JP2023512423A - 再生性ポリペプチドおよびその使用 - Google Patents

Abstract

本明細書中に記載されるのは、軟部組織および筋肉の疾患、障害、および損傷の処置にとって有用な、ＦＧＦ１７、ＩＧＦ２、またはＢＭＰ？アミノ酸配列と異種ポリペプチドからのアミノ酸配列とを含むポリペプチドである。また、本明細書中にさらに記載されるのは、線維芽細胞増殖因子受容体アゴニストおよびグリコサミノグリカン、インスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ１Ｒ）アゴニストおよび短鎖脂肪酸、ならびにＢＭＰ受容体アゴニストおよびｍＴＯＲアクチベーターおよび／またはグリコサミノグリカンという相乗的な組み合わせである。また、さらに記載されるのは、当該ポリペプチドおよび／または相乗的組成物を投与する工程を含む、筋肉および軟部組織の疾患を処置する方法である。

Description

配列表、表、またはコンピュータプログラムへの言及
配列表の正式な写しは、明細書と共に、ＡＳＣＩＩ様式テキストファイル（ファイル名「ＪＴＩ０１５＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」、２０２０年１２月１７日作成、サイズ２０８キロバイト）として、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して提出される。ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して提出される配列表は、明細書の一部であり、その全体を引用により本明細書に援用する。

背景
平均寿命が長くなるにしたがって、「健康的に老化する」ということがさらに重要視されている。人々は年を重ねるにつれてより活発なライフスタイルを送りたいと望んでおり、その結果として、多くの老化障害が、老化していく人々の生活の質に著しい影響を及ぼし得る。再生を目的とする処置は、老化疾患の処置にとって有用である。加えて、老化障害を対象とする多くの処置は、病気や損傷を有している、または早すぎる組織減少、消耗、もしくは衰弱を導く遺伝子障害もしくは発育障害を有している若い人々に応用できる。

概要
本明細書中に記載されるのは、軟部組織および筋肉の疾患、障害、および損傷の処置にとって有用な、ＦＧＦ１７、ＩＧＦ２、またはＢＭＰ７アミノ酸配列と異種ポリペプチドからのアミノ酸配列とを含むポリペプチドである。ＩＧＦ２アミノ酸配列は、配列番号８９のアミノ酸配列との同一性が少なくとも約９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％であるアミノ酸配列を含み得る。ＢＭＰ７アミノ酸配列は、配列番号８９のアミノ酸配列との同一性が少なくとも約９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％であるアミノ酸配列を含み得る。ＢＭＰ７アミノ酸配列は、配列番号９３のアミノ酸配列との同一性が少なくとも約９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％である、アミノ酸１５～３０個からなるフラグメントを含み得る。ＦＧＦ１７アミノ酸配列は、配列番号５４のアミノ酸配列との同一性が少なくとも約９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％であるアミノ酸配列を含み得る。ＦＧＦ１７アミノ酸配列は、アミノ酸Ｇ１８１～Ｔ２０３の欠失、アミノ酸１９７～Ｔ２０３の欠失、アミノ酸２０４～２１６の欠失、アミノ酸１８１～２１６の欠失、Ｒ２０４Ｑ／Ｋ２０７Ｑ、アミノ酸１９７～２１６の欠失、Ｋ１９１Ａ／Ｋ１９３Ａ／Ｓ２００Ａ、およびこれらの組み合わせから選択される変異を含み得る。ＦＧＦ１７、ＩＧＦ２、および／またはＢＭＰ７は、Ｎ－、Ｃ－、またはＯ－結合型グリコシル化された少なくとも１つのアミノ酸を含み得る。

異種ポリペプチドは、免疫グロブリン分子もしくはそのフラグメント、アルブミン分子、トランスフェリン分子、ＸＴＥＮ配列、プロリン－アラニン－セリンポリマー、ホモアミノ酸ポリマー、グリシンリッチ配列、ゼラチン様ポリマー、エラスチン様ペプチド、カルボキシ末端ペプチド、またはこれらの組み合わせであり得る。免疫グロブリン分子のフラグメントは、ＩｇＧのヒンジドメイン、ＩｇＧのＣＨ２ドメイン、ＩｇＧのＣＨ３ドメイン、またはこれらの任意の組み合わせを含み得る。免疫グロブリン分子またはそのフラグメントは、当該免疫グロブリン分子のフラグメントのエフェクター機能を低下させる１つ以上の変異を含み得る。また、本明細書中にさらに記載されるのは、線維芽細胞増殖因子受容体アゴニストおよびグリコサミノグリカン、インスリン様増殖因子１受容体（Ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ １ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＩＧＦ１Ｒ）アゴニストおよび短鎖脂肪酸、ならびにＢＭＰ受容体アゴニストおよびｍＴＯＲアクチベーターおよび／またはグリコサミノグリカンという組み合わせである。

本明細書中に記載されるのは、上記ポリペプチド、ならびに／またはポリペプチドと小脂肪酸、ｍＴＯＲアクチベーター、および／もしくはグリコサミノグリカンとを組み合わせた組成物を投与する工程を含む、筋肉および軟部組織の疾患を処置する方法である。処置できる筋肉疾患は、たとえばサルコペニア、悪液質、筋ジストロフィー、および筋損傷などの、急性および慢性の筋肉消耗の疾患または状態を含む。急性および慢性の筋肉消耗の疾患または状態を処置するために、軟部組織の再生が有用であり得る。

精製したＩＧＦ２－ｈＦｃｍがヒト筋芽細胞の分化を増進させたことを示す。 精製したＩＧＦ２－ＬｈＦｃ４がヒト筋芽細胞の分化を増進させたことを示す。 精製したＨＳＡ－Ｌ－ＩＧＦ２Ｒ６１Ａがヒト筋芽細胞の分化を増進させた。 ＩＧＦ２およびＩＧＦ２受容体がヒト筋芽細胞において発現したことを示す。 ＩＧＦ２およびＩＧＦ２受容体がヒト筋芽細胞において発現したことを示す。 酪酸ナトリウムが筋融合を増大させたことを示す。 酪酸ナトリウムがＩＧＦ２活性を増大させたことを示す。 酪酸ナトリウムがＩＧＦ２活性を増大させたことを示す。 さらなる用量のビヒクル、ＩＧＦ２、酪酸ナトリウム、またはＩＧＦ２および酪酸ナトリウムでの処理によるｅＭｙＨＣ陽性細胞の面積の割合における変化を示す。 さらなる用量のビヒクル、ＩＧＦ２、酪酸ナトリウム、またはＩＧＦ２および酪酸ナトリウムでの処理によるｅＭｙＨＣ陽性細胞の面積の割合における変化を示す。 ＩＧＦ２がＤＭ１ヒト筋芽細胞におけるＭＹＯＧの発現を増大させることを示す。 ＩＧＦ２受容体が軟骨細胞および骨細胞上に発現したことを示す。 ＩＧＦ２処理がＤＭ１ヒト筋芽細胞（３２歳の白人女性）の増殖を増進させたことを示す。 ＩＧＦ２処理がＤＭ１ヒト筋芽細胞（３２歳の白人女性）の融合を増進させたことを示す。 ＩＧＦ２がＤＭ１ヒト筋芽細胞（３２歳の白人女性）におけるＭＹＨ３およびＣＫＭの発現を増大させたことを示す。 ＩＧＦ２がＤＭ１ヒト筋芽細胞（３２歳の白人女性）におけるＡＴＰ１Ｂ１の発現を増大させたことを示す。 ＩＧＦ２／ＮａＢの全身投与が老化により誘発される筋機能不全から保護したことを示す。 ＩＧＦ２／ＮａＢの全身投与が老化により誘発される筋機能不全から保護したことを示す（両肢の握力によって測定）。 ＩＧＦ２／ＮａＢの全身投与が老化により誘発される筋機能不全から保護したことを示す（前肢の力によって測定）。 ＩＧＦ２／ＮａＢの全身投与が老化により誘発される筋機能不全から保護したことを示す（走行距離によって測定）。 ＩＧＦ２／ＮａＢの全身投与が老化により誘発される筋機能不全から保護したことを示す（疲弊化までの走行時間によって測定）。 ＩＧＦ２／ＮａＢの全身投与が老化により誘発される筋機能不全から保護したことを示す（最大走行速度によって測定）。 ＩＧＦ２／ＮａＢの全身投与が老化により誘発される筋機能不全から保護したことを示す（トレッドミル成果によって測定）。 ＩＧＦ２／ＮａＢの慢性全身投与が肝臓、腎臓、および膵臓の機能にとって安全であったことを実証する実験の全体像を示す。 ＩＧＦ２／ＮａＢの全身投与が白血球細胞数、アルブミン濃度（図１０Ｃ）、クレアチニン濃度（図１０Ｄ）、およびカルシウム濃度（図１０Ｅ）に対して有害作用を及ぼさなかったことを示す。 ＩＧＦ２および酪酸ナトリウムの全身投与がデキサメタゾンにより誘発される筋萎縮から保護する実験の全体像を示す。 ＩＧＦ２および酪酸ナトリウムの全身投与がデキサメタゾンにより誘発される筋萎縮から保護したことを示す（両肢の力によって測定）。 ＩＧＦ２および酪酸ナトリウムの全身投与がデキサメタゾンにより誘発される筋萎縮から保護したことを示す（両肢の比力（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂｏｔｈｌｉｍｂ ｆｏｒｃｅ）によって測定）。 ＩＧＦ２および酪酸ナトリウムの全身投与がデキサメタゾンにより誘発される筋萎縮から保護したことを示す（前肢の力によって測定）。 ＩＧＦ２および酪酸ナトリウムの全身投与がデキサメタゾンにより誘発される筋萎縮から保護したことを示す（重量に対する前肢の力（ｍＮ）の比率として計算した前肢の比力（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｏｒｅｌｉｍｂ ｆｏｒｃｅ）によって測定）。 ＩＧＦ２および酪酸ナトリウムの全身投与がデキサメタゾンにより誘発される筋萎縮から保護したことを示す（筋線維断面積によって測定）。 ＢＭＰ７が筋芽細胞の増殖を誘発したことを示す（新たに形成された核によって測定）。 ＢＭＰ７が筋芽細胞の増殖を誘発したことを示す（核の総数によって測定）。 ロイシンがＢＭＰ７の分裂促進活性を増大させたことを示す。 ヒアルロン酸（ＨＡ）がＢＭＰ７の分裂促進活性を増大させたことを示す。 ＢＭＰ７受容体がヒト筋芽細胞において発現したことを示す。 軟骨損傷および変形性関節症における軟骨細胞増殖のための処理を示す。 培地上清の一部としてのまたは精製したＦＧＦ１７－ｈＦｃｍがマウス筋芽細胞の増殖を増進させたことを示す（図１７Ｂ）。 ＦＧＦ１７配列の変異がＣＨＯ細胞におけるタンパク質発現レベルを改善したことを示す。 培地上清の一部としてのまたは精製したＦＧＦ１７配列の変異がマウス筋芽細胞の増殖を増進させたことを示す。 さらなるＦＧＦ１７変異体がＣＨＯ細胞におけるタンパク質発現レベルを改善したことを示す。 培地上清の一部としてのまたは精製したさらなるＦＧＦ１７配列の変異がマウス筋芽細胞の増殖を増進させたことを示す。 培地中において、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）とＦＧＦ１７の融合タンパク質の改善された安定性（ＦＧＦ１７単独よりも安定）を示す。 ＦＧＦ１７受容体がヒト筋芽細胞において発現したことを示す。 ヘパリンがＦＧＦ１７の分裂促進活性を増大させたことを示す。 ヒアルロン酸（ＨＡ）がＦＧＦ１７の分裂促進活性を増大させたことを示す。 デキストラン硫酸（ＤＳ）がマウス筋芽細胞においてＦＧＦ１７の分裂促進活性を増大させたことを示す。 デキストラン硫酸（ＤＳ）がヒト筋芽細胞においてＦＧＦ１７の分裂促進活性を増大させたことを示す。 ＦＧＦ１７の筋肉内投与がＢａＣｌ２損傷高齢マウスモデルにおける筋肉の再生を増進させたことを実証する実験の全体像を示す。 ＦＧＦ１７の筋肉内投与がＢａＣｌ２損傷高齢マウスモデルにおいて筋肉の再生を増進させたことを、代表的な筋組織学において示す。 ＦＧＦ１７の筋肉内投与がＢａＣｌ２損傷高齢マウスモデルにおいて筋肉の再生を増進させたことを示す（新しい線維の形成によって測定）。 ＦＧＦ１７の筋肉内投与がＢａＣｌ２損傷高齢マウスモデルにおいて線維症の低減によって筋肉の再生を増進させたことを示す。 ＦＧＦ１７の全身投与がデキサメタゾンにより誘発される筋萎縮から保護することを実証する実験の全体像を示す。 ＦＧＦ１７の全身投与がデキサメタゾンにより誘発される筋萎縮から保護したことを示す（筋肉量変化の割合によって（図２６Ｂ）、前肢の力によって（図２６Ｃ）、前肢の比力によって（図２６Ｄ）、および両肢の力によって（図２６Ｅ）測定）。 ＦＧＦ１７の全身投与がデキサメタゾンにより誘発される筋萎縮から保護したことを示す（筋肉量変化の割合によって（図２６Ｂ）、前肢の力によって（図２６Ｃ）、前肢の比力によって（図２６Ｄ）、および両肢の力によって（図２６Ｅ）測定）。 ＦＧＦ１７の全身投与がデキサメタゾンにより誘発される筋萎縮から保護したことを示す（筋肉量変化の割合によって（図２６Ｂ）、前肢の力によって（図２６Ｃ）、前肢の比力によって（図２６Ｄ）、および両肢の力によって（図２６Ｅ）測定）。 ＦＧＦ１７の全身投与がデキサメタゾンにより誘発される筋萎縮から保護したことを示す（筋肉量変化の割合によって（図２６Ｂ）、前肢の力によって（図２６Ｃ）、前肢の比力によって（図２６Ｄ）、および両肢の力によって（図２６Ｅ）測定）。 ＦＧＦ１７での処理が軟骨細胞増殖を増大させたことを示す。

詳細な説明
特定の態様において、本明細書中において開示されるのは、細胞表面受容体の活性化と分泌シグナル、多量体化成分（ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｚｉｎｇ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）、または安定化成分のうちの１種以上とを経て前駆細胞の増殖または再生または機能を増大させる、治療活性タンパク質またはそのポリペプチド配列もしくは誘導体もしくはフラグメントである。我々は、特定のポリペプチドの配列を改変および組み合わせることによって、サルコペニア、悪液質、筋ジストロフィー、および筋損傷などの急性および慢性の筋肉消耗の疾患または状態を処置するのに有用な、筋肉および軟部組織の再生のために適用できる分泌性の治療活性タンパク質を創製した。特定の態様において、本明細書中において開示されるのは、サルコペニア、悪液質、筋ジストロフィー、および筋損傷などの急性および慢性の筋肉消耗の疾患または状態を有する個体を処置する方法である。

特定の態様において、本明細書中において開示されるのは、ＦＧＦ８サブファミリーアミノ酸配列と異種ポリペプチドアミノ酸配列とを含むポリペプチドであって、異種ポリペプチドは、ＦＧＦ８サブファミリーアミノ酸配列の安定性または生物学的機能を増大させる。特定の態様において、本明細書中において開示されるのは、ＦＧＦＲアゴニストおよびグリコサミノグリカンを含む組成物である。

特定の態様において、本明細書中において開示されるのは、ＩＧＦ２アミノ酸配列と異種ポリペプチドアミノ酸配列とを含むポリペプチドであって、異種ポリペプチドアミノ酸配列は、ＩＧＦ２アミノ酸配列の安定性または生物学的機能を増大させる。特定の態様において、本明細書中において開示されるのは、ＩＧＦ１Ｒアゴニストおよび短い脂肪酸鎖を含む組成物である。

特定の態様において、本明細書中において開示されるのは、ＢＭＰ７アミノ酸配列と異種ポリペプチドアミノ酸配列とを含むポリペプチドであって、異種ポリペプチドは、ＢＭＰ７アミノ酸配列の安定性または生物学的機能を増大させる。特定の態様において、本明細書中において開示されるのは、ＢＭＰ７受容体アゴニストおよびグリコサミノグリカンを含む組成物である。

分泌シグナル配列は、治療活性タンパク質もしくはポリペプチド配列を伴って天然に生じるものであるか、または、これとは異なり、分泌効率、プロセシング速度、もしくは細胞株特異的プロセシングを介して発現量を最適化するために選択、改変、もしくは創製されたものであるかのいずれかであり得る。さらなる例および配列番号が表１中に示される。特定の態様において、ポリペプチドは、分泌シグナルペプチドを含み得る。特定の実施形態において、分泌シグナルペプチドは配列番号１０～１６のうちの１つである。融合ポリペプチドの産生は、異種の産生系（たとえば、細菌、酵母、哺乳動物、昆虫など）においてなされ得る。

ポリペプチドは、目的の細胞種において、膜受容体を介して再生効果を誘発できる。筋肉および軟部組織の再生を改善する能力に関して選択される幹細胞セクレトームの例が表２中に列記され、これらは、たとえば、ＦＧＦ１７、ＢＭＰ７、ＩＧＦ２、およびそれらのバリアントを含む。多量体化成分は、それ自身以外の２つ以上のタンパク質成分同士を連結させることができる。多量体化成分は、それ自身以外の成分同士をタンデムに連結させて１つの連続するアミノ酸配列とするアミノ酸リンカー配列の形態をとり得る。または、多量体化成分は、二量体化するタンパク質もしくはタンパク質ドメインの形態をとり得て、その結果、共有結合性ジスルフィド結合もしくは非共有結合が二量体化を駆動し得る。例が表３中に示される。

安定化成分は、分解の低減、翻訳もしくは翻訳後フォールディングの増大、アンフォールディング率の低減、半減期の増大、および／またはその他の望ましい薬物動態学的パラメータ（たとえば、血清半減期、Ｃ_ｍａｘ、ＡＵＣ、Ｔ_ｍａｘなど）の改善をなし得る。例は、アルブミンまたはヒト抗体からの結晶化可能フラグメント（Ｆｃ）領域などの、豊富に存在する循環タンパク質またはそのフラグメントを含み得る。さらなる例が表３中に示される。

いくつかの定義
以下の記載において、様々な実施形態について十分に理解できるようにする目的で、いくつかの具体的な詳細が記載される。しかしながら、当業者には、提供されている実施形態はこうした詳細がなくても実施できるということが理解される。文脈上の必要性がない限り、以下の明細書および請求項の全体にわたって、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語およびその活用形（「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」および「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」）は、「～を含むがそれらに限定されない」という、包含的なオープン形式であると解釈される。本明細書および特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、そうでないことが明瞭に記載されていない限り、複数形としての意味を含む。また、「または」「もしくは」という語は、そうでないことが明瞭に記載されていない限り、一般的に、「および／または」を含む意味で使用されるということに留意されたい。さらに、本明細書中において提供される見出しは、便宜上提供されているだけであって、請求される実施形態の範囲または意味を説明するものではない。

本明細書中において使用される場合、「約」という語は、記載される量の近傍１０％の量を指す。

本明細書中において使用される場合、「個体」、「患者」、または「対象」という用語は、交換可能に使用されて、記載される組成物および方法を用いて処置できる少なくとも１つの疾患を有するとして診断された、またはそうした疾患に罹患していることが疑われる、またはそうした疾患を発症するリスクがある個体を指す。特定の実施形態において、個体は哺乳動物である。特定の実施形態において、哺乳動物は、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ラマ、アルパカ、またはヤクである。特定の実施形態において、個体はヒトである。

本明細書中において使用される場合、「処置する」「処理する」（「ｔｒｅａｔ」または「ｔｒｅａｔｉｎｇ」）という用語は、個体の生理学的なまたは疾患性の状態に関連する少なくとも１つの兆候または症状の緩和のために設計されたまたはこれを意図した、当該個体の生理学的なまたは疾患性の状態への介入を指す。ある疾患の罹患者には様々な個体が含まれることから、当業者であれば、所与の処置に対してすべての個体が同じように反応するわけではないこと、あるいはまったく反応しない個体もあり得ることを認識し得る。

本明細書中において使用される場合、「異種」という用語は、異種の比較対象であるアミノ酸配列またはヌクレオチド配列の場合とは異なる供給源（たとえば、遺伝子、ポリペプチド、または生物）からのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を指す。異種は、異なる生物に由来する生物学的配列、または、同じ生物に属する異なる供給源（たとえば、遺伝子またはタンパク質）に由来する配列を含む。異種の配列は、異なる供給源からのヌクレオチド配列を含む組換えＤＮＡ分子、異なる供給源からのアミノ酸配列を含む融合タンパク質、および天然または合成由来のエピトープまたは精製タグを含む。

本明細書中において使用される場合、「筋肉」という用語は、骨格筋を指すものであり、平滑筋または心筋を指すものではない。

本明細書中において使用される場合、「軟部組織」という用語は、腱、靱帯、および軟骨を含むがこれらに限定されない結合組織を指す。

本明細書中において使用される場合、「分裂促進活性」という用語は、細胞の分裂または増殖を誘発する活性を指す。

本明細書中において使用される場合、「融合増進活性」という用語は、複数の細胞の融合による多核細胞の形成（複数の筋細胞の融合による多核筋線維の形成など）を増進させる活性、または、最終分化中の幹細胞もしくは前駆細胞の専門的（ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）細胞系譜型への分化（筋芽細胞の筋細胞への成長、または拡大中の筋線維の細胞サイズの増大など）を進める活性を指す。

「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、交換可能に使用されて、アミノ酸残基からなるポリマーを指し、最短の長さに制限されない。提供される抗体および抗体鎖およびその他のペプチド（たとえばリンカーおよび結合ペプチド）を含むポリペプチドは、天然および／または非天然のアミノ酸残基を含むアミノ酸残基を含み得る。また、こうした用語は、ポリペプチドの発現後改変（たとえば、グリコシル化、シアリル化（ｓｉａｌｙｌａｔｉｏｎ）、アセチル化、およびリン酸化など）を含む。いくつかの態様において、ポリペプチドは、そのタンパク質が望ましい活性を維持している限りにおいて、自然または天然の配列に関する改変を含有し得る。こうした改変は、部位特異的変異誘発によって意図的になされたものであってもよいし、または、当該タンパク質を産生する宿主の変異もしくはＰＣＲ増幅におけるエラーなどによる偶発的なものであってもよい。

基準ポリペプチド配列に対する配列同一性の割合（％）は、配列同一性の割合を最大とするために必要に応じて配列をアライメントしたりギャップを導入したりした後における、基準ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である、候補配列中のアミノ酸残基の割合である（保存的置換は配列同一性の一部とみなさない）。アミノ酸配列の同一性の割合を求める目的でなされるアライメントは、たとえば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの一般に利用可能なコンピュータソフトウェアの使用といったような、周知される様々な方法で実施できる。配列をアライメントするために好適なパラメータを求めることができ、これは、比較対象配列の全長にわたってアライメントを最大とするために必要なアルゴリズムを含む。しかしながら、本明細書中における目的のためには、アミノ酸配列同一性の％値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ－２を使用して得られる。ＡＬＩＧＮ－２配列比較コンピュータプログラムはＧｅｎｅｎｔｅｃｈ社により作製され、そのソースコードは、ユーザードキュメンテーションと共に、アメリカ合衆国著作権局（ワシントンＤ．Ｃ．、２０５５９）に提出されており、アメリカ合衆国著作権登録番号第ＴＸＵ５１００８７号で登録されている。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社（サウスサンフランシスコ、カリフォルニア州）から一般に利用可能である、または、ソースコードからコンパイルすることもできる。ＡＬＩＧＮ－２プログラムのコンパイルは、デジタルＵＮＩＸ（登録商標） Ｖ４．０Ｄを含むＵＮＩＸ（登録商標）動作システムで使用するためになされるべきである。すべての配列比較パラメータはＡＬＩＧＮ－２プログラムによって設定されるものであり、変動しない。

ＡＬＩＧＮ－２を使用してアミノ酸配列比較を実施する際には、所与のアミノ酸配列Ａと所与のアミノ酸配列Ｂとのアミノ酸配列同一性％（代替的には、所与のアミノ酸配列Ｂに対して特定のアミノ酸配列同一性％を有するまたは含む所与のアミノ酸配列Ａともいえる）は、以下のように計算される：分数Ｘ／Ｙを１００倍する（Ｘは、配列アライメントプログラムＡＬＩＧＮ－２により、当該プログラムによるＡとＢとのアライメントにおいて同一マッチとして記録されるアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂ中のアミノ酸残基の総数）。アミノ酸配列Ａの長さとアミノ酸配列Ｂの長さとが等しくない場合にはＢに対するＡのアミノ酸配列同一性％とＡに対するＢのアミノ酸配列同一性％とは等しくないということが理解される。そうでないということが具体的に述べられていない限り、本明細書中において使用されるすべてのアミノ酸配列同一性の％値は、ＡＬＩＧＮ－２コンピュータプログラムを使用して、直前の段落中に記載されるとおりに得られる。

本明細書中において記載されるポリペプチドは、核酸によってコードされ得る。核酸は、２つ以上のヌクレオチド塩基を含む型のポリヌクレオチドである。特定の実施形態において、核酸は、ポリヌクレオチドをコードするポリペプチドを細胞中に移送するために使用できるベクターの構成要素である。本明細書中において使用される場合、「ベクター」という用語は、自身が結合している別の核酸を輸送できる核酸分子を指す。ベクターの１つの型としては、宿主細胞の染色体ＤＮＡ中に組み込まれ得るゲノム組込型ベクター（ｇｅｎｏｍｉｃ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｖｅｃｔｏｒ）（または「組込型ベクター（ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｖｅｃｔｏｒ）」）がある。別の型のベクターとしては、たとえば染色体外で複製できる核酸などの「エピソーム」ベクターがある。自身が作動可能に結合している遺伝子の発現を指揮できるベクターは、本明細書中において、「発現ベクター」とよばれる。好適なベクターは、プラスミド、細菌人工染色体、酵母人工染色体、およびウイルスベクターなどを含む。発現ベクター中の、転写の制御において使用されるプロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナルなどの調節エレメントは、哺乳動物、微生物、ウイルス、または昆虫の遺伝子に由来し得る。宿主中で複製する能力（通常は複製起点により与えられる）と、形質転換体の認識を促進する選択遺伝子とが、さらに組み込まれてもよい。レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルスなどのウイルスに由来するベクターが使用され得る。プラスミドベクターは、線状にされて、染色体中の場所に組み込まれ得る。ベクターは、ゲノム中における規定位置へのまたは限定された複数部位への部位特異的な組込み（たとえば、ＡｔｔＰ－ＡｔｔＢ組換え）を指揮する配列を含み得る。さらに、ベクターは、転位因子に由来する配列を含み得る。

ＦＧＦ１７ポリペプチド
特定の態様において、本明細書中に記載されるのは、ＦＧＦ１７アミノ酸配列を含むＦＧＦ１７ポリペプチドである。ＦＧＦ１７アミノ酸配列は、ヒトＦＧＦ１７であり得る。ＦＧＦ１７アミノ酸配列は、配列番号５４と少なくとも約９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有し得る。ＦＧＦ１７アミノ酸配列は、配列番号５４との同一性が１００％であり得る。ＦＧＦ１７アミノ酸配列は、配列番号５５との同一性が少なくとも約９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％であり得る。ＦＧＦ１７アミノ酸配列は、配列番号５５との同一性が１００％であり得る。ＦＧＦ１７アミノ酸配列は、配列番号５６との同一性が少なくとも約９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％であり得る。ＦＧＦ１７アミノ酸配列は、配列番号５６との同一性が１００％であり得る。ＦＧＦ１７アミノ酸配列は、配列番号５７との同一性が少なくとも約９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％であり得て、当該配列はＲ２０４ＱおよびＫ２０７Ｑの変異を含む。ＦＧＦ１７アミノ酸配列は、配列番号５７との同一性が１００％であり得る。ＦＧＦ１７アミノ酸配列は、配列番号５８との同一性が少なくとも約９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％であり得る。ＦＧＦ１７アミノ酸配列は、配列番号５８との同一性が１００％であり得る。ＦＧＦ１７アミノ酸配列は、配列番号５９との同一性が少なくとも約９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％であり得て、当該配列は、Ｋ１９１Ａ、Ｋ１９３Ａ、およびＳ２００Ａの変異を含む。ＦＧＦ１７アミノ酸配列は、配列番号５９との同一性が１００％であり得る。

本明細書中において記載されるＦＧＦ１７ポリペプチドは、ＦＧＦ１７ポリペプチドの発現、安定性、または機能を増大させるさらなる異種の（ＦＧＦ１７ではない）アミノ酸配列を含み得る融合タンパク質またはポリペプチドであり得る。当該異種アミノ酸配列は、細胞系（たとえば、ＣＨＯ細胞、または大量産生に好適なその他の細胞系）からのＦＧＦ１７融合ポリペプチドの発現を、異種アミノ酸配列を含まないポリペプチドと比較して１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、７５％、１００％、１５０％、２００％、２００％、４００％、５００％、１，０００％、またはそれ以上増大させ得る。当該異種アミノ酸配列は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてＦＧＦ１７ポリペプチドのバイオアベイラビリティを、異種アミノ酸配列を含まないポリペプチドと比較して１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、７５％、１００％、１５０％、２００％、２００％、４００％、５００％、１，０００％、またはそれ以上増大させ得る（たとえば、Ｔｌ／２を増大させ得る）。当該異種アミノ酸配列は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてＦＧＦ１７ポリペプチドの機能を、異種アミノ酸配列を含まないポリペプチドと比較して１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、７５％、１００％、１５０％、２００％、２００％、４００％、５００％、１，０００％、またはそれ以上増大させ得る（たとえば、ＦＧＦ受容体を経るシグナル伝達により）。

ＦＧＦ１７－異種ポリペプチド融合タンパク質のＦＧＦ１７アミノ酸配列は、配列番号５４との同一性が少なくとも約９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％であり得る。融合タンパク質のＦＧＦ１７アミノ酸配列は、配列番号５４との同一性が１００％であり得る。融合タンパク質のＦＧＦ１７アミノ酸配列は、配列番号５５との同一性が少なくとも約９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％であり得る。融合タンパク質のＦＧＦ１７アミノ酸配列は、配列番号５５との同一性が１００％であり得る。融合タンパク質のＦＧＦ１７アミノ酸配列は、配列番号５６との同一性が少なくとも約９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％であり得る。融合タンパク質のＦＧＦ１７アミノ酸配列は、配列番号５６との同一性が１００％であり得る。融合タンパク質のＦＧＦ１７アミノ酸配列は、配列番号５７との同一性が少なくとも約９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％であり得て、当該配列は、Ｒ２０４ＱおよびＫ２０７Ｑの変異を含む。融合タンパク質のＦＧＦ１７アミノ酸配列は、配列番号５７との同一性が１００％であり得る。融合タンパク質のＦＧＦ１７アミノ酸配列は、配列番号５８との同一性が少なくとも約９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％であり得る。融合タンパク質のＦＧＦ１７アミノ酸配列は、配列番号５８との同一性が１００％であり得る。融合タンパク質のＦＧＦ１７アミノ酸配列は、配列番号５９との同一性が少なくとも約９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％であり得て、当該配列は、Ｋ１９１Ａ、Ｋ１９３Ａ、およびＳ２００Ａの変異を含む。融合タンパク質のＦＧＦ１７アミノ酸配列は、配列番号５９との同一性が１００％であり得る。

ＦＧＦ１７融合ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号６０、配列番号６１、または配列番号６２との同一性が少なくとも約９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％であり得る。融合ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号６５との同一性が少なくとも約９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％であり得て、当該配列は、Ｒ２０４ＱおよびＫ２０７Ｑの変異を含む。融合ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号６６、配列番号６６、または配列番号７１との同一性が１００％であり得て、当該配列は、Ｋ１９１Ａ、Ｋ１９３Ａ、およびＳ２００Ａの変異を含む。融合ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号７２との同一性が１００％であり得る。融合ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、または配列番号６９との同一性が少なくとも約９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％であり得て、当該配列は、Ｒ２０４ＱおよびＫ２０７Ｑの変異を含む。

ＦＧＦ１７アミノ酸配列は、配列番号５４～７０または７４のうちの１つとの同一性が少なくとも約８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％であり得て、ポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端から１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個のアミノ酸が欠失している。

ＩＧＦ２融合タンパク質
本明細書中に記載されるのは、治療に有用な特定のＩＧＦ２ポリペプチドであり、当該ＩＧＦ２含有ポリペプチドのｉｎ ｖｉｖｏにおける安定性および機能を増進させるＩＧＦ２融合ポリペプチドを含む。

特定の態様において、本明細書中において記載されるのは、ＩＧＦ受容体リガンドポリペプチドである。ＩＧＦ２ポリペプチドは、ＩＧＦ２アミノ酸配列を含み得る。ＩＧＦ２アミノ酸配列は、ヒトＩＧＦ２ポリペプチドのそれであり得る。ヒトＩＧＦ２ポリペプチドは、配列番号７９のアミノ酸２５～９１（すなわち配列番号７６）を含み得る。ＩＧＦ２アミノ酸配列は、配列番号７６、７９、８１、または８６のうちの１つとの同一性が少なくとも約９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％であり得る。ＩＧＦ２アミノ酸配列は、配列番号７６との同一性が１００％であり得る。ＩＧＦ２アミノ酸配列は、配列番号７６、７９～８１、８６、または８８のうちの１つとの同一性が少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％であり得て、ポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端から１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個のアミノ酸が欠失している。

特定の場合において、本明細書中において記載されるＩＧＦ２ポリペプチドは、異種アミノ酸配列を含まないポリペプチドと比較してＩＧＦ２ポリペプチドの発現、安定性、または機能を増大させるさらなる異種の（ＩＧＦ２ではない）アミノ酸配列を含み得る融合タンパク質またはポリペプチドである。当該異種アミノ酸配列は、細胞系（たとえば、ＣＨＯ細胞、または大量産生に好適なその他の細胞系）からのＩＧＦ２融合ポリペプチドの発現を、異種アミノ酸配列を含まないポリペプチドと比較して１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、７５％、１００％、１５０％、２００％、２００％、４００％、５００％、１，０００％、またはそれ以上増大させ得る。当該異種アミノ酸配列は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてＩＧＦ２ポリペプチドのバイオアベイラビリティまたはその他の薬物動態学的因子を、異種アミノ酸配列を含まないポリペプチドと比較して１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、７５％、１００％、１５０％、２００％、２００％、４００％、５００％、１，０００％、またはそれ以上増大させ得る（たとえば、Ｔ_１／２、ＡＵＣ、Ｃ_ｍａｘ、Ｔ_ｍａｘなどを増大させ得る）。当該異種アミノ酸配列は、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＩＧＦ２ポリペプチドの薬力学および／または機能を、異種アミノ酸配列を含まないポリペプチドと比較して１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、７５％、１００％、１５０％、２００％、２００％、４００％、５００％、１，０００％、またはそれ以上、それぞれ改善および／または増大させ得る（たとえば、ＩＧＦ受容体を経るシグナル伝達により）。

また、本明細書中にさらに記載されるのは、ＩＧＦ受容体リガンド融合ポリペプチド、またはＩＧＦ２とは異種のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。ＩＧＦ受容体リガンド融合は、ＩＧＦ受容体リガンドの安定性または機能を増進させる異種アミノ酸配列を含む。ＩＧＦ２－異種ポリペプチド融合タンパク質のＩＧＦ２アミノ酸配列は、配列番号７６との同一性が少なくとも約９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％であり得る。融合タンパク質のＩＧＦ２アミノ酸配列は、配列番号７６との同一性が１００％であり得る。融合タンパク質のＩＧＦ２アミノ酸配列は、配列番号８０との同一性が少なくとも約９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％であり得る。融合タンパク質のＩＧＦ２アミノ酸配列は、配列番号８０との同一性が１００％であり得る。融合タンパク質のＩＧＦ２アミノ酸配列は、配列番号８８との同一性が少なくとも約９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％であり得る。融合タンパク質のＩＧＦ２アミノ酸配列は、配列番号８８との同一性が１００％であり得る。さらなる代表的な配列が、表２中に見つけられ得る。

ＢＭＰ７融合タンパク質
本明細書中に記載されるのは、治療に有用な特定のＢＭＰ７ポリペプチドであり、当該ＢＭＰ７含有ポリペプチドのｉｎ ｖｉｖｏにおける安定性および機能を増進させるＢＭＰ７融合ポリペプチドを含む。

一態様において、本明細書中に記載されるのは、ＢＭＰ７アミノ酸配列を含むＢＭＰ７ポリペプチドである。ＢＭＰ７アミノ酸配列は、ヒトＢＭＰ７アミノ酸配列であり得る。ＢＭＰ７アミノ酸配列は、ＢＭＰ７のアミノ酸２９３～４３１を含み得る、またはこれらからなり得る。ＢＭＰ７アミノ酸配列は、ＢＭＰ７ナックルドメイン（配列番号９２）を含み得る。ＢＭＰ７配列は、配列番号８９との同一性が少なくとも約９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％であり得る。ＢＭＰ７配列は、配列番号８９との同一性が１００％であり得る。ＢＭＰ７配列は、配列番号９２との同一性が少なくとも約９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％であり得る。ＢＭＰ７配列は、配列番号９２との同一性が１００％であり得る。ＢＭＰ７ポリペプチド配列は、ＢＭＰ７ナックルドメインの繰り返しを１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上含み得る。

ＢＭＰ７アミノ酸配列を、さらに、異種アミノ酸配列に、直接的にまたはＢＭＰ７アミノ酸配列と異種ポリペプチドアミノ酸配列との間にリンカー配列を伴って、融合させて、融合ポリペプチドを創製し得る。融合ポリペプチドは、ヒトＢＭＰ７アミノ酸配列を含み得る。融合ポリペプチドは、ＢＭＰ７のアミノ酸２９３～４３１を含み得る、またはこれらからなり得る。融合ポリペプチドは、ＢＭＰ７ナックルドメイン（配列番号９２）を含み得る。融合ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号８９との同一性が少なくとも約９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％であるＢＭＰ７アミノ酸配列を含み得る。融合ポリペプチドは、配列番号８９との同一性が１００％であるＢＭＰ７アミノ酸配列を含み得る。融合ポリペプチドアミノ酸は、配列番号９２との同一性が少なくとも約９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％であるＢＭＰ７アミノ酸配列を含み得る。融合ポリペプチドは、配列番号９２との同一性が１００％であるＢＭＰ７アミノ酸配列を含み得る。融合ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号９０との同一性が少なくとも約９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％であり得る。融合ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号９０との同一性が１００％であり得る。融合ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号９１との同一性が少なくとも約９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％であり得る。融合ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号９１との同一性が１００％であり得る。

ＢＭＰ７アミノ酸配列は、配列番号２０、２１、３２、または８９のうちの１つとの同一性が少なくとも約８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％であり得て、ポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端から１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個のアミノ酸が欠失している。

いくつかの態様において、ＢＭＰ７配列は、ＢＭＰ７配列のフラグメントであってよい。ＢＭＰ７のナックルドメインは、配列番号８９のアミノ酸９８～１２９（配列番号３２）を含む。ナックルドメインからのアミノ酸１５～３０個からなるフラグメントは、ＢＭＰシグナル伝達を活性化し得る。ＢＭＰ７配列は、ＢＭＰのナックルドメインを含み得る。ＢＭＰ７配列は、配列番号３２のアミノ酸１５～３０個からなるフラグメントであり得る。ＢＭＰ７配列は、配列番号３２の少なくとも約１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２９、２９、３０、３１、３２、３３、３４、または３５個のアミノ酸であり得る。

分泌シグナルペプチド
特定の態様において、融合ポリペプチドは、分泌シグナルペプチドを含み得る。分泌シグナルペプチドは、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、または配列番号３０であり得る。本明細書中における融合ポリペプチドの、異種の産生系（たとえば、細菌、酵母、哺乳動物、昆虫など）での産生は、その特定の宿主細胞にとって好適な分泌シグナル配列の使用を伴い得る。

多量体化成分は、それ自身以外の２つ以上のタンパク質成分同士を連結させる。多量体化成分は、それ自身以外の同一または異なる成分同士を連結させて１つの連続するアミノ酸配列とするアミノ酸リンカー配列を含み得る。好適なリンカーは、本明細書中において記載されるＧｌｙ－Ｓｅｒリンカーなどのポリペプチドリンカーまたはスペーサーを含む。多量体化成分は、多量体化または二量体化するタンパク質またはタンパク質ドメインの形態をとり得て、その結果、共有結合性ジスルフィド結合（たとえば、１つ以上の新規のシステイン残基の付加による）または非共有結合が二量体化を駆動し得る（たとえば、ロイシンジッパー）。多量体化成分は、複数のＩＧＦ２アミノ酸配列を結合または多量体化し得る。多量体化成分は、２つのＩＧＦ２アミノ酸配列を結合または多量体化し得る。当該２つのＩＧＦ２アミノ酸配列は、同じであっても異なっていてもよく、本明細書中において記載されるＩＧＦ２配列のうちの任意のものから選択され得る。多量体化成分は、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上のＩＧＦ２アミノ酸配列を結合または多量体化し得る。多量体化成分は、ＩＧＦ２アミノ酸配列と、融合の増進、増殖増進の機能、血漿半減期の増大、またはその他の薬物動態学的もしくは薬力学的パラメータの改善を提供する別のポリペプチドとを、結合または多量体化し得る。

ＦＧＦ１７、ＩＧＦ２、またはＢＭＰ７アミノ酸配列は、その機能性フラグメント、それが変異した配列、またはそれが改変されたポリペプチドを含み得る。表２は、フラグメント、ポリペプチド、および改変ポリペプチドについてのいくつかの例を列記する。ＩＧＦ２またはＢＭＰ７配列は、Ｎ－、Ｃ－、またはＯ－結合型グリコシル化されていてもよい。ＩＧＦ２配列は、１つのアミノ酸がグリコシル化されていてもよい。ＩＧＦ２配列は、配列番号３１のＴｈｒ９６、Ｔｈｒ９９、またはＴｈｒ１６３に対応する部位がグリコシル化されていてもよい。ＢＭＰ７配列は、少なくとも１つのグリコシル化アミノ酸を含んでいてよい。ＢＭＰ７は、配列番号８９のＡｓｎ１０、Ａｓｎ２９、またはＡｓｎ９０残基がグリコシル化されていてもよい。

本明細書中において記載されるＦＧＦ１７、ＩＧＦ２、またはＢＭＰ７受容体リガンドポリペプチドおよび受容体リガンド融合ポリペプチドは、核酸によってコードされて、当該受容体リガンドポリペプチドまたは融合ポリペプチドの産生を促進し得る。これらの核酸は、細菌、酵母、昆虫、または哺乳動物の発現系と適合し得る。これらは、プロモーター／エンハンサー（構造的または誘発性）、ポリアデニル化シグナル、選択マーカー（抗生物質耐性など）、複製起点、またはその他の付属性核酸配列を含み得る。ＦＧＦ１７、ＩＧＦ２、またはＢＭＰ７配列は、多くの生物からのものを使用できる。ＦＧＦ１７、ＩＧＦ２、またはＢＭＰ７配列は、ヒトのＦＧＦ１７、ＩＧＦ２、またはＢＭＰ７アミノ酸配列を含み得る。ＦＧＦ１７、ＩＧＦ２、またはＢＭＰ７配列は、ネコ、イヌ、またはウマのＦＧＦ１７、ＩＧＦ２、またはＢＭＰ７配列を含み得る。ＦＧＦ１７、ＩＧＦ２、またはＢＭＰ７配列は、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ラマ、アルパカ、ヤク、またはサルの配列を含み得る。

ＦＧＦ１７核酸配列
特定の実施形態において、ＦＧＦ１７核酸配列は、配列番号１７との同一性が少なくとも約９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％である。ＦＧＦ１７核酸配列は、配列番号１７との同一性が１００％であり得る。ＦＧＦ１７核酸配列は、配列番号２２との同一性が少なくとも約９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％である。ＦＧＦ１７核酸配列は、配列番号２２との同一性が１００％であり得る。ＦＧＦ１７核酸配列は、配列番号２３との同一性が少なくとも約９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％であり得る。ＦＧＦ１７核酸配列は、配列番号２３との同一性が１００％であり得る。

ＩＧＦ２核酸配列
ＩＧＦ２核酸配列は、配列番号３９との同一性が少なくとも約９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％であり得る。ＩＧＦ２核酸配列は、配列番号３９との同一性が１００％であり得る。ＩＧＦ２核酸配列は、配列番号４３との同一性が少なくとも約９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％であり得る。ＩＧＦ２核酸配列は、配列番号４３との同一性が１００％であり得る。ＩＧＦ２核酸配列は、配列番号４６との同一性が少なくとも約９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％であり得る。ＩＧＦ２核酸配列は、配列番号４６との同一性が１００％であり得る。

ＢＭＰ７核酸配列
ＢＭＰ７核酸配列は、配列番号５１との同一性が少なくとも約９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％であり得る。ＢＭＰ７核酸配列は、配列番号５１との同一性が１００％であり得る。ＢＭＰ７核酸配列は、配列番号５２との同一性が少なくとも約９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％であり得る。ＢＭＰ７核酸配列は、配列番号５２との同一性が１００％であり得る。ＢＭＰ７核酸配列は、配列番号５３との同一性が少なくとも約９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％であり得る。ＢＭＰ７核酸配列は、配列番号５３との同一性が１００％であり得る。

異種ペプチド
本明細書中において記載される融合タンパク質の一部を含む異種ポリペプチドは、免疫グロブリン分子のフラグメント、アルブミン分子、トランスフェリン分子、ＸＴＥＮ配列、プロリン－アラニン－セリンポリマー、ホモアミノ酸ポリマー、グリシンリッチ配列、ゼラチン様ポリマー、エラスチン様ペプチド、カルボキシ末端ペプチド、もしくはこれらの組み合わせを含み得る、またはこれらからなり得る、または本質的にこれらからなり得る。

本明細書中において記載される一態様において、治療用ポリペプチドは、ＦＧＦ受容体リガンドポリペプチドまたはＦＧＦ１７ポリペプチドである。本明細書中において記載される一態様において、治療用ポリペプチドは、ＩＧＦ受容体リガンドポリペプチドまたはＩＧＦ２ポリペプチドである。本明細書中において記載される一態様において、治療用ポリペプチドは、ＢＭＰ受容体リガンドポリペプチドまたはＢＭＰ７ポリペプチドである。

本明細書中において記載される一態様において、治療用ポリペプチドは、直接的にまたはリンカーを介して異種ポリペプチドアミノ酸配列に融合されており、異種アミノ酸配列は、治療用ポリペプチドの機能または安定性を増大させる。

異種ペプチドは、治療用アミノ酸配列の薬物動態、薬力学、安定性、または生物学的機能を改善できる。異種配列は、治療用アミノ酸配列のＣ末端またはＮ末端において、治療用アミノ酸配列に融合され得る。治療用アミノ酸配列は、Ｎ末端において、異種配列に融合され得る。治療用アミノ酸配列は、Ｃ末端において、異種配列に融合され得る。フレキシブルリンカーが、Ｎ末端において、治療用アミノ酸配列と異種配列との間に使用され得る。フレキシブルリンカーが、Ｃ末端において、治療用アミノ酸配列と異種配列との間に使用され得る。スペーサーが、Ｎ末端において、治療用アミノ酸配列と異種配列との間に使用され得る。スペーサーが、Ｃ末端において、治療用アミノ酸配列と異種配列との間に使用され得る。

異種ペプチドは、ＩＧＦ２アミノ酸配列の薬物動態、薬力学、安定性、または生物学的機能を改善できる。融合タンパク質は、Strohl, “Fusion Proteins for Half-Life Extension of Biologies as a Strategy to Make Biobetters,” BioDrugs (2015) 29:215-239において記載されるように、たとえば半減期を長くすることなどによって、生理活性分子の薬物動態を改善するために使用できる。ポリペプチドを免疫グロブリン、アルブミン、またはトランスフェリンなどの半減期の長い分子または分子のフラグメントに融合させることによって、ポリペプチドの半減期が増大する。ＸＴＥＮ配列は、アミノ酸残基Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｐ、Ｓ、およびＴを含有する繰り返しのアミノ酸ポリマーであり、これは、通常は不活性であるが、ペプチドに融合させた際には、当該ペプチドの半減期を長くすることができる。また、プロリン－アラニン－セリンポリマー（プロリン、アラニン、およびセリンの繰り返し）、グリシンリッチ配列（Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｓ）などのホモアミノ酸ポリマー配列、ゼラチン様タンパク質、およびエラスチン様配列（Ｖ－Ｐ－Ｇ－ｘ－Ｇ、ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸）などの小さな繰り返し配列を融合させることによっても、ポリペプチドの半減期を長くすることができる。ポリペプチドにカルボキシ末端ペプチド（ｃａｒｂｏｘｙ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ；ＣＴＰ）を融合させることによって、ＣＴＰの強い負の電荷（ｃｈａｎｇｅ）のために、血清中におけるポリペプチドの半減期を長くすることができる。異種ポリペプチドは、免疫グロブリン分子のフラグメント、アルブミン分子、トランスフェリン分子、ＸＴＥＮ配列、プロリン－アラニン－セリンポリマー、ホモアミノ酸ポリマー、グリシンリッチ配列、ゼラチン様ポリマー、エラスチン様ペプチド、カルボキシ末端ペプチド、またはこれらの組み合わせを含み得る。

免疫グロブリンは大きなエフェクター分子であり、たとえば、ＩｇＧ免疫グロブリンは、血漿半減期が約２１日間である。免疫グロブリンフラグメントを第２のポリペプチドに融合させると、これによって第２のポリペプチドの半減期が増大し得る。免疫グロブリン分子のフラグメントは、ＩｇＧのヒンジドメイン、ＩｇＧのＣＨ２ドメイン、ＩｇＧのＣＨ３ドメイン、またはこれらの任意の組み合わせを含み得る。免疫グロブリン分子のフラグメントは、ＩｇＧ１のヒンジドメイン、ＩｇＧ１のＣＨ２ドメイン、ＩｇＧ１のＣＨ３ドメイン、またはこれらの任意の組み合わせを含み得る。免疫グロブリン分子のフラグメントは、ＩｇＧ４のヒンジドメイン、ＩｇＧ４のＣＨ２ドメイン、ＩｇＧ４のＣＨ３ドメイン、またはこれらの任意の組み合わせを含み得る。

いくつかの場合において、免疫グロブリン分子またはフラグメントの変異によって、当該免疫グロブリン分子またはフラグメントの半減期または安定性が増大し得る。免疫グロブリン分子のフラグメントは、ＩｇＧ１のヒンジドメイン、ＩｇＧ１のＣＨ２ドメイン、ＩｇＧ１のＣＨ３ドメイン、またはこれらの任意の組み合わせと、免疫グロブリン分子における以下のアミノ酸変異のうちの１つ以上とを含み得る：Ｐ３２９Ｇ、Ｌ２３４Ａ、およびＬ２３５Ａ。免疫グロブリン分子のフラグメントは、ＩｇＧ４分子を含む。免疫グロブリン分子のフラグメントは、免疫グロブリン分子における以下のアミノ酸変異のうちの少なくとも１つを有するＩｇＧ４分子を含み得る：ＥＵナンバリングシステムに従う、ＩｇＧ４のＮ４３４Ａ、Ｎ４３４Ｈ、Ｔ３０７Ａ／Ｅ３８０Ａ／Ｎ４３４Ａ、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ、４３３Ｋ／４３４Ｆ／４３６Ｈ、Ｔ２５０Ｑ、Ｔ２５０Ｆ、Ｍ４２８Ｌ、Ｍ４２８Ｆ、Ｔ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ｓ、Ｖ３０８Ｗ、Ｖ３０８Ｙ、Ｖ３０８Ｆ、Ｍ２５２Ｙ／Ｍ４２８Ｌ、Ｄ２５９Ｉ／Ｖ３０８Ｆ、Ｍ４２８Ｌ／Ｖ３０８Ｆ、Ｑ３１１Ｖ／Ｎ４３４Ｓ、Ｔ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａ、Ｅ２５８Ｆ／Ｖ４２７Ｔ、Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｓ２２８Ｐ／Ｌ２３５Ｅ／Ｒ４０９Ｋ、Ｓ２２８Ｐ／Ｌ２３５Ｅ、Ｋ３７０Ｑ、Ｋ３７０Ｅ、Ｇ４４６の欠失、Ｋ４４７の欠失、およびこれらの組み合わせ。

分泌シグナル配列は、細胞内においてタンパク質を分泌経路へとターゲティングする配列モチーフである。分泌配列は、タンパク質から切断されて、成熟した分泌タンパク質を産生し得る。ポリペプチドは、分泌シグナル配列を含み得る。ポリペプチドは、ヒトのＦＧＦ１７、ＩＧＦ２、またはＢＭＰ７分泌配列（配列番号９、配列番号１１、配列番号１２）を含み得る。ポリペプチドは、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、または配列番号１６である分泌シグナルを含み得る。

リンカーおよびスペーサー
リンカーまたはスペーサーは、１つのタンパク質中において異なるドメイン同士を分離する短いアミノ酸配列である、または融合タンパク質と融合タンパク質との間のドメインである。本明細書中において使用される場合、「リンカー」および「スペーサー」という用語は、区別されない。リンカーは、リジッドであってもよく、フレキシブルであってもよい。リジッドなリンカーは、異なるドメイン同士の間の好ましくない相互作用を防止し得る。プロリンに富むリンカーは比較的リジッドである傾向があり、グリシンに富むリンカーは比較的フレキシブルである傾向がある。フレキシブルなリンカーは、１つのタンパク質内におけるドメイン同士の相互作用を許容する。フレキシブルリンカーの別の用途として、タンパク質複合体と結合パートナーとを共有結合的に結合させて安定なタンパク質複合体を生成することができる。また、フレキシブルリンカーは、二量体化を増進させるためにも使用され得る。リンカーおよびスペーサーは、Chichili et al, Linkers in the Structural biology of protein-protein interactions, Protein Sci. Feb 2013. 22(2): 153-167中において考察されている。

本明細書中において記載される融合ポリペプチドは、治療用ポリペプチドと異種ポリペプチドとを分離するリンカーまたはスペーサーアミノ酸配列をさらに含み得る。リンカーまたはスペーサーは、ペプチドリンカーまたはスペーサーであってよい。リンカーまたはスペーサーは、フレキシブルなリンカーまたはスペーサーであってよい。リンカーは、３つのアラニン（ＡＡＡ）であってよい。ペプチドリンカーは、グリシン－セリンリンカーであってよい。リンカーは、（１文字アミノ酸コードにて）ＧＧＧＧＳ（４ＧＳ）、または４ＧＳリンカーの多量体（２個、３個、４個、または５個の４ＧＳリンカーの繰り返しなど）であってよい。グリシン－セリンリンカーは、配列番号９４もしくは配列番号９５のアミノ酸配列、または、配列番号９４もしくは配列番号９５を２、３、４、もしくは５回繰り返したものを含み得る。リンカーは、表２中のポリペプチド配列または表３の異種ポリペプチドアミノ酸配列のいずれにも由来しない少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、または３２個のアミノ酸を含み得る。

リンカーまたはスペーサーは、１つのアミノ酸残基であってもよく、またはこれより長くてもよい。特定の実施形態において、ペプチドリンカーの長さは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、または３２個のアミノ酸である。ペプチドリンカーは、少なくとも１つのアミノ酸残基を有し得るが、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、または２個のアミノ酸残基長を超えない。

ＦＧＦＲアゴニストおよびグリコサミノグリカンの組み合わせ
特定の態様において、本明細書中において開示されるのは、ＦＧＦＲアゴニストおよびグリコサミノグリカンを含む組成物である。ＦＧＦ受容体にはＦＧＦ１Ｒ、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４という４種があり、これらは全身の様々な組織によって発現される。ＦＧＦＲの化学的アゴニストは、ＰＦ－０５２３１０２３およびＳＵＮ１１６０２を含むが、これらに限定されない。また、デカフィン（ｄｅｋａｆｉｎ）およびヘキサフィン（ｈｅｘａｆｉｎ）を含むその他のポリペプチドも、ＦＧＦＲシグナル伝達を活性化することができる。こうした組成物は、予想外の相乗効果を含み得て、筋肉および／または軟部組織の状態または障害の処置に有用である。また、この相乗効果は、ＦＧＦＲアゴニストおよびグリコサミノグリカンを別々に投与することを含む方法によって増進され得る。本明細書中において記載される組み合わせは、当該組み合わせの各成分に対して、さらなる処置有用性および機能を付与できる。

ＦＧＦＲ１は、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ８、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２２、およびＦＧＦ２３によって活性化され得る。ＦＧＦＲ１アゴニストは、ＦＧＦＲ１アゴニスト性抗体、ＦＧＦポリペプチドもしくはその機能性フラグメント、ＦＧＦ１７もしくはその機能性フラグメント、ＰＦ－０５２３１０２３、ＳＵＮ１１６０２、デカフィン、ヘキサフィン、またはこれらの組み合わせであり得る。

ＦＧＦＲ２は、選択的にスプライシングされた２つのアイソフォームを含む。ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂはＦＧＦ１、ＦＧＦ３、ＦＧＦ１０、およびＦＧＦ２２に結合し、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｃはＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ４、ＦＧＦ６、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１７、およびＦＧＦ１８に結合する。ＦＧＦＲ２アゴニストは、ＦＧＦＲ２アゴニスト性抗体、ＦＧＦポリペプチドもしくはその機能性フラグメント、ＦＧＦ１７もしくはその機能性フラグメント、ＰＦ－０５２３１０２３、ＳＵＮ１１６０２、デカフィン、ヘキサフィン、またはこれらの組み合わせであり得る。

ＦＧＦＲ３は、少なくともＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２１、およびＦＧＦ２３、およびＦＧＦ１７によって活性化され得る。ＦＧＦＲ３における変異は、軟骨細胞の増殖における欠陥および石灰化ならびに軟骨無形成症と関連づけられている。ＦＧＦＲ３アゴニストは、ＦＧＦＲ３アゴニスト性抗体、ＦＧＦポリペプチドもしくはその機能性フラグメント、ＦＧＦ１７もしくはその機能性フラグメント、ＰＦ－０５２３１０２３、ＳＵＮ１１６０２、デカフィン、ヘキサフィン、またはこれらの組み合わせであり得る。

ＦＧＦＲ４は、少なくともＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ４、ＦＧＦ６、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、およびＦＧＦ１８によって活性化され得る。ＦＧＦＲ４アゴニストは、ＦＧＦＲ４アゴニスト性抗体、ＦＧＦポリペプチドもしくはその機能性フラグメント、ＦＧＦ１７もしくはその機能性フラグメント、ＰＦ－０５２３１０２３、ＳＵＮ１１６０２、デカフィン、ヘキサフィン、またはこれらの組み合わせであり得る。

ＦＧＦＲアゴニストは、ＦＧＦ８サブファミリーのメンバーであり得る。ＦＧＦＲアゴニストは、ＦＧＦＲ１アゴニストであり得る。ＦＧＦＲアゴニストは、ＦＧＦ１７であり得る。ＦＧＦ１７ポリペプチドは、配列番号５４との同一性が少なくとも約９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％であり得る。ＦＧＦ１７は、配列番号５４との同一性が１００％であり得る。ＦＧＦ１７ポリペプチドは、配列番号５５との同一性が少なくとも約９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％であり得る。ＦＧＦ１７ポリペプチドは、配列番号５５との同一性が１００％であり得る。ＦＧＦ１７ポリペプチドは、配列番号５６との同一性が少なくとも約９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％であり得る。ＦＧＦ１７は、配列番号５６との同一性が１００％であり得る。ＦＧＦ１７ポリペプチドは、配列番号５７との同一性が少なくとも約９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％であり得て、当該配列は、Ｒ２０４ＱおよびＫ２０７Ｑの変異を含む。特定の実施形態において、ＦＧＦ１７ポリペプチドは、配列番号５７との同一性が１００％である。特定の実施形態において、ＦＧＦ１７ポリペプチドは、配列番号５８との同一性が少なくとも約９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％である。ＦＧＦ１７ポリペプチドは、配列番号５８との同一性が１００％であり得る。ＦＧＦ１７ポリペプチドは、配列番号５９との同一性が少なくとも約９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％であり得て、当該配列は、Ｋ１９１Ａ、Ｋ１９３Ａ、およびＳ２００Ａの変異を含む。ＦＧＦ１７ポリペプチドは、配列番号５９との同一性が１００％であり得る。

グリコサミノグリカンは、二糖単位の繰り返しを含有する直鎖状の多糖である。グリコサミノグリカンには以下の４つのクラスがある：ヘパリン／ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸、ケラチン硫酸、およびヒアルロン酸。グリコサミノグリカンは、ヘパリン／ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸、ケラチン硫酸、またはヒアルロン酸であり得る。いくつかの実施形態において、グリコサミノグリカンは、ヘパリンを含む。グリコサミノグリカンは、ヒアルロン酸を含み得る。

ヘパリンは天然物に由来し得て、未分画ヘパリンと称されることが多い。また、ヘパリンは、分子量に基づいて定義され得る。低分子量ヘパリンは、ダルテパリン、エノキサパリン、セルトパリン、アルデパリン、パルナパリン、レビパリン、ナドロパリン、およびダナパロイドを含む。ヘパリンは、ヘパリン硫酸、デルマタン硫酸、およびコンドロイチン硫酸の混合物であるダナパロイドなどのように、その他の化合物との混合物として投与できる。組成物は、低分子量ヘパリン、ヘパリン硫酸、未分画ヘパリン、ヘパリン四糖、ダルテパリン、チンザパリン、エノキサパリン、セルトパリン、アルデパリン、パルナパリン、レビパリン、ナドロパリン、ヘパリンフラッシュ、ダナパロイド、フォンダパリヌクス、またはこれらの組み合わせを含み得る。

ヒアルロン酸（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ；ＨＡ）はポリマー分子であり、広範囲の分子量を示し得る。ヒアルロン酸は、モダル分子量調製物（ｍｏｄａｌ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）のほとんどいずれの平均においても使用できる。分子量は、たとえば、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３１００、３２００、３３００、３４００、３５００、３６００、３７００、３８００、３９００、４０００、４１００、４２００、４３００、４４００、４５００、４６００、４７００、４８００、４９００、５０００ｋＤａ、またはそれ以上、またはそこにおいて導き出せる任意の範囲であり得る。ＨＡは、低分子量ＨＡ（約５００～７００キロダルトンｋＤａ）、中分子量ＨＡ（７００～１０００ｋＤａ）、および高分子量ＨＡ（１．０～４．０百万ダルトン（ＭＤａ））を含み得る。ＨＡは、天然調製物、合成調製物、またはこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、ＨＡは、低分子量、中分子量、低分子量、またはこれらの組み合わせである。いくつかの実施形態において、ＨＡは、天然ＨＡ、合成ＨＡ、またはこれらの組み合わせである。

ＨＡは、ヒアルロン酸誘導体であってよい。ＨＡに行ない得る化学修飾の例は、ＨＡの４つの反応性基、すなわちアセトアミド末端、カルボキシル末端、ヒドロキシル末端、および還元末端と、薬剤との任意の反応を含む。ＨＡ誘導体は、疎水化ヒアルロナン、マレイミド修飾ＨＡ、メタクリル化ヒアルロン酸、または硫酸化ヒアルロン酸を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、ＨＡは、アセトアミド基、カルボキシル基、水酸基、還元末端、またはこれらの組み合わせにおいて修飾される。ＨＡは、疎水化ヒアルロナン、マレイミド修飾ＨＡ、メタクリル化ヒアルロン酸、硫酸化ヒアルロン酸、またはこれらの組み合わせを含み得る。ＨＡは、タンパク質または有機分子を介して共有結合的に架橋されて、より高分子量の部位になり得る。

また、本明細書中にさらに記載されるのは、ＦＧＦＲアゴニストおよびグリコサミノグリカンを投与することを含む方法である。投与は、同じ組成物において行なってもよいし、別個の調製物において行なってもよい。別個の調製物を投与する場合、これらを、有効に同時に（たとえば、同じ処置中に）投与することもできるし、または、少なくとも１時間、１２時間、２４時間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、もしくはそれ以上の間隔をあけて別個に投与することもできる。別個の調製物を投与する場合、これらを、静脈内、皮内、および皮下から選択される同じ経路でまたは異なる経路で投与できる。調製物は、別個であるか１回用であるかにかかわらず、筋肉または軟部組織の損傷部位に直接投与できる。

ＩＧＦ１Ｒアゴニストおよび短い脂肪酸鎖の組み合わせ
特定の態様において、本明細書中において開示されるのは、ＩＧＦ１Ｒアゴニストおよび短い脂肪酸鎖を含む組成物である。ＩＧＦ１Ｒシグナル伝達は、細胞の増殖、細胞の分化、および細胞の生存に関与する経路を含む下流の経路を活性化する。ＩＧＦ１およびＩＧＦ２という２つのＩＧＦリガンドは、ＩＧＦ１Ｒシグナル伝達を活性化する。ＩＧＦ１Ｒシグナル伝達を活性化するさらなるペプチドは、ＩＮＳである。ＩＧＦ１Ｒのその他のアゴニストは、デメチルアステリキノンＢ１、ジンセノサイドＲｇ５、およびヒト抗菌ペプチドＬＬ－３７を含むが、これらに限定されない。ＩＧＦ１Ｒアゴニストは、ＩＧＦ１Ｒアゴニスト性抗体、ＩＧＦポリペプチドもしくはその機能性フラグメント、ＩＧＦ２もしくはその機能性フラグメント、インスリン、デメチルアステリキノンＢ１、ジンセノサイドＲｇ５、ＬＬ－３７、またはこれらの組み合わせを含み得る。こうした組成物は、予想外の相乗効果を含み、筋肉および／または軟部組織の状態または障害の処置に有用である。また、この相乗効果は、ＩＧＦ１Ｒアゴニストおよび短い脂肪酸鎖を別々に投与することを含む方法によって増進され得る。

ＩＧＦ２Ｒアゴニストは、ＩＧＦリガンドであり得る。ＩＧＦ１Ｒアゴニストは、ＩＧＦ２であり得る。ＩＧＦ２ポリペプチドは、配列番号７６との同一性が少なくとも約９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％であり得る。ＩＧＦ２ポリペプチドは、配列番号７６との同一性が１００％であり得る。ＩＧＦ２ポリペプチドは、配列番号８０との同一性が少なくとも約９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％であり得る。ＩＧＦ２ポリペプチドは、配列番号８０との同一性が１００％であり得る。ＩＧＦ２ポリペプチドは、配列番号８１との同一性が少なくとも約９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％であり得る。ＩＧＦ２ポリペプチドは、配列番号８１との同一性が１００％であり得る。

組成物は、ＩＧＦ１Ｒアゴニストおよび短い脂肪酸鎖を含み得る。短い脂肪酸鎖は、ブチレート、フェニル酪酸、バルプロ酸、プロピオン酸、メタン酸、エタン酸、２－メチルプロパン酸、３－メチルブタン酸、ペンタン酸、およびこれらの多量体（トリブチリンなど）を含むが、これらに限定されない。ブチレートは、酪酸、酪酸ナトリウム、酪酸メチル、酪酸エチル、酪酸ブチル、酪酸ペンチル、または酪酸ナトリウムを含むが、これらに限定されない。短鎖脂肪酸は、ブチレートであり得る。ブチレートは、酪酸であり得る。ブチレートは、酪酸ナトリウムであり得る。短鎖脂肪酸は、フェニル酪酸、バルプロ酸、プロピオン酸、メタン酸、エタン酸、２－メチルプロパン酸、３－メチルブタン酸、ペンタン酸、またはこれらの多量体（トリブチリンなど）であり得る。

また、本明細書中にさらに記載されるのは、ＩＧＦ１Ｒアゴニストおよび短い脂肪酸鎖を投与することを含む方法である。投与は、同じ組成物において行なってもよいし、別個の調製物において行なってもよい。別個の調製物を投与する場合、これらを、有効に同時に（たとえば、同じ処置中に）投与することもできるし、または、少なくとも１時間、１２時間、２４時間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、もしくはそれ以上の間隔をあけて別個に投与することもできる。

ＢＭＰ受容体アゴニストおよびｍＴＯＲアクチベーターの組み合わせ
特定の態様において、本明細書中において開示されるのは、ＢＭＰ受容体アゴニストおよびｍＴＯＲアクチベーターを含む組成物である。ＢＭＰ受容体は、ＴＧＦ－ベータ経路を経て下流のシグナル伝達を活性化し、分化、増殖、および遊走を含む多くの細胞機能に関与している。ＢＭＰ受容体には以下の２つのクラスがある：Ｉ型ＢＭＰ（ＡＣＶＲ１、ＢＭＰＲ１Ａ、およびＢＭＰＲ１Ｂ）、およびＩＩ型ＢＭＰ（ＢＭＰ２Ｒ、ＡＣＶＲ２Ａ、およびＡＣＶＲ２Ｂ）。１型ＢＭＰ受容体はＢＭＰリガンドに排他的に結合し、ＩＩ型ＢＭＰ受容体は、ＢＭＰと、アクチビン、Ｇｄｆ９、およびＧＤｆ１１を含む関連タンパク質とに結合する。ＢＭＰ受容体アゴニストは、ＡＣＶＲ１アゴニスト、ＢＭＰＲ１Ａアゴニスト、ＢＭＰＲ１Ｂアゴニスト、ＢＭＰ２Ｒアゴニスト、ＡＣＶＲ２Ａアゴニスト、ＡＣＶＲ２Ｂアゴニスト、またはこれらの組み合わせを含み得る。ＢＭＰ受容体アゴニストは、ＡＣＶＲ１アゴニスト、ＡＣＶＲ２Ａアゴニスト、ＡＣＶＲ２Ｂアゴニスト、ＢＭＰＲ１Ａアゴニスト、またはこれらの組み合わせを含み得る。ＢＭＰ受容体は、ＡＣＶＲ１アゴニストを含み得る。ＢＭＰ受容体アゴニストは、ＡＣＶＲ２Ａアゴニストを含み得る。ＢＭＰ受容体は、ＡＣＲＶ２Ｂアゴニストを含み得る。ＢＭＰ受容体は、ＢＭＰＲ１Ａアゴニストを含み得る。ＢＭＰ受容体アゴニストは、ＡＣＶＲ１アゴニスト抗体、ＢＭＰＲ１Ａアゴニスト抗体、ＢＭＰＲ１Ｂアゴニスト抗体、ＢＭＰ２Ｒアゴニスト抗体、ＡＣＶＲ２Ａアゴニスト抗体抗体、ＡＣＶＲ２Ｂアゴニスト抗体抗体、ＢＭＰポリペプチドもしくはその機能性フラグメント、ＢＭＰ７もしくはその機能性フラグメント、ベントロモルフィン（ｖｅｎｔｒｏｍｏｒｐｈｉｎ）、ＳＢ４、タクロリムス、イソリキリチゲニン、アラントラクトン、ＰＤ４０７８２４、またはこれらの組み合わせを含み得る。こうした組成物は、予想外の相乗効果を含み、筋肉および／または軟部組織の状態または障害の処置に有用である。また、この相乗効果は、ＢＭＰ受容体アゴニスト抗体およびロイシンを別々に投与することを含む方法によって増進され得る。

ＢＭＰ７ポリペプチドは、配列番号８９との同一性が少なくとも約９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％であり得る。ＢＭＰ７ポリペプチドは、配列番号８９との同一性が１００％であり得る。ＢＭＰ７ポリペプチドは、配列番号９０との同一性が少なくとも約９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％であり得る。ＢＭＰ７ポリペプチドは、配列番号９０との同一性が１００％であり得る。ＢＭＰ７ポリペプチドは、配列番号９１との同一性が少なくとも約９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％であり得る。ＢＭＰ７ポリペプチドは、配列番号９１との同一性が１００％であり得る。ＢＭＰ７ポリペプチドは、配列番号９３との同一性が少なくとも約９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％であり得る。ＢＭＰ７ポリペプチドは、配列番号９３との同一性が１００％であり得る。

哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（ｍａｍｍａｌｉａｎ ｔａｒｇｅｔ ｏｆ ｒａｐａｍｙｃｉｎ；ｍＴＯＲ）経路は、骨格筋の量および増殖を調節する重要なレギュレーターである。ｍＴＯＲは、細胞の増殖、分化、オートファジー、生存、および代謝を含む様々な細胞プロセスに関与するセリン／トレオニンキナーゼである。ｍＴＯＲＣ１複合体を経るｍＴＯＲ活性化は、筋原線維筋肉タンパク質合成と骨格筋肥大との両方に必要とされる。ｍＴＯＲＣ１複合体の不活性化は、高齢による筋肉消耗、悪液質、および身体活動による萎縮における筋肉量および筋肉構造（ｍｕｓｃｌｅ ｓｔｒｕｃｔ）の減少との関連が見いだされている。

ｍＴＯＲシグナル伝達経路は、アミノ酸、ポリペプチド、および小分子を含む多くの異なるシグナルによって活性化され得る。ｍＴＯＲアクチベーターは、アミノ酸であり得る。アミノ酸は、ロイシン、バリン、イソロイシン、またはこれらの組み合わせであり得る。アミノ酸は、ロイシンであり得る。ｍＴＯＲアクチベーターは、ポリペプチドであり得る。ポリペプチドは、脳に豊富なＲａｓホモログ（Ｒａｓ ｈｏｍｏｌｏｇ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｉｎ ｂｒａｉｎ；Ｒｈｅｂ）、結節性硬化症（ｔｕｂｅｒｏｕｓ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ｃｏｍｐｌｅｘ；ＴＳＣ）、プロテインキナーゼＢ（ＰＫＢ）、細胞外シグナル制御キナーゼ１／２（ＥＲＫ１／２）、ｐ９０リボソームｓ６キナーゼ１（ＲＳＫ１）、Ｗｎｔリガンド、またはこれらの組み合わせを含み得る。ｍＴＯＲアクチベーターは、小分子であり得る。ｍＴＯＲアクチベーターは、ＭＨＹ１４８５、ＮＶ－５１３８、３－ベンジル－５－（（２－ニトロフェノキシ）メチル）－ジヒドロフラン－２（３Ｈ）－オン（３ＢＤＯ）、またはこれらの組み合わせを含み得る。ｍＴＯＲアクチベーターは、ロイシン、バリン、イソロイシン、脳に豊富なＲａｓホモログ（Ｒｈｅｂ）、結節性硬化症（ＴＳＣ）、プロテインキナーゼＢ（ＰＫＢ）、細胞外シグナル制御キナーゼ１／２（ＥＲＫ１／２）、ｐ９０リボソームｓ６キナーゼ１（ＲＳＫ１）、Ｗｎｔリガンド、ＭＨＹ１４８５、ＮＶ－５１３８、３－ベンジル－５－（（２－ニトロフェノキシ）メチル）－ジヒドロフラン－２（３Ｈ）－オン（３ＢＤＯ）、またはこれらの組み合わせを含み得る。

ｍＴＯＲアクチベーターは、ロイシンを含み得る。アミノ酸ロイシンは、骨格筋中におけるｍＴＯＲシグナル伝達の重要な一部である。ロイシンは、人間の飲食物に必須の分枝鎖アミノ酸である。ヒトタンパク質において最も一般的なアミノ酸であり、アミノ酸１０個につき１個に近い頻度で含まれる（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ ｒｅｌｅａｓｅ ２０１３＿０４－２０１３年４月）。このアミノ酸の循環濃度および細胞内濃度は、細胞分裂、タンパク質合成、およびオートファジーなどの主要な同化プロセスおよび異化プロセスを制御するフィードバック機構の一部として監視および厳重制御されている。ロイシンの調節効果の一部にはｍＴＯＲＣ１複合体が介在しており、後者の活性化によるタンパク質合成および細胞周期進行の駆動は、一部、細胞内ロイシン濃度によって駆動されている。ＢＭＰ受容体アゴニスト抗体とロイシンまたは別の分枝鎖アミノ酸との組み合わせは、相乗的な分裂促進活性を示す。

合成ロイシン誘導体が使用され得る。ロイシンは、ｌ－ロイシン、グリシル－ｌ－ロイシン、アセチル－ｌ－ロイシン、ｌ－ロイシンエチルエステル、およびｌ－ロイシンメチルエステル、カプロン酸、フタロイル－ｌ－ロイシン、ベンゾイル－ｄｌ－ロイシン、またはこれらの組み合わせを含み得る。ロイシンは、塩であり得る。ロイシンは、ｌ－ロイセニウムマレイン酸水素（ｌ－ｌｅｕｃｅｎｉｕｍ ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｍａｌｅａｔｅ）、ロイシン塩酸塩、またはこれらの組み合わせを含み得る。

また、本明細書中にさらに記載されるのは、ＢＭＰ受容体アゴニスト抗体およびｍＴＯＲアクチベーターを投与することを含む方法である。投与は、同じ組成物において行なってもよいし、別個の調製物において行なってもよい。別個の調製物を投与する場合、これらを、有効に同時に（たとえば、同じ処置中に）投与することもできるし、または、少なくとも１時間、１２時間、２４時間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、もしくはそれ以上の間隔をあけて別個に投与することもできる。

治療適応
特定の態様において、本明細書中に記載される、ＦＧＦ８サブファミリーアミノ酸配列および異種ポリペプチドを含む融合ポリペプチド、ＦＧＦＲアゴニストおよびグリコサミノグリカンを含む組成物、ならびに方法は、軟部組織の損傷、分解、もしくは破壊を伴う疾患および障害の処置にとって、または、老化障害、筋肉消耗障害、筋損傷、結合組織の損傷、もしくは非筋肉軟部組織の損傷、もしくはこれらの任意の組み合わせを有する個体の処置における使用にとって有用である。

特定の態様において、本明細書中に記載される、ＩＧＦリガンドアミノ酸配列および異種ポリペプチドを含む融合ポリペプチド、ＩＧＦ１Ｒアゴニストおよび短い脂肪酸鎖を含む組成物、ならびに方法は、軟部組織の損傷、分解、または破壊を伴う疾患および障害の処置にとって、または、老化障害、筋肉消耗障害、筋損傷、結合組織の損傷、もしくは非筋肉軟部組織の損傷、もしくはこれらの任意の組み合わせを有する個体の処置における使用にとって有用である。

特定の態様において、本明細書中に記載される、ＢＭＰ７アミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、ＢＭＰ受容体アゴニストおよびグリコサミノグリカンを含む組成物、ＢＭＰ受容体アゴニストおよびｍＴＯＲアクチベーターを含む組成物、ならびに方法は、軟部組織の損傷、分解、または破壊を伴う疾患および障害の処置にとって、または、老化障害、筋肉消耗障害、筋損傷、結合組織の損傷、もしくは非筋肉軟部組織の損傷、もしくはこれらの任意の組み合わせを有する個体の処置における使用にとって有用である。

筋組織の劣化および減少を導く老化障害は、以下のような障害である。たとえば、サルコペニアは、骨格筋の量質および強さの進行的な減少であって、老化との関連があり得る。急性の筋肉傷害を導く損傷はそれ以外の筋肉障害であって、これらは、本明細書中において記載されるポリペプチド、組成物、および方法によって処置可能である。当該障害は、筋断裂、肉離れ（ｓｔｒａｉｎ）、および挫傷（ｃｏｎｔｕｓｉｏｎ）を含む。断裂は、筋組織の分離である。筋肉の肉離れ（ｓｔｒａｉｎ）は、収縮によって引き起こされる損傷で、大きなメカニカルストレスのために筋線維が裂けるものであり、グレードＩ、ＩＩ、またはＩＩＩに分類され得る。筋肉の挫傷（ｃｏｎｔｕｓｉｏｎ）は、筋肉の血腫である。また、筋損傷は、悪液質など、メカニカルストレス以外のストレスによっても生じる。悪液質は、栄養不良、がん、ＡＩＤＳ、セリアック病、慢性阻塞性肺疾病、多発性硬化、関節リウマチ、鬱血性心不全、結核、家族性アミロイド多発ニューロパチー、水銀中毒（肢端疼痛症）、クローン病、未処置／重症の１型糖尿病、神経性食欲不振症、化学療法、筋ジストロフィーまたは不動を引き起こすその他の遺伝性疾患、およびホルモン欠乏症によって引き起こされ得る。また、特定の筋肉の低下である嚥下障害または顔面肩甲上腕型筋ジストロフィーなどの特定の障害も、本明細書中において記載されるポリペプチドによって処置し得る。本明細書中において記載されるＦＧＦ８サブファミリーアミノ酸配列を含むポリペプチドならびに／またはＦＧＦＲアゴニストおよびグリコサミノグリカンを含む組成物を使用して処置し得るさらなる軟部組織障害は、腱、靱帯、または軟骨に損傷を与えるものである。本明細書中において記載されるＩＧＦリガンドアミノ酸配列を含むポリペプチドならびにＩＧＦ１Ｒアゴニストおよび短い脂肪酸鎖を含む組成物を使用して処置し得るさらなる軟部組織障害は、腱、靱帯、または軟骨に損傷を与えるものである。本明細書中に記載されるＢＭＰ７アミノ酸配列を含む融合ポリペプチド、ＢＭＰ受容体アゴニストおよびグリコサミノグリカンを含む組成物、ならびに方法を使用して処置し得るさらなる軟部組織障害は、腱、靱帯、または軟骨に損傷を与えるものである。

筋肉消耗疾患は、筋ジストロフィーであり得る。筋ジストロフィーは、筋強直性筋ジストロフィー、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィー、眼咽頭型筋ジストロフィー、または遠位型筋ジストロフィーを含み得る。筋ジストロフィーは、筋強直性ジストロフィーであり得る。

老化障害は、サルコペニアであり得る。筋肉消耗障害は、悪液質であり得る。悪液質は、がん、ＡＩＤＳ、末期腎疾患、または心血管疾患の結果として生じ得る。損傷は、筋損傷であり得る。筋肉消耗は、手足の固定または廃用による萎縮であり得る。筋損傷は、肉離れ（ｓｔｒａｉｎ）または裂傷であり得る。筋損傷は、グレードＩＩＩの肉離れ（ｓｔｒａｉｎ）であり得る。サルコペニアは、筋損傷発生の一因となり得る。損傷は、靱帯傷害であり得る。靱帯傷害は、断裂または裂傷であり得る。損傷は、腱傷害であり得る。腱傷害は、断裂または裂傷であり得る。損傷は、軟骨傷害であり得る。

本明細書中に記載される組成物は、筋炎を処置する方法において使用するためのものである。筋炎は、皮膚筋炎、多発性筋炎、壊死性ミオパチー（壊死性自己免疫ミオパチーまたは免疫介在性壊死性ミオパチーともよばれる）、若年性筋炎、または孤発性封入体筋炎を含み得る。

本明細書中において記載される組成物は、軟骨関連障害を処置する方法において使用するためのものであり得る。軟骨関連障害は、裂傷、損傷、または摩耗によるものであり得る。軟骨関連疾患は、変形性関節症、離断性骨軟骨炎、軟骨無形成症、または変性性軟骨損傷であり得る。

本明細書中において記載される組成物は、軟部組織傷害に関連する細胞の増殖を増大させるまたはその生存を増進させる方法において使用するためのものであり得る。本明細書中において記載される、ＩＧＦリガンドアミノ酸配列を含むポリペプチド、ならびにＩＧＦ１Ｒアゴニストおよび短い脂肪酸鎖を含む組成物は、筋細胞、筋肉前駆細胞、腱細胞、腱細胞前駆細胞、軟骨細胞、軟骨細胞前駆細胞、間葉系幹細胞、または線維芽細胞のうちの任意の１種以上の増殖を増大させるまたはその生存を増進させる方法において有用であり得る。

筋線維症は、コラーゲンを含む細胞外マトリックス成分の過剰な蓄積である。筋線維症は、筋肉の機能を低下させ、損傷後の筋肉再生に悪影響を及ぼし、筋肉の再損傷を生じやすくさせる。本明細書中において記載される組成物は、筋線維症を緩和する方法において使用するためのものであり得る。線維症は、老化、筋ジストロフィー、または損傷と関連づけられ得る。ＩＧＦリガンドは、ＩＧＦ２であり得る。

筋芽細胞は、成熟筋細胞に分化するためには、融合して多核細胞を形成しなければならない。特定の実施形態において、本明細書中において記載される、ＩＧＦリガンドアミノ酸配列および異種ポリペプチドを含む融合ポリペプチド、ＩＧＦ１Ｒアゴニストおよび短い脂肪酸鎖を含む組成物、ならびに方法は、筋芽細胞の融合を増大させる方法において使用するためのものである。ＩＧＦリガンドは、ＩＧＦ２であり得る。

本明細書中において記載される、ＩＧＦリガンドアミノ酸配列および異種ポリペプチドを含む融合ポリペプチド、ＩＧＦ１Ｒアゴニストおよび短い脂肪酸鎖を含む組成物、ならびに方法は、筋肉量を増大させる方法において使用するためのものであり得る。筋肉量は、少なくとも約１％、２．５％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、または５０％を超えて増大し得る。ＩＧＦリガンドは、ＩＧＦ２であり得る。

本明細書中において記載される、ＩＧＦリガンドアミノ酸配列および異種ポリペプチドを含む融合ポリペプチド、ＩＧＦ１Ｒアゴニストおよび短い脂肪酸鎖を含む組成物、ならびに方法は、握力を増大させる方法において使用するためのものであり得る。握力は、少なくとも約１％、２．５％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、または５０％を超えて増大し得る。ＩＧＦリガンドはＩＧＦ２であり得る。

本明細書中において記載される、ＩＧＦリガンドアミノ酸配列および異種ポリペプチドを含む融合ポリペプチド、ＩＧＦ１Ｒアゴニストおよび短い脂肪酸鎖を含む組成物、ならびに方法は、筋肉の持久力を増大させる方法において使用するためのものであり得る。筋肉の持久力は、少なくとも約１％、２．５％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、または５０％を超えて増大し得る。ＩＧＦリガンドは、ＩＧＦ２であり得る。

処置の方法
特定の態様において、本明細書中において開示されるのは、障害を有する個体を処置する方法であって、当該障害を有する個体に、ＦＧＦＲアゴニストおよびグリコサミノグリカンを投与することを含む方法である。ＦＧＦＲアゴニストおよびグリコサミノグリカンは、別個の調製物において投与できる。ＦＧＦＲアゴニストおよびグリコサミノグリカンは、同時に投与できる。ＦＧＦＲアゴニストおよびグリコサミノグリカンは、異なる時に投与できる。グリコサミノグリカンは、ヘパリンであり得る。グリコサミノグリカンは、ヒアルロン酸であり得る。

特定の態様において、本明細書中において開示されるのは、障害を有する個体を処置する方法であって、当該障害を有する個体に、ＦＧＦＲ１アゴニストおよびグリコサミノグリカンを投与することを含む方法である。ＦＧＦＲ１アゴニストおよびグリコサミノグリカン（たとえば、ヘパリン）は、別個の調製物において投与できる。ＦＧＦＲ１アゴニストおよびグリコサミノグリカン（たとえば、ヘパリン）は、同時に投与できる。ＦＧＦＲ１アゴニストおよびグリコサミノグリカン（たとえば、ヘパリン）は、異なる時に投与できる。グリコサミノグリカンは、ヘパリンであり得る。グリコサミノグリカンは、ヒアルロン酸であり得る。

特定の態様において、本明細書中において開示されるのは、障害を有する個体を処置する方法であって、当該障害を有する個体に、ＦＧＦ８サブファミリーアミノ酸配列を含むポリペプチドおよびグリコサミノグリカン（たとえば、ヘパリン）またはグリコサミノグリカンを含む化合物もしくは混合物を投与することを含む方法である。ＦＧＦ８サブファミリーアミノ酸配列を含むポリペプチドおよびグリコサミノグリカン（たとえば、ヘパリン）は、別個の調製物において投与できる。ＦＧＦ８サブファミリーアミノ酸配列を含むポリペプチドおよびグリコサミノグリカン（たとえば、ヘパリン）は、同時に投与できる。ＦＧＦ８サブファミリーアミノ酸配列を含むポリペプチドおよびグリコサミノグリカン（たとえば、ヘパリン）は、異なる時に投与できる。グリコサミノグリカンは、ヒアルロン酸であり得る。

特定の態様において、本明細書中において開示されるのは、障害を有する個体を処置する方法であって、当該障害を有する個体に、ＦＧＦ１７アミノ酸配列を含むポリペプチドおよびグリコサミノグリカン（たとえば、ヘパリン）またはグリコサミノグリカンを含む化合物もしくは混合物を投与することを含む方法である。ＦＧＦ１７アミノ酸配列を含むポリペプチドおよびグリコサミノグリカン（たとえば、ヘパリン）は、別個の調製物において投与できる。ＦＧＦ１７アミノ酸配列を含むポリペプチドおよびグリコサミノグリカン（たとえば、ヘパリン）は、同時に投与できる。ＦＧＦ１７アミノ酸配列およびグリコサミノグリカンを含むポリペプチドは、異なる時に投与できる。グリコサミノグリカンは、ヒアルロン酸であり得る。

特定の態様において、本明細書中において開示されるのは、障害を有する個体を処置する方法であって、ＦＧＦ８サブファミリーアミノ酸配列を含むポリペプチドを投与することを含む方法である。ポリペプチドは、ＦＧＦ１７アミノ酸配列を含み得る。ポリペプチドは、ＦＧＦ１７融合タンパク質を含み得る。

特定の態様において、本明細書中において開示されるのは、障害を有する個体を処置する方法であって、当該個体にＩＧＦ１Ｒアゴニストおよび短い脂肪酸鎖（たとえば、ブチレート）を投与することを含む方法である。ＩＧＦ１Ｒアゴニストおよび短い脂肪酸鎖（たとえば、ブチレート）は、別個の調製物において投与できる。ＩＧＦ１Ｒアゴニストおよび短い脂肪酸鎖（たとえば、ブチレート）は、同時に投与できる。ＩＧＦ１Ｒアゴニストおよび短い脂肪酸鎖（たとえば、ブチレート）は、異なる時に投与できる。

特定の態様において、本明細書中において開示されるのは、障害を有する個体を処置する方法であって、当該障害を有する個体に、ＩＧＦリガンドアミノ酸配列を含むポリペプチドおよびブチレートを投与することを含む方法である。ＩＧＦリガンドアミノ酸配列を含むポリペプチドおよびブチレートは、別個の調製物において投与できる。ＩＧＦリガンドアミノ酸配列を含むポリペプチドおよびブチレートは、同時に投与できる。ＩＧＦリガンドアミノ酸配列を含むポリペプチドおよびブチレートは、異なる時に投与できる。

特定の態様において、本明細書中において開示されるのは、障害を有する個体を処置する方法であって、当該障害を有する個体に、ＩＧＦ２アミノ酸配列を含むポリペプチドおよび短い脂肪酸鎖（たとえば、ブチレート）を投与することを含む方法である。ＩＧＦリガンドアミノ酸配列を含むポリペプチドおよび短い脂肪酸鎖（たとえば、ブチレート）は、別個の調製物において投与できる。ＩＧＦ２アミノ酸配列を含むポリペプチドおよび短い脂肪酸鎖（たとえば、ブチレート）は、同時に投与できる。ＩＧＦ２アミノ酸配列を含むポリペプチドおよび短い脂肪酸鎖（たとえば、ブチレート）は、異なる時に投与できる。

特定の態様において、本明細書中において開示されるのは、障害を有する個体を処置する方法であって、当該障害を有する個体に、ＢＭＰ受容体アゴニストおよびグリコサミノグリカンを投与することを含む方法である。ＢＭＰ受容体アゴニストおよびグリコサミノグリカンは、別個の調製物において投与できる。ＢＭＰ受容体アゴニストおよびグリコサミノグリカンは、同時に投与できる。ＢＭＰ受容体アゴニストおよびグリコサミノグリカンは、異なる時に投与できる。グリコサミノグリカンは、ヘパリンであり得る。グリコサミノグリカンは、ヒアルロン酸であり得る。

特定の態様において、本明細書中において開示されるのは、障害を有する個体を処置する方法であって、当該障害を有する個体に、ＢＭＰ７アミノ酸配列を含むポリペプチドおよびヒアルロン酸またはヒアルロン酸を含む化合物もしくは混合物を投与することを含む方法である。ＢＭＰ７アミノ酸配列を含むポリペプチドおよびヒアルロン酸は、別個の調製物において投与される。いくつかの実施形態において、ＢＭＰ７アミノ酸配列を含むポリペプチドおよびヒアルロン酸は、同時に投与される。いくつかの実施形態において、ＢＭＰ７アミノ酸配列を含むポリペプチドおよびヒアルロン酸は、異なる時に投与される。

特定の態様において、本明細書中において開示されるのは、障害を有する個体を処置する方法であって、当該障害を有する個体に、ＢＭＰ７アミノ酸配列を含むポリペプチドおよびヘパリンまたはヘパリンを含む化合物もしくは混合物を投与することを含む方法である。いくつかの実施形態において、ＢＭＰ７アミノ酸配列を含むポリペプチドおよびヘパリンは、別個の調製物において投与される。いくつかの実施形態において、ＢＭＰ７アミノ酸配列を含むポリペプチドおよびヘパリンは、同時に投与される。いくつかの実施形態において、ＢＭＰ７アミノ酸配列を含むポリペプチドおよびヘパリンは、異なる時に投与される。

特定の態様において、本明細書中において開示されるのは、障害を有する個体を処置する方法であって、当該障害を有する個体に、ＢＭＰ受容体アゴニストおよびｍＴＯＲアクチベーターを投与することを含む方法である。いくつかの実施形態において、ＢＭＰ受容体アゴニストおよびｍＴＯＲアクチベーターは、別個の調製物において投与される。いくつかの実施形態において、ＢＭＰ受容体アゴニストおよびｍＴＯＲアクチベーターは、同時に投与される。いくつかの実施形態において、ＢＭＰ受容体アゴニストおよびｍＴＯＲアクチベーターは、異なる時に投与される。特定の実施形態において、ｍＴＯＲアクチベーターはロイシンである。

特定の態様において、本明細書中において開示されるのは、障害を有する個体を処置する方法であって、当該障害を有する個体に、ＢＭＰ７アミノ酸配列を含むポリペプチドおよびロイシンまたはロイシンを含む化合物もしくは混合物を投与することを含む方法である。いくつかの実施形態において、ＢＭＰ７アミノ酸配列を含むポリペプチドおよびロイシンは、別個の調製物において投与される。いくつかの実施形態において、ＢＭＰ７アミノ酸配列を含むポリペプチドおよびロイシンは、同時に投与される。いくつかの実施形態において、ＢＭＰ７アミノ酸配列を含むポリペプチドおよびロイシンは、異なる時に投与される。

特定の態様において、本明細書中において開示されるのは、障害を有する個体を処置する方法であって、当該障害を有する個体に、ＢＭＰ受容体アゴニストおよびグリコサミノグリカンを投与することを含む方法である。いくつかの実施形態において、ＢＭＰ受容体アゴニストおよびグリコサミノグリカンは、別個の調製物において投与される。いくつかの実施形態において、ＢＭＰ受容体アゴニストおよびグリコサミノグリカンは、同時に投与される。いくつかの実施形態において、ＢＭＰ受容体アゴニストおよびグリコサミノグリカンは、異なる時に投与される。特定の実施形態において、グリコサミノグリカンはヘパリンである。特定の実施形態において、グリコサミノグリカンはヒアルロン酸である。

特定の態様において、本明細書中において開示されるのは、障害を有する個体を処置する方法であって、当該障害を有する個体に、ＢＭＰ７アミノ酸配列を含むポリペプチドおよびグリコサミノグリカン（たとえば、ヘパリンまたはヒアルロン酸）またはグリコサミノグリカン（たとえば、ヘパリンまたはヒアルロン酸）を含む化合物もしくは混合物を投与することを含む方法である。いくつかの実施形態において、ＢＭＰ７アミノ酸配列を含むポリペプチドおよびグリコサミノグリカン（たとえば、ヘパリンまたはヒアルロン酸）は、別個の調製物において投与される。いくつかの実施形態において、ＢＭＰ７アミノ酸配列を含むポリペプチドおよびグリコサミノグリカン（たとえば、ヘパリンまたはヒアルロン酸）は、同時に投与される。いくつかの実施形態において、ＢＭＰ７アミノ酸配列を含むポリペプチドおよびグリコサミノグリカン（たとえば、ヘパリンまたはヒアルロン酸）は、異なる時に投与される。

処置は、たとえば皮下、静脈内、または筋肉内などの任意の好適な経路で投与できる。特定の実施形態において、処置は、たとえば週１回、週２回、月１回、月２回、３週間に１回、または４週間に１回などの、好適な投薬スケジュールで投与される。処置は、任意の治療的有効量にて投与できる。治療的有効量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇであり得る。治療的有効量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約０．００２ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約０．００５ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約０．０１ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約０．０２ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約０．２ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．００２ｍｇ／ｋｇ～約０．００５ｍｇ／ｋｇ、約０．００２ｍｇ／ｋｇ～約０．０１ｍｇ／ｋｇ、約０．００２ｍｇ／ｋｇ～約０．０２ｍｇ／ｋｇ、約０．００２ｍｇ／ｋｇ～約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．００２ｍｇ／ｋｇ～約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．００２ｍｇ／ｋｇ～約０．２ｍｇ／ｋｇ、約０．００２ｍｇ／ｋｇ～約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．００２ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．００５ｍｇ／ｋｇ～約０．０１ｍｇ／ｋｇ、約０．００５ｍｇ／ｋｇ～約０．０２ｍｇ／ｋｇ、約０．００５ｍｇ／ｋｇ～約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．００５ｍｇ／ｋｇ～約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．００５ｍｇ／ｋｇ～約０．２ｍｇ／ｋｇ、約０．００５ｍｇ／ｋｇ～約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．００５ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約０．０２ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約０．２ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ～約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ～約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ～約０．２ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ～約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ～約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ～約０．２ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ～約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約０．２ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．２ｍｇ／ｋｇ～約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．２ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、または約０．５ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇであり得る。治療的有効量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ、約０．００２ｍｇ／ｋｇ、約０．００５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．２ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、または約１ｍｇ／ｋｇであり得る。治療的有効量は、少なくとも、約０．００１ｍｇ／ｋｇ、約０．００２ｍｇ／ｋｇ、約０．００５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．２ｍｇ／ｋｇ、または約０．５ｍｇ／ｋｇであり得る。治療的有効量は、最大で、約０．００２ｍｇ／ｋｇ、約０．００５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．２ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、または約１ｍｇ／ｋｇであり得る。治療的有効量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇであり得る。治療的有効量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約０．２ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約２ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約２０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．２ｍｇ／ｋｇ～約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．２ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．２ｍｇ／ｋｇ～約２ｍｇ／ｋｇ、約０．２ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約０．２ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．２ｍｇ／ｋｇ～約２０ｍｇ／ｋｇ、約０．２ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ～約２ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ～約２０ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ～約２ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ～約２０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ～約２０ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ～約２０ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ～約２０ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ、または約２０ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇであり得る。治療的有効量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．２ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ、または約５０ｍｇ／ｋｇであり得る。治療的有効量は、少なくとも、約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．２ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、または約２０ｍｇ／ｋｇであり得る。治療的有効量は、最大で、約０．２ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ、または約５０ｍｇ／ｋｇであり得る。

処置される個体は、哺乳動物であり得る。哺乳動物は、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ラマ、アルパカ、またはヤクであり得る。個体は、イヌ、ネコ、またはウマであり得る。処置される個体は、ヒトであり得る。

製造方法
ＦＧＦ１７、ＩＧＦ、またはＢＭＰ７リガンドアミノ酸配列を含むポリペプチドは、任意の好適な手法で精製または合成できる。ポリペプチドをコードする核酸を好適なベクター中にクローニングして、好適な細胞系において発現させることができる。細胞系は、原核細胞系であり得る。細胞系は、真核細胞系であり得る。細胞系は、哺乳動物細胞系であり得る。ポリペプチドは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ ｃｏｌｉ）から発現させ得る。ポリペプチドは、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、クルイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、またはヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）を含むがこれらに限定されない酵母細胞から発現させ得る。ポリペプチドは、ＮＳ０、Ｓｐ２／０、およびＦＯを含むがこれらに限定されないマウス骨髄腫細胞から発現させ得る。ポリペプチドは、チャイニーズハムスター卵巣（Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ；ＣＨＯ）細胞から発現させ得る。ポリペプチドは、ＣＯＳ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、またはＢＨＫ細胞を含むがこれらに限定されない哺乳動物細胞によって発現させ得る。ポリペプチドは、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ－２９３細胞、ＣＡＰ細胞、ＣＡＰ－Ｔ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞を含むがこれらに限定されないヒト細胞から発現させ得る。

このような発現系からの上清を、遠心分離、超遠心、ろ過、透析ろ過、タンジェンシャルフローろ過、透析、クロマトグラフィー（たとえば、陽イオン交換、イオン交換、疎水性相互作用、逆相、アフィニティ、またはサイズ排除）を伴う１つ以上の精製工程に供することができる。ポリペプチドは、ヒトへの投与にとって適切な程度まで精製できる。さらに、ポリペプチドは、ヒト個体に投与される調製物中に封入するために合成できる。ポリペプチドは、固相合成などの好適なペプチド合成方法によって製造できる。

哺乳動物発現ベクターｐｍａｘ Ｃｌｏｎｉｎｇを使用して、Ｃ末端に６ｘＨｉｓタグ、ＳｔｒｅｐＩＩタグ、およびヒトＩｇＧ１ Ｆｃタグをつけたベクターを作製できる。分泌筋原性因子をコードするＤＮＡフラグメントを、ＰＣＲによって、ヒトオープンリーディングフレーム（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ；ＯＲＦ）クローンから増幅し、続いて、タグをつけたベクター中に、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎクローニング技術（タカラバイオ社）によって挿入する。分泌筋原性因子を持つ発現ベクターを、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ＣＨＯトランスフェクションキット（サーモサイエンティフィック）を使用して、ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ細胞中に、１ｍｌあたり６×１０^６個の密度にて、一過性トランスフェクションする。

培養上清中の、異なるタグをつけて発現させた筋原性因子を、異なる精製用培地を使用して、アフィニティ精製する。ポリペプチドは、Ｆｃ領域を含み得る。こうしたポリペプチドに対して、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、タンパク質Ｌ、またはこれらの任意の組み合わせを含むマトリックスまたは樹脂を使用できる。このマトリックスまたは樹脂をカラム上に適切に載せることによって、バッチ精製を容易にすることができる。

免疫グロブリン融合タンパク質の精製
異種配列は、免疫グロブリンまたはそのフラグメントを含み得る。ポリペプチドが免疫グロブリンまたはそのフラグメントを含む場合、ポリペプチドをタンパク質Ａ、Ｇ、またはＬの親和性を用いて精製し得る。タンパク質ＡおよびＧは、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）において見いだされる細胞表面タンパク質である。これらは、哺乳動物抗体、特にＩｇＧクラスの抗体のＦｃ領域に結合する特性を有する。タンパク質ＡまたはＧアフィニティクロマトグラフィーにおいて使用するために、架橋非荷電アガロース（セファロース；天然アガロースから荷電画分を除いたもの）、トリスアクリル（ｔｒｉｓａｃｒｙｌ）、架橋デキストラン、またはシリカに基づく材料などの固体マトリックスに、タンパク質ＡまたはＧを結合させる。そのための方法は、当技術分野において広く周知されている（たとえば、タンパク質の第１級アミノ機能を介したＣＮＢｒ活性化マトリックスへの結合）。以前にＬａｎｇｏｎｅら（１９８２）により記載されるように、タンパク質Ａは、高い親和性と高い特異性で、ＩｇＧのＦｃ部分（すなわち、ＩｇＧのＣγ２－Ｃγ３界面領域）に結合する。これは、特に、ヒトのアロタイプまたはサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびマウスのアロタイプまたはサブクラスＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３に強く結合する。

タンパク質Ａ、Ｇ、またはＬによる精製後、結合した画分を、さらなる樹脂またはマトリックスを含む１つ以上のイオン交換カラムを通して、またはこれを通させて、溶出および通過させることができる。第１のイオン交換体は、一般的に、陰イオン交換樹脂である。第１のイオン交換体にローディングして流すために使用するバッファーのｐＨは、Ｆｃ含有融合ポリペプチドおよびタンパク質ＡのｐＩを考慮に入れて、本発明に従ってフロースルーモードにおいてイオン交換体を使って分離するＦｃ含有融合ポリペプチドとタンパク質Ａとに、相反する総電荷（ｏｐｐｏｓｉｎｇ ｔｏｔａｌ ｃｈａｎｇｅ）を課するように設定する。本発明に係る第１の陰イオン交換体の動作モードには、タンパク質Ａアフィニティクロマトグラフィー工程からの酸性または中性の溶出液を、第１の陰イオン交換体の平衡バッファーでバッファー交換することが必要である。第１の陰イオン交換体に供した後は、Ｆｃ含有融合ポリペプチドをアプライに使用できる、または、慣習的な精製方法によるさらなる精製が必要とみなされる場合もある。さらに好ましい一実施形態において、第１のイオン交換工程に続いて第２のイオン交換工程が行なわれ、この第２の工程では、第２のイオン交換媒体によって抗体をローディングおよび結合させ、ローディングバッファー以外のバッファーを用いて、塩および／またはｐＨを増大させることにより、本質的にモノマー状かつ非凝集状の抗体として溶出させる。

本明細書中において開示される方法において、第１のイオン交換体上にローディングしたＦｃ含有融合ポリペプチドの少なくとも７０％、８０％、または９０％を、当該イオン交換体のフロースルー中に回収できる。

マスターセルバンクおよび遺伝子組換え細胞
本明細書中に記載されるのは、遺伝子組換え細胞株創製のために１つ以上のＩＧＦリガンドまたはＩＧＦ２融合ポリペプチドをコードする核酸をそのゲノム中に組み込んで含む細胞を含み得るマスターセルバンクである。マスターセルバンクは、ＩＧＦリガンドまたはＩＧＦ２融合ポリペプチドをコードする核酸をそれぞれ含む複数の細胞を含み得る。核酸は、染色体外において、プラスミドまたは酵母人工染色体上に維持され得る。核酸は、染色体上の位置に組み込まれ得る。細胞は、酵母細胞であり得る。酵母は、ピキア・パストリスまたはサッカロミセス・セレビシエであり得る。細胞は、哺乳動物細胞であり得る。哺乳動物細胞は、２９３Ｔ細胞またはその派生物（たとえば、２９３Ｔ－Ｒｅｘ）であり得る。細胞は、細菌細胞であり得る。

遺伝子組換えされた哺乳動物、酵母、または細菌の細胞は、少なくとも約－８０°またはそれ未満に凍結するのに好適な凍結保存剤（ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅ）を含むマスターセルバンクであり得る。マスターセルバンクは、グリセリンまたはＤＭＳＯを約１０～約３０％含み得て、約－８０°またはそれ未満における長期保存に好適であり得る。マスターセルバンクは、遺伝子組換えされた哺乳動物、酵母、または細菌の株を、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０年間、またはそれよりも長く保存できる。

医薬的に許容される賦形剤、担体、および希釈剤
本明細書中において記載される、ＦＧＦ１７、ＩＧＦ２、もしくはＢＭＰ７アミノ酸配列と異種ポリペプチドからのアミノ酸配列とを含むポリペプチド、または、線維芽細胞増殖因子受容体アゴニストおよびグリコサミノグリカン、インスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ１Ｒ）アゴニストおよび短鎖脂肪酸、ならびにＢＭＰ受容体アゴニストおよびｍＴＯＲアクチベーターおよび／もしくはグリコサミノグリカンの組み合わせは、１種以上の医薬的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤を含む医薬組成物において投与できる。正確な成分は、好ましい投与経路に基づいて異なり得る。医薬組成物中において使用される賦形剤は、特定の投与経路（たとえば、静脈内、局所、皮下、または筋肉内）を意図したポリペプチドの好適化、ポリペプチドの安定性の増大、目的の組織（たとえば、筋肉または皮膚）の浸透の増大、特定の部位における滞留時間の増大、溶解度の増大、ポリペプチドの有効性の増大、および／または投与と同時に起こる炎症反応の低減によって、さらなる機能をポリペプチドに提供し得る。

組成物は、可溶化剤、乳化剤、または分散剤と共に医薬組成物中に含まれ得る。可溶化剤は、少なくとも約２ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、１５ｍｇ／ｍＬ、または２０ｍｇ／ｍＬを超える高濃度の融合ポリペプチド溶液を実現することができる。水性医薬組成物中におけるカルボマーは、乳化剤および粘度調節剤としての役割を果たす。医薬的に許容される賦形剤は、カルボマーを含み得る、またはこれからなり得る。カルボマーは、カルボマー９１０、カルボマー９３４、カルボマー９３４Ｐ、カルボマー９４０、カルボマー９４１、カルボマー１３４２、もしくはこれらの組み合わせを含み得る、またはこれらからなり得る。水性医薬組成物中におけるシクロデキストリンは、可溶化剤および安定化剤としての役割を果たす。医薬的に許容される賦形剤は、シクロデキストリンを含み得る、またはこれからなり得る。シクロデキストリンは、アルファシクロデキストリン、ベータシクロデキストリン、ガンマシクロデキストリン、もしくはこれらの組み合わせを含み得る、またはこれらからなり得る。医薬組成物中におけるレシチンは、可溶化剤としての役割を果たし得る。可溶化剤は、レシチンを含み得る、またはこれからなり得る。医薬組成物中におけるポロキサマーは、乳化剤、可溶化剤、および分散剤としての役割を果たす。医薬的に許容される賦形剤は、ポロキサマーを含み得る、またはこれからなり得る。ポロキサマーは、ポロキサマー１２４、ポロキサマー１８８、ポロキサマー２３７、ポロキサマー３３８、ポロキサマー４０７、もしくはこれらの組み合わせを含み得る、またはこれらからなり得る。医薬組成物中におけるポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルは、乳化剤、可溶化剤、界面活性剤、および分散剤としての役割を果たす。医薬的に許容される賦形剤は、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルを含み得る、またはこれからなり得る。ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルは、ポリソルベート２０、ポリソルベート２１、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート６１、ポリソルベート６５、ポリソルベート８０、ポリソルベート８１、ポリソルベート８５、ポリソルベート１２０、もしくはこれらの組み合わせを含み得る、またはこれらからなり得る。医薬組成物中におけるステアリン酸ポリオキシエチレンは、乳化剤、可溶化剤、界面活性剤、および分散剤としての役割を果たす。医薬的に許容される賦形剤は、ステアリン酸ポリオキシエチレンを含み得る、またはこれからなり得る。ステアリン酸ポリオキシエチレンは、ステアリン酸ポリオキシル２、ステアリン酸ポリオキシル４、ステアリン酸ポリオキシル６、ステアリン酸ポリオキシル８、ステアリン酸ポリオキシル１２、ステアリン酸ポリオキシル２０、ステアリン酸ポリオキシル３０、ステアリン酸ポリオキシル４０、ステアリン酸ポリオキシル５０、ステアリン酸ポリオキシル１００、ステアリン酸ポリオキシル１５０、ジステアリン酸ポリオキシル４、ジステアリン酸ポリオキシル８、ジステアリン酸ポリオキシル１２、ジステアリン酸ポリオキシル３２、ジステアリン酸ポリオキシル１５０、もしくはこれらの組み合わせを含み得る、またはこれらからなり得る。医薬組成物中におけるソルビタンエステルは、乳化剤、可溶化剤、および非イオン性界面活性剤、および分散剤としての役割を果たす。医薬的に許容される賦形剤は、ソルビタンエステルを含み得る、またはこれからなり得る。ソルビタンエステルは、ラウリン酸ソルビタン、オレイン酸ソルビタン、パルミチン酸ソルビタン、ステアリン酸ソルビタン、トリオレイン酸ソルビタン、セスキオレイン酸ソルビタン、もしくはこれらの組み合わせを含み得る、またはこれらからなり得る。溶解性は、タンパク質担体によって達成され得る。タンパク質担体は、組換えヒトアルブミンを含み得る。

本明細書中において記載される、ＦＧＦ１７、ＩＧＦ２、もしくはＢＭＰ７アミノ酸配列と異種ポリペプチドからのアミノ酸配列とを含むポリペプチド、または、線維芽細胞増殖因子受容体アゴニストおよびグリコサミノグリカン、インスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ１Ｒ）アゴニストおよび短鎖脂肪酸、ならびにＢＭＰ受容体アゴニストおよびｍＴＯＲアクチベーターおよび／もしくはグリコサミノグリカンの組み合わせは、安定性を増大させるように配合できる。ポリペプチドは、水性調製物では、分解を防止するために安定化させる必要がある場合がある。安定剤は、ｐＨバッファー、塩、アミノ酸、ポリオール／二糖／多糖、リポソーム、界面活性剤、酸化防止剤、還元剤、またはキレート剤を含み得る。安定剤は、ポリオール／非還元糖を含み得る、またはこれらからなり得る。非還元糖は、スクロース、マンニトール、トレハロース、ラフィノース、スタキオース、キシリトール、デンプン、ベルバスコース、もしくはこれらの組み合わせを含み得る、またはこれらからなり得る。ポリペプチドは、安定性を増大させるために、リポソーム中に封入できる。安定剤は、リポソームを含み得る、またはこれからなり得る。リポソームは、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）リポソーム、ホスファチジルコリン：コレステロール（ＰＣ：Ｃｈｏｌ）（７０：３０）リポソーム、もしくはジパルミトイルホスファチジルコリン：ジパルミトイルホスファチジルセリン（ＤＰＰＣ：ＤＰＰＳ）リポソーム（７０：３０）を含み得る、またはこれらからなり得る。非イオン性界面活性剤は、ポリペプチドの安定性を増大させることができる。安定剤は、非イオン性界面活性剤を含み得る、またはこれからなり得る。非イオン性界面活性剤は、ポリソルベート（たとえば、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０）、アルキル糖アルキルエーテルおよびアルキルグリセリルエーテル、ポリオキシエチレン（４）ラウリルエーテル；ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、もしくはこれらの組み合わせを含み得る、またはこれらからなり得る。ポリペプチドは、安定剤としての組換えヒト血清アルブミンなどのタンパク質界面活性剤と共に配合できる。酸化防止剤または還元剤は、ポリペプチドの安定性を増大させることができる。安定剤は、酸化防止剤もしくは還元剤を含み得る、またはこれらからなり得る。還元剤は、ジチオトレイトール、エチレンジアミン四酢酸、２－メルカプトエタノール、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩、トリス（ヒドロキシプロピル）ホスフィン、もしくはこれらの組み合わせを含み得る、またはこれらからなり得る。酸化防止剤は、メチオニン、アスコルビン酸、クエン酸、アルファトコフェロール、重亜硫酸ナトリウム、パルミチン酸アスコルビル、エリソルビン酸、もしくはこれらの組み合わせを含み得る、またはこれらからなり得る。キレート剤は、プロテアーゼの活性を低下させることによって、ポリペプチドを安定化することができる。安定剤は、キレート剤を含み得る、またはこれからなり得る。キレート剤は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコール－ビス（β－アミノエチルエーテル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸（ＥＧＴＡ）、金属複合体（たとえばＺｎ－タンパク質複合体）、もしくはこれらの組み合わせを含み得る、またはこれらからなり得る。バッファー剤は、ポリペプチドの酸加水分解を低減することによって、ポリペプチドを安定化することができる。安定剤は、バッファー剤を含み得る、またはこれからなり得る。バッファー剤は、スクロースオクタ硫酸（ｓｕｃｒｏｓｅ ｏｃｔａ－ｓｕｌｆａｔｅ）、炭酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、ホウ酸、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、乳酸、３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ヒドロキシメチルアミノメタン（トリス）、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、もしくはこれらの組み合わせを含み得る、またはこれらからなり得る。

また、本明細書中において記載される、ＦＧＦ１７、ＩＧＦ２、もしくはＢＭＰ７アミノ酸配列と異種ポリペプチドからのアミノ酸配列とを含むポリペプチド、または、線維芽細胞増殖因子受容体アゴニストおよびグリコサミノグリカン、インスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ１Ｒ）アゴニストおよび短鎖脂肪酸、ならびにＢＭＰ受容体アゴニストおよびｍＴＯＲアクチベーターおよび／もしくはグリコサミノグリカンの組み合わせは、たとえばコアセルベーション技術によってもしくは界面重合によって調製されたマイクロカプセル（たとえば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン－マイクロカプセル、およびポリ－（メチルメタクリレート）マイクロカプセル）中に、またはコロイド状運搬系（たとえば、リポソーム、アルブミン小球体、マイクロエマルション、ナノ粒子、およびナノカプセル）中に、またはマクロエマルション中に封じ込め得る、またはこれらに結合させ得る。こうした技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１６版，Ｏｓｌｏ，Ａ．編（１９８０）中に開示される。

本明細書中において記載される、ＦＧＦ１７、ＩＧＦ２、もしくはＢＭＰ７アミノ酸配列と異種ポリペプチドからのアミノ酸配列とを含むポリペプチド、または、線維芽細胞増殖因子受容体アゴニストおよびグリコサミノグリカン、インスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ１Ｒ）アゴニストおよび短鎖脂肪酸、ならびにＢＭＰ受容体アゴニストおよびｍＴＯＲアクチベーターおよび／もしくはグリコサミノグリカンの組み合わせは、抗炎症剤と共に配合し得るまたは運搬され得る。抗炎症剤は、コルチコステロイドを含み得る、またはこれからなり得る。コルチコステロイドは、ヒドロコルチゾン、コルチゾン、ベタメタゾン（Ｃｅｌｅｓｔｏｎｅ）、プレドニゾン（Ｐｒｅｄｎｉｓｏｎｅ Ｉｎｔｅｎｓｏｌ）、プレドニゾロン（Ｏｒａｐｒｅｄ、Ｐｒｅｌｏｎｅ）、トリアムシノロン（Ａｒｉｓｔｏｓｐａｎ Ｉｎｔｒａ－Ａｒｔｉｃｕｌａｒ、Ａｒｉｓｔｏｓｐａｎ Ｉｎｔｒａｌｅｓｉｏｎａｌ、Ｋｅｎａｌｏｇ）、メチルプレドニゾロン（Ｍｅｄｒｏｌ、Ｄｅｐｏ－Ｍｅｄｒｏｌ、Ｓｏｌｕ－Ｍｅｄｒｏｌ）、もしくはデキサメタゾン（Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ Ｉｎｔｅｎｓｏｌ）を含み得る、またはこれらからなり得る。抗炎症剤は、非ステロイド系抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）を含み得る、またはこれからなり得る。ＮＳＡＩＤは、アスピリン、セレコキシブ、ジクロフェナク、ジフルニサル、エトドラク、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、ケトロラック、ナブメトン、ナプロキセン、オキサプロジン、ピロキシカム、サルサラート、スリンダク、もしくはトルメチンを含み得る、またはこれらからなり得る。

本明細書中において記載される、ＦＧＦ１７、ＩＧＦ２、もしくはＢＭＰ７アミノ酸配列と異種ポリペプチドからのアミノ酸配列とを含むポリペプチド、または、線維芽細胞増殖因子受容体アゴニストおよびグリコサミノグリカン、インスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ１Ｒ）アゴニストおよび短鎖脂肪酸、ならびにＢＭＰ受容体アゴニストおよびｍＴＯＲアクチベーターおよび／もしくはグリコサミノグリカンの組み合わせは、１種以上の医薬的に許容される賦形剤、担体、および希釈剤を含む静脈内投与に好適な医薬組成物中に含め得る。本開示に係るポリペプチドは、滅菌溶液中に懸濁して投与できる。溶液は、生物学的調製物の投与に一般的に使用されるものであり得て、たとえば、約０．９％のＮａＣｌまたは約５％のデキストロースを含む。さらに、溶液は、以下のうちの１種以上を含み得る：たとえば酢酸塩、クエン酸塩、ヒスチジン、コハク酸塩、リン酸塩、リン酸カリウム、重炭酸塩、およびヒドロキシメチルアミノメタン（トリス）などのバッファー；たとえばポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ ８０）、ポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ ２０）、およびポロキサマー１８８などの界面活性剤；たとえばグルコース、デキストロース、マンノース、マンニトール、ソルビトール、スクロース、トレハロース、およびデキストラン４０などのポリオール／二糖／多糖；たとえばグリシン、ヒスチジン、ロイシン、もしくはアルギニンなどのアミノ酸；たとえばアスコルビン酸、メチオニンなどの酸化防止剤；または、たとえばＥＤＴＡもしくはＥＧＴＡなどのキレート剤。

本明細書中において記載される、ＦＧＦ１７、ＩＧＦ２、もしくはＢＭＰ７アミノ酸配列と異種ポリペプチドからのアミノ酸配列とを含むポリペプチド、または、線維芽細胞増殖因子受容体アゴニストおよびグリコサミノグリカン、インスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ１Ｒ）アゴニストおよび短鎖脂肪酸、ならびにＢＭＰ受容体アゴニストおよびｍＴＯＲアクチベーターおよび／もしくはグリコサミノグリカンの組み合わせは、１種以上の医薬的に許容される賦形剤、担体、および希釈剤を含む筋肉内投与または皮下投与に好適な医薬組成物中に含め得る。筋肉内注射または皮下注射に好適な調製物は、生理学的に許容される滅菌された水性または非水性の溶液、分散液、懸濁液、またはエマルション、および、滅菌注射液もしくは分散液中に再構成できる滅菌粉末を含み得る。好適な水性および非水性の担体、希釈剤、溶媒、またはビヒクルの例は、エタノール、ポリオール（イノシトール、プロピレングリコール、ポリエチレン－グリコール、グリセリン、およびクレモフォールなど）およびこれらの好適な混合物、植物油（オリーブ油など）、ならびにオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルを含む。たとえば、レシチンなどの被覆剤を使用することによって、および分散液の場合には必要な粒子径を維持することによって、および界面活性剤を使用することによって、適切な流動性を維持する。また、皮下注射に好適な調製物は、保存剤、湿潤剤、乳化剤、および懸濁剤などの任意の添加剤も含有する。

本明細書中において記載される、ＦＧＦ１７、ＩＧＦ２、もしくはＢＭＰ７アミノ酸配列と異種ポリペプチドからのアミノ酸配列とを含むポリペプチド、または、線維芽細胞増殖因子受容体アゴニストおよびグリコサミノグリカン、インスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ１Ｒ）アゴニストおよび短鎖脂肪酸、ならびにＢＭＰ受容体アゴニストおよびｍＴＯＲアクチベーターおよび／もしくはグリコサミノグリカンの組み合わせは、クリーム、ゲル、ペースト、軟こう、またはエマルションとして、局所的投与のために配合し得る。クリーム、ゲル、ペースト、軟こう、またはエマルション中の賦形剤は、ゼラチン、カゼイン、レシチン、アラビアゴム、コレステロール、トラガカントガム、ステアリン酸、塩化ベンザルコニウム、ステアリン酸カルシウム、モノステアリン酸グリセリル、セトステアリルアルコール、セトマクロゴール乳化ワックス、ソルビタンエステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンヒマシ油誘導体、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール、ステアリン酸ポリオキシエチレン、コロイド状二酸化ケイ素、リン酸塩、ドデシル硫酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、非結晶セルロース、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、トリエタノールアミン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、糖、およびデンプンを含み得る。

本明細書中において記載される、ＦＧＦ１７、ＩＧＦ２、もしくはＢＭＰ７アミノ酸配列と異種ポリペプチドからのアミノ酸配列とを含むポリペプチド、または、線維芽細胞増殖因子受容体アゴニストおよびグリコサミノグリカン、インスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ１Ｒ）アゴニストおよび短鎖脂肪酸、ならびにＢＭＰ受容体アゴニストおよびｍＴＯＲアクチベーターおよび／もしくはグリコサミノグリカンの組み合わせと共に使用される賦形剤は、高濃縮調製物の保存、配合、または投与を可能とし得る。特定の実施形態において、高濃縮融合ポリペプチドは、１ミリリットルあたり少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、２０、２５、４０、４５、または５０ミリグラム、またはそれ以上である。

本開示に係るポリペプチドおよび／または組成物は、投与前に、輸送／保存、凍結乾燥、および再構成できる。凍結乾燥したリガンド融合ポリペプチド調製物は、マンニトール、ソルビトール、スクロース、トレハロース、およびデキストラン４０などの充填剤を含み得る。凍結乾燥した調製物は、ガラス製バイアル中に入れることができる。融合ポリペプチドは、配合時、再構成されていてもいなくても、特定のｐＨ（一般的には７．０未満）に緩衝され得る。特定の実施形態において、ｐＨは、４．５～６．５、４．５～６．０、４．５～５．５、４．５～５．０、または５．０～６．０であり得る。

キット
また、本明細書中にさらに記載されるのは、本明細書中において記載される、ＦＧＦ１７、ＩＧＦ２、もしくはＢＭＰ７アミノ酸配列と異種ポリペプチドからのアミノ酸配列とを含むポリペプチド、または、線維芽細胞増殖因子受容体アゴニストおよびグリコサミノグリカン、インスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ１Ｒ）アゴニストおよび短鎖脂肪酸、ならびにＢＭＰ受容体アゴニストおよびｍＴＯＲアクチベーターおよび／もしくはグリコサミノグリカンの組み合わせのうちの１つ以上を適切な容器中に含み、かつ、使用説明書、希釈剤、賦形剤、担体、および投与デバイスから選択される１つ以上のさらなる構成要素を含む、キットである。

一態様において、本明細書中に記載されるのは、軟部組織または筋肉の疾患または障害の処置を調製する方法であって、１種以上の医薬的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤と、本明細書中において記載される、ＦＧＦ１７、ＩＧＦ２、もしくはＢＭＰ７アミノ酸配列と異種ポリペプチドからのアミノ酸配列とを含むポリペプチド、または、線維芽細胞増殖因子受容体アゴニストおよびグリコサミノグリカン、インスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ１Ｒ）アゴニストおよび短鎖脂肪酸、ならびにＢＭＰ受容体アゴニストおよびｍＴＯＲアクチベーターおよび／もしくはグリコサミノグリカンの組み合わせとを混合する工程を含む方法である。一態様において、本明細書中に記載されるのは、保存または輸送のための軟部組織または筋肉の疾患または障害の処置を調製する方法であって、本開示に係る１つ以上の抗体を凍結乾燥する工程を含む方法である。

本明細書中において開示される発明は、以下の実験の詳細からさらによく理解され得る。しかしながら、当業者であれば、記載される具体的な方法および結果は、以下添付の請求項中にさらに十分に記載されている本発明を説明するのみであるということを容易に理解し得る。特記しない限り、本開示は具体的な手順または材料などに限定されず、よってこれらは変動し得る。また、本明細書中において使用される専門用語は具体的な実施形態の説明のみを目的とするものであって限定を意図していないということも理解される。

実施例１ 組換えタンパク質の発現および精製
異なるタグを有する遺伝子を持つ哺乳動物発現プラスミドを、ＣＨＯ細胞中に一過性トランスフェクションした。遺伝子が発現してタンパク質が産生され、続いて、これが培地中に分泌された。培地中のタンパク質をポリアクリルアミドゲル上で可視化し、その活性をｉｎ ｖｉｔｒｏ機能アッセイによって測定した。次いで、培地中の組換えタンパク質をアフィニティ精製した。精製したタンパク質をポリアクリルアミドゲル上で可視化して純度を評価し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ機能アッセイによってアッセイしてその生物学的活性を調べた。

発現ベクターの作製：哺乳動物発現ベクターｐｍａｘ Ｃｌｏｎｉｎｇを使用して、Ｃ末端に６×Ｈｉｓタグ、ＳｔｒｅｐＩＩタグ、ならびにヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ４ Ｆｃタグをつけたベクターを作製した。分泌筋原性因子をコードするＤＮＡフラグメントを、ＰＣＲによって、ヒトオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）クローンから増幅し、続いて、タグをつけたベクター中に、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎクローニング技術（タカラバイオ社）によって挿入した。

分泌筋原性ポリペプチドの発現：分泌筋原性因子を持つ発現ベクターを、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ＣＨＯトランスフェクションキット（サーモサイエンティフィック）を使用して、ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ細胞中に、１ｍｌあたり６×１０^６個の密度にて、一過性トランスフェクションした。１８～２２時間後、トランスフェクションした培養物中に、ＣＨＯ ｆｅｅｄおよびエンハンサーを添加した。次いで、発現したタンパク質を、２４時間毎にＳＤＳ－ＰＡＧＥによって監視して、最大の発現レベルを達成した。ほとんどの場合には、４日目に細胞培養物を回収して、細胞を遠心沈殿させた。上清を再び遠心沈殿させて、細胞片を除去した。分泌筋原性因子を含有する、清澄になった培養上清を、－８０℃において保存した、または使用のために速やかに処理した。

分泌筋原性ポリペプチドの発現レベルの測定：改善された分泌筋原性因子の発現レベルを測定するために、以下の３通りのタンパク質分析技術を適用した：ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）、ウェスタンブロッティング、および酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）。ウェスタンブロットを行なって、筋原性因子を特定した。ＥＬＩＳＡを使用して、培養上清中の筋原性因子の絶対量を測定した。

作製した筋原性ポリペプチドの単離：培養上清中の、異なるタグをつけて発現させた筋原性因子を、異なる精製用培地を使用してアフィニティ精製した。Ｆｃ融合因子について、タンパク質Ａ磁気ビーズ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）またはタンパク質Ａメンブレンカラム（タカラバイオ社）のいずれかを使用して、Ｆｃ融合因子に特異的に結合させた。６×Ｈｉｓタグ因子については、ＮＴＡ－磁気ビーズ（ＮＴＡ－ｍａｇｎｅｔｉｃｓ ｂｅａｄｓ；ＮＥＢ）を使用して、因子を単離した。

実施例２ 精製したＩＧＦ２－ｈＦｃｍがヒト筋芽細胞の分化を増進させた
図１Ａ：ＩＧＦ２－ｈＦｃｍをコードするプラスミドにて、懸濁ＣＨＯ細胞を一過性トランスフェクションした。タンパク質Ａメンブレンカラムによって、ＩＧＦ２－ｈＦｃｍをアフィニティ精製した。精製したＩＧＦ２－ｈＦｃｍをヒト筋芽細胞の培養物中に９６時間添加した。ミオシン重鎖（ｍｙｏｓｉｎ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ；ＭｙＨＣ）を免疫染色して、蛍光顕微鏡によってイメージングした。精製したＩＧＦ２－ｈＦｃｍで処理したヒト筋芽細胞のＭｙＨＣの面積の割合は、ビヒクルコントロールで処理したヒト筋芽細胞のＭｙＨＣの面積の割合よりも有意に高い（Ｏｎｅ－Ｗａｙ ＡＮＯＶＡ Ｔｕｋｅｙ Ｈｏｎｅｓｔ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ、ｎ＝２～６）。

実施例３ ＩＧＦ２－ＬｈＦｃ４がヒト筋芽細胞の分化を増進させた
図１Ｂ：ＩＧＦ２－ＬｈＦｃ４をコードするプラスミドにて、懸濁ＣＨＯ細胞を一過性トランスフェクションした。タンパク質Ａメンブレンカラムによって、ＩＧＦ２－ＬｈＦｃ４をアフィニティ精製した。精製したＩＧＦ２－ＬｈＦｃ４をヒト筋芽細胞の培養物中に９６時間添加し、培地交換を毎日行なった。ミオシン重鎖（ＭｙＨＣ）を免疫染色して、蛍光顕微鏡によってイメージングした。精製したＩＧＦ２－ＬｈＦｃ４で処理したヒト筋芽細胞のＭｙＨＣの面積の割合は、ビヒクルコントロールで処理したヒト筋芽細胞のＭｙＨＣの面積の割合よりも有意に高い（Ｏｎｅ－Ｗａｙ ＡＮＯＶＡ Ｔｕｋｅｙ Ｈｏｎｅｓｔ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ、ｎ＝２～６）。

実施例４ 精製したＨＳＡ－Ｌ－ＩＧＦ２Ｒ６１Ａ ヒト筋芽細胞の分化
図２Ａ：ＨＳＡ－Ｌ－ＩＧＦ２Ｒ６１Ａをコードするプラスミドにて、懸濁ＣＨＯ細胞を一過性トランスフェクションした。タンパク質Ａメンブレンカラムによって、ＨＳＡ－Ｌ－ＩＧＦ２Ｒ６１Ａをアフィニティ精製した。精製したＨＳＡ－Ｌ－ＩＧＦ２Ｒ６１Ａをヒト筋芽細胞の培養物中に９６時間添加し、培地交換を毎日行なった。ミオシン重鎖（ＭｙＨＣ）を免疫染色して、蛍光顕微鏡によってイメージングした。精製したＨＳＡ－Ｌ－ＩＧＦ２Ｒ６１Ａで処理したヒト筋芽細胞のＭｙＨＣの面積の割合は、ビヒクルコントロールで処理したヒト筋芽細胞のＭｙＨＣの面積の割合よりも有意に高い（Ｏｎｅ－Ｗａｙ ＡＮＯＶＡ Ｔｕｋｅｙ Ｈｏｎｅｓｔ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ、ｎ＝２～６）。

実施例５ ＩＧＦ２およびＩＧＦ２受容体がヒト筋芽細胞において発現する
若齢（１７～２１歳の白人男性）および老化（６８～６９歳の白人男性）ヒト筋芽細胞の細胞株におけるＩＧＦ２（図２Ｂ）およびＩＧＦ２受容体（図２Ｃ）ＲＮＡＳｅｑ発現についての棒グラフおよび定量表。増殖培地（ＧＭ）または融合培地（ＦＭ）中で筋芽細胞を９６時間培養した。２４時間毎に新しい培地を添加した。平均±ＳＥＭ。ｎ＝６。発現をＦＰＫＭとして表す。有意なｐ値（若齢ＧＭ～老化ＧＭ：３．５４Ｅ－０４）。

図２Ｂ

図２Ｃ

実施例６ 酪酸ナトリウムが筋融合を増大させる
マウス筋芽細胞を、ＰＢＳまたは濃度０．１ｎＭ、１ｎＭ、および１０ｎＭの酪酸ナトリウムにて処置した。筋芽細胞を４８時間培養し、２４時間毎に新しい培地を添加した。細胞にＥｄＵ（３０ｕＭ）を２～５時間適用し、エタノールで固定し、ヘキスト３３４２で染色し、免疫染色して増殖を調べ（ＥｄＵで陽性染色された細胞の割合（％ＥｄＵ）によって測定）、免疫染色して分化を調べた（培地およびビヒクルのみを添加したネガティブコントロールを基準にした、胚ミオシン重鎖が陽性染色された細胞の面積における増加（％ｅＭｙＨＣ）によって測定）。未処理の筋芽細胞と比較すると、酪酸ナトリウム１ｎＭで処理した細胞は、図３Ａ中に示されるように、融合率が増大した。有意性は、ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ Ｔｕｋｅｙ Ｈｏｎｅｓｔ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ検定によって、０．０５未満のｐ値にて判断した。

図３Ａ：ビヒクルとの比較における酪酸ナトリウム（ＮａＢｕｔ）に応答した融合指数についての棒グラフ。示された用量のＮａＢｕｔの存在下において、筋芽細胞を４８時間培養した。２４時間毎に新しい培地およびＮａＢｕｔを添加した。平均±Ｓ．Ｄ．。また、融合指数およびｐ値についての表定量を示す。（スチューデント両側Ｔ検定により^＊ｐ＜０．０５、ｎ＝３～５）

実施例７ 酪酸ナトリウムがＩＧＦ２活性を増大させる
ＰＢＳ（ビヒクル）、ＩＧＦ２（１５ｎｇ／ｍＬ）、酪酸ナトリウム、またはＩＧＦ２および酪酸ナトリウムのいずれかにて、ヒト筋芽細胞を処理した。２４時間毎に新しい培地を添加した。９６時間後、細胞にＥｄＵ（３０ｕＭ）を２～５時間適用し、エタノールで固定し、ヘキスト３３４２で染色し、免疫染色して増殖を調べ（ＥｄＵで陽性染色された細胞の割合（％ＥｄＵ）によって測定）、免疫染色して分化を調べた（培地およびビヒクルのみを添加したネガティブコントロールを基準にした、胚ミオシン重鎖が陽性染色された細胞の面積における増加（％ｅＭｙＨＣ）によって測定）。ｅＭｙＨｃ陽性細胞の総面積を分析し、処理した細胞を、ビヒクル単独で処理した細胞と比較した。ＩＧＦ単独で処理した細胞と、ＩＧＦ２および酪酸ナトリウムで細胞を処理した２通りの条件とは、分化量が有意に増加した。ＩＧＦ２単独で処理した細胞と比較して、１ｎＭおよび１００ｎＭの酪酸ナトリウムおよびＩＧＦ２で処理した細胞におけるｅＭｙＨＣ細胞の総面積が有意に増加した。有意性は、ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ Ｔｕｋｅｙ Ｈｏｎｅｓｔ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ検定によって、０．０５未満のｐ値にて判断した。

図３Ｂ：ビヒクルとの比較における酪酸ナトリウム（ＮａＢｕｔ）に応答したマウス筋芽細胞の融合指数についての棒グラフ。示された用量のＮａＢｕｔの存在下において、マウス筋芽細胞を４８時間培養した。２４時間毎に新しい培地およびＮａＢｕｔを添加した。平均±Ｓ．Ｄ．。融合指数およびｐ値についての表定量を示す。（スチューデント両側Ｔ検定により^＊ｐ＜０．０５、ｎ＝３～５）。有意なｐ値（ビヒクル～ＩＧＦ２：０．０１５ｕｇ／ｍＬ：６．３３Ｅ－０６、ビヒクル～ＮａＢｕｔ：１ｎＭ ＩＧＦ２：０．０１５ｕｇ／ｍＬ：１．７９Ｅ－１１、ビヒクル～ＮａＢｕｔ：１００ｎＭ ＩＧＦ２：０．０１５ｕｇ／ｍＬ：１．７９Ｅ－１１）
図３Ｂについてのデータの表

図３Ｃ ＩＧＦ２（１５ｎｇ／ｍＬ）との比較における、示される処理に応答したｅＭｙＨＣ陽性ヒト筋芽細胞の面積％の棒グラフ定量。示された用量のＢＭＰ７の存在下において、筋芽細胞を９６時間培養した。２４時間毎に新しい培地およびＢＭＰ７を添加した。平均±Ｓ．Ｄ．。（Ｏｎｅ－Ｗａｙ ＡＮＯＶＡ Ｔｕｋｅｙ Ｈｏｎｅｓｔ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅにより^＊ｐ＜０．０５、ｎ＝２～１２）
図３Ｃについてのデータの表

実施例８ 酪酸ナトリウムがＩＧＦ２活性を増大させる
ＰＢＳ（ビヒクル）、ＩＧＦ２（１５ｎｇ／ｍＬ）、酪酸ナトリウム、またはＩＧＦ２および酪酸ナトリウムのいずれかにて、ヒト筋芽細胞を処理した。２４時間毎に新しい培地を添加した。４８時間後、細胞にＥｄＵ（３０ｕＭ）を２～５時間適用し、エタノールで固定し、ヘキスト３３４２で染色し、免疫染色して増殖を調べ（ＥｄＵで陽性染色された細胞の割合（％ＥｄＵ）によって測定）、免疫染色して分化を調べた（培地およびビヒクルのみを添加したネガティブコントロールを基準にした、胚ミオシン重鎖が陽性染色された細胞の面積における増加（％ｅＭｙＨＣ）によって測定）。図４Ａ中においてみられるように、ｅＭｙＨｃ陽性細胞の総面積を分析し、処理した細胞を、ビヒクル単独で処理した細胞と比較した。０．０３ｕｇ／ｍＬのＩＧＦ２またはＩＧＦ２と酪酸ナトリウムとの組み合わせで処理した筋芽細胞は、ビヒクル単独で培養した細胞と比較した場合に、ｅＭｙＨＣ陽性面積における有意な増加を示した。

図４Ａ：ビヒクル（ビヒクル）との比較における、示される処理に応答したｅＭｙＨＣ陽性老化ヒト筋芽細胞（６８歳の白人男性）の面積％の棒グラフ。示された用量の因子の存在下において、筋芽細胞を９６時間培養した。２４時間毎に新しい培地および因子を添加した。平均±Ｓ．Ｄ．。有意なｐ値（ビヒクル～ＩＧＦ２：０．０３ｕｇ／ｍＬ：１．４２Ｅ－０８、ビヒクル～ＮａＢｕｔ：１ｎＭ ＩＧＦ２：０．０３ｕｇ／ｍＬ：１．７９Ｅ－１１、ビヒクル～ＮａＢｕｔ：１０ｎＭ ＩＧＦ２：０．０３ｕｇ／ｍＬ：１．８０Ｅ－１１、ビヒクル～ＮａＢｕｔ：１００ｎＭ ＩＧＦ２：０．０３ｕｇ／ｍＬ：１．７９Ｅ－１１）。図４Ｂ ＩＧＦ２（１５ｎｇ／ｍＬ）との比較における、示される処理に応答したｅＭｙＨＣ陽性ヒト筋芽細胞（６８歳の白人男性）の面積％の棒グラフ定量。示された用量のＢＭＰ７の存在下において、筋芽細胞を９６時間培養した。平均±Ｓ．Ｄ．。有意なｐ値（ＩＧＦ２～ＮａＢｕｔ：１ｎＭ ＩＧＦ２：０．０３ｕｇ／ｍＬ：１．８８Ｅ－３、ビヒクル～ＮａＢｕｔ：１０ｎＭ ＩＧＦ２：０．０３ｕｇ／ｍＬ：４．８０Ｅ－３、ビヒクル～ＮａＢｕｔ：１００ｎＭ ＩＧＦ２：０．０３ｕｇ／ｍＬ：１．８７Ｅ－３）（Ｏｎｅ－Ｗａｙ ＡＮＯＶＡ Ｔｕｋｅｙ Ｈｏｎｅｓｔ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅにより^＊ｐ＜０．０５、ｎ＝２～１２）
図４Ａについてのデータの表

ＩＧＦ２および酪酸ナトリウムの組み合わせで処理した筋芽細胞を、ＩＧＦ２単独で処理した細胞と比較した。図４Ｂおよび表１２中に示されるように、ＩＧＦ２単独で処理した細胞と比較して、組み合わせで処理したすべての細胞では有意に増加した。有意性は、ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ Ｔｕｋｅｙ Ｈｏｎｅｓｔ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ検定によって、０．０５未満のｐ値にて判断した。

図４Ｂについてのデータの表

実施例９ ＩＧＦ２がＤＭ１ヒト筋芽細胞においてＭＹＯＧの発現を増大させる
図５Ａ ＦＭ（ビヒクル）との比較における、示される処理に応答したＤＭ１ヒト筋芽細胞における筋原性遺伝子発現の倍率変化についての棒グラフ。因子（ＢＭＰ７ ５０ｎｇ／ｍＬ、ブチレート１００ｎＭ、ＩＧＦ２ ２００ｎｇ／ｍＬ）の存在下において、筋芽細胞を４８時間培養した。平均±Ｓ．Ｄ．。有意なｐ値（ＦＭ～ＩＧＦ２：４．９４Ｅ－０４、ＦＭ～ＩＧＦ２＿ＮａＢｕｔ：６．５３Ｅ－０３）（^＊ｐ＜０．０１） ＭＹＦ５、ＭＹＯＤ１、およびＭＹＯＧの平均およびｐ値の表（ｎ＝３）。

図５Ａについてのデータの表

実施例１０ 軟骨細胞および骨細胞上にＩＧＦ２受容体が発現する
図６Ａ：ＩＧＦ２受容体が軟骨関連細胞上に発現することを示す棒グラフ。データはRamilowsky et al, Nature 2015から得られる。
図６ＡのＲＮＡ発現についてのデータの表（ＴＰＭ）

実施例１１ ＩＧＦ２処理がＤＭ１ヒト筋芽細胞（３２歳の白人女性）において増殖および融合を増進させる
図７Ａ ＥｄＵ陽性ヒト筋芽細胞（３２歳の白人女性）％についての棒グラフ、および図７Ｂ ＩＧＦ２に応答したＭｙＨＣの面積％。筋芽細胞を、増殖のために７２時間、融合のために９６時間培養した（示される因子の存在下）。平均±Ｓ．Ｄ．。平均±ＳＤ。有意なｐ値（ＥｄＵ：ビヒクル～ＩＧＦ２：６．８Ｅ－３、％ｅＭｙＨＣ面積：ビヒクル～ＩＧＦ２：１．９Ｅ－４）（スチューデント両側Ｔ検定により^＊ｐ＜０．０５、ｎ＝３～６）。

図７Ａについてのデータの表

図７Ｂについてのデータの表

実施例１２ ＩＧＦ２がＤＭ１ヒト筋芽細胞（３２歳の白人女性）においてＭＹＨ３、ＣＫＭ、およびＡＴＰ１Ｂ１の発現を増大させる
図８Ａ ビヒクルとの比較における、示される処理に応答したＤＭ１ヒト筋芽細胞（３２歳の白人女性）におけるＭＹＨ３およびＣＫＭ発現の倍率変化についての棒グラフ。因子（ＩＧＦ２ ２００ｎｇ／ｍＬ）の存在下において、筋芽細胞を９６時間培養した。平均±Ｓ．Ｄ．。有意なｐ値（ＭＹＨ３：ビヒクル～ＩＧＦ２：１．１３Ｅ－０３、ＣＫＭ：ビヒクル～ＩＧＦ２：７．６７Ｅ－０３） 図８Ｂ ＦＭ（ビヒクル）との比較における、示される処理に応答したＤＭ１ヒト筋芽細胞（３２歳の白人女性）におけるＡＴＰ１Ｂ１発現の倍率変化についての棒グラフ。因子（ＩＧＦ２ ２００ｎｇ／ｍＬ）の存在下において、筋芽細胞を４８時間培養した。平均±Ｓ．Ｄ．。有意なｐ値（ビヒクル～ＩＧＦ２：３．１１Ｅ－０５）（スチューデント両側Ｔ検定により^＊ｐ＜０．０５、ｎ＝３）。

図８Ａについてのデータの表

図８Ｂについてのデータの表

実施例１３ ＩＧＦ２／ＮａＢの全身投与が、老化により誘発される筋機能不全から保護する
図９Ａ：ＩＧＦ２（５０ｕｇ／ｋｇ）またはＮａＢ（１．２ｇ／ｋｇ）、ＩＧＦ２／ＮａＢ（１５０ｕｇ／ｋｇ、１．２ｇ／ｋｇ）またはビヒクル（ＰＢＳ）の皮下注射を、２１～２４ヶ月齢のマウスに１４日間投与した。１３日目および１４日目に筋肉機能を評価した。（図９Ｂ） １３日目に評価した握力。第１のグラフ 図９Ｂは両肢の握力を示す、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、^＊＊ｐ＝０．００４３、^＊＊ｐ＝０．００１（Ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ、多重比較）。図９Ｃ） 前肢の力、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、^＊ｐ＝０．０３６８、^＊ｐ＝０．０１８７（Ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ、多重比較）。図９Ｄ） ２分毎に速度が２ｍ／分ずつ徐々に増加するように設定した誘導性トレッドミルランニングモデル（ｉｎｄｕｃｅｄ ｔｒｅａｄｍｉｌｌ ｒｕｎｎｉｎｇ ｍｏｄｅｌ）を使用して、１４日目にトレッドミル成果を測定した。走行距離が示される。^＊＊＊ｐ＝０．０００５、^＊ｐ＝０．０４５９、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１（Ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ、多重比較） 図９Ｅ） 疲弊化までの時間 ^＊＊＊ｐ＝０．０００２、^＊＊ｐ＝０．００２４（Ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ、多重比較） 図９Ｆ） 最大速度 ^＊＊＊ｐ＝０．０００４、^＊＊ｐ＝０．００１３ 図９Ｇ） 仕事（ｋｊ） ^＊＊ｐ＝０．００２６、^＊＊ｐ＝０．００３５（Ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ、多重比較）。

実施例１４ ＩＧＦ２／ＮａＢの全身投与は安全である
図１０Ａ） ビヒクルまたはＩＧＦ２／ＮａＢの皮下注射を、２１ヶ月齢マウスに１４日間投与し、血液および血清を採取して、全血球数と肝臓、腎臓、および膵臓の機能のための代謝パネルとを評価した。図１０Ｂ～図１０Ｅ） 測定した３７のリードアウトのうちの４つの代表的なグラフであって、白血球細胞数（独立ｔ検定、ｐ＝０．８０２０）、アルブミン濃度（独立ｔ検定、ｐ＞０．９９９９）、クレアチニン濃度（独立ｔ検定、ｐ＝０．５４９０）、およびカルシウム濃度（独立ｔ検定、ｐ＝０．８１１）を示す。

実施例１５ ＩＧＦ２／Ｂｕｔの全身投与が、デキサメタゾンにより誘発される筋萎縮から保護する
図１１Ａ） デキサメタゾン（２５ｍｇ／ｋｇ 腹腔内）を、ＩＧＦ２／ＮａＢ（１５０ｕｇ／ｋｇ、１．２ｇ／ｋｇ）またはビヒクル（ＰＢＳ）の皮下注射と同時に、１２週齢のマウスに１４日間投与した。１３～１４日目に筋肉機能を評価した。１３日目に握力を評価した、グラフは、１３日目に測定した両肢の力（図１１Ｂ）と両肢の比力（図１１Ｃ）とを示す。両肢の比力は、重量（ｇ）に対する両肢の力（ｍＮ）の比率として計算した、^＊＊＊ｐ＝０．０００３、^＊＊＊ｐ＝０．０００４（独立ｔ検定）。図１１Ｄ） １３日目に握力を評価した、グラフは、１３日目に測定した前肢の力（図１１Ｄ）と前肢の比力（図１１Ｅ）とを示す。前肢の比力は、重量（ｇ）に対する前肢の力（ｍＮ）の比率として計算した、^＊＊ｐ＝０．００１２、^＊＊＊ｐ＝０．０００５（独立ｔ検定）。図１１Ｆ） １５日目に、マウスを安楽死させて、組織学的分析のためにＴＡを採取した、グラフは、ＳＭＡＳＨソフトウェアを使用して評価した筋線維サイズ分布を示す。^＊＊ｐ＝０．０５４、^＊ｐ＝０．０３７、および^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１（２－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ、多重比較）。

実施例１６ ＢＭＰ７が筋芽細胞の増殖を誘発する
図１２Ａ） ＢＭＰ７に応答したＥｄＵ陽性マウス筋芽細胞％についての棒グラフ定量。示された用量のＢＭＰ７の存在下において、筋芽細胞を４８時間培養した。２４時間毎に新しい培地およびＢＭＰ７を添加し、続いて２時間のＥｄＵ適用および固定を行なった。平均±Ｓ．Ｄ．。有意なｐ値（ビヒクル～ＢＭＰ７ ０．０２５ｕｇ／ｍＬ：１．２１Ｅ－０７、ビヒクル～ＢＭＰ７ ０．０７５ｕｇ／ｍＬ：８．０５Ｅ－０７、ビヒクル～ＢＭＰ７ ０．２２５５ｕｇ／ｍＬ：３．３７Ｅ－０３、ビヒクル～ＢＭＰ７ ０．９ｕｇ／ｍＬ：４．９９Ｅ－０２）。図１２Ｂ） ＢＭＰ７に応答したＥｄＵ陽性ヒト筋芽細胞（６８歳の白人男性）％についての棒グラフ定量。示された用量のＢＭＰ７の存在下において、筋芽細胞を７２時間培養した。細胞にＥｄＵを４時間適用した後、固定した。平均±Ｓ．Ｄ．。有意なｐ値（ビヒクル～ＢＭＰ７ １．５６ｎｇ／ｍＬ：０．０４）。（ウェルチの片側Ｔ検定により^＊ｐ＜０．０５、ｎ＝２）
図１２Ａについてのデータの表 ＢＭＰ７マウス筋芽細胞増殖

図１２Ｂについてのデータの表 ＢＭＰ７ヒト筋芽細胞増殖

実施例１７ ロイシンがＢＭＰ７の分裂促進活性を増大させる
図１３Ａ） ビヒクルとの比較におけるＥｄＵ陽性マウス筋芽細胞％についての棒グラフ。示される因子の存在下において、マウス筋芽細胞を４８時間培養し、続いて２時間のＥｄＵ適用の後、固定した。平均±Ｓ．Ｄ．。有意なｐ値（ＦＭ～ＢＭＰ７：０．００８ｕｇ／ｍＬ：３．１７Ｅ－０２、ＦＭ～ロイシン：３００ｕＭ ＢＭＰ７：０．００８ｕｇ／ｍＬ：２．７７Ｅ－０３、ＦＭ～ロイシン：１００ｕＭ ＢＭＰ７：０．００８ｕｇ／ｍＬ：３．７２Ｅ－０５、ＦＭ～ロイシン：９００ｕＭ ＢＭＰ７：０．００８ｕｇ／ｍＬ：２．５２Ｅ－０３）。（Ｏｎｅ－Ｗａｙ ＡＮＯＶＡ Ｔｕｋｅｙ Ｈｏｎｅｓｔ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅにより^＊ｐ＜０．０５、ｎ＝２～６）
実施例１８ ヒアルロン酸（ＨＡ）がＢＭＰ７の分裂促進活性を増大させる

図１４Ａ：ビヒクルとの比較におけるＥｄＵ陽性マウス筋芽細胞％についての棒グラフ。示される因子の存在下において、マウス筋芽細胞を４８時間培養した。ＥｄＵ適用および固定。平均±Ｓ．Ｄ．。（増大した活性のスチューデント片側Ｔ検定により^＊ｐ＜０．０５、ｎ＝２～６）
実施例１９ ＢＭＰ７受容体がヒト筋芽細胞において発現する

図１５Ａ：若齢および老化ヒト筋芽細胞（６８～６９歳の白人男性）細胞株におけるＢＭＰ７受容体ＲＮＡＳｅｑ発現についての棒グラフ。筋芽細胞を融合培地中において９６時間培養した。２４時間毎に新しい培地を添加し、続いてＲＮＡ抽出およびシーケンシングを行なった。平均±ＳＥＭ。ｎ＝３。発現をＦＰＫＭとして表す。

実施例２０ 軟骨損傷および変形性関節症における軟骨細胞増殖のための処理
図１６Ａ：ＢＭＰ７受容体が軟骨関連細胞上に発現することを示す棒グラフ。データはRamilowsky et al., Nature, 2015から得られる。

実施例２１ ＦＧＦ１７－ｈＦｃｍがマウス筋芽細胞の増殖を増進させる
図１７Ａ） 空のコントロールプラスミドまたはＦＧＦ１７－ｈＦｃｍをコードするプラスミドのいずれかにて、懸濁ＣＨＯ細胞を一過性トランスフェクションした。４日後、培養上清を回収して、マウス筋芽細胞の培養物中に４８時間添加し、続いて２時間のＥｄＵ適用の後、固定した。ＦＧＦ１７－ｈＦｃｍを発現するＣＨＯ細胞の培養上清で処理したＥｄＵ陽性マウス筋芽細胞の割合は、ビヒクルコントロールまたは空のコントロールベクターを発現するＣＨＯ細胞の培養上清のいずれかで処理したＥｄＵ陽性マウス筋芽細胞の割合よりも有意に高い（Ｏｎｅ－Ｗａｙ ＡＮＯＶＡ Ｔｕｋｅｙ Ｈｏｎｅｓｔ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ、ｎ＝２～６）。図１７Ｂ） ＦＧＦ１７－ｈＦｃｍをコードするプラスミドにて、懸濁ＣＨＯ細胞を一過性トランスフェクションした。４日後、培養上清を回収し、タンパク質ＡメンブレンカラムによってＦＧＦ１７－ｈＦｃｍをアフィニティ精製した。精製したＦＧＦ１７－ｈＦｃｍをマウス筋芽細胞の培養物中に４８時間添加し、続いて２時間のＥｄＵ適用および固定を行なった。精製したＦＧＦ１７－ｈＦｃｍで処理したＥｄＵ陽性マウス筋芽細胞の割合は、空のコントロールベクターを発現するＣＨＯ細胞の培養上清で処理したＥｄＵ陽性マウス筋芽細胞の割合よりも有意に高い（Ｏｎｅ－Ｗａｙ ＡＮＯＶＡ Ｔｕｋｅｙ Ｈｏｎｅｓｔ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ、ｎ＝２～６）。

図１７Ａについてのデータの表

図１７Ｂについてのデータの表

実施例２２ ：ＦＧＦ１７変異体がＣＨＯ細胞におけるタンパク質発現レベルを改善した
図１８Ａ：ＦＧＦ１７－ｈＦｃｍまたはその変異体をコードするプラスミド（ＦＧＦ１７ｄ１８１－２１６－ｈＦｃｍ、ＦＧＦ１７ｄ２０４－２１６－ｈＦｃｍ、ＦＧＦ１７Ｒ２０４ＱＫ２０７Ｑ－ｈＦｃｍ）で一過性トランスフェクションしたＣＨＯ細胞からの培養上清のＳＤＳ－ＰＡＧＥ。発現したＦＧＦ１７－ｈＦｃｍタンパク質および変異タンパク質を、白色矢印で示した。図１８Ｂ） 異なるＦＧＦ１７をコードするプラスミドで一過性トランスフェクションしたＣＨＯ細胞からの培養上清をマウス筋芽細胞の培養物中に４８時間添加し、続いて２時間のＥｄＵ適用および固定を行なった。野生型ＦＧＦ１７－ｈＦｃｍまたは変異ＦＧＦ１７－ｈＦｃｍ（ＡＡ２０４－２１６欠失変異体およびＲ２０４ＱＫ２０７Ｑ点変異変異体）を発現するＣＨＯ細胞の培養上清で処理したＥｄＵ陽性マウス筋芽細胞の割合は、空のコントロールベクターを発現するＣＨＯ細胞の培養上清で処理したＥｄＵ陽性マウス筋芽細胞の割合よりも有意に高い（Ｏｎｅ－Ｗａｙ ＡＮＯＶＡ Ｔｕｋｅｙ Ｈｏｎｅｓｔ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ、ｎ＝２～６）。

図１８Ｂ

実施例２３ ＦＧＦ１７変異体がＣＨＯ細胞におけるタンパク質発現レベルを改善した
図１９Ａ） ＦＧＦ１７－ｈＦｃｍまたはその変異体をコードするプラスミド（ＦＧＦ１７ｄ１９７－２１６－ｈＦｃｍ、ＦＧＦ１７Ｋ１９１ＡＫ１９３ＡＳ２００Ａ－ｈＦｃｍ）で一過性トランスフェクションしたＣＨＯ細胞からの培養上清のＳＤＳ－ＰＡＧＥ。発現したＦＧＦ１７－ｈＦｃｍタンパク質および変異タンパク質を、白色矢印で示した。図１９Ｂ） 異なるＦＧＦ１７をコードするプラスミドで一過性トランスフェクションしたＣＨＯ細胞からの培養上清を、マウス筋芽細胞の培養物中に４８時間添加し、続いて２時間のＥｄＵ適用および固定を行なった。野生型ＦＧＦ１７－ｈＦｃｍまたは変異ＦＧＦ１７－ｈＦｃｍ（ＡＡ１９７－２１６欠失変異体およびＫ１９１ＡＫ１９３ＡＳ２００Ａ点変異変異体）を発現するＣＨＯ細胞の培養上清で処理したＥｄＵ陽性マウス筋芽細胞の割合は、空のコントロールベクターを発現するＣＨＯ細胞の培養上清で処理したマウス筋芽細胞よりも有意に高い（Ｏｎｅ－Ｗａｙ ＡＮＯＶＡ Ｔｕｋｅｙ Ｈｏｎｅｓｔ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ、ｎ＝２～６）。

図１９Ｂ

実施例２４ ヒト血清アルブミン（Ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ；ＨＳＡ）融合ＦＧＦ１７は、培地中において、ＨＳＡ融合タグを有さないＦＧＦ１７よりも安定である
図２０Ａ ＨＳＡ－ＦＧＦ１７およびＦＧＦ１７を、培地中において、３７度のＣＯ２インキュベータでインキュベートした。異なる時点（０、１、３、５、および７日目）に、アリコートを取って、－８０度において保存した。マウス筋芽細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖アッセイによって、各サンプルの活性を評価した。増殖アッセイからの各時点での核の数を、０日目の核の数で標準化した。

実施例２５ マウス筋芽細胞におけるＦＧＦ１７による筋原性遺伝子発現の差次的誘発
リアルタイムｑＰＣＲにより監視した、マウス筋芽細胞株における、ビヒクル（ＦＭ）に応答した筋原性遺伝子のＲＮＡ発現（ＦＭに対する倍率変化）。筋芽細胞を、融合培地中において４８時間培養した。平均±ＳＤ。ｎ＝３。（Ｙ、Ｚ） ヒト筋芽細胞におけるＦＧＦ１７による筋原性遺伝子発現の差次的誘発。老化ヒト筋芽細胞株におけるＦＭまたはｒｈ－ＦＧＦ１７に応答した筋原性遺伝子のＲＮＡ発現（ＦＭ（融合培地（ＤＭＥＭ＋２％ウマ血清））に対する倍率変化）の定量表（リアルタイムｑＰＣＲによる）。筋芽細胞をＦＭ中において（Ｂ）４８時間または（Ｃ）７２時間培養した。平均±ＳＤ。ｎ＝３。

実施例２６ ＦＧＦ１７受容体がヒト筋芽細胞において発現する
図２１Ａ：若齢および老化ヒト筋芽細胞株におけるＦＧＦ１７受容体ＲＮＡＳｅｑ発現についての棒グラフ。筋芽細胞を融合培地中において９６時間培養し、２４時間毎に新しい培地を添加し、続いてＲＮＡ抽出およびシーケンシングを行なった。平均±ＳＥＭ。ｎ＝３。発現値はＦＰＫＭとして報告される。

実施例２７ ヘパリンがＦＧＦ１７の分裂促進活性を増大させる
図２２Ａ：ビヒクルとの比較におけるＥｄＵ陽性マウス筋芽細胞％についての棒グラフ。示される因子の存在下において、筋芽細胞を４８時間培養した。２４時間毎に新しい培地および因子を添加し、続いて２時間のＥｄＵ適用および固定を行なった。平均±Ｓ．Ｄ．。％ＥｄＵおよびｐ値についての表定量（Ｏｎｅ－Ｗａｙ ＡＮＯＶＡ Ｔｕｋｅｙ Ｈｏｎｅｓｔ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅにより^＊ｐ＜０．０５、ｎ＝２～６）

実施例２８ ヒアルロン酸（ＨＡ）がＦＧＦ１７の分裂促進活性を増大させる
図２３：ビヒクルとの比較におけるＥｄＵ陽性マウス筋芽細胞％についての棒グラフ。示される因子の存在下において、筋芽細胞を４８時間培養した。２４時間毎に新しい培地および因子を添加し、続いて２時間のＥｄＵ適用および固定を行なった。平均±Ｓ．Ｄ．。％ＥｄＵおよびｐ値についての表定量が示される。（増大した活性のスチューデント片側Ｔ検定により^＊ｐ＜０．０５、ｎ＝２～６）

実施例２９ デキストラン硫酸（ＤＳ）がＦＧＦ１７の分裂促進活性を増大させる
図２４Ａ：各条件について比較した総ＥｄＵ陽性マウス筋芽細胞についての棒グラフ。示される因子の存在下において、筋芽細胞を４８時間培養した。２４時間毎に新しい培地および因子を添加し、続いて２時間のＥｄＵ適用および固定を行なった。平均±標準偏差（ＳＤ）。１視野あたりのＥｄＵ数およびマウスアッセイについてのｐ値（増大した活性のスチューデント片側Ｔ検定により^＊ｐ＜０．０５、ｎ＝３～６、相乗値が１よりも小さいことが効果のエビデンス）についての表定量。図２４Ｂ） 各条件についての総ＥｄＵ陽性ヒト筋芽細胞についての棒グラフ。示される因子の存在下において筋芽細胞を７２時間培養し、続いて４時間のＥｄＵ適用および固定を行なった。２４時間毎に新しい培地および因子を添加した。平均±標準偏差（ＳＤ）。ＥｄＵ陽性数およびヒトアッセイについてのｐ値（増大した活性のスチューデント片側Ｔ検定により^＊ｐ＜０．０５、ｎ＝３～６、相乗値が１よりも小さいことが効果のエビデンス）についての表定量。

図２４Ａについてのデータの表

図２４Ｂについてのデータの表

実施例３０ ＢａＣｌ２損傷高齢マウスモデルにおいてＦＧＦ１７の筋肉内投与が筋肉の再生を増進させた
図２５Ａ） 実験の全体像。１．２％のＢａＣｌ２（７ｕｌ／ＴＡ）の筋肉内注射を使用して、７８週齢のマウスのＴＡにおいて化学的損傷を発生させた。筋損傷させて２時間後および４８時間後に、ＦＧＦ１７（５００ｎｇ／ｍＬ）を筋肉内注射にて投与した。図２５Ｃ） 損傷面積１ｍｍ＾２あたりの新たに再生した線維の数として計算した再生指数の定量化。再生した線維は、中心核を有する線維として特定した、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１（独立ｔ検定）。図２５Ｄ） 線維化面積の割合として計算した線維化指数を示すヒストグラム。^＊ｐ＝０．０１８６（独立ｔ検定）。

実施例３１ ＦＧＦ１７の全身投与が、デキサメタゾンにより誘発される筋萎縮から保護する
図２６Ａ） 実験の全体像および群。デキサメタゾン（２５ｍｇ／ｋｇ 腹腔内）を、ＦＧＦ１７（０．５ｍｇ／ｋｇ）の皮下注射と同時に、１２週齢のマウスに２０日間投与した。２１日目に筋肉重量を評価した。７、１３、および２１日目に前肢の握力および両肢の握力を測定した 図２６Ｂ） ビヒクルからの割合変化として示される、初期体重に対するＴＡ筋重量。^＊＊＊ｐ＝０．０００５、^＊ｐ＝０．０４９９。図２６Ｃ） ２１日目に測定した前肢の力、ヒストグラムは、重量（ｇ）に対する前肢の力（Ｎ）の比率として計算した前肢の比力を示す、^＊ｐ＝０．０４５８、^＊＊ｐ＝０．００１４ 図２６Ｄ） 重量（ｇ）に対する両肢の力（Ｎ）の比率として計算した、２１日目に測定した両肢の力 ^＊＊＊ｐ＝０．００１ ^＊ｐ＝０．０１０２。Ｔｕｋｅｙの方法により多重比較のためにＯｎｅ ｗａｙ Ａｎｏｖａ補正したものを使用して、データを比較した。

実施例３２ 軟骨損傷および変形性関節症における軟骨細胞増殖のための処理、ならびにＦＧＦ１７による軟骨細胞増殖の誘発
ＲＮＡ発現は、ＦＧＦ１７受容体が軟骨関連細胞上に発現したことを示す。 図２７Ａ） ＦＧＦ１７に応答したＥｄＵ陽性ヒト軟骨細胞％についての棒グラフ定量。示された用量のＦＧＦ１７の存在下において、軟骨細胞を４８時間培養した。ポジティブコントロールとしてＦＧＦ１８を０．１ｕｇ／ｍＬ添加した。新しい培地およびＦＧＦ１７を２４時間毎に添加した。ＥｄＵ陽性軟骨細胞％およびｐ値の表が示される。平均±Ｓ．Ｄ．。（Ｔｕｋｅｙ Ｈｏｎｅｓｔ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ Ｔ－ｔｅｓｔにより^＊ｐ＜０．０５、ｎ＝２～３）
表 ＦＧＦＲ１のＲＮＡ発現（ＴＰＭ）

図２７Ａについてのデータの表

実施例３３ ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける筋原性活性測定アッセイ
マウス筋芽細胞増殖アッセイ
個体の組織前駆細胞からの再生の低下は年齢または疾患に関する機能不全の顕著な特徴であるため、組織前駆細胞における分裂促進能力を測定するアッセイは、処理の成功可能性のリードアウトとしての役割を果たす。処理したマウスまたはヒトの筋肉前駆細胞の増大した増殖率、分化の度合い、および細胞生存を測定することによって、病気、損傷を有している、または早すぎる組織減少、消耗、もしくは衰弱を導く遺伝子障害もしくは発育障害を有している個体の処置において、治療用に使用できる可能性のある再生因子についての、良好な基準を提供できる。

マウス増殖培地（マトリゲル被覆プレート（マトリゲル：ＰＢＳ １：３００）上のＨａｍ’ｓ Ｆ－１０（Ｇｉｂｃｏ）、２０％ウシ増殖血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、５ｎｇ／ｍＬ ＦＧＦ２、および１％ペニシリン－ストレプトマイシン、３７℃、５％ＣＯ２）中において、マウス筋肉前駆細胞（初期継代筋芽細胞）を培養および増殖させた。実験条件について、細胞を、マウス融合培地（ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）＋２％ウマ血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ））中に、１ウェルあたり培地２５０～５００μＬを入れたマトリゲル被覆８ウェルチャンバースライド（マトリゲル：ＰＢＳ １：１００）上にて、１ウェルあたり細胞４０，０００個で播種した。播種して１時間後に、５０％の各培地にてマウス筋芽細胞を処理し、上記条件において、３７℃、１０％ＣＯ２インキュベータ内にて、マウス筋芽細胞を２４時間培養した。ＤＭＳＯ中のＢｒｄＵ（３００μＭ）を２時間添加した後、冷７０％エタノールで固定して、染色するまで４℃で保存した。

再生指数の定量
ＰＢＳ＋０．２５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００中において透過化した後、抗原賦活化を行なった。マウス抗胚ミオシン重鎖（ｅＭｙＨＣ、ハイブリドーマクローン１．６５２、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｂａｎｋ）およびラット抗ＢｒｄＵ（Ａｂｃａｍ社 ａｂ６３２６）に対する種特異的モノクローナル抗体を含む一次抗体を用いて、一次染色を行なった。フルオロフォア結合種特異的抗体（ロバ抗ラット４８８、＃７１２－４８５－１５０；ロバ抗マウス４８８、＃７１５－４８５－１５０）を用いた二次染色。ヘキスト染色によって核を可視化する。ヘキスト染色を使用して細胞数を計数し、ＢｒｄＵおよびｅＭｙＨＣについて陽性である細胞の割合を表にして報告した。

ＦＧＦ１７－ｈＦｃｍがマウス筋芽細胞の増殖を増進させる。
空のコントロールプラスミドまたはＦＧＦ１７－ｈＦｃｍをコードするプラスミドのいずれかにて、懸濁ＣＨＯ細胞を一過性トランスフェクションした。４日後、培養上清を回収して、マウス筋芽細胞の培養物中に４８時間添加し、続いて２時間のＥｄＵ適用の後、固定した。ＦＧＦ１７－ｈＦｃｍを発現するＣＨＯ細胞の培養上清で処理したＥｄＵ陽性マウス筋芽細胞の割合は、ビヒクルコントロールまたは空のコントロールベクターを発現するＣＨＯ細胞の培養上清のいずれかで処理したＥｄＵ陽性マウス筋芽細胞の割合よりも有意に高い（Ｏｎｅ－Ｗａｙ ＡＮＯＶＡ Ｔｕｋｅｙ Ｈｏｎｅｓｔ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ、ｎ＝２～６）。

ＦＧＦ１７－ｈＦｃｍをコードするプラスミドにて、懸濁ＣＨＯ細胞を一過性トランスフェクションした。４日後、培養上清を回収し、タンパク質ＡメンブレンカラムによってＦＧＦ１７－ｈＦｃｍをアフィニティ精製した。精製したＦＧＦ１７－ｈＦｃｍをマウス筋芽細胞の培養物中に４８時間添加し、続いて２時間のＥｄＵ適用および固定を行なった。精製したＦＧＦ１７－ｈＦｃｍで処理したＥｄＵ陽性マウス筋芽細胞の割合は、空のコントロールベクターを発現するＣＨＯ細胞の培養上清で処理したＥｄＵ陽性マウス筋芽細胞の割合よりも有意に高い（Ｏｎｅ－Ｗａｙ ＡＮＯＶＡ Ｔｕｋｅｙ Ｈｏｎｅｓｔ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ、ｎ＝２～６）。

実施例３４ 再生促進因子についての筋原性遺伝子プロファイリング
筋原性因子Ｐａｘ７、Ｍｙｆ５、Ｍｙｏｄ１、およびＭｙｏｇの発現は、筋肉前駆細胞の機能状態についての重要な指標である。Ｐａｘ７およびＭｙｆ５を上方制御する因子は増殖性の前駆細胞の賦活化を示し、Ｍｙｏｄ１およびＭｙｏｇの上方制御は筋線維再生を示唆する。これらの遺伝子の発現のリードアウトは、本明細書中において記載される、ＦＧＦ１７、ＩＧＦ２、もしくはＢＭＰ７アミノ酸配列と異種ポリペプチドからのアミノ酸配列とを含む任意の所与のポリペプチド、または、線維芽細胞増殖因子受容体アゴニストおよびグリコサミノグリカン、インスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ１Ｒ）アゴニストおよび短鎖脂肪酸、ならびにＢＭＰ受容体アゴニストおよびｍＴＯＲアクチベーターおよび／もしくはグリコサミノグリカンの組み合わせが成功する可能性を提供し得る。因子で処理したマウスまたはヒト筋肉前駆細胞において筋原性遺伝子を測定することによって、損傷を有している、または早すぎる組織減少、消耗、もしくは衰弱を導く遺伝子障害もしくは発育障害を有している個体の処置のための治療効果についての良好な特徴づけが提供され得る。また、コントロールとして、このアッセイを、分化細胞により条件付けした培地中で培養した分化細胞から精製したタンパク質について（結果として、筋芽細胞の増殖はなかった）、または精製したヘパリン結合画分についても行い得る。

各ウェルからＲＮＡを単離し（ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ）、逆転写（Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によってｃＤＮＡを得た。ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ３（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して、リアルタイム定量ＰＣＲを行なった。

ウェルプレート中で老化ヒト筋芽細胞を培養した。異なる培地を用いて細胞を培養した結果、筋原性遺伝子発現が差次的に誘発された。表４中に示されるように、すべての因子が、融合培地中において培養した細胞と比較して、４８時間および７２時間において少なくとも１つの筋原性受容体遺伝子における変化をもたらした。ＩＧＦ２と共に培養した細胞では、４８時間でＭＹＯＧのレベルが、７２時間でＭＹＯＤのレベルが増加した。

表４：ＩＧＦ２と共に培養した筋芽細胞における筋原性転写因子の倍率変化増加

ヒトまたはマウス前駆細胞における筋原性遺伝子のプロファイリング
筋原性活性試験のために、上述されるとおりに、ヒトまたはマウス筋肉前駆細胞を播種および培養し得る。播種して１時間後に、筋芽細胞を各因子で処理し得る。筋芽細胞を分析してＰａｘ７、Ｍｙｆ５、Ｍｙｏｄ１、およびＭｙｏｇの発現について調べることによって、ＦＧＦ１７、ＩＧＦ２、またはＢＭＰ７アミノ酸配列を含むポリペプチドでの処理の再生効果を特徴づけ、また、試験を行うことによって、異種ポリペプチドからのアミノ酸配列、または、線維芽細胞増殖因子受容体アゴニストおよびグリコサミノグリカン、インスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ１Ｒ）アゴニストおよび短鎖脂肪酸、ならびにＢＭＰ受容体アゴニストおよびｍＴＯＲアクチベーターおよび／もしくはグリコサミノグリカンの組み合わせの効果を特徴づけ得る。

実施例３５ 幹細胞分泌因子についてのｉｎ ｖｉｖｏ試験
複数のｉｎ ｖｉｖｏ筋変性モデルについて試験し得る。本明細書中において記載される、ＦＧＦ１７、ＩＧＦ２、もしくはＢＭＰ７アミノ酸配列と異種ポリペプチドからのアミノ酸配列とを含むポリペプチド、または、線維芽細胞増殖因子受容体アゴニストおよびグリコサミノグリカン、インスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ１Ｒ）アゴニストおよび短鎖脂肪酸、ならびにＢＭＰ受容体アゴニストおよびｍＴＯＲアクチベーターおよび／もしくはグリコサミノグリカンの組み合わせがｉｎ ｖｉｔｒｏモデルにおいて再生特性を有することから、これらのｉｎ ｖｉｖｏモデルは、完全な臓器系のコンテクストにおいて、類似する再生効果および増殖効果を示し得る。

急性損傷モデル
実験群は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雄マウス（Ｎ＝１８）、若齢が１２～１３週齢（３ヶ月齢）マウス（ｎ＝６）、老化が７７～７８週齢（１８ヶ月齢）マウス（ｎ＝１２）であり得る。ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいて特定および実証した任意の単一因子、または、ＦＧＦ１７、ＩＧＦ２、もしくはＢＭＰ７アミノ酸配列と異種ポリペプチドからのアミノ酸配列とを含むポリペプチド、または、線維芽細胞増殖因子受容体アゴニストおよびグリコサミノグリカン、インスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ１Ｒ）アゴニストおよび短鎖脂肪酸、ならびにＢＭＰ受容体アゴニストおよびｍＴＯＲアクチベーターおよび／もしくはグリコサミノグリカンの組み合わせについての試験に、この設計を使用し得る。

０日目に、マウスを計量し、右および左の両後肢の前脛骨（Ｔｉｂｉａｌｉｓ ａｎｔｅｒｉｏｒ、ＴＡ、０日目）中に、塩化バリウム（ＢａＣｌ_２、１０μＬ、生理食塩水中に１．２％ｗ／ｖ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）の局所的注射によって、筋損傷を与え得る。ＴＡ損傷後肢部位中へのＢａＣｌ_２の後、ビヒクルまたは因子Ａ（０．１ｍｇ／ｋｇ）の注射を筋肉内に同時投与し得て、再び、４８時間後である２日目に、ＴＡ損傷後肢部位中に投与（筋肉内）し得る。また、これも２日目に、右および左の両後肢の腓腹筋（Ｇａｓｔｒｏｃｎｅｍｉｕｓ、ＧＡ、２日目、筋肉内）中に、ＢａＣｌ_２（Ｃｔｘ、１０μＬ、生理食塩水中に１．２％ｗ／ｖ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を注射した。ＴＡ後肢部位中へのＢａＣｌ２の後、損傷後に、ビヒクルまたは因子の注射を順次投与（筋肉内）し得て、再び、４８時間後である４日目に、ＧＡ損傷後肢部位中に投与（筋肉内）し得る。増殖細胞を標識するために、ブロモデオキシウリジン（ｂｒｏｍｏｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ；ＢｒｄＵ）を１日１回３日間（２～４日目）投与し（１００ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）、その後、犠牲死させた。

５日目に動物を犠牲死させ得て、動物の重量を記録し、続いて、心臓穿刺によって最終血（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｂｌｏｏｄ）０．５ｍｌを採取し、これを処理して血漿として、８０℃において保存し得る。次いで、１×ＰＢＳを用いて動物を灌流して、各後肢のＧＡ／ＴＡ筋から皮膚を慎重に切開し、写真を撮る（刺激する前に）。ＧＡ筋またはＴＡ筋を限定的に刺激した後、切除した組織を撮影、計量し、次いで、ＰＢＳ中の２５％スクロース中に４℃において４時間入れ、１×ＰＢＳ中ですすぎ、Ｔｉｓｓｕｅ－ＴＥＫ ＯＣＴ中に浸漬して、急速に凍結させた後、８０℃において凍結状態で筋組織を保存する。凍結切片作製およびＨ＆Ｅを行なって、筋損傷部位を適切に可視化できていることを確認し得た。新しい骨格筋線維からの筋組織組成、線維化組織、および脂肪（ａｄｉｐｏｓｅ、ｆａｔ）を測定し得る。筋肉再生（中心に核を有する新しい筋線維の、１ミリメートルあたりの数として定義）、線維症（線維化瘢痕の面積として定義）、線維のサイズ（幅および面積として定義）、脂肪組織（筋肉を取り囲む脂肪の量によって定義）を測定することによって、再生のレベルを評価し得る。

サルコペニア／慢性投与モデル
表４中に示されるように、実験設計は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雄マウス（Ｎ＝１８）、若齢が１２～１３週齢（３ヶ月齢）マウス（ｎ＝６）、老化が７７～７８週齢（１８ヶ月齢）マウス（ｎ＝１２）である。ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいて特定および実証した任意の単一因子または２種以上の因子もしくは相乗的小分子からなる複雑な混合物についての試験に、この設計を使用できる。

０日目に、マウスに、年齢に基づくパラメータのベースラインとして、以下のｉｎ ｖｉｖｏ健康寿命（ｈｅａｌｔｈｓｐａｎ）測定を１日間かけて行ない得る：重量、回転ホイール成績、握力、および水平バー。各アッセイは、１つのアッセイについて１匹の動物に対して４回行なうべきである。これらの健康寿命アッセイは－１日目から繰り返し得る。－９日目に１日休ませた後、犠牲死させるまでの残りの実験期間にわたり、マウスに対してビヒクルまたは因子Ａの１日１回の連日注射（０．１ｍｇ／ｋｇ）を開始し得る（－８～＋５日目、投与日数１３日間）。投与を開始して６日後の－４日目に、マウスに、健康寿命アッセイの繰り返しを行ない得る。犠牲死させる５日前の０日目に、マウスの右後肢のみの前脛骨（ＴＡ、０日目）中に、心臓毒（Ｃｔｘ、１０μｇ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）の局所的注射によって筋損傷を与え得る。次いで、２日目に、右後肢の腓腹筋（ＧＡ、２日目）に、心臓毒（Ｃｔｘ、１０μｇ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を与え得る。２～４日目に、ＢｒｄＵ（１００ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）を１日１回３日間投与して、その後犠牲死させ得る。＋５日目に、取り下げる前に、動物に対して、ｉｎ ｖｉｖｏ荷重負荷（ｉｎｃａｐａｃｉｔａｎｃｅ）アッセイを行ない得る。＋５日目に、動物を犠牲死させ得て、動物の重量を記録し得る。心臓穿刺により０．５ｍｌの血液を採取し得て、これを処理して血漿として、血漿サンプルを８０℃において保存し得る。次いで、１×ＰＢＳを用いて動物を灌流し得る。各後肢のＧＡ／ＴＡ筋から皮膚を慎重に切開し、写真を撮る（刺激する前に）。ＧＡ筋またはＴＡ筋を限定的に刺激した後、筋肉を計量し得て、次いで、ＰＢＳ中の２５％スクロース中に筋肉を４℃において４時間入れ、次いで１×ＰＢＳ中で筋肉をすすぎ、Ｔｉｓｓｕｅ－ＴＥＫ ＯＣＴを添加して、筋組織を８０℃において凍結状態で保存し得る。凍結切片作製およびＨ＆Ｅを行なって、筋損傷部位を適切に可視化できていることを確認し得る。鼠蹊部の白色脂肪組織（ｗｈｉｔｅ ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ；ＷＡＴ）を慎重に切除して、計量し得る。

新しい骨格筋線維からの筋組織組成、線維化組織、および脂肪（ａｄｉｐｏｓｅ、ｆａｔ）を測定し得る。筋肉再生（中心に核を有する新しい筋線維の、１ミリメートルあたりの数として定義）、線維症（線維化瘢痕の面積として定義）、線維のサイズ（幅および面積として定義）、脂肪組織（筋肉を取り囲む脂肪の量によって定義）を測定することによって、再生のレベルを評価し得る。処置中における動物の重量と、回転ホイールでの成績（速度、距離、持続時間）、握力、および水平バーでの成績を含む健康寿命アッセイとは、ＦＧＦ１７、ＩＧＦ２、もしくはＢＭＰ７アミノ酸配列と異種ポリペプチドからのアミノ酸配列とを含むポリペプチド、または、線維芽細胞増殖因子受容体アゴニストおよびグリコサミノグリカン、インスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ１Ｒ）アゴニストおよび短鎖脂肪酸、ならびにＢＭＰ受容体アゴニストおよびｍＴＯＲアクチベーターおよび／もしくはグリコサミノグリカンの組み合わせで全身に処置をした老化動物の表現型の結果を考慮に入れ得る。

８ヶ月齢（ｎ＝６ＷＴ、ｎ＝７ ＭＰＳ ＩＩＩＢ）および１０ヶ月齢（ｎ＝３ＷＴ、ｎ＝４ ＭＰＳ ＩＩＩＢ）において、水平バー試験を、以前（Malinowska et al. 2010）に記載される通りに行ない得る。簡潔には、詰め物をした表面の上方３２０ｍｍにある２つの支柱の間に、３００ｍｍの金属ワイヤ（直径２ｍｍ）を固定した。マウスにワイヤの中央を握らせて、落下するまでまたは端に達するまでの時間を記録し、２分後に試験を停止した。ｘ秒でバーを横切った場合には２４０－ｘと記録し得て、バーに留まっている場合には１２０と記録し得て、ｙ秒後にバーから落下した場合には値ｙと記録し得る。試験は練習として３回繰り返し得て、続いて１０分間の休憩後に３回行ない得て、そのスコアを記録した。

また、動物は、より良好な健康寿命の結果を有し得る：減少した重量、脂肪組成、筋肉周りの瘢痕組織、増大した走行速度、持続時間、および距離、増大した握力、および向上した水平バー試験での成績。

遺伝性肥満筋ジストロフィーモデル
遺伝性肥満（ｏｂ／ｏｂ）マウスのＴＡ筋中に、０日目にＢａＣｌ２を注射し得る。０日目および２日目に、マウス３匹をビヒクル単独で処置し得て、マウス３匹にｈＰＳＣ因子を注射し得て、マウス３匹をＦＧＦ１９（ポジティブコントロール）で処置し得る。５日目にマウスを安楽死させ得て、ＰＢＳを用いてＴＡ筋を灌流し、切開し得る。次いで、筋肉を分析して再生指数および線維化指数について調べ得る。

萎縮モデル
実験設計として、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雄マウスに、ビヒクル（Ｎ＝７）、デキサメタゾン（２５ｍｇ／ｋｇ 腹腔内）（Ｎ＝６）、またはデキサメタゾン＋処置品（Ｎ＝６）を２０日間にわたり毎日投与する。ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいて特定および実証した任意の単一因子または２種以上の因子からなる複雑な混合物についての試験に、この設計を使用できる。

２１日目に、動物を犠牲死させて、動物の重量を記録する。心臓穿刺により０．５ｍｌの血液を採取して、これを処理して血漿として、血漿サンプルを－８０℃において保存する。１×ＰＢＳを用いて動物を灌流する。各後肢のＧＡ／ＴＡ筋から皮膚を注意深く切開した後、写真を撮り、続いてＧＡ筋またはＴＡ筋を限定的に刺激し、筋肉を計量し、次いで－８０Ｃにおいてイソペンタン中で急速に凍結させる。

筋肉の強さ、持久力、および機能を試験する方法
前肢および両肢の握力試験：３０分間にわたって順化させた後、マウスを握力計に導入する。前肢の握力のためには、尾をもってぶら下げたマウスに、前肢のみでグリップバーを握らせる。両肢の測定のためには、マウスをグリッド上に置き、両肢でグリッドを握らせる。各マウスから生じた力を、５～６回の測定の平均として計算する。

肢部持久力試験：持久力試験よりも前に、マウスに、齧歯類用トレッドミル環境があることに気付かせて、１回１０分の１０ｍ／分での練習を２回、それぞれ異なる日にさせることによって、慣れさせる。持久力試験のために、齧歯類用トレッドミルの個々のレーン内にマウスを入れる。疲弊化に達するまで、速度を２ｍ／分で徐々に上げる。疲弊化は、２Ｈｚのショックを強度５で３～５秒間かける通電グリル上にマウスが留まっていることとして定義する。

ｉｎ ｖｉｖｏ強縮力（ｔｅｔａｎｉｃ ｆｏｒｃｅ）測定：イソフルランの調節運搬を用いることにより、マウスは全工程にわたって麻酔されている。麻酔した後、動物を加温チャンバに載せ、Ａｕｒｏｒａフォーストランスデューサーのフットペダルに脚を固定する。特に坐骨神経を刺激するために２つの電極をつける。５０、１００、１５０、および２００Ｈｚを含む一連の刺激に応答して動物の後肢の足関節のねじれにより生じる力（直接の力ではなく）を測定する。

Ｉｎ ｓｉｔｕ強縮力測定：この実験は、Ａｕｒｏｒａ ｆｏｒｃｅ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔを使用して行なう。マウスは全工程にわたって麻酔されている。前脛骨の周りの皮膚を小さく切開することでアキレス腱を露出させ、これを、外科的縫合によって、フックを介してＡｕｒｏｒａフォーストランスデューサーにつなぐ。前脛骨上の２つの電極による５０、１００、１５０、および２００Ｈｚを含む一連の刺激に応答して筋肉によって生じた力を記録する。

実施例３６ バイオアベイラビリティおよび薬物動態によりアッセイした、分裂促進性ポリペプチドのｉｎ ｖｉｖｏ安定性
組織におけるバイオアベイラビリティ
治療用ポリペプチドのバイオアベイラビリティを、若齢マウス（１０～１２週齢）および高齢マウス（７８週齢）の標的組織において評価し得る。この実験のために、若齢マウスのコホート１つ（１０～１２週齢、Ｎ＝２４）および高齢マウスのコホート１つ（７８週齢、Ｎ＝２４）に対して、治療用組成物の皮下（ＳＣ）注射を１回行ない得る。４匹の若齢マウス（１０～１２週齢、Ｎ＝６）および４匹の高齢マウス（７８週齢、Ｎ＝６）に対して、ビヒクルの皮下注射を１回行ない得て、コントロールとして使用し得る。各コホートからのマウス４匹を、３０分、１時間、１．５時間、２時間、または４時間後に安楽死させ得る。各時点において、心臓穿刺によって採血し得て、続いて、前脛骨、腓腹筋、四頭筋、心臓、および横隔膜などの選択された組織を採取し得る。投与した治療用ポリペプチドの検出および定量を、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によって検出し得る。治療用ポリペプチドのレベルを、ビヒクルを注射したマウスから採取したサンプルと比較することによって、組織レベルのバイオアベイラビリティを判断し得る。

作製した分裂促進性ポリペプチドの薬物動態
マウスの薬物動態（ＰＫ）は、薬物の吸収、分布、代謝、および体内からの排出に相当する。治療用ポリペプチドの薬物動態プロファイルを、若齢マウス（１０～１２週齢）および高齢マウス（７８週齢）において判断し得る。この実験のために、若齢マウス（１０～１２週齢）および高齢マウス（７８週齢）の両方において、皮下（ＳＣ）および静脈内（ＩＶ）注射を含む２通りの投与経路について調べ得る。各群について、５、１５、３０、６０、９０、および１２０分という６つの時点について、エンドポイントサンプリングまたは連続サンプリングを用いて評価し得る。各時点、各群、各経路について、少なくとも４匹の動物を使用し得る。作製した分裂促進性ポリペプチドの、サンプル中での濃度を、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳまたはＥＬＩＳＡによって測定し得る。様々な薬物動態と、異なる経路での投与後の吸収／排出ダイナミクスとを計算し得る。

実施例３７ 再生因子についてのさらなる試験
ＦＧＦ１７、ＩＧＦ２、もしくはＢＭＰ７アミノ酸配列と異種ポリペプチドからのアミノ酸配列とを含むポリペプチド、または、線維芽細胞増殖因子受容体アゴニストおよびグリコサミノグリカン、インスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ１Ｒ）アゴニストおよび短鎖脂肪酸、ならびにＢＭＰ受容体アゴニストおよびｍＴＯＲアクチベーターおよび／もしくはグリコサミノグリカンの組み合わせの組み合わせ作用経路についての機序的洞察を、細胞年齢についてのアッセイのパネルを確立してこれに対してスクリーニングすることによって得ることができる。アッセイは、細胞質およびミトコンドリアにおける反応性酸素種（ＲＯＳ）の産生または耐性、テロメラーゼ活性の測定、リソソーム経路、オートファジー経路、およびプロテアソーム経路を介したプロテオスタシス能力の測定、エピジェネティックな再パターン形成、ならびに細胞エネルギーバランス（たとえば、ＡＴＰ／ＡＤＰ比率およびＮＡＤ／ＮＡＤＨ比率）を含む。これらのアッセイの多くは、高スループット自動顕微鏡法を活用して、線維芽細胞、内皮細胞、間葉系幹細胞、および軟骨細胞を含む様々な細胞種に対してこれらの測定を行なうものである。総合的に、これらの測定項目は、ヘパリン結合ｈＰＳＣセクレトームまたはその各成分が再生効果を発揮する経路と機序との両方についての情報を与え得る。これらのディーププロファイルベクトルは、因子の組み合わせへの合理的なアプローチと、機械学習予測とにとって、重要であり得る。

老化の顕著な特徴を改善する目的で細胞に対するセクレトームの効果を試験するために、単一細胞の高スループット自動イメージングおよび定量化による深い集団レベルの統計学の力の達成を使用できる。ヒトの線維芽細胞および上皮細胞、筋芽細胞、間葉系幹細胞、軟骨細胞、および神経前駆細胞における、若齢、老化、および老化＋処理の細胞成分状態プロファイルを比較し得る。試験および方法のいくつかの例は、以下を含む。

エピジェネティック初期化：リプレッシブマークＨ３Ｋ９ｍｅ３、ヘテロクロマチン関連タンパク質ＨＲＩγ、核ラミナ支持タンパク質ＬＡＰ２α。

核膜フォールディング／小疱形成：核膜タンパク質ラミンＡ／Ｃの免疫蛍光。

タンパク質分解性活性：蛍光性タグキモトリプシン様基質の開裂は、プロテアソーム２０Ｓコアパーティクル（ｃｏｒｅ ｐａｒｔｉｃｌｅ）活性に対応する。まず、ＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ色素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でウェルを１０分間染色し得る。ＴＥＣＡＮ蛍光プレートリーダーを使用することにより、細胞数の尺度として、ウェルのシグナルを読み取り得る。次いで、細胞をＨＢＳＳ／Ｃａ／Ｍｇで洗浄した後、キモトリプシン様蛍光発生基質ＬＬＶＹ－Ｒ１１０（Ｓｉｇｍａ）（これがプロテアソーム２０Ｓコアパーティクルによって開裂する）を含有する元の培地に交換し得る。次いで、細胞を、３７℃において５％ＣＯ２中で２時間インキュベートし得て、その後、ＴＥＣＡＮ蛍光プレートリーダーで再びシグナルを読み取り得る。次いで、ＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔによって読み取り値を標準化し得る。

オートファゴソームの形成：ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ Ｄｅｅｐ Ｒｅｄ（Ｓｉｇｍａ）で染色することによって、オートファゴソームの数および体積を測定し得る。次いで、細胞を、３７℃において５％ＣＯ２中で２０分間インキュベートし得て、ＨＢＳＳ／Ｃａ／Ｍｇを使用して２回洗浄し、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ Ｄｅｅｐ Ｒｅｄ細胞標識化色素を使用して１５分間染色し得る。次いで、Ｏｐｅｒｅｔｔａ Ｈｉｇｈ Ｃｏｎｔｅｎｔ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用する単一細胞イメージングのために、細胞をＨＢＳＳ／Ｃａ／Ｍｇに切り換え得る。

エネルギー代謝：ＡＴＰアッセイキット（ａｂ８３３５５、Ａｂｃａｍ、ケンブリッジ、ＭＡ）を製造元の説明書に従って使用する比色分析によって、細胞中のＡＴＰを測定する。細胞を冷リン酸緩衝生理食塩水で洗浄し得て、ホモジナイズし、遠心分離して上清を集め得る。サンプルを３通り、アッセイバッファーを用いてローディングし得る。ＡＴＰ反応混合物およびバックグラウンドコントロール（５０μＬ）をウェルに添加して、暗所で３０分間インキュベートする。ＯＤ５７０ｎｍにおいて、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ２ｅ（モレキュラーデバイス社、サニーヴェール、ＣＡ）を使用して、プレートを読み取る。平均光学濃度を使用し、検量線を基準にして、細胞内ＡＴＰ濃度を推定する。

ミトコンドリア活性：ミトコンドリア膜電位を測定するために、細胞をＨａｍ’ｓ Ｆ１０（血清なし、ペニシリン／ストレプトマイシンなし）で２回洗浄し得る。続いて、ＭｕＳＣを、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ ＦＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｍ７５１４）およびＤＡＰＩで３７℃において３０分間染色し得て、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１０で３回洗浄し得て、ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩＩフローサイトメーターを使用することによって分析し得る。

ミトコンドリアＲＯＳ測定。細胞をＨＢＳＳ／Ｃａ／Ｍｇで洗浄し得て、次いで、ＭｉｔｏＳＯＸ（Ｔｈｅｒｍｏ）（ミトコンドリアへと選択的にターゲティングされていて、スーパーオキシドにより酸化されると蛍光を発する、生細胞透過蛍光発生色素）を含有するＨＢＳＳ／Ｃａ／Ｍｇに切り換え得る。細胞を、３７℃において５％ＣＯ２中で１０分間インキュベートし得る。次いで、細胞をＨＢＳＳ／Ｃａ／Ｍｇで２回洗浄し得て、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ Ｄｅｅｐ Ｒｅｄを使用して１５分間染色し得る。最後に、新しいＨＢＳＳ／Ｃａ／Ｍｇ中において、Ｏｐｅｒｅｔｔａ Ｈｉｇｈ Ｃｏｎｔｅｎｔ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用することにより、細胞をイメージングし得る。

栄養感知の制御不全（Ｄｅｒｅｇｕｌａｔｅｄ Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｓｅｎｓｉｎｇ）：ＳＩＲＴ１のレベルを測定し得る。

老化：老化関連ベータ－ガラクトシダーゼ染色を細胞中において測定し、ＰＢＳで２回洗浄し、次いで、ＰＢＳ中の１５％パラホルムアルデヒドを用いて６分間固定する。細胞をＰＢＳで３回すすぎ得て、その後、Ｘ－ｇａｌ発色基質（内在性ベータガラクトシダーゼにより開裂する）で染色し得る。乾燥を防止するために、プレートを染色溶液中に保持かつパラフィルム化し得て、環境中のＣＯ２において３７℃において一晩インキュベートし得る。翌日に、細胞をＰＢＳで再び洗浄し得て、その後、ライカ明視野顕微鏡でのイメージングのために７０％グリセリン溶液に切り換え得る。

細胞のセクレトーム：炎症性サイトカインプロファイルのための質量分析またはＯ－結合。

軟部組織の堆積：ＳＯＸ９、ＭＭＰ３、ＭＭＰ１３、およびＣＯＬ２Ａ１発現（これの減少は、軟骨減少、疼痛、口唇裂、および関節破壊によって特徴づけられる）のための免疫蛍光。

実施例３８ 精製したＩＧＦ２－ｈＦｃｍが筋芽細胞の分化を増進させた
ＩＧＦ２－ｈＦｃｍをコードするプラスミドにて、懸濁ＣＨＯ細胞を一過性トランスフェクションした。４日後、培養上清を回収し、タンパク質ＡメンブレンカラムによってＩＧＦ２－ｈＦｃｍをアフィニティ精製した。精製したＩＧＦ２－ｈＦｃｍをヒト筋芽細胞の培養物中に添加した。ミオシン重鎖（ＭｙＨＣ）を免疫染色し、蛍光顕微鏡によってイメージングした。染色されたＭｙＨＣを定量化した後、視野内において、染色されたチャネル中でバックグラウンドを超えて照射されたピクセルの割合として、ＭｙＨＣの面積の割合を計算した。精製したＩＧＦ２－ｈＦｃｍで処理したマウス筋芽細胞のＥｄＵの割合は、空のコントロールベクターを発現するＣＨＯ細胞の培養上清で処理したマウス筋芽細胞のＥｄＵの割合よりも有意に高い。有意性は、ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ Ｔｕｋｅｙ Ｈｏｎｅｓｔ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ検定によって、０．０５未満のｐ値にて判断した。

表５：ＩＧＦ２が筋芽細胞の分化を増進させた

この例においては、ＩＧＦ２融合タンパク質が細胞増殖を誘発できることが見いだされた。ＩＧＦ２融合タンパク質とＨＡＰとはｉｎ ｖｉｔｒｏ特性を共有しており、このことは、ｉｎ ｖｉｖｏ特性も共有し得ることを示唆する。

実施例３９ ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＩＧＦ２組成物での筋ジストロフィーの処置のモデル化
筋ジストロフィー（ＭＤ）は、典型的には骨格筋の形成および安定化を担うタンパク質をコードする遺伝子における遺伝子変異によって生じる、様々な筋変性疾患を包含する。これらの遺伝子の変異によって表現型に生じる結果は、筋肉の量および強さにおける経時的かつ進行性の減少であり、これはサルコペニアの場合と類似するが、これを引き起こす原因は異なる。ＨＡＰはサルコペニックな筋肉における表現型の改善をもたらすため、ＭＤのモデルにおいて類似する改善を調べるために試験した。

１型筋強直性ジストロフィー（ｈＭＤ）（ＤＭＰＫ１遺伝子における変異によって引き起こされる筋ジストロフィー）を有する個体からのヒト筋肉前駆細胞の増殖および／または融合を増進させる能力について、ＩＧＦ２をそれぞれ試験した。筋原性活性に及ぼすＩＧＦ２の効果を、予期される生理的レベルを中心としてその周りの広範囲の濃度にわたって、生物学的に３通りアッセイし、これは、ｈＭＤ筋芽細胞に各因子を７２時間添加し、培地交換を毎日行ない（ＤＭＥＭ＋２％ウマ血清）、最初の培地交換時に因子の２回目の適用を行なうことによって行なった。７２時間後または９６時間後に、細胞にＥｄＵ（３０ｕＭ）を２～５時間適用し、エタノールで固定し、ヘキスト３３４２で染色し、免疫染色して増殖を調べ（ＥｄＵで陽性染色された細胞の割合（％ＥｄＵ）によって測定）、免疫染色して分化を調べた（培地およびビヒクルのみを添加したネガティブコントロールを基準にした、胚ミオシン重鎖が陽性染色された細胞の面積における増加（％ｅＭｙＨＣ）によって測定）。キーエンスＢＺ－１００を用いてウェルを４倍でイメージングし、Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｆｉｌｅｒにおいて画像を定量し、統計をＲで計算した。さらに、筋芽細胞からＲＮＡを抽出して、ｑＰＣＲにより定量した転写物の存在量を選択した。図７Ａおよび図７Ｂは、ＩＧＦ２処理がＤＭ１ヒト筋芽細胞（３２歳の白人女性）の増殖および分化をそれぞれ促進したことを示す。図８Ａおよび図８Ｂは、ＩＧＦ２がＤＭ１ヒト筋芽細胞（３２歳の白人女性）におけるＭＹＨ３、ＣＫＭ、およびＡＴＰ１Ｂ１の発現を増大させたことを示す。

実施例４０ 治療用ポリペプチドの全身投与がサルコペニアを改善し、筋損傷から保護する
７８週齢のマウスに、治療用ポリペプチドまたはビヒクル単独の皮下注射を１４日間にわたって毎日投与する。ＩＧＦ２は、１００～１０００μｇ／ｋｇの濃度において注射する。いくつかの実験においては処置群には治療用因子を１種与え、その他の実験においては処置群に因子の組み合わせを与える。７日目に、前肢の握力および両肢の握力によって筋肉機能を評価する。１２、１３、および１４日目に、群１および群２にＢｒｄＵを腹腔内注射する。１３～１５日目に、すべてのマウスの握力を評価し、持久力試験によって最大距離および最大速度および強縮力を調べる。

１５日目に、群１および群２のマウスを安楽死させ、筋肉を分析して増殖および線維症のマーカーについて調べる。１５日目に、１．２％のＢａＣｌ_２の筋肉内注射（７ｕｌ／ＴＡ）を使用して、群３および群４のＴＡ中に化学的損傷を生じさせる。群３および群４のマウスには、１５～２１日目に治療用ポリペプチドの皮下注射を継続する。また、これらには、１９、２０、および２１日目に腹腔内にＢｒｄＵ注射を行なう。２１日目に、ＴＡ筋の試験を行なってｉｎ ｓｉｔｕ強縮力について調べる。ＴＡ筋を切開して、増殖および線維症の兆候について評価する。

実施例４１ 融合ポリペプチドの全身投与が誘発性筋萎縮を改善する
１２週齢のマウスを３つの処置群に分ける：ビヒクルのみを注射する群１、デキサメタゾンを注射する群２、ならびにデキサメタゾンおよびＩＧＦ２融合ポリペプチドを注射する群３。デキサメタゾン（２５ｍｇ／ｋｇ 腹腔内）は、ＩＧＦ２融合ポリペプチドの皮下注射と同時に、１４日間投与する。

７日目に、前肢および両肢の握力についてマウスを評価する。１３～１５日目に、握力、ｉｎ ｖｉｖｏにおける強縮力についてマウスを評価し、トレッドミル持久力試験を行なって最大速度および最大距離を調べる。

実施例４２ ＩＧＦ２融合ポリペプチドの全身投与は遺伝性肥満マウスにおいて筋萎縮を改善することが予測される
１３週齢の遺伝性肥満マウス（ｏｂ／ｏｂ）に、ＩＧＦ２融合ポリペプチドを皮下に１４日間注射し得る。７日目に、前肢および両肢の握力を測定し得る。１２、１３、および１４日目に、ＢｒｄＵを注射する。１３、１４、および１５日目に、前肢および両肢の握力ならびにｉｎ ｖｉｖｏにおける強縮力を試験し得て、最大距離および最大速度を調べるために持久力試験を行なう。１４日目に、マウスを安楽死させ得て、ＴＡ筋を切開し得る。筋肉重量および増殖を分析し得る。

実施例４３ ＩＧＦ２融合ポリペプチドの全身投与は７０週齢のｍｄｘマウスにおいてジストロフィーの特徴を改善または減速させることが予測される
処置が必要な別のクラスのヒトミオパチーは、遺伝子異常により誘発される筋ジストロフィーであり、その中でも、デュシェンヌ型筋ジストロフィーは、稀ではあるが死亡に至るものである。高齢の遺伝性ジストロフィー（ｍｄｘ）マウス（１５ヶ月齢を超える）は、ヒトデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）と類似する特徴を示し、とりわけ、筋肉再生の低下が筋肉消耗を導く。ＩＧＦ２融合ポリペプチドでの処置によって、高齢ｍｄｘマウスのジストロフィーの特徴を改善できる。順化期間中に、重量、前肢および両肢の握力、ならびにｉｎ ｖｉｖｏにおける強縮力を評価して、各マウスについてベースラインの強さを調べ得る。７０週齢のジストロフィーマウス（ｍｄｘ）に、ＩＧＦ２融合ポリペプチドを皮下に１４日間注射する。７日目に、前肢および両肢の握力を測定する。１２、１３、および１４日目に、ＢｒｄＵを注射する。１３、１４、および１５日目に、前肢および両肢の握力ならびにｉｎ ｖｉｖｏにおける強縮力を試験し、最大距離および最大速度を調べるために持久力試験を行なう。右の前脛骨および腓腹筋を採取し得て、Ｔｉｓｓｕｅ－ＴＥＫ ＯＣＴ中に浸漬し、次いで、液体窒素中で予備冷却しておいた冷イソペンタン浴中で急速に凍結させて、－８０℃において保存し得る。組織を切片化し得て、ラミニンを染色して筋線維の断面積（ｃｒｏｓｓ ｓｅｃｔｉｏｎａｌ ａｒｅａ；ＣＳＡ）を調べ、ｅＭｙＨＣを染色して新しい線維の形成を測定し、ＢｒｄＵを染色して増殖率を評価し得る。左の前脛骨および腓腹筋を採取し得て、液体窒素中で急速に凍結させて、ｑＰＣＲおよびウェスタンブロットを含む分子分析を行ない得る。

ＩＧＦ２は１０～２００ｕｇ／ｋｇの濃度において有効であることが予測される。

実施例４４ ＩＧＦ２融合ポリペプチドの全身投与は６週齢のマウスにおいてジストロフィーの特徴を改善することが予測される
３～６週齢において、ｍｄｘマウスの骨格筋に重症の壊死を与えると、これに続いて衛星細胞の活性化が増大して筋肉再生が増進される。本明細書中において記載されるＩＧＦ２融合ポリペプチドでの処置は、再生プロセス、よって筋肉の健康状態を改善できる。順化期間中に、重量、前肢および両肢の握力、ならびにｉｎ ｖｉｖｏにおける強縮力を評価して、各マウスについてベースラインの強さを調べ得る。６週齢のジストロフィーマウス（ｍｄｘ）に、ＩＧＦ２融合ポリペプチドを皮下に１４日間注射する。７日目に、前肢および両肢の握力を測定する。１２、１３、および１４日目に、ＢｒｄＵを注射する。１３、１４、および１５日目に、前肢および両肢の握力ならびにｉｎ ｖｉｖｏにおける強縮力を試験し、最大距離および最大速度を調べるために持久力試験を行なう。

マウスを安楽死させ得る。右の前脛骨および腓腹筋を採取し得て、Ｔｉｓｓｕｅ－ＴＥＫ ＯＣＴ中に浸漬し、次いで、液体窒素中で予備冷却しておいた冷イソペンタン浴中で急速に凍結させて、－８０℃において保存し得る。組織を切片化し得て、ラミニンを染色して筋線維の断面積（ＣＳＡ）を調べ、ｅＭｙＨＣを染色して新しい線維の形成を測定し、ＢｒｄＵを染色して増殖率を評価し得る。左の前脛骨および腓腹筋を採取し得て、液体窒素中で急速に凍結させて、ｑＰＣＲおよびウェスタンブロットを含む分子分析を行ない得る。

ＩＧＦ２は、１０～２００μｇ／ｋｇの濃度において有効であることが予測される。

実施例４５ 軟骨損傷および変形性関節症における軟骨細胞増殖のための処置
軟骨は、突然の損傷の結果として、または漸進的な摩耗および裂傷もしくは炎症によって、損傷し得て、疾患状態（たとえば、変形性関節症）が導かれ得る。軟骨細胞は軟骨マトリックスを分泌し、軟骨に関連する細胞種は、前駆脂肪細胞、骨細胞、および腱細胞がすべてである。

前駆脂肪細胞、軟骨細胞、骨細胞、および腱細胞をウェルプレート中で培養した。各ウェルからＲＮＡを単離して（ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ）、逆転写（Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によってｃＤＮＡを得た。ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ３（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して、リアルタイム定量ＰＣＲを行なった。

これらの軟骨関連細胞は、ＦＧＦ１７、ＩＧＦ２、もしくはＢＭＰ７アミノ酸配列と異種ポリペプチドからのアミノ酸配列とを含むポリペプチド、または、線維芽細胞増殖因子受容体アゴニストおよびグリコサミノグリカン、インスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ１Ｒ）アゴニストおよび短鎖脂肪酸、ならびにＢＭＰ受容体アゴニストおよびｍＴＯＲアクチベーターおよび／もしくはグリコサミノグリカンの組み合わせに対する受容体を発現した。皮下前駆脂肪細胞、軟骨細胞、骨細胞、および腱細胞はすべて、１種以上の受容体を発現し、このことは、上述される、ＦＧＦ１７、ＩＧＦ２、もしくはＢＭＰ７アミノ酸配列と異種ポリペプチドからのアミノ酸配列とを含むポリペプチド、または、線維芽細胞増殖因子受容体アゴニストおよびグリコサミノグリカン、インスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ１Ｒ）アゴニストおよび短鎖脂肪酸、ならびにＢＭＰ受容体アゴニストおよびｍＴＯＲアクチベーターおよび／もしくはグリコサミノグリカンの組み合わせが、軟骨の減少、および関節に関連する損傷の増悪、または疾患の回復に影響を及ぼし得るということを示す。

実施例４６ 治療用組成物の臨床試験
この研究の目的は、サルコペニア、筋ジストロフィーと診断された健康な個体または手術から回復中の個体における、ＦＧＦ１７、ＩＧＦ２、もしくはＢＭＰ７アミノ酸配列と異種ポリペプチドからのアミノ酸配列とを含むポリペプチド、または、線維芽細胞増殖因子受容体アゴニストおよびグリコサミノグリカン、インスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ１Ｒ）アゴニストおよび短鎖脂肪酸、ならびにＢＭＰ受容体アゴニストおよびｍＴＯＲアクチベーターおよび／もしくはグリコサミノグリカンの組み合わせの、複数の用量レベルでの繰り返し投与について、安全性、忍容性、および薬物動態を調べることである。特定の実施形態において、筋ジストロフィーは筋強直性ジストロフィーである。さらに、この研究から、こうした個体におけるＩＧＦ２融合ポリペプチドでの処置によって生じる身体機能、骨格筋量、および強さについてのデータも取得できる。個体に、プラセボまたはＩＧＦ２融合ポリペプチド組成物を投与し得て、２５週間の研究期間にわたって監視し得る。以下に記載される主要評価項目および副次評価項目（ｐｒｉｍａｒｙ ａｎｄ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｏｕｔｃｏｍｅ ｍｅａｓｕｒｅｓ）について評価し得る。

主要評価項目：
安全性および忍容性：研究アーム１つあたりの有害事象の割合などの様々な項目によって評価。

副次評価項目：
血漿薬物動態（Ｃｍａｘ、Ｔｍａｘ、ＡＵＣ）［投与後０．５、１、１．５、２、４、６、８、１２、および２４時間での血漿。］
簡易的身体機能評価（Ｓｈｏｒｔ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｂａｔｔｅｒｙ；ＳＰＰＢ）。ベースラインから２５週目までの変化。

１０メートル歩行試験。ベースラインから２５週目までの変化。

二重エネルギーＸ線吸収測定（Ｄｕａｌ－ｅｎｅｒｇｙ Ｘ－ｒａｙ Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｍｅｔｒｙ；ＤＥＸＡ）により測定される総除脂肪体重および四肢骨格筋指数における、ベースラインから２５週目までの変化。

選択基準（Ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｃｒｉｔｅｒｉａ）：
サルコペニア、筋ジストロフィーの診断、または手術からの回復；ＤＸＡにより確認される筋肉量減少；歩行速度低下；ＳＰＰＢスコア９以下；体重少なくとも３５ｋｇ；患者との面談により決定された十分な食事摂取。１人で１０メートル歩行可能。

プロトコール
患者に、プラセボ（５％デキストロース溶液）または処置品（５％デキストロース中）を静脈投与し得る。第１週の１日目に開始し、毎週繰り返す（第１週～第２５週の１日目）。第１３週および第２５週の最後に、上述される方法によって患者の改善を評価し得る。用量は慣習的な３＋３設計から選択し得て、用量制限毒性を示さない上から２つの用量として選択し得る。

本発明の好ましい実施形態が本明細書中において示されかつ記載されているが、当業者には、このような実施形態が例示のみを目的として提供されていることが明らかである。当業者であれば、本発明から逸脱することなく、非常に多くの変形、変更、および置き換えを想起し得る。本発明を実施する際には、本明細書中において記載される発明の実施形態に対して様々な代案を使用し得ることが理解される。

本明細書において言及されるすべての出版物、特許出願、発行済特許、およびその他の文献を、当該出版物、特許出願、発行済特許、またはその他の文献の各々の全体の具体的かつ個別の引用による援用と同程度にて、本明細書に引用により援用する。引用により援用するテキスト中に含まれる定義と、本開示における定義とが矛盾する場合には、前者は除外される。

精製したＩＧＦ２－ｈＦｃｍがヒト筋芽細胞の分化を増進させたことを示す。 酪酸ナトリウムが筋融合を増大させたことを示す。 酪酸ナトリウムがＩＧＦ２活性を増大させたことを示す。 酪酸ナトリウムがＩＧＦ２活性を増大させたことを示す。 さらなる用量のビヒクル、ＩＧＦ２、酪酸ナトリウム、またはＩＧＦ２および酪酸ナトリウムでの処理によるｅＭｙＨＣ陽性細胞の面積の割合における変化を示す。 さらなる用量のビヒクル、ＩＧＦ２、酪酸ナトリウム、またはＩＧＦ２および酪酸ナトリウムでの処理によるｅＭｙＨＣ陽性細胞の面積の割合における変化を示す。 ＩＧＦ２受容体が軟骨細胞および骨細胞上に発現したことを示す。 ＢＭＰ７が筋芽細胞の増殖を誘発したことを示す（新たに形成された核によって測定）。 ＢＭＰ７が筋芽細胞の増殖を誘発したことを示す（核の総数によって測定）。 ロイシンがＢＭＰ７の分裂促進活性を増大させたことを示す。 ヒアルロン酸（ＨＡ）がＢＭＰ７の分裂促進活性を増大させたことを示す。 ＢＭＰ７受容体がヒト筋芽細胞において発現したことを示す。 軟骨損傷および変形性関節症における軟骨細胞増殖のための処理を示す。 培地上清の一部としてのまたは精製したＦＧＦ１７－ｈＦｃｍがマウス筋芽細胞の増殖を増進させたことを示す（図１０Ｂ）。 培地上清の一部としてのまたは精製したＦＧＦ１７－ｈＦｃｍがマウス筋芽細胞の増殖を増進させたことを示す（図１０Ｂ）。 ＦＧＦ１７配列の変異がＣＨＯ細胞におけるタンパク質発現レベルを改善したことを示す。 培地上清の一部としてのまたは精製したＦＧＦ１７配列の変異がマウス筋芽細胞の増殖を増進させたことを示す。 さらなるＦＧＦ１７変異体がＣＨＯ細胞におけるタンパク質発現レベルを改善したことを示す。 培地上清の一部としてのまたは精製したさらなるＦＧＦ１７配列の変異がマウス筋芽細胞の増殖を増進させたことを示す。 ＦＧＦ１７受容体がヒト筋芽細胞において発現したことを示す。 ヘパリンがＦＧＦ１７の分裂促進活性を増大させたことを示す。 ヒアルロン酸（ＨＡ）がＦＧＦ１７の分裂促進活性を増大させたことを示す。 ＦＧＦ１７の筋肉内投与がＢａＣｌ２損傷高齢マウスモデルにおける筋肉の再生を増進させたことを実証する実験の全体像を示す。 ＦＧＦ１７の筋肉内投与がＢａＣｌ２損傷高齢マウスモデルにおいて筋肉の再生を増進させたことを示す（新しい線維の形成によって測定）。 ＦＧＦ１７の筋肉内投与がＢａＣｌ２損傷高齢マウスモデルにおいて線維症の低減によって筋肉の再生を増進させたことを示す。 ＦＧＦ１７の全身投与がデキサメタゾンにより誘発される筋萎縮から保護することを実証する実験の全体像を示す。 ＦＧＦ１７の全身投与がデキサメタゾンにより誘発される筋萎縮から保護したことを示す（筋肉量変化の割合によって（図１７Ｂ）、前肢の比力によって（図１７Ｃ）、および両肢の力によって（図１７Ｄ）測定）。 ＦＧＦ１７の全身投与がデキサメタゾンにより誘発される筋萎縮から保護したことを示す（筋肉量変化の割合によって（図１７Ｂ）、前肢の比力によって（図１７Ｃ）、および両肢の力によって（図１７Ｄ）測定）。 ＦＧＦ１７の全身投与がデキサメタゾンにより誘発される筋萎縮から保護したことを示す（筋肉量変化の割合によって（図１７Ｂ）、前肢の比力によって（図１７Ｃ）、および両肢の力によって（図１７Ｄ）測定）。

実施例３ ＩＧＦ２－ＬｈＦｃ４がヒト筋芽細胞の分化を増進させた
ＩＧＦ２－ＬｈＦｃ４をコードするプラスミドにて、懸濁ＣＨＯ細胞を一過性トランスフェクションした。タンパク質Ａメンブレンカラムによって、ＩＧＦ２－ＬｈＦｃ４をアフィニティ精製した。精製したＩＧＦ２－ＬｈＦｃ４をヒト筋芽細胞の培養物中に９６時間添加し、培地交換を毎日行なった。ミオシン重鎖（ＭｙＨＣ）を免疫染色して、蛍光顕微鏡によってイメージングした。精製したＩＧＦ２－ＬｈＦｃ４で処理したヒト筋芽細胞のＭｙＨＣの面積の割合は、ビヒクルコントロールで処理したヒト筋芽細胞のＭｙＨＣの面積の割合よりも有意に高い（Ｏｎｅ－Ｗａｙ ＡＮＯＶＡ Ｔｕｋｅｙ Ｈｏｎｅｓｔ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ、ｎ＝２～６）。

実施例４ 精製したＨＳＡ－Ｌ－ＩＧＦ２Ｒ６１Ａ ヒト筋芽細胞の分化
ＨＳＡ－Ｌ－ＩＧＦ２Ｒ６１Ａをコードするプラスミドにて、懸濁ＣＨＯ細胞を一過性トランスフェクションした。タンパク質Ａメンブレンカラムによって、ＨＳＡ－Ｌ－ＩＧＦ２Ｒ６１Ａをアフィニティ精製した。精製したＨＳＡ－Ｌ－ＩＧＦ２Ｒ６１Ａをヒト筋芽細胞の培養物中に９６時間添加し、培地交換を毎日行なった。ミオシン重鎖（ＭｙＨＣ）を免疫染色して、蛍光顕微鏡によってイメージングした。精製したＨＳＡ－Ｌ－ＩＧＦ２Ｒ６１Ａで処理したヒト筋芽細胞のＭｙＨＣの面積の割合は、ビヒクルコントロールで処理したヒト筋芽細胞のＭｙＨＣの面積の割合よりも有意に高い（Ｏｎｅ－Ｗａｙ ＡＮＯＶＡ Ｔｕｋｅｙ Ｈｏｎｅｓｔ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ、ｎ＝２～６）。

実施例５ ＩＧＦ２およびＩＧＦ２受容体がヒト筋芽細胞において発現する
若齢（１７～２１歳の白人男性）および老化（６８～６９歳の白人男性）ヒト筋芽細胞の細胞株におけるＩＧＦ２およびＩＧＦ２受容体ＲＮＡＳｅｑ発現についての棒グラフおよび定量表。増殖培地（ＧＭ）または融合培地（ＦＭ）中で筋芽細胞を９６時間培養した。２４時間毎に新しい培地を添加した。平均±ＳＥＭ。ｎ＝６。発現をＦＰＫＭとして表す。有意なｐ値（若齢ＧＭ～老化ＧＭ：３．５４Ｅ－０４）。

実施例６ 酪酸ナトリウムが筋融合を増大させる
マウス筋芽細胞を、ＰＢＳまたは濃度０．１ｎＭ、１ｎＭ、および１０ｎＭの酪酸ナトリウムにて処置した。筋芽細胞を４８時間培養し、２４時間毎に新しい培地を添加した。細胞にＥｄＵ（３０ｕＭ）を２～５時間適用し、エタノールで固定し、ヘキスト３３４２で染色し、免疫染色して増殖を調べ（ＥｄＵで陽性染色された細胞の割合（％ＥｄＵ）によって測定）、免疫染色して分化を調べた（培地およびビヒクルのみを添加したネガティブコントロールを基準にした、胚ミオシン重鎖が陽性染色された細胞の面積における増加（％ｅＭｙＨＣ）によって測定）。未処理の筋芽細胞と比較すると、酪酸ナトリウム１ｎＭで処理した細胞は、図２Ａ中に示されるように、融合率が増大した。有意性は、ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ Ｔｕｋｅｙ Ｈｏｎｅｓｔ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ検定によって、０．０５未満のｐ値にて判断した。

図２Ａ：ビヒクルとの比較における酪酸ナトリウム（ＮａＢｕｔ）に応答した融合指数についての棒グラフ。示された用量のＮａＢｕｔの存在下において、筋芽細胞を４８時間培養した。２４時間毎に新しい培地およびＮａＢｕｔを添加した。平均±Ｓ．Ｄ．。また、融合指数およびｐ値についての表定量を示す。（スチューデント両側Ｔ検定により^＊ｐ＜０．０５、ｎ＝３～５）

図２Ｂ：ビヒクルとの比較における酪酸ナトリウム（ＮａＢｕｔ）に応答したマウス筋芽細胞の融合指数についての棒グラフ。示された用量のＮａＢｕｔの存在下において、マウス筋芽細胞を４８時間培養した。２４時間毎に新しい培地およびＮａＢｕｔを添加した。平均±Ｓ．Ｄ．。融合指数およびｐ値についての表定量を示す。（スチューデント両側Ｔ検定により^＊ｐ＜０．０５、ｎ＝３～５）。有意なｐ値（ビヒクル～ＩＧＦ２：０．０１５ｕｇ／ｍＬ：６．３３Ｅ－０６、ビヒクル～ＮａＢｕｔ：１ｎＭ ＩＧＦ２：０．０１５ｕｇ／ｍＬ：１．７９Ｅ－１１、ビヒクル～ＮａＢｕｔ：１００ｎＭ ＩＧＦ２：０．０１５ｕｇ／ｍＬ：１．７９Ｅ－１１）
図２Ｂについてのデータの表

図２Ｃ ＩＧＦ２（１５ｎｇ／ｍＬ）との比較における、示される処理に応答したｅＭｙＨＣ陽性ヒト筋芽細胞の面積％の棒グラフ定量。示された用量のＢＭＰ７の存在下において、筋芽細胞を９６時間培養した。２４時間毎に新しい培地およびＢＭＰ７を添加した。平均±Ｓ．Ｄ．。（Ｏｎｅ－Ｗａｙ ＡＮＯＶＡ Ｔｕｋｅｙ Ｈｏｎｅｓｔ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅにより^＊ｐ＜０．０５、ｎ＝２～１２）
図２Ｃについてのデータの表

実施例８ 酪酸ナトリウムがＩＧＦ２活性を増大させる
ＰＢＳ（ビヒクル）、ＩＧＦ２（１５ｎｇ／ｍＬ）、酪酸ナトリウム、またはＩＧＦ２および酪酸ナトリウムのいずれかにて、ヒト筋芽細胞を処理した。２４時間毎に新しい培地を添加した。４８時間後、細胞にＥｄＵ（３０ｕＭ）を２～５時間適用し、エタノールで固定し、ヘキスト３３４２で染色し、免疫染色して増殖を調べ（ＥｄＵで陽性染色された細胞の割合（％ＥｄＵ）によって測定）、免疫染色して分化を調べた（培地およびビヒクルのみを添加したネガティブコントロールを基準にした、胚ミオシン重鎖が陽性染色された細胞の面積における増加（％ｅＭｙＨＣ）によって測定）。図３Ａ中においてみられるように、ｅＭｙＨｃ陽性細胞の総面積を分析し、処理した細胞を、ビヒクル単独で処理した細胞と比較した。０．０３ｕｇ／ｍＬのＩＧＦ２またはＩＧＦ２と酪酸ナトリウムとの組み合わせで処理した筋芽細胞は、ビヒクル単独で培養した細胞と比較した場合に、ｅＭｙＨＣ陽性面積における有意な増加を示した。

図３Ａ：ビヒクル（ビヒクル）との比較における、示される処理に応答したｅＭｙＨＣ陽性老化ヒト筋芽細胞（６８歳の白人男性）の面積％の棒グラフ。示された用量の因子の存在下において、筋芽細胞を９６時間培養した。２４時間毎に新しい培地および因子を添加した。平均±Ｓ．Ｄ．。有意なｐ値（ビヒクル～ＩＧＦ２：０．０３ｕｇ／ｍＬ：１．４２Ｅ－０８、ビヒクル～ＮａＢｕｔ：１ｎＭ ＩＧＦ２：０．０３ｕｇ／ｍＬ：１．７９Ｅ－１１、ビヒクル～ＮａＢｕｔ：１０ｎＭ ＩＧＦ２：０．０３ｕｇ／ｍＬ：１．８０Ｅ－１１、ビヒクル～ＮａＢｕｔ：１００ｎＭ ＩＧＦ２：０．０３ｕｇ／ｍＬ：１．７９Ｅ－１１）。図３Ｂ ＩＧＦ２（１５ｎｇ／ｍＬ）との比較における、示される処理に応答したｅＭｙＨＣ陽性ヒト筋芽細胞（６８歳の白人男性）の面積％の棒グラフ定量。示された用量のＢＭＰ７の存在下において、筋芽細胞を９６時間培養した。平均±Ｓ．Ｄ．。有意なｐ値（ＩＧＦ２～ＮａＢｕｔ：１ｎＭ ＩＧＦ２：０．０３ｕｇ／ｍＬ：１．８８Ｅ－３、ビヒクル～ＮａＢｕｔ：１０ｎＭ ＩＧＦ２：０．０３ｕｇ／ｍＬ：４．８０Ｅ－３、ビヒクル～ＮａＢｕｔ：１００ｎＭ ＩＧＦ２：０．０３ｕｇ／ｍＬ：１．８７Ｅ－３）（Ｏｎｅ－Ｗａｙ ＡＮＯＶＡ Ｔｕｋｅｙ Ｈｏｎｅｓｔ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅにより^＊ｐ＜０．０５、ｎ＝２～１２）
図３Ａについてのデータの表

ＩＧＦ２および酪酸ナトリウムの組み合わせで処理した筋芽細胞を、ＩＧＦ２単独で処理した細胞と比較した。図３Ｂおよび表１２中に示されるように、ＩＧＦ２単独で処理した細胞と比較して、組み合わせで処理したすべての細胞では有意に増加した。有意性は、ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ Ｔｕｋｅｙ Ｈｏｎｅｓｔ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ検定によって、０．０５未満のｐ値にて判断した。

図３Ｂについてのデータの表

実施例９ ＩＧＦ２がＤＭ１ヒト筋芽細胞においてＭＹＯＧの発現を増大させる
ＦＭ（ビヒクル）との比較における、示される処理に応答したＤＭ１ヒト筋芽細胞における筋原性遺伝子発現の倍率変化についての棒グラフ。因子（ＢＭＰ７ ５０ｎｇ／ｍＬ、ブチレート１００ｎＭ、ＩＧＦ２ ２００ｎｇ／ｍＬ）の存在下において、筋芽細胞を４８時間培養した。平均±Ｓ．Ｄ．。有意なｐ値（ＦＭ～ＩＧＦ２：４．９４Ｅ－０４、ＦＭ～ＩＧＦ２＿ＮａＢｕｔ：６．５３Ｅ－０３）（^＊ｐ＜０．０１） ＭＹＦ５、ＭＹＯＤ１、およびＭＹＯＧの平均およびｐ値の表（ｎ＝３）。

データの表

実施例１０ 軟骨細胞および骨細胞上にＩＧＦ２受容体が発現する
図４Ａ：ＩＧＦ２受容体が軟骨関連細胞上に発現することを示す棒グラフ。データはRamilowsky et al, Nature 2015から得られる。
図４ＡのＲＮＡ発現についてのデータの表（ＴＰＭ）

実施例１１ ＩＧＦ２処理がＤＭ１ヒト筋芽細胞（３２歳の白人女性）において増殖および融合を増進させる
ＥｄＵ陽性ヒト筋芽細胞（３２歳の白人女性）％についての棒グラフ、およびＩＧＦ２に応答したＭｙＨＣの面積％。筋芽細胞を、増殖のために７２時間、融合のために９６時間培養した（示される因子の存在下）。平均±Ｓ．Ｄ．。平均±ＳＤ。有意なｐ値（ＥｄＵ：ビヒクル～ＩＧＦ２：６．８Ｅ－３、％ｅＭｙＨＣ面積：ビヒクル～ＩＧＦ２：１．９Ｅ－４）（スチューデント両側Ｔ検定により^＊ｐ＜０．０５、ｎ＝３～６）。

データの表

データの表

実施例１２ ＩＧＦ２がＤＭ１ヒト筋芽細胞（３２歳の白人女性）においてＭＹＨ３、ＣＫＭ、およびＡＴＰ１Ｂ１の発現を増大させる
ビヒクルとの比較における、示される処理に応答したＤＭ１ヒト筋芽細胞（３２歳の白人女性）におけるＭＹＨ３およびＣＫＭ発現の倍率変化についての棒グラフ。因子（ＩＧＦ２ ２００ｎｇ／ｍＬ）の存在下において、筋芽細胞を９６時間培養した。平均±Ｓ．Ｄ．。有意なｐ値（ＭＹＨ３：ビヒクル～ＩＧＦ２：１．１３Ｅ－０３、ＣＫＭ：ビヒクル～ＩＧＦ２：７．６７Ｅ－０３） ＦＭ（ビヒクル）との比較における、示される処理に応答したＤＭ１ヒト筋芽細胞（３２歳の白人女性）におけるＡＴＰ１Ｂ１発現の倍率変化についての棒グラフ。因子（ＩＧＦ２ ２００ｎｇ／ｍＬ）の存在下において、筋芽細胞を４８時間培養した。平均±Ｓ．Ｄ．。有意なｐ値（ビヒクル～ＩＧＦ２：３．１１Ｅ－０５）（スチューデント両側Ｔ検定により^＊ｐ＜０．０５、ｎ＝３）。

データの表

データの表

実施例１３ ＩＧＦ２／ＮａＢの全身投与が、老化により誘発される筋機能不全から保護する
ＩＧＦ２（５０ｕｇ／ｋｇ）またはＮａＢ（１．２ｇ／ｋｇ）、ＩＧＦ２／ＮａＢ（１５０ｕｇ／ｋｇ、１．２ｇ／ｋｇ）またはビヒクル（ＰＢＳ）の皮下注射を、２１～２４ヶ月齢のマウスに１４日間投与した。１３日目および１４日目に筋肉機能を評価した。１３日目に評価した握力。第１のグラフは両肢の握力を示す、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、^＊＊ｐ＝０．００４３、^＊＊ｐ＝０．００１（Ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ、多重比較）。前肢の力、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、^＊ｐ＝０．０３６８、^＊ｐ＝０．０１８７（Ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ、多重比較）。２分毎に速度が２ｍ／分ずつ徐々に増加するように設定した誘導性トレッドミルランニングモデル（ｉｎｄｕｃｅｄ ｔｒｅａｄｍｉｌｌ ｒｕｎｎｉｎｇ ｍｏｄｅｌ）を使用して、１４日目にトレッドミル成果を測定した。走行距離が示される。^＊＊＊ｐ＝０．０００５、^＊ｐ＝０．０４５９、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１（Ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ、多重比較） 疲弊化までの時間 ^＊＊＊ｐ＝０．０００２、^＊＊ｐ＝０．００２４（Ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ、多重比較） 最大速度 ^＊＊＊ｐ＝０．０００４、^＊＊ｐ＝０．００１３ 仕事（ｋｊ） ^＊＊ｐ＝０．００２６、^＊＊ｐ＝０．００３５（Ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ、多重比較）。

実施例１４ ＩＧＦ２／ＮａＢの全身投与は安全である
ビヒクルまたはＩＧＦ２／ＮａＢの皮下注射を、２１ヶ月齢マウスに１４日間投与し、血液および血清を採取して、全血球数と肝臓、腎臓、および膵臓の機能のための代謝パネルとを評価した。測定した３７のリードアウトのうちの４つの代表的なグラフであって、白血球細胞数（独立ｔ検定、ｐ＝０．８０２０）、アルブミン濃度（独立ｔ検定、ｐ＞０．９９９９）、クレアチニン濃度（独立ｔ検定、ｐ＝０．５４９０）、およびカルシウム濃度（独立ｔ検定、ｐ＝０．８１１）を示す。

実施例１５ ＩＧＦ２／Ｂｕｔの全身投与が、デキサメタゾンにより誘発される筋萎縮から保護する
デキサメタゾン（２５ｍｇ／ｋｇ 腹腔内）を、ＩＧＦ２／ＮａＢ（１５０ｕｇ／ｋｇ、１．２ｇ／ｋｇ）またはビヒクル（ＰＢＳ）の皮下注射と同時に、１２週齢のマウスに１４日間投与した。１３～１４日目に筋肉機能を評価した。１３日目に握力を評価した、グラフは、１３日目に測定した両肢の力と両肢の比力とを示す。両肢の比力は、重量（ｇ）に対する両肢の力（ｍＮ）の比率として計算した、^＊＊＊ｐ＝０．０００３、^＊＊＊ｐ＝０．０００４（独立ｔ検定）。１３日目に握力を評価した、グラフは、１３日目に測定した前肢の力と前肢の比力とを示す。前肢の比力は、重量（ｇ）に対する前肢の力（ｍＮ）の比率として計算した、^＊＊ｐ＝０．００１２、^＊＊＊ｐ＝０．０００５（独立ｔ検定）。１５日目に、マウスを安楽死させて、組織学的分析のためにＴＡを採取した、グラフは、ＳＭＡＳＨソフトウェアを使用して評価した筋線維サイズ分布を示す。^＊＊ｐ＝０．０５４、^＊ｐ＝０．０３７、および^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１（２－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ、多重比較）。

実施例１６ ＢＭＰ７が筋芽細胞の増殖を誘発する
図５Ａ） ＢＭＰ７に応答したＥｄＵ陽性マウス筋芽細胞％についての棒グラフ定量。示された用量のＢＭＰ７の存在下において、筋芽細胞を４８時間培養した。２４時間毎に新しい培地およびＢＭＰ７を添加し、続いて２時間のＥｄＵ適用および固定を行なった。平均±Ｓ．Ｄ．。有意なｐ値（ビヒクル～ＢＭＰ７ ０．０２５ｕｇ／ｍＬ：１．２１Ｅ－０７、ビヒクル～ＢＭＰ７ ０．０７５ｕｇ／ｍＬ：８．０５Ｅ－０７、ビヒクル～ＢＭＰ７ ０．２２５５ｕｇ／ｍＬ：３．３７Ｅ－０３、ビヒクル～ＢＭＰ７ ０．９ｕｇ／ｍＬ：４．９９Ｅ－０２）。図５Ｂ） ＢＭＰ７に応答したＥｄＵ陽性ヒト筋芽細胞（６８歳の白人男性）％についての棒グラフ定量。示された用量のＢＭＰ７の存在下において、筋芽細胞を７２時間培養した。細胞にＥｄＵを４時間適用した後、固定した。平均±Ｓ．Ｄ．。有意なｐ値（ビヒクル～ＢＭＰ７ １．５６ｎｇ／ｍＬ：０．０４）。（ウェルチの片側Ｔ検定により^＊ｐ＜０．０５、ｎ＝２）
図５Ａについてのデータの表 ＢＭＰ７マウス筋芽細胞増殖

図５Ｂについてのデータの表 ＢＭＰ７ヒト筋芽細胞増殖

実施例１７ ロイシンがＢＭＰ７の分裂促進活性を増大させる
図６Ａ） ビヒクルとの比較におけるＥｄＵ陽性マウス筋芽細胞％についての棒グラフ。示される因子の存在下において、マウス筋芽細胞を４８時間培養し、続いて２時間のＥｄＵ適用の後、固定した。平均±Ｓ．Ｄ．。有意なｐ値（ＦＭ～ＢＭＰ７：０．００８ｕｇ／ｍＬ：３．１７Ｅ－０２、ＦＭ～ロイシン：３００ｕＭ ＢＭＰ７：０．００８ｕｇ／ｍＬ：２．７７Ｅ－０３、ＦＭ～ロイシン：１００ｕＭ ＢＭＰ７：０．００８ｕｇ／ｍＬ：３．７２Ｅ－０５、ＦＭ～ロイシン：９００ｕＭ ＢＭＰ７：０．００８ｕｇ／ｍＬ：２．５２Ｅ－０３）。（Ｏｎｅ－Ｗａｙ ＡＮＯＶＡ Ｔｕｋｅｙ Ｈｏｎｅｓｔ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅにより^＊ｐ＜０．０５、ｎ＝２～６）
実施例１８ ヒアルロン酸（ＨＡ）がＢＭＰ７の分裂促進活性を増大させる

図７Ａ：ビヒクルとの比較におけるＥｄＵ陽性マウス筋芽細胞％についての棒グラフ。示される因子の存在下において、マウス筋芽細胞を４８時間培養した。ＥｄＵ適用および固定。平均±Ｓ．Ｄ．。（増大した活性のスチューデント片側Ｔ検定により^＊ｐ＜０．０５、ｎ＝２～６）
実施例１９ ＢＭＰ７受容体がヒト筋芽細胞において発現する

図８Ａ：若齢および老化ヒト筋芽細胞（６８～６９歳の白人男性）細胞株におけるＢＭＰ７受容体ＲＮＡＳｅｑ発現についての棒グラフ。筋芽細胞を融合培地中において９６時間培養した。２４時間毎に新しい培地を添加し、続いてＲＮＡ抽出およびシーケンシングを行なった。平均±ＳＥＭ。ｎ＝３。発現をＦＰＫＭとして表す。

実施例２０ 軟骨損傷および変形性関節症における軟骨細胞増殖のための処理
図９Ａ：ＢＭＰ７受容体が軟骨関連細胞上に発現することを示す棒グラフ。データはRamilowsky et al., Nature, 2015から得られる。

実施例２１ ＦＧＦ１７－ｈＦｃｍがマウス筋芽細胞の増殖を増進させる
図１０Ａ） 空のコントロールプラスミドまたはＦＧＦ１７－ｈＦｃｍをコードするプラスミドのいずれかにて、懸濁ＣＨＯ細胞を一過性トランスフェクションした。４日後、培養上清を回収して、マウス筋芽細胞の培養物中に４８時間添加し、続いて２時間のＥｄＵ適用の後、固定した。ＦＧＦ１７－ｈＦｃｍを発現するＣＨＯ細胞の培養上清で処理したＥｄＵ陽性マウス筋芽細胞の割合は、ビヒクルコントロールまたは空のコントロールベクターを発現するＣＨＯ細胞の培養上清のいずれかで処理したＥｄＵ陽性マウス筋芽細胞の割合よりも有意に高い（Ｏｎｅ－Ｗａｙ ＡＮＯＶＡ Ｔｕｋｅｙ Ｈｏｎｅｓｔ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ、ｎ＝２～６）。図１０Ｂ） ＦＧＦ１７－ｈＦｃｍをコードするプラスミドにて、懸濁ＣＨＯ細胞を一過性トランスフェクションした。４日後、培養上清を回収し、タンパク質ＡメンブレンカラムによってＦＧＦ１７－ｈＦｃｍをアフィニティ精製した。精製したＦＧＦ１７－ｈＦｃｍをマウス筋芽細胞の培養物中に４８時間添加し、続いて２時間のＥｄＵ適用および固定を行なった。精製したＦＧＦ１７－ｈＦｃｍで処理したＥｄＵ陽性マウス筋芽細胞の割合は、空のコントロールベクターを発現するＣＨＯ細胞の培養上清で処理したＥｄＵ陽性マウス筋芽細胞の割合よりも有意に高い（Ｏｎｅ－Ｗａｙ ＡＮＯＶＡ Ｔｕｋｅｙ Ｈｏｎｅｓｔ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ、ｎ＝２～６）。

図１０Ａについてのデータの表

図１０Ｂについてのデータの表

実施例２２ ：ＦＧＦ１７変異体がＣＨＯ細胞におけるタンパク質発現レベルを改善した
図１１Ａ：ＦＧＦ１７－ｈＦｃｍまたはその変異体をコードするプラスミド（ＦＧＦ１７ｄ１８１－２１６－ｈＦｃｍ、ＦＧＦ１７ｄ２０４－２１６－ｈＦｃｍ、ＦＧＦ１７Ｒ２０４ＱＫ２０７Ｑ－ｈＦｃｍ）で一過性トランスフェクションしたＣＨＯ細胞からの培養上清のＳＤＳ－ＰＡＧＥ。発現したＦＧＦ１７－ｈＦｃｍタンパク質および変異タンパク質を、白色矢印で示した。図１１Ｂ） 異なるＦＧＦ１７をコードするプラスミドで一過性トランスフェクションしたＣＨＯ細胞からの培養上清をマウス筋芽細胞の培養物中に４８時間添加し、続いて２時間のＥｄＵ適用および固定を行なった。野生型ＦＧＦ１７－ｈＦｃｍまたは変異ＦＧＦ１７－ｈＦｃｍ（ＡＡ２０４－２１６欠失変異体およびＲ２０４ＱＫ２０７Ｑ点変異変異体）を発現するＣＨＯ細胞の培養上清で処理したＥｄＵ陽性マウス筋芽細胞の割合は、空のコントロールベクターを発現するＣＨＯ細胞の培養上清で処理したＥｄＵ陽性マウス筋芽細胞の割合よりも有意に高い（Ｏｎｅ－Ｗａｙ ＡＮＯＶＡ Ｔｕｋｅｙ Ｈｏｎｅｓｔ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ、ｎ＝２～６）。

図１１Ｂ

実施例２３ ＦＧＦ１７変異体がＣＨＯ細胞におけるタンパク質発現レベルを改善した
図１２Ａ） ＦＧＦ１７－ｈＦｃｍまたはその変異体をコードするプラスミド（ＦＧＦ１７ｄ１９７－２１６－ｈＦｃｍ、ＦＧＦ１７Ｋ１９１ＡＫ１９３ＡＳ２００Ａ－ｈＦｃｍ）で一過性トランスフェクションしたＣＨＯ細胞からの培養上清のＳＤＳ－ＰＡＧＥ。発現したＦＧＦ１７－ｈＦｃｍタンパク質および変異タンパク質を、白色矢印で示した。図１２Ｂ） 異なるＦＧＦ１７をコードするプラスミドで一過性トランスフェクションしたＣＨＯ細胞からの培養上清を、マウス筋芽細胞の培養物中に４８時間添加し、続いて２時間のＥｄＵ適用および固定を行なった。野生型ＦＧＦ１７－ｈＦｃｍまたは変異ＦＧＦ１７－ｈＦｃｍ（ＡＡ１９７－２１６欠失変異体およびＫ１９１ＡＫ１９３ＡＳ２００Ａ点変異変異体）を発現するＣＨＯ細胞の培養上清で処理したＥｄＵ陽性マウス筋芽細胞の割合は、空のコントロールベクターを発現するＣＨＯ細胞の培養上清で処理したマウス筋芽細胞よりも有意に高い（Ｏｎｅ－Ｗａｙ ＡＮＯＶＡ Ｔｕｋｅｙ Ｈｏｎｅｓｔ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ、ｎ＝２～６）。

図１２Ｂ

実施例２４ ヒト血清アルブミン（Ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ；ＨＳＡ）融合ＦＧＦ１７は、培地中において、ＨＳＡ融合タグを有さないＦＧＦ１７よりも安定である
ＨＳＡ－ＦＧＦ１７およびＦＧＦ１７を、培地中において、３７度のＣＯ２インキュベータでインキュベートした。異なる時点（０、１、３、５、および７日目）に、アリコートを取って、－８０度において保存した。マウス筋芽細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖アッセイによって、各サンプルの活性を評価した。増殖アッセイからの各時点での核の数を、０日目の核の数で標準化した。

実施例２６ ＦＧＦ１７受容体がヒト筋芽細胞において発現する
図１３Ａ：若齢および老化ヒト筋芽細胞株におけるＦＧＦ１７受容体ＲＮＡＳｅｑ発現についての棒グラフ。筋芽細胞を融合培地中において９６時間培養し、２４時間毎に新しい培地を添加し、続いてＲＮＡ抽出およびシーケンシングを行なった。平均±ＳＥＭ。ｎ＝３。発現値はＦＰＫＭとして報告される。

実施例２７ ヘパリンがＦＧＦ１７の分裂促進活性を増大させる
図１４Ａ：ビヒクルとの比較におけるＥｄＵ陽性マウス筋芽細胞％についての棒グラフ。示される因子の存在下において、筋芽細胞を４８時間培養した。２４時間毎に新しい培地および因子を添加し、続いて２時間のＥｄＵ適用および固定を行なった。平均±Ｓ．Ｄ．。％ＥｄＵおよびｐ値についての表定量（Ｏｎｅ－Ｗａｙ ＡＮＯＶＡ Ｔｕｋｅｙ Ｈｏｎｅｓｔ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅにより^＊ｐ＜０．０５、ｎ＝２～６）

実施例２８ ヒアルロン酸（ＨＡ）がＦＧＦ１７の分裂促進活性を増大させる
図１５Ａ：ビヒクルとの比較におけるＥｄＵ陽性マウス筋芽細胞％についての棒グラフ。示される因子の存在下において、筋芽細胞を４８時間培養した。２４時間毎に新しい培地および因子を添加し、続いて２時間のＥｄＵ適用および固定を行なった。平均±Ｓ．Ｄ．。％ＥｄＵおよびｐ値についての表定量が示される。（増大した活性のスチューデント片側Ｔ検定により^＊ｐ＜０．０５、ｎ＝２～６）

実施例２９ デキストラン硫酸（ＤＳ）がＦＧＦ１７の分裂促進活性を増大させる
各条件について比較した総ＥｄＵ陽性マウス筋芽細胞についての棒グラフ。示される因子の存在下において、筋芽細胞を４８時間培養した。２４時間毎に新しい培地および因子を添加し、続いて２時間のＥｄＵ適用および固定を行なった。平均±標準偏差（ＳＤ）。１視野あたりのＥｄＵ数およびマウスアッセイについてのｐ値（増大した活性のスチューデント片側Ｔ検定により^＊ｐ＜０．０５、ｎ＝３～６、相乗値が１よりも小さいことが効果のエビデンス）についての表定量。各条件についての総ＥｄＵ陽性ヒト筋芽細胞についての棒グラフ。示される因子の存在下において筋芽細胞を７２時間培養し、続いて４時間のＥｄＵ適用および固定を行なった。２４時間毎に新しい培地および因子を添加した。平均±標準偏差（ＳＤ）。ＥｄＵ陽性数およびヒトアッセイについてのｐ値（増大した活性のスチューデント片側Ｔ検定により^＊ｐ＜０．０５、ｎ＝３～６、相乗値が１よりも小さいことが効果のエビデンス）についての表定量。

データの表

データの表

実施例３０ ＢａＣｌ２損傷高齢マウスモデルにおいてＦＧＦ１７の筋肉内投与が筋肉の再生を増進させた
図１６Ａ） 実験の全体像。１．２％のＢａＣｌ２（７ｕｌ／ＴＡ）の筋肉内注射を使用して、７８週齢のマウスのＴＡにおいて化学的損傷を発生させた。筋損傷させて２時間後および４８時間後に、ＦＧＦ１７（５００ｎｇ／ｍＬ）を筋肉内注射にて投与した。図１６Ｂ） 損傷面積１ｍｍ＾２あたりの新たに再生した線維の数として計算した再生指数の定量化。再生した線維は、中心核を有する線維として特定した、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１（独立ｔ検定）。図１６Ｃ） 線維化面積の割合として計算した線維化指数を示すヒストグラム。^＊ｐ＝０．０１８６（独立ｔ検定）。

実施例３１ ＦＧＦ１７の全身投与が、デキサメタゾンにより誘発される筋萎縮から保護する
図１７Ａ） 実験の全体像および群。デキサメタゾン（２５ｍｇ／ｋｇ 腹腔内）を、ＦＧＦ１７（０．５ｍｇ／ｋｇ）の皮下注射と同時に、１２週齢のマウスに２０日間投与した。２１日目に筋肉重量を評価した。７、１３、および２１日目に前肢の握力および両肢の握力を測定した 図１７Ｂ） ビヒクルからの割合変化として示される、初期体重に対するＴＡ筋重量。^＊＊＊ｐ＝０．０００５、^＊ｐ＝０．０４９９。２１日目に測定した前肢の力、ヒストグラムは、重量（ｇ）に対する前肢の力（Ｎ）の比率として計算した前肢の比力を示す、^＊ｐ＝０．０４５８、^＊＊ｐ＝０．００１４ 図１７Ｃ） 重量（ｇ）に対する両肢の力（Ｎ）の比率として計算した、２１日目に測定した両肢の力 ^＊＊＊ｐ＝０．００１ ^＊ｐ＝０．０１０２。Ｔｕｋｅｙの方法により多重比較のためにＯｎｅ ｗａｙ Ａｎｏｖａ補正したものを使用して、データを比較した。

実施例３２ 軟骨損傷および変形性関節症における軟骨細胞増殖のための処理、ならびにＦＧＦ１７による軟骨細胞増殖の誘発
ＲＮＡ発現は、ＦＧＦ１７受容体が軟骨関連細胞上に発現したことを示す。ＦＧＦ１７に応答したＥｄＵ陽性ヒト軟骨細胞％についての棒グラフ定量。示された用量のＦＧＦ１７の存在下において、軟骨細胞を４８時間培養した。ポジティブコントロールとしてＦＧＦ１８を０．１ｕｇ／ｍＬ添加した。新しい培地およびＦＧＦ１７を２４時間毎に添加した。ＥｄＵ陽性軟骨細胞％およびｐ値の表が示される。平均±Ｓ．Ｄ．。（Ｔｕｋｅｙ Ｈｏｎｅｓｔ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ Ｔ－ｔｅｓｔにより^＊ｐ＜０．０５、ｎ＝２～３）
表 ＦＧＦＲ１のＲＮＡ発現（ＴＰＭ）

データの表

１型筋強直性ジストロフィー（ｈＭＤ）（ＤＭＰＫ１遺伝子における変異によって引き起こされる筋ジストロフィー）を有する個体からのヒト筋肉前駆細胞の増殖および／または融合を増進させる能力について、ＩＧＦ２をそれぞれ試験した。筋原性活性に及ぼすＩＧＦ２の効果を、予期される生理的レベルを中心としてその周りの広範囲の濃度にわたって、生物学的に３通りアッセイし、これは、ｈＭＤ筋芽細胞に各因子を７２時間添加し、培地交換を毎日行ない（ＤＭＥＭ＋２％ウマ血清）、最初の培地交換時に因子の２回目の適用を行なうことによって行なった。７２時間後または９６時間後に、細胞にＥｄＵ（３０ｕＭ）を２～５時間適用し、エタノールで固定し、ヘキスト３３４２で染色し、免疫染色して増殖を調べ（ＥｄＵで陽性染色された細胞の割合（％ＥｄＵ）によって測定）、免疫染色して分化を調べた（培地およびビヒクルのみを添加したネガティブコントロールを基準にした、胚ミオシン重鎖が陽性染色された細胞の面積における増加（％ｅＭｙＨＣ）によって測定）。キーエンスＢＺ－１００を用いてウェルを４倍でイメージングし、Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｆｉｌｅｒにおいて画像を定量し、統計をＲで計算した。さらに、筋芽細胞からＲＮＡを抽出して、ｑＰＣＲにより定量した転写物の存在量を選択した。ＩＧＦ２処理がＤＭ１ヒト筋芽細胞（３２歳の白人女性）の増殖および分化をそれぞれ促進したことを示す。ＩＧＦ２がＤＭ１ヒト筋芽細胞（３２歳の白人女性）におけるＭＹＨ３、ＣＫＭ、およびＡＴＰ１Ｂ１の発現を増大させたことを示す。

Claims (25)

1. 個体における筋肉または軟部組織の障害または状態を処置する方法であって、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）受容体リガンドアミノ酸配列と異種ポリペプチドアミノ酸配列とを含むポリペプチドの治療的有効量を前記個体に投与する工程を含み、前記異種ポリペプチドアミノ酸配列は、前記ＩＧＦ受容体リガンドアミノ酸配列の安定性または生物学的機能を増大させる、方法。
2. 前記ＩＧＦ受容体リガンドアミノ酸配列は、ＩＧＦ２を含む、請求項１に記載の方法。
3. 短鎖脂肪酸を投与する工程をさらに含む、請求項２に記載の方法。
4. 前記短鎖脂肪酸はブチレートである、請求項３に記載の方法。
5. 前記ＩＧＦ２のアミノ酸配列は、ヒトＩＧＦ２アミノ酸配列を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記ＩＧＦ２のアミノ酸配列は、配列番号８９のアミノ酸配列との同一性が少なくとも約９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％であるアミノ酸配列を含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
7. 前記ＩＧＦ２の配列は、Ｎ－、Ｃ－、またはＯ－結合型グリコシル化された少なくとも１つのアミノ酸を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
8. インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）受容体リガンドアミノ酸配列と異種ポリペプチドアミノ酸配列とを含むポリペプチドの治療的有効量を含む組成物であって、前記異種ポリペプチドアミノ酸配列は、前記ＩＧＦ受容体リガンドアミノ酸配列の安定性または生物学的機能を増大させる、組成物。
9. 処置を必要とする個体における筋肉または軟部組織の疾患または状態を処置する方法であって、前記方法は、骨形成タンパク質７（ＢＭＰ７）アミノ酸配列と異種ポリペプチドアミノ酸配列とを含むポリペプチドの治療的有効量を前記個体に投与する工程を含み、前記異種ポリペプチドアミノ酸配列は、前記ＢＭＰ７アミノ酸配列の安定性または生物学的機能を増大させる、方法。
10. 前記ＢＭＰ７アミノ酸配列は、配列番号８９のアミノ酸配列との同一性が少なくとも約９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％であるアミノ酸配列を含む、請求項９に記載の方法。
11. 前記ＢＭＰ７アミノ酸配列は、配列番号８９と同一である、請求項１０に記載の方法。
12. 前記ＢＭＰ７アミノ酸配列は、ＢＭＰ７のナックルドメイン（配列番号９３）を含む、請求項９に記載の方法。
13. 前記ＢＭＰ７アミノ酸配列は、配列番号９３のアミノ酸配列との同一性が少なくとも約９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％である、アミノ酸１５～３０個からなるフラグメントを含む、請求項９に記載のポリペプチド。
14. 前記ＢＭＰ７アミノ酸配列は、Ｎ－、Ｃ－、またはＯ－結合型グリコシル化された少なくとも１つのアミノ酸を含む、請求項９～１３のいずれか１項に記載の方法。
15. 骨形成タンパク質７（ＢＭＰ７）アミノ酸配列および異種ポリペプチドアミノ酸配列の治療的有効量を含む組成物であって、前記異種ポリペプチドアミノ酸配列は、前記ＢＭＰ７アミノ酸配列の安定性または生物学的機能を増大させる、組成物。
16. 前記異種ポリペプチドアミノ酸配列は、免疫グロブリン分子のフラグメント、アルブミン分子、トランスフェリン分子、ＸＴＥＮ配列、プロリン－アラニン－セリンポリマー、ホモアミノ酸ポリマー、グリシンリッチ配列、ゼラチン様ポリマー、エラスチン様ペプチド、カルボキシ末端ペプチド、またはこれらの組み合わせを含む、請求項１～７または９～１４のいずれか１項に記載の方法。
17. 前記異種ポリペプチドアミノ酸配列は免疫グロブリン分子のフラグメントを含み、前記免疫グロブリン分子のフラグメントは、ＩｇＧのヒンジドメイン、ＩｇＧのＣＨ２ドメイン、ＩｇＧのＣＨ３ドメイン、またはこれらの任意の組み合わせを含む、請求項１７に記載の方法。
18. 前記免疫グロブリン分子のフラグメントは、前記免疫グロブリン分子のフラグメントのエフェクター機能を低下させる１つ以上の変異を含む、請求項１７または１８に記載の方法。
19. 前記免疫グロブリン分子のフラグメントは、ＩｇＧ４分子のフラグメントを含む、請求項１７～１９のいずれか１項に記載の方法。
20. 前記免疫グロブリン分子のフラグメントは、前記免疫グロブリン分子のフラグメントにおける以下のアミノ酸変異または変異セットのうちの少なくとも１つを有するＩｇＧ４分子のフラグメントを含む、請求項３２に記載のポリペプチド：ＥＵナンバリングシステムに従う、ＩｇＧ４のＮ４３４Ａ、Ｎ４３４Ｈ、Ｔ３０７Ａ／Ｅ３８０Ａ／Ｎ４３４Ａ、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ、４３３Ｋ／４３４Ｆ／４３６Ｈ、Ｔ２５０Ｑ、Ｔ２５０Ｆ、Ｍ４２８Ｌ、Ｍ４２８Ｆ、Ｔ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ｓ、Ｖ３０８Ｗ、Ｖ３０８Ｙ、Ｖ３０８Ｆ、Ｍ２５２Ｙ／Ｍ４２８Ｌ、Ｄ２５９Ｉ／Ｖ３０８Ｆ、Ｍ４２８Ｌ／Ｖ３０８Ｆ、Ｑ３１１Ｖ／Ｎ４３４Ｓ、Ｔ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａ、Ｅ２５８Ｆ／Ｖ４２７Ｔ、Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｓ２２８Ｐ／Ｌ２３５Ｅ／Ｒ４０９Ｋ、Ｓ２２８Ｐ／Ｌ２３５Ｅ、Ｋ３７０Ｑ、Ｋ３７０Ｅ、Ｇ４４６の欠失、Ｋ４４７の欠失、およびこれらの組み合わせ。
21. 筋肉または軟部組織の障害を有する個体を処置する方法であって、線維芽細胞増殖因子８（ＦＧＦ８）サブファミリーアミノ酸配列と異種ポリペプチドアミノ酸配列とを含むポリペプチドの治療的有効量を投与する工程を含み、前記異種ポリペプチドアミノ酸配列は、前記ＦＧＦアミノ酸配列の安定性または生物学的機能を増大させる、方法。
22. ＦＧＦ１７アミノ酸配列は、配列番号５４のアミノ酸配列との同一性が少なくとも約９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％であるアミノ酸配列を含む、請求項２１に記載の方法。
23. 前記ＦＧＦ１７アミノ酸配列は、アミノ酸Ｇ１８１～Ｔ２０３の欠失、アミノ酸１９７～Ｔ２０３の欠失、アミノ酸２０４～２１６の欠失、アミノ酸１８１～２１６の欠失、Ｒ２０４Ｑ／Ｋ２０７Ｑ、アミノ酸１９７～２１６の欠失、Ｋ１９１Ａ／Ｋ１９３Ａ／Ｓ２００Ａ、およびこれらの組み合わせから選択される変異を含む、請求項２１または２２に記載の方法。
24. 前記ＦＧＦ１７アミノ酸配列は、Ｎ－、Ｃ－、またはＯ－結合型グリコシル化された少なくとも１つのアミノ酸を含む、請求項２１～２３のいずれか１項に記載の方法。
25. 治療的有効量の線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）アゴニストおよびグリコサミノグリカンを含む組成物。

Images