CN110373445A - 一种抗肿瘤药物快速药效测试试剂盒的制备方法及使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗肿瘤药物快速药效测试试剂盒的制备方法及使用方法，收集临床肿瘤手术样本或PDX小鼠肿瘤样本，单细胞悬液制备，肿瘤干细胞和巨噬细胞提取，3D共培养装置的建立，LDH检测肿瘤干细胞活力，根据对照组肿瘤干细胞的活力值，计算出给药组肿瘤干细胞活力增殖百分比，进而评价相应药物的药效，由于肿瘤干细胞在体外不容易生长，此种方法先筛选出具有高度增殖能力的肿瘤干细胞，再借助其成瘤，两周即可做出药效结果。可以结合体内和体外实验技术进行快速抗肿瘤药物药效评价，可用于快速高效的检测抗肿瘤药物的药效。
Description
技术领域
本发明涉及环境科学技术领域，尤其涉及一种抗肿瘤药物快速药效测试试剂盒的制备方法及使用方法。
背景技术
肿瘤的病死率高居诸病之首，并还在持续上升，成为威胁人民健康的大敌。有一半的人会在生命的某个阶段罹患癌症。化疗是目前最常见的癌症治疗手段，能有效杀死癌细胞，但对有些患者来说，不但对化疗药物没有反应，而且其健康组织还会遭到破坏，导致患者产生不必要的毒副作用。因此肿瘤的治疗必须向个体化、精准化治疗发展。其研究过程中一个主要的挑战是为临床患者开发强大的化疗药物评价模型，这些模型将代替患者试药，模拟患者对各种药物的反应。
目前临床常用的精准医学手段是基因检测以及人源肿瘤移植瘤（Patient-Derived Xenograft, PDX）模型筛药。基因检测是基于遗传性方法对癌症基因靶点的检测，然而现如今基因检测的技术还在高速发展阶段，其结果的准确性深受活检样本、检测技术的限制，到目前为止，仍然没办法保证结果的准确性，存在一定误差性。此外，肿瘤的分裂与生长是在时时刻刻发生的，也就意味着，肿瘤随时都可能会发生突变。而基因检测所取得的样本只能代表当时的基因状态，也可能当取样后，又发生了基因突变，导致结果的不准确。PDX是把病人的肿瘤块直接移植到免疫系统改良后的小鼠体内从而生长出肿瘤，能准确地反映“源瘤病人”的病理学、遗传学特征以及药物反应。运用PDX模型进行个体化精准医疗的主要难点在于模型建成周期与药敏测试花费时间长，以及PDX模型的移植成瘤率低。基本的造模需2～3个月，加药敏实验通常出结果需6～8个月。对于肿瘤发展迅速、生存期短的患者而言, 有些未能获得药敏结果就已经死亡。因此，为临床患者开发出准确易行且实验周期短的化疗药物评价模型是精准医疗领域中一个急需解决的问题。
发明内容
本发明提供一种抗肿瘤药物快速药效测试试剂盒的制备方法及使用方法，解决现有技术中的存在一定误差、模型建成周期与药敏测试花费时间长以及PDX模型的移植成瘤率低等技术问题。PDX模型是基于患者来源的肿瘤组织的移植所建立的, 若患者没有手术或组织活检的机会, 则无法建立此模型。对于双原发肿瘤、原发病灶不明的转移瘤而言,如何选择标本以及模型是否能发表达肿瘤转移的生物学行为，目前仍然没有比较成熟的研究。因建模小鼠均无成熟免疫系统, PDX模型不能用于免疫抑制剂、免疫调节剂疗效的评估
本发明采用以下技术方案：一种抗肿瘤药物快速药效测试试剂盒的制备方法，步骤为：
第一步：取新鲜收集的临床肿瘤样本或PDX小鼠肿瘤样本于运输保存管中，运至实验室，所述运输保存管内放液氮；
第二步，单细胞悬液制备：在实验室中将临床肿瘤样本或PDX小鼠肿瘤样本剔除非肿瘤组织和坏死组织得肿瘤样品，将肿瘤样品切成2mm3小块，用PBS冲洗并收集组织块，于1000rpm离心5min去上清；离心的后的沉淀使用2型胶原酶37℃摇床孵育2至4小时；孵育后用40μm尼龙网过滤，去除组织残块和细胞团；将滤液1000rpm离心5min去除上清，将沉淀使用含1％胎牛血清FBS的PBS重悬细胞并进行清洗后，将细胞重悬于含1％FBS的PBS，计数并调整细胞密度至1×108；
第三步，肿瘤干细胞和巨噬细胞提取：以15μl/107细胞的浓度加入肿瘤干细胞分选磁珠CD133和巨噬细胞分选磁珠CD11b，4℃孵育30min；用上述细胞和分选磁珠的20倍体积PBE洗上述和磁珠结合的细胞一次，再加0.3ml/108细胞PBE充分混悬细胞后，加入与肿瘤干细胞分选磁珠CD133和巨噬细胞分选磁珠CD11b相对应的二抗包被的超微磁珠，混匀后置8-15℃孵育10-15min；用磁铁做磁场，来吸引二抗包被的超微磁珠，将分离柱安装入磁场中，加入0.5ml PBE，在重力作用下自然流尽，以预处理分离柱；收集的液体1000 rpm离心3分钟去除上清，细胞培养液重悬，计数调整细胞密度至1×105个~10×105个，得到巨噬细胞和肿瘤干细胞；
第四步，3D共培养装置的建立：由0.4 μm的聚对苯二甲酸乙二醇酯PET膜将3D共培养装置分隔开形成内圈和外圈，外圈用于培养巨噬细胞，内圈用于培养肿瘤干细胞，将巨噬细胞和肿瘤干细胞分别接种于外圈和内圈中，PET膜的孔径允许细胞因子交互传递但细胞不可通过，3D共培养装置底部为透明质酸水凝胶，所述透明质酸水凝胶由马来酰亚胺基团聚合物maleinide-functionalized polymer、聚乙二醇交联剂PEG-link以及质酸凝胶Hyaluronic acid hydrogels组成，使细胞聚团生长形成3D形态，建立成3D共培养装置；
第五步：所述抗肿瘤药物快速药效测试试剂盒为96孔板，在96孔板的每一个孔板内都设有独立的3D共培养装置。
作为本发明的一种优选技术方案：所述第四步中马来酰亚胺基团聚合物、聚乙二醇交联剂和质酸凝胶质量份数配比为1.5：2：2，加水直接在3D共培养装置底层混合配制成具有弹性和硬度的透明质酸水凝胶，为细胞提供可粘附的细胞外环境，肿瘤干细胞通过自身分泌基质金属蛋白酶，为肿瘤干细胞自身创造移动空间、伸展和迁移，使细胞聚团生长形成3D形态。
作为本发明的一种优选技术方案：所述第五步中巨噬细胞和肿瘤干细胞分别接种于3D共培养装置的外圈和内圈中，共培养后3-5天填后，将96孔板内的每个内圈内加入临床使用抗肿瘤药物，48小时后，将96孔板每孔中的聚对苯二甲酸乙二醇酯PET膜拔除，将每孔剩下来的上清液进行LDH乳酸脱氢酶细胞毒性测试，检测不同抗肿瘤药物对于肿瘤干细胞的治疗作用，检测药效敏感性。
本发明还提供了上述制备方法制得的抗肿瘤药物快速药效测试试剂盒的使用方法，步骤为：
第一步：收集3D形态的巨噬细胞和肿瘤干细胞，用1×分析液重悬巨噬细胞和肿瘤干细胞；
第二步：同时接种巨噬细胞和肿瘤干细胞于96孔板中，在96孔板中还需要分别制备下列样本；
背景对照：每孔加200ul培养液，3个复孔，背景值应从其他值中减去，因为染色液本身有颜色，所以需要减去染色液的背景数值；
低对照：向每孔200ul分析液中加1-2×104细胞，3个复孔；
高对照：向每孔200ul含1％Triton X-100的分析液中加1-2×104细胞，3个复孔；
检测样本：向每孔200ul含检测物质的分析液中加1-2×104细胞，3个复孔；
第三步：在培养箱中孵育细胞，孵育时间为10-60min；
第四步：在1000rpm下离心细胞10min；
第五步：每孔转移100ul离心后的上清液到相应的96孔板中；
第六步：每孔加入100ul反应混合液，室温孵育30min，避光操作；
第七步：用微孔读板仪在490-500nm检测所有样本的吸光值，参考波长大于600nm；
计算细胞毒的百分比：
细胞毒（％）＝（检测样本－低对照）/（高对照－低对照）%
根据对照组肿瘤干细胞的活力值，计算出给药组肿瘤干细胞活力增殖百分比，进而评价相应药物的药效。
作为本发明的一种优选技术方案：所述第三步中培养箱中培养条件为5％CO2，90%湿度，37℃。
作为本发明的一种优选技术方案：所述分析液为1％血清或1％BSA培养液。
作为本发明的一种优选技术方案：所述第二步中培养液是5％FBS的DMEMdulbecco's modified eagle medium。
作为本发明的一种优选技术方案：所述第三步中孵育时间为30min。
作为本发明的一种优选技术方案：所述第六步中反应混合液为双蒸水溶解显色催化剂Catalyst。
有益效果：
本发明所述一种抗肿瘤药物快速药效测试试剂盒的制备方法及使用方法采用以上技术方案与现有技术相比，具有以下技术效果：
1、由于肿瘤干细胞在体外不容易生长，此种方法先筛选出具有高度增殖能力的肿瘤干细胞，再借助其成瘤，两周即可做出药效结果。经过验证，该方法与传统PDX所得到的药效结果有极高的相关性。本发明可以结合体内和体外实验技术进行快速抗肿瘤药物药效评价，可用于快速高效的检测抗肿瘤药物的药效；
2、与本发明还通过种入巨噬细胞模拟人体的免疫微环境，总之，本发明具有快速，药筛实验所需时间比传统PDX模型短，操作便捷，成本费用低，能模拟乳腺癌免疫微环境，可重复性强，适合临床使用，易于推广的优点。
附图说明
图1是本申请3D共培养装置的剖面图。
图2是本申请3D共培养装置的俯视图。
图3是本申请试剂盒96孔板结构示意图。
图4是本申请抗肿瘤药物快速药效测试试剂盒的制备流程图。
图5是本申请抗肿瘤药物快速药效测试试剂盒检测乳腺癌患者的化疗药物敏感性的PDX模型得到的药筛结果。
图6是本申请抗肿瘤药物快速药效测试试剂盒对实施例3中胰腺癌患者进行抗肿瘤药物快速药效测试报告。
附图标记说明：1、聚对苯二甲酸乙二醇酯PET膜，2、巨噬细胞，3、肿瘤干细胞，4、透明质酸水凝胶。
具体实施方式
以下结合实例对本发明作进一步的描述，实施例仅用于对本发明进行说明，并不构成对权利要求范围的限制，本领域技术人员可以想到的其他替代手段，均在本发明权利要求范围内。其中2型胶原酶购自Gibco。
实施例1：
如图1-4所示，一种抗肿瘤药物快速药效测试试剂盒的制备方法，步骤为：
第一步：取新鲜收集的临床肿瘤样本或PDX小鼠肿瘤样本于运输保存管中，所述运输保存管内放液氮，在尽可能短的时间内运至实验室进行后续操作。
第二步，单细胞悬液制备：在实验室中将临床肿瘤样本或PDX小鼠肿瘤样本剔除非肿瘤组织和坏死组织得肿瘤样品，将肿瘤样品切成2mm3小块，用PBS冲洗并收集组织块，于1000rpm离心5min去上清；离心的后的沉淀使用2型胶原酶37℃摇床孵育2至4小时；孵育后用40μm尼龙网过滤，去除组织残块和细胞团；将滤液1000rpm离心5min去除上清，将沉淀使用含1％胎牛血清FBS的PBS重悬细胞并进行清洗后，将细胞重悬于含1％FBS的PBS，计数并调整细胞密度至1×108。
第三步，肿瘤干细胞和巨噬细胞提取：以15μl/107细胞的浓度加入肿瘤干细胞分选磁珠CD133和巨噬细胞分选磁珠CD11b，4℃孵育30min；用上述细胞和分选磁珠的20倍体积PBE洗上述和磁珠结合的细胞一次，再加0.3ml/108细胞PBE充分混悬细胞后，加入与肿瘤干细胞分选磁珠CD133和巨噬细胞分选磁珠CD11b相对应的二抗包被的超微磁珠，混匀后置8-15℃孵育10-15min；用磁铁做磁场，可提供足够的磁力，来吸引二抗包被的超微磁珠，将分离柱安装入磁场中，利用磁场系统与磁珠来进行细胞分离，加入0.5ml PBE，在重力作用下自然流尽，以预处理分离柱；收集的液体1000 rpm离心3分钟去除上清，细胞培养液重悬，计数调整细胞密度至1×105个~10×105个，得到巨噬细胞和肿瘤干细胞；
第四步，3D共培养装置的建立：由0.4 μm的聚对苯二甲酸乙二醇酯PET膜1将试剂盒分隔开形成内圈和外圈，外圈用于培养巨噬细胞2，内圈用于培养肿瘤干细胞3，将巨噬细胞和肿瘤干细胞分别接种于外圈和内圈中，PET膜的孔径允许细胞因子交互传递但细胞不可通过，3D共培养装置底部为透明质酸水凝胶4，所述透明质酸水凝胶由马来酰亚胺基团聚合物maleinide-functionalized polymer、聚乙二醇交联剂PEG-link以及质酸凝胶Hyaluronicacid hydrogels组成，马来酰亚胺基团聚合物、聚乙二醇交联剂和质酸凝胶质量份数配比为1.5：2：2，加水直接在3D共培养装置底层混合配制成具有弹性和硬度的透明质酸水凝胶，为细胞提供可粘附的细胞外环境，肿瘤干细胞通过自身分泌基质金属蛋白酶，为肿瘤干细胞自身创造移动空间、伸展和迁移，使细胞聚团生长形成3D形态，建立成3D共培养装置；
第五步：所述抗肿瘤药物快速药效测试试剂盒为96孔板，在96孔板的每一个孔板内都设有独立的3D共培养装置，巨噬细胞和肿瘤干细胞分别接种于3D共培养装置的外圈和内圈中，共培养后3-5天填后，将96孔板内的每个内圈内加入临床使用抗肿瘤药物，48小时后，将96孔板每孔中的聚对苯二甲酸乙二醇酯PET膜1拔除，将每孔剩下来的上清液进行LDH乳酸脱氢酶细胞毒性测试，检测不同抗肿瘤药物对于肿瘤干细胞的治疗作用，检测药效敏感性。
上述制备方法制得的抗肿瘤药物快速药效测试试剂盒的使用方法，步骤为：
第一步：收集3D形态的巨噬细胞和肿瘤干细胞，用1×分析液重悬巨噬细胞和肿瘤干细胞，所述分析液为1％血清或1％BSA培养液；
第二步：同时接种巨噬细胞和肿瘤干细胞于96孔板中，在96孔板中还需要分别制备下列样本；
背景对照：每孔加200ul培养液，3个复孔，背景值应从其他值中减去，因为染色液本身有颜色，所以需要减去染色液的背景数值，培养液是5％FBS的DMEM dulbecco's modifiedeagle medium；
低对照：向每孔200ul分析液中加1-2×104细胞，3个复孔；
高对照：向每孔200ul含1％Triton X-100的分析液中加1-2×104细胞，3个复孔；
检测样本：向每孔200ul含检测物质的分析液中加1-2×104细胞，3个复孔。
第三步：在培养箱中孵育细胞，孵育时间为30min，培养箱中培养条件为5％CO2，90%湿度，37℃；
第四步：在1000rpm下离心细胞10min；
第五步：每孔转移100ul离心后的上清液到相应的96孔板中；
第六步：每孔加入100ul反应混合液，室温孵育30min，避光操作，反应混合液为双蒸水溶解显色催化剂Catalyst；
第七步：用微孔读板仪在490-500nm检测所有样本的吸光值，参考波长大于600nm；
计算细胞毒的百分比：
细胞毒（％）＝（检测样本－低对照）/（高对照－低对照）%
根据对照组肿瘤干细胞的活力值，计算出给药组肿瘤干细胞活力增殖百分比，进而评价相应药物的药效。
实施例2：
如图1-4所示，一种抗肿瘤药物快速药效测试试剂盒的制备方法，步骤为：
第一步：取新鲜收集的临床肿瘤样本或PDX小鼠肿瘤样本于运输保存管中，所述运输保存管内放液氮，在尽可能短的时间内运至实验室进行后续操作。
第二步，单细胞悬液制备：在实验室中将临床肿瘤样本或PDX小鼠肿瘤样本剔除非肿瘤组织和坏死组织得肿瘤样品，将肿瘤样品切成2mm3小块，用PBS冲洗并收集组织块，于1000rpm离心5min去上清；离心的后的沉淀使用2型胶原酶37℃摇床孵育2至4小时；孵育后用40μm尼龙网过滤，去除组织残块和细胞团；将滤液1000rpm离心5min去除上清，将沉淀使用含1％胎牛血清FBS的PBS重悬细胞并进行清洗后，将细胞重悬于含1％FBS的PBS，计数并调整细胞密度至1×108。
第三步，肿瘤干细胞和巨噬细胞提取：以15μl/107细胞的浓度加入肿瘤干细胞分选磁珠CD133和巨噬细胞分选磁珠CD11b，4℃孵育30min；用上述细胞和分选磁珠的20倍体积PBE洗上述和磁珠结合的细胞一次，再加0.3ml/108细胞PBE充分混悬细胞后，加入与肿瘤干细胞分选磁珠CD133和巨噬细胞分选磁珠CD11b相对应的二抗包被的超微磁珠，混匀后置8-15℃孵育10-15min；用磁铁做磁场，可提供足够的磁力，来吸引二抗包被的超微磁珠，将分离柱安装入磁场中，利用磁场系统与磁珠来进行细胞分离，加入0.5ml PBE，在重力作用下自然流尽，以预处理分离柱；收集的液体1000 rpm离心3分钟去除上清，细胞培养液重悬，计数调整细胞密度至1×105个~10×105个，得到巨噬细胞和肿瘤干细胞；
第四步，3D共培养装置的建立：由0.4 μm的聚对苯二甲酸乙二醇酯PET膜1将试剂盒分隔开形成内圈和外圈，外圈用于培养巨噬细胞2，内圈用于培养肿瘤干细胞3，将巨噬细胞和肿瘤干细胞分别接种于外圈和内圈中，PET膜的孔径允许细胞因子交互传递但细胞不可通过，3D共培养装置底部为透明质酸水凝胶4，所述透明质酸水凝胶由马来酰亚胺基团聚合物maleinide-functionalized polymer、聚乙二醇交联剂PEG-link以及质酸凝胶Hyaluronicacid hydrogels组成，马来酰亚胺基团聚合物、聚乙二醇交联剂和质酸凝胶质量份数配比为1.5：2：2，加水直接在3D共培养装置底层混合配制成具有弹性和硬度的透明质酸水凝胶，为细胞提供可粘附的细胞外环境，肿瘤干细胞通过自身分泌基质金属蛋白酶，为肿瘤干细胞自身创造移动空间、伸展和迁移，使细胞聚团生长形成3D形态，建立成3D共培养装置；
第五步：所述抗肿瘤药物快速药效测试试剂盒为96孔板，在96孔板的每一个孔板内都设有独立的3D共培养装置，巨噬细胞和肿瘤干细胞分别接种于3D共培养装置的外圈和内圈中，共培养后3-5天填后，将96孔板内的每个内圈内加入临床使用抗肿瘤药物，48小时后，将96孔板每孔中的聚对苯二甲酸乙二醇酯PET膜1拔除，将每孔剩下来的上清液进行LDH乳酸脱氢酶细胞毒性测试，检测不同抗肿瘤药物对于肿瘤干细胞的治疗作用，检测药效敏感性。
上述制备方法制得的抗肿瘤药物快速药效测试试剂盒的使用方法，步骤为：
第一步：收集3D形态的巨噬细胞和肿瘤干细胞，用1×分析液重悬巨噬细胞和肿瘤干细胞，所述分析液为1％血清或1％BSA培养液；
第二步：同时接种巨噬细胞和肿瘤干细胞于96孔板中，在96孔板中还需要分别制备下列样本；
背景对照：每孔加200ul培养液，3个复孔，背景值应从其他值中减去，因为染色液本身有颜色，所以需要减去染色液的背景数值，培养液是5％FBS的DMEM dulbecco's modifiedeagle medium；
低对照：向每孔200ul分析液中加1-2×104细胞，3个复孔；
高对照：向每孔200ul含1％Triton X-100的分析液中加1-2×104细胞，3个复孔；
检测样本：向每孔200ul含检测物质的分析液中加1-2×104细胞，3个复孔。
第三步：在培养箱中孵育细胞，孵育时间为30min，培养箱中培养条件为5％CO2，90%湿度，37℃；
第四步：在1000rpm下离心细胞10min；
第五步：每孔转移100ul离心后的上清液到相应的96孔板中；
第六步：每孔加入100ul反应混合液，室温孵育30min，避光操作，反应混合液为双蒸水溶解显色催化剂Catalyst；
第七步：用微孔读板仪在490-500nm检测所有样本的吸光值，参考波长大于600nm；
计算细胞毒的百分比：
细胞毒（％）＝（检测样本－低对照）/（高对照－低对照）%
根据对照组肿瘤干细胞的活力值，计算出给药组肿瘤干细胞活力增殖百分比，进而评价相应药物的药效。
图5是本发明涉及的PDX模型得到的药筛结果。该结果有空白对照组（control），顺铂给药组（cisplatin），紫杉醇给药组（paclitaxel）以及多西他赛给药组（docetaxel），将以上药物分别施用于共培养装置，之后检测肿瘤干细胞损伤值。图中可知，化疗药物多西他赛和紫杉醇对该患者均有好的抑制效果。
实施例3：
如图1-4所示，一种抗肿瘤药物快速药效测试试剂盒的制备方法，步骤为：
第一步：取新鲜收集的临床肿瘤样本或PDX小鼠肿瘤样本于运输保存管中，所述运输保存管内放液氮，在尽可能短的时间内运至实验室进行后续操作。
第二步，单细胞悬液制备：在实验室中将临床肿瘤样本或PDX小鼠肿瘤样本剔除非肿瘤组织和坏死组织得肿瘤样品，将肿瘤样品切成2mm3小块，用PBS冲洗并收集组织块，于1000rpm离心5min去上清；离心的后的沉淀使用2型胶原酶37℃摇床孵育2至4小时；孵育后用40μm尼龙网过滤，去除组织残块和细胞团；将滤液1000rpm离心5min去除上清，将沉淀使用含1％胎牛血清FBS的PBS重悬细胞并进行清洗后，将细胞重悬于含1％FBS的PBS，计数并调整细胞密度至1×108。
第三步，肿瘤干细胞和巨噬细胞提取：以15μl/107细胞的浓度加入肿瘤干细胞分选磁珠CD133和巨噬细胞分选磁珠CD11b，4℃孵育30min；用上述细胞和分选磁珠的20倍体积PBE洗上述和磁珠结合的细胞一次，再加0.3ml/108细胞PBE充分混悬细胞后，加入与肿瘤干细胞分选磁珠CD133和巨噬细胞分选磁珠CD11b相对应的二抗包被的超微磁珠，混匀后置8-15℃孵育10-15min；用磁铁做磁场，可提供足够的磁力，来吸引二抗包被的超微磁珠，将分离柱安装入磁场中，利用磁场系统与磁珠来进行细胞分离，加入0.5ml PBE，在重力作用下自然流尽，以预处理分离柱；收集的液体1000 rpm离心3分钟去除上清，细胞培养液重悬，计数调整细胞密度至1×105个~10×105个，得到巨噬细胞和肿瘤干细胞；
第四步，3D共培养装置的建立：由0.4 μm的聚对苯二甲酸乙二醇酯PET膜1将试剂盒分隔开形成内圈和外圈，外圈用于培养巨噬细胞2，内圈用于培养肿瘤干细胞3，将巨噬细胞和肿瘤干细胞分别接种于外圈和内圈中，PET膜的孔径允许细胞因子交互传递但细胞不可通过，3D共培养装置底部为透明质酸水凝胶4，所述透明质酸水凝胶由马来酰亚胺基团聚合物maleinide-functionalized polymer、聚乙二醇交联剂PEG-link以及质酸凝胶Hyaluronicacid hydrogels组成，马来酰亚胺基团聚合物、聚乙二醇交联剂和质酸凝胶质量份数配比为1.5：2：2，加水直接在3D共培养装置底层混合配制成具有弹性和硬度的透明质酸水凝胶，为细胞提供可粘附的细胞外环境，肿瘤干细胞通过自身分泌基质金属蛋白酶，为肿瘤干细胞自身创造移动空间、伸展和迁移，使细胞聚团生长形成3D形态，建立成3D共培养装置；
第五步：所述抗肿瘤药物快速药效测试试剂盒为96孔板，在96孔板的每一个孔板内都设有独立的3D共培养装置，巨噬细胞和肿瘤干细胞分别接种于3D共培养装置的外圈和内圈中，共培养后3-5天填后，将96孔板内的每个内圈内加入临床使用抗肿瘤药物，48小时后，将96孔板每孔中的聚对苯二甲酸乙二醇酯PET膜1拔除，将每孔剩下来的上清液进行LDH乳酸脱氢酶细胞毒性测试，检测不同抗肿瘤药物对于肿瘤干细胞的治疗作用，检测药效敏感性。
上述制备方法制得的抗肿瘤药物快速药效测试试剂盒的使用方法，步骤为：
第一步：收集3D形态的巨噬细胞和肿瘤干细胞，用1×分析液重悬巨噬细胞和肿瘤干细胞，所述分析液为1％血清或1％BSA培养液；
第二步：同时接种巨噬细胞和肿瘤干细胞于96孔板中，在96孔板中还需要分别制备下列样本；
背景对照：每孔加200ul培养液，3个复孔，背景值应从其他值中减去，因为染色液本身有颜色，所以需要减去染色液的背景数值，培养液是5％FBS的DMEM dulbecco's modifiedeagle medium；
低对照：向每孔200ul分析液中加1-2×104细胞，3个复孔；
高对照：向每孔200ul含1％Triton X-100的分析液中加1-2×104细胞，3个复孔；
检测样本：向每孔200ul含检测物质的分析液中加1-2×104细胞，3个复孔。
第三步：在培养箱中孵育细胞，孵育时间为30min，培养箱中培养条件为5％CO2，90%湿度，37℃；
第四步：在1000rpm下离心细胞10min；
第五步：每孔转移100ul离心后的上清液到相应的96孔板中；
第六步：每孔加入100ul反应混合液，室温孵育30min，避光操作，反应混合液为双蒸水溶解显色催化剂Catalyst；
第七步：用微孔读板仪在490-500nm检测所有样本的吸光值，参考波长大于600nm；
计算细胞毒的百分比：
细胞毒（％）＝（检测样本－低对照）/（高对照－低对照）%
根据对照组肿瘤干细胞的活力值，计算出给药组肿瘤干细胞活力增殖百分比，进而评价相应药物的药效。
如图6所示，62岁，男性，胰腺癌患者，中分化乳头状腺癌，提取该患者手术提取的癌组织，进行抗肿瘤药物快速药效测试报告。报告结果分为3个等级，A：十分耐受，抗肿瘤效果好，副作用小，优先推荐；B：耐受，抗肿瘤效果较好，有一定的副作用，一般推荐；C：耐受差，抗肿瘤效果较差，比较强的副作用，不推荐使用。该患者对于吉西他滨疗效好，耐受度好，副作用小，优秀推荐；其他可以推荐使用顺羧酸铂（卡铂）；或者顺铂与吉西他滨的组合治疗。
Claims (9)
1.一种抗肿瘤药物快速药效测试试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤为：
第一步：取新鲜收集的临床肿瘤样本或PDX小鼠肿瘤样本于运输保存管中，运至实验室，所述运输保存管内放液氮；
第二步，单细胞悬液制备：在实验室中将临床肿瘤样本或PDX小鼠肿瘤样本剔除非肿瘤组织和坏死组织得肿瘤样品，将肿瘤样品切成2mm3小块，用PBS冲洗并收集组织块，于1000rpm离心5min去上清；离心的后的沉淀使用2型胶原酶37℃摇床孵育2至4小时；孵育后用40μm尼龙网过滤，去除组织残块和细胞团；将滤液1000rpm离心5min去除上清，将沉淀使用含1％胎牛血清FBS的PBS重悬细胞并进行清洗后，将细胞重悬于含1％FBS的PBS，计数并调整细胞密度至1×108；
第三步，肿瘤干细胞和巨噬细胞提取：以15μl/107细胞的浓度加入肿瘤干细胞分选磁珠CD133和巨噬细胞分选磁珠CD11b，4℃孵育30min；用上述细胞和分选磁珠的20倍体积PBE洗上述和磁珠结合的细胞一次，再加0.3ml/108细胞PBE充分混悬细胞后，加入与肿瘤干细胞分选磁珠CD133和巨噬细胞分选磁珠CD11b相对应的二抗包被的超微磁珠，混匀后置8-15℃孵育10-15min；用磁铁做磁场，来吸引二抗包被的超微磁珠，将分离柱安装入磁场中，加入0.5ml PBE，在重力作用下自然流尽，以预处理分离柱；收集的液体1000 rpm离心3分钟去除上清，细胞培养液重悬，计数调整细胞密度至1×105个~10×105个，得到巨噬细胞和肿瘤干细胞；
第四步，3D共培养装置的建立：由0.4 μm的聚对苯二甲酸乙二醇酯PET膜（1）将3D共培养装置分隔开形成内圈和外圈，外圈用于培养巨噬细胞（2），内圈用于培养肿瘤干细胞（3），将巨噬细胞和肿瘤干细胞分别接种于外圈和内圈中，PET膜的孔径允许细胞因子交互传递但细胞不可通过，3D共培养装置底部为透明质酸水凝胶（4），所述透明质酸水凝胶由马来酰亚胺基团聚合物maleinide-functionalized polymer、聚乙二醇交联剂PEG-link以及质酸凝胶Hyaluronic acid hydrogels组成，使细胞聚团生长形成3D形态，建立成3D共培养装置；
第五步：所述抗肿瘤药物快速药效测试试剂盒为96孔板，在96孔板的每一个孔板内都设有独立的3D共培养装置。
2.根据权利要求1所述的一种抗肿瘤药物快速药效测试试剂盒的制备方法，其特征在于：所述第四步中马来酰亚胺基团聚合物、聚乙二醇交联剂和质酸凝胶质量份数配比为1.5：2：2，加水直接在3D共培养装置底层混合配制成具有弹性和硬度的透明质酸水凝胶，为细胞提供可粘附的细胞外环境，肿瘤干细胞通过自身分泌基质金属蛋白酶，为肿瘤干细胞自身创造移动空间、伸展和迁移，使细胞聚团生长形成3D形态。
3.根据权利要求1所述的一种抗肿瘤药物快速药效测试试剂盒的制备方法，其特征在于：所述第五步中巨噬细胞和肿瘤干细胞分别接种于3D共培养装置的外圈和内圈中，共培养后3-5天填后，将96孔板内的每个内圈内加入临床使用抗肿瘤药物，48小时后，将96孔板每孔中的聚对苯二甲酸乙二醇酯PET膜（1）拔除，将每孔剩下来的上清液进行LDH乳酸脱氢酶细胞毒性测试，检测不同抗肿瘤药物对于肿瘤干细胞的治疗作用，检测药效敏感性。
4.根据权利要求1-3任一所述抗肿瘤药物快速药效测试试剂盒的制备方法制备得到的抗肿瘤药物快速药效测试试剂盒的使用方法，其特征在于，步骤为：
第一步：收集3D形态的巨噬细胞和肿瘤干细胞，用1×分析液重悬巨噬细胞和肿瘤干细胞；
第二步：同时接种巨噬细胞和肿瘤干细胞于96孔板中，在96孔板中还需要分别制备下列样本；
背景对照：每孔加200ul培养液，3个复孔，背景值应从其他值中减去，因为染色液本身有颜色，所以需要减去染色液的背景数值；
低对照：向每孔200ul分析液中加1-2×104细胞，3个复孔；
高对照：向每孔200ul含1％Triton X-100的分析液中加1-2×104细胞，3个复孔；
检测样本：向每孔200ul含检测物质的分析液中加1-2×104细胞，3个复孔；
第三步：在培养箱中孵育细胞，孵育时间为10-60min；
第四步：在1000rpm下离心细胞10min；
第五步：每孔转移100ul离心后的上清液到相应的96孔板中；
第六步：每孔加入100ul反应混合液，室温孵育30min，避光操作；
第七步：用微孔读板仪在490-500nm检测所有样本的吸光值，参考波长大于600nm；
计算细胞毒的百分比：
细胞毒（％）＝（检测样本－低对照）/（高对照－低对照）%
根据对照组肿瘤干细胞的活力值，计算出给药组肿瘤干细胞活力增殖百分比，进而评价相应药物的药效。
5.根据权利要求4所述抗肿瘤药物快速药效测试试剂盒的使用方法，其特征在于：所述第三步中培养箱中培养条件为5％CO2，90%湿度，37℃。
6.根据权利要求4所述抗肿瘤药物快速药效测试试剂盒的使用方法，其特征在于：所述分析液为1％血清或1％BSA培养液。
7.根据权利要求4所述抗肿瘤药物快速药效测试试剂盒的使用方法，其特征在于：所述第二步中培养液是5％FBS的DMEM dulbecco's modified eagle medium。
8.根据权利要求4所述抗肿瘤药物快速药效测试试剂盒的使用方法，其特征在于：所述第三步中孵育时间为30min。
9.根据权利要求4所述抗肿瘤药物快速药效测试试剂盒的使用方法，其特征在于：所述第六步中反应混合液为双蒸水溶解显色催化剂Catalyst。
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| CN114600835A (zh) * | 2022-03-08 | 2022-06-10 | 郑羽 | 一种实验室pdx模型建立辅助系统及其控制方法 |
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| US20140154735A1 (en) * | 2011-01-06 | 2014-06-05 | Capsant Neurotechnologies Ltd. | Tumour cell and tissue culture |
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| CN114600835B (zh) * | 2022-03-08 | 2023-01-24 | 郑羽 | 一种实验室pdx模型建立辅助系统及其控制方法 |
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