KR20210041580A

KR20210041580A - 새로운 마이오카인 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20210041580A
Application number: KR1020217005407A
Authority: KR
Inventors: 홀거 회플링; 한쇼르크 켈러; 조피 레미레; 제르게 주메르마터
Original assignee: 노파르티스 아게
Priority date: 2018-08-02
Filing date: 2019-07-31
Publication date: 2021-04-15
Also published as: EP3829620B1; TW202019457A; CN112512553A; IL280369A; CA3106518A1; US20220144908A1; EP3829620A1; WO2020026167A1; AU2019313506A1; JP2021533113A

Abstract

본 발명은 마이오카인 활성을 갖는 C1orf54 폴리펩타이드 및 이의 변이체, 및 근육 관련 장애를 치료, 완화 또는 예방하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다.

Description

새로운 마이오카인 및 이의 용도

본 발명은 염색체 1 오픈 리딩 프레임 54(C1orf54) 폴리펩타이드 및 이의 변이체에 관한 것이다. 본 발명은 마이오카인 활성을 갖는 인간 염색체 1 오픈 리딩 프레임 54(C1orf54) 폴리펩타이드 및 이의 변이체를 제공한다. 본 발명은 치료에서 사용하기 위한 인간 염색체 1 오픈 리딩 프레임 54(C1orf54) 폴리펩타이드 및 이의 변이체를 제공한다. 구체적으로는, 본 발명은 근육 관련 장애를 치료, 완화 또는 예방하기 위한 마이오카인 활성을 갖는 C1orf54 폴리펩타이드 및 이의 변이체를 제공한다.

많은 흔한 급성 및 만성 병태는 근골격 장애와 연관된다. 예를 들어, 수술 후의 비활동성 위축, 하지의 손상, 집중 치료 병동(ICU: intensive care unit) 근병증 또는 연령 관련 건강 제한을 갖는 환자는 전형적으로 근육량 및 근육 기능의 진행성 소실을 경험한다. 대개 손상된 재생과 함께 근육량 또는 근육 강도의 감소는 불리한 결과, 예컨대 심한 기능 제한, 증가된 낙상 위험, 장애 및 감소된 삶의 질을 갖는다. 근골격 장애는 우리의 현대 사회의 모든 사회인구학적 계층에 걸쳐 모든 연령의 남성 및 여성에서 흔하고, 전세계적으로 수억명의 인간에 영향을 미친다. 근골격 장애의 유행은 현저히 연령에 따라 증가하고, 추가적으로는 낮은 신체 활동과 같은 우세한 라이프스타일 인자의 영향을 받는 것들이 많다. 따라서, 이 병태에 대한 많은 의학적, 사회경제학적 필요성이 충족되어 있지 않다. 현재의 치료는 대개 예방 또는 치유를 목표로 하기보다는 증상의 관리로 제한된다.

골격근은 운동하기 위해 높은 가소성 및 높은 반응성을 갖는 조직이다. 위성 세포(근육 전구 세포)는 전형적으로 운동 및 손상 시 활성화되고, 근육 조직의 개형에서 중요한 역할을 한다. 운동은 특히 정신의학적 질환, 신경학적 질환, 대사 질환, 심혈관 질환, 폐 질환, 근골격 장애 및 암에 대한 고도로 효과적인 치료이다(Pedersen and Saltin (2015) Scand J Med Sci Sports 25 Suppl 3, 1-72). 근육에서 유래된 분비된 인자가 운동의 유리한 효과의 매개에 관여되는 것으로 생각된다(Giudice and Taylor (2017) Curr Opin Pharmacol 34, 49-55). 이러한 인자는 다양한 사이토카인 및 펩타이드를 포함하고, 이들은 자가분비, 주변분비 또는 내분비 효과를 발휘할 수 있고, 종합적으로 '마이오카인'이라 칭해진다(Pedersen and Febbraio (2012) Nat Rev Endocrinol 8, 457-465). 골격근 단백체의 분석은 운동 또는 수축에 반응하여 분비되는 수백개의 마이오카인을 밝혀냈다. 그러나, 모든 마이오카인이 근육 성장에 긍정적인 효과를 갖는 것은 아니다. 예를 들어 마이오카인 마이오스타틴은 근발생을 억제하고, 음성 근육 조절제이다(Elkina et al. (2011) J Cachexia Sarcopenia Muscle 2, 143-151). 더욱이, 이환된 환자에의 경우 격렬한 신체 활동을 발휘하는 것이 일반적으로 어렵다. 공지된 근육 동화물질이 근육량을 증가시키고, 이것이 후속하여 근육 강도를 증가시킬 수 있지만, 동화물질은 다양한 원치 않는 부작용을 발생시킬 수 있다: 스테로이드 사용은 고혈압(Urhausen A, Albers T, Kindermann W. Heart Br Card Soc. 2004;90(5):496-501), 심실 기능 감소(Pope HG, Kanayama G, Athey A, Ryan E, Hudson JI, Baggish A. Am J Addict Am Acad Psychiatr Alcohol Addict. 2014;23(4):371-377), 심혈관 질환, 예컨대 심장 발작(Vanberg P, Atar D. Handb Exp Pharmacol. 2010;(195):411-457), 동맥 손상(Baggish AL, Weiner RB, Kanayama G, et al. 2017;135(21):1991-2002) 및 뇌졸중(El Scheich T, Weber A-A, Klee D, Schweiger D, Mayatepek E, Karenfort M. J Pediatr Endocrinol Metab JPEM. 2013;26(1-2):161-165)과 연관된다. 더욱이, 근육 부피의 증가가 반드시 근육 강도 증가로 바뀌지는 않는다(Hayashida I, Tanimoto Y, Takahashi Y, Kusabiraki T, Tamaki J. PLoS One. 2014 Nov 3;9(11):e111810). 그러므로, 근육 강도에 대한 직접적인 정량적 효과로 운동의 효과를 모방하는 마이오카인-기반 치료의 제공에 대한 의학적 필요성이 크다.

본 발명의 소정의 구현예는 하기 양태에 기재되어 있다:

1. 서열 번호 3 또는 서열 번호 4의 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 95%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 단리된 폴리펩타이드로서, 폴리펩타이드는 마이오카인 활성을 갖는, 단리된 폴리펩타이드.

2. 양태 1에 있어서, 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산이 서열 번호 3 또는 서열 번호 4 중 어느 하나의 서열 내에 변형, 결실, 부가 및/또는 치환된, 단리된 폴리펩타이드.

3. 양태 1에 있어서, 폴리펩타이드는 서열 번호 3 또는 서열 번호 4 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진, 단리된 폴리펩타이드.

4. 치료에 사용하기 위한 C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체.

5. 약제로서 사용하기 위한 C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체.

6. 폴리펩타이드로서, 약제로서 사용하기 위한

a. 서열 번호 2, 3 또는 4의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드;

b. 서열 번호 2, 3 또는 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드;

c. 서열 번호 2, 3 또는 4와 적어도 95%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드;

d. 서열 번호 2, 3 또는 4와 적어도 95%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드; 및

e. 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산이 서열 번호 2, 3 또는 4 중 어느 하나의 서열 내에 변형, 결실, 부가 및/또는 치환된 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진 폴리펩타이드로부터 선택되는, 폴리펩타이드.

7. 폴리펩타이드로서, 약제의 제조에 사용하기 위한

8. 양태 4 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 마이오카인 활성을 갖는, 용도를 위한 폴리펩타이드.

9. 양태 4 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 대상체에서 근육 관련 장애의 치료를 위한 약제로서 사용하기 위한, 폴리펩타이드.

9.a. 양태 4 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 대상체에서 근육 관련 장애의 치료를 위한 약제의 제조에서 사용하기 위한, 폴리펩타이드.

10. 대상체에서 근육 관련 장애를 치료하는 데 사용하기 위한 폴리펩타이드로서, 치료는

e. 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산이 서열 번호 2, 3 또는 4 중 어느 하나의 서열 내에 변형, 결실, 부가 및/또는 치환된 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진 폴리펩타이드로부터 선택된 폴리펩타이드의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 폴리펩타이드,

11. 약제학적 조성물로서,

a. 약제학적 유효량의 적어도 하나의 폴리펩타이드이되,

i) 서열 번호 2, 3 또는 4의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드;

ii) 서열 번호 2, 3 또는 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드;

iii) 서열 번호 2, 3 또는 4와 적어도 95%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드;

iv) 서열 번호 2, 3 또는 4와 적어도 95%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드; 및

v) 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산이 서열 번호 2, 3 또는 4 중 어느 하나의 서열 내에 변형, 결실, 부가 및/또는 치환된 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진 폴리펩타이드로부터 선택되고,

상기 폴리펩타이드는 마이오카인 활성을 갖는 폴리펩타이드;

b. 적어도 하나의 약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는, 약제학적 조성물.

12. 양태 11에 있어서, 근육 관련 장애의 치료에 사용하기 위한, 약제학적 조성물.

13. 대상체에서 근육 관련 장애를 치료하는 방법으로서,

e. 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산이 서열 번호 2, 3 또는 4 중 어느 하나의 서열 내에 변형, 결실, 부가 및/또는 치환된 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진 폴리펩타이드로부터 선택된 폴리펩타이드의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고,

상기 폴리펩타이드는 마이오카인 활성을 갖는, 방법.

14. 양태 9 및 10 중 어느 하나에 있어서, 상기 근육 관련 장애는 근위축, 정형외과적 손상, 근육 손상, 근력 저하, 심부전, 화학요법, 후뇌졸중, 속발성 근손실, 근육감소증, 비만 또는 대사 증후군으로부터 선택되거나 이에 의해 야기된 장애인, 용도를 위한 폴리펩타이드.

14.a. 양태 12에 있어서, 상기 근육 관련 장애는 근위축, 정형외과적 손상, 근육 손상, 근력 저하, 심부전, 화학요법, 후뇌졸중, 속발성 근손실, 근육감소증, 비만 또는 대사 증후군으로부터 선택되거나 이에 의해 야기된 장애인, 약제학적 조성물.

14.b. 양태 13에 있어서, 상기 근육 관련 장애는 근위축, 정형외과적 손상, 근육 손상, 근력 저하, 심부전, 화학요법, 후뇌졸중, 속발성 근손실, 근육감소증, 비만 또는 대사 증후군으로부터 선택되거나 이에 의해 야기된 장애인, 방법.

15. 양태 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 상기 마이오카인 활성은 근육 기능 증가 활성을 포함하는, 단리된 폴리펩타이드.

15.a. 양태 8 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 상기 마이오카인 활성은 근육 기능 증가 활성을 포함하는, 용도를 위한 단리된 폴리펩타이드.

15.b. 양태 11 내지 12 중 어느 하나에 있어서, 상기 마이오카인 활성은 근육 기능 증가 활성을 포함하는, 약제학적 조성물.

15.c. 양태 13에 있어서, 상기 마이오카인 활성은 근육 기능 증가 활성을 포함하는, 방법.

16. 양태 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 상기 마이오카인 활성은 근육 강도 증가 활성을 포함하는, 단리된 폴리펩타이드.

16.a. 양태 8, 9 및 10 중 어느 하나에 있어서, 상기 마이오카인 활성은 근육 강도 증가 활성을 포함하는, 용도를 위한 폴리펩타이드.

16.b. 양태 11 내지 12 중 어느 하나에 있어서, 상기 마이오카인 활성은 근육 강도 증가 활성을 포함하는, 약제학적 조성물.

16.c. 양태 13에 있어서, 상기 마이오카인 활성은 근육 강도 증가 활성을 포함하는, 방법.

17. 양태 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 상기 마이오카인 활성은 근육 재생 개선 활성을 포함하는, 단리된 폴리펩타이드.

17a. 양태 8 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 상기 마이오카인 활성은 근육 재생 개선 활성을 포함하는, 용도를 위한 폴리펩타이드.

17b. 양태 11 내지 12 중 어느 하나에 있어서, 상기 마이오카인 활성은 근육 재생 개선 활성을 포함하는, 약제학적 조성물.

17c. 양태 13에 있어서, 상기 마이오카인 활성은 근육 재생 개선 활성을 포함하는, 방법.

18. 대상체에서 근육 관련 장애의 치료에 사용하기 위한 양태 4 내지 6, 10, 12, 14, 14a, 14b, 15a, 15b, 16a, 16b, 17a 및 17b 중 어느 하나에 따른 폴리펩타이드 또는 약제학적 조성물로서, 폴리펩타이드는 적어도 2회의 사이클을 포함하는 간헐적 투약 스케줄에 따라 투여되고, 각각의 사이클은 (a) 상기 C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체가 대상체에게 투여되는 투약 기간 및 (b) 휴지 기간을 포함하는, 폴리펩타이드 또는 약제학적 조성물.

19. 양태 13, 14c, 15c, 16c 및 17c 중 어느 하나에 따른 대상체에서 근육 관련 장애를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 유효량의 C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 폴리펩타이드는 적어도 2회의 사이클을 포함하는 간헐적 투약 스케줄에 따라 투여되고, 각각의 사이클은 (a) 상기 C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체가 대상체에게 투여되는 투약 기간 및 (b) 휴지 기간을 포함하는, 방법.

20. 대상체에서 근육 관련 장애를 치료하는 방법으로서,

상기 폴리펩타이드는 마이오카인 활성을 갖고, 유효량의 상기 폴리펩타이드는 적어도 2회의 사이클을 포함하는 간헐적 투약 스케줄에 따라 투여되고, 각각의 사이클은 (a) 치료학적 유효량의 상기 C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체가 환자에게 투여되는 투약 기간 및 이후 (b) 휴지 기간을 포함한다.

도 1: 상동성 단백질과의 인간 C1orf54(UniProt ID Q8WWF1)(서열 번호 1)의 정렬(순서대로 각각 서열 번호 46-68). 서열은 2015년 8월 18일에 각각 www.uniprot.org(The UniProt Consortium (2017), Nucleic Acids Research, 45(D1):D158-D169) 또는 www.ensembl.org(Zerbino et al. (2018) Nucleic Acids Research, 46(D1):D754-D761)로부터 검색되고, MUSCLE 알고리즘(Edgar (2004) Nucleic Acids Research, 32(5):1792-1797)을 사용하여 Jalview(Waterhouse et al. (2009) Bioinformatics, 25(9):1189-1191)에서 정렬되었다.
도 2: 정주형 마우스와 비교하여 운동한 마우스의 사두근에서의 C1orf54 mRNA 수준의 비교. C1orf54 mRNA 수준은 운동 직후 상승하고, 운동 중단 후 30분, 60분 및 180분에 상승한 채 있었다. n= 7~8 마우스/그룹. 모든 값은 평균 ± SEM으로 표현된다. 차이 분석은 limma-voom Bioconductor 패키지를 사용하여 백만개의 판독당 계수치에서 수행되었다. 모든 p-값은 Benjamini 및 Hochberg 다중 시험 보정을 이용하여 조정되었다. 정주형 그룹으로부터의 통계 유의차는 다음과 같이 표시된다: **p < 0.01, ***p<0.001. FPKM = 백만개의 맵핑된 판독당 전사체의 킬로염기당 단편.
도 3: 단독의 또는 조합된 상이한 운동 패러다임에 반응한 어린 대상체로부터의 인간 골격근에서의 C1ORF54 mRNA 수준의 증가. 훈련전 및 훈련후 개별 값은 어린 참가자의 그룹으로부터 각각의 대상체에 대해 표시된다. n=7~11 참가자/그룹. CT 그룹에서의 1명의 대상체는 훈련후 값이 이용 가능하지 않으므로 통계 분석으로부터 배제되었다. 모든 p-값은 Benjamini 및 Hochberg 다중 시험 보정을 이용하여 조정되었다. 훈련전으로부터의 통계 유의차는 하기와 같이 표시된다: *p < 0.05, **p<0.01. FPKM = 백만개의 맵핑된 판독당 전사체의 킬로염기당 단편, HIIT = 고강도 호기성 간격 훈련, RT = 저항 훈련, CT = 조합된 운동 훈련.
도 4: 표시된 용량에서의 비히클(PBS) 또는 비히클 중에 제제화된 서열 번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 단백질로 처리된 마우스의 비복근에서의 Myod1 mRNA의 변화. n= 5 마우스/그룹. 모든 값은 평균 ± SEM으로 표현된다. 통계 유의차는 1방향 ANOVA, 이어서 Fisher LSD에 의해 평가되고, 하기와 같이 표시된다: *p < 0.05. Mpk = 체중 킬로그램당 밀리그램.
도 5: 6시간 동안 표시된 용량의 재조합 전장 인간 C1orf54(서열 번호 2, My Biosources, ref. MBS1284901) 또는 비히클에 의한 처리 시 인간 근아세포에서의 MYOD1 mRNA에서의 용량 의존적 감소. 값은 평균 ± SEM(그룹당 n= 4)로 표현된다. 통계 유의차는 1방향 ANOVA 및 Tukey 사후 시험에 의해 평가되고, 하기와 같이 표시된다: **p < 0.01, ***p<0.001 완충액 대조군과 비교됨; # p<0.05, ## p < 0.01, ### p<0.001 그래프에 도시된 바대로 비교됨.
도 6의 A: 비히클 또는 1 mg/kg의 서열 번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 C1orf54 단리된 단백질에 의한 처리에 반응한 절대 근육 힘의 증가. 도6의 B: 비히클 또는 1 mg/kg의 서열 번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 C1orf54 단리된 단백질에 의한 처리에 반응한 특정 힘의 증가. 특정 근육 힘은 비복근 중량에 대해 절대 근육 힘을 정규화하여 계산된다. 패널 A 및 B에 대해, n= 9 마우스/그룹. 모든 값은 평균 ± SEM으로 표현된다. 통계 유의차는 다중 비쌍별 t-시험 비교에 의해 평가되고, 하기와 같이 표시된다: *p < 0.05 및 **p < 0.01.
도 7: 비히클 또는 서열 번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 C1orf54 단리된 단백질에 의한 처리에 마우스 비복근에서의 Pax7 양성 위성 세포의 수. 값은 평균 ± SEM(n= 9~10 마우스/그룹)으로 표현된다. 통계 유의차는 비쌍별 t-시험에 의해 평가되고, 하기와 같이 표시된다: **p < 0.01.
도 8: 1% FBS를 함유하는 성장 배지 중에 1 ㎍/mL의 재조합 전장 인간 C1orf54 단백질(서열 번호 2, My Biosources, ref. MBS1284901)(정사각형) 및 용매 대조군(원)으로 처리된 1차 인간 근아세포의 (퍼센트 포화상태에서의) 성장 곡선. 값은 평균 ± SEM(그룹당 n= 6)로 표현된다. 통계 유의차는 다중 비쌍별 t-시험 비교에 의해 평가되고, 하기와 같이 표시된다: *p < 0.05, **p < 0.01 및 ***p<0.001.

일반 정의

본 발명이 보다 쉽게 이해될 수 있도록 하기 위해, 소정 용어가 먼저 정의된다. 추가적인 정의는 상세한 설명 전체에 걸쳐 기재되어 있다.

"포함하는"이라는 용어는 "함유하는"뿐만 아니라 "구성되는"을 의미하며, 예를 들어 X를 "포함하는" 조성물은 X만으로 구성될 수 있거나, 예를 들어 X + Y와 같이 추가적인 것을 포함할 수 있다.

본 발명은 생물학적 활성을 갖는 C1orf54 폴리펩타이드 및 이의 변이체를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 “염색체 1 오픈 리딩 프레임 54(C1orf54) 폴리펩타이드”는 염색체 1 오픈 리딩 프레임 54(C1orf54) 유전자에 의해 암호화된 폴리펩타이드를 지칭하고, 바람직하게는 본원에서 신호 펩타이드가 없는 C1orf54 폴리펩타이드를 지칭하는 서열 번호 2에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는, 인간 염색체 1 오픈 리딩 프레임 54(C1orf54)(본원에서 신호 펩타이드를 포함하는 C1orf54 폴리펩타이드를 지칭하는 서열 번호 1을 갖는 UniGene ID:141426, UniGene Hs.91283, NM_024579.3, NP_078855.2, Uniprot 수탁 번호 Q8WWF1)가 특히 바람직하다.

명확성 및 일관성을 위해, 본 출원 및 청구항에 걸쳐 C1orf54 단백질에서의 아미노산 잔기의 넘버링은 신호 펩타이드가 없는 C1orf54(Uniprot 수탁 번호 Q8WWF1)(즉, 서열 번호 2)의 야생형 C1orf54 단백질 서열 넘버링에 기초한다. 여기서, 이 서열 번호 2는 “전장 서열”이라 칭해진다.

용어 “C1orf54 폴리펩타이드”는 또한 본원에 개시된 C1orf54 폴리펩타이드의 변이체(예를 들어, 아미노산 서열 번호 3 또는 서열 번호 4를 포함하는 C1orf54 폴리펩타이드 또는 다른 절두된, 융합 또는 돌연변이된 C1orf54 폴리펩타이드)를 포함한다. 상기 용어는 또한 폴리펩타이드의 각각을 개별적으로 및 함께 지칭한다. 예를 들어, 질환의 치료 등을 포함하는 조성물의 제조, 정제, 유도체화, 투여의 설명은 개별적으로 또는 합동으로 각각의 폴리펩타이드에 관한 것이다. C1orf54 폴리펩타이드 변이체는 마이오카인 활성을 갖는 C1orf54 야생형 서열로부터 적어도 하나의 아미노산이 다른(예를 들어, 결실, 치환 또는 부가) 단백질이고, 여기서 용어 “야생형 서열”은 적어도 하나의 자연 발생 유기체에 이용 가능한 폴리펩타이드 또는 유전자 서열 또는 인간에 의해 변경, 돌연변이, 또는 달리 조작되지 않는 폴리펩타이드 또는 유전자 서열을 지칭한다. 이러한 야생형 서열은 천연으로부터 단리될 수 있거나, 재조합 또는 합성 수단에 의해 생성될 수 있다.

본원에 기재된 C1orf54 폴리펩타이드는 다양한 소스, 예컨대 인간 조직 유형으로부터 단리될 수 있거나, 재조합 또는 합성 방법에 의해 제조될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "폴리펩타이드", "펩타이드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 기재하도록 상호호환적으로 사용된다. 용어 "폴리펩타이드"는 생물학적 활성을 갖는 재조합 전장, 프로- 및/또는 성숙 폴리펩타이드 형태, 및 단편 또는 스플라이스 변이체, 또는 전장 폴리펩타이드로부터 유래된 생물학적 활성을 갖는 재조합으로 제조된 절두를 의미할 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 폴리펩타이드의 재조합 형태는 예를 들어 원핵생물 및/또는 진핵생물 세포에서의 재조합 단백질의 발현, 이어서 하나 이상의 단리 및 정제 단계, 및/또는 펩타이드 합성장치를 사용한 폴리펩타이드 또는 이의 부분의 화학 합성을 포함하는 표준 방법 및 프로토콜에 따라 제조될 수 있고, 이는 당업자에게 잘 공지되어 있다. 게다가, 용어 “폴리펩타이드”는 자연 발생 아미노산 중합체 및 자연 비발생 아미노산 중합체뿐만 아니라 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 자연 발생 아미노산의 인공적인 화학적 모방체인 아미노산 중합체에도 적용된다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 “단리된 폴리펩타이드”는 원래의 환경(예를 들어, 자연 발생인 경우에는 자연 환경)으로부터 제거된 폴리펩타이드를 지칭하도록 의도된다. 예를 들어, 살아 있는 동물에 존재하는 자연 발생 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드는 단리된 것이 아니고, 인간의 개입에 의해 자연계에서 공존하는 물질의 일부 또는 전부로부터 분리된 동일한 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드는 단리된 것이다. 이러한 폴리뉴클레오타이드는 벡터의 일부일 수 있고/있거나 이러한 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드는 조성물의 일부일 수 있으며, 이러한 벡터 또는 조성물은 이것이 자연에서 발견되는 환경의 일부가 아니라는 점에서 여전히 단리된 것일 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이 “보존적으로 변형된 변이체”는 단일 아미노산 또는 암호화된 서열에서의 작은 백분율의 아미노산을 변경, 부가, 치환 및/또는 결실시키는 펩타이드, 폴리펩타이드, 또는 단백질 서열에 대한 개별 치환, 결실 또는 부가를 지칭하고, 여기서 변경은 화학적으로 유사한 아미노산에 의한 아미노산의 치환을 야기한다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표는 당해 분야에 공지되어 있다. 이러한 보존적으로 변형된 변이체는 본 발명의 다형성 변이체, 종간 동족체 및 대립유전자에 부가적인 것이며 이들을 배제하지 않는다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리가 당해 분야에서 정의되어 있다. 이들 패밀리는 염기성 측쇄(예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 하전되지 않은 극성 측쇄(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타 분지형 측쇄(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 갖는 아미노산을 포함한다. 따라서, 폴리펩타이드 또는 이의 변이체에서의 아미노산 잔기는 바람직하게는 동일한 측쇄 패밀리로부터의 다른 아미노산 잔기로 대체될 수 있다.

용어 "서열 유사성"은 최고의 서열 정렬의 동일한 위치에서의 아미노산이 동일하거나 유사하고, 바람직하게는 동일하다는 것을 의미한다. "유사한 아미노산"은 극성, 용해도, 친수성, 소수성, 전하 또는 크기와 같은 유사한 특징을 보유한다.

본원에 기재된 바와 같은 C1orf54 폴리펩타이드 및 변이체 서열과 관련하여 용어 "퍼센트(%) 아미노산 서열 동일성"은 서열 동일성의 일부로서 임의의 보존적 치환을 고려하지 않으면서 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해 서열을 정렬하고 필요한 경우 갭을 도입한 후 특정 C1orf54 폴리펩타이드 서열에서의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열에서의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 결정하는 목적을 위한 정렬은 예를 들어 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 EMBOSS Needle, BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여 당해 분야에서의 기술 내에 있는 다양한 방식으로 달성될 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전장에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하는 정렬을 측정하기 위한 적절한 매개변수를 결정할 수 있다. "퍼센트(%) 아미노산 서열 유사성"은 계산에서 동일한 아미노산 이외에 보존적 아미노산 치환을 포함함을 제외하고는 % 아미노산 서열 동일성을 결정하기 위해 사용되는 동일한 계산에 의해 결정된다.

용어 "동일한"은 2개 이상의 핵산 또는 폴리펩타이드 서열의 맥락에서 동일한 서열을 갖는 2개 이상의 서열 또는 하위서열을 지칭한다.

2개 이상의 폴리펩타이드에서의 유사한 위치는 아미노산 서열 또는 구조 유사성에 기초하여 폴리펩타이드 서열을 정렬하여 결정될 수 있다. 이러한 정렬 도구는 예를 들어 World Wide Web, 예를 들어 ClustalW(www.ebi.ac.uk/clustalw) 또는 Align(http://www.ebi.ac.uk/emboss/align/index.html)에서 바람직하게는 Align EMBOSS 니들, 매트릭스: Blosum62, 갭 오픈 10.0, 갭 연장 0.5에 대한 표준 설정을 이용하여 얻어질 수 있다. 당업자는 성공적인 정렬을 생성하기 위해 서열 중 어느 하나에서 갭을 도입하는 것이 필요할 수 있다는 것을 이해한다. 2개 이상의 C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체에서의 잔기는 잔기가 최고의 서열 정렬로 정렬되면 "상응한다"고 칭해진다. 2개의 폴리펩타이드 사이의 "최고의 서열 정렬"은 정렬된 동일한 잔기의 가장 큰 수를 생성하는 정렬로 정의된다.

본원에 개시된 것처럼, 본 발명은 단리된 C1orf54 폴리펩타이드, 바람직하게는 최고의 서열 정렬을 사용하여 단백질의 전체 길이에 걸쳐 및/또는 최고의 서열 정렬의 영역에 걸쳐 C1orf54 폴리펩타이드 아미노산 서열과의 적어도 약 80% 아미노산 서열 유사성, 대안적으로 적어도 약 81%의 아미노산 서열 유사성, 대안적으로 적어도 약 82%의 아미노산 서열 유사성, 대안적으로 적어도 약 83%의 아미노산 서열 유사성, 대안적으로 적어도 약 84%의 아미노산 서열 유사성, 대안적으로 적어도 약 85%의 아미노산 서열 유사성, 대안적으로 적어도 약 86%의 아미노산 서열 유사성, 대안적으로 적어도 약 87%의 아미노산 서열 유사성, 대안적으로 적어도 약 88%의 아미노산 서열 유사성, 대안적으로 적어도 약 89%의 아미노산 서열 유사성, 대안적으로 적어도 약 90%의 아미노산 서열 유사성, 대안적으로 적어도 약 91%의 아미노산 서열 유사성, 대안적으로 적어도 약 92%의 아미노산 서열 유사성, 대안적으로 적어도 약 93%의 아미노산 서열 유사성, 대안적으로 적어도 약 94%의 아미노산 서열 유사성, 대안적으로 적어도 약 95%의 아미노산 서열 유사성, 대안적으로 적어도 약 96%의 아미노산 서열 유사성, 대안적으로 적어도 약 97%의 아미노산 서열 유사성, 대안적으로 적어도 약 98%의 아미노산 서열 유사성, 및 대안적으로 적어도 약 99%의 아미노산 서열 유사성, 바람직하게는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 인간 C1orf54 폴리펩타이드에 관한 것이고, 여기서 최고의 서열 정렬은 표준 설정, 바람직하게는 EMBOSS::니들(매트릭스: Blosum62, 갭 오픈 10.0, 갭 연장 0.5)을 이용하여 당해 분야에 공지된 도구, 예를 들어 Align을 이용하여 얻어질 수 있으며, 아미노산 서열은 서열 번호 2로서 본원에 기재되어 있다.

"C1orf54 폴리펩타이드 변이체" 또는 “C1orf54 변이체”는 최고의 서열 정렬을 이용하여 단백질의 전체 길이에 걸쳐 및/또는 최고의 서열 정렬의 영역에 걸쳐 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 아미노산 서열 유사성, 바람직하게는 100%의 서열 동일성을 갖는 본원에 정의된 바와 같은 생물학적 활성 C1orf54 폴리펩타이드를 의미하고, 여기서 최고의 서열 정렬은 표준 설정, 바람직하게는 EMBOSS::니들(매트릭스: Blosum62, 갭 오픈 10.0, 갭 연장 0.5)을 이용하여 당해 분야에 공지된 도구, 예를 들어 Align을 이용하여 얻어질 수 있으며, 전장 C1orf54 폴리펩타이드 서열, 예를 들어 서열 번호 2, 또는 전장 C1orf54 폴리펩타이드 서열의 임의의 다른 단편, 예를 들어 서열 번호 3 또는 서열 번호 4는 본원에 기재되어 있다. C1orf54 변이체는 또한 신호 펩타이드 서열을 포함하는 C1orf54 전구체 단백질, 예를 들어 아미노산 서열 번호 1을 포함하는 폴리펩타이드이다. C1orf54 변이체는 또한, 예를 들어 C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체의 생물학적(예를 들어, 혈청) 반감기를 증가시키기 위해, C1orf54 단백질을 포함하는 융합 단백질, 예를 들어 다른 이종성 폴리펩타이드 또는 아미노산 서열, 예를 들어 면역글로불린 Fc 영역, 인간 혈청 알부민(HSA) 폴리펩타이드에 융합된, 또는 다른 모이어티, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜(PEG)에 접합된 C1orf54 단백질을 포함하는 단백질이다. 일 구현예에서, 이러한 C1orf54 변이체는 C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체와 태그 폴리펩타이드의 융합을 포함한다. 태그는 일반적으로 C1orf54 폴리펩타이드의 아미노 또는 카복실 말단에 배치된다. C1orf54 변이체는 또한 전장 C1orf54 폴리펩타이드 또는 C1orf54 변이체의 절두이고, 여기서 절두는 폴리펩타이드의 N 말단에 또는 폴리펩타이드의 C 말단에 또는 폴리펩타이드의 N 말단 및 폴리펩타이드의 C 말단 둘 다에 있을 수 있다. 본 발명에 따르면, 서열 번호 3 및 서열 번호 4를 갖는 폴리펩타이드는 서열 번호 2에 기재된 바와 같은 전장 C1orf54 폴리펩타이드의 이러한 절두된 변이체이다. 변이체는 또한 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 치환, 변형, 부가 및/또는 결실을 함유하는 생물학적 활성을 갖는 폴리펩타이드를 포함하고, 최고의 서열 정렬을 이용하여 단편의 전체 길이에 걸쳐 및/또는 최고의 서열 정렬의 영역에 걸쳐 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 서열 유사성, 바람직하게는 100%의 서열 동일성을 갖고, 여기서 최고의 서열 정렬은 표준 설정, 바람직하게는 EMBOSS::니들(매트릭스: Blosum62, 갭 오픈 10.0, 갭 연장 0.5)을 이용하여 당해 분야에 공지된 도구, 예를 들어 Align을 이용하여 얻어질 수 있으며, 아미노산 서열은 서열 번호 2, 3 또는 4는 기재되어 있다. 본원에 기재된 바와 같은 C1orf54 변이체는 이러한 단백질이 서열 번호 2에 기재된 바와 같은 전장 C1orf54 단백질의 기능적 균등물로서 여겨질 수 있다는 점에서 이의 생물학적 활성을 보유하고, 즉 변이체는 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 근육 기능의 증가의 생물학적 활성을 보유하거나, 변이체는 본원에 기재된 바와 같이 예를 들어 시험관내 또는 생체내 적합한 생물학적 시스템에서 평가된 바와 같은 서열 번호 2에 기재된 바와 같은 전장 C1orf54 폴리펩타이드에 대해 관찰된 생물학적 활성 중 적어도 하나를 초과한다. C1orf54 변이체는 또한 서열 번호 5~9 또는 서열 번호 10~14의 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하는 단리된 폴리펩타이드이다.

더욱이, C1orf54 폴리펩타이드와 관련하여 기능적 균등물은 적어도 하나의 천연 또는 인공 돌연변이를 포함하는 C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체로서 이해된다. 돌연변이는 C1orf54 폴리펩타이드의 생물학적 활성을 감소시키지 않는 하나 이상의 아미노산의 삽입, 결실 또는 치환일 수 있다.

상기 기재된 바와 같은 융합 단백질의 경우에, 서열 동일성 또는 서열 유사성은 오직 이러한 융합 단백질의 C1orf54 부분에 기초하여 정의되어야 하고, 즉 C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체로부터 유래되지 않은 추가의 아미노산은 이러한 정렬에 고려되지 않을 것이고, 즉 정렬 점수의 계산으로부터 배제된다. 상기 기재된 바와 같은 절두된 단백질의 경우에, 서열 동일성 또는 서열 유사성은 절두된 C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체에 기초하여 정의되어야 한다. 변이체는 융합된 또는 절두된 C1orf54 폴리펩타이드 변이체, 예를 들어 서열 번호 3 또는 서열 번호 4를 갖는 C1orf54 폴리펩타이드 변이체와 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한 아미노산 서열을 나타낼 수 있다.

비교를 위한 서열의 정렬 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 비교를 위한 서열의 최적의 정렬은 예를 들어 문헌[Smith and Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2:482c]의 국소 상동성 알고리즘에 의해, 문헌[Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443]의 상동성 정렬 알고리즘에 의해, 문헌[Pearson and Lipman (1988) Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 85:2444]의 유사성 검색 방법에 의해, 이들 알고리즘의 컴퓨터 구현(Genetics Computer Group(미국 위스콘신주 매디슨 사이언스 드라이브 575)의 Wisconsin Genetics Software Package 내의 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA)에 의해, 또는 수동 정렬 및 시각적 검사에 의해(예를 들어, 문헌[Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995 supplement)] 참조) 수행될 수 있다.

서열 비교를 위한 바람직한 알고리즘은 EMBOSS 니들이고, 이는 2개의 입력된 서열을 읽고, 파일에 이의 최적 전체 서열 정렬을 쓴다. 프로그램은 이의 전체 길이를 따라 2개의 서열의 최적 정렬(갭을 포함)을 발견하도록 Needleman-Wunsch 정렬 알고리즘을 이용한다. EMBOSS 니들에 대한 표준 설정은 갭 오픈 10.0에 대해 10.0 및 갭 연장에 대해 0.5의 패널티를 갖는 BLOSUM62 스코어링 매트릭스이다.

C1orf54 폴리펩타이드는 이의 생리학적 환경과 소통하도록 근육 세포가 사용하는 복잡한 시스템의 일부이고, 이것은 따라서 마이오카인으로 분류된다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "마이오카인"은 근육 세포에 의해 생성되고 발현되고 방출되는 사이토카인, 펩타이드 또는 폴리펩타이드, 프로테오글리칸 펩타이드, 생물활성 지질, 제2 메신저 등을 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "마이오카인 활성"은 대상체, 세포 또는 조직, 예를 들어 지방 조직, 뇌, 췌장, 장, 간, 면역 세포, 골, 간 및 종양 세포에서 마이오카인, 또는 마이오카인 신호에 의해 생성된 자가분비, 주변분비 및/또는 내분비 효과를 지칭한다. 마이오카인 활성은 억제성 또는 자극성일 수 있다. 이러한 "마이오카인 활성"은 근비대, 근육 재생의 증가, 근육 강도(힘 생성 능력)의 증가, 1차 인간 골격근 세포의 증식, 근육 신경분포의 증가, 세포외 기질 개형에 대한 효과, 골 대사의 조절(예를 들어, 골 질량, 골 밀도, 골형성, 골 무기질화, 골 치유), 지방 대사의 조절(예를 들어, 지방분해의 증가, 지단백 리파제 활성의 감소, 지방 조직의 갈색화의 증가, 열발생의 증가, 지방 조직 질량의 감소, 지방산 산화의 증가, 순환 및/또는 간 트리글리세라이드의 수준의 감소, 체지방량의 감소, 내장 지방의 감소), 면역 세포 반응의 조절, 면역조절 과정의 조절, 염증성 과정의 조절, 면역 세포의 반응의 조절, 염증의 감소, 에너지 지출의 자극, 전신 대사의 조절, 전신 인슐린 감수성의 조절, 글루코스 대사의 조절(예를 들어, 글루코스 흡수의 증가, 글리코겐 합성의 증가, 글루코스 산화의 증가, 글루코스 관용성의 개선, 인슐린 감수성의 개선), 췌장 베타-세포 생존능력의 촉진, 알파-세포 이상증식, 전신 심혈관 적응(심박출량의 증가, 향상된 혈액 부피를 포함), 혈관신생의 증가(예를 들어, 혈관화, 골격근 세포의 또는 근처의 모세관화, 산소 공급 및 이용의 개선, 혈관 보수 과정의 증가, 죽종형성의 감소, 혈압 조절), 심보호, 인지 기능 및 기억의 개선, 스트레스 및 우울증의 감소, 뇌 신경생성, 암 보호(예를 들어, 아폽토시스의 증가 및 면역 효과기 세포의 동원을 통해) 및 항노화 효과를 야기할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 상기 마이오카인 활성은 바람직하게는 근육 기능을 증가시킨다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 “근육 기능의 증가” 또는 “증가된 근육 기능” 또는 “근육 기능 증가 활성”(및 기타)은 i) 근육 강도의 증가, ii) 근육 전구 세포 증식의 증가, iii) 근육 재생 활성의 개선 또는 iv) 근육 피로 저항의 증가 중 적어도 하나 이상으로 이어지는 활성을 지칭하도록 의도된다. 용어 “증가시킨다(증가된)” 또는 “개선된”은 생체내 또는 시험관내 측정되는 매개변수(예를 들어, 근육 강도, 근육 전구 세포 증식, 근육 재생 활성, 위성 세포 증식 검정 또는 근육 피로 저항)가 제1 시점과 비교하여 제2 시점에 더 높은 상태를 지칭한다. 상기 매개변수는 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 적합한 시험관내 및/또는 생체내 검정, 예를 들어 인간 근아세포 시험관내 증식 검정 또는 생체내 마우스 위성 세포 증식 검정 또는 근육 강도를 평가하는 방법에 의해 평가될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "근육 강도"(및 기타)는 근육, 또는 합해서 근육 그룹이 생성할 수 있는 힘의 최대 양을 지칭한다. 근육 강도는 다양한 방법, 예컨대 그립 강도, 1 반복 최대 강도 시험, 근지구력에 대한 시간 의존적 시험, 근육 피로의 시간 의존적 시험 또는 근지구력 및 피로의 시간 의존적 시험 및 기타에 의해 평가될 수 있다. 근육 강도는 단일 또는 다수의 관절 및 호흡 및 다른 근육(예를 들어, 폐 기능 시험)에 걸쳐 동적 이동(예를 들어, 30초 의자 일어나기 시험, 계단 보행 시험, 무릎 굴곡/신전) 또는 정적 이동(예를 들어, 손 그립 동력측정법, 등척성 무릎 굴곡/신전)에 의해 평가될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, 대상체에서의 용어 “근육 강도의 증가”(및 기타)는 또한 적어도 2주, 적어도 4주, 적어도 8주, 적어도 12주, 적어도 16주, 적어도 20주, 적어도 24주, 적어도 28주, 적어도 32주, 적어도 36주, 적어도 40주, 적어도 44주, 적어도 48주, 적어도 52주 또는 그 이상의 치료 후에 측정된 바와 같은, 치료 전과 비교한 근육 강도 및/또는 신체 기능의 증가를 지칭하도록 의도된다.

신체 기능은 간편 신체 기능 평가(SPPB: Short Physical Performance Battery), 걸음걸이 속도 측정, 일어서서 걷기 시험(TGUG: timed get-up-and-go test), 계단 보행 능력 시험(SCPT: stair climb power test), 400 m 걸음 시험 및/또는 거리에 대한 6분 걸음 시험(6MWD: 6-minute walk test for distance)에 의해 평가될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 “조절한다”는 기능의 수준 또는 활성이 본 발명에 의해 제공된 물질의 부재에서 관찰된 것보다 크거나 이와 동일하거나 이보다 작다는 것을 기재하도록 사용된다.

본원에 사용된 바와 같이 용어 “대상체” 또는 “환자”는 근육 관련 장애 또는 질환을 앓거나 이것으로 영향을 받을 수 있거나 달리 근육 기능의 증가로부터 이익을 얻는 인간 및 동물을 포함하도록 의도된다. 대상체의 예는 포유류, 예를 들어 인간, 개, 소, 말, 돼지, 양, 염소, 고양이 및 형질전환 비인간 동물을 포함한다. 일 구현예에서, 대상체는 인간, 예컨대 근육 관련 장애를 앓거나, 그러한 위험이 있거나, 잠재적으로 앓을 수 있는 인간이다. 바람직한 구현예에서, 대상체는 인간 대상체, 예를 들어 근육 관련 장애를 갖는 인간 환자이다. 다른 구현예에서, 대상체는 상기 동물의 지방제외체중 또는 근육 기능을 증가시키기 위해 본원에 개시된 방법(예를 들어, C1orf54의 투여)에 따라 치료되는 동물, 예를 들어 소 또는 돼지이다.

본원에 사용된 바와 같이, 대상체(환자)가 생물학적으로, 의학적으로 또는 삶의 질에 있어서 치료로부터 이익을 얻는 경우, 대상체는 이러한 치료를 "필요로 한다".

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "근육량"은 근육 중량, 질량, 면적 또는 부피에 의해 표현되는 근육 또는 근육 그룹의 양 또는 크기를 지칭한다. 근육량은 또한 총 지방제외체중, 신체 구획, 예컨대 다리의지방제외체중, 또는 다리 또는 팔 구획의 횡단면으로 표현될 수 있다. 근육의 부피 또는 질량은 근육 면적, 부피 또는 질량을 제공하는 임의의 공지된 또는 달리 효과적인 기법, 예컨대 이중 에너지 X선 흡광광도법(DXA: Dual energy X-ray absorptiometry), 바이오임피던스 분석(BIA: Bioimpedance analysis), 전산화 단층촬영(CT: computed tomography) 스캔, 초음파, 자기 공명 영상(MRI: magnetic resonance imaging) 또는 무지방 연조직당 전체 또는 부분 신체 칼륨(TBK 또는 PBK)을 이용하여 결정될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 “위성 세포”는 근섬유의 기저판 밑에서 자연적으로 위치하고, 자가 재생하고 새로운 골격근 세포를 형성할 수 있는(즉, 근원성) 작은 단핵 줄기 세포를 지칭하도록 의도된다. 위성 세포의 가장 확정적인 마커는 Pax7이고, 이것은 출생 후 근육의 모든 위성 세포에 존재하고, 이들이 분화하기 시작할 때까지 증식하는 근아세포에서 발현된다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 “근육의 재생 능력”, “근육 재생 활성” 또는 “근육 재생 개선 활성”(및 기타)은 생존가능 또는 기능적 근세포의 총 수를 증가시키거나, 회복시키거나 유지시키고, 질환 또는 손상 후 조직 손실과 같은 손상에 반응하여 손상된 근섬유의 대체를 제공하기 위한 근육 세포의 재생 또는 보수의 과정을 지칭하도록 의도된다. 이 손상에 반응하여, 위성 세포는 활성화되고, 수임 근아세포가 되고, 이것은 이후 보수를 위해 전구체의 집단을 확장시키도록 증식하기 시작한다(예를 들어, 문헌[Kuang and Rudnicki (2008) Trends Mol Med 14, 82-91)] 참조). 마지막으로, 증식하는 근아세포는 세포 주기로부터 빠져나오고, 말기 분화를 겪는다. 이들은 재생 근섬유를 형성하도록 서로에 융합되어, 손상되고 죽은 것을 대체한다. 용어 “근육의 재생 능력” 또는 “근육 재생 활성”(및 기타)은 또한 위성 세포 매개 성장(세포 주기에 다시 들어가고, 기존의 근섬유로 증식하고 이에 융합하거나, 새로운 근섬유를 형성), 융합체 근섬유 성장 또는 근아세포 의존적 신생 근섬유 분화의 과정을 포함하고, 이로써 근섬유 성장은 또한 근아세포 의존적일 수 있고, 신생 근섬유 분화는 위성 세포 의존적일 수 있고, 이로써 근섬유는 기존의 근섬유로 융합하고/하거나 재생 근섬유의 크기를 증가시키고/시키거나, 새로운 근섬유를 형성하고, 이로써 골격근 재생을 촉진한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 “근육 관련 장애”는 사람이 보통의 매일의 독립성을 유지시키는 데 필요한 수준에서 근육이 이의 기능을 수행할 수 없게 하는 근육 기능장애(예를 들어, 근육 강도 또는 힘의 감소, 재생 능력의 감소 및/또는 지구력의 감소)를 생성시키는 질환 또는 장애를 지칭하도록 의도된다. 대상체는 자신의 생리학적 일을 적절히 수행하는 데 장애가 있을 수 있다. 이러한 근육 기능장애는 신체 불능, 이동성의 손상, 기능 독립성의 손실, 빈번한 낙상, 낙상의 두려움, 손상을 주는 낙상, 근육 소모, 손상되고 불안정한 걸음걸이, 불리한 걸음걸이 기계학, 척추측만증, 문제가 있는 뛰기 및 점핑, 물체 들기 어려움, 근육긴장증, 감기는 눈꺼풀, 근육 비대, 근육 부전 또는 위축, 호흡 곤란, 걷지 못함, 학습 장애, 불량한 균형, 눕거나 앉은 자세에서 일어나기 어려움, 일어서기 위한 가우어스 방법(Gower's maneuver)의 사용, 및/또는 지구력의 감소를 야기할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 “근손실”은 근육의 양 및 질의 악화 상태를 지칭하도록 의도된다. 비제한적인 근손실 증상은 근육량의 손실 또는 감소, 순수 근육의 손실 또는 감소, 근육 중량의 손실 또는 감소, 근육 둘레의 손실 또는 감소, 근육 기능의 손실 또는 감소, 근육 강도의 손실 또는 감소, 운동성의 손실 또는 감소, 또는 임의의 이들의 조합일 수 있다. 예를 들어, 근손실은 노화, 질환(예를 들어, 암 및 간 질환), 비활동, 손상(예를 들어, 간 이식), 또는 이들의 임의의 조합에 의해 생길 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 “근손실"은 자연적인 근육 노화 과정, 및 선천성 병리학 및 후천성 병리학을 포함한다. 근육 노화는 진행성 골격근 소실을 초래하고, 이것은 제한 없이 근육감소증을 포함한다. 용어 “근손실”은 또한 골격근(들)에 영향을 미치는 임의의 선천성 또는 후천성 근육 퇴행, 약화, 기능이상 및/또는 소실을 포함한다. 선천성 병리학은 제한 없이 근병증(예를 들어, 뒤시엔느 근이영양증(DMD: Duchenne muscular dystrophy), 베커 근이영양증, 선천성 근이영양증, 지대 근이영양증(LGMD: Limb Girdle muscular dystrophy), 얼굴어깨팔 근이영양증, 근긴장성 근이영양증, 눈인두근 근이영양증, 원위 근이영양증 및 에머리-드라이푸스(Emery-Dreifuss) 근이영양증)을 포함한다. 이와 반대로, 골격근(들)에 영향을 미치는 후천성 병리학은 유전되지 않고, 염증(예를 들어, 염증성 근병증), 약물(예를 들어, 약물 유도된 근병증), 외상 또는 손상(예를 들어, 외상 유도된 근병증 또는 수술 유도된 근병증), 결합 조직 및 근육 허혈(예를 들어, 버거씨병), 암(예를 들어, 암 유도된 근육감소증) 또는 심지어 식이(예를 들어, 식이 유도된 근병증)에 의해 유도될 수 있다. 일부 구현예에서, 개시된 조성물, 용도, 키트, 방법 및 화합물은 환자의 근손실을 감소시키거나 정지시키거나 역전시킨다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 “속발성 근손실”은 손상, 병 또는 외상으로부터 생기는 근육의 양 및 질의 악화의 상태를 지칭하도록 의도된다. 이것은 뇌졸중, 자동차 사고, 중증 화상, 싸움 상해, 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD: chronic obstructive pulmonary disease), 당뇨병, 암, 수술과 연관된 활동, 장기간 동안 근육 및 관절의 이동의 불능(예를 들어, 침상안정, 석고붕대) 및 신체에서 부정적인 질소 균형을 생성하는 다른 상태를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 침상안정 10일 초과의 불용은 골격근, 강도 및 환자 기능의 손실을 초래하는 것으로 오랫 동안 인식되었지만, 상당한 근손실 및 위축이 단기간 불용(10일 미만) 후 이미 발생하는 것으로 또한 현재 이해된다(Dirks et al. (2016) Diabetes 65, 2862-2875, Wall et al. (2013) Ageing Res Rev 12, 898-906). 따라서, 용어 “속발성 근손실”은 단기간 불용 및 장기간 불용 후 생기는 근손실을 포함한다. 일부 구현예에서, 개시된 조성물, 용도, 키트, 방법 및 화합물은 환자의 속발성 근손실을 감소시키거나 정지시키거나 역전시킨다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 “근육감소증”은 문헌[Sarcopenia: European consensus on definition and diagnosis (Cruz-Jentoft et al. (2010) Age Ageing 39, 412-423) 및 International Working Group on Sarcopenia (Fielding et al. (2011) J Am Med Dir Assoc 12, 249-256)]에 정의된 바와 같은 노인에서 보이는 골격근 질량, 강도 및 손상된 기능 능력의 일반화된 진행성 손실을 특징으로 하는 증후군을 지칭한다. 부가적으로, 근육감소증은 질환, 수술 및 다른 병태(암(Collins et al (2014) BMJ Open;4:e003697. doi:10.1136/bmjopen-2013-003697), 간경변(Georgiou et al (2018) Clin Nutr ESPEN. 24:185-186), 만성 폐쇄성 폐 질환(Jones et al (2015) Thorax. 70:213-8), 말초 동맥 질환(Addison et al (2018) Arch Phys Med Rehabil. 99(4):623-628), 후뇌졸중(Ryan et al (2017) Arch Phys Med Rehabil. 98(3):495-499), 및 심부전(Saitoh et al (2018) Expert Rev Cardiovasc Ther. 16(2):133-142)와 연관된 골격근 질량 및 기능의 소실을 나타내기 위해, 그리고 장기 이식을 겪은 사람(Meek and Madill (2017) Clin Nutr ESPEN. 22:76-80) 및 고관절 골절로부터 회복된 사람에서(Landi et al (2017) Osteoporos Int. 28:1569-1576. doi: 10.1007/s00198-017-3929-z). 일반적으로, 근육감소증의 진단은 낮은 근육 강도 및 낮은 신체 기능 중 적어도 하나, 및 낮은 근육량의 존재를 필요로 한다. 용어 “근육감소증”은 원발성 근육감소증(연령 관련 근육감소증) 및 속발성 근육감소증을 포함하고, 여기서 근육 및 기능 손실은 다른 병태(예컨대, 침상안정, 비활동, 정주형 라이프스타일 및 탈컨디셔닝에서 생긴 활동 관련 근육감소증; 심장, 폐, 간, 신장 및/또는 뇌의 진행된 장기 부전, 염증성 질환, 악성질환 또는 내분비 질환과 연관된 질환 관련 근육감소증, 및 흡수불량, 위장 장애 또는 식욕부진을 야기하는 약제의 사용에 의한 것과 같은 에너지 및/또는 단백질의 부적절한 식이 섭취에서 생긴 영양 관련된 근육감소증을 포함)의 결과이다. 일부 구현예에서, 개시된 조성물, 용도, 키트, 방법 및 화합물은 환자의 근육감소증을 감소시키거나 정지시키거나 역전시킨다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 “악액질”은 문헌[Special Interest Groups (SIG) “cachexia-anorexia in chronic wasting diseases” and “nutrition in geriatrics” (Muscaritoli et al. (2010) Clin Nutr 29, 154-159)]에 의해 정의된 바와 같은 지방 조직의 손실을 동반하거나 동반하지 않고 골격근의 손실로 인한 진행성 체중 감소, 근육 소모/손실 및 피로를 특징으로 하는 소모를 지칭한다. 악액질은 염증, 인슐린 저항성, 식욕부진, 및 암, 만성 심부전, 만성 심근병증, 만성 신부전, 말기 단계 신장 질환, 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD), 간부전, 간경변증, 후천성 면역결핍 증후군(AIDS), 중증 화상 손상 및 류마티스성 관절염과 같은 중증 만성 병으로 인한 근육 단백질의 파괴의 증가와 흔히 연관된다. 일부 구현예에서, 개시된 조성물, 용도, 키트, 방법 및 화합물은 환자의 악액질을 감소시키거나 정지시키거나 역전시킨다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 “근력 저하”는 수술 및 급성 또는 장기간 손상과 같은 외상 후에 보인 근육 강도의 손실, 예를 들어 뇌졸중, 또는 높은 수준의 염증 후 불용, 또는 수축 강도와 무관하게 개별 근육 또는 근육의 그룹의 능력을 생성하는 더 낮은 힘에 의해 생기는 관절 주위에서의 힘을 감소시키는 다른 병태를 포함한다. 수술후 근력 저하는 수술 절차 후 하나 이상의 근육의 강도의 감소를 지칭한다. 저하는 일반화(즉, 전신 약화)되거나, 특정 부위, 신체의 일측, 사지 또는 근육에 국한될 수 있다. 외상후 근력 저하는 외상성 삽화(예를 들어, 신체 상해, 수술 또는 뇌졸중) 후에 하나 이상의 근육의 강도의 감소를 특징으로 한다. 일부 구현예에서, 개시된 조성물, 용도, 키트, 방법 및 화합물은 환자의 근력 저하를 감소시키거나 정지시키거나 역전시킨다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 “투여”는 약제학적 활성 성분, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체의 투약량을 이를 필요로 하는 대상체에게 주는 방법을 지칭하도록 의도된다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "약제학적으로 허용 가능한"은, 건전한 의학적 판단의 범위 내에서, 합리적인 이익/위험 비율에 비례하는 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 및 기타 문제 또는 합병증 없이 대상체, 예를 들어 포유동물 또는 인간의 조직과 접촉하기에 적합한 화합물, 물질, 조성물 및/또는 투여 형태를 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제" 또는 “담체, 희석제 또는 부형제”는 조성물을 개선하거나 안정화시키거나, 조성물의 제조를 수월하게 하도록 사용될 수 있는 약제학적 조성물의 제조 또는 사용에 유용한 물질을 지칭한다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 용매, 분산 매질, 코팅, 항박테리아제 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제, 및 기타를 포함하고, 예를 들어 적합한 희석제, 계면활성제, 항산화제, 보존제, 완충제, 벌크화제, 동결보호제(cryoprotectant/lyoprotectant), 염, 약물 안정화제, 결합제, 부형제, 붕괴제, 활택제, 습윤제, 감미료, 항료, 염료 및 이들의 조합, 적절한 바대로 동물 또는 인간에게 투여될 때 생리학적으로 상용성이고, 불리한 반응, 알레르기 반응 또는 다른 뜻밖의 반응을 일으키지 않는 용매, 분산 매질, 코팅, 항박테리아제 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제, 및 기타를 포함한다(예를 들어, 문헌[Remington The Science and Practice of Pharmacy, 22^nd Ed. Pharmaceutical Press, 2013, pp. 1049-1070] 참조). 임의의 종래의 매질 또는 제제가 활성 화합물과 비상용성인 경우를 제외하고는, 본원에 개시된 조성물에서 이의 사용이 고려된다.

본원에 사용된 바와 같이 용어 “약제학적 조성물”은 이의 원하는 활성에 가장 적합한 신체 위치에 대한 투여, 예를 들어 전신 투여에 적합한 형태로 적어도 하나의 약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체를 지칭한다. 용어 “약제학적 조성물”은 대상체에게 영향을 미치는 특정 질환 또는 병태를 치료하기 위해 대상체, 예를 들어 포유류 또는 인간에게 투여되는 적어도 하나의 치료제, 바람직하게는 C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체를 함유하는 혼합물 또는 용액을 지칭하도록 의도된다. 달리 표시되지 않는 한, 이들은 그 자체가 공지된 방식으로, 예를 들어 다양한 종래의 혼합, 분쇄, 직접 압착, 과립화, 당 코팅, 용해, 동결건조 공정, 또는 당업자에게 쉽게 자명한 제작 기법에 의해 제조된다. 필요한 유효량은 복수의 투여량 단위를 투여하여 달성될 수 있으므로 각각의 투여 형태의 개별 용량의 단위 함량 그 자체가 유효량을 구성할 필요가 없음은 인정될 것이다. 단일 투여형을 생성하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 제제의 양은 치료받는 대상체, 및 특정 투여 방식에 따라 변할 것이다. 단일 투여형을 생성하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 제제의 양은 일반적으로 치료 효과를 생성하는 조성물의 양일 것이다. 일반적으로, 100% 기준으로, 이 양은 약제학적으로 허용가능한 담체와 조합된 약 0.01% 내지 약 99%의 활성 제제, 약 0.1% 내지 약 70%, 또는 약 1% 내지 약 30%의 활성 제제의 범위일 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 본원에 기재된 C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체의 “치료학적 유효량” 또는 “유효량”을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 “유효량”, “유효 용량”, “약제학적 유효량”, "약제학적 유효 용량", "치료학적 유효량" 또는 "치료학적 유효 용량"(및 기타)은 상호호환적으로 사용되고, 본원에 기재된 C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체의 양/용량을 지칭하도록 의도되고, 근육 관련 질환 또는 장애의 임상적으로 관찰 가능한 징후 및 증상의 기준치에 비해 관찰 가능한 또는 임상적으로 유의미한 개선을 제공하기 위해 및/또는 근육 관련 질환 또는 장애와 연관된 하나 이상의 증상을 예방하거나 발생을 억제하거나 완화하거나 지연시키거나 경감시키거나 정지시키거나 역전시키거나 치료하기 위해 필요한 시간 동안 필요한 투여량에서 충분한 본원에 기재된 C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체의 양/용량을 지칭하도록 의도된다. 유효량은 질환의 유형, 사용된 조성물, 투여 경로, 치료되는 포유류의 유형, 고려되는 특정 포유류의 신체 특징, 동반 약제, 및 다른 인자, 예컨대 의학 분야의 당업자가 인식하는 개체의 질환 상태, 연령, 성별 및 중량에 따라 달라진다. 또한, 치료적 유효량은 치료제의 임의의 독성 또는 유해 효과보다 치료적으로 유익한 효과가 더 큰 것이다. 이러한 화합물의 독성 및 치료 효능은 세포 배양 또는 실험 동물에서 표준 약학 절차, 예컨대 LD50(집단의 50%에 대한 치사 용량) 및 ED50(집단의 50%에서 치료적으로 유효한 용량)을 결정하는 절차에 의해 결정될 수 있다. 독성 및 치료 효과 간의 용량 비는 치료 지수이며, LD50/ED50의 비로 표현될 수 있다. 높은 치료 지수를 나타내는 화합물이 바람직하다. 독성 부작용을 나타내는 화합물이 사용될 수 있지만, 감염되지 않은 세포에 대한 잠재적 손상을 최소화하고, 이에 의해 부작용을 감소시키기 위해, 이환된 조직 부위로 이러한 화합물을 표적화하는 전달 시스템을 설계하기 위해 주의를 기울여야 한다. 세포 배양 검정 및 동물 연구로부터 얻어진 데이터가 인간에서 사용하기 위한 투여량 범위를 제형화하는 데 사용될 수 있다. 이러한 화합물의 투여량은 바람직하게는 독성이 거의 또는 전혀 없는 ED50을 포함하는 순환 농도 범위 내에 있다. 투여량은 이용되는 투여량 형태 및 이용되는 투여 경로에 따라 이 범위 내에서 변할 수 있다. 본 발명의 방법에 사용되는 임의의 화합물에 있어서, 치료 유효 용량은 처음에 세포 배양 검정으로부터 추정될 수 있다. 세포 배양에서 결정되는 IC50(즉, 증상의 최대-절반 억제를 달성하는 평가 화합물의 농도)을 포함하는 순환 혈장 농도 범위를 달성하는 용량이 동물 모델에서 제형화될 수 있다. 이러한 정보는 인간에서 유용한 용량을 보다 정확히 결정하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 혈장에서의 수준이 측정될 수 있다. 다른 구현예에서, 용어 “치료학적 유효량”은 세포, 또는 조직, 또는 비세포 생물학적 재료, 또는 배지에 투여될 때 세포, 조직 또는 비세포 생물학적 재료에서 마이오카인으로서 적어도 부분적으로 작용하기에 효과적인 본 발명의 C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체의 양을 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같이, 질환 또는 장애와 연결되어 용어 “예방한다”, “예방하는” 또는 "예방"은, 대상체가 병태를 발생시킬 확률을 감소시키는, 병태(예를 들어, 특정 질환 또는 장애 또는 이의 임상 증상)를 발생시킬 위험이 있는 대상체의 예방적 치료를 지칭한다. 일부 구현예에서, 개시된 조성물, 용도, 키트, 방법 및 화합물은 환자에서의 예방적 치료에 사용된다.

본원에 사용된 바와 같이, 근육 관련 장애와 연결되어 용어 "치료한다", "치료하는" 또는 "치료"는 일부 구현예에서 질환 또는 장애를 경감시키는 것(즉, 질환 또는 이의 임상 증상 중 적어도 하나의 발생을 느리게 하거나 정지시키거나 줄이는 것)을 지칭한다. 다른 구현예에서, "치료한다", "치료하는" 또는 "치료"는 환자가 구별할 수 없는 것을 포함하여 적어도 하나의 신체적 매개변수를 완화하거나 경감시키는 것을 지칭한다. 또 다른 구현예에서, "치료하다", "치료하는" 또는 "치료"는 신체적으로(예를 들어, 식별 가능한 증상의 안정화), 생리적으로(예를 들어, 신체적 매개변수의 안정화) 또는 둘 다에서 질환 또는 장애를 조절하는 것을 나타낸다. 또 다른 실시 형태에서, “치료하다”, “치료하는” 또는 “치료”는 근육 관련 장애의 발병 또는 발생 또는 진행을 지연시키는 것을 지칭한다.

본원에서 달리 지시되거나 문맥에 의해 달리 명백하게 모순되지 않는 한, 본원에서 기술된 모든 방법은 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본원에서 제공된 임의의 모든 실시예, 또는 예시적인 용어(예를 들어, "예컨대")의 사용은 단순히 본 발명을 더 잘 예시하고자 하는 것이며 청구된 발명의 범위에 제한을 부여하지 않는다.

발명을 실시하기 위한 구체적인 내용

본 발명은 부분적으로 C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체가 마이오카인 활성을 갖는다는 발견에 기초한다. C1ORF54 mRNA의 발현의 수준이 대상체에서 운동에 반응하여 골격근에서 증가된다는 것이 발견되었다.

따라서, 본 발명은 마이오카인 활성을 갖는 이의 C1orf54 변이체를 제공한다. 본 발명은 또한 약제로서 사용하기 위한 C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체를 제공한다. 본 발명은 또한 치료에서의 용도를 위한 또는 약제의 제조에서의 용도를 위한 C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체를 제공한다. 본 발명은 또한 근육 관련 장애의 치료, 예방 또는 경감에서 사용하기 위한 C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 결과적으로, 마이오카인 활성을 갖는 매우 바람직한 C1orf54 폴리펩타이드 및 이의 변이체 및 신규의 치료학적 접근법이 본 발명에 의해 제공된다.

(예를 들어, 액체 또는 동결건조된 형태의) 본원에 기재된 바와 같은 C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체 또는 본원에 기재된 바와 같은 C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체를 포함하는 약제학적 조성물을 포함하는 키트가 추가로 제공된다.

본 발명은 마이오카인 활성을 갖는 단리된 C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체의 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 근육 관련 장애를 치료하거나 예방하거나 경감시키는 방법을 추가로 제공한다.

일 구현예에서, 본 발명은 서열 번호 3 또는 서열 번호 4로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90% 또는 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 제공하고, 상기 아미노산 서열은 마이오카인 활성을 갖는 C1orf54 변이체를 암호화한다.

또한, 아미노산 서열이 서열 번호 2, 3 또는 4의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100% 동일한 재조합 폴리펩타이드; 또는 서열 번호 16, 17 또는 18의 폴리뉴클레오타이드 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 핵산에 의해 암호화된 아미노산 서열을 제조하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 a) 이종성 조절 서열에 작동가능하게 연결된 핵산 서열을 제공하는 단계; 및 b) 폴리펩타이드의 발현을 허용하는 조건 하에 (a)의 핵산을 발현시켜 재조합 폴리펩타이드를 제조하는 단계를 포함한다. 제조된 C1orf54 폴리펩타이드 및 이의 변이체를 암호화하는 서열 번호 16, 17 또는 18로부터 선택된 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어 이종성 프로모터에 작동가능하게 연결된 상기 방법에 기재된 바와 같은 아미노산 서열 번호 2, 3 또는 4를 포함하는 C1orf54 폴리펩타이드 및 이의 변이체를 포함하는 벡터가 또한 제공된다. 또한, 상기 벡터 중 하나 이상을 포함하는 단리된 숙주 세포가 제공된다. 또한, (a) 상기 벡터 중 하나 이상을 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 상기 C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체를 회수하는 단계를 포함하는, 상기 방법에 따라 C1orf 54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체를 제조하는 공정이 제공된다.

대안적으로, 아미노산 서열이 서열 번호 10~14의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100% 동일한 재조합 폴리펩타이드; 또는 서열 번호 19~23의 폴리뉴클레오타이드 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 핵산에 의해 암호화된 아미노산 서열을 제조하는 방법이 제공되고: 상기 방법은 a) 이종성 조절 서열에 작동가능하게 연결된 핵산 서열을 제공하는 단계; 및 b) 폴리펩타이드의 발현을 허용하는 조건 하에 (a)의 핵산을 발현시켜 재조합 폴리펩타이드를 제조하는 단계를 포함한다. 제조된 C1orf54 폴리펩타이드 및 이의 변이체를 암호화하는 서열 번호 19~23으로부터 선택된 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어 이종성 프로모터에 작동가능하게 연결된 것으로 기재된 바와 같은 아미노산 서열 번호 10~14를 포함하는 C1orf54 폴리펩타이드 및 이의 변이체를 포함하는 벡터가 또한 제공된다. 또한, 상기 벡터 중 하나 이상을 포함하는 단리된 숙주 세포가 제공된다. 또한, (a) 상기 벡터 중 하나 이상을 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 상기 C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체를 회수하는 단계를 포함하는, 상기 방법에 따라 C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체를 제조하는 공정이 제공된다.

다른 연구자들은 이전에 C1orf54를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 클로닝 및 단리(Gregory et al. (2006) Nature 441, 315-321, Hartley et al. (2000) Genome Res 10, 1788-1795, Strausberg et al. (2002) Proc Natl Acad Sci U S A 99, 16899-16903) 및 암호화된 폴리펩타이드가 분비된다는 사실(WO1998/42738호, WO1999/18127호, EP1104808호)을 기재하였다.

다양한 C1orf54 폴리펩타이드 및 이의 변이체가 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 본 발명은 마이오카인 활성을 갖는 다양한 C1orf54 폴리펩타이드 및 이의 변이체의 용도를 고려한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 전장 C1orf54 폴리펩타이드 아미노산 서열 또는 이의 변이체의 용도를 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 마이오카인 활성을 보유하는 C1orf54 서열의 일부(전장 서열이 아님)를 포함하는 C1orf54 폴리펩타이드, 또는 이의 변이체를 제공한다. 따라서, 일부 구현예에서, 본 발명의 C1orf54 폴리펩타이드는 적어도 마이오카인 활성을 갖는 인간(예를 들어, 서열 번호 2) C1orf54 단백질 서열의 단편(예를 들어, 적어도 60개, 적어도 65개, 적어도 70개, 적어도 75개, 적어도 80개, 적어도 85개, 적어도 90개, 적어도 95개, 적어도 100개, 적어도 105개, 적어도 110개의 인접한 아미노산)을 포함한다.

일부 구현예에서, 본 발명의 C1orf54 단백질은 적어도 천연 마우스(예를 들어, 서열 번호 24), 개(예를 들어, 서열 번호 32), 소(예를 들어, 서열 번호 33) 또는 말(예를 들어, 서열 번호 31) C1orf54 폴리펩타이드 서열의 단편(예를 들어, 적어도 60개, 적어도 65개, 적어도 70개, 적어도 75개, 적어도 80개, 적어도 85개, 적어도 90개, 적어도 95개, 적어도 100개, 적어도 105개, 적어도 110개의 인접한 아미노산)을 포함한다.

일부 구현예에서, 본 발명은 C 말단 서열의 적어도 일부가 결여된, 예를 들어 C 말단으로부터의 적어도 10개, 20개, 30개, 40개, 50개의 아미노산, 예를 들어 10개, 20개, 30개, 40개, 50개의 아미노산이 결여된 C1orf54 폴리펩타이드 변이체(비제한적인 예로서 임의의 서열 번호 1~14를 포함)를 제공한다.

일부 구현예에서, 본 발명은 N 말단 서열의 적어도 일부가 결여된, 예를 들어 N 말단으로부터의 적어도 10개, 20개, 30개, 40개, 50개의 아미노산, 예를 들어 10개, 20개, 30개, 40개, 50개의 아미노산이 결여된 C1orf54 폴리펩타이드 변이체(비제한적인 예로서 임의의 서열 번호 1~14를 포함)를 제공한다.

본 발명의 C1orf54 폴리펩타이드는 자연 발생 C1orf54 폴리펩타이드의 변이체 및 절두, 및 마이오카인 활성을 갖는 본원에 기재된 C1orf54 폴리펩타이드 변이체의 변이체 및 절두를 포함한다. 본 발명은 본 발명의 방법에서 마이오카인 활성을 갖는 자연 발생 C1orf54 폴리펩타이드의 C1orf54 폴리펩타이드 변이체 및 절두의 용도를 포함한다. 마이오카인 활성을 갖는 활성 변이체는 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 당업자에게 공지된 임의의 수의 방식으로 확인될 수 있다. 일부 구현예에서, 활성 단백질의 아미노산 정렬은 비변이체인 또는 보존된 아미노산 변화를 포함하는 위치를 확인하도록 확립될 수 있다.

따라서, 본 발명의 일 양태는 서열 번호 3의 아미노산 서열과 적어도 95%, 적어도 97% 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 단리된 폴리펩타이드를 제공하고, 여기서 폴리펩타이드는 마이오카인 활성을 갖는다.

본 발명의 다른 양태는 서열 번호 4의 아미노산 서열과 적어도 95%, 적어도 97% 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 단리된 폴리펩타이드를 제공하고, 여기서 폴리펩타이드는 마이오카인 활성을 갖는다.

일 구현예에서, 서열 번호 3 및 서열 번호 4의 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진 단리된 폴리펩타이드가 제공되고, 여기서 1개, 3개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산이 서열 번호 3 또는 서열 번호 4 중 어느 하나의 서열 내에 변형되거나 결실되거나 치환되고, 폴리펩타이드는 마이오카인 활성을 갖는다.

다른 구현예에서, 본 발명은 서열 번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 단리된 폴리펩타이드를 제공하고, 폴리펩타이드는 마이오카인 활성을 갖는다.

다른 구현예에서, 본 발명은 서열 번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 단리된 폴리펩타이드를 제공하고, 폴리펩타이드는 마이오카인 활성을 갖는다.

본 발명의 C1orf54 폴리펩타이드는 또한 비자연적 C1orf54 단백질 플랭킹 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 마이오카인 활성을 갖는 C1orf54 폴리펩타이드의 일부는 융합 단백질을 형성하기 위해 하나 이상의 이종성 아미노산에 융합될 수 있다. 융합 파트너 서열은 아미노산 태그, 생체내 반감기 및/또는 프로테아제 저항을 연장시키는 비-L(예를 들어, D-) 아미노산 또는 다른 아미노산 모방체, 표적화 서열 또는 다른 서열, 예를 들어 인간 면역글로불린 Fc 단편을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 일 구현예에서, 본 발명은 하나 이상의 이종성 아미노산, 펩타이드 또는 단백질에 융합된 C1orf54 폴리펩타이드를 제공하고, 여기서 이종성 아미노산, 펩타이드 또는 융합 단백질 파트너는 아미노산 태그, 생체내 반감기 연장제, 표적화 서열, 인간 면역글로불린 Fc 단편을 포함할 수 있다.

추가의 구현예에서, 본 발명에 따른 단리된 C1orf 54 폴리펩타이드, 예를 들어 서열 번호 3 및 서열 번호 4의 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어진 단리된 C1orf54 폴리펩타이드는 마이오카인 활성을 갖고, 여기서 상기 마이오카인 활성은 근육 기능 증가 활성을 포함한다.

다른 구현예에서, 본 발명에 따른 단리된 C1orf54 폴리펩타이드, 예를 들어 서열 번호 3 및 서열 번호 4의 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어진 단리된 C1orf54 폴리펩타이드는 마이오카인 활성을 갖고, 여기서 상기 마이오카인 활성은 근육 강도 증가 활성을 포함한다.

다른 구현예에서, 본 발명에 따른 단리된 폴리펩타이드, 예를 들어 서열 번호 3 및 서열 번호 4의 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어진 단리된 C1orf54 폴리펩타이드는 마이오카인 활성을 갖고, 여기서 상기 마이오카인 활성은 근육 재생 개선 활성을 포함한다.

약제학적 조성물

약제학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제와 함께 제제화된, 마이오카인 활성을 갖는 단리된 C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체, 예를 들어 서열 번호 2, 3 또는 4의 아미노산 서열을 포함하는 C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체를 포함하는 약제학적 조성물이 본원에 제공된다. 이 조성물은 의학적 병태의 치료에 적합한 하나 이상의 다른 치료제를 추가로 함유할 수 있다.

본원에 기재된 약제학적 조성물은 당해 분야에 공지된 다양한 방법에 의해 투여될 수 있다. 투여 경로 및/또는 방식은 원하는 결과에 따라 달라질 수 있다. 투여 경로에 따라, 마이오카인 활성을 갖는 C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체는 화합물을 불활성화시킬 수 있는 산의 작용 및 다른 천연 조건으로부터 이 화합물을 보호하는 재료로 코팅될 수 있다. 따라서, 다른 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물과 같은 조성물을 제공한다.

따라서,

i. 서열 번호 2, 3 또는 4의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드;

ii. 서열 번호 2, 3 또는 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드;

iii. 서열 번호 2, 3 또는 4와 적어도 95%의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드;

iv. 서열 번호 2, 3 또는 4와 적어도 95%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드; 및

v. 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산이 서열 번호 2, 3 또는 4 중 어느 하나의 서열 내에 변형, 결실, 부가 및/또는 치환된 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진 폴리펩타이드로부터 선택된 약제학적 유효량의 적어도 하나의 폴리펩타이드; 및

적어도 하나의 약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는, 약제학적 조성물이 제공되며,

이 때 상기 폴리펩타이드는 마이오카인 활성을 갖는다.

또한,

iv. 서열 번호 2, 3 또는 4와 적어도 95%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드;

v. 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산이 서열 번호 2, 3 또는 4 중 어느 하나의 서열 내에 변형, 결실, 부가 및/또는 치환된 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진 폴리펩타이드로부터 선택된 적어도 하나의 폴리펩타이드; 및

적어도 하나의 약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는, 약제학적 조성물이 제공되며, 이 때 상기 폴리펩타이드는 마이오카인 활성을 갖는다. 다른 구현예에서, 상기 약제학적 조성물은 근육 관련 장애의 치료에서 사용하기 위한 것이다. 일 구현예에서, 상기 마이오카인 활성은 근육 기능 증가 활성을 포함한다. 일 구현예에서, 상기 근육 기능 증가 활성은 본원에 기재된 검정에 의해 결정된다. 다른 구현예에서, 상기 마이오카인 활성은 근육 강도 증가 활성을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 상기 근육 강도 증가 활성은 본원에 기재된 검정에 의해 결정된다. 또 다른 구현예에서, 상기 마이오카인 활성은 근육 재생 개선 활성을 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 상기 근육 재생 개선 활성은 본원에 기재된 검정에 의해 결정된다. 다른 구현예에서, 상기 마이오카인 활성은 근육 강도 증가 활성 및 근육 재생 개선 활성을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 본원에 제공된 약제학적 조성물은 근육 관련 장애의 치료에 사용하기 위한 것이다. 일 구현예에서, 본원에 제공된 약제학적 조성물은 근위축, 정형외과 손상, 근육 손상, 근력 저하, 심부전, 화학요법, 및 후뇌졸중, 속발성 근손실, 근육감소증, 악액질, 비만 또는 대사 증후군으로부터 선택되거나 이에 의해 생긴 근육 관련 장애의 치료에 사용하기 위한 것이다.

일 구현예에서, 상기 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제와 함께 제제화된다.

투약 요법은 최적의 목적하는 반응(예를 들어, 치료학적 반응)을 제공하기 위해 조정된다. 예를 들어, 단일 볼루스가 투여될 수 있고, 여러 번 분할된 용량이 시간이 지남에 따라 투여될 수 있거나, 용량이 치료 상황의 긴급성에 의해 지시되는 바와 같이 비례하여 감소 또는 증가될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 투여 단위 형태는 치료받고자 하는 대상체에 대한 단일 투여량으로 적합한 물리적으로 분리된 단위를 지칭하며; 각각의 단위는 필요한 약제학적 담체와 연계되어 원하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 소정량의 활성 화합물을 함유한다. 본 발명의 투여량 단위 형태에 대한 명세사항은 활성 화합물의 독특한 특성 및 달성될 특정 치료 효과, 및 개체의 민감도를 치료하기 위한 이러한 활성 화합물을 배합하는 분야에 내재된 한계에 의해 설명되며, 이에 직접 의존한다. C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체 또는 상기 C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체를 포함하는 약제학적 조성물의 치료학적 유효량은 숙주의 체중 1 kg당 약 0.001 내지 150 mg, 또는 0.01 내지 30 mg, 및 보다 일반적으로는 0.1 내지 10 mg의 범위이다. 당업자는 투여 경로(예를 들어, 정맥내 또는 피하)에 따라 변하는 적합한 유효량을 확인하는 것을 알고 있다. 일부 전신 투여 방법에서, 투여량은 1 내지 1000 μg/mL, 및 일부 방법에서는 25 내지 500 μg/mL의 C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체의 혈장 농도를 달성하도록 조정된다. 대안적으로, 상기 조성물은 지속 방출 제형일 수 있고, 이 경우에 덜 빈번한 투여가 필요하다. 투여량 및 빈도는 환자에서 C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체의 반감기에 따라 달라진다. 투여량 및 투여 빈도는 치료가 예방적인지 또는 치료적인지에 따라 다를 수 있다. 예방적 적용에서, 예를 들어 상대적으로 낮은 투여량이 장기간에 걸쳐 상대적으로 덜 빈번한 간격으로 투여된다. 치료적 적용에서, 예를 들어 질병 진행이 감소되거나 종료될 때까지, 또는 환자가 질병 증상의 부분적인 또는 완전한 완화를 나타낼 때까지, 비교적 짧은 간격으로 비교적 높은 투여량이 때때로 요구된다. 이후에, 환자는 예방적 요법을 투여받을 수 있다. 본원에 제공된 약제학적 조성물 중 활성제의 실제 투여량 수준은 환자에게 독성이 없으면서 특정한 환자, 조성물 및 투여 방식에 대해 원하는 치료 반응을 달성하는 데 효과적인 활성제의 양이 달성되도록 달라질 수 있다. 선택된 투여량 수준은 사용되는 본 발명의 특정한 조성물의 활성, 또는 투여 경로, 투여 시간, 사용되는 특정한 화합물의 배출 속도, 치료 지속기간, 사용되는 특정한 조성물과 조합되어 사용되는 기타 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료되는 환자의 연령, 성별, 체중, 병태, 전반적 건강 및 과거 병력, 및 의학 분야에 공지된 유사 인자를 포함한 다양한 약동학적 인자에 따라 달라질 것이다. 예시적인 치료 요법은 1일마다 적어도 1회, 1주마다 적어도 1회, 2주마다 적어도 1회, 3주마다 적어도 1회, 4주마다 적어도 1회, 1달마다 적어도 1회, 3달마다 적어도 1회, 또는 3달 내지 6달마다 적어도 1회의 투여를 포함한다. 본 발명의 조성물에 포함된 치료학적 유효량의 C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체의 투여는 질환 증상의 중증도의 감소, 질환 무증상 기간의 빈도 및 기간의 증가, 또는 질환 고통으로 인한 손상 또는 불능의 예방, 즉 근육 강도 및/또는 근육의 재생 능력의 증가를 초래할 수 있다.

환자는 C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체의 유효량, 즉 해당 근육 관련 장애를 치료, 완화 또는 예방하기에 충분한 양을 받을 것이다. 치료학적 효과는 또한 신체 증상의 감소를 포함할 수 있다. 치료학적 효과는 운동 효과를 모방할 수 있다. 투여량은 단일 용량 스케줄 또는 다중 용량 스케줄에 의할 수 있다. 투여량은 간헐적일 수 있다. 간헐적 투약 동안, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 약제학적 조성물에 포함된, C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체, 예를 들어 서열 번호 2, 3 또는 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드의 치료학적 유효량은 환자에게 투여되어서, 본원에 기재된 바와 같은 C1orf54의 생물학적 활성을 유도하고, 이어서 C1orf54 생물학적 활성이 유도된 상태와 비교하여 감소하도록, 예를 들어 약제학적 조성물에 포함된, C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체, 예를 들어 서열 번호 2, 3 또는 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드가 상기 환자에게 투여되지 않는 기간이 이어진다. 일 구현예에서, 간헐적 투약 스케줄은 적어도 2회의 사이클을 포함하고, 각각의 사이클은 (a) 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 약제학적 조성물에 포함된 C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체, 예를 들어 서열 번호 2, 3 또는 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드의 치료학적 유효량이 환자에게 투여되는 투약 기간 및 이후 (b) 휴지 기간을 포함한다.

본 발명의 조성물은 당업계에 공지된 다양한 방법 중 하나 이상을 이용하는 하나 이상의 투여 경로에 의해 투여될 수 있다. 당업자가 인식하고 있는 바와 같이, 투여 경로 및/또는 방식은 원하는 결과에 따라 달라질 것이다. 본 발명의 치료학적 단백질에 대한 투여 경로는 예를 들어 주사 또는 주입에 의한 정맥내, 근육내, 진피내, 복강내, 피하, 국소 전달, 척추 또는 다른 비경구 투여 경로를 포함한다. 일 구현예에서 C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체 또는 상기 C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체를 포함하는 조성물은 정맥내 투여된다. 다른 구현예에서, C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체 또는 상기 C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체를 포함하는 조성물은 피하로 투여된다. 다른 구현예에서, C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체 또는 상기 C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체를 포함하는 조성물은 근육내 투여된다.

본 발명의 용도 및 방법

예를 들어 본원에 개시된 바와 같은 C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체, 또는 상기 C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체를 포함하는 조성물은 치료학적 유용성을 갖는다. 예를 들어, 이들 분자는 대상체에게 투여될 수 있고, 질환의 치료, 예방에 및/또는 질환 증상의 발생의 지연을 위해 사용될 수 있다. 본 발명은 치료에서 또는 약제로서 사용하기 위한, 예를 들어 본원에 개시된 바와 같은 C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체, 또는 상기 C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 병리학적 장애, 예를 들어 근육 관련 장애의 치료에서 사용하기 위한, 예를 들어 본원에 개시된 바와 같은 C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체, 또는 상기 C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체를 포함하는 조성물을 추가로 제공한다. 본 발명은 병리학적 장애, 예를 들어 근육 관련 장애의 치료를 위한 약제의 제조에서의, 예를 들어 본원에 개시된 바와 같은 C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체, 또는 상기 C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체를 포함하는 조성물의 용도를 추가로 제공한다. 일 구현예에서, 본 발명은 근육 기능을 증가시키는 데 사용하기 위한, 예를 들어 본원에 개시된 바와 같은 C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체, 또는 상기 C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 하나의 특정 구현예에서, 상기 근육 기능은 근육 강도 증가를 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 환자에서 근육 강도를 증가시키는 데 사용하기 위한, 예를 들어 본원에 개시된 바와 같은 C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체, 또는 상기 C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 근육 강도를 증가시키려는 필요는 특히 근육 관련 장애의 결과로서 본원에 언급된 병태 중 하나로부터 생길 수 있거나, 이것은 본원에 언급되지 않은 병리학적 병태와 같은 병태로부터 생길 수 있는데, 이는 그럼에도 불구하고 근육 기능의 증가로부터 이익이 된다. 다른 구현예에서, 상기 근육 기능은 근육 재생 개선을 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 근육 기능은 근육 강도 증가 및 근육 재생 개선을 포함한다.

일 양태에서, 본 발명은 치료에 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체를 제공한다. 따라서, 본 발명은 약제로서 사용하기 위한

c. 서열 번호 2, 3 또는 4와 적어도 95%의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드;

d. 서열 번호 2, 3 또는 4와 적어도 95%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드; 및

e. 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산이 서열 번호 2, 3 또는 4 중 어느 하나의 서열 내에 변형, 결실, 부가 및/또는 치환된 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진 폴리펩타이드로부터 선택된 폴리펩타이드를 제공한다.

일 구현예에서, C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체, 예를 들어 서열 번호 2, 3 또는 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드는 마이오카인 활성을 갖는다. 추가의 구현예에서, C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체, 예를 들어 서열 번호 2, 3 또는 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드는 대상체에서 근육 관련 장애의 치료에 사용하기 위한 것이다.

다른 양태에서, 본 발명은 약제의 제조에서 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체를 제공한다. 본 발명은 약제의 제조에서 사용하기 위한

일 구현예에서, 약제의 제조에서 사용하기 위한 C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체, 예를 들어 서열 번호 2, 3 또는 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드는 마이오카인 활성을 갖는다. 추가의 구현예에서, C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체, 예를 들어 서열 번호 2, 3 또는 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드는 대상체에서 근육 관련 장애의 치료에 사용할 약제의 제조에 사용하기 위한 것이다.

추가의 양태에서, 본 발명은 대상체에서 근육 관련 장애를 치료하는 데 사용하기 위한 폴리펩타이드 또는 이의 변이체를 제공하고, 치료는

e. 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산이 서열 번호 2, 3 또는 4 중 어느 하나의 서열 내에 변형, 결실, 부가 및/또는 치환된 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진 폴리펩타이드로부터 선택된 폴리펩타이드를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고,

상기 폴리펩타이드는 마이오카인 활성을 갖는다.

다른 양태에서, 본 발명은 대상체에서 근육 관련 장애를 치료하는 데 사용하기 위한 폴리펩타이드 또는 이의 변이체를 제공하고, 치료는

f. 서열 번호 2, 3 또는 4의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드;

g. 서열 번호 2, 3 또는 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드;

h. 서열 번호 2, 3 또는 4와 적어도 95%의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드; 또는

i. 서열 번호 2, 3 또는 4와 적어도 95%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드로부터 선택된 폴리펩타이드의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고; 상기 폴리펩타이드는 마이오카인 활성을 갖는다.

본 발명은 치료학적 유효량의 C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체, 예를 들어 서열 번호 2, 3, 또는 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 또는 상기 C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체, 예를 들어 서열 번호 2, 3 또는 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 병리학적 장애, 예를 들어 근육 관련 장애를 앓는 환자를 치료하는 방법을 추가로 제공한다. 따라서, 본 발명은 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 마이오카인 활성을 갖는 약제학적 조성물에 포함된 C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체, 예를 들어 서열 번호 2, 3 또는 4를 갖는 폴리펩타이드의 치료학적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 근육 관련 장애를 치료하는 방벙을 제공하고, 이로써 상기 마이오카인 활성은 근육 기능 증가 활성을 포함한다. 상기 근육 기능은 근육 강도 및/또는 근육 재생을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 근육 강도를 증가시키는 방법에 관한 것이다. 다른 구현예에서, 상기 근육 기능은 근육 재생 개선을 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 근육 기능은 근육 강도 증가 및 근육 재생 개선을 포함한다. 근육 강도를 증가시키려는 필요는 특히 근육 관련 장애의 결과로서 본원에 언급된 병태 중 하나로부터 생길 수 있거나, 이것은 본원에 언급되지 않은 병리학적 병태와 같은 병태로부터 생길 수 있는데, 이는 그럼에도 불구하고 근육 기능의 증가로부터 이익이 된다

따라서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체를 투여하는 단계를 포함하는, 근육 관련 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 대상체에서 근육 관련 장애를 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은

e. 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산이 서열 번호 2, 3 또는 4 중 어느 하나의 서열 내에 변형, 결실, 부가 및/또는 치환된 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진 폴리펩타이드로부터 선택된 폴리펩타이드의 치료학적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고,

상기 폴리펩타이드는 마이오카인 활성을 갖는다.

하기 부문에서, 상기 기술된 용도 및 방법의 다양한 양태 및 구현예가 기재되어 있고, 모든 이들 양태 및 구현예는 함께 조합될 수 있다. 당업자는 하기 페이지에 개시된 교시내용이 모두 서로 조합 가능하고, 이들 페이지의 다양한 부분으로부터의 특징을 조합하는 특정 양태 및 구현예가 당업자에게 적절하게 개시된 것으로 여겨질 것이라는 것을 인식한다.

본 발명의, 예를 들어 약제학적 조성물에 포함된, 단리된 C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체, 예를 들어 서열 번호 2, 3 또는 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드는 본원에 제공된 바대로, 예를 들어 본 발명을 수행하기 위한 모드에 의해 기재된 바대로 예를 들어 시험관내 및 생체내 시험에 표시된 것처럼 마이오카인 활성을 나타내고, 따라서 생체내 또는 시험관내 치료 또는 용도를 위해 표시된다. 근육 강도와 같은 근육 기능의 증가로부터 및/또는 근육 재생의 개선으로부터 이익을 얻는 질환 및 장애가 특히 고려된다.

따라서, 본 발명은 근육 강도의 증가에 사용하기 위한, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 약제학적 조성물에 포함된, C1orf54 폴리펩타이드 및 이의 변이체, 예를 들어 서열 번호 2, 3 또는 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 제공한다.

본 발명은 또한 근육 강도의 증가를 위한 약제로서의 용도를 위한 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들어 약제학적 조성물에 포함된, C1orf54 폴리펩타이드 및 이의 변이체, 예를 들어 서열 번호 2, 3 또는 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 제공한다.

또한, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들어 약제학적 조성물에 포함된, C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체, 예를 들어 서열 번호 2, 3 또는 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 근육 강도를 증가시키는 방법을 제공한다.

골격근은 운동하기 위해 높은 가소성 및 높은 반응성을 갖는 조직이다. 위성 세포(근육 전구 세포)는 전형적으로 운동 및 손상 시 활성화되고, 근육 조직의 개형에서 중요한 역할을 한다. MyoD는 주로 위성 세포를 분화로 유도시켜 위성 세포의 운명을 결정하는 중요한 전사 인자이다. MyoD가 결여된 근육 전구 세포는 더 많은 줄기-세포 유사 표현형을 재개하고, 손상된 근육으로의 주사 후, 야생형 세포와 비교하여 상당히 더 높은 효율로 생착한다. 부가적으로, MyoD가 결여된 위성 세포는 근섬유의 기저판 밑에서 검출될 수 있고, 증가된 생착 후 증식 및 생존을 보여준다(Asakura et al. (2007) Proc Natl Acad Sci USA 104, 16552-16557). 따라서, MyoD를 일시적으로 감소시키는 것이 바람직하다. 본 발명의 C1orf54 폴리펩타이드는 시험관내 MyoD 수준(실시예 5, 도 5) 또는 생체내 MyoD 수준(실시예 4, 도 4)을 감소시킨다.

따라서, 이를 필요로 하는 대상체에서 근육 기능의 증가에 사용하기 위한 마이오카인 활성을 갖는, 예를 들어 약제학적 조성물에 포함된, C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체, 예를 들어 서열 번호 2, 3 또는 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드가 본원에 제공되고, 상기 방법은 이러한 폴리펩타이드 또는 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 폴리펩타이드 또는 약제학적 조성물의 투여는 MyoD의 수준을 감소시켜서 대상체에서 근육 기능의 증가, 적합하게는 근육 강도의 증가 및/또는 개선된 근육 재생을 촉진한다.

다른 구현예에서, 치료학적 유효량의 C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체, 예를 들어 서열 번호 2, 3 또는 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 투여하는 단계를 포함하는 근육 관련 장애를 치료하는 방법이 제공되고, 상기 폴리펩타이드의 투여는 MyoD의 수준을 감소시켜서, 대상체에서 근육 기능의 증가, 적합하게 근육 강도의 증가 및/또는 개선된 근육 재생을 촉진한다.

일 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들어 약제학적 조성물에 포함된, C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체, 예를 들어 서열 번호 2, 3 또는 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드는 근아세포의 증식을 자극하기 위해 및/또는 위성 세포의 빈도 또는 수를 증가시키기 위해 사용하기 위한 것이다. 상기 사용은 생체내 또는 시험관내 사용, 바람직하게는 생체내 사용일 수 있다.

따라서, 일 구현예에서, 이를 필요로 하는 대상체에서 근육 기능의 증가에 사용하기 위한 마이오카인 활성을 갖는, 예를 들어 약제학적 조성물에 포함된, C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체, 예를 들어 서열 번호 2, 3 또는 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드가 본원에 제공되고, 상기 방법은 상기 폴리펩타이드 또는 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 폴리펩타이드 또는 약제학적 조성물의 투여는 근아세포의 증식을 자극하여서, 대상체에서 근육 기능의 증가, 적합하게 근육 강도의 증가 및/또는 개선된 근육 재생을 촉진한다.

추가의 구현예에서, 본 발명은 또한 이를 필요로 하는 대상체에서 근육 기능의 증가에 사용하기 위한 마이오카인 활성을 갖는, 예를 들어 약제학적 조성물에 포함된, C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체, 예를 들어 서열 번호 2, 3 또는 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 제공하고, 상기 방법은 상기 폴리펩타이드 또는 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 폴리펩타이드 또는 약제학적 조성물의 투여는 대상체의 골격근 줄기 세포 또는 위성 세포의 빈도 또는 수를 증가시켜서, 대상체에서 근육 기능의 증가, 적합하게 근육 강도의 증가 및/또는 개선된 근육 재생을 촉진한다.

다른 구현예에서, 본 발명은 치료학적 유효량의 C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체, 예를 들어 서열 번호 2, 3 또는 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 투여하는 단계를 포함하는 근육 관련 장애를 치료하는 방법을 제공하고, 상기 폴리펩타이드의 투여는 근아세포의 증식을 자극하여서, 대상체에서 근육 기능의 증가, 적합하게 근육 강도의 증가 및/또는 개선된 근육 재생을 촉진한다.

또 다른 구현예에서, 본 발명은 치료학적 유효량의 C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체, 예를 들어 서열 번호 2, 3 또는 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 투여하는 단계를 포함하는 근육 관련 장애를 치료하는 방법을 제공하고, 상기 폴리펩타이드의 투여는 대상체의 골격근 줄기 세포 또는 위성 세포의 빈도 또는 수를 증가시켜서, 대상체에서 근육 기능의 증가, 적합하게 근육 강도의 증가 및/또는 개선된 근육 재생을 촉진한다.

본 발명 또한 일 구현예에서, 예를 들어 약제학적 조성물에 포함된, 단리된 C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체, 예를 들어 서열 번호 2, 3 또는 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드의 유효량을 위성 세포를 포함하는 단리된 생물학적 샘플에 투여하는 단계를 포함하는, 위성 세포 자가 재생 및/또는 분화를 촉진하는 시험관내 방법을 제공한다. 추가의 구현예에서, 위성 세포의 근아세포로의 증식 및/또는 분화를 자극하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 상기 위성 세포가 근아세포로 증식하고/하거나 분화하기에 충분한 조건 하에 그리고 충분한 시간 동안 상기 세포를, 예를 들어 약제학적 조성물에 포함된, 일정량의 C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체, 예를 들어 서열 번호 2, 3 또는 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명은 또한 근아세포 성장을 촉진하기 위해, 예를 들어 약제학적 조성물에 포함된, C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체, 예를 들어 서열 번호 2, 3 또는 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드의 시험관내 용도를 제공한다. 일 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들어 약제학적 조성물에 포함된, C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체, 예를 들어 서열 번호 2, 3 또는 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드의 유효량을 근아세포를 포함하는 단리된 생물학적 샘플에 투여하는 단계를 포함하는, 근아세포 성장을 촉진하는 시험관내 방법이 제공된다. 상기 생물학적 샘플은 인간 골격근-유래 세포(hSkMDC)일 수 있다.

다른 구현예에서, 본 발명은 위성 세포 자가 재생 및/또는 분화를 촉진하는 제제 또는 제제의 조합을 확인하기 위한 시험관내 스크리닝 방법을 제공하고, 상기 방법은

a) 단리된 위성 세포를 후보 제제 또는 후보 제제의 조합과 접촉시키는 단계;

b) 상기 세포의 세포 표현형을 평가하는 단계;

c) 단계 b)에서의 세포 표현형을 상기 제제 또는 제제의 조합의 부재 하에 위성 세포의 표현형, 및/또는 예를 들어 약제학적 조성물에 포함된 단리된 C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체, 예를 들어 서열 번호 2, 3 또는 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드와 접촉된 위성 세포의 표현형과 비교하는 단계를 포함한다.

바람직한 구현예에 따르면, C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체, 예를 들어 서열 번호 2, 3 또는 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드는 근육 관련 장애로 이환된 대상체에 사용하기 위한 것이다. 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 근육 관련 장애로 이환된 대상체에 사용하기 위한 C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체, 예를 들어 서열 번호 2, 3 또는 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 다른 바람직한 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체, 예를 들어 서열 번호 2, 3 또는 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드의 치료학적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 근육 관련 장애를 갖는 대상체를 치료하는 방법이 제공된다.

아주 많은 근육 관련 장애는 근육 기능이상으로 이어지는 것으로 나타났다. 이들 근육 관련 장애는 하나 이상의 근골격 질환 또는 장애, 예컨대 모든 원인으로부터의 근위축, 유전성 또는 열성 근병증(예를 들어, 근이영양증) 및 약물 유도된 근병증(예를 들어, 글루코코르티코이드에 의한 치료로부터 생김)을 포함하는 근위축, 근육 소모 질환(예컨대, 후천성 면역결핍 질환[AIDS], 울혈성 심부전, 류마티스성 관절염, 암, 만성 폐쇄성 폐 질환[COPD], 간부전 또는 간경변증, 화상, 패혈증과 같은 기저 병으로부터 생길 수 있는 악액질), 오래된 불용(예를 들어, 마비, 신경 손상, 혼수, 침상안정 및 ICU 체류로 생김), 정형외과 손상, 근육 손상, 수술(예컨대, 관절 대체 수술)에 의해 유도된 허약, 화학요법, 후뇌졸중, 횡문근융해, 근위축 또는 근력 저하의 연령 관련된 병태(예컨대, 노화의 결과일 수 있는 근육감소증), 비만, 대사 증후군, 당뇨병, 심혈관 손상 또는 질환, 내분비 장애, 또는 면역학적 장애를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.

소정의 구현예에서, 본 발명은 비제한적인 예로서 임의의 원인으로부터의 근위축, 근병증, 근육 소모 질환, 오래된 불용, 정형외과 손상, 근육 손상, 근력 저하, 화학요법, 후뇌졸중, 만성 심부전, 횡문근융해, 연령 관련된 병태, 예를 들어 근육감소증, 속발성 근손실, 비만 및/또는 대사 증후군을 포함하는 근육 관련 장애의 방법에서의 또는 치료에서의 용도를 위한 화합물 및 약제학적 조성물을 제공한다. 이러한 용도 또는 방법은 마이오카인 활성을 갖는, 예를 들어 약제학적 조성물에 포함된, C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체, 예를 들어 서열 번호 2, 3 또는 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드의 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.

일 구현예에서, 근육 관련 장애는 근육 소모이다. 근육 소모는 다양한 질환, 장애, 다른 병태 또는 사건으로부터 생긴 골격근 조직의 비자발적 손실에 의해 나타난 상태를 기술하도록 사용되는 일반 용어이다. 근병증, 약물 유도된 근병증, 신경 외상 또는 퇴행성, 대사 또는 염증성 신경병증의 결과로 인한 탈신경 및 근위축 또는 쇠약의 연령 관련된 병태를 포함하는 근육 소모의 많은 원인이 있다.

일 구현예에서, 근위축은 근병증, 예컨대 근긴장; 네말렌 근병증, 다핵/미세핵 근병증 및 근세관(중심핵) 근병증, 양성 선천성 저긴장, 중심핵 질환(중심핵 근병증으로도 공지됨)을 포함하는 선천성 근병증; 미토콘드리아 근병증(예를 들어, Kearns-Sayre 증후군); 가족성 주기 마비; 염증성 근병증; 예컨대 글리코겐 또는 지질 저장 질환에 의해 생긴 대사성 근병증; 피부근육염; 다발근염; 봉입체 근염(예를 들어, 산발성 봉입체 근염 및 유전성 봉입체 근위축); 골화 근육염; 횡문근융해 및 미오글로빈뇨로부터 생긴다. 근병증은 근이영양증 증후군, 예컨대 뒤시엔느 근이영양증, 베커 근이영양증, 근긴장성 근이영양증, 안면견갑상완형 근이영양증, 에머리-드라이푸스 근이영양증, 눈인두근 근이영양증, 지대형 근이영양증, 선천성 근이영양증(예를 들어, 메로신(Merosin) 결핍 선천성 근이영양증, 베들렘 근병증, 울리히 선천성 근이영양증, 후쿠야마 선천성 근이영양증), 척추 근이영양증, 경직 척추 근이영양증, 원위 근이영양증, 사코글리칸돌연변이증 또는 유전성 원위 근병증에 의해 생길 수 있다.

일 구현예에서, 근위축은 예를 들어 코티솔, 덱사메타손, 베타메타손, 프레드니손, 메틸프레드니솔론 또는 프레드니솔론과 같은 글루코코르티코이드에 의한 치료의 결과로서 약물 유도된 근육증이다.

일 구현예에서, 근위축은 신경 외상으로 인한 탈신경의 결과 또는 신경근 질환, 장애 또는 손상(예를 들어, 운동 신경 질환, 예컨대 근 위축성 축삭경화증, 영아 척수성 근위축, 연소성 척수성 근위축, 다병변 전도체 블록을 갖는 자가면역 운동 신경병증), 파킨슨병, 헌팅턴병, 중증 근무력증, 중심핵 근병증(예를 들어, X 연관 근세관 근병증), 자가면역 신경퇴행성 질환(예를 들어, 길랑 바레 증후군, 만성 염증성 탈수초성 다발성신경병증, 람베르트-이튼(Lambert-Eaton) 근무력 증후군), 크로이츠펠트-야콥병, 및 뇌졸중 또는 척수 손상으로 인한 마비를 포함하는 퇴행성, 대사성 또는 염증성 신경병증의 결과이다.

일 구현예에서, 근위축은 근육 기능의 증가로부터 이익을 얻는 근위축 또는 근력 저하의 연령 관련 병태이다. 치료될 수 있는 근육 관련 장애의 예는 비제한적인 예로서 근육감소증, 피부 위축, 근육 소모, 불용성 근위축, 죽상동맥경화증, 동맥 경화증, 폐기종, 골다공증, 골관절염, 면역학적 무능, 고혈압, 치매, 헌팅턴병, 알츠하이머병, 악액질, 연령 관련 황반 변성, 암, 뇌졸중, 노쇠, 손상된 신장 기능 및 연령 관련 탈모를 포함하는 노화/노쇠와 연관된 것을 포함한다.

본 발명의 일 구현예에서, 근육 관련 장애는 (예를 들어, 외상, 침상안정, 자발적 비활동, 비자발적 비활동, 손상으로 인한) 골격 비활동, 영양 부족(예를 들어, 공복 또는 기아), 심근병증, 심근 경색, 협심증, 암, HIV 소모 증후군, 또는 내분비 장애, 예컨대 갑상선 또는 부신 또는 뇌하수체 장애로부터 생긴다.

일 구현예에서, 근육 관련 장애는 II형 당뇨병, 당뇨병 연관 근위축, 대사 증후군/X 증후군/인슐린 내성 증후군, 고혈당, 비만 및 비만 연관 근육감소증을 포함하는 대사 장애이다.

일 구현예에서, 근육 관련 장애는 지방제외체중의 손실 및/또는 근육 소모로부터 고통받는 성인 및 소아 화상 손상 또는 패혈증 및 집중 치료 병동(ICU) 획득 허약으로부터 고통받는 환자를 포함하는 중증 및 중등도 화상 손상에서 보이는 것과 같은 급성 근육 소모 질환이다.

일 구현예에서, 근육 관련 장애는 후천성 면역결핍 질환[AIDS], 울혈성 심부전, 류마티스성 관절염, 암, 만성 폐쇄성 폐 질환[COPD] 경변증, 화상, 패혈증, 다발성 경화증, 결핵, 인간 면역결핍 바이러스, 영양실조, 파킨슨병, 폐기종, 심부전, 운동 뉴런 질환, 낭성 섬유증, 치매, 근육감소증, 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD), 신장 질환 및 신부전과 같은 기저 병으로부터 생길 수 있는 악액질이다.

일 구현예에서, 근육 관련 장애는 사지(즉, 다리 또는 팔), 두개, 척추, 골반 또는 관절(즉, 무릎 또는 엉덩이)의 골절이다. 따라서, 일 구현예에서, 근육 관련 장애는 위팔뼈, 노뼈, 척골, 수근골, 중수골, 빗장뼈, 어깨뼈, 대퇴골, 관골, 슬개골, 경골, 비골, 거골, 종골, 족근골, 발허리뼈, 좌골 또는 회장 중 하나 이상의 손상 또는 골절이다. 다른 구현예에서, 근육 관련 장애는 무릎, 엉덩이, 발목, 어깨, 팔꿈치 및 손목의 관절의 하나 이상에서의 수술이다. 이러한 수술은 엉덩이, 무릎, 어깨 또는 다른 관절(들) 중 하나 이상의 교체를 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩타이드 또는 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 예를 들어 수술, 예를 들어 엉덩이 또는 무릎 대체 수술로부터 생긴 강화된 비활동의 근육 소모 효과를 완화시키는 데 있어서의, 예를 들어 약제학적 조성물에 포함된, C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체, 예를 들어 서열 번호 2, 3 또는 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 제공하고, 상기 폴리펩타이드 또는 약제학적 조성물은 마이오카인 활성을 갖는다. 일 구현예에서, 환자는 강화된 휴식/비활동의 예상된 기간 전에, 예를 들어 약제학적 조성물에 포함된, C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체, 예를 들어 서열 번호 2, 3 또는 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드로 전치료될 수 있다. 이러한 기간은 환자가 예를 들어 수술을 위해 병원에 입원할 때 발생할 수 있다. 비활동은 예컨대 부러진 사지 또는 관절의 석고붕대에 의해, 또는 마비성 작용제의 투여에 의해, 또는 엉덩이 또는 다리에 대한 수술 후 또는 관절 대체 후 국소화될 수 있다.

본원에 기재된 방법 및 용도에 따른 치료는 근육 관련 장애를 갖거나 근육 관련 장애의 위험이 있는 대상체에서의 감소된 근육 소모를 야기할 수 있다. 이는 또한 근육 관련 장애를 갖거나 근육 관련 장애의 위험이 있는 대상체에서 지연된 근육 소모를 야기할 수 있다. 이는 또한 근육 관련 장애를 갖거나 근육 관련 장애의 위험이 있는 대상체에서 근육 소모의 억제를 야기할 수 있다. 이는 또한 근육 관련 장애를 갖거나 근육 관련 장애의 위험이 있는 대상체에서 근육 기능의 유지를 야기할 수 있다. 이는 또한 근육 관련 장애를 갖거나 근육 관련 장애의 위험이 있는 대상체에서 기능 회복을 향상시킬 수 있다. 일 구현예에서, 뇌졸중 후 기능 회복의 향상을 위한, 예를 들어 약제학적 조성물에 포함된, C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체, 예를 들어 서열 번호 2, 3 또는 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드가 제공된다. 일 구현예에서, 뇌졸중 후 환자에서 기능 회복이 달성될 때까지의 시간을 감소시키기 위한, 예를 들어 약제학적 조성물에 포함된, C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체, 예를 들어 서열 번호 2, 3 또는 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드가 제공된다. 다른 구현예에서, 엉덩이 골절로 인한 급성 근육 손상 및 연관된 근위축을 갖는 대상체에서 기능 회복의 향상을 위한, 예를 들어 약제학적 조성물에 포함된, C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체, 예를 들어 서열 번호 2, 3 또는 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드가 본원에 제공된다. 다른 구현예에서, 70세 초과의 대상체에서 기능 회복의 향상을 위한, 예를 들어 약제학적 조성물에 포함된, C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체, 예를 들어 서열 번호 2, 3 또는 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드가 본원에 제공된다. 다른 구현예에서, ICU 근병증을 갖는 대상체에서 기능 회복의 향상을 위한, 예를 들어 약제학적 조성물에 포함된, C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체, 예를 들어 서열 번호 2, 3 또는 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드가 본원에 제공된다. 다른 구현예에서, 말초 신경 손상을 갖는 대상체에서 기능 회복의 향상을 위한, 예를 들어 약제학적 조성물에 포함된, C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체, 예를 들어 서열 번호 2, 3 또는 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드가 본원에 제공된다. 다른 구현예에서, 고정화에 의한 정형외과학적 손상을 갖는 대상체에서 기능 회복의 향상을 위한, 예를 들어 약제학적 조성물에 포함된, C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체, 예를 들어 서열 번호 2, 3 또는 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드가 본원에 제공된다. 다른 구현예에서, COPD와 연관된 근력 저하 및/또는 기능이상을 갖는 대상체에서 기능 회복의 향상을 위한, 예를 들어 약제학적 조성물에 포함된, C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체, 예를 들어 서열 번호 2, 3 또는 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드가 본원에 제공된다. 다른 구현예에서, 심부전과 연관된 근력 저하 및/또는 기능이상을 갖는 대상체에서 기능 회복의 향상을 위한, 예를 들어 약제학적 조성물에 포함된, C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체, 예를 들어 서열 번호 2, 3 또는 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드가 본원에 제공된다. 다른 구현예에서, 화학요법과 연관된 근력 저하 및/또는 기능이상을 갖는 대상체에서 기능 회복의 향상을 위한, 예를 들어 약제학적 조성물에 포함된, C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체, 예를 들어 서열 번호 2, 3 또는 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드가 본원에 제공된다. 다른 구현예에서, 급성 신장 손상(AKI: acute kidney injury)과 연관된 근력 저하 및/또는 기능이상을 갖는 대상체에서 기능 회복의 향상을 위한, 예를 들어 약제학적 조성물에 포함된, C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체, 예를 들어 서열 번호 2, 3 또는 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드가 본원에 제공된다. 다른 구현예에서, 만성 신장 손상(CKI: chronic kidney injury)과 연관된 근력 저하 및/또는 기능이상을 갖는 대상체에서 기능 회복의 향상을 위한, 예를 들어 약제학적 조성물에 포함된, C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체, 예를 들어 서열 번호 2, 3 또는 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드가 본원에 제공된다.

다른 구현예에서, 본 발명은 또한 건강한 대상체에서 근육 강도의 증가 및/또는 근육 재생의 개선 및/또는 근육 피로 저항의 증가와 같은 근육 기능을 향상시키기 위한, 예를 들어 약제학적 조성물에 포함된, C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체, 예를 들어 서열 번호 2, 3 또는 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 제공한다.

제안된 치료로부터 이익을 얻을 수 있는 다른 환자는 집중 치료 또는 장기적 입원을 요하는 급성 또는 위태로운 병으로부터 회복한 환자; 중증 외상, 예컨대 자동차 사고, 중등도 또는 중증 화상, 싸움 손상으로부터 회복한 청소년을 포함한다. 근육의 손실이 대부분의 중증 또는 장기적인 병의 흔한 합병증이므로, 근육 강도의 증가 및/또는 근육 재생의 개선이 회복을 빠르게 하고 이 손실의 근본 원인과 무관하게 근손실을 경험하는 환자의 기능으로 돌아갈 것으로 예상된다.

일 구현예에서, 속발성 근손실을 예방하기 위해 손상 직후 대상체에서 일시적 또는 영구적 불능을 예방하는, 예를 들어 약제학적 조성물에 포함된, C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체, 예를 들어 서열 번호 2, 3 또는 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드가 본원에 제공된다.

일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법 및 용도에 의한 치료는 대상체의 신체 기능을 개선할 것이다. 신체 기능은 비제한적인 예로서 간편 신체 기능 평가(SPPB), 걸음걸이 속도 측정, 일어서서 걷기 시험(TGUG), 계단 보행 능력 시험(SCPT), 400 m 걸음 시험 및/또는 거리에 대한 6분 걸음 시험(6MWD)을 포함하는 다양한 시험에 의해 평가될 수 있다.

본원에 언급된 바와 같은 거리에 대한 6분 걸음 시험(6MWD)은 예를 들어 문헌[ATS Statement: Guidelines for the Six-Minute Walk Test, Am J Respir Crit Care Med Vol 166. pp 111-117, 2002]에 기재된 바와 같이, 예를 들어, 미국 흉부 학회(American Thoracic Society)와 같은 의사회에 의해 제공된 현 실행 지침에서 정의된 바와 같이, 현재의 임상 실행법에 따라 수행되는 표준 신체 운동 시험을 지칭한다.

본원에 언급된 바와 같은 간편 신체 기능 평가(SPPB)는 3개의 별개의 시험(서기 균형, 8 피트(2.44 미터)를 걷는 시간 및 5회 의자에서 일어나고 앉은 자세로 복귀하는 시간)의 측정에 의해 하지 신체 기능 상태를 평가하기 위해 수행되는 표준 신체 운동 시험을 지칭한다(PMID: 8126356). 이후, 이들 3개의 별개의 시험은 0 내지 12 SPPB 점의 척도로 요약 기능 점수로 조합된다.

본원에 언급된 바와 같은 걸음걸이 속도 측정은 8 피트(2.44 미터)와 6 미터 걷기 거리 사이의 한정된 거리를 걷는 대상체의 능력을 평가하도록 수행되는 표준 신체 운동 시험과 관련된다. 바람직한 구현예에서, 걸음걸이 속도는 4 미터의 걷기 거리에 의해 평가된다. 걷기는 강도, 조화 및 균형을 필요로 함으로써, 심혈관, 호흡, 신경 및 근골격계를 포함하는 여러 장기 시스템에 부담을 준다.

본원에 언급된 바와 같은 일어서서 걷기 시험(TUG)은 대상체의 운동을 평가하기 위해 수행되는 표준 신체 운동 시험을 지칭한다. 이것은 사람이 의자에서 일어나고, 3 미터를 걷고, 돌고, 의자로 다시 걷고, 다시 앉는데 걸리는 시간을 측정하며, 정적 강도 및 동적 강도를 필요로 한다. 시험은 의학 집단, 예를 들어 American Geriatrics Society/British Geriatrics Society (2011)(J Am Geriatr Soc 59, 148-157)에 의한 추천에 따라 수행된다.

본원에 언급된 바와 같은 계단 보행 능력 시험(SCPT)은 대상체의 하지 강도, 힘 및 균형을 평가하기 위한 기능 시험을 지칭한다. 다수의 시험 변동은 상이한 환자 집단, 예컨대 무릎 또는 엉덩이 대체(관절성형술)에 대해 개발되었다. 시험 변동은 계단의 수, 개별 계단의 높이(예를 들어, 18 cm 또는 20 cm), 업무 요건(오름 단독 또는 오름/내림 조합), 또는 시험이 미리 결정된 수의 계단에 걸쳐 시기화되는지 또는 계단 수가 소정의 기간에 기록되는지, 예를 들어 9개 계단 오름/내림, 5개 계단 오름/내림 4개 계단 오름/내림, 30초 시험, 신속하고 속도에 맞춘 6개 계단을 포함한다.

일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법 및 용도에 의한 치료는 대상체의 근육 강도를 개선할 것이다. 근육 강도는 단일 또는 다수의 관절 및 호흡 및 다른 근육(예를 들어, 폐 기능 시험)에 걸쳐 동적 이동(예를 들어, 30초 의자 일어나기 시험, 계단 보행 시험, 무릎 굴곡/신전) 또는 정적 이동(예를 들어, 손 그립 동력측정법, 등척성 무릎 굴곡/신전)에 의해 평가될 수 있다. 근육 강도를 평가하기 위한 다른 흔히 사용되는 시험은 자전거 측력계, 저항 훈련 기계에서의 신속한 동적 수축 및 최대 수직 점프를 포함한다.

본원에 언급된 바와 같은 30초 의자 서기 시험(Jones et al. (1999) Res Q Exerc Sport 70, 113-119)은 대상체의 하지 강도 및 지구력을 평가하기 위해 수행되는 표준 신체 운동 시험을 지칭한다. 이것은 대상체가 30초 내에 앉은 자세에서 일어나, 완전히 선 자세가 되고 다시 앉는 시간을 측정한다. 이것은 하지 강도 및 지구력 둘 다를 요한다.

본원에 언급된 바와 같은 핸드그립 시험은 대상체의 그립 강도를 평가하기 위해 수행되는 표준 신체 운동 시험에 관한 것이다. 그립 강도는 악력계, 예를 들어 Jamar 악력계(Lafayette Instrument Company, 미국)에 의해 평가될 수 있다.

본원에 언급된 바와 같은 무릎 굴곡/신전 시험은 사두근(무릎 신전) 및/또는 햄스트링(무릎 굴곡)의 대상체의 강도를 평가하기 위해 수행되는 표준 신체 운동 시험을 지칭한다. 등척성, 등장성 또는 등운동 강도가 평가될 수 있다.

키트

본 발명은 또한 근육 관련 장애를 치료하기 위한 키트를 포함한다. 이러한 키트는 C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체, 예를 들어 C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체, 예를 들어 서열 번호 2, 3 또는 4를 포함하는 폴리펩타이드(예를 들어, 액체 또는 동결건조된 형태) 또는 본원에 기재된 바와 같은 C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체, 예를 들어 서열 번호 2, 3 또는 4를 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물을 포함한다. 추가로, 이러한 키트는 C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체, 예를 들어 서열 번호 2, 3 또는 4를 포함하는 폴리펩타이드를 투여하기 위한 수단(예를 들어, 오토인젝터, 시린지 및 바이알, 프리필드 시린지, 프리필드 펜) 및 사용 설명서를 포함할 수 있다. 이 키트는 예를 들어 동봉된 C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체, 예를 들어 서열 번호 2, 3 또는 4를 포함하는 폴리펩타이드와 조합되어 전달하기 위한 근육 관련 장애를 치료하기 위한 추가의 치료제를 함유할 수 있다. 이러한 키트는 또한 근육 관련 장애를 갖는 환자를 치료하기 위해 C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체, 예를 들어 서열 번호 2, 3 또는 4를 포함하는 폴리펩타이드의 투여를 위한 설명서를 포함할 수 있다. 이러한 설명서는 동봉된 C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체, 예를 들어 서열 번호 2, 3 또는 4를 포함하는 폴리펩타이드와 사용하기 위한 용량, 투여 경로 및 투약 섭생을 제공할 수 있다.

"투여하기 위한 수단"이라는 구절은 비제한적인 예로서 프리필드 시린지, 바이알 및 시린지, 주사 펜, 오토인젝터, IV 드립 및 백, 펌프 등을 포함하여 환자에게 약물을 전신으로 투여하기 위한 임의의 이용 가능한 도구를 나타내도록 사용된다. 이러한 물품에 의해, 환자는 약물을 자가 투여(즉, 의사의 보조 없이 약물을 투여)할 수 있거나, 의사가 그 약물을 투여할 수 있다. C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체, 예를 들어 서열 번호 2, 3 또는 4를 포함하는 폴리펩타이드, 및 C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체, 예를 들어 서열 번호 2, 3 또는 4를 포함하는 폴리펩타이드를 환자에게 투여하기 위한 수단을 포함하는, 근육 관련 장애를 갖는 환자를 치료하는 용도를 위한 키트가 본원에 개시된다.

C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체, 예를 들어 서열 번호 2, 3 또는 4를 포함하는 폴리펩타이드 또는 C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체, 예를 들어 서열 번호 2, 3 또는 4를 포함하는 폴리펩타이드, 및 본원에 기재된 바와 같은 약제학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물을 포함하는 키트가 본원에 개시되고, 키트는 상기 C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체, 예를 들어 서열 번호 2, 3 또는 4를 포함하는 폴리펩타이드 또는 상기 C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체, 예를 들어 서열 번호 2, 3 또는 4를 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 상기 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하기 위한 용도 및 수단에 대한 설명서를 추가로 포함한다.

본 발명을 수행하기 위한 방식

본 발명은 단지 예로서 설명되었으며, 본 발명의 범위 및 사상 내에 머무르면서 수정이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다.

실시예

실시예 1: C1orf54 발현 작제물

(1) 발현 작제물의 설계

재조합 발현을 위한 인간 및 마우스 C1orf54 작제물은 공공 영역에서 이용 가능한 정보에 기초하여 설계되었다(Zerbino et al. (2018) Nucleic Acids Research, 46(D1):D754-D761; The UniProt Consortium (2017), Nucleic Acids Research, 45(D1):D158-D169).

추정상 N 말단 신호 펩타이드(잔기 M1 내지 G16)가 생략된, 전장 성숙 마우스 C1orf54 잔기 Q17 내지 M148(UniProt ID Q8R2K8)은 TEV 절단 부위(작제물 1, 작제물 정보를 위해 표 1 참조)를 함유하는 N 말단 MRGSHHHHHHENLYFQSG 태그(서열 번호 34)에, 또는 N 말단 MG와 C 말단 GSSGLNDIFEAQKIEWHEHHHHHH 태그(서열 번호 35)(작제물 2) 사이에 융합되었다.

추정상 N 말단 신호 펩타이드(잔기 M1 내지 G16)가 생략된, 전장 성숙 인간 C1orf54 잔기 Q17 내지 M131(UniProt ID Q8WWF1)(서열 번호 2)은 TEV 절단 부위(작제물 3)를 함유하는 N 말단 MRGSHHHHHHENLYFQSG 태그(서열 번호 34)에, 또는 N 말단 MG와 C 말단 GSSGLNDIFEAQKIEWHEHHHHHH 태그(서열 번호 35)(작제물 6) 사이에, 또는 오직 N 말단 MS 펩타이드에 융합되었다.

작제물 4 및 5의 설계를 위해, 인간 C1orf54는 다른 종으로부터의 상동성 서열과 정렬되었다(도 1). 서열은 2015년 8월 18일에 각각 www.uniprot.org(The UniProt Consortium (2017), Nucleic Acids Research, 45(D1):D158-D169) 또는 www.ensembl.org(Zerbino et al. (2018) Nucleic Acids Research, 46(D1):D754-D761)로부터 검색되고, MUSCLE 알고리즘(Edgar (2004) Nucleic Acids Research, 32(5):1792-1797)을 이용하여 Jalview(Waterhouse et al. (2009) Bioinformatics, 25(9):1189-1191)에서 정렬되었다. 작제물 4는 고도로 보존되고 음으로 하전된 N 말단 영역이 결여된 잔기 D67 내지 M131(서열 번호 4)을 포함하는 반면, 작제물 5는 C 말단 소수성 영역이 결여된 잔기 Q17 내지 P116(서열 번호 3)을 포함한다. 작제물 4 및 5는 둘 다 TEV 절단 부위를 함유하는 N 말단 MRGSHHHHHHENLYFQSG 태그(서열 번호 34)에 융합되었다.

(2) 작제물의 클로닝

마우스 C1Orf54의 DNA 서열은 이. 콜라이에서의 발현을 위한 최적화를 포함하여 GeneArt(ThermoFisher)로부터 구입되었다. MRGS-His6-TEV-G-mC1Orf54(aa17-148)(작제물 1)의 생성을 위해, 인서트는 GeneArt 작제물로부터의 PCR에 의해 증폭되어 정방향 프라이머 5’-GAAGGAGATATACATATGCGTGGTAGCCATCATCATCATCACCATGAAAATCTGTATTTTCAGAGCGGCCAAGAATATGATCACGAAGAAC-3’(서열 번호 36) 및 역방향 프라이머 5’- GTGGTGGTGGTGCTCGAGTGCGGCCGCTTATCACATAAAATGAA CACCACCTTGC-3’(서열 번호 37)를 사용하여 N 말단에서 MRGS-His6-TEV-G를 부가하였다.

PCR 산물은 NdeI/NotI에 의해 소화되고, 동일한 제한 효소로 처리된 pET26b(+) 발현 벡터로 결찰되었다. 작제물 2 MG-mC1Orf54(aa17-148)에 대해 인서트는 정방향 프라이머: 5’-GTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGGGTCAAGAATATGATCACGAA-3’(서열 번호 38) 및 역방향 프라이머: 5’-GGCTTCGAAGATGTCGTTCAGGCCAGAGGATCCCATAAAATGAACACCACC-3’(서열 번호 39)를 사용하여 동일한 주형으로부터의 PCR에 의해 증폭되었다.

DNA 단편은 In-Fusion 기술을 통해 GSS-Avi-His6을 이미 함유하는 pET26b(+) 골격으로 클로닝되었다(그리고 적절한 제한 효소 NdeI/BamHI로 처리되었다).

인간 C1Orf54의 경우에, 성숙 부분의 DNA 서열은 5’ 말단 및 2 중단 코돈에서의 NdeI 제한 부위 및 3’ 말단에서 NotI 제한 부위를 포함하는 GeneArt에서의 작제물 6 (MG-hsC1Orf (aa17-131)-GSS-Avi-His6)의 유전자 합성 구입 전에 인하우스 알고리즘을 이용하여 이. 콜라이에서 발현에 최적화되었다. DNA 단편은 NdeI/NotI 처리된 pET26b(+) 발현 벡터에 대한 후속하는 결찰을 위해 Nde/NotI에 의해 소화되었다. 작제물 3 내지 5 및 7은 표 2에 기재된 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 이전의 작제물 6으로부터 증폭되었다. 4개의 인서트는 모두 NdeI/NotI로 소화되고, 작제물 #6의 생성을 위해 사용된 동일한 골격에 클로닝되었다.

각각의 경우에 결찰 산물은 수용성 DH5α 이. 콜라이 세포로 형질주입되었다. Lb/카나마이신 플레이트에서 성장한 여러 콜로니가 선택되고, 플라스미드 DNA 제조가 수행되었다. 양성 콜리니는 서열에 의해 이후 확인되었다.

(3) 작제물의 발현

발현 플라스미드는 에스체리치아 콜라이 균주 BL21-Gold(DE3)(Agilent)로 형질전환되었다. 모든 작제물에 대해, 1 리터의 Terrific Broth 배지를 밤샘 예비배양으로 접종하였다. DASGIP 생물반응기 시스템(Eppendorf)에서 발효를 수행하였다. 배양물을 pH 7.01의 촉발점에 도달할 때까지 37℃에서 성장시켰다. 이때에, 발현은 1 mM IPTG의 첨가에 의해 유도되었다. 작제물 1, 2, 4 및 7에서 배양은 37℃에서 5시간 동안 지속되었다. 작제물 3, 5 및 6에서 온도는 20℃로 낮아지고, 배양은 14시간 동안 지속되었다. 배양 단계의 종료 시, 배양물을 원심분리에 의해 수확하였다. 세포 펠릿을 -20℃에서 저장하고, 추가의 하류 공정을 위해 정제로 전달하였다.

(4) 재조합 단백질의 단리

에스체리치아 콜라이에서의 작제물 1, 2, 3, 4, 6 및 7의 재조합 발현은 봉입체를 형성시킨다. 이들 작제물 중 어느 하나를 함유하는 이. 콜라이 세포를 1 g의 습식 세포 펠릿에 대해 10 ml 완충액을 사용하여 0.1 M Tris/HCl, 0.1 M NaCl, 1 mM EDTA, 3 mM L-메티오닌, pH 7.0에 현탁시키고, 100 mL당 1 cOmplete™ 프로테아제 억제제 칵테일 정제(Roche)로 보충하였다. 0.1 mg/mL의 계란 난백 라이소자임을 첨가하고, 현탁액을 4℃에서 부드럽게 교반하였다. 30분 후, 10 mM MgCl₂ 및 10 U/mL Benzonase®(Merck)를 첨가하고, 현탁액을 4℃에서 추가 30분 동안 교반하였다. 세포를 APV 2000 실험실 균질화기(SPX Flow)를 사용하여 고압(800 bar 및 주위 온도에서의 2회 계대배양)에 의해 용해시켰다. 60 mM EDTA, 1.5 M NaCl, 5%(v/v) Triton X-100, pH 7.0의 부피의 ½를 용해물에 첨가하고, 4℃에서 60분 동안 부드럽게 교반하였다. 봉입체를 10,000x g 및 4℃에서 30분 동안 원심분리에 의해 침강시켰다. 펠릿을 4℃에서 1 부피의 50 mM Tris/HCl, 20 mM EDTA, 0.6 M NaCl, 3 mM L-메티오닌, pH 7.0으로 1회 및 1 부피의 50 mM Tris/HCl, 0.3 M NaCl, pH 7.0으로 3회 세척하고, 각각의 세척 단계 후 10,000x g 및 4℃에서 30분 동안 원심분리하였다. 봉입체 펠릿을 추가의 가공 전에 -20℃에서 저장하였다. 정제를 위해, 1 g의 IB를 20 mL의 6 M GdmCl, 10 mM Tris, 100 mM 일염기성 인산염에 가용화시키고, 주위 온도에서 밤새 NaOH로 pH 8.0(완충액 A1)로 5 mM DTT로 조정하였다. 생성된 변성된 단백질 용액을 주위 온도에서 10,000x g 이상에서 30분 동안 원심분리에 의해 청징시키고, 이후 무균 여과시켰다. 용액을 7℃에서 5 mM DTT를 포함하는 완충액 A1로 평형화된 5 mL의 HisTrap excel™ IMAC 칼럼(GE Healthcare)에 로딩하였다. 칼럼을 100 ml의 10 mM Tris/HCl, 30% 이소프로판올, pH 8.0, 이어서 100 mL의 완충액 A1로 세척하였다. 결합된 단백질을 6 M GdmCl, 10 mM Tris, 100 mM 일염기성 인산염으로 용출시키고, 단일 단계에서 HCl로 pH 4.5(완충액 A2)로 조정하였다. 1.8 mL의 분획을 수집하고, SDS-PAGE에 의해 분석하였다. 관심 단백질을 함유하는 분획을 혼주하였다. 변성된 단백질의 재폴딩을 위해, 풀을 이후 2 M L-Arg-HCl과 1:1 비로 혼합하고, 5 mM DTT로 보충하고, 1 mM DTT를 함유하는 PBS, pH 7.3에 대해 밤새 투석하였다. 투석된 샘플을 PEG 35,000을 사용하여 원하는 농도로 농축시키고(Brooks et al. (1962) Trans, 2(4):216-264), 무균 여과시켰다. C 말단 태그를 함유하는 작제물 2 및 6을 겔 여과에 의해 또는 직접적으로 변성 IMAC 후, 하기 효소로 절제된 작제물에 대해 기재된 바대로 RP-HPLC에 의해 연마하였다.

작제물 5는 이 작제물을 함유하는 이 콜라이 세포의 세포기질에서 가용성 발현되고, 50　mM 일염기성 인산염, 500　mM NaCl, 20　mM 이미다졸에 현탁되고, NaOH로 pH　8(완충액 A2)로 조정되고, 1 g의 습식 세포 펠릿에 대해 10　mL의 완충액을 사용하여 50　mL당 1 cOmplete™ 프로테아제 억제제 칵테일 정제(Roche), 30　U/mL Benzonase®(Merck) 및 10　mM MgCl₂가 보충되었다. 세포를 APV 2000 실험실 균질화기(SPX Flow)를 사용하여 고압(800　bar 및 주위 온도에서의 2회 계대배양)에 의해 용해시켰다. 용해물을 10,000x　g 및 4℃에서 30분 동안 원심분리하였다. 상청액을 여과(0.22 ㎛)시키고, 완충액 A2와 평형화된 5　mL의 HisTrap excel™ IMAC 칼럼(GE Healthcare)에 밤새 로딩하였다. A280 기준선 신호로 세척한 후, 단백질을 10 칼럼 부피에 걸쳐 완충액 A2 중에 20 내지 500　mM 이미다졸의 선형 구배에 의해 용출시켰다. 1.8　mL의 분획을 수집하고, SDS-PAGE에 의해 분석하였다. 관심 단백질을 함유하는 분획을 혼주하고, 태그의 효소 절단을 위해 PBS, pH　7.3, 1　mM DTT에 대해 밤새 투석하였다.

작제물 1, 3, 4 및 5에 대해, N 말단 태그를 각각의 샘플(200　U/mg)에 AcTEV™ 프로테아제(Thermo Fisher Scientific)를 첨가하여 효소 절단한 후 30℃에서 3시간 동안 항온처리하였다. 효소 절단은 MS에 의해 확인되었다. 남은 비절단된 단백질 및 프로테아제로부터 절단물의 분리를 촉진하기 위해, 샘플을 5　mM DTT로 완충액 A1에 대해 투석하였다. 투석된 단백질을 여과시키고, 5　mM DTT를 포함하는 완충액 A1로 평형화된 5　mL의 HisTrap excel™ IMAC 칼럼(GE Healthcare)에 로딩하고, 통과물을 수집하였다. 절단된 단백질을 함유하는 분획을 혼주하고, PBS, pH　7.3, 1　mM DTT에 대해 밤새 투석한 후, PEG　35,000을 사용하여 농축시키거나, 8　mL/분 및 50℃에서 POROS™　20　R1(Thermo Fisher Scientific), 95x15　mm(17 mL) 또는 250x20　mm(78 mL), 25　mM 중탄산암모늄으로 평형화된 RP-HPLC 칼럼에 로딩하고, 평형 완충액으로 A280 기준선 신호로 세척한 후, 20 칼럼 부피 중의 0 내지 75% 에탄올의 선형 구배로 또는 75% 에탄올로의 단계 구배로 8　mL/분 및 50℃에서 용출시켰다. 관심 단백질을 함유하는 분획을 혼주하고, 4℃에서 PBS, pH 7.3에 대해 24시간 이상 동안 투석하고, 마지막으로 무균 여과시켰다.

작제물 7의 봉합체를 0.2　M 아황산나트륨을 함유하는 6　M 우레아, 20　mM Tris/HCl, 5　mM EDTA, pH　8(완충액 A3)에 가용화시켰다. 용액을 10,000x　g에서 30분 동안 원심분리하고, 무균 여과시키고, 상기 기재된 바대로 RP-HPLC에 의해 정제하고, PBS에 대해 투석하고, 무균 여과시켰다.

실시예 2: 근육 C1orf54 mRNA는 설치류에서 운동에 의해 증가된다

방법: 7주령 내지 12주령의 수컷 C57BL/6 마우스를 Charles River Laboratories로부터 구입하였다. 마우스를 7일 동안 조사 시설에 적응시켰다. 이들을 12:12시간 광-암 주기로 25℃에서 수용하고, 15.8 MJ/kg의 에너지 함량으로 18.2% 단백질 및 3.0% 지방을 함유하는 표준 실험실 식이를 공급하였다(Nafag, 제품 # 3890, Kliba, 스위스 바젤). 음식 및 물은 자유식으로 제공되었다.

정주형 대조군 동물을 2의 그룹에 수용하였다. 운동시킨 동물을 단독으로 수용하고, 7일 동안 러닝 휠(running wheel)( Low-Profile Wireless Running Wheel for Mouse, Med Associates Inc, 제품 #: ENV-047)에 연속적으로 접근하게 했다. 8일째에, 러닝 휠에 접근할 수 있는 그룹으로부터의 마우스를 25분 동안 트레드밀(Panlab, Harvard Apparatus)에서 단일 회의 운동을 추가하고, 이후 특정 시점, 즉 트레드밀 운동 직후, 30분, 60분 또는 180분 후에 CO₂로 안락사시켰다. 정주형 대조군 그룹으로부터의 동물을 같은 날에 안락사시켰다. 사두근을 신속히 절개하고, 액체 질소에서 급속 냉동시켰다. 총 RNA를 표준 절차(TRIzol 시약(Invitrogen) 및 QIAcube 기술(Qiagen))를 이용하여 사두근으로부터 추출하였다. 모든 샘플을 Dnase로 처리하고, RNA 품질 및 양을 Bioanalyzer(Bioanalyzer 2100 Agilent)로 측정하였다. 라이브러리는 리보솜 RNA 결핍 프로토콜을 이용하여 생성되었다. 시퀀싱은 Illumina HiSeq2500 가닥 페어링된 말단 시퀀싱을 이용하여 수행되었다. 판독은 마우스 기준 게놈 버전 mm10으로 star를 사용하여 맵핑되고, 계수치는 유전자 수준 매개변수를 사용하여 특징 계수치를 사용하여 생성되었다. 보고된 계수치는 FPKM(백만개당 Kb당 단편)이다.

결과: 본 발명자들은 지금까지 비규명된 인자로서 분비되고 확인된 C1orf54인 것으로 예측된 신규의 운동-유도된 인자를 개발하도록 자발적 바퀴 러닝 및 강제된 트레드밀 러닝으로 이루어진 공존 운동 패러다임을 적용하였다: C1orf54 mRNA 수준은 정주형 마우스와 비교하여 운동된 사두근에서 증가하였다. 실제로, C1orf54 mRNA의 상승된 수준은 운동 직후 사두근에서 검출되고, 적어도 3시간 동안 지속되어서(도 2), 운동이 근육에서의 C1orf54 mRNA의 생성을 자극한다는 것을 나타낸다.

실시예 3: 근육 C1ORF54 mRNA는 운동 후 인간에서 증가된다

방법: 다양한 유형의 운동을 겪은 인간으로부터의 바스투스 라테랄리스(vastus lateralis) 생검으로부터의 전사체학 데이터를 갖는 공개적으로 이용 가능한 데이터세트(GSE97084)(Robinson et al. (2017) Cell Metab 25, 581-592)는 C1ORF54의 발현 수준에 대해 재분석되었다. 보고된 계수치는 FPKM(백만개당 Kb당 단편)이다.

결과: 마우스에서의 C1orf54 mRNA 발현에서의 운동의 효과를 고려하여, 공개적으로 이용 가능한 데이터세트는 운동이 인간에서 유사한 방식으로 C1ORF54를 조절하는지를 평가하기 위해 분석되었다. 참여자가 상이한 운동 패러다임을 겪은 인간 운동 연구(Robinson et al. (2017) Cell Metab 25, 581-592)에서 바스투스 라테랄리스에서의 C1ORF54 mRNA 수준은 각각의 연구의 어린 참여자에 대해 운동 전 및 후 분석되었다. 데이터는 운동이 인간 골격근에서 C1ORF54의 수준을 증가시킨다는 것을 보여준다(도 3). C1ORF54 mRNA의 증가는 문헌(Robinson et al. (2017) Cell Metab 25, 581-592)에 기재된 바대로 운동 요법의 유형(고강도 호기성 간격 훈련(HIIT), 저항 훈련(RT) 및 조합된(CT) 운동 훈련)과 상관없고, 따라서 운동에 대한 보편적인 반응을 반영한다.

실시예 4: C1orf54는 생체내 Myod1의 전사를 조절한다

마우스는 비히클(PBS) 또는 비히클 중에 제제화된 서열 번호 25의 아미노산 서열을 갖는 단리된 폴리펩타이드의 단일 복강내 주사를 받았다. 주사 후 60분에, 마우스를 CO₂로 안락사시키고, 비복근을 절개하고, 액체 질소 중에 급속 냉동시켰다. 총 RNA를 제조사의 지시에 따라 TRIzol 시약(Invitrogen)을 사용하여 비복근으로부터 추출하였다. 역방향 전사는 고역량 역방향 전사 키트(Applied Biosystems)를 사용하여 1 ㎍의 총 RNA에서 랜덤 육합체로 수행되었다. 실시간 PCR은 근원성 분화 1(Myod1, Mm00440387_m1, Applied Biosystems) 및 2개의 하우스키핑 유전자(Tbp, Mm00446971_m1, Applied Biosystems 및 Hprt, Mm03024075_m2, Applied Biosystems)에 대한 특정 TaqMan 프로브를 사용하여 C1000 운도순환기(CFX384 Real-Time system, Bio-Rad)에서 384웰 플레이트에서 이중 수행되었다. 자동 설정은 CT를 결정하도록 적용되었다. 2^-ΔΔCT를 사용한 비교 방법은 상대 발현을 결정하도록 사용되었다. 2개의 하우스키핑 유전자는 정규화(Tbp, Mm00446971_m1, Applied Biosystems 및 Hprt, Mm03024075_m2, Applied Biosystems)에 사용되었다. 모든 결과는 비히클에 대한 배수 변화로 표현된다.

통계 분석은 1방향 ANOVA, 이어서 Fisher 최소 유의차(LSD)를 사용하여 수행되었다. 확률 값이 0.05 미만일 때 차이는 유의미한 것으로 여겨졌다. 통계 분석은 GraphPad Prism 버전 7.03(GraphPad Software, Inc., 캘리포니아주 라 졸라)에 의해 수행되었다.

결과: C1orf54는 비히클과 비교하여 0.5 또는 1 mg/kg의 서열 번호 25의 아미노산 서열을 갖는 단리된 폴리펩타이드의 단일 복강내 주사 후 60분에 비복근에서 Myod1의 mRNA 수준을 감소시킨다(도 4). MyoD1은 주로 위성 세포를 분화로 유도시켜 위성 세포의 운명을 결정하는 중요한 전사 인자이다. 위성 세포는 근육 성장, 유지, 보수 및 재생에 관여된다(Wang and Rudnicki (2011) Nat Rev Mol Cell Biol 13, 127-133). MyoD1이 결여된 근육 전구 세포는 줄기-세포와 더 유사한 표현형을 재개하고, 손상된 근육으로의 주사 후, 야생형 세포와 비교하여 상당히 더 높은 효율로 생착하고 생존이 증가한다. 부가적으로, MyoD1 음성 근아세포-유래 위성 세포는 생착 후 근섬유의 기저판 밑에서 검출될 수 있어서, MyoD1 음성 근아세포의 자가 재생 특성을 나타낸다(Asakura et al. (2007) Proc Natl Acad Sci USA 104, 16552-16557). 따라서, C1orf54의 활성은 MyoD1을 하향조절하여 근원성 분화에 영향을 미치고, 그로 인해 줄기-세포 유사 표현형을 촉진한다. C1orf54는 따라서 근육 기능 개선 활성을 포함한다.

실시예 5: C1orf54는 시험관내 인간 근육 세포에서 MYOD1의 전사를 억제한다

방법: 1차 인간 근육 세포(hSkMDC, 로트 P401061-51M, Cook MyoSite, 미국 펜실베이니아주 피츠버그)를 해동하고, MyoTonic 혈청-비함유 성장 배지(COOK MK-2222), 성장 보충제(COOK MK-2288), 20% 소 태아 혈청(Gibco, 16000-044, 로트 1233705), 50 ㎍/mL의 겐타마이신(Gibco, 15710-049) 및 10 ㎍/mL의 인슐린(Amimed, 5-79F00-G, 로트 K11988P)을 함유하는 성장 배지(GM)에서 2개의 T175 조직 배양 플라스크에서 시딩하였다. 37℃/5% CO₂에서의 5일간의 성장 후, 세포를 DPBS(Gibco 14190-144)로 헹구고, Accutase(Gibco A11105-01)로 탈착시키고, 뉴클레오카운터(chemometec)를 사용하여 계수하였다. 0.2 mL의 GM 중의 40,000개의 세포를 실온(RT)에서 30분 동안 웰마다 0.5 mL의 젤라틴(EmbryoMax 0.1% 젤라틴 용액, Millipore ES-006-B)으로 코팅된 24웰 플레이트로 웰마다 시딩하였다. 다음날, 세포를 125, 250, 500, 1000 ng/mL의 재조합 태그-비함유 인간 C1orf54 단백질 aa 17-131(서열 번호 2; Mybiosource, MBS 1284901 로트 03095), 용매 대조군(33 μM Tris-HCl, 3.3 μM EDTA 및 0.07% 글리세롤)으로 처리하거나, 37℃에서 6시간 동안 처리하지 않았다. 후속하여, 세포를 용해시키고, 총 RNA를 제조사의 지시(Zymo research)에 따라 Direct-zol 키트를 사용하여 추출하였다. cDNA를 High-Capacity cDNA 아카이브 키트(Applied Biosystems 4368813)를 사용하여 합성하고, MYOD1 유전자 발현은 TaqMan 유전자 발현 마스터 믹스(Applied Biosystems #4369016), TaqMan 검정(Hs00159528_m1, Applied Biosystems) 및 ABI PRISM 7000 서열 검출 시스템(Applied Biosystems)을 사용하여 정량적 PCR에 의해 결정되었다. 2^-ΔΔCT를 사용한 비교 방법은 상대 발현을 결정하도록 사용되었다. 유전자 발현은 3개의 하우스키핑 유전자 GAPDH(4310884E, Applied Biosystems), TBP(Hs00427620_m1, Applied Biosystems) 및 HPRT(Hs01003268_g1, Applied Biosystems)로 정규화되었다.

결과: 재조합 인간 C1orf54 단백질(aa17-131, 서열 번호 2)은 6시간 치료 후 용량 의존적 방식으로 1차 인간 근육 전구 세포에서 MYOD1 유전자 발현을 억제하였다(도 5). 사용된 최고 용량(1000 ng/mL)은 MYOD1 유전자 발현의 65.6% 감소를 생성시켰다(도 5). 후기 근원성 전사 인자인 미오게닌은 C1orf54 단백질에 의해 상당히 조절되지 않았다(데이터 비기재). MyoD1이 결여된 근육 세포는 증가된 증식을 보여준다(Sabourin et al. (1999) J Cell Biol 144, 631-643). 이 데이터는 따라서 C1orf54가 근육 전구 세포의 증식을 촉진하면서 근원성 분화를 방지한다는 것을 나타낸다.

실시예 6: C1orf54는 생체내 근육 힘을 증가시킨다

방법: 12주령의 수컷 C57BL/6 마우스를 Charles River Laboratories로부터 구입하였다. 마우스를 7일 동안 조사 시설에 순응시키고, 12:12시간 광-암 주기로 25℃에서 수용하고, 15.8 MJ/kg의 에너지 함량으로 18.2% 단백질 및 3.0% 지방을 함유하는 표준 실험실 식이를 공급하였다(Nafag, 제품 # 3890, Kliba, 스위스 바젤). 음식 및 물은 자유식으로 제공되었다.

순응 후, 마우스를 체중별로 무작위화하고, 3일마다 비히클(PBS) 또는 비히클 중에 제제화된 1 mg/kg의 서열 번호 25의 아미노산 서열을 갖는 단리된 폴리펩타이드의 복강내 주사에 의해 치료하였다. 각각의 마우스는 총 3회 주사를 받았다(제1일, 제4일 및 제7일에, 여기서 제1일은 동물이 주사를 받는 첫 번째 날로 정의된다). 제9일에 생긴 근육 힘은 비침습적으로 평가되었다. 이를 위해, 동물을 안락사시키고, 다리를 면도하고, 경피성 전극을 통해 뒷다리에 전기 자극을 가하여 근육 수축을 유발하였다. 전극을 사두근 및 발에 고정하였다. 힘은 힘 유도장치(KD45.5N)에 연결되고 자극 시 발의 압력의 기록을 허용하는 홈메이드 페달에서 기록되었다. 10 내지 120 Hz의 범위의 주파수는 후속하여 자극장치(Stimulator ML180, ADInstruments)를 통해 인가되고, 테타니 힘(tetanic force)은 각각의 주파수에서 기록되었다(PowerLab, ADInstruments).

통계 분석은 다중 비쌍별 t-시험 비교를 이용하여 수행되었다. 확률 값이 0.05 미만일 때 차이는 유의미한 것으로 여겨진다. 모든 통계 분석은 GraphPad Prism 버전 7.03(GraphPad Software, Inc., 캘리포니아주 라 졸라)에 의해 수행되었다.

결과:

10 내지 70 Hz(준최대 힘 생성)의 범위의 낮은 자극 주파수에서, 뒷다리의 유발된 힘은 비히클 및 1 mg/kg의 C1orf54(서열 번호 25의 아미노산 서열을 갖는 단리된 폴리펩타이드)로 치료된 동물 사이에 유사하다(도 6의 A). 이와 반대로, 80 내지 120 Hz의 범위이고 최대 힘 생성을 반영하는 더 높은 자극 주파수에서, C1orf54로 치료된 마우스는 비히클 처리된 동물과 비교하여 대략 15% 더 높은 절대 근육 힘을 나타낸다.

특정 힘은 주로 모니터링되는 수축에 기여하는 비복근의 중량에 대해 절대 근육 힘을 정규화하여 평가된다. 더 높은 자극 주파수에서의 특정한 유발된 힘은 비히클 처리된 동물과 비교하여 C1orf54에서 대략 13% 더 높다(도 6의 B). 이는 C1orf54 폴리펩타이드의 간헐적 투여가 근육 강도를 증가시킨다는 것을 나타낸다.

실시예 7: C1orf54는 생체내 Pax7 양성 위성 세포의 수를 증가시킨다

순응 후, 마우스를 체중별로 무작위화하고, 3일마다 비히클(PBS) 또는 비히클 중에 제제화된 1 mg/kg의 서열 번호 25의 아미노산 서열을 갖는 단리된 폴리펩타이드의 복강내 주사로 치료하였다. 각각의 마우스는 총 4회 주사를 받았다(제1일, 제4일, 제7일 및 제10일에, 여기서 제1일은 동물이 주사를 받는 첫 번째 날로 정의된다). 제11일에, 동물을 CO₂로 안락사시키고, 비복근을 신속히 절개하고, OCT(Tissue-Tek)에 포매하고, 액체 질소 냉각 이소펜탄에서 동결시켰다.

동결된 근육을 8 ㎛ 단면으로 절단하고, 이것을 약 2시간 동안 실온에서 건조시키고, 백에서 단단히 밀봉된 플라스틱 박스에 -20℃에서 저장하였다. 염색하는 날에, 슬라이드를 동결기로부터 꺼내고, 30분 동안 실온에서 건조시키고, 10분 동안 3% 파라포름알데하이드로 고정하였다. 이후, 절편을 30분 동안 PBTX(0.2% Triton X100을 함유하는 PBS) 중에 벡터 M.O.M 차단 시약(Vector Laboratories, 카탈로그 #MKB-2213, 1/100 희석됨) 및 10% 염소 혈청으로 차단하였다. 위성 세포를 검출하기 위해, 절편을 4℃에서 차단 완충액 중에 Pax7(Developmental Studies Hybridoma Bank(DSHB))에 대해 1차 항체와 밤새 항온처리하였다. Tokyo Institute of Technology에서 A. Kawakami에 의해 개발된 Pax7 하이브리도마는 DSHB로부터 얻어지고, NIH의 NICHD에 의해 생성되고, 아이오와 대학교(University of Iowa), 생물학부(아이오와주 52242 아이오와 시티)에서 유지되었다. 마우스 항체를 하이브리도마로부터 Novartis에서 정제하고, 닭 Pax7의 항원 아미노산 352-523을 검출한다. PBTX에 의한 몇번의 세척 후, 절편을 3시간 동안 PBTX에서 10% 염소 혈청에서 브리징 항체(래트 항-마우스 IgG, Serotec, 카탈로그 #MCA336, 1/500 희석됨)와 실온에서 항온처리하였다. 샘플을 후속하여 PBTX로 세척하고, 1시간 동안 실온에서 형광 표지된 2차 항체(Alexa 594 염소 항-래트, Invitrogen, 카탈로그 #A11007, 1/200 희석됨)로 염색하였다. PBTX로 세척한 후, 샘플을 DAPI(Invitrogen)와 ProLong Gold 안티페이드 시약으로 탑재하였다. Pax7 및 DAPI 둘 다에 양성인 세포를 계수하였다. 통계 분석은 비쌍별 t-시험을 이용하여 수행되었다. 확률 값이 0.05 미만일 때 차이는 유의미한 것으로 여겨진다. 통계 분석은 GraphPad Prism 버전 7.03(GraphPad Software, Inc., 캘리포니아주 라 졸라)에 의해 수행되었다.

결과: 위성 세포의 수를 결정하기 위해, 근육 절편은 Pax7에 대해 염색되고, 이것은 위성 세포에 대해 잘 확립된 마커를 나타낸다(Kuang and Rudnicki (2008) Trends Mol Med 14, 82-91). 위성 세포는 근육 성장, 유지, 보수 및 재생에 관여된다(Wang and Rudnicki (2011) Nat Rev Mol Cell Biol 13, 127-133). 제1일, 제4일, 제7일 및 제10일에 1 mg/kg의 C1orf54에 의한 간헐적 치료는 비히클 처리와 비교하여 대략 66%로 비복근에서 Pax7 양성 위성 세포의 수를 상당히 증가시켰다(도 7). C1orf54에 의한 치료 후에 증가된 수의 위성 세포는 C1orf54가 골격근의 근육 성장 및 재생 능력을 촉진한다는 것을 입증한다.

실시예 8: C1orf54는 시험관내 인간 근아세포의 증식을 촉진한다

방법: Cook MyoSite(미국 펜실베니아주 피츠버그)로부터의 1차 인간 근육 세포(hSkMDC, 로트 P201076-19M)를 해동하고, MyoTonic 혈청-비함유 성장 배지(COOK MK-2222), 성장 보충제(COOK MK-8888), 10% 소 태아 혈청 슈피어리어(Millipore, S0613, 로트 15H095) 및 50 ㎍/mL의 겐타마이신(Gibco, 15710-049)을 함유하는 성장 배지(GM)에서 3개의 T175 조직 배양 플라스크에 시딩하였다. 37℃/5% CO₂에서의 2일간의 성장 후, 세포를 DPBS(Gibco 14190-144)로 헹구고, Accutase(A11105-01)로 탈착시키고, 뉴클레오카운터(ChemoMetec)를 사용하여 계수하였다. 0.1 mL의 GM 중의 1,000개의 세포를 실온에서 30분 동안 웰마다 0.1 mL의 젤라틴(EmbryoMax 0.1% 젤라틴 용액, Millipore ES-006-B)으로 코팅된 96웰 플레이트로 웰마다 시딩하였다. 밤샘 항온처리 후, 세포를 2.5시간 동안 FBS가 없는 GM과 항온처리한 후, 2.5시간 동안 1% FBS를 함유하는 GM으로 배지 교환하였다. 후속하여, 세포를 1000 ng/mL의 재조합 태그-비함유 인간 C1orf54 단백질 aa 17-131(서열 번호 2; Mybiosource, MBS 1284901 로트 03095), C1orf54 MBS 용매 대조군(53 μM Tris-HCl, 5.3 μM EDTA 및 0.26% 글리세롤) 또는 1% PBS 대조군으로 처리하였다. 퍼센트(%) 포화상태로서의 세포 성장은 IncuCyte FL Live-Cell 분석 시스템(Essen BioScience, Ltd.)을 사용하여 life cell imaging(4시간마다 웰당 2개의 영상)에 의해 측정되었다.

통계 분석은 다중 비쌍별 t-시험 비교를 이용하여 수행되었다. 모든 통계 분석은 GraphPad Prism 버전 7.03(GraphPad Software, Inc., 캘리포니아주 라 졸라)에 의해 수행되었다.

결과: 재조합 인간 C1orf54 단백질(서열 번호 2; aa17-131)은 C1orf54 단백질 용매로 처리된 대조군 세포와 비교하여 제6일에 실험이 종료될 때까지 치료 후 2일에 시작하여 명확하고 지속적으로 인간 근아세포의 성장을 향상시켰다(도 8). 세포는 속도가 다르지만 모든 조건 하에 계속해서 성장하였다. 이 데이터는 C1orf54가 근육 전구 세포의 성장을 자극한다는 것을 나타낸다.

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Ile Ser Tyr Glu 65 70 75 80 Thr Asp Arg Ala Asp His Gln Lys Pro Val Thr Glu Lys Pro Val Thr 85 90 95 Met Glu Pro Gln Ser Pro Asp Leu Asn Asp Ala Val Ser Gly Leu Gln 100 105 110 Ser Pro Gly Pro Leu Leu Leu Ser Trp Ala Leu Val Gln Gly Met Met 115 120 125 Tyr Phe Leu 130 <210> 63 <211> 131 <212> PRT <213> Bos taurus <400> 63 Met Asp Val Leu Phe Val Ala Ile Leu Ala Val Pro Leu Ile Leu Gly 1 5 10 15 Gln Glu Tyr Glu Asp Gly Glu Glu Leu Glu Glu Asp Glu Tyr Tyr Gln 20 25 30 Val Ile Tyr Tyr Tyr Thr Ile Thr Pro Ser Tyr Asp Glu Phe Gly Val 35 40 45 Asn Phe Thr Val Asp Tyr Ser Met Phe Glu Ser Glu Asn Thr Val Asn 50 55 60 Arg Leu Asp Glu Lys Val Glu Ala Ser Glu Thr Thr Ile Ser Tyr Glu 65 70 75 80 Thr Asp Arg Ala Asp His Gln Lys Pro Val Ile Glu Lys Pro Val Thr 85 90 95 Met Glu Pro Gln Ser Pro Asp Leu Asn Asp Ala Val Ser Gly Leu Gln 100 105 110 Ser Pro Gly Pro Leu Leu Leu Ser Trp Ala Leu Ile Gln Gly Val Met 115 120 125 Tyr Phe Leu 130 <210> 64 <211> 127 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 64 Ala Ile Leu Ala Val Pro Leu Ile Leu Gly Gln Glu Tyr Glu Asp Glu 1 5 10 15 Glu Gly Leu Glu Glu Glu Asp Tyr Tyr Gln Val Ala Tyr Tyr Tyr Thr 20 25 30 Ile Thr Pro Asn Tyr Asp Asp Phe Gly Val Asn Phe Thr Ile Asp Tyr 35 40 45 Ser Thr Phe Glu Leu Glu Asp Arg Leu Gly Thr Leu Asp Lys Glu Val 50 55 60 Thr Thr Glu Ala Val Glu Thr Thr Ile Ser Leu Gly Thr Glu Gly Ala 65 70 75 80 Asp His Thr Lys Pro Val Thr Val Lys Pro Thr Thr Met Asp Thr Gln 85 90 95 Ser Pro Val Leu Asp Gly Ala Val Ser Gly Leu Arg Asn Pro Val Ser 100 105 110 Leu Leu Leu Pro Cys Ile Leu Val Gln Gly Gly Met Tyr Phe Met 115 120 125 <210> 65 <211> 144 <212> PRT <213> Myotis lucifugus <400> 65 Met Asp Val Leu Leu Ala Ala Ile Leu Ala Val Pro Leu Val Leu Gly 1 5 10 15 Gln Ile Tyr Glu Asp Glu Glu Gly Leu Glu Glu Asp Tyr Tyr Tyr Gln 20 25 30 Met Met Tyr Asn Tyr Thr Val Thr Pro Thr Tyr Asp Pro Asp Tyr Phe 35 40 45 Gly Ala Asn Phe Thr Val Asp Tyr Ser Ile Phe Glu Leu Glu Asp Arg 50 55 60 Leu Asn Arg Leu Asp Lys Glu Val Thr Glu Ala Glu Glu Thr Thr Ile 65 70 75 80 Ile His Glu Thr Glu Arg Val Asp His Gln Arg Pro Val Thr Val Lys 85 90 95 Ser Val Thr Val Glu Pro Val Thr Met Glu Pro Val Thr Met Glu Pro 100 105 110 Gln Ser Pro Asp Met Asn His Ala Val Ser Ser Leu Gln Ser Pro Val 115 120 125 Ser Leu Leu Leu Ser Trp Thr Leu Leu Gln Glu Trp Met Tyr Phe Met 130 135 140 <210> 66 <211> 131 <212> PRT <213> Cavia porcellus <400> 66 Met Asp Val Leu Phe Thr Ala Ile Leu Val Val Pro Leu Ile Leu Gly 1 5 10 15 Gln Glu Tyr Glu Asp Glu Glu Leu Val Gln Asp Asp Tyr Tyr Gln Val 20 25 30 Ile Tyr Tyr Tyr Thr Val Thr Pro Thr Tyr Asp Asp Phe Asn Val Asn 35 40 45 Phe Thr Ile Asp Tyr Ser Met Phe Glu Ser Glu Asp Lys Leu Asn Asn 50 55 60 Ser Phe Lys Glu Val Thr Thr Lys Ala Val Glu Thr Thr Ile Ser Leu 65 70 75 80 Gln Thr Gln Pro Glu Asp Asn Glu Asn Pro Val Thr Thr Lys Pro Met 85 90 95 Thr Met Ala Thr Gln Ser Pro Asp Leu Asn Ser Ala Thr Val Ser Asn 100 105 110 Leu Pro Ser Pro Val Pro Leu Leu Leu Leu Trp Ala Leu Val Gln Gly 115 120 125 Gly Met Phe 130 <210> 67 <211> 148 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 67 Met Asp Val Leu Phe Ile Ala Leu Leu Val Ala Pro Leu Ile Leu Gly 1 5 10 15 Gln Glu Tyr Asp His Glu Glu Gln Leu Glu Glu Gly Asp Tyr Tyr Gln 20 25 30 Val Ala Tyr Tyr Tyr Tyr Thr Val Thr Pro Asn Tyr Asp Asp Phe Ser 35 40 45 Val Asn Phe Thr Val Asp Tyr Ser Val Phe Glu Ser Glu Asp Arg Leu 50 55 60 Asn Arg Leu Asn Lys Glu Val Thr Thr Thr Glu Ala Val Glu Thr Thr 65 70 75 80 Ala Ser Ser Tyr Ser Leu His Thr Glu Leu Met Asp Pro Gln Asn Pro 85 90 95 Val Thr Thr Lys Pro Val Thr Thr Glu Pro Val Thr Thr Glu Pro Val 100 105 110 Thr Thr Glu Pro Gln Ser Pro Asn Gln Asn Asp Ala Met Ser Thr Leu 115 120 125 Gln Ser Pro Val Ser Cys Phe Leu Leu Trp Thr Leu Leu Gln Gly Gly 130 135 140 Val His Phe Met 145 <210> 68 <211> 152 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 68 Met Asp Val Leu Phe Ile Ala Leu Leu Val Ala Pro Leu Val Leu Gly 1 5 10 15 Gln Glu Tyr Glu Asp Glu Glu Gln Leu Glu Glu Val Asp Tyr Tyr Gln 20 25 30 Val Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Thr Val Thr Pro Asn Tyr Asp Asp Phe Asn 35 40 45 Val Asn Phe Thr Val Asp Tyr Ser Ala Phe Glu Ser Glu Asp Arg Leu 50 55 60 Asn Ser Leu Asn Glu Glu Val Thr Thr Thr Glu Ala Val Glu Thr Ser 65 70 75 80 Ala Ser Ser Tyr Ser Leu His Thr Glu Pro Val Asp His Gln Asn Pro 85 90 95 Val Thr Thr Lys Pro Val Thr Met Lys Pro Val Thr Thr Lys Pro Val 100 105 110 Thr Thr Lys Gln Val Thr Thr Lys Gln Val Thr Thr Glu Ser Val Ser 115 120 125 Gln Met Gly Ile Glu Glu Glu Gly Asn Met Ala Ser Leu Thr Gln Thr 130 135 140 Asp Pro Arg Thr Ser Asp Leu Gln 145 150

Claims

서열 번호 3 또는 서열 번호 4의 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 95%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 단리된 폴리펩타이드로서, 마이오카인 활성을 갖는, 단리된 폴리펩타이드.
제1항에 있어서, 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산이 서열 번호 3 또는 서열 번호 4 중 어느 하나의 서열 내에 변형, 결실, 부가 및/또는 치환된, 단리된 폴리펩타이드.
제1항에 있어서, 폴리펩타이드는 서열 번호 3 또는 서열 번호 4 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진, 단리된 폴리펩타이드.
치료에 사용하기 위한 단리된 C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체.
약제로서 사용하기 위한 단리된 C1orf54 폴리펩타이드 또는 이의 변이체.
약제로서 사용하기 위한
a. 서열 번호 2, 3 또는 4의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드;
b. 서열 번호 2, 3 또는 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드;
c. 서열 번호 2, 3 또는 4와 적어도 95%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드; 및
d. 서열 번호 2, 3 또는 4와 적어도 95%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드로부터 선택되는, 폴리펩타이드.
약제의 제조에 사용하기 위한
a. 서열 번호 2, 3 또는 4의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드;
b. 서열 번호 2, 3 또는 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드;
c. 서열 번호 2, 3 또는 4와 적어도 95%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드; 및
d. 서열 번호 2, 3 또는 4와 적어도 95%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드로부터 선택되는, 폴리펩타이드.
제4항 내지 제7항 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 마이오카인 활성을 갖는, 용도를 위한 폴리펩타이드.
제4항 내지 제6항 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에서 근육 관련 장애의 치료에 사용하기 위한, 폴리펩타이드.
대상체에서 근육 관련 장애의 치료에 사용하기 위한 폴리펩타이드로서, 치료는
a. 서열 번호 2, 3 또는 4의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드;
b. 서열 번호 2, 3 또는 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드;
c. 서열 번호 2, 3 또는 4와 적어도 95%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드;
d. 서열 번호 2, 3 또는 4와 적어도 95%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드로부터 선택된 폴리펩타이드의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하고,
상기 폴리펩타이드는 마이오카인 활성을 갖는, 폴리펩타이드.
a. 약제학적 유효량의 적어도 하나의 폴리펩타이드로서,
i) 서열 번호 2, 3 또는 4의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드;
ii) 서열 번호 2, 3 또는 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드;
iii) 서열 번호 2, 3 또는 4와 적어도 95%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드; 및
iv) 서열 번호 2, 3 또는 4와 적어도 95%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드로부터 선택되고;
마이오카인 활성을 갖는 폴리펩타이드;
b. 적어도 하나의 약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는, 약제학적 조성물.
제11항에 있어서, 근육 관련 장애의 치료에 사용하기 위한, 약제학적 조성물.
대상체에서 근육 관련 장애를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은
a. 서열 번호 2, 3 또는 4의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드;
b. 서열 번호 2, 3 또는 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드;
c. 서열 번호 2, 3 또는 4와 적어도 95%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드;
d. 서열 번호 2, 3 또는 4와 적어도 95%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드로부터 선택된 폴리펩타이드의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고,
상기 폴리펩타이드는 마이오카인 활성을 갖는, 방법.
제9항 또는 제10항에 따른 용도를 위한 폴리펩타이드 또는 제12항에 따른 약제학적 조성물 또는 제13항에 따른 방법으로서, 상기 근육 관련 장애는 근위축, 정형외과적 손상, 근육 손상, 근력 저하, 심부전, 화학요법, 후뇌졸중, 속발성 근손실, 근육감소증, 비만 또는 대사 증후군으로부터 선택되거나 이에 의해 야기된 장애인, 용도를 위한 폴리펩타이드 또는 약제학적 조성물 또는 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 단리된 폴리펩타이드 또는 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 용도를 위한 폴리펩타이드 또는 제11항 또는 제12항에 따른 약제학적 조성물 또는 제13항에 따른 방법으로서, 상기 마이오카인 활성은 근육 기능 증가 활성을 포함하는, 단리된 폴리펩타이드 또는 용도를 위한 폴리펩타이드 또는 약제학적 조성물 또는 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 단리된 폴리펩타이드 또는 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 용도를 위한 폴리펩타이드 또는 제11항 또는 제12항에 따른 약제학적 조성물 또는 제13항에 따른 방법으로서, 상기 마이오카인 활성은 근육 강도 증가 활성을 포함하는, 단리된 폴리펩타이드 또는 용도를 위한 폴리펩타이드 또는 약제학적 조성물 또는 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 단리된 폴리펩타이드 또는 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 용도를 위한 폴리펩타이드 또는 제11항 또는 제12항에 따른 약제학적 조성물 또는 제13항에 따른 방법으로서, 상기 마이오카인 활성은 근육 재생 개선 활성을 포함하는, 단리된 폴리펩타이드 또는 용도를 위한 폴리펩타이드 또는 약제학적 조성물 또는 방법.