WO2004010537A2 - Biopuce flexible - Google Patents

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WO2004010537A2
WO2004010537A2 PCT/FR2003/002287 FR0302287W WO2004010537A2 WO 2004010537 A2 WO2004010537 A2 WO 2004010537A2 FR 0302287 W FR0302287 W FR 0302287W WO 2004010537 A2 WO2004010537 A2 WO 2004010537A2
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electrodes
electrically
electronically
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WO2004010537A3 (fr
WO2004010537B1 (fr
Inventor
Marc Cuzin
Michel Guy
Philippe Cleuziat
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Apibio
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Publication date
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Priority to US10/520,105 priority patent/US20060049046A1/en
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Publication of WO2004010537A3 publication Critical patent/WO2004010537A3/fr
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54373—Apparatus specially adapted for solid-phase testing involving physiochemical end-point determination, e.g. wave-guides, FETS, gratings
    • G01N33/5438—Electrodes
    • H—ELECTRICITY
    • H01—ELECTRIC ELEMENTS
    • H01R—ELECTRICALLY-CONDUCTIVE CONNECTIONS; STRUCTURAL ASSOCIATIONS OF A PLURALITY OF MUTUALLY-INSULATED ELECTRICAL CONNECTING ELEMENTS; COUPLING DEVICES; CURRENT COLLECTORS
    • H01R12/00—Structural associations of a plurality of mutually-insulated electrical connecting elements, specially adapted for printed circuits, e.g. printed circuit boards [PCB], flat or ribbon cables, or like generally planar structures, e.g. terminal strips, terminal blocks; Coupling devices specially adapted for printed circuits, flat or ribbon cables, or like generally planar structures; Terminals specially adapted for contact with, or insertion into, printed circuits, flat or ribbon cables, or like generally planar structures
    • H01R12/50—Fixed connections
    • H01R12/59—Fixed connections for flexible printed circuits, flat or ribbon cables or like structures

Definitions

  • the present invention relates to a sensor, and more particularly a biosensor, to serve as a tool in molecular biological analysis.
  • biosensor is meant a functional unit, for single use or not, for example implemented for the purposes of molecular biological determination, arranged for and / or intended to cooperate with at least one distinct and complementary device or instrument, receiving a sample of interest, liquid or fluid, stationary or in motion, said liquid sample comprising at least one target species, in suspension or in solution, for example a biomolecule, optionally labeled; and the biosensor delivers at least one output signal in relation to the presence, and / or the nature, and / or the structure and / or the quantity of said target species.
  • biochip a small biosensor, for example of the order of a centimeter, it can be called a "biochip", according to the terminology used in the technical field concerned.
  • the biosensor comprises at least:
  • the material or material of the support is inert, and not substantially electrically conductive, in the sense that said material practically does not interact with the sample, and in particular the target species, by strong bond of the covalent chemical bond type , or by weak bond, for example hydrogen bond, other interactions of physical type, such as surface tension, not being moreover excluded;
  • the material constituting such a support is for example a plastic material, for example a thermoplastic resin, for example a polypropylene,
  • this treatment may for example consist of a coating with a layer of an electronic conductive polymer, for example modified polypyrole, according to the techniques set out in documents F 2 703 359, WO9422889, and EP0 691 978, FR 2 787 582, EP I 141 391, and WO 0036145, at the end of this treatment, a multiplicity of electrically or electronically conductive electrodes is obtained on the support, arranged on the useful face of the support according to the operating arrangement adopted, discovered, in the sense that these electrodes can be brought into contact together with the same external liquid medium, in this case the sample of interest.
  • an electronic conductive polymer for example modified polypyrole
  • a set of connections, or circuit, of electrical or electronic type, with the various elementary electrodes respectively said set of connections being arranged to connect each elementary electrode individually, independently with respect to the other elementary electrodes, for example by addressing ( confer document FR-A-2741475); a multiplicity of electrical terminals corresponding respectively to the above-mentioned electrodes, disposed on a useful face of the support, uncovered, in the sense that said terminals can be connected to the outside, electrically or electronically, independently, with respect to each other; a multiplicity of electrically or electronically conductive tracks, each running on one and / or the other face of the support, connecting the multiplicity of electrodes respectively to the multiplicity of terminals; said set of connections is therefore an electrical or electronic circuit multiplexed with electrical terminals and electrodes and counter-electrodes which are connected to them respectively; a layer of an electrically or electronically insulating material, for example a varnish, coating one and / or the other face of the support, on the one hand by covering said tracks at least in part, and
  • biosensors for example of the order of 1 mm 2 to a few cm 2 may require for their realization or production, the implementation of techniques called “micro” or “nano-technologies”, for example by lithography or micromachining.
  • the Applicant does not intend to be limited to particular dimensions, in particular of the order of ⁇ m or of nm, when it uses the term “sensor”, “biosensor”, or “biochip” in the present description and in the claims in annex, considering that the same structure or the same arrangement as that defined below can be implemented with dimensions of the order of a few mm 2 , as with much larger dimensions.
  • a biosensor as considered by the present invention cannot function autonomously, except to carry with it its own source of energy. Consequently, this biosensor is designed to cooperate, for example removably, on the one hand with external means making it possible to circulate or remain, in contact with the operating surface and the ligands, the liquid sample of interest, but also other fluids or liquids, such as washing liquid, and on the other hand with means for detecting and processing the output signal (s), the whole being generally controlled and controlled, by external electronic means, analog or computer, for example according to any processing logic or flowchart.
  • biomolecule any entity, in particular biochemical, or biological, identical to or derived from any molecular species existing in nature.
  • biopolymers for example DNA, TARN, oligo and polynucleotides, functional or structural proteins, peptides, oligo and polypeptides, polysaccharides, etc.
  • markers or “marked” is meant the characteristic according to which a marker, that is to say a substituent or residue allowing, is attached to an entity, for example the target species, covalently or otherwise, with or without the aid of an external means, such as illumination, with or without a posterior step, such as bringing into contact with a substrate, to produce a signal, previously called the output signal.
  • the preferred markers according to the present invention are:
  • Fluorophores for example fluorescein, cyanine, phycoerythrin.
  • Luminophores luminol, isoluminol, ABEI (N-4-amino-butyl-N- ethyl-isoluminol).
  • Enzymes for example oxidation of a chromogen; confer horseradish peroxidase, alkaline phosphatase.
  • determination is meant the identification, qualitative and / or quantitative, detection, description (for example sequencing), separation, or enrichment of the target species, which may be called “analyte” in the case qualitative and / or quantitative identification.
  • analyte in the case qualitative and / or quantitative identification.
  • determination any sequencing of a biomolecule of the DNA or polypeptide type.
  • the output signal (s) for the purposes of the determination may be of any suitable nature, depending on the markers used, and the type of detection required. It could be. light, visible or invisible, electrical, electro-optical, electrochemical, etc. signals. Furthermore, these signals can if necessary be detected separately, taking into account, on the one hand, the addressing of the electrodes of the biosensor, and on the other hand of the connection assembly of the electrical terminals respectively with the different electrodes present on the biosensor.
  • ligand is meant any entity, cellular, biological, or biomolecule having an affinity, specific or not, for a target species.
  • a ligand mention will be made of any oligonucleotide capable of binding by weak bonds, in this case it will be said to hybridize, with a strand of DNA (target species), comprising a sequence complementary to that of the ligand.
  • Each ligand is attached or anchored at each site or on each electrode of the biosensor, optionally after functionalization of the elementary sites of the operating surface of the support, by any appropriate means, for example chemical, by covalent bond, for example via a spacer arm, or by adsorption, absorption, etc.
  • the binding of the ligands can be carried out according to the electrochemical techniques described in documents FR 2789401, EP 1 152 821 and WO 0047317, FR2 742 451, EP 0 868 464 and WO 9722648.
  • target species any cell, biological or biochemical species capable of binding by weak bond to one or more ligands.
  • biosensors of the biochip type are tools, simple or complex, well suited to all kinds of molecular biology analysis; confer
  • DNA chips a new tool for genetic analysis and diagnostics. Mr. Cuzin. Clinical and Biological Transfusion 2001; 8: 291-6; and "How to make a DNA chip", Michael C.
  • a biosensor as described above is placed at the bottom of a well, for example a micro-titration plate, into which the liquid sample comprising the target species is introduced, stays, then is evacuated .
  • the present invention relates to a sensor, in particular a biosensor, and for example a biochip, particularly simple to manufacture or produce, and allowing the most varied implementations, for example in the wells of a microplate.
  • the multiplicity of electrodes is arranged in an extreme zone opposite to another extreme zone in which the electrical terminals are grouped together, and on the other hand the support comprises at least one flexible zone, located between the two extreme zones.
  • the entire support is flexible and made, for example, of flexible insulating material with a small thickness.
  • Flexible means in particular that the area of the same name is foldable around at least one axis having a direction perpendicular to the direction of alignment of the operating arrangement of the electrodes and the grouping of the electrical terminals.
  • the support is a flexible sheet or plate of insulating material.
  • the purely electrical zone of the sensor is offset from its active zone, that is to say that comprising and gathering the electrodes, on which the ligands are respectively fixed, and this allowing n ' any relative position between the two end zones comprising the electrical terminals and the electrodes respectively, thanks to the flexibility of the support, at least in its intermediate zone between the two said end zones.
  • the electrodes can be soaked in a liquid solution, while the electrical terminals are in the open air and / or dry. This makes it possible, under excellent technical or practical conditions: - addressing the ligands in an extreme zone, with a measurement by electrical detection in another extreme zone,
  • the offset between the extreme zones makes it possible to have a sensor according to the invention, in each well, with its active zone, that is to say that comprising the electrodes at bottom of said well and its electrical zone, that is to say that comprising the electrical terminals, as a peripheral, for example on the edge of the microplate.
  • a sensor according to the present invention makes it possible to manufacture and implement biochips according to an approach totally different from the traditional approach, by:
  • each biochip cut in the place of its use for example at the bottom of a well of a micro-titration plate, by adapting to the conformation of the place of use.
  • FIG. 1 represents on an enlarged scale a biosensor of the biochip type, according to the present invention
  • FIG. 2 represents a sectional view along line II / II of the figure
  • FIGS. 3 and 4 respectively represent two other embodiments of the present invention
  • FIG. 5 represents a detail, (at the left end according to the representation of the Figure 2), of another embodiment of the present invention.
  • an electrically or electronically insulating material for example a varnish
  • the multiplicity of electrodes (4) is arranged in a zone (la) opposite to a zone (lb) in which the multiplicity of electrical terminals (5) are grouped together, and on the other hand the support (2), because of the flexibility or suppleness of the insulating material used, is arranged to be flexible at least in an intermediate zone (le), at least around at least an axis having a direction perpendicular to the direction of alignment of the operating arrangement of the electrodes (31 and 32) in the area (la), and of the grouping of the electrical terminals (5) in the area (lb).
  • Each assembly composed of an electrode (31) and an electrode (32) can be seen as a single electrode comprising two adjacent heads, connected to each other.
  • another electrically or electronically conductive track (7) travels on the other face (2b) of the support (2), from another electrical terminal (8) arranged on the face (2b) of the support thus made useful; this terminal (8) is discovered to be connected to a potential of reference, and one end (8 a) of the track (7) is covered with a layer (9) of the electronically insulating material, for example a varnish.
  • electrically or electronically conductive pass between, respectively two other electrical terminals (8 and 11), to be connected to a reference potential, disposed respectively on one (2a) and the other (2b) faces of the support (2), and respectively two ends (8a) and (10a), each covered with electrically or electronically insulating material, for example a varnish.
  • the track (7) and or the track (10) thus described can be assigned to the electric shielding of the arrangement of the electrodes (31 and 32), in order to guard against electromagnetic radiation disturbing the addressing signals or of measurement.
  • at least one electrical terminal (4) is disposed on the other face (2b) of the support (2), a face also useful within the meaning of the present invention, and the track (5) which corresponds to it crosses the thickness of the support (2).
  • This arrangement allows electrical contact to be made on the side opposite the stud (31), so that the latter possibly in contact with a liquid is electrically accessible in an area outside said liquid.
  • a plurality of ligands are each fixed in multiple number, on the electrodes (31 and / or 32), respectively different.
  • Example A sensor according to the invention, or “flexo-chip”, is implemented, before or after addressing, or before or after hybridization, as shown diagrammatically in FIG. 6, with the following reference numbers: 1) sensor
  • a flexo-chip according to the invention is addressed as follows: - a flexo-chip (1) is immersed in a copolymerization solution (21) containing 20 mM of pyrrole and 1 ⁇ M of pyrrole-ODNl (1 pyrrole-ODN unit for 20,000 pyrrole units). A potential of + 1N / DHW is applied for a time t necessary to pass a quantity of charge equal to 2.7 mC.cm "2 per stud,
  • the flexo-chip (1) is immersed in a solution (21) containing the same pyrrole / pyrrole-OD ⁇ molar ratio but with a different OD ⁇ (OD ⁇ 2),
  • nucleotide sequences of the deposited probes are by way of example:
  • ODN 5 SE01-1262P TT ⁇ TTTTTTGTATGGTTTATTTGATGCTTACTGGTATTATTGCAGATAAATTACACTCT
  • ODN 6 YDR411C-894P TTTTTTTTTTGTCTCAAACCAGTGGCACAGATTCAGGCAGAGCTTCTGGAAGTCAATTAA
  • ODN 7 YEF3-2800P T TTTTTTTTGCTTTGTCTAAGGCTTTGAAGGAATTTGAAGGTGGTGTTATTATCATTAC '
  • ODN 8 YNL208 -542P TTTTTTTTTTCCTCAGGAA ⁇ TCGGGGGCCAAGGTCGTCAAGGATTCAATGGCGGTTCACG

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Abstract

Capteur (1), en particulier biocapteur, comprenant: un support (2) isolant électrique ou électronique, comprenant au moins une face utile (20), une multiplicité d'électrodes (31, 32) électriquement ou électroniquement conductrices, disposées sur la face utile (2a) du support selon tout arrangement opératoire prédéterminé, découvertes, au sens où lesdites électrodes peuvent être mises au contact ensemble avec un même milieu extérieur, par exemple liquide, une multiplicité de bornes électriques (4) correspondant respectivement auxdites électrodes (4), disposées sur une face utile (2a, 2b) du support, découvertes, au sens où lesdites bornes peuvent être connectées à l'extérieur, électriquement ou électroniquement, de manière indépendante les unes par rapport aux autres, une multiplicité de pistes (5) électriquement ou électroniquement conductrices, cheminant chacune sur l'une (2a) et/ou l'autre face (2b) du support, reliant la multiplicité d'électrodes (31, 32) respectivement à la multiplicité de bornes (4), une couche (6) d'un matériau électriquement ou électroniquement isolant, revêtissant l'une (2a) et/ou l'autre (2b) faces du support (2), d'une part en recouvrant au moins en partie lesdites pistes (5), et d'autre part en découvrant et les électrodes (31, 32) et les bornes (5), caractérisé en ce que, en combinaison, d'une part la multiplicité d'électrodes (4) est disposée dans une zone extrême (1a) à l'opposé d'une autre zone extrême dans laquelle des bornes (5) électriques sont regroupées ensemble, et d'autre part le support (2) comporte au moins une zone flexible (1c), située entre les deux zones extrêmes.

Description

BIOPUCE FLEXIBLE
La présente invention concerne un capteur, et plus particulièrement un biocapteur, pour servir d'outil en analyse biologique moléculaire. Par « biocapteur », on entend un ensemble fonctionnel, à usage unique ou non, par exemple mis en œuvre aux fins d'une détermination biologique moléculaire, agencé pour et/ou destiné à coopérer avec au moins un appareil ou instrument distinct et complémentaire, recevant un échantillon d'intérêt, liquide ou fluide, immobile ou en mouvement, ledit échantillon liquide comprenant au moins une espèce cible, en suspension ou en solution, par exemple une biomolécule, éventuellement marquée ; et le biocapteur délivre au moins un signal de sortie en relation avec la présence, et/ou la nature, et/ou la structure et/ou la quantité de ladite espèce cible. S'agissant d'un biocapteur de petite taille, par exemple de l'ordre du centimètre, celui-ci peut être appelé « biopuce », selon la terminologie retenue dans le domaine technique concerné. Le biocapteur comprend au moins :
- un support comportant une face utile comprenant une surface opératoire au contact de l'échantillon ; le matériau ou la matière du support est inerte, et non substantiellement conducteur de l'électricité, au sens où ledit matériau n'interagit pratiquement pas avec l'échantillon, et en particulier l'espèce cible, par liaison forte du type liaison chimique covalente, ou par liaison faible, par exemple liaison hydrogène, d'autres interactions de type physique, telles que tension superficielle, n'étant pas par ailleurs exclues ; le matériau constitutif d'un tel support est par exemple une matière plastique, par exemple une résine thermoplastique, par exemple un polypropylène,
- un arrangement opératoire de sites élémentaires distribués de manière prédéterminée sur la surface opératoire, chaque site élémentaire étant adressé, c'est-à- dire identifié par des coordonnées qui lui sont uniques ; ces sites élémentaires sont eux- mêmes éventuellement traités pour former des électrodes, en vue de la fixation ou de l'ancrage des ligands, dont il sera question ci-après ; ce traitement peut par exemple consister en un revêtement avec une couche d'un polymère conducteur électronique, par exemple polypyrole modifié, selon les techniques exposées dans les documents F 2 703 359, WO9422889, et EP0 691 978, FR 2 787 582, EP I 141 391, et WO 0036145, au terme de ce traitement, on obtient sur le support une multiplicité d'électrodes électriquement ou électroniquement conductrices, disposées sur la face utile du support selon l'arrangement opératoire retenu, découvertes, au sens où ces électrodes peuvent être mises au contact ensemble avec un même milieu liquide extérieur, en l'occurrence l'échantillon d'intérêt. - un ensemble de connexions, ou circuit, de type électrique ou électronique, avec respectivement les différentes électrodes élémentaires, ledit ensemble de connexions étant agencé pour relier individuellement chaque électrode élémentaire, de manière indépendante par rapport aux autres électrodes élémentaires, par exemple par adressage (conférer le document FR- A- 2741475) ; une multiplicité de bornes électriques correspondant respectivement aux électrodes précitées, disposées sur une face utile du support, découvertes, au sens où lesdites bornes peuvent être connectées à l'extérieur, électriquement ou électroniquement, de manière indépendante, les unes par rapport aux autres ; une multiplicité de pistes électriquement ou électroniquement conductrices, cheminant chacune sur l'une et/ou l'autre face du support, reliant la multiplicité d'électrodes respectivement à la multiplicité de bornes ; ledit ensemble de connexions est donc un circuit électrique ou électronique multiplexe de bornes électriques et d'électrodes et contre-électrodes qui leur sont connectées respectivement ; - une couche d'un matériau électriquement ou électroniquement isolant, par exemple un vernis, revêtissant l'une et/ou l'autre face du support, d'une part en recouvrant au moins en partie lesdites pistes, et d'autre part en découvrant, et les électrodes et les bornes.
Les dimensions de ces biocapteurs, par exemple de l'ordre de 1 mm2 à quelques cm2 peuvent requérir pour leur réalisation ou production, la mise en œuvre de techniques dites « micro » ou « nano-technologies », par exemple par lithographie ou micro-usinage.
Mais la Demanderesse n'entend pas être limitée à des dimensions particulières, notamment de l'ordre du μm ou du nm, lorsqu'elle utilise le terme « capteur », « biocapteur », ou « biopuce » dans la présente description et dans les revendications en annexe, considérant que la même structure ou le même agencement que celui défini ci-après peut être mis en œuvre avec des dimensions de l'ordre de quelques mm2, comme avec des dimensions beaucoup plus importantes.
Bien entendu, un biocapteur tel que considéré par la présente invention ne peut fonctionner de manière autonome, sauf à embarquer avec lui sa propre source d'énergie. Par conséquent, ce biocapteur est agencé pour coopérer, par exemple de façon amovible, d'une part avec des moyens extérieurs permettant de faire circuler ou séjourner, en contact de la surface opératoire et des ligands, l'échantillon liquide d'intérêt, mais aussi d'autres fluides ou liquides,tels que liquide de lavage, et d'autre part avec des moyens de détection et de traitement du ou des signaux de sortie, le tout étant en général contrôlé et commandé, par des moyens électroniques extérieurs, analogiques ou informatiques, par exemple selon toute logique ou organigramme de traitement.
Par « biomolécule », on entend toute entité, en particulier biochimique, ou biologique, identique à ou dérivée de toute espèce moléculaire existant dans la nature. Au rang des biomolécules considérées par la présente invention, on peut citer certains biopolymères, par exemple l'ADN, TARN, les oligo et polynucléotides, les protéines fonctionnelles ou structurales, les peptides, les oligo et polypeptides, les polysaccharides, etc.
Par « marquage » ou « marqué », on entend la caractéristique selon laquelle on fixe sur une entité, par exemple l'espèce cible, de manière covalente ou autre, un marqueur, c'est-à-dire un substituant ou reste permettant, avec ou sans l'aide d'un moyen extérieur, tel qu'illumination, avec ou sans étape postérieure, telle que mise en contact avec un substrat, de produire un signal, dit précédemment signal de sortie. Les marqueurs préférés selon la présente invention sont :
- Les haptènes, par exemple la biotine fixant le conjugué streptavidine- phycoérythrine.
- Les fluorophores : par exemple fluorescéine, cyanine, phycoérythrine.
- Les luminophores : luminol, isoluminol, ABEI (N-4-amino-butyl-N- éthyl-isoluminol).
- Les enzymes : par exemple d'oxydation d'un chromogène ; conférer peroxydase de raifort, phosphatase alcaline.
Par « détermination », on entend l'identification, qualitative et/ou quantitative, la détection, la description (par exemple séquençage), la séparation, ou l'enrichissement de l'espèce cible, pouvant être appelée « analyte » dans le cas d'une identification qualitative et/ou quantitative. Ressort selon la présente invention de l'expression « détermination », tout séquençage d'une biomolécule du type ADN ou polypeptide.
Le ou les signaux de sortie aux fins de la détermination peuvent avoir toute nature appropriée, en fonction des marqueurs mis en œuvre, et du type de détection requis. Il peut s'agir. de signaux lumineux, visibles ou invisibles, électriques, électro-optiques, électrochimiques, etc.... Par ailleurs, ces signaux peuvent le cas échéant être détectés séparément, compte tenu, d'une part de l'adressage des électrodes du biocapteur, et d'autre part de l'ensemble de connexion des bornes électriques respectivement avec les différentes électrodes présentes sur le biocapteur. Par « ligand », on entend toute entité, cellulaire, biologique, ou biomolécule ayant une affinité, spécifique ou non, pour une espèce cible. Affinité exprimant qu'il se forme, dans les conditions (notamment température, pH, force ionique, etc.) de la mise en contact de l'espèce cible avec le ligand, un appariement ou complexe stable entre ladite espèce cible et ledit ligand. A titre d'exemple de ligand, on citera tout oligonucléotide susceptible de se lier par liaisons faibles, on dira dans ce cas de s'hybrider, avec un brin d'ADN (espèce cible), comportant une séquence complémentaire avec celle du ligand.
Chaque ligand est attaché ou ancré en chaque site ou sur chaque électrode du biocapteur, éventuellement après fonctionnalisation des sites élémentaires de la surface opératoire du support, par tout moyen approprié, par exemple chimique, par liaison covalente, par exemple par l'intermédiaire d'un bras espaceur, ou par adsorption, absorption, etc.
S 'agissant de sites élémentaires revêtus comme indiqué précédemment avec un polymère de type polypyrole modifié ou polythiophène, et électriquement adressés, la fixation des ligands peut être effectuée selon les techniques électrochimiques décrites par les documents FR 2789401, EP 1 152 821 et WO 0047317, FR2 742 451, EP 0 868 464 et WO 9722648.
Par espèce cible, on entend toute espèce cellulaire, biologique, ou biochimique, susceptible de se lier par liaison faible à un ou plusieurs ligands.
S'agissant d'un biocapteur du type biopuce, en l'état actuel du secteur technique considéré, on peut distinguer deux voies d'obtention de ligands respectivement différents, fixés chacun en nombre multiple respectivement sur les différentes électrodes : - une voie in situ, qui consiste, par une série d'opérations successives, incrémentées, à synthétiser sur la surface opératoire elle-même, les différents ligands, ensemble, motif élémentaire par motif élémentaire, par exemple mer par mer, à partir d'un premier motif fixé en différents sites élémentaires, et ce dans l'ordre des séquences respectivement retenues pour les différents ligands ; à cet égard, on se référera aux documents FR 2703359, EP 0 691 978, et WO 9422889 ; US 5 744 305, US 6 015 880, WO 9525116, et EP 0 750 629,
- et une voie ex situ, qui consiste à synthétiser ou obtenir les ligands respectivement différents en dehors de la surface opératoire, et à fixer les différents ligands chacun en nombre multiple, dans leurs sites élémentaires respectivement différents par activation électrique différenciée, car adressée, desdits sites élémentaires; conférer les documents FR 2703359, EP 0 691 978, et WO9422889 ; WO 0151689, US 6 090 933.
Aujourd'hui, les biocapteurs du type biopuces sont des outils, simples ou complexes, bien adaptés à toutes sortes d'analyse de biologie moléculaire ; conférer
"DNA chips : a new tool for genetic analysis and diagnostics". M. Cuzin. Transfusion clinique et Biologique 2001 ; 8:291-6 ; et "How to make a DNA chip", Michael C.
Pirrung, Angew. Chem. Int. Ed 2002.41, 1276-1289.
De manière générale, un biocapteur tel que décrit précédemment est disposé au fond d'un puits, par exemple d'une plaque de micro-titration, au sein duquel l'échantillon liquide comprenant l'espèce cible est introduit, séjourne, puis est évacué.
La présente invention a pour objet un capteur, en particulier un biocapteur, et par exemple une biopuce, particulièrement simples à fabriquer ou réaliser, et permettant les mises en œuvre les plus variées, par exemple dans les puits d'une micro- plaque.
Selon la présente invention, d'une part la multiplicité d'électrodes est disposée dans une zone extrême à l'opposé d'une autre zone extrême dans laquelle les bornes électriques sont regroupées ensemble, et d'autre part le support comporte au moins une zone flexible, située entre les deux zones extrêmes. Préférentiellement, la totalité du support est flexible et réalisée par exemple en matériau isolant souple sous faible épaisseur.
Flexible veut dire en particulier que la zone du même nom est pliable autour d'au moins un axe ayant une direction perpendiculaire à la direction d'alignement de l'arrangement opératoire des électrodes et du regroupement des bornes électriques.
Préférentiellement, le support est une feuille ou plaque souple en matériau isolant.
Grâce à la présente invention, la zone purement électrique du capteur se trouve déportée par rapport à sa zone active, c'est-à-dire celle comportant et rassemblant les électrodes, sur lesquelles les ligands sont respectivement fixés, et ce en permettant n'importe quelle position relative entre les deux zones extrêmes comportant respectivement les bornes électriques et les électrodes, grâce à la flexibilité du support, au moins dans sa zone intermédiaire entre les deux dites zones extrêmes.
Ainsi, les électrodes peuvent être trempées dans une solution liquide, alors que les bornes électriques sont à l'air libre et/ou au sec. Ceci permet de réaliser, dans d'excellentes conditions techniques ou pratiques : - l'adressage des ligands dans une zone extrême, avec une mesure par détection électrique dans une autre zone extrême,
- un contrôle qualité au cours des étapes d'adressage des sondes ou ligands sur leurs électrodes respectives, et d'hybridation (appariement des ligands fixes sur le support avec la ou les espèces cibles d'intérêt), par exemple par mesure de l'impédance en chaque site de liaison ; la mesure de l'impédance est différence en chaque site, selon qu'il est non adressé, adressé, non hybride, ou hybride,
- s'agissant d'une micro-plaque de titration, le déport entre les zones extrêmes permet de disposer un capteur selon l'invention, dans chaque puits, avec sa zone active, c'est-à-dire celle comportant les électrodes au fond dudit puits et sa zone électrique, c'est-à-dire celle comportant les bornes électriques, en périphérique, par exemple sur le bord de la micro-plaque.
Et un capteur selon la présente invention permet de fabriquer et mettre en œuvre des biopuces selon une approche totalement différente de l'approche traditionnelle, en :
- fabricant les biopuces sur un seul et même support flexible, puis en procédant à la découpe,
- reportant chaque biopuce découpée dans l'endroit de son utilisation, par exemple au fond d'un puits d'une plaque de micro-titration, en s'adaptant à la conformation de l'endroit d'utilisation.
La présente invention est maintenant décrite par référence au dessin annexé dans lequel : la figure 1 représente à échelle agrandie un biocapteur du type biopuce, selon la présente invention, - la figure 2 représente une vue en coupe selon la ligne II/II de la figure
1, à caractère schématique, de la biopuce représentée à la figure 1, les figures 3 et 4 représentent respectivement deux autres modes de réalisation de la présente invention, la figure 5 représente un détail, (à l'extrémité gauche selon la représentation de la figure 2), d'exécution d'un autre mode de réalisation de la présente invention.
Conformément aux figures 1 et 2, un capteur (1), en particulier un biocapteur selon la présente invention comprend : un support (2) isolant électrique ou électronique, par exemple obtenu en polyimide, comprenant une face utile (2a) correspondant à la face supérieure et une autre face (2b), pouvant être utilisé, correspondant à la face intérieure, une multiplicité d'électrodes (31, 32), chaque électrode (31) étant reliée à une électrode (32), ou comportant au moins deux têtes (31), (32) adjacentes reliées entre elles, électriquement ou électroniquement conductrices, disposées sur la face utile (2a) du support, selon tout arrangement opératoire prédéterminé, découvertes, au sens où lesdites électrodes peuvent être mises au contact ensemble avec un même milieu extérieur, par exemple un échantillon liquide d'intérêt, une multiplicité de bornes électriques (4) correspondant respectivement aux électrodes (31) disposées sur une face utile (2a, ou 2b) du support
(2), découvertes, au sens où ces bornes peuvent être connectées à l'extérieur électriquement ou électroniquement de manière indépendante les unes par rapport aux autres, une multiplicité de pistes (5) électriquement ou électroniquement conductrices, réalisées par exemple dans un alliage de nickel et d'or ou d'un alliage de cuivre et d'or, cheminant chacune sur l'une (2a) et/ou l'autre (2b) faces du support (2), reliant la multiplicité d'électrodes (31 et 32), respectivement à la multiplicité des bornes
(4), une couche (6) d'un matériau électriquement ou électroniquement isolant, par exemple un vernis, couvrant l'une (2a) et/ou l'autre (2b) faces du support (2), d'une part en recouvrant au moins en partie, sinon en totalité les pistes (5), et d'autre part en découvrant et les électrodes (31, 32) et les bornes (5).
Selon l'invention, en combinaison, d'une part la multiplicité d'électrodes (4) est disposée dans une zone (la) à l'opposé d'une zone (lb) dans laquelle la multiplicité des bornes (5) électriques sont regroupées ensemble, et d'autre part le support (2), du fait de la flexibilité ou souplesse du matériau isolant mis en œuvre, est agencé pour être flexible au moins dans une zone intermédiaire (le), au moins autour d'au moins un axe ayant une direction perpendiculaire à la direction d'alignement de l'arrangement opératoire des électrodes (31 et 32) dans la zone (la), et du regroupement des bornes électriques (5) dans la zone (lb).
Chaque ensemble composé d'une électrode (31) et d'une électrode (32) peut être vu comme une seule et même électrode comportant deux têtes adjacentes, reliées entre elles.
Conformément au mode d'exécution de la figure (3), une autre piste (7) électriquement ou électroniquement conductrice chemine sur l'autre face (2b) du support (2), à partir d'une autre borne électrique (8) disposée sur la face (2b) du support ainsi rendu utile ; cette borne (8) est découverte pour être reliée à un potentiel de référence, et une extrémité (8 a) de la piste (7) est recouverte d'une couche (9) du matériau électroniquement isolant, par exemple un vernis.
Bien entendu, la disposition décrite précédemment pourrait être mise en oeuvre sur la face utile (2a). Conformément au mode d'exécution de la figure 4, deux autre pistes (7) et
(10), électriquement ou électroniquement conductrices, cheminent entre, respectivement deux autre bornes électriques (8 et 11), pour être reliée à un potentiel de référence, disposées respectivement sur l'une (2a) et l'autre (2b) faces du support (2), et respectivement deux extrémités (8a) et (10a), recouvertes chacune du matériau électriquement ou électroniquement isolant, par exemple un vernis.
La piste (7) et ou la piste (10) ainsi décrites, peuvent être affectées au blindage électrique de l'arrangement des électrodes (31 et 32), afin de se prémunir contre les rayonnements électro-magnétiques perturbant les signaux d'adressage ou de mesure. Comme montré à la figure 5 au moins une borne électrique (4) est disposée sur l'autre face (2b) du support (2), face également utile au sens de la présente invention, et la piste (5) qui lui correspond traverse l'épaisseur du support (2). Cette disposition permet une prise de contact électrique du côté opposé au plot (31), de telle sorte que ce dernier éventuellement en contact avec un liquide soit électriquement accessible dans une zone en dehors dudit liquide.
S'agissant d'un biocapteur, du type biopuce, une pluralité de ligands sont fixés chacun en nombre multiple, sur les électrodes (31 et/ou 32), respectivement différentes.
Exemple Un capteur selon l'invention, ou "flexo-puce", est mis en œuvre, avant ou après adressage, ou avant ou après hybridation, comme représenté schématiquement à la figure 6, avec les références numériques suivantes : 1) capteur
20, 21) contenant dans lequel est disposé un liquide (21) 22) électrode de référence
23) potentiostat
24) organe de commande et contrôle
25) boîtier d'alimentation
26) masse 27) contre-électrode.
Une flexo-puce selon l'invention est adressée comme suit : - on plonge une flexo-puce (1) dans une solution (21) de copolymérisation contenant 20 mM de pyrrole et 1 μM de pyrrole-ODNl (1 unité pyrrole-ODN pour 20 000 unités pyrrole). On applique un potentiel de +1N/ECS pendant un temps t nécessaire pour faire passer une quantité de charge égale à 2,7 mC.cm"2 par plot,
- on sort la flexo-puce (1) et la rince à l'eau désionisée si l'on désire adresser les autres plots par un autre ODΝ, (ODΝ = oligonucléotide),
- ensuite on replonge la flexo-puce (1) dans une solution (21) contenant le même ratio molaire pyrrole/pyrrole-ODΝ mais avec un ODΝ différent (ODΝ2),
- on recommence ces manipulations n fois le nombre de plots (31-32) jusqu'à ce qu'ils soient tous adressés.
Les séquences nucléotidiques des sondes déposées sont à titre d'exemple :
0DN 1 ACT-908P TTTTTTTTTTCTCCACCACTGCTGAAAGAGAAATTGTCCGTGTCATCAAGGAAAAACTAT
0DN 2 GRE1-88P TTTTTTTTTTAGACAACAGCGTCATGAAAAACATCAACAGAGGGAATTCAGGAATCAAGG
ODN 3 KRR1-456P T τTTTTTTTTTTAAAGGCTTTGGAACTTCTAACTAAATGTTACATTCTAGTACAAGGTA
ODN 4 RPS31-246P
ODN 5 SE01-1262P TT ΓTTTTTTGTATGGTTTATTTGATGCTTACTGGTATTATTGCAGATAAATTACACTCT
ODN 6 YDR411C-894P TTTTTTTTTTGTCTCAAACCAGTGGCACAGATTCAGGCAGAGCTTCTGGAAGTCAATTAA
ODN 7 YEF3-2800P T TTTTTTTTGCTTTGTCTAAGGCTTTGAAGGAATTTGAAGGTGGTGTTATTATCATTAC '
ODN 8 YNL208 -542P TTTTTTTTTTCCTCAGGAAτTCGGGGGCCAAGGTCGTCAAGGATTCAATGGCGGTTCACG

Claims

REVENDICATIONS
1. Capteur (1), en particulier biocapteur, comprenant :
- un support (2) isolant électrique ou électronique, comprenant au moins une face utile (20),
- une multiplicité d'électrodes (31, 32) électriquement ou électroniquement conductrices, disposées sur la face utile (2a) du support selon tout arrangement opératoire prédéterminé, découvertes, au sens où lesdites électrodes peuvent être mises au contact ensemble avec un même milieu extérieur, par exemple liquide,
- une multiplicité de bornes électriques (4) correspondant respectivement auxdites électrodes (4), disposées sur une face utile (2a, 2b) du support, découvertes, au sens où lesdites bornes peuvent être connectées à l'extérieur, électriquement ou électroniquement, de manière indépendante les unes par rapport aux autres, - une multiplicité de pistes (5) électriquement ou électroniquement conductrices, cheminant chacune sur l'une (2a) et/ou l'autre face (2b) du support, reliant la multiplicité d'électrodes (31, 32) respectivement à la multiplicité de bornes
(4),
- une couche (6) d'un matériau électriquement ou électroniquement isolant, revêtissant l'une (2a) et/ou l'autre (2b) faces du support (2), d'une part en recouvrant au moins en partie lesdites pistes (5), et d'autre part en découvrant et les électrodes (31, 32) et les bornes (5), caractérisé en ce que, en combinaison, d'une part la multiplicité d'électrodes (4) est disposée dans une zone extrême (la) à l'opposé d'une autre zone extrême dans laquelle des bornes (5) électriques sont regroupées ensemble, et d'autre part le support (2) comporte au moins une zone flexible (le), située entre les deux zones extrêmes.
2. Capteur selon la revendication 1, caractérisé en ce que la totalité du support est flexible.
3. Capteur selon la revendication 1, caractérisé en ce que la zone flexible est pliable autour d'au moins un axe ayant une direction perpendiculaire à la direction d'alignement de l'arrangement opératoire des électrodes (31, 32) et du regroupement des bornes électriques (5).
4. Capteur selon la revendication 1, caractérisé en ce que le support (2) est une feuille souple en matériau isolant.
5. Capteur selon la revendication 1, caractérisé en ce que chaque électrode comporte au moins deux têtes (31, 32) adjacentes reliées entre elles.
6. Capteur selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'au moins une autre piste (7) électriquement ou électroniquement conductrice chemine sur l'une (2a) et/ou l'autre (2b) faces du support, entre une autre borne (8) électrique disposée sur une face utile (2b) du support, découverte pour être reliée à un potentiel de référence, et une extrémité (8a) recouverte d'une couche (9) du matériau électriquement ou électroniquement isolant.
7. Capteur selon la revendication 6, caractérisé en ce que ladite autre piste (7) conductrice est affectée au blindage de l'arrangement des électrodes (31, 32).
8. Capteur selon la revendication 6, caractérisé en ce que deux autres pistes (7, 10) électriquement ou électroniquement conductrices cheminent, entre deux autres bornes électriques (8, 11), pour être reliée à un potentiel de référence, disposées respectivement sur l'une (2a) et l'autre (2b) face du support, et respectivement deux extrémités (8a, 10a) recouvertes chacune d'une couche (9, 12) du matériau électriquement ou électroniquement isolant.
9. Capteur selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'au moins une borne électrique (4) est disposée sur l'autre face (2b) du support, également utile, et la piste (5) qui lui correspond traverse l'épaisseur du support (2).
10. Biocapteur selon la revendication 1, du type biopuce, caractérisé en ce qu'une pluralité de ligands sont fixés chacun en nombre multiple, sur des électrodes (31 ,32) respectivement différentes.
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