DE60225157T2 - Gerät das die freigabe von nukleotiden während einer reaktion steuert - Google Patents

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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Gebiete der molekularen Biologie und der Genomik. Genauer betrifft die offenbarte Vorrichtung die Nukleinsäuresequenzierung.
  • ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK
  • Das Erscheinen des Human-Genom-Projekts machte die Entwicklung von verbesserten Verfahren zum Sequenzieren von Nukleinsäuren wie DNS (Desoxyribonukleinsäure) und RNS (Ribonukleinsäure) notwendig. Genetische Information wird in Form von sehr langen DNS-Molekülen gespeichert, die in Chromosome organisiert sind. Die dreiundzwanzig Chromosomenpaare im menschlichen Genom enthalten ungefähr drei Billion DNS-Sequenzbasen. Diese DNS-Sequenzinformation bestimmt eine Vielzahl von Eigenschaften jedes Individuums wie Größe, Augenfarbe und Ethnizität. Viele verbreitete Krankheiten wie Krebs, zystische Fibrose, Sichelzellenanämie und Muskeldystrophie beruhen mindestens teilweise auf Variationen in der DNS-Sequenz.
  • Die Bestimmung der gesamten Sequenz des menschlichen Genoms hat eine Grundlage zur Identifizierung der genetischen Basis solcher Krankheiten geschaffen. Jedoch ist es noch ein weiter Weg, um die genetischen Variationen zu identifizieren, die mit jeder Krankheit in Verbindung stehen. Dies würde eine DNS-Sequenzierung von Abschnitten von Chromosomen in Individuen oder Familien erfordern, die jeweils solch eine Krankheit haben, um spezifische Ver änderungen in der DNS-Sequenz zu identifizieren, welche die Krankheit begünstigen. Die RNS, ein Zwischenmolekül, das zur Verarbeitung von genetischer Information erforderlich ist, kann in einigen Fällen auch sequenziert werden, um die genetischen Grundlagen verschiedener Krankheiten zu identifizieren.
  • Existierende Verfahren zur Nukleinsäuresequenzierung, die auf der Erkennung von fluoreszent markierten Nukleinsäuren beruhen, die nach Größe getrennt worden sind, sind durch die Länge der Nukleinsäure, die sequenziert werden kann, eingeschränkt. In der Regel können nur 500 bis 1.000 Basen einer Nukleinsäuresequenz gleichzeitig bestimmt werden. Dies ist viel kürzer als die Länge der funktionellen DNS-Einheit, die als ein Gen bezeichnet wird, das eine Länge von Zehn- oder sogar Hunderttausenden von Basen haben kann. Mit Hilfe derzeitiger Verfahren erfordert die Bestimmung einer kompletten Gensequenz, dass viele Kopien des Gens erzeugt, in sich überschneidende Fragmente geschnitten und sequenziert werden, wonach die sich überschneidenden DNS-Sequenzen zu dem kompletten Gen zusammengefügt werden können. Dieses Verfahren ist mühsam, kostenintensiv, uneffizient und zeitaufwendig.
  • WO 00/070073 beschreibt ein Verfahren zum Sequenzieren eines Zielnukleinsäure-Moleküls durch Messen der zeitlichen Reihenfolge von Basenzugaben während einer Polymerisationsreaktion in Echtzeit. Die Sequenz wird durch Identifizieren derjenigen Base, die in den wachsenden komplementären Strang der Zielnukleinsäure aufgenommen wird, abgeleitet. Jedes Nukleotidanalogon, das als Folge der Polymerisation hinzugefügt wird, wird identifiziert. Markierte Nukleotidanaloga werden beschrieben, um zu bestimmen, welche Art von Nukleotidanalogon zu dem Sequenzierungsprimer hinzugefügt wurde. Nukleotidanaloga, die fluoreszierende Einheiten tragen, werden beschrieben, wie Raman-Signal erzeugende Einheiten. Ein durch Nanotechnologie hergestelltes System wird beschrieben, das Reservoirs von Reagenzien, einschließlich dATP-, dCTP-, dGTP- und dUPT-Reagenzien aufweist.
  • Die vorliegende Erfindung ist in Anspruch 1 definiert. Im Folgenden wird eine Vorrichtung gemäß einer Ausführungsform der Erfindung mit Bezug auf 1 beschrieben. Ferner werden zu Erläuterungszwecken Verfahren beschrieben, welche die vorliegende Erfindung nach den Ansprüchen nicht verkörpern.
  • KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • Die folgenden Zeichnungen sind Teil der vorliegenden Spezifikation und sind aufgenommen worden, um bestimmte Ausführungsformen weiter darzustellen. Diese Ausführungsformen sind besser mit Bezug auf eine oder mehrere dieser Zeichnungen in Kombination mit der ausführlichen Beschreibung der hierin vorgestellten spezifischen Ausführungsformen zu verstehen.
  • 1 zeigt eine beispielhafte Vorrichtung 10 (nicht maßstabsgetreu) und ein Verfahren zur DNS-Sequenzierung, in dem eine Nukleinsäure 13 durch Überwachen der Aufnahme von Nukleotidvorläufern 17 aus einer Lösung während der Nukleinsäuresynthese sequenziert wird.
  • BESCHREIBUNG VON ERLÄUTERNDEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
  • Die offenbarten Verfahren, Zusammensetzungen und Vorrichtungen dienen der Verwendung zum schnellen, automatisierten Sequenzieren von Nukleinsäuren 13. In bestimmten Ausführungsformen, sind die Verfahren, Zusammensetzungen und Vorrichtungen geeignet, um die Sequenzen von sehr langen Molekülen der Nukleinsäuren 13 mit einer Länge von mehr als 1.000, mehr als 2.000, mehr als 5.000, mehr als 10.000, mehr als 20.000, mehr als 50.000, mehr als 100.000 oder sogar mehr Basen zu erhalten. In verschiedenen Ausführungsformen kann solche Sequenzinformation während des Ablaufens eines einzigen Sequenzierungslaufes mittels eines Moleküls der Matrizennukleinsäure 13 erhalten werden. In anderen Ausführungsformen kann eine Vielzahl von Kopien der Matrizennukleinsäure 13 parallel oder sequentiell sequenziert werden, um die Sequenz der Nukleinsäure 13 zu bestätigen oder vollständige Sequenzdaten zu erhalten. In alternativen Ausführungsformen können sowohl der Matrizenstrang 13 als auch sein komplementärer Strang sequenziert werden, um die Genauigkeit der Sequenzinformation zu bestätigen. Zu Vorteilen gegenüber den Verfahren des Standes der Technik zum Sequenzieren der Nukleinsäure 13 gehören die Fähigkeit zum Lesen langer Sequenzen von Nukleinsäure 13 in einem einzigen Sequenzierungslauf, eine höhere Geschwindigkeit zum Erhalten von Sequenzdaten, verminderte Sequenzierungskosten und höhere Effizienz im Hinblick auf die Bedienerzeit, die pro Einheit erzeugter Sequenzdaten erforderlich ist.
  • In bestimmten Ausführungsformen ist die zu sequenzierende Nukleinsäure 13 DNS, wenngleich in Betracht gezogen wird, dass auch andere Nukleinsäuren, umfassend RNS oder synthetische Nukleotidanaloga sequenziert werden könnten. Die folgende ausführliche Beschreibung enthält zahlreiche spezifische Details, um ein umfassenderes Verständnis der offenbarten Ausführungsformen bereitzustellen. Für den Fachmann wird es jedoch offensichtlich sein, dass die Ausführungsformen ohne diese spezifischen Details in die Praxis umgesetzt werden können. An anderen Stellen sind diejenigen Vorrichtungen, Verfahren, Verfahrensweisen und einzelne Bestandteile, die im Stand der Technik gut bekannt sind, hierin nicht im Detail beschrieben worden.
  • Bestimmte Ausführungsformen sind in 1 dargestellt. 1 zeigt eine Vorrichtung 10 zum Sequenzieren von Nukleinsäure 13, umfassend eine Reaktionskammer 11 und eine Detektionseinheit 12. Die Reaktionskammer 11 enthält ein Nukleinsäure-(Matrizen-)Molekül 13, das zusammen mit einem synthetischen Reagenz 15 wie DNS-Polymerase an eine Immobilisierungsoberfläche 14 gebunden ist. Ein Primermolekül 16, das bezüglich der Sequenz zu dem Matrizenmolekül 13 komplementär ist, wird zu dem Matrizenmolekül 13 hybridisiert. Nukleotidvorläufer 17 sind in der Reaktionskammer 11 in einer Lösung vorhanden. Zur Synthese eines naszierenden DNS-Strangs 16 müssen die Nukleotidvorläufer 17 mindestens ein Molekül von jeweils Desoxyadenosin-5'-triphosphat (dATP), Desoxyguanosin-5'-triphosphat (dGTP), Desoxycytosin-5'-triphosphat (dCTP) und Desoxythymidin-5'-triphosphat (dTTP) aufweisen. Für die Synthese eines naszierenden RNS-Strangs 16 müssen die Nukleotidvorläufer 17 ATP, CTP, GTP and Uridin-5'-triphosphat (UTP) umfassen.
  • Zum Initiieren einer Sequenzierungsreaktion fügt die Polymerase 15 jeweils ein Nukleotidvorläufermolekül 17 zu dem 3'-Ende des Primers 16 hinzu, wodurch das Primermolekül 16 verlängert wird. Da das Primermolekül 16 ausgedehnt wird, wird es als ein naszierender Strang 16 be zeichnet. Für jede Verlängerungsrunde wird ein einzelner Nukleotidvorläufer 17 in den naszierenden Strang 16 eingebunden. Da die Aufnahme von Nukleotidvorläufern 17 durch Watson-Crick-Basenpaarinteraktionen mit dem Matrizenstrang 13 bestimmt wird, ist die Sequenz des wachsenden naszierenden Strangs 16 zu der Sequenz des Matrizenstrangs 13 komplementär. Bei der Watson-Crick-Basenpaarung wird immer ein Adenosin-(A)Rest auf einem Strang mit einem Thymidin-(T)Rest auf dem anderen Strang oder ein Uridin-(U)Rest gepaart, wenn der Strang RNS ist. In ähnlicher Weise wird immer ein Guanosin-(G)Rest auf einem Strang mit einem Cytosin-(C)Rest auf dem anderen Strang gepaart. Folglich kann die Sequenz des Matrizenstrangs 13 aus der Sequenz des naszierenden Strangs 16 bestimmt werden.
  • 1 stellt Ausführungsformen dar, in denen ein einzelnes Nukleinsäuremolekül 13 in einer einzigen Reaktionskammer 11 enthalten ist. In alternativen Ausführungsformen kann eine Vielzahl von Nukleinsäuremolekülen 13 jeweils in einer getrennten Reaktionskammer 11 gleichzeitig sequenziert werden. In solchen Fällen kann die Nukleinsäurematrize 13 in jeder Reaktionskammer 11 identisch sein oder kann verschieden sein. In anderen alternativen Ausführungsformen können zwei oder mehr Matrizen-Nukleinsäuremoleküle 13 in einer einzigen Reaktionskammer 11 vorhanden sein. In solchen Ausführungsformen sind die Nukleinsäuremoleküle 13 bezüglich der Sequenz identisch. Wenn mehr als eine Matrizennukleinsäure 13 in der Reaktionskammer 11 vorhanden ist, repräsentieren die Raman-Emissionssignale einen Mittelwert der Nukleinsäurevorläufer 17, die in alle naszierenden Stränge 16 in der Reaktionskammer 11 eingebunden werden. Der Fachmann kann das erhaltene Signal mittels bekannter Datenanalysetechniken zu jedem beliebigen gegebenen Zeitpunkt für synthetische Reaktionen korrigieren, die entweder hinter den meisten Reaktionen, die in der Reaktionskammer 11 stattfinden, zurückbleiben oder diesen vorausgehen.
  • Der Fachmann wird erkennen, dass je nach dem benutzten Polymerasemolekül 15 der naszierende Strang 16 einen gewissen Prozentanteil von falsch angepassten Basen enthalten kann, wobei die neu aufgenommene Base mit der entsprechenden Base in dem Matrizenstrang 13 nicht korrekt durch Wasserstoff gebunden wird. In verschiedenen Ausführungsformen ist eine Genauigkeit von mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98%, mindestens 99%, mindestens 99,5%, mindestens 99,8%, mindestens 99,9% oder höher zu beobachten. Der Fachmann wird wissen, dass bestimmte Polymerasen 15 eine Fehlerkorrekturaktivität (auch als eine 3'-Exonuklease oder Korrekturleseaktivität bezeichnet) haben, die wirkt, um einen neu eingebundenen Nukleotidvorläufer 17, der nicht korrekt zu dem Matrizenstrang 13 basengepaart wurde, zu entfernen. In verschiedenen Ausführungsformen können Polymerasen 15 mit oder ohne eine Korrekturleseaktivität eingesetzt werden. Der Fachmann wird ebenfalls wissen, dass bestimmte Polymerasen 15 wie reverse Transkriptase eine inhärent hohe Fehlerrate haben, was die häufige Aufnahme von falsch angepassten Basen ermöglicht. Je nach der Ausführungsform kann eine Polymerase 15 mit entweder einer höheren oder einer niedrigeren inhärenten Fehlerrate ausgewählt werden. In bestimmten Ausführungsformen kann eine Polymerase 15 mit der kleinstmöglichen Fehlerrate benutzt werden. Die Fehlerraten der Polymerase 15 sind im Stand der Technik gut bekannt.
  • Die Detektionseinheit 12 umfasst eine Erregungsquelle 18 wie einen Laser und einen Raman-Spektroskopiedetektor 19. Die Erregungsquelle 18 erleuchtet die Reaktionskammer 11 mit einem Erregungsstrahl 20. Der Erregungsstrahl 20 interagiert mit den Nukleotidvorläufern 17, was zu der Erregung von Elektronen zu einem höheren Energiezustand führt. Wenn die Elektronen zu einem niedrigeren Energiezustand zurückkehren, emittieren sie ein Raman-Emissionssignal, das von dem Raman-Detektor 19 detektiert wird. Da das Raman-Emissionssignal aus jedem der vier Arten von Nukleotidvorläufern 17 unterschieden werden kann, kann die Detektionseinheit 12 die Menge jeder Art von Nukleotidvorläufern 17 in der Reaktionskammer messen.
  • Die Aufnahme von Nukleotidvorläufern 17 in den wachsenden naszierenden Strang 16 führt zu einer Verminderung von Nukleotidvorläufern 17 aus der Reaktionskammer 11. Damit die synthetische Reaktion fortgesetzt werden kann, kann eine Quelle von frischen Nukleotidvorläufern 17 erforderlich sein. Diese Quelle ist in 1 als ein Molekülspender 21 dargestellt. In alternativen Ausführungsformen kann ein Molekülspender 21 Teil der Sequenzierungsvorrichtung 10 sein oder auch nicht.
  • In bestimmten Ausführungsformen ist der Molekülspender 21 gestaltet, um jeden der vier Nukleotidvorläufer 17 in gleichen Mengen freizusetzen, die auf die Syntheserate des naszierenden Strangs 16 abgestimmt sind. Jedoch weisen die Nukleinsäuren 13 nicht unbedingt eine gleichmäßige Verteilung von A-, T-, G- und C-Resten auf. Insbesondere können bestimmte Bereiche von DNS-Molekülen entweder AT-reich oder GC-reich sein, je nach der Spezies, aus der die DNS erhalten wird, und dem spezifischen Bereich des sequenzierten DNS-Moleküls. In alternativen Ausführungsformen ist die Freisetzung von Nukleotidvorläufern 17 aus dem Molekülspender 21 derart gesteuert, dass relativ konstante Konzentrationen jeder Art von Nukleotidvorläufer 17 in der Reaktionskammer 11 beibehalten werden. Solche Ausführungsformen können ein Informationsverarbeitungs- und Steuersystem benutzen, das zwischen der Detektionseinheit 12 und dem Molekülspender 21 verbunden ist.
  • In Ausführungsformen, die ein Informationsverarbeitungs- und Steuersystem wie einen Computer oder Mikroprozessor betreffen, der an eine Datenspeichereinheit angeschlossen ist oder diese integriert, können Daten von einem Detektor 19 wie einer Spektrometer- oder Monochromatoranordnung erfasst werden. Das Informationsverarbeitungs- und Steuersystem kann eine Datenbank verwalten, die spezifische Raman-Signaturen mit spezifischen Nukleotidvorläufern 17 verbindet. Das Informationsverarbeitungs- und Steuersystem kann die Signaturen, die von dem Detektor 19 detektiert werden, aufzeichnen und diese Signaturen mit den Signaturen von bekannten Nukleotidvorläufern 17 in Beziehung setzen. Das Informationsverarbeitungs- und Steuersystem kann auch eine Aufzeichnung der Aufnahme von Nukleotidvorläufern 17 verwalten, welche die Sequenz des Matrizenmoleküls 13 angibt. Das Informationsverarbeitungs- und Steuersystem kann auch im Stand der Technik bekannte Standardverfahren wie die Subtraktion von Hintergrundsignalen ausführen.
  • In Ausführungsformen, die einen Molekülspender 21 betreffen, kann die Zugabe von Nukleotidvorläufern 17 zu der Reaktionskammer 11 gleichzeitig mit der Aufnahme von Nukleotidvorläufern 17 in den naszierenden Strang 16 zu einem komplexen Raman-Signal führen. In bestimmen Ausführungsformen kann die synthetische Reaktion vollständig oder fast vollständig ablaufen gelassen werden, bevor zusätzliche Nukleotidvorläufer 17 zu der Reaktionskammer 11 hinzugefügt werden. In alternativen Ausführungsformen kann die Zugabe von Nukleotidvorläufern 17 zu der Reaktionskammer 11 gleichzeitig mit der Aufnahme von Nukleotidvorläufern 17 in den naszierenden Strang 16 stattfinden. In solchen Ausführungsformen kann das Informationsverarbeitungs- und Steuersystem benutzt werden, um die Daten bezüglich der Konzentration von Nukleotidvorläufern 17 zu korrigieren, die aus dem Raman-Emissionsspektrum für die Menge an Nukleotidvorläufern 17, die durch den Molekülspender 21 hinzugefügt wird, erhalten werden.
  • In bestimmten Ausführungsformen kann die Reaktionskammer 11 ein einzelnes Molekül jeder Art von Nukleotidvorläufern 17 enthalten. In solchen Ausführungsformen kann die Freisetzung von Nukleotidvorläufern 17 von dem Molekülspender 21 eng mit der Aufnahme von Nukleotidvorläufern 17 in den naszierenden Strang verknüpft sein, um Verzögerungen in der synthetischen Reaktion aufgrund der Abwesenheit eines erforderlichen Nukleotidvorläufers 17 zu vermeiden.
  • Bestimmte Ausführungsformen betreffen die Synthese eines naszierenden DNS-Strangs 16. Der Matrizenstrang 13 kann entweder RNS oder DNS sein. Mit einem RNS-Matrizenstrang 13 kann das synthetische Reagenz 15 eine reverse Transkriptase sein, deren Beispiele im Stand der Technik bekannt sind. In Ausführungsformen, in denen der Matrizenstrang 13 ein DNS-Molekül ist, kann das synthetische Reagenz 15 eine DNS-Polymerase sein, deren Beispiele im Stand der Technik bekannt sind.
  • In anderen Ausführungsformen kann der naszierende Strang 16 ein RNS-Molekül sein. Dies erfordert, dass das synthetische Reagenz 15 eine RNS-Polymerase ist. In diesen Ausführungsformen ist kein Primer 16 erforderlich. Jedoch muss der Matrizenstrang 13 eine Beschleunigersequenz enthalten, die wirksam ist, um die RNS-Polymerase 15 zu binden und eine Transkription eines naszierenden RNS-Strangs 16 zu initiieren. Die exakte Zusammensetzung der Beschleunigersequenz hängt von der Art der verwendeten RNS-Polymerase 15 ab. Eine Optimierung von Beschleunigersequenzen zum Ermöglichen einer effizienten Initiierung der Transkriptase entspricht dem Stand der Technik. Die Ausführungsformen sind nicht auf die Art des benutzten Matrizenmoleküls 13, die Art des synthetisierten naszierenden Strangs 16 oder die Art der benutzten Polymerase 15 eingeschränkt. Praktisch jede beliebige Matrize 13 und jede beliebige Polymerase 15, die eine Synthese eines Nukleinsäuremoleküls 16 unterstützen können, das bezüglich der Sequenz zu dem Matrizenstrang 13 komplementär ist, können benutzt werden.
  • In einigen alternativen Ausführungsformen können die Nukleotidvorläufer 17 mit einer Markierung chemisch modifiziert sein. Die Markierung weist eine einzigartige und stark sichtbare optische Signatur auf, die für jeden der gemeinsamen Nukleotidvorläufer 17 unterschieden werden kann. In bestimmten Ausführungsformen kann die Markierung der Erhöhung der Stärke des Raman-Emissionssignals oder anderweitigen Verbesserung der Empfindlichkeit oder Spezifizität des Raman-Detektors 19 für Nukleotidvorläufer 17 dienen. Zu nicht einschränkenden Beispielen von Mar kierungsmolekülen, die für Ausführungsformen benutzt werden könnten, welche die Raman-Spektroskopie betreffen, gehören TRIT (Tetramethylrhodaminisothiol), NBD (7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol), der Farbstoff Texasrot, Phthalsäure, Terephthalsäure, Isophthalsäure, Kresylechtviolett, Kresylblauviolett, Brilliantkresylblau, para-Aminobenzoesäure, Erythrosin und Aminoacridin. Andere Markierungseinheiten, die für bestimmte Ausführungsformen nützlich sein können, sind Cyanid, Thiol, Chlor, Brom, Methyl, Phosphor und Schwefel. In bestimmen Ausführungsformen können Kohlenstoffnanoröhrchen als Raman-Markierungen benutzt werden. Die Verwendung von Markierungen in der Raman-Spektroskopie ist im Stand der Technik bekannt (zum Beispiel US-Patentschriften Nr. 5,306,403 und 6,174,677 ). Der Fachmann wird verstehen, dass Raman-Markierungen unterscheidbare Raman-Spektren erzeugen sollten, wenn sie an unterschiedliche Nukleotidvorläufer 17 gebunden werden, oder unterschiedliche Markierungen sollten entwickelt werden, um nur eine Art von Nukleotidvorläufer 17 zu binden.
  • In einigen Ausführungsformen weist die Markierung ein verstärktes Raman-Signal auf. In alternativen Ausführungsformen können Markierungen verwendet werden, die andere Signalarten aufweisen, wie fluoreszierende oder lumineszierende Signale. Es wird in Betracht gezogen, dass alternative Detektionsverfahren in solchen Ausführungsformen benutzt werden können, zum Beispiel die Fluoreszenzspektroskopie oder Lumineszenzspektroskopie. Viele alternative Verfahren zur Detektion von Nukleotidvorläufern 17 in einer Lösung sind im Stand der Technik bekannt und können angewendet werden. Für solche Verfahren kann der Raman-Spektroskopiedetektor 19 durch einen Detektor 19 ersetzt werden, um Fluoreszenz, Lumineszenz oder andere im Stand der Technik bekannte Signalarten zu detektieren.
  • In bestimmten Ausführungsformen kann das Matrizenmolekül 13 an eine Oberfläche 14 wie funktionalisiertes Glas, Silizium, PDMS (Polydimethlylsiloxan), mit Silber oder anderen Metallen beschichtete Oberflächen, Quarz, Kunststoff, PTFE (Polytetrafluorethylen), PVP (Polyvinylpyrrolidon), Polystyrol, Polypropylen, Polyacrylamid, Latex, Nylon, Nitrocellulose, ein Glaskügelchen, ein Magnetkügelchen oder jedes beliebige andere Material, das im Stand der Technik bekannt ist und funktionelle Gruppen wie Amino, Carboxyl, Thiol, Hydroxyl oder Diels-Alder-Reagenzien, die auf ihrer Oberfläche eingebunden sind, aufweisen kann.
  • In einigen Ausführungsformen können funktionelle Gruppen an Vernetzungsmittel kovalent gebunden werden, so dass zwischen dem Matrizenstrang 13 und der Polymerase 15 Bindeinteraktionen ohne sterische Hinderung stattfinden können. Zu typischen Vernetzungsgruppen gehören Ethylen-Glycol-Oligomere und Diamine. Die Bindung kann entweder eine kovalente oder eine nicht kovalente Bindung sein. Verschiedene Verfahren zum Binden von Nukleinsäuremolekülen 13 an Oberflächen 14 sind im Stand der Technik bekannt und können angewendet werden.
  • Definitionen
  • Wie hier verwendet, kann sich „ein", „einer" oder „eine" auf ein oder mehr als ein Element beziehen.
  • „Nukleinsäure" 13 bedeutet entweder DNS, RNS mit einfachem Strang, mit doppeltem Strang oder mit dreifachem Strang und sämtliche chemische Modifikationen davon, wenngleich einsträngige Nukleinsäuren 13 bevorzugt werden. Praktisch jede beliebige Modifikation der Nukleinsäure 13 wird berücksichtigt. Wie hier verwendet, kann eine Nukleinsäure 13 mit einem Strang durch das Präfix „ss", eine Nukleinsäure mit zwei Strängen durch das Präfix „ds" und eine Nukleinsäure mit drei Strängen durch das Präfix „ts" gekennzeichnet sein.
  • Eine "Nukleinsäure" 13 kann fast jede beliebige Länge aufweisen, von 10, 20, 30, 40, 50, 60, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.500, 2.000, 2.500, 3.000, 3.500, 4.000, 4.500, 5.000, 6.000, 7.000, 8.000, 9.000, 10.000, 15.000, 20.000, 30.000, 40.000, 50.000, 75.000, 100.000, 150.000, 200.000, 500.000, 1.000.000, 1.500.000, 2.000.000, 5.000.000 oder sogar mehr Basen bis zu einem chromosomalen DNS-Molekül 13 von voller Länge.
  • Ein „Nukleosid" ist ein Molekül, das eine Base (A, T, G, C oder U) umfasst, die an einen Pentosezucker wie Desoxyribose, Ribose oder Derivate oder Analoga von Pentosezuckerstoffen kovalent gebunden ist.
  • Ein „Nukleotid" bezieht sich auf ein Nukleosid, das ferner mindestens eine Phosphatgruppe umfasst, die an den Pentosezucker kovalent gebunden ist. In einigen Ausführungsformen sind die Nukleotidvorläufer 17 Ribonukleosidtriphosphate oder Desoxyribonukleosidtriphosphate. Es wird in Betracht gezogen, dass verschiedene Substitutionen oder Modifikationen in der Struktur der Nukleotidvorläufer 17 vorgenommen werden können, solange sie von der Polymerase 15 noch immer in den naszierenden Strang 16 aufgenommen werden können. Zum Beispiel kann die Ribose- oder Desoxyriboseeinheit in bestimmten Ausführungsformen durch einen anderen Pentosezucker oder ein Pentosezuckeranalogon ersetzt werden. In anderen Ausführungsformen können die Phosphatgruppen durch verschiedene Gruppen wie Phosphonate, Sulfate oder Sulfonate ersetzt werden. In wieder anderen Ausführungsformen können die Purin- oder Pyrimidinbasen durch andere Purine oder Pyrimidine oder Analoga davon ersetzt werden, sofern die Sequenz von Nukleotidvorläufern 17, die in den naszierenden Strang 16 eingebunden werden, die Sequenz des Matrizenstrangs 13 reflektiert.
  • Nukleinsäuren
  • Die Matrizenmoleküle 13 können durch jede beliebige, dem Durchschnittsfachmann bekannte Technik hergestellt werden. In bestimmten Ausführungsformen sind die Matrizenmoleküle 13 natürlich vorkommende DNS- oder RNS-Moleküle, zum Beispiel chromosomale DNS oder Boten-RNS (mRNS). Praktisch jede beliebige natürlich vorkommende Nukleinsäure 13 kann durch die offenbarten Verfahren hergestellt und sequenziert werden, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, chromosomale, mitochondriale oder Chloroplast-DNS oder ribosomale, Transfer-, heterogene nukleare oder Boten-RNS. Die zu sequenzierende Nukleinsäure 13 kann durch Standardverfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, aus entweder prokaryotischen oder eukaryotischen Quellen erhalten werden.
  • Verfahren zum Herstellen und Isolieren verschiedener Formen von zellularen Nukleinsäuren 13 sind bekannt, (siehe zum Beispiel Guide to Molecular Cloning Techniques, Hrsg. Berger und Kimmel, Academic Press, New York, NY, 1987; Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2. Ausgabe, Hrsg. Sambrook, Fritsch und Maniatis, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Im Allgemeinen werden Zellen, Gewebe oder ein anderes Quellenmaterial, das zu sequenzierende Nukleinsäuren 13 enthält, zuerst homogenisiert, zum Beispiel durch Gefrieren in flüssigem Stickstoff gefolgt von Mahlen in einem Mörser mit Stößel. Bestimmte Gewebe können mittels eines Waring-Mischers, Virtis-Homogenisators, Dounce-Homogenisators oder eines anderen Homogenisators homogenisiert werden. Rohe Homogenate können mit Reinigungsmitteln wie Natriumdodecylsulfat (SDS), Triton X-100, CHAPS (3-[(3-Cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1-propansulfonat), Octylglucosid oder anderen im Stand der Technik bekannten Reinigungsmitteln extrahiert werden. Alternativ oder zusätzlich können zur Extraktion chaotrope Mittel wie Guanidiniumisothiocyanat oder organische Lösungsmittel wie Phenol benutzt werden. In einigen Ausführungsformen kann eine Proteasebehandlung, zum Beispiel mit Proteinase K benutzt werden, um Zellproteine abzubauen. Partikelförmige Kontaminanten können durch Zentrifugierung oder Ultrazentrifugierung (zum Beispiel 10 bis 30 Minuten bei etwa 5.000 bis 10.000 × g oder 30 bis 60 Minuten bei etwa 50.000 bis 100.000 × g) entfernt werden. Eine Dialyse gegenüber wässrigem Puffer von geringer Ionenstärke kann von Nutzen sein, um Salze oder andere lösliche Kontaminanten zu entfernen. Die Nukleinsäuren 13 können durch Zugabe von Ethanol bei –20°C oder durch Zugabe von Natriumacetat (pH 6,5, etwa 0,3 M) und 0,8 Volumen 2-Propanol ausgefällt werden. Die ausgefällten Nukleinsäuren 13 können durch Zentrifugierung oder für chromosale DNS durch Spulen der ausgefällten DNS auf eine Glaspipette oder andere Sonde gesammelt werden.
  • Der Fachmann wird erkennen, dass die oben erwähnten Verfahren nur beispielhaft sind und dass je nach der bestimmten Art der zu sequenzierenden Nukleinsäure 13 viele Variationen benutzt werden können. Zum Beispiel wird die mitochondriale DNS oft durch Cäsiumchlorid-Dichtegradientenzentrifuierung mittels Schrittgradienten hergestellt, während die mRNS oft mittels vorbereitender Säulen aus im Handel erhältlichen Quellen wie Promega (Madison, WI) oder Clontech (Palo Alto, CA) hergestellt wird. Solche Variationen sind im Stand der Technik bekannt.
  • Der Fachmann wird verstehen, dass je nach der Art der herzustellenden Matrizennukleinsäure 13 verschiedene Nukleasehemmer benutzt werden können. Zum Beispiel kann eine RNase-Kontamination in nicht abgefassten Lösungen durch die Behandlung mit Diethylpyrocarbonat (DEPC) beseitigt werden, während im Handel erhältliche Nukleasehemmer von Standardquellen wie Promega (Madison, WI) oder BRL (Gaithersburg, MD) erhalten werden können. Die gereinigte Nukleinsäure 13 kann in einem wässrigen Puffer wie IE (Tris-EDTA) (Ethylendiamintetraessigsäure) aufgelöst und vor Gebrauch bei –20°C oder in flüssigem Stickstoff gelagert werden.
  • Wenn eine einsträngige DNS (ssDNS) 13 sequenziert werden soll, kann eine ssDNS 13 durch Standardverfahren aus einer doppelsträngigen DNS (dsDNS) hergestellt werden. Am einfachsten ist es, die dsDNS über ihre Glühtemperatur zu erwärmen, bei welcher sie sich spontan in die ssDNS 13 auftrennt. Repräsentative Bedingungen könnten eine Erwärmung bei 92 bis 95°C für 5 Minuten oder länger sein. Formeln zum Bestimmen der Bedingungen zum Trennen der dsDNS auf der Grundlage zum Beispiel eines GC-Gehalts und der Länge des Moleküls sind im Stand der Technik bekannt. Alternativ kann eine einsträngige DNS 13 aus einer doppelsträngigen DNS durch im Stand der Technik bekannte Standardamplifikationstechniken mittels eines Primers hergestellt werden, der sich nur an einen Strang der doppelsträngigen DNS bindet. Andere Verfahren zum Herstellen einer einsträngigen DNS 13 sind im Stand der Technik bekannt, zum Beispiel durch Einsetzen der zu sequenzierenden doppelsträngigen Nukleinsäure in eine replikative Form einer Phage wie M13 und Ermöglichen, dass die Phage einsträngige Kopien der Matrize 13 erzeugt.
  • Wenngleich bestimmte Ausführungsformen die Herstellung von natürlich vorkommenden Nukleinsäuren 13 betreffen, könnte potentiell jede beliebige Art von Nukleinsäure 13 sequenziert werden, die als eine Matrize für eine RNS- oder DNS-Polymerase dienen kann. Zum Beispiel können Nukleinsäuren 13 sequenziert werden, die durch verschiedene Amplifikationstechniken wie die Amplifikation mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCRTM) hergestellt werden. (Siehe US-Patentschriften Nr. 4,683,195 , 4,683,202 und 4,800,159 .) Die zu sequenzierenden Nukleinsäuren 13 können alternativ in Standardvektoren wie Plasmiden, Cosmiden, BACs (künstliche Bakterien-Chromosome) oder YACs (künstliche Hefe-Chromosome) geklont werden. (Siehe zum Beispiel Berger und Kimmel, 1987; Sambrook et al., 1989.) Nukleinsäure-Inserts 13 können aus der Vektor-DNS isoliert werden, zum Beispiel durch Exzision mit geeigneten Restriktionsendonukleasen gefolgt von einer Agarosegelelektrophorese und Ethidiumbromidfärbung. Ausgewählte Nukleinsäuren 13, die hinsichtlich der Größe fraktioniert wurden, können aus Gelen entfernt werden, zum Beispiel durch die Verwendung von Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt oder durch Elektroelution aus Gelscheiben. Verfahren zur Insert-Isolierung sind dem Durchschnittsfachmann bekannt.
  • Isolierung von einzelnen Nukleinsäuremolekülen
  • In bestimmten Ausführungsformen ist das zu sequenzierende Nukleinsäuremolekül 13 ein einzelnes ssDNS- oder ssRNS-Molekül. Verschiedene Verfahren zur Auswahl und Manipulation von einzelnen ssDNS- oder ssRNS-Molekülen 13 können angewendet werden, zum Beispiel hydrodynamische Fokussierung, Mikromanipulatorkopplung, optische Fallen oder eine Kombination dieser und ähnlicher Verfahren. (Siehe zum Beispiel Goodwin et al, 1996, Acc. Chem. Res. 29: 607–619; US-Patentschriften Nr. 4,962,037 ; 5,405,747 ; 5,776,674 ; 6,136,543 ; 6,225,068 .)
  • In bestimmten Ausführungsformen können Mikrofluidtechniken oder Nanofluidtechniken angewendet werden, um Matrizennukleinsäuren 13 zu sortieren und zu isolieren. Die Hydrodynamik kann angewendet werden, um die Bewegung der Nukleinsäuren 13 in einen Mikrokanal, eine Mikrokapillare oder Mikropore zu manipulieren. In einer Ausführungsform können hydrodynamische Kräfte benutzt werden, um Nukleinsäuremoleküle 13 über eine Kammstruktur zu getrennten einzelnen Nukleinsäuremolekülen 13 zu bewegen. Sobald die Nukleinsäuremoleküle 13 getrennt worden sind, kann eine hydrodynamische Fokussierung angewendet werden, um die Moleküle 13 zu positionieren. Ein thermisches oder elektrisches Potential, Druck oder Vakuum können ebenfalls benutzt werden, um eine Bewegungskraft zur Manipulation von Nukleinsäuren 13 bereitzustellen. In Ausführungsbeispielen kann die Manipulation von Matrizennukleinsäuren 13 zum Sequenzieren die Verwendung einer Kanalblockgestaltung einbeziehen, die durch Mikrotechno logie hergestellte Kanäle und ein integriertes Gelmaterial aufweist, wie in den US-Patentschriften Nr. 5,867,266 und 6,214,246 offenbart.
  • In einer anderen Ausführungsform kann eine Probe, welche die Nukleinsäurematrize 13 enthält, vor dem Koppeln an eine Immobilisierungsoberfläche 14 verdünnt werden. In Ausführungsbeispielen kann die Immobilisierungsoberfläche 14 in Form von magnetischen oder nicht magnetischen Kügelchen oder anderen eigenständigen strukturellen Einheiten vorliegen. Bei einer angemessenen Verdünnung weist jedes Kügelchen eine statistische Bindewahrscheinlichkeit von null oder einem Nukleinsäuremolekül 13 auf. Kügelchen mit einem gebundenen Nukleinsäuremolekül 13 können zum Beispiel mittels fluoreszierender Farbstoffe und Flusszytometersortierung oder magnetischer Sortierung identifiziert werden. In Abhängigkeit der relativen Größen und Gleichförmigkeit der Kügelchen und der Nukleinsäuren 13 kann es möglich sein, einen magnetischen Filter und Massentrennung zu verwenden, um Kügelchen, die ein einzelnes gebundenes Nukleinsäuremolekül 13 enthalten, zu trennen. In anderen Ausführungsformen kann eine Vielzahl von Nukleinsäuren 13, die an ein einzelnes Kügelchen oder eine andere Immobilisierungsoberfläche 14 gebunden sind, sequenziert werden.
  • In alternativen Ausführungsformen kann eine beschichtete Faserspitze 14 benutzt werden, um Nukleinsäurematrizen 13 mit einem einzigen Molekül zur Sequenzierung zu erzeugen (zum Beispiel US-Patentschrift Nr. 6,225,068 ). In anderen alternativen Ausführungsformen können die Immobilisierungsoberflächen 14 hergestellt werden, um ein einzelnes Molekül von Avidin oder einem anderen Vernetzungsmittel aufzunehmen. Solch eine Ober fläche 14 könnte einen einzelnen biotinylierten Primer 16 binden, der wiederum mit einer einzelnen zu sequenzierenden Matrizennukleinsäure 14 hybridisieren kann. Diese Ausführungsform ist nicht auf das Avidin-Biotin-Bindesystem eingeschränkt, sondern kann an jedes beliebige im Stand der Technik bekannte Kopplungssystem angepasst werden.
  • In anderen alternativen Ausführungsformen kann eine optische Falle zur Manipulation von Nukleinsäuren 13 mit einem einzelnen Molekül zur Sequenzierung benutzt werden. (Zum Beispiel US-Patentschrift Nr. 5,776,674 ). Beispielhafte Systeme von optischen Fallen sind im Handel von Cell Robotics, Inc. (Albuquerque, NM), S + L GmbH (Heidelberg, Deutschland) und P. A. L. M. GmbH (Wolfratshausen, Deutschland) erhältlich.
  • Immobilisierungsverfahren
  • In verschiedenen Ausführungsformen können die zu sequenzierenden Nukleinsäuremoleküle 13 an eine feste Oberfläche 14 gebunden (oder immobilisiert) werden. Die Immobilisierung von Nukleinsäuremolekülen 13 kann durch verschiedene Verfahren erreicht werden, die entweder eine nicht kovalente oder kovalente Bindung zwischen dem Nukleinsäuremolekül 13 und der Oberfläche 14 betreffen. In einem Ausführungsbeispiel kann die Immobilisierung durch Beschichten einer Oberfläche 14 mit Streptavidin oder Avidin und nachfolgender Bindung eines biotinylierten Polynukleotids 13 erreicht werden (Holmstrom et al., Anal Biochem. 209: 278–283, 1993). Die Immobilisierung kann auch durch Beschichtung einer Silizium-, Glasoberfläche oder anderen Oberfläche 14 mit Poly-L-Lys (Lysin) oder Poly L-Lys, Phe (Phenylalanin) gefolgt von einer kovalenten Bindung von entweder amino- oder sulfhydryl-modifizierten Nukleinsäuren 13 mittels bifunktioneller Vernetzungsreagenzien stattfinden (Running et al., BioTechniques 8: 276–277, 1990; Newton et al., Nucleic Acids Res. 21: 1155–62, 1993). Aminreste können auf eine Oberfläche 14 mittels Aminosilan zum Vernetzen eingeführt werden.
  • Die Immobilisierung kann durch eine direkte kovalente Bindung von 5'-phosphorylierten Nukleinsäuren 13 an chemisch modifizierte Oberflächen 14 stattfinden (Rasmussen et al., Anal. Biochem. 198: 138–142, 1991). Die kovalente Bindung zwischen der Nukleinsäure 13 und der Oberfläche 14 wird durch Kondensation mit einem wasserlöslichen Carbodiimid gebildet. Dieses Verfahren ermöglicht eine überwiegend 5'-Bindung der Nukleinsäuren 13 über ihre 5'-Phosphate.
  • Die DNS 13 wird gewöhnlich an Glas gebunden, indem zunächst die Glasoberfläche 14 silanisiert und dann mit Carbodiimid oder Glutaraldehyd aktiviert wird. Alternative Verfahren können Reagenzien wie 3-Glycidoxypropyltrimethoxysilan (GOP) oder Aminopropyltrimethoxysilan (APTS) benutzen, wobei die DNS 13 über Aminolinker verbunden wird, die entweder an dem 3'- oder 5'-Ende des Moleküls eingebunden sind. Die DNS 13 kann mittels ultravioletter Strahlung direkt an die Membranoberflächen 14 gebunden werden. Andere nicht einschränkende Beispiele von Immobilisierungstechniken für Nukleinsäuren 13 sind in den US-Patentschriften Nr. 5,610,287 , 5,776,674 und 6,225,068 offenbart.
  • Die Art der zu verwendenden Oberfläche 14 zur Immobilisierung der Nukleinsäure 13 ist nicht einschränkend. In verschiedenen Ausführungsformen kann die Immobilisierungsoberfläche 14 magnetische Kügelchen, nicht magnetische Kügelchen, eine ebene Oberfläche, eine zugespitzte Oberfläche oder jede beliebige andere Kombination von fester Oberfläche 14 sein, die nahezu jedes beliebige Material umfasst, sofern das Material alterungsbeständig und inert genug ist, um das Stattfinden der Sequenzierungsreaktion der Nukleinsäure 13 zu ermöglichen. Zu nicht einschränkenden Beispielen von Oberflächen 14, die benutzt werden können, gehören Glas, Siliziumdioxid, Silikat, PDMS, mit Silber oder anderen Metallen beschichtete Oberflächen, Nitrocellulose, Nylon, aktivierter Quarz, aktiviertes Glas, Polyvinylidendifluorid (PVDF), Polystyrol, Polyacrylamid, andere Polymere wie Poly(vinylchlorid), Poly(methylmethacrylat) oder Poly(dimethylsiloxan) und Photopolymere, die photoreaktive Spezies wie Nitrene, Carbene und Ketylradikale, die kovalente Bindungen mit Nukleinsäuremolekülen 13 bilden können (Siehe US-Patentschrift Nr. 5,405,766 und 5,986,076 ).
  • Bifunktionelle Vernetzungsreagenzien können in verschiedenen Ausführungsformen von Nutzen sein, wie zum Binden eines Nukleinsäuremoleküls 13 an eine Oberfläche 14. Die bifunktionellen Vernetzungsreagenzien können gemäß der Spezifizität ihrer funktionellen Gruppe, zum Beispiel amino-, guanidino-, indol- oder carboxylspezifischen Gruppen aufgeteilt werden. Von diesen sind Reagenzien, die freie Aminogruppen betreffen, aufgrund ihrer Erhältlichkeit im Handel, Syntheseleichtigkeit und milden Reaktionsbedingungen, unter denen sie angewendet werden können, weit verbreitet. Beispielhafte Verfahren zum Vernetzen von Molekülen sind in den US-Patentschriften Nr. 5,603,872 und 5,401,511 offenbart. Zu Vernetzungsreagenzien gehören Glutaraldehyd (GAD), bifunktionelles Oxiran (OXR), Ethylen glycoldiglycidylether (EGDE) und Carbodiimide wie 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC).
  • Synthetische Reagenzien
  • In bestimmten Ausführungsformen betrifft die Sequenzierungsreaktion das Binden eines synthetischen Reagenzes 15 wie einer DNS-Polymerase 15 an ein Primermolekül 16 und die katalysierte Zugabe von Nukleotidvorläufern 17 zu dem 3'-Ende des Primers 16. Zu nicht einschränkenden Beispielen von potentiell nützlichen synthetischen Reagenzien 15 gehören DNS-Polymerase, RNS-Polymerase, reverse Transkriptase und RNS-abhängige RNS-Polymerasen. Der Unterschied zwischen diesen synthetischen Reagenzien 15 im Hinblick auf ihre „Korrekturlese"-Aktivität und Erfordernis oder Nichtvorhandensein der Erfordernis für Primer und Beschleunigersequenzen sind hierin erläutert und sind im Stand der Technik bekannt. Wenn RNS-Polymerasen als das synthetische Reagenz 15 verwendet werden, kann das zu sequenzierende Matrizenmolekül 13 eine doppelsträngige DNS sein.
  • In Ausführungsformen, die synthetische Reagenzien 15 mit Korrekturlesefähigkeit benutzen, wird die Freisetzung von fehlerhaft eingebundenen Nukleotidvorläufern 17 von der Detektionseinheit 12 detektiert und die Sequenzdaten werden entsprechend korrigiert. In Ausführungsformen, die synthetische Reagenzien 15 ohne Korrekturlesefähigkeit benutzen, werden Fehler nicht korrigiert. Diese Fehler können durch Sequenzieren beider Stränge der ursprünglichen Matrize 13 oder durch Sequenzieren einer Vielzahl von Kopien des gleichen Strangs 13 beseitigt werden. Zu nicht einschränkenden Beispielen von Polymerasen 15, die benutzt werden könnten, gehören Thermatoga maritima-DNS-Polymerase, AmplitaqFSTM-DNS-Polymerase, TaquenaseTM-DNS-Polymerase, ThermoSequenaseTM, Taq-DNS-Polymerase, QbetaTM-Replikase, T4-DNS-Polymerase, Thermus thermophilus-DNS-Polymerase, RNS-abhängige RNS-Polymerase und SP6-RNS-Polymerase.
  • Eine Anzahl von synthetischen Reagenzien 15 sind im Handel erhältlich, einschließlich Pwo-DNS-Polymerase von Boehringer Mannheim Biochemicals (Indianapolis, IN); Bst-Polymerase von Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA); IsoThermTM-DNS-Polymerase von Epicentre Technologies (Madison, WI); Reverse Transkriptase des murinen Moloney-Leukämievirus, Pfu-DNS-Polymerase, Reverse Transkriptase des Myeloblastosis-Vogelvirus, Thermus flavus (Tfl)-DNS-Polymerase und Thermococcus litoralis (Tli)-DNS-Polymerase von Promega (Madison, WI); RAV2-Reverse-Transkriptase, HTV-1-Reverse-Transkriptase, T7-RNS-Polymerase, T3-RNS-Polymerase, SP6-RNS-Polymerase, RNS-Polymerase E. coli, Thermus aquaticus-DNS-Polymerase, T7-DNS-Polymerase +/– 3'→5'-Exonuklease, Klenow-Fragment von DNS-Polymerase I, Thermus 'ubiquitous'-DNS-Polymerase und DNS-Polymerase I von Amersham Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ). Jedoch kann jedes beliebige synthetische Reagenz 15, das im Stand der Technik zur matrizenabhängigen Polymerisation von Nukleotidvorläufern 17 bekannt ist, benutzt werden. (Siehe zum Beispiel Goodman und Tippin, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1(2): 101–9, 2000; US-Patentschrift Nr. 6,090,589 .)
  • Der Fachmann wird erkennen, dass die Aktivitätsrate der Polymerase 15 derart manipuliert werden kann, dass sie mit der optimalen Analyserate von Nukleotidvorläufern 17 durch die Detektionseinheit 12 übereinstimmt. Verschiedene Verfahren sind zum Einstellen der Aktivitätsrate der Polymerase 15 bekannt, einschließlich der Einstellung der Temperatur, des Drucks, pHs, Salzgehalts, der Konzentration von zweiwertigen Kationen oder der Konzentration von Nukleotidvorläufern 17 in der Reaktionskammer 11. Verfahren zur Optimierung der Aktivität der Polymerase 15 sind dem Durchschnittsfachmann bekannt.
  • Markierungen
  • Bestimmte Ausführungsformen können die Aufnahme einer Markierung in die Nukleotidvorläufer 17 betreffen, um ihre Messung durch die Detektionseinheit 12 zu ermöglichen. Eine Anzahl von unterschiedlichen Markierungen kann benutzt werden, wie Raman-Markierungen, Fluorophoren, Chromophoren, Radioisotopen, enzymatische Markierungen, Antikörper, chemilumineszierende, elektrolumineszierende Markierungen, Affinitätsmarkierungen usw. Ein Fachmann wird erkennen, dass diese und andere hierin nicht erwähnte Markierungseinheiten in den offenbarten Verfahren benutzt werden können.
  • Markierungen zur Verwendung in Ausführungsformen, welche die Raman-Spektroskopie betreffen, sind oben erläutert. In anderen Ausführungsformen kann die zu benutzende Markierungseinheit eine Fluorophore wie Alexa 350, Alexa 430, AMCA (7-Amino-4-methylcumarin-3-essigsäure), BODIPY (5,7-Dimethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen-3-propionsäure) 630/650, BODIPY 650/665, BODIPY-FL (Fluorescein), BODIPY-R6G (6-Carboxyrhodamin), BODIPY-TMR (Tetramethylrhodamin), BODIPY-TRX (Texas-Rot-X), Kaskadenblau, Cy2 (Cyanin), Cy3, Cy5,6-FAM (5-Carboxyfluorescein), Fluorescein, 6-JOE (2'7'-Dimethoxy-4'5'-dichloro-6-carboxyfluorescein), Oregon-Grün 488, Oregon-Grün 500, Oregon-Grün 514, Pazifik-Blau, Rhodamin-Grün, Rhodamin-Rot, ROX (6-Carboxy-X-rhodamin), TAMRA (N,N,N',N'-Tetramethyl-6-carboxyrhodamin), Tetramethylrhodamin und Texas-Rot sein. Fluoreszierende oder lumineszierende Markierungen können aus Standardquellen im Handel erhalten werden, wie Molekularsonden (Eugene, OR).
  • Primer
  • Die Primer 16 können durch jedes beliebige im Stand der Technik bekannte Verfahren erhalten werden. Im Allgemeinen weisen die Primer 16 eine Länge von zwischen zehn und zwanzig Basen auf, wenngleich längere Primer 16 eingesetzt werden können. In bestimmten Ausführungsformen sind die Primer 16 gestaltet, um bezüglich der Sequenz exakt zu einem bekannten Abschnitt eines Matrizennukleinsäuremoleküls 13 komplementär zu sein, vorzugsweise nahe der Bindungsstelle der Matrize 13 an die Immobilisierungsoberfläche 14. Verfahren zur Synthese von Primern 16 jeder beliebigen Sequenz, zum Beispiel mittels eines automatisierten Nukleinsäuresynthetisators unter Anwendung der Phosphoramiditchemie sind bekannt und solche Instrumente können von Standardquellen wie Applied Biosystems (Foster City, CA) oder Millipore Corp. (Bedford, MA) erhalten werden.
  • Andere Ausführungsformen betreffen das Sequenzieren einer Nukleinsäure 13 in Abwesenheit einer bekannten Primerbindestelle. In solchen Fällen kann es möglich sein, zufällige Primer 16 wie zufällige Hexamere oder zufällige Oligomere mit einer Länge von 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 Basen oder einer größeren Länge zu benutzen, um die Polymerisation eines naszierenden Strangs 16 zu initiieren. Um die Existenz einer Vielzahl von Polymerisationsstellen auf einem einzelnen Matrizenstrang 13 zu vermeiden, können Primer 16 neben denjenigen, die zu dem Matrizenmolekül 13 nahe ihrer Bindungsstelle an die Immobilisierungsoberfläche 14 hybridisiert werden, entfernt werden, bevor die synthetische Reaktion ausgelöst wird.
  • Dies könnte zum Beispiel mittels einer Immobilisierungsoberfläche 14 erreicht werden, die mit einem Bindemittel wie Streptavidin beschichtet ist. Ein komplementäres Bindemittel wie Biotin könnte an das 5'-Ende der Primermoleküle 16 gebunden werden. Nach Stattfinden der Hybridisierung zwischen dem Primer 16 und der Matrize 13 könnten diejenigen Primermoleküle 16, die nicht auch an die Immobilisierungsoberfläche 14 gebunden werden, entfernt werden. Nur diejenigen Primer 16, die zu dem Matrizenstrang 13 hybridisiert werden, dienen als Primer 16 für die matrizenabhängige DNS-Synthese. In anderen alternativen Ausführungsformen kann eine Vielzahl von Primermolekülen 16 an die Immobilisierungsoberfläche 14 gebunden werden. Ein Matrizenmolekül 13 wird hinzugefügt und zu einem komplementären Primer 16 wasserstoffgebunden lassen. Eine matrizenabhängige Polymerase 15 wirkt dann, um die Synthese des naszierenden Strangs 16 zu initiieren.
  • Andere Arten der Vernetzung könnten benutzt werden, um selektiv nur einen Primer 16 pro Matrizenstrang 13 zu halten, wie photoaktivierbare Vernetzungsmittel. Wie oben erläutert, ist eine Anzahl von Vernetzungsmitteln im Stand der Technik bekannt und kann benutzt werden. Vernetzungsmittel können auch durch Verbindungsarme an die Immobilisierungsoberfläche 14 gebunden werden, um die Möglichkeit der sterinen Hinderung zu vermeiden, wobei die Immobilisierungsoberfläche 14 die Wasserstoffbindung zwischen dem Primer 16 und der Matrize 13 behindert.
  • Reaktionskammer
  • Die Reaktionskammer 11 ist gestaltet, um die Immobilisierungsoberfläche 14, Nukleinsäurematrize 13, Primer 16, synthetisches Reagenz 15 und die Nukleotidvorläufer 17 in einer wässrigen Umgebung zu halten. In einigen Ausführungsformen ist die Reaktionskammer 11 mit einer Temperaturregelung gestaltet, zum Beispiel durch Aufnahme von Pelletier-Elementen oder anderen im Stand der Technik bekannten Verfahren. Verfahren zum Regeln der Temperatur für Flüssigkeiten mit geringem Volumen, die bei der Nukleinsäurepolymerisation benutzt werden, sind im Stand der Technik bekannt (Siehe zum Beispiel US-Patentschriften Nr. 5,038,853 , 5,919,622 , 6,054,263 und 6,180,372 .)
  • In bestimmten Ausführungsformen werden die Reaktionskammer 11 und sämtliche zugehörige Fluidkanäle, zum Beispiel zur Bereitstellung von Verbindungen zu einem Molekülspender 21, zu einer Auslassöffnung, zu einer Einlassöffnung für die Matrize 13 oder zu einer Quelle von synthetischen Reagenzien, in einem diskontinuierlichen Herstellungsverfahren hergestellt, wie auf den Gebieten der Herstellung von Computerchips oder der Herstellung von Mikrokapillar-Chips bekannt ist. In einigen Ausführungsformen können die Reaktionskammer 11 und andere Bauteile der Vorrichtung 10 wie der Molekülspender 21 als ein einziger integrierter Chip hergestellt sein. Solch ein Chip kann durch im Stand der Technik bekannte Verfahren wie durch Photolithographie und Ätzen hergestellt werden. Jedoch ist das Herstellungsverfahren nicht einschränkend und andere im Stand der Technik bekannte Verfahren können angewendet werden, wie Ablation, Spritzguss, Guss oder Prägetechniken. Verfahren zur Herstellung von nanoelektromechanischen Systemen können für bestimmte Ausführungsformen verwendet werden, wie diejenigen, die einen Molekülspender 21 ein setzen (Siehe zum Beispiel Craighead, Science 290: 1532–36, 2000.). Durch Mikrotechnologie hergestellte Chips sind im Handel von Quellen wie Caliper Technologies Inc. (Mountain View, CA) und ACLARA BioSciences Inc. (Mountain View, CA) erhältlich.
  • In einem nicht einschränkenden Beispiel können Borofloat-Glasplättchen (Precision Glass & Optics, Santa Ana, CA) für einen kurzen Zeitraum in konzentrierter HF (Fluorwasserstoffsäure) vorgeätzt und vor der Abscheidung einer amorphen Silizium-Opferschicht in einem System der plasmagestützten chemischen Dampfabscheidung (PECVD) (PEII-A, Technics West, San Jose, CA) gereinigt werden. Plättchen können mit Hexamethyldisilazan (HMDS) grundiert, mit Fotolack (Shipley 1818, Marlborough, MA) rotationsbeschichtet und weich gebacken werden. Ein Kontaktmaskenausrichter (Quintet Corp. San Jose, CA) kann benutzt werden, um die Fotolackschicht mit einer oder mehreren Maskengestaltungen zu belichten und der belichtete Fotolack kann mittels einer Mischung eines Microposit-Entwicklerkonzentrats (Shipley) und Wasser entfernt werden. Die entwickelten Plättchen können hart gebacken und das belichtete amorphe Silizium mittels CF4 (Kohlenstofftetrafluorid) in einem PECVD-Reaktor entfernt werden. Die Plättchen können mit konzentriertem HF chemisch geätzt werden, um die Reaktionskammer 11 und sämtliche Kanäle zu bilden. Der verbleibende Fotolack kann abgezogen und das amorphe Silizium entfernt werden.
  • Zugangslöcher können mit einer Diamantbohrkrone (Crystalite, Westerville, OH) in die geätzten Plättchen gebohrt werden. Ein fertiger Chip kann durch Verschweißen einer geätzten und gebohrten Platte an ein flaches Plättchen der gleichen Größe in einem programmierbaren Vakuumofen (Centurion VPM, J. M. Ney, Yucaipa, CA) hergestellt werden. In bestimmten Ausführungsformen kann der Chip durch Binden von zwei geätzten Platten aneinander hergestellt werden. Alternative beispielhafte Verfahren zur Herstellung eines Chips einer Reaktionskammer 11 sind in den US-Patentschriften Nr. 5,867,266 und 6,214,246 offenbart.
  • Um die Detektion von Nukleotidvorläufern 17 von der Detektionseinheit 12 zu ermöglichen, kann das Material, das die Reaktionskammer 11 umfasst, ausgewählt sein, um gegenüber elektromagnetischer Strahlung bei den für die Detektionseinheit 12 benutzten Erregungs- und Emissionsfrequenzen durchlässig zu sein. Glas, Silizium und beliebige andere Materialien, die in den für die Raman-Spektroskopie benutzten Frequenzbereichen im Allgemeinen durchlässig sind, Fluoreszenzspektroskopie, Lumineszenzspektroskopie oder andere Formen der Spektroskopie können zur Konstruktion der Reaktionskammer 11 benutzt werden. In einigen Ausführungsformen können die Oberflächen der Reaktionskammer 11, die der Detektionseinheit 12 gegenüberliegen, mit Silber, Gold, Platin, Kupfer, Aluminium oder anderen Materialien beschichtet werden, die gegenüber der Detektionseinheit 12 relativ undurchlässig sind. In dieser Position ist das undurchlässige Material verfügbar, um das Raman-Signal oder ein anderes Signal zum Beispiel durch oberflächenverstärkte Raman-Spektroskopie zu verstärken, während die Funktion der Detektionseinheit 12 nicht behindert wird. In alternativen Ausführungsformen kann ein Netz, das Silber, Gold, Platin Kupfer, oder Aluminium umfasst, im Inneren der Reaktionskammer angeordnet werden.
  • In verschiedenen Ausführungsformen kann die Reaktionskammer 11 ein Innenvolumen von etwa 1 Picoliter, etwa 2 Picoliter, etwa 5 Picoliter, etwa 10 Picoliter, etwa 20 Picoliter, etwa 50 Picoliter, etwa 100 Picoliter, etwa 250 Picoliter, etwa 500 Picoliter, etwa 1 Nanoliter, etwa 2 Nanoliter, 5 Nanoliter, etwa 10 Nanoliter, etwa 20 Nanoliter, etwa 50 Nanoliter, etwa 100 Nanoliter, etwa 250 Nanoliter, etwa 500 Nanoliter, etwa 1 Mikroliter, etwa 2 Mikroliter, etwa 5 Mikroliter, etwa 10 Mikroliter, etwa 20 Mikroliter, etwa 50 Mikroliter, etwa 100 Mikroliter, etwa 250 Mikroliter, etwa 500 Mikroliter oder etwa 1 Milliliter aufweisen.
  • Molekülspender
  • Der Molekülspender 21 ist gestaltet, um die Nukleotidvorläufer 17 in die Reaktionskammer 11 abzugeben. In bestimmten Ausführungsformen kann der Molekülspender 21 jede Art von Nukleotidvorläufern 17 in gleichen Mengen abgeben. In solchen Ausführungsformen kann ein einziger Molekülspender 21 benutzt werden, um alle vier Nukleotidvorläufer 17 in die Reaktionskammer 11 abzugeben. Andere Ausführungsformen können erfordern, dass die Freisetzungsrate der vier Arten von Nukleotidvorläufern 17 unabhängig gesteuert wird. In solchen Ausführungsformen kann eine Vielzahl von Molekülspendern 21 benutzt werden. In einem nicht einschränkenden Beispiel können vier separate Molekülspender 21 benutzt werden, wobei jeder eine einzige Art von Nukleotidvorläufer 17 in die Reaktionskammer 11 abgibt.
  • In verschiedenen Ausführungsformen kann der Molekülspender 21 in Form einer Pumpenvorrichtung vorliegen. Zu Pumpenvorrichtungen, die benutzt werden können, gehören verschiedene durch Mikrotechnologie hergestellte Pumpen, die im Stand der Technik bekannt sind. Zum Beispiel sind Pumpen mit einer schwellenden Membran, die von einem piezoelektrischen Stapel angetrieben werden, und mit zwei Prüfventilen in den US-Patentschriften Nr. 5,277,556 , 5,271,724 und 5,171,132 offenbart. Pumpen, die von einem thermopneumatischen Element angetrieben werden, sind in der US-Patentschrift Nr. 5,126,022 offenbart. Piezoelektrische Peristaltikpumpen, die eine Vielzahl von Membranen in Reihe benutzen, oder Peristaltikpumpen, die von einer angelegten Spannung angetrieben werden, sind in der US-Patentschrift Nr. 5,705,018 offenbart. Die veröffentlichte PCT-Anmeldung Nr. WO 94/05414 offenbart die Verwendung einer Lambwellenpumpe zum Fluidtransport in Kanäle im Mikrometerbereich. Der Fachmann wird erkennen, dass der Molekülspender 21 nicht auf die hierin offenbarten Pumpen eingeschränkt ist, sondern jede beliebige im Stand der Technik bekannte Gestaltung für die gemessene Ausschüttung von Fluida mit sehr geringem Volumen einschließen kann.
  • In anderen Ausführungsformen kann der Molekülspender 21 die Form einer elektrohydrodynamischen Pumpe (zum Beispiel Richter et al., Sensors and Actuators 29: 159–165, 1991; US-Patentschrift Nr. 5,126,022 ) annehmen. In der Regel setzen solche Pumpen eine Reihe von Elektroden ein, die über eine Oberfläche eines Kanals oder die Reaktions-/Pumpenkammer angeordnet sind. Die Anlegung eines elektrischen Feldes über die Elektroden führt zu einer elektrophoretischen Bewegung von geladenen Spezies in der Probe. Indiumzinnoxidschichten können zum Mustern von Elektroden auf Substratoberflächen, zum Beispiel einem Glas- oder Siliziumsubstrat besonders geeignet sein. Diese Verfahren können auch angewendet werden, um die Nukleotidvorläufer 17 in die Reaktionskammer 11 zu ziehen. Zum Beispiel können die Elektroden auf der Oberfläche des Molekülspenders 21 gemustert werden und mit geeigneten funktionellen Gruppen zum Koppeln der Nukleotidvorläufer 17 an die Oberfläche der Elektroden modifiziert werden. Die Anlegung eines Stroms zwischen den Elektroden auf der Oberfläche des Molekülspenders 21 und einer gegenüberliegenden Elektrode führt zu einer elektrophoretischen Bewegung der Nukleotidvorläufer 17 in die Reaktionskammer 11.
  • In bestimmten Ausführungsformen kann der Molekülspender 21 gestaltet sein, um jeweils einen einzigen Nukleotidvorläufer 17 abzugeben. In anderen Ausführungsformen kann der Molekülspender 21 gestaltet sein, um Nukleotidvorläufer 17 in Mengen von etwa 1 Picoliter, etwa 2 Picoliter, etwa 5 Picoliter, etwa 10 Picoliter, etwa 20 Picoliter, etwa 50 Picoliter, etwa 100 Picoliter, etwa 250 Picoliter, etwa 500 Picoliter, etwa 1 Nanoliter, etwa 2 Nanoliter, 5 Nanoliter, etwa 10 Nanoliter, etwa 20 Nanoliter, etwa 50 Nanoliter, etwa 100 Nanoliter, etwa 250 Nanoliter, etwa 500 Nanoliter, etwa 1 Mikroliter, etwa 2 Mikroliter, etwa 5 Mikroliter, etwa 10 Mikroliter, etwa 20 Mikroliter oder etwa 50 Mikroliter abzugeben.
  • Detektionseinheit
  • Raman-bezogene Ausführungsformen
  • In einigen Ausführungsformen ist die Detektionseinheit 12 gestaltet, um Nukleotidvorläufer 17 durch Raman-Spektroskopie zu detektieren und zu quantifizieren. Verschiedene Verfahren zur Detektion von Nukleotidvorläufern 17 durch Raman-Spektroskopie sind im Stand der Technik bekannt (Siehe zum Beispiel die US-Patentschriften Nr. 5,306,403 ; 6,002,471 ; 6,174,677 ). Variationen bezüglich der oberflächenverstärkten Raman-Spektroskopie (SERS) oder der oberflächenverstärkten Resonsanz-Raman-Spektroskopie (SERRS) sind offenbart worden. Bei der SERS und SERRS wird die Empfindlichkeit der Raman-Detektion um einen Faktor von 106 oder mehr für Moleküle verstärkt, die auf aufgerauten Metalloberflächen wie Silber-, Gold-, Platin-, Kupfer- oder Aluminiumoberflächen adsorbiert werden.
  • Ein nicht einschränkendes Beispiel einer Detektionseinheit 12 ist in der US-Patentschrift Nr. 6,002,471 offenbart. In dieser Ausführungsform wird der Erregungsstrahl 20 entweder durch einen Nd:YAG-Laser 18 bei einer Wellenlänge von 532 nm oder einen Ti:Saphir-Laser 18 bei einer Wellenlänge von 365 erzeugt. Gepulste Laserstrahle 20 oder kontinuierliche Laserstrahle 20 können benutzt werden. Der Erregungsstrahl 20 geht durch ein konfokales optisches System und ein Mikroskopobjektiv und wird auf die Reaktionskammer 11 fokussiert. Das Raman-Emissionslicht aus den Nukleotidvorläufern 17 wird von dem Mikroskopobjektiv und dem konfokalen optischen System gesammelt und zur spektralen Dissoziation an den Monochromator 19 gekoppelt. Das konfokale optische System weist eine Kombination von dichroitischen Filtern, Sperrfiltern, konfokalen Phiolen, Linsen und Spiegeln zur Verringerung des Hintergrundsignals auf. Eine standardgemäße Vollfeldoptik kann auch als konfokale Optik benutzt werden. Das Raman-Emissionssignal wird von einem Raman-Detektor 19 detektiert. Der Detektor 19 weist eine Lawinenphotodiode auf, die mit einem Computer zum Zählen und Digitalisieren des Signals verbunden ist. In bestimmten Ausführungsformen kann ein Netz, das Silber, Gold, Platin, Kupfer oder Aluminium umfasst, in die Reaktionskammer 11 aufgenommen werden, um aufgrund der oberflächenverstärkten Raman- Spektroskopie oder oberflächenverstärkten Raman-Resonanz-Spektroskopie ein erhöhtes Signal bereitzustellen.
  • Alternative Ausführungsformen der Detektionseinheiten 12 sind zum Beispiel in der US-Patentschrift Nr. 5,306,403 offenbart, die ein Doppelgitter-Spektrophotometer 19 des Typs Spex Model 1403 ausgestattet mit einer Gallium-Arsenid-Photomultiplikatorröhre (RCA Model C31034 oder Burle Industries Model C3103402) aufweist. Die Erregungsquelle 18 ist ein Argon-Ionen-Laser mit einer Wellenlänge von 514,5 nm von SpectraPhysics, Model 166, und ein Krypton-Ionen-Laser mit einer Wellenlänge von 647,1 nm (Innova 70, Coherent).
  • Zu alternativen Erregungsquellen 18 gehören ein Stickstofflaser (Laser Science Inc.) bei 337 nm und ein Helium-Kadmium-Laser (Liconox) bei 325 nm ( US-Patentschrift Nr. 6,174,677 ). Der Erregungsstrahl 20 kann mit einem Bandpassfilter (Corion) spektral gereinigt werden und kann mittels einer 6fach-Objektivlinse (Newport, Model L6X) auf die Reaktionskammer 11 fokussiert werden. Die Objektivlinse kann benutzt werden, um sowohl die Nukleotidvorläufer 17 zu erregen als auch das Raman-Signal zu erfassen, indem ein holographischer Strahlteiler (Kaiser Optical Systems, Inc., Model HB 647-26N18) benutzt wird, um eine rechtwinklige Geometrie für den Erregungsstrahl 20 und das emittierte Raman-Signal zu erzeugen. Ein holographischer Kerbfilter (Kaiser Optical Systems, Inc.) kann zur Verringerung der gestreuten Rayleigh-Strahlung benutzt werden. Zu alternativen Raman-Detektoren 19 gehören ein ISA HR-320-Spektrograph, der mit einem Detektionssystem mit einer rotverstärkten, intensivierten ladungsgekoppelten Vorrichtung (RE-ICCD) (Princeton Instruments) ausgestattet ist. Andere Arten von Detektoren 19 können benutzt werden, wie geladene Injektionsvorrichtungen, Photodiodenanordnungen oder Phototransistoranordnungen.
  • Jede beliebige geeignete Form oder Konfiguration von Raman-Spektroskopie oder verwandte Techniken, die im Stand der Technik bekannt sind, können zur Detektion von Nukleotiden 16, 104 benutzt werden, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf die normale Raman-Streuung, Resonanz-Raman-Streuung, oberflächenverstärkte Raman-Streuung, oberflächenverstärkte Resonsanz-Raman-Streuung, kohärente anti-Stokes-Raman-Spektroskopie (CARS), stimulierte Raman-Streuung, umgekehrte Raman-Spektroskopie, stimulierte Verstärkungs-Raman-Spektroskopie, Hyper-Raman-Streuung, den molukularen optischen Laserprüfer (MOLE) oder Raman-Mikrosonde oder Raman-Mikroskopie oder konfokale Raman-Mikrospektrometrie, dreidimensionale oder Abtast-Raman, Raman-Sättigungsspektroskopie, zeitaufgelöste Resonanz-Raman, Raman-Entkopplungsspektroskopie oder UV-Raman-Mikroskopie.
  • FRET-bezogene Ausführungsformen
  • In bestimmten alternativen Ausführungsformen können die Nukleotidvorläufer 17 mittels Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET) identifiziert und quantifiziert werden. Der FRET ist ein spektroskopisches Phänomen, das zur Detektion von Nähe zwischen einem Donormolekül und einem Akzeptormolekül benutzt wird. Die Donor- und Akzeptorpaare werden derart ausgewählt, dass eine fluoreszierende Emission aus dem Donor das Erregungsspektrum des Akzeptors überlappt. Wenn die zwei Moleküle (bei einem Abstand von weniger als 100 Angström) assoziiert werden, wird die Energie im erregten Zustand des Donors strahlungs los auf den Akzeptor übertragen und die Donoremission wird gelöscht. Wenn das Akzeptormolekül eine Fluorophore ist, dann wird seine Emission verbessert. Zusammensetzungen und Verfahren zur Verwendung von FRET mit Oligonukleotiden sind im Stand der Technik bekannt (zum Beispiel US-Patentschrift Nr. 5,866,366 ).
  • Zu Molekülen, die häufig als Markierungen für FRET benutzt werden, gehören Fluorescein, 5-Carboxyfluorescein (FAM), 2'7'-Dimethoxy-4'5'-dichloro-6-carboxyfluorescein (JOE), Rhodamin, 6-Carboxyrhodamin (REG), N,N,N',N'-Tetramethyl-6-carboxyrhodamin (TAMRA), 6-Carboxy-X-rhodamin (ROX), 4-(4'-Dimethylaminophenylazo)benzoesäure (DABCYL) und 5-(2'-Aminoethyl)aminonaphthalen-1-sulfonsäure (EDANS). Andere potentielle FRET-Donor- oder Akzeptormoleküle sind im Stand der Technik bekannt (Siehe US-Patentschrift Nr. 5,866,336 , Tabelle 1). Der Fachmann wird mit der Auswahl von Paaren von Markierungsmolekülen für den FRET vertraut sein ( US-Patentschrift Nr. 5,866,336 ).
  • In FRET-bezogenen Ausführungsformen können die Donor- und Akzeptormoleküle kovalent oder nicht kovalent an verschiedene Bestandteile der Sequenzierungsvorrichtung 10 gebunden werden. In bestimmten Ausführungsformen können die Donor- und Akzeptormoleküle an die Nukleotidvorläufer 17, an den Matrizenstrang 13 oder die Polymerase 15 gebunden werden.
  • In bestimmten Ausführungsformen kann das Donormolekül an den Matrizenstrang 13 und die Akzeptormoleküle an die Nukleotidvorläufer 17 gebunden werden. In diesem Fall sollte jede Art von Nukleotidvorläufer 17 an ein Akzeptormolekül mit einem unterscheidbaren Emissions spektrum gebunden werden, während das Donormolekül mit einem breiten Emissionsspektrum ausgewählt werden sollte, das sich mit den Erregungsspektren für alle vier Akzeptormoleküle überschneidet. Eine Vielzahl von Donormolekülen wird auf dem Matrizenstrang 13 vorhanden sein, zum Beispiel in Form von fluoreszierenden Interkalantien, die in doppelsträngige Nukleinsäuren eingesetzt werden. In alternativen Ausführungsformen können die Donormoleküle an den Matrizenstrang 13 in einer Position kovalent gebunden werden, welche die Basenpaarbildung nicht beeinträchtigt. Bei Erregung überträgt die Vielzahl von Donormolekülen ihre Energie auf die Akzeptormarkierungsmoleküle, die an die Nukleotidvorläufer 17 gebunden werden, was zu einem verstärkten Emissionssignal aus den Akzeptormolekülen führt. Da die Stärke der Signalverstärkung mit zunehmender Entfernung schnell abnimmt, tritt die größte Signalverstärkung für Nukleotidvorläufer 17 auf, die in den naszierenden Strang 16 eingebunden werden, während die Nukleotidvorläufer 17, die in der Lösung innerhalb der Reaktionskammer 11 frei sind, eine relativ schwache Signalverstärkung aufweisen sollten. Die Wellenlänge des Erregungsstrahls 20 kann ausgewählt werden, um die Donormoleküle maximal zu erregen, während die Akzeptormoleküle nur schwach erregt werden. In diesem Fall erzeugen nur diejenigen Nukleotidvorläufer 17, die in den naszierenden Strang 16 eingebunden sind, ein detektierbares fluoreszierendes Signal. Während jeder Nukleotidvorläufer 17 in den naszierenden Strang 16 eingebunden wird, wird das Signal aus seiner Donormarkierung detektiert.
  • In bestimmten Ausführungsformen kann die zu sequenzierende Matrizennukleinsäure 13 durch im Stand der Technik bekannte Verfahren, zum Beispiel mit Hilfe einer optischen Falle (zum Beispiel US-Patentschrift Nr. 6,136,543 ) innerhalb des Sichtfeldes eines Fluoreszenzmikroskops gehalten werden. Ein nicht einschränkendes Beispiel eines Fluoreszenzmikroskops, das benutzt werden kann, ist ein invertiertes Phasenkontrast- und Auflichtmikroskop (IMT2-RFC, Olympus Co., Ltd.), das eine Ölimmersionslinse mit einer Leistung von 100 (Plan.multidot.Apochromat.times.100, 1.40 NA, Olympus Co., Ltd.) benutzt. Der Erregungsstrahl 20 kann von einem Laser 18 emittiert werden, wie oben erläutert. Die Fluoreszenzemission kann mit Hilfe eines angemessenen Filters durch die Objektivlinse erfasst und mittels jedes beliebigen empfindlichen Fluoreszenzdetektors 19 wie einer CCD-Vorrichtung, Photodioden, Photomultiplikatorröhren oder dergleichen detektiert werden.
  • In alternativen Ausführungsformen kann das Donormolekül an die Polymerase 15 gebunden werden. Wie oben erläutert, sollte jede Art von Nukleotidvorläufer 17 ein unterscheidbares Akzeptormolekül aufweisen und das Emissionsspektrum des Donors sollte sich mit den Erregungsspektren jedes der Akzeptormoleküle überschneiden. Eine Fluoreszenzdetektion kann wie in den Ausführungsformen erläutert, die eine donormarkierte Matrizennukleinsäure 13 betreffen, ausgeführt werden. Da die Anzahl von Donormolekülen im Wesentlichen geringer als bei dem Markierungsverfahren der Matrize 13 ist, sollte die Größe der Signalverstärkung für die Akzeptormoleküle geringer sein. Jedoch sollte der Fluoreszenzresonanztransfer in dieser Ausführungsform auf diejenigen Nukleotidvorläufer 17 eingeschränkt werden, die sich entweder an oder nahe bei der katalytischen Stelle der Polymerase 15 befinden. Das Donormolekül sollte nahe bei der katalytischen Stelle gebunden werden, jedoch in einer Position, in der es die Polymeraseaktivität des synthetischen Reagenzes 15 nicht beeinträchtigt. In dieser Ausführungsform sollte ein viel unkomplizierteres FRET-Signal detektiert werden.
  • Informationsverarbeitungs- und Steuersystem und Datenanalyse
  • In bestimmten Ausführungsformen kann die Sequenzierungsvorrichtung 10 ein Informationsverarbeitungs- und Steuersystem umfassen. Die Ausführungsformen sind für die Art des benutzten Informationsverarbeitungs- und Steuersystems nicht einschränkend. Ein beispielhaftes Informationsverarbeitungs- und Steuersystem kann einen Computer aufweisen, der einen Bus zum Übermitteln von Information und einen Prozessor zum Verarbeiten von Information umfasst. In einer Ausführungsform ist der Prozessor aus der Pentium®-Prozessorfamilie ausgewählt, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf die Pentium® II-Prozessorfamilie, die Pentium® III-Prozessorfamilie und die Pentium® 4-Prozessorfamile, die von Intel Corp. (Santa Clara, CA) erhältlich sind. In alternativen Ausführungsformen kann der Prozessor ein Celeron®-, ein Itanium®- oder ein Pentium Xeon®-Prozessor (Intel Corp., Santa Clara, CA) sein. In verschiedenen anderen Ausführungsformen kann der Prozessor auf einer Intel®-Architektur wie der Intel® IA-32- oder Intel® IA-64-Architektur beruhen. Als Alternative können andere Prozessoren benutzt werden.
  • Der Computer kann ferner einen wahlfreien Zugriffsspeicher (RAM) oder andere dynamische Speichervorrichtung, einen Nur-Lese-Speicher (ROM) und/oder anderen statischen Speicher und eine Datenspeichervorrichtung wie eine Magnetplatte oder optische Platte und ihr ent sprechendes Laufwerk umfassen. Das Informationsverarbeitungs- und Steuersystem kann auch andere Peripheriegeräte umfassen, die im Stand der Technik bekannt sind, wie eine Anzeigevorrichtung (zum Beispiel Kathodenstrahlröhren- oder Flüssigkristallanzeige), eine alphanumerische Eingabevorrichtung (zum Beispiel Tastatur), eine Cursorsteuervorrichtung (zum Beispiel Maus, Steuerkugel oder Cursorausrichtungstasten) und eine Kommunikationsvorrichtung (zum Beispiel Modem, Netzwerkschnittstellenkarte oder Schnittstellenvorrichtung, die zur Verbindung mit einem Ethernet benutzt wird, Token-Ring oder andere Netzarten).
  • In bestimmten Ausführungsformen kann die Detektionseinheit 12 auch an den Bus gekoppelt sein. Daten aus der Detektionseinheit 12 können von dem Prozessor verarbeitet werden und die Daten können in dem Hauptspeicher gespeichert werden. Die Daten hinsichtlich der Emissionsprofile für Standardnukleotidvorläufer 17 können ebenfalls im Haupt- oder ROM-Speicher gespeichert werden. Der Prozessor kann die Emissionsspektren der Nukleotidvorläufer 17 in der Reaktionskammer vergleichen, um die Art von Nukleotidvorläufer 17 zu identifizieren, die in den naszierenden Strang 16 eingebunden wird. Der Hauptspeicher kann auch die Sequenz von Nukleotidvorläufern 17 speichern, die aus der Reaktionskammer 11 verschwinden. Der Prozessor kann die Daten aus der Detektionseinheit 12 analysieren, um die Sequenz der Matrizennukleinsäure 13 zu bestimmen.
  • Man wird zu schätzen wissen, dass für bestimmte Implementierungen ein anders ausgestattetes Informationsverarbeitungs- und Steuersystem als das oben beschriebene Beispiel benutzt werden kann. Folglich kann die Konfiguration des Systems in unterschiedlichen Ausführungsformen variieren. Auch ist zu berücksichtigen, dass, während die hierin beschriebenen Prozesse unter der Steuerung eines programmierten Prozessors ausgeführt werden können, die Prozesse in alternativen Ausführungsformen voll oder teilweise von jeder beliebigen programmierbaren oder hart-codierten Logik wie feldprogrammierbaren Gatteranordnungen (FPGAs), TTL-Logik oder anwendungsspezifischen integrierten Schaltungen (ASICs) implementiert werden können. Außerdem kann das Verfahren durch jede beliebige Kombination von programmierten Universalrechnerkomponenten und/oder benutzerdefinierten Hardwarekomponenten ausgeführt werden.
  • Nach dem Datenerfassungsvorgang werden die Daten in der Regel einem Datenanalysevorgang mitgeteilt. Um den Analysevorgang zu ermöglichen, werden die von der Detektionseinheit 12 erhaltenen Daten in der Regel mittels eines digitalen Computers analysiert. In der Regel ist der Computer zum Empfang und zur Speicherung der Daten aus der Detektionseinheit 12 sowie zur Analyse und Mitteilung der erfassten Daten geeignet programmiert In bestimmten Ausführungsformen kann dies das Bestimmen der Konzentration von Nukleotidvorläufern 17 in der Reaktionskammer 11 aus den Raman-Daten und das Subtrahieren von Raman-Hintergrundsignalen einbeziehen.
  • In bestimmten Ausführungsformen kann das Informationsverarbeitungs- und Steuersystem die Menge an Nukleotidvorläufern 17, die in die Reaktionskammer 11 abgegeben werden, steuern. In solchen Ausführungsformen kann das Informationsverarbeitungs- und Steuersystem zwischen der Detektionseinheit 12 und dem Molekülspender 21 verbunden sein, um die Freisetzung von Nukleotidvorläufern 17 von dem Molekülspender 21 zu regulieren, um die Auf nahmerate von Nukleotidvorläufern 17 in den naszierenden Strang 16 ungefähr daran anzupassen.
  • In bestimmten Ausführungsformen können benutzerdefinierte Softwarepakete benutzt werden, um die aus der Detektionseinheit 12 erhaltenen Daten zu analysieren. In alternativen Ausführungsformen kann die Datenanalyse mittels eines Informationsverarbeitungs- und Steuersystems und öffentlich erhältlichen Softwarepaketen ausgeführt werden. Zu nicht einschränkenden Ausführungsformen von erhältlicher Software zur DNS-Sequenzanalyse gehören die PRISMTM-DNS-Sequenzierungsanalysesoftware (Applied Biosystems, Foster City, CA), das SequencherTM-Paket (Gene Codes, Ann Arbor, MI) und verschiedene Softwarepakete, die von der National Biotechnology Information Facility auf der Website www.nbif.org/links/1.4.1.php. erhältlich sind.

Claims (7)

  1. Vorrichtung, umfassend: a) eine Reaktionskammer (11), um eine Polymerase (15) und mindestens ein Nukleinsäurematrize (13) aufzunehmen, die an eine Immobilisierungsoberfläche (14) gebunden ist, um einen naszierenden Strang (16) zu züchten, der bezüglich der Sequenz zu der entsprechenden Matrize komplementär ist; b) eine Detektionseinheit (12), die eine Erregungsquelle (18) umfasst, wobei die Detektionseinheit zum Identifizieren und Quantifizieren von Nukleotidvorläufern (17) in der Reaktionskammer ausgelegt ist, um Nukleotidvorläufer zu identifizieren, die in den naszierenden Strang oder die naszierenden Stränge eingebunden sind; wobei die Vorrichtung gekennzeichnet ist durch: c) einen Molekülspender (21) zum Abgeben von Nukleotidvorläufern in die Reaktionskammer; und d) ein Informationsverarbeitungs- und Steuersystem, das mit der Detektionseinheit und dem Molekülspender zum Steuern der Nukleotidvorläufer-Freisetzungsrate des Spenders betrieblich verbunden ist, um die Freisetzung von Nukleotidvorläufern von dem Molekülspender zu regulieren, um die Aufnahmerate von Nukleotidvorläufern in den naszierenden Strang oder die naszierenden Stränge (16) ungefähr daran anzupassen, wobei der Molekülspender eine Vielzahl von Molekülspendern zum Abgeben von vier Arten von Nukleinsäurevorläufern umfasst, wodurch die Freisetzungsrate der vier Arten von Nukleotidvorläufern unabhängig gesteuert wird.
  2. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Reaktionskammer ein einzelnes Nukleinsäuremolekül enthält, das an eine Immobilisierungsoberfläche gebunden ist.
  3. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Reaktionskammer ein Silber-, Gold-, Platin-, Kupfer- oder Aluminiumnetz enthält.
  4. Vorrichtung nach Anspruch 1, ferner umfassend eine Datenspeichereinheit.
  5. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Reaktionskammer und der Molekülspender Teil eines integrierten Chips sind.
  6. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Erregungsquelle ein Laser ist.
  7. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei der Raman-Detektor ein Spektrometer oder ein Monochromator ist.
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DE102011008788B3 (de) * 2011-01-14 2012-05-03 Institut Für Photonische Technologien E.V. Anordnung zur Durchführung einer Einzelprobenanalyse und -manipulation für die Raman-Mikrospektroskopie

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