BRPI0620434A2 - teste aperfeiçoado de ativação de monócitos capaz de detectar melhor contaminantes pirogênicos não-endotóxicos em produtos médicos - Google Patents

Abstract

TESTE APERFEIçOADO DE ATIVAçãO DE MONóCITOS CAPAZ DE DETECTAR MELHOR CONTAMINANTES PIROGêNICOS NãO-ENDOTóXICOS EM PRODUTOS MéDICOS. A presente invenção refere-se a um teste aperfeiçoado de ativação de monócitos que é capaz de detectar melhor pirogénios não- endotóxicos em produtos médicos, teste este em que uma amostra é incubada com um reagente que contém monócitos em um sistema de ensaio que compreende pelo menos uma superfície que compreende polipropileno. A invenção também se refere a sistemas de ensaio para uso nesses testes que incluem pelo menos uma cavidade de microtitulação que apresenta pelo menos uma superfície interna que compreende polipropileno e que apresenta um perfil tal que reagente contendo monócitos seja concentrado na cavidade para proporcionar maior contato célula-célula. A invenção também se refere a um kit de diagnóstico que pode ser usado para testar a presença de pirogênios não-endotóxicos em uma amostra.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "TESTE A- PERFEIÇOADO DE ATIVAÇÃO DE MONÓCITOS CAPAZ DE DETECTAR MELHOR CONTAMINANTES PIROGÊNICOS NÃO-ENDOTÓXICOS EM PRODUTOS MÉDICOS".

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção geralmente refere-se a um teste aperfeiço- ado de ativação de monócitos que é capaz de detectar melhor pirogênios não-endotóxicos em produtos médicos, teste este em que uma amostra é incubada com um reagente que contém monócitos em um sistema de ensaio que compreende pelo menos uma superfície que compreende polipropileno. A invenção também se refere a sistemas de ensaio para uso nesses testes que incluem pelo menos uma cavidade de microtitulação que apresenta pelo menos uma superfície interna que compreende polipropileno e que apresen- ta um perfil tal que reagente contendo monócitos seja concentrado na cavi- dade para proporcionar maior contato célula-célula. A invenção também se refere a um kit de diagnóstico que pode ser usado para testar a presença de pirogênios não-endotóxicos em uma amostra.

ANTECEDENTE DA INVENÇÃO

Quando certos compostos químicos ou biológicos são levados a contato com o sistema circulatório de seres humanos ou outros mamíferos, eles causam uma resposta sistêmica conhecida como resposta inflamatória ou inflamação. A resposta inflamatória é um mecanismo de defesa para pro- teger o corpo de infecção e/ou dano; inflamação aumenta o fluxo de sangue ao local de infecção ou dano, levando fluidos, proteínas e células brancas do sangue (leucócitos) necessários para ajudar no processo de cicatrização. Por exemplo, um sintoma associado à resposta inflamatória é uma elevação na temperatura do corpo ou febre, que funciona como um mecanismo de defesa a patógenos que causam superaquecimento. A resposta inflamatória poderá ser associada a uma variedade de sintomas "semelhantes à influen- za" que incluem febre, calafrios, fadiga, dores de cabeça, perda de apetite e rigidez muscular. Um composto químico ou biológico que dispara febre tem sido historicamente referido como "pirogênio" ou composto "pirogênico", re ferindo-se à resposta febril que tais compostos poderão causar. Alguns com- postos químicos ou biológicos, entretanto, são geralmente pró-inflamatórios e poderão ou não causar febre como parte da resposta inflamatória que cau- sam.

Em alguns casos, dependendo da sensibilidade de um indivíduo e do tipo e concentração de pirogênio a que é exposto, o indivíduo pode de- senvolver sintomas similares a choque após exposição a um pirogênio que ameaçam a vida. Produtos médicos que podem ser inalados, injetados ou infundidos e dispositivos médicos tais como membranas ou materiais implan- tados apresentam um risco particular de pirogenicidade. Mesmo nutrientes podem representar um risco de pirogenicidade. Pirogênios contidos em pro- dutos e nutrientes são referidos como pirogênios exógenos; em contraste, pirogênios endógenos são compostos mensageiros do sistema imune que medeiam resposta inflamatória de um indivíduo a pirogênios exógenos. Além da natureza pirogênica do próprio produto ou subprodutos de sua produção, contaminação do produto pode freqüentemente causar pirogenicidade. Piro- genicidade devido à contaminação de um produto pode ser causada por qualquer um de um grupo diverso de pirogênios derivados de bactérias, ví- rus, fungos ou mesmo do hospedeiro. Esse problema pode persistir mesmo que o produto seja "esterilizado" por métodos térmicos ou químicos; um composto pirogênico comumente encontrado, endotoxina bacteriana (que consiste grandemente em lipopolissacarídeo (LPS) da parede celular de bac- térias gram-negativas), pode permanecer após as bactérias serem mortas. Assim, teste de pirogênio de vários produtos farmacêuticos, nutrientes e produtos médicos para aplicação parenteral é necessário a fim de assegurar a segurança de tais produtos.

Usualmente, compostos que atuam como pirogênio funcionam assim por estimulação da produção de pirogênios endógenos, tais como prostaglandinas e citocinas pró-inflamatórias, em monócitos após contato com tecido, células ou fluidos corporais. São esses pirogênios produzidos endogenamente que mediam a resposta inflamatória no organismo afetado. Os pirogênios mais importantes e bem conhecidos desses pirogênios endó- genos são as citocinas interleucina-1 (IL-1), interleucina-6 (IL-6), interleuci- na-8 (IL-8) e fator de necrose de tumor (TNF)1 e o mediador de lipídeos de baixo peso molecular prostaglandina E2 (PGE2). Esses compostos são roti- neiramente ensaiados por ELISA, ou ensaios imunossorventes ligados à en- zima (para IL-1, IL-6 ou TNF), e EIA, ou imunoensaio enzimático (para PGE2).

A fim de evitar uma reação pirogênica e asseguar a segurança de qualquer fármaco ou produto farmacêutico administrado parenteralmente, contaminação pirogênica tem de ser monitorada para identificar lotes indivi- duais que estão contaminados com contaminantes bacterianos. Dois méto- dos farmacopáicos baseados em animais, o teste de Iisados de amebócitos de Limulus (LAL), também referido como teste de endotoxinas bacterianas (BET), e o teste de pirogênios de coelho, são presentes e rotineiramente utilizados para monitorar contaminação pirogênica em produtos farmacêuti- cos produzidos em massa.

O teste do coelho é um teste in vivo que consiste em injetar um número de coelhos estatisticamente significativo com o composto de amos- tra e observar a elevação média de temperatura corporal originada nos ani- mais de teste. Embora o teste do coelho seja responsivo a um amplo espec- tro de agentes pirogênicos, incluindo pirogênios não-endotóxicos, esse teste do coelho apresenta uma sensibilidade relativamente baixa (ng de endotoxi- na/ml) comparada a de outros testes de pirogênio (pg de endotoxina/ml para o teste LAL). Adicionalmente, a correlação de resposta pirogênica com com- postos entre espécies é, no melhor dos casos, aproximada. Acha-se docu- mentado, por exemplo, que a dose de endotoxina bacteriana que origina uma resposta pirogênica varia tanto quanto 10.000 vezes entre espécies. A intensidade relativa, resultados quantitativos pobres, variabilidade entre es- pécies de coelhos e problemas éticos envolvidos em testes com animais têm tornado desfavorável nos últimos anos o teste com coelhos.

Em contraste com o teste do coelho, que detecta uma ampla faixa de pirogênios, o teste LAL somente detecta pirogênios endotóxicos. Endotoxina bacteriana, por exemplo lipopolissacarídeo (LPS), que se origina da parede celular de bactérias gram-negativas, é um dos melhores compos- tos pirogênicos descritos (Moltz e outros, Neurosci. Biobehav. Rev., 1993, 17, 237-269; Tilders e outros, Psychoneuroendocrinology, 1994, 19, 209- 232; Rothwell, Crit. Rev. Neurobiol., 1994, 8, 1-10; Zeisberger e Roth, Neu- ropsychobiology, 1993, 28, 106-109). Ensinou-se, portanto, ser geralmente útil substituir experimentos onerosos e que demandam tempo com coelhos por um teste LAL direto para endotoxina bacteriana. Essa abordagem apre- senta limitações óbvias. O teste LAL é um teste in vitro muito sensível; con- tudo, ele somente detecta endotoxinas de bactérias gram-negativas e forne- ce resultados falso negativo com certos produtos que podem todavia estimu- lar monócitos para produzir citocinas pirogênicas. O teste LAL é também suscetível à interferência por, por exemplo, altos níveis de proteína de subs- tâncias do teste ou por glicanos (Roslansky e Novitsky, J. Clin. Microbiol., 1991, 29, 2477; Fennrich e outros, Dev. BioL Stand., 1999, 101, 131). Por outro lado, o teste de Limulus é tão sensível que é facilmente propenso a resultados falso-positivos devido a impurezas que não são relevantes para produzir qualidade (Fujiwara e outros, Yakugaku Zasshi, 1990, 110, 332- 340).

Assim, existia uma necessidade de um sistema de teste não ba- seado em animais que se caracterizam por alta sensibilidade, alta especifici- dade e a capacidade de detectar uma ampla faixa de pirogênios. Com essa intenção e com uma compreensão aperfeiçoada da resposta inflamatória humana, foram desenvolvidos sistemas de teste baseados na ativação iri vitro de monócitos humanos. Cerca de 20 anos atrás, pesquisadores usaram células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) para detectar endoto- xina monitorando a liberação de citocinas pirogênicas. (Dinarello e outros, J. Clin. Microbiol., 1984, 20, 323; Duff e Atkins, J. Immunol. Methods, 1982, 52, 323). Desde então, diversos diferentes sistemas de testes usando diferentes fontes de monócitos humanos, incluindo sangue total periférico humano (WB), PBMCs ou linhagens de células monocíticas, tais como MONOMAC-6 (MM6) (Ziegler-Heitbrock e outros, Int. J. Câncer, 1988, 41, 456) ou THP-1 (Tsuchiya e outros, Int. J. Câncer, 1980, 26, 171), e várias leituras de saída, incluindo as citocinas pirogênicas de fator de necrose de tumor alfa, TNF-α, IL-6, IL-1β e a neopterina de metabólitos não-pirogênicos (Hartung e outros, The Report and Recommendations of ECVAM Workshop 43, 2001, 29, 99; Poole e Gaines Das, Eur J Parenteral Sciences, 2001, 6, 63; Poole e outros, J. Immunol. Methods, 2003, 274, 209; Gaines Das e outros, J Immunol Me- thods, 2004, 288, 165), têm sido desenvolvidos. Recentemente, em um es- tudo europeu em colaboração, o Estudo Humano, seis dos mais proeminen- tes testes de ativação de monócitos, cada um usando uma combinação dife- rente das fontes e leituras de saída de células descritas acima, foram avalia- dos em relação à capacidade de detectar endotoxina em produtos médicos incorporados com várias concentrações de endotoxina pura.

Em cinco dos seis testes, as células foram cultivadas em placas de poliestireno de 96 cavidades com cavidades de fundo chato (Hoffmann e outros, J. Immunol. Methods, 2005, 298, 161). No sexto teste (baseado em Fennrich e outros, Dev. Biol. Stand., 1999; Fennrich e outros, ALTEX, 1999; Hartung e outros, 2001), tubos de centrífuga Eppendorf (1,2 ml) feitos de poliestireno, com fundos cônicos, foram usados na maior parte da avaliação e, em parte desse estudo, tubos de polipropileno (1,5 ml), com fundos re- dondos, foram utilizados em lugar dos tubos de polietileno da Charles River Laboratories, o fabricante do kit Endosafe® In vitro Pyrogen Test (IPT) usado no estudo. Essa substituição não foi relatada apresentar qualquer efeito sig- nificativo sobre o teste, e os próprios tubos de polipropileno foram depois substituídos por placas de poliestireno de 96 cavidades de fundo chato, quando Charles River Laboratories modificou o Endosafe® IPT para volumes reduzidos. A fonte de monócitos neste teste foi sangue total e a leitura de saída foi IL-1 β. Sangue total foi incubado com vários fármacos incorporados com diferentes concentrações de endotoxina.

Carlin e Viitanen descrevem um teste de ativação de monócitos, baseado em sangue total ou células MONOMAC-6 como fonte de monócitos e IL-6 como leitura de saída, para avaliar a progenicidade inerente da vacina Infanrix, que contém antígenos gram-positivos e gram-negativos, incluindo vários pirogênios não-endotóxicos, isto é, toxóide de Diphtheria, toxóide de Pertussis e toxóide de Tetanus (Pharmeuropa, 2003, 15, 3, 418-423). Célu- las foram cultivadas sob baixa densidade celular em tubos graduados sem endotoxina Eppendorf Bio-Pure de composição não-descrita. A pirogenicida- de da vacina não foi o resultado de contaminação da vacina durante sua fa- bricação ou armazenagem. Hartung e Wendel descrevem um teste de ativa- ção de monócitos, baseado em sangue total como fonte de monócitos e IL- 1β como leitura de saída preferida, para detectar endotoxina e pirogênios não-endotóxicos em suas formas puras, isto é, LPS de Salmonella abortus equi, estreptolisina O (SLO) de Streptococcus pyrogens e muramil dipeptí- deo (MDP) (Hartung e Wendel, In Vitro Toxicology, 1996, 9, 4, 353-359; Pa- tente norte-americana Ns 5.891.728). Células foram cultivadas em tubos de polipropileno.

Yamamoto e outros descrevem um teste de ativação de monóci- tos, baseado em sangue total ou células de diferentes linhagens de células humanas, a linhagem de células 28SC sendo preferida, como fonte de mo- nócitos/células monocíticas e IL-6 como leitura de saída preferida, para de- tectar pirogênios endotóxicos (Jpn. J. infect. Dis., 2003, 56, 93-100). Diz-se que o teste de endotoxina prediz a possibilidade de uma sinergia in vivo en- tre endotoxina e um fármaco parenteral, particularmente interferon, tal que o fármaco eleve os efeitos pirogênicos da endotoxina. Células foram cultivadas ou com endotoxina em sua forma pura ou com uma mistura de endotoxina em sua forma pura e interferon humano. Células da linhagem de células fo- ram cultivadas em placas de poliestireno de 96 cavidades de fundo chato, Células sangüíneas foram cultivadas em tubos de material não-especificado.

Nakagawa e outros descrevem um teste de ativação de monóci- tos, baseado em sangue total ou células MM6-CA8 (um subclone de MO- NOMAC-6) como fonte de monócitos e IL-6 como leitura de saída preferida, para detectar pirogênios endotóxicos e não-endotóxicos em suas formas puras, isto é, LPS de 055:B5 de E. eolie peptidoglicano insolúvel (PG) deri- vado de S. aureus (Clinicai and Diagnostic Laboratory Immunol., 2002, 9, 3, 588-597). Células MM6-CA8 foram cultivadas em placas de poliestireno de 96 cavidades. Células sangüíneas foram cultivadas em tubos de polipropile- no; os volumes usados (225 μΙ de sangue, 25 μL de solução de teste, 750 μL de solução salina) impediram o uso de placas-padrão de 96 cavidades (250 μL/cavidade).

Recentemente, várias fontes indicaram que polipropileno deve ser evitado em testes de pirogênio. Por exemplo, Charles River Laboratories recomenda evitar polipropileno porque a natureza hidrofóbica de uma super- fície de polipropileno poderia resultar na adsorção de endotoxina nessa su- perfície devido aos domínios hidrofóbicos associados ao componente Lipi- deo A de LPS (Charles River Laboratories, Endosafe Times, setembro de 2004). Harlan Sera-Lab, um fabricante de testes de biossegurança, estabe- lece que tubos de polipropileno podem interferir no ensaio LAL (Harlan Sera- Lab, Catálogo de 2004). E a Associação Européia de Enfermeiros de Diálise e Transplantes, bem como a Associação Européia de Cuidados Renais re- comendam evitar polipropileno e usar poliestireno em testes de endotoxina porque poliestireno normalmente não absorve endotoxina (Diretrizes EDT- NA/ERCA).

Assim, existe uma necessidade de um teste de pirogênios não baseado em animais caracterizado por alta sensibilidade, alta especificidade e a capacidade de detectar uma ampla faixa de contaminantes pirogênios em produtos médicos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

As requerentes desenvolveram um teste de pirogênio in vitro que é sensível e detecta contaminantes pirogênicos presentes em produtos mé- dicos. Geralmente, a presente invenção refere-se a um método de detecção de pirogênios não-endotóxicos em uma amostra mediante combinação de monócitos, isto é, na forma de um reagente que contém monócitos e a a - mostra a ser testada em um primeiro sistema de ensaio que compreende pelo menos uma superfície que compreende polipropileno, tal que os monó- citos estejam em contato com a superfície. Os monócitos e a amostra são incubados de modo que os monócitos produzam uma citocina ou um media- dor endógeno da resposta inflamatória durante incubação. O conteúdo do primeiro sistema de ensaio é transferido para um segundo sistema de ensaio que compreende pelo menos uma superfície tratada com um anticorpo a uma citocina ou um mediador endógeno ou marcador da resposta inflamató- ria. O segundo sistema de ensaio é ensaiado em relação à presença de cito- cina ou mediador endógeno ligado ao anticorpo na superfície. Quando os monócitos usados nesse método são PBMCs ou células de linhagem de cé- lulas monocíticas, os monócitos estão presentes nos sistemas de ensaio sob uma alta densidade celular.

A presente invenção refere-se também geralmente a um método de detecção de pirogênios não-endotóxicos em um produto médico adminis- trado parenteralmente mediante combinação de sangue total, como reagente que contém monócitos, e do produto médico a ser testado em um primeiro sistema de ensaio que compreende pelo menos uma superfície que compre- ende polipropileno, tal que o sangue entre em contato com a superfície. O sangue e o produto médico são incubados de modo que o sangue produza a citocina IL-6 durante incubação. O conteúdo do primeiro sistema de ensaio é transferido para um segundo sistema de ensaio que compreende pelo me- nos uma superfície tratada com um anticorpo a IL-6. O segundo sistema de ensaio é ensaiado em relação à presença de IL-6 ligado ao anticorpo na su- perfície.

A presente invenção refere-se adicionalmente a um método de cultura de monócitos, isto é, na forma de um reagente que contém monóci- tos, para uso em um teste de pirogênio não-endotóxico mediante combina- ção dos monócitos e de uma amostra a ser testada em um sistema de en- saio que compreende pelo menos uma superfície que compreende polipropi- leno, tal que os monócitos estejam em contato com a superfície.

A invenção refere-se também a um método de cultura de monó- citos como parte de um teste de pirogênios não-endotóxicos mediante com- binação dos monócitos e de urna amostra em um sistema de ensaio que compreende pelo menos uma cavidade de microtitulação com uma forma tal que o reagente que contém monócitos seja concentrado em comparação com uma cavidade de microtitulação de fundo chato, a superfície da cavida- de compreendendo polipropileno, tal que os monócitos estejam em contato com a superfície. Quando os monócitos usados nesses métodos de cultura são células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) ou células de li- nhagem de células monocíticas, os monócitos estão presentes nos sistemas de ensaio sob uma alta densidade celular.

A invenção refere-se também a um método de detecção de piro- gênios não-endotóxicos em um produto médico administrado parenteralmen- te mediante combinação de sangue total, como reagente que contém monó- citos, e do produto médico a ser testado em um sistema de ensaio que com- preende pelo menos uma superfície que compreende polipropileno e pelo menos uma superfície tratada com um anticorpo a IL-6, tal que o sangue esteja em contato com a superfície que compreende polipropileno, e ensaiar o sistema de ensaio em relação à presença de IL-6 ligado ao anticorpo na superfície.

A invenção proporciona adicionalmente a um kit de diagnóstico que contém uma placa de microtitulação que compreende uma pluralidade de cavidades de microtitulação com uma forma tal que meio de cultura con- tido em cada cavidade seja concentrado em comparação com uma cavidade de microtitulação de fundo chato, a superfície da cavidade compreendendo polipropileno, e monócitos crioconservados, isto é, na forma de um reagente que contém monócitos crioconservados, contidos nas cavidades da placa de microtitulação, tal que os monócitos estejam em contato com a superfície das cavidades. Quando os monócitos no kit são células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) ou células de linhagem de células monocíticas, os monócitos estão presentes nas cavidades sob uma alta densidade celu- lar.

A invenção também proporciona um kit de diagnóstico que con- tém um sistema de ensaio para detectar pirogênios não-endotóxicos em um produto médico administrado parenteralmente, o sistema de ensaio compre- endendo uma placa de microtitulação que compreende uma pluralidade de cavidades de microtitulação com uma forma tal que meio de cultura contido em cada cavidade seja concentrado em comparação com uma cavidade de microtitulação de fundo chato, a superfície de cada cavidade compreen- dendo polipropileno, sangue total crioconservado, como reagente que con- tém monócitos crioconservados, contido nas cavidades da placa de microti- tulação, tal que o sangue esteja em contato com a superfície das cavidades, e um anticorpo IL-6.

Outros objetivos e características desta invenção serão em parte evidentes e em parte apontados neste relatório.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A figura 1 é um gráfico que representa respostas de IL-6 para amostras de teste que apresentam quatro diferentes densidades celulares (1 milhão, 0,5 milhão, 0,25 milhão e 0,13 milhão de PBMCs por 250 μl de cavi- dade) em um teste de ativação de monócitos realizado com células mononu- cleares de sangue periférico em placas de polipropileno com cavidades de fundo redondo, com IL-6 como leitura de saída. As respostas de IL-6 se dão a padrão de endotoxina (1 unidade de endotoxina por ml) e controle positivo de Extraneal® (isto é, uma batelada desse produto contaminado com pirogê- nio não-endotóxico).

A figura 2 é um gráfico que ilustra respostas de IL-6 para amos- tras de teste que apresentam baixa densidade celular em um teste de ativa- ção de monócitos realizado com sangue total em placas de poliestireno com cavidades de fundo chato. As respostas de IL-6 se dão a LPS, controle ne- gativo de Extraneal® (isto é, uma batelada limpa desse produto), controle positivo de Extraneal®, controle negativo de Hemoglobina (Hb) (isto é, uma batelada limpa desse produto) e controle positivo de Hemoglobina (Hb) (isto é, uma batelada desse produto contaminada com pirogênio não-endotóxico).

A figura 3 é um gráfico que ilustra respostas de IL-6 para amos- tras de teste que apresentam baixa densidade celular em um teste de ativa- ção de monócitos realizado com células mononucleares de sangue periférico em placas de poliestireno com cavidades de fundo chato. As respostas de IL-6 se dão a LPS, controles positivos e negativos de Extraneal® e controles positivos e negativos de Hb.

A figura 4 é um gráfico que ilustra respostas de IL-6 para amos- tras de teste que apresentam baixa densidade celular em um teste de ativa- ção de monócitos realizado com células MONOMAC6 em placas de poliesti- reno com cavidades de fundo chato. As respostas de IL-6 se dão a LPS, controles positivos e negativos de Extraneal® e controles positivos e negati- vos de Hb.

A figura 5 é um gráfico que representa respostas de IL-6 para amostras de teste que apresentam baixa densidade celular em um teste de ativação de monócitos realizado com células THP-1 em placas de poliestire- no com cavidades de fundo chato. As respostas de IL-6 se dão a LPS, con- troles positivos e negativos de ExtraneaP e controles positivos e negativos de Hb.

A figura 6 é um gráfico que ilustra respostas de TNF-α para a- mostras de teste que apresentam baixa densidade celular em um teste de ativação de monócitos realizado com células THP-12A9 em placas de polies- tireno com cavidades de fundo chato. As respostas de TNF-α se dão a LPS, controles positivos e negativos de ExtraneaP e controles positivos e negati- vos de Hb.

A figura 7 é um gráfico que ilustra respostas de IL-6 para amos- tras de teste que apresentam baixa densidade celular em um teste de ativa- ção de monócitos realizado com células de clone de MONOMAC6-CA8 em placas de poliestireno com cavidades de fundo chato. As respostas de IL-6 se dão a LPS e controles positivos e negativos de Extraneal®.

A figura 8 é um gráfico que ilustra respostas de IL-6 para amos- tras de teste que apresentam baixa densidade celular em um teste de ativa- ção de monócitos realizado com células 28SC em placas de poliestireno com cavidades de fundo chato. As respostas de IL-6 se dão a LPS e contro- les positivos e negativos de dextrano.

A figura 9 é um gráfico que representa respostas de IL-6 para amostras de teste que apresentam alta densidade celular em um teste de ativação de monócitos realizado com células mononucleares de sangue peri- férico em placas de polipropileno com cavidades de fundo redondo. As res- postas de IL-6 se dão a LPS, controles positivos e negativos de Extraneal® e controles positivos e negativos de dextrano. A figura 10 é um gráfico que representa respostas de IL-6 para amostras de teste que apresentam baixa densidade celular em um teste de ativação de monócitos realizado com sangue total em placas de polipropile- no com cavidades de fundo redondo. As respostas de IL-6 se dão a LPS e controles positivos e negativos de ExtraneaP.

A figura 11A é um gráfico que representa respostas de IL-6 para placas de polipropileno (colunas negras) e placas de poliestireno (colunas cinzas) em um teste de ativação de monócitos realizado com células mono- nucleares de sangue periférico (1 milhão de células por cavidade). As res- postas de IL-6 se dão a LPS, controles positivos e negativos de ExtraneaP e controles positivos e negativos de Hb.

A figura 11B é um gráfico que representa respostas de IL-1β pa- ra placas de polipropileno (colunas negras) e placas de poliestireno (colunas cinzas) em um teste de ativação de monócitos realizado com células mono- nucleares de sangue periférico (1 milhão de células por cavidade). As res- postas de IL-1/?se dão a LPS1 controles positivos e negativos de ExtraneaP e controles positivos e negativos de Hb.

A figura 12A é um gráfico que ilustra respostas de IL-6 para a- mostras de teste que apresentam alta densidade celular em um teste de ati- vação de monócitos realizado com células mononucleares de sangue perifé- rico em placas de polipropileno com cavidades de fundo redondo. As respos- tas de IL-6 se dão a LPS e controles positivos e negativos de ExtraneaP.

A figura 12B é um gráfico que ilustra respostas de IL-6 para a- mostras de teste que apresentam baixa densidade celular em um teste de ativação de monócitos realizado com células mononucleares de sangue peri- férico em placas de poliestireno com cavidades de fundo chato. As respostas de IL-6 se dão a LPS e controles positivos e negativos de ExtraneaP.

A figura 13A é um gráfico que ilustra respostas de IL-6 para a- mostras de teste que apresentam alta densidade celular em um teste de ati- vação de monócitos realizado com células mononucleares de sangue perifé- rico em placas de polipropileno com cavidades de fundo redondo. As respos- tas de IL-6 se dão a LPS e controles positivos e negativos de ExtraneaP. A figura 13B é um gráfico que ilustra respostas de IL-6 para a- mostras de teste que apresentam alta densidade celular em um teste de ati- vação de monócitos realizado com células mononucleares de sangue perifé- rico em placas de poliestireno com cavidades de fundo chato. As respostas de IL-6 se dão a LPS e controles positivos e negativos de Extranea.

A figura 14A é um gráfico que ilustra respostas de IL-6 para a- mostras de teste que apresentam alta densidade celular em um teste de ati- vação de monócitos realizado com células mononucleares de sangue perifé- rico em placas de polipropileno com cavidades de fundo redondo. As respos- tas de IL-6 se dão a LPS e controles positivos e negativos de Extranea.

A figura 14B é um gráfico que ilustra respostas de IL-6 para a- mostras de teste que apresentam alta densidade celular em um teste de ati- vação de monócitos realizado com células mononucleares de sangue perifé- rico em placas de poliestireno com cavidades de fundo chato. As respostas de IL-6 se dão a LPS e controles positivos e negativos de Extranea.

A figura 15 é um gráfico que ilustra respostas de IL-1B para a- mostras de teste que apresentam alta densidade celular em um teste IPT comercialmente disponível realizado com sangue total em placas de poliesti- reno com cavidades de fundo chato. As respostas de IL-1B se dão a LPS, controles positivos e negativos de ExtraneaP, controles positivos e negativos de hemoglobina, controle salino e controle gram-positivo.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Pirogênios estimulam monócitos (bem como outros leucócitos) e macrófagos do sangue a produzirem e liberarem numerosos mediadores pirogênicos endógenos da resposta inflamatória, incluindo citocinas (por e- xemplo, TNF-α, IL-Iyffe IL-6). A liberação desses mediadores pirogênicos na circulação dispara uma cascata de eventos que conduz a uma resposta in- flamatória no indivíduo afetado. O teste de ativação de monócitos da presen- te invenção depende da medição desses pirogênios endógenos como mar- cadores para uma resposta inflamatória. De acordo com uma modalidade preferida da presente invenção, uma amostra é incubada com um reagente que contém monócitos em um primeiro sistema de ensaio que compreende uma superfície compreendida de polipropileno, o reagente que contém mo- nócitos estando presente no sistema de ensaio sob alta densidade celular. O conteúdo do primeiro sistema de ensaio é então transferido para um segun- do sistema de ensaio que compreende uma superfície revestida com anti- corpos anticitocina e o segundo sistema de ensaio é ensaiado em relação à presença de citocinas ligadas à superfície dos anticorpos.

Os testes de pirogênios da presente invenção são usados para detectar pirogênios não-endotóxicos, isto é, bactérias gram-positivas (por exemplo, Staphylococcus aureus) ou seus componentes (por exemplo, mu- ropeptídeo, ácido lipoteicóico, enterotoxinas, estreptolisina), estimuladores imunes tais como fito-hemaglutimina ou forbolesteras, bem como endotoxi- na. Porque o teste utiliza a resposta de monócitos a citocinas para diversos pirogênios em vez de uma resposta específica à endotoxina bacteriana gram-positiva, um amplo espectro de agentes pirogênicos pode ser detecta- do com o teste da presente invenção.

Os testes de pirogênios/pirogênicos da presente invenção mos- tram ser mais eficazes na detecção de pirogênio não-endotóxico em lotes contaminados de um produto médico em comparação com testes conven- cionais. Os exemplos desta invenção mostram que esses testes convencio- nais são incapazes de distinguir amostras de controle positivo de solução de diálise peritoneal ExtraneaP, hemoglobina ou dextrano de amostra de con- trole negativo dos mesmos parentéricos. A amostra de controle positivo de ExtraneaP foi obtida de um lote de produtos contaminados com pirogênio não-endotóxico; o lote contaminado causou reações adversas em seres hu- manos, mas testou negativo em relação à presença de pirogênio de acordo com um teste LAL, que somente testa pirogênios endotóxicos (Martis e ou- tros, Lancet, 365(9459), 588). A amostra de controle positivo de hemoglobi- na foi também obtida de um lote de produtos contaminados com pirogênio não-endotóxico; o lote contaminado causou respostas febris em coelhos, mas testou negativo em relação à presença de pirogênio de acordo com um teste LAL. O controle positivo de dextrano foi uma preparação de dextrano que se verificou causar febre em seres humanos, mas testou negativo em relação à presença de pirogênio de acordo com um teste LAL. A capacidade de o teste detectar contaminantes não-endotóxicos em produtos médicos é de grande valor na medida em que possibilita identificação de lotes de pro- dutos médicos contaminados antes de os lotes serem liberados para uso em pacientes. Testes conhecidos funcionam bem no contexto de detecção de pirogênios puros não-endotóxicos e endotóxicos, isto é, peptidoglicano (PG) de S. aureus e LPS de E. coli, conforme descrito por Nakagawa e outros como discutido acima, ou na incorporação endotóxica de produtos, isto é, vários fármacos foram incorporados com diferentes concentrações de endo- toxina nos seis testes do Estudo Humano, como discutido acima. Testes LAL funcionam eficazmente, contanto que um produto médico esteja contamina- do com endotoxina (Mascoli, C.C., Weary1 M.E., J. Parenter. Drug Assoc., 2003, 33, 81; Mascoli, C.C., Weary, M.E., Prog. Clin. Biol. Res., 2003, 29, 387). Entretanto, quando um produto médico é contaminado com pirogênio não-endotóxico, tais testes falham em detectar o pirogênio. Sem estar ligado a uma teoria particular, acredita-se que o pirogênio não-endotóxico interaja com o produto médico resultando em um "mascaramento" do pirogênio e na incapacidade de detectar contaminantes não-endotóxicos.

Os testes de pirogênios da presente invenção superam esse efeito de mascaramento e são capazes de detectar contaminantes não- endotóxicos em produtos médicos: por exemplo, em uma modalidade prefe- rida, em que PBMCs foram cultivadas sob alta densidade celular em cavida- des de polipropileno de fundo redondo, o teste de pirogênios da .presente invenção foi capaz de distinguir entre amostras de controles positivos e ne- gativos de solução de ExtraneaP e dextrano (ver figura 9). Nenhum dos kits disponíveis que foram testados foram capazes de distinguir entre controles positivos e negativos de ExtraneaP ou controles de hemoglobina (ver figuras 1-8). Novamente, sem estar ligado a uma teoria particular, acredita-se que altas densidades celulares proporcionam mais células para maior contato célula-célula. Contato célula-célula elevado facilita maior comunicação entre células e, portanto, resulta em um aumento de resposta inflamatória a um contaminante pirogênico. Células se comunicam entre si via mediadores so- lúveis, tais como citocinas, e via contato célula-célula, em que citocinas po- dem também tomar parte. Uma cavidade de fundo redondo, ou uma cavida- de geralmente com forma tal que células sejam concentradas, proporciona maior contato célula-célula em comparação com uma cavidade de fundo chato. E acredita-se que polipropileno aumente a biodisponibilidade de piro- gênios não-endotóxicos. Novamente, sem estar ligado a uma teoria particu- lar, acredita-se que tratamento superficial de placas de poliestireno, como convencionalmente usado em cultura de células, torne sua superfície menos hidrofóbica e capaz de ligar células melhor, mas também leva sua superfície a ligar e neutralizar pirogênios não-endotóxicos. A placa de polipropileno não tem sua superfície tratada de modo que ela permaneça mais hidrofóbica do que a placa de poliestireno e menos provável de neutralizar pirogênios não- endotóxicos.

1. Componentes de Testes de Pirogênios

Um teste de pirogênios que se caracteriza por alguma combina- ção dos três elementos descritos acima, alta densidade celular, fundo re- dondo (ou uma forma diferente apropriada) e polipropileno, isto é, PBMCs presentes sob alta densidade celular em uma cavidade de poliestireno de fundo redondo, permite detecção aperfeiçoada de contaminação não- endotóxica em produtos médicos. Os testes de pirogênios da presente in- venção podem ser usados para testar uma variedade de produtos médicos em relação à presença de contaminação não-endotóxica, incluindo produtos hemoderivados, produtos médicos para administração parenteral, dialisados, vacinas, soluções intravenosas e qualquer fluido que contate o corpo ou flui- dos corporais.

A. Citocina ou Mediador Endóqeno da Resposta Inflamatória Qualquer mediador endógeno da resposta inflamatória secretado pelo reagente que contém monócitos que é detectável poderá ser usado como base do teste de pirogênios da presente invenção. Preferencialmente, contudo, uma citocina ou marcador de endotelina são empregados porque eles são fáceis de detectar pelo método da invenção. Verificou-se que mo- nócitos em sangue total incubado com um pirogênio endotóxico ou não- endotóxico produzem diversas classes de citocinas, incluindo, mas sem se limitar aos mesmos, citocinas pró-inflamatórias (TNF-α, IL-1, IL-6), citocinas antiinflamatórias (IL-4, IL-10, IL-13, IL-1ra, TGF), Th1 (IL-2, IFN, IL-12), Th2 (IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13), IL-1β, IL-1 ra, IL-8 e PGE2. Marcadores de cito- cinas preferidos para isso na invenção incluem TNF-α, IL-1β IL-1ra, IL-6, IL- 8 e PGE2. IL-6 é um marcador de citocinas particularmente preferido para ensaio na presente invenção. IL-6 é produzido em quantidades detectáveis em um período de incubação relativamente curto. IL-6 imunorreativo, dife- rentemente de IL-1β e TNF-α imunorreativos, é secretado inteiramente no meio/sangue condicionado por células, em grandes quantidades, permitindo - sua completa estimativa. Em contraste, TNF-α e IL-1β imunorreativos per- manecem grandemente intracelulares, elevando a possibilidade de que pre- parações para teste que afetam permeabilidade celular possam mais facil- mente interferir no teste com TNF-α ou IL-1β (imunorreativos) como leitura de saída, em vez de IL-6 (ver figuras 2 e 3). No entanto, TNF-α ou IL-1β po- deriam também ser usados como marcadores de citocinas na presente in- venção. TNF-α é produzido antes de IL-6 na resposta de pirogênios monocí- ticos. Assim, uma modalidade da invenção que ensaia THF-α usaria um tempo de incubação mais curto (~1 a 2 horas) do que modalidades que en- saiam IL-6. Diferentes contaminantes pirogênicos poderiam dar origem a diferentes respostas a citocinas na cultura celular. Portanto, a invenção po- derá ser configurada para detectar a formação de citocinas particulares quando contaminação com um pirogênio particular que causa secreção des- sas citocinas é provável para um produto farmacêutico.

B. Anticorpo à Citocina ou Mediador Endóaeno

Uma vez determinada a citocina a ser ensaiada, um anticorpo para essa citocina tem de ser produzido para uso na presente invenção. An- ticorpos policlonais purificados sob condições rigorosas, conforme descrito no Exemplo 1 da Patente Norte-americana N° 6.696.261, que é incorporada aqui em sua totalidade como referência, funcionam bem no teste de pirogê- nios. Porque o sangue de animal de que os anticorpos policlonais são isola- dos é naturalmente livre de pirogênio (se tomado de animais saudáveis), tem-se simplesmente de evitar contaminação das matérias-primas com piro- gênios durante purificação para obter um produto sem pirogênio. Tampões e fases sólidas sem pirogênio são utilizados em colunas de cromatografia de afinidade para obter anticorpos policlonais livres de pirogênio, conforme des- crito no Exemplo 1 da Patente Norte-americana Ns 6.696.261. Alternativa- mente, anticorpos monoclonais de culturas de hibridoma podem ser usados. No entanto, quando se usam anticorpos monoclonais, tem-se de tomar cui- dado em isolar os anticorpos de qualquer pirogênio contaminante que possa estar presente na cultura de células de hibridoma.

Para uso na presente invenção, o anticorpo à citocina é aplicado em uma superfície em um sistema de ensaio. Métodos, tal como revestimen- to, para ligar anticorpos a uma superfície em um sistema de ensaio, tal como uma cavidade de microtitulação, são bem conhecidos no estado da técnica bioquímica. Muitos sistemas de ensaio são disponíveis comercialmente, e o fabricante usualmente proporciona materiais e instruções para revestimento de anticorpos em uma superfície do sistema. Devido à sua facilidade de lei- tura e o pequeno volume de amostra exigido, cavidades de microtitulação em que uma porção da superfície interna da cavidade é revestida pelo anti- corpo são utilizadas em uma modalidade preferida da presente invenção. A fim de explorar plenamente as vantagens da invenção, prefere-se que a ca- vidade de microtitulação seja parte de uma placa de microtitulação, que é uma disposição planar de cavidades similares, situadas de modo que a dis- posição de cavidades possa ser lida com equipamento automatizado de lei- tura de placas de imunoensaio (ver, por exemplo, Patente Norte-americana Ns 5.281.540, aqui incorporada como referência). Equipamento automatiza- do tais como leitoras de placas ELISA (por exemplo, a Leitora de Micropla- cas Ultramark, disponível pela Bio-Rad Laboratories, Inc.) automatiza o pro- cesso de avaliação de ensaios e gradualmente diminui o custo por teste. Se desejado, placas de cavidades de microtitulação podem ser tornadas livres de pirogênio (se já não fornecidas como tal) mediante ampla lavagem com tampão sem pirogênio. Em uma modalidade particularmente preferida da presente invenção, anticorpos policlonais anti-IL-6 são revestidos nas cavi- dades de uma placa ELISA. Contudo, outros formatos de testes de imunodi- agnóstico (por exemplo, em que o anticorpo é revestido em uma haste de verificação ou conta) são aceitáveis para uso na presente invenção.

Além do anticorpo de "captura", outros anticorpos e reagentes para uso em ensaio de citocina poderão ser aplicados quando da produção de sistemas de placas de microtitulação para uso na presente invenção. Por exemplo, após o anticorpo de captura ser aplicado à placa de microtitulação, os sítios de ligação restantes da placa podem ser "bloqueados" com outra proteína. Após bloqueio, um anticorpo de detecção marcado (tal como um anticorpo biotinado ou marcado com enzima) pode ser aplicado à placa de microtitulação, juntamente com um composto de vitrificação protetor. Assim, quando uma amostra é incubada na cavidade de microtitulação, conforme descrito abaixo, uma citocina liberada é capturada pelo anticorpo de captura ligado à cavidade e marcada pelo anticorpo de detecção simultaneamente durante o período de incubação da amostra.

C. Reaaente que contém Monócitos

Como primeira etapa nos testes de pirogênios da presente in- venção, células contidas em um reagente que contém monócitos são culti- vadas combinando o reagente que contém monócitos e uma amostra a ser testada em um sistema de ensaio. O reagente que contém monócitos da presente invenção é selecionado do grupo que consiste em PBMCs, células de linhagem de células monocíticas, sangue total ou qualquer linhagem de células que expresse ou possa ser levada a expressar os receptores simila- res a Toll (TLRs) que são envolvidos na mediação de respostas a agentes pró-inflamatórios e pirogênicos, incluindo células em que esses receptores foram induzidos ou clonados. Preferencialmente, a linhagem de células mo- nocíticas é selecionada do grupo que consiste em MONOMAC-6 (MM6), THP-1 e 28SC. Os monócitos no reagente que contém monócitos preferen- cialmente são monócitos da mesma espécie daqueles a quem o produto tes- tado deve ser administrado (isto é, ser humano para produtos farmacêuticos; gato, cão, cavalo, etc. para produtos veterinários). Entretanto, monócitos de outras espécies com a desejada reatividade a pirogênios poderão também ser usados. Em certas modalidades preferidas, o reagente que contém mo- nócitos compreende PBMCs.

Em uma modalidade da invenção, o reagente que contém mo- nócitos é sangue total e o sistema de ensaio inclui pelo menos uma superfí- cie que compreende polipropileno, tal que o reagente que contém monócitos esteja em contato com a superfície.

Em outra modalidade da invenção, o reagente que contém mo- nócitos é PBMCs presentes em alta densidade celular e o sistema de ensaio inclui pelo menos uma superfície que compreende polipropileno, polietileno, poliestireno ou outro material similar em contato com os PBMCs.

Quando o reagente que contém monócitos é PBMCs ou células de linhagem celular, o reagente está presente no sistema de ensaio sob alta densidade celular, para facilitar maior contato célula-célula, como explicado em detalhes acima. Em certas modalidades, o reagente que contém monóci- tos está presente no sistema de ensaio em uma densidade celular por cavi- dade de pelo menos cerca de 125.000 células, pelo menos cerca de 250.000, 500.000, 600.000, 700.000, 800.000, 900.000, 1.000.000, 1.100.000, 1.200.000, 1.300.000, 1.400.000, 1.500.000, 1.600.000, 1.700.000, 1.800.000, 1.900.000 ou 2.000.000 células por cavidade. Aquele versado na técnica será capaz de reconhecer que a densidade máxima de células é excedida quando existem nutrientes celulares insuficientes no vo- lume de reagente na cavidade para manter apropriadamente as células na cavidade.

Quando o reagente que contém monócitos é sangue total, o rea- gente está presente no sistema de ensaio sob uma densidade celular menor que a de PBMCs ou células de linhagem celular. Em certas modalidades em que o reagente que contém monócitos é sangue, o reagente está presente no sistema de ensaio em uma densidade celular de pelo menos cerca de 100.000 células mononucleares de sangue periférico por cavidade, pelo me- nos cerca de 200.000, 210.000, 220.000, 230.000, 240.000, 250.000, 260.000, 270.000, 280.000, 290.000, 300.000, 310.000, 320.000, 330.000, 340.000, 350.000, 360.000, 370.000, 380.000, 390.000 ou 400.000 PBMCs por cavidade. Sem estar ligado a uma teoria particular, acredita-se que san- gue total possa ser usado sob densidade celular menor em comparação com PBMCs ou células de linhagem celular porque monócitos estão em seu am- biente natural e todos os componentes séricos que poderão influenciar sua resposta a pirogênios estão presentes em solução. Adicionalmente, quando ò reagente que contém monócitos compreende sangue total, a leitura de sa- ída utilizada para o teste de pirogênios é IL-6. Preferencialmente, quando sangue total é usado como reagente que contém monócitos, o sangue é fresco ou de menos de 24 horas, e mais preferencialmente de menos de 4 horas. Também, quando sangue total é utilizado, anticoagulantes podem ser incluídos para retardar ou impedir o sangue de coagular; anticoagulantes adequados incluem citrato (por exemplo, em uma concentração final de 0,38%), heparina (heparina sódica) ou fragmina (heparina de baixo peso mo- lecular). Aditivos anticoagulantes podem ser usados sem afetar a resposta dos monócitos a pirogênios na amostra de teste. Sangue total pode também ser diluído com um tampão apropriado ou outro diluente, tal como meios de cultura celular RPMI ou solução salina fisiológica. Sangue total é preferenci- almente diluído até pelo menos 50%, mais preferencialmente até cerca de 5% a cerca de 25%, e mais preferencialmente cerca de 20%, do volume final para incubação (ver figura 1 da Patente Norte-americana N5 6.696.261). Me- diante diluição de sangue total, a curva de resposta de IL-6 da maioria dos doadores poderá ser levada a uma faixa compacta que pode ser usada para quantificar uma faixa mais ampla de concentrações de contaminação com pirogênios (ver figura 3 da Patente Norte-americana Ns 6.696.261). 2. Sistemas de Dois Ensaios

Em certas modalidades da presente invenção, o teste de piroge- nicidade é realizado em um sistema de dois recipientes de ensaio, tal que as etapas de incubação de amostra com o reagente que contém monócitos e a captura de citocina(s) produzida(s) pelo reagente que contém monócitos o- corram em dois sistemas de recipientes de ensaio diferentes. A etapa de incubação segue a etapa de cultura descrita acima; incubação da amostra de teste com o reagente que contém monócitos (tais como PBMCs) é reali- zada no mesmo sistema de ensaio da etapa de cultura. O tempo de incuba- ção ótimo para uso no teste de pirogênios da presente invenção variará de- pendendo das condições de ensaio, a saber a citocina que é ensaiada. Por exemplo, quando sangue total é incubado com endotoxina e a leitura de saí- da é IL-6, citocina adicional mínima é produzida pelo reagente que contém monócitos após incubação por 6 horas; após 4 horas de incubação, uma quantidade suficiente de IL-6 foi secretada pelo reagente para permitir quan- tificação do contaminante pirogênico. Quando sangue total é incubado com pirogênio não-endotóxico e qualquer leitura de saída é utilizada, uma quanti- dade suficiente de IL-6 foi secretada pelo reagente para permitir quantifica- ção do contaminante pirogênico após cerca de 16-24 horas de incubação. Para uma modalidade da presente invenção que ensaia produção de IL-6, um tempo de incubação de cerca de 6 a cerca de 24 horas, mais preferenci- almente de cerca de 12 a cerca de 24 horas, e mais preferencialmente de cerca de 16 a cerca de 24 horas, é preferido. Se outra citocina é ensaiada, o período de incubação deverá ser otimizado para a produção dessa citocina particular. Essa otimização está dentro das capacidades daquele versado na técnica. Se a citocina a ser ensaiada não for liberada pelos monócitos, as células podem ser lisadas por congelamento/descongelamento, ou por adi- ção de um detergente no final do período de incubação em uma concentra- ção que não romperá ligação de ligantes com anticorpos.

Uma vez completada a etapa de incubação, o conteúdo do sis- tema de ensaio (o primeiro sistema de ensaio), a saber o reagente que con- tém monócitos e a amostra de teste, é transferido para um segundo sistema de ensaio que compreende pelo menos uma superfície tratada com um anti- corpo para uma citocina ou um mediador endógeno da resposta inflamatória, por exemplo endotelina. O segundo sistema de ensaio é ensaiado em rela- ção à presença de citocina ou mediador endógeno na superfície revestida com o anticorpo anticitocina ou mediador antiendógeno. Preferencialmente, condições estéreis rigorosas são mantidas em todos os pontos no procedi- mento antes de o anticorpo revestido ser ensaiado em relação à citocina li- gada. Se uma placa ELISA revestida com um anticorpo de captura for utili- zada como modalidade da presente invenção, a placa será lavada e um se- gundo anticorpo anticitocina conjugado com uma enzima será adicionado à placa ELISA (a menos que o segundo anticorpo "de detecção" marcado fos- se inicialmente adicionado à placa antes de vitrificação ou juntamente com o conteúdo do primeiro sistema de ensaio). A placa ELISA é lavada novamen- te e adição de um substrato à placa ELISA produzirá cor. Após um curto tempo de incubação, a reação é terminada e a densidade óptica da solução é medida em uma leitora de placa ELISA. Esse processo é adicionalmente descrito no Exemplo 2 da Patente Norte-americana N9 6.696.261. Alternati- vãmente, técnicas de imunoensaio não-enzimático poderão ser utilizadas. Por exemplo, o segundo anticorpo do "sanduíche" de imunoensaio poderá ser marcado com uma porção fluorescente ou um isótopo radioativo. Após lavagem, a quantidade de citocina capturada na cavidade pode ser quantifi- cada mediante detecção da quantidade de fluorescência ou radiação presen- te na cavidade. Diversos sistemas de ensaio baseados em ensaios enzimá- ticos e não-enzimáticos são disponíveis comercialmente e podem ser facil- mente modificados para uso na presente invenção por aquele versado na técnica.

3. Sistema de um Ensaio

Em certas modalidades da presente invenção, o teste de piroge- nicidade é realizado em um sistema de um recipiente, tal que as etapas de incubação de amostra com o reagente que contém monócitos e a captura de citocina(s) produzida(s) pelo reagente que contém monócitos ocorram no mesmo sistema de recipiente de ensaio. O sistema de ensaio compreende pelo menos uma superfície que compreende polipropileno e pelo menos uma superfície tratada com um anticorpo para uma citocina ou um mediador en- dógeno da resposta inflamatória. A etapa de incubação segue a etapa de cultura descrita acima e é realizada no mesmo sistema de ensaio da etapa de cultura. Conforme descrito acima no contexto do sistema de dois recipien- tes de ensaio, o tempo de incubação ótimo para uso no teste de pirogênios da presente invenção variará dependendo das condições de ensaio, a saber a citocina que é ensaiada. Geralmente, os ensinamentos relativos à etapa de incubação discutida com relação ao sistema de dois recipientes de ensaio aplicam-se também ao sistema de um recipiente de ensaio. O período de incubação deverá ser otimizado para a produção de uma citocina particular e essa otimização está dentro das capacidades daquele versado na técnica.

Se a citocina a ser ensaiada não for liberada pelos monócitos, as células poderão ser Iisadas por congelamento/descongelamento, ou por adição de um detergente no final do período de incubação em uma concentração que não romperá ligação de Iigantes com anticorpos.

Uma vez completa a etapa de incubação, o sistema de ensaio, que compreende pelo menos uma superfície tratada com um anticorpo para uma citocina ou um mediador endógeno da resposta inflamatória, por exem- plo endotelina, é ensaiado em relação à presença de citocina ou mediador endógeno na superfície revestida com o anticorpo anticitocina ou mediador antiendógeno. Preferencialmente, condições estéreis rigorosas são mantidas em todos os pontos no procedimento antes de o anticorpo revestido ser en- saiado em relação à citocina ligada. Geralmente, a discussão relativa à eta- pa de ensaio do sistema de dois recipientes de ensaio, isto é, a discussão da placa ELISA e de técnicas de imunoensaio não-enzimático, aplicam-se tam- bém ao sistema de um recipiente de ensaio.

Em geral, o sistema de um recipiente de ensaio e o sistema de dois recipientes de ensaio são intercambiáveis.

4. Recipientes de Ensaio

Os sistemas de ensaio da presente invenção compreendem pelo menos uma superfície em contato com o reagente que contém monócitos.

Em certas modalidades da presente invenção, o(s) sistema(s) de ensaio in- clui(em) pelo menos uma cavidade de microtitulação, e a superfície é pelo menos uma porção do interior da cavidade de microtitulação. Em modalida- des particulares, a superfície da cavidade de microtitulação compreende um revestimento de polipropileno ou todo a cavidade de microtitulação é com- posto de polipropileno. Em certas modalidades em que o sistema de ensaio compreende pelo menos uma superfície tratada com um anticorpo para uma citocina ou para um mediador endógeno da resposta inflamatória, a superfí- cie em que o anticorpo é aplicado é pelo menos uma porção do interior da cavidade de microtitulação. Preferencialmente, a cavidade de microtitulação apresenta uma forma tal que o reagente que contém monócitos seja concen- trado em comparação com uma cavidade de microtitulação de fundo chato.

Em modalidades particulares, a(s) cavidade(s) de microtitulação compreende(m) uma parte superior aberta, uma região superior que se es- tende descendentemente da parte superior aberta e uma parede inferior que assume forma cônica em seu diâmetro de um local acima do ponto mais bai- xo até o ponto mais baixo.

Em modalidades particulares, a(s) cavidade(s) de microtitulação compreende(m) uma parte superior aberta, uma região superior que se es- tende descendentemente da parte superior aberta que apresenta uma ex- tremidade superior aberta e uma extremidade inferior, e uma região inferior que apresenta uma extremidade superior e um ponto mais baixo, a região inferior estendendo-se da extremidade inferior da região superior e assumin- do forma cônica em seu diâmetro mais rapidamente do que a região superior da extremidade superior da região inferior na direção do ponto mais baixo.

Em certas modalidades, a parede inferior dessa cavidade de microtitulação é não-planar, preferencialmente curvada, às vezes parabólica. Em certas modalidades particulares, a parede inferior estende-se descen- dentemente, ou os lados da cavidade de microtitulação inclinam-se para dentro.

5. Kit de Diagnóstico

Qualquer uma das modalidades descritas acima pode ser incor- porada em um kit de diagnóstico para realizar testes de pirogênios. O kit é utilizado para detectar uma variedade de pirogênios não-endotóxicos, inclu- indo bactérias gram-positivas (por exemplo, Staphylococcus aureus) ou seus componentes (por exemplo, muropeptídeo, ácido lipoteicóico, enterotoxinas, estreptolisina), bem como pirogênios endotóxicos em uma variedade de pro- dutos médicos, incluindo produtos hemoderivados ou outros parentéricos, tais como dialisados, vacinas e soluções intravenosas. Geralmente, tal kit inclui uma placa de microtitulação que compreende uma pluralidade de cavi- dades de microtitulação com uma forma tal que meio de cultura contido em cada cavidade seja concentrado em comparação com uma cavidade de mi- crotitulação de fundo chato, as cavidades compreendendo pelo menos uma superfície que compreende polipropileno. As cavidades da placa de microti- tulação contêm reagente que contém monócitos crioconservados que com- preende total crioconservado, células mononucleares de sangue periférico crioconservado ou células de linhagem de células monocíticas, que estão em contato com a superfície das cavidades. Em certas modalidades, as ca- vidades da placa de microtitulação compreendem polipropileno. Quando o reagente que contém monócitos crioconservados compreende sangue célu- las mononucleares de sangue periférico crioconservado ou células de linha- gem de células monocíticas, o reagente está presente nas cavidades sob alta densidade celular. Kits que contêm sangue total crioconservado como reagente que contém monócitos também contêm anticorpos para IL-6, na medida em que IL-6 é a leitura de saída preferida.

Em modalidades particulares, as cavidades incluem uma barrei- ra que é impermeável a monócitos. A barreira compreende pelo menos uma superfície compreendida de um material sem pirogênio, e é tipicamente uma membrana, uma grade, uma peneira ou um crivo. A barreira é preferencial- mente estéril. Materiais de barreira adequados para uso com placas de mi- crotitulação são conhecidos no estado da técnica. A barreira, que é permeá- vel a fluidos, permite que células crioconservadas sejam lavadas sem ser removidas das cavidades; sulfóxido de dimetila (DMSO), que banha células crioconservadas e atua como um conservante, pode ser removido de modo que não interfira no teste. Amostras de teste são adicionadas acima da bar- reira, penetram na barreira, contatam células abaixo da barreira e potencial- mente estimulam essas células a produzir citocinas. Citocinas liberadas por células difundem-se no meio acima da barreira. Tipicamente, as soluções acima e abaixo da barreira são completamente misturadas, mediante aspira- ção das soluções. Subseqüentemente, uma alíquota de meio bem misturado de cima da barreira é ensaiada em relação à presença de citocina ou um mediador endógeno da resposta inflamatória. 6. Interpretação de Dados de Produção de Citocinas A. Método da Curva Padrão

A fim de interpretar apropriadamente os dados de produção de citocinas gerados no teste de pirogênio da presente invenção, uma curva- padrão de endotoxina é gerada incubando o reagente que contém monócitos com endotoxina-padrão USP. A finalidade disso é quantificar a resposta à produção de citocinas medida para uma amostra de teste em termos da res- posta observada para um pirogênio conhecido. Uma curva-padrão poderá ser gerada a partir de qualquer número de pontos de dados estatisticamente significativos gerados com concentrações significativamente variadas de en- dotoxina-padrão por meio de utilização de software padrão de análise de dados mais ajustada. Métodos de geração tais como curva-padrão são ge- ralmente conhecidos no estado da técnica. As requerentes verificaram que pontos de dados de 10; 4; 1; 0,25; 0,06; 0,03 e 0 EU/ml de endotoxina são adequados para gerar uma curva-padrão, mas qualquer número de concen- trações estatisticamente significativo através de uma faixa similar seria ade- quado. Uma vez gerada uma curva-padrão, a concentração equivalente de não-endotoxina (quantificada em equivalentes unitários de endotoxina) pode- rá ser interpolada da resposta a citocinas usando a curva-padrão. Como a resposta de reagentes que contêm monócitos baseados em sangue total pode variar significativamente de doador para doador, é importante gerar uma curva-padrão para cada conjunto de ensaios realizado com um lote par- ticular de reagente que contém monócitos. Entretanto, porque a modalidade preferida de placas ELISA da invenção utiliza quantidades muito pequenas de sangue humano (cerca de 40 pL/cavidade), uma única unidade de san- gue doado pode ser usada para diversas centenas de cavidades. A curva- padrão gerada utilizando a endotoxina USP ajuda na normalização dos da- dos em termos de relação com unidades de endotoxina (EU, como definido pela USP/FDA, que são idênticas a IU, unidades internacionais como defini- do por WHO), que é o padrão da indústria para expressar contaminação en- dotoxina/pirogênio.

B. Método dos Lotes de Referência Alternativamente, os dados de produção de citocinas gerados no teste de pirogênio da presente invenção poderão ser interpretados compa- rando respostas a citocinas originadas por lotes de testes de um produto com aquelas originadas por lotes de referência de um produto, um lote de referência contaminado e um lote de referência não-contaminado. Primeiro, os dois lotes de referência de um produto médico são identificados: os lotes de referência são testados em relação a pirogênios e as respostas a citoci- nas originadas por esses lotes são medidas. Em seguida, lotes de teste são testados em relação a pirogênios e as respostas originadas desses lotes são comparadas com aquelas dos lotes de referência. Geralmente, um lote de testes será considerado não-contaminado se ele dê origem a uma resposta menor do que a do lote de referência contaminado e uma resposta similar àquela do lote de referência não-contaminado. Cada lote de testes poderá ser testado uma vez ou diversas vezes. Por exemplo, de acordo com um método de lotes de referência, um produto foi considerado não-contaminado se ele deu origem à liberação de não mais que duas vezes tanto IL-6 quanto o lote de referência não-contaminado em quatro de quatro doadores ou sete de oito doadores; o teste foi conduzido em quadruplicata usando o sangue de quatro diferentes doadores. Um método preferido de lotes de referência é descrito em Gaines-Das e outros, 2004, em que a amostra de teste é exigida a estimular a liberação de menos IL-6 do que a referência. Nesse artigo, a preparação de teste é exigida a passar no teste com as PBMNCs de quatro diferentes doadores. Se a preparação de teste passa no teste com as PBMNCs de três dos quatro doadores, o teste é continuado com PBMNCs de quatro doadores adicionais, nenhum dos quais forneceu PBMNCs para o primeiro teste, e a preparação de teste é exigida a passar no teste com as PBMNCs de sete dos oito diferentes doadores.

Vantajosamente, os testes de ativação de monócitos da presen- te invenção são capazes de detectar melhor a presença de uma ampla vari- edade de pirogênios, incluindo pirogênios não-endotóxicos, em produtos médicos tais como produtos hemoderivados, soluções intravenosas e vacinas. DEFINIÇÕES

Como usado neste relatório, o termo pirogênio endotóxico ou não-endotóxico "puro" ou pirogênio em sua "forma pura" refere-se à endoto- xina que foi purificada de sua proteína associada. Endotoxina pura é tam- bém conhecida como lipopolissacarídeo (LPS).

O termo "reagente que contém monócitos" significa qualquer solução de células de leucócitos monocíticos do sistema imune. Preferenci- almente, essas células são derivadas do organismo a quem o produto que está sendo testado deve ser administrado (isto é, ser humano para produtos farmacêuticos; gato, cão, cavalo, etc. para produtos veterinários). Um exem- plo de reagente que contém monócitos é sangue total humano.

O termo "sistema de ensaio" significa qualquer recipiente e su- perfície que poderão ser usados em um teste de ativação de monócitos, in- cluindo um recipiente em que células são cultivadas e incubadas com uma amostra de teste, bem como um recipiente e superfície com anticorpo ligado que poderá ser usado em um imunoensaio. Preferencialmente, com relação à realização de um imunoensaio, tais recipientes são placas de cavidades de microtitulação com anticorpo ligado a uma superfície na cavidade, em que um grande número de imunoensaios colorimétricos ligados à enzima pode- rão ser realizados em paralelo e que poderão ser automaticamente avalia- dos por uma máquina de leitura de placas ELISA. Entretanto, outros siste- mas de imunoensaio são considerados, especialmente aqueles em que a superfície revestida não é necessariamente parte da parede do recipiente. Por exemplo, um tubo de teste maior que contém uma conta de poliestireno ou haste de verificação revestida pelo anticorpo poderia ser utilizado na pre- sente invenção.

O termo "linhagem de células monocíticas" inclui qualquer linha- gem de células que apresenta receptores endógenos para CD14 ou recepto- res semelhantes a Toll (TLRs) ou que foram transfectados com CD14 e/ou TLRs e/ou genes-repórter para mediadores inflamatórios/pirogênicos. A li- nhagem de células não tem de ser monocítica, contanto que ela apresente ou tenha sido transfectada com os componentes dos "receptores pirogêni- cos" presentes em monócitos: esses componentes incluem TLRs e CD14. Por exemplo, células Embrionárias de Rim Humano (HEK) já apresentam a maior parte dos TLRs e podem ser estavelmente transfectadas com os TLRs que elas não apresentam - TLR2 e TLR4 - e também com CD14 para torná- las suficientemente semelhantes a um monócito para funcionar nos métodos da invenção.

EXEMPLOS

Exemplo 1

Preparação de PBMC

PBMCs foram isoladas de sangue periférico humano hepariniza- do que não tinha mais de 4 horas por centrifugação por gradiente de densi- dade usando Ficoll Paque Plus (Pharmacia N° 17-1440-02). As células foram lavadas duas vezes com solução salina tamponada com fosfato da Dulbecco sem cálcio e magnésio {Gibeo N° 14190), ressuspensas em Meio Mínimo Essencial (MEM) (Gibco N° 11090), tampão HEPES (Gibeo N° 15630) e 5 μl de plasma termicamente inativado do próprio doador (isto é, 2% de concen- tração final). As PBMCs foram diluídas nas densidades celulares exigidas (8 milhões, 4 milhões, 2 milhões e 1 milhão de PBMCs por mL).

Cultura de Células

Culturas celulares foram realizadas em quadruplicata nas se- guintes placas de microtitulação: Corning Costar Ne 3790 e Ns 3359. 125 pL de suspensão de células contendo 1 milhão, 0,5 milhão, 0,25 milhão ou 0,13 milhão de células foram adicionados em cada cavidade, seguidos de 125 pL de amostra de teste ou endotoxina-padrão (0,0064-20 EU/mL). A mistura de 250 μl foi moderadamente misturada e incubada a 37 ± 1°c, em 5% de CO2 e em ar umidificado. A duração da cultura foi de 16 a 24 horas, após o que alíquotas do fluido de cultura foram obtidas com o tempo, diluídas 1 em 2 e 1 em 50 e ensaiadas em relação a IL-6.

ELISA Para IL-6

Placas de 96 cavidades (Immulon 4, Dynex N9 011-010-3855) foram revestidas com 150 pL de 3 pg/mL de IgG monoclonal de camundon- go (R&D Systems, N9 MAB206 dissolvido em tampão de bicarbonato, pH 9,5) por incubação da noite para o dia a 2-8°c. As placas foram lavadas três vezes com 300 μL de tampão de lavagem (HEPES 20 mM, NaCI 150 mM, pH 7,4). Sítios de ligação não-específicos nas placas foram bloqueados me- diante adição de 200 μL de solução de bloqueio (0,02 g/L de Soroalbumina Bovina, Fração V, sem protease). As placas foram novamente lavadas três vezes com 300 μΙ_ do mesmo tampão de lavagem e 100 pL de amostras (an- teriormente diluídas 1 em 2 e 1 em 50 em diluente de amostra) ou padrões (7,8-1.000 pg/mL de WHO padrão internacional para IL-6, Ns 89/548) foram adicionados em cada cavidade. 100 pL de diluente de amostra foram adicio- nados em cada cavidade não-utilizada. A placa foi coberta com selador (Fal- con Ne 3073) e incubada com agitação vigorosa (aproximadamente 300 rpm) por 1 hora ± 5 minutos.

A placa foi então aspirada e lavada cinco vezes com 300 μι. de tampão de lavagem. Em seguida, 100 μΙ_ de 0,2 μg/mL de anticorpo a IL-6 biotinado anti-humano de cabra (R&D Systems, N2 BAF206) foram adiciona- dos em cada cavidade e a placa foi novamente coberta com selador e incu- bada com agitação vigorosa (aproximadamente 300 rpm) por 1 hora ± 5 mi- nutos.

A placa foi então aspirada e lavada cinco vezes com 300 μL de tampão de lavagem. Em seguida, 100 pL de 0,02 pg/mL de fosfatase alcali- na (Rockland, Ns S000-05) foram adicionados em cada cavidade e a placa foi novamente coberta com selador e incubada com agitação vigorosa (apro- ximadamente 300 rpm) por 1 hora ± 5 minutos.

A placa foi aspirada e lavada cinco vezes com 300 pL de tampão de lavagem. Em seguida, 200 pL de 1 mg/mL de pNPP em tampão de dieta- nolamina com MgCI2 0,5 mM foram adicionados em cada cavidade. A placa foi novamente coberta com selador e incubada com agitação vigorosa (apro- ximadamente 300 rpm) à temperatura ambiente até que a maior concentra- ção da curva-padrão de IL-6 (1.000 pg/mL) tivesse uma densidade óptica entre cerca de 2,5 e 3,0 a 405 nm, em cujo ponto a reação foi interrompida mediante adição de 50 pL de NaOH a 2 M em cada cavidade. A densidade óptica de cada cavidade foi determinada em 30 minutos da reação, sendo esta interrompida usando um aparelho de leitura de microplacas a 405 nm.

A figura 1 mostra o efeito de densidade celular nas respostas de IL-6 a padrão de endotoxina (1 EU/ml) e controle positivo de ExtraneaP. O controle positivo de Extraneal® foi contaminado com pirogênio não- endotóxico e causou uma reação a fármaco adversa em recipientes huma- nos desse lote desse fármaco, mas forneceu uma resposta negativa no teste LAL (Martis e outros, 2005). Os valores são média ± erro-pádrão da média de quatro cavidades de réplica. Densidades celulares de 0,25 a 1 milhão de PBMC por cavidade responderam similarmente ao padrão de endotoxina de 1 EU/ml. A amostra de controle positivo foi detectada melhor usando 1 mi- lhão > 0,5 milhão > 0,25 milhão >> 0,13 milhão de células por cavidade.

Exemplo 2 - Testes Comparativos de Pirogênio

Os métodos descritos neste relatório como estado da técnica corrente foram replicados. Nenhum desses métodos discrimina controles positivos do produto para solução de diálise Extraneal®, hemoglobina e/ou dextrano de controles negativos do produto.

Os ensaios de Hoffman e outros, 2005, foram replicados con- forme descritos aqui usando placas de poliestireno de microtitulação com cavidades de fundo chato e leitura de saída de IL-6. O reagente contendo monócito foi usado sob baixa densidade celular e se constituiu de sangue total (75.000 células por cavidade), PBMCs (100.000 células por cavidade), MONOMAC6 (250.000 células por cavidade), ou THP-1 (250.000 células por cavidade) nas figuras 2-5, respectivamente. Nota-se que na figura 5, leitura de saída de IL-6 foi substituída por neopterina porque IL-6 é um pirogênio endógeno (em contraste com neopterina) e uma leitura de saída mais robus- ta nos métodos da invenção. Na figura 6, foram usadas células THP-12A9 em baixa densidade celular (250.000 células por cavidade) como reagente contendo monócito e TNF foi a leitura de saída.

O ensaio de Nakagawa e outros foi replicado, conforme descrito aqui, usando 1.000.000 de células de clone MONOMAC-CA8 por ml como reagente contendo monócito, leitura de saída de IL-6 e placas de poliestireno de microtitulação com cavidades de fundo chato, Ver figura 7. O ensaio de Yamamoto e outros foi replicado, conforme descrito aqui, usando 1.000.000 de células 28C por ml como o reagente contendo monócito, leitura de saída de IL-6 e placas de poliestireno de microtitulação com cavidades de fundo chato. Ver figura 8. Contudo, as células 28 C foram condicionadas com calcitriol (100 ng/nl) em vez de interferon gama porque este último falhou em fornecer uma curva de resposta à dose para padrão de endotoxina.

Exemplo 3 - Teste de Pirogênio da Invenção

Culturas (200 μl) de sangue total humano a 20% (40 μl = aprox. 60.000 PBMCs/cavidade = aprox, 300.000 PBMCs/ml) foram realizadas em quadruplicata em placas de polipropileno de fundo redondo de 96 cavidades (Costar Nq 3790, Corning Incorporated, EUA). As adições por cavidade fo- ram: amostras de MEM-HEPES (60 μΙ), sangue de um único doador (40 μl), padrão de endotoxina ou amostras de ExtraneaP diluídas 1:1 com MEM- HEPES (100 μl, isto é, a solução de ExtraneaP era em uma diluição final de 1 em 4 na cavidade). O conteúdo das cavidades foi misturado girando sua- vemente (sem cavidades de contaminação cruzada) e incubado sem vibra- ção (para permitir que as células sedimentassem) a 37°c por 16-24 horas em uma atmosfera de 5% de CO2 no ar. No final da incubação de cultura tissu- lar, 100 μl de alíquotas de sobrenadante límpido de cada cavidade foram tomados para ensaio de IL-6 por meio de ELISA.

A metodologia usada para as amostras de dextrano foi similar àquela descrita acima no Exemplo 1. O isolamento e a cultura celular foram similares, exceto que a densidade celular foi de 400.000 células por cavida- de e a diluição de amostra usada no ELISA foi de 1 em 10. O ELISA de IL-6 foi diferente pelo fato de que se usaram placas revestidas com anticorpo monoclonal Clone 16 (para captura de IL-6) e um anticorpo policlonal de ovelha conjugado com peroxidase de rábano-silvestre como anticorpo de detecção. O ELISA é utilizado no teste de sangue total/IL-6 (NIBSC) e no teste de PBMCs/IL-6 (Novartis) conforme descrito no artigo de Hoffmann e outros, 2005.

A figura 9 ilustra resultados comparativos para a amostra de controle negativo de ExtraneaP e para a amostra de controle positivo Extra- neaP, e para amostra de controle negativo de dextrano e para amostra de controle positivo de dextrano. Pode-se observar que o teste de pirogênio da invenção pode prontamente discriminar entre esses controles positivos e negativos. O teste foi realizado, em quadruplicata, de acordo com o protoco- lo descrito acima, com sangue de um único doador. Os valores são média ± erro-padrão das médias de quatro cavidades de réplica.

A figura 10 ilustra resultados comparativos para a amostra de controle negativo de ExtraneaP e para a amostra de controle positivo de Ex- traneaP. Pode-se observar que o teste de pirogênio da invenção pode pron- tamente discriminar entre esses controles positivos e negativos. O teste foi realizado, em quadruplicata, de acordo com o protocolo descrito acima, com sangue de um único doador. Os valores são média ± erro-padrão das mé- dias de quatro cavidades de réplica. Observe-se que baixa densidade celular foi suficiente para discriminação de controles positivos e negativos de Extra- neaP quando sangue total foi o reagente contendo monócitos e foram usa- das cavidades de polipropileno de fundo redondo.

Exemplo 4 - Teste de Pirogênio da Invenção: Resultados Comparativos de Placas de Polipropileno vs Placas de Poliestireno e IL-6 vs IL-1β em Relação a um Único Doador

As amostras de teste foram preparadas de acordo com o método do Exemplo 1, exceto que foram usadas densidades celulares de 1 milhão de células por cavidade, algumas amostras foram submetidas à leitura de saída de IL-1β e algumas amostras foram colocadas em placas de poliesti- reno de microtitulação com cavidades de fundo chato. A figura 11A mostra que respostas de IL-6 a controles positivos foram claramente distintas de controles negativos para testes conduzidos em placas de polipropileno, mas não se distinguiram daquelas em placas de poliestireno. Os valores são mé- dia ± erro-padrão das médias de quatro cavidades de réplica. A figura 11B mostra que respostas de IL-1β para controles positivos foram claramente distintas de controles negativos para testes conduzidos em placas de poli- propileno, mas não se distinguiram daquelas em placas de poliestireno. Con- tudo, a magnitude da resposta na figura 11B foi muito menor que aquela da figura 11A, indicando que IL-1 β é uma leitura de saída pobre quando compa- rada com IL-6. Os valores são média ± erro-padrão das médias de quatro cavidades de réplica.

Exemplo 5 - Teste de Pirogênio da Invenção: Resultados Comparativos de Placas de Polipropileno vs Placas de Poliestireno para Doadores Múltiplos

As amostras de teste foram preparadas de acordo com o método do Exemplo 1, exceto que foram usadas densidades celulares de 0,88 e 1 milhão de células por cavidade, foram usados três doadores, algumas amos- tras foram colocadas em placas de poliestireno de microtitulação com cavi- dades de fundo chato e o ELISA de IL-6 usou placas revestidas com anticor- po monoclonal Clone 16 e um anticorpo policlonal de ovelha conjugado com peroxidase de rábano-silvestre como anticorpo de detecção conforme descri- to no artigo de Hoffmann e outros, 2005. As figuras 12A e 12B ilustram a resposta de IL-6 para placas de polipropileno de microtitulação com cavida- des de fundo redondo e placas de poliestireno de microtitulação com cavida- des de fundo chato para densidade celular de PBMCs de 0,88 milhão de cé- lulas por cavidade para doador A, respectivamente. Em relação a doador A, o teste de pirogênio não distinguiu entre controles positivos e negativos quando foram usadas as placas de poliestireno, mas distinguiu entre esses controles quando se usaram placas de polipropileno. As figuras 13A e 13B ilustram á resposta de IL-6 para placas de polipropileno de microtitulação com cavidades de fundo redondo e placas de poliestireno de microtitulação com cavidades de fundo chato para densidade celular de PBMCs de 1 mi- lhão de células por cavidade de doador B, respectivamente. Embora ambos os testes de pirogênio tenham distinguido entre controles positivos e negati- vos de doador B, a resposta de IL-6 ao controle positivo foi aproximadamen- te 6 vezes aquela do controle negativo usando as placas de polipropileno, mas apenas aproximadamente 2 vezes aquela do controle negativo usando placas de poliestireno. As figuras 14A e 14B ilustram a resposta de IL-6 para placas de polipropileno de microtitulação com cavidades de fundo redondo e placas de poliestireno de microtitulação com cavidades de fundo chato para densidade celular de PBMCs de 0,88 milhão de células por cavidade de do- ador C, respectivamente. Embora ambos os testes de pirogênio tenham dis- tinguido entre controles positivos e negativos de doador B, a resposta de IL- 6 para o controle positivo foi aproximadamente duas vezes maior usando as placas de polipropileno versus as placas de poliestireno. Note-se que em polipropileno a resposta para o controle positivo de ExtraneaP excede a res- posta para a dose maior de padrão de LPS, isto é, 0,4 EU/ml, haja visto que em poliestireno a resposta ao controle positivo de ExtraneaP é menor que a resposta para a dose menor de padrão de LPS, isto é, 0,1 EU/ml.

Exemplo 6 - Teste Comparativo de Pirogênio: IPT (Charles River Laboratori- es)

A metodologia usada na realização desse teste é descrita na folha de instruções de Teste de Pirogênio In Vitro Endosafe®-\PT (comerci- almente disponível por Charles River Laboratories (PIIPT10002)) usando o procedimento de ensaio para estimulação de sangue total usando IL-1 β e placas de poliestireno de microtitulação. A figura 15 ilustra que o teste IPT falhou em discriminar entre controles positivos e negativos de ExtraneaP e Hemoglobina, embora o kit tenha respondido a padrão de LPS e a um kit de controle positivo de ácido lipotecóico de uma bactéria gram-positiva.

Exemplo 7 - Teste de Pirogênio da Invenção Usando Células Criopreserva- das

Suspensão de células (por exemplo, 1 milhão de PBMCs ou cé- lulas monocíticas) em plasma e sulfóxido de dimetila (ou em sangue total e sulfóxido de dimetila) é adicionada a cada cavidade de uma placa de poli- propileno de 96 cavidades com cavidades de 250 μί de fundo redondo, a qual é em seguida selada e crioconservada.

No dia do teste, a placa é descongelada, levada a temperatura ambiente, a selagem removida e a inserção de 96 cavidades puxada firme- mente até a posição. A inserção apresenta paredes de polipropileno e um fundo chato que é uma barreira à passagem de células, mas não de líquidos.

O DMSO é lavado das células mediante enchimento da inserção com meio fresco e aspiração do meio de cima a baixo para misturar as solu- ções acima e abaixo da barreira celular, antes aspirando e descartando a solução acima da barreira celular. Ao repetir essa etapa de lavagem 5 vezes, as células são lavadas e tornadas essencialmente livres de DMSO e são retidas em um volume conhecido de meio fresco.

Amostra de teste ou padrão e mais meio fresco são adicionados à inserção e, aspirando essa solução acima e abaixo para misturar as solu- ções acima e abaixo da barreira celular, pirogênio na amostra ou padrão (pi- rogênio) é deixado acessar as células.

A placa é incubada a 37 ± 1°c, em 5% de gás dióxido de carbono em ar umidificado, por 16-24 horas. Durante a incubação, as células sedi- mentam-se permitindo às células contatar umas com as outras, o que facilita liberação de IL-6 estimulada por pirogênio. No final do período de incubação, as soluções acima e abaixo da barreira celular são totalmente misturadas aspirando a solução acima da barreira celular acima e abaixo, antes que uma alíquota de meio condicionado a células seja tomada para ensaio de IL- 6.

PBMCs crioconservados são vantajosas porque elas podem ser facilmente transportadas sobre gelo seco por todo o mundo. Ao contrário de poliestireno, polipropileno resiste a nitrogênio líquido sem rachar. Na chega- da, as PBMCs necessitam apenas ser descongeladas e lavadas para se tor- narem livres do DMSO para estar prontas para uso em um teste, juntamente com a inserção de placa proporcionada. Ao transportar as células no número ótimo por cavidade e usar as células juntamente com a inserção de placa, um kit de teste aperfeiçoado é proporcionado ao usuário final. Com um kit convencional, as células são transportadas em um tubo e, uma vez descon- geladas, têm de ser lavadas por meio de centrifugação, o que peletiza as células, permitindo que elas se dispersem em meio limpo. Usualmente, as células são lavadas duas ou três vezes dessa maneira. Em seguida, as célu- las têm de ser contadas e ressuspensas na densidade celular exigida antes que elas possam ser liberadas em cavidades. O teste de pirogênio da pre- sente invenção exige menos trabalho, consome menos tempo e de longe é menos traumático às células em comparação com testes convencionais que podem resultar em perda celular, ativação e morte celular.

Quando se introduzem elementos da presente invenção ou a(s) modalidade(s) preferida(s) desta, os artigos "um", "uma", "o(s)H, "a(s)" e "re- ferido(a)" ou "referidos(as)" pretendem significar que há um ou mais dos e- lementos. Os termos "compreendendo", "que compreende(em)", "incluindo", "que inclui(em)" e "apresentando" ou "que apresenta(m)" pretendem ser in- clusivos e significam que poderão ser elementos adicionais diferentes dos elementos listados. Como várias alterações podem ser feitas nos métodos e composições acima sem se desviar do escopo da invenção, pretende-se que todo assunto contido na descrição acima deva ser interpretado como ilustra- tivo e não em um sentido limitativo.

Claims (37)

1. Método de detecção de pirogênios não-endotóxicos em uma amostra, método este que compreende as etapas de: combinar um reagente que contém monócitos e a amostra a ser testada em um primeiro sistema de ensaio que compreende pelo menos uma superfície que compreende polipropileno, em que o reagente que con- tém monócitos compreende células mononuclares de sangue periférico ou células de linhagem de células monocíticas, está em contato com a superfí- cie e está presente nesse sistema de ensaio sob alta densidade celular; incubar o reagente que contém monócitos e a amostra, em que o reagente que contém monócitos produz uma citocina ou um mediador en- dógeno da resposta inflamatória; transferir o conteúdo do primeiro sistema de ensaio para um se- gundo sistema de ensaio que compreende pelo menos uma superfície trata- da com um anticorpo a uma citocina ou um mediador endógeno da resposta inflamatória; e ensaiar o segundo sistema de ensaio em relação à presença de citocina ou mediador endógeno ligado ao anticorpo na superfície; por meio do que um nível elevado de citocina ou mediador endógeno ligado à superfí- cie indica a presença de pirogênios na amostra testada.

2. Método de detecção de pirogênios não-endotóxicos em um produto médico administrado parenteralmente, método este que compreen- de as etapas de: combinar um reagente que contém monócitos e o produto médi- co a ser testado em um primeiro sistema de ensaio que compreende pelo menos uma superfície que compreende polipropileno, em que o reagente que contém monócitos compreende sangue total e está em contato com a superfície; incubar o reagente que contém monócitos e o produto médico, em que o reagente que contém monócitos produz IL-6; transferir o conteúdo do primeiro sistema de ensaio para um se- gundo sistema de ensaio que compreende pelo menos uma superfície trata- da com um anticorpo a IL-6; e ensaiar o segundo sistema de ensaio em relação à presença de IL-6 ligado ao anticorpo na superfície; por meio do que um nível elevado de IL-6 ligado à superfície indica a presença de pirogênios no produto médico testado.

3. Método de detecção de pirogênios não-endotóxicos em um produto médico administrado parenteralmente, método este que compreen- de as etapas de: combinar um reagente que contém monócitos e o produto médi- co a ser testado em um primeiro sistema de ensaio que compreende pelo menos uma superfície que compreende polipropileno e pelo menos uma su- perfície tratada com um anticorpo a IL-6, em que o reagente que contém monócitos compreende sangue total e está em contato com a superfície que compreende polipropileno; e ensaiar o sistema de ensaio em relação à presença de IL-6 liga- do ao anticorpo na superfície; por meio do que um nível elevado de IL-6 li- gado à superfície indica a presença de pirogênios no produto médico testa- do.

4. Método de cultura de células contidas em um reagente que contém monócitos para uso em um ensaio de pirogênios não-endotóxicos, método este que compreende as etapas de: combinar o reagente que contém monócitos e uma amostra a ser testada em um sistema de ensaio que compreende pelo menos uma su- perfície que compreende polipropileno, em que o reagente que contém mo· nócitos compreende células mononuclares de sangue periférico ou células de linhagem de células monocíticas, está em contato com a superfície e está presente nesse sistema de ensaio sob alta densidade celular.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, no qual o sistema de ensaio compreende pelo menos uma cavidade de microtitulação com uma forma tal que o reagente que contém monócitos seja concentrado em comparação com uma cavidade de microtitulação de fundo chato, pelo me- nos uma superfície desse cavidade compreende polipropileno e o reagente que contém monócitos está presente nessa cavidade sob alta densidade celular,

6. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, no qual pelo menos um dentre o primeiro e o segundo sistemas de ensaio inclui pelo me- nos uma cavidade de microtitulação e a(s) superfície(s) é(são) pelo menos uma porção do interior da cavidade de microtitulação.

7. Método, de acordo com a reivindicação 3 ou 4, no qual o sis- tema de ensaio inclui pelo menos uma cavidade de microtitulação e a(s) su- perfície(s) é(são) pelo menos uma porção do interior da cavidade de microti- tulação.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a -7, no qual a cavidade apresenta um perfil tal que reagente contendo monóci- tos seja concentrado para proporcionar maior contato célula-célula em com- paração com uma cavidade de microtitulação de fundo chato.

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a -7, no qual a cavidade de microtitulação compreende uma parte superior a- berta, uma região superior que se estende descendentemente da parte su- perior aberta e uma parede inferior que assume forma cônica em seu diâme- tro de um local acima do ponto mais baixo até o ponto mais baixo.

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a -7, no qual a cavidade de microtitulação compreende uma parte superior a- berta, uma região superior que se estende descendentemente da parte su- perior aberta que apresenta uma extremidade superior aberta e uma extre- midade inferior, e uma região inferior que apresenta uma extremidade supe- rior e um ponto mais baixo, a região inferior estendendo-se da extremidade inferior da região superior e assumindo forma cônica em seu diâmetro mais rapidamente do que a região superior da extremidade superior da região in- ferior na direção do ponto mais baixo.

11. Método, de acordo com a reivindicação 9, no qual a parede inferior da cavidade de microtitulação é não-planar, curvada, parabólica ou se estende descendentemente.

12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a -7, no qual os lados da cavidade de microtitulação inclinam-se para dentro.

13. Método, de acordo com a reivindicação 5, no qual o sistema de ensaio compreende pelo menos uma superfície tratada com um anticorpo para uma citocina e a superfície em que o anticorpo é aplicado é pelo menos uma porção do interior da cavidade de microtitulação.

14. Método, de acordo com a reivindicação 13, no qual o anti- corpo é um anticorpo a um mediador endógeno da resposta iriflamatória.

15. Método, de acordo com a reivindicação 14, no qual o media- dor endógeno é endotelina.

16. Método, de acordo com a reivindicação 5, o qual compreen- de adicionalmente a etapa de ensaiar o sistema de ensaio em relação à pre- sença de citocina ou mediador endógeno ligado ao anticorpo na superfície; por meio do que um nível elevado de citocina ou mediador endógeno ligado à superfície indica a presença de pirogênios na amostra testada.

17. Método, de acordo com a reivindicação 1, 13 ou 16, no qual a citocina é selecionada do grupo que consiste em interleucina-1 (IL-1), inter- leucina-Ira (IL-1ra),interleucina-6 (IL-6), interleucina-8 (IL-8) e fator de ne- crose de tumor α (TNF-α).

18. Método, de acordo com a reivindicação 17, no qual a citocina é IL-6.

19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a -18, no qual o anticorpo é um anticorpo policlonal.

20. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a -18, no qual o anticorpo é um anticorpo monoclonal.

21. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a -20, no qual o(s) sistema(s) de ensaio é(são) um ensaio imunossorvente colo- rimétrico ligado a enzima (ELISA), um imunoensaio radiomarcado ou um imunoensaio marcado com fluorescência.

22. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 -30 ou 4 a 21, no qual a linhagem de células monocíticas compreende uma li- nhagem de células monocíticas humanas.

23. Método, de acordo com a reivindicação 22, no qual a linha- gem de células monocíticas é MONOMAC-6, THP-1 ou 28SC.

24. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e -4 a 21, no qual a linhagem de células monocíticas compreende uma linha- gem de células que apresenta receptores endógenos para CD14 e recepto- res semelhantes a Toll ou que foram transfectados com receptores CD14 e/ou receptores semelhantes a Toll e/ou genes-repórter para mediadores inflamatórios ou pirogênicos.

25. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e -4 a 24, no qual a amostra é um produto médico parenteralmente administra- do.

26. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2, -3 e 25, no qual o produto médico parenteralmente administrado é seleciona- do do grupo que consiste em um produto hemoderivado, solução para diáli- se, vacina e expansor de plasma.

27. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e -4 a 26, no qual o reagente que contém monócitos está presente no sistema de ensaio em uma densidade celular de pelo menos cerca de 250.000, -500.000, 600.000, 700.000, 800.000, 900.000, 1.000.000, 1.100.000, -1.200.000, 1.300.000, 1.400.000, 1.500.000, 1.600.000, 1.700.000, -1.800.000, 1.900.000 ou 2.000.000 células por cavidade.

28. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e -4 a 27, no qual as células mononucleares de sangue periférico compreen- dem células mononucleares de sangue periférico humano.

29. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2, -3, 6 a 12, 19 a 21 e 26, no qual o reagente que contém monócitos compre- ende adicionalmente um diluente.

30. Método, de acordo com a reivindicação 29, no qual o diluen- te é meio RPMI.

31. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2, -3, 6 a 12, 19 a 21, 26, 29 e 30, no qual o reagente que contém monócitos compreende adicionalmente um anticoagulante.

32. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2, - 3, 6 a 12, 19 a 21, 26 e 29 a 31, no qual o sangue total compreende sangue total humano.

33. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2, - 3, 6 a 12, 19 a 21, 26 e 29 a 31, no qual o reagente que contém monócitos está presente no sistema de ensaio em uma densidade celular maior que cerca de 100.000, 200.000, 210.000, 220.000, 230.000, 240.000, 250.000, - 260.000, 270.000, 280.000, 290.000, 300.000, 310.000, 320.000, 330.000, - 340.000, 350.000, 360.000, 370.000, 380.000, 390.000 ou 400.000 células mononucleares de sangue periférico por cavidade.

34. Kit de diagnóstico que compreende: uma placa de microtitulação que compreende uma pluralidade de cavidades de microtitulação com uma forma tal que células contidas em cada cavidade sejam concentradas em comparação com uma cavidade de microtitulação de fundo chato, a superfície da cavidade compreendendo po- lipropileno; e um reagente que contém monócitos crioconservados que está contido nas cavidades da placa, em que o reagente que contém monócitos compreende células mononucleares de sangue periférico crioconservadas ou células de linhagem de células monocíticas crioconservadas está em con- tato com a superfície das cavidades e está presente nas cavidades sob alta densidade celular.

35. Kit de diagnóstico que compreende: uma sistema de ensaio para detecção de pirogênios não- endotóxicos em um produto médico parenteralmente administrado, esse sis- tema de ensaio compreendendo uma placa de microtitulação que compre- ende uma pluralidade de cavidades de microtitulação com uma forma taíque células contidas em cada cavidade sejam concentradas em comparação com uma cavidade de microtitulação de fundo chato, a superfície da cavida- de compreendendo polipropileno; e um reagente que contém monócitos crioconservados que está contido nas cavidades da placa de microtitulação, em que o reagente que contém monócitos compreende sangue total crioconservado e está em con- tato com a superfície das cavidades; e um anticorpo a IL-6.

36. Kit, de acordo com a reivindicação 34 ou 35, no qual a cavi- dade compreende adicionalmente uma barreira que é impermeável a monócitos.

37. Kit, de acordo com a reivindicação 36, no qual a barreira compreende uma membrana, uma grade, uma peneira ou um crivo.