well and incubated for 1 hour at 37 ° C.
  • the plates are rinsed and then 30 ⁇ l of a solution containing each of the four monoclonal detection antibodies ⁇ TSH, ⁇ FSH, LH and ⁇ HCG labeled with alkaline phosphatase (bioMérieux) are added per well.
  • the circular format test based on colorimetric detection in the presence of the alkaline phosphatase conjugate is a good tool for quantitative measurement of proteins.

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Abstract

1) Biopuce (1) comprenant un support (2) dont une face utile (2a) comprend une surface opératoire (3), un réseau de sites élémentaires (Xn) disposé sur ladite surface opératoire, et une multiplicité de ligands fixés chacun en nombre multiple en des sites élémentaires respectivement différents, caractérisée en ce que la face utile du support comprend ladite surface opératoire constituée par au moins une couronne opératoire (31) sur laquelle des sites élémentaires (Xn) sont distribués, et une surface non opératoire (4), pratiquement exempte de tout site élémentaire, disposée à l'intérieur ou au centre de ladite couronne opératoire.

Description

Nouvelle disposition des sites de liaison d'une biopuce
La présente invention concerne les biopuces, et plus particulièrement le mode d'organisation de ses sites de liaison, pour servir d'outils en analyse biologique moléculaire.
Par « biopuce », on entend un ensemble fonctionnel, à usage unique ou non, généralement mis en œuvre aux fins d'une détermination biologique moléculaire, agencé pour et/ou destiné à coopérer avec au moins un appareil ou instrument distinct et complémentaire, et recevant un échantillon d'intérêt, liquide ou fluide, immobile ou en mouvement, suspecté de contenir au moins une espèce cible, en suspension ou en solution, par exemple une biomolécule, éventuellement marquée, et délivrant au moins un signal de sortie en relation avec la présence, et/ou la nature, et/ou la structure et/ou la quantité de ladite espèce cible. Cette biopuce comprend au moins :
- un support comportant une face utile comprenant une surface opératoire au contact de l'échantillon ; le matériau ou la matière du support est inerte, et non substantiellement conducteur de l'électricité, au moins selon ladite surface opératoire, au sens où ledit matériau n'interagit pratiquement pas avec l'échantillon, et en particulier l'espèce cible, par liaison forte du type liaison chimique covalente, ou par liaison faible, par exemple liaison hydrogène, d'autres interactions de type physique, telles que tension superficielle, n'étant pas par ailleurs exclues ; le matériau constitutif d'un tel support est par exemple du silicium, un verre, ou une matière plastique, par exemple une résine de synthèse thermodurcie ou thermoplastique, par exemple un polypropylène, un polystyrène ou une résine polyacrylamide,
- un réseau, par exemple matrice, de sites élémentaires distribués de manière méthodique ou ordonnée sur la surface opératoire, à la manière de pixels, par exemple selon au moins deux axes de référence, chaque site élémentaire étant adressé, c'est-à-dire identifié par des coordonnées qui lui sont uniques dans tout repère approprié, formé par exemple par des axes de références ; ces sites élémentaires sont eux- mêmes traités ou non, en vue de la fixation ou de l'ancrage des ligands, dont il sera question ci-après ; ce traitement peut par exemple consister en un revêtement avec une couche d'un polymère conducteur électronique, par exemple polypyrole modifié, selon les techniques exposées dans les documents FR 2 703 359, WO9422889, et EPO 691 978, FR 2 787 582, EP 1 141 391 , et WO 0036145.
- le cas échéant, un ensemble de connexions, ou circuit, par exemple électrique, avec respectivement les différents sites élémentaires, ledit ensemble de connexions étant agencé pour relier individuellement chaque site élémentaire, de manière indépendante par rapport aux autres sites élémentaires, par exemple par adressage (conférer le document FR- A- 2741475) ; ledit ensemble de connexions est par exemple un circuit électrique multiplexe d'électrodes et contre-électrodes, disposées respectivement dans lesdits sites élémentaires ;
- une multiplicité de ligands, ou sondes, identiques, attachés ou ancrés, par tous moyens appropriés, dans chaque site élémentaire, par exemple selon les techniques exposées dans les documents FR2679255 et EP0524864 ;
- éventuellement, des moyens formant avec la surface opératoire une cavité de circulation ou séjour de l'échantillon liquide, comportant au moins une entrée et une sortie pour ce dernier ;
- éventuellement, des moyens d'observation, transmission, ou émission du signal ou des signaux de sortie, correspondant à la liaison de l'espèce cible avec les ligands, respectivement en un ou plusieurs sites de liaison ;
Cette biopuce peut en outre comprendre, de manière intégrée ou non avec la surface opératoire et ses ligands ou sondes, différents moyens, ramenés à l'échelle de la biopuce, classiquement utilisés en laboratoire, pour :
- obtenir ou préparer l'échantillon d'intérêt, à partir d'un autre échantillon dit de départ, par dénaturation, séparation, concentration, purification, etc. ;
- traiter l'échantillon d'intérêt, par exemple par amplification, et/ou marquage avec un marqueur, avant sa mise en contact avec les ligands ou sondes ;
- traiter le ou les complexes formés entre l'espèce cible et respectivement le ou les ligands, par exemple par marquage, afin d'obtenir, simultanément ou postérieurement à la formation des complexes, respectivement un ou des signaux de sortie.
Lorsque la biopuce, ou « biochip », ou "micro-array", est associée ou comprend en outre ces moyens de laboratoire, dans le secteur technique concerné, on parlera alors de « labopuce » (ou « lab on a chip »). En pareil cas, le support comprend un ensemble de canaux et/ou puits, par exemple réactionnels, reliés entre eux et avec la cavité de circulation ou séjour, ainsi que divers réactifs ou agents de traitement, à l'état sec ou liquide, disposés sur le support en fonction de la circulation et du ou des traitements retenus pour l'échantillon de départ ou l'échantillon d'intérêt.
Les dimensions de ces biopuces, par exemple de l'ordre de 1 mm2 à quelques cm2, requièrent normalement pour leur réalisation ou production, la mise en œuvre de techniques dites « micro » ou « nano- technologies », par exemple par lithographie ou micro-usinage.
Mais la Demanderesse n'entend pas être limitée à des dimensions particulières, notamment de l'ordre du μm ou du nm, lorsqu'elle utilise le terme « biopuce » dans la présente description et dans les revendications en annexe, considérant que la même structure ou le même agencement que celui défini ci-après peut être mis en œuvre avec des dimensions de l'ordre de quelques mm2, comme avec des dimensions beaucoup plus importantes.
Bien entendu, une biopuce telle que considérée par la présente invention ne peut fonctionner de manière autonome, sauf à embarquer avec elle sa propre source d'énergie. Par conséquent, cette biopuce est agencée pour coopérer, par exemple de façon amovible, d'une part avec des moyens extérieurs permettant de faire circuler ou séjourner, en contact de la surface opératoire et des ligands, l'échantillon liquide d'intérêt, mais aussi d'autres fluides ou liquides.tels que liquide de lavage, et d'autre part avec des moyens de détection et de traitement du ou des signaux de sortie, le tout étant en général contrôlé et commandé, par des moyens électroniques extérieurs, analogiques ou informatiques, par exemple selon toute logique ou organigramme de traitement. Par « biomolécule », on entend toute entité, en particulier biochimique, ou biologique, identique à ou dérivée de toute espèce moléculaire existant dans la nature. Au rang des biomolécules considérées par la présente invention, on peut citer certains biopolymères, par exemple l'ADN, l'ARN, les oligo et polynucléotides, les protéines fonctionnelles ou structurales, les peptides, les oligo et polypeptides, les polysaccharides, etc. Par « marquage » ou « marqué », on entend la caractéristique selon laquelle on fixe sur une entité, par exemple l'espèce cible, de manière covalente ou autre, un marqueur, c'est-à-dire un substituant ou reste permettant, avec ou sans l'aide d'un moyen extérieur, tel qu'illumination, avec ou sans étape postérieure, telle que mise en contact avec un substrat, de produire un signal, dit précédemment signal de sortie. Les marqueurs préférés selon la présente invention sont : - les haptènes : (exemple : la biotine fixant un conjugué streptavidine-phycoéryhrine - les fluorophores par exemple fluorescéine, cyanine, phycoérythrine
- les luminophores : luminol, isoluminol, ABEI (N-4-amino-butyl- N-éthyl-isoluminol)
- les enzymes : par exemple d'oxydation d'un chromogène ; conférer peroxydase de raifort, phosphatase alcaline.
Par « détermination », on entend l'identification, qualitative et/ou quantitative, la détection, la description (par exemple séquençage), la séparation, ou l'enrichissement de l'espèce cible, pouvant être appelée « analyte » dans le cas d'une identification qualitative et/ou quantitative. Ressort selon la présente invention de l'expression « détermination », tout séquençage d'une biomolécule du type ADN ou polypeptide.
Le ou les signaux de sortie considérés par la présente invention peuvent avoir toute nature appropriée, en fonction des marqueurs mis en œuvre, et du type de détection requis. Il peut s'agir de signaux lumineux, visibles ou invisibles, électriques, électro-optiques, électrochimiques, etc....
Par ailleurs, ces signaux peuvent le cas échéant être détectés séparément, compte tenu, d'une part de l'adressage des sites élémentaires de la biopuce, et d'autre part de l'ensemble de connexions respectivement avec les différents sites élémentaires, éventuellement présents sur la biopuce. Par « ligand », on entend toute entité, cellulaire, biologique, ou biomolécule ayant une affinité, spécifique ou non, pour une espèce cible.
Affinité exprimant qu'il se forme, dans les conditions (notamment température, pH, force ionique, etc.) de la mise en contact de l'espèce cible avec le ligand, un appariement ou complexe stable entre ladite espèce cible et ledit ligand. A titre d'exemple de ligand, on citera tout oligonucléotide susceptible de se lier par liaisons faibles, on dira dans ce cas de s'hybrider, avec un brin d'ADN (espèce cible), comportant une séquence complémentaire avec celle du ligand.
Chaque ligand est attaché ou ancré en chaque site élémentaire de la biopuce, éventuellement après fonctionnalisation de la surface opératoire du support, par tout moyen approprié, par exemple chimique, par liaison covalente, par exemple par l'intermédiaire d'un bras espaceur, ou par adsorption, absorption, etc.
S'agissant de sites élémentaires revêtus comme indiqué précédemment avec un polymère de type polypyrrole modifié ou polythiophène, et électriquement adressés, la fixation des ligands peut être effectuée selon les techniques électrochimiques décrites par les documents FR 2789401, EP 1 152 821 et WO 0047317 ; FR2 742 451, EP 0 868 464 et WO 9722648.
Par "espèce cible", on entend toute espèce cellulaire, biologique, ou biochimique, susceptible de se lier par liaison faible à un ou plusieurs ligands.
S'agissant d'une biopuce, en l'état actuel du secteur technique considéré, on peut distinguer deux voies d'obtention de ligands respectivement différents, fixés chacun en nombre multiple respectivement sur les différents sites élémentaires :
- une voie in situ, qui consiste, par une série d'opérations successives, incrémentées, à synthétiser sur la surface opératoire elle-même, les différents ligands, ensemble, motif élémentaire par motif élémentaire, par exemple mer par mer, à partir d'un premier motif fixé en différents sites élémentaires, et ce dans l'ordre des séquences respectivement retenues pour les différents ligands ; à cet égard, on se référera aux documents FR 2703359, EP 0 691 978, et WO 9422889 ;
US 5 744 305, US 6 015 880, WO 09525116, et EP 0 750 629,
- et une voie ex situ, qui consiste à synthétiser ou obtenir les ligands respectivement différents en dehors de la surface opératoire, et à fixer les différents ligands chacun en nombre multiple, dans leurs sites élémentaires respectivement différents, et ce par des méthodes d'impression (avec ou sans contact), ou par activation électrique différenciée, car adressée, desdits sites élémentaires ; conférer les documents FR 2703359, EP 0 691 978, et WO9422889 ;
WO 00151689, US 6 090 933.
Aujourd'hui, les biopuces sont des outils, simples ou complexes, bien adaptés à toutes sortes d'analyse de biologie moléculaire ; conférer "DNA chips : a new tool for genetic analysis and diagnostics". M.Cuzin. Transfusion clinique et Biologique 2001 ; 8:291-6 ; et "How to make a DNA chip" Mickael C Pirrung. Angew.chem.lnt.ed 2002, 41 , 1276, 1289.
De manière générale, une biopuce telle que décrite précédemment est disposée au fond d'un puits, par exemple d'une plaque de micro-titration, au sein duquel l'échantillon liquide comprenant l'espèce cible est introduit, séjourne, puis est évacué. Préférentiellement, le fond d'un puits constitue directement le support de la biopuce.
La présente invention concerne donc une biopuce telle que précédemment définie, comprenant un support dont une face utile comprend une surface opératoire, un réseau de sites élémentaires disposé sur ladite surface opératoire, et une multiplicité de ligands fixés chacun en nombre multiple en des sites élémentaires respectivement différents.
Généralement la surface opératoire a une forme matricielle rectangulaire ou carrée, compte tenu de la dispositon en lignes et colonnes des sites élémentaires liés respectivement aux ligands. Une telle forme génère une hétérogénéité de comportement ou traitement des sites élémentaires, et donc des ligands qui leur sont liés, en particulier dans les extrémités angulaires de la matrice, sur la surface opératoire, comme montré par les considérations suivantes.
S'agissant du lavage des sites élémentaires, celui-ci est effectué en général avec un flux liquide unidirectionnel, présentant une vitesse plus importante au centre qu'à l'extérieur, sur la base d'un jet centré sur toute la surface opératoire à laver. Après hybridation, le lavage permet d'éliminer les cibles non spécifiques, non liées aux sondes. Le jet est unidirectionnel et central au niveau de la surface opératoire, résultant en une efficacité de lavage différente entre les sites centraux et périphériques. De plus, la présence de sites au centre de la face utile du support diminue la flexibilité et la compatibilité avec des laveurs qui viennent en contact, abîmant les sites élémentaires centraux.
S'agissant de l'agitation de l'échantillon liquide d'intérêt, contenant l'espèce cible, pour la complexation de cette dernière avec un ou plusieurs ligands de la biopuce, celle-ci est souvent effectuée au sein de la cavité réactionnelle, par exemple puits d'une plaque de micro-tritration, sous une forme hydrodynamique telle que tourbillon ou vortex. A cet égard, les sites élémentaires périphériques sont alors plus balayés avec l'échantillon liquide d'intérêt, que les sites situés au centre.
S'agissant encore de la lecture des différents signaux de sortie, émis par les ligands marqués, et lorsque ceux-ci sont de nature lumineuse, la biopuce est éclairée par exemple avec un faisceau lumineux présentant une hétérogénéité, par exemple une intensité plus importante au centre que sur ses bords ; de telle sorte que, à ligands marqués identiques, l'intensité lumineuse émise ou réémise peut être plus importante pour les sites élémentaires au centre qu'à la périphérie de la biopuce.
La présente invention a donc pour objet de remédier aux inconvénients précédents.
Plus particulièrement, la présente invention a pour objet une biopuce, ayant un comportement essentiellement homogène, d'un site élémentaire à l'autre, présent sur le support.
Conformément à la présente invention, la face utile du support de la biopuce comprend, d'une part une surface opératoire constituée par au moins une couronne opératoire sur laquelle les sites élémentaires sont distribués, et une surface non opératoire, pratiquement exempte de tous sites élémentaires, disposée au centre de ladite couronne opératoire.
Plus généralement, s'agissant d'une biopuce comprenant un support dont une face utile comprend un réseau de sites élémentaires, et une multiplicité de ligands fixés chacun en nombre multiple en des sites élémentaires respectivement différents, selon la présente invention, les sites élémentaires sont distribués sur la face utile selon au moins une ligne circulaire.
La présente invention comporte les modes d'exécution suivants :
- sur la couronne opératoire, ou sur chaque couronne opératoire, les sites élémentaires sont distribués de manière régulière, ou irrégulière ;
- la surface opératoire comprend au moins deux couronnes opératoires concentriques ;
- un site élémentaire, dit détrompeur, est disposé, ou dans la surface non opératoire, ou dans la surface opératoire, du côté de la couronne opératoire, de manière à repérer la biopuce en position relative ;
- la surface opératoire et la surface non opératoire sont traitées de manière respectivement différentes, vis-à-vis de la détection ou du traitement des signaux de sortie émis par des ligands marqués, fixés en des sites élémentaires respectivement différents ; - la surface opératoire est en élévation ou en dépression par rapport à la surface non opératoire, par exemple pour favoriser un lavage efficace de la surface opératoire ;
- la surface opératoire et/ou la surface non opératoire ne sont pas planes et ont par exemple la forme d'une cuvette ;
- la surface non opératoire est affectée à au moins une fonction autre que la détermination directe de l'espèce cible, par exemple au stockage d'un réactif requis pour cette détermination ; - la surface opératoire comprend des ligands de nature différente, par exemple peptidique et oligonucléotidique.
Préférentiellement, une biopuce selon la présente invention s'intègre dans un dispositif, par exemple à usage unique, pour la détermination d'au moins une espèce cible. Par exemple, un tel dispositif est une plaque de micro-titration, comprenant une pluralité de puits élémentaires pour la réception d'au moins un échantillon d'intérêt, et au moins une biopuce est disposée dans un dit puits ou sur le fonds d'un dit puits. Préférentiellement, le fond d'au moins un puits constitue directement le support de la biopuce. La présente invention est maintenant décrite par référence au dessin annexé, dans lequel :
- la figure 1 représente une biopuce selon la présente invention, vue de dessus et de manière schématique ;
- la figure 2 représente une biopuce selon une variante de la présente invention.
Par référence à la figure 1 , une biopuce (1) conforme à l'invention comprend un support (2) dont une face utile (2a) comprend une surface dite opératoire (3), un réseau de sites élémentaires (Xn) référencés chacun par une lettre et un chiffre selon tout repère approprié, ce réseau étant disposé sur la surface opératoire (3), ainsi qu'une multiplicité de ligands (non représentés) fixés chacun en nombre multiple en des sites élémentaires respectivement différents. La face utile (2a) du support (2) comprend, d'une part la surface opératoire (3) constituée par au moins une couronne opératoire (31) sur laquelle les sites élémentaires (Xn) sont distribués, et une surface non opératoire (4), pratiquement exempte de tous sites élémentaires, disposée au centre de ladite couronne opératoire. Comme montré en particulier par la figure 2, la surface opératoire (3) comprend deux couronnes opératoires concentriques (31 et 32).
Sur chaque couronne opératoire (31 et 32), les sites élémentaires (Xn) peuvent être distribués de manière régulière ou irrégulière.
Un site élémentaire (5), dit détrompeur, est disposé dans la surface non opératoire (4), du côté de la couronne opératoire (31) ou du côté de la couronne opératoire (32). Avantageusement, grâce à l'invention, la surface opératoire (3) et la surface non opératoire (4) sont traitées de manière respectivement différente, par exemple en ce qui concerne leurs réflectances respectives vis-à-vis de la détection ou du traitement des signaux de sortie émis par les ligands marqués, fixés en des sites élémentaires (Xn) respectivement différents.
De manière non représentée, la surface opératoire (3), c'est-à- dire chacune des couronnes opératoires 31 ou 32, est en élévation ou en dépression par rapport à la surface non opératoire (4).
De manière non représentée, la surface non opératoire (4) est affectée à au moins une fonction autre que la détermination de l'espèce cible, par exemple au stockage d'un réactif intervenant dans la détermination de cette dernière.
Par conséquent, de manière générale, selon l'invention, la biopuce comporte le support (2) dont la face utile (2a) comprend un réseau de sites élémentaires (Xn) et une multiplicité de ligands fixés chacun en nombre multiple en des sites élémentaires respectivement différents, et ces derniers sont distribués sur la face utile (2a) selon au moins une ligne circulaire.
Bien entendu, une biopuce telle que décrite précédemment appartient à un dispositif, par exemple à usage unique, pour la détermination d'au moins une espèce cible, ce dispositf pouvant être une plaque de micro-titration, comprenant une pluralité de puits élémentaires pour la réception d'au moins un échantillon d'intérêt ; dans ce dernier cas, au moins une biopuce est déposée dans undit puits, ou sur le fonds de ce dernier. Préférentiellement, le fond d'au moins un puits constitue directement le support de la biopuce.
On décrit ci-après plusieurs exemples, par référence à la biopuce représentée à la figure 1. Cette biopuce comporte par conséquent, selon la couronne opératoire (31), seize sites élémentaires.
EXEMPLE 1 Un oligonucléotide de capture synthétique fonctionnalisé en 5' par un groupement NH2, formant donc un ligand, est dilué à une concentration de 1 μM dans du PBS 3X (0.45 M Nacl, 0.15M phosphate de sodium, pH 7). Ce ligand est déposé de façon discrète selon le plan de dépôt de la présente invention dans le fond d'au moins un puits d'une microplaque de 96 puits (Greiner) à l'aide d'un système automatisé.
La microplaque est incubée une nuit à 4°C puis lavée 2 fois par 300μl de PBS Tween (0. 15 M NaCI, 0.05 M de phosphate de sodium, pH 7, 0.5% de Tween 20 (Merck)).
1 ,5μl d'une espèce cible d'ADN dénaturée à une concentration 1 μM, dans 30μl de tampon d'hybridation (PBS 3X + ADN de sperme de saumon 10 mg/ml Sigma ®) est ajouté dans les puits, suivis de 1.5μl d'une solution de conjugués oligonucléotide-peroxydase, servant d'oligonucléotide de détection, diluée à une concentration de 50 pmol/ml dans un tampon phosphate pH 7 (Na2HP04, KH2P04, BSA 0,1%). La microplaque est incubée 1 heure à 37°C et lavée 2 fois avec 300μl de PBS Tween. 100 μl de substrat colorimétrique et précipitant TMB (BioFx) (3,3',5,5'-tétraméthyIbenzidine (TMB) = substrat de la peroxydase de raifort), sont ajoutés par puits. Après 10 minutes de réaction, la lecture est effectuée sur un microscope (ZEISS ® axioscope II) équipé d'une caméra haute définition (Hamamatsu ®), et d'un objectif de grossissement X4 permettant d'imager la totalité d'un fond de puits d'une microplaque 96 puits. On obtient l'image selon la Figure 3, montrant des spots colorés, d'égale intensité et de surface identique, démontrant au passage la fixation du ligand en quantité homogène d'un site élémentaire à l'autre.
EXEMPLE 2 Conformément au protocole général décrit dans l'exemple 1 , on a effectué la détection de deux fragments d'acide nucléique cible déterminés respectivement par les séquences suivantes : 5'CATCTG rAOTTAœAACGGGACC-K-ιAœGCGTœGTTATGTGACCAGATACNr CTATAACCGAGAGGAGTACGGCΠCGACAG GACGTGÇTAGGTGTACCGGGCGGT GACGCCGCTGGGœCGCCrG<rœCGAGTACrGGAACAGCCAGAAGGAAGTCCT GGAGAGGACCCGGGCGGAGTTGGACACGGTGTGCAGACACAACTACCAG-3'
1 CTGGTAGTTG TGTCTGCACA CCGTGTCCAA CTCCGCCCGG GTCCTCTCCA 51 GGACTTCCTT CTGGCTGTTC CAGTACTCGG CGGCAGGCGG
CCCCAGCGGC
101 GTCACCGCCC GGTACACCTC CACGTCGCTG TCGAAGCCGT
ACTCCTCTCG
151 GTTATAGATG TATCTGGTCA CATAACGCAC GCGCTCCGTC CCGTTGGTGA
201 AGTAGCACAT G
(S2)
5'CATGTGCTACTTCACCAACGGGACAGAGCGCGTGCGΓΓCTTGTGAGC AGAAGCA
TCTATAACCGAGAAGAGATCGGCTTCGACAGCGACGTGGGGGAGTTC CGGGCGG
TGACGCTGCTGGGGCTGCCTGCCGCCGAGTACTGGAACAGCCAGAA GGACATCCT GGAGAGGAAACGGGCGGCGGTGGACACGGTGTGCAGACACAACTAC
CAG -3'
1 CTGGTAGTTG TGTCTGCACA CCGTGTCCAA CTCCGCCCGG GTCCTCTCCA 51 GGACTTCCTT CTGGCTGTTC CAGTACTCGG CGGCAGGCGG
CCCCAGCGGC 101 GTCACCGCCC GGTACACCTC CACGTCGCTG TCGAAGCCGT ACTCCTCTCG
151 GTTATAGATG TATCTGGTCA CATAACGCAC GCGCTCCGTC CCGTTGGTGA
201 AGTAGCACAT G (S1) respectivement à une concentration de 1 μM, en utilisant un même oligonucléotide de capture complémentaire des deux fragments d'ADN (ligand C+), un oligonucléotide de capture non complémentaire à chacun des deux fragments d'ADN (ligand C-), un oligonucléotide de capture (ligand 26c) complémentaire du fragment d'acide nucléique (S1), et un autre oligonucléotide de capture (45a) complémentaire du fragment d'acide nucléique (S2), qui ont respectivement pour séquences :
5' CGCTTCGACAGCGACGTGGGG 3' C+ 5' TATGAAACTTATGGGGATAC 3' C-
5' jTCTTGTGAGCAGAAGCl 26c
5* GACGTGGAGGTGTACC 45a et un oligonucléotide de détection conjugué à la peroxydase de séquence : 5' TGGAACAGCCAGAAGGA 3' Dans chacun des puits de la microplaque on trouve donc 16 sites élémentaires correspondant aux ligands C+, C-, 26c et 45a dans les positions suivantes par référence à la figure 3 : ligand C+ : 1 ; 2; 9 ; 10 ligand C- : 5 ; 6; 13; 14 ligand 26c : 3 ; 4; 11; 12 ligand 45 a : 7 ; 8; 15; 16. Dans le premier puits où l'on introduit le fragment d'acide nucléique S2 on observe la coloration des spots de C+ et 45A, alors que les spots de C- et 26c ne présentent aucune coloration (conférer figure 4).
Dans le second puits où l'on introduit le fragment d'acide nucléique S1 , on observe la coloration des spots de C+ et 26c, alors que les spots de C- et 45a ne présentent aucune coloration ; (conférer figure 5). On constate que le format de test proposé dans cet exemple possède une très bonne spécificité vis-à-vis du fragment d'acide nucléique que l'on cherche à détecter, et qu'il ne génère pas de bruit de fond.
EXEMPLE 3
Conformément au protocole décrit dans l'exemple 1, des oligonucléotides de capture sont déposés de façon discrète dans le fond d'un puits d'une microplaque 96 puits, selon un plan de dépôt en matrice
(fig.6) et, également, selon un plan de dépôt de la présente invention
(fig.7). 1.5μl d'une séquence cible d'ADN, dénaturée à une concentration d'1 μM, biotynilée par utilisation d'amorces biotynilée pendant la PCR, est diluée à une concentraton de 1 μM dans 30μl de tampon d'hybridation (PBS 3X+ADN de sperme de saumon 10mg/ml Sigma) et 5μl de Streptavidine- Phycoérythrine de concentration 10μg/ml (Sigma) sont ensuite ajoutés.
Cette solution est déposée dans les puits de la microplaque, incubée pendant 1 h à 37°C et lavée deux fois avec 300 μl de PBS Tween. La lecture en fluorescence est effectuée à 532mm.
On constate que le dépôt selon une disposition matricielle présente des sites élémentaires d'intensités lumineuses variables. En revanche, le dépôt en disposition circulaire présente des sites élémentaires d'intensités équivalentes.
Etant donné la symétrie circulaire de l'éclairage des lecteurs, la disposition en cercle favorise une homogénéité de l'intensité lumineuse des sites élémentaires.
EXEMPLE 4
Conformément au protocole général décrit dans l'exemple 1 , on a effectué la détection de la séquence cible en utilisant un plan de dépôt en matrice (fig.8) et le plan de dépôt de la présente invention (fig.3). On constate que le dépôt selon une disposition matricielle présente des sites élémentaires centraux dont la baisse d'intensité peut résulter de l'action des appareils de lavage dont l'intensité du flux et l'aspiration sont très variables et s'exercent au centre du puits. La disposition en cercle favorise donc une homogénéité de traitement par les laveurs des sites élémentaires.
EXEMPLE 5
Nous avons procédé à deux approches pour des mesures quantitatives en colorimétrie utilisant la Phosphatase Alcaline. La première approche utilise des cibles synthétiques marquées à la biotine en 5'. La deuxième approche in vivo utilise un modèle biologique référencé (stress des cellules de la levure [Saccharomyces cerevisiae] au cadmium).
Matériels et Méthodes
Approche in vivo :
Dans le but de mettre en évidence les changements qui s'opèrent au niveau des profils des ARNs messagers au sein d'une unité biologique
(par exemple entre deux situations physiologiques différentes), nous avons mis en place un modèle biologique renfermant des gènes dont les niveaux d'expression impliquent trois classes d'ARN messager 1. ARNm très abondant (10 %) ; 2. ARNm moyennement abondant (1%) ; 3. ARNm faiblement abondant (de l'ordre d'une copie ou plus). Nous avons choisi le système de détoxication du cadmium chez la levure (Saccharomyces cerevisiae) comme modèle biologique. En effet, ce système bien documenté renferme dix gènes dont les niveaux d'expression répondent parfaitement à nos critères (Holstege et al. (1998) Cell 95 :717-728). Ces dix gènes sont répartis en 5 classes suivant leur réponse à la présence du cadmium : 2 constitutifs, 2 moyennement induits, 2 fortement induits, 2 moyennement réprimés et 2 fortement réprimés.
Les séquences codantes de ces 10 gènes ont été extraites du site web SGD dédié au génome complet de la levure (http://genome- www.stanford.edu/Saccharomyces/, Deval A. Lashkari et al. (1997) PNAS 94 :13057-13062).
Le choix de la levure réside d'une part du fait que c'est un organisme eucaryote ancestral, et d'autre part dans sa proximité organisationnelle du génome avec celui des cellules eucaryotes supérieurs. De plus, il est facile à manipuler et son génome est entièrement séquence (6430 gènes répartis sur 16 chromosomes). Il est aussi bien documenté et largement utilisé comme modèle biologique dans des études de pharmacologie, de toxicologie et d'oncologie.
Cette étude a été réalisée en utilisant la souche YPH499 (MAT α ura3-52 his3-Δ200 ade2-101uaa trpl- Δ 63 lys2-801uag Ieu2- Δ 1). Les cellules ont été cultivées en milieu liquide YPD contenant 6.7 g/l de base azotée de levure et 5 g/l de sulfate d'ammonium sans acides aminés (Qbiogen, France), 2% glucose, 30 mg/l d'uracil, d'adenine, de lysine, d'histidine, de tryptophane et de leucine. La croissance s'effectue jusqu'au milieu de la phase exponentielle (DO600 = 0.4) à 30 °C, puis les cellules sont exposées à 1 mM CD2+ pendant 1 h (Fauchon et al. (2002). Molecular
Cell. 9: p713-723), récoltées, lavées deux fois dans 10 ml d'eau stérile et resuspendues dans le tampon S ( Sorbitol, tampon phosphate, et 1 μl de Mercaptoethanol). L'ajout de Zymoliase (100U/mL) dans du tampon S pendant 30 min à 30°C permet la destruction de la paroi cellulaire. L'extraction des ARNs totaux est réalisée à l'aide du TRIAZOL (Abgene®, UK). L'intégrité des ARNs est contrôlée sur gel d'agarose et par spectrophotomètre à 260 et 280 nm. Les ARNs totaux (environ 20 μg) des échantillons test et référence sont rétro-transcrits en utilisant le kit Superscript II Reverse-Transcription (Invitrogen Corporation ; Carlsbad-CA) en présence des dNTPs et d'un dNTP-biotin. Les ADNc ainsi marqués sont purifiés sur des filtres Microcon suivant les recommandations du fabriquant (Milipore Corp., Canton, Massa.).
Approche synthétique :
Deux sondes oligonucléotidiques dérivés des gènes actl et seo de la levure sont déposés au fond de chaque puits d'une plaque de microtitration. Chaque puits contient 9 et 8 spots des gènes Act et Seo, respectivement. Un signal unique et spécifique est obtenu pour chaque cible hybridée à sa sonde correspondante. Modélisation des oligonucléotides
Les sondes oligonucléotidiques de 60 mers de Saccharomyces cerevisiae, correspondant spécifiquement à chacun des 10 gènes impliqués dans le système de détoxication au cadmium, sont optimisées en utilisant un outil bio-informatique propriétaire.
Ces sondes sont chimiquement synthétisées avec une forte efficacité de couplage pour une bonne qualité.
Ces sondes de haute qualité (pureté > 95%) sont déposés au fond d'une plaque de microtitration 96 en utilisant un robot automatique comme mentionné dans l'exemple 1.
Les spots sont écartés les un des autres de 600 μm et ont un diamètre de 200 à 300 μm. Protocole expérimental
Les cibles biotynilées sont chimiquement dénaturées dans un volume n'excédant pas 3 μl. Ce volume est complété à 30 μl par du tampon d'hybridation (PBS 3X, ADN de sperme de saumon 10mg/ml Sigma®), ensuite déposé au fond du puits puis incubé à 37°C pendant 1 heure. Les puits sont ensuite lavés quatre fois avec à chaque fois 300μl du tampon de lavage (NaCI, KCI, Na2HPO4, KH2PO4, Tween 20 et EDTA). Le conjugué Streptavidine-Phosphate Alcaline est déposé à raison de 10 ng par puits puis incubé à 25°C pendant 15 minutes. Les puits sont lavés une seconde fois comme décrit ci-dessus, 50μl du substrat précipitant de la phosphatase alcaline sont ajoutés à chaque puits puis incubés à 25°C pendant 15 à 60 minutes. Cette dernière étape peut être stoppée à tout moment par ajout de 40mM d'EDTA.
Pour les échantillons in vivo, un facteur d'échelle uniforme est appliqué en supposant que la médiane arithmétique des rapports pour les gènes de ménage entre les conditions de croissance, est égal à 1 afin de normaliser les données. De plus, ce facteur de normalisation est appliqué aux autres gènes.
Résultats
Approche synthétique :
Comme observé sur la figure 9, un signal unique et spécifique est obtenu pour chaque cible hybridée à sa sonde correspondante. De plus, l'intensité du signal diminue de manière corrélée avec la quantité de cibles biotynilées hybridées de la biopuce. Quand on rassemble les données obtenues avec 340 spots, des gammes dynamiques significatives linéaires peuvent être établies pour les deux cibles avec un seuil de détection inférieur à 107 copies par essai avec une gamme dynamique d'environ 2.5 logs et des CVs intra et inter-puits inférieurs à 8% (Fig. 10). L'intensité des signaux est considérée seulement quand sa valeur est plus grande que le signal de bruit de fond plus 3 écart-types représenté par la ligne de base (Fig. 10). De plus, nous avons observé une amélioration importante de la sensibilité quand la solution de coloration est incubée pendant un long moment (résultats non montrés). L'ensemble de ces résultats suggèrent que ce test colorimétrique sur ce type de biopuce proposé avec ce format circulaire permet d'obtenir une large gamme dynamique et une très bonne sensibilité.
Approche ADNc
Les ARNms issus des cellules levures cultivées en conditions plus ou moins cadmium sont rétro-transcrits en ADNc marqués suivant le protocole décrit ci-dessus. 0.2 μg d'ADNc biotynilé est hybride aux sondes levures (correspondant aux gènes de levure impliqués dans le système de détoxication du cadmium) déposées au fond des puits de la biopuce. Comme attendu, aucun signal d'hybridation n'a été détecté pour le spot contrôle négatif en positions 14 et 16 (Fig. 11 , Panel A). Cependant, on peut constater un profil d'expression différentielle en parfait accord avec le niveau d'expression basai des gènes étudiés dans ce modèle (Holstege et al. (1998) Cell 95 :717-728, Fauchon et al. (2002). Molecular Cell. 9: p713- 723). Ainsi, nous détectons à partir de 0,2 μg d'ADNc simultanément un gène faiblement exprimé (spot : «) et un gène fortement exprimé (spot : $) (Fig. 11 , Panel A). Des changements significatifs des niveaux des ARNm sont induits par la présence du cadmium dans le milieu de culture (Fig. 11 ,
Panel B). Plusieurs rapports ont mentionné l'effet du cadmium sur le niveau d'expression des gènes (Garcia et al., 2002. J Biol Chem. 2002 (40):37359- 68, Rubinelli ét al., 2002, Planta. 215:p. 1-13.; Shin ét al., 2002. Biochim Biophys Acta. 1577: p.164-70). Nous observons ainsi une diminution de l'expression du gène yef (spot : *) parallèlement à une augmentation de l'expression des gènes gre, seo et ynl (spots : *, ≈ et es, respectivement) (Fig. 11 , Panel B). Ces résultats sont en parfait accord avec ceux rapportés par Fauchon et al. (2002. Molecular Cell. 9: p713-723). Conclusion
Le test en format circulaire basé sur une détection colorimétrique en présence du conjugué de la Phosphatase Alcaline, et comme démontré dans les deux approches quantitatives sur les deux modèles cités ci-dessus (synthétique et in vivo), est un bon outil de mesure quantitative relative pour le monitoring de l'expression de gènes (Fig 10 et 11). Il a une forte sensibilité et une grande gamme dynamique (Fig. 10), ce qui lui permet d'analyser simultanément des gènes différemment exprimés à partir d'un petit échantillon (Fig. 11 ).
EXEMPLE 6
Les anticorps monoclonaux αTSH, αFSH, αLH et αLHet α HCG (bioMérieux) sont dilués à 100 μg/ml en tampon carbonate 50 mM pH9.7 et spottés dans des plaques de microtitration blanches 96 puits selon le format de la figure 12.
1 : AcαFSH
2 : AcαFSH 3: AcαFSH 4 : AcαFSH 5: AcαTSH
6 : AcαTSH
7 : AcαTSH
8 : AcαTSH
9 : AcαLH
10 : AcαLH 11 : AcαLH
12 : AcαLH
13 : AcαHCG
14 : AcαHCG
15 : AcαHCG
16 : AcαHCG
17 : AcαFSH
Les plaques sont incubées dans des conditions contrôlées de température et de pression, puis lavées et traitées à l'aide d'une solution de PBS contenant de la BSA (0.1%) et du tréhalose (2%). Elles sont ensuite séchées et stockées. Les antigènes TSH, FSH, LH et HCG (Scripps) sont dilués en tampon PBS tween 0.1% sérum de cheval 10%. 30 μl de solution contenant les antigènes en mélange sont ajoutés dans chaque puits et incubés 1h à 37°C. Les plaques sont rincées puis on ajoute par puits 30 μl d'une solution contenant chacun des quatre anticorps monoclonaux de détection αTSH, αFSH, LH et αHCG marqués par la phosphatase alcaline (bioMérieux). Après 30 minutes d'incubation à 37°C, les puits sont rincés puis on ajoute 30μl de substrat enzymatique précipitant (BCIP-NBT, bioFx) durant 30 minutes à température ambiante. Les plaques sont ensuite analysées et les niveaux de gris sont reportés en fonction de la concentration en antigène.
Les courbes de calibration obtenues en variant la concentration en antigène sont reportées en figure 13. Les seuils de détection sont décrits dans le tableau I ci-dessous.
Tableau
Figure imgf000020_0001
Le test en format circulaire basé sur une détection colorimétrique en présence du conjugué de la phosphatase alcaline, est un bon outil de mesure quantitative des protéines.

Claims

REVENDICATIONS
1) Biopuce (1) comprenant un support (2) dont une face utile (2a) comprend une surface opératoire (3), un réseau de sites élémentaires (Xn) disposé sur ladite surface opératoire, et une multiplicité de ligands fixés chacun en nombre multiple en des sites élémentaires respectivement différents, caractérisée en ce que la face utile du support comprend ladite surface opératoire constituée par au moins une couronne opératoire (31) sur laquelle des sites élémentaires (Xn) sont distribués, et une surface non opératoire (4), pratiquement exempte de tout site élémentaire, disposée à l'intérieur ou au centre de ladite couronne opératoire.
2) Biopuce selon la revendication 1 , caractérisée en ce que sur la couronne opératoire (31), les sites élémentaires sont distribués de manière régulière, ou irrégulière
3) Biopuce selon la revendication 1 , caractérisée en ce que la surface opératoire (3) du support comprend au moins deux couronnes opératoires (31, 32) concentriques
4) Biopuce selon la revendication 1 , caractérisée en ce que un site élémentaire dit détrompeur, est disposé dans la surface non opératoire, à proximité ou du côté de la dite couronne opératoire (31)
5) Biopuce selon la revendication 1 , caractérisée en ce qu'un site élémentaire détrompeur est disposé dans la surface opératoire, à proximité ou du côté de ladite couronne opératoire (31).
6) Biopuce selon la revendication 1 , caractérisée en ce que, la surface opératoire (3) et la surface non opératoire (4) sont traitées de manière respectivement différente, vis-à-vis de la détection ou du traitement des signaux de sortie émis par des ligands marqués fixés en des sites élémentaires (Xn) respectivement différents
7) Biopuce selon la revendication 1 , caractérisée en ce que la surface opératoire (3) est en élévation (évélation) ou en dépression par rapport à la surface non opératoire (4) 8) Biopuce selon la revendication 1 , caractérisée en ce que la surface non opératoire est affectée à au moins une fonction autre que la détermination de l'espèce cible, par exemple le stockage d'un réactif
9) Biopuce pour la détermination d'au moins une espèce cible, comprenant un support (2) dont une face utile (2a) comprend un réseau de sites élémentaires (Xn), et une multiplicité de ligands fixés chacun en nombre multiple en des sites élémentaires (Xn) respectivement différents, caractérisée en ce que les sites élémentaires sont distribués sur la face utile selon au moins une ligne circulaire
10) Dispositif, par exemple à usage unique, pour la détermination d'au moins une espèce cible, compenant au moins une biopuce (1) selon l'une quelconque des revendications 1 à 9
11 ) Dispositif selon la revendication 10, par exemple plaque de micro-titration, comprenant une pluralité de puits élémentaires pour la réception d'au moins un échantillon d'intérêt, caractérisé en ce que au moins une biopuce est disposée dans undit puits, ou sur le fond d'undit puits.
12) Dispositif selon la revendication 11 , caractérisé en ce que le fond d'au moins un puits constitue directement le support de la biopuce.
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