KR20230147049A - 유동 세포측정 방법을 위한 역치 게이팅 - Google Patents
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Abstract
검정에서 각각의 형광 채널에 대해 양성 형광을 음성 형광으로부터 분리하는 정적 게이팅 역치의 설정 및 사용을 포함한, 유동 세포측정 분석을 위한 방법이 제공된다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2020년 12월 16일에 출원된 미국 가출원 번호 63/126,509 (발명의 명칭: "THRESHOLD GATING FOR FLOW CYTOMETRY METHODS")를 우선권 주장하며, 이 가출원의 내용은 그 전문이 참조로 포함된다.
분야
본 개시내용은 일부 측면에서 검정에서 각각의 형광 채널에 대한 음성 형광으로부터 양성 형광을 분리하는 정적 게이팅 역치의 설정 및 사용을 포함하는 유동 세포측정 분석에 관한 것이다.
각각의 형광색소-접합된 항체에 대한 형광 마이너스 원 (FMO) 또는 이소형 게이팅 대조군은 품질 관리 (QC) 설정에서 사용되는 유동 세포측정 방법에 대한 산업 표준 게이팅 대조군이다. 이들 게이팅 접근법에 대한 이익은 이들이 객관적 게이트 배치를 허용한다는 것이지만, 또한 이들 접근법에 대한 단점, 예컨대 처리량 감소, 검정 복잡성 증가 (예를 들어, 시간 제한, 실패율 및 샘플 부피 제한으로 인함), 및 상품의 비용 증가가 존재한다. 개선된 게이팅 접근법이 필요하다. 이러한 요구를 충족시키는 실시양태가 제공된다.
본원에 (1) 복수의 적어도 2개의 참조 세포 샘플에 대한 1개 이상의 형광 신호에 대해 유동 세포측정법에 의해 세포측정 이벤트를 측정하는 단계로서, 복수의 적어도 2개의 참조 샘플은 (a) 각각이 1개 이상의 형광 신호로 표지되지 않은 비염색된 세포의 집단을 포함하는 복수의 제1 참조 세포 샘플; 및 (b) 복수의 제2 참조 세포 샘플을 포함하고, 여기서 복수의 제2 참조 세포 샘플 각각은 복수의 제1 참조 세포 샘플 중 하나와 동일한 공급원 유형의 세포로부터 유래되고, 복수의 제2 참조 세포 샘플 각각은 1개 이상의 형광 신호 중 적어도 하나로 표지된 염색된 세포의 적어도 하나의 집단을 포함하는 것인 단계; 및 (2) 1개 이상의 형광 신호 각각에 대한 정적 형광 역치 게이트를, 각각의 형광 신호에 대해 역치 게이트가 (a) 1개 이상의 형광 신호 각각의 각 형광 신호에 대해 복수의 제1 참조 세포 샘플의 형광의 제90 백분위수 초과이고; (b) 동일한 각 형광 신호에 대해 복수의 제2 참조 세포 샘플의 형광의 제10 백분위수 미만인 형광이도록 설정하는 단계를 포함하는, 정적 형광 역치 게이트를 결정하는 방법이 제공된다.
또한 본원에 (1) 유동 세포측정기에 의해 측정된 1개 이상의 형광 신호에 따라 분류된 표지된 세포를 포함하는 시험 세포 샘플로부터의 복수의 세포측정 이벤트를 포함하는 유동 세포측정 데이터를 수신하는 단계; (2) 정적 형광 역치 게이트를 개별적으로 1개 이상의 형광 신호 각각에 적용하고, 여기서 1개 이상의 형광 신호 각각에 대한 정적 형광 역치 게이트는 제1항의 방법에 따라 결정되는 것인 단계; 및 (3) 1개 이상의 형광 신호 각각에 대해, 정적 역치 게이트 초과의 형광 신호를 갖는 시험 샘플로부터의 세포의 하위세트를 확인하는 단계를 포함하는, 유동 세포측정 데이터로부터 세포측정 이벤트의 하위세트를 선택하는 방법이 제공된다.
또한 본원에 (1) 유동 세포측정기에 의해 측정된 1개 이상의 형광 신호에 따라 분류된 표지된 세포를 포함하는 시험 세포 샘플로부터의 복수의 세포측정 이벤트를 포함하는 유동 세포측정 데이터를 수신하는 단계; (2) 정적 형광 역치 게이트를 개별적으로 1개 이상의 형광 신호 각각에 적용하는 단계로서, 여기서 1개 이상의 형광 신호 각각에 대한 정적 형광 역치 게이트는 (a) 각각이 1개 이상의 형광 신호에 따라 분류된 복수의 적어도 2개의 참조 세포 샘플에 대한 1개 이상의 형광 신호에 대해 유동 세포측정법에 의해 측정된 세포측정 이벤트로서, 복수의 적어도 2개의 참조 세포 샘플은 (i) 각각이 1개 이상의 형광 신호로 표지되지 않은 비염색된 세포의 집단을 포함하는 복수의 제1 참조 세포 샘플; 및 (ii) 복수의 제2 참조 세포 샘플을 포함하고, 여기서 복수의 제2 참조 세포 샘플 각각은 복수의 제1 참조 세포 샘플 중 하나와 동일한 공급원 유형의 세포로부터 유래되고, 여기서 복수의 제2 참조 세포 샘플 각각은 1개 이상의 형광 신호 중 적어도 하나로 표지된 염색된 세포의 적어도 하나의 집단을 포함하는 것인 세포측정 이벤트; 및 (b) 1개 이상의 형광 신호 각각에 대해 정적 형광 역치 게이트를, 각각의 형광 신호에 대해 역치 게이트가 (i) 1개 이상의 형광 신호 각각의 각 형광 신호에 대해 복수의 제1 참조 세포 샘플의 형광의 제90 백분위수 초과이고; (ii) 동일한 각 형광 신호에 대해 복수의 제2 참조 세포 샘플의 형광의 제10 백분위수 미만인 형광이도록 설정하는 것으로부터 결정되는 것인 단계; 및 (3) 1개 이상의 형광 신호 각각에 대해, 정적 역치 게이트 초과의 형광 신호를 갖는 시험 세포 샘플로부터의 세포의 하위세트를 확인하는 단계를 포함하는, 유동 세포측정 데이터로부터 세포측정 이벤트의 하위세트를 선택하는 방법이 제공된다.
또한 본원에 (1) 유동 세포측정기에 의해 측정된 1개 이상의 형광 신호에 따라 분류된 표지된 세포를 포함하는 시험 세포 샘플로부터의 복수의 세포측정 이벤트를 포함하는 유동 세포측정 데이터를 수신하는 단계; 및 (2) 정적 형광 역치 게이트를 개별적으로 1개 이상의 형광 신호 각각에 적용하는 단계로서, 여기서 1개 이상의 형광 신호 각각에 대한 정적 형광 역치 게이트는 본원에 개시된 정적 형광 역치 게이트를 결정하는 임의의 방법에 따라 결정되는 것인 단계를 포함하는, 유동 세포측정법을 사용하여 정적 형광 역치 게이트를 적용하는 방법이 제공된다.
또한 본원에 (1) 유동 세포측정기에 의해 측정된 1개 이상의 형광 신호에 따라 분류된 표지된 세포를 포함하는 시험 세포 샘플로부터의 복수의 세포측정 이벤트를 포함하는 유동 세포측정 데이터를 수신하는 단계; (2) 정적 형광 역치 게이트를 개별적으로 1개 이상의 형광 신호 각각에 적용하는 단계로서, 여기서 1개 이상의 형광 신호 각각에 대한 정적 형광 역치 게이트는 (a) 각각이 1개 이상의 형광 신호에 따라 분류된 복수의 적어도 2개의 참조 세포 샘플에 대한 1개 이상의 형광 신호에 대해 유동 세포측정법에 의해 측정된 세포측정 이벤트로서, 복수의 적어도 2개의 참조 세포 샘플은 (i) 각각이 1개 이상의 형광 신호로 표지되지 않은 비염색된 세포의 집단을 포함하는 복수의 제1 참조 세포 샘플; 및 (ii) 복수의 제2 참조 세포 샘플을 포함하고, 여기서 복수의 제2 참조 세포 샘플 각각은 복수의 제1 참조 세포 샘플 중 하나와 동일한 공급원 유형의 세포로부터 유래되고, 복수의 제2 참조 세포 샘플 각각은 1개 이상의 형광 신호 중 적어도 하나로 표지된 염색된 세포의 적어도 하나의 집단을 포함하는 것인 세포측정 이벤트; 및 (b) 1개 이상의 형광 신호 각각에 대해 정적 형광 역치 게이트를, 각각의 형광 신호에 대해 역치 게이트가 (i) 1개 이상의 형광 신호 각각의 각 형광 신호에 대해 복수의 제1 참조 세포 샘플의 형광의 제90 백분위수 초과이고; (ii) 동일한 각 형광 신호에 대해 복수의 제2 참조 세포 샘플의 형광의 제10 백분위수 미만인 형광이도록 설정하는 것으로부터 결정되는, 유동 세포측정법을 사용하여 정적 형광 역치 게이트를 적용하는 방법이 제공된다.
임의의 이러한 실시양태 중 일부에서, 시험 세포 샘플, 및 복수의 제1 및 제2 참조 세포 샘플 각각은 동일한 공급원 유형의 세포로부터의 것이다. 임의의 이러한 실시양태 중 일부에서, 세포의 공급원 유형은 세포주이다. 임의의 이러한 실시양태 중 일부에서, 세포의 공급원 유형은 대상체로부터의 1차 세포 집단이다. 임의의 상기 실시양태 중 일부에서, 각각의 시험 세포 샘플, 및 복수의 제1 및 제2 참조 세포 샘플 각각의 세포의 공급원 유형은 상이한 대상체로부터의 것이다. 임의의 이러한 실시양태 중 일부에서, 각각의 상이한 대상체는 동일하거나 유사한 질환 또는 상태를 갖는다. 임의의 이러한 실시양태 중 일부에서, 세포의 공급원 유형은 전혈 샘플, 분리반출술 샘플 또는 백혈구분리반출술 샘플이다. 임의의 이러한 실시양태 중 일부에서, 세포의 공급원 유형은 세포의 풍부화된 집단, 임의로 T 세포의 풍부화된 집단이다. 임의의 이러한 실시양태 중 일부에서, 세포의 공급원 유형은 재조합 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 세포의 조작된 집단이며, 임의로 여기서 재조합 단백질은 유전자 전달, 임의로 형질도입에 의해 세포의 집단 내로 도입된다. 임의의 이러한 실시양태 중 일부에서, 세포의 공급원 유형은 세포 요법이다.
임의의 이러한 실시양태 중 일부에서, 세포의 공급원 유형은 T 세포의 풍부화된 집단이다. 임의의 이러한 실시양태 중 일부에서, 재조합 단백질은 유전자 전달에 의해 세포의 집단 내로 도입되었다. 임의의 이러한 실시양태 중 일부에서, 재조합 단백질은 형질도입에 의해 세포의 집단 내로 도입되었다.
임의의 이러한 실시양태 중 일부에서, 복수의 제1 참조 세포 샘플은 2, 5, 10, 25, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000개 초과의 세포 샘플을 포함한다. 임의의 이러한 실시양태 중 일부에서, 복수의 제2 참조 세포 샘플은 2, 5, 10, 25, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000개 초과의 세포 샘플을 포함한다.
임의의 이러한 실시양태 중 일부에서, 복수의 제1 및 제2 참조 세포 샘플 각각은 임상 시험에서 질환 또는 상태를 갖는 대상체로부터의 세포의 공급원 유형이다. 임의의 이러한 실시양태 중 일부에서, 세포의 공급원 유형은 자가 세포 요법이고, 제1 및 제2 참조 세포 샘플 각각은 세포 요법을 시험하기 위한 임상 시험에서 대상체로부터의 세포 요법의 샘플이다. 임의의 이러한 실시양태 중 일부에서, 세포 요법은 T 세포 요법, 임의로 CAR-T 세포 요법, TCR-T 세포 요법, 또는 TIL 요법이다. 임의의 이러한 실시양태 중 일부에서, 세포 요법은 NK 세포 요법이다. 임의의 이러한 실시양태 중 일부에서, 세포 요법은 줄기 세포 요법이다.
임의의 이러한 실시양태 중 일부에서, 세포 요법은 CAR-T 세포 요법이다. 임의의 이러한 실시양태 중 일부에서, 세포 요법은 TCR-T 세포 요법이다. 임의의 이러한 실시양태 중 일부에서, 세포 요법은 TIL 요법이다.
임의의 이러한 실시양태 중 일부에서, 시험 세포 샘플 및 각각의 제2 참조 세포 샘플은 세포를 1개 이상의 형광 신호로 표지하기 위한 1종 이상의 염색 시약으로 세포 염색에 적용된다. 임의의 이러한 실시양태 중 일부에서, 1종 이상의 염색 시약은 마커에 특이적인 결합제 및 1개 이상의 형광 신호 중 하나를 방출할 수 있는 형광 염료를 포함한다. 임의의 이러한 실시양태 중 일부에서, 마커는 세포 표면 마커 또는 생존율 마커이다.
임의의 이러한 실시양태 중 일부에서, 각각의 1종 이상의 염색 시약은 마커에 특이적인 결합제 및 1개 이상의 형광 신호 중 하나를 방출할 수 있는 형광 염료를 포함한다.
임의의 이러한 실시양태 중 일부에서, 적어도 1종의 마커는 샘플 내 세포의 적어도 5% 이상에서 발현되거나 발현될 것으로 여겨지는 우세한 속성이다. 임의의 이러한 실시양태 중 일부에서, 적어도 1종의 마커는 샘플 내 세포의 5% 미만 상에서 발현되거나 발현되는 것으로 여겨지는 낮은 유병률 속성이다. 임의의 이러한 실시양태 중 일부에서, 샘플은 시험 세포 샘플 및 각각의 제2 참조 세포 샘플이다.
임의의 이러한 실시양태 중 일부에서, 1개 이상의 형광 신호는 2개 이상의 상이한 형광 신호를 포함한다. 임의의 이러한 실시양태 중 일부에서, 세포 염색은 세포를 2개 이상의 상이한 형광 신호로 표지하기 위한 다색 세포 염색이며, 여기서 각각의 염색 시약은 상이한 마커를 상이한 형광 신호로 표지한다. 임의의 이러한 실시양태 중 일부에서, 2개 이상의 상이한 형광 신호는 2 내지 10개의 형광 신호, 임의로 정확히 또는 약 2, 3, 4, 5 또는 6개를 포함한다. 임의의 이러한 실시양태 중 일부에서, 2개 이상의 상이한 형광 신호 각각은 상이한 방출 스펙트럼을 갖고/거나, 여기서 각각의 형광 신호의 피크 방출 스펙트럼은 중첩되지 않는다. 임의의 이러한 실시양태 중 일부에서, 2개 이상의 상이한 형광 신호는 PE-Cy7, APC, AF700, BV421, 아쿠아 및 BV605로 이루어진 군으로부터 선택된 염료에 의해 방출된 신호이다.
임의의 이러한 실시양태 중 일부에서, 2개 이상의 상이한 형광 신호는 2, 3, 4, 5 또는 6개 또는 약 2, 3, 4, 5 또는 6개의 형광 신호를 포함한다. 임의의 이러한 실시양태 중 일부에서, 2개 이상의 상이한 형광 신호 각각은 상이한 방출 스펙트럼을 갖는다. 임의의 이러한 실시양태 중 일부에서, 각각의 형광 신호의 피크 방출 스펙트럼은 중첩되지 않는다. 임의의 이러한 실시양태 중 일부에서, 2개 이상의 상이한 형광 신호 각각은 PE-Cy7, APC, AF700, BV421, 아쿠아 및 BV605로 이루어진 군으로부터 선택된 염료에 의해 방출된 신호이다.
임의의 이러한 실시양태 중 일부에서, 시험 세포 샘플 및 각각의 제2 참조 세포 샘플의 세포 염색은 동일한 염색 시약으로 및 동일한 프로토콜 조건을 사용하여 수행된다.
임의의 이러한 실시양태 중 일부에서, 복수의 제2 참조 세포 샘플은 동일한 염색된 세포의 이중 샘플을 포함한다. 임의의 이러한 실시양태 중 일부에서, 복수의 제2 참조 세포 샘플은 동일한 염색된 세포의 삼중 샘플을 포함한다.
임의의 이러한 실시양태 중 일부에서, 적어도 1개의 형광 신호에 대해 정적 형광 역치 게이트는 형광 신호에 대한 복수의 제1 참조 세포 샘플 중에서 형광의 제95 백분위수 초과인 형광이다. 임의의 이러한 실시양태 중 일부에서, 1개 이상의 형광 신호 중 적어도 하나에 대한 정적 형광 역치 게이트는 형광 신호에 대한 복수의 제1 참조 세포 샘플 중에서 형광의 제97 백분위수 초과인 형광이다. 임의의 이러한 실시양태 중 일부에서, 1개 이상의 형광 신호 중 적어도 하나에 대한 정적 형광 역치 게이트는 형광 신호에 대한 복수의 제1 참조 세포 샘플 중에서 형광의 제99 백분위수 초과인 형광이다.
임의의 이러한 실시양태 중 일부에서, 1개 이상의 형광 신호 중 적어도 하나에 대한 정적 형광 역치 게이트는 형광 신호에 대한 복수의 제2 참조 세포 샘플 중에서 형광의 제5 백분위수 미만인 형광이다. 임의의 이러한 실시양태 중 일부에서, 1개 이상의 형광 신호 중 적어도 하나에 대한 정적 형광 역치 게이트는 형광 신호에 대한 복수의 제2 참조 세포 샘플 중에서 형광의 제3 백분위수 미만인 형광이다. 임의의 이러한 실시양태 중 일부에서, 1개 이상의 형광 신호 중 적어도 하나에 대한 정적 형광 역치 게이트는 형광 신호에 대한 복수의 제2 참조 세포 샘플 중에서 형광의 제1 백분위수 미만인 형광이다.
임의의 이러한 실시양태 중 일부에서, 형광 신호에 대한 비염색된 세포의 집단 및 염색된 세포의 집단의 형광이 2배 초과만큼 상이한 경우에, 정적 형광 역치 게이트는 형광 신호에 대한 복수의 제2 참조 세포 샘플 중에서 형광의 제1 백분위수 미만 또는 형광의 모든 백분위수 미만으로 설정된다. 임의의 이러한 실시양태 중 일부에서, 형광 신호에 대한 비염색된 세포의 집단 및 염색된 세포의 집단의 형광이 5배 초과만큼 상이한 경우에, 정적 형광 역치 게이트는 형광 신호에 대한 복수의 제2 참조 세포 샘플 중에서 형광의 제1 백분위수 미만 또는 형광의 모든 백분위수 미만으로 설정된다. 임의의 이러한 실시양태 중 일부에서, 형광 신호에 대한 비염색된 세포의 집단 및 염색된 세포의 집단의 형광이 10배 초과만큼 상이한 경우에, 정적 형광 역치 게이트는 형광 신호에 대한 복수의 제2 참조 세포 샘플 중에서 형광의 제1 백분위수 미만 또는 형광의 모든 백분위수 미만으로 설정된다.
임의의 이러한 실시양태 중 일부에서, 낮은 유병률 속성에 대해, 정적 형광 역치 게이트의 설정은 1개 이상의 형광 신호 중 1개 이상에 대한 평균 형광 강도 (MFI)를 확인하는 것을 추가로 포함한다.
임의의 이러한 실시양태 중 일부에서, 1개 이상의 형광 신호 각각에 대해, 정적 형광 역치 게이트는 로그 유동 축 상의 짝수이다. 임의의 이러한 실시양태 중 일부에서, 1개 이상의 형광 신호 각각에 대해, 정적 형광 역치 게이트는 로그 유동 축 상에서 10의 자리까지 반올림되거나, 100의 자리까지 반올림되거나, 또는 1,000의 자리까지 반올림된다.
임의의 상기 실시양태 중 일부에서, 방법은 1개 이상의 형광 신호 중 적어도 2개, 1개 이상의 형광 신호 중 적어도 3개, 1개 이상의 형광 신호 중 적어도 4개, 1개 이상의 형광 신호 중 적어도 5개, 1개 이상의 형광 신호 중 적어도 6개, 또는 1개 이상의 형광 신호 중 적어도 7개 이상에 대해 정적 형광 역치 게이트 초과의 형광 신호를 갖는 시험 세포 샘플로부터의 세포의 하위세트를 확인하는 것을 추가로 포함한다.
임의의 이러한 실시양태 중 일부에서, 방법은 1개 이상의 형광 신호 모두에 대해 정적 형광 역치 게이트 초과의 형광 신호를 갖는 시험 세포 샘플로부터의 세포의 하위세트를 확인하는 것을 추가로 포함한다.
임의의 이러한 실시양태 중 일부에서, 정적 형광 역치 게이트는 시험 세포 샘플의 염색된 세포의 집단의 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%를 포함한다. 임의의 이러한 실시양태 중 일부에서, 1개 이상의 형광 신호 각각에 대해 정적 형광 역치 게이트는 시험 세포 샘플의 염색된 세포의 집단의 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%를 포함하도록 설정된다.
임의의 제공된 실시양태 중 일부에서, 1개 이상의 형광 신호 중 적어도 하나에 대한 세포측정 이벤트의 확인된 하위세트에 대해, 방법은 세포측정 이벤트의 확인된 하위세트의 적어도 하나의 형광 신호의 형광 강도를 평가하는 것을 추가로 포함한다. 임의의 제공된 실시양태 중 일부에서, 1개 이상의 형광 신호 각각에 대한 세포측정 이벤트의 확인된 하위세트 각각에 대해, 방법은 세포측정 이벤트의 확인된 하위세트의 형광 신호의 강도를 평가하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 형광 강도는 평균 형광 강도이다.
임의의 제공된 실시양태 중 일부에서, 1개 이상의 형광 신호 중 적어도 하나에 대한 세포측정 이벤트의 확인된 하위세트에 대해, 방법은 수집된 세포측정 이벤트의 총수와 비교하여 세포측정 이벤트의 확인된 하위세트의 백분율을 결정하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 형광 신호 각각에 대한 세포측정 이벤트의 확인된 하위세트 각각에 대해, 방법은 수집된 세포측정 이벤트의 총 개수에 비교된 각각의 형광 신호에 대한 세포측정 이벤트의 확인된 하위세트의 백분율을 결정하는 것을 추가로 포함한다.
임의의 제공된 실시양태 중 일부에서, 방법은 유동 세포측정기에 의한 1개 이상의 형광 신호의 보정을 포함한다. 일부 실시양태에서, 보정은 적어도 1일 1회 수행된다.
도 1a 및 1b는 유동 세포측정 이벤트의 분석의 그래프 표현을 도시한다. 도 1a는 상이한 샘플로부터의 복수의 세포 집단을 도시하고, 음성 비염색된 세포 집단의 상부 경계 및 양성 염색된 세포 집단의 하부 경계를 확인하고, 또한 양성 염색된 세포 집단으로부터 음성 비염색된 세포 집단을 분리하도록 설정된 형광 역치를 도시한다. 도 1b는 음성 비염색된 세포 집단 (좌측) 및 양성 염색된 세포 집단 (우측)의 대표적인 히스토그램 분석을 도시하며, 여기서 평균 형광 강도 (MFI) 및 형광의 제95 및 제99 백분위수가 음성 비염색된 세포 집단 (좌측)에 대해 결정되었고, MFI 및 형광의 제1 및 제5 백분위수가 양성 염색된 세포 집단 (우측)에 대해 결정되었다.
도 2a 및 2b는 AF700 형광단을 사용한, 우세한 속성에 대한 음성 비염색된 세포 집단 (도 2a) 및 양성 염색된 세포 집단 (도 2b)의 분석을 도시한다.
도 3은 6개의 시험된 속성 각각에 대해 형광 마이너스 원 (FMO) 게이팅 대조군에 대한 정적 형광 게이팅 역치의 적용을 도시한다.
도 2a 및 2b는 AF700 형광단을 사용한, 우세한 속성에 대한 음성 비염색된 세포 집단 (도 2a) 및 양성 염색된 세포 집단 (도 2b)의 분석을 도시한다.
도 3은 6개의 시험된 속성 각각에 대해 형광 마이너스 원 (FMO) 게이팅 대조군에 대한 정적 형광 게이팅 역치의 적용을 도시한다.
유동 세포측정법 방법에서 세포를 게이팅하는 것과 관련하여 정적 형광 역치 게이트를 결정하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 제공된 방법은 신속하며 효율적이고, 일부 측면에서, 고처리량 방식으로 세포 상에서 수행될 수 있는 자동화 게이팅 방법을 제공한다. 제공된 방법은 세포의 품질 관리 평가, 예컨대 세포의 특정 속성 또는 특징을 평가하는 목적에 특히 유용하다. 일부 실시양태에서, 정적 게이트 역치를 설정하기 위한 제공된 방법은 관심 시험 세포 샘플의 유사한 특징 또는 특색을 갖는 것으로 공지되거나 여겨지는 참조 세포 집단을 이용한다. 일단 설정되면, 정적 역치 게이트는 1개 이상의 시험 세포 샘플에 적용될 수 있다. 일부 측면에서, 제공된 방법은 임상 시험 또는 연구에서 또는 동일하거나 유사한 치료 요법에 따라 치료 중인 대상체 사이의 유사한 세포 샘플 (예를 들어, 세포의 동일한 공급원 유형)을 평가하는 데 특히 유용하다. 특정한 실시양태에서, 제공된 방법은 세포 요법 (예를 들어, T 세포 요법, 예컨대 CAR-T 세포), 특히 유사한 프로토콜 또는 절차에 따라 또는 유사한 군의 대상체 (예를 들어, 동일한 기저 질환 또는 상태를 갖는 대상체)로부터 생산 또는 생성된 것을 평가하거나 또는 특징화하는 데 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 정적 게이트 역치를 결정하는 방법은 (1) 복수의 적어도 2개의 참조 세포 샘플에 대한 1개 이상의 형광 신호에 대해 유동 세포측정법에 의해 세포측정 이벤트를 측정하는 단계로서, 복수의 적어도 2개의 참조 세포 샘플은 (a) 각각이 1개 이상의 형광 신호로 표지되지 않은 비염색된 세포의 집단을 포함하는 복수의 제1 참조 세포 샘플; 및 (b) 복수의 제2 참조 세포 샘플을 포함하고, 여기서 복수의 적어도 2개의 참조 세포 샘플 각각은 복수의 제1 참조 세포 샘플 중 하나와 동일한 공급원 유형의 세포로부터 유래되고, 복수의 제2 참조 세포 샘플 각각은 1개 이상의 형광 신호 중 적어도 하나로 표지된 염색된 세포의 적어도 하나의 집단을 포함하는 것인 단계; 및 (2) 1개 이상의 형광 신호 각각에 대한 정적 형광 역치 게이트를 설정하는 단계를 포함한다. 제공된 방법의 일부 실시양태에서, 정적 형광 역치 게이트는 양성 (염색된) 세포 포함을 최대화하고 음성 (비염색된) 세포 포함을 최소화하도록 설정된다. 일부 실시양태에서, 표지된 속성의 각각의 형광 신호 (예를 들어, 마커-특이적 형광단 염료에 의한 염색)에 대해, 정적 게이트 역치는 제1 참조 세포 샘플 중 1개 이상의 형광 신호 각각에 대한 세포의 형광의 상부 경계 및 제2 참조 세포 샘플 중 1개 이상의 형광 신호 각각에 대한 세포의 형광의 하부 경계에 기초하여 설정된다. 일부 실시양태에서, 상부 및 하부 경계는, 예컨대 양성/염색된 세포 포함을 최대화하고 음성/비염색된 세포 배제를 최소화하기 위해 샘플에서의 형광 분포의 백분위수로서 결정된다.
일부 실시양태에서, 제공된 방법은 또한 정적 형광 역치 게이트를, 정적 게이트 역치를 설정하는 데 사용된 것과 동일한 1개 이상의 형광 신호를 사용하여 동일한 속성 (예를 들어, 마커)에 대해 표지된 (염색된) 표지된 세포의 시험 집단으로부터의 세포측정 이벤트에 적용하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 정적 형광 역치 게이트를 적용하는 것은 목적하는 관심 집단의 특색 또는 특성을 평가하는 데 사용될 수 있다. 본원에 (1) 유동 세포측정기에 의해 측정된 1개 이상의 형광 신호에 따라 분류된 표지된 세포의 시험 집단으로부터 복수의 세포측정 이벤트를 포함하는 유동 세포측정 데이터를 수신하는 단계; (2) 정적 형광 역치 게이트를 개별적으로 1개 이상의 형광 신호 각각에 적용하는 단계; 및 (3) 1개 이상의 형광 신호 각각에 대해, 정적 역치 게이트 초과의 형광 신호를 갖는 세포의 시험 집단으로부터의 세포측정 이벤트의 하위세트를 확인하는 단계를 포함하는, 유동 세포측정 데이터로부터 세포측정 이벤트의 하위세트를 선택하는 방법이 제공된다.
일부 실시양태에서, 1개 이상의 형광 신호 중 적어도 하나에 대한 세포측정 이벤트의 확인된 하위세트에 대해, 방법은 세포측정 이벤트의 확인된 하위세트의 적어도 하나의 형광 신호의 형광 강도를 평가하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 형광 신호 각각에 대한 세포측정 이벤트의 확인된 하위세트 각각에 대해, 방법은 세포측정 이벤트의 확인된 하위세트의 형광 신호의 강도를 평가하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 형광 강도는 평균 형광 강도이다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 형광 신호 중 적어도 하나에 대한 세포측정 이벤트의 확인된 하위세트에 대해, 방법은 수집된 세포측정 이벤트의 총수와 비교하여 세포측정 이벤트의 확인된 하위세트의 백분율을 결정하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 형광 신호 각각에 대한 세포측정 이벤트의 확인된 하위세트 각각에 대해, 방법은 수집된 세포측정 이벤트의 총수와 비교하여 각 형광 신호에 대한 세포측정 이벤트의 확인된 하위세트의 백분율을 결정하는 것을 추가로 포함한다.
유동 세포측정법은 1개 이상의 레이저를 통과할 때 시스 유체 중의 입자, 예컨대 분자, 분석물-결합된 비드, 또는 개별 세포의 물리적 및 화학적 특성을 분석하는 데 사용되는 기술이다. 가장 통상적으로 세포 입자는 형광 표지되고, 이어서 레이저에 의해 여기되어 다양한 파장의 광을 방출한다. 유동 세포측정기는 형광 모노클로날 항체의 결합에 기초하여 세포 하위세트를 열거하는 데 널리 사용된다. 이들 기기는 현탁액 내의 세포가 조사를 위해 레이저 빔을 통해 단일-파일로 이동하도록 설계된다. 이어서, 세포는 이들이 입사 레이저 광을 산란시키는 방식에 의해 분류되며, 이는 세포의 크기 및 내부 입도에 대한 정보를 제공한다. 추가로, 이들이 방출할 수 있는 임의의 형광 광은 특이적 항체 결합의 검출, 및 따라서 후속 세포-하위세트 확인을 허용한다. 표준 유동 세포측정 장치 및 방법에 관한 일반적인 설명은 호프만(Hoffman) 및 한센(Hansen)의 발명의 명칭: "Method and Apparatus for Automated Identification and Enumeration of Specified Blood Cell Subclasses" (본원에 참고로 포함됨)에 관한 미국 특허 번호 4,284,412에 제공되어 있다.
일부 실시양태에서, 유동 세포측정기는 5개의 주요 구성요소를 갖는다. 첫째로, 감지를 위해 단일 파일을 광 빔을 통해 통과시킬 수 있도록 세포를 운반하고 정렬하는 유체 시스(sheath)가 형성된다. 둘째로, 측정 시스템, 통상적으로 빔이 유체 시스와 정렬되는 레이저 빔. 셋째로, 레이저 빔으로부터의 측정된 파라미터, 예를 들어 전방-산란광 및 측방-산란광의 아날로그 측정치를 컴퓨팅 시스템으로 처리될 수 있는 디지털 신호로 전환시키는 아날로그-디지털 전환 시스템 및 검출기가 제공된다. 넷째, 선형 또는 로그 증폭 시스템. 마지막으로, 신호의 분석을 위한 컴퓨터 시스템. 유동 세포측정기는 초마다 수천개의 입자를 분석할 수 있고, 특정 물리적 또는 화학적 특성을 갖는 입자를 능동적으로 분리하고 단리할 수 있다. 유동 세포측정법을 사용하여 샘플로부터 데이터를 수집하는 과정은 획득으로 칭한다. 획득은 유동 세포측정기에 물리적으로 연결되고 유동 세포측정기로부터 디지털 또는 아날로그 신호를 수신하는 컴퓨터에 의해 매개된다. 현대 유동 세포측정기는 전형적으로 입자의 표면 상의 다중 항체 또는 마커를 검출하도록 혼입된 다중 레이저 및 검출기를 갖는다.
유동 세포측정 장치 및 다른 입자 분석기 (예를 들어, 질량 세포측정기)는 특정의 미리 결정된 파라미터, 예를 들어 광 산란 및 형광을 포함한 광학 파라미터에 기초하여 입자 (예를 들어, 세포)의 확인 및 특징화를 제공한다. 유동 세포측정법에서, 예를 들어, 유체 현탁액 중의 입자 (예를 들어, 세포)는 입자가 전형적으로 1개 이상의 레이저로부터의 여기 광에 노출되고 입자의 광 산란 및 형광 특성이 측정되는 검출 영역을 지나 통과한다. 입자 또는 그의 성분은 전형적으로 검출을 용이하게 하기 위해 1개 이상의 형광 염료로 표지된다. 다수의 상이한 입자 또는 성분은 상이한 입자 또는 성분을 표지하기 위해 스펙트럼적으로 구분되는 형광 염료를 사용함으로써 동시에 검출될 수 있다. 일부 구현양태에서, 하나는 측정하고자 하는 산란 파라미터 각각에 대한 것이고, 하나는 검출하고자 하는 별개의 염료 각각에 대한 것인 다수의 광검출기가 분석기에 포함된다. 수득된 데이터는 각각의 광 산란 파라미터 및 형광 방출에 대해 측정된 신호를 포함한다.
일부 실시양태에서, 검출 영역 내의 센서는, 예를 들어 각각의 사용된 형광 염료에 대한 복수의 상이한 특성, 및 1개 이상의 광 산란 특성 예컨대 전방-산란광 (FCS), 측방-산란광 (SSC) 등을 동시에 검출하기 위해 배열된다. 예를 들어, 유동 세포측정기를 사용하여 측정된 파라미터는 전형적으로, 대부분 전방 방향을 따라 입자에 의해 산란되는 여기 광인 FSC; 대부분 측방 방향으로 입자에 의해 산란되는 여기 광인 SSC, 및 FL1, FL2 등으로 지칭되는 스펙트럼의 채널 (주파수 범위)에서 각각의 형광 염료로부터 방출된 광을 포함한다. 이들 센서, 예를 들어 광검출기는 이들이 검출 영역을 통과할 때 실시간으로 입자에 대한 데이터를 수득하고, 데이터를 데이터 저장을 위한 컴퓨터 판독가능 매체에 전송한다.
일부 실시양태에서, 유동 세포측정 샘플은 다차원 공간에서 다수의 포인트를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 차원은 약 3 내지 15 중 어디쯤이고, 통상적으로 세포에 상응하는 포인트 (또는 세포측정 이벤트)의 수는 종종 수만 내지 수십만개이다. 유동 세포측정 분석의 측면에서, 차원 중 2개는 통상적으로 세포의 물리적 특성 (예를 들어, 크기 및 입도)을 특징화하는 전방 산란 및 측방 산란의 강도에 상응한다. 나머지 차원은 주어진 파장에서의 세포의 형광의 강도 (색)에 상응한다.
유동 및 스캐닝 세포측정기 둘 다는, 예를 들어 BD 바이오사이언시스(BD Biosciences) (캘리포니아주 산호세)로부터 상업적으로 입수가능하다. 유동 세포측정법은, 예를 들어 문헌 [Landy et al. (eds.), Clinical Flow Cytometry, Annals of the New York Academy of Sciences Volume 677 (1993); Bauer et al. (eds.), Clinical Flow Cytometry: Principles and Applications, Williams & Wilkins (1993); Ormerod (ed.), Flow Cytometry: A Practical Approach, Oxford Univ. Press (1994); Jaroszeski et al. (eds.), Flow Cytometry Protocols, Methods in Molecular Biology No. 91, Humana Press (1997); 및 Shapiro HM: Practical Flow Cytometry. 4th edition. New York: John Wiley & Sons; 2003]에 기재되어 있으며, 이들 모두는 본원에 참조로 포함된다. 형광 영상화 현미경검사는, 예를 들어 본원에 참조로 포함된 문헌 [Pawley (ed.), Handbook of Biological Confocal Microscopy, 2nd Edition, Plenum Press (1989)]에 기재되어 있다.
일부 측면에서, 세포측정기는 측정된 데이터를 기록하고 데이터를 분석하기 위한 수단을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 데이터 저장 및 분석은 검출 전자 장치에 연결된 컴퓨터를 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 데이터는 표 형태로 저장될 수 있고, 여기서 각각의 행은 하나의 입자에 대한 데이터에 상응하고, 열은 각각의 측정된 파라미터에 상응한다. 유동 세포측정기로부터의 데이터를 저장하기 위한 표준 파일 포맷, 예컨대 "FCS" 파일 포맷의 사용은 개별 프로그램 및/또는 기계를 사용하여 데이터를 분석하는 것을 용이하게 한다. 현행의 분석 방법을 사용하여, 데이터는 전형적으로 시각화의 용이성을 위해 2차원 (2D) 플롯으로 디스플레이되지만, 다차원 데이터를 시각화하기 위해서는 다른 방법이 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 유동 세포측정 데이터는 각각의 이벤트를 독립적으로 플롯팅할 것이고, 이벤트마다 각각의 채널에서 검출된 광의 신호 강도를 나타낼 것이다. 일부 측면에서, 히스토그램은 전형적으로 하나의 축을 따라 단일 채널에서 검출된 강도를 플롯팅하고, 그 강도에서 검출된 이벤트의 수는 별개의 축에 있다. 하나의 특정한 강도에서 검출된 다수의 이벤트가 히스토그램 상에 스파이크로서 디스플레이될 것이다. 다른 측면에서, 이벤트는 2- 또는 3-차원 산점도 상에서 동시에 2 또는 3개의 파라미터를 비교하는 플롯인 도트-플롯으로서 플롯팅된다. 도트 플롯에서, 각각의 이벤트는 산점도 상에 단일 포인트로서 나타내어진다. 2D 플롯의 경우, 2개의 상이한 채널의 강도가 2개의 축을 따라 제시된다. 3차원 (3D) 플롯의 경우, 3개의 상이한 채널의 강도가 다양한 축을 따라 제시된다. 유사한 강도를 갖는 이벤트는 산점도 상의 동일한 영역에서 함께 클러스터링될 것이다. 예를 들어, 도트-플롯 데이터의 경우, 큰 샘플은 종종 플롯의 동일한 영역에 나타낸 이벤트의 무거운 클러스터를 생성할 것이다. 도트-플롯의 이들 영역에 추가의 해상도를 부가하기 위한 많은 방법이 존재한다. 예를 들어, 히트 맵을 사용하여 플롯의 주어진 영역 부근의 이벤트 밀도에 대한 정보를 제공할 수 있 있다.
수득된 데이터는 사실상 다차원이고, 여기서 각각의 입자는 측정된 파라미터에 의해 규정된 다차원 공간 내의 포인트에 상응할 수 있다. 특정 유형의 세포의 집단 또는 클러스터는 이러한 다차원 공간에서 서로에 대한 상관관계에 기초하여 확인된다. 상이한 세포 유형은 다양한 세포 단백질을 염료-표지된 항체로 표지함으로써 생성된 산란 파라미터 및 형광 방출에 의해 확인될 수 있다. 클러스터 및 그에 의한 집단의 확인은 세포의 게이팅에 의해 수행될 수 있다. 전형적으로, 관심 입자의 하위세트, 예컨대 혈액 샘플 중 CD4+ 림프구에 상응하는 게이트는 유동 시스템과 작동적으로 연관된 소프트웨어의 보조로 사용자에 의해 정의된다. 게이트는 이어서 계수, 단리, 또는 다른 조작을 위한 입자의 하위세트를 선택하기 위한 편리한 방법을 사용자에게 제공한다. 게이팅은 샘플로부터 생성될 수 있는 대량의 데이터를 이해하는 것을 보조하는 데 사용된다. 따라서, 게이트의 생성 및 조작을 효율적으로 용이하게 하는 것은 결과가 의미하는 것에 대한 이해 속도 및 정확도를 개선시키는 것을 보조할 수 있다.
일부 실시양태에서, 게이트는 "역치" 게이트일 수 있으며, 이는 다차원 공간 내의 개방 영역을 규정하는 단지 하나의 광학 파라미터에 대한 게이트이다. 대부분의 기존 방법에서, "역치" 게이팅은 주로, 관심 입자에 의해 생성된 신호를 처리하기 위해 설계된 검출 시스템 전자장치의 처리 능력을 압도할 샘플 내의 파편과 같은 물품에 의해 야기된 고주파 저수준 신호를 제거하기 위해 단지 전방 광 산란에 대해 사용되었다. 보다 통상적으로, "윈도우" 게이팅이 사용되며, 이는 통상적으로, 예를 들어 신호 값에 대한 상한 및 하한을 규정함으로써 다차원 공간에서 폐쇄 영역을 규정한다. "윈도우" 게이팅에서, 영역은 계수, 분류 또는 배제될 입자 또는 세포 유형에 상응하도록 생성된다. 일부 실시양태에서, 게이팅은 2개의 파라미터, 예컨대 측면 산란 (예를 들어, 수직축 상) 및 형광 신호 (예를 들어, 수평축 상)의 2D-플롯 상에서 수행된다.
일부 실시양태에서, 전통적인 유동 세포측정 게이팅 대조군은 전형적으로 이소형 게이팅 대조군 또는 형광색소 접합된 항체를 이용하며, 이는 특히 품질 관리 설정에서 유동 세포측정 방법을 위한 산업 표준 게이팅 대조군이다. 일부 측면에서, 이러한 방법은 객관적 게이트 배치를 가능하게 하기 때문에 유리할 수 있다. 다른 한편으로, 이러한 방법은 1개 이상의 단점 예컨대 플레이트당 처리량 감소, 검정 복잡성 증가 (예를 들어, 시간, 실패율, 요구되는 샘플 부피) 및 제품의 비용 증가와 연관된다.
또한, 많은 기존 방법에서, 게이팅은 데이터에 존재하는 세포측정 이벤트의 "산란 플롯" 또는 "도트 플롯"으로 지칭되는 1개 이상의 2차원 플롯에 디스플레이되는 집단 주위에 게이트를 그림으로써 수동으로 수행된다. 수동 게이팅에서, 사용자는 도트-플롯 상에서 1개 이상의 상이한 파라미터, 예를 들어 SSC, FSC 또는 상이한 형광 신호를 나타내는 1개 이상의 채널로부터 유동 세포측정 데이터 (또는 세포측정 이벤트)를 수집한다. 획득된 데이터에 기초하여, 사용자는 추가의 분석을 위해 세포의 하위집단을 선택하는 게이트 박스를 그린다. 연구자는 기하학적 게이트, 예컨대 직사각형, 타원형 또는 다각형을 그리기 위해 여러 도구 중 하나를 사용할 수 있다. 게이트 내의 세포의 하위집단은 1개 이상의 다른 대안적 채널로부터의 정보를 디스플레이하는 다른 플롯 상에 구체적으로 강조될 것이다. 단일 산점도에 대해 다중 게이트를 확립할 수 있고, 게이트는 "스태킹"되고 조합될 수 있다 (즉, 채널 1 및 2에서에 대해 게이팅된 세포의 하위집단은 채널 3 및 4에서에 대해 추가로 게이팅되어 보다 많은 특이성 및 보다 깊은 분석을 허용할 수 있음). 수동 플롯팅이 전형적으로 그의 유연성 및 그의 직관 때문에 사용되지만, 보다 큰 파일 크기에서 관심 세포 집단을 추출하는 데 수동 순차적 게이팅은 지루하고 노동 집약적이다. 또한, 관심 데이터가 완전히 기하학적이지는 않거나, 또는 이용가능한 도구를 사용하여 용이하게 표시되지 않을 수 있기 때문에, 도구가 정확한 게이트를 그리는 것은 가능하지 않을 수 있다. 또한, 수동 게이팅은 또한 수동 게이팅을 수행하는 상이한 사용자 사이의 변동성을 초래할 수 있다. 따라서, 개선된 방법이 필요하다.
제공된 방법은 유동 세포측정 패널에서 각각의 속성 (예를 들어, 형광 신호로 표지됨)에 대한 게이트로서 형광 역치를 생성하는 것에 기초한다. 정적 게이트 역치의 사용을 수반하는 제공된 실시양태는 양성 및 음성 염색 사이의 우수한 해상도, 충분한 대표적인 참조 샘플 (예를 들어, 임상 샘플), 및 세포측정기 및 시약의 강건한 형광 제어를 갖는 환경이 존재하는 샘플에 대해 특히 유리하다. 본원에 입증된 바와 같이, 정적 게이트 역치를 설정하고 사용하는 제공된 실시양태는, 예를 들어 FMO 샘플에 적용되는 경우 배경 형광을 적절하게 배제한다. 또한, 보고서는 현재의 게이팅 방법과 동등하다. 최종적으로, 제공된 방법은 낮은 사용자간 변동성, 예컨대 모든 평가된 속성에 대해 3% 미만의 변동 계수로 정밀하다. 따라서, 제공된 방법은 특히 신속하고 고처리량 품질 관리가 수행되기를 원하는 환경에서 유동 세포측정법에 의해 염색된 세포 샘플을 평가하기 위한 개선된 대안을 제공한다.
본원에 기재된 기술은 하드웨어, 소프트웨어, 펌웨어, 또는 그의 임의의 조합으로 구현될 수 있다. 이러한 기술은 범용 컴퓨터, 무선 통신 장치, 또는 무선 통신 장치 핸드셋 및 다른 장치에서의 응용을 비롯한 다수의 용도를 갖는 집적 회로 장치와 같은 임의의 다양한 장치에서 구현될 수 있다. 모듈 또는 구성요소로서 기재된 임의의 특징은 통합 논리 장치에서 함께 또는 개별적이지만 상호운용가능한 논리 장치로서 개별적으로 구현될 수 있다. 소프트웨어에서 실행되는 경우, 기술은 적어도 부분적으로, 실행시에, 상기 기재된 방법 중 하나 이상을 수행하는 명령을 포함하는 프로그램 코드를 포함하는 컴퓨터-판독가능 데이터 저장 매체에 의해 실현될 수 있다. 컴퓨터-판독가능 데이터 저장 매체는 패키징 물질을 포함할 수 있는 컴퓨터 프로그램 제품의 일부를 형성할 수 있다. 컴퓨터-판독가능 매체는 메모리 또는 데이터 저장 매체, 예컨대 랜덤 액세스 메모리 (RAM), 예컨대 동기식 동적 랜덤 액세스 메모리 (SDRAM), 판독-전용 메모리 (ROM), 비-휘발성 랜덤 액세스 메모리 (NVRAM), 전기적으로 소거 및 프로그램가능한 판독-전용 메모리 (EEPROM), 플래쉬 메모리, 자기 또는 광학 데이터 저장 매체 등을 포함할 수 있다. 컴퓨터-판독가능 매체는 비-일시적 저장 매체일 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 기술은 적어도 부분적으로, 프로그램 코드를 명령 또는 데이터 구조의 형태로 운반 또는 통신하며, 컴퓨터, 예컨대 전파된 신호 또는 파에 의해 접근, 판독 및/또는 실행될 수 있는 컴퓨터-판독가능 통신 매체에 의해 실현될 수 있다.
프로그램 코드는 1개 이상의 프로세서, 예컨대 1개 이상의 디지털 신호 프로세서 (DSP), 범용 마이크로프로세서, 주문형 집적 회로 (ASIC), 필드 프로그램가능 로직 어레이 (FPGA), 또는 다른 등가의 통합 또는 개별 논리 회로를 포함할 수 있는 프로세서에 의해 실행될 수 있다. 이러한 프로세서는 본 개시내용에 기재된 임의의 기술을 수행하도록 구성될 수 있다. 범용 프로세서는 마이크로프로세서일 수 있지만; 대안적으로, 프로세서는 임의의 통상적인 프로세서, 컨트롤러, 마이크로컨트롤러, 또는 상태 기계일 수 있다. 프로세서는 또한 컴퓨팅 장치의 조합, 예를 들어 DSP 및 마이크로프로세서의 조합, 복수의 마이크로프로세서, DSP 코어와 함께 1개 이상의 마이크로프로세서, 또는 임의의 다른 이러한 구성으로서 구현될 수 있다. 따라서, 본원에 사용된 용어 "프로세서"는 임의의 상기 구조, 상기 구조의 임의의 조합, 또는 본원에 기재된 기술의 실행에 적합한 임의의 다른 구조 또는 장치를 지칭할 수 있다. 또한, 일부 측면에서, 본 명세서에 설명된 기능성은 코딩 및 디코딩을 위해 구성된 전용 소프트웨어 모듈 또는 하드웨어 모듈 내에 제공되거나, 조합된 비디오 인코더-디코더(CODEC)에 통합될 수도 있다.
본 출원에서 언급된 특허 문헌, 과학 논문 및 데이터베이스를 비롯한 모든 간행물은 각각의 개별 간행물이 개별적으로 참조로 포함된 것과 동일한 정도로 모든 목적을 위해 그 전문이 참조로 포함된다. 본원에 제시된 정의가 본원에 참조로 포함된 특허, 출원, 공개된 출원 및 다른 공개에 제시된 정의와 상반되거나 또는 달리 모순되는 경우에, 본원에 제시된 정의는 본원에 참조로 포함된 정의보다 우선한다.
본원에 사용된 섹션 표제는 단지 조직화 목적을 위한 것이며, 기재된 대상을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
I. 유동 세포측정법 및 데이터 획득
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 유동 세포측정 데이터를 수신하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 유동 세포측정기에 의해 측정된 1개 이상의 형광 신호에 따라 분류된 표지된 세포의 시험 집단으로부터 복수의 세포측정 이벤트를 포함하는 유동 세포측정 데이터를 수신하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포의 시험 집단은 샘플, 예를 들어 생물학적 샘플이거나 또는 그 내에 포함된다. 제공된 실시양태에서, 세포의 시험 집단은 세포 샘플의 1개 이상의 속성을 표지하기 위해 1개 이상의 형광 신호로 염색되고, 유동 세포측정법에 의해 평가되어 세포측정 이벤트를 수집한다. 세포측정 이벤트는 섹션 II에 기재된 방법에 따른 것을 포함하여, 본원에 기재된 바와 같은 정적 게이트 역치를 설정함으로써 분석될 수 있다.
일부 실시양태에서, 유동 세포측정 데이터 수집은 유체 시스템, 광학 및 검출, 신호 처리 및 정전기 세포 분류와 같은 수많은 원리를 수반한다. 일부 실시양태에서, 유동 세포측정법은 샘플로부터의 개별 입자, 예컨대 개별 세포의 특성을 측정하는 데 사용된다.
일부 실시양태에서, 유동 세포측정 데이터 수집은 유동 세포측정 세포 샘플의 수집으로 시작한다. 유동 세포측정법 세포 샘플을 획득하는 데 있어서, 세포 샘플의 직접 또는 간접 염색을 수반하는 유동 세포측정법 프로토콜이 사용될 수 있다. 직접 염색 유동 세포측정법 프로토콜은 살아있는 또는 고정된 세포를 세포 표면 항원에 대한 직접 표지된 항체와 함께 인큐베이션하는 가장 통상적인 염색 방법 중 하나이다. 이용가능한 직접 표지된 항체가 없는 경우, 또는 이미 획득한 신호를 증폭시키는 것이 목표인 경우, 간접 염색 유동 세포측정법을 사용한다. 간접 염색 유동 세포측정법은 세포가 관심 항원에 대한 1차 항체로 염색되고, 제1의 1차 항체를 인식하는 표지된 2차 항체를 사용하여 가시화되는 경우이다. 통상의 기술자가 알 수 있는 바와 같이, 염색의 다른 변형법, 예를 들어 항원이 세포 표면 상에 존재하지 않는 경우 사용되는 세포내 염색이 가능하다.
일부 실시양태에서, 염색을 위한 세포 (예를 들어, 시험 샘플)는 세포주 또는 생물학적 샘플로부터의 세포일 수 있다. 관심 세포를 함유하는 임의의 생물학적 샘플을 염색을 위해 수득할 수 있다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 대상체, 예컨대 특정한 질환 또는 상태를 갖거나 요법 (예를 들어, 세포 요법)을 필요로 하거나 또는 치유적 치료 (예를 들어, 세포 요법)가 투여될 대상체로부터 수득되거나 또는 그로부터 유래된다. 일부 측면에서, 대상체는 인간, 예컨대 특정한 치료적 개입을 필요로 하는 환자인 대상체이다. 따라서, 일부 실시양태에서 세포는 1차 세포, 예를 들어 1차 인간 세포이다. 샘플은 대상체로부터 직접 취한 조직, 체액 및 다른 샘플을 포함한다. 생물학적 샘플은 생물학적 공급원으로부터 직접 수득된 샘플 또는 프로세싱되는 샘플일 수 있다. 생물학적 샘플은 체액, 예컨대 혈액, 혈장, 혈청, 뇌척수액, 활액, 소변 및 땀, 조직 및 기관 샘플, 예컨대 그로부터 유래된 프로세싱된 샘플을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
일부 측면에서, 샘플은 혈액 또는 혈액-유래 샘플이거나, 또는 분리반출술 또는 백혈구분리반출술 생성물이거나 또는 이로부터 유래된다. 예시적인 샘플은 전혈, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), 백혈구, 골수, 흉선, 조직 생검, 종양, 백혈병, 림프종, 림프절, 장 연관 림프성 조직, 점막 연관 림프성 조직, 비장, 다른 림프성 조직, 간, 폐, 위, 장, 결장, 신장, 췌장, 유방, 골, 전립선, 자궁경부, 고환, 난소, 편도 또는 다른 기관, 및/또는 그로부터 유래된 세포를 포함한다. 샘플은 세포 요법, 예를 들어 입양 세포 요법과 관련하여 자가 및 동종이형 공급원으로부터의 샘플을 포함한다.
일부 예에서, 대상체의 순환 혈액으로부터의 세포는, 예를 들어 분리반출술 또는 백혈구분리반출술에 의해 수득된다. 샘플은, 일부 측면에서, T 세포, 단핵구, 과립구, B 세포, 다른 유핵 백혈구, 적혈구 및/또는 혈소판을 포함한 림프구를 함유하고, 일부 측면에서 적혈구 및 혈소판 이외의 세포를 함유한다.
일부 실시양태에서, 대상체로부터 수집된 혈액 세포를 세척하여, 예를 들어 혈장 분획을 제거하고, 후속 프로세싱 단계를 위해 세포를 적절한 완충제 또는 배지에 넣는다. 일부 실시양태에서, 세포를 포스페이트 완충 염수 (PBS)로 세척한다. 일부 실시양태에서, 세척 용액은 칼슘 및/또는 마그네슘 및/또는 많은 또는 모든 2가 양이온이 결여되어 있다. 일부 측면에서, 세척 단계는 제조업체의 지침에 따라 반자동화 "관통형" 원심분리기 (예를 들어, 코브(Cobe) 2991 세포 프로세서, 백스터(Baxter))에 의해 달성된다. 일부 측면에서, 세척 단계는 제조업체의 지침에 따라 접선 유동 여과 (TFF)에 의해 달성된다. 일부 실시양태에서, 세포는 세척 후에 다양한 생체적합성 완충제, 예컨대 예를 들어 Ca2+/Mg2+ 무함유 PBS 중에 재현탁된다. 특정 실시양태에서, 혈액 세포 샘플의 성분을 제거하고, 세포를 배양 배지에 직접 재현탁시킨다.
일부 실시양태에서, 제조 방법은 염색 전에 세포를 동결, 예를 들어 동결보존하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 동결 및 후속 해동 단계는 과립구를 제거하고, 어느 정도 세포 집단 내의 단핵구를 제거한다. 일부 실시양태에서, 세포는, 예를 들어 혈장 및 혈소판을 제거하기 위한 세척 단계 후에 동결 용액 중에 현탁된다. 일부 측면에서 임의의 다양한 공지된 동결 용액 및 파라미터가 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 약 12.5%, 12.0%, 11.5%, 11.0%, 10.5%, 10.0%, 9.5%, 9. 0%, 8.5%, 8.0%, 7.5%, 7.0%, 6.5%, 6.0%, 5.5%, 또는 5.0% DMSO, 또는 약 1% 또는 약 1% 내지 약 15%, 또는 약 6% 내지 약 12%, 또는 약 5% 내지 약 10%, 또는 약 6% 내지 약 8% DMSO의 최종 농도를 갖는 배지 및/또는 용액 중에서 동결, 예를 들어 동결냉동 또는 동결보존된다. 특정한 실시양태에서, 세포는 약 5.0%, 4.5%, 4.0%, 3.5%, 3.0%, 2.5%, 2.0%, 1.5%, 1.25%, 1.0%, 0.75%, 0.5% 또는 0.25% HSA, 또는 0.1% 내지 -5%, 0.25% 내지 4%, 0.5% 내지 2%, 또는 1% 내지 2% HSA의 최종 농도를 갖는 배지 및/또는 용액 중에서 동결, 예를 들어 동결냉동 또는 동결보존된다. 한 예는 20% DMSO 및 8% 인간 혈청 알부민 (HSA)을 함유하는 PBS, 또는 다른 적합한 세포 동결 배지를 사용하는 것을 수반한다. 일부 실시양태에서, 이어서 이를 DMSO 및 HSA의 최종 농도가 각각 10% 및 4%이도록 배지로 1:1 희석한다. 일부 실시양태에서, 세포는 이어서 분당 약 1°의 속도로 또는 약 -80℃로 동결되고, 액체 질소 저장 탱크의 증기 상에 저장된다.
일부 실시양태에서, 1개 이상의 제조 및/또는 비-친화도 기반 세포 분리 단계가 세포의 염색 전에 수행될 수 있다. 일부 예에서, 세포가 1개 이상의 시약의 존재 하에 세척, 원심분리 및/또는 인큐베이션되어 예를 들어, 원치 않는 성분을 제거하고, 목적하는 성분을 풍부화하고, 특정 시약에 대해 감수성인 세포를 용해 또는 제거한다. 일부 예에서, 세포는 1개 이상의 특성, 예컨대 밀도, 부착 특성, 크기, 감수성 및/또는 특정한 성분에 대한 내성에 기초하여 분리된다. 일부 실시양태에서, 방법은 밀도-기반 세포 분리 방법, 예컨대 적혈구를 용해시키고 퍼콜 또는 피콜 구배를 통해 원심분리함으로써 말초 혈액으로부터 백혈구를 제조하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 세포 집단의 세포는 유동 세포측정기에 의해 측정될 수 있는 형광 신호를 생성하는 1개 이상의 형광 마커 (예를 들어, 1개 이상의 형광단)로 표지된다. 일부 실시양태에서, 수득된 샘플의 적어도 일부는 샘플 중 세포를 1종 이상의 염색 시약과 함께 인큐베이션함으로써 세포 염색에 적용되며, 여기서 각각의 염색 시약은 형광 신호 또는 마커 (예를 들어, 형광단)를 함유한다. 염색 시약은 특정한 세포 유형 또는 세포의 하위유형의 특징화, 선택 또는 단리를 위한 임의의 시약일 수 있다. 일부 실시양태에서, 염색 시약 또는 시약들은 면역친화성-기반 시약, 예컨대 항체이다. 일부 실시양태에서, 염색 시약은 세포의 발현 또는 1종 이상의 마커의 발현 수준에 기초하여, 예컨대 1종 이상의 특이적 분자, 예컨대 표면 마커, 예를 들어 표면 단백질, 세포내 마커 또는 핵산의 세포 내 또는 세포 상의 발현 또는 존재에 기초하여 세포를 염색한다. 일부 실시양태에서, 마커는 세포 표면 마커이다.
샘플에서 관심 세포 유형 상에서 발현되는 것으로 공지되거나 여겨지는 임의의 마커는 염색 시약에 의해 표적화될 수 있다. 예시적인 마커는 림프구 집단, 예컨대 T 세포 상에 존재하는 마커를 포함한다. 일부 실시양태에서, 샘플은 전혈 샘플일 수 있다. 일부 실시양태에서, 샘플은 분리반출술 샘플이다. 일부 실시양태에서, 샘플은 백혈구분리반출술 샘플이다. 일부 실시양태에서, 세포 표면 마커는 1개 이상의 표면 마커 CD3, CD4, CD8, CD45, CD45RA, CD45RO, CD28, CD62L, CCR7, CD27, CD95, CD127을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 세포는 이러한 마커에 특이적으로 결합하는 1종 이상의 항체 또는 결합 파트너와의 인큐베이션에 의해 선택된다.
일부 실시양태에서, 마커는 집단 내의 1개 이상의 세포 상에서 또는 그에 의해 발현되는 것으로 공지된 재조합 단백질에 대한 마커일 수 있다. 일부 실시양태에서, 마커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 세포 형질전환 방법, 예컨대 세포 형질감염 또는 형질도입에 의해 세포 내로 도입될 수 있다. 일부 실시양태에서, 마커는 재조합 수용체, 예컨대 키메라 항원 수용체 (CAR) 또는 TCR이다. 일부 실시양태에서, CAR에 대한 염색 시약은 항원-결합 도메인에 대해 (예를 들어, 항-이디오타입 항체) 또는 CAR의 세포외 도메인의 스페이서 영역 (예를 들어, 이뮤노글로불린 힌지 영역)에 대해 지시된 항체일 수 있다. 일부 실시양태에서, TCR에 대한 염색 시약은 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 사량체일 수 있다.
일부 실시양태에서, 마커는 세포에서 또 다른 재조합 단백질과 공동-발현되는 대용 마커 (형질도입 마커로도 불림)인 재조합 단백질이다. 형질도입 마커 또는 대용 마커는 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 재조합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 도입된 세포를 검출하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 형질도입 마커는 세포의 변형을 나타내거나 확인할 수 있다. 일부 실시양태에서, 대용 마커는 세포 표면 상에서 재조합 수용체, 예를 들어, CAR과 공동-발현되도록 제조된 단백질이다. 특정한 실시양태에서, 이러한 대용 마커는 활성을 거의 또는 전혀 갖지 않도록 변형된 표면 단백질이다. 특정 실시양태에서, 대용 마커는 재조합 단백질 (예를 들어, 재조합 수용체)을 코딩하는 동일한 폴리뉴클레오티드 상에서 코딩된다. 일부 실시양태에서, 재조합 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 내부 리보솜 진입 부위 (IRES)에 의해 임의로 분리된 마커를 코딩하는 핵산 서열, 또는 자가-절단 펩티드 또는 리보솜 스키핑을 유발하는 펩티드, 예컨대 2A 서열, 예컨대 T2A, P2A, E2A 또는 F2A를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된다. 외인성 마커 유전자는 일부 경우에 세포의 검출 또는 선택을 허용하도록, 또한 일부 경우에 세포 자살을 촉진하도록 조작된 세포와 관련하여 이용될 수 있다.
예시적인 대용 마커는 세포 표면 폴리펩티드의 말단절단된 형태, 예컨대 비-기능성이고 세포 표면 폴리펩티드의 전장 형태에 의해 통상적으로 형질도입되는 신호 또는 신호들을 형질도입하지 않거나 형질도입할 수 없고/없거나 내재화하지 않거나 내재화할 수 없는 말단절단된 형태를 포함할 수 있다. 말단절단된 형태의 성장 인자 또는 다른 수용체, 예컨대 말단절단된 인간 표피 성장 인자 수용체 2 (tHER2), 말단절단된 표피 성장 인자 수용체 (EGFRt) 또는 전립선-특이적 막 항원 (PSMA) 또는 그의 변형된 형태를 포함하는 예시적인 말단절단된 세포 표면 폴리펩티드. EGFRt는 항체 세툭시맙 (에르비툭스(Erbitux)®) 또는 다른 치료 항-EGFR 항체 또는 결합 분자에 의해 인식되는 에피토프를 함유할 수 있고, 이는 EGFRt 구축물 및 재조합 수용체, 예컨대 키메라 항원 수용체 (CAR)로 조작된 세포를 확인 또는 선택하는 데, 및/또는 수용체를 발현하는 세포를 제거 또는 분리하는 데 사용될 수 있다. 미국 특허 번호 8,802,374 및 문헌 [Liu et al., Nature Biotech. 2016 April; 34(4): 430-434)]을 참조한다. 일부 측면에서, 마커, 예를 들어, 대용 마커는 CD34, NGFR, CD19 또는 말단절단된 CD19, 예를 들어, 말단절단된 비-인간 CD19, 또는 표피 성장 인자 수용체 (예를 들어, tEGFR)의 전부 또는 일부 (예를 들어, 말단절단된 형태)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 마커를 코딩하는 핵산은 링커 서열, 예컨대 절단가능한 링커 서열, 예를 들어 T2A를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된다. 예를 들어, 마커, 및 임의로 링커 서열은 PCT 공개 번호 WO2014031687에 개시된 바와 같은 임의의 것일 수 있다. 예를 들어, 마커는 임의로 링커 서열, 예컨대 T2A 절단가능한 링커 서열에 연결된 말단절단된 EGFR (tEGFR)일 수 있다.
일부 실시양태에서, 대용 마커는 형광 단백질, 예컨대 녹색 형광 단백질 (GFP), 증강 녹색 형광 단백질 (EGFP), 예컨대 수퍼폴드 GFP, 적색 형광 단백질 (RFP), 예컨대 tdTomato, mCherry, mStrawberry, AsRed2, DsRed 또는 DsRed2, 시안 형광 단백질 (CFP), 청색 녹색 형광 단백질 (BFP), 증강 청색 형광 단백질 (EBFP), 및 황색 형광 단백질 (YFP), 및 이들의 변이체 (형광 단백질의 종 변이체, 단량체 변이체, 및 코돈-최적화 및/또는 증강 변이체 포함)이거나 또는 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 마커는 효소, 예컨대 루시페라제, 이. 콜라이로부터의 lacZ 유전자, 알칼리성 포스파타제, 분비 배아 알칼리성 포스파타제 (SEAP), 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제 (CAT)이거나 또는 이를 포함한다. 예시적인 발광 리포터 유전자는 루시페라제 (luc), β-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 (CAT), β-글루쿠로니다제 (GUS) 또는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 마커는 세포 건강 마커이다. 세포 건강 마커의 비제한적 예는 카스파제 절단 생성물, 예컨대 염료 기질, c-PARP, 절단된 시토케라틴 18, 절단된 카스파제, 절단된 카스파제 3, 시토크롬 C, 아폽토시스 유도 인자 (AIF), 아폽토시스 억제제 (IAP) 패밀리 구성원, 뿐만 아니라 다른 분자, 예컨대 Bcl-2 패밀리 구성원, 예컨대 항아폽토시스 단백질 (MCL-1, BCL-2, BCL-XL), BH3-단독 아폽토시스 증감인자 (PUMA, NOXA, Bim, Bad), 및 아폽토시스촉진 단백질 (Bad, Bax) (하기 참조), p53, c-myc 원종양유전자, APO-1/Fas/CD95, 성장 자극 유전자, 또는 종양 억제 유전자, 미토콘드리아 막 염료, 아넥신-V, 7-AAD, 아민 아쿠아, 트리판 블루, 아이오딘화프로피듐 또는 다른 생존율 염료를 포함한다. 일부 실시양태에서, 마커는 아폽토시스의 마커인 아넥스 V이다. 살아있는 세포는, 정상적으로는 세포내인 포스파티딜세린에 결합하지만 세포가 아폽토시스 또는 다른 형태의 세포 사멸을 겪을 때 세포 표면으로 이동하는 아넥신 V로 염색될 수 있다.
일부 실시양태에서, 염색 시약은 사멸 세포에 결합된 경우 특정한 파장에서 형광을 방출하도록 사멸 세포에 대해 선택성인 생존율 염료인 형광단 염료이다. 일부 실시양태에서, 생존율 염료는 아민 반응성 염료, 예컨대 염료에 공유 결합된 NHS 활성 에스테르 (숙신이미딜 에스테르, 술포숙신이미딜 에스테르, 테트라플루오로페닐 에스테르 또는 술포디클로로페놀 에스테르를 포함할 수 있음)이다. 이러한 생존율 염료는 형광 반응성 염료와 세포 단백질 내의 1급 아민, 예컨대 리신 잔기의 반응에 기초하여 세포 생존율 검출을 가능하게 한다. 이들 염료는 살아있는 세포 막을 침투할 수 없으므로, 살아있는 세포의 경우에는 세포 표면 단백질만이 염료와 반응하는 데 이용가능하여, 희미한 염색을 초래한다. 그러나, 사멸 세포에서, 반응성 염료는 사멸 세포의 손상된 막을 투과하고 내부 및 외부 아민 둘 다를 염색하여, 보다 강한 염색을 유발할 수 있다. 일부 실시양태에서, 공유 결합된 염료는 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 405, 퍼시픽 블루, 알렉사 플루오르 430, 플루오레세인(Fluorescein), 알렉사 플루오르 488, 텍사스 레드(Texas Red), 알렉사 플루오르 594일 수 있다. 일부 실시양태에서, 형광단 염료는 녹색, 적색, 청색, 보라색, 아쿠아색 또는 황색으로서 정의될 수 있다. 녹색 형광 및 적색 형광 염료는 488nm 레이저에 의해 여기되고, 보라색, 아쿠아색 및 황색 염료는 상이한 방출 파장을 갖는 405nm 여기 공급원을 필요로 하고, 청색 형광 반응성 염료는 UV 여기를 필요로 하고, 최종적으로 원적색 및 근적외선 염료는 633/635 nm에서 여기된다. 상이한 파장에서 여기가능한 상이한 형광색소를 갖는 아민 반응성 염료의 이용가능성은 사용된 유동 세포측정기의 임의의 구성에 적합한 시약의 조합을 선택하는 것을 가능하게 한다.
일부 실시양태에서, 생존율 염료는 아이오딘화프로피듐, DRAQ7, 7-AAD, 이바이오사이언스 픽서블 바이어빌러티 다이 이플루오르(eBioscience Fixable Viability Dye eFluor)® 455UV, 이바이오사이언스 픽서블 바이어빌러티 다이 이플루오르® 450, 이바이오사이언스 픽서블 바이어빌러티 다이 이플루오르® 506, 이바이오사이언스 픽서블 바이어빌러티 다이 이플루오르® 520, 이바이오사이언스 픽서블 바이어빌러티 다이 이플루오르® 660, 이바이오사이언스 픽서블 바이어빌러티 다이 이플루오르® 780, 바이오레전드 좀비 아쿠아(BioLegend Zombie Aqua)™, 바이오레전드 좀비 NIR™, 바이오레전드 좀비 레드™, 바이오레전드 좀비 바이올렛™, 바이오레전드 좀비 UV™, 또는 바이오레전드 좀비 옐로우™이다.
일부 실시양태에서, 염색 시약은 마커에 결합, 예컨대 특이적으로 결합할 수 있는 결합제에, 예컨대 화학적 접합에 의해 부착될 수 있는 1종 이상의 형광 마커로 구성된다. 일부 실시양태에서, 결합제는 단백질이다. 일부 실시양태에서, 결합제는 항체 또는 항원-결합 단편이다. 형광 마커는 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 결합제, 예를 들어 항체에 접합될 수 있다.
관련 기술분야에 널리 공지된 바와 같이, "항체"는 이뮤노글로불린 (Ig) 분자의 가변 영역에 위치한 적어도 1개의 에피토프 인식 부위를 통해 표적, 예컨대 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, 지질 또는 폴리펩티드에 특이적으로 결합할 수 있는 이뮤노글로불린 (Ig) 분자이다. 본원에 사용된 상기 용어는 무손상 폴리클로날 또는 모노클로날 항체 뿐만 아니라 그의 단편, 예컨대 dAb, Fab, Fab', F(ab')2, Fv), 단일 쇄 (scFv), 그의 합성 변이체, 자연 발생 변이체, 요구되는 특이성의 항원-결합 단편을 갖는 항체 부분을 포함하는 융합 단백질, 키메라 항체, 나노바디, 및 요구되는 특이성의 항원-결합 부위 또는 단편 (에피토프 인식 부위)을 포함하는 이뮤노글로불린 분자의 임의의 다른 변형된 구성을 포괄한다. CH3 도메인에 연결된 scFv를 포함하는 미니바디가 또한 본원에 포함된다 (S. Hu et al., Cancer Res., 56, 3055-3061, 1996). 예를 들어, 문헌 [Ward, E. S. et al., Nature 341, 544-546 (1989); Bird et al., Science, 242, 423-426, 1988; Huston et al., PNAS USA, 85, 5879-5883, 1988); PCT/US92/09965; WO94/13804; P. Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 6444-6448, 1993; Y. Reiter et al., Nature Biotech, 14, 1239-1245, 1996; S. Hu et al., Cancer Res., 56, 3055-3061, 1996]을 참조한다.
마커에 "특이적으로 결합" 또는 "우선적으로 결합" (본원에서 상호교환가능하게 사용됨)하는 결합제, 예컨대 항체는 관련 기술분야에서 널리 이해되는 용어이다. 분자는 대안적 마커보다 특정한 마커 표적과 보다 빈번하게, 보다 신속하게, 보다 긴 지속기간으로 및/또는 보다 큰 친화도로 반응하거나 회합하는 경우에 "특이적 결합" 또는 "우선적 결합"을 나타내는 것으로 언급된다. 항체는 다른 물질에 결합하는 것보다 더 큰 친화도, 결합력으로, 더 용이하게, 및/또는 더 긴 지속기간으로 결합하는 경우에 표적에 특이적으로 결합하거나 또는 우선적으로 결합한다. 또한, 이러한 정의를 판독함으로써 특이적 결합 또는 우선적 결합이 배타적 결합을 (포함할 수는 있지만) 반드시 필요로 하는 것은 아니라는 것이 이해된다. 이러한 특이적 또는 우선적 결합을 결정하는 방법, 예를 들어 면역검정이 또한 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다.
제공된 실시양태에서, 결합제, 예컨대 항체는 형광 마커, 예컨대 형광단에 접합된다. 예를 들어, 세포는 1개 이상의 형광 표지된 항체와 함께 인큐베이션될 수 있다. 일부 실시양태에서, 유동 세포측정 분석에 사용하기에 적합한 임의의 형광 마커 또는 형광단이 사용될 수 있다. 형광 마커의 일부 비제한적 예는 형광 단백질 (예를 들어, GFP, YFP, RFP), 형광 모이어티 (예를 들어, 플루오레세인 이소티오시아네이트) (FITC), 피코에리트린 (PE), 알로피코시아닌 (APC), 알렉사 플루오르 (AF)), 핵산 착색제 (예를 들어, 4',6-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI), SYT016, 아이오딘화프로피듐 (PI), 세포 막 염색제 (예를 들어, FMI-43), 세포 기능적 염료 (예를 들어, 플루오-4, 인도-1), 및 합성 염료 (예를 들어, 브릴리언트 바이올렛 (BV))를 포함한다. 예시적인 형광단은 히드록시쿠마린, 캐스케이드 블루, 다일라이트 405 퍼시픽 오렌지, 알렉사 플루오르 430, 플루오레세인, 오레곤 그린, 알렉사 플루오르 488, 바디피 493, 2,7-디클로로플루오레시엔, ATTO 488, 크로메오 488, 다일라이트 488, 하이라이트 488, 알렉사 플루오르 532, 알렉사 플루오르 555, ATTO 550, 바디피(BODIPY) TMR-X, CF 555, 크로메오 546, Cy3, TMR, TRITC, Dy547, Dy548, Dy549, 하이라이트 555, 다일라이트 550, 바디피 564, 알렉사 플루오르 568, 알렉사 플루오르 594, 로다민, 텍사스 레드, 알렉사 플루오르 610, 알렉사 플루오르 633, 다일라이트 633, 알렉사 플루오르 647, APC, ATTO 655, CF633, CF640R, 크로메오642, Cy5, 다일라이트 650, 알렉사 플루오르 680, IRDye 680, 알렉사 플루오르 700 (AF700), Cy5.5, ICG, 알렉사 플루오르 750, 다일라이트 755, IRDye 750, Cy7, PE-Cy7, Cy7.5, 알렉사 플루오르 790, 다일라이트 800, IRDye 800, BV421, BV510, BV570, BV605, BV650, BV711, BV750, BV785, Qdot® 525, Qdot® 565, Qdot® 605, Qdot® 655, Qdot® 705, 또는 Qdot® 800을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 1종 이상의 형광 마커는 세포 속성을 검출하는 1종 이상의 형광 마커를 포함한다. 세포 속성은 특정한 세포 또는 세포 유형의 속성인 임의의 마커일 수 있다. 일부 실시양태에서, 각각의 세포 속성은 CD3, CD4, CD8, CD19, CD45, 및 생존/사멸 (세포 생존율)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 세포 속성은 우세한 속성이다. 일부 실시양태에서, 우세한 속성은 샘플의 적어도 5% 이상, 예를 들어 샘플의 세포의 집단 내의 세포의 적어도 5% 이상에서 검출가능한 속성이다. 일부 실시양태에서, T 세포의 집단을 함유하는, 예컨대 T 세포에 대해 풍부화된 샘플에 대해, 우세한 속성은 CD3, CD4, CD8, 및/또는 CD45를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 세포 속성은 낮은 유병률 속성이다. 낮은 유병률 속성은, 일부 실시양태에서, 샘플의 5% 미만, 예를 들어, 샘플의 세포의 집단 내의 세포의 5% 미만에서 검출가능한 속성이다. 일부 실시양태에서, 건강한 것으로 여겨지는 세포의 집단에 대해, 낮은 유병률 속성은 생존/사멸 (세포 생존율)이다. 일부 실시양태에서, T 세포가 풍부화된 세포의 집단에 대해, 낮은 유병률 속성은 B 세포 마커, 예컨대 CD19, CD20, CD22, 및/또는 CD138일 수 있다.
일부 실시양태에서, 1종 이상의 형광 마커는 각각이 유동 세포측정기에 의해 측정된 형광 신호를 생성하는 1종 이상의 형광 마커를 포함한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 1개 이상의 형광 신호 각각은 형광 마커 또는 염색에 의해 인식되는 세포 속성을 검출한다.
일부 실시양태에서, 형광 마커는 발광 검출 수단을 포함하고, 발광 검출 수단은 유리하게는 적어도 형광 파장 방출의 광을 방출한다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 형광 마커는 1개 이상의 형광 마커의 각각의 형광 마커의 방출 파장 스펙트럼이 1개 이상의 형광 마커의 다른 형광 마커의 여기 파장 스펙트럼과 구별가능하도록 선택된다. 상이한 형광 마커는 동일한 파장의 광 또는 상이한 파장에 의해 여기될 수 있다. 바람직하게는, 방출 파장은 1개 이상의 형광 마커 각각에 대해 상이하다.
일부 실시양태에서, 다색 염색 또는 표지는 상이한 마커 (예를 들어, 세포 표면 마커)에 대한 다중 염색 시약이 세포와 함께 인큐베이션되는 다중 형광단을 사용하여 수행된다. 일부 실시양태에서, 예를 들어 1종 이상의 염색 시약, 예컨대 항체에 접합된 형광 마커는 이들 사이의 에너지 전달을 최소화하도록, 예컨대 중첩 방출 및 흡수 스펙트럼을 회피하거나 최소화하도록 선택된다. 일부 실시양태에서, 각각의 형광 마커는 상이한 방출 스펙트럼을 갖는다. 일부 실시양태에서, 다중 형광 마커는 단일 파장 또는 다중 파장으로 여기될 수 있지만, 검출은 피크 방출 스펙트럼이 중첩되지 않는 영역에서 일어난다. 일부 실시양태에서, 형광 마커 중 1종 이상의 여기는 단일 또는 동일한 파장의 광에 의한 것일 수 있지만, 그로부터 상이한 파장의 광이 방출된다.
일부 실시양태에서, 1종 이상의 형광 마커는 각각 개별적으로 PE-Cy7, APC, AF700, BV421, 아쿠아 및 BV605로 이루어진 군으로부터 선택된 형광단을 포함한다.
일부 실시양태에서, 세포는 다중 마커, 예컨대 세포 표면 마커에 대해 다중 염색 시약으로 염색된다. 일부 실시양태에서, 이는 다중 마커로 표지된 세포를 생성하며, 세포의 잘 정의된 하위세트의 특징화를 가능하게 한다.
일부 실시양태에서, 세포 염색은 이러한 마커에 특이적으로 결합하는 항체 또는 결합 파트너와의 인큐베이션을 수반하고, 일부 실시양태에서 세척 단계 및 항체 또는 결합 파트너에 결합되지 않은 세포로부터 항체 또는 결합 파트너에 결합된 세포의 분리가 이어진다. 이러한 방법의 일부 측면에서, 세포의 부피는 목적하는 염색 시약의 양과 혼합되고, 세포의 염색을 위한 조건 하에 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 염색 또는 표지는 0℃ 내지 25℃의 온도, 예컨대 4℃ 또는 약 4℃에서 수행된다. 일부 실시양태에서, 염색 또는 표지는 5분 초과, 전형적으로 15분 초과 동안 수행된다. 일부 실시양태에서, 염색 또는 표지는 15분 내지 6시간, 예컨대 30분 내지 2시간 동안 수행된다. 일부 실시양태에서, 염색 또는 표지는, 예를 들어 약 15분, 30분, 1시간, 1.5시간, 2시간, 2.5시간, 3시간 또는 이들 사이의 임의의 값에서 수행된다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 염색 시약으로의 표지화는 동시에 수행된다. 일부 실시양태에서, 분석을 위해 샘플을 유동 세포측정기에 도입하기 전에 1회 이상의 세척 단계가 수행된다.
일부 실시양태에서, 세포 샘플은 판독을 위해 세포가 유동 세포측정기를 통과하도록 하기 위해 단일 세포를 1 x 106 내지 1 x 107 세포/ml의 밀도로 현탁시킴으로써 제조된다. 일부 실시양태에서, 세포의 이러한 농도는 유체 시스로 불린다. 일부 실시양태에서, 유체 시스는 전형적으로 초당 약 2,000-20,000개 세포로 진행되는 유동 분류 속도에 영향을 미친다. 세포 샘플의 유체 시스는 전형적으로 포스페이트 완충 염수 용액으로 제조되지만, 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 공지되고 이해되는 바와 같이 다른 용액이 이용가능하다.
일부 실시양태에서, 샘플은 유동 세포측정기에 도입된다. 샘플이 유동 세포측정기에 진입하는 경우, 입자는 세포 샘플의 3차원 공간에 무작위로 분포된다. 세포 샘플은 전형적으로 수압의 적용으로 유체공학 시스템을 통해 단일 스트림으로 좁아진다. 이어서, 이 스트림은 광 산란 또는 형광 방출의 1개 이상의 빔을 통과한다. 레이저는 전형적으로 유동 세포측정기에서 광원으로서의 역할을 한다. 레이저는 세포 샘플과 접촉되면 세포 크기의 척도로서 전방 방향으로의 산란광, 세포 복잡성의 척도로서 측방 방향으로의 산란광, 및 또한 특정한 세포 마커의 상대량에 비례하는 측방 방향으로 방출되는 형광광을 생성하는 단일 파장의 광을 생성한다. 광전자증배관 (PMT) 또는 포토다이오드는 세포로부터 반사된 광을 수용한다. 일부 실시양태에서, 레이저 여기 라인으로부터 0 내지 20도 오프셋에서 유래된 광은 전방 산란광으로서 공지되어 있다. 일부 실시양태에서, 레이저의 여기 라인에 대해 대략 90도의 각도에서 측정된 광은 측면 산란광 및 형광 신호로 불린다. 전방 산란광 및 측방 산란광은 모두 유동 세포측정기를 통과하는 모든 입자에 대해 특유하고, 모든 조합이 세포 샘플 내의 입자를 구별하기 위해 사용될 수 있다. 형광 채널은 통상적으로 기기 내의 채널의 수에 따라 명칭 FL1, FL2, FL3 등으로 표시된다. 각각의 형광 채널은 다른 모든 것을 필터링하면서 선택된 특이적 염료를 검출하기 위한 장벽 필터로 설정된다. 특이적 염료가 우세하게 검출가능한 채널은 그의 1차 형광 채널로 지칭될 수 있는 반면, 다른 형광 채널은 2차 채널로 지정될 수 있다. 산란 및 형광 방출 광 신호는 전자 펄스로 전환되고, 이는 유동 세포측정법 엔진에 의해 프로세싱되고, 그래픽 사용자 인터페이스 "GUI" 상에 디스플레이된다.
II. 정적 게이팅 역치
일부 실시양태에서, 제공된 방법은 정적 형광 역치 게이트를 개별적으로, 예컨대 섹션 I에 기재된 바와 같은 시험 샘플로부터 수집된 유동 세포측정 데이터에 존재하는 1개 이상의 형광 신호 각각에 적용하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 1개 이상의 형광 신호 각각에 대한 정적 형광 역치 게이트는 (a) 1개 이상의 형광 신호에 따라 각각 분류된 복수의 적어도 2개의 참조 세포 집단에 대한 1개 이상의 형광 신호에 대해 유동 세포측정법에 의해 측정된 세포측정 이벤트; 및 (b) 1개 이상의 형광 신호 각각에 대한 정적 형광 역치 게이트를 설정하는 것으로부터 결정된다.
일부 실시양태에서, 1개 이상의 형광 신호 각각에 대한 정적 형광 역치 게이트는 (a) 복수의 적어도 2개의 참조 세포 집단에 대한 1개 이상의 형광 신호에 대한 유동 세포측정법에 의한 세포측정 이벤트의 측정; 및 (b) 1개 이상의 형광 신호 각각에 대한 정적 형광 역치 게이트의 설정으로부터 결정된다.
A. 정적 게이팅 역치의 설정
본원에 (1) 복수의 적어도 2개의 참조 세포 샘플에 대한 1개 이상의 형광 신호에 대해 유동 세포측정법에 의해 세포측정 이벤트를 측정하는 단계로서, 복수의 적어도 2개의 참조 세포 샘플은 (a) 각각이 1개 이상의 형광 신호로 표지되지 않은 비염색된 세포의 집단을 포함하는 복수의 제1 참조 세포 샘플; 및 (b) 복수의 제2 참조 세포 샘플을 포함하고, 여기서 복수의 제2 참조 세포 샘플 각각은 복수의 제1 참조 세포 샘플 중 하나와 동일한 공급원 유형의 세포로부터 유래되고, 복수의 제2 참조 세포 샘플 각각은 1개 이상의 형광 신호 중 적어도 하나로 표지된 염색된 세포의 적어도 하나의 집단을 포함하는 것인 단계; 및 (2) 1개 이상의 형광 신호 각각에 대해 정적 형광 역치 게이트를 설정하는 단계를 포함하는, 정적 형광 역치 게이트를 결정하는 방법이 제공된다.
일부 실시양태에서, 참조 세포 샘플의 세포의 공급원 유형은 염색을 위한 관심 세포를 함유하는 임의의 생물학적 샘플로부터의 세포의 집단이다. 일부 실시양태에서, 세포는 생물학적 샘플로부터의 세포주 또는 세포들일 수 있다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 대상체로부터 수득되거나 유래된 1차 세포, 예컨대 특정한 질환 또는 상태를 갖거나 또는 치료 (예를 들어, 세포 요법)를 필요로 하거나 또는 치유적 치료 (예를 들어, 세포 요법)가 투여될 1차 세포를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 대상체는 인간, 예컨대 특정한 치료적 개입을 필요로 하는 환자인 대상체이다. 따라서, 일부 실시양태에서 세포의 공급원 유형은 1차 세포, 예를 들어 1차 인간 세포이다. 샘플은 대상체로부터 직접 취한 조직, 체액 및 다른 샘플을 포함한다. 생물학적 샘플은 생물학적 공급원으로부터 직접 수득된 샘플 또는 프로세싱되는 샘플일 수 있다. 생물학적 샘플은 체액, 예컨대 혈액, 혈장, 혈청, 뇌척수액, 활액, 소변 및 땀, 조직 및 기관 샘플, 예컨대 그로부터 유래된 프로세싱된 샘플을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
일부 측면에서, 샘플은 혈액 또는 혈액-유래 샘플이거나, 또는 분리반출술 또는 백혈구분리반출술 생성물이거나 또는 이로부터 유래된다. 예시적인 샘플은 전혈, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), 백혈구, 골수, 흉선, 조직 생검, 종양, 백혈병, 림프종, 림프절, 장 연관 림프성 조직, 점막 연관 림프성 조직, 비장, 다른 림프성 조직, 간, 폐, 위, 장, 결장, 신장, 췌장, 유방, 골, 전립선, 자궁경부, 고환, 난소, 편도 또는 다른 기관, 및/또는 그로부터 유래된 세포를 포함한다. 샘플은 세포 요법, 예를 들어 입양 세포 요법과 관련하여 자가 및 동종이형 공급원으로부터의 샘플을 포함한다.
일부 예에서, 대상체의 순환 혈액으로부터의 세포는, 예를 들어 분리반출술 또는 백혈구분리반출술에 의해 수득된다. 샘플은, 일부 측면에서, T 세포, 단핵구, 과립구, B 세포, 다른 유핵 백혈구, 적혈구 및/또는 혈소판을 포함한 림프구를 함유하고, 일부 측면에서 적혈구 및 혈소판 이외의 세포를 함유한다.
일부 실시양태에서, 세포의 공급원 유형은 대상체로부터 단리된 1차 세포 집단일 수 있다. 일부 실시양태에서, 단리된 세포 집단은 전형적으로 복수의 세포 집단, 예를 들어 혈액 또는 혈액-유래 세포의 집단, 예컨대 조혈 세포, 백혈구(leukocyte) (백혈구(white blood cell)), 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), 및/또는 면역계의 세포, 예를 들어 선천성 또는 적응성 면역의 세포, 예컨대 골수 또는 림프성 세포, 예를 들어 림프구, 전형적으로 T 세포 및/또는 NK 세포를 포함한다.
일부 실시양태에서, 세포의 공급원 유형은 특정한 유형 또는 하위유형의 세포의 풍부화된 집단이며, 여기서 이러한 세포는 예컨대 샘플로부터의 세포의 양성 또는 음성 선택에 의해 출발 세포 샘플 (예를 들어, 분리반출술 또는 백혈구분리반출술 샘플)로부터 선택되었다. 풍부화 및/또는 선택될 수 있는 T 세포 집단 중에는 CD3+ T 세포, CD4+ 세포, CD8+ 세포, 및 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포의 하위-집단, 예컨대 특정한 하위-유형의 세포의 풍부화 또는 고갈에 의해 또는 특정한 표면 마커 발현 프로파일에 기초하여 생성된 T 세포의 하위-집단이 있다. 예를 들어, 풍부화 및/또는 선택될 수 있는 T 세포 (예를 들어, CD4+ 또는 CD8+ T 세포)의 하위-유형 중에는 기능, 활성화 상태, 성숙, 분화 가능성, 확장, 재순환, 국재화 및/또는 지속 능력, 항원-특이성, 항원 수용체의 유형, 특정한 기관 또는 구획에서의 존재, 마커 또는 시토카인 분비 프로파일, 및/또는 분화 정도에 의해 정의된 것들이 있다. 풍부화, 단리 및/또는 선택될 수 있는 T 세포 및/또는 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포의 하위유형 및 하위집단 중에 나이브 T (TN) 세포, 이펙터 T 세포 (TEFF), 기억 T 세포 및 그의 하위유형, 예컨대 줄기 세포 기억 T (TSCM), 중심 기억 T (TCM), 이펙터 기억 T (TEM), 또는 말단 분화 이펙터 기억 T 세포, 종양-침윤 림프구 (TIL), 미성숙 T 세포, 성숙 T 세포, 헬퍼 T 세포, 세포독성 T 세포, 점막-연관 불변 T (MAIT) 세포, 자연 발생 및 적응 조절 T (Treg) 세포, 헬퍼 T 세포, 예컨대 TH1 세포, TH2 세포, TH3 세포, TH17 세포, TH9 세포, TH22 세포, 여포성 헬퍼 T 세포, 알파/베타 T 세포, 및 델타/감마 T 세포가 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 세포 샘플에서 샘플로부터 풍부화 및/또는 선택된 T 세포 집단 중 1종 이상은 1종 이상의 특정한 마커, 예컨대 표면 마커의 양성 (마커+)이거나 또는 이를 높은 수준으로 발현하거나 (마커높은), 또는 1종 이상의 마커에 대해 음성 (마커-)이거나 또는 이를 비교적 낮은 수준으로 발현하는 (마커낮은) 세포이다. 일부 경우에, 이러한 마커는 특정 T 세포 집단 (예컨대 비-기억 세포)에서는 부재하거나 또는 비교적 낮은 수준으로 발현되지만 특정 다른 T 세포 집단 (예컨대 기억 세포)에서는 존재하거나 또는 비교적 더 높은 수준으로 발현되는 것이다. 한 실시양태에서, 세포 (예컨대 CD8+ 세포 또는 T 세포, 예를 들어 CD3+ 세포)는 높은 표면 수준의 CD45RO, CCR7, CD28, CD27, CD44, CD127 및/또는 CD62L에 대해 양성이거나 이를 발현하는 세포에 대해 풍부화되고/거나 (즉, 이에 대해 양성 선택됨), 높은 표면 수준의 CD45RA에 대해 양성이거나 이를 발현하는 세포가 고갈된다 (예를 들어, 이에 대해 음성 선택됨). 일부 실시양태에서, 세포는 CD122, CD95, CD25, CD27 및/또는 IL7-Rα (CD127)의 높은 표면 수준을 발현하거나 양성인 세포에 대해 풍부화되거나 또는 이러한 세포가 고갈된다. 일부 예에서, CD8+ T 세포는 및 CD62L 및 CD45RO에 대해 양성인 (또는 CD45RA에 대해 음성인)인 세포에 대해 풍부화된다.
일부 실시양태에서, CD4+ T 세포 집단 및 CD8+ T 세포 하위집단, 예를 들어, 중심 기억 (TCM) 세포가 풍부화된 하위집단이다.
일부 실시양태에서, 세포는 자연 킬러 (NK) 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 단핵구 또는 과립구, 예를 들어 골수 세포, 대식세포, 호중구, 수지상 세포, 비만 세포, 호산구 및/또는 호염기구이다.
일부 실시양태에서, 세포의 공급원 유형은, 예를 들어 재조합 단백질을 코딩하는 핵산으로의 유전자 전달 (예를 들어, 형질도입)에 의해 도입된 세포의 조작된 집단이다. 발현될 재조합 단백질의 예는 재조합 수용체, 예컨대 키메라 항원 수용체 (CAR) 또는 T 세포 수용체 (TCR)를 포함한다. 유전자 조작된 성분, 예를 들어 재조합 수용체, 예를 들어 CAR 또는 TCR의 도입을 위한 다양한 방법이 널리 공지되어 있고, 제공된 방법 및 세포 샘플과 함께 사용될 수 있다. 예시적인 방법은 바이러스, 예를 들어 레트로바이러스 또는 렌티바이러스, 형질도입, 트랜스포손 및 전기천공을 통한 것을 포함하는, 재조합 단백질을 코딩하는 핵산의 전달을 위한 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 유전자 조작은 재조합 또는 조작된 성분을 코딩하는 핵산을, 예컨대 레트로바이러스 형질도입, 형질감염 또는 형질전환에 의해 세포를 함유하는 조성물 내로 도입하는 것을 수반한다. 재조합 단백질, 예컨대 재조합 수용체를 코딩하는 핵산 분자를 세포에 도입하는 것은 다수의 공지된 벡터 중 임의의 것을 사용하여 수행될 수 있다. 이러한 벡터는 렌티바이러스 및 감마레트로바이러스 시스템, 뿐만 아니라 트랜스포존-기반 시스템, 예컨대 피기백(PiggyBac) 또는 슬리핑 뷰티(Sleeping Beauty)-기반 유전자 전달 시스템을 비롯한 바이러스 및 비-바이러스 시스템을 포함한다. 예시적인 방법은 바이러스, 예를 들어 레트로바이러스 또는 렌티바이러스, 형질도입, 트랜스포손 및 전기천공을 통한 것을 포함한, 수용체를 코딩하는 핵산의 전달을 위한 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 복수의 참조 세포 샘플 각각에 대한 세포의 공급원 유형으로서 사용되는 1차 세포 샘플은 상이한 대상체 (예를 들어, 환자)로부터의 것이고, 각각은 시험 세포 샘플에 대한 세포의 공급원 유형이 수득된 (또는 경우에 따라 수득될) 대상체 (예를 들어, 환자)와 상이하다. 일부 실시양태에서, 각각의 상이한 대상체 (예를 들어, 환자)는 동일하거나 유사한 질환 또는 상태를 갖는다. 예를 들어, 각각의 상이한 대상체는 동일한 암 유형을 갖는다. 일부 경우에, 세포의 공급원 유형은 특정 요법 전에 또는 그 과정에서 대상체의 세포에 대해 유동 세포측정 분석을 수행하는 것이 바람직한 질환 또는 상태를 갖는 대상체 (예를 들어, 환자)로부터의 샘플일 수 있다. 일부 경우에, 참조 세포 샘플은 특정한 요법의 시험을 위한 임상 시험으로부터의 대상체로부터의 샘플일 수 있다. 일부 실시양태에서, 시험될 세포의 공급원 유형은 대상체 (예를 들어, 환자)에게 투여될 세포 요법의 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포 요법은 CAR 세포 요법 (예를 들어, CAR T 세포), TCR 세포 요법, 종양 침윤 림프구 (TIL) 세포 요법, 자연 킬러 (NK) 세포 요법 또는 줄기 세포 요법이다. 치료될 대상체에 관하여, 세포는 동종 및/또는 자가일 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 요법은 자가 세포 요법이다. 일부 실시양태에서, 세포는 만능 및/또는 다능, 예컨대 줄기 세포, 예컨대 유도된 만능 줄기 세포 (iPSC) 또는 그로부터 분화된 세포이다. 일부 경우에, 참조 세포 샘플은 임상 시험에서 복수의 상이한 대상체로부터 개별적으로 생산된 세포 요법의 샘플일 수 있고, 시험 세포 샘플은 특정한 세포 요법으로의 치료에 대해 확인되거나 또는 이에 대해 승인된 시험 대상체 (예를 들어, 환자)로부터 생산된 세포 요법의 샘플이다. 일부 실시양태에서, 제공된 방법은 대상체로의 도입 전에 생산된, 예를 들어 조작된 세포 요법의 품질 제어 또는 특징화와 관련하여 수행될 수 있다.
특정한 실시양태에서, 참조 세포 샘플 내의 세포의 공급원 유형은 정적 게이팅 역치를 사용하여 제공된 방법에 의해 분석되기를 원하는 시험 세포 샘플의 유사한 속성 또는 특색을 함유하는 것으로 공지되어 있거나 또는 함유하는 것으로 여겨지는 세포이다. 따라서, 제공된 실시양태에서, 시험 세포 샘플, 및 제1 및 제2 참조 세포 샘플은 동일한 세포 공급원으로부터의 것이다. 예를 들어, 시험 세포 샘플이 백혈구분리반출술 세포 샘플인 경우에, 참조 세포 샘플 내의 세포의 공급원은 또한 백혈구분리반출술 세포 샘플이다. 일부 실시양태에서, 세포가 대상체로부터의 1차 세포인 경우에, 참조 세포 샘플의 세포의 공급원 및 시험 세포 샘플은 또한 유사한 속성 또는 특색을 갖는 대상체로부터 수득되거나 유래될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 시험 세포 샘플은 질환을 갖는 대상체로부터 유래되고, 참조 세포 집단 샘플은 동일하거나 유사한 질환에 걸린 다른 대조군 대상체로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 질환은 암, 또는 암의 특정한 유형 또는 하위유형, 예컨대 림프종, 백혈병, 골수종 또는 고형 종양 암이다. 일부 실시양태에서, 시험 세포 샘플은 예컨대 유전자 전달 (예를 들어, 형질도입) 또는 유전자 편집 절차에 의해, 또는 조정제, 예컨대 활성화제, 시토카인, 면역조정제, 소분자 화합물 또는 세포의 1종 이상의 특색 또는 특성을 변경시킬 수 있는 다른 작용제의 존재 하의 노출 또는 인큐베이션에 의해 조작된 세포의 집단이다. 이러한 실시양태에서, 참조 세포 샘플은 또한 시험 세포 샘플과 동일한 조건 하에 (또는 경우에 따라 시험 세포 샘플에 대해 계획된 바와 같이) 유사하게 조작된 세포의 집단이다.
일부 실시양태에서, 복수의 제1 참조 세포 샘플은 2개 초과의 세포 샘플을 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수의 제1 참조 세포 샘플은 5, 10, 25, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000개 초과의 세포 샘플을 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수의 제1 참조 세포 샘플은 100 내지 500개 세포 샘플, 예컨대 100 내지 400개 세포 샘플, 100 내지 300개 세포 샘플, 100 내지 200개 세포 샘플, 200 내지 500개 세포 샘플, 200 내지 400개 세포 샘플, 200 내지 300개 세포 샘플, 300 내지 500개 세포 샘플, 300 내지 400개 세포 샘플 또는 400 내지 500개 세포 샘플을 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 제1 참조 세포 샘플은 이러한 세포가 임의의 형광 마커로 염색되거나 그에 노출되지 않은 비표지된 세포 집단이어서 세포가 임의의 형광 신호로 표지되지 않는다. 일부 실시양태에서, 복수의 제1 세포 샘플은 배경 대조군으로서 역할을 할 수 있는 비염색된 세포의 집단을 나타내어 샘플 내의 세포의 음성 염색 또는 자가형광을 차지한다.
일부 실시양태에서, 복수의 제2 참조 세포 샘플은 2개 초과의 세포 샘플을 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수의 제2 참조 세포 샘플은 5, 10, 25, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000개 초과의 세포 샘플을 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수의 제2 참조 세포 샘플은 100 내지 500개 세포 샘플, 예컨대 100 내지 400개 세포 샘플, 100 내지 300개 세포 샘플, 100 내지 200개 세포 샘플, 200 내지 500개 세포 샘플, 200 내지 400개 세포 샘플, 200 내지 300개 세포 샘플, 300 내지 500개 세포 샘플, 300 내지 400개 세포 샘플 또는 400 내지 500개 세포 샘플을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 참조 세포 샘플 (비표지된 또는 비염색된 세포 샘플)과 동일한 세포 공급원의 일부가 각각의 제2 참조 세포 샘플 각각에 대한 세포의 출발 공급원으로서 사용된다. 따라서, 제공된 실시양태에서, 복수의 제2 참조 세포 집단 각각은 복수의 제1 참조 세포 집단 중 하나로부터 유래된다.
일부 실시양태에서, 제2 참조 샘플은 복수의 제2 참조 세포 샘플의 세포 샘플 각각을 1종 이상의 염색 시약과 개별적으로 접촉시킴으로써 표지 절차에 적용된다. 제공된 방법의 실시를 위해, 시험 샘플 및 각각의 제2 참조 샘플은 세포를 1개 이상의 형광 신호로 표지하기 위한 1종 이상의 염색 시약을 사용한 세포 염색에 적용한다. 일부 실시양태에서, 염색 시약은 섹션 I에 기재된 바와 같은 임의의 시약일 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 염색 절차는 섹션 I에 기재된 바와 같은 임의의 방법으로 수행될 수 있다. 제공된 실시양태에서, 특정한 마커 및 염료에 특이적인 결합제는 염색 시약을 사용한 세포의 염색이 특정 마커 속성에 대한 양성 및 음성/비염색 집단 사이의 명확한 분리를 가져오도록 선택된다. 예를 들어, 제공된 방법은 양성 및 음성 염색된 샘플 사이의 명확한 분리가 가능하지 않은 속성에는 적합하지 않을 수 있는 것으로 이해된다.
제공된 실시양태에서, 시험 세포 샘플 및 각각의 제2 참조 세포 샘플의 세포 염색은 동일한 염색 시약(들)을 사용하고 동일한 프로토콜 조건을 사용하여 수행된다. "동일한"에 대한 언급은 시약 사이의 또는 프로토콜 수행에서의 일부 변동성이 예상되기 때문에 염색 시약 또는 프로토콜이 모든 측면에서 동일한 것을 의미하지는 않는 것으로 이해된다. 변동성이 최소화되고 절차가 가능한 한 유사한 것을 보장하도록 절차가 행해지는 것은 통상의 기술자의 수준 내에 있다. 예를 들어, 염색이, 예를 들어 상업적 제공업체로부터 입수가능한 바와 같은 염색 시약의 정확히 동일한 로트 또는 배치를 사용하여 수행될 필요는 없다. 전형적으로, 염색 시약의 각각의 제조된 배치 또는 로트는 그의 평균 형광 강도 (MFI)가 동일한 염색 시약의 1개 이상의 이전 로트 또는 배치에 매칭되도록 특징화된다. 일부 실시양태에서, 세포 염색은 동일한 단백질 서열 또는 화학 구조, 예컨대 동일한 형광단 유형을 갖는 것으로 공지된 염색 시약을 사용하여 수행된다. 전형적으로, 염색 시약은 동일한 상업적 판매업체 또는 공급업체로부터 수득된 시약, 예컨대 동일한 카탈로그 번호 하에 판매된 것이다.
일부 실시양태에서, 세포는 다중 마커, 예컨대 세포 표면 마커에 대해 다중 염색 시약으로 염색된다. 일부 실시양태에서, 이는 다중 마커로 표지된 세포를 생성하며, 이는 잘 정의된 하위세트의 세포의 특징화를 가능하게 한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 세포 염색은 세포를 2개 이상의 상이한 형광 신호로 표지하기 위한 다색 세포 염색이고, 여기서 각각의 염색 시약은 상이한 마커를 상이한 형광 신호로 표지한다. 일부 실시양태에서, 2개 이상의 상이한 형광 신호는 2 내지 10개의 형광 신호를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 염색을 수행하여 세포를 2개의 상이한 형광 신호로 표지한다. 일부 실시양태에서, 세포 염색을 수행하여 세포를 3개의 상이한 형광 신호로 표지한다. 일부 실시양태에서, 세포 염색을 수행하여 세포를 4개의 상이한 형광 신호로 표지한다. 일부 실시양태에서, 세포 염색을 수행하여 세포를 5개의 상이한 형광 신호로 표지한다. 일부 실시양태에서, 세포 염색을 수행하여 세포를 6개의 상이한 형광 신호로 표지한다. 일부 실시양태에서, 세포 염색을 수행하여 세포를 7개의 상이한 형광 신호로 표지한다. 일부 실시양태에서, 세포 염색을 수행하여 세포를 8개의 상이한 형광 신호로 표지한다. 일부 실시양태에서, 세포 염색을 수행하여 세포를 9개의 상이한 형광 신호로 표지한다. 일부 실시양태에서, 세포 염색을 수행하여 세포를 10개의 상이한 형광 신호로 표지한다. 일부 실시양태에서, 2개 이상의 상이한 형광 신호 각각은 상이한 방출 스펙트럼을 갖는다. 일부 실시양태에서, 2개 이상의 상이한 형광 신호 각각은 세포 염색에서 1개 이상의 다른 형광 신호와 중첩되지 않는 형광 신호의 피크 방출 스펙트럼을 갖는다. 일부 실시양태에서, 세포 염색은 PE-Cy7, APC, AF700, BV421, 아쿠아, 또는 BV605로부터 선택된 염료에 의해 2개 이상의 상이한 형광 신호가 방출되는 염색 시약으로 수행된다.
일부 실시양태에서, 세포 염색은 이러한 마커에 특이적으로 결합하는 염색 시약, 예를 들어 형광단 염료에 접합된 항체 또는 결합 파트너와의 인큐베이션, 일부 실시양태에서 세척 단계, 및 항체 또는 결합 파트너에 결합되지 않은 세포로부터 염색 시약에 결합된 세포의 분리를 수반한다. 이러한 방법의 일부 측면에서, 세포의 부피는 목적하는 염색 시약의 양과 혼합되고, 세포의 염색을 위한 조건 하에 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 염색 또는 표지는 0℃ 내지 25℃의 온도, 예컨대 4℃ 또는 약 4℃에서 수행된다. 일부 실시양태에서, 염색 또는 표지는 5분 초과, 전형적으로 15분 초과 동안 수행된다. 일부 실시양태에서, 염색 또는 표지는 15분 내지 6시간, 예컨대 30분 내지 2시간 동안 수행된다. 일부 실시양태에서, 염색 또는 표지는, 예를 들어 약 15분, 30분, 1시간, 1.5시간, 2시간, 2.5시간, 3시간 또는 이들 사이의 임의의 값에서 수행된다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 염색 시약으로의 표지화는 동시에 수행된다. 일부 실시양태에서, 분석을 위해 샘플을 유동 세포측정기에 도입하기 전에 1회 이상의 세척 단계가 수행된다.
일부 실시양태에서, 각각의 세포 샘플, 예를 들어, 복수의 제1 및 제2 참조 세포 샘플 각각은 세포가 판독을 위해 유동 세포측정기를 통과하도록 하기 위해 단일 세포를 1 x 106 내지 1 x 107 세포/ml의 밀도로 현탁시킴으로써 개별적으로 제조된다. 일부 실시양태에서, 세포의 이러한 농도는 유체 시스로 불린다. 일부 실시양태에서, 유동 분류 속도에 영향을 미치며, 이는 유체 시스는 전형적으로 초당 약 2,000-20,000개 세포로 진행한다. 세포 샘플의 유체 시스는 전형적으로 포스페이트 완충 염수 용액으로 제조되지만, 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 공지되고 이해되는 바와 같이 다른 용액이 이용가능하다.
일부 실시양태에서, 유동 세포측정법을 복수의 제1 참조 세포 샘플 각각에 대한 단일 세포 샘플에 대해 수행하였다.
일부 실시양태에서, 세포 염색은 1개 이상의 형광 신호로의 표지를 위해 염색된 각각의 공급원 유형의 세포에 대해 다수회, 예컨대 이중 또는 삼중으로 반복되어, 이중 또는 삼중 염색된 샘플을 생성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 복수의 제2 참조 세포 샘플은 동일한 염색된 세포의 이중 샘플을 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수의 제2 참조 세포 샘플은 동일한 염색된 세포의 삼중 샘플을 포함한다.
일부 실시양태에서, 샘플을 유동 세포측정기 상에서 실행시키기 전에, 유동 세포측정기의 정렬, 보상 및 보정 중 하나 이상이 수행된다. 정렬, 보상 및 보정은 기기가 그의 최대 효율로 작동하도록 보장할 뿐만 아니라, 시간 경과에 따라 또는 다양한 기기로 취해진 데이터가 비교가능할 수 있도록 재현성을 달성한다.
일부 실시양태에서, 정렬은 산란 및 형광 신호가 그의 최고 강도 및 최고 분포, 즉 분포의 최저 변동 계수 <CV로 조정되도록 다양한 광학 및 전기 구성요소를 조정하고 포커싱하는 과정이다. 정렬될 유동 세포측정기의 성분은 레이저, 렌즈, 거울, 장벽 필터 및 PMT를 포함한다.
일부 경우에, 다중-형광 분석, 즉 2종 이상의 형광 염료를 동시에 사용하는 분석이 유동 세포측정기 상에서 수행될 수 있다. 그러나, 정확한 분석을 수행하기 위해, 유동 세포측정기에서 전기 보상 회로를 조정할 필요가 있어 다른 형광 채널 내로 중첩되는 임의의 형광 방출이 이러한 다른 채널로부터 차감될 수 있다. 보상은 각각의 채널에 대한 장벽 필터에 의해 제거되지 않은 스펙트럼 중첩으로 인한 2차 형광 채널에서 형광 염료로부터의 잔류 신호를 전자적으로 제거하는 과정이다. 적절한 표준을 사용한 유동 세포측정기의 보정은 샘플로부터의 결과가 시간 경과에 따라 및 상이한 기기 사이에 비교가능할 수 있도록 보장한다. 특정 기기 및 기기 설정과 무관한 형광 신호의 강도의 보정을 위해, 보정 표준 및 측정되는 샘플의 여기 및 방출 스펙트럼은 동등해야 하고, 각각에 대한 측정은 동일한 기기 설정 하에 이루어져야 한다. 유동 세포측정기의 보정 방법은 공지되어 있고, 예를 들어 미국 특허 4,714,682; 4,767,206; 4,774,189; 및 5,620,842 및 국제 공개 PCT 출원 번호 WO1991000509에 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 보정 방법은 유동 세포측정기의 형광 채널을 정렬 및 보정하는 데 사용될 수 있는 블랭크 및 형광 표지된 마이크로비드 둘 다를 사용한다. 예를 들어, 미국 특허 번호 4,774,189 및 4,767,206은 유동 세포측정기를 보정하기 위해 이러한 마이크로비드를 사용하는 방법을 기재한다. 일부 실시양태에서, 보정에 사용된 표준은, 예를 들어 미국 특허 번호 6,008,052에 기재된 바와 같이 샘플에서 연구될 세포를 모방한다.
일부 실시양태에서, 형광 보정은 제공된 방법의 정확도 및 재현성을 보장한다. 일부 실시양태에서, 정확하고 재현가능한 결과를 수득하기 위해, 유동 세포측정기는 정렬되고 보정되어야 한다. 1종 초과의 형광 염료로 작동하는 경우에, 기기는 또한 형광 광전자증배관 (PMT)에 대한 보상을 필요로 한다.
일부 실시양태에서, 각각의 세포 샘플, 예를 들어 복수의 제1 및 제2 참조 세포 샘플 각각은 유동 세포측정기 내로 개별적으로 도입된다. 전방 산란광 및 측방 산란광은 모두 유동 세포측정기를 통과하는 모든 입자에 대해 특유하고, 모든 조합이 세포 샘플 내의 입자를 구별하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 전방 산란광, 측방 산란광 및 방출된 광 신호는 유동 세포측정법 엔진에 의해 처리되고 유동 세포측정 데이터로서 제공되는 전자 펄스로 전환된다. 일부 실시양태에서, 유동 세포측정 데이터는 그래픽 사용자 인터페이스 "GUI" 상에 디스플레이된다.
일부 실시양태에서, 복수의 제1 참조 세포 샘플 각각 및 복수의 제2 참조 세포 샘플 각각으로부터의 유동 세포측정 데이터를 사용하여 정적 역치 게이트를 설정한다. 일부 실시양태에서, 정적 형광 역치 게이트를 설정하는 것은 1개 이상의 형광 신호 각각에 대해 정적 형광 역치 게이트를 설정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 정적 역치 게이트는 1개 이상의 형광 신호 각각에 대해 음성 염색으로부터 양성을 구별해내도록 선택된 고정 역치이다 (도 1a 참조). 일부 실시양태에서, 1개 이상의 형광 신호 각각에 대해, 정적 게이트 역치는 (1) 복수의 제1 참조 샘플로부터의 비염색된 샘플 각각으로부터의 형광 신호의 상부 형광 경계를 결정하고; (2) 복수의 제2 참조 샘플로부터의 염색된 샘플 각각으로부터의 형광 신호의 형광의 하부 경계를 결정하고; (3) 각각의 형광 신호에 대한 고정 또는 정적 역치를 형광 신호에 대한 역치 게이트로서 설정함으로써 설정된다. 일부 실시양태에서, 각각의 형광 신호의 상부 경계를 결정하는 것은 복수의 제1 참조 샘플로부터의 비염색된 샘플에서의 형광 신호의 분포에 따라 상부 백분위수 (예를 들어, 제90 백분위수 이상)로서 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 각각의 형광 신호의 하부 경계를 결정하는 것은 복수의 제2 참조 샘플로부터의 염색된 샘플에서의 형광 신호의 분포에 따라 하부 백분위수 (예를 들어, 제10 백분위수 이하)로서 결정될 수 있다.
일부 실시양태에서, 1개 이상의 형광 신호 각각에 대한 정적 형광 역치 게이트를 설정하는 것은, 각각의 형광 신호에 대한 역치 게이트가 (i) 1개 이상의 형광 신호 각각의 각 형광 신호에 대해 복수의 제1 참조 세포 집단의 형광의 제90 백분위수 초과이고; (ii) 동일한 각 형광 신호에 대해 복수의 제2 참조 세포 집단의 형광의 제10 백분위수 미만이도록 하는 것이다.
따라서, (1) 복수의 적어도 2개의 참조 세포 샘플에 대한 1개 이상의 형광 신호에 대해 유동 세포측정법에 의해 세포측정 이벤트를 측정하는 단계로서, 복수의 적어도 2개의 참조 세포 샘플은 (a) 각각이 1개 이상의 형광 신호로 표지되지 않은 비염색된 세포의 집단을 포함하는 복수의 제1 참조 세포 샘플; 및 (b) 복수의 제2 참조 세포 샘플을 포함하고, 여기서 복수의 제2 참조 세포 샘플 각각이 복수의 제1 참조 세포 샘플 중 하나와 동일한 공급원 유형의 세포로부터 유래되고, 복수의 제2 참조 세포 샘플 각각이 1개 이상의 형광 신호 중 적어도 하나로 표지된 염색된 세포의 적어도 하나의 집단을 포함하는 것인 단계; 및 (2) 1개 이상의 형광 신호 각각에 대해 정적 형광 역치 게이트를, 각각의 형광 신호 역체 게이트가 (a) 1개 이상의 형광 신호 각각의 각 형광 신호에 대해 복수의 제1 참조 세포 집단의 형광의 제90 백분위수 초과이고; (b) 동일한 각 형광 신호에 대해 복수의 제2 참조 세포 집단의 형광의 제10 백분위수 미만이도록 설정하는 단계를 포함하는, 정적 형광 역치 게이트를 결정하는 방법이 본원에서 제공된다.
일부 실시양태에서, 각각의 형광 신호의 경우, 정적 형광 역치 게이트는 각각의 형광 신호에 대한 세포의 복수의 제1 참조 집단 중에서 형광의 제90, 제91, 제92, 제93, 제94, 제95, 제96, 제97, 제98 또는 제99 백분위수 초과인 형광 신호의 형광이다. 일부 실시양태에서, 각각의 형광 신호의 경우, 정적 형광 역치 게이트는 각각의 형광 신호에 대한 세포의 복수의 제1 참조 집단 중에서 형광의 제90, 제91, 제92, 제93, 제94 또는 제95 백분위수 초과인 형광 신호의 형광이다.
일부 실시양태에서, 각각의 형광 신호의 경우, 정적 형광 역치 게이트는 각각의 형광 신호에 대한 세포의 복수의 제1 참조 집단 중에서 형광의 제95, 제96, 제97, 제98 또는 제99 백분위수 초과인 형광 신호의 형광이다.
일부 실시양태에서, 각각의 형광 신호의 경우, 정적 형광 역치 게이트는 각각의 형광 신호에 대한 세포의 복수의 제2 참조 집단 중에서 형광의 제10, 제9, 제8, 제7, 제6, 제5, 제4, 제3, 제2 또는 제1 백분위수 미만인 형광 신호의 형광이다. 일부 실시양태에서, 각각의 형광 신호의 경우, 정적 형광 역치 게이트는 동일한 각각의 형광 신호에 대한 세포의 복수의 제2 참조 집단 중에서 형광의 제5, 제4, 제3, 제2 또는 제1 백분위수 미만인 형광 신호의 형광이다.
일부 실시양태에서, 각각의 형광 신호의 경우, 정적 형광 역치 게이트는 각각의 형광 신호에 대해 복수의 제1 참조 세포 집단 중에서 형광의 제90, 제91, 제92, 제93, 제94, 제95, 제96, 제97, 제98, 또는 제99 백분위수 초과이고; 동일한 각 형광 신호에 대해 복수의 제2 참조 세포 집단 중에서 형광의 제10, 제9, 제8, 제7, 제6, 제5, 제4, 제3, 제2 또는 제1 백분위수 미만인 형광 신호의 형광이다.
일부 실시양태에서, 각각의 형광 신호의 경우, 정적 형광 역치 게이트는 각각의 형광 신호에 대해 복수의 제1 참조 세포 집단 중에서 형광의 제90, 제91, 제92, 제93, 제94 또는 제95 백분위수 초과이고; 동일한 각 형광 신호에 대해 복수의 제2 참조 세포 집단 중에서 형광의 제5, 제4, 제3, 제2 또는 제1 백분위수 미만인 형광 신호의 형광이다.
일부 실시양태에서, 각각의 형광 신호의 경우, 정적 형광 역치 게이트는 각각의 형광 신호에 대해 복수의 제1 참조 세포 집단 중에서 형광의 제95, 제96, 제97, 제98 또는 제99 백분위수 초과이고; 동일한 각 형광 신호에 대해 복수의 제2 참조 세포 집단 중에서 형광의 제5, 제4, 제3, 제2 또는 제1 백분위수 미만인 형광 신호의 형광이다.
일부 실시양태에서, 적어도 1개의 형광 신호에 대해 정적 형광 역치 게이트는 형광 신호에 대한 복수의 제1 참조 세포 샘플 중에서 형광의 제95 백분위수 초과인 형광이다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 형광 신호 중 적어도 하나에 대한 정적 형광 역치 게이트는 형광 신호에 대한 복수의 제1 참조 세포 샘플 중에서 형광의 제96 백분위수 초과인 형광이다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 형광 신호 중 적어도 하나에 대한 정적 형광 역치 게이트는 형광 신호에 대한 복수의 제1 참조 세포 샘플 중에서 형광의 제97 백분위수 초과인 형광이다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 형광 신호 중 적어도 하나에 대한 정적 형광 역치 게이트는 형광 신호에 대한 복수의 제1 참조 세포 샘플 중에서 형광의 제98 백분위수 초과인 형광이다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 형광 신호 중 적어도 하나에 대한 정적 형광 역치 게이트는 형광 신호에 대한 복수의 제1 참조 세포 샘플 중에서 형광의 제99 백분위수 초과인 형광이다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 형광 신호 중 적어도 하나에 대한 정적 형광 역치 게이트는 형광 신호에 대한 복수의 제1 참조 세포 샘플 중에서 대략 모든 형광 백분위수 또는 그 초과인 형광이다.
일부 실시양태에서, 1개 이상의 형광 신호 중 적어도 하나에 대한 정적 형광 역치 게이트는 형광 신호에 대한 복수의 제2 참조 세포 샘플 중에서 형광의 제5 백분위수 미만인 형광이다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 형광 신호 중 적어도 하나에 대한 정적 형광 역치 게이트는 형광 신호에 대한 복수의 제2 참조 세포 샘플 중에서 형광의 제4 백분위수 미만인 형광이다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 형광 신호 중 적어도 하나에 대한 정적 형광 역치 게이트는 형광 신호에 대한 복수의 제2 참조 세포 샘플 중에서 형광의 제3 백분위수 미만인 형광이다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 형광 신호 중 적어도 하나에 대한 정적 형광 역치 게이트는 형광 신호에 대한 복수의 제2 참조 세포 샘플 중에서 형광의 제2 백분위수 미만인 형광이다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 형광 신호 중 적어도 하나에 대한 정적 형광 역치 게이트는 형광 신호에 대한 복수의 제2 참조 세포 샘플 중에서 형광의 제1 백분위수 미만인 형광이다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 형광 신호 중 적어도 하나에 대한 정적 형광 역치 게이트는 형광 신호에 대한 복수의 제2 참조 세포 샘플 중에서 형광의 모든 백분위수 미만인 형광이다.
일부 실시양태에서, 1개 이상의 형광 신호 중 적어도 하나에 대한 정적 형광 역치 게이트는 각각의 형광 신호에 대해 복수의 제1 참조 세포 집단 중에서 형광의 제90 백분위수 초과이고, 동일한 각 형광 신호에 대해 복수의 제2 참조 세포 집단 중에서 형광의 제10 백분위수 미만인 형광이다.
일부 실시양태에서, 1개 이상의 형광 신호 중 적어도 하나에 대한 정적 형광 역치 게이트는 각각의 형광 신호에 대해 복수의 제1 참조 세포 집단 중에서 형광의 제95 백분위수 초과이고, 동일한 각 형광 신호에 대해 복수의 제2 참조 세포 집단 중에서 형광의 제5 백분위수 미만인 형광이다.
일부 실시양태에서, 1개 이상의 형광 신호 중 적어도 하나에 대한 정적 형광 역치 게이트는 각각의 형광 신호에 대해 복수의 제1 참조 세포 집단 중에서 형광의 제99 백분위수 초과이고, 동일한 각 형광 신호에 대해 복수의 제2 참조 세포 집단 중에서 형광의 제1 백분위수 미만인 형광이다.
특정한 형광 신호에 대한 특정한 정적 형광 역치 게이트를 선택하는 것은 통상의 기술자의 수준 내에 있다. 정적 형광 역치 게이트를 선택하는 데 고려되는 인자는 염색된 샘플에서의 허용가능한 위양성 또는 위음성의 정도를 포함한다. 특정한 실시양태에서, 정적 형광 역치 게이트는 비염색된 또는 음성 집단을 완전히 배제하도록 선택된다. 일부 실시양태에서, 정적 형광 역치 게이트는, 일부 경우에 통계적 이상치를 제외하고는 가능한 한 많은 양성 집단을 포함하도록 선택된다. 일부 실시양태에서, 정적 형광 게이트 역치는 양성 및 음성/비염색 형광 사이에 넓은 범위가 존재하는 경우에 양성 집단에 대해 보존적으로 설정된다 (예를 들어, 복수의 제2 참조 집단 중 제1 백분위수 미만 또는 모든 백분위수 미만). 일부 실시양태에서, 형광 양성 및 비염색/음성 세포 집단이 2배 초과, 예컨대 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배 또는 그 초과만큼 상이한 경우에, 광범위한 형광의 형광 신호이 존재한다. 일부 실시양태에서, 형광 양성 세포 집단과 비염색된 세포 집단/음성 세포 집단이 5배 초과로 상이한 경우, 광범위한 형광의 형광 신호이 존재한다. 일부 실시양태에서, 형광 양성 세포 집단과 비염색된 세포 집단/음성 세포 집단이 10배 초과로 상이한 경우에, 광범위한 형광의 형광 신호이 존재한다.
일부 실시양태에서, 낮은 유병률 속성 (예를 들어, 세포 집단 사이의 속성에 대해 양성인 세포의 5% 미만의 예상 빈도)의 경우, 추가의 평균 형광 강도 (MFI) 분석은 사용되어 역치 결정을 보조할 수 있다. 이러한 예에서, 기재된 바와 같은 백분위수 정보 (예를 들어, 각각 복수의 제1 참조 샘플 및 복수의 제2 참조 샘플 중에서 형광의 제99 및 제1 백분위수)는 정보를 제공하고, 집단의 경계 또는 가장자리를 결정하는 것을 보조하지만, 일부 경우에 희귀 이벤트, 또는 낮은 유병률 속성에 대한 것일 수 있는 것처럼 시작할 이벤트가 거의 없는 집단에서의 이상치에 의해 편향될 수 있다. MFI는 중앙값 측정치이고, 이상치로부터의 편향에 덜 민감하다. 따라서, 일부 실시양태에서, MFI는 3차 분석으로서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, MFI는 낮은 유병률 집단의 중심 또는 가장 조밀한 부분을 확인하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 양성/염색된 및 음성/비염색된 집단의 중심이 MFI에 기초하여 결정되고, 차이 집단의 가장자리가 백분위수 (예를 들어, 제1 참조 세포 샘플 중에서 형광의 제99 백분위수 및 제2 참조 세포 샘플 중에서 형광의 제1 백분위수)에 기초하여 결정되면, 2개의 집단을 분리하기 위해 역치를 설정할 수 있다. 특정한 형광 신호에 대한 MFI를 고려하여 역치를 설정하는 것은 통상의 기술자의 수준 내에 있다.
일부 실시양태에서, 임의의 제공된 실시양태에 따라 정적 형광 게이트 역치인 것으로 결정된 세트 형광은 로그 유동 축 상에서 짝수로 반올림될 수 있다. 일부 실시양태에서, 짝수를 선택하는 것은 작업흐름을 최적화할 수 있다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 형광 신호 각각에 대해, 정적 형광 역치 게이트는 로그 유동 축 상에서 10의 자리까지 반올림되거나, 100의 자리까지 반올림되거나, 또는 1,000의 자리까지 반올림된다.
B. 정적 게이팅 역치의 적용 및 세포의 확인
일부 실시양태에서, 제공된 방법은 시험 집단으로부터의 복수의 세포측정 이벤트를 포함하는 유동 세포측정 데이터에 본원에, 예를 들어, 섹션 II, 파트 A에 기재된 바와 같은 1개 이상의 형광 신호 각각에 대한 정적 형광 역치 게이트를 적용하는 것을 포함한다.
본원에 제공된 방법 중에서 (1) 유동 세포측정기에 의해 측정된 1개 이상의 형광 신호에 따라 분류된 표지된 세포의 시험 집단으로부터의 복수의 세포측정 이벤트를 포함하는 유동 세포측정 데이터를 수신하는 단계; 및 (2) 정적 형광 역치 게이트를 설정하기 위한 임의의 제공된 방법에 따라, 정적 형광 역치 게이트를 개별적으로 1개 이상의 형광 신호 각각에 적용하는 단계를 포함하는, 유동 세포측정법을 사용하여 정적 형광 역치 게이트를 적용하는 방법이 존재한다.
예를 들어, 본원에 (1) 유동 세포측정기에 의해 측정된 1개 이상의 형광 신호에 따라 분류된 표지된 세포의 시험 집단으로부터의 복수의 세포측정 이벤트를 포함하는 유동 세포측정 데이터를 수신하는 단계; (2) 정적 형광 역치 게이트를 개별적으로 1개 이상의 형광 신호 각각에 적용하는 단계로서, 여기서 1개 이상의 형광 신호 각각에 대한 정적 형광 역치 게이트는 (a) 각각이 1개 이상의 형광 신호에 따라 분류된 세포의 복수의 적어도 2개의 참조 집단에 대한 1개 이상의 형광 신호에 대해 유동 세포측정법에 의해 측정된 세포측정 이벤트로서, 복수의 적어도 2개의 참조 집단은 (i) 각각이 1개 이상의 형광 신호로 표지되지 않은 비염색된 세포의 집단을 포함하는 세포의 복수의 제1 참조 집단; 및 (ii) 세포의 복수의 제2 참조 집단을 포함하고, 여기서 세포의 복수의 제2 참조 집단 각각은 세포의 복수의 제1 참조 집단 중 하나로부터 유래되고, 세포의 복수의 제2 참조 집단 각각은 1개 이상의 형광 신호 중 적어도 하나로 표지된 염색된 세포의 적어도 하나의 집단을 포함하는 것인 세포측정 이벤트; 및 (b) 1개 이상의 형광 신호 각각에 대한 정적 형광 역치 게이트를, 각각의 형광 신호에 대해 이를 (i) 1개 이상의 형광 신호 각각의 각 형광 신호에 대해 복수의 제1 참조 세포 집단의 형광의 제90 백분위수 초과이고; (ii) 동일한 각 형광 신호에 대해 복수의 제2 참조 세포 집단의 형광의 제10 백분위수 미만이도록 설정하는 것으로부터 결정되는 것인 단계를 포함하는, 유동 세포측정법을 사용하여 정적 형광 역치 게이트를 적용하는 방법이 제공된다.
일부 실시양태에서, 제공된 방법은 1개 이상의 형광 신호 각각에 대해, 정적 역치 게이트 초과의 형광 신호를 갖는 세포의 시험 집단으로부터 세포측정 이벤트의 하위세트를 확인하는 것을 추가로 포함한다.
또한 본원에 (1) 유동 세포측정기에 의해 측정된 1개 이상의 형광 신호에 따라 분류된 표지된 세포의 시험 집단으로부터 복수의 세포측정 이벤트를 포함하는 유동 세포측정 데이터를 수신하는 단계; (2) 정적 형광 역치 게이트를 개별적으로 1개 이상의 형광 신호 각각에 적용하는 단계로서, 여기서 1개 이상의 형광 신호 각각에 대한 정적 형광 역치 게이트는 (a) 각각이 1개 이상의 형광 신호에 따라 분류된 세포의 복수의 적어도 2개의 참조 집단에 대한 1개 이상의 형광 신호에 대해 유동 세포측정법에 의해 측정된 세포측정 이벤트로서, 복수의 적어도 2개의 참조 집단은 (i) 각각이 1개 이상의 형광 신호로 표지되지 않은 비염색된 세포의 집단을 포함하는 세포의 복수의 제1 참조 집단; 및 (ii) 세포의 복수의 제2 참조 집단을 포함하고, 여기서 세포의 복수의 제2 참조 집단 각각은 세포의 복수의 제1 참조 집단 중 하나로부터 유래되고, 세포의 복수의 제2 참조 집단 각각은 1개 이상의 형광 신호 중 적어도 하나로 표지된 염색된 세포의 적어도 하나의 집단을 포함하는 것인 세포측정 이벤트; 및 (b) 1개 이상의 형광 신호 각각에 대한 정적 형광 역치 게이트를, 각각의 형광 신호에 대해 이를 (i) 1개 이상의 형광 신호 각각의 각 형광 신호에 대해 복수의 제1 참조 세포 집단의 형광의 제90 백분위수 초과이고; (ii) 동일한 각 형광 신호에 대해 복수의 제2 참조 세포 집단의 형광의 제10 백분위수 미만이도록 설정하는 것으로부터 결정되는 것인 단계; 및 (3) 1개 이상의 형광 신호 각각에 대해, 정적 역치 게이트 초과의 형광 신호를 갖는 세포의 시험 집단으로부터 세포측정 이벤트의 하위세트를 확인하는 단계를 포함하는, 유동 세포측정 데이터로부터 세포측정 이벤트의 하위세트를 선택하는 방법이 제공된다.
제공된 방법의 일부 실시양태에서, 형광 신호 중 적어도 하나에 대한 세포의 확인된 하위세트의 형광 특색 또는 특징이 결정된다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 형광 신호 각각에 대한 세포의 확인된 하위세트의 형광 특색 또는 특징이 결정된다.
일부 실시양태에서, 1개 이상의 형광 신호 중 적어도 하나에 대한 세포측정 이벤트의 확인된 하위세트에 대해, 방법은 세포측정 이벤트의 확인된 하위세트의 적어도 하나의 형광 신호의 형광 강도를 평가하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 형광 신호 각각에 대한 세포측정 이벤트의 확인된 하위세트 각각에 대해, 방법은 세포측정 이벤트의 확인된 하위세트의 형광 신호의 강도를 평가하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 형광 강도는 평균 형광 강도이다.
일부 실시양태에서, 1개 이상의 형광 신호 중 적어도 하나에 대한 세포측정 이벤트의 확인된 하위세트에 대해, 방법은 수집된 세포측정 이벤트의 총수와 비교하여 세포측정 이벤트의 확인된 하위세트의 백분율을 결정하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 형광 신호 각각에 대한 세포측정 이벤트의 확인된 하위세트 각각에 대해, 방법은 수집된 세포측정 이벤트의 총수와 비교하여 각 형광 신호에 대한 세포측정 이벤트의 확인된 하위세트의 백분율을 결정하는 것을 추가로 포함한다.
III. 정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 용어, 표기법 및 다른 기술 과학 용어 또는 용어는 청구된 주제가 속하는 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는 것으로 의도된다. 일부 경우에, 통상적으로 이해되는 의미를 갖는 용어는 명확성을 위해 및/또는 용이한 참조를 위해 본원에 정의되며, 본원에서의 이러한 정의의 포함은 반드시 관련 기술분야에서 일반적으로 이해되는 것에 비해 실질적인 차이를 나타내는 것으로 해석되어서는 안된다.
본원에 사용된 단수 형태는 문맥이 달리 명백하게 지시하지 않는 한 복수 지시대상을 포함한다. 예를 들어, 단수형은 "적어도 하나" 또는 "하나 이상"을 의미한다. 본원에 기재된 측면 및 변형은 측면 및 변형으로 "이루어진" 및/또는 "본질적으로 이루어진" 것을 포함하는 것으로 이해된다.
용어 "적어도 하나" 및 "하나 이상"은 1, 2, 3, 4, [... ] 등인 1 이상의 임의의 정수를 포함하는 것으로 이해될 수 있다. 용어 "복수"는 2, 3, 4, 5, [... ] 등인 2 이상의 임의의 정수를 포함하는 것으로 이해될 수 있다.
요소의 군과 관련하여 어구 "중 적어도 하나"는 요소로 이루어진 군으로부터의 적어도 하나의 요소를 의미하기 위해 본원에 사용될 수 있다. 예를 들어, 요소의 군과 관련하여 어구 "중 적어도 하나"는 열거된 요소 중 하나, 열거된 요소 중 복수의 하나, 복수의 개별 열거된 요소, 또는 복수의 열거된 요소의 선택을 의미하기 위해 본원에 사용될 수 있다.
본 개시내용 전반에 걸쳐, 청구된 대상의 다양한 측면은 범위 포맷으로 제시된다. 범위 포맷의 기재는 단지 편의 및 간결성을 위한 것이며, 청구된 대상의 범주에 대한 융통성 없는 제한으로 해석되어서는 안된다는 것이 이해되어야 한다. 따라서, 범위의 기재는 구체적으로 개시된 모든 가능한 하위-범위 뿐만 아니라 그 범위 내의 개별 수치 값을 갖는 것으로 간주되어야 한다. 예를 들어, 값의 범위가 제공되는 경우에, 그 범위의 상한과 하한 사이의 각각의 개재 값 및 그 언급된 범위 내의 임의의 다른 언급된 값 또는 개재 값이 청구된 대상 내에 포괄되는 것으로 이해된다. 이들 보다 작은 범위의 상한치 및 하한치는 독립적으로 보다 작은 범위에 포함될 수 있고, 또한 언급된 범위에서 임의의 구체적으로 배제된 한계를 조건으로 청구된 대상 내에 포괄된다. 언급된 범위가 한계 중 하나 또는 둘 다를 포함하는 경우에, 이들 포함된 한계 중 하나 또는 둘 다를 배제하는 범위가 또한 청구된 대상에 포함된다. 이는 범위의 폭과 상관없이 적용된다.
본원에 사용된 용어 "약"은 용이하게 공지된 각각의 값에 대한 통상의 오차 범위를 지칭한다. 본원에서 "약" 값 또는 파라미터에 대한 언급은 그 값 또는 파라미터 자체에 관한 실시양태를 포함 (및 기재)한다. 예를 들어, "약 X"를 언급하는 기재는 "X"의 기재를 포함한다.
본원에 사용된 "이벤트" 또는 "세포측정 이벤트"는 유동 세포측정기에 의해 단일 입자, 예컨대 세포 또는 합성 입자로부터 측정된 데이터를 지칭한다. 전형적으로, 단일 입자로부터 측정된 데이터는 1개 이상의 광 산란 파라미터, 및 적어도 하나의 형광 신호 파라미터를 포함하는 다수의 파라미터를 포함한다. 따라서, 각각의 이벤트는 파라미터 측정의 벡터로서 나타내어지며, 여기서 각각의 측정된 파라미터는 데이터 공간의 1차원에 상응한다.
"형광성 마커" 또는 "형광 마커"는 파장 범위에서 에너지를 흡수하고 흡광도 범위 이외의 파장 범위에서 에너지를 방출할 수 있는 형광단을 포함하는 형광 마커를 의미한다. 따라서, 이는 광에 의한 여기 시 광을 방출할 수 있는 형광 화합물을 지칭한다. 용어 "형광 마커" 또는 그의 변형은 용어 "형광단"과 상호교환가능하게 사용될 수 있는 것으로 이해된다. 용어 "여기 파장"은 형광단이 에너지를 흡수하는 파장의 범위를 지칭한다. 용어 "방출 파장"은 형광단이 에너지를 방출하거나 형광을 내는 파장의 범위를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 상호교환가능하게 사용될 수 있는 용어인 "형광" 또는 "형광 강도"는 형광 마커, 예컨대 형광단으로부터 방출된 것과 같은 특정한 형광 신호의 방출의 형광 샘플 강도로부터 형광 방사휘도를 측정하는 검출 시스템의 출력을 지칭한다. 형광 강도는 빛 또는 다른 전자기 방사선을 흡수한 후 얼마나 많은 빛 (광자)이 형광 마커에 의해 방출되는지이다.
본원에 사용된 "평균 형광 강도" 또는 "MFI"는 특정한 형광 채널에서의 형광 강도의 평균을 지칭한다.
본원에 사용된 "게이트"는 관심 데이터의 하위세트를 확인하는 경계점의 세트를 지칭한다. 세포측정법에서, 게이트는 특정한 관심 이벤트의 군을 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 게이트는 특정한 이벤트를 둘러싸는 윈도우일 수 있다. 다른 실시양태에서, 게이트는 "역치 게이트"일 수 있다. 본원에 사용된 "게이팅"은 주어진 데이터 세트에 대한 게이트를 정의하는 과정을 지칭한다.
본원에 사용된 "역치 게이트"는 특정 형광 강도보다 높은 형광 신호 또는 형광 강도를 방출하는 세포 집단의 세포를 특정 형광 강도보다 낮은 형광 신호 또는 형광 강도를 방출하는 세포 집단의 세포로부터 분리하는 특정 형광 강도로 설정된 게이트를 지칭한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 이는 다차원 공간 내에 개방 영역을 규정한다.
본원에 사용된 "정적 역치 게이트"는 주어진 형광 신호에 대해 고정되거나 변화되지 않고 복수의 염색되거나 표지된 샘플에 적용될 수 있는 역치 게이트를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 정적 역치 게이트는 유동 세포측정법 검정, 예를 들어 다색 유동 세포측정법 검정에서 형광 신호로 표지된 각각의 속성 (예를 들어, 마커)에 대해 설정된다.
본원에 사용된 "표지된"은 검출가능한 표지, 예컨대 형광 마커 또는 염색제가 부착된 상태를 지칭한다. 예를 들어, 세포 집단의 세포는 1개 이상의 형광 신호가 유동 세포측정기에 의해 측정될 수 있도록 1개 이상의 형광 마커로 표지될 수 있다.
본원에 사용된 "백분위수"는 그의 빈도 분포에서 주어진 백분율의 점수가 속하는 점수 또는 그 미만을 지칭한다.
본원에 사용된 세포의 "풍부화된" 집단에 대한 언급은, 예를 들어 세포의 출발 집단에서의 그의 백분율과 비교하여 세포 유형 또는 집단의 수 또는 백분율을 증가시키기 위해 풍부화, 단리 또는 선택 단계에 적용된 1개 이상의 특정한 세포 유형 또는 하위세트 또는 세포 집단을 지칭한다. 따라서, 이는 예컨대 집단 또는 세포에 의해 발현되는 마커에 기반한 양성 선택에 의해, 또는 세포 집단 또는 고갈될 세포 상에 존재하지 않는 마커에 기반한 음성 선택에 의해, 또는 다른 세포 유형에 비해, 이같은 세포의 백분율 또는 빈도를 증가시키는 것을 지칭한다. 상기 용어는 조성물로부터의 다른 세포, 세포 유형 또는 집단의 완전한 제거를 필요로 하지 않으며, 그렇게 풍부화된 세포가 풍부화된 조성물 중에 100%로 또는 심지어 거의 100%로 존재하는 것을 필요로 하지 않는다. 일부 실시양태에서, 풍부화된 세포 집단은 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 그 초과의 특정한 세포 유형 또는 하위세트를 함유한다. 예를 들어, 풍부화된 세포 집단은 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 그 초과의 T 세포 (예를 들어, CD3+ 세포) 또는 그의 CD4+ 또는 CD8+ 하위세트를 함유하는 풍부화된 T 세포 집단일 수 있다. 특정 유형의 세포, 예컨대 마커를 발현하는 세포의 양성 선택 또는 그에 대한 풍부화에 대한 언급은 이러한 세포의 수 또는 백분율을 증가시키는 것을 지칭하지만, 마커를 발현하지 않는 세포의 완전한 부재를 초래할 필요는 없다. 마찬가지로, 특정 유형의 세포, 예컨대 마커를 발현하는 세포의 음성 선택, 제거 또는 고갈은 이러한 세포의 수 또는 백분율을 감소시키는 것을 지칭하지만, 이러한 모든 세포를 완전히 제거시켜야 할 필요는 없다. 예를 들어, 일부 측면에서, CD4+ 또는 CD8+ 집단 중 하나의 선택은 상기 집단, CD4+ 또는 CD8+ 집단을 풍부화하지만, 또한 일부 경우에 풍부화된 집단에 여전히 존재하는 CD4 또는 CD8 집단 중 다른 것을 포함할 수 있는 일부 잔류 또는 작은 백분율의 다른 비-선택된 세포를 함유할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 세포 또는 세포의 집단이 특정한 마커에 대해 "양성"이라는 언급은 특정한 마커, 일반적으로 표면 마커의 세포 상의 또는 내의 검출가능한 존재를 의미한다. 표면 마커를 언급하는 경우에, 상기 용어는 유동 세포측정법에 의해, 예를 들어 마커에 특이적으로 결합하는 항체로 염색하고 상기 항체를 검출함으로써 검출되는 바와 같은 표면 발현의 존재를 지칭하며, 여기서 염색은 다른 것은 동일한 조건 하에 이소형-매칭된 대조군을 사용하여 동일한 절차를 수행하여 검출된 염색을 실질적으로 초과하는 수준에서 및/또는 마커에 대해 양성인 것으로 공지된 세포에 대한 것과 실질적으로 유사한 수준에서, 및/또는 마커에 대해 음성인 것으로 공지된 세포에 대한 것보다 실질적으로 더 높은 수준에서 유동 세포측정법에 의해 검출가능하다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 세포 또는 세포의 집단이 특정한 마커에 대해 "음성"이라는 언급은 세포 상에 또는 내에 특정한 마커, 일반적으로 표면 마커가 실질적으로 검출가능하게 존재하지 않는 것을 의미한다. 표면 마커를 언급하는 경우에, 상기 용어는 유동 세포측정법에 의해, 예를 들어 마커에 특이적으로 결합하는 항체로 염색하고 상기 항체를 검출함으로써 검출된 바와 같은 표면 발현의 부재를 지칭하며, 여기서 염색은 달리 동일한 조건 하에 이소형-매칭된 대조군을 사용하여 동일한 절차를 수행하는 검출된 염색을 실질적으로 초과하는 수준에서, 및/또는 마커에 대해 양성인 것으로 공지된 세포에 대한 것보다 실질적으로 더 낮은 수준에서, 및/또는 마커에 대해 음성인 것으로 공지된 세포에 대한 것과 비교하여 실질적으로 유사한 수준에서 유동 세포측정법에 의해 검출되지 않는다.
본원에 사용된 "대상체"는 포유동물, 예컨대 인간 또는 다른 동물이고, 전형적으로 인간이다.
IV. 예시적인 실시양태
제공된 실시양태 중에는
1. 정적 형광 역치 게이트를 결정하는 방법이며, 방법은 하기를 포함한다:
(1) 복수의 적어도 2개의 참조 세포 샘플에 대한 1개 이상의 형광 신호에 대해 유동 세포측정법에 의해 세포측정 이벤트를 측정하는 단계로서, 복수의 적어도 2개의 참조 세포 샘플은
(a) 각각이 1개 이상의 형광 신호로 표지되지 않은 비염색된 세포의 집단을 포함하는 복수의 제1 참조 세포 샘플; 및
(b) 복수의 제2 참조 세포 샘플을 포함하고, 복수의 제2 참조 세포 샘플 각각이 복수의 제1 참조 세포 샘플 중 하나와 동일한 세포 공급원 유형으로부터 유래되고, 복수의 제2 참조 세포 샘플 각각이 1개 이상의 형광 신호 중 적어도 하나로 표지된 염색된 세포의 적어도 하나의 집단을 포함하는 것인 단계; 및
(2) 1개 이상의 형광 신호 각각에 대한 정적 형광 역치 게이트를, 각각의 형광 신호의 경우 역치 게이트가
(a) 1개 이상의 형광 신호 각각의 각 형광 신호에 대해 복수의 제1 참조 세포 샘플의 형광의 제90 백분위수 초과이고;
(b) 동일한 각 형광 신호에 대해 복수의 제2 참조 세포 샘플의 형광의 제10 백분위수 미만인 형광이도록 설정하는 단계.
2. 유동 세포측정 데이터로부터 세포측정 이벤트의 하위세트를 선택하는 방법이며, 방법은 하기를 포함한다:
(1) 유동 세포측정기에 의해 측정된 1개 이상의 형광 신호에 따라 분류된 표지된 세포를 포함하는 시험 세포 샘플로부터의 복수의 세포측정 이벤트를 포함하는 유동 세포측정 데이터를 수신하는 단계;
(2) 정적 형광 역치 게이트를 개별적으로 1개 이상의 형광 신호 각각에 적용하는 단계로서, 여기서 1개 이상의 형광 신호 각각에 대한 정적 형광 역치 게이트는 실시양태 1의 방법에 따라 결정되는 것인 단계;
(3) 1개 이상의 형광 신호 각각에 대해, 정적 역치 게이트 초과의 형광 신호를 갖는 세포측정 이벤트의 하위세트를 확인하는 단계.
3. 유동 세포측정 데이터로부터 세포측정 이벤트의 하위세트를 선택하는 방법이며, 하기를 포함한다:
(1) 유동 세포측정기에 의해 측정된 1개 이상의 형광 신호에 따라 분류된 표지된 세포를 포함하는 시험 세포 샘플로부터의 복수의 세포측정 이벤트를 포함하는 유동 세포측정 데이터를 수신하는 단계;
(2) 정적 형광 역치 게이트를 개별적으로 1개 이상의 형광 신호 각각에 적용하는 단계로서, 여기서 1개 이상의 형광 신호 각각에 대한 정적 형광 역치 게이트는
(a) 각각이 1개 이상의 형광 신호에 따라 분류된 복수의 적어도 2개의 참조 세포 샘플에 대한 1개 이상의 형광 신호에 대해 유동 세포측정법에 의해 측정된 세포측정 이벤트로서, 복수의 적어도 2개의 참조 세포 샘플은
(i) 각각이 1개 이상의 형광 신호로 표지되지 않은 비염색된 세포의 집단을 포함하는 복수의 제1 참조 세포 샘플; 및
(ii) 복수의 제2 참조 세포 샘플을 포함하고, 여기서 복수의 제2 참조 세포 샘플 각각은 복수의 제1 참조 세포 샘플 중 하나와 동일한 세포 공급원 유형으로부터 유래되고, 복수의 제2 참조 세포 샘플 각각은 1개 이상의 형광 신호 중 적어도 하나로 표지된 염색된 세포의 적어도 하나의 집단을 포함하는 것인 세포측정 이벤트; 및
(b) 1개 이상의 형광 신호 각각에 대한 정적 형광 역치 게이트를, 각각의 형광 신호에 대해 역치 게이트가
(i) 1개 이상의 형광 신호 각각의 각 형광 신호에 대해 복수의 제1 참조 세포 샘플의 형광의 제90 백분위수 초과이고;
(ii) 동일한 각 형광 신호에 대해 복수의 제2 참조 세포 샘플의 형광의 제10 백분위수 미만인 형광이도록 설정하는 것으로부터 결정되는 것인 단계; 및
(3) 1개 이상의 형광 신호 각각에 대해, 정적 역치 게이트 초과의 형광 신호를 갖는 세포측정 이벤트의 하위세트를 확인하는 단계.
4. 유동 세포측정법을 사용하여 정적 형광 역치 게이트를 적용하는 방법이며, 하기를 포함한다:
(1) 유동 세포측정기에 의해 측정된 1개 이상의 형광 신호에 따라 분류된 표지된 세포를 포함하는 시험 세포 샘플로부터의 복수의 세포측정 이벤트를 포함하는 유동 세포측정 데이터를 수신하는 단계; 및
(2) 정적 형광 역치 게이트를 개별적으로 1개 이상의 형광 신호 각각에 적용하는 단계로서, 여기서 1개 이상의 형광 신호 각각에 대한 정적 형광 역치 게이트는 실시양태 1의 방법에 따라 결정되는 것인 단계.
5. 유동 세포측정법을 사용하여 정적 형광 역치 게이트를 적용하는 방법이며, 하기를 포함한다:
(1) 유동 세포측정기에 의해 측정된 1개 이상의 형광 신호에 따라 분류된 표지된 세포를 포함하는 시험 세포 샘플로부터의 복수의 세포측정 이벤트를 포함하는 유동 세포측정 데이터를 수신하는 단계;
(2) 정적 형광 역치 게이트를 개별적으로 1개 이상의 형광 신호 각각에 적용하는 단계로서, 여기서 1개 이상의 형광 신호 각각에 대한 정적 형광 역치 게이트는
(a) 각각이 1개 이상의 형광 신호에 따라 분류된 복수의 적어도 2개의 참조 세포 샘플에 대한 1개 이상의 형광 신호에 대해 유동 세포측정법에 의해 측정된 세포측정 이벤트로서, 복수의 적어도 2개의 참조 세포 샘플은
(i) 각각이 1개 이상의 형광 신호로 표지되지 않은 비염색된 세포의 집단을 포함하는 복수의 제1 참조 세포 샘플; 및
(ii) 복수의 제2 참조 세포 샘플을 포함하고, 여기서 복수의 제2 참조 세포 샘플 각각은 복수의 제1 참조 세포 샘플 중 하나와 동일한 세포 공급원 유형으로부터 유래되고, 복수의 제2 참조 세포 샘플 각각은 1개 이상의 형광 신호 중 적어도 하나로 표지된 염색된 세포의 적어도 하나의 집단을 포함하는 것인 세포측정 이벤트; 및
(b) 1개 이상의 형광 신호 각각에 대해 정적 형광 역치 게이트를, 각각의 형광 신호에 대해 역치 게이트가
(i) 1개 이상의 형광 신호 각각의 각 형광 신호에 대해 복수의 제1 참조 세포 샘플의 형광의 제90 백분위수 초과이고;
(ii) 동일한 각 형광 신호에 대해 복수의 제2 참조 세포 샘플의 형광의 제10 백분위수 미만인 형광이도록 설정하는 것으로부터 결정되는 것인 단계.
6. 실시양태 1-5 중 어느 하나에 있어서, 시험 세포 샘플, 및 복수의 제1 및 제2 참조 세포 샘플 각각이 동일한 공급원 유형의 세포로부터의 것인 방법.
7. 실시양태 1-6 중 어느 하나에 있어서, 세포의 공급원 유형이 세포주인 방법.
8. 실시양태 1-6 중 어느 하나에 있어서, 세포의 공급원 유형이 대상체로부터의 1차 세포 집단인 방법.
9. 실시양태 8에 있어서, 각각의 시험 세포 샘플, 및 복수의 제1 및 제2 참조 세포 샘플 각각의 세포의 공급원 유형이 상이한 대상체로부터의 것인 방법.
10. 실시양태 9에 있어서, 각각의 상이한 대상체가 동일하거나 유사한 질환 또는 상태를 갖는 것인 방법.
11. 실시양태 1-10 중 어느 하나에 있어서, 세포의 공급원 유형이 전혈 샘플, 분리반출술 샘플 또는 백혈구분리반출술 샘플인 방법.
12. 실시양태 1-11 중 어느 하나에 있어서, 세포의 공급원 유형이 세포의 풍부화된 집단, 임의로 T 세포의 풍부화된 집단인 방법.
13. 실시양태 1-12 중 어느 하나에 있어서, 세포의 공급원 유형이 재조합 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 세포의 조작된 집단이며, 임의로 여기서 재조합 단백질은 유전자 전달, 임의로 형질도입에 의해 세포의 집단 내로 도입된 것인 방법.
14. 실시양태 1-13 중 어느 하나에 있어서, 세포의 공급원 유형이 세포 요법인 방법.
15. 실시양태 1-14 중 어느 하나에 있어서, 복수의 제1 참조 세포 샘플이 2, 5, 10, 25, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000개 초과의 세포 샘플을 포함하는 것인 방법.
16. 실시양태 1-15 중 어느 하나에 있어서, 복수의 제2 참조 세포 샘플이 2, 5, 10, 25, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000개 초과의 세포 샘플을 포함하는 것인 방법.
17. 실시양태 1-16 중 어느 하나에 있어서, 복수의 제1 및 제2 참조 세포 샘플 각각이 임상 시험에서 질환 또는 상태를 갖는 대상체로부터의 공급원 유형의 세포인 방법.
18. 실시양태 1-16 중 어느 하나에 있어서, 세포의 공급원 유형이 자가 세포 요법이고, 제1 및 제2 참조 세포 샘플 각각이 세포 요법을 시험하기 위한 임상 시험에서 대상체로부터의 세포 요법의 샘플인 방법.
19. 실시양태 14 또는 실시양태 18에 있어서, 세포 요법이 T 세포 요법, 임의로 CAR-T 세포 요법, TCR-T 세포 요법 또는 TIL 요법인 방법.
20. 실시양태 14 또는 실시양태 18에 있어서, 세포 요법이 NK 세포 요법인 방법.
21. 실시양태 14 또는 실시양태 18에 있어서, 세포 요법이 줄기 세포 요법인 방법.
22. 실시양태 1-21 중 어느 하나에 있어서, 시험 세포 샘플 및 각각의 제2 참조 세포 샘플이 세포를 1개 이상의 형광 신호로 표지하기 위한 1종 이상의 염색 시약으로의 세포 염색에 적용된 것인 방법.
23. 실시양태 22에 있어서, 1종 이상의 염색 시약이 마커에 특이적인 결합제, 및 1개 이상의 형광 신호 중 하나를 방출할 수 있는 형광 염료를 포함하는 것인 방법.
24. 실시양태 23에 있어서, 마커가 세포 표면 마커 또는 생존율 마커인 방법.
25. 실시양태 23 또는 실시양태 24에 있어서, 적어도 하나의 마커가 샘플 내의 세포의 적어도 5% 이상에서 발현되거나 발현될 것으로 여겨지는 우세한 속성인 방법.
26. 실시양태 23 또는 실시양태 24에 있어서, 적어도 하나의 마커가 샘플 내의 세포의 5% 미만에서 발현되거나 발현될 것으로 여겨지는 낮은 유병률 속성인 방법.
27. 실시양태 1-26 중 어느 하나에 있어서, 1개 이상의 형광 신호가 2개 이상의 상이한 형광 신호를 포함하는 것인 방법.
28. 실시양태 22-27 중 어느 하나에 있어서, 세포 염색이 세포를 2개 이상의 상이한 형광 신호로 표지하기 위한 다색 세포 염색이고, 여기서 각각의 염색 시약이 상이한 마커를 상이한 형광 신호로 표지하는 것인 방법.
29. 실시양태 27 또는 실시양태 28에 있어서, 2개 이상의 상이한 형광 신호가 2 내지 10개의 형광 신호, 임의로 정확히 또는 약 2, 3, 4, 5 또는 6개의 형광 신호를 포함하는 것인 방법.
30. 실시양태 27-29 중 어느 하나에 있어서, 2개 이상의 상이한 형광 신호 각각이 상이한 방출 스펙트럼을 갖고/거나 각각의 형광 신호의 피크 방출 스펙트럼이 중첩되지 않는 것인 방법.
31. 실시양태 27-30 중 어느 하나에 있어서, 2개 이상의 상이한 형광 신호가 PE-Cy7, APC, AF700, BV421, 아쿠아, 및 BV605로 이루어진 군으로부터 선택된 염료에 의해 방출된 신호인 방법.
32. 실시양태 22-31 중 어느 하나에 있어서, 시험 세포 샘플 및 각각의 제2 참조 세포 샘플의 세포 염색이 동일한 염색 시약으로 동일한 프로토콜 조건을 사용하여 수행되는 것인 방법.
33. 실시양태 1-32 중 어느 하나에 있어서, 복수의 제2 참조 세포 샘플이 동일한 염색된 세포의 이중 샘플을 포함하는 것인 방법.
34. 실시양태 1-32 중 어느 하나에 있어서, 복수의 제2 참조 세포 샘플이 동일한 염색된 세포의 삼중 샘플을 포함하는 것인 방법.
35. 실시양태 1-34 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 형광 신호에 대한 정적 형광 역치 게이트가 형광 신호에 대해 복수의 제1 참조 세포 샘플 중에서 형광의 제95 백분위수 초과인 형광이 되는 것인 방법.
36. 실시양태 1-34 중 어느 하나에 있어서, 1개 이상의 형광 신호 중 적어도 하나에 대한 정적 형광 역치 게이트가 형광 신호에 대해 복수의 제1 참조 세포 샘플 중에서 형광의 제97 백분위수 초과인 형광인 방법.
37. 실시양태 1-34 중 어느 하나에 있어서, 1개 이상의 형광 신호 중 적어도 하나에 대한 정적 형광 역치 게이트가 형광 신호에 대해 복수의 제1 참조 세포 샘플 중에서 형광의 제99 백분위수 초과인 형광인 방법.
38. 실시양태 1-37 중 어느 하나에 있어서, 1개 이상의 형광 신호 중 적어도 하나에 대한 정적 형광 역치 게이트가 형광 신호에 대해 복수의 제2 참조 세포 샘플 중에서 형광의 제5 백분위수 미만인 형광인 방법.
39. 실시양태 1-37 중 어느 하나에 있어서, 1개 이상의 형광 신호 중 적어도 하나에 대한 정적 형광 역치 게이트가 형광 신호에 대해 복수의 제2 참조 세포 샘플 중에서 형광의 제3 백분위수 미만인 형광인 방법.
40. 실시양태 1-37 중 어느 하나에 있어서, 1개 이상의 형광 신호 중 적어도 하나에 대한 정적 형광 역치 게이트가 형광 신호에 대해 복수의 제2 참조 세포 샘플 중에서 형광의 제1 백분위수 미만인 형광인 방법.
41. 실시양태 1-37 및 40 중 어느 하나에 있어서, 형광 신호에 대해 비염색된 세포 집단의 형광 및 염색된 세포 집단의 형광이 2배 초과만큼 상이한 경우, 정적 형광의 설정이 형광 신호에 대하여 복수의 제2 참조 세포 샘플 중에서 형광의 제1 백분위수 미만 또는 형광의 모든 백분위수 미만인 방법.
42. 실시양태 1-37 및 40 중 어느 하나에 있어서, 형광 신호에 대해 비염색된 세포 집단의 형광 및 염색된 세포 집단의 형광이 5배 초과만큼 상이한 경우, 정적 형광의 설정이 형광 신호에 대하여 복수의 제2 참조 세포 샘플 중에서 형광의 제1 백분위수 미만 또는 형광의 모든 백분위수 미만인 방법.
43. 실시양태 1-37 및 40 중 어느 하나에 있어서, 형광 신호에 대해 비염색된 세포 집단의 형광 및 염색된 세포 집단의 형광이 10배 초과만큼 상이한 경우, 정적 형광의 설정이 형광 신호에 대하여 복수의 제2 참조 세포 샘플 중에서 형광의 제1 백분위수 미만 또는 형광의 모든 백분위수 미만인 방법.
44. 실시양태 1-43 중 어느 하나에 있어서, 낮은 유병률 속성에 대해, 정적 형광 역치 게이트의 설정이 1개 이상의 형광 신호 중 하나 이상에 대한 평균 형광 강도 (MFI)를 확인하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
45. 실시양태 1-44 중 어느 하나에 있어서, 1개 이상의 형광 신호 각각에 대해, 정적 형광 역치 게이트가 로그 유동 축 상의 짝수인 방법.
46. 실시양태 1-45 중 어느 하나에 있어서, 1개 이상의 형광 신호 각각에 대해, 정적 형광 역치 게이트가 로그 유동 축 상에서 10의 자리까지 반올림되거나, 100의 자리까지 반올림되거나, 또는 1,000의 자리까지 반올림되는 것인 방법.
47. 실시양태 2, 3 및 6-46 중 어느 하나에 있어서, 1개 이상의 형광 신호 중 적어도 2개, 1개 이상의 형광 신호 중 적어도 3개, 1개 이상의 형광 신호 중 적어도 4개, 1개 이상의 형광 신호 중 적어도 5개, 1개 이상의 형광 신호 중 적어도 6개, 또는 1개 이상의 형광 신호 중 적어도 7개 이상에 대해 정적 역치 게이트 초과의 형광 신호를 갖는 세포의 하위세트를 시험 세포 집단으로부터 확인하는 것을 추가로 포함하는 방법.
48. 실시양태 2, 3, 및 6-47 중 어느 하나에 있어서, 1개 이상의 형광 신호 모두에 대해 정적 역치 게이트 초과의 형광 신호를 갖는 세포의 하위세트를 시험 세포 집단으로부터 확인하는 것을 추가로 포함하는 방법.
49. 실시양태 1-47 중 어느 하나에 있어서, 정적 형광 역치 게이트가 시험 샘플의 염색된 세포의 집단의 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%를 포함하는 것인 방법.
50. 실시양태 1-49 중 어느 하나에 있어서, 1개 이상의 형광 신호 각각에 대한 정적 형광 역치 게이트를 시험 샘플의 염색된 세포의 집단의 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%를 포함하도록 설정하는 것인 방법.
51. 실시양태 2, 3, 및 6-50 중 어느 하나에 있어서, 1개 이상의 형광 신호 중 적어도 하나에 대한 세포측정 이벤트의 확인된 하위세트에 대해, 세포측정 이벤트의 확인된 하위세트의 적어도 하나의 형광 신호의 형광 강도를 평가하는 것을 추가로 포함하는 방법.
52. 실시양태 2, 3 및 6-50 중 어느 하나에 있어서, 1개 이상의 형광 신호 각각에 대한 세포측정 이벤트의 확인된 하위세트 각각에 대해, 세포측정 이벤트의 확인된 하위세트의 형광 신호의 강도를 평가하는 것을 추가로 포함하는 방법.
53. 실시양태 51 또는 실시양태 52에 있어서, 형광 강도가 평균 형광 강도인 방법.
54. 실시양태 2, 3, 및 6-53 중 어느 하나에 있어서, 1개 이상의 형광 신호 중 적어도 하나에 대한 세포측정 이벤트의 확인된 하위세트에 대해, 수집된 세포측정 이벤트의 총수와 비교된 세포측정 이벤트의 확인된 하위세트의 백분율을 결정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
55. 실시양태 2, 3 및 6-53 중 어느 하나에 있어서, 1개 이상의 형광 신호 각각에 대한 세포측정 이벤트의 확인된 하위세트 각각에 대해, 수집된 세포측정 이벤트의 총수와 비교하여 각 형광 신호에 대한 세포측정 이벤트의 확인된 하위세트의 백분율을 결정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
56. 실시양태 1-55 중 어느 하나에 있어서, 유동 세포측정기에 의한 1개 이상의 형광 신호의 보정을 포함하는 방법.
57. 실시양태 56에 있어서, 보정이 적어도 1일 1회 수행되는 것인 방법.
V. 실시예
하기 실시예는 단지 예시적 목적을 위해 포함되며, 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
실시예 1: 유동 세포측정 분석을 위한 정적 게이팅 역치의 개발
각각의 형광색소-접합된 항체에 대한 형광 마이너스 원 (FMO) 또는 이소형 게이팅 대조군은 품질 관리 (QC) 설정에서 사용되는 유동 세포측정 방법에 대한 산업 표준 게이팅 대조군이다. 이들 게이팅 접근법에 대한 이익은 이들이 객관적 게이트 배치를 허용한다는 것이지만, 또한 이들 접근법에 대한 단점, 예컨대 처리량 감소, 검정 복잡성 증가 (예를 들어, 시간 제한, 실패율 및 샘플 부피 제한으로 인함), 및 상품의 비용 증가가 존재한다. 이들 단점을 다루기 위해 유동 세포측정 분석을 위한 정적 게이팅 역치를 개발하였다.
형광 역치를 유동 세포측정법을 사용하여 6가지 속성에 대해 결정하였다 (표 E1). 샘플의 344개의 임상 로트를 사용하였다. 각각의 임상 샘플은 CAR T 세포를 함유하는 제조된 약물 제품의 로트로부터 유래되었다. 음성 염색 분석을 비염색된 샘플에 대해 단일선으로부터 수행하고, 양성 염색 분석을 염색된 샘플에 대해 삼중으로 수행하였다 (표 E1).
표 E1.
플로우조 분석 소프트웨어 (v10.6)를 사용하여 형광 발현을 특징화하였다. 비염색 샘플의 분석을 사용하여 각각의 속성에 대한 비염색된 또는 음성 형광의 상부 경계를 특징화하였다. 비염색된 또는 음성 샘플의 경우, 이는 비염색된 또는 음성 형광의 최대 상부 경계로 간주되는 형광의 제99 백분위수를 결정하는 것; 비염색된 또는 음성 형광의 2차 상부 경계로 간주되는 형광의 제95 백분위수를 결정하는 것; 및 일부 경우에, 평균 형광 강도 (MFI)를 결정하는 것을 포함하였다 (도 1b, 좌측).
양성 염색된 복제물의 분석을 사용하여 각각의 속성에 대한 양성 형광의 하부 경계를 특징화하였다. 양성 염색된 샘플에 대해, 이는 염색된 형광의 최소 하부 경계로 간주되는 형광의 제1 백분위수를 결정하는 것; 염색된 형광의 제2 하부 경계로 간주되는 형광의 제5 백분위수를 결정하는 것; 및 일부 경우에, MFI를 결정하는 것을 포함하였다 (도 1b, 우측).
MFI를 사용하여 세포 집단의 중심 또는 가장 조밀한 부분을 확인하였고, 이는 낮은 유병률 속성을 분석할 경우 특히 도움이 될 수 있으며, 여기서 형광 단독의 백분위수에 대한 의존성은, 예를 들어 형광을 나타내는 세포의 수가 비교적 적은 세포 집단 (양성 또는 음성 염색된 세포 집단)에서의 이상치에 의해 편향될 수 있다. 음성 염색된 세포 집단 및 양성 염색된 세포 집단의 중심을 MFI에 기초하여 결정하고, 이어서 세포 집단의 가장자리를 음성 염색된 세포 집단에 대한 제99 및/또는 제95 백분위수의 형광을 확인함으로써, 또는 양성 염색된 세포 집단에 대한 제1 및/또는 제5 백분위수의 형광을 확인함으로써 결정하였다. 이는 음성 염색된 세포 집단을 양성 염색된 세포 집단으로부터 분리하기 위한 역치를 설정하는 것을 가능하게 하도록 하였다. MFI 분석은 조밀하고 강건한 세포 집단, 예를 들어 높은 유병률 속성을 분석하는 경우에 필요하지 않은 반면, MFI 분석은 희박한 세포 집단의 형광 특성, 예를 들어 낮은 유병률 속성을 특징화하기 위한 추가의 방식으로서 사용하였다.
도 2a 및 2b는 AF700 형광단을 사용한 대표적인 속성에 대한 음성 또는 비염색된 분석 (도 2a) 및 양성 염색된 분석 (도 2b)의 예를 나타낸다. 도 2a에 도시된 바와 같이, 비염색된 또는 음성 형광에 대한 제95 백분위수의 최대값은 62.9의 상대 형광 강도를 갖고, 비염색된 또는 음성 형광에 대한 제99 백분위수의 최대값은 173.00의 상대 형광 강도를 가졌다. 도 2b에 나타낸 바와 같이, 양성 염색된 샘플에 대한 형광의 제1 백분위수는 3,597.0의 상대 형광 강도를 갖고, 양성 염색된 샘플에 대한 형광의 제5 백분위수는 5,324.0의 상대 형광 강도를 가졌다. 이 데이터에 기초하여, 이 속성에 대한 정적 형광 역치를 3,000으로 설정하였다.
이어서, 각각의 속성에 대한 형광 역치를 양성 염색이 비염색된 또는 음성 염색과 구별되도록 확립하였다.
때때로 높은 유병률 속성으로 지칭되는 우세한 속성 (샘플에서 ≥ 5% 빈도)에 대해, 형광 역치는 (1) 비염색된 또는 음성 집단에 대해 제99 백분위수의 최대값 초과로 형광 역치를 설정함으로써 비염색된 또는 음성 집단을 배제하고, (2) 통계적 이상치를 배제하면서 가능한 한 많은 양성 집단을 포함하고, (3) 양성 및 음성 또는 비염색된 형광 사이에 넓은 범위가 존재하는 경우에 양성 집단에 대해 역치를 보존적으로 배치하고, (3) 작업흐름을 최적화하기 위해 역치를 로그 유동 축 상에서 짝수로 반올림함으로써 확립되었다. 도 2a 및 2b에 제시된 분석으로 이러한 기준을 우세한 속성에 적용함으로써, 형광 역치는 3,000으로 확립되었다. 가능한 한 많은 양성 집단을 포함시키기 위해, 통계적 이상치를 배제하면서, 형광 역치는, 가능한 경우마다 각각의 속성에 대한 양성 집단에 대해 최소 제5 백분위수 미만으로 설정하였으며, 이를 분석된 각각의 우세한 속성에 대해 수행하였다.
낮은 유병률 속성 (샘플에서 ≤ 5% 빈도)에 대해, 형광 역치는 (1) 비염색된 또는 음성 집단에 대해 제99 백분위수의 최대값 초과로 형광 역치를 설정함으로써 비염색된 또는 음성 집단을 배제하고, (2) 통계적 이상치를 배제하면서 가능한 한 많은 양성 집단을 포함하고, (3) 작업흐름을 최적화하기 위해 MFI 분석을 사용하여 역치 결정을 보조하고, (3) 역치를 로그 유동 축 상에서 짝수로 반올림함으로써 확립되었다. 통계적 이상치를 배제하면서 가능한 한 많은 양성 집단을 포함시키기 위해, 형광 역치는 가능한 경우마다 각각의 속성에 대한 양성 집단에 대해 최소 제5 백분위수 미만으로 설정하였다. 속성 5에 대한 염료 (아쿠아(Aqua), 하기 표 E2에 제시된 바와 같음)는 높은 수준의 배경을 가졌고, 따라서 1506.3의 최소 제5 백분위수 값은 비염색된 또는 음성 집단에 비해 양성 집단을 우선적으로 포함시키기 위해 가장 가까운 스케일 마커인 2000으로 반올림하였다.
MFI 분석은 비염색된 또는 음성 집단 및 양성 집단을 특징화하여, 집단의 중간 및 가장 조밀한 부분이 형광 스케일 상에 있는 경우에 전형적으로 존재하는 강도의 평균 형광 강도 또는 제50 백분위수를 확인하는 것을 수반하였다. 이어서, MFI 분석을 사용하여 각각의 속성의 형광 역치/경계를 결정하는 것을 보조하였다.
하기 표 E2는 6개의 보고가능한 속성 각각에 대한 비염색된 또는 음성 염색 분석 및 양성 염색 분석을 요약하고, 각각의 속성에 대해 확립된 형광 역치를 제공한다. 속성 1-3 및 6은 우세한 속성이고, 속성 4 및 5는 낮은 우세한 속성이다.
표 E2.
낮은 유병률 속성 4 및 5에 대한 형광 역치는, 양성 염색 분석에서 제1 백분위수 및 제5 백분위수 값의 편향으로 인해 부분적으로 MFI에 의해 결정하였다.
정적 형광 역치 게이트가 현재 클러스터 게이팅 관행과 동등한지를 결정하기 위해, 속성 1, 2 및 6을 비롯한 우세한 속성에 대한 형광 역치를 사용하여 각각의 속성에 대한 FMO 대조군을 분석하였다. 역치 게이팅되지 않은 FMO 게이팅 속성을 이 평가에 포함시켜, 형광 역치를 사용한 상류 게이팅 변화가 보고가능한 값에 영향을 미치는지를 결정하였다. 표 E3은 비교 분석으로부터의 결과를 요약한다. 각각의 우세한 속성에 대한 정적 형광 역치 게이트는 FMO-가이드된 게이트를 배치하는 데 사용된 주파수 미만이었다 (도 3; 표 E3). 표 E3에 나타낸 바와 같이, 속성 1, 2 및 6에 대한 정적 형광 역치 게이트는 FMO 분석을 사용한 현재의 게이팅 방법과 동등한 것으로 나타났다. 이는 정적 형광 역치 게이팅이 FMO 샘플에 적용되는 경우 배경 형광을 적절하게 배제하며, 보고는 FMO 분석의 현재 게이팅 방법과 동등하다는 것을 입증한다.
표 E3.
정적 형광 역치 게이팅의 정밀도를 평가하기 위해, 4개의 우세한 속성 (속성 1-3 및 6)에 대해 97개의 환자 샘플 로트에 대한 3명의 작업자에 걸친 작업자 사이의 변동 계수 (CV) 백분율 (%)에 기초한 정밀도를 평가하였다.
표 E4에 제시된 바와 같이, 정적 형광 역치 게이팅은 작업자간에 정확하였고, 평가된 모든 속성에 대해 3% 미만의 CV가 관찰되었다.
표 E4.
린(Lin)의 일치 상관관계 시험을 사용하여 정적 형광 역치 게이팅 보고물과 보고가능한 속성 사이의 상관관계를 특징화하였다. 일치 상관관계 결과는 하기 표 E5에 상술된다.
표 E5.
FMO 샘플에 적용된 정적 형광 역치 게이팅을 사용하여 배경 형광을 평가하기 위해, 정적 형광 역치 게이팅을 3개의 개발 샘플에 적용하였으며, 이들 각각은 동일한 6개의 속성 각각을 사용하여 염색된 FMO 샘플을 가졌고, 이어서 적절한 형광 채널을 사용하여 분석하였다. 배경 백분율을 모 집단의 백분율로서 보고하였다. FMO 평가를 위한 최대 허용 배경은 이전에 결정된 바와 같이 0.2%의 최대 허용 배경을 갖는 집단 4를 제외한 모든 집단에 대해 모 집단의 1.0%였다 (데이터는 제공되지 않음). 각각의 집단에 대한 최대 배경을 보여주는 FMO 비교 결과는 하기 표 E6에 제공된다. 표 E6에 제시된 바와 같이, 각각의 집단에 대한 최대 배경은 1%의 최대 허용 배경 백분율보다 충분히 낮았기 때문에 허용가능하였다. 이는 6개의 속성 각각에 대한 정적 형광 역치 게이트가 배경 염색을 배제하는 데 효과적이었음을 입증한다.
표 E6.
본 발명은 범위가, 예를 들어 본 발명의 다양한 측면을 예시하기 위해 제공된 특정한 개시된 실시양태로 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 기재된 조성물 및 방법에 대한 다양한 변형은 본원의 설명 및 교시로부터 명백해질 것이다. 이러한 변형은 본 개시내용의 진정한 범주 및 취지로부터 벗어나지 않으면서 실시될 수 있고, 본 개시내용의 범주 내에 속하는 것으로 의도된다.
Claims (57)
- 정적 형광 역치 게이트를 결정하는 방법이며,
(1) 복수의 적어도 2개의 참조 세포 샘플에 대한 1개 이상의 형광 신호에 대해 유동 세포측정법에 의해 세포측정 이벤트를 측정하는 단계로서, 복수의 적어도 2개의 참조 세포 샘플은
(a) 각각이 1개 이상의 형광 신호로 표지되지 않은 비염색된 세포의 집단을 포함하는 복수의 제1 참조 세포 샘플; 및
(b) 복수의 제2 참조 세포 샘플을 포함하고, 여기서 복수의 제2 참조 세포 샘플 각각은 복수의 제1 참조 세포 샘플 중 하나와 동일한 세포 공급원 유형으로부터 유래되고, 복수의 제2 참조 세포 샘플 각각은 1개 이상의 형광 신호 중 적어도 하나로 표지된 염색된 세포의 적어도 하나의 집단을 포함하는 것인 단계; 및
(2) 1개 이상의 형광 신호 각각에 대한 정적 형광 역치 게이트를, 각각의 형광 신호에 대해 역치 게이트가
(a) 1개 이상의 형광 신호 각각의 각 형광 신호에 대해 복수의 제1 참조 세포 샘플의 형광의 제90 백분위수 초과이고;
(b) 동일한 각 형광 신호에 대해 복수의 제2 참조 세포 샘플의 형광의 제10 백분위수 미만인 형광이도록 설정하는 단계
를 포함하는 방법. - 유동 세포측정 데이터로부터 세포측정 이벤트의 하위세트를 선택하는 방법이며,
(1) 유동 세포측정기에 의해 측정된 1개 이상의 형광 신호에 따라 분류된 표지된 세포를 포함하는 시험 세포 샘플로부터의 복수의 세포측정 이벤트를 포함하는 유동 세포측정 데이터를 수신하는 단계;
(2) 정적 형광 역치 게이트를 개별적으로 1개 이상의 형광 신호 각각에 적용하고, 여기서 1개 이상의 형광 신호 각각에 대한 정적 형광 역치 게이트는 제1항의 방법에 따라 결정되는 것인 단계;
(3) 1개 이상의 형광 신호 각각에 대해, 정적 역치 게이트 초과의 형광 신호를 갖는 시험 샘플로부터의 세포측정 이벤트의 하위세트를 확인하는 단계
를 포함하는 방법. - 유동 세포측정 데이터로부터 세포측정 이벤트의 하위세트를 선택하는 방법이며,
(1) 유동 세포측정기에 의해 측정된 1개 이상의 형광 신호에 따라 분류된 표지된 세포를 포함하는 시험 세포 샘플로부터의 복수의 세포측정 이벤트를 포함하는 유동 세포측정 데이터를 수신하는 단계;
(2) 정적 형광 역치 게이트를 개별적으로 1개 이상의 형광 신호 각각에 적용하는 단계로서, 여기서 1개 이상의 형광 신호 각각에 대한 정적 형광 역치 게이트는
(a) 각각이 1개 이상의 형광 신호에 따라 분류된 복수의 적어도 2개의 참조 세포 샘플에 대한 1개 이상의 형광 신호에 대해 유동 세포측정법에 의해 측정된 세포측정 이벤트로서, 복수의 적어도 2개의 참조 세포 샘플은
(i) 각각이 1개 이상의 형광 신호로 표지되지 않은 비염색된 세포의 집단을 포함하는 복수의 제1 참조 세포 샘플; 및
(ii) 복수의 제2 참조 세포 샘플을 포함하고, 여기서 복수의 제2 참조 세포 샘플 각각은 복수의 제1 참조 세포 샘플 중 하나와 동일한 세포 공급원 유형으로부터 유래되고, 복수의 제2 참조 세포 샘플 각각은 1개 이상의 형광 신호 중 적어도 하나로 표지된 염색된 세포의 적어도 하나의 집단을 포함하는 것인 세포측정 이벤트; 및
(b) 1개 이상의 형광 신호 각각에 대한 정적 형광 역치 게이트를, 각각의 형광 신호에 대해 역치 게이트가
(i) 1개 이상의 형광 신호 각각의 각 형광 신호에 대해 복수의 제1 참조 세포 샘플의 형광의 제90 백분위수 초과이고;
(ii) 동일한 각 형광 신호에 대해 복수의 제2 참조 세포 샘플의 형광의 제10 백분위수 미만인 형광이도록 설정하는 것으로부터 결정되는 것인 단계; 및
(3) 1개 이상의 형광 신호 각각에 대해, 정적 역치 게이트 초과의 형광 신호를 갖는 시험 세포 샘플로부터의 세포측정 이벤트의 하위세트를 확인하는 단계
를 포함하는 방법. - 유동 세포측정법을 사용하여 정적 형광 역치 게이트를 적용하는 방법이며,
(1) 유동 세포측정기에 의해 측정된 1개 이상의 형광 신호에 따라 분류된 표지된 세포를 포함하는 시험 세포 샘플로부터의 복수의 세포측정 이벤트를 포함하는 유동 세포측정 데이터를 수신하는 단계; 및
(2) 정적 형광 역치 게이트를 개별적으로 1개 이상의 형광 신호 각각에 적용하는 단계로서, 여기서 1개 이상의 형광 신호 각각에 대한 정적 형광 역치 게이트는 제1항의 방법에 따라 결정되는 것인 단계
를 포함하는 방법. - 유동 세포측정법을 사용하여 정적 형광 역치 게이트를 적용하는 방법이며,
(1) 유동 세포측정기에 의해 측정된 1개 이상의 형광 신호에 따라 분류된 표지된 세포를 포함하는 시험 세포 샘플로부터의 복수의 세포측정 이벤트를 포함하는 유동 세포측정 데이터를 수신하는 단계;
(2) 정적 형광 역치 게이트를 개별적으로 1개 이상의 형광 신호 각각에 적용하는 단계로서, 여기서 1개 이상의 형광 신호 각각에 대한 정적 형광 역치 게이트는
(a) 각각이 1개 이상의 형광 신호에 따라 분류된 복수의 적어도 2개의 참조 세포 샘플에 대한 1개 이상의 형광 신호에 대해 유동 세포측정법에 의해 측정된 세포측정 이벤트로서, 복수의 적어도 2개의 참조 세포 샘플은
(i) 각각이 1개 이상의 형광 신호로 표지되지 않은 비염색된 세포의 집단을 포함하는 복수의 제1 참조 세포 샘플; 및
(ii) 복수의 제2 참조 세포 샘플을 포함하고, 여기서 복수의 제2 참조 세포 샘플 각각은 복수의 제1 참조 세포 샘플 중 하나와 동일한 세포 공급원 유형으로부터 유래되고, 복수의 제2 참조 세포 샘플 각각은 1개 이상의 형광 신호 중 적어도 하나로 표지된 염색된 세포의 적어도 하나의 집단을 포함하는 것인 세포측정 이벤트; 및
(b) 1개 이상의 형광 신호 각각에 대한 정적 형광 역치 게이트를, 각각의 형광 신호에 대해 역치 게이트가
(i) 1개 이상의 형광 신호 각각의 각 형광 신호에 대해 복수의 제1 참조 세포 샘플의 형광의 제90 백분위수 초과이고;
(ii) 동일한 각 형광 신호에 대해 복수의 제2 참조 세포 샘플의 형광의 제10 백분위수 미만인 형광이도록 설정하는 것으로부터 결정되는 것인 단계
를 포함하는 방법. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 시험 세포 샘플, 및 복수의 제1 및 제2 참조 세포 샘플 각각이 동일한 공급원 유형의 세포로부터의 것인 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 세포의 공급원 유형이 세포주인 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 세포의 공급원 유형이 대상체로부터의 1차 세포 집단인 방법.
- 제8항에 있어서, 각각의 시험 세포 샘플, 및 복수의 제1 및 제2 참조 세포 샘플 각각의 세포의 공급원 유형이 상이한 대상체로부터의 것인 방법.
- 제9항에 있어서, 각각의 상이한 대상체가 동일하거나 유사한 질환 또는 상태를 갖는 것인 방법.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 세포의 공급원 유형이 전혈 샘플, 분리반출술 샘플 또는 백혈구분리반출술 샘플인 방법.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 세포의 공급원 유형이 세포의 풍부화된 집단, 임의로 T 세포의 풍부화된 집단인 방법.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 세포의 공급원 유형이 재조합 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 세포의 조작된 집단이며, 임의로 여기서 재조합 단백질은 유전자 전달, 임의로 형질도입에 의해 세포의 집단 내로 도입된 것인 방법.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 세포의 공급원 유형이 세포 요법인 방법.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 제1 참조 세포 샘플이 2, 5, 10, 25, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000개 초과의 세포 샘플을 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 제2 참조 세포 샘플이 2, 5, 10, 25, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000개 초과의 세포 샘플을 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 제1 및 제2 참조 세포 샘플 각각이 임상 시험에서 질환 또는 상태를 갖는 대상체로부터의 세포의 공급원 유형인 방법.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 세포의 공급원 유형이 자가 세포 요법이고, 제1 및 제2 참조 세포 샘플 각각이 세포 요법을 시험하기 위한 임상 시험에서 대상체로부터의 세포 요법의 샘플인 방법.
- 제14항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 요법이 T 세포 요법, 임의로 CAR-T 세포 요법, TCR-T 세포 요법, 또는 TIL 요법인 방법.
- 제14항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 요법이 NK 세포 요법인 방법.
- 제14항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 요법이 줄기 세포 요법인 방법.
- 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 시험 세포 샘플 및 각각의 제2 참조 세포 샘플이 세포를 1개 이상의 형광 신호로 표지하기 위한 1종 이상의 염색 시약으로 세포 염색된 것인 방법.
- 제22항에 있어서, 1종 이상의 염색 시약 각각이 마커에 특이적인 결합제 및 1개 이상의 형광 신호 중 하나를 방출할 수 있는 형광 염료를 포함하는 것인 방법.
- 제23항에 있어서, 마커가 세포 표면 마커 또는 생존율 마커인 방법.
- 제23항 또는 제24항에 있어서, 적어도 하나의 마커가 시험 세포 샘플 및 각각의 제2 참조 세포 샘플 내의 적어도 5% 이상의 세포 상에서 발현되거나 발현될 것으로 여겨지는 우세한 속성인 방법.
- 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 마커가 시험 세포 샘플 및 각각의 제2 참조 세포 샘플 내의 5% 미만의 세포 상에서 발현되거나 발현될 것으로 여겨지는 낮은 유병률 속성인 방법.
- 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 1개 이상의 형광 신호가 2개 이상의 상이한 형광 신호를 포함하는 것인 방법.
- 제22항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 염색이 세포를 2개 이상의 상이한 형광 신호로 표지하기 위한 다색 세포 염색이고, 여기서 각각의 염색 시약이 상이한 마커를 상이한 형광 신호로 표지하는 것인 방법.
- 제27항 또는 제28항에 있어서, 2개 이상의 상이한 형광 신호가 2 내지 10개의 형광 신호, 임의로 정확히 또는 약 2, 3, 4, 5 또는 6개를 포함하는 것인 방법.
- 제27항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 2개 이상의 상이한 형광 신호 각각이 상이한 방출 스펙트럼을 갖고/거나 각각의 형광 신호의 피크 방출 스펙트럼이 중첩되지 않는 것인 방법.
- 제27항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 2개 이상의 상이한 형광 신호 각각이 PE-Cy7, APC, AF700, BV421, 아쿠아, 및 BV605로 이루어진 군으로부터 선택된 염료에 의해 방출된 신호인 방법.
- 제22항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 시험 세포 샘플 및 각각의 제2 참조 세포 샘플의 세포 염색을 동일한 염색 시약으로 동일한 프로토콜 조건을 사용하여 수행하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 제2 참조 세포 샘플이 동일한 염색된 세포의 이중 샘플을 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 제2 참조 세포 샘플이 동일한 염색된 세포의 삼중 샘플을 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 형광 신호에 대한 정적 형광 역치 게이트가 형광 신호에 대해 복수의 제1 참조 세포 샘플 중에서 형광의 제95 백분위수 초과인 형광인 방법.
- 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 1개 이상의 형광 신호 중 적어도 하나에 대한 정적 형광 역치 게이트가 형광 신호에 대해 복수의 제1 참조 세포 샘플 중에서 형광의 제97 백분위수 초과인 형광인 방법.
- 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 1개 이상의 형광 신호 중 적어도 하나에 대한 정적 형광 역치 게이트가 형광 신호에 대해 복수의 제1 참조 세포 샘플 중에서 형광의 제99 백분위수 초과인 형광인 방법.
- 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 1개 이상의 형광 신호 중 적어도 하나에 대한 정적 형광 역치 게이트가 형광 신호에 대해 복수의 제2 참조 세포 샘플 중에서 형광의 제5 백분위수 미만인 형광인 방법.
- 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 1개 이상의 형광 신호 중 적어도 하나에 대한 정적 형광 역치 게이트가 형광 신호에 대해 복수의 제2 참조 세포 샘플 중에서 형광의 제3 백분위수 미만인 형광인 방법.
- 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 1개 이상의 형광 신호 중 적어도 하나에 대한 정적 형광 역치 게이트가 형광 신호에 대해 복수의 제2 참조 세포 샘플 중에서 형광의 제1 백분위수 미만인 형광인 방법.
- 제1항 내지 제37항 및 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 형광 신호에 대한 비염색된 세포의 집단 및 염색된 세포의 집단의 형광이 2배 초과만큼 상이한 경우에, 정적 형광 역치 게이트는 형광 신호에 대하여 복수의 제2 참조 세포 샘플 중에서 형광의 제1 백분위수 미만 또는 형광의 모든 백분위수 미만으로 설정되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제37항 및 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 형광 신호에 대한 비염색된 세포의 집단 및 염색된 세포의 집단의 형광이 5배 초과만큼 상이한 경우에, 정적 형광 역치 게이트가 형광 신호에 대하여 복수의 제2 참조 세포 샘플 중에서 형광의 제1 백분위수 미만 또는 형광의 모든 백분위수 미만으로 설정되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제37항 및 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 형광 신호에 대한 비염색된 세포의 집단 및 염색된 세포의 집단의 형광이 10배 초과만큼 상이한 경우에, 정적 형광 역치 게이트는 형광 신호에 대하여 복수의 제2 참조 세포 샘플 중에서 형광의 제1 백분위수 미만 또는 형광의 모든 백분위수 미만으로 설정되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 낮은 유병률 속성에 대해, 정적 형광 역치 게이트의 설정이 1개 이상의 형광 신호 중 하나 이상에 대한 평균 형광 강도 (MFI)를 확인하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 1개 이상의 형광 신호 각각에 대해, 정적 형광 역치 게이트가 로그 유동 축 상의 짝수인 방법.
- 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 1개 이상의 형광 신호 각각에 대해, 정적 형광 역치 게이트가 로그 유동 축 상에서 10의 자리까지 반올림되거나, 100의 자리까지 반올림되거나, 또는 1,000의 자리까지 반올림되는 것인 방법.
- 제2항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 1개 이상의 형광 신호 중 적어도 2개, 1개 이상의 형광 신호 중 적어도 3개, 1개 이상의 형광 신호 중 적어도 4개, 1개 이상의 형광 신호 중 적어도 5개, 1개 이상의 형광 신호 중 적어도 6개, 또는 1개 이상의 형광 신호 중 적어도 7개 이상에 대해 정적 형광 역치 게이트 초과의 형광 신호를 갖는 시험 세포 샘플로부터의 세포의 하위세트를 확인하는 것을 추가로 포함하는 방법.
- 제2항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 1개 이상의 형광 신호 모두에 대해 정적 형광 역치 게이트 초과의 형광 신호를 갖는 시험 세포 샘플로부터의 세포의 하위세트를 확인하는 것을 추가로 포함하는 방법.
- 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 정적 형광 역치 게이트가 시험 세포 샘플의 염색된 세포의 집단의 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%를 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 1개 이상의 형광 신호 각각에 대한 정적 형광 역치 게이트가 시험 세포 샘플의 염색된 세포의 집단의 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%를 포함하도록 설정하는 것인 방법.
- 제2항, 제3항, 및 제6항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 1개 이상의 형광 신호 중 적어도 하나에 대한 세포측정 이벤트의 확인된 하위세트에 대해, 세포측정 이벤트의 확인된 하위세트의 적어도 하나의 형광 신호의 형광 강도를 평가하는 것을 추가로 포함하는 방법.
- 제2항, 제3항, 및 제6항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 1개 이상의 형광 신호 각각에 대한 세포측정 이벤트의 확인된 하위세트 각각에 대해, 세포측정 이벤트의 확인된 하위세트의 형광 신호의 강도를 평가하는 것을 추가로 포함하는 방법.
- 제51항 또는 제52항에 있어서, 형광 강도가 평균 형광 강도인 방법.
- 제2항, 제3항 및 제6항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 1개 이상의 형광 신호 중 적어도 하나에 대한 세포측정 이벤트의 확인된 하위세트에 대해, 수집된 세포측정 이벤트의 총수와 비교하여 세포측정 이벤트의 확인된 하위세트의 백분율을 결정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
- 제2항, 제3항 및 제6항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 1개 이상의 형광 신호 각각에 대한 세포측정 이벤트의 확인된 하위세트 각각에 대해, 수집된 세포측정 이벤트의 총수와 비교하여 각각의 형광 신호에 대한 세포측정 이벤트의 확인된 하위세트의 백분율을 결정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
- 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 유동 세포측정기에 의한 1개 이상의 형광 신호의 보정을 포함하는 방법.
- 제56항에 있어서, 보정이 적어도 1일 1회 수행되는 것인 방법.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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