KR102156616B1 - 의학적 장치 디자인, 제조 및 시험 시스템 - Google Patents

의학적 장치 디자인, 제조 및 시험 시스템 Download PDF

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마이클 씨. 하일즈
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쿠크 바이오텍 인코포레이티드
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Abstract

의학적 장치의 부위들, 예를 들면, 세포를 환자에게 전달하거나 사용 동안에 세포 또는 세포 제제와 접촉하도록 사용될 수 있는 캐뉼화된 전달 부품들 또는 이의 어셈블리의 루멘들을 시험하기 위한 방법 및 시스템이 기재되어 있다. 시험 세포는 잠재적으로 인큐베이팅 기간 동안, 루멘 또는 다른 장치 부위의 벽 및/또는 루멘 또는 다른 장치 부위의 벽과 접촉하는 액체와 접촉된다. 이어서, 상기 시험 세포는 선천적 면역 반응, 대사 활성, 생존능, 세포독성 반응, 콜로니 형성 및/또는 운동성과 같은 시험 세포의 하나 이상 및 바람직하게는 다중 특성에 대한 벽 접촉 또는 액체 접촉의 영향에 대해 평가된다. 기재된 바와 같은 방법 및 시스템은 캐뉼화된 전달 장치 또는 다른 의학적 장치의 개발 및/또는 제조에 사용될 수 있고, 예를 들면, 디자인 또는 프로세스 입력 또는 출력, 디자인 또는 프로세스 유효성 및/또는 장치 로트 승인을 위한 명세서를 제공한다. 또한, 상기 방법 및 시스템에 따라 제조된 장치 또는 제품이 기재된다.

Description

의학적 장치 디자인, 제조 및 시험 시스템{MEDICAL DEVICE DESIGN, MANUFACTURE AND TESTING SYSTEMS}
관련 출원에 대한 참조
본 출원은, 2012년 9월 26일자로 출원되고 발명의 명칭이 "Medical Device Design, Manufacture and Testing Systems"인 미국 가특허 출원 번호 제61/705,650호에 대한 우선권의 이익을 주장하고, 상기 출원은 이의 전문이 본원에 인용에 의해 포함된다.
본 발명은, 일반적으로, 세포 전달을 위해 사용될 수 있는 의학적 장치에 관한 것이고, 소정 실시형태에서는 상기 의학적 장치의 전달 통로가 세포에 대한 이들의 영향에 대해 시험될 수 있는 시스템 및 방법에 관한 것이다.
세포 치료요법의 분야는 한동안 광범위한 병태 또는 손상에 대해 환자들을 위한 개선된 의학적 치료를 제공하기 위한 노력으로 조사되어 왔다. 일부 입증된 연구 전망에도 불구하고, 세포 치료요법의 임상적 실시는 지체되어 왔다. 환자에게 확실히 이로울 수 있는 것으로 입증된 세포 유형 및 투여 방식의 동정은 어려웠고, 임상 현장에서 실패 또는 단지 산발적인 성공에 대한 이유가 잘 공지되어 있지 않다. 세포는 물리적 및 화학적 자극 둘 다에 대해 민감한 것으로 공지되어 있지만, 제안된 치료요법으로부터 손상(detract)에 이롭거나 이롭지 않을 수 있는 자극의 동정은 제한되어 왔다.
많은 제안된 임상적 적용에서, 세포는 비침습적으로 환자에게 도입되어야만 하고, 이들 목적을 위해 전달 장치가 요구된다. 그러나, 세포 치료요법에서 세포에 대한 전달 장치를 개발하거나 제조하는 경우 어떠한 특정 사항들이 고려될 필요가 있는지에 대한 연구 또는 이해가 거의 보고되어 있지 않았다. 따라서, 치료학적 제제 - 세포 -의 생물학적 민감성 및 의학적 전달 장치 디자인 및 제조의 복잡성 둘 다를 고려할 결정적 필요성이 본 분야에 존재한다. 본 발명은 적어도 이의 몇몇의 양상에서 이들 필요성을 해소한다.
[도면의 간단한 설명]
본 발명의 소정 양상은, 의학적 장치들이, 예를 들면, 치료학적 목적을 위해 사람 또는 동물 환자에게 도입되는 경우에 세포의 수행능과 관련된 세포 특성에 대한 이들의 영향을 포함하는, 생(viable) 세포에 대한 이들의 영향에 대해 시험되는, 시스템 및 방법에 관한 것이다. 상기 영향은 일부 실시형태에서 면역 반응, 대사 활성, 생존능(예를 들면, 노출 후의 생 세포 백분율), 세포독성 반응, 증식, 목적하지 않은 경로에 대한 활성화 저하, 콜로니 형성에 대한 능력 및/또는 이동에 관한 것일 수 있다. 샘플 시험 세포는, 의학적 전달 장치의 전달 통로를 통해 통과하고, 수집되거나, 그렇지 않으면 의학적 장치의 존재 하에 체류하고/하거나 의학적 장치의 표면과 접촉되고, 수집될 수 있다. 이어서, 상기 수집된 세포는 세포의 특성을 결정하기 위해 검정될 수 있다. 상기 수집된 세포로부터의 결과는, 대조군 세포로부터의 상응하는 결과와 비교하여 상기 세포에 대한 의학적 전달 장치 또는 다른 의학적 장치의 잠재적 영향(들)을 결정할 수 있다. 이들 방법은 의학적 장치 또는 프로세스 디자인 또는 유효화의 일부로서 그리고/또는 장치 로트(device lot) 유효화의 일부로서 사용될 수 있다. 소정 실시형태에서, 세포-기반 시험은, 세포 전달 통로를 형성하기 위해 서로 연합된 적어도 제1 및 제2 전달 부품(component)들을 포함하는 부품 어셈블리인 의학적 전달 장치 상에서 수행될 수 있다. 이러한 방식에서, 최종 사용자에 의해 사용될 전체 전달 통로는, 상기 부품 통로들을 평가하는 것보다는 또는 상기 부품 통로들을 별도로 평가하는 것에 추가하여 세포에 대한 전체 전달 통로의 효과에 대해 평가될 수 있다. 이는, 별도의 부품 노출과 전체 통로 노출 사이에서 발생할 수 있는 세포 효과에서의 잠재적인 차이들을 설명하기 위해 사용될 수 있다. 이들 차이는, 예를 들면, 상이한 물질들 또는 표면 피쳐(feature)들과의 접촉, 상기 부품들 사이의 연결 부위(region)들 또는 상기 전체 전달 통로를 통한 유동 동안의 유체 응력으로 인한 것일 수 있다.
도 2는 TLR-2 수용체를 통한 NF-KB 경로의 활성화/억제를 도시하는 그래프이다. TLR-2 수용체로 형질감염된 HEK-293 세포는, 음성(RPMI) 및 양성(PAM3CSK4) 대조군의 존재 하에, 그리고, 구리, 폴리비닐클로라이드(PVC) 및 Cook Advance 35LP 벌룬 카테터(balloon catheter)의 루멘과 접촉된 상태로 항온배양된 배지의 존재 하에 배양하였고, 각각은, 하기 실시예 1에서 추가로 기술되는 바와 같이 본원에서 LOT 1로서 동정된 제1 제조 로트로부터 각각 취해진 3개의 복제물들을 갖는 4개 샘플들의 평균으로서 나타낸다.
도 1은 본 발명의 제조 방법의 한 실시형태의 도식적 다이아그램을 제공한다.
도 2는 TLR-2 수용체를 통한 NF-KB 경로의 활성화/억제를 도시하는 그래프이다. TLR-2 수용체로 형질감염된 HEK-293 세포는, 음성(RPMI) 및 양성(PAM3CSK4) 대조군의 존재 하에, 그리고, 구리, 폴리비닐클로라이드(PVC) 및 Cook Advance 35LP 벌룬 카테터(balloon catheter)의 루멘과 접촉된 상태로 인큐베이팅된 배지의 존재 하에 배양하였고, 각각은, 하기 실시예 1에서 추가로 기술되는 바와 같이 본원에서 LOT 1로서 동정된 제1 제조 로트로부터 각각 취해진 3개의 복제물들을 갖는 4개 샘플들의 평균으로서 나타낸다.
도 3은, 하기 실시예 1에서 추가로 기술되는 바와 같이, 도 2를 생성하기 위해 사용되는 LOT 1로부터의 개별 복제물에서 NF-KB 활성화/억제 수준을 도시하는 그래프이다.
도 4는, TLR-2 수용체를 통한 NF-KB 경로의 활성화/억제를 도시하는 그래프이다. TLR-2 수용체로 형질감염된 HEK-293 세포는 음성(RPMI) 및 양성(PAM3CSK4) 대조군의 존재 하에, 그리고, 구리, 폴리비닐클로라이드(PVC) 및 Cook Advance 35LP 벌룬 카테터의 루멘과 접촉된 상태로 인큐베이팅된 배지의 존재 하에 배양하였고, 각각은, 하기 실시예 1에서 추가로 기술되는 바와 같이 본원에서 LOT 2로서 동정된 제2 제조 로트로부터 각각 취해진 3개의 복제물들을 갖는 4개 샘플들의 평균으로서 나타낸다.
도 5는, 하기 실시예 1에서 추가로 기술되는 바와 같이, 도 4를 생성하기 위해 사용된 LOT 2로부터의 개별 복제물에서 NF-KB 활성화/억제 수준을 도시하는 그래프이다.
도 6 및 도 7은, 적용된 조건의 부재 하의 배양(대조군), 라텍스의 존재 하에 인큐베이팅된 배지의 존재 하의 배양(양성 대조군으로서 사용됨) 또는 대사 활성 및 세포독성 시험 목적을 위해 LOT 1 및 LOT 2로부터 취한 복제물 35 LP 샘플의 루멘에서 인큐베이팅된 배지의 존재 하의 배양 후 U937 세포의 대사 활성 및 총 세포독성 반응을 도시하는 그래프이다(상기 대사 활성 및 세포독성 시험에 대한 복제물 35 LP 샘플은, 상기 언급된 TLR 시험으로부터의 재사용된 샘플과 반대로 새로운 샘플이었고; 각각의 35 LP 복제물 유래의 인큐베이팅된 배지는 별도의 분취물들로 나누고 별도의 검정을 위해 사용되었다).
도 4는, TLR-2 수용체를 통한 NF-KB 경로의 활성화/억제를 도시하는 그래프이다. TLR-2 수용체로 형질감염된 HEK-293 세포는 음성(RPMI) 및 양성(PAM3CSK4) 대조군의 존재 하에, 그리고, 구리, 폴리비닐클로라이드(PVC) 및 Cook Advance 35LP 벌룬 카테터의 루멘과 접촉된 상태로 항온배양된 배지의 존재 하에 배양하였고, 각각은, 하기 실시예 1에서 추가로 기술되는 바와 같이 본원에서 LOT 2로서 동정된 제2 제조 로트로부터 각각 취해진 3개의 복제물들을 갖는 4개 샘플들의 평균으로서 나타낸다.
상기 개시된 바와 같이, 본 발명의 양상들은, 환자에게 세포를 전달하기 위해 사용될 수 있는 의학적 전달 장치(예를 들면, 개별 부품 또는 어셈블리로서)의 전달 경로를 시험하고/하거나, 세포가, 예를 들면, 접촉에 의해 또는 인접한 체류에 의해 노출되는 의학적 장치의 다른 부위 또는 표면을 시험하기 위한 방법 및 시스템에 관한 것이다. 소정 실시형태에서, 시험 세포는, 잠재적으로 인큐베이팅 기간에 걸쳐, 의학적 장치의 루멘의 벽 또는 다른 표면 및/또는 의학적 장치의 루멘의 벽 또는 다른 표면과 접촉된 액체 배지와 접촉시킨다. 이어서, 상기 시험 세포는, 시험 세포의 하나 이상의 특성, 그리고, 바람직하게는 다중 특성에 대한 벽 또는 다른 표면 접촉 또는 액체 배지 접촉의 효과에 대해 평가한다. 상기 효과는, 몇몇 실시형태에서, 면역 반응, 대사 활성, 생존능, 세포독성 반응, 증식 및/또는 이동과 관련될 수 있다. 기술된 바와 같은 방법 및 시스템은, 예를 들면, 제품 디자인 또는 프로세스 입력, 제품 디자인 또는 프로세스 유효화 및/또는 장치 로트 출시 기준에 대한 세부 사항을 제공하면서 캐뉼러 삽입된(cannulated) 전달 장치 또는 다른 의학적 장치의 개발, 제조 및/또는 보급에 사용될 수 있다. 또한, 상기 방법 및 시스템에 따라 제조된 장치 또는 제품, 및 이를 보급하기 위한 방법이 기재된다.
도 6 및 도 7은, 적용된 조건의 부재 하의 배양(대조군), 라텍스의 존재 하에 항온배양된 배지의 존재 하의 배양(양성 대조군으로서 사용됨) 또는 대사 활성 및 세포독성 시험 목적을 위해 LOT 1 및 LOT 2로부터 취한 복제물 35 LP 샘플의 루멘에서 항온배양된 배지의 존재 하의 배양 후 U937 세포의 대사 활성 및 총 세포독성 반응을 도시하는 그래프이다(상기 대사 활성 및 세포독성 시험에 대한 복제물 35 LP 샘플은, 상기 언급된 TLR 시험으로부터의 재사용된 샘플과 반대로 새로운 샘플이었고; 각각의 35 LP 복제물 유래의 항온배양된 배지는 별도의 분취물들로 나누고 별도의 검정을 위해 사용되었다).
상기 의학적 전달 장치 또는 다른 의학적 장치 부품(들)는 임의의 적합한 물질 또는 물질들의 배합물을 포함하도록 제조될 수 있다. 중합체성 물질 및 금속 물질이 전형적으로 상기 장치에 혼입된다. 적합한 중합체성 물질들로는, 예를 들면, 셀룰로스 아세테이트, 셀룰로스 니트레이트, 실리콘, 가교-링크된 폴리비닐 알콜(PVA), 폴리우레탄, 폴리아미드, 스티렌 이소부틸렌-스티렌 블록 공중합체(Kraton), 폴리에틸렌 테라프탈레이트, 폴리에스테르, 폴리오르토에스테르, 폴리무수물, 폴리에테르 설폰, 폴리카보네이트, 폴리프로필렌, 고분자량의 폴리에틸렌, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리에스테르, 폴리락트산 또는 폴리글리콜산 또는 이들의 공중합체, 폴리무수물, 폴리카프로락톤, 폴리하이드록시부티레이트 발레레이트, 또는 다른 생분해성 중합체, 또는 임의의 이들 동정된 중합체들 중 임의의 중합체들의 혼합물 또는 공중합체가 포함된다. 적합한 금속으로는 스테인레스강, 니티놀, MP35N, 금, 탄탈, 백금 또는 백금 이리듐, 니오븀, 텅스텐, 이코넬, 니켈, 티타늄, 스테인레스강/티타늄 복합물(composite), 코발트, 크로뮴, 코발트/크로뮴 합금, 마그네슘, 알루미늄, 또는 다른 생체 적합성 금속 및/또는 이의 복합물 또는 합금이 포함된다. 상기 의학적 장치 루멘 또는 다른 전달 경로의 벽은, 이들 또는 다른 적합한 물질들 중 어느 하나 또는 배합물을 포함할 수 있다.
본 발명의 양상에 따라, 샘플은 일부 방식으로 의학적 장치의 벽 또는 벽들, 예를 들면, 사용 동안에 세포 또는 세포 제제와 접촉할 것으로 예상되는 의학적 장치 전달 경로 또는 다른 의학적 장치 부위를 정의하는 벽 또는 벽들과 접촉함에 의한 시험을 위해 제조된다. 몇몇 실시형태에서, 상기 샘플 물질은 이것이 경로 또는 다른 의학적 장치 부위의 벽들과 접촉되므로 세포를 함유할 것이다. 상기 세포 제제와 상기 경로 또는 다른 의학적 장치 부위의 접촉은 임의의 적합한 인큐베이팅 시간 동안 이루어질 수 있고, 몇몇 양상에서는 전달 경로 또는 다른 의학적 장치 부위의 전형적이거나 최악의 사례의 사용으로부터 예상되는 것보다 더 긴 인큐베이팅 시간 동안 이루어질 것이다. 이것은 경로 또는 다른 부위를 시험하는데 있어서 안전성 인자를 도입하는 것을 보조할 수 있다. 상기 경로 또는 다른 부위의 벽들과 접촉된 샘플의 인큐베이팅은, 정적(static) 조건, 유동 조건 또는 둘 다의 조건 하에서 수행될 수 있다. 정적 접촉 전략의 예는, 경로 또는 다른 부위의 벽들의 구조 물질(construction material), 예를 들면, 중합체성 물질, 및/또는 이러한 구조 물질로부터 침출될 수 있는 임의의 물질에 대한 세포의 민감성에 대해 시험하는 경우 발견될 수 있다. 세포 제제와 상기 경로 또는 다른 부위와의 유동 접촉의 예는 상기 직전에 언급된 것들뿐만 아니라, 최종적으로 경로로부터 환자에게 전달되는 세포의 수 또는 용량에 영향을 미치는 바와 같은 유동 조건 하에 세포가 상기 경로 벽 또는 다른 벽에 부착하거나 그렇지 않으면 장치 부위에 미접착된 상태를 유지하는 경향성에 대해 시험하는 것도 포함한다. 유동 조건이 사용되는 경우, 최악의 사례의 시험이 수행될 수 있다. 이것은, 상기 전달 경로 또는 다른 장치 부위의 사용에서 임상적으로 사용될 수 있는 최저 예측 유속인 유속에서 최악의 사례의 느린-유동 시험을 포함할 수 있다. 경로 벽 또는 다른 부위 벽에 부착하는 경향이 있을 수 있는 세포에 대해, 이것은 의학적 장치의 경로 또는 다른 부위로부터 방출된 세포 용량과 관련된 시험으로 도입될 수 있다. 최악의 사례의 높은-유동 시험은 상기 경로 또는 부위의 임상적 사용 동안에 적용될 것으로 예측되는 최대 유속에서 또는 이를 초과하는 유속에서 수행될 수 있다. 세포는 전단력 및 높은 유속 동안에 생성될 수 있는 다른 힘에 민감할 수 있기 때문에, 상기 최악의 사례 시험은, 예를 들면, 상기 경로 또는 다른 부위로부터 일단 방출된 세포의 수행능 특성에 대한 전달 경로 또는 다른 장치 부위의 임의의 영향에 대한 시험에서 사용될 수 있다.
상기 주지된 바와 같이, 시험되는 전달 경로 또는 다른 부위는, 단일 장치, 또는 어셈블리 형태로 제공되는 장치의 조합으로부터 정의될 수 있다. 상기 어셈블리에서, 장치들 각각에서 루멘 또는 통로 또는 부위는 전형적으로 서로 유동적으로 커플링되어 전체 루멘 또는 통로 또는 부위를 형성할 것이다. 상기 전체 통로 또는 부위들의 물리적 파라미터는 각각의 커플링된 장치의 각각의 개별 통로 및 커플링을 위한 부위들 및 임의의 갭, 레지(ledge), 직경의 변화, 또는 장치들의 커플링 부위에서 발생하는 다른 물리적 변화에 의해 결정된다. 커플링 부위에서의 이들 잠재적인 불규칙성은, 예를 들면, 경로 또는 부위 표면에서 불규칙한 부분 내에 포집되거나 부착됨에 의해, 예상되는 전달 조건 하에서도 경로 또는 다른 부위 내에 세포가 보유되는 경향에 영향을 미칠 수 있고, 또한, 세포가 노출되는 유동 조건에 영향을 미칠 수 있다. 소정 실시형태에서, 상기 경로 또는 다른 부위는, 시린지 배럴, 카테터 및 니들 중 2개 이상, 및 잠재적으로 모든 3개의 상기 부품들을 포함하는 어셈블리에 의해 정의된다. 여전히 다른 전달 장치 또는 장치 부품들은 단독으로 또는 어셈블리로 사용될 수 있음이 이해될 것이다. 추가로, 소정 실시형태에서, 장치 또는 장치의 어셈블리에 의해 정의된 전달 경로 또는 다른 부위는, 임상적 사용 동안에 예상되는 방식으로 조작될 수 있다. 상기 조작은, 예를 들면, 다른 장치, 예를 들면, 예상된 형태, 예를 들면, 임상적 사용 동안에 예측되는 구불구불한 형태로 전달 경로를 물리적으로 위치시키는 가이드 와이어(guide wire)와의 접촉, 또는 임상적 사용 동안에 예상되는 물질 또는 배지로의 경로 또는 다른 부위의 노출, 예를 들면, 시험 세포와 경로 또는 다른 경로의 접촉 전에 환자에서 사용될 것으로 예상되는 생물학적 부재로 상기 전달 경로를 상태조정(condition)하기 위한 혈액 또는 혈액 분획물에의 노출을 포함할 수 있다.
상기 전달 경로 또는 다른 부위 시험은 착수된 시험 동안 적합한 온도에서 수행될 것이다. 상기 경로 또는 다른 부위는, 상기 경로 또는 다른 부위와의 시험을 위해 개발될 샘플의 접촉 동안에 냉각되거나, 가열되거나, 실온(예를 들면, 약 22 내지 25℃)으로 유지될 수 있다. 세포 제제가 상기 샘플에 포함되는 경우, 일부 시험은, 약 생리학적 온도(약 37℃)에서 그리고/또는 적합한 접촉 시간, 예를 들면, 약 10분 내지 5시간, 또는 약 30분 내지 약 3시간 동안 접촉 단계에 착수할 것이다. 예를 들면, 인큐베이터 또는 수욕을 포함하는 전달 경로 또는 다른 부위를 상기 온도로 가열하기 위한 임의의 적합한 배열이 사용될 수 있다. 다른 샘플 접촉을 위해, 예를 들면, 샘플을 생성하는 세포의 부재 하에 생리학적 온도보다 더 낮은 온도, 예를 들면, 실온 또는 냉온이 때때로 사용될 수 있다.
상기 개시된 바와 같이, 본 발명의 양상들은, 환자에게 세포를 전달하기 위해 사용될 수 있는 의학적 전달 장치(예를 들면, 개별 부재 또는 어셈블리로서)의 전달 경로를 시험하고/하거나, 세포가, 예를 들면, 접촉에 의해 또는 인접한 체류에 의해 노출되는 의학적 장치의 다른 부위 또는 표면을 시험하기 위한 방법 및 시스템에 관한 것이다. 소정 실시형태에서, 시험 세포는, 잠재적으로 항온배양 기간에 걸쳐, 의학적 장치의 루멘의 벽 또는 다른 표면 및/또는 의학적 장치의 루멘의 벽 또는 다른 표면과 접촉된 액체 배지와 접촉시킨다. 이어서, 상기 시험 세포는, 시험 세포의 하나 이상의 특성, 그리고, 바람직하게는 다중 특성에 대한 벽 또는 다른 표면 접촉 또는 액체 배지 접촉의 효과에 대해 평가한다. 상기 효과는, 몇몇 실시형태에서, 면역 반응, 대사 활성, 생존능, 세포독성 반응, 증식 및/또는 이동과 관련될 수 있다. 기술된 바와 같은 방법 및 시스템은, 예를 들면, 제품 디자인 또는 프로세스 입력, 제품 디자인 또는 프로세스 유효화 및/또는 장치 로트 출시 기준에 대한 세부 사항을 제공하면서 캐뉼러 삽입된(cannulated) 전달 장치 또는 다른 의학적 장치의 개발, 제조 및/또는 보급에 사용될 수 있다. 또한, 상기 방법 및 시스템에 따라 제조된 장치 또는 제품, 및 이를 보급하기 위한 방법이 기재된다.
세포의 부재 하에 샘플 체류 시간은 다양할 수 있다. 소정 실시형태에서, 상기 샘플 체류 시간은 적어도 약 30분, 적어도 약 1시간, 또는 적어도 약 2시간이고, 예를 들면, 약 30분 내지 약 48시간, 또는 약 1시간 내지 약 24시간, 또는 약 1시간 내지 약 5시간의 범위 내일 것이다. 몇몇 양상에서, 세포 부재 하에 상기 샘플 체류 시간은 약 10시간을 초과하고, 예를 들면, 약 10시간 내지 48시간 범위 내일 것이다. 상기 인큐베이팅 시간은 상기 전달 경로, 및 세포가 민감할 수 있는 상기 경로를 정의하는 벽에 의해 방출될 수 있는 임의의 불순물 또는 다른 침출 보조제로 상기 샘플을 상태조정하기에 충분할 수 있다. 세포-불포함 샘플을 상기 방식으로 상태조정한 후, 시험 세포와의 접촉 시험의 후속적인 사용을 위해 전달 경로부터 수집될 수 있다. 이와 관련하여, 상기 세포-불포함 샘플 또는 세포-함유 샘플에 대해서는 상기 논의되고, 상기 전달 경로로부터 수집된 샘플 용적은, 일부 양상에서 다중 분취물로 분리되고 동일하거나 상이한 성질을 갖는 다수의 시험에 사용될 수 있기에 충분히 대량일 수 있다.
상기 의학적 전달 장치 또는 다른 의학적 장치 부재(들)는 임의의 적합한 물질 또는 물질들의 배합물을 포함하도록 제조될 수 있다. 중합체성 물질 및 금속 물질이 전형적으로 상기 장치에 혼입된다. 적합한 중합체성 물질들로는, 예를 들면, 셀룰로스 아세테이트, 셀룰로스 니트레이트, 실리콘, 가교-링크된 폴리비닐 알콜(PVA), 폴리우레탄, 폴리아미드, 스티렌 이소부틸렌-스티렌 블록 공중합체(Kraton), 폴리에틸렌 테라프탈레이트, 폴리에스테르, 폴리오르토에스테르, 폴리무수물, 폴리에테르 설폰, 폴리카보네이트, 폴리프로필렌, 고분자량의 폴리에틸렌, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리에스테르, 폴리락트산 또는 폴리글리콜산 또는 이들의 공중합체, 폴리무수물, 폴리카프로락톤, 폴리하이드록시부티레이트 발레레이트, 또는 다른 생분해성 중합체, 또는 임의의 이들 동정된 중합체들 중 임의의 중합체들의 혼합물 또는 공중합체가 포함된다. 적합한 금속으로는 스테인레스강, 니티놀, MP35N, 금, 탄탈, 백금 또는 백금 이리듐, 니오븀, 텅스텐, 이코넬, 니켈, 티타늄, 스테인레스강/티타늄 복합물(composite), 코발트, 크로뮴, 코발트/크로뮴 합금, 마그네슘, 알루미늄, 또는 다른 생체 적합성 금속 및/또는 이의 복합물 또는 합금이 포함된다. 상기 의학적 장치 루멘 또는 다른 전달 경로의 벽은, 이들 또는 다른 적합한 물질들 중 어느 하나 또는 배합물을 포함할 수 있다.
본 발명의 양상에 따라, 샘플은 일부 방식으로 의학적 장치의 벽 또는 벽들, 예를 들면, 사용 동안에 세포 또는 세포 제제와 접촉할 것으로 예상되는 의학적 장치 전달 경로 또는 다른 의학적 장치 부위를 정의하는 벽 또는 벽들과 접촉함에 의한 시험을 위해 제조된다. 몇몇 실시형태에서, 상기 샘플 물질은 이것이 경로 또는 다른 의학적 장치 부위의 벽들과 접촉되므로 세포를 함유할 것이다. 상기 세포 제제와 상기 경로 또는 다른 의학적 장치 부위의 접촉은 임의의 적합한 항온배양 시간 동안 이루어질 수 있고, 몇몇 양상에서는 전달 경로 또는 다른 의학적 장치 부위의 전형적이거나 최악의 사례의 사용으로부터 예상되는 것보다 더 긴 항온배양 시간 동안 이루어질 것이다. 이것은 경로 또는 다른 부위를 시험하는데 있어서 안전성 인자를 도입하는 것을 보조할 수 있다. 상기 경로 또는 다른 부위의 벽들과 접촉된 샘플의 항온배양은, 정적(static) 조건, 유동 조건 또는 둘 다의 조건 하에서 수행될 수 있다. 정적 접촉 전략의 예는, 경로 또는 다른 부위의 벽들의 구조 물질(construction material), 예를 들면, 중합체성 물질, 및/또는 이러한 구조 물질로부터 침출될 수 있는 임의의 물질에 대한 세포의 민감성에 대해 시험하는 경우 발견될 수 있다. 세포 제제와 상기 경로 또는 다른 부위와의 유동 접촉의 예는 상기 직전에 언급된 것들뿐만 아니라, 최종적으로 경로로부터 환자에게 전달되는 세포의 수 또는 용량에 영향을 미치는 바와 같은 유동 조건 하에 세포가 상기 경로 벽 또는 다른 벽에 부착하거나 그렇지 않으면 장치 부위에 미접착된 상태를 유지하는 경향성에 대해 시험하는 것도 포함한다. 유동 조건이 사용되는 경우, 최악의 사례의 시험이 수행될 수 있다. 이것은, 상기 전달 경로 또는 다른 장치 부위의 사용에서 임상적으로 사용될 수 있는 최저 예측 유속인 유속에서 최악의 사례의 느린-유동 시험을 포함할 수 있다. 경로 벽 또는 다른 부위 벽에 부착하는 경향이 있을 수 있는 세포에 대해, 이것은 의학적 장치의 경로 또는 다른 부위로부터 방출된 세포 용량과 관련된 시험으로 도입될 수 있다. 최악의 사례의 높은-유동 시험은 상기 경로 또는 부위의 임상적 사용 동안에 적용될 것으로 예측되는 최대 유속에서 또는 이를 초과하는 유속에서 수행될 수 있다. 세포는 전단력 및 높은 유속 동안에 생성될 수 있는 다른 힘에 민감할 수 있기 때문에, 상기 최악의 사례 시험은, 예를 들면, 상기 경로 또는 다른 부위로부터 일단 방출된 세포의 수행능 특성에 대한 전달 경로 또는 다른 장치 부위의 임의의 영향에 대한 시험에서 사용될 수 있다.
상기 주지된 바와 같이, 시험되는 전달 경로 또는 다른 부위는, 단일 장치, 또는 어셈블리 형태로 제공되는 장치의 조합으로부터 정의될 수 있다. 상기 어셈블리에서, 장치들 각각에서 루멘 또는 통로 또는 부위는 전형적으로 서로 유동적으로 커플링되어 전체 루멘 또는 통로 또는 부위를 형성할 것이다. 상기 전체 통로 또는 부위들의 물리적 파라미터는 각각의 커플링된 장치의 각각의 개별 통로 및 커플링을 위한 부위들 및 임의의 갭, 레지(ledge), 직경의 변화, 또는 장치들의 커플링 부위에서 발생하는 다른 물리적 변화에 의해 결정된다. 커플링 부위에서의 이들 잠재적인 불규칙성은, 예를 들면, 경로 또는 부위 표면에서 불규칙한 부분 내에 포집되거나 부착됨에 의해, 예상되는 전달 조건 하에서도 경로 또는 다른 부위 내에 세포가 보유되는 경향에 영향을 미칠 수 있고, 또한, 세포가 노출되는 유동 조건에 영향을 미칠 수 있다. 소정 실시형태에서, 상기 경로 또는 다른 부위는, 시린지 배럴, 카테터 및 니들 중 2개 이상, 및 잠재적으로 모든 3개의 상기 부재들을 포함하는 어셈블리에 의해 정의된다. 여전히 다른 전달 장치 또는 장치 부재들은 단독으로 또는 어셈블리로 사용될 수 있음이 이해될 것이다. 추가로, 소정 실시형태에서, 장치 또는 장치의 어셈블리에 의해 정의된 전달 경로 또는 다른 부위는, 임상적 사용 동안에 예상되는 방식으로 조작될 수 있다. 상기 조작은, 예를 들면, 다른 장치, 예를 들면, 예상된 형태, 예를 들면, 임상적 사용 동안에 예측되는 구불구불한 형태로 전달 경로를 물리적으로 위치시키는 가이드 와이어(guide wire)와의 접촉, 또는 임상적 사용 동안에 예상되는 물질 또는 배지로의 경로 또는 다른 부위의 노출, 예를 들면, 시험 세포와 경로 또는 다른 경로의 접촉 전에 환자에서 사용될 것으로 예상되는 생물학적 부재로 상기 전달 경로를 상태조정(condition)하기 위한 혈액 또는 혈액 분획물에의 노출을 포함할 수 있다.
이제 도 1을 참조하여, 본 발명의 키트 제조 방법의 한 실시형태를 개시한다. 상기 방법에서, 제조된 로트(16)의 키트가 제조되어야만 한다. 이렇게 하기 위해, 전달 어셈블리의 제1 로트(12)의 제1 부품을 각각 전달 어셈블리의 로트(13) 및 로트(14)의 제2 및 제3 부품과 함께 제조한다. 샘플 부품들(12a 내지 12c)은 로트(12)로부터 취하고, 샘플 부품들(13a 내지 13c)은 로트(13)로부터 취하고, 샘플 부품들(14a 내지 14c)은 로트(14)로부터 취한다. 이들 샘플은 각각 다른 로트 유래의 샘플들 중 하나와 쌍을 이루어 샘플 전달 어셈블리(121314a, 121314b, 및 121314c)를 생성시킨다. 이들 각각의 샘플 어셈블리들은, 각각 나타낸 바와 같이 시험 A, 시험 B 및 시험 C에 적용한다. 이들 시험은, 예를 들면, 로트 16에서 제조된 키트에 대한 로트 출하 요건의 일부일 수 있다. 시험 A, 시험 B 및 시험 C는 본원에 기술된 바와 같은 세포-관련된 시험들 중 어느 하나 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 추가로, 개시된 바와 같은 시험 샘플 어셈블리 이외에도, 로트(12, 13 및 14) 유래의 개별 장치들을 단독으로 시험할 수 있다. 샘플 어셈블리(121314a 내지 c)가 결정 단계(15)에서와 같이 시험 a, b 및 c 각각을 통과하는 경우, 로트(12) 유래의 장치(12d 내지 l), 로트(13) 유래의 장치(13d 내지 l), 및 로트(14) 유래의 장치(14d 내지 l)은 팩키징(17)과 함께 보여지는 바와 같이 팩키징될 수 있고 임의로 최종적으로 멸균시킬 수 있다. 추가의 잠재적인 샘플링 단계에서, 키트 로트(16) 유래의 키트들의 샘플들을 취하고 개방하고 각각의 부품들을 조합하여 추가의 샘플 어셈블리들을 제조하고, 이를 본원에 기술된 이들 방법들 중 어느 하나 또는 이들의 조합을 사용하여 세포-관련된 시험에 적용할 수 있다. 그 후, 로트(16) 유래의 키트는 최종 사용자에게 보급을 위해 출하될 수 있다.
본 발명의 소정 실시형태에서, 세포 부재 하의 샘플은 전달 경로 또는 다른 장치 부위와 접촉된다. 상기 샘플은 세포 배양 배지로 구성될 수 있다. 상기 주지된 바와 같이, 샘플 접촉의 조건은 유동, 정적 또는 조합된 유동 및 정적 조건 하일 수 있다. 유리하게는, 세포의 부재 하에 시험하기 위한 샘플을 생성시키는데 있어서, 전달 경로 또는 다른 부위 내의 긴 체류 시간을 사용하여, 예를 들면, 시험 계획(regimen)에 충분한 안전성 인자를 제공할 수 있다.
세포의 부재 하에 샘플 체류 시간은 다양할 수 있다. 소정 실시형태에서, 상기 샘플 체류 시간은 적어도 약 30분, 적어도 약 1시간, 또는 적어도 약 2시간이고, 예를 들면, 약 30분 내지 약 48시간, 또는 약 1시간 내지 약 24시간, 또는 약 1시간 내지 약 5시간의 범위 내일 것이다. 몇몇 양상에서, 세포 부재 하에 상기 샘플 체류 시간은 약 10시간을 초과하고, 예를 들면, 약 10시간 내지 48시간 범위 내일 것이다. 상기 항온배양 시간은 상기 전달 경로, 및 세포가 민감할 수 있는 상기 경로를 정의하는 벽에 의해 방출될 수 있는 임의의 불순물 또는 다른 침출 보조제로 상기 샘플을 상태조정하기에 충분할 수 있다. 세포-불포함 샘플을 상기 방식으로 상태조정한 후, 시험 세포와의 접촉 시험의 후속적인 사용을 위해 전달 경로부터 수집될 수 있다. 이와 관련하여, 상기 세포-불포함 샘플 또는 세포-함유 샘플에 대해서는 상기 논의되고, 상기 전달 경로로부터 수집된 샘플 용적은, 일부 양상에서 다중 분취물로 분리되고 동일하거나 상이한 성질을 갖는 다수의 시험에 사용될 수 있기에 충분히 대량일 수 있다.
상기 논의된 바와 같이 생성된 샘플 또는 적합하게는 다른 샘플은, 상기 전달 경로가 세포에 대한 영향을 가질 수 있는지를 결정하기 위해 검정된다. 예를 들면, 대사 활성, 생존능, 운동성, 증식, 콜로니 형성, 또는 예를 들면, 선천적 또는 후천적 면역 영향을 포함하는 면역 영향을 포함하는 광범위한 세포 특성이 시험될 수 있다. 이들 특성 또는 다른 세포 특성에 대한 다양한 시험이 공지되어 있고 사용될 수 있다. 세포에 대한 영향의 검정은 본래 정성적 또는 정량적일 수 있고, 예를 들면, 단백질의 발현 또는 DNA 요소들의 전사에 대해 검정할 수 있다. 상기 발현 또는 전사 검정은 단백질 또는 DNA 요소 중 선택된 하나 또는 그룹에 대해 시험할 수 있거나, 일부 경우에 세포에 대한 전체 발현 또는 전사 프로필을 포함할 수 있다. 상기 검정은 온전한 세포(예를 들면, 형광 활성화된 세포 분류)를 사용할 수 있거나, 발현 또는 전사 시험에서 제조되는 것들과 같은 세포 추출물을 사용할 수 있다. 추가로, 용량 시험에서, 세포 계수 또는 추정는, 전달 경로를 통한 통과 동안에 경험된 세포 계수의 임의의 손실을 결정하기 위해 세포 제제를 전달 경로를 통해 통과시키기 전 또는 후에 제공될 수 있다.
이들 시험 또는 다른 결정 시험 각각은 전형적으로 당업계에 널리 공지된 바와 같은 적합한 대조군을 사용할 수 있고, 전형적으로 이를 사용할 것이다. 대조군은 양성 대조군, 음성 대조군 또는 무효(null) 대조군일 수 있다.
본원에 기술된 상기 시험 방법은 광범위한 장치 디자인, 개발 또는 제조 목적을 위해 사용될 수 있다. 도식적으로, 장치 디자인에서, 본원에 기재된 시험 중 하나 이상은 의도된 전달 장치에 대한 구조 파라미터의 물리적 및/또는 물질의 선택 및 시험에 사용될 수 있다. 이들 양상에서, 본원에 기술된 시험은 디자인 또는 유효성 입력으로서 사용될 수 있다. 또한, 장치 개발 동안에, 본원에 기술된 시험은, 디자인 입력, 또는 장치 또는 이에 대한 제조 프로세스에 대한 유효성에 대한 세부 사항으로서 사용될 수 있다. 또한 추가로, 본원에 기술된 바와 같은 시험은, 상업적 보급을 위한 장치의 제조 동안에 사용될 수 있다. 한 양상에서, 본원에 기술된 바와 같은 시험은 로트 출하(lot release) 기준으로서 사용될 수 있다. 상기 실시형태에서, 제조된 로트의 장치는 로트 출하 기준으로서 지정된 본원에 기술된 바와 같은 시험이 완료될 때까지 분리되고 격리될 수 있다. 시험 통과시 상기 장치는 보급을 위해 출하되어 최종 사용자에게 보급될 수 있다.
이제 도 1을 참조하여, 본 발명의 키트 제조 방법의 한 실시형태를 개시한다. 상기 방법에서, 제조된 로트(16)의 키트가 제조되어야만 한다. 이렇게 하기 위해, 전달 어셈블리의 제1 로트(12)의 제1 부재를 각각 전달 어셈블리의 로트(13) 및 로트(14)의 제2 및 제3 부재들과 함께 제조한다. 샘플 부재들(12a 내지 12c)은 로트(12)로부터 취하고, 샘플 부재들(13a 내지 13c)은 로트(13)로부터 취하고, 샘플 부재들(14a 내지 14c)은 로트(14)로부터 취한다. 이들 샘플은 각각 다른 로트 유래의 샘플들 중 하나와 쌍을 이루어 샘플 전달 어셈블리(121314a, 121314b, 및 121314c)를 생성시킨다. 이들 각각의 샘플 어셈블리들은, 각각 나타낸 바와 같이 시험 A, 시험 B 및 시험 C에 적용한다. 이들 시험은, 예를 들면, 로트 16에서 제조된 키트에 대한 로트 출하 요건의 일부일 수 있다. 시험 A, 시험 B 및 시험 C는 본원에 기술된 바와 같은 세포-관련된 시험들 중 어느 하나 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 추가로, 개시된 바와 같은 시험 샘플 어셈블리 이외에도, 로트(12, 13 및 14) 유래의 개별 장치들을 단독으로 시험할 수 있다. 샘플 어셈블리(121314a 내지 c)가 결정 단계(15)에서와 같이 시험 a, b 및 c 각각을 통과하는 경우, 로트(12) 유래의 장치(12d 내지 l), 로트(13) 유래의 장치(13d 내지 l), 및 로트(14) 유래의 장치(14d 내지 l)은 팩키징(17)과 함께 보여지는 바와 같이 팩키징될 수 있고 임의로 최종적으로 멸균시킬 수 있다. 추가의 잠재적인 샘플링 단계에서, 키트 로트(16) 유래의 키트들의 샘플들을 취하고 개방하고 각각의 부재들을 조합하여 추가의 샘플 어셈블리들을 제조하고, 이를 본원에 기술된 이들 방법들 중 어느 하나 또는 이들의 조합을 사용하여 세포-관련된 시험에 적용할 수 있다. 그 후, 로트(16) 유래의 키트는 최종 사용자에게 보급을 위해 출하될 수 있다.
소정 실시형태에서, 의학적 전달 장치 전달 경로 또는 다른 의학적 장치 부위는, 본원에 기재된 바와 같이 단일 부품 또는 어셈블리일 수 있고, 다수의 상이한 세포 유형 또는 제제, 예를 들면, 본원에 개시된 임의의 것들, 예를 들면, 2개 이상 또는 3개 이상의 상이한 세포 유형 또는 제제의 존재 하에 시험될 것이다. 추가로, 각각의 상이한 세포 유형 또는 세포 제제 유형에 대하여, 세포, 예를 들면, 본원에 개시된 임의의 것들의 다중 특성(예를 들면, 2개 이상 또는 3개 이상의 특성들)에 대한 의학적 전달 장치 전달 경로 또는 다른 의학적 장치 부위의 영향이 시험될 수 있다.
또한, 본원에서 동정된 임의의 세포들의 혼합물 또는 다른 혼합물들이 사용될 수 있다. 소정 실시형태에서, 천연-발생 세포 혼합물, 또는 이의 분획물이 사용된다. 이들 실시형태의 실시예는 말초 혈액 또는 이의 분획물, 골수 또는 이의 분획물, 및 제대혈 또는 이의 분획물 등을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 세포는 내피 선조 세포(EPC)이거나 이를 포함한다. 본 발명에 사용하기에 바람직한 EPC는 내피 콜로니 형성 세포(ECFC), 특히, 높은 증식 잠재력을 갖는 ECFC이다. 적합한 상기 세포는, 예를 들면, 2005년 2월 9일자로 출원된 미국 특허출원 일련 번호 제11/055,182호를 공개하는 2005년 12월 1일에 공개된 미국 특허출원 공개 번호 제20050266556호, 및 2007년 8월 13일자로 출원된 미국 특허출원 제11/837,999호를 공개하는 2008년 1월 1일자로 공개된 미국 특허출원 공개 번호 제20080025956호에 기술되어 있고, 이들 문헌 각각은 이의 전문이 본원에 인용에 의해 포함된다. 상기 ECFC 세포는 클론 집단일 수 있고/있거나, 사람 또는 다른 동물의 제대혈로부터 수득할 수 있다. 추가로 또는 대안으로, 상기 내피 콜로니 형성 세포는 하기의 특성들을 갖는다: (a) 세포 표면 항원 CD31, CD105, CD146, 및 CD144를 발현하고/하거나; (b) CD45 및 CD14를 발현하지 않고/않거나; (c) 아세틸화된 LDL을 섭취하고/하거나; (d) 단일 세포로부터 분주되는(planted) 경우 2000개 이상의 세포의 적어도 2차 콜로니를 다시 만들고/만들거나; (e) HeLa 세포에 의해 발현되는 것의 적어도 34%의 높은 수준의 텔로머라제를 발현하고/하거나; (f) 0.8 초과의 핵 대 세포질 비율을 나타내고/내거나; (g) 약 22마이크론 미만의 세포 직경을 갖는다. 이들 특징 (a) 내지 (g) 중 일부 또는 전부의 임의의 조합은, 본 발명에 사용되는 ECFC를 특성확인할 수 있다.
다른 실시형태에서, 세포는 근육 유도된 근원세포 및/또는 근육 유도된 줄기 세포를 포함하는 근육 유도된 세포이거나 이를 포함한다. 이들을 수득하기 위한 적합한 상기 줄기 세포 및 방법은, 예를 들면, 미국 특허 제6,866,842호 및 미국 특허 제7,155,417호에 기술되어 있고, 이들 각각은 이의 전문이 본원에 인용에 의해 포함된다. 상기 근육 유도된 세포는 데스민, M-카드헤린, MyoD, 미오게닌, CD34, 및/또는 Bcl-2를 발현할 수 있고, CD45 또는 c-Kit 세포 마커의 발현이 결여될 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 상기 세포는, 지방 조직으로부터 유도된 줄기 세포이거나 이를 포함한다. 적합한 상기 세포 및 이들을 수득하기 위한 방법은, 예를 들면 미국 특허 제6,777,231호 및 미국 특허 제7,595,043호에 기술되어 있고, 이의 각각은 전문이 본원에 인용에 의해 포함된다. 상기 세포 집단은, 또한, 때때로 기질 혈관 분획 세포로서 언급되는 지방-유도된 줄기 및 재생 세포를 포함할 수 있고, 상기 세포는 성인-유도될 수 있는, 줄기 세포, 내피 선조 세포, 백혈구, 내피 세포, 및 혈관 평활근 세포를 포함하는 혼합된 집단일 수 있다. 소정 형태에서, 상기 세포는, 골 세포, 연골 세포, 신경 세포, 또는 근육 세포 중 2개 이상으로 분화할 수 있는 지방-유도된 세포를 포함할 수 있다.
시험에 사용될 세포는 유전학적으로 변형되지 않거나 유전학적으로 변형된 세포일 수 있다. 유전학적으로 변형된 세포는, 목적하는 단백질 또는 다른 물질을 암호화하는 발현가능하는 DNA를 함유하도록 변형된 세포를 포함할 수 있다. 이어서, 상기 세포는, 상기 세포 전달 통로가, 목적하는 단백질 또는 다른 물질의 발현에 대한 임의의 영향(예를 들면, 억제 또는 활성화를 포함)을 갖는지를 결정하기 위한 시험에 사용될 수 있다. 설명적으로, 세포는 면역 반응에 관여하는 단백질 또는 다른 물질, 예를 들면, 톨형(toll-like) 수용체(TLR), 예를 들면, TLR-2, TLR-4, 또는 TLR-7을 암호화하는 외인성 DNA를 함유하도록 형질감염 또는 다른 방법에 의해 유전학적으로 변형될 수 있다. 이어서, 이들 TLR-변형된 세포는, 상기 전달 통로가 세포에 의한 TLR 발현에 대한 효과를 갖는지를 결정하기 위해 본원에 기술된 바와 같은 시험에 사용될 수 있다.
소정 실시형태에서, 의학적 전달 장치 전달 경로 또는 다른 의학적 장치 부위는, 본원에 기재된 바와 같이 단일 부재 또는 어셈블리일 수 있고, 다수의 상이한 세포 유형 또는 제제, 예를 들면, 본원에 개시된 임의의 것들, 예를 들면, 2개 이상 또는 3개 이상의 상이한 세포 유형 또는 제제의 존재 하에 시험될 것이다. 추가로, 각각의 상이한 세포 유형 또는 세포 제제 유형에 대하여, 세포, 예를 들면, 본원에 개시된 임의의 것들의 다중 특성(예를 들면, 2개 이상 또는 3개 이상의 특성들)에 대한 의학적 전달 장치 전달 경로 또는 다른 의학적 장치 부위의 영향이 시험될 수 있다.
본 발명의 양상들을 추가로 이해하는 것을 촉진시킬 목적으로, 하기의 실시예가 제공된다. 이들 실시예는 본래 설명을 위한 것이고 제한하고자 하는 것이 아닌 것으로 이해될 것이다.
실시예 1
선천적 면역 반응 검정
본 실시예는, 카테터 루멘의 세포성 선천적 면역 반응에 대한 이들의 영향을 평가하기 위한 세포 기반 검정을 기술한다. 구체적으로, 본원에서, TLR2 및 TLR4를 발현하는 유전학적으로 변형된 세포를 사용하여 세포 내에서 TLR2 또는 TLR4 발현을 활성화하거나 억제하는 이들의 잠재력에 대한 카테터 루멘을 평가하였다.
시험 배지: HEK-293 세포 배양 배지는 실온(20 내지 22℃)에서 16시간 동안 35 LP 카테터 및 다른 시험 물질과 접촉된 상태로 인큐베이팅하였다. LOT 1로 지정된 제1 장치 로트로부터 취한 35LP 카테터에 대해, 상기 가이드 와이어 루멘은 인큐베이팅 기간 동안 대략 1mL의 배양 배지 용적으로 완전히 채웠다. 다른 샘플에 대해, 상기 용적은 구리(2ml) 및 PVC(1.2ml) 튜브의 내부 직경 및 길이로 인해 다양하였지만, 상기 인큐베이팅 시간 및 온도는 동일하게 유지시켰다(인큐베이팅 프로세스를 기술한다). 인큐베이팅 기간 후, 배양 배지의 상태조정된 샘플은 FACS 튜브에 수집하였고 세포 검정에서 즉각적 사용을 위한 것이었다.
세포 배양: HEK-293, TLR-2 형질감염된 세포는 40,000세포/웰의 농도로 플레이팅하였고, 한편, 상기 TLR4 형질감염된 세포는 별도의 96웰 플레이트에 10,000세포/웰의 농도로 플레이팅하였다. 특정 배지 보충물은 문헌[the cell line vendor's literature]에 의해 지시된 바와 같이 각각의 세포주에 첨가하였다. 모든 세포독성 지표 세포(indicator cell)는 세포 배양 인큐베이터(5% CO2, 37℃)에서 24시간 동안 인큐베이팅하였다. 상기 인큐베이팅 기간 후, 상기 세포 배양 배지를 제거하고 장치-노출된-배지로 대체하였다. 정상적인 세포 배양 배지는 음성 대조군으로서 사용하였다. Pam3CSK4(1Ong) 및 LPS(100ug)는 각각 TLR2 및 TLR4 형질감염된 세포에 대한 양성 대조군으로서 사용하였다.
NFkb 활성화/억제 검정: 장치 또는 양성 대조군 변형된 세포 배양 배지에서 24시간 인큐베이팅 기간 후, 세포 배양 상청액의 15μL의 분취액을, 185μL/웰 용적의 퀵-블루(Quick-Blue) 현상제 기질을 함유하는 96웰 미세역가 플레이트에 첨가하였다. 상기 기질을 사용하여 분비된 배아 알칼리성 포스파타제(SEAP) 효소 활성의 수준을 정량한다. TLR 세포주는 장치로부터 침출된 오염물과 TLR 수용체의 상호작용 결과로서 발생하는 TLR 연관된 신호 전달의 양에 의존하여 다양한 수준으로 배아 AP 효소 형태를 분비한다. TLR 유형 수용체의 표면 자극에 의한 AP-1 및 NF-kB 단백질 둘 다의 활성화는, SEAP 리포터 유전자의 전사를 조절하는 프로모터 부위 상의 이들의 특이적 결합 부위에 결합하는 AP-1 및 NF-kB를 유도한다. 이것은 SEAP 효소의 생산 및 이의 세포 배양 배지로의 수송 증가를 유도한다.
AP 기질 전개 반응은 CO2 인큐베이터에서 37℃에서 3시간 동안 진행하도록 하였다. AP 관련된 기질 발색의 존재는 OD655에서 흡광도를 판독하도록 설정된 분자 장치 스펙트라 맥스 250 비색 플레이트 판독기 세트(Molecular Devices Spectra Max 250 colorimetric plate reader set)를 사용하여 평가하였다. 상기 초기 15μL의 세포 배양 상청액을 TLR 세포 배양물로부터 제거한 후, 상기 세포 배양 플레이트는 추가의 24시간 동안 인큐베이터로 복귀시켜 본 발명자가 또한 48시간 시점을 확보하도록 하였다. 상기 시점에서, 세포 배양 상청액의 다른 15μL의 분취액을 각각의 TLR 세포 배양물로부터 제거하였고, 185μL/웰의 퀵-블루 AP 현상제 기질을 함유하는 다른 96웰 미세역가 플레이트에 첨가하였다. 상기 기질 반응은 후속적으로 CO2 인큐베이터에서 37℃에서 3시간 동안 인큐베이팅하였다. 상기 퀵-블루 AP 현상제 기질은 분자 장치 스펙트라 맥스 250 비색 판독기 상에서 OD650에서 다시 판독하여 SEAP 생성의 상대적 수준을 정량하였다. 또한, SEAP 리포터 효소 분비 수준은, 침출된 장치-튜빙 오염물에 의한 TLR 유형 수용체 자극 정도와 상호 관련되어 있다. 상기 결과는 도 1 및 도 2(TLR2 시험) 및 도 3 및 도 4(TLR4 시험)에 나타낸다. 각각 평균 계산된 개별 복제물 값을 보여주는 도 1 및 도 2에 나타낸 바와 같이, TLR2는 음성 대조군(RPMI)에 비해 양성 대조군(PAM3CSK4)에서 활성화되었다. 시험 제품에서, 구리-, PVC- 및 35LP-상태조정된 배지 샘플 모두는 음성 대조군에 비해 TLR2를 억제하였고, 35LP-상태조정된 샘플은 구리 및 PVC보다 더 낮은 수준으로 억제한다.
양성 대조군으로서 사용된 다른 시험 물질은 구리 및 PVC의 튜빙이었다. 사용된 구리 튜빙은 1/8" 두께였고, 연질 냉장 튜빙은 제조원[Kleindorfer's Hardware Store in Bloomington IN (제조자: Cambridge-Lee Industries, Inc., Manufacturers Notice: Cleaned per ASTM B280 and NFPA 99)]으로부터 구입하였다. 상기 PVC 튜빙은 제조원[Cook Polymer Technology (Material Compound # 11011, Cook Polymer Project # D-4520, Year Extruded: 2000)]에 의해 제조된 8.0 FR 화이트(White)였다. DMEM(음성 대조군)은 제조원(Invivogen)으로부터 수득하였고, PAM3CSK4(양성 대조군)는 제조원(Imgenex)으로부터 수득하였다.
방법
시험 배지: HEK-293 세포 배양 배지는 실온(20 내지 22℃)에서 16시간 동안 35 LP 카테터 및 다른 시험 물질과 접촉된 상태로 항온배양하였다. LOT 1로 지정된 제1 장치 로트로부터 취한 35LP 카테터에 대해, 상기 가이드 와이어 루멘은 항온배양 기간 동안 대략 1mL의 배양 배지 용적으로 완전히 채웠다. 다른 샘플에 대해, 상기 용적은 구리(2ml) 및 PVC(1.2ml) 튜브의 내부 직경 및 길이로 인해 다양하였지만, 상기 항온배양 시간 및 온도는 동일하게 유지시켰다(항온배양 프로세스를 기술한다). 항온배양 기간 후, 배양 배지의 상태조정된 샘플은 FACS 튜브에 수집하였고 세포 검정에서 즉각적 사용을 위한 것이었다.
세포 배양: HEK-293, TLR-2 형질감염된 세포는 40,000세포/웰의 농도로 플레이팅하였고, 한편, 상기 TLR4 형질감염된 세포는 별도의 96웰 플레이트에 10,000세포/웰의 농도로 플레이팅하였다. 특정 배지 보충물은 문헌[the cell line vendor's literature]에 의해 지시된 바와 같이 각각의 세포주에 첨가하였다. 모든 세포독성 지표 세포(indicator cell)는 세포 배양 항온배양기(5% CO2, 37℃)에서 24시간 동안 항온배양하였다. 상기 항온배양 기간 후, 상기 세포 배양 배지를 제거하고 장치-노출된-배지로 대체하였다. 정상적인 세포 배양 배지는 음성 대조군으로서 사용하였다. Pam3CSK4(1Ong) 및 LPS(100ug)는 각각 TLR2 및 TLR4 형질감염된 세포에 대한 양성 대조군으로서 사용하였다.
NFkb 활성화/억제 검정: 장치 또는 양성 대조군 변형된 세포 배양 배지에서 24시간 항온배양 기간 후, 세포 배양 상청액의 15μL의 분취액을, 185μL/웰 용적의 퀵-블루(Quick-Blue) 현상제 기질을 함유하는 96웰 미세역가 플레이트에 첨가하였다. 상기 기질을 사용하여 분비된 배아 알칼리성 포스파타제(SEAP) 효소 활성의 수준을 정량한다. TLR 세포주는 장치로부터 침출된 오염물과 TLR 수용체의 상호작용 결과로서 발생하는 TLR 연관된 신호 전달의 양에 의존하여 다양한 수준으로 배아 AP 효소 형태를 분비한다. TLR 유형 수용체의 표면 자극에 의한 AP-1 및 NF-kB 단백질 둘 다의 활성화는, SEAP 리포터 유전자의 전사를 조절하는 프로모터 부위 상의 이들의 특이적 결합 부위에 결합하는 AP-1 및 NF-kB를 유도한다. 이것은 SEAP 효소의 생산 및 이의 세포 배양 배지로의 수송 증가를 유도한다.
AP 기질 전개 반응은 CO2 항온배양기에서 37℃에서 3시간 동안 진행하도록 하였다. AP 관련된 기질 발색의 존재는 OD655에서 흡광도를 판독하도록 설정된 분자 장치 스펙트라 맥스 250 비색 플레이트 판독기 세트(Molecular Devices Spectra Max 250 colorimetric plate reader set)를 사용하여 평가하였다. 상기 초기 15μL의 세포 배양 상청액을 TLR 세포 배양물로부터 제거한 후, 상기 세포 배양 플레이트는 추가의 24시간 동안 항온배양기로 복귀시켜 본 발명자가 또한 48시간 시점을 확보하도록 하였다. 상기 시점에서, 세포 배양 상청액의 다른 15μL의 분취액을 각각의 TLR 세포 배양물로부터 제거하였고, 185μL/웰의 퀵-블루 AP 현상제 기질을 함유하는 다른 96웰 미세역가 플레이트에 첨가하였다. 상기 기질 반응은 후속적으로 CO2 항온배양기에서 37℃에서 3시간 동안 항온배양하였다. 상기 퀵-블루 AP 현상제 기질은 분자 장치 스펙트라 맥스 250 비색 판독기 상에서 OD650에서 다시 판독하여 SEAP 생성의 상대적 수준을 정량하였다. 또한, SEAP 리포터 효소 분비 수준은, 침출된 장치-튜빙 오염물에 의한 TLR 유형 수용체 자극 정도와 상호 관련되어 있다. 상기 결과는 도 1 및 도 2(TLR2 시험) 및 도 3 및 도 4(TLR4 시험)에 나타낸다. 각각 평균 계산된 개별 복제물 값을 보여주는 도 1 및 도 2에 나타낸 바와 같이, TLR2는 음성 대조군(RPMI)에 비해 양성 대조군(PAM3CSK4)에서 활성화되었다. 시험 제품에서, 구리-, PVC- 및 35LP-상태조정된 배지 샘플 모두는 음성 대조군에 비해 TLR2를 억제하였고, 35LP-상태조정된 샘플은 구리 및 PVC보다 더 낮은 수준으로 억제한다.
도 3 및 도 4에 나타낸 TLR4에 대한 결과는 TLR2의 결과와 유사하였다. TLR4는 음성 대조군(RPMI)에 비해 양성 대조군(LPS)에서 활성화되었다. 시험 제품에서, 구리-, PVC- 및 35LP-상태조정된 배지 샘플 모두는 음성 대조군에 비해 TLR4를 억제하였고, 35LP-상태조정된 샘플은 구리 및 PVC 보다 낮은 수준으로 억제한다.
실시예 2
대사 활성 및 세포독성 검정
본 실시예는, 세포의 대사 활성에 대한 카테터 루멘의 효과 또는 세포에 대한 잠재적 세포독성에 관한 평가를 위한 세포 기반 검정을 기재한다. 구체적으로, 본원에서 이들 목적을 위해 U937 세포를 사용하였다.
시험 배지: 대략적으로 1mL의 U937 세포 배양 배지는, 사람 생리학적 온도(37℃)에서 48시간 동안 35 LP 카테터 및 다른 라텍스(양성 대조군)과 접촉된 상태로 인큐베이팅하였다. 상기 35 LP 카테터에 대해, 각각의 카테터의 상기 가이드 와이어 루멘은, 약 1ml의 배양 배지 용적을 상기 루멘에 주입함으로써 완전히 채워졌고, 그 후, 상기 루멘은 각각의 말단에 파라핀으로 고정시켰고, 상기 카테터는 48시간 동안 37℃ 인큐베이터에서 인큐베이팅하였다. 상기 인큐베이팅 기간 후, 배양 배지의 상태조정된 샘플은 대사 활성 및 세포독성 검정에 즉각적으로 사용하기 위해 15ml의 원뿔 튜브에 수집하였다.
초기 세포 배양: U937 세포는 대략 mL당 5 X 105세포로 T75 세포 배양 플라스크에서 계대 7 또는 8로 배양하였다. 세포를 50ml의 원뿔 튜브로 흡인시킨 후 이들을 실온에서 5분 동안 300 x g에서 원심분리하였다. 이후, 상기 상청액을 제거하였고, 펠렛을 신선한 배지에 재현탁시켜 1 x 106세포/ml의 세포 농도를 제공하였다. 1 x 106세포를 제공한 분취액을, 캡이 구비된 12 x 75mm 폴리스티렌 튜브로 흡인하였고, 상기 튜브는 실온에서 5분 동안 300xg로 원심분리하였다. 상기 배지는 원심분리 후 흡인하였고, 튜브는, 펠렛을 풀기 위해 랙에 세웠다. 1mL의 장치 노출되거나 라텍스 튜브 노출된 처리 배지를 이들의 각각의 튜브 내의 펠렛에 첨가하였고, 반면, 미처리된 배지는 대조군 튜브, 및 스타우로스포린에 대한 튜브에 첨가하였다. 이어서, 상기 세포는 약 5시간의 인큐베이팅 기간 동안 24웰 플레이트에 이동시키고, 이후 2개의 상이한 검정을 수행하였다.
프레스토 블루 검정: 상기 프레스토 블루 검정(대사 활성)은 스타우로스포린을 이의 웰에 첨가한 후 5시간째에 판독되도록 설정하였다. 상기 대조군 웰 유래의 세포를 사용하여 세포 배양 배지와 함께 표준 곡선을 작성하였다: 단독의 배지(블랭크); 31,300; 62,500; 125,000; 250,000 및 500,000개 세포들. 90㎕의 각각의 표준 및 처리 그룹은 96웰 플레이트에 3중으로 위치시킴에 이어서, 10㎕의 프레스토 블루 시약을 모든 웰에 첨가하였다. 상기 플레이트를 덮고 30분 동안 37℃ 인큐베이터에 위치시켰다. 상기 플레이트는 상기 인큐베이팅 후 형광 플레이트 판독기상에서 판독하였다.
세포 생존능/세포독성 검정: 각각의 처리 웰로부터의 200㎕의 세포를, 캡이 구비된 12 x 75mm 폴리스티렌 튜브에 2회 피펫팅하였다. FAM-FLICA 아폽토시스 검출 프로브는 DMSO로 희석하여 150 x 스톡 농축 용액이 되게 하였다. 사용 전에, 1:7.5 희석물을 준비하여 20 x 작용 용액(working solution)을 제조하였다. 약 10㎕의 상기 작용 용액은, 염색되지 않은 세포를 제외한 각각의 튜브에 첨가하였고, 이후 상기 튜브는 37℃에서 45분 동안 인큐베이팅하기 위해 방치하였다. PBS 용액 중의 2mL의 1% BSA를, 인큐베이팅 기간 후 염색되지 않은 것을 포함하는 각각의 튜브에 첨가하였다. 이어서, 상기 튜브는 실온에서 5분 동안 300xg로 원심분리하였다. 이어서, 배지를 흡인시켰고, 상기 튜브는, 펠렛을 풀기 위해 랙에 세웠다. 상기 단계는 2회 세척 동안 반복하였다. PBS 용액 중의 최종 200㎕의 1% BSA를, 염색되지 않은 것을 포함하는 각각의 튜브에 첨가하고, 판독 전에 빙상에 놓았다.
라텍스 튜빙(양성 대조군)은 상업적으로 수득하였다.
방법
시험 배지: 대략적으로 1mL의 U937 세포 배양 배지는, 사람 생리학적 온도(37℃)에서 48시간 동안 35 LP 카테터 및 다른 라텍스(양성 대조군)과 접촉된 상태로 항온배양하였다. 상기 35 LP 카테터에 대해, 각각의 카테터의 상기 가이드 와이어 루멘은, 약 1ml의 배양 배지 용적을 상기 루멘에 주입함으로써 완전히 채워졌고, 그 후, 상기 루멘은 각각의 말단에 파라핀으로 고정시켰고, 상기 카테터는 48시간 동안 37℃ 항온배양기에서 항온배양하였다. 상기 항온배양 기간 후, 배양 배지의 상태조정된 샘플은 대사 활성 및 세포독성 검정에 즉각적으로 사용하기 위해 15ml의 원뿔 튜브에 수집하였다.
초기 세포 배양: U937 세포는 대략 mL당 5 X 105세포로 T75 세포 배양 플라스크에서 계대 7 또는 8로 배양하였다. 세포를 50ml의 원뿔 튜브로 흡인시킨 후 이들을 실온에서 5분 동안 300 x g에서 원심분리하였다. 이후, 상기 상청액을 제거하였고, 펠렛을 신선한 배지에 재현탁시켜 1 x 106세포/ml의 세포 농도를 제공하였다. 1 x 106세포를 제공한 분취액을, 캡이 구비된 12 x 75mm 폴리스티렌 튜브로 흡인하였고, 상기 튜브는 실온에서 5분 동안 300xg로 원심분리하였다. 상기 배지는 원심분리 후 흡인하였고, 튜브는, 펠렛을 풀기 위해 랙에 세웠다. 1mL의 장치 노출되거나 라텍스 튜브 노출된 처리 배지를 이들의 각각의 튜브 내의 펠렛에 첨가하였고, 반면, 미처리된 배지는 대조군 튜브, 및 스타우로스포린에 대한 튜브에 첨가하였다. 이어서, 상기 세포는 약 5시간의 항온배양 기간 동안 24웰 플레이트에 이동시키고, 이후 2개의 상이한 검정을 수행하였다.
프레스토 블루 검정: 상기 프레스토 블루 검정(대사 활성)은 스타우로스포린을 이의 웰에 첨가한 후 5시간째에 판독되도록 설정하였다. 상기 대조군 웰 유래의 세포를 사용하여 세포 배양 배지와 함께 표준 곡선을 작성하였다: 단독의 배지(블랭크); 31,300; 62,500; 125,000; 250,000 및 500,000개 세포들. 90㎕의 각각의 표준 및 처리 그룹은 96웰 플레이트에 3중으로 위치시킴에 이어서, 10㎕의 프레스토 블루 시약을 모든 웰에 첨가하였다. 상기 플레이트를 덮고 30분 동안 37℃ 항온배양기에 위치시켰다. 상기 플레이트는 상기 항온배양 후 형광 플레이트 판독기상에서 판독하였다.
세포 생존능 /세포독성 검정: 각각의 처리 웰로부터의 200㎕의 세포를, 캡이 구비된 12 x 75mm 폴리스티렌 튜브에 2회 피펫팅하였다. FAM-FLICA 아폽토시스 검출 프로브는 DMSO로 희석하여 150 x 스톡 농축 용액이 되게 하였다. 사용 전에, 1:7.5 희석물을 준비하여 20 x 작용 용액(working solution)을 제조하였다. 약 10㎕의 상기 작용 용액은, 염색되지 않은 세포를 제외한 각각의 튜브에 첨가하였고, 이후 상기 튜브는 37℃에서 45분 동안 항온배양하기 위해 방치하였다. PBS 용액 중의 2mL의 1% BSA를, 항온배양 기간 후 염색되지 않은 것을 포함하는 각각의 튜브에 첨가하였다. 이어서, 상기 튜브는 실온에서 5분 동안 300xg로 원심분리하였다. 이어서, 배지를 흡인시켰고, 상기 튜브는, 펠렛을 풀기 위해 랙에 세웠다. 상기 단계는 2회 세척 동안 반복하였다. PBS 용액 중의 최종 200㎕의 1% BSA를, 염색되지 않은 것을 포함하는 각각의 튜브에 첨가하고, 판독 전에 빙상에 놓았다.
상기 결과는, 수행된 분석 및 이의 변형이 세포의 대사 활성에 대한 카테터 루멘의 효과를 평가하거나 선택된 수용 표준과 상대적인 세포에 대한 잠재적인 세포독성을 평가하는데 적합한지를 입증하는 도 6(대사 활성) 및 도 7(세포 독성)에 나타낸다.
발명을 기술하는 문단(특히 하기 특허청구범위의 문단)에서 용어 "한", "하나의" 및 "상기"(관사 "a", "an" 및 'the"), 및 이의 유사한 언급의 사용은, 달리 본원에 지적되지 않거나 문단에 의해 명백히 반박되지 않는 경우, 단수 및 복수 둘 다를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 본원에서 수치 범위에 대한 언급은 달리 지적되지 않는 경우 상기 범위 내에 떨어지는 각각의 별도의 값에 개별적으로 언급하는 약칭 방법으로서 작용하는 것으로 의도되고 각각의 별도의 수치는 이것이 본원에서 개별적으로 언급되는 것과 같이 본 명세서에 도입된다. 본원에 기재된 모든 방법은 본원에서 달리 지적되지 않거나 명백히 본원 문단에 의해 반박되지 않는 경우 임의의 적합한 차수로 수행될 수 있다. 본원에 제공된 임의의 모든 예, 또는 예시적 용어(예를 들면, "와 같은")의 사용은 단지 발명을 보다 양호하게 설명하기 위한 것으로 의도되고 달리 청구되지 않는 경우 본 발명을 제한하는 것은 아니다. 상기 명세서에서 어떠한 용어도 임의의 비-청구된 요소를 발명의 수행에 필수적임을 지적하는 것으로서 해석되지 말아야 한다.
본 발명은 도면 및 이전의 기재에서 상세히 설명되고 기재되었지만, 이것은 설명을 위한 것이지 특징을 제한하는 것이 아닌 것으로 고려되어야 하고 이는 단지 바람직한 양태를 나타내고 기재된 것이며 본 발명의 취지내에 있는 모든 변화 및 변형은 보호되고자 하는 것으로 이해되어야만 한다. 추가로, 본원에서 인용된 모든 문헌들은 당업계의 기술 수준을 지적하고 이들의 전문이 본원에 인용에 의해 포함된다.

Claims (47)

  1. 의학적 장치의 루멘을 통해 전달되는 세포에 대한 상기 루멘의 잠재적 영향에 대해 상기 의학적 장치의 루멘을 시험하기 위한 방법으로서,
    상기 루멘은 세포-함유 유동성 물질의 전달을 위한 것이고,
    상기 방법은
    상기 루멘의 벽과 접촉된 상태로 액체 배지를 상기 루멘 내에서 상기 액체 배지의 체류 시간 동안 인큐베이팅(incubaing)하는 단계;
    하나 이상의 세포를 상기 액체 배지와 접촉시키는 단계;
    상기 인큐베이팅 후 상기 루멘으로부터 상기 액체 배지를 수집하는 단계; 및
    상기 세포에 의한 하나 이상의 톨형(toll-like) 수용체의 발현에 대한 상기 접촉의 영향을 평가하는 단계를 포함하는,
    의학적 장치의 루멘을 시험하기 위한 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 의학적 장치가 카테터인, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 하나 이상의 세포가, 상기 하나 이상의 톨형 수용체를 암호화하는 외인성 DNA를 포함하는, 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 하나 이상의 세포가 포유동물 세포인, 방법.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 하나 이상의 세포가 사람 세포인, 방법.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 액체 배지가 수성 배지인, 방법.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 하나 이상의 세포가 세포 집단인, 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 집단이 클론 집단인, 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 클론 집단이 사람 배아 신장 세포의 클론 집단인, 방법.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 하나 이상의 톨형 수용체가 톨형 수용체 2, 톨형 수용체 4, 또는 둘 다를 포함하는, 방법.
  11. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 배지가 세포 성장 배지인, 방법.
  12. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 루멘 내에서 상기 인큐베이팅 및 상기 접촉을 동시에 수행함을 포함하는, 방법.
  13. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 인큐베이팅이, 상기 하나 이상의 세포의 부재 하에 상기 루멘의 벽과 접촉된 상태로 상기 액체 배지를 인큐베이팅함을 포함하는, 방법.
  14. 의학적 장치의 루멘을 통해 전달되는 세포에 대한 상기 루멘의 잠재적 영향에 대해 상기 의학적 장치의 루멘을 시험하기 위한 방법으로서,
    상기 방법은
    세포의 선천적 면역 반응에 대한 영향에 대해 상기 루멘을 1차 평가하는 단계로서, 이같은 1차 평가 단계가, 상기 루멘의 벽과 접촉된 상태로 액체 배지를 상기 루멘 내에서 상기 액체 배지의 체류 시간 동안 인큐베이팅하고, 상기 인큐베이팅 후 상기 루멘으로부터 상기 액체 배지를 수집하고, 상기 세포를 상기 액체 배지와 접촉시키고, 상기 세포의 선천성 면역 반응에 대한 상기 접촉의 영향을 평가함을 포함하는, 1차 평가 단계; 및
    세포독성, 운동성, 생존능, 대사 활성 또는 이의 임의의 배합을 포함하는 그룹으로부터 선택되는 세포의 하나 이상의 다른 특성들에 대한 영향에 대해 상기 루멘을 2차 평가하는 단계로서, 이같은 2차 평가 단계가, 상기 루멘의 벽과 접촉된 상태로 액체 배지를 상기 루멘 내에서 상기 액체 배지의 체류 시간 동안 인큐베이팅하고, 상기 인큐베이팅 후 상기 루멘으로부터 상기 액체 배지를 수집하고, 상기 세포를 상기 액체 배지와 접촉시키고, 상기 세포의 하나 이상의 다른 특성들에 대한 상기 접촉의 영향을 평가함을 포함하는, 2차 평가 단계
    를 포함하는, 의학적 장치의 루멘을 시험하기 위한 방법.
  15. 삭제
  16. 제14항에 있어서, 상기 2차 평가가, 세포의 세포독성 및 세포의 대사 활성 둘 다에 대한 루멘의 영향을 평가함을 포함하는, 방법.
  17. 의학적 장치의 루멘을 통해 전달되는 세포에 대한 상기 루멘의 잠재적 영향에 대해 상기 의학적 장치의 루멘을 평가하기 위한 방법으로서,
    상기 방법은
    하나 이상의 세포를 상기 루멘의 벽과 접촉된 상태로 인큐베이팅된 액체 배지와 상기 루멘 내에서 상기 액체 배지의 체류 시간 동안 접촉시키는 단계;
    상기 접촉 후 상기 루멘으로부터 상기 액체 배지를 수집하는 단계;
    상기 하나 이상의 세포의 하나 이상의 특성에 대한 상기 접촉의 영향을 평가하는 단계를 포함하는,
    의학적 장치의 루멘을 평가하기 위한 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 의학적 장치가 카테터인, 방법.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 하나 이상의 특성이 대사 활성을 포함하는, 방법.
  20. 제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 액체 배지가, 1시간 초과의 시간 동안 상기 루멘과 접촉된 상태로 인큐베이팅되는, 방법.
  21. 제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 액체 배지가 세포 성장 배지를 포함하는, 방법.
  22. 제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 평가가, 상기 세포에 의한 하나 이상의 단백질의 발현 수준을 측정함을 포함하는, 방법.
  23. 제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 하나 이상의 세포가 세포 집단인, 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 세포 집단이 세포의 클론 집단인, 방법.
  25. 제23항에 있어서, 상기 세포 집단이 세포의 이종성 집단인, 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 세포의 이종성 집단이 골수에 의해 제공되는, 방법.
  27. 어셈블리의 부품(component)들을 시험하기 위한 방법으로서,
    상기 방법은
    샘플 어셈블리의 통로의 벽에 접촉된 상태로 액체 배지를 상기 통로 내에서 상기 액체 배지의 체류 시간 동안 인큐베이팅하는 단계로서, 여기서, 상기 샘플 어셈블리는 상기 통로를 형성하기 위해 제2 루멘을 갖는 샘플 제2 부품에 커플링된 제1 루멘을 갖는 샘플 제1 부품을 포함하는, 인큐베이팅 단계;
    하나 이상의 세포를 상기 액체 배지와 접촉시키는 단계;
    상기 인큐베이팅 후에 상기 통로로부터 상기 액체 배지를 수집하는 단계; 및
    상기 세포의 하나 이상의 특성에 대한 상기 접촉의 영향을 평가하는 단계
    를 포함하는, 어셈블리의 부품들을 시험하기 위한 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 어셈블리가 세포 전달 어셈블리이고, 상기 통로가 세포 전달 경로이고, 상기 샘플 제1 부품이 샘플 제1 전달 부품이고, 상기 샘플 제2 부품이 샘플 제2 전달 부품인, 방법.
  29. 제27항 또는 제28항에 있어서, 상기 하나 이상의 세포가 포유동물 세포인, 방법.
  30. 제27항 또는 제28항에 있어서, 상기 하나 이상의 세포가 사람 세포인, 방법.
  31. 제27항 또는 제28항에 있어서, 상기 하나 이상의 세포가 세포 집단인, 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 집단이 클론 집단인, 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 클론 집단이, 하나 이상의 톨형 수용체를 암호화하는 외인성 DNA를 함유하는 사람 배아 신장 세포의 클론 집단인, 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 하나 이상의 톨형 수용체가 톨형 수용체 2, 톨형 수용체 4 또는 둘 다를 포함하는, 방법.
  35. 제27항 또는 제28항에 있어서, 상기 배지가 세포 성장 배지인, 방법.
  36. 제27항 또는 제28항에 있어서, 상기 통로 내에서 상기 인큐베이팅 및 상기 접촉을 동시에 수행함을 포함하는, 방법.
  37. 제27항 또는 제28항에 있어서, 상기 인큐베이팅이, 상기 하나 이상의 세포의 부재 하에 상기 통로의 벽과 접촉된 상태로 상기 액체 배지를 인큐베이팅함을 포함하고, 상기 수집이 상기 접촉 전에 수행되는, 방법.
  38. 제27항 또는 제28항에 있어서, 상기 하나 이상의 특성이 세포독성, 대사 활성, 운동성, 생존능 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  39. 제27항 또는 제28항에 있어서, 상기 인큐베이팅이 적어도 30분의 기간 동안 이루어지는, 방법.
  40. 제39항에 있어서, 상기 인큐베이팅이 30분 내지 48시간의 기간 동안 이루어지는, 방법.
  41. 키트 제조 방법으로서,
    각각 세포 통과(passage of cell)를 위한 제1 루멘을 갖는, 제1 전달 부품의 복수의 유닛(unit)들을 포함하는 제1 장치 로트(device lot)를 제조하는 단계;
    각각 세포 통과를 위한 제2 루멘을 갖는, 제2 전달 부품의 복수의 유닛들을 포함하는 제2 장치 로트를 제조하는 단계로서, 여기서, 상기 제1 전달 부품이 상기 제2 전달 부품과 연합가능하여, 세포를 통과시키기 위한 통로로서의 상기 제1 루멘 및 상기 제2 루멘을 포함하는 통로를 갖는 전달 어셈블리를 제공하게 되는, 제2 장치 로트를 제조하는 단계;
    상기 제1 전달 부품의 제1 시험 샘플 유닛들을 얻기 위해 상기 제1 장치 로트를 샘플링하는 단계;
    상기 제2 전달 부품의 제2 시험 샘플 유닛들을 얻기 위해 상기 제2 장치 로트를 샘플링하는 단계;
    상기 제1 시험 샘플 유닛의 상기 제1 루멘 및 상기 제2 시험 샘플 유닛의 상기 제2 루멘을 포함하는 통로를 갖는 샘플 전달 어셈블리를 제공하기 위해 상기 제1 시험 샘플 유닛들 중 하나와 상기 제2 시험 샘플 유닛들 중 하나를 연합시키는 단계;
    세포의 하나 이상의 특성에 대한 영향에 대해 상기 통로를 평가하는 단계로서, 상기 평가하는 단계가, 상기 통로의 벽에 접촉된 상태로 액체 배지를 상기 통로 내에서 상기 액체 배지의 체류 시간 동안 배치시키고, 하나 이상의 세포를 상기 액체 배지와 접촉시키며, 상기 배치 후에 상기 통로로부터 상기 액체 배지를 수집하고, 상기 세포의 하나 이상의 특성에 대한 상기 접촉의 영향을 평가함을 포함하는, 단계; 및
    상기 제1 장치 로트로부터의 제1 전달 부품들을 상기 제2 장치 로트로부터의 제2 전달 부품들과 함께 팩키징하는 단계
    를 포함하는, 키트 제조 방법.
  42. 제41항에 있어서, 상기 평가가,
    상기 통로를 통해 세포를 통과시키고;
    상기 통과 후 세포를 회수하고;
    상기 세포의 하나 이상의 특성들에 대한 상기 통로의 영향에 대해 상기 회수된 세포를 평가함을 포함하는, 방법.
  43. 제41항 또는 제42항에 있어서, 상기 평가가,
    통로의 벽과 접촉된 상태로 액체 배지를 인큐베이팅하여 처리된 배지를 형성하는 단계로서, 여기서, 상기 벽은 상기 제1 루멘으로부터의 벽 부분들 및 상기 제2 루멘으로부터의 벽 부분들을 포함하는 것인, 처리된 배지를 형성하는 단계; 및
    상기 처리된 배지와 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  44. 제41항 또는 제42항에 있어서, 상기 팩키징 전에, 상기 샘플 전달 어셈블리가, 세포의 하나 이상의 특성에 대한 상기 영향과 관련된 하나 이상의 사전결정된 기준을 충족하는지를 결정함을 또한 포함하는, 방법.
  45. 제41항 또는 제42항에 있어서, 상기 하나 이상의 특성이 세포독성, 대사활성, 선천적 면역 반응, 운동성, 생존능 및 이들의 임의의 조합을 포함하는 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  46. 제41항 또는 제42항에 있어서, 상기 하나 이상의 특성이 대사 활성을 포함하는, 방법.
  47. 제41항 또는 제42항에 있어서, 상기 하나 이상의 특성이 선천적 면역 반응을 포함하는, 방법.
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