CN101346630B - 能够更好地在医疗制品中检测非内毒素致热污染物的改进的单核细胞活化测试 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了能够在医疗制品中更好地检测非内毒素热原的改进的单核细胞活化测试，其中样品与含有单核细胞的试剂一起孵育在包含至少一个含有聚丙烯的表面的分析测试系统中。本发明还涉及了在这些测试中使用的分析系统，其包括至少一个微量滴定孔，所述孔具有至少一个含有聚丙烯的内表面，其形状使得含有单核细胞的试剂在孔中集中，以提供更多的细胞与细胞接触。本发明还涉及可以用于检测样品中非内毒素热原存在的诊断试剂盒。

Description

能够更好地在医疗制品中检测非内毒素致热污染物的改进的单核细胞活化测试
发明领域
总的来说，本发明涉及能够在医疗制品中更好地检测非内毒素热原的改进的单核细胞活化测试，其中样品与含有单核细胞的反应试剂孵育在含有至少一个含聚丙烯的表面的分析系统中。本发明还涉及在这些测试中使用的分析系统，其包括至少一个微量滴定孔，所述孔具有至少一个含有聚丙烯的内表面并且具有的形状使得含有单核细胞的试剂在孔中集中，以提供更多的细胞进行细胞接触。本发明还涉及可以用于检测样品中非内毒素热原的存在的诊断试剂盒。
发明背景
当某些化学或生物学化合物与人类或其它哺乳动物的循环系统相接触时，它们引起被称为炎性反应或炎症的全身性反应。炎性反应是保护身体免于感染和/或伤害的防御性机制；炎症增加了流向感染或受伤部位的血液，带去帮助愈合过程的必需的流体、蛋白和白血细胞(白细胞)。例如，与炎性反应有关的一种症状是体温升高或发烧，它作为针对引起过热的病原的防御机制起作用。炎性反应可以与多种“流感样”症状有关，包括发烧、寒战、疲乏、头痛、失去食欲和肌肉僵硬。引发发烧的化学或生物学化合物在历史上被称为“热原”或“致热”化合物，用于指这些化合物可以引起的发烧反应。但是，某些化学的或生物学的化合物一般来说是促炎性的，并会或不会引起发烧作为它们引起的炎性反应的一部分。
在某些情况下，根据个体的敏感性以及个体所暴露的热原的类型和浓度，个体可能在暴露于热原后发生威胁生命的类似休克的症状。可以被吸入、注射或输注的医疗制品，以及医疗装置例如膜或植入材料造成了热原性的特别风险。即使是营养品也可能表现出热原性风险。在医疗制品和营养品中包含的热原被称为外源性热原；反之，内源性热原是免疫系统的信使化合物，介导个体对外源性热原的炎性反应。除了制品本身或它的生产中的副产物的致热性质之外，制品的污染通常也能引起热原性。由制品的污染引起的热原性可以由来自细菌、病毒、真菌、或甚至来自宿主的多种不同类型的热原中的任何一种所引起。即使制品通过加热或化学方法“灭菌”，这个问题仍然存在；通常遇到的致热化合物细菌内毒素(主要由来自革兰氏阴性细菌细胞壁的脂多糖(LPS)构成)，在细菌被杀死后可以存留。因此，对用于肠胃外使用的各种药物、营养品和医疗制品进行热原测试是必要的，以确保这些制品的安全性。
通常情况下，作为热原的化合物起到热原的作用是通过在与组织、细胞或体液接触后，刺激单核细胞中的内源性热原、例如前列腺素和促炎性细胞因子的产生。正是这些内源性产生的热原在受影响的生物体中介导了炎性反应。这些内源热原中最重要和广为人知的是细胞因子白介素-1(IL-1)、白介素-6(IL-6)、白介素-8(IL-8)和肿瘤坏死因子(TNF)以及低分子量的脂类介质前列腺素E2(PGE2)。这些化合物通常通过ELISA或称酶联免疫吸附分析(用于IL-1、IL-6或TNF)和EIA或称酶法免疫分析(用于PGE2)进行分析。
为了避免任何肠胃外给药的药物或药物制品的致热反应并确保它们的安全性，必须对致热污染进行监控，以鉴定被细菌污染物污染的每个批次。目前常规用于监测批量生产的药物制品中的热原污染有两种基于动物的药典(Pharmacopial)方法，鲎阿米巴细胞裂解物测试(Limulus amebocyte lysate(LAL)test)、也被称为细菌内毒素测试(BET)，以及兔热原测试。
兔测试是一种体内测试，由给统计学显著性数量的兔注射样品化合物并观察在试验动物中引起的平均体温升高而构成。尽管兔测试对广谱的致热剂包括非内毒素热原具有反应性，但兔测试的灵敏度(ng内毒素/ml)与其它热原检验(LAL检验为pg内毒素/ml)相比相对较低。此外，物种之间致热反应与化合物的相关性最多只是近似的。例如，已经记录到在物种之间引发致热反应的细菌内毒素的剂量变化多达10,000倍。相对的不灵敏性、定量结果差、兔种类之间的易变性以及动物试验所涉及的伦理问题，使得兔测试近年来遭到冷遇。
与检测广范围热原的兔测试相反，LAL测试仅检测内毒素热原。细菌内毒素，例如来自革兰氏阴性细菌细胞壁的脂多糖(LPS)，是描述得最多的致热化合物之一(Moltz等，Neurosci.Biobehav.Rev.，1993，17，237-269；Tilders等，Psychoneuroendocrinology.1994，19，209-232；Rothwell，Crit.Rev.Neurobiol 1994，8，1-10；Zeisberger 和Roth，Neuropsychobioloqy，1993，28，106-109)。因此认为，对细菌内毒素用直接LAL测试代替昂贵和耗时的兔实验通常是有用的。这种方法具有明显的限制。LAL测试是非常灵敏的体外测试；但是，它只能检测来自革兰氏阴性细菌的内毒素，并且对于某些仍然能够刺激单核细胞产生致热细胞因子的制品给出了假阴性的结果。LAL测试还容易受到例如测试物质的高蛋白水平或受到葡聚糖的干扰(Roslansky和Novitsky，J.Clin.Microbiol.，1991，29，2477；Fennrich等，Dev.Biol.Stand.1999101，131)。另一方面，鲎测试太灵敏了，容易产生由于与产品质量无关的杂质而引起的假阳性结果(Fujiwara等，Yakugaku Zasshi，1990，110，332-340)。
因此，存在着对具有高灵敏度、高特异性、并能够检测广范围的热原的特点的不基于动物的测试系统的需求。出于这种目的以及为了增进对人类炎性反应的了解，发展了基于人类单核细胞的体外活化的测试系统。大约20年前，研究人员使用外周血单核细胞(PBMC)通过监测致热细胞因子的释放来检测内毒素(Dinarello等，J.Clin. Microbiol.，1984，20，323；Duff和Atkins，J.Immunol.Methods，1982，52323)。从那以后，已经发展了几种不同的测试系统，使用不同来源的人类单核细胞，包括人类外周全血(WB)、PBMC、或单核细胞细胞系例如MONOMAC-6(MM6)(Ziegler-Heitbrock等，Int.J.Cancer，1988，41，456)或THP-1(Tsuchiya等，Int.J.Cancer，1980，26，171)，并使用不同的读出结果，包括致热细胞因子肿瘤坏死因子-α、TNF-α、IL-6、IL-1β以及非致热的代谢物新喋呤(Hartung等，The Report andRecommendations of ECVAM Workshop 43，2001，29，99；Poole和Gaines Das.Eur J Parenteral Sciences，2001，6，63；Poole等，J.Immunol. Methods，2003，274，209；Gaines Das等，J Immunol Methods，2004，288，165)。最近，在一项合作的欧洲研究Human(e)研究中，六种最突出的单核细胞活化测试，每种都使用了上述细胞来源和读出结果的不同组合，评估了它们在掺有不同浓度的纯内毒素的医疗制品中检测内毒素的能力。
在这六种测试的五种中，细胞被培养在具有平底孔的96孔聚苯乙烯板中(Hoffmann等，J.Immunol.Methods，2005，298，161)。在第六种测试中(基于Fennrich等，Dev.Biol.Stand.，1999；Fennrich等，ALTEX，1999；Hartung等，2001)，在大部分评估中使用具有锥形底的聚苯乙烯制成的Eppendorf离心管(1.2ml)，在一部分研究中使用了具有圆形底的聚丙烯管(1.5ml)来代替在研究中使用的
Figure S2006800488729D00041
体外热原测试(IPT)试剂盒的制造商Charles River Laboratories的聚乙烯管。这种替代没有被报道对测试具有任何显著的影响，在那以后当Charles River Laboratories为了减小体积修改了
Figure S2006800488729D00042
IPT后，聚丙烯管被平底的聚苯乙烯96孔板所代替。在该测试中单核细胞的来源是全血，读出结果是IL-1β。全血与掺有不同浓度内毒素的各种药物一起孵育。
Carlin和Viitanen公开了基于全血或MONOMAC-6细胞作为单核细胞来源、IL-6作为读出结果的单核细胞活化测试，用于评估疫苗Infanrix的内在热原性，该疫苗含有革兰氏阳性和革兰氏阴性抗原，包括各种非内毒素热原、即白喉类毒素、百日咳类毒素和破伤风类毒素(Pharmeuropa，2003，15，3，418-423)。细胞以低细胞密度培养在无内毒素的组成未公开的Eppendorf生物纯级管中。疫苗的热原性不是疫苗在生产或储存过程中的污染的结果。Hartung和Wendel公开了基于全血作为单核细胞来源、IL-1β作为优选的读出结果的单核细胞活化测试，用于检测纯态的内毒素和非内毒素热原，即来自马流产沙门菌(Salmonella abortus equi)的LPS、来自链球菌致热原(Streptococcuspyrogens)的链球菌溶血素O(SLO)、以及胞壁酰二肽(MDP)(Hartung和Wendel，In Vitro Toxicology.1996，9，4，353-359；美国专利No.5,891,728)。细胞被培养在聚丙烯管中。
Yamamoto等公开了基于全血或来自不同人类细胞系、优选28SC细胞系的细胞作为单核细胞的来源、IL-6作为优选的读出结果的单核细胞活化测试，用于检测内毒素热原(Jpn.J.Infect.Dis.，2003，56，93-100)。内毒素测试据说预测了内毒素和肠胃外药物、特别是干扰素之间的体内协同的可能性，使得药物增加了内毒素的致热效应。细胞与纯态内毒素或纯态内毒素与人类干扰素的混合物一起培养。细胞系的细胞被培养在具有平底孔的聚苯乙烯96孔板中。血细胞被培养没有特定材料的管中。
Nakagawa等描述了基于全血或MM6-CA8细胞(MONOMAC-6的亚克隆)作为单核细胞来源、IL-6作为优选的读出结果的单核细胞活化测试，用于检测纯态的内毒素和非内毒素热原，即来自大肠杆菌(E.coli)O55：B5的LPS和来自金黄色葡萄球菌(S.aureus)的不溶性肽聚糖(PG)(Clinical and Diagnostic Laboratory Immunol.，2002，9，3，588-597)。MM6-CA8细胞培养在聚苯乙烯96孔板中。血细胞培养在聚丙烯管中；所用的体积(225μL血液，25μL测试溶液，750μL盐水)排除了标准96孔板(250μL/孔)的使用。
最近，多种不同的来源表明在热原测试中应该避免聚丙烯。例如，Charles River Laboratories推荐避免聚丙烯，因为聚丙烯表面的疏水本性可导致内毒素由于与LPS的脂A成分有关的疏水性结构域而吸附在这样的表面上(Charles River Laboratories，Endosafe Times，Sept.2004)。生物安全测试的制造商Harlan Sera-Lab指出，聚丙烯管可以干扰LAL分析(Harlan Sera-Lab，2004年目录)。并且，欧洲透析和移植护士协会(the European Dialysis and Transplant Nurses Association)以及欧洲肾脏护理协会(the European Renal Care Association)推荐在内毒素测试中避免聚丙烯而使用聚苯乙烯，因为聚苯乙烯一般不吸附内毒素(EDTNA/ERCA准则)。
因此，对具有高灵敏度、高特异性、并能够在医疗制品中检测广范围的致热性污染物的特点的不基于动物的热原测试，存在着需求。
发明简述
本申请人开发了灵敏的体外热原测试，检测医疗制品中存在的致热性污染物。总的来说，本发明涉及在样品中检测非内毒素热原的方法，通过将单核细胞，即以含有单核细胞的试剂形式，与待测样品在含有至少一个含有聚丙烯的表面的第一个分析系统中混合，使得单核细胞与表面相接触。将单核细胞与样品孵育，以便单核细胞在孵育过程中产生细胞因子或炎性反应的内源介质。将第一个分析系统的内含物转移到第二个分析系统中，该系统含有至少一个用针对细胞因子或炎性反应的内源介质或标记物的抗体处理过的表面。第二个分析系统分析与表面上的抗体结合的细胞因子或内源介质的存在。当本方法中使用的单核细胞是PBMC或单核细胞系细胞时，单核细胞以高细胞密度存在于分析系统中。
总的来说，本发明还涉及了在肠胃外施用的医疗制品中检测非内毒素热原的方法，通过将全血作为含有单核细胞的试剂与待测医疗制品在含有至少一个含聚丙烯的表面的第一个分析系统中混合，使得血液与表面相接触。将血液与医疗制品孵育，使得血液在孵育过程中产生细胞因子IL-6。将第一个分析系统的内含物转移到第二个分析系统中，该系统含有至少一个用针对IL-6的抗体处理过的表面。第二个分析系统分析与表面上的抗体结合的IL-6的存在。
本发明进一步涉及即以含有单核细胞的试剂形式培养单核细胞的方法，用于非内毒素热原测试，在该测试中通过将单核细胞与待测样品在含有至少一个含有聚丙烯的表面的分析系统中混合，来使单核细胞与表面相接触。
本发明还涉及培养单核细胞作为非内毒素热原测试的一部分的方法，在该测试中将单核细胞与样品在含有至少一个微量滴定孔的分析系统中混合，该孔的形状使得与平底微量滴定孔相比，含有单核细胞的试剂被集中，孔的表面含有聚丙烯，使得单核细胞与表面相接触。当在这些培养方法中使用的单核细胞是外周血单核细胞(PBMC)或单核细胞系细胞时，单核细胞以高细胞密度存在于分析系统中。
本发明还涉及了在肠胃外施用的医疗制品中检测非内毒素热原的方法，通过将作为含有单核细胞试剂的全血与待测医疗制品在分析系统中混合，该系统含有至少一个含聚丙烯的表面和至少一个用针对IL-6的抗体处理过的表面，使得血液与含有聚丙烯的表面相接触，并分析该分析系统中与表面上的抗体结合的IL-6的存在。
本发明还提供了含有微量滴定板的诊断试剂盒，该板含有多个微量滴定孔，孔的形状使得与平底的微量滴定孔相比，每个孔中含有的培养基被集中，每个孔的表面含有聚丙烯，在微量滴定板的孔中含有低温保存的单核细胞，即以含有低温保存的单核细胞的试剂的形式，使得单核细胞与孔的表面相接触。当试剂盒中的单核细胞是外周血单核细胞(PBMC)或单核细胞系细胞时，单核细胞以高细胞密度存在于孔中。
本发明还提供了一种诊断试剂盒，含有用于在肠胃外施用的医疗制品中检测非内毒素热原的分析系统，该分析系统含有微量滴定板，该板含有多个微量滴定孔，孔的形状使得与平底的微量滴定孔相比，每个孔中含有的培养基集中；含有聚丙烯的每个孔的表面；在微量滴定板的孔中含有的低温保存的全血，作为含低温保存的单核细胞的试剂，以便血液与孔的表面相接触；和针对IL-6的抗体。
本发明的其它目标和特点在后文中将部分变得明显并部分被指出。
附图简述
图1是描述在在具有圆底孔的聚丙烯板上使用外周血单核细胞进行的单核细胞活化测试中，IL-6对具有4种不同的细胞密度(1百万、50万、25万和13万个PBMC/250μl孔)的测试样品的反应的图，IL-6作为读出结果。IL-6反应是针对内毒素标准品(1个内毒素单位/ml)和
Figure S2006800488729D00081
阳性对照(即被非内毒素热原污染的该制品的批次)。
图2是说明在具有平底孔的聚苯乙烯板上使用全血进行的单核细胞活化测试中IL-6对具有低细胞密度的测试样品的反应的图。IL-6反应是针对LPS、
Figure S2006800488729D00082
阴性对照(即该制品的干净的批次)、
Figure S2006800488729D00083
阳性对照、血红蛋白(Hb)阴性对照(即该制品的干净的批次)和血红蛋白(Hb)阳性对照(即被非内毒素热原污染的该制品的批次)。
图3是说明了在具有平底孔的聚苯乙烯板上使用外周血单核细胞进行的单核细胞活化测试中，IL-6对具有低细胞密度的测试样品的反应的图。IL-6反应是针对LPS、
Figure S2006800488729D00084
阳性和阴性对照以及Hb阳性和阴性对照。
图4是说明了在具有平底孔的聚苯乙烯板上使用MONOMAC6细胞进行的单核细胞活化测试中，IL-6对具有低细胞密度的测试样品的反应的图。IL-6反应是针对LPS、
Figure S2006800488729D00085
阳性和阴性对照以及Hb阳性和阴性对照。
图5是说明了在具有平底孔的聚苯乙烯板上使用THP-1细胞进行的单核细胞活化测试中，IL-6对具有低细胞密度的测试样品的反应的图。IL-6反应是针对LPS、
Figure S2006800488729D00091
阳性和阴性对照以及Hb阳性和阴性对照。
图6是说明了在具有平底孔的聚苯乙烯板上使用THP-12A9细胞进行的单核细胞活化测试中，TNF-α对具有低细胞密度的测试样品的反应的图。TNF-α反应是针对LPS、
Figure S2006800488729D00092
阳性和阴性对照以及Hb阳性和阴性对照。
图7是说明了在具有平底孔的聚苯乙烯板上使用MONOMAC6-CA8克隆细胞进行的单核细胞活化测试中，IL-6对具有低细胞密度的测试样品的反应的图。IL-6反应是针对LPS以及
Figure S2006800488729D00093
阳性和阴性对照。
图8是说明了在具有平底孔的聚苯乙烯板上使用28SC细胞进行的单核细胞活化测试中，IL-6对具有低细胞密度的测试样品的反应的图。IL-6反应是针对LPS以及葡聚糖阳性和阴性对照。
图9是描绘了在具有圆底孔的聚丙烯板上使用外周血单核细胞进行的单核细胞活化测试中，IL-6对具有高细胞密度的测试样品的反应的图。IL-6反应是针对LPS、
Figure S2006800488729D00094
阳性和阴性对照以及葡聚糖阳性和阴性对照。
图10是描绘了在具有圆底孔的聚丙烯板上使用全血进行的单核细胞活化测试中，IL-6对具有低细胞密度的测试样品的反应的图。IL-6反应是针对LPS以及
Figure S2006800488729D00095
阳性和阴性对照。
图11A是描绘了在使用外周血单核细胞(每孔1百万个细胞)进行的单核细胞活化测试中，IL-6对聚丙烯板(黑色柱)和聚苯乙烯板(灰色柱)的反应的图。IL-6反应是针对LPS、
Figure S2006800488729D00096
阳性和阴性对照以及Hb阳性和阴性对照。
图11B是描绘了在使用外周血单核细胞(每孔1百万个细胞)进行的单核细胞活化测试中，IL-1β对聚丙烯板(黑色柱)和聚苯乙烯板(灰色柱)的反应的图。IL-1β反应是针对LPS、
Figure S2006800488729D00097
阳性和阴性对照以及Hb阳性和阴性对照。
图12A是说明了在具有圆底孔的聚丙烯板上使用外周血单核细胞进行的单核细胞活化测试中，IL-6对具有高细胞密度的测试样品的反应的图。IL-6反应是针对LPS以及
Figure S2006800488729D00101
阳性和阴性对照。
图12B是说明了在具有平底孔的聚苯乙烯板上使用外周血单核细胞进行的单核细胞活化测试中，IL-6对具有低细胞密度的测试样品的反应的图。IL-6反应是针对LPS以及
Figure S2006800488729D00102
阳性和阴性对照。
图13A是说明了在具有圆底孔的聚丙烯板上使用外周血单核细胞进行的单核细胞活化测试中，IL-6对具有高细胞密度的测试样品的反应的图。IL-6反应是针对LPS以及
Figure S2006800488729D00103
阳性和阴性对照。
图13B是说明了在具有平底孔的聚苯乙烯板上使用外周血单核细胞进行的单核细胞活化测试中，IL-6对具有高细胞密度的测试样品的反应的图。IL-6反应是针对LPS以及
Figure S2006800488729D00104
阳性和阴性对照。
图14A是说明了在具有圆底孔的聚丙烯板上使用外周血单核细胞进行的单核细胞活化测试中，IL-6对具有高细胞密度的测试样品的反应的图。IL-6反应是针对LPS以及
Figure S2006800488729D00105
阳性和阴性对照。
图14B是说明了在具有平底孔的聚苯乙烯板上使用外周血单核细胞进行的单核细胞活化测试中，IL-6对具有高细胞密度的测试样品的反应的图。IL-6反应是针对LPS以及
Figure S2006800488729D00106
阳性和阴性对照。
图15是说明了在具有平底孔的聚苯乙烯板上使用全血进行的商业化的IPT测试中，IL-1β对具有高细胞密度的测试样品的反应的图。IL-1β反应是针对LPS、
Figure S2006800488729D00107
阳性和阴性对照、血红蛋白阳性和阴性对照、盐水对照以及革兰氏阳性对照。
发明详述
热原刺激血液单核细胞(以及其它的白细胞)和巨噬细胞产生和释放大量的炎性反应的内源致热性介质，包括细胞因子(例如TNF-α、IL-1β和IL-6)。这些致热性介质被释放到循环中，引发了级联事件，导致在受到影响的个体中发生炎性反应。本发明的单核细胞活化测试依赖于测量这些内源性热原作为炎性反应标记物。按照本发明的优选实施方案，将样品与含有单核细胞的试剂在含有包含聚丙烯的表面的第一个分析系统中孵育，在分析系统中含有单核细胞的试剂以高细胞密度存在。然后将第一个分析系统的内含物转移到第二个分析系统中，该系统含有用抗细胞因子抗体包被的表面，第二个分析系统分析被抗体结合到表面上的细胞因子的存在。
本发明的热原测试被用于检测非内毒素热原，即革兰氏阳性细菌(例如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus))或它们的组分(例如胞壁肽、脂胞壁酸、肠毒素、链球菌溶血素)、免疫刺激剂例如植物血凝素或佛波醇酯(phorbolesteras)，以及内毒素。因为测试利用了单核细胞对各种不同热原的细胞因子反应而不是特异性针对革兰氏阴性细菌内毒素的反应，因此使用本发明的测试可以检测广谱的致热剂。
本发明的热原测试已经显示出与常规测试相比，更有效地检测医疗制品的污染批次中的非内毒素热原。本文的例子显示出这些常规的测试不能将
Figure S2006800488729D00111
腹膜透析溶液、血红蛋白或葡聚糖的阳性对照样品与同样的肠胃外物质的阴性对照样品区分开来。
Figure S2006800488729D00112
阳性对照样品从被非内毒素热原污染的产品批次中获得；被污染的批次在人类中引起了不良反应，但是按照只检测内毒素热原的LAL测试却被检测为热原存在为阴性(Martis等，Lancet，365(9459)，588)。血红蛋白阳性对照也是从被非内毒素热原污染的产品批次中获得；被污染的批次在兔中引起了发热反应，但是按照LAL测试被检测为热原存在为阴性。葡聚糖阳性对照是已经被发现在人类中引起发烧的葡聚糖制品，但是按照LAL测试被检测为热原存在为阴性。测试方法检测医疗制品中非内毒素污染物的能力是非常有价值的，因为它能够在医疗产品批次被发放用于患者之前鉴定被污染的产品批次。已知的测试在检测纯的非内毒素和内毒素热原、即在上面讨论过的Nakagawa等公开的来自金黄色葡萄球菌的肽聚糖(PG)和来自大肠杆菌的LPS，或者在检测混有内毒素的产品、即在上面讨论过的Human(e)研究的6种测试中掺有不同不同浓度内毒素的各种药物的情况下，都很好地发挥作用。假如医疗制品被内毒素污染，LAL测试能够有效地起作用(Mascoli，CC，Weary，M.E.，J Parenter Drug Assoc.2003，33，81；Mascoli，CC，Weary，M.E.，Prog Clin Biol Res.2003，29，387)。但是，当医疗制品被非内毒素热原污染时，这些测试不能检测到热原。不受特定理论的束缚，据信非内毒素热原与医疗制品相互作用，导致了对热原的“屏蔽”，并且不能检测非内毒素污染物。
本发明的热原测试克服了这种屏蔽效应，能够检测医疗制品中的非内毒素污染物：例如，在优选实施方案中，PBMC以高细胞密度被培养在圆底的聚丙烯孔中，本发明的热原测试能够区分
Figure S2006800488729D00121
溶液和葡聚糖的阳性和阴性对照样品(参见图9)。进行测试的现有试剂盒都不能区分
Figure S2006800488729D00122
或血红蛋白的阳性和阴性对照(参见图1-8)。再一次不受特定理论的束缚，据信高细胞密度提供了更多的细胞进行更强的细胞与细胞的接触。细胞与细胞的接触增加促进了细胞之间更多的通讯，从而导致了针对致热污染物的炎性反应增强。细胞彼此之间通过可溶性介质例如细胞因子和通过细胞与细胞的接触来进行通讯，其中细胞因子也可以参与。圆底的孔、或总的来说其形状使得细胞集中的孔，与平底的孔相比，提供了更多的细胞与细胞的接触。并且，据信聚丙烯增加了非内毒素热原的生物利用度。再一次不受特定理论的束缚，据信聚苯乙烯板按常规用于细胞培养进行表面处理使得它们的表面具有较低的疏水性，能够更好地结合细胞，但是也使它们的表面结合和中和非内毒素热原。聚丙烯板没有进行表面处理，因此它比聚苯乙烯板保留了更多的疏水性，并且中和非内毒素热原的可能性降低了。
1、热原测试的成分
其特征为上面描述的三个要素：高细胞密度、圆底(或者不同的适当形状)和聚丙烯的某种组合的热原测试，即PBMC以高细胞密度存在于圆底聚丙烯孔中，这使得改进了对医疗制品中非内毒素污染的检测。本发明的热原测试可以被用于测试各种不同医疗制品中非内毒素污染的存在，包括血液制品、用于肠胃外施用的医疗制品、透析液、疫苗、静脉内溶液以及与身体或体液接触的任何液体。
A、细胞因子或炎性反应的内源性介质
由含有单核细胞的试剂分泌的任何可以被检测的炎性反应内源性介质都可以用作本发明的热原测试的基础。但是，优选使用细胞因子或内皮素标记物，因为它们易于被本发明的方法所检测。已经发现全血中的单核细胞与内毒素或非内毒素热原孵育产生了几类细胞因子，包括但不限于促炎性细胞因子(TNF-α、IL-1、IL-6)、抗炎细胞因子(IL-4、IL-10、IL-13、IL-1ra、TGF)、Th1(IL-2、IFN、IL-12)、Th2(IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13)、IL-1β、IL-1ra、IL-8和PGE2。用于本发明的优选的细胞因子标记物包括TNF-α、IL-1β、IL-1ra、IL-6、IL-8和PGE2。IL-6是本发明的分析中特别优选的细胞因子标记物。IL-6在相对短的孵育时间内产生可检测的量。免疫反应性IL-6，与免疫反应性IL-1β和TNF-α不同，以大量完全分泌到细胞调节的培养基/血液中，允许了它的完全评估。相反，免疫反应性TNF-α和IL-1β主要保留在细胞内，增加了这样的可能性，即影响细胞通透性的测试制剂可能更容易干扰以(免疫反应性的)TNF-α或IL-1β作为读出结果而不是IL-6的测试(参见图2和3)。然而，TNF-α或IL-1β也可以在本发明中用作细胞因子标记物。在单核细胞热原反应中，TNF-α比IL-6更早产生。因此，分析TNF-α的本发明实施方案使用的孵育时间(大约1到2小时)比分析IL-6的实施方案更短。不同的致热污染物在细胞培养中可以引发不同的细胞因子反应。因此，本发明可以被定制成当药物制品可能被引起特定细胞因子分泌的特定热源污染时，检测这些细胞因子的形成。
B、针对细胞因子或内源性介质的抗体
一旦确定了要分析的细胞因子，必须制造针对该细胞因子的抗体用于本发明。在严紧条件下纯化的多克隆抗体，如在此以其全文引为参考的美国专利No.6,696,261的实施例1中描述的那些，在热原测试中可以很好地工作。因为分离多克隆抗体的动物的血液是天然无热原的(如果从健康动物取得)，人们必须在纯化过程中仅仅防止原材料被热原污染，以获得无热原产品。无热原的缓冲液和固定相被用于亲和层析柱中，按照美国专利No.6,696,261的实施例1中描述获得无热原的多克隆抗体。或者，可以使用来自杂交瘤培养物的单克隆抗体。但是当使用单克隆抗体时，必须小心地将抗体与任何可能存在于杂交瘤细胞培养物中的污染热原分离开。
为了用于本发明，针对细胞因子的抗体被施加到分析系统的表面上。方法，例如用于将抗体结合在分析系统表面例如微量滴定孔上的包被，在生物化学技术领域中是众所周知的。许多分析系统是可商购的，并且制造商通常提供了用于将抗体包被到系统表面上的材料和说明。因为易于读数以及需要的样品体积少，在本发明的优选实施方案中使用了微量滴定板，其中孔的内表面的一部分被抗体包被。为了完全利用本发明的优点，优选微量滴定孔是微量滴定板的一部分，微量滴定板是类似的孔的平面阵列，其位置使得孔的阵列可以用自动免疫分析读板仪器读数(参见，例如美国专利No.5,281,540，在此引为参考)。自动化的仪器例如ELISA读板器(例如Ultramark Microplate Reader，可以从Bio-Rad Laboratories，Inc.获得)，使分析评估过程自动化，并极大地减少了每次测试的花费。如果需要，微量滴定孔的板可以通过用无热原缓冲液深度清洗使其无热原(如果在被提供时不是无热原的话)。在本发明的特别优选的实施方案中，抗IL-6多克隆抗体包被在ELISA板的孔上。但是，也可以接受其它免疫诊断测试形式(例如，其中抗体被包被在测量杆或珠子上)用于本发明。
除了“捕获”抗体之外，在制作用于本发明的微量滴定板系统时还可以使用其它用于分析细胞因子的抗体和试剂。例如，在对微量滴定板施加捕获抗体之后，板的剩余的结合位点可以用另一种蛋白“封闭”。封闭之后，可以对微量滴定板施加标记的检测抗体(例如生物素化的或酶标记的抗体)，连同保护性的上光化合物。因此，如下所述当样品在微量滴定孔中孵育时，在样品孵育期间，释放的细胞因子被结合在孔上的捕获抗体所捕获，并同时被检测抗体所标记。
C、含有单核细胞的试剂
作为本发明热原测试的第一步，通过将含有单核细胞的试剂与待测样品在分析系统中混合，来培养含有单核细胞的试剂中包含的细胞。本发明的含有单核细胞的试剂选自：PBMCs、单核细胞系细胞、全血、或表达或能够被导致表达Toll样受体(TLRs)的任何细胞系，包括其中这些受体已经被诱导或克隆了的细胞，所述Toll样受体参与介导针对促炎性和致热剂的反应。优选，单核细胞系选自MONOMAC-6(MM6)、THP-1和28SC。含有单核细胞的试剂中的单核细胞优选来自将要施用待测产品的相同物种(即对于药物制品来说为人类，对于兽医制品来说为猫、狗、马等)的单核细胞。但是，来自其它物种的具有所需的热原反应性的单核细胞也可以使用。在某些优选实施方案中，含有单核细胞的反应试剂含有PBMC。
在本发明的一个实施方案中，含有单核细胞的试剂是全血，分析系统包括了至少一个含有聚丙烯的表面，使得含有单核细胞的反应试剂与表面相接触。
在另一个实施方案中，含有单核细胞的试剂是存在高细胞密度的PBMC，分析系统包括了至少一个含有聚丙烯、聚乙烯、聚苯乙烯或另一种类似的材料的表面，该表面与PBMC相接触。
当含有单核细胞的试剂是PBMC或细胞系细胞时，试剂以高细胞密度存在于分析系统中，以促进更多的细胞与细胞接触，正如上面详细解释的那样。在某些实施方案中，含有单核细胞的试剂以每个孔至少大约125,000个细胞、至少大约250,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000、1,000,000、1,100,000、1,200,000、1,300,000、1,400,000、1,500,000、1,600,000、1,700,000、1,800,000、1,900,000或2,000,000个细胞的每孔细胞密度存在于分析系统中。本领域的普通技术人员将会认识到当在孔中的试剂体积中存在的细胞营养物不足以适当维持孔中的细胞时，最大细胞密度是过量的。
当含有单核细胞的试剂是全血时，反应试剂以比PBMC或细胞系细胞低的细胞密度存在于分析系统中。在含有单核细胞的试剂是血液的某些实施方案中，试剂以每个孔至少大约100,000个外周血单核细胞、至少每孔大约200,000、210,000、220,000、230,000、240,000、250,000、260,000、270,000、280,000、290,000、300,000、310,000、320,000、330,000、340,000、350,000、360,000、370,000、380,000、390,000或400,000个PBMC的细胞密度存在于分析系统中。不被具体的理论所束缚，据信全血可以使用比PBMC或细胞系细胞低的细胞密度，因为单核细胞是在它们的天然环境中，所有可以影响它们对热原的反应的血清成分都存在于溶液中。此外，当含有单核细胞的试剂包含全血时，用于热原测试的读出结果是IL-6。
优选当血液被用作含有单核细胞的试剂时，血液是新鲜的或不超过24小时，更优选不超过4小时。此外，当使用全血时，可以包含抗凝剂以推迟或阻止凝血；适合的抗凝剂包括柠檬酸盐(例如终浓度为0.38％)、肝素(肝素钠)或法安明(fragmin)(低分子量肝素)。抗凝添加剂可以被使用而不影响单核细胞对测试样品中的热原的反应。全血也可以用适当的缓冲液或其它稀释剂例如RPMI细胞培养基或生理盐水进行稀释。全血优选被稀释到孵育的最终体积的至少50％、更优选到大约5％到大约25％、并更优选大约20％(参见美国专利No.6,696,261的图1)。通过稀释全血，大部分的供体的IL-6反应曲线可以被带到紧凑的范围内，这可以用来定量范围较宽的热原污染浓度(参见美国专利No.6,696,261的图3)。
2、双分析系统
在本发明的某些实施方案中，热原性测试是在两个分析容器系统中进行，使得样品与含有单核细胞的试剂的孵育步骤和含有单核细胞的试剂产生的细胞因子的捕获步骤发生在两个不同的分析容器系统中。孵育步骤在上面描述的培养步骤之后；测试样品与含有单核细胞的试剂(例如PBMC)的孵育在与培养步骤相同的分析系统中进行。用于本发明的热原测试的最适孵育时间根据分析条件、即被分析的细胞因子而变化。例如，当将全血与内毒素一起孵育、读出结果是IL-6时，在孵育6小时后含有单核细胞的试剂产生最少的额外细胞因子；在经过4小时孵育后，试剂已经分泌足够量的IL-6，允许对热原污染物进行定量。当全血与非内毒素热原一起孵育并使用任何读出结果时，在大约16到24小时的孵育后，试剂已经分泌了足够量的IL-6，允许对热原污染物进行定量。对于分析IL-6产生的本发明的实施方案来说，优选的孵育时间是大约6到大约24小时，更优选为大约12到大约24小时，最优选为大约16到大约24小时。如果分析另一种细胞因子，应该根据该特定细胞因子的产生而对孵育时间进行最适化。这样的最适化在本领域普通技术人员的能力之内。如果被分析的细胞因子不由单核细胞释放，则可以通过冻融或通过在孵育期末加入浓度不会破坏配体与抗体的结合的去污剂来裂解细胞。
一旦孵育步骤完成，分析系统(第一个分析系统)的内含物，即含有单核细胞的试剂和测试样品，被转移到第二个分析系统中，第二分析系统含有至少一个用针对细胞因子或炎性反应的内源性介质例如内皮素的抗体处理过的表面。分析第二个分析系统中在用抗细胞因子或抗内源介质抗体包被的表面上细胞因子或内源性介质的存在。优选，在分析包被了抗体的表面上结合的细胞因子之前，在程序中的所有点处维持严格的无菌条件。如果用捕获抗体包被的ELISA板用作本发明的实施方案，将板清洗，并向ELISA板中加入与酶偶联的第二种抗细胞因子抗体(除非第二种标记的“检测”抗体在上光之前或与第一分析系统的内含物一起首先加入到板中)。再次清洗ELISA板，向ELISA板中加入底物将产生颜色。经过短时间孵育之后，终止反应，在ELISA读板器上测量溶液的光密度。这个过程在美国专利No.6,696,261的实施例2中有进一步的描述。或者，可以使用非酶法的免疫分析技术。例如，免疫分析“三明治”的第二抗体可以用荧光基团或放射性同位素标记。清洗之后，在孔中捕获的细胞因子的量可以通过检测孔中存在的荧光或辐射的量来定量。几种基于酶法和非酶法的分析系统可以商购，并可以被本领域普通技术人员容易地修改以用于本发明。
3、单分析系统
在本发明的某些实施方案中，热原性测试在单分析容器系统中进行，使得样品与含有单核细胞的试剂的孵育步骤和含有单核细胞的试剂产生的细胞因子的捕获步骤发生在同一个分析容器系统中。分析系统含有至少一个含聚丙烯的表面和至少一个用针对细胞因子或炎性反应的内源性介质的抗体处理过的表面。孵育步骤在上面描述的培养步骤之后，并在与培养步骤相同的分析系统中进行。如上面对双分析容器系统的内容所述，用于本发明的热原测试的最适孵育时间根据分析条件、即被分析的细胞因子而变化。总的来说，关于双分析容器系统讨论的有关孵育步骤的教示也同样适用于单分析容器系统。产生特定细胞因子的孵育时间应该最适化，这样的最适化在本领域普通技术人员的能力之内。如果待分析的细胞因子不由单核细胞释放，可以通过冻融、或通过在孵育期末加入浓度不会破坏配体与抗体的结合的去污剂来裂解细胞。
一旦孵育步骤完成，则在含有至少一个用针对细胞因子或炎性反应的内源性介质例如内皮素的抗体处理过的表面的分析系统中，分析用抗细胞因子或抗内源性介质抗体包被的表面上细胞因子或内源性介质的存在。优选，在分析包被了抗体的表面上结合的细胞因子之前，在程序中的所有点上维持严格的无菌条件。总的来说，对于双分析容器系统的分析步骤进行的讨论，即关于ELISA板和非酶法免疫分析技术的讨论，也同样适用于单分析容器系统。
总的来说，单分析容器系统和双分析容器系统可以互换。
4、分析容器
本发明的分析系统含有至少一个与含有单核细胞的试剂接触的表面。在本发明的某些实施方案中，分析系统包括至少一个微量滴定孔，并且表面至少是微量滴定孔内部的一部分。在特定的实施方案中，微量滴定孔的表面含有聚丙烯涂层或者整个微量滴定孔由聚丙烯构成。在某些实施方案中，分析系统含有至少一个用针对细胞因子或炎性反应的内源性介质的抗体处理过的表面，施加抗体的表面至少是微量滴定孔内部的一部分。优选，微量滴定孔的形状使得与平底的微量滴定孔相比，含有单核细胞的试剂集中了。
在某些实施方案中，微量滴定孔包括开放的顶端，上部区域从开放的顶端向下延伸，底壁从最低点以上的位置到最低点的直径逐渐减小。
在某些实施方案中，微量滴定孔包括开放的顶端，从开口的顶端向下延伸的上部区域具有顶端和底端，而底部区域具有顶端和最低点，底部区域从上部区域的底端延伸，从底部区域的顶端到最低点，直径逐渐减小得比上部区域更快。
在某些实施方案中，所述微量滴定孔的底壁不是平的，优选为曲面的，有时为抛物面的。在某些特定的实施方案中，底壁是向下延伸的，或微量滴定孔的侧面是向内倾斜的。
5、诊断试剂盒
上述实施方案中的任何一个都可以整合到诊断试剂盒中用于进行热原测试。试剂盒被用于检测各种不同的非内毒素热原，包括革兰氏阳性细菌(例如金黄色葡萄球菌)或它们的组分(例如胞壁肽、脂胞壁酸、肠毒素、链球菌溶血素)，以及各种不同医疗制品、包括血液制品或其它肠胃外用品例如透析液、疫苗和静脉溶液液中的内毒素热原。总的来说，这样的试剂盒包括微量滴定板，该板含有多个微量滴定孔，它们的形状使得每个孔中含有的培养基与平底微量滴定孔相比集中，孔含有至少一个含有聚丙烯的表面。微量滴定板的孔包含含有低温保存的单核细胞试剂，该试剂含有低温保存的全血、低温保存的外周血单核细胞或低温保存的单核细胞系细胞，它们与孔的表面接触。在某些实施方案中，微量滴定板的孔含有聚丙烯。当含有低温保存的单核细胞的试剂包含低温保存的外周血单核细胞或低温保存的单核细胞系细胞时，试剂以高细胞密度存在于孔中。含有低温保存的全血作为含有单核细胞的试剂的试剂盒还含有针对IL-6的抗体，因为IL-6是优选的读出结果。
在具体的实施方案中，孔包括单核细胞不能透过的屏障。屏障含有至少一个由无热原材料构成的表面，通常是膜、格栅、滤网或筛。屏障优选为无菌的。适合用于微量滴定板的屏障的材料在本技术领域内是已知的。屏障对于流体是可透过的，它使得低温保存的细胞可以不用移出孔就被清洗；二甲基亚砜(DMSO)洗浴低温保存的细胞并作为防腐剂，它可以被取出以便不干扰测试。测试样品被加到屏障上方，透过屏障，与屏障之下的细胞相接触，并可能刺激这些细胞产生细胞因子。细胞所释放的细胞因子扩散到屏障上方的培养基中。通常，通过抽吸溶液使阻挡层之上和之下的溶液完全混合。然后，对屏障之上的混合好的培养基的等份试样进行分析，分析细胞因子和炎性反应的内源性介质的存在。
6、细胞因子产生数据的解读
A、标准曲线方法
为了恰当解读本发明的热原测试中产生的细胞因子产生数据，通过将含有单核细胞的试剂与USP标准内毒素进行孵育，产生内毒素标准曲线。其目的是为了根据针对已知热原观察到的反应，来对测试样品中测量到的细胞因子产生反应进行定量。标准曲线可以从使用显著不同浓度的标准内毒素产生的任何统计学显著性数量的数据点，通过使用标准最佳拟合数据分析软件来产生。产生这样的标准曲线的方法在本技术领域内是一般常识。本申请人已经发现10、4、1、0.25、0.06、0.03和0EU/ml的内毒素数据点适合用于产生标准曲线，但是通过类似范围的任何统计学显著性数量的浓度都将是合适的。一旦产生了标准曲线，可以使用标准曲线从细胞因子反应内推出等同的非内毒素浓度(以等同的内毒素单位定量)。因为基于全血的含有单核细胞的试剂的反应从供体到供体可以有显著变化，重要的是对使用具体批次的含有单核细胞的试剂进行每套分析产生标准曲线。但是，因为本发明的优选的ELISA板实施方案使用了非常少量的人类血液(大约40μL/孔)，因此单一单位的捐血就可以用于几百个孔。使用USP内毒素产生的标准曲线帮助了将数据相对于内毒素单位(EU，被USP/FDA定义，与WHO定义的国际单位IU一致)进行了标准化，这是用于表示内毒素/热原污染的工业标准。
B、参比批次方法
或者，在本发明的热原测试中产生的细胞因子产生数据，可以通过将产品的测试批次引发的细胞因子反应与产品的参比批次、包括污染的参比批次和未污染的参比批次引发的细胞因子反应相比较来解读。首先，鉴定医疗制品的两个参比批次：对参比批次进行热原测试，并测量这些批次引发的细胞因子反应。然后，对测试批次进行热原测试，将这些批次引发的反应与参比批次引发的反应进行比较。一般来说，测试批次如果引发的反应比污染的参比批次更小并且反应与未污染的参比批次类似，它将被视为未污染的。每个测试批次可以被测试一次或几次。例如，按照一种参比批次方法，如果产品引发的IL-6释放在四个供体中的四个或八个供体中的七个中不超过未污染的参比批次的两倍时，它被视为未污染的；该测试使用四个不同供体的血液四份平行进行。优选的参比批次方法在Gaines-Das等2004中有描述，其中需要测试样品来刺激比参比少的IL-6的释放。在该文中，测试制品需要用来自四个不同供体的PBMNC通过测试。如果测试制品使用四个供体中的三个的PBMNC通过了测试，则将使用另外四个供体的PBMNC继续进行测试，这四个供体没有一个在第一次测试时提供PBMNC，测试制品需要用来自八个不同供体中的七个的PBMNC通过测试。
有利的是，本发明的单核细胞活化测试能够更好地检测在医疗制品例如血液制品、静脉溶液和疫苗中存在的各种各样的热原，包括非内毒素热原。
定义
在本文中使用的术语“纯的”内毒素或非内毒素热原、或“纯态”热原，是指已经脱去了与它相关的蛋白的内毒素。纯的内毒素也被称为脂多糖(LPS)。
术语“含有单核细胞的试剂”是指免疫系统的单核白细胞的任何溶液。优选，这些细胞来自要施用待测制品的生物体(即对于药物制品来说为人类，对于兽医制品来说为猫、狗或马等)。含有单核细胞的试剂的例子是人类全血。
术语“分析系统”是指任何可以用于单核细胞活化测试的容器和表面，包括细胞与测试样品一起培养和孵育的容器，以及带有可以用于免疫分析的结合的抗体的容器和表面。优选，对于进行免疫分析来说，这样的容器是微量滴定孔板，在孔的表面结合有抗体，其中可以平行地进行大量的比色酶联免疫分析，并且可以通过ELISA读板机器进行自动评估。但是也可以设想其它的免疫分析系统，特别是在包被的表面不是容器壁的必需部分的情况下。例如，含有抗体包被的聚苯乙烯珠子或测量杆的较大的试管可以用于本发明。
术语“单核细胞系”包含了任何具有内源性CD14和/或Toll样受体(TLR)或已经用CD14和/或TLR和/或炎性/致热介质的报告基因转染的细胞系。细胞系不必须是单核细胞，只要它具有或已经被转染了存在于单核细胞上的“热原受体”的成分就行；这些成分包括TLRs和CD14。例如，人类胚胎肾脏(HEK)细胞已经具有了大多数TLR，可以用它们不具有的TLR——TLR2和TLR4以及CD 14进行稳定地转染，使它们能够充分像单核细胞，在本发明的方法中起作用。
实施例
实施例1
PBMC的制备。PBMC从不超过4小时的肝素化人类外周血通过使用Ficoll Paque Plus(Pharmacia#17-1440-02)进行密度梯度离心而分离。细胞用不含钙和镁的Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(Gibco#14190)洗两次，重新悬浮在最低必需培养基(MEM)(Gibco#11090)、HEPES缓冲液(Gibco#15630)和5μL供体自己的热失活血浆(即终浓度为2％)中。将PBMC稀释到所需的细胞密度(每毫升8百万、4百万、2百万和1百万个PBMC)。
细胞培养。细胞培养在下述的微量滴定板上四份平行进行：Corning Costar#3790，#3359。在每个孔中加入含有1百万、50万、25万或13万个细胞的125μL细胞悬浮液，然后加入125μL测试样品或标准内毒素(0.0064-20EU/mL)。将250μL混合物轻轻混合，在潮湿空气和5％CO2中在37±1℃下孵育。培养的时间是16到24小时，该时间后获得培养流体的等份试样，稀释到2倍和50倍，分析IL-6。
IL-6的ELISA。将96孔板(Immulon 4，Dynex#011-010-3855)用150μL的3μg/mL小鼠单克隆IgG(R&D Systems#MAB206，溶解在碳酸氢盐缓冲液中，pH 9.5)通过在2-8℃孵育过夜进行包被。将板用300μL清洗缓冲液(20mM HEPES，150mM NaCl，pH 7.4)清洗3次。通过加入200μL阻断溶液(0.02g/L牛血清白蛋白，组分V，无蛋白酶)将板上的非特异性结合位点阻断。板再用300μL同样的清洗缓冲液洗3次，在每个孔中加入100μL样品(之前在样品稀释液中稀释2倍和50倍)或标准品(7.8-1000pg/mL，IL-6的WHO国际标准，#89/548)。在每个未使用的孔中加入100μL样品稀释液。将板用密封盖(sealer，Falcon #3073)盖住，然后振荡(大约300rpm)孵育1小时±5分钟。
然后将板吸空，用300μL清洗缓冲液洗5次。然后在每个孔中加入100μL 0.2μg/mL的生物素化山羊抗人IL-6抗体(R&D Systems，#BAF206)，再次用密封盖盖住板，振荡(大约300rpm)孵育1小时±5分钟。
然后将板吸空，用300μL清洗缓冲液洗5次。然后在每个孔中加入100μL 0.02μg/mL的碱性磷酸酶(Rockland #S000-05)，将板再次用密封盖盖住，振荡(大约300rpm)孵育1小时±5分钟。
将板吸空，用300μL清洗缓冲液洗5次。然后在每个孔中加入200μL 1mg/mL的pNPP，该pNPP溶解在含有0.5mM MgCl2的二乙醇胺缓冲液中。将板再次用密封盖盖住，于室温振荡(大约300rpm)孵育，直到IL-6标准曲线的最大浓度(1000pg/mL)在405nm处具有大约2.5和3.0之间的光密度，在该点处通过在每个孔中加入50μL 2M的NaOH来终止反应。在反应终止后30分钟内使用设置到405nm的微孔板读板器测定每个孔的光密度。
图1显示了细胞密度对IL-6对于内毒素标准品(1EU/ml)和阳性对照的反应的影响。
Figure S2006800488729D00242
阳性对照被非内毒素热原污染，并在该药品该批次的人类接受者中引起了药物不良反应，但是在LAL测试中给出了阴性反应(Martis等，2005)。值是4个重复孔的平均值+平均值的标准误差。每个孔25万到1百万个PBMC的细胞密度对1EU/ml内毒素标准品的反应相似。阳性对照样品检测最好的是使用每个孔1百万＞50万＞25万＞13万个细胞。
实施例2-对比热原测试
本文描述的方法按本技术领域的当前状况进行重复。这些方法都不能将
Figure S2006800488729D00243
透析溶液、血红蛋白和/或葡聚糖的阳性产品对照与阴性产品对照区分开来。
Hoffman等，2005的分析按照其中的描述进行了重复，使用了带有平底孔的聚苯乙烯微量滴定板和IL-6读出结果。含有单核细胞的试剂以低细胞密度使用，在图2-5中是全血(每个孔75,000个细胞)、PBMC(每个孔100,000个细胞)、MONOMAC6(每个孔250,000个细胞)或THP-1(每个孔250,000个细胞)。注意到在图5中，IL-6读出结果被新喋呤所取代，因为在本发明的方法中IL-6是内源的热原(与新喋呤相反)，并且读出结果更牢靠。在图6中，低细胞密度的THP-12A9细胞(每个孔250,000个细胞)被用作含有单核细胞的试剂，TNF为读出结果。
Nakagawa等的分析按照其中的描述进行了重复，使用每毫升1,000,000个MONOMAC-CA8克隆细胞作为含有单核细胞的试剂，IL-6作为读出结果，以及具有平底孔的聚苯乙烯微量滴定板。参见图7。
Yamamoto等的分析按照其中的描述进行了重复，使用每毫升1,000,000个28C细胞作为含有单核细胞的试剂，IL-6为读出结果，以及具有平底孔的聚苯乙烯微量滴定板。参见图8。但是，28C细胞被钙三醇(100ng/nl)而不是γ-干扰素所引发，因为后者对于内毒素标准品不能给出剂量反应曲线。
实施例3-本发明的热原测试
20％的人类全血培养物(200μl)(40μl＝大约60,000PBMC/孔＝大约300,000PBMC/ml)在96孔圆底聚丙烯板(Costar#3790，CorningIncorporated，USA)上进行四份平行培养。每个孔中加入：MEM-HEPES(60μl)、来自单一供体的血液(40μl)、用MEM-HEPES 1∶1稀释的内毒素标准品或
Figure S2006800488729D00251
样品(100μl，即在孔中
Figure S2006800488729D00252
溶液的最终稀释倍数为4倍)。通过轻轻旋转使孔的内含物混合(不使孔交叉污染)，在含有5％CO2的气氛下在37℃不振荡(令细胞沉降)孵育16-24小时。在组织培养孵育结束时，从每个孔取出100μl的澄清的上清液等份试样，通过ELISA分析IL-6。
用于葡聚糖样品的方法与上面实施例1中描述的相同。细胞的分离和培养相似，除了细胞密度是每个孔400,000个细胞以及在ELISA中使用的样品稀释度是10倍之外。IL-6 ELISA的不同之处在于它使用了用克隆16单克隆抗体包被的板(用于捕获IL-6)，以及与辣根过氧化物酶偶联的绵羊多克隆抗体作为检测抗体。在全血/IL-6测试(NIBSC)和PBMC/IL-6测试(Novartis)中使用的ELISA与Hoffmann等2005年的论文中描述的相同。
图9显示了阴性对照样品和
Figure S2006800488729D00262
阳性对照样品、以及葡聚糖阴性对照样品和葡聚糖阳性对照样品的比较性的结果。可以看出，本发明的热源测试可以轻易地区分这些阳性和阴性对照。测试按照上面描述的方案使用来自单一供体的血液四份平行进行。值是四个重复孔的平均值±平均值的标准误差。
图10显示了
Figure S2006800488729D00263
阴性对照样品和阳性对照样品的比较性的结果。可以看出，本发明的热原测试可以容易地区分这些阳性和阴性对照。测试按照上面描述的方案使用来自单一供体的血液四份平行进行。值是四个重复孔的平均值±平均值的标准误差。要注意的是，当含有单核细胞的试剂是全血并且使用圆底的聚丙烯孔时，低细胞密度就足以将阳性
Figure S2006800488729D00265
对照与阴性区分开来。
实施例4-本发明的热原测试：对于单一供体来说聚丙烯板对聚 苯乙烯板和IL-6对IL-1β的比较性结果
按照实施例1中的方法制备测试样品，只是使用的细胞密度为每个孔1百万个细胞，某些样品进行IL-1β读出，某些样品被放置在具有平底孔的聚苯乙烯微量滴定板中。图11A显示出对于在聚丙烯板中进行的测试来说，对阳性对照的IL-6反应与阴性对照明确区分开，但是对于在聚苯乙烯板中进行的测试来说则不能区分开。值是四个重复孔的平均值±平均值的标准误差。图11B显示出对于在聚丙烯板中进行的测试来说，对阳性对照的IL-1β反应与阴性对照明确区分开，但是对于在聚苯乙烯板中进行的测试来说则不能区分开。但是在图11B中的反应的强度比图11A中的反应的强度要弱得多，表明与IL-6相比，IL-1β是差的读出结果值。值是四个重复孔的平均值±平均值的标准误差。
实施例5-本发明的热原测试：对于多个供体来说聚丙烯板对聚 苯乙烯板的比较性结果
按照实施例1中的方法制备测试样品，只是使用的细胞密度为每个孔88万和1百万个细胞，使用了三个供体，某些样品被放置在具有平底孔的聚苯乙烯微量滴定板中，IL-6的ELISA使用了用克隆16单克隆抗体包被的板和与辣根过氧化物酶偶联的绵羊多克隆抗体作为检测抗体，如同Hoffmann等的2005年的论文中所述。图12A和12B分别显示了对于具有圆底孔的聚丙烯微量滴定板和具有平底孔的聚苯乙烯微量滴定板的IL-6反应，PBMC细胞密度为每个孔供体A的88万个细胞。对于供体A来说，当使用聚苯乙烯板时，热原测试不能区分开阳性和阴性对照，但是当使用聚丙烯板时能够区分开这些对照。图13A和13B分别显示了对于具有圆底孔的聚丙烯微量滴定板和具有平底孔的聚苯乙烯微量滴定板的IL-6反应，PBMC细胞密度为每个孔供体B的1百万个细胞。尽管对于供体B来说两种热原测试都能区分开阳性和阴性对照，但是当使用聚丙烯板时对阳性对照的IL-6反应是对阴性对照的反应的大约6倍，而使用聚苯乙烯板时仅仅为对阴性对照的反应的大约2倍。图14A和14B分别显示了对于具有圆底孔的聚丙烯微量滴定板和具有平底孔的聚苯乙烯微量滴定板的IL-6反应，PBMC细胞密度为使每个孔供体C的88万个细胞。尽管对于供体B来说两种热原测试都能区分开阳性和阴性对照，但是使用聚丙烯板与使用聚苯乙烯板相比，对阳性对照的IL-6反应是大约2倍高。注意的是在聚丙烯中，对
Figure S2006800488729D00271
阳性对照的反应超过了对LPS标准品最大剂量即0.4EU/ml的反应，而在聚苯乙烯中，对
Figure S2006800488729D00272
阳性对照的反应小于对LPS标准品最小剂量即0.1EU/ml的反应。
实施例6-对比性热原测试：IPT(Charles River Laboratories)
用于进行本测试的方法被描述在
Figure S2006800488729D00281
体外热原测试指导说明书中(可以从Charles River Laboratories商购，(PIIPT10002))，使用了用IL-1β和聚苯乙烯微量滴定板用于全血刺激的分析程序。图15显示出IPT测试不能区分开
Figure S2006800488729D00282
和血红蛋白的阳性和阴性对照，尽管试剂盒能够与LPS标准品和试剂盒中来自革兰氏阳性细菌的脂胞壁酸阳性对照反应。
实施例7-使用低温保存的细胞的本发明的热原测试
在具有圆底的250μL孔的96孔聚丙烯板的每个孔中加入在血浆和二甲基亚砜中(或在全血和二甲基亚砜中)的细胞悬浮液(例如1百万个PBMC或单核细胞)，然后密封并低温保存。
在测试日，将板融化，达到室温，取下密封，将96孔插件牢固地压到位。插件具有聚丙烯壁和平的底面，该底面对于细胞通过来说是屏障，但是液体能够通过。
通过用新鲜的培养基充满插件、上下吸培养基以混合细胞屏障上下的溶液、然后吸取并丢弃细胞屏障之上的溶液来将DMSO从细胞中洗掉。通过重复该清洗步骤5次，细胞被洗得基本上不含DMSO，然后保留在已知体积的新鲜培养基中。
将测试样品或标准品和更多的新鲜培养基加到插件中，然后通过上下吸该溶液混合细胞屏障上下的溶液，使样品或(热原)标准品中的热原与细胞接近。
将板在含有5％二氧化碳气体的加湿的空气下在37±1℃孵育16-24小时。在孵育过程中，细胞的沉降使得细胞彼此接触，促进了热原刺激的IL-6的释放。在孵育时期结束时，通过上下吸细胞屏障之上的溶液使细胞屏障上下的溶液完全混合，然后取出细胞调节过的培养基的等份试样进行IL-6分析。
低温保存的PBMC是有利的，因为它们可以容易地在干冰上全全世界运输。与聚苯乙烯不同，聚丙烯经得起液氮而不破裂。在达到后，PBMC只需要被融化并洗去DMSO，再加上提供的板插件就可以准备用于测试中。通过运输每个孔中最适数量的细胞以及将细胞与板插件一起使用，为终端用户提供了改进的测试试剂盒。在常规试剂盒中，细胞在试管中运输，一旦融化后，必须通过离心使细胞沉积、并使它们分散在干净的培养基中来进行清洗。通常细胞要以这种方式清洗2到3次。然后必须对细胞进行计数并重新悬浮成所需的细胞密度，然后才可以将它们分配到孔中。与可能导致细胞损失、活化和细胞死亡的常规测试相比，本发明的热原测试降低了劳动强度、减少了时间耗费并极大地降低了对细胞的创伤。
在介绍本发明的要素或其优选实施方案时，冠词″a″、″an″、″该″和″所述″是指有一个或多个要素。术语″包含″、″包括″和″具有″其目的是包含性的，是指除了列出的要素之外还可以有其它的要素。因为在上述的方法和成分中可以作出各种不同的改变而不背离本发明的范围，因此在上面的说明书中包含的所有的事物都应该被解释为举例说明性的，而没有限制的意义。

Claims (37)

1.在样品中检测非内毒素热原的方法，包括下列步骤：
将含有单核细胞的试剂与待测样品在分析系统中组合，所述分析系统包括含有多个微量滴定孔的微量滴定板，所述微量滴定孔的形状使得与平底的微量滴定孔相比，含有单核细胞的试剂被集中以提供更多的细胞与细胞的接触，其中每个微量滴定孔包含的底壁是非平面的，并且其中所述微量滴定孔的表面包含聚丙烯涂层或者整个微量滴定孔由聚丙烯构成；
将含有单核细胞的试剂与样品孵育，其中的样品包含热原，并且含有单核细胞的试剂产生细胞因子或炎性反应的内源性介质，并且其中分析系统还包含至少一个用针对细胞因子或炎性反应的内源性介质的抗体处理过的表面，或者所述方法还包括将分析系统的内含物转移到第二分析系统的步骤，所述第二分析系统包含至少一个用针对细胞因子或炎性反应的内源性介质的抗体处理过的表面；以及
分析分析系统或第二个分析系统中与表面上的抗体结合的细胞因子或内源性介质的存在，由此与表面结合的细胞因子或内源性介质的水平升高表明在测试样品中存在热原。
2.权利要求1的方法，其中每个微量滴定孔包含的底壁是曲面的、抛物面的或向下延伸的。
3.权利要求1中的方法，其中每个微量滴定孔的侧面是向内倾斜的。
4.权利要求1中的方法，其中抗体施加在所述微量滴定孔的内部的至少一部分。
5.权利要求4中的方法，其中所述抗体是针对炎性反应的内源性介质的抗体。
6.权利要求5中的方法，其中所述内源性介质是内皮素。
7.权利要求1至4任一项中的方法，其中所述细胞因子选自白介素-1（IL-1）、白介素-1ra（IL-1ra）、白介素-6（IL-6）、白介素-8（IL-8）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）。
8.权利要求7中的方法，其中所述细胞因子是IL-6。
9.权利要求1至8任一项中的方法，其中所述分析系统是比色的酶联免疫吸附分析（ELISA）、放射性标记的免疫分析或荧光标记的免疫分析。
10.权利要求1中的方法，其中含有单核细胞的试剂包含外周血单核细胞（PBMCs）或单核细胞系细胞。
11.权利要求10中的方法，其中所述单核细胞系包括人类单核细胞系。
12.权利要求11中的方法，其中所述单核细胞系包括选自MONOMAC-6、THP-1和28SC的人类单核细胞系。
13.权利要求10中的方法，其中所述单核细胞系包含具有内源性CD14和Toll样受体、或已经被炎性或致热性介质的CD14和/或Toll样受体和/或报告基因转染的细胞系。
14.权利要求10中的方法，其中所述外周血单核细胞是人类外周血单核细胞。
15.权利要求10中的方法，其中所述含有单核细胞的试剂以每个孔至少250,000个细胞的细胞密度存在于所述分析系统中。
16.权利要求15中的方法，其中所述含有单核细胞的试剂以每个孔至少500,000个细胞的细胞密度存在于所述分析系统中。
17.权利要求16中的方法，其中所述含有单核细胞的试剂以每个孔至少600,0000个细胞的细胞密度存在于所述分析系统中。
18.权利要求17中的方法，其中所述含有单核细胞的试剂以每个孔至少700,000个细胞的细胞密度存在于所述分析系统中。
19.权利要求18中的方法，其中所述含有单核细胞的试剂以每个孔至少800,000个细胞的细胞密度存在于所述分析系统中。
20.权利要求19中的方法，其中所述含有单核细胞的试剂以每个孔至少900,000个细胞的细胞密度存在于所述分析系统中。
21.权利要求20中的方法，其中所述含有单核细胞的试剂以每个孔至少1,000,000个细胞的细胞密度存在于所述分析系统中。
22.权利要求21中的方法，其中所述含有单核细胞的试剂以每个孔至少1,100,000个细胞的细胞密度存在于所述分析系统中。
23.权利要求22中的方法，其中所述含有单核细胞的试剂以每个孔至少1,200,000个细胞的细胞密度存在于所述分析系统中。
24.权利要求23中的方法，其中所述含有单核细胞的试剂以每个孔至少1,300,000个细胞的细胞密度存在于所述分析系统中。
25.权利要求24中的方法，其中所述含有单核细胞的试剂以每个孔至少1,400,000个细胞的细胞密度存在于所述分析系统中。
26.权利要求25中的方法，其中所述含有单核细胞的试剂以每个孔至少1,500,000个细胞的细胞密度存在于所述分析系统中。
27.权利要求26中的方法，其中所述含有单核细胞的试剂以每个孔至少1,600,000个细胞的细胞密度存在于所述分析系统中。
28.权利要求27中的方法，其中所述含有单核细胞的试剂以每个孔至少1,700,000个细胞的细胞密度存在于所述分析系统中。
29.权利要求28中的方法，其中所述含有单核细胞的试剂以每个孔至少1,800,000个细胞的细胞密度存在于所述分析系统中。
30.权利要求29中的方法，其中所述含有单核细胞的试剂以每个孔至少1,900,000个细胞的细胞密度存在于所述分析系统中。
31.权利要求30中的方法，其中所述含有单核细胞的试剂以每个孔至少2,000,000个细胞的细胞密度存在于所述分析系统中。
32.权利要求1中的方法，其中所述含有单核细胞的试剂含有全血。
33.权利要求32中的方法，其中所述全血是人类全血。
34.权利要求1-9任一项中的方法，其中所述含有单核细胞的试剂还含有稀释剂，抗凝剂，或者稀释剂和抗凝剂二者。
35.权利要求1-34任一项中的方法，其中所述样品是肠胃外施用的医疗制品，所述肠胃外施用的医疗制品任选自血液制品、透析溶液、疫苗和血浆增容剂。
36.诊断试剂盒，包括：
含有单核细胞的试剂；
包括含有多个微量滴定孔的微量滴定板，所述微量滴定孔的形状使得与平底的微量滴定孔相比，含有单核细胞的试剂被集中以提供更多的细胞与细胞的接触，其中每个微量滴定孔包含的底壁是非平面的，其中所述微量滴定孔的表面包含聚丙烯涂层或者整个微量滴定孔由聚丙烯构成，并且或者所述分析系统还包含至少一个用针对细胞因子或炎性反应的内源性介质的抗体处理过的表面，或者所述试剂盒包括第二分析系统，所述第二分析系统包含至少一个用针对细胞因子或炎性反应的内源性介质的抗体处理过的表面，其中细胞因子或炎性反应的内源性介质是由含有单核细胞的试剂暴露于含有热原的样品产生的细胞因子或炎性反应的内源性介质。
37.权利要求36中的试剂盒，其中每个微量滴定孔包含的底壁是曲面的、抛物面的或向下延伸的。
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