JP2014043448A - アルブミン融合タンパク質 - Google Patents

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Abstract

【課題】不安定な蛋白質分子の貯蔵問題あって、最小限の貯蔵後操作しか必要としない単純な処方によって、安定化した、長期間持続するタンパク質治療分子の処方物を提供する。
【解決手段】アルブミン融合タンパク質を含む。アルブミン融合タンパク質をコードする核酸分子はまた、これらの核酸を含むベクター、これらの核酸ベクターで形質転換される宿主細胞、ならびにアルブミン融合タンパク質を生成し、そしてこれらの核酸、ベクター、および／または宿主細胞を使用する方法。アルブミン融合タンパク質を含む薬学的組成物、およびアルブミン融合タンパク質を使用して、疾患、障害または状態を処置し、予防し、または改善する方法。
【選択図】なし

Description

（発明の背景）
本発明は、一般に、アルブミンまたはアルブミンのフラグメントもしくは改変体に融合された治療用タンパク質（少なくとも１つのポリペプチド、抗体、ペプチド、またはそれらのフラグメントおよび改変体を含むが、これらに限定されない）に関する。本発明は、治療用アルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、治療用アルブミン融合タンパク質、組成物、薬学的組成物、処方物およびキットを包含する。治療用アルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで形質転換された宿主細胞もまた、本発明に含まれ、これらのポリヌクレオチド、および／または宿主細胞を使用して、本発明のアルブミン融合タンパク質を作製する方法も同様に、本発明に含まれる。
その成熟形態において５８５アミノ酸のタンパク質（図１（配列番号１０３８）において示されるように）であるヒト血清アルブミン（ＨＳＡ、またはＨＡ）は、血清の浸透圧の重要な部分を担い、内因性リガンドおよび外因性リガンドのキャリアとしても機能する。現在では、臨床的使用のためのＨＡは、ヒト血液からの抽出によって生成される。微生物における組換えＨＡ（ｒＨＡ）の生成は、ＥＰ３３０４５１およびＥＰ３６１９９１に開示されている。
それらのネイティブな状態または組換え生成される場合の治療用タンパク質（例えば、インターフェロンおよび成長ホルモン）は、代表的には、短い貯蔵寿命を示す不安定な分子であり、特に水溶液中に処方される場合には、短い貯蔵寿命を示す不安定な分子である。投与のために処方される場合のこれらの分子の不安定性は、貯蔵の間の全てのときに分子の多くが凍結乾燥または冷蔵されなければならず、それによって、この分子を輸送および／または貯蔵するのが困難になることを支配する。貯蔵の問題は、薬学的処方物が、病院の環境の外で貯蔵および分配されなければならないときに、特に深刻である。
不安定なタンパク質分子の貯蔵問題に対する実際的な解決手段は、ほとんど提唱されていない。従って、容易に分配され、好ましくは、最小限の貯蔵後操作しか必要としない単純な処方によって、安定化した、長期間持続するタンパク質治療分子の処方物が必要である。
本発明は、アルブミンまたはアルブミンのフラグメント（一部）もしくは改変体に融合された治療用タンパク質（例えば、ポリペプチド、抗体、ペプチド、またはそれらのフラグメントもしくは改変体）を含む、アルブミン融合タンパク質を包含する。本発明は、アルブミンまたはアルブミンのフラグメント（部分）もしくは改変体に融合された治療用タンパク質（例えば、ポリペプチド、抗体、ペプチド、またはそれらのフラグメントもしくは改変体）をコードする核酸分子を含むかあるいはこれらからなるポリヌクレオチドもまた含む。本発明は、治療用タンパク質の貯蔵寿命を長期化し、そして／あるいはインビトロもしくはインビボでの治療用タンパク質および／または溶液中（もしくは薬学的組成物中）のその活性を安定化するために十分な、アルブミンまたはアルブミンのフラグメント（部分）もしくは改変体に融合された治療用タンパク質（例えば、ポリペプチド、抗体、ペプチド、またはそれらのフラグメントもしくは改変体）をコードする核酸分子を含むかあるいはこれらからなるポリヌクレオチドもまた含む。本発明のポリヌクレオチドによりコードされるアルブミン融合タンパク質もまた、本発明によって包含され、本発明のポリヌクレオチドで形質転換された宿主細胞、ならびにこれら本発明のポリヌクレオチドおよび／または宿主細胞を使用して、本発明のアルブミン融合タンパク質を作製する方法もまた本発明によって包含される。
本発明の好ましい局面において、アルブミン融合タンパク質は、表２に記載されるポリヌクレオチドによってコードされるものを含むが、これらに限定されない。
本発明はまた、本発明のアルブミン融合タンパク質および薬学的に受容可能な賦形剤もしくはキャリアを含む薬学的処方物を含む。このような処方物は、キットまたは容器中に存在し得る。このようなキットまたは容器は、治療用タンパク質の長期化した貯蔵寿命に関する説明書とともに包装され得る。このような処方物は、患者、好ましくは、哺乳動物、最も好ましくはヒトにおける疾患または疾患徴候を処置、予防、改善または診断する方法において使用され得、この方法は、この薬学的処方物を患者に投与する工程を包含する。
他の実施形態において、本発明は、疾患または傷害を予防、処置、または改善する方法を含む。好ましい実施形態において、本発明は、表１の「好ましい適応症Ｙ」列において列挙される疾患または障害を処置する方法を包含し、この方法は、このような処置、予防または改善が所望される患者に、この疾患または障害を処置、予防または改善するに有効な量において、表１の「治療用タンパク質Ｘ」列に（処置される疾患または障害が、表１の「好ましい適応症Ｙ」列において列挙されるのと同じ行に）開示される治療用タンパク質または治療用タンパク質に対応する部分（そのフラグメントもしくは改変体）を含む本発明のアルブミン融合タンパク質を投与する工程を包含する。
一実施形態において、表１または２に記載されるアルブミン融合タンパク質は、長期化した貯蔵寿命を有する。
第２の実施形態において、表１または２に記載されるアルブミン融合タンパク質は、表１に記載される、対応する非融合治療分子よりも安定である。
本発明はさらに、本発明の核酸分子（表１および２に記載されるポリヌクレオチドを含むが、これらに限定されない）を含むように改変された、好ましくは本発明のアルブミン融合タンパク質を発現するように改変されたトランスジェニック生物を包含する。
図１Ａは、ヒトアルブミンの成熟形態のアミノ酸配列（配列番号１０３８）およびこれをコードするポリヌクレオチド（配列番号１０３７）を示す。 図１Ｂは、ヒトアルブミンの成熟形態のアミノ酸配列（配列番号１０３８）およびこれをコードするポリヌクレオチド（配列番号１０３７）を示す。 図１Ｃは、ヒトアルブミンの成熟形態のアミノ酸配列（配列番号１０３８）およびこれをコードするポリヌクレオチド（配列番号１０３７）を示す。 図１Ｄは、ヒトアルブミンの成熟形態のアミノ酸配列（配列番号１０３８）およびこれをコードするポリヌクレオチド（配列番号１０３７）を示す。 図２は、ｐＰＰＣ０００５クローニングベクター（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３２７８）の制限マップを示す。 図３は、ｐＳＡＣ３５酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ発現ベクター（Ｓｌｅｅｐら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：４２（１９９０））の制限マップを示す。 図４は、ＴＦ−１細胞の増殖に対する、構築物ＩＤ番号（本明細書中以降、ＣＩＤ）１９６６および１９８１に含まれるＤＮＡによってコードされるＥＰＯアルブミン融合タンパク質、ならびに組換えヒトＥＰＯの種々の希釈物の効果を示す（実施例８および９を参照のこと）。細胞を３回洗浄して、ＧＭ−ＣＳＦを除去し、ＣＩＤ１９６６タンパク質またはＣＩＤ１９８１タンパク質の３倍希釈物の存在下で、７２時間にわたり、１０，０００細胞／ウェルにてプレートした。使用される濃度は、ＨＳＡ＋Ｅｐｏではなく、Ｅｐｏ単独の重量に基づいて計算した。組換えヒトＥｐｏ（ｒｈＥｐｏ）をポジティブコントロールとして使用し、１００ｎｇ／ｍｌ〜０．０１ｎｇ／ｍｌまで３倍連続希釈した。細胞を、さらに１８時間、０．５ｍＣｉ／ウェルの３Ｈ−チミジンに曝した。（白四角）ｒｈＥｐｏ；（逆向黒三角）ＨＳＡ−Ｅｐｏ１９８１；（黒丸）Ｅｐｏ−ＨＳＡ１９９６。 図５は、用量応答分析であり、０日目および７日目からのヘマトクリットの％変化に対する、組換えヒトＥＰＯならびにＣＩＤ１９６６およびＣＩＤ１９８１に含まれるＤＮＡによってコードされるＥＰＯアルブミン融合タンパク質の種々の用量の効果を示す（実施例８および９を参照のこと）。４８週齢のメスＤＢＡ／２ＮＨｓｄマウスを、各４匹の動物の１２群に分けた。組換えヒトＥＰＯ（ｒｈＥｐｏ）を、０．５、１．５、４．５および１２μｇ／ｋｇにて、０日目、２日目、４日目および６日目に、皮下注射した。構築物ＣＩＤ１９６６およびＣＩＤ１９８１から作製したＥｐｏアルブミン融合タンパク質を、２、６、１８および５４μｇ／ｋｇにて、０日目、２日目、４日目および６日目に、皮下注射した。より高用量のＥｐｏアルブミン融合タンパク質は、組換えヒトＥｐｏとのほぼ等モル比較を可能にする（融合物の重量は、非グリコシル化Ｅｐｏの重量の約４．３５倍であることに留意すること）。実験の０日目および７日目に、動物から尾静脈を介して採血し、ヘマトクリットを遠心分離により決定した。（黒四角）ｒｈＥｐｏ；（白丸）ＣＩＤ１９８１；（逆向黒三角）ＣＩＤ１９６６。 図６Ａは、０日目〜８日目までのヘマトクリットの％変化に対する、ＣＩＤ１９６６およびＣＩＤ１９９７それぞれに含まれるＤＮＡによってコードされるＥｐｏアルブミン融合タンパク質の種々の皮下投与の効果を示す（実施例８および１０を参照のこと）。＊、ｐ＜０．００５、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ非母数分析によって決定される場合、ｒｈＥｐｏと比較した（ｎ＝６）。 図６Ｂは、０日目〜１４日目までのヘマトクリットの％変化に対する、ＣＩＤ１９９７およびＣＩＤ１９６６に含まれるＤＮＡによってコードされるＥｐｏアルブミン融合タンパク質の皮下投与の効果を示す（実施例８および１０を参照のこと）。＊、ｐ＜０．００５、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ非パラメーター分析によって決定される場合、ｒｈＥｐｏと比較した（ｎ＝６）；＊＊、ｐ＜０．０５、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ非パラメーター分析によって決定される場合、ｒｈＥｐｏと比較した（ｎ＝６）。 図７は、ＴＦ−１細胞増殖に対する、ＣＩＤ１９８１およびＣＩＤ１９９７それぞれに含まれるＤＮＡによりコードされる種々の希釈アルブミン融合タンパク質の効果を示す（実施例９および１０を参照のこと）。細胞を３回洗浄して、ＧＭ−ＣＳＦを除去し、ＣＩＤ１９８１またはＣＩＤ１９９７によってコードされるＥｐｏアルブミン融合タンパク質の３倍希釈物の存在下で、７２時間にわたり、１０，０００細胞／ウェルにてプレートした。等モル量のｒｈＥｐｏをポジティブコントロールとして使用した（非グリコシル化Ｅｐｏの重量は、２０ｋｄであるのに対して、Ｅｐｏアルブミン融合タンパク質は、８７ｋｄであるので、約４．３５分の１のタンパク質を添加した）。細胞を、さらに２４時間、０．５μＣｉ／ウェルの３Ｈ−チミジンに曝した。（黒四角）ｒｈＥｐｏ標準；（黒三角）ＣＩＤ１９８１（ＣＨＯ）；（白丸）ＣＩＤ１９９７（ＮＳＯ）。 図８は、０日目〜８日目までのヘマトクリットの％変化に対する、組換えヒトＥＰＯ（ｒｈＥｐｏ）ならびに構築物１９９７（ＣＩＤ１９９７）に含まれるＤＮＡによってコードされるＥＰＯアルブミン融合タンパク質の種々の用量の効果を示す（実施例１０を参照のこと）。（黒三角）＝ｒｈＥｐｏ；（白四角）＝ＣＩＤ１９９７。 図９は、ＣＴＬＬ−２増殖に対する、ＣＩＤ１８１２に含まれるＤＮＡによってコードされるＩＬ２アルブミン融合タンパク質の種々の希釈物の効果を示す（実施例１５を参照のこと）。１×１０４細胞／ウェルを、ＩＬ２アルブミン融合タンパク質（ＣＩＤ１８１２）の示された量を含む最終容積２００μｌの完全培地中、９６ウェルプレートに播種した。全サンプルを、三連で行った。細胞を３７℃で４０分間インキュベートし、次いで２０μｌのＡｌａｍａｒ Ｂｌｕｅを添加し、細胞を８時間インキュベートした。５３０／５９０の吸光度を、増殖の尺度として使用した。ＥＣ５０＝０．３８６±０．０２１。（白三角）＝ＣＩＤ１８１２。 図１０は、２１日目のＲＥＮＣＡ腫瘍増殖に対する、ＣＩＤ１８１２に含まれるＤＮＡによってコードされるＩＬ２アルブミン融合タンパク質の効果を示す（実施例１５を参照のこと）。ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝１０）に、１０５ＲＥＮＣＡ細胞を、ＳＣ注射（脇腹中央部）した。１０日後、ｒＩＬ２（０．９ｍｇ／ｋｇ）、ＩＬ２アルブミン融合タンパク質（ＣＩＤ１８１２タンパク質；０．６ｍｇ／ｋｇ）、もしくはＰＢＳ（プラシーボ）の１日１回の注射（ＱＤ）、またはＣＩＤ１８１２タンパク質（０．６ｍｇ／ｋｇ）の一日おきの注射（ＱＯＤ）をマウスに与えた。腫瘍容積を、ＲＥＮＣＡ接種後の２１日目に決定した。データを、散乱分析で示す（各ドットは、１匹の動物を表す）。各群の平均値は、水平線によって示される。＊、ｐ＝０．００３５、プラシーボコントロールとＣＩＤ１８１２タンパク質との間。括弧の中の数字は、一群あたりのマウスの総数に対する生存していたマウスの数を示す。（白丸）＝プラセボ；（黒丸）＝ＩＬ２；（白三角）＝ＣＩＤ１８１２タンパク質（ＱＤ）；（白四角）＝ＣＩＤ１８１２タンパク質（ＱＯＤ）。 図１１は、ＮＦＳ−６０細胞増殖に対する、ＣＩＤ１６４２およびＣＤＩ１６４３に含まれるＤＮＡによってコードされるＧＣＳＦアルブミン融合タンパク質の種々の希釈物の効果を示す（実施例１９および２０を参照のこと）。（黒四角）＝ＣＩＤ１６４２；（黒三角）＝ＣＩＤ１６４３；（白丸）＝ＨＳＡ。 図１２は、総白血球数に対する組換えヒトＧＣＳＦ（Ｎｅｕｐｏｇｅｎ）およびＧＣＳＦアルブミン融合タンパク質の効果を示す（実施例１９を参照のこと）。各日における総ＷＢＣ（１０３細胞／μｌ）を、群平均±ＳＥＭとして示す。ＧＣＳＦアルブミン融合タンパク質を、４日ごとに４回（Ｑ４Ｄ）、２５μｇ／ｋｇまたは１００μｇ／ｋｇのいずれかで、あるいは７日ごとに２回（Ｑ７Ｄ）、１００μｇ／ｋｇでｓｃ注射した。ＧＣＳＦアルブミン融合タンパク質１００μｇ／ｋｇ Ｑ７についての８日目および９日目のデータを、他の群との比較を容易にするために、それぞれ、９日目および１０日目として示す。コントロールは、４日ごとに４回ｓｃ注射した生理食塩水ビヒクル（ビヒクルＱ４Ｄ）または毎日１回１４回ｓｃ投与したＮｅｕｐｏｇｅｎ（Ｎｅｕｐｏｇｅｎ ５μｇ／ｋｇ ＱＤ）であった。処置期間は、１〜１４日目、回復期間は、１５から２８日目と考えられる。 図１３は、ＩＳＲＥ−ＳＥＡＰ／２９３Ｆレポーター細胞におけるＳＥＡＰ活性に対する、ＣＩＤ２０１１およびＣＩＤ２０５３に含まれるＤＮＡによってコードされるＩＦＮｂアルブミン融合タンパク質の種々の希釈物の効果を示す（実施例２５を参照のこと）。タンパク質を、ＤＭＥＭ／１０％ ＦＢＳ中で５ｅ−７〜ｌｅ−１４ｇ／ｍｌまで連続希釈し、ＩＳＲＥ−ＳＥＡＰ／２９３Ｆレポーター細胞を処理するために使用した。２４時間後に、上清をレポーター細胞から取り出し、ＳＥＡＰ活性についてアッセイした。ＩＦＮｂアルブミン融合タンパク質を３つの安定なクローン：２９３Ｆ／＃２０１１、ＣＨＯ／＃２０１１およびＮＳＯ／＃２０５３から精製した。哺乳動物由来ＩＦＮｂであるＡｖｏｎｅｘはＢｉｏｇｅｎ製であり、２．０ｅ５ ＩＵ／μｇの比活性を有することが報告された。 図１４は、ＧＬＰ−１または構築物ＩＤ３０７０（ＣＩＤ３０７０タンパク質）によってコードされるＧＬＰ−１アルブミン融合タンパク質で処置した後のＩＮＳ−１（８３２／１３）細胞におけるインスリンｍＲＮＡの定常レベルを例示する。ＧＬＰ−１およびＣＩＤ３０７０タンパク質の両方とも、ＩＮＳ−１細胞におけるインスリン遺伝子の転写を刺激する。最初のバー（黒）は、非処理細胞を示す。バー２〜４（白）は、示された濃度のＧＬＰ−１で処理した細胞を示す。バー５〜７（灰色）は、示された濃度のＣＩＤ３０７０タンパク質で処理した細胞を示す。 図１５は、Ｈｓ２９４Ｔ黒色腫細胞に対する、ＣＩＤ３１６５（ＣＩＤ３１６５タンパク質）によってコードされるＩＦＮアルブミン融合タンパク質および組換えＩＦＮａ（ｆＩＮＦα）の抗増殖活性を比較する。細胞を、種々の濃度のＣＩＤ３１６５タンパク質またはｒＩＦＮａのいずれかとともに培養し、増殖を、培養の３日後にＢｒｄＵ組み込みによって測定した。ＣＩＤ３１６５タンパク質は、１０ｎｇ／ｍｌを上回る濃度で細胞増殖の測定可能な阻害を引き起こし、５０％阻害は、約２００ｎｇ／ｍｌで達成された。（黒四角）＝ＣＩＤ３１６５タンパク質、（黒菱形）＝ｒＩＦＮａ。 図１６は、ＩＳＲＥ−ＳＥＡＰ／２９３Ｆレポーター細胞におけるＳＥＡＰ活性に対する、ＩＦＮａアルブミン融合タンパク質の種々の規約物の効果を示す。アルブミンの上流に融合したＩＦＮａの１つの調製物（黒菱形）を試験し、アルブミンの下流に融合したＩＦＮａの２つの異なる調製物（黒三角）および（黒四角）もまた試験した。 図１７は、処置サルにおけるＯＡＳ（ｐ４１）のｍＲＮＡレベルに対する、時間および構築物２２４９（ＣＩＤ２２４９タンパク質）に含まれるＤＮＡによってコードされるＩＦＮａアルブミン融合タンパク質の用量の効果を示す（実施例３１を参照のこと）。時点あたり：最初のバー＝ビヒクルコントロール、第２のバー＝３０μｇ／ｋｇ ＣＩＤ２２４９タンパク質１日目ｉｖ、第３のバー＝３０μｇ／ｋｇ ＣＩＤ２２４９タンパク質１日目ｓｃ、第４のバー＝３００μｇ／ｋｇ ＣＩＤ２２４９タンパク質１日目ｓｃ、第５のバー＝４０μｇ／ｋｇ 組換えＩＦＮａ１日目、３日目、および５日目ｓｃ。 図１８は、３Ｔ３−Ｌｌ脂肪細胞におけるグルコース取り込みに対する、構築物２２５０および２２７６に含まれるＤＮＡによってコードされるインスリンアルブミン融合タンパク質の種々の希釈物の効果を示す（実施例３３および３５を参照のこと）。 図１９は、ＮＦＳ細胞増殖に対する、種々のＧＣＳＦアルブミン融合タンパク質（ＣＩＤ＃１６４３およびＣＩＤ＃２７０２（Ｌ−１７１，実施例１１４を参照のこと）によりコードされるものを含む）の効果を示す。水平破線は、最小検出レベルを示す。
（発明の詳細な説明）
（定義）
以下の定義は、本明細書を通して使用される特定の用語の理解を容易にするために提供される。
本明細書中で使用される場合、「ポリヌクレオチド」とは、少なくとも１つの治療用タンパク質Ｘ（またはそのフラグメントもしくは改変体）の対してインフレームで連結される少なくとも一分子のアルブミン（またはそのフラグメントもしくは改変体）を含むかあるいはこれらからなる融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する核酸分子；配列番号Ｙのアミノ酸配列（表２の第６列に記載される）またはそのフラグメントもしくは改変体を含むかあるいはこれらからなる融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する核酸分子；配列番号Ｘに示される配列を含むかあるいはこれからなるヌクレオチド配列を有する核酸分子；配列番号Ｚのアミノ酸配列を含むかあるいはこれからなる融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する核酸分子；表２または実施例に記載されるように生成される本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する核酸分子；本発明の治療用アルブミン融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する核酸分子、表２に記載されるアルブミン融合構築物中に含まれるヌクレオチド配列を有する核酸分子、あるいはＡＴＣＣに寄託されたアルブミン融合構築物（表３に記載される）中に含まれるヌクレオチド配列を有する核酸分子をいう。
本明細書中で使用される場合、「アルブミン融合構築物」とは、少なくとも１分子の治療用タンパク質（またはそのフラグメントもしくは改変体）をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドにインフレームで連結される少なくとも１分子のアルブミン（またはそのフラグメントもしくは改変体）をコードするポリヌクレオチドをふくむかあるいはこれらからなる核酸分子；表２または実施例に記載されるように生成される少なくとも一分子の治療用タンパク質（またはそのフラグメントもしくは改変体）をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドにインフレームで融合される少なくとも１つのアルブミン（またはそのフラグメントもしくは改変体）をコードするポリヌクレオチドを含むかあるいはこれらからなる核酸分子；あるいは例えば、以下のエレメント：（１）機能的な自己複製ベクター（シャトルベクター、発現ベクター、組み込みベクター、および／または複製系）、（２）転写の開始のための領域（例えば、調節可能プロモーターまたは誘導性プロモーター、構成プロモーターのようなプロモーター領域）、（３）転写の終結のための領域、（４）リーダー配列、および（５）選択マーカー、のうちの１以上をさらに含む少なくとも１分子の治療用タンパク質（またはそのフラグメントもしくは改変体）をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドにインフレームで連結される少なくとも一分子のアルブミン（またはそのフラグメントもしくは改変体）をコードするポリヌクレオチドを含むかあるいはこれらからなる核酸。治療用タンパク質およびアルブミンタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、一旦アルブミン融合構築物の一部になると、各々、アルブミン融合構築物の「一部」、「領域」、または「部分」ともいわれ得る。
本発明は、一般に、アルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド；アルブミン融合タンパク質；アルブミン融合タンパク質またはアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを使用して、疾患または障害を処置、予防、または改善する方法に関する。本明細書中で使用される場合、「アルブミン融合タンパク質」とは、少なくとも一分子の治療用タンパク質（またはそのフラグメントもしくは改変体）への少なくとも一分子のアルブミン（またはそのフラグメントもしくは改変体）の融合によって形成されるタンパク質をいう。本発明のアルブミン融合タンパク質は、治療用タンパク質の少なくともフラグメントもしくは改変体およびヒト血清アルブミンの少なくともフラグメントもしくは改変体を含み、これらは、遺伝的融合によって互いに結合される（すなわち、アルブミン融合タンパク質は、治療用タンパク質の全てまたは一部をコードするポリヌクレオチドが、アルブミンの全てまたは一部をコードするポリヌクレオチドにインフレームで連結される核酸の翻訳によって生成される）。治療用タンパク質およびアルブミンタンパク質は、一旦アルブミン融合タンパク質の一部になると、おのおの、アルブミン融合タンパク質の「一部（ｐｏｒｔｉｏｎ）」、「領域」または「部分（ｍｏｉｅｔｙ）」（例えば、「治療用タンパク質部分」または「アルブミンタンパク質部分」）といわれ得る。非常に好ましい実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質は、少なくとも一分子の治療用タンパク質Ｘまたはそのフラグメントもしくは改変体（治療用タンパク質Ｘの成熟形態を含むが、これらに限定されない）および少なくとも一分子のアルブミンまたはそのフラグメントもしくは改変体（アルブミンの成熟形態を含むが、これらに限定されない）を含む。
さらに好ましい実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質は、宿主細胞によってプロセシングされ、周りの培養培地に分泌される。発現のために使用される宿主の分泌経路において生じる新生アルブミン融合タンパク質のプロセシングは、シグナルペプチド切断；ジスルフィド結合形成；適切な折りたたみ；糖質の付加およびプロセシング（例えば、Ｎ結合型グリコシル化およびＯ結合型グリコシル化）；特異的タンパク質切断；およびマルチマータンパク質へのアセンブリが挙げられ得るが、これらに限定されない。
本発明のアルブミン融合タンパク質は、好ましくは、プロセシングされた形態である。最も好ましい実施形態において、「アルブミン融合タンパク質のプロセシングされた形態」とは、Ｎ末端シグナルペプチド切断をうけたアルブミン融合タンパク質産物をいう（本明細書中「成熟アルブミン融合タンパク質」ともいう）。
いくつかの例において、本発明のアルブミン融合構築物を含む代表的クローンを、アメリカンタイプカルチャーコレクション（本明細書中、「ＡＴＣＣ（登録商標）」と称する）に寄託した。さらに、当該分野で公知の技術および本明細書中に記載の技術によって、寄託物から所定のアルブミン融合構築物を回収することが可能である。ＡＴＣＣ（登録商標）は、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ ２０１１０−２２０９，ＵＳＡに位置する。ＡＴＣＣ寄託は、特許手続目的のための微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の条項に拠って行われた。
一実施形態において、本発明は、治療用タンパク質および血清アルブミンタンパク質を含むかあるいはこれらからなるアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。さらなる実施形態において、本発明は、治療用タンパク質および血清アルブミンタンパク質を含むかあるいはこれらからなるアルブミン融合タンパク質を提供する。
好ましい実施形態において、本発明は、表２に記載されるポリヌクレオチドによってコードされる治療用タンパク質および血清アルブミンタンパク質を含むかあるいはこれらからなるアルブミン融合タンパク質を提供する。さらに好ましい実施形態において、本発明は、表２において配列番号Ｙとしてその配列が示されるアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。他の実施形態において、本発明は、治療用タンパク質の生物学的に活性なおよび／または治療的に活性なフラグメント、ならびに血清アルブミンタンパク質を含むかあるいはこれらからなるアルブミン融合タンパク質を提供する。他の実施形態において、本発明は、治療用タンパク質の生物学的に活性なおよび／または治療的に活性な改変体、ならびに血清アルブミンタンパク質を含むかあるいはこれらからなるアルブミン融合タンパク質を提供する。好ましい実施形態において、アルブミン融合タンパク質の血清アルブミンタンパク質成分は、血清アルブミンの成熟形態である。本発明はさらに、これらのアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを包含する。
さらなる実施形態において、本発明は、治療用タンパク質、ならびに血清アルブミンの生物学的に活性なおよび／または治療的に活性なフラグメントを含むかあるいはこれらからなるアルブミン融合タンパク質を提供する。さらなる実施形態において、本発明は、治療用タンパク質、ならびに血清アルブミンの生物学的に活性なおよび／または治療的に活性な改変体を含むかあるいはこれらからなるアルブミン融合タンパク質を提供する。好ましい実施形態において、アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分は、治療用タンパク質の成熟形態である。さらに好ましい実施形態において、アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分は、治療用タンパク質の細胞外可溶性ドメインである。代替的実施形態において、アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分は、治療用タンパク質の活性形態である。本発明はさらに、これらのアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを包含する。
さらなる実施形態において、本発明は、治療用タンパク質の生物学的に活性なおよび／または治療的に活性なフラグメントもしくは改変体、ならびに血清アルブミンの生物学的に活性なおよび／または治療的に活性なフラグメントもしくは改変体を含むかあるいはこれらからなるアルブミン融合タンパク質を提供する。好ましい実施形態において、本発明は、治療用タンパク質の成熟部分および血清アルブミンの成熟形態を含むかあるいはこれらからなるアルブミン融合タンパク質を提供する。本発明は、これらのアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドをさらに包含する。
（治療用タンパク質）
上記のように、本発明のポリヌクレオチドは、治療用タンパク質の少なくともフラグメントもしくは改変体およびヒト血清アルブミンの少なくともフラグメントもしくは改変体を含むかあるいはこれらからなるタンパク質をコードし、これらは、互いに、好ましくは遺伝的融合によって結合している。
さらなる実施形態は、治療用タンパク質の少なくともフラグメントもしくは改変体およびヒト血清アルブミンの少なくともフラグメントもしくは改変体を含むかあるいはこれらからなるタンパク質をコードし、これらは、互いに化学的結合体化によって連結されている。
本明細書中で使用される場合、「治療用タンパク質」とは、１以上の治療的および／または生物学的活性を有するタンパク質、ポリペプチド、抗体、ペプチドまたはそのフラグメントもしくは改変体をいう。本発明によって包含される治療用タンパク質は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗体、および生物学的製剤（ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）が挙げられるが、これらに限定されない（用語ペプチド、タンパク質、およびポリペプチドは、本明細書中で交換可能に使用される）。用語「治療用タンパク質」は、抗体、およびそのフラグメントもしくは改変体を包含する。従って、本発明のタンパク質は、治療用タンパク質の少なくともフラグメントもしくは改変体、および／または抗体の少なくともフラグメントもしくは改変体を含み得る。さらに、用語「治療用タンパク質」は、治療用タンパク質の内因性相関物または天然に存在する相関物をいい得る。
「治療的活性」を示すポリペプチドまたは「治療的に活性」であるタンパク質とは、本明細書中に記載の治療用タンパク質またはさもなければ当該分野で公知の１以上の治療用タンパク質のような、治療用タンパク質と関連する１つ以上の既知の生物学的活性および／または治療的活性を保有するポリペプチドを意味する。非限定的な例として、「治療用タンパク質」は、疾患、状態または障害を処置、予防、または改善するために有用なタンパク質である。非限定的な例として、「治療用タンパク質」は、特定の細胞型（正常（例えば、リンパ球）または異常（例えば、癌細胞））に特異的に結合するタンパク質であり、従って、その細胞型化合物（薬物または細胞傷害性薬剤）を特異的に標的化するために使用され得る。
例えば、本発明のアルブミン融合タンパク質によって含まれ得る「治療用タンパク質」部分の非網羅的列挙は、以下を含むが、これらに限定されない：エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＩＬ−２、Ｇ−ＣＳＦ、インスリン、カルシトニン、成長ホルモン、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＰＴＨ、ＴＲ６（国際公開番号ＷＯ９８／３０６９４）、ＢＬｙＳ、ＢＬｙＳ単鎖抗体、Ｒｅｓｉｓｔｉｎ、成長ホルモン放出因子、ＶＥＧＦ−２、ＫＧＦ−２、Ｄ−ＳＬＡＭ、ＫＤＩ、およびＴＲ２、ＧＬＰ−１、Ｅｘｔｅｎｄｉｎ ４およびＧＭ−ＣＳＦ。
インターフェロンハイブリッドはまた、アルブミンのアミノ末端またはカルボキシ末端に融合されて、インターフェロンハイブリッドアルブミン融合タンパク質を形成し得る。
インターフェロンハイブリッドアルブミン融合タンパク質は、インターフェロン活性（例えば、抗ウイルス応答、細胞増殖の調節および免疫応答の調節）を増強し得るか、あるいはインターフェロン活性を抑制し得る（Ｌｅｂｌｅｕら，ＰＮＡＳ ＵＳＡ，７３：３１０７−３１１１（１９７６）；Ｇｒｅｓｓｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，２５１：５４３−５４５（１９７４）；およびＪｏｈｎｓｏｎ，Ｔｅｘａｓ Ｒｅｐｏｒｔｓ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ，３５：３５７−３６９（１９７７））。各インターフェロンハイブリッドアルブミン融合タンパク質は、ウイルス感染（例えば、肝炎（例えば、ＨＣＶ）；またはＨＩＶ）、多発性硬化症、または癌を処置、予防または改善するために使用され得る。
一実施形態において、そのインターフェロンハイブリッドアルブミン融合タンパク質のインターフェロンハイブリッド部分は、インターフェロンα−インターフェロンαハイブリッド（本明細書中、α−αハイブリッドといわれる）を含む。例えば、このインターフェロンハイブリッドアルブミン融合タンパク質のα−αハイブリッド部分は、インターフェロンα Ｄに融合されるインターフェロンα Ａからなるかあるいはこれらを含む。さらなる実施形態において、そのＡ／Ｄハイブリッドは、インターフェロンα Ｄに共通のＢｇＥ制限部位において融合される。ここでＡ／ＤハイブリッドのＮ末端部分は、インターフェロンα Ａのアミノ酸１−６２に対応し、Ｃ末端部分は、インターフェロンα Ｄのアミノ酸６４−１６６に対応する。例えば、このＡ／Ｄハイブリッドは、以下のアミノ酸配列を含む：
Figure 2014043448
 ここでＸ１は、ＲまたはＫであり、Ｘ２はＡまたはＶであり（例えば、構築物＃２８７５を参照のこと）。さらなる実施形態において、このＡ／Ｄハイブリッドは、一般的なＰｖｕＩＩＩ制限部位において融合される。ここでこのＡ／ＤハイブリッドのＮ末端部分は、インターフェロンα Ａのアミノ酸１−９１に対応し、Ｃ末端部分は、インターフェロンα Ｄのアミノ酸９３−１６６に対応する。例えば、このＡ／Ｄハイブリッドは、以下のアミノ酸配列を含む：
Figure 2014043448
 ここでＸ１は、ＲまたはＫであり、第２のＸ２は、ＡまたはＶである（例えば、構築物ＩＤ＃２８７２を参照のこと）。これらのハイブリッドは、米国特許第４，４１４，５１０号（これは、その全体が本明細書中に参考として援用される）にさらに記載される。
さらなる実施形態において、そのインターフェロンハイブリッドアルブミン融合タンパク質のα−αハイブリッド部分は、インターフェロンα Ｆに融合されたインターフェロンα Ａからなるかあるいはこれらを含む。さらなる実施形態において、このＡ／Ｆハイブリッドは、一般的なＰｖｕＩＩＩ制限部位に融合され、ここでＡ／ＦハイブリッドのＮ末端部分は、インターフェロンα Ａのアミノ酸１−９１に対応し、Ｃ末端部分は、インターフェロンα Ｆのアミノ酸９３−１６６に対応する。例えば、このＡ／Ｆハイブリッドは、以下のアミノ酸配列を含む：
Figure 2014043448
 ここでＸはＲまたはＫのいずれかである（例えば、構築物ＩＤ＃２８７４）。これらのハイブリッドは、米国特許第４，４１４，５１０号（これは、その全体が本明細書中に参考として援用される）にさらに記載される。さらなる実施形態において、このインターフェロンハイブリッドアルブミン融合タンパク質のα−αハイブリッド部分は、インターフェロンα Ｂに融合されたインターフェロンα Ａからなるかあるいはこれらを含む。代替的実施形態において、このＡ／Ｂハイブリッドは、一般的なＰｖｕＩＩＩ制限部位において融合され、ここでこのＡ／ＢハイブリッドのＮ末端部分は、インターフェロンα Ａのアミノ酸１−９１に対応し、Ｃ末端部分は、インターフェロンα Ｂのアミノ酸９３−１６６に対応する。例えば、このＡ／Ｂハイブリッドは、以下のアミノ酸配列を含む：
Figure 2014043448
 ここでＸ１はＲまたはＫであり、Ｘ２からＸ５は、ＳＣＶＭまたはＶＬＣＤである（例えば、構築物ＩＤ＃２８７３を参照のこと）。これらのハイブリッドは、米国特許第４，４１４，５１０号（これは、その全体が本明細書中に参考として援用される）にさらに記載される。
別の実施形態において、このインターフェロンハイブリッドアルブミン融合タンパク質のインターフェロンハイブリッド部分は、インターフェロンβ−インターフェロンαハイブリッド（本明細書中で、β−αハイブリッドといわれる）を含む。例えば、このインターフェロンハイブリッドアルブミン融合タンパク質のβ−αハイブリッド部分は、インターフェロンα Ｄに融合されるインターフェロンβ−１からなるかあるいはこれらを含む（インターフェロンα−１ともいわれる）。さらなる実施形態において、このβ−１／α Ｄ ハイブリッドが融合され、ここでＮ末端部分は、インターフェロンβ−１のアミノ酸１−７３に対応し、Ｃ末端部分は、インターフェロンα Ｄのアミノ酸７４−１６７に対応する。例えば、このβ−１／α Ｄハイブリッドは、以下のアミノ酸配列を含む：
Figure 2014043448
 ここでＸは、ＡまたはＶである。これらのハイブリッドは、米国特許第４，７５８，４２８号（これは、その全体が本明細書中に参考として援用される）においてさらに記載される。
別の実施形態において、インターフェロンハイブリッドアルブミン融合タンパク質のインターフェロンハイブリッド部分は、インターフェロンα−インターフェロンβハイブリッド（本明細書中で、α−βハイブリッドといわれる）を含む。例えば、インターフェロンハイブリッドアルブミン融合タンパク質のα−βハイブリッド部分は、インターフェロンβ−１に融合された、インターフェロンα Ｄ（インターフェロンα−１ともいわれる）からなるかあるいはこれらを含む。さらなる実施形態において、このαＤ／β−１ハイブリッドは融合され、ここでＮ末端部分は、インターフェロンα Ｄのアミノ酸１−７３に対応し、Ｃ末端部分は、インターフェロンβ−１のアミノ酸７４−１６６に対応する。
例えば、このαＤ／β−１ハイブリッドは、以下のアミノ酸配列を有する：
Figure 2014043448
 これらのハイブリッドは、米国特許第４，７５８，４２８号（これは、その全体が本明細書中に参考として援用される）にさらに記載される。
さらなる実施形態において、このインターフェロンハイブリッドアルブミン融合タンパク質のインターフェロンハイブリッド部分は、α−αインターフェロンハイブリッド、α−βインターフェロンハイブリッド、およびβ−αインターフェロンハイブリッドのさらなる組み合わせを含み得る。さらなる実施形態において、このインターフェロンハイブリッドアルブミン融合タンパク質のインターフェロンハイブリッド部分は、インターフェロンハイブリッドのアミノ酸配列に対して変異、置換、欠失、または付加を含むように改変され得る。インターフェロンハイブリッドアルブミン融合タンパク質に対するこのような改変は、例えば、生成のレベルを改善し、安定性を増大し、活性を増大または減少し、あるいは新たな生物学的特性を付与するように行われ得る。
上記のインターフェロンハイブリッドアルブミン融合タンパク質は、本発明によって包含され、このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞およびベクターも同様に包含される。一実施形態において、上記のポリヌクレオチドによってコードされるインターフェロンハイブリッドアルブミン融合タンパク質は、長期化した貯蔵寿命を有する。さらなる実施形態において、上記のポリヌクレオチドによってコードされるインターフェロンハイブリッドアルブミン融合タンパク質は、インビトロおよび／またはインビボにおいて、対応する非融合インターフェロンハイブリッド分子より長い血清半減期および／または溶液中（または薬学的組成物中）でのより安定した活性を有する。
別の非限定的例において、「治療用タンパク質」は、生物学的活性、特に、疾患を処置、予防または改善するために有用な生物学的活性を有するタンパク質である。治療用タンパク質によって保持され得る生物学的活性の非包括的列挙は、免疫応答の増強、新脈管形成の促進、新脈管形成の阻害、内分泌機能の調節、造血機能の調節、神経性腸の刺激、免疫応答の増強、免疫応答の阻害、あるいは以下の「生物学的活性」の節に記載され、そして／または表１（第２列）の所定の治療用タンパク質について開示される生物学的活性のうちの任意の１つ以上を含む。
本明細書中で使用される場合、「治療活性」または「活性」は、その効果が、ヒトにおける所望の治療的結果と一致するか、あるいは非ヒト哺乳動物または他の種もしくは生物において所望の効果に一致する活性をいい得る。治療的活性は、インビボまたはインビトロで、測定され得る。例えば、所望の効果は、細胞培養物中でアッセイされ得る。例として、ＥＰＯが治療用タンパク質である場合、実施例８に記載されるように、ＥＰＯの細胞増殖に対する効果は、治療的活性が測定されるエンドポイントとして使用され得る。このようなインビトロまたはアッセイまたは細胞培養物アッセイは、当該分野で記載されるように、多くの治療用タンパク質について市販されている。アッセイの例としては、実施例の節または表１の「例示的活性アッセイ」の列（第３列）において本明細書中で記載されるものが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応する治療用タンパク質（例えば、細胞表面タンパク質および分泌タンパク質）は、しばしば、１以上のオリゴサッカリド基の結合によって改変される。グリコシル化といわれる改変は、タンパク質の物理的特性に劇的な影響を及ぼし得、タンパク質安定性、分泌および局在化において重要であり得る。グリコシル化は、ポリペプチド骨格に沿った特定の位置で起こる。グリコシル化には通常、２つの主要な型がある：Ｏ結合オリゴサッカリドにより特徴付けられるグリコシル化（これは、セリン残基またはスレオニン残基に結合される）；およびＮ結合型オリゴサッカリドによって特徴付けられるグリコシル化（これは、Ａｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ配列におけるアスパラギン残基に結合され、ここでＸは、プロリンを除く任意のアミノ酸であり得る）。Ｎ−アセチルノイラミン酸（シアル酸としても公知）は、通常、Ｎ結合型オリゴサッカリドおよびＯ結合型オリゴサッカリドの両方の末端残基である。変数（例えば、タンパク質構造および細胞型）は、異なるグリコシル化部位における鎖内の糖質ユニットの数および性質に影響を及ぼす。グリコシル化アイソマーはまた、所定の細胞型内の同じ部位では共通する。
例えば、ヒトインターフェロンのいくつかの型は、グリコシル化されている。天然のヒトインターフェロン−α２は、スレオニン１０６においてＯグリコシル化されており、インターフェロン−α１４では、アスパラギン７２においてＮグリコシル化されている。（Ａｄｏｌｆら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ ２７６：５１１（１９９１）；Ｎｙｍａｎ ＴＡら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ ３２９：２９５（１９９８））。天然のインターフェロン−β１αのアスパラギン８０におけるオリゴサッカリドは、タンパク質の溶解性および安定性において重要な要因を担い得るが、その生物学的活性に必須ではない。このことは、安定性を増強するように配列改変により操作された非グリコシル化アナログ（インターフェロン−βｌｂ）の生成を可能にする（Ｈｏｓｏｉら，Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｒｅｓ．８：３７５（１９８８；Ｋａｒｐｕｓａｓら，Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ５４：１２０３（１９９８）；Ｋｎｉｇｈｔ，Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｒｅｓ．２：４２１（１９８２）；Ｒｕｎｋｅｌら，Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ １５：６４１（１９９８）；Ｌｉｎ，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．９６：９７（１９９８））。インターフェロン−γは、２５位および９７位において２つのＮ結合型オリゴサッカリド鎖を含み、これらはともに、生体活性組換えタンパク質の効率的な形成に重要であり、そのタンパク質の薬物動態特性に対して影響を有する（Ｓａｒｅｎｅｖａら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ ２４２：１９１（１９９６）；Ｓａｒｅｎｅｖａら，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．３０３：８３１（１９９４）；Ｓａｒｅｎｅｖａら，Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｒｅｓ．１３：２６７（１９９３））。混合されたＯ結合型グリコシル化およびＮ結合型グリコシル化もまた、例えば、ヒトエリスロポエチンにおいて存在し、Ｎ結合型グリコシル化は、２４位、３８位および８３位に位置するアスパラギン残基において存在する一方で、Ｏ結合型グリコシル化は、１２６位に位置するセリン残基において存在する（Ｌａｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：３１１６（１９８６）；Ｂｒｏｕｄｙら，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２６５：３２９（１９８８））。
ＥＰＯアルブミン融合タンパク質のグリコシル化は、ＥＰＯアルブミン融合タンパク質の活性および／または安定性に影響を及ぼし得る。アルブミン融合タンパク質のＥＰＯ部分は、グリコシル化のための３つのＮ結合部位を含み得、その部位の各々は、１つのテトラアンテナリー構造を有し得る。ＥＰＯアルブミン融合タンパク質が、グリコシル化される場合、その分子の半減期は、増大され得る。一実施形態において、このＥＰＯアルブミン融合タンパク質は、グリコシル化される。別の実施形態において、このＥＰＯアルブミン融合タンパク質は、過剰にグリコシル化される（ｈｙｐｅｒｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）。
オリゴサッカリドにおいて共通して見出される糖の１つの型は、シアル酸である。ＥＰＯのＮ結合型グリコシル化部位の各テトラアンテナリー構造は、４つのシアル酸残基を有し得る。従って、好ましい実施形態において、このＥＰＯアルブミン融合タンパク質は、シアル酸を含む糖質基でグリコシル化される。さらなる実施形態において、このＥＰＯアルブミン融合タンパク質は、４つのシアル酸残基／テトラアンテナリー構造／部位を含む、シアル酸 対 タンパク質が１２：１以上のモル比で完全にシアル化されたＥＰＯタンパク質を含む。代替的実施形態において、このＥＰＯアルブミン融合タンパク質は、過剰シアル化ＥＰＯタンパク質を含む。ここで、１つ、２つ、または３つのシアル酸残基は、シアル酸 対 タンパク質が１２：１未満のモル比で、各テトラアンテナリー構造／部位に結合される。
ＥＰＯアルブミン融合タンパク質のシアル化において使用され得る２つの型のシアル酸は、 Ｎ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）またはＮ−グリコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）である。好ましい実施形態において、過剰シアル化ＥＰＯアルブミン融合タンパク質は、Ｎｅｕ５Ａｃを含む。より好ましくは、過剰シアル化ＥＰＯアルブミン融合タンパク質の総シアル酸含有量は、少なくとも９７％ Ｎｅｕ５Ａｃである。最も好ましいのは、Ｎｅｕ５Ｇｃがほとんどまたは全くないＥＰＯアルブミン融合タンパク質構造である。
好ましくは、アルブミンＥＰＯ融合タンパク質は、少なくとも４モルのシアル化、より好ましくは、少なくとも８〜９モルのシアル化を有する。さらなる実施形態は、４モルのシアル化、５モルのシアル化、６モルのシアル化、７モルのシアル化、８〜９モルのシアル化、８モルのシアル化、９モルのシアル化、１０モルのシアル化、１１モルのシアル化、または１２モルのシアル化を有するアルブミンＥＰＯ融合タンパク質を含む。
タンパク質のシアル化の程度は、タンパク質の電荷およびクロマトグラフィーカラムに対するその保持時間を変化させる。従って、精製プロセスにおいて使用される特定のカラムクロマトグラフィー工程は、過剰シアル化ＥＰＯアルブミン融合タンパク質についてモニターまたは富化するために使用され得る。好ましい実施形態において、シアル化の量は、ＨＰＬＣクロマトグラフィーによってモニターされ得る。さらなる実施形態において、ＥＰＯアルブミン融合物の精製プロセスにおける工程は、過剰シアル化ＥＰＯアルブミン融合タンパク質について富化するために使用され得る。好ましい実施形態において、過剰シアル化ＥＰＯアルブミン融合タンパク質について富化するために使用され得る精製工程は、高アンモニウム塩によるウイルス粒子を除去するためのブチルセファロースＦＦ精製工程および最終的な精製工程のためのｐＨ６．８でのヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを包含する。
本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分、ならびにそれらのアナログおよび改変体に対応する治療用タンパク質は、１以上の部位でのグリコシル化が、それらが発現される宿主細胞により、またはそれらの発現の他の条件に起因して、それらの核酸配列の操作の結果として変化するように改変され得る。例えば、グリコシル化アイソマーは、グリコシル化部位を除去または導入することによって（例えば、アミノ酸残基の置換または欠失（例えば、グルタミンのアスパラギンへの置換）によって）生成され得るか、あるいは非グリコシル化組換えタンパク質が、タンパク質をグリコシル化しない宿主細胞において（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉまたはグリコシル化欠損酵母において）タンパク質を発現することによって生成され得る。これらのアプローチは、以下でより詳細に記載され、当該分野で公知である。
治療用タンパク質、特に、表１に記載される治療用タンパク質、ならびにそれらの核酸およびアミノ酸配列は、当該分野で周知であり、公のデータベース（例えば、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔｓ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ Ｄａｔａｂａｓｅｓ（例えば、ＣＡＳ Ｒｅｇｉｓｔｒｙ）、ＧｅｎＢａｎｋ）および定期購読契約型提供データベース（例えば、ＧｅｎＳｅｑ（例えば、Ｄｅｒｗｅｎｔ）から入手可能である。本発明のポリヌクレオチドを誘導するために使用され得る治療用タンパク質の例示的ヌクレオチド配列は、表２の第７列「配列番号Ｘ」に示される。配列番号Ｘとして示される配列は、所定の治療用タンパク質（例えば、全長または成熟のいずれか）をコードする野生型ポリヌクレオチド配列であり得るか、またはいくつかの場合において、その配列は、この野生型ポリヌクレオチド配列（例えば、野生型治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチド）の改変体であり得る。ここでこのポリヌクレオチドのＤＮＡ配列は、例えば、特定の種における発現；または野生型治療用タンパク質の改変体の改変体（すなわち、部位指向性変異体；対立遺伝子改変体））をコードするポリヌクレオチドのために最適化されている。同じ行に記載される構築物を得るために、配列番号Ｘとして示される配列を使用することは、十分に、当業者の能力の範囲内である。例えば、配列番号Ｘが、全長タンパク質に対応するが、そのタンパク質の一部のみが、特定のＣＩＤを生成するために使用される場合、特定のフラグメントを増幅し、適切なベクターにこれをクローニングするために、分子生物学的技術（例えば、ＰＣＲ）によることは、当業者の技術範囲内である。
治療用タンパク質部分の本発明のアルブミン融合タンパク質に対応するさらなる治療用タンパク質は、表１の「治療用タンパク質Ｘ」の列（第１列）に開示される治療用タンパク質またはペプチド、またはそのフラグメントもしくは変数改変体（ｖａｒｉａｂｌｅ）のうちの１つ以上が挙げられるが、これらに限定されない。
表１は、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応する治療用タンパク質、または本発明のポリヌクレオチドによってコードされるアルブミン融合タンパク質の非網羅的列挙を提供する。第１列「治療用タンパク質Ｘ」は、治療用タンパク質分子を開示し、その次に、括弧には治療用タンパク質分子またはそのフラグメントもしくは改変体を含むかあるいはこれらからなるタンパク質の科学名および商標名を含む。「治療用タンパク質Ｘ」は、本明細書中で使用される場合、個々の治療用タンパク質分子、またはこの列において開示される所定の治療用タンパク質分子と関連する治療用タンパク質の群全体いずれかをいう。「生物学的活性」列（第２列）は、治療用タンパク質分子と関連した生物学的活性を記載する。第３列は、「例示的活性アッセイ」は、治療用タンパク質Ｘ、または治療用タンパク質Ｘ（またはそのフラグメント）部分を含むアルブミン融合タンパク質の治療的および／または生物学的活性を試験するために使用され得るアッセイを記載する参考文献を提供する。「例示的活性アッセイ」列に引用される参考文献の各々は、表１の「生物学的活性」列に示される対応する生物学的活性をアッセイするために、特に、参考文献に記載されるそれぞれの活性アッセイの記載に関して、それらの全体が本明細書中に参考として援用される（例えば、それらの材料および方法を参照のこと）。第５列「好ましい適応症Ｙ」は、治療用タンパク質Ｘまたは治療用タンパク質Ｘ（またはそれらのフラグメント）部分を含むアルブミン融合タンパク質によって処置、予防、診断、および／あるいは改善され得る疾患、障害、および／または状態を記載する。「構築物ＩＤ」列（第５列）は、参照される治療用タンパク質Ｘ（またはそのフラグメント）部分を含むかあるいはこれらからなるアルブミン融合タンパク質をコードする、表２に開示される例示的アルブミン融合構築物に対する関連を提供する。
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表２は、アルブミン融合タンパク質をコードする核酸分子を含むかあるいはこれからなる、本発明のポリヌクレオチドの非網羅的列挙を提供する。第５カラム「融合数」は、各ポリヌクレオチドの融合数を示す。第２列は、「構築物ＩＤ」は、本発明の各ポリヌクレオチドについての固有の数字による識別子を提供する。この構築物ＩＤは、表１の対応する行に列挙される所定の治療用タンパク質Ｘに対応する治療用タンパク質部分を含むかあるいはこれらからなる、アルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを同定するために使用され得る。ここでその構築物ＩＤは、第５列に列挙される。「構築物名」列（第３列）は、所定のアルブミン融合構築物またはポリヌクレオチドの名称を提供する。
表２の第４列「説明」は、所定のアルブミン融合構築物の一般的な説明を提供し、第５列の「発現ベクター」は、所定のアルブミン融合タンパク質をコードする核酸分子を含むかあるいはこれらからなるポリヌクレオチドがクローニングされたベクターを列挙する。
ベクターは、当該分野で公知であり、市販されるかまたは何れか他のところに記載される。例えば、実施例において記載される場合、（１）所定のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、（２）リーダー配列、（３）プロモーター領域、および（４）転写ターミネーターをうちの１つ以上を含むかあるいはこれらのうちの１以上からなる「発現カセット」は、簡便なクローニングベクターにアセンブリされ得、続いて、例えば、発現ベクターのような代わりのベクター（例えば、酵母発現ベクターまたは哺乳動物発現ベクターを含む）にアセンブリされ得る。一実施形態において、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける発現のために、アルブミン融合タンパク質をコードする核酸分子を含むかあるいはこれからなる発現カセットが、ｐＳＡＣ３５にクローニングされる。別の実施形態において、ＣＨＯ細胞における発現のために、アルブミン融合タンパク質をコードする核酸分子を含むかあるいはこれからなる発現カセットが、ｐＣ４にクローニングされる。さらなる実施形態において、アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分をコードする核酸分子を含むかあるいはこれからなるポリヌクレオチドは、ｐＣ４：ＨＳＡにクローニングされる。なおさらなる実施形態において、ＮＳ０細胞における発現のために、アルブミン融合タンパク質をコードする核酸分子を含むかあるいはこれからなる発現カセットが、ｐＥＥ１２にクローニングされる。他の有用なクローニングおよび／または発現ベクターは、当業者に公知であり、本発明の範囲内である。
第６列「配列番号Ｙ」は、本発明のアルブミン融合タンパク質の全長アミノ酸配列を提供する。大部分の例において、配列番号Ｙは、コードされるアルブミン融合タンパク質の非プロセシング形態を示す（言い換えると、配列番号Ｙは、特定の構築物によってコードされるシグナル配列、ＨＳＡ部分、および治療部分全てを示す。本発明により具体的に意図されるのは、配列番号Ｙをコードするポリヌクレオチド全てである。これらのポリヌクレオチドが、細胞からコードタンパク質を発現するために使用される場合、その細胞の天然の分泌およびプロセシング工程は、表２の第４列および／または第１１列に列挙されるシグナル配列を欠くタンパク質を生成する。列挙されるシグナル配列の具体的アミノ酸配列は、後に、本明細書中に示されるか、または当該分野で周知である。従って、本発明の最も好ましい実施形態は、細胞によって生成されるアルブミン融合タンパク質（表２の第４列および／または第１１列に示されるリーダー配列を欠く）を含む。最も好ましいのは、表２の第４列および／または第１１列に列挙される特定のリーダー配列なしで、配列番号Ｙを含むポリペプチドである。これら２つの好ましい実施形態を含む組成物（薬学的組成物を含む）もまた、好ましい。さらに、表２の第４列および／または第１１列に列挙されるシグナル配列を、異なるシグナル配列（例えば、プロセシングされたアルブミン融合タンパク質の分泌を容易にするために、本明細書中で後に記載されるシグナル配列）で弛緩することは、十分に、当業者の能力の範囲内である。
第７列「配列番号Ｘ」は、所定のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分をコードするポリヌクレオチドが得られ得る親核酸配列を提供する。一実施形態において、アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分をコードするポリヌクレオチドが得られ得るこの親核酸配列は、表Ｉに示される治療用タンパク質をコードする野生型遺伝子配列を含む。代替的実施形態において、アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分をコードするポリヌクレオチドが得られ得るこの親核酸配列は、表Ｉに示される治療用タンパク質をコードする野生型遺伝子配列の改変体もしくは誘導体（例えば、治療用タンパク質をコードする野生型遺伝子配列の、合成コドンで最適化された改変体）を含む。
第８列「配列番号Ｚ」は、親核酸配列（配列番号Ｘ）の推定翻訳物を提供する。この親配列は、特定の構築物を得るために使用される全長親タンパク質、親タンパク質の成熟部分、野生型タンパク質の改変体もしくはフラグメント、または記載される構築物を作製するために使用され得る人工配列であり得る。当業者は、配列番号Ｚに示されるこのアミノ酸配列を使用して、所定の構築物によってコードされるアルブミン融合タンパク質のどのアミノ酸残基が、治療用タンパク質によって提供されるかを決定し得る。さらに、同じ行に記載される構築物を得るために、配列番号Ｚとして示される配列を使用することは、十分に、当業者の能力の範囲内である。例えば、配列番号Ｚが、全長タンパク質に対応するが、そのタンパク質の一部のみが、特定のＣＩＤを生成するために使用される場合、特定のフラグメントを増幅し、適切なベクターにこれをクローニングするために、分子生物学的技術（例えば、ＰＣＲ）によることは、当業者の技術範囲内である。
第９列および第１０列においてそれぞれ提供される増幅プライマー「配列番号Ａ」および「配列番号Ｂ」は、所定のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分をコードする核酸分子を含むかあるいはこれからなるポリヌクレオチドを生成するために使用される例示的プライマーである。本発明の一実施形態において、第９列および第１０列において示される配列（配列番号Ａおよび／またはＢ）を有するオリゴヌクレオチドプライマーは、対応する行の第７列に提供されるヌクレオチド配列（配列番号Ｘ）を含むかあるいはこれからなる核酸分子をテンプレートＤＮＡとして使用して、アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分をコードするポリヌクレオチドをＰＣＲ増幅するために使用される。ＰＣＲ法は、当該分野で十分に確立されている。さらなる有用なプライマー配列は、容易に想定され得、当業者によって利用され得る。
代替的実施形態において、オリゴヌクレオチドプライマーは、テンプレートＤＮＡ配列内に変異を生成するために、重複ＰＣＲ反応において使用され得る。ＰＣＲ法は、当該分野で公知である。
表３に示されるように、本出願において開示される特定のアルブミン融合構築物は、ＡＴＣＣ（登録商標）に寄託されている。
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当該分野で公知の技術および本明細書中他の箇所に記載される技術（例えば、実施例４０を参照のこと）により、寄託物から構築された所定のアルブミン融合構築物を回収することが可能である。ＡＴＣＣは、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ ２０１１０−２２０９，ＵＳＡに存在する。
ＡＴＣＣへの寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタベスト条約の規定に準じてなされた。
本発明のさらなる実施形態において、（１）所定のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、（２）リーダー配列、（３）プロモーター領域、および（４）転写ターミネーターのうちの１つ以上を含むかあるいはそれらからなる「発現カセット」が、１つのベクターから他のベクターへと移動または「サブクローニング」され得る。サブクローニングされるフラグメントは、当該分野で周知の方法（例えば、ＰＣＲ増幅（例えば、配列番号ＡまたはＢに示される配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを用いて）および／または制限酵素消化）により生成され得る。
好ましい実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質は、治療活性および／または治療活性に対応する生物学的活性および／または表１の対応する行に列挙されるアルブミン融合タンパク質の治療タンパク質部分に対応する治療タンパク質の生物学的活性を有し得る。さらに好ましい実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療活性タンパク質部分は表２の配列番号Ｘの列に示される配列によりコードされるタンパク質のフラグメントまたは改変体であり、対応する治療タンパク質の治療活性および／または生物学的活性を有し得る。
（成長ホルモンの非ヒトアルブミン融合タンパク質）
１つの実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質では、非ヒト動物種の１つ以上の血清アルブミンタンパク質が、同じ非ヒト動物種の１つ以上の成長ホルモンタンパク質に、そのＮ末端またはＣ末端のいずれかでタンデムかつインフレームで融合されている。非ヒト血清アルブミンおよび成長ホルモンタンパク質は、当該分野で周知であり、かつ公開されているデータベースにて利用可能である。例えば、表４は、ＧｅｎＢａｎｋにおいて見出される非ヒト血清アルブミン配列（第２列）および非ヒト成長ホルモン配列（第３列）に対応する登録番号を示す。好ましい実施形態において、表４に列挙される非ヒト動物種由来の血清アルブミンタンパク質は、同じ非ヒト動物種由来の成長ホルモンタンパク質に融合される。
特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質では、表４、第２列に列挙される１つ以上のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ血清アルブミンタンパク質が、表４、第３列に列挙される１つ以上のＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ成長ホルモンに、そのＮ末端またはＣ末端でタンデムかつインフレームで融合されている。
非ヒト血清アルブミンのフラグメントまたは改変体（例えば、血清アルブミンの成熟形態）を含む融合タンパク質もまた、本発明により包含される。非ヒト成長ホルモンタンパク質（例えば、成長ホルモンの成熟形態）のフラグメントまたは改変体を含む融合タンパク質もまた、本発明により包含される。好ましくは、非ヒト成長ホルモンフラグメントおよび改変体は、成長活性を保持する。
本発明のポリヌクレオチドは、上記の非ヒトアルブミン融合タンパク質をコードする１つ以上の核酸分子を含むかあるいはそれらからなる。例えば、そのポリヌクレオチドは、対応する非ヒト動物種の非ヒト成長ホルモンタンパク質（例えば、表４、第３列に列挙される成長ホルモン参照配列）をコードする１つ以上の核酸分子を含むかあるいはそれらからなるポリヌクレオチドに、５’または３’のいずれかで、タンデムかつインフレームで融合された、表４、第１列に列挙される非ヒト動物種由来の血清アルブミンタンパク質（
例えば、表４、第２列に列挙される非ヒト血清アルブミン参照配列）をコードする１つ以上の核酸分子を含むかあるいはそれらからなり得る。
上記の非ヒトアルブミン融合タンパク質は、本発明により包含され、これらのポリヌクレオチドを含む宿主細胞およびベクターもまた同様である。１つの実施形態において、上記のポリヌクレオチドによりコードされる非ヒトアルブミン融合タンパク質は、延長された有効期間を有する。さらなる実施形態において、上記のポリヌクレオチドによりコードされる非ヒトアルブミン融合タンパク質は、対応する非融合成長ホルモン分子よりも、インビトロおよび／またはインビボで、溶液（または薬学的組成物）中でより長い血清半減期および／またはより安定した活性を有する。
本発明はまた、非ヒト動物種における疾患または障害を予防、処置、または緩和する方法を包含する。特定の実施形態において、本発明は、獣医学的疾患または障害を処置する方法を包含し、この方法は、このような処置、予防、または緩和が所望される非ヒト動物種に、この疾患または障害を処置、予防、または緩和するのに有効な量で、成長ホルモンタンパク質（またはそのフラグメントもしくは改変体）に対応する成長ホルモン部分を含む本発明のアルブミン融合タンパク質を投与する工程を包含する。処置、予防、または緩和され得る獣医学的疾患および／または障害としては、成長障害（例えば、下垂体性小人症）、皮膚疼痛、肥満、成長ホルモン応答性皮膚疾患、拡張型心筋症、食餌障害、生殖障害、および内分泌障害が挙げられる。
本発明の非ヒトアルブミン融合タンパク質はまた、皮膚創傷、角膜損傷、骨折、および関節、腱、または靱帯の損傷の治療を促進するのに使用され得る。
本発明の非ヒトアルブミン融合タンパク質はまた、製乳動物におけるミルク生成を増加させるために使用され得る。好ましい実施形態において、製乳動物は、乳牛である。
本発明の非ヒトアルブミン融合タンパク質はまた、老化動物における身体の状態を改善するのに使用され得る。
本発明の非ヒトアルブミン融合タンパク質はまた、飼育用動物における受胎、妊娠率、および生殖成功を増加させるのに使用され得る。
本発明の非ヒトアルブミン融合タンパク質はまた、消耗について上昇した動物における赤身 対 脂肪の比を改善するのに、食欲を改善するのに、ならびに身体の大きさおよび成長率を増加させるのに使用され得る。
Figure 2014043448
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（ポリペプチドおよびポリヌクレオチドのフラグメントおよび改変体）
（フラグメント）
本発明はさらに、表１に記載される治療タンパク質、アルブミンタンパク質、および／または本発明のアルブミン融合タンパク質のフラグメントに関する。
本発明はまた、表１に記載される治療タンパク質、アルブミンタンパク質、および／または本発明のアルブミン融合タンパク質のフラグメントをコードするポリヌクレオチドに関する。
タンパク質のＮ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失がその治療タンパク質の１つ以上の生物学的機能の改変または喪失を生じるとしても、アルブミンタンパク質、および／または本発明のアルブミン融合タンパク質、他の治療活性および／または機能活性（例えば、生物学的活性、多量体化する能力、リガンド結合能力）がなおも保持され得る。例えば、このポリペプチドの完全形態または成熟形態を認識する抗体を誘導および／または結合する、Ｎ末端欠失を有するポリペプチドの能力は、完全ポリペプチドの残基の大部分未満がＮ末端から除去される場合に、一般的には保持される。完全ポリペプチドのＮ末端残基を欠く特定のポリペプチドがこのような免疫学的活性を保持するか否かは、本明細書中に記載される慣用的な方法およびそうでなければ当該分野で公知の方法により容易に決定され得る。多くのＮ末端アミノ酸残基が欠失したムテインがいくつかの生物学的活性または免疫学的活性を保持し得る可能性は低い。実際、６アミノ酸残基程度で構成されるペプチドは、しばしば、免疫学的応答を惹起し得る。
従って、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療タンパク質部分に対応する治療タンパク質のフラグメントとしては、全長タンパク質および、１つ以上の残基が参照ポリペプチド（すなわち、表１に示される治療タンパク質、または表２に記載されるポリヌクレオチドまたはアルブミン融合構築物によりコードされるアルブミン融合タンパク質の治療タンパク質部分）のアミノ酸配列のアミノ末端から欠失したポリペプチドが挙げられる。特に、Ｎ末端欠失は、一般式ｍ〜ｑにより記載され得、ここで、ｑは参照ポリペプチド（例えば、表１に示される治療タンパク質、または本発明のアルブミン融合タンパク質の治療タンパク質部分または表２に記載されるポリヌクレオチドまたはアルブミン融合構築物によりコードされるアルブミン融合タンパク質の治療タンパク質部分）中のアミノ酸残基総数を示す全整数であり、そしてｍは２〜ｑ−６の範囲の任意の整数として規定される。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明により包含される。
さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質のアルブミンタンパク質部分に対応する血清アルブミンポリペプチドのフラグメントとしては、全長タンパク質および、１つ以上の残基が参照ポリペプチド（すなわち、血清アルブミン、または表２に記載されるポリヌクレオチドまたはアルブミン融合構築物によりコードされるアルブミン融合タンパク質の血清アルブミン部分）のアミノ酸配列のアミノ末端から欠失したポリペプチドが挙げられる。好ましい実施形態において、Ｎ末端欠失は、一般式ｍ〜５８５により記載され得、ここで、５８５は成熟ヒト血清アルブミン（配列番号１０３８）中のアミノ酸残基総数を示す全整数であり、そしてｍは２〜５７９の範囲の任意の整数として規定される。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明により包含される。さらなる実施形態において、Ｎ末端欠失は、一般式ｍ〜６０９により記載され得、ここで、６０９は全長ヒト血清アルブミン（配列番号１０９４）中のアミノ酸残基総数を示す全整数であり、そしてｍは２〜６０３の範囲の任意の整数として規定される。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明により包含される。
さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質のフラグメントとしては、全長アルブミン融合タンパク質および、１つ以上の残基がアルブミン融合タンパク質（例えば、表２に記載されるポリヌクレオチドまたはアルブミン融合構築物によりコードされるアルブミン融合タンパク質；または表２の第６列に開示されるアミノ酸配列を有するアルブミン融合タンパク質）のアミノ末端から欠失したポリペプチドが挙げられる。特に、Ｎ末端欠失は、一般式ｍ〜ｑにより記載され得、ここで、ｑはアルブミン融合タンパク質中のアミノ酸残基総数を示す全整数であり、そしてｍは２〜ｑ−６の範囲の任意の整数として規定される。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明により包含される。
上述のように、参照ポリペプチド（例えば、治療タンパク質；血清アルブミンタンパク質；または本発明のアルブミン融合タンパク質）のＮ末端またはＣ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失が、そのタンパク質の１つ以上の生物学的機能の改変または喪失を生じるとしても、他の機能活性（例えば、生物学的活性、多量体化する能力、リガンド結合能力）および／または治療活性がなおも保持され得る。例えば、このポリペプチドの完全形態または成熟形態を認識する抗体を誘導および／または結合する、Ｃ末端欠失を有するポリペプチドの能力は、完全ポリペプチドまたは成熟ポリペプチドの残基の大部分未満がＣ末端から除去される場合に、一般的には保持される。参照ポリペプチドのＮ末端残基および／またはＣ末端残基を欠く特定のポリペプチドが治療活性を保持するか否かは、実際には、本明細書中に記載される慣用的な方法および／またはそうでなければ当該分野で公知の方法により容易に決定され得る。
本発明はさらに、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療タンパク質部分（例えば、表１に示される治療タンパク質、または表２に記載されるポリヌクレオチドまたはアルブミン融合構築物によりコードされるアルブミン融合タンパク質の治療タンパク質部分）に対応する治療タンパク質のアミノ酸配列のカルボキシ末端から１つ以上の残基が欠失したポリペプチドを提供する。特にＣ末端欠失は、一般式１〜ｎにより記載され得、ここで、ｎは６〜ｑ−１までの範囲の任意の全整数であり、そしてｑは参照ポリペプチド（例えば、表１に示される治療タンパク質、または表２に記載されるポリヌクレオチドまたはアルブミン融合構築物によりコードされるアルブミン融合タンパク質の治療タンパク質部分）中のアミノ酸残基の総数を表す全整数である。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた本発明により包含される。
さらに、本発明は、本発明のアルブミン融合タンパク質のアルブミンタンパク質部分（例えば、血清アルブミン、または表２に記載されるポリヌクレオチドまたはアルブミン融合構築物によりコードされるアルブミン融合タンパク質のアルブミンタンパク質部分）に対応するアルブミンタンパク質のアミノ酸配列のカルボキシ末端から１つ以上の残基が欠失したポリペプチドを提供する。特に、Ｃ末端欠失は、一般式１〜ｎにより記載され得、ここで、ｎは６〜５８４までの範囲の任意の全整数であり、ここで５８４は成熟ヒト血清アルブミン（配列番号１０３８）中のアミノ酸残基の総数−１を表す全整数である。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた本発明により包含される。特にＣ末端欠失は、一般式１〜ｎにより記載され得、ここで、ｎは６〜６０８までの範囲の任意の全整数であり、ここで６０８は血清アルブミン（配列番号１０９４）中のアミノ酸残基の総数−１を表す全整数である。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた本発明により包含される。
さらに、本発明は、本発明のアルブミン融合タンパク質のカルボキシ末端から１つ以上の残基が欠失したポリペプチドを提供する。特にＣ末端欠失は、一般式１〜ｎにより記載され得、ここで、ｎは６〜ｑ−１までの範囲の任意の全整数であり、そしてｑは本発明のアルブミン融合タンパク質中のアミノ酸残基の総数を表す全整数である。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた本発明により包含される。
さらに、上記のＮ末端欠失またはＣ末端欠失のいずれかは、Ｎ末端およびＣ末端欠失参照ポリペプチドを生成するために組み合わされ得る。本発明はまた、アミノ末端およびカルボキシル末端の両方から１つ以上のアミノ酸が欠失したポリペプチドを提供する。このポリペプチドは、参照ポリペプチド（例えば、表１に示される治療タンパク質、または本発明のアルブミン融合タンパク質の治療タンパク質部分、または表２に記載されるポリヌクレオチドもしくはアルブミン融合構築物によりコードされる治療タンパク質部分、または血清アルブミン（例えば、配列番号１０３８）、または本発明のアルブミン融合タンパク質のアルブミンタンパク質部分、または表２に記載されるポリヌクレオチドもしくはアルブミン融合構築物によりコードされるアルブミンタンパク質部分、またはアルブミン融合タンパク質、または本発明のポリヌクレオチドもしくはアルブミン融合構築物によりコードされるアルブミン融合タンパク質）の残基ｍ〜ｎを有すると一般的に記載され得る。
ここで、ｎおよびｍは、上記のような整数である。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた本発明により包含される。
本発明の適用はまた、本明細書中に示される参照ポリペプチド配列（表１に示される治療タンパク質、または本発明のアルブミン融合タンパク質の治療タンパク質部分、または表２に記載されるポリヌクレオチドもしくはアルブミン融合構築物によりコードされる治療タンパク質部分、または血清アルブミン（例えば、配列番号１０３８）、または本発明のアルブミン融合タンパク質のアルブミンタンパク質部分、または表２に記載されるポリヌクレオチドもしくはアルブミン融合構築物によりコードされるアルブミンタンパク質部分、またはアルブミン融合タンパク質、または本発明のポリヌクレオチドもしくはアルブミン融合構築物によりコードされるアルブミン融合タンパク質）と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のポリペプチドを含むタンパク質、またはそのフラグメントに関する。好ましい実施形態において、その適用は、上記のようなＮ末端欠失およびＣ末端欠失のアミノ酸配列を有する参照ポリペプチドと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のポリペプチドを含むタンパク質に関する。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた本発明により包含される。
本発明の好ましいポリペプチドフラグメントは、そのアミノ酸配列がフラグメントである治療タンパク質または血清アルブミンタンパク質のポリペプチド配列の治療活性および／または機能活性（例えば、生物学的活性）を示すアミノ酸配列を含むかあるいはそれらからなる。
他の好ましいポリペプチドフラグメントは、生物学的に活性なフラグメントである。生物学的に活性なフラグメントは、本発明のポリペプチドの活性と類似するが、必ずしも同一でない活性を示すフラグメントである。このフラグメントの生物学的活性は、改善された所望の活性または減少した望ましくない活性を含み得る。
（改変体）
「改変体」とは、参照核酸またはポリペプチドとは異なるがそれらの本質的な特性は保持している、ポリヌクレオチドまたは核酸をいう。一般的に、改変体は全体的に非常に類似しており、そして、多くの領域において、参照核酸またはポリペプチドと同一である。
本明細書中で使用される場合、「改変体」とは、それぞれ治療的タンパク質（例えば、表１の「治療的」欄を参照のこと）、アルブミンタンパク質、および／またはアルブミン融合タンパク質と配列が異なるが、本明細書の他の箇所に記載されるかそうでなければ当該分野で公知のような、その少なくとも１つの機能的特性および／または治療的特性を保持している、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療的タンパク質部分、本発明のアルブミン融合タンパク質のアルブミン部分、または本発明のアルブミン融合タンパク質をいう。一般的に、改変体は、全体的に非常に類似しており、そして多くの領域において、アルブミン融合タンパク質の治療的タンパク質部分に対応する治療的タンパク質、アルブミン融合タンパク質のアルブミンタンパク質部分に対応するアルブミンタンパク質、および／またはアルブミン融合タンパク質のアミノ酸配列と同一である。これらの改変体をコードする核酸はまた、本発明に包含される。
本発明はまた、例えば、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療的タンパク質部分に対応する治療的タンパク質のアミノ酸配列（例えば、表１に開示される治療的タンパク質：Ｘのアミノ酸配列；または表１および２に記載されるポリヌクレオチドもしくはアルブミン融合構築物によりコードされるアルブミン融合タンパク質の治療的タンパク質部分のアミノ酸配列、またはそのフラグメントもしくは改変体）、本発明のアルブミン融合タンパク質のアルブミンタンパク質部分に対応するアルブミンタンパク質のアミノ酸配列（例えば、表１および２に記載されるポリヌクレオチドもしくはアルブミン融合構築物によりコードされるアルブミン融合タンパク質のアルブミンタンパク質部分のアミノ酸配列；配列番号１０３８に示されるアミノ酸配列；またはそれらのフラグメントもしくは改変体）、および／またはアルブミン融合タンパク質のアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または少なくとも１００％同一なアミノ酸配列を含むか、あるいはこれらのアミノ酸配列からなるタンパク質に関する。これらのポリペプチドのフラグメントもまた提供される（例えば、本明細書中に記載されるフラグメント）。本発明に含まれるさらなるポリペプチドは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で（例えば、６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中で、約４５℃で、フィルター結合ＤＮＡに対してハイブリダイゼーションし、その後０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で、約５０〜６５℃で１回以上洗浄する）、高度にストリンジェントな条件下で（例えば、６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中で、約４５℃で、フィルター結合ＤＮＡに対してハイブリダイゼーションし、その後０．１×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ中で、約６８℃で１回以上洗浄する）、または当業者に公知である他のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら編、１９８９、Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎ ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．およびＪｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．、６．３．１〜６．３．６および２．１０．３頁を参照のこと）、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードする核酸分子の相補体にハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドである。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明に含まれる。
問い合わせアミノ酸配列に、例えば、少なくとも９５％「同一」であるアミノ酸配列を有するポリペプチドにより、対象ポリペプチド配列が、問い合わせアミノ酸配列の各１００個のアミノ酸あたり５つまでのアミノ酸の変更を含み得ることを除いて、対象ポリペプチドのアミノ酸配列が問い合わせ配列に同一であることが意図される。換言すれば、問い合わせアミノ酸配列に少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るために、対象配列におけるアミノ酸残基の５％までが、挿入されても、欠失されても、別のアミノ酸で置換されてもよい。参照配列のこれらの改変は、参照アミノ酸配列のアミノ末端位置もしくはカルボキシ末端位置で生じ得るか、または参照配列中の残基間で個々に、もしくは参照配列内の１つ以上の連続する群においてのいずれかで散在される、それらの末端位置の間のどこにでも生じ得る。
実際問題として、任意の特定のポリペプチドが、例えば、本発明のアルブミン融合タンパク質またはそのフラグメント（例えば、アルブミン融合タンパク質の治療的タンパク質部分またはアルブミン融合タンパク質のアルブミン部分）のアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるか否かは、従来的に、公知のコンピュータープログラムを使用して決定され得る。問い合わせ配列（本発明の配列）と対象配列との間での最良の全体的な一致を決定するための好ましい方法（全体的配列整列とも呼ばれる）は、Ｂｒｕｔｌａｇら（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．６：２３７−２４５（１９９０））のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータープログラムを使用して決定され得る。配列整列において、問い合わせ配列および対象配列は、両方ともヌクレオチド配列であるかまたは両方ともアミノ酸配列であるかのいずれかである。上記の全体的配列整列の結果は、同一性パーセントで示される。ＦＡＳＴＤＢアミノ酸整列に用いられる好ましいパラメーターは：Ｍａｔｒｉｘ＝ＰＡＭ ０、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝２、Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｐｅｎａｌｔｙ＝１、Ｊｏｉｎｉｎｇ Ｐｅｎａｌｔｙ＝２０、Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ Ｇｒｏｕｐ Ｌｅｎｇｔｈ＝０、Ｃｕｔｏｆｆ Ｓｃｏｒｅ＝１、Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ ＝ 配列の長さ、Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａｐ Ｓｉｚｅ Ｐｅｎａｌｔｙ ＝ ０．０５、Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ＝５００または対象アミノ酸配列の長さ（どちらかより短い方）である。
対象配列が、Ｎ末端またはＣ末端欠失により（内部の欠失のためではなく）問い合わせ配列よりも短い場合、手動の補正が結果に対してなされなければならない。これは、ＦＡＳＴＤＢプログラムが、全体的な同一性パーセントを算定する場合に、対象配列のＮ末端開裂およびＣ末端切断を考慮しないからである。問い合わせ配列に比べて、Ｎ末端およびＣ末端で短縮されている対象配列について、同一性パーセントは、問い合わせ配列の総塩基のパーセントとして、対応する対象残基と一致／整列しない、対象配列のＮ末端およびＣ末端である問い合わせ配列の残基の数を計算することによって補正される。残基が一致／整列されているか否かは、ＦＡＳＴＤＢ配列整列の結果によって決定される。次いで、このパーセントは、上記のＦＡＳＴＤＢプログラムによって特定のパラメーターを使用して計算された同一性パーセントから差し引かれ、最終的な同一性パーセントのスコアに到達する。この最終的な同一性パーセントのスコアは、本発明の目的のために使用されるものである。問い合わせ配列と一致／整列していない対象配列のＮ末端およびＣ末端側の残基のみが、同一性パーセントのスコアを手動で調整する目的のために考慮される。すなわち、問い合わせ残基のみが、対象配列の最も遠いＮ末端およびＣ末端の残基の外側に位置する。
例えば、９０アミノ酸残基の対象配列は、同一性パーセントを決定するために１００残基の問い合わせ配列と整列される。欠失が対象配列のＮ末端で生じ、それゆえＦＡＳＴＤＢ整列は、Ｎ末端での最初の１０残基の一致／整列を示さない。１０個の不対合残基は、配列の１０％（一致していないＮ末端およびＣ末端での残基の数／問い合わせ配列中の残基の総数）に相当するので、ＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算される同一性パーセントのスコアから１０％が差し引かれる。残りの９０残基が完全に一致した場合、最終的な同一性パーセントは９０％である。別の例において、９０残基の対象配列が、１００残基の問い合わせ配列と比較される。この場合、欠失は、内部欠失であり、そのため問い合わせ配列と一致／整列しない対象配列のＮ末端またはＣ末端の残基は存在しない。この場合、ＦＡＳＴＤＢによって算定される同一性パーセントは、手動で補正されない。再び、ＦＡＳＴＤＢ整列において示される、問い合わせ配列と一致／整列しない対象配列のＮ末端およびＣ末端の外の残基位置のみが手動で補正される。他の手動の補正は、本発明の目的のためにはなされない。
改変体は、この改変体と同じ長さの正常ＨＡまたは治療的タンパク質の長さと少なくとも７５％（好ましくは少なくとも約８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％）の配列同一性を通常有する。ヌクレオチドまたはアミノ酸の配列レベルの相同性または同一性は、配列類似性検索用に調整されたプログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘにより使用されるアルゴリズムを使用するＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）分析（Ｋａｒｌｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４−２２６８（１９９０）およびＡｌｔｓｃｈｕｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３６：２９０−３００（１９９３）（参考として援用される））により決定される。
ＢＬＡＳＴプログラムにより使用されるアプローチは、最初に問い合わせ配列とデータベース配列との間で類似のセグメントを考慮し、次いで同定される全てのマッチの統計学的有意性を評価し、そして最終的に有意性の予め選択した閾値を満足するマッチのみをまとめることである。配列データベースの類似性検索における基本的な問題の考察については、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ６：１１９−１２９（１９９４））（全て参考として援用される）を参照のこと。ヒストグラム、説明、整列、期待値（すなわち、データベース配列に対してマッチを報告するための統計的に有意な閾値）、カットオフ、マトリックスおよびフィルターについての検索パラメーターは、デフォルトの設定である。ｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ、およびｔｂｌａｓｔｘにより使用されるデフォルトスコアリングマトリックスは、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５−１０９１９（１９９２）（全て参考として援用される））である。ｂｌａｓｔｎについては、スコアリングマトリックスは、Ｍ（すなわち、一対のマッチした残基についての見返り（ｒｅｗａｒｄ）スコア）対Ｎ（すなわち、ミスマッチ残基についてのペナルティスコア）の比により設定される（ここで、ＭおよびＮについてのデフォルト値は、それぞれ５および−４である）。４つのｂｌａｓｔｎパラメーターは、以下のように調整され得る：Ｑ＝１０（ギャップ生成ペナルティ）；Ｒ＝１０（ギャップ伸長ペナルティ）；ｗｉｎｋ＝１（問い合わせ配列に沿ってｗｉｎｋ番目の位置毎にワードヒットを生じる）；およびｇａｐｗ＝１６（ギャップアラインメントが生成されるウインドウ幅を設定する）。等価なＢｌａｓｔｐパラメーター設定は、Ｑ＝９；Ｒ＝２；ｗｉｎｋ＝１；およびｇａｐｗ＝３２であった。ＧＣＧパッケージバージョン１０．０において利用可能な配列間のＢｅｓｔｆｉｔ比較は、ＤＮＡパラメーターＧＡＰ＝５０（ギャップ生成ペナルティ）およびＬＥＮ＝３（ギャップ伸長ペナルティ）を使用し、そしてタンパク質比較における等価設定は、ＧＡＰ＝８およびＬＥＮ＝２である。
本発明のポリヌクレオチド改変体は、コード領域、非コード領域、またはその両方における変化を含み得る。特に好ましいものは、サイレントな置換、付加、または欠失を生成するが、コードされるポリペプチドの特性または活性を変化させない変化を含むポリヌクレオチド改変体である。遺伝コードの縮重に起因するサイレントな置換によって生成されるヌクレオチド改変体が、好ましい。さらに、任意の組合せにおいて５０個未満、４０個未満、３０個未満、２０個未満、１０個未満、または５〜５０個、５〜２５個、５〜１０個、１〜５個、もしくは１〜２個のアミノ酸が置換、欠失、または付加されるポリペプチド改変体もまた、好ましい。ポリヌクレオチド改変体は、種々の理由（例えば、特定の宿主についてのコドン発現を至適化するため（ヒトｍＲＮＡにおけるコドンを、酵母またはＥ．ｃｏｌｉのような細菌宿主に好ましいコドンに変化させる））のために、生成され得る。
好ましい実施形態において、アルブミン融合タンパク質のアルブミン部分をコードする本発明のポリヌクレオチドは、酵母または哺乳動物細胞における発現のために最適化される。さらなる好ましい実施形態において、アルブミン融合タンパク質の治療的タンパク質部分をコードする本発明のポリヌクレオチドは、酵母または哺乳動物細胞における発現のために最適化される。なおさらなる好ましい実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、酵母または哺乳動物細胞における発現のために最適化される。
代替の実施形態において、アルブミン融合タンパク質の治療的タンパク質部分をコードするコドン最適化ポリヌクレオチドは、本明細書中に記載されるようなストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下では、治療的タンパク質をコードする野生型ポリヌクレオチドにハイブリダイズしない。さらなる実施形態において、アルブミン融合タンパク質のアルブミン部分をコードするコドン最適化ポリヌクレオチドは、本明細書中に記載されるストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でアルブミンタンパク質をコードする野生型ポリヌクレオチドにハイブリダイズしない。別の実施形態において、アルブミン融合タンパク質をコードするコドン最適化ポリヌクレオチドは、本明細書中に記載されるストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で治療的タンパク質部分またはアルブミンタンパク質部分をコードする野生型ポリヌクレオチドにハイブリダイズしない。
さらなる実施形態において、アルブミン融合タンパク質の治療的タンパク質部分をコードするポリヌクレオチドは、その治療的タンパク質の天然に存在する配列を含まないか、あるいはその配列から構成されない。さらなる実施形態において、アルブミン融合タンパク質のアルブミンタンパク質部分をコードするポリヌクレオチドは、アルブミンタンパク質の天然に存在する配列を含まないか、あるいはその配列から構成されない。代替の実施形態において、アルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、治療的タンパク質部分またはアルブミンタンパク質部分の天然に存在する配列を含まないか、その配列から構成されない。
天然に存在する改変体は、「対立遺伝子改変体」と呼ばれ、そして生物の染色体上の所定の遺伝子座を占有する遺伝子のいくつかの代替の形態のうちの１つをいう。（Ｇｅｎｅｓ ＩＩ、Ｌｅｗｉｎ，Ｂ．，編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８５））。これらの対立遺伝子改変体は、ポリヌクレオチドレベルおよび／またはポリペプチドレベルのいずれかで変化し得、そして本発明に含まれる。あるいは、天然に存在しない改変体は、変異誘発技術によってまたは直接的な合成によって生成され得る。
タンパク質工学および組換えＤＮＡ技術の公知の方法を使用して、改変体は、本発明のポリペプチドの特性を改善または変化させるために作製され得る。例えば、１つ以上のアミノ酸は、生物学的機能を実質的に損失することなく本発明のポリペプチドのＮ末端またはＣ末端から欠失され得る。例として、Ｒｏｎら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２９８４−２９８８（１９９３））は、３、８、または２７個のアミノ末端のアミノ酸残基を欠失させた後でさえもヘパリン結合活性を有する改変体ＫＧＦタンパク質を報告した。
同様に、インターフェロンγは、このタンパク質のカルボキシ末端から８〜１０個のアミノ酸残基を欠失させた後、１０倍までのより高い活性を示した（Ｄｏｂｅｌｉら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：１９９−２１６（１９８８））。
さらに、豊富な証拠は、改変体が、天然に存在するタンパク質の生物学的活性に類似する活性をしばしば保持することを実証する。例えば、Ｇａｙｌｅおよび共同研究者ら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２２１０５−２２１１１（１９９３））は、ヒトサイトカインＩＬ−１ａの広範囲にわたる変異分析を行った。彼らは、ランダムな変異誘発を使用して、分子の全長にわたって改変体当たり平均２．５アミノ酸の変化になる、３，５００個を超える個々のＩＬ−１ａ改変体を作製した。複数の変異が、全ての可能なアミノ酸の位置で試験された。この研究者らは、「分子の大部分は、［結合活性または生物学的活性］のいずれに対してもほとんど影響を伴わないで変化され得る」ことを見出した。実際、試験された３，５００個を超えるヌクレオチド配列のうち、わずか２３個の独特なアミノ酸配列が、野生型と活性が有意に異なるタンパク質を生成した。
さらに、ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失が、１つ以上の生物学的機能の改善または損失を生じたとしても、他の生物学的活性はなお保持され得る。例えば、分泌される形態を認識する抗体を誘導および／または結合する、欠失改変体の能力は、分泌される形態の過半数より少ない残基が、Ｎ末端またはＣ末端から除去される場合に保持されるようである。タンパク質のＮ末端またはＣ末端残基を欠損する特定のポリペプチドが、このような免疫原性活性を保持するか否かは、本明細書中に記載される慣用的な方法、およびそうでなければ当該分野において公知の慣用的な方法によって容易に決定され得る。
従って、本発明は、機能的活性（例えば、生物学的活性および／または治療的活性）を有するポリペプチド改変体をさらに含む。一実施形態において、本発明は、アルブミン融合タンパク質の治療的タンパク質部分に対応する治療的タンパク質の１つ以上の生物学的活性および／または治療的活性に対応する機能的活性（例えば、生物学的活性および／または治療的活性）を有するアルブミン融合タンパク質の改変体を提供する。別の実施形態において、本発明は、アルブミン融合タンパク質の治療タンパク質部分に対応する治療タンパク質の１つ以上の生物学的および／または治療的活性に対応する機能的活性（例えば、生物学的活性および／または治療的活性）を有するアルブミン融合タンパク質の改変体を提供する。このような改変体は、当該分野で公知の一般的規則に従って、活性に対してほとんど影響を及ぼさないように選択される、欠失、挿入、反転、反復、および置換を含む。このような改変体をコードするポリヌクレオチドもまた、本発明に含まれる。
好ましい実施形態において、本発明の改変体は、保存的置換を有する。「保存的置換」により、以下のようなグループ内の交換を意図する：脂肪族または疎水性のアミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅの置換；ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの置換；酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの置換；アミド残基ＡｓｎおよびＧｌｎの置換、塩基性残基Ｌｙｓ、Ａｒｇ、およびＨｉｓの置換；芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、およびＴｒｐの置換、ならびに小さいサイズのアミノ酸Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、およびＧｌｙの置換。
表現型的にサイレントなアミノ酸置換を作製する方法に関する指針は、例えば、Ｂｏｗｉｅら、「Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｅｓｓａｇｅ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３０６−１３１０（１９９０）において提供され、ここで、著者らは、変化に対するアミノ酸配列の寛容性を研究するための２つの主要なストラテジーがあることを指摘する。
第１のストラテジーは、進化の過程の間の自然選択によるアミノ酸置換の寛容を利用する。異なる種におけるアミノ酸配列を比較することにより、保存されるアミノ酸が同定され得る。これらの保存されたアミノ酸は、タンパク質の機能について重要であるようである。対照的に、置換が自然選択によって寛容されたアミノ酸の位置は、これらの位置がタンパク質の機能に重要ではないことを示す。従って、アミノ酸置換を寛容する位置は、タンパク質の生物学的活性をなおも維持しながら改変され得る。
第２のストラテジーは、タンパク質機能に重要な領域を同定するために、クローン化された遺伝子の特定の位置でアミノ酸変化を導入するための遺伝子工学を使用する。例えば、部位特異的変異誘発またはアラニンスキャニング変異誘発（分子中の各残基毎に１つのアラニン変異の導入）が、使用され得る。ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１−１０８５（１９８９）を参照のこと。次いで、得られた変異体分子は生物学的活性について試験され得る。
著者らが言及するように、これらの２つのストラテジーは、タンパク質がアミノ酸置換に驚くほど寛容であることを明らかにした。著者らはさらに、どのアミノ酸変化が、タンパク質中の特定のアミノ酸位置で許容されるようであるかを示す。例えば、（タンパク質の三次構造内に）ほとんど埋もれているアミノ酸残基は、非極性側鎖を必要とするが、表面側鎖の特徴は、一般にほとんど保存されない。さらに、寛容される保存的なアミノ酸置換は、脂肪族または疎水性アミノ酸のＡｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅの置換；ヒドロキシル残基のＳｅｒおよびＴｈｒの置換；酸性残基のＡｓｐおよびＧｌｕの置換；アミド残基のＡｓｎおよびＧｌｎの置換、塩基性残基のＬｙｓ、Ａｒｇ、およびＨｉｓの置換；芳香族残基のＰｈｅ、Ｔｙｒ、およびＴｒｐの置換、ならびに小さなサイズのアミノ酸のＡｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、およびＧｌｙの置換を含む。保存的なアミノ酸置換に加えて、本発明の改変体は、（ｉ）１つ以上の非保存的なアミノ酸残基の置換（ここでは置換されるアミノ酸残基は、遺伝コードによってコードされるアミノ酸残基であってもそうでなくてもよい）を含むポリペプチド、または（ｉｉ）置換基を有する１つ以上のアミノ酸残基の置換を含むポリペプチド、または（ｉｉｉ）別の化合物（例えば、ポリペプチドの安定性および／もしくは可溶性を増加するための化合物（例えば、ポリエチレングリコール））と融合もしくは化学的に結合体化されたポリペプチド、（ｉｖ）さらなるアミノ酸（例えば、ＩｇＧ Ｆｃ融合領域ペプチド）を含むポリペプチドを含む。このような改変体ポリペプチドは、本明細書中の教示から、当業者の範囲内であると考えられる。
例えば、他の荷電したアミノ酸または中性のアミノ酸での荷電したアミノ酸のアミノ酸置換を含むポリペプチド改変体は、改善された特性（例えば、より少ない凝集性）を有するタンパク質を生成し得る。薬学的処方物の凝集は、凝集体の免疫原活性に起因して、活性の減少およびクリアランスの増加の両方をもたらす。Ｐｉｎｃｋａｒｄら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：３３１−３４０（１９６７）；Ｒｏｂｂｉｎｓら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ３６：８３８−８４５（１９８７）；Ｃｌｅｌａｎｄら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ １０：３０７−３７７（１９９３）を参照のこと。
特定の実施形態において、本発明のポリペプチドは、アルブミン融合タンパク質のアミノ酸配列、治療的タンパク質および／またはヒト血清アルブミンのアミノ酸配列のフラグメントまたは改変体を含むか、あるいはこれらのアミノ酸配列からなり、ここでこのフラグメントまたは改変体は、参照アミノ酸配列と比較した場合に、１〜５、５〜１０、５〜２５、５〜５０、１０〜５０、または５０〜１５０のアミノ酸残基の付加、置換、および／または欠失を有する。好ましい実施形態において、このアミノ酸置換は保存的である。
これらのポリペプチドをコードする核酸もまた、本発明に含まれる。
本発明のポリペプチドは、ペプチド結合または改変されたペプチド結合、すなわち、ペプチドアイソスター（ｉｓｏｓｔｅｒｅ）によって互いに連結したアミノ酸から構成され得、そして遺伝子がコードする２０個のアミノ酸以外のアミノ酸を含み得る。このポリペプチドは、翻訳後プロセシングのような天然のプロセスによって、または当該技術分野で周知の化学改変技術によってのいずれかで、改変され得る。このような改変は、基本テキスト、およびより詳細な研究論文、ならびに多くの研究文献に十分記載される。改変は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖、およびアミノ末端またはカルボキシル末端を含む、ポリペプチドのどこにでも生じ得る。同じ型の改変が、所定のポリペプチド中のいくつかの部位で同じまたは種々の程度で存在し得ることが理解される。また、所定のポリペプチドは多くの型の改変を含み得る。ポリペプチドは、例えば、ユビキチン化の結果として分枝状であり得、そしてポリペプチドは、分枝を含むかまたは含まない、環状であり得る。環状、分枝状および分枝した環状のポリペプチドは、天然の翻訳後プロセスから生じ得るか、または合成方法によって作製され得る。改変としては、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトール（ｐｈｏｓｐｈｏｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ）の共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、水酸化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペグ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化のようなタンパク質へのアミノ酸のトランスファーＲＮＡ媒介付加、およびユビキチン化が挙げられる。（例えば、ＰＲＯＴＥＩＮＳ−ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ，第２版，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）；ＰＯＳＴ−ＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮＡＬ ＣＯＶＡＬＥＮＴ ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ，Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１−１２頁（１９８３）；Ｓｅｉｆｔｅｒら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８２：６２６−６４６（１９９０）；Ｒａｔｔａｎら，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６３：４８−６２（１９９２）を参照のこと）。
（機能的活性）
「機能的活性を有するポリペプチド」とは、治療的タンパク質の全長形態、プロタンパク質形態、および／または成熟形態に関連する１以上の既知の機能的活性を示し得るポリペプチドをいう。このような機能的活性としては、生物学的活性、抗原性［抗ポリペプチド抗体に結合（または結合についてポリペプチドと競合）する能力］、免疫原性（本発明の特定のポリペプチドに結合する抗体を生成する能力）、本発明のポリペプチドとマルチマーを形成する能力、およびポリペプチドについてのレセプターまたはリガンドに結合する能力が挙げられるがこれらに限定されない。
「生物学的活性を有するポリペプチド」とは、特定の生物学的アッセイにおいて測定した場合に、用量依存性ありまたはなしで、本発明の治療的タンパク質の活性と類似の活性であるが、その活性と必ずしも同一でない活性を示すポリペプチド（成熟形態を含む）をいう。用量依存性が存在する場合、用量依存性は、そのポリペプチドの用量依存性と同一である必要はなく、むしろ本発明のポリペプチドと比較した場合の所定の活性における用量依存性と実質的に類似である（すなわち、候補ポリペプチドは、本発明のポリペプチドと比較してより高い活性、または約１／２５以下、好ましくは１／１０以下、そして最も好ましくは、約１／３以下の活性を示す）。
好ましい実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質は、アルブミンに融合されない場合の治療的タンパク質部分（またはそのフラグメントもしくは改変体）に関連する少なくとも１つの生物学的活性および／または治療的活性を有する。
本発明のアルブミン融合タンパク質は、当該分野で公知のアッセイおよび本明細書中に記載されるアッセイを使用するかそれらを慣用的に改変して、機能的活性（例えば、生物学的活性）についてアッセイされ得る。さらに、当業者は、表１の対応する列（例えば、表１の３欄）に言及されるアッセイを使用して、活性についてアルブミン融合タンパク質の治療的タンパク質部分に対応する治療的タンパク質のフラグメントを慣用的にアッセイし得る。さらに、当業者は、当該分野で公知のアッセイを使用して、かつ／または以下の実施例の項に記載されるアッセイを使用して活性についてアルブミン融合タンパク質のアルブミンタンパク質部分に対応するアルブミンタンパク質のフラグメントを慣用的にアッセイし得る。
例えば、アルブミン融合タンパク質が治療的タンパク質に結合するかまたは抗治療的ポリペプチド抗体および／または抗アルブミン抗体への結合についてこの治療タンパク質と競合する能力についてアッセイする、１つの実施形態において、当該分野で公知の種々の免疫アッセイが、用いられ得る。このようなアッセイとしては、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫放射分析アッセイ、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、インサイチュ免疫アッセイ（例えば、コロイド金、酵素または放射性同位体標識を用いる）、ウェスタンブロット、沈降反応、凝集アッセイ（例えば、ゲル凝集アッセイ、血球凝集アッセイ）、補体結合アッセイ、免疫蛍光アッセイ、プロテインＡアッセイ、および免疫電気泳動アッセイなどのような技術を用いる競合アッセイ系および非競合アッセイ系が挙げられるが、これらに限定されない。１つの実施形態では、抗体結合が、一次抗体上の標識を検出することによって検出される。別の実施形態では、この一次抗体は、この一次抗体に対する二次抗体または試薬の結合を検出することによって検出される。さらなる実施形態では、この二次抗体が標識される。多くの手段が、免疫アッセイにおける結合の検出について当該分野で公知であり、そして本発明の範囲内である。
好ましい実施形態において、治療的タンパク質の結合パートナー（例えば、レセプターまたはリガンド）が同定される場合、例えば、還元および非還元ゲルクロマトグラフィー、タンパク質アフィニティークロマトグラフィー、ならびにアフィニティーブロッティングのような当該分野で周知の手段によって、融合物の治療的タンパク質部分としてその治療的タンパク質を含むアルブミン融合タンパク質による結合パートナーへの結合が、アッセイされ得る。一般には、Ｐｈｉｚｉｃｋｙら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５９：９４−１２３（１９９５）を参照のこと。別の実施形態では、融合物の治療的タンパク質部分に対応する治療的ポリペプチドの基質に結合する、アルブミン融合タンパク質の生理学的相関の能力が、当該分野で公知の技術を使用して慣用的にアッセイされ得る。
代替の実施形態において、アルブミン融合タンパク質の多量体化する能力が評価されている場合、その多量体の他の成分との会合は、例えば、当該分野で周知の手段（例えば、還元および非還元のゲルクロマトグラフィー、タンパク質アフィニティークロマトグラフィー、ならびにアフィニティブロッティング）によりアッセイされ得る。一般的には、Ｐｈｉｚｉｃｋｙら（前出）を参照のこと。
好ましい実施形態において、治療的タンパク質に結合する抗体の全てまたは一部をふくむアルブミン融合タンパク質は、アルブミンに融合されていない場合の治療的タンパク質（またはそのフラグメントもしくは改変体）に結合する抗体に関連する少なくとも１つの生物学的活性および／または治療的活性（例えば、ポリペプチドまたはエピトープに特異的に結合すること）を有する。他の好ましい実施形態において、治療的タンパク質に結合する抗体の全てまたは一部を含むアルブミン融合タンパク質の生物学的活性および／または治療的活性は、治療的タンパク質に結合する抗体により特異的に結合されるポリペプチドに関連する生物学的活性および／または治療的活性の１つ以上の阻害（すなわち、拮抗作用）または活性化（すなわち、アゴニスト作用）である。
治療的タンパク質に結合する抗体の少なくとも１つのフラグメントまたは改変体を含むアルブミン融合タンパク質は、種々の方法で特徴付けされ得る。特に、治療的タンパク質に結合する抗体の少なくとも１つのフラグメントまたは改変体を含むアルブミン融合タンパク質は、アルブミン融合タンパク質の治療的タンパク質部分に対応する治療的タンパク質に結合する抗体により特異的に結合される同じ抗原に特異的に結合する能力について、本明細書中に記載される技術を使用して、または当該分野で公知の技術を慣用的に改変してアッセイされ得る。
アルブミン融合タンパク質（例えば、治療的タンパク質に結合する抗体の少なくとも１つのフラグメントまたは改変体を含む）の、特定のタンパク質またはエピトープに（特異的に）結合する能力についてのアッセイが、溶液において（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：４１２−４２１（１９９２））、ビーズ上で（例えば、Ｌａｍ、Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２−８４（１９９１））、チップ上で（例えば、Ｆｏｄｏｒ、Ｎａｔｕｒｅ ３６４：５５５−５５６（１９９３））、細菌上で（例えば、米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子上で（例えば、米国特許第５，５７１，６９８；５，４０３，４８４；および５，２２３，４０９）、プラスミド上で（例えば、Ｃｕｌｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１８６５−１８６９（１９９２））、またはファージ上で（例えば、ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６−３９０（１９９０）；Ｄｅｖｌｉｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：４０４−４０６（１９９０）；Ｃｗｉｒｌａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：６３７８−６３８２（１９９０）；ならびにＦｅｌｉｃｉ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３０１−３１０（１９９１））（これらの参考文献の各々は、その全体が、本明細書中に参考として援用される）、実施され得る。治療的抗体の少なくとも１つのフラグメントまたは改変体を含むアルブミン融合タンパク質はまた、特定のタンパク質またはエピトープについてのそれらの特異性および親和性について、本明細書中に記載される技術または当該分野で公知の他の方法を使用するか、慣用的に改変してアッセイされ得る。
治療的タンパク質に結合する抗体の少なくとも１つのフラグメントまたは改変体を含むアルブミン融合タンパク質は、他の抗原（例えば、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療的タンパク質部分に対応する治療的タンパク質（またはそのフラグメントもしくは改変体）に結合する抗体により特異的に結合される分子との配列／構造保存性を有する分子）との交差反応性について当該分野で公知の任意の方法によりアッセイされ得る。
（免疫特異的）結合および交差反応性を分析するために使用され得る免疫アッセイとしては、少し例を挙げれば、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射定量アッセイ、蛍光免疫アッセイ、およびプロテインＡ免疫アッセイのような技術を用いる競合アッセイ系および非競合アッセイ系が挙げられるが、これらに限定されない。このようなアッセイは慣用的であり、そして当該分野において周知である（例えば、その全体が本明細書中に参考として援用される、Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと）。例示的な免疫アッセイが、以下に簡潔に記載される（が、これらは限定を目的とすることが意図されない）。
免疫沈降プロトコルは、一般に、タンパク質ホスファターゼインヒビターおよび／またはプロテアーゼインヒビター（例えば、ＥＤＴＡ、ＰＭＳＦ、アプロチニン、バナジン酸ナトリウム）を補充したＲＩＰＡ緩衝液（１％ ＮＰ−４０またはＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１％ デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ ＳＤＳ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１Ｍ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）、１％ Ｔｒａｓｙｌｏｌ）のような溶解緩衝液中で、細胞の集団を溶解する工程、本発明のアルブミン融合タンパク質（例えば、治療的タンパク質に結合する抗体の少なくとも１つのフラグメントまたは改変体を含む）を細胞溶解物に添加する工程、一定時間（例えば、１〜４時間）４０℃でインキュベートする工程、例えば、抗アルブミン抗体に結合したセファロースビーズを細胞溶解物に添加する工程、約１時間以上４０℃でインキュベートする工程、溶解緩衝液中でビーズを洗浄する工程、およびＳＤＳ／サンプル緩衝液中でビーズを再懸濁する工程を包含する。アルブミン融合タンパク質の、特定の抗原を免疫沈降する能力は、例えば、ウェスタンブロット分析により、アッセイされ得る。当業者は、アルブミン融合タンパク質の抗原への結合を増加するように、そしてバックグラウンドを減少させる（例えば、セファロースビーズを用いて細胞溶解物を事前にきれいにすること）ように改変され得るパラメーターに関して、知識があり得る。免疫沈降プロトコルに関するさらなる考察については、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９９４、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１０．１６．１を参照のこと。
ウェスタンブロット分析は一般的に、タンパク質サンプルを調製する工程、タンパク質サンプルのポリアクリルアミドゲルでの電気泳動（例えば抗原の分子量に依存した８％〜２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、タンパク質サンプルをポリアクリルアミドゲルからメンブレン（例えばニトロセルロース、ＰＶＤＦまたはナイロン）へ移す工程、ブロッキング溶液（例えば、３％のＢＳＡまたは無脂肪ミルクを含むＰＢＳ）中でメンブレンをブロッキングする工程、メンブレンを洗浄緩衝液（例えば、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０）中で洗浄する工程、（ブロッキング緩衝液で希釈された）本発明のアルブミン融合タンパク質をメンブレンに適用する工程、洗浄緩衝液中でメンブレンを洗浄する工程、ブロッキング緩衝液で希釈された、酵素基質（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼもしくはアルカリホスファターゼ）または放射性分子（例えば３２Ｐまたは１２５Ｉ）に結合体化した２次抗体（これはアルブミン融合タンパク質（例えば、抗ヒト血清アルブミン抗体）を認識する）を適用する工程、洗浄緩衝液中でメンブレンを洗浄する工程、および抗原の存在を検出する工程、を包含する。当業者は、検出されるシグナルを増加し、そしてバックグランドノイズを減少するように改変され得るパラメータをよく知っている。ウェスタンブロットプロトコルに関するさらなる考察については、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、１９９４、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１０．８．１）を参照のこと。
ＥＬＩＳＡは、抗原を調製する工程、９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルをその抗原でコーティングする工程、酵素基質（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスフォターゼ）のような検出可能な化合物に結合体化した本発明のアルブミン融合タンパク質（例えば、治療用タンパク質に結合する抗体の少なくともフラグメントまたは改変体を含む）をそのウェルに添加し、そして一定時間インキュベートする工程、非結合アルブミン融合タンパク質または非特異的結合アルブミン融合タンパク質を洗い流す工程、およびウェルをコートする抗原に特異的に結合したアルブミン融合タンパク質の存在を検出する工程を含む。ＥＬＩＳＡにおいて、目的の抗体は、検出可能な化合物に結合体化している必要はない；その代わり、検出可能な化合物に結合体化した第二の抗体（アルブミン融合タンパク質を認識する）がウェルに添加され得る。さらに、ウェルを抗原でコーティングする代わりに、アルブミン融合タンパク質がウェルにコーティングされ得る。この場合、検出可能な分子は、検出可能な化合物（酵素基質（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）に結合体化された抗原であり得る。当業者は、検出されるシグナルを増加させるように改変され得るパラメータ、および当該分野において公知のＥＬＩＳＡの他のバリエーションに関して、知識を有し得る。ＥＬＩＳＡに関するさらなる考察については、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１１．２．１を参照のこと。
タンパク質、抗原、またはエピトープに対するアルブミン融合タンパク質の結合親和性およびアルブミン融合タンパク質−タンパク質／抗原／エピトープ相互作用のオフレート（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）が、競合結合アッセイにより決定され得る。競合結合アッセイの一つの例は、ラジオイムノアッセイであり、ラジオイムノアッセイは、標識した抗原（例えば、３Ｈまたは１２５Ｉ）と、漸増量の非標識抗原の存在下での本発明のアルブミン融合タンパク質とのインキュベーション、および標識した抗原に結合した抗体の検出を含む。
アルブミン融合タンパク質の、特定のタンパク質、抗原またはエピトープに対する親和性、および結合オフレートは、スキャッチャードプロット分析によるデータから決定され得る。アルブミン融合タンパク質と同じタンパク質、抗原またはエピトープに結合する第２のタンパク質との競合はまた、ラジオイムノアッセイを用いて決定され得る。この場合、このタンパク質、抗原、またはエピトープは、漸増量の非標識第二抗体の存在下で、標識した化合物（例えば、３Ｈまたは１２５Ｉ）に結合体化したアルブミン融合タンパク質とともにインキュベートされる。
好ましい実施形態において、ＢＩＡｃｏｒｅ速度論分析が、タンパク質、抗原もしくはエピトープに対する本発明のアルブミン融合タンパク質の結合のオン速度およびオフ速度を決定するために使用される。ＢＩＡｃｏｒｅ速度論分析は、アルブミン融合タンパク質、または特定のポリペプチド、抗原、もしくはエピトープの結合、および表面上に固定された特定のポリペプチド、抗原、もしくはエピトープまたはアルブミン融合タンパク質をそれぞれ備えるチップからのアルブミン融合タンパク質、または特定のポリペプチド、抗原、もしくはエピトープの解離を分析する工程を包含する。
アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応する治療用タンパク質に結合する抗体もまた、所定のタンパク質または抗原（好ましくは、それらの交代が特異的に結合する抗原）に対する結合親和性に関して、記載または特定され得る。好ましい結合親和性としては、５×１０−２Ｍ未満、１０−２Ｍ未満、５×１０−３Ｍ未満、１０−３Ｍ未満、５×１０−４Ｍ未満、１０−４Ｍ未満の解離定数すなわちＫｄを有する親和性が挙げられる。より好ましい結合親和性としては、５×１０−５Ｍ未満、１０−５Ｍ未満、５×１０−６Ｍ未満、１０−６Ｍ未満、５×１０−７Ｍ未満、１０−７Ｍ未満、５×１０−８Ｍ未満、１０−８Ｍ未満の解離定数すなわちＫｄを有する親和性が挙げられる。なおより好ましい結合親和性としては、５×１０−９Ｍ未満、１０−９Ｍ未満、５×１０−１０Ｍ未満、１０−１０Ｍ未満、５×１０−１１Ｍ未満、１０−１１Ｍ未満、５×１０−１２Ｍ未満、１０−１２Ｍ未満、５×１０−１３Ｍ未満、１０−１３Ｍ未満、５×１０−１４Ｍ未満、１０−１４Ｍ未満、５×１０−１５Ｍ未満または１０−１５Ｍ未満の解離定数すなわちＫｄを有する親和性が挙げられる。好ましい実施形態において、治療用タンパク質に結合する抗体の少なくともフラグメントもしくは改変体を含むアルブミン融合タンパク質は、治療用タンパク質に結合する対応する抗体（アルブミンに融合していない）の親和性と類似する所定のタンパク質もしくはエピトープに対する親和性を、アルブミン融合タンパク質（治療用タンパク質に結合する抗体のうちの少なくともフラグメントもしくは改変体を含む）の価およびその対応する抗体の価を考慮すると、有する。さらに、本明細書中に記載される（実施例および表１を参照のこと）かさもなければ当該分野で公知であるアッセイは、アルブミン融合タンパク質ならびにそのフラグメント、改変体および誘導体が、そのアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分および／またはアルブミン部分のいずれかに関連する生物学的活性および／またはＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ活性を（インビトロまたはインビボのいずれかで）惹起する能力を測定するために、慣用的に適用され得る。他の方法は、当業者に公知であり、本発明の範囲内である。
（アルブミン）
上記のように、本発明のアルブミン融合タンパク質は、治療用タンパク質のうちの少なくともフラグメントもしくは改変体と、ヒト血清アルブミンの少なくともフラグメントもしくは改変体とを含み、これらは、互いに、好ましくは遺伝子融合によって結合されている。
さらなる実施形態は、治療用タンパク質のうちの少なくともフラグメントもしくは改変体と、ヒト血清アルブミンの少なくともフラグメントもしくは改変体とを含み、これらは互いに、化学結合によって連結されている。
用語、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）およびヒトアルブミン（ＨＡ）は、本明細書中で互換可能に使用される。用語「アルブミン」および「血清アルブミン」は、より広範であり、ヒト血清アルブミン（ならびにそのフラグメントおよび改変体）ならびに他の種由来のアルブミン（ならびにそのフラグメントおよび改変体）を包含する。
本明細書中で使用される場合、「アルブミン」とは、アルブミンの１つ以上の機能的活性（例えば、生物学的活性）を有する、アルブミンのタンパク質もしくはアミノ酸配列、またはアルブミンのフラグメントもしくは改変体を集合的に指す。特に、「アルブミン」とは、ヒトアルブミンまたはそのフラグメント（例えば、ＥＰ ２０１ ２３９、ＥＰ ３２２ ０９４、ＷＯ ９７／２４４４５、ＷＯ ９５／２３８５７）を指し、特に、図１および配列番号１０３８に示されるヒトアルブミンの成熟形態、あるいは他の脊椎動物由来のアルブミン、またはこれらの分子もしくはフラグメントのアナログもしくは改変体を指す。
好ましい実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質において使用されるヒト血清アルブミンは、配列番号１０３８に関する以下の組の点変異のうちの１つまたは両方を含む：Ｌｅｕ−４０７→Ａｌａ、Ｌｅｕ−４０８→Ｖａｌ、Ｖａｌ−４０９→Ａｌａ、およびＡｒｇ−４１０→Ａｌａ；またはＡｒｇ−４１０→Ａ、Ｌｙｓ−４１３→Ｇｌｎ、およびＬｙｓ−４１４→Ｇｌｎ（例えば、本明細書中に全体が参考として援用される、国際公開番号ＷＯ９５／２３８５７を参照のこと）。なおより好ましい実施形態において、上記の点変異の組の１つまたは両方を含む本発明のアルブミン融合タンパク質は、酵母Ｙａｐ３ｐタンパク質分解切断に対する改善した安定性／抵抗性を有し、これにより、酵母宿主細胞中で発現される組換えアルブミン融合タンパク質の生成増加が可能である。
本明細書中で使用される場合、治療用タンパク質の治療活性または寿命を延長するに十分なアルブミン部分とは、このタンパク質の治療活性を安定化または延長するために長さまたは構造が十分であり、その結果、アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分の寿命が、非融合状態における寿命と比較して延長または伸長している、アルブミン部分を指す。このアルブミン融合タンパク質のアルブミン部分は、上記のようなＨＡ配列の全長を含み得るか、またはその治療活性を安定化可能または延長可能である１つ以上のそのフラグメントを含み得る。そのようなフラグメントは、長さが１０個以上のアミノ酸であり得るか、またはＨＡ配列からの約１５個、２０個、２５個、３０個、５０個以上連続するアミノ酸を含み得るか、またはＨＡの特定のドメインの部分またはすべてを含み得る。
例えば、最初の２つの免疫グロブリン様ドメインに広がるＨＡの１つ以上のフラグメントが、使用され得る。好ましい実施形態において、このＨＡフラグメントは、ＨＡの成熟形態である。
本発明のアルブミン融合タンパク質のアルブミン部分は、正常ＨＡの改変体であり得る。本発明のアルブミン融合タンパク質の治療タンパク部分はまた、本明細書中に記載されるような治療用タンパク質の改変体であり得る。用語「改変体」は、保存的または非保存的のいずれかである、挿入、欠失、および置換を包含し、ここでそのような変化は、アルブミンの腫脹の（ｏｎｃｏｔｉｃ）有用なリガンド結合特性および非免疫原性特性のうちの１つ以上も、その治療用タンパク質の治療活性を付与する活性部位もしくは活性ドメインも、実質的には変化しない。
詳細には、本発明のアルブミン融合タンパク質は、ヒトアルブミンの天然に存在する多型改変体、およびヒトアルブミンのフラグメント（例えば、ＥＰ ３２２ ０９４に開示されるフラグメント（すなわち、ＨＡ（Ｐｎ）であり、ここで、ｎは、３６９〜４１９である））を包含し得る。このアルブミンは、任意の脊椎動物、特に任意の哺乳動物、例えば、ヒト、ウシ、ヒツジ、またはブタに由来し得る。非哺乳動物アルブミンとしては、雌鳥およびサケが挙げられるが、これらに限定されない。このアルブミン融合タンパク質のアルブミン部分は、この治療用タンパク質部分とは異なる動物由来であり得る。
一般的に述べると、ＨＡのフラグメントまたは改変体は、少なくとも１００アミノ酸長、好ましくは、少なくとも１５０アミノ酸長である。このＨＡ改変体は、ＨＡの少なくとも１つのドメイン全体、例えば、ドメイン１（配列番号１０３８のアミノ酸１〜１９４）、ドメイン２（配列番号１０３８のアミノ酸１９５〜３８７）、ドメイン３（配列番号１０３８のアミノ酸３８８〜５８５）、ドメイン１および２（配列番号１０３８の１〜３８７）、ドメイン２および３（配列番号１０３８の１９５〜５８５）、またはドメイン１および３（配列番号１０３８のアミノ酸１〜１９４および配列番号１０３８のアミノ酸３８８〜５８５）からなり得るか、あるいはこれらを含み得る。各ドメイン自体は、２つの相同なサブドメイン、すなわち、１〜１０５、１２０〜１９４、１９５〜２９１、３１６〜３８７、３８８〜４９１、および５１２〜５８５から構成され、可撓性のサブドメイン間リンカー領域が、残基Ｌｙｓ１０６〜Ｇｌｕ１１９、Ｇｌｕ２９２〜Ｖａｌ３１５、およびＧｌｕ４９２〜Ａｌａ５１１を含む。
好ましくは、本発明のアルブミン融合タンパク質のアルブミン部分は、ＨＡの少なくとも１つのサブドメインもしくはドメインまたはその保存的改変体を含む。その融合物がサブドメインをベースとする場合、隣接リンカーのうちのいくらかまたはすべては、好ましくは、治療用タンパク質部分に結合するために使用される。
（治療用タンパク質に特異的に結合する抗体もまた、治療用タンパク質である）
本発明はまた、表１に開示される治療用タンパク質に特異的に結合する抗体の少なくともフラグメントもしくは改変体を含む、アルブミン融合タンパク質を包含する。用語「治療用タンパク質」は、治療用タンパク質に結合する抗体（例えば、表１の欄Ｉに記載される）ならびにそのフラグメントおよび改変体を包含することが、特に企図される。従って、本発明のアルブミン融合タンパク質は、治療用タンパク質の少なくともフラグメントもしくは改変体、および／または治療用タンパク質に結合する抗体の少なくともフラグメントもしくは改変体を含み得る。
（抗体の構造およびバックグラウンド）
基本的な抗体構造単位は、テトラマーを含むことが公知である。各テトラマーは、２つの同一なポリペプチド鎖対から構成され、各対は、１つの「軽鎖」（約２５ｋＤａ）および１つの「重鎖」（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、抗原認識を主に担う約１００〜１１０アミノ酸以上の可変領域ｆを含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、エフェクター機能を主に担う定常領域を規定する。ヒト軽鎖は、κ軽鎖およびλ軽鎖として分類される。重鎖は、μ、δ、γ、α、またはεとして分類され、それぞれ、抗体のアイソタイプをＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥとして規定する。一般に、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第３〜５章（Ｐａｕｌ，Ｗ．編、第４版、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９８）（すべての目的のためにその全体が参考として援用される）を参照のこと。各軽鎖／重鎖対の可変領域は、抗体結合部位を形成する。
従って、インタクトなＩｇＧ抗体は、２つの結合部位を有する。二官能性抗体または二重特異性抗体において以外では、その２つの結合部位は同じである。
これらの鎖はすべて、３つの超可変領域（相補性決定領域またはＣＤＲとも呼ばれる）により結合された、比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）の同じ一般構造を示す。このＣＤＲ領域は、一般に、その抗原と接触してその特異性を決定する抗体部分である。各対の重鎖および軽鎖に由来するＣＤＲは、フレームワーク領域により整列され、それにより、特異的エピトープに結合することが可能である。Ｎ末端からＣ末端まで、軽鎖可変領域および重鎖可変領域の両方は、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４を含む。これらの可変領域は、重鎖定常領域または軽鎖定常領域に連結される。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、Ｋａｂａｔ、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｒｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９８７および１９９１））、またはＣｈｏｔｈｉａ ＆ Ｌｅｓｋ，Ｊ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１〜９１７（１９８７）；Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７８〜８８３（１９８９）の定義に従う。
本明細書中で使用される場合、「抗体」とは、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分（すなわち、抗原に特異的に結合する抗原結合部位を含む分子（例えば、抗体の１つ以上のＣＤＲ領域を含む分子））を指す。アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応し得る抗体としては、モノクローナル抗体、多重特異的抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体、単鎖抗体（例えば、単鎖Ｆｖｓ）、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーによって産生されるフラグメント、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本発明の抗体に特異的な抗Ｉｄ抗体を含む）、および上記のいずれかのエピトープ結合フラグメント（例えば、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、または１つ以上のＣＤＲ領域）を含むが、これらに限定されない。
（治療用タンパク質に結合する抗体）
本発明は、治療用タンパク質（例えば、表１に開示される）に結合する抗体の少なくともフラグメントまたは改変体を含むアルブミン融合タンパク質、またはそのフラグメントもしくは改変体を包含する。
治療用タンパク質（またはそのフラグメントもしくは改変体）に結合する抗体は、鳥類および哺乳動物を含む任意の動物起源由来であり得る。好ましくは、この抗体は、ヒト、ネズミ（例えば、マウスおよびラット）、ロバ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、またはニワトリの抗体である。より好ましくは、その抗体は、ヒト抗体である。本明細書中で使用される場合、「ヒト」抗体は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、そしてヒト免疫グロブリンライブラリーから単離された抗体、およびヒト抗体を生成するように遺伝子操作された異種マウス（ｘｅｎｏｍｉｃｅ）もしくは他の生物から単離された抗体を包含する。
治療用タンパク質に結合し、かつ本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応し得る抗体分子は、免疫グロブリン分子の任意の型（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、任意のクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）または任意のサブクラスであり得る。好ましい実施形態において、治療用タンパク質に結合しかつアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応し得る抗体分子は、ＩｇＧ１である。他の好ましい実施形態において、治療用タンパク質に結合しかつアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応し得る抗体分子は、ＩｇＧ２である。他の好ましい実施形態において、治療用タンパク質に結合しかつアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応し得る抗体分子は、ＩｇＧ４である。
最も好ましくは、治療用タンパク質に結合しかつアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応し得る抗体は、本発明のヒト抗原結合フラグメントであり、これには、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）、ならびにＶＬドメインまたはＶＨドメインのいず
れかを含むフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。単鎖抗体を含む抗原結合抗体フラグメントは、可変領域を、単独でか、または以下の全体もしくは部分と組み合わせて含み得る：ヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン。
治療用タンパク質に結合しかつアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応し得る抗体は、一重特異的、二重特異的、三重特異的またはより多重の特異性であり得る。多重特異的抗体は、治療用タンパク質の異なるエピトープに対して特異的であり得るか、または治療用タンパク質および異種エピトープ（例えば、異種ポリペプチドもしくは固体支持体物質）の両方に特異的であり得る。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ ９３／１７７１５；同ＷＯ ９２／０８８０２；同ＷＯ ９１／００３６０；同ＷＯ ９２／０５７９３；Ｔｕｔｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０−６９（１９９１）；米国特許第４，４７４，８９３号、同第４，７１４，６８１号、同第４，９２５，６４８号、同第５，５７３，９２０号、同第５，６０１，８１９号；Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−１５５３（１９９２）を参照のこと。
治療用タンパク質（またはそのフラグメントもしくは改変体）に結合する抗体は、二重特異的または二官能性であり得、これは、その抗体が２つの異なる重鎖／軽鎖対と２つの異なる結合部位とを有する人工的ハイブリッド抗体であることを意味する。二重特異的抗体は、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’フラグメントの結合を含む、種々の方法により生成され得る。例えば、ＳｏｎｇｓｉｖｉｌａｉおよびＬａｃｃｈｍａｎｎ，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５〜３２１（１９９０）、Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７〜１５５３（１９９２）を参照のこと。さらに、二重特異的抗体は、「ディアボディ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）」（Ｈｏｌｌｉｇｎｅｒら、「Ｄｉａｂｏｄｉｅｓ’：ｓｍａｌｌ ｂｉｖａｌｅｎｔ ａｎｄ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ」ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９０：６４４４〜６４４８（１９９３））または「Ｊａｎｕｓｉｎｓ」（Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら「Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ （Ｊａｎｕｓｉｎｓ） ｔａｒｇｅｔ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｏｎ ＨＩＶ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｃｅｌｌｓ」ＥＭＢＯ Ｊ １０：３６５５〜３６５９（１９９１）およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら「Ｊａｎｕｓｉｎ：ｎｅｗ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｓｉｇｎ ｆｏｒ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅａｇｅｎｔｓ」Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｕｐｐｌ ７：５１〜５２（１９９２））として見出され得る。
本発明はまた、本明細書中に記載されるかまたは当該分野で公知である抗体のフラグメントまたは改変体（誘導体を含む）を含む、アルブミン融合タンパク質を提供する。当業者に公知である標準的技術は、本発明の分子をコードするヌクレオチド配列中に変異を導入するために使用され得る（例えば、アミノ酸置換を生じる、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介性変異誘発）。好ましくは、この改変体（誘導体を含む）は、参照ＶＨドメイン、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３、ＶＬドメイン、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、またはＶＬＣＤＲ３と比較して、５０個未満のアミノ酸置換、４０個未満のアミノ酸置換、３０個未満のアミノ酸置換、２５個未満のアミノ酸置換、２０個未満のアミノ酸置換、１５個未満のアミノ酸置換、１０個未満のアミノ酸置換、５個未満のアミノ酸置換、４個未満のアミノ酸置換、３個未満のアミノ酸置換、または２個未満のアミノ酸置換をコードする。特定の実施形態において、それらの改変体は、ＶＨＣＤＲ３の置換をコードする。好ましい実施形態において、その改変体は、１つ以上の推定非必須アミノ酸残基にて、保存的アミノ酸置換を有する。
治療用タンパク質に結合しかつアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応し得る抗体は、これらが認識または特異的に結合する、治療用タンパク質のエピトープまたは部分に関して記載または特定化され得る。治療用タンパク質または治療用タンパク質の特定のエピトープに特異的に結合する抗体はまた、排除され得る。従って、本発明は、治療用タンパク質を特異的に結合し、そしてその排除を可能にする、抗体を含む。好ましい実施形態において、治療用タンパク質に結合する抗体の少なくともフラグメントもしくは改変体を含むアルブミン融合タンパク質は、その抗体自体の非融合フラグメントまたは改変体と同じエピトープに結合する。
治療用タンパク質に結合しかつアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応し得る抗体はまた、その交差反応性について記載または特定化され得る。治療用タンパク質の任意の他のアナログ、オルソログまたはホモログを結合しない抗体が、含まれる。
治療用タンパク質に対して少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％および少なくとも５０％の同一性（当該分野で公知の方法および本明細書中に記載される方法を用いて計算した場合）を有するポリペプチドを結合する抗体もまた、本発明に含まれる。特定の実施形態において、治療用タンパク質に結合しかつアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応し得る抗体は、ヒトタンパク質の、マウスホモログ、ラットホモログおよび／またはウサギホモログならびに対応するそれらのエピトープと交差反応する。治療用タンパク質に対して９５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満および５０％未満の配列同一性（当該分野で公知の方法および本明細書中に記載される方法を用いて計算した場合）を有するポリペプチドを結合しない抗体もまた、本発明に含まれる。特定の実施形態において、上記の交差反応性は、本明細書中に開示された、任意の単一の特異的な抗原性ポリペプチドまたは免疫原性ポリペプチド、あるいはその特異的な抗原性ポリペプチドおよび／または免疫原性ポリペプチドのうちの２個、３個、４個、５個以上の組み合わせに関する。好ましい実施形態において、治療用タンパク質に結合する抗体の少なくともフラグメントまたは改変体を含むアルブミン融合タンパク質は、特定の抗体自体のフラグメントまたは改変体と比較して、同様であるかまたは実質的に同一な交差反応性を有する。
さらに本発明に含まれるのは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下（本明細書中で記載されるような）で治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを結合する抗体である。治療用タンパク質に結合しかつアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応し得る抗体はまた、本発明のポリペプチドに対するそれらの結合親和性について記載または特定化され得る。好ましい結合親和性としては、５×１０−２Ｍ未満、１０−２Ｍ未満、５×１０−３Ｍ未満、１０−３Ｍ未満、５×１０−４Ｍ未満、１０−４Ｍ未満の解離定数すなわちＫｄを有する親和性が挙げられる。より好ましい結合親和性としては、５×１０−５Ｍ未満、１０−５Ｍ未満、５×１０−６Ｍ未満、１０−６Ｍ未満、５×１０−７Ｍ未満、１０−７Ｍ未満、５×１０−８Ｍ未満、または１０−８Ｍ未満の解離定数すなわちＫｄを有する親和性が挙げられる。なおより好ましい結合親和性としては、５×１０−９Ｍ未満、１０−９Ｍ未満、５×１０−１０Ｍ未満、１０−１０Ｍ未満、５×１０−１１Ｍ未満、１０−１１Ｍ未満、５×１０−１２Ｍ未満、１０−１２Ｍ未満、５×１０−１３Ｍ未満、１０−１３Ｍ未満、５×１０−１４Ｍ未満、１０−１４Ｍ未満、５×１０−１５Ｍ未満または１０−１５Ｍ未満の解離定数すなわちＫｄを有する親和性が挙げられる。好ましい実施形態において、治療用タンパク質に結合する抗体の少なくともフラグメントもしくは改変体を含むアルブミン融合タンパク質は、治療用タンパク質に結合する対応する抗体（アルブミンに融合していない）の親和性と類似する所定のタンパク質もしくはエピトープに対する親和性を、アルブミン融合タンパク質（治療用タンパク質に結合する抗体のうちの少なくともフラグメントもしくは改変体を含む）の価およびその対応する抗体の価を考慮すると、有する。
本発明はまた、競合的結合を決定するための当該分野で公知の任意の方法（例えば、本明細書中で記載されるイムノアッセイ）によって決定されるような、治療用タンパク質のエピトープに対する抗体の結合を競合的に阻害する抗体を提供する。好ましい実施形態において、この抗体は、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、または少なくとも５０％、そのエピトープへの結合を競合的に阻害する。好ましい実施形態において、治療用タンパク質に結合する抗体の少なくともフラグメントまたは改変体を含むアルブミン融合タンパク質は、治療用タンパク質のエピトープへの第２の抗体の結合を競合的に阻害する。他の好ましい実施形態において、治療用タンパク質に結合する抗体の少なくともフラグメントまたは改変体を含むアルブミン融合タンパク質は、治療用タンパク質のエピトープへの第２の抗体の結合を、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、または少なくとも５０％、競合的に阻害する。
治療用タンパク質に結合しかつ本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応し得る抗体は、その治療用タンパク質のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用し得る。例えば、本発明は、本発明のポリペプチドとのレセプター／リガンド相互作用を部分的に破壊するかまたは完全に破壊する抗体を含む。本発明は、レセプター特異的抗体およびリガンド特異的抗体の両方の特徴を有する。本発明はまた、リガンド結合を妨害しないがレセプター活性化を妨害するレセプター特異的抗体の特徴を有する。レセプター活性化（すなわち、シグナル伝達）は、本明細書中に記載の技術、そうでなければ、当該分野で公知の技術により決定され得る。例えば、レセプター活性化は、レセプターのリン酸化（例えば、チロシンまたはセリン／トレオニン）、または免疫沈降とそれに続くウェスタンブロット分析（例えば、上記のような）によってその基質を検出することにより、決定され得る。特定の実施形態においては、この抗体の非存在下のリガンド活性またはレセプター活性を、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、または少なくとも５０％阻害する抗体が提供される。好ましい実施形態において、治療用タンパク質に結合する抗体の少なくともフラグメントまたは改変体を含むアルブミン融合タンパク質は、その治療用タンパク質に結合する抗体の非融合フラグメントまたは改変体と比較して、リガンド結合の防止および／またはレセプター活性化の防止に関して、類似するかまたは実質的に類似する特徴を有する。
本発明はまた、リガンド結合およびレセプター活性化の両方を妨げるレセプター特異的抗体、ならびにレセプター−リガンド複合体を認識し、かつ好ましくは、結合していないレセプターも結合していないリガンドも特異的には認識しない、レセプター特異的抗体の特徴を有する。同様に、本発明は、リガンドと結合しかつレセプターへのそのリガンドの結合を妨げる中和抗体、およびリガントと結合し、それによりレセプター活性化を妨げるが、そのリガンドがレセプターを結合することを妨げない抗体を含む。さらに、本発明は、そのレセプターを活性化する抗体を含む。これらの抗体は、レセプターアゴニストとして作用し得、すなわち、例えば、そのレセプターの二量体化を誘発することによって、リガンド媒介レセプター活性化の生物学的活性の全てまたはサブセットのいずれかを増強し得るかまたは活性化し得る。この抗体は、本明細書中に開示される治療用タンパク質（例えば、表１に開示される）の特異的生物学的活性を含む生物学的活性に対するアゴニスト、アンタゴニストまたは逆アゴニストとして特定化され得る。上記抗体アゴニストは、当該分野で公知の方法を用いて作製され得る。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９６／４０２８１；米国特許第５，８１１，０９７号；Ｄｅｎｇら、Ｂｌｏｏｄ ９２（６）：１９８１−１９８８（１９９８）；Ｃｈｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８（１６）：３６６８−３６７８（１９９８）；Ｈａｒｒｏｐら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１（４）：１７８６−１７９４（１９９８）；Ｚｈｕら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ：５８（１５）：３２０９−３２１４（１９９８）；Ｙｏｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０（７）：３１７０−３１７９（１９９８）；Ｐｒａｔら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．１１１（Ｐｔ２）：２３７−２４７（１９９８）；Ｐｉｔａｒｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０５（２）：１７７−１９０（１９９７）；Ｌｉａｕｔａｒｄら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ９（４）：２３３−２４１（１９９７）；Ｃａｒｌｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（１７）：１１２９５−１１３０１（１９９７）；Ｔａｒｙｍａｎら、Ｎｅｕｒｏｎ １４（４）：７５５−７６２（１９９５）；Ｍｕｌｌｅｒら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ６（９）：１１５３−１１６７（１９９８）；Ｂａｒｔｕｎｅｋら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ８（１）：１４−２０（１９９６）（上記の文献は、全て、その全体が参考として本明細書中に援用される）を参照のこと。好ましい実施形態において、治療用タンパク質に結合する抗体の少なくともフラグメントまたは改変体を含むアルブミン融合タンパク質は、その治療用タンパク質に結合する抗体の非融合フラグメントまたは改変体と比較して、類似するかまたは実質的に同一であるアゴニスト特性またはアンタゴニスト特性を有する。
治療用タンパク質に結合しかつ本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応し得る抗体は、例えば、治療用タンパク質を精製し、検出し、そして標的化するために使用され得る。これらは、インビトロおよびインビボの両方での診断方法および治療方法を含む。例えば、この抗体は、生物学的サンプルにおける治療用タンパク質のレベルを定性的および定量的に測定するためのイムノアッセイにおける有用性を有する。例えば、Ｈａｒｌｏｗら，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，第２版，１９８８）（本明細書中でその全体が参照として援用される）を参照のこと。同様に、治療用タンパク質に結合する抗体の少なくともフラグメントまたは改変体を含むアルブミン融合タンパク質は、例えば、治療用タンパク質を精製し、検出し、そして標的化するために使用され得る。これらは、インビトロおよびインビボの両方での診断方法および治療方法を含む。
治療用タンパク質に結合しかつアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応し得る抗体は、改変された（すなわち、その抗体への任意の型の分子の共有結合によって）誘導体を包含する。例えば、限定はしないが、この抗体誘導体は、例えば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、公知の保護基／ブロック基による誘導体化、タンパク質分解性切断、細胞リガンドまたは他のタンパク質への結合などによって、改変された抗体を包含する。多数の化学的改変のいずれかが、公知の技術によって実行され得、その技術としては、特異的化学切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、その誘導体は、１つ以上の非古典的アミノ酸を含み得る。本発明のアルブミン融合タンパク質もまた、上記のように改変され得る。
（治療用タンパク質に結合する抗体の生成方法）
治療用タンパク質に結合しかつ本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応し得る抗体は、当該分野で公知の任意の適切な方法によって産生され得る。目的の抗原に対するポリクローナル抗体は、当該分野で周知の種々の手順によって産生され得る。例えば、治療用タンパク質が種々の宿主動物（ウサギ、マウス、ラットなどを含むがこれらに限定されない）に投与されて、その抗原に対して特異的なポリクローナル抗体を含む血清の産生を誘導し得る。種々のアジュバントが、宿主種に依存して、免疫学的応答を増加させるために使用され得、そしてフロイント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、リゾレシチンのような界面活性物質、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびにＢＣＧ（カルメット−ゲラン杆菌）およびｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍのような潜在的に有用なヒトアジュバントを含むが、これらに限定されない。このようなアジュバントはまた、当該分野で周知である。
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え、およびファージディスプレイ技術、またはそれらの組み合わせの使用を含む、当該分野で公知の広範な種々の技術を用いて調製され得る。例えば、モノクローナル抗体は、当該分野で公知の以下に挙げられるハイブリドーマ技術を使用して産生され得、例えば、Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，第２版、１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ５６３−６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．１９８１）（上記の参考文献は、その全体が参考として援用される）に教示される。本明細書中で使用される場合、用語「モノクローナル抗体」とは、ハイブリドーマ技術を通して生成された抗体に限定されない。
用語「モノクローナル抗体」とは、任意の真核生物、原核生物、またはファージクローンを含む単一のクローンに由来し、それが生成される方法に由来するのではない、抗体をいう。
ハイブリドーマ技術を用いて特異的抗体を産生およびスクリーニングする方法は、当該分野で慣用的かつ周知である。非限定的な実施例において、マウスは、治療用タンパク質またはそのフラグメントもしくは改変体、アルブミン融合タンパク質、あるいはそのような治療用タンパク質またはそのフラグメントもしくは改変体またはアルブミン融合タンパク質を発現する細胞を用いて、免疫され得る。一旦免疫応答が検出される（例えば、上記抗原に特異的な抗体がマウスの血清中に検出される）と、マウスの脾臓を収集しそして脾細胞を単離する。次に、その脾細胞を周知の技術によって任意の適切な骨髄腫細胞（例えば、ＡＴＣＣから入手可能な細胞株ＳＰ２０由来の細胞）に融合させる。ハイブリドーマを限界希釈によって選択およびクローン化する。次に、ハイブリドーマクローンを、本発明のポリペプチドに結合し得る抗体を分泌する細胞について、当該分野で公知の方法によってアッセイする。一般的に高いレベルの抗体を含む腹水が、陽性ハイブリドーマクローンを用いてマウスを免疫することによって、産生され得る。
従って、本発明は、モノクローナル抗体、および抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を培養する工程を包含する方法によって産生される抗体を、生成する方法を提供し、ここで、好ましくは、このハイブリドーマは、骨髄腫細胞と本発明の抗原で免疫したマウスから単離された脾細胞とを融合させ、次いで本発明のポリペプチドと結合し得る抗体を分泌するハイブリドーマクローンについて、融合物から生じるハイブリドーマをスクリーニングすることによって生成される。
ポリクローナルヒトＢ細胞株およびモノクローナルヒトＢ細胞株の両方を生成するための別の周知の方法は、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）を使用する形質転換である。
ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞株を生成するためのプロトコルは、当該分野で一般に公知であり、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｉｇａｎら編、１９９４、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ（これは、その全体が参考として本明細書中に援用される）の第７．２２章に概説されるプロトコルがある。
形質転換用のＢ細胞源は、一般的にヒト末梢血であるが、形質転換用Ｂ細胞はまた、他の供給源（リンパ節、扁桃、脾臓、腫瘍組織、および感染組織が挙げられるが、これらに限定されない）に由来し得る。組織は、一般には、ＥＢＶ形質転換前に、単一細胞懸濁物にされる。さらに、Ｂ細胞含有サンプル中のＴ細胞を物理的に除去するかまたは（例えば、シクロスポリンＡでの処理によって）不活化するための工程が、行われ得る。なぜなら、抗ＥＢＶ抗体に対して血清陽性である個体由来のＴ細胞は、ＥＢＶによるＢ細胞不死化を抑制し得るからである。
一般に、ヒトＢ細胞を含むサンプルに、ＥＢＶが接種され、そして３〜４週間培養される。代表的なＥＢＶ供給源は、Ｂ９５−８細胞株（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−１４９２）の培養上清である。ＥＢＶ形質転換の物理的徴候は、一般には、この３〜４週間の培養期間の終わりに観察され得る。位相差顕微鏡によって、形質転換細胞は、大きく、透明で、毛様に見え得、緊密な細胞クラスター状態に凝集する傾向があり得る。最初は、ＥＢＶ株は、一般的にはポリクローン性である。しかし、長期の細胞培養期間、ＥＢＶ株は、特定のＢ細胞クローンの選択的増殖の結果として、モノクローン性またはポリクローン性になり得る。あるいは、ポリクローン性ＥＢＶ形質転換株は、（例えば、限界希釈培養により）サブクローン化され得るか、または適切な融合パートナーと融合され得、モノクローナルＢ細胞株を得るために限界希釈でプレートされてもモノクローナルＢ細胞株を得る。ＥＢＶ形質転換細胞株のために適切な融合パートナーとしては、マウス骨髄腫細胞株（例えば、ＳＰ２／０、Ｘ６３−Ａｇ８．６５３）、ヘテロミエローマ細胞株（ヒト×マウス；例えば、ＳＰＡＭ−８、ＳＢＣ−Ｈ２０、およびＣＢ−Ｆ７）、およびヒト細胞株（例えば、ＧＭ １５００、ＳＫＯ−０００７、ＲＰＭＩ ８２２６、およびＫＲ−４）が挙げられる。従って、本発明はまた、本発明のポリペプチドまたはそのフラグメントに対するヒトポリクローナル抗体またはヒトモノクローナル抗体の生成方法（ヒトＢ細胞のＥＢＶ形質転換を含む）を提供する。
特定のエピトープを認識する抗体フラグメントは、公知の技術によって生成され得る。
例えば、本発明のＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは、（Ｆａｂフラグメントを生成するために）パパインまたは（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを産生するために）ペプシンのような酵素を使用して、免疫グロブリン分子のタンパク質分解切断によって産生され得る。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、可変領域、軽鎖定常領域および重鎖のＣＨ１ドメインを含む。
例えば、治療用タンパク質に結合する抗体はまた、当該分野で公知の種々のファージディスプレイ方法を用いて産生され得る。ファージディスプレイ法において、機能的抗体ドメインは、それらをコードするポリヌクレオチド配列を保有するファージ粒子の表面に提示される。特定の実施形態において、そのようなファージは、レパートリーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、ヒトもしくはマウス）から発現される抗原結合ドメインを提示するために利用され得る。目的の抗原に結合する抗原結合ドメインを発現するファージは、抗原を用いて選択または同定され得る（例えば、標識した抗原あるいは固体表面またはビーズに結合または捕捉された抗原を使用する）。これらの方法において用いられるファージは、代表的には、ファージ遺伝子ＩＩＩタンパク質またはファージ遺伝子ＶＩＩＩタンパク質のいずれかに組換え的に融合されたＦａｂ、Ｆｖまたはジスルフィド安定化されたＦｖの抗体ドメインを有するファージから発現されたｆｄおよびＭ１３結合ドメインを含む糸状ファージ（ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｐｈａｇｅ）である。治療用タンパク質に結合する抗体を作製するために用いられ得るファージディスプレイ方法の例としては、以下に開示される方法が挙げられる：Ｂｒｉｎｋｍａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８２：４１−５０（１９９５）；Ａｍｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８４：１７７−１８６（１９９５）；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：９５２−９５８（１９９４）；Ｐｅｒｓｉｃら、Ｇｅｎｅ １８７ ９−１８（１９９７）；Ｂｕｒｔｏｎら、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５７：１９１−２８０（１９９４）；ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４；ＰＣＴ公開ＷＯ ９０／０２８０９；ＷＯ ９１／１０７３７；ＷＯ ９２／０１０４７；ＷＯ ９２／１８６１９；ＷＯ ９３／１１２３６；ＷＯ ９５／１５９８２；ＷＯ ９５／２０４０１；ならびに米国特許第５，６９８，４２６号；同第５，２２３，４０９号；同第５，４０３，４８４号；同第５，５８０，７１７号；同第５，４２７，９０８号；同第５，７５０，７５３号；同第５，８２１，０４７号；同第５，５７１，６９８号；同第５，４２７，９０８号；同第５，５１６，６３７号；同第５，７８０，２２５号；同第５，６５８，７２７号；同第５，７３３，７４３号および同第５，９６９，１０８号（これらの各々は、本明細書中でその全体が参考として援用される）。
上記参考文献に記載されるように、ファージ選択後、ファージ由来の抗体をコードする領域は、ヒト抗体を含む抗体の全体または任意の他の所望の抗原結合フラグメントを生成するために単離されかつ用いられ得、そして例えば、以下に詳細が記載されるように、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母および細菌を含む任意の所望の宿主において発現され得る。例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２フラグメントを組換え的に産生するための技術はまた、当該分野で公知の方法を用いて使用され得、このような方法は
、以下に開示される：ＰＣＴ公開ＷＯ ９２／２２３２４；Ｍｕｌｌｉｎａｘら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １２（６）：８６４−８６９（１９９２）；およびＳａｗａｉら、ＡＪＲＩ ３４：２６−３４（１９９５）；およびＢｅｔｔｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１−１０４３（１９９８）（これらの参考文献は、その全体が参考として援用される）。
単鎖のＦｖｓおよび抗体を産生するために用いられ得る技術の例としては、米国特許第４，９４６，７７８号および同第５，２５８，４９８号；Ｈｕｓｔｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２０３：４６−８８（１９９１）；Ｓｈｕら、ＰＮＡＳ ９０：７９９５−７９９９（１９９３）；およびＳｋｅｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０３８−１０４０（１９８８）に記載される技術が挙げられる。ヒトにおける抗体のインビボにおける使用およびインビトロ検出アッセイを含むいくつかの用途のために、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体の使用が好ましくあり得る。キメラ抗体とは、抗体の異なる部分が、異なる動物種に由来する分子（例えば、マウスモノクローナル抗体由来の可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗体）である。キメラ抗体を産生するための方法は、当該分野において公知である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２（１９８５）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４（１９８６）；Ｇｉｌｌｉｅｓら、（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １２５：１９１−２０２；米国特許第５，８０７，７１５号；同第４，８１６，５６７号；および同第４，８１６３９７号を参照のこと（これらはそれらの全体が、参考として本明細書中に援用される）。ヒト化抗体は、非ヒト種由来の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する所望された抗原に結合する非ヒト種抗体由来の抗体分子である。しばしば、ヒトフレームワーク領域内のフレームワーク残基は、抗原結合を変化させるため（好ましくは改善させるために）ＣＤＲドナー抗体由来の対応残基と置換される。これらフレームワークの置換は、当該分野で周知の方法によって同定され、例えば、抗原結合に重要なフレームワーク残基を同定するためのＣＤＲおよびフレームワーク残基の相互作用のモデリング、ならびに特定の位置における異常なフレームワーク残基を同定するための配列比較による。（例えば、Ｑｕｅｅｎら、米国特許第５，５８５，０８９号；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３（１９８８）を参照のこと（これらはそれらの全体が参考として本明細書中に援用される））。抗体は、以下を含む当該分野で公知の種々の技術を用いてヒト化され得る：例えば、ＣＤＲ−移植（欧州特許第２３９，４００号；ＰＣＴ公開ＷＯ ９１／０９９６７；米国特許第５，２２５，５３９号；同第５，５３０，１０１号および同第５，５８５，０８９号）、ベニヤリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）またはリサーフェイシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（欧州特許第５９２，１０６号；同第５１９，５９６号；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２８（４／５）：４８９−４９８（１９９１）； Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ７（６）：８０５−８１４（１９９４）；Ｒｏｇｕｓｋａら、ＰＮＡＳ ９１：９６９−９７３（１９９４））、および鎖シャッフリング（ｃｈａｉｎ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）（米国特許第５，５６５，３３２号）。
完全なヒト抗体は、ヒト患者の治療的処置に対して特に所望される。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを用いた上記のファージディスプレイ法を含む当該分野で公知の種々の方法により作製され得る。米国特許第４，４４４，８８７号、同第４，７１６，１１１号；およびＰＣＴ公開ＷＯ ９８／４６６４５、ＷＯ ９８／５０４３３、ＷＯ ９８／２４８９３、ＷＯ ９８／１６６５４、ＷＯ ９６／３４０９６、ＷＯ ９６／３３７３５、およびＷＯ ９１／１０７４１；（これらの各々はその全体が参考として本明細書中に援用される）もまた参照のこと。
ヒト抗体はまた、機能的内因性免疫グロブリンの発現は出来ないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現し得るトランスジェニックマウスを用いて産生され得る。例えば、ヒト重鎖免疫グロブリン遺伝子およびヒト軽鎖免疫グロブリン遺伝子の複合体は、無作為にまたは相同組換えによってマウス胚性幹細胞に導入され得る。あるいは、ヒト可変領域、定常領域および多様性領域（ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｒｅｇｉｏｎ）は、ヒト重鎖遺伝子およびヒト軽鎖遺伝子に加えて、マウスの胚性幹細胞に導入され得る。マウス重鎖免疫グロブリン遺伝子およびマウス軽鎖免疫グロブリン遺伝子は、相同組換えによるヒト免疫グロブリン遺伝子座の導入と別々にまたは同時に非機能的にされ得る。特に、ＪＨ領域のホモ接合性の欠失は、内因性抗体の産生を妨げる。改変された胚性幹細胞を増殖させ、そしてキメラマウスを産生するために胚盤胞中に微量注入する。次いで、キメラマウスを、ヒト抗体を発現するホモ接合性の子孫を産生するために繁殖させる。トランスジェニックマウスを、選択された抗原（例えば、本発明のポリペプチドの全体または部分）を用いて通常の様式で免疫する。抗原に対するモノクローナル抗体は、従来のハイブリドーマ技術を用いた免疫したトランスジェニックマウスから得られ得る。トランスジェニックマウスに保持されたヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、Ｂ細胞分化の間に再構成し、そしてその後、クラススイッチングおよび体細胞変異を受ける。従って、そのような技術の使用によって、治療的に有用なＩｇＧ抗体、ＩｇＡ抗体、ＩｇＭ抗体およびＩｇＥ抗体の産生が可能である。ヒト抗体を産生するためのこの技術の概要については、ＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ、Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５）を参照のこと。
ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのこの技術のならびにそのような抗体を産生するためのプロトコールの詳細な議論については、例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９８／２４８９３；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９６／３４０９６；ＷＯ９６／３３７３５；欧州特許第０ ５９８ ８７７；米国特許第５，４１３，９２３号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６６１，０１６号；同第５，５４５，８０６号；同第５，８１４，３１８号；同第５，８８５，７９３号；同第５，９１６，７７１号；同第５，９３９，５９８号；同第６，０７５，１８１号；および同第６，１１４，５９８号を参照のこと（これらはその全体が本明細書中に参考として援用される）。さらに、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｅｍｏｎｔ，ＣＡ）およびＧｅｎｐｈａｒｍ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）のような企業は、上記の技術に類似した技術を用いて選択された抗原に対するヒト抗体を提供することに従事し得る。
選択されたエピトープを認識する完全ヒト抗体は、「ガイドされた（ｇｕｉｄｅｄ）選択」といわれる技術を用いて産生し得る。このアプローチにおいて、選択された非ヒトモノクローナル抗体（例えば、マウス抗体）は、同じエピトープを認識する完全ヒト抗体の選択を導くために使用される。（Ｊｅｓｐｅｒｓら、Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：８９９−９０３（１９８８））。
（抗体をコードするポリヌクレオチド）
本発明はさらに、抗体およびそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、ストリンジェントまたはより低いストリジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で（例えば、上記に定義されるような）抗体（好ましくは、治療用タンパク質と特異的に結合する、そしてより好ましくは、表２の「配列番号Ｚ」の欄に開示される「治療用タンパク質Ｘ」のアミノ酸配列を有するポリペプチドに結合する抗体）をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む。
このポリヌクレオチドは、当該分野で公知の任意の方法によって得られ得、そしてそのポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が決定される。例えば、その抗体のヌクレオチド配列が知られている場合、この抗体をコードするポリヌクレオチドは、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドから構築され得（例えば、Ｋｕｔｍｅｉｅｒら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １７：２４２（１９９４）に記載されるような）、これは、簡単にいうと、以下の工程を包含する：この抗体をコードする配列の部分を含むオーバーラップするオリゴヌクレオチドの合成、これらのオリゴヌクレオチドのアニーリングおよび連結、次いで連結されたオリゴヌクレオチドのＰＣＲによる増幅。
あるいは、抗体をコードするポリヌクレオチドは、適切な供給源からの核酸から生成され得る。特定の抗体をコードする核酸を含むクローンは入手不可能だが、その抗体分子の配列が既知である場合、その免疫グロブリンをコードする核酸は、化学的に合成され得るか、あるいは適切な供給源（例えば、抗体ｃＤＮＡライブラリー、または抗体を発現する任意の組織もしくは細胞（例えば、抗体の発現のために選択されたハイブリドーマ細胞）から生成されたｃＤＮＡライブラリー、またはそれから単離された核酸（好ましくはポリＡ＋ＲＮＡ））から、例えば、その抗体をコードするｃＤＮＡライブラリーからのｃＤＮＡクローンを同定するために、配列の３’末端および５’末端にハイブリダイズ可能な合成プライマーを使用するＰＣＲ増幅によって、または特定の遺伝子配列に特異的なオリゴ
ヌクレオチドプローブを使用するクローニングによって得られ得る。ＰＣＲによって生成された増幅された核酸は、次いで、当該分野で周知の任意の方法を用いて、複製可能なクローニングベクターにクローニングされ得る（実施例１０７を参照のこと）。
一旦、抗体のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列が決定されると、抗体のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列の操作について当該分野で周知の方法（例えば、組換えＤＮＡ技術、部位特異的変異誘発、ＰＣＲなど（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９９０，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹおよびＡｕｓｕｂｅｌら編、１９９８，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹに記載の技術を参照のこと。これらは両方がその全体において本明細書に参考として援用される。））を用いて操作され、例えば、アミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を作製するように異なるアミノ酸配列を有する抗体を生成し得る。
特定の実施形態において、重鎖および／または軽鎖の可変ドメインのアミノ酸配列は、相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列の同定のために、当該分野において周知の方法によって（例えば、配列超可変性の領域を決定するために、他の重鎖、および軽鎖の可変領域を既知のアミノ酸配列と比較することによって）調べられ得る。慣用的な組換えＤＮＡ技術を用いて、１つ以上のＣＤＲが、前述のようにフレームワーク領域内に（例えば、非ヒト抗体をヒト化するために、ヒトフレームワーク領域中に）挿入され得る。このフレームワーク領域は天然に存在し得るか、またはコンセンサスフレームワーク領域であり得、そして好ましくはヒトフレームワーク領域であり得る（例えば、列挙したヒトフレームワーク領域については、Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７８：４５７−４７９（１９９８）を参照のこと）。好ましくは、フレームワーク領域およびＣＤＲの組み合わせによって生成されたポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体をコードする。好ましくは、上記に議論されるように、１つ以上のアミノ酸置換は、フレームワーク領域内で作製され得、そして好ましくは、そのアミノ酸置換は、抗体のその抗原への結合を改善する。さらに、このような方法は、１つ以上の鎖内ジスルフィド結合が欠如した抗体分子を生成するように、鎖内ジスルフィド結合に関与する１つ以上の可変領域のシステイン残基のアミノ酸置換または欠失を作製するために使用され得る。ポリヌクレオチドへの他の変更は、本発明によって包含されそして当該分野の技術の範囲内にある。
さらに、適切な抗原特異性のマウス抗体分子由来の遺伝子を、適切な生物学的活性のヒト抗体分子由来の遺伝子と共にスプライシングさせることによって、「キメラ抗体」を産生するために開発された技術（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：８５１−８５５（１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６０４−６０８（１９８４）；Ｔａｋｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４５２−４５４（１９８５））が使用され得る。上記のように、キメラ抗体は、異なる部分が異なる動物種に由来する分子であり、このような分子は、マウスｍＡｂおよびヒト免疫グロブリンの定常領域由来の可変領域を有する（例えば、ヒト化抗体）。
あるいは、単鎖抗体の産生に関する記載された技術（米国特許第４，９４６，７７８号；Ｂｉｒｄ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２（１９８８）；Ｈｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３（１９８８）；およびＷａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５４４−５４（１９８９））が、単鎖抗体の産生に適応され得る。単鎖抗体は、Ｆｖ領域の重鎖フラグメントおよび軽鎖フラグメントがアミノ酸架橋を介して連結されることによって形成され、単鎖ポリペプチドを生じる。Ｅ．ｃｏｌｉにおける機能性Ｆｖフラグメントのアセンブリのための技術もまた、使用され得る（Ｓｋｅｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：１０３８−１０４１（１９８８））。
（抗体の組換え発現）
抗体、またはそのフラグメント、誘導体もしくはアナログ（例えば、抗体の重鎖もしくは軽鎖または単鎖抗体）の組換え発現は、その抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターの構築を必要とする。一旦、抗体分子または抗体の重鎖もしくは軽鎖、あるいはそれらの部分（好ましくは、重鎖または軽鎖の可変ドメインを含有する）をコードする本発明のポリヌクレオチドが得られると、抗体分子の産生のためのベクターは、当該分野で周知の技術を用いる組換えＤＮＡ技術によって生成され得る。従って、抗体をコードするヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドの発現によってタンパク質を調製するための方法は、本明細書に記載される。当業者に周知の方法は、抗体をコードする配列ならびに適切な転写制御シグナルおよび翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターの構築のために使用され得る。これらの方法には、例えば、インビトロの組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボの遺伝子組換えが挙げられる。従って、本発明は、プロモーターに作動可能に連結された、本発明の抗体分子、あるいはその重鎖もしくは軽鎖、または重鎖もしくは軽鎖の可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む、複製可能なベクターを提供する。このようなベクターは、抗体分子の定常領域（例えば、ＰＣＴ公開 ＷＯ８６／０５８０７；ＰＣＴ公開 ＷＯ８９／０１０３６；および米国特許第５，１２２，４６４号を参照のこと）をコードするヌクレオチド配列を含み得、そしてこの抗体の可変ドメインは、重鎖または軽鎖の全体の発現のためにこのようなベクターにクローニングされ得る。
この発現ベクターは、従来技術によって宿主細胞へと移入され、そしてこのトランスフェクトされた細胞は、次いで、抗体を産生するために、従来技術によって培養される。従って、本発明は、異種プロモーターに作動可能に連結された、本発明の抗体、あるいはその重鎖もしくは軽鎖、または単鎖抗体をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を含む。二重鎖抗体の発現についての好ましい実施形態において、重鎖および軽鎖の両方をコードするベクターは、以下に詳述されるように、免疫グロブリン分子全体の発現のために宿主細胞中に同時発現され得る。
種々の宿主発現ベクター系は、本発明の抗体分子を発現させるために利用され得る。このような宿主発現系は、目的のコード配列が産生され、かつ続いて精製され得るビヒクルを表わすが、また、適切なヌクレオチドをコードする配列で形質転換またはトランスフェクトされる場合に、インサイチュで本発明の抗体分子を発現し得る細胞を表わす。これらには、以下が挙げられるが、これらに限定されない：抗体をコードする配列を含む組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターを用いて形質転換された細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のような微生物；抗体をコードする配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ）；抗体をコードする配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）に感染した植物細胞系または抗体をコードする配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系；あるいは哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物のウイルスに由来するプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含む組換え発現構築物を保有する哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、３Ｔ３細胞）。好ましくは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのような細菌細胞、そしてより好ましくは、特に、組換え抗体分子全体の発現のために真核生物細胞が、組換え抗体分子の発現のために使用される。例えば、ヒトサイトメガロウイルス由来の主要即時性初期（ｍａｊｏｒ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ）遺伝子プロモーターエレメントのようなベクターと組み合わされた、チャイニーズハムスターの卵巣細胞（ＣＨＯ）のような哺乳動物細胞が、抗体のための効果的な発現系である（Ｆｏｅｃｋｉｎｇら、Ｇｅｎｅ ４５：１０１（１９８６）；Ｃｏｃｋｅｔｔら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：２（１９９０））。
細菌系において、多くの発現ベクターが、抗体分子の発現を意図する使用に依存して有利に選択され得る。例えば、多量のこのようなタンパク質が産生されるべき場合、抗体分子の薬学的組成物の生成のために、容易に精製される融合タンパク質産物の高レベルの発現を指向するベクターが所望され得る。このようなベクターには、以下が挙げられるが、これらに限定されない：抗体をコードする配列がｌａｃＺをコードする領域と共にベクターにインフレーム（ｉｎ ｆｒａｍｅ）で個別に連結され得、その結果、融合タンパク質が産生されるＥ．ｃｏｌｉ発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒら、ＥＭＢＯ Ｊ．２：１７９１（１９８３））；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ＆Ｉｎｏｕｙｅ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：３１０１−３１０９（１９８５）；Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ＆Ｓｃｈｕｓｔｅｒ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４：５５０３−５５０９（１９８９））など。ｐＧＥＸベクターもまた、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として、外来性ポリペプチドを発現させるために使用され得る。一般に、このような融合タンパク質は可溶性であり、そして溶解した細胞から、マトリックスグルタチオン−アガロースビーズへの吸着および結合、それに続く遊離グルタチオン存在化での溶出によって容易に精製され得る。このｐＧＥＸベクターは、トロンビンまたはＸａ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計され、その結果、このクローニングされた標的遺伝子産物は、ＧＳＴ部分から放出され得る。
昆虫系においては、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）が、異種遺伝子を発現するためのベクターとして使用される。このウイルスは、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞において増殖する。抗体をコードする配列は、このウイルスの非必須の領域（例えばポリヘドリン遺伝子）に個々にクローニングされ得、そしてＡｃＮＰＶプロモーター（例えばポリヘドリンプロモーター）の制御下に配置され得る。
哺乳動物宿主細胞においては、多数のウイルスに基づく発現系が利用され得る。アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合においては、目的の抗体をコードする配列は、アデノウイルスの転写／翻訳制御複合体、例えば後期プロモーターおよび３つの部分に分かれるリーダー配列、に連結され得る。次いで、このキメラ遺伝子は、インビトロまたはインビボでの組換えによって、アデノウイルスゲノムに挿入され得る。ウイルスのゲノムの非必須領域（例えば、Ｅ１またはＥ３領域）における挿入は、生存可能で、感染した宿主において抗体分子を発現する能力のある組換えウイルスを生じる（例えば、Ｌｏｇａｎ＆Ｓｈｅｎｋ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：３５５−３５９（１９８４）を参照のこと）。特異的開始シグナルはまた、挿入された抗体をコードする配列の効率的な翻訳のために必要とされ得る。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接する配列を含む。さらに、この開始コドンは、挿入部分全体の翻訳を確実にするために、所望されるコード配列のリーディングフレーム（ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）と相が同じでなければならない。これらの外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、種々の起源、天然および合成の両方であり得る。発現の効率は、適切な転写エンハンサー要素、転写ターミネーター、などの含有によって高められ得る（Ｂｉｔｔｎｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１−５４４（１９８７）を参照のこと）。
さらに、宿主細胞株が選択され得、これは挿入配列の発現を調節し、または、所望される特異的な様式で遺伝子産物を改変し、そしてプロセシングする。タンパク質産物のこのような改変（例えばグリコシル化）およびプロセシング（例えば切断）は、タンパク質の機能のために重要であり得る。異なる宿主細胞は、タンパク質および遺伝子産物の、翻訳後プロセシングおよび改変のための、特徴的で特異的な機構を有する。適切な細胞株または宿主系は、発現された異種タンパク質の正確な改変およびプロセシングを確実にするように選択され得る。この目的のために、遺伝子産物の、第一の転写、グリコシル化、およびリン酸化の正確なプロセシングのための細胞機構を有する、真核生物宿主細胞が、使用され得る。このような哺乳動物宿主細胞は、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、Ｈｅｌａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、ＷＩ３８、そして特に、例えば、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２０およびＴ４７Ｄのような乳癌細胞株、ならびに、例えば、ＣＲＬ７０３０およびＨｓ５７８Ｂｓｔのような正常な乳腺細胞株を含むが、これらに限定されない。
組換えタンパク質の長期間の高収率産生、安定発現が好ましい。例えば、安定に抗体分子を発現する細胞株が操作され得る。ウイルスの複製起点を含む発現ベクターを使用するよりも、宿主細胞は、適切な発現制御要素（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位、など）、および選択マーカーによって制御されるＤＮＡで形質転換され得る。異種ＤＮＡの導入に続いて、操作された細胞は、１〜２日間富化培地で増殖させられ得、次いで、選択培地に切り替えられる。組換えプラスミドにおける選択マーカーは、選択に対する耐性を与え、そして細胞が、プラスミドをその染色体内に安定に組み込み、そして増殖して、細胞増殖巣を形成し、次にこれはクローニングされ得、増殖して細胞株になることを可能にする。この方法は、抗体分子を発現する細胞株を操作するために、有利に使用され得る。このような操作された細胞株は、直接的または間接的に抗体分子と相互作用する化合物のスクリーニングおよび評価において、特に有用であり得る。
多数の選択系が使用され得、この選択系は、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ １１：２２３（１９７７））、ヒポキサンチン−グアニン ホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ＆Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ４８：２０２（１９９２））、およびアデニン ホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙら、Ｃｅｌｌ ２２：８１７（１９８０））の遺伝子（これらの遺伝子は、ｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−またはａｐｒｔ−細胞においてそれぞれ使用され得る）を含むが限定されない。また、代謝拮抗物質耐性は、以下の遺伝子の選択の基礎として使用され得る：ｄｈｆｒ、これはメトトレキサートに対する耐性を与える（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：３５７（１９８０）；Ｏ’Ｈａｒｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：１５２７（１９８１））；ｇｐｔ、これはミコフェノール酸に対する耐性を与える（Ｍｕｌｌｉｇａｎ＆Ｂｅｒｇ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：２０７２（１９８１））；ｎｅｏ、これはアミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を与える（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ １２：４８８−５０５；ＷｕおよびＷｕ、Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ３：８７−９５（１９９１）；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３−５９６（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６−９３２（１９９３）；およびＭｏｒｇａｎおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７（１９９３）；１９９３年５月、ＴＩＢ ＴＥＣＨ １１（５）：１５５−２１５）；ならびにｈｙｇｒｏ、これはハイグロマイシンに対する耐性を与える（Ｓａｎｔｅｒｒｅら、Ｇｅｎｅ ３０：１４７（１９８４））。組換えＤＮＡ技術の分野で一般に公知の方法は、所望の組換えクローンを選択するために、慣用的に適用され得、そしてこのような方法は、以下に記載されている：例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮＹ（１９９３）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９９０）；ならびにＤｒａｃｏｐｏｌｉら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１２章および１３章、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮＹ（１９９４）；Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． １５０：１（１９８１）（これらはその全体が本明細書中に参考として援用される）。
抗体分子の発現レベルは、ベクター増幅によって増大され得る（総説として、ＢｅｂｂｉｎｇｔｏｎおよびＨｅｎｔｓｃｈｅｌ、Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｖｅｃｔｏｒｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｇｅｎｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｖｏｌ．３．（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８７）を参照のこと）。抗体を発現するベクター系におけるマーカーが、増幅可能であると、宿主細胞の培養物に存在するインヒビターのレベルにおける増加は、マーカー遺伝子のコピーの数を増加する。増幅領域は抗体遺伝子と結合しているので、抗体の産生もまた増加する（Ｃｒｏｕｓｅら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２５７（１９８３））。
グルタミンシンターゼ（ＧＳ）またはＤＨＦＲを選択マーカーとして使用するベクターは、それぞれ、薬物メチオニンスルホキシミン（ｓｕｌｐｈｏｘｉｍｉｎｅ）またはメトトレキセートの存在下で、増幅され得る。グルタミンシンターゼベースのベクターの利点は、グルタミンシンターゼネガティブの細胞株（例えば、マウス骨髄腫細胞株のＮＳ０）の入手可能性である。グルタミンシンターゼ発現系はまた、内因性遺伝子の機能を防止するためにさらなるインヒビターを提供することによって、グルタミンシンターゼ発現細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞）において機能し得る。グルタミンシンターゼ発現系およびその構成要素は、以下のＰＣＴ公開において詳述される：ＷＯ８７／０４４６２；ＷＯ８６／０５８０７；ＷＯ８９／０１０３６；ＷＯ８９／１０４０４およびＷＯ９１／０６６５７（これらは、その全体が本明細書中で参考として援用される）。さらに、本発明に従って使用され得るグルタミンシンターゼ発現ベクターは、例えば、Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｐｏｒｔｓｍｏｕｔｈ，ＮＨ）を含む業者から市販される。マウス骨髄腫細胞においてＧＣ発現系を使用する、モノクローナル抗体の発現および産生は、Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎら、Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６９（１９９２）ならびにＢｉｂｌｉａおよびＲｏｂｉｎｓｏｎ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１１：１（１９９５）（これらは、本明細書中でその全体が参考として援用される）に記載される。
宿主細胞は、本発明の二つの発現ベクター（重鎖由来のポリペプチドをコードする第一のベクターおよび軽鎖由来のポリペプチドをコードする第二のベクター）で、同時トランスフェクトされ得る。この二つのベクターは、重鎖および軽鎖のポリペプチドの等しい発現を可能にする、同一の選択マーカーを含み得る。あるいは、重鎖および軽鎖両方のポリペプチドをコードし、そして発現することができる、単一のベクターが使用され得る。このような状況において、過剰の毒性の遊離重鎖を避けるために、重鎖の前に軽鎖が配置されるべきである（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ、Ｎａｔｕｒｅ ３２２：５２（１９８６）；Ｋｏｈｌｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：２１９７（１９８０））。重鎖および軽鎖のためのコード配列はｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含み得る。
一旦本発明の抗体分子が、動物によって産生されるか、化学的に合成されるか、または組換えにより発現されると、当該分野で公知の、免疫グロブリン分子の精製のための任意の方法、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー（特に、プロテインＡの後に特異的抗原に対するアフィニティーによる）、およびサイズカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度差、またはタンパク質精製のための任意の他の標準的な技術によって、精製され得る。さらに、治療タンパク質に結合し、そして本発明のアルブミン融合タンパク質の治療タンパク質部分に応答し得る、抗体またはそのフラグメントは、本明細書中に記載されるかまたはそうでなければ当該分野において公知の、異種ポリペプチド配列に融合され得、精製を容易にする。
（抗体の改変）
治療タンパク質に結合する抗体、またはフラグメントもしくは改変体は、精製を容易にするペプチドのような、マーカー配列に融合され得る。好ましい実施形態において、マーカーアミノ酸配列は、とりわけヘキサ−ヒスチジンペプチド（例えば、ｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ，９１３１１）において提供されるタグ）であり、これらの多くのマーカーアミノ酸配列が市販されている。例えば、Ｇｅｎｔｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８２１−８２４（１９８９）に記載されるように、ヘキサ−ヒスチジンは、融合タンパク質の都合の良い精製を提供する。精製のために有用な他のペプチドタグは、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピトープに対応する赤血球凝集素タグ（「ＨＡ」タグともまた称される）（Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７（１９８４））、および「ｆｌａｇ」タグを含むが、これに限定されない。
本発明は、診断剤または治療剤に結合体化される、抗体またはそのフラグメントをさらに含む。抗体は、例えば、臨床上の試験手順（例えば、所定の処置レジメンの効力を決定するため）の一部として、腫瘍の発生または進行をモニターするために、診断的に使用され得る。検出は、抗体を検出可能な物質と連結させることによって容易にされ得る。検出可能な物質の例としては、種々の酵素、補欠分子団、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性物質、種々の陽電子放射断層撮影を使用する陽電子放射金属、および非放射性常磁性金属イオンが挙げられる。この検出可能な物質は、抗体（またはそのフラグメント）に対して、直接的、または当該分野で公知の技術を使用する媒介物（例えば、当該分野で公知のリンカーなど）を介して間接的のいずれかで、連結または結合体化され得る。例えば、本発明に従う診断薬としての使用のための抗体に結合され得る金属イオンに関しては、米国特許第４，７４１，９００号を参照のこと。適切な酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ；適切な補欠分子団複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられ；適切な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンが挙げられ；発光物質の例としては、ルミノールが挙げられ；生物発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンが挙げられ；ならびに、適切な放射性物質の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎまたは９９Ｔｃが挙げられる。検出可能な物質の他の例は、本明細書中の他の箇所に記載されている。
さらに、本発明の抗体は、治療用部分（例えば細胞毒（例えば細胞増殖抑制性もしくは細胞殺傷性の薬剤））、治療剤または放射性金属イオン（例えば、α−エミッタ−（例えば２１３Ｂｉ）など）に結合され得る。細胞毒または細胞毒性薬剤は、細胞に対して有害な任意の薬剤を含む。例としては、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｏｌ）、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン（ｃｏｌｃｈｉｃｉｎ）、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ ａｎｔｈｒａｃｉｎ ｄｉｏｎｅ）、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシン、ならびにそのアナログまたはホモログが挙げられる。治療剤は、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン（５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパ（ｔｈｉｏｅｐａ）クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、ならびにｃｉｓ−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アンスラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前はダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアンスラマイシン（ａｎｔｈｒａｍｙｃｉｎ）（ＡＭＣ））、ならびに抗有糸分裂剤（例えばビンクリスチンおよびビンブラスチン）、を含むが、それらに限定されない。
本発明の結合体は、所定の生物学的応答を改変するために使用され得、治療剤または薬物部分は、古典的な化学的治療剤に限定されると解釈されない。例えば、薬物部分は、所望の生物学的活性を有するタンパク質またはポリペプチドであり得る。このようなタンパク質としては、例えば、毒素（例えばアブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素、またはジフテリア毒素）；タンパク質（例えば、腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経発育因子、血小板由来増殖因子、組織プラスミノゲンアクチベーター、アポトーシス薬（例えば、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＡＩＭ Ｉ（国際公開第ＷＯ９７／３３８９９号を参照のこと）、ＡＩＭ ＩＩ（国際公開第ＷＯ９７／３４９１１号を参照のこと）、Ｆａｓリガンド（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：１５６７−１５７４（１９９４））、ＶＥＧＩ（国際公開第ＷＯ９９／２３１０５号を参照のこと））、血栓症薬もしくは抗脈管形成薬（例えば、アンジオスタチンもしくはエンドスタチン）；または生物学的応答改変剤（例えばリンホカイン、インターロイキン−１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン−２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）、または他の増殖因子など）、が挙げられ得る。
抗体はまた、固体支持体に付着させられ得、この固体支持体は、標的抗原の免疫アッセイまたは精製に特に有用である。このような固体支持体としては、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニルまたはポリプロピレンが挙げられるがそれらに限定されない。
このような治療部分を抗体に結合する技術は周知であり、例えば、Ａｒｎｏｎら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｏｆ Ｄｒｕｇｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ」Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｒｅｉｓｆｅｌｄら（編）、２４３−５６頁（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９８５）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（第２版）、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら（編）、６２３−５３頁（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．１９８７）；Ｔｈｏｒｐｅ、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｒｒｉｅｒｓ Ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｇｅｎｔｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ」Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｐｉｎｃｈｅｒａら（編）、４７５−５０６頁（１９８５）；「Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｕｓｅ Ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ」Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｂａｌｄｗｉｎら（編）、３０３−１６頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９８５）、およびＴｈｏｒｐｅら、「Ｔｈｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ Ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１１９−５８（１９８２）を参照のこと。
あるいは、抗体は２次抗体に結合され、米国特許第４，６７６，９８０号（これは、その全体が本明細書に参考として援用される）におけるＳｅｇａｌによる記載のような抗体の異種結合体（ｈｅｔｅｒｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を形成し得る。
単独、あるいは細胞毒性因子および／またはサイトカインと組み合わせて投与される、抗体に結合する治療部分を有するかまたは有さない抗体が、治療薬として使用され得る。
（抗体−アルブミン融合物）
治療タンパク質に結合し、そして本発明のアルブミン融合タンパク質の治療タンパク質部分に対応し得る抗体としては、表１の「治療タンパク質Ｘ」の欄に開示される治療タンパク質に結合する抗体、またはそのフラグメントもしくは改変体が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態において、治療タンパク質に免疫特異的に結合し、そしてアルブミン融合タンパク質の治療タンパク質部分に対応する抗体のフラグメントまたは改変体は、ＶＨドメインを含むかまたはＶＨドメインからなる。他の実施形態において、治療タンパク質に免疫特異的に結合し、そしてアルブミン融合タンパク質の治療タンパク質部分に対応する抗体のフラグメントまたは改変体は、１つ、２つまたは３つのＶＨ ＣＤＲを含むかまたはこれらからなる。他の実施形態において、治療タンパク質に免疫特異的に結合し、そしてアルブミン融合タンパク質の治療タンパク質部分に対応する抗体のフラグメントまたは改変体は、ＶＨ ＣＤＲ１を含むかまたはＶＨ ＣＤＲ１からなる。他の実施形態において、治療タンパク質に免疫特異的に結合し、そしてアルブミン融合タンパク質の治療タンパク質部分に対応する抗体のフラグメントまたは改変体は、ＶＨ ＣＤＲ２を含むかまたはＶＨ ＣＤＲ２からなる。他の実施形態において、治療タンパク質に免疫特異的に結合し、そしてアルブミン融合タンパク質の治療タンパク質部分に対応する抗体のフラグメントまたは改変体は、ＶＨ ＣＤＲ３を含むかまたはＶＨ ＣＤＲ３からなる。
特定の実施形態において、治療タンパク質に免疫特異的に結合し、そしてアルブミン融合タンパク質の治療タンパク質部分に対応する抗体のフラグメントまたは改変体は、ＶＬドメインを含むかまたはＶＬドメインからなる。他の実施形態において、治療タンパク質に免疫特異的に結合し、そしてアルブミン融合タンパク質の治療タンパク質部分に対応する抗体のフラグメントまたは改変体は、１つ、２つまたは３つのＶＬ ＣＤＲを含むかまたはこれらからなる。他の実施形態において、治療タンパク質に免疫特異的に結合し、そしてアルブミン融合タンパク質の治療タンパク質部分に対応する抗体のフラグメントまたは改変体は、ＶＬ ＣＤＲ１を含むかまたはＶＬ ＣＤＲ１からなる。他の実施形態において、治療タンパク質に免疫特異的に結合し、そしてアルブミン融合タンパク質の治療タンパク質部分に対応する抗体のフラグメントまたは改変体は、ＶＬ ＣＤＲ２を含むかまたはＶＬ ＣＤＲ２からなる。他の実施形態において、治療タンパク質に免疫特異的に結合し、そしてアルブミン融合タンパク質の治療タンパク質部分に対応する抗体のフラグメントまたは改変体は、ＶＬ ＣＤＲ３を含むかまたはＶＬ ＣＤＲ３からなる。
他の実施形態において、治療タンパク質に免疫特異的に結合し、そしてアルブミン融合タンパク質の治療タンパク質部分に対応する抗体のフラグメントまたは改変体は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つのＶＬ ＣＤＲおよび／またはＶＨ ＣＤＲを含むかまたはこれらからなる。
好ましい実施形態において、治療タンパク質に免疫特異的に結合し、そしてアルブミン融合タンパク質の治療タンパク質部分に対応する抗体のフラグメントまたは改変体は、ペプチドリンカー（例えば、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３（配列番号１０９２））によって治療抗体のＶＬドメインに連結された、治療抗体のＶＨドメインを含むｓｃＦｖを含むかまたはこれらからなる。
（免疫表現型分類（ｉｍｍｕｎｏｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ））
本発明の抗体、あるいは治療タンパク質（またはそのフラグメントもしくは改変体）に結合する抗体の少なくとも１つのフラグメントまたは改変体を含む本発明のアルブミン融合タンパク質は、細胞株および生物学的サンプルの免疫表現型分類のために利用され得る。本発明の治療タンパク質は、細胞特異的マーカーとして、あるいはより詳細には、特定の細胞型の分化および／または成熟の種々の段階で差示的に発現される細胞マーカーとして有用であり得る。特異的エピトープ、またはエピトープの組み合わせに対して指向されるモノクロナール抗体（あるいは治療タンパク質に結合する抗体の少なくとも１つのフラグメントまたは改変体を含むルブミン融合タンパク質）は、マーカーを発現する細胞集団のスクリーニングを可能とする。種々の技術が、マーカーを発現する細胞集団をスクリーニングするために、モノクロナール抗体（あるいは治療タンパク質に結合する抗体の少なくとも１つのフラグメントまたは改変体を含むルブミン融合タンパク質）を用いて利用され得、そしてその技術には、抗体でコーティングされた磁気ビーズを用いる磁気分離、固体マトリクス（すなわち、プレート）に付着した抗体を用いる「パンニング」、ならびにフローサイトメトリー（例えば、米国特許第５，９８５，６６０号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｃｅｌｌ，９６：７３７−４９（１９９９）を参照のこと）が挙げられる。
これらの技術は、血液学的悪性腫瘍（すなわち、急性白血病患者における最少残留疾患（ｍｉｎｉｍａｌ ｒｅｓｉｄｕａｌ ｄｉｓｅａｓｅ）（ＭＲＤ））および対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）を予防するための移植術における「非自己」細胞と共に見出され得るような、細胞の特定集団のスクリーニングを可能にする。あるいは、これらの技術は、ヒト臍帯血において見出され得るような増殖および／または分化を受け得る、造血幹細胞および先祖細胞のスクリーニングを可能にする。
（治療タンパク質に結合する抗体、および治療タンパク質に結合する抗体のフラグメントまたは改変体を含むアルブミン融合タンパク質の特徴づけ）
本発明の抗体、または治療タンパク質（またはそのフラグメントもしくは改変体）に結合する抗体の少なくともフラグメントもしくは改変体を含む本発明のアルブミン融合タンパク質は、種々の方法で特徴づけされ得る。特に、治療タンパク質に結合する抗体の少なくともフラグメントまたは改変体を含む、本発明のアルブミン融合タンパク質は、本明細書中に記載される技術を使用してか、または当該分野で公知の技術を慣用的に改変して、アルブミン融合タンパク質の治療タンパク質部分に結合する抗体に対応する、治療タンパク質に結合する抗体によって特異的に結合される同じ抗原に特異的に結合する能力について、アッセイされ得る。
本発明の抗体、または治療タンパク質（またはそのフラグメントもしくは改変体）に結合する抗体の少なくともフラグメントもしくは改変体を含む本発明のアルブミン融合タンパク質が、特異的タンパク質またはエピトープに（特異的に）結合する能力についてのアッセイは、溶液中で（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：４１２−４２１（１９９２））、あるいはビーズ（例えば、Ｌａｍ、Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２−８４（１９９１））、チップ上で（例えば、Ｆｏｄｏｒ、Ｎａｔｕｒｅ ３６４：５５５−５５６（１９９３））、細菌上で（例えば、米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子（例えば、米国特許第５，５７１，６９８号；同第５，４０３，４８４号および同第５，２２３，４０９号）、プラスミド（例えば、Ｃｕｌｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１８６５−１８６９（１９９２））またはファージ（例えば、ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６−３９０（１９９０）；Ｄｅｖｌｉｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：４０４−４０６（１９９０）；Ｃｗｉｒｌａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：６３７８−６３８２（１９９０）；Ｆｅｌｉｃｉ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３０１−３１０（１９９１））（これらの参考文献の各々は、その全体が本明細書中で参考として援用される）で実施され得る。本発明の抗体、または治療タンパク質（またはそのフラグメントもしくは改変体）に結合する抗体の少なくともフラグメントもしくは改変体を含む本発明のアルブミン融合タンパク質はまた、本明細書中に記載される技術または他の当該分野で公知の技術を使用または慣用的に改変して、特定のタンパク質またはエピトープに対するそれらの特異性および親和性について、アッセイされ得る。
治療タンパク質に結合する抗体の少なくともフラグメントもしくは改変体を含む本発明のアルブミン融合タンパク質は、当該分野で公知の任意の方法によって、他の抗原（例えば、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療タンパク質部分に対応する、治療タンパク質（またはそのフラグメントもしくは改変体）に結合する抗体によって特異的に結合される分子との、配列保存／構造保存を有する分子）との交差反応性についてアッセイされ得る。
（免疫特異的な）結合および交差反応性を分析するために使用され得る免疫アッセイとしては、いくつかのものについてだけ名称を挙げると、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射定量アッセイ、蛍光免疫アッセイ、プロテインＡ免疫アッセイのような技術を用いる競合アッセイ系および非競合アッセイ系が挙げられるが、これらに限定されない。このようなアッセイは慣用的であり、そして当該分野において周知である（例えば、その全体が本明細書中に参考として援用される、Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと）。例示的な免疫アッセイが、以下に簡潔に記載される（が、これらは限定を目的とすることが意図されない）。
免疫沈降プロトコルは、一般に、タンパク質ホスファターゼインヒビターおよび／またはプロテアーゼインヒビター（例えば、ＥＤＴＡ、ＰＭＳＦ、アプロチニン、バナジン酸ナトリウム）を補充したＲＩＰＡ緩衝液（１％ ＮＰ−４０またはＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１％ デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ ＳＤＳ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１Ｍ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）、１％ Ｔｒａｓｙｌｏｌ）のような溶解緩衝液中で、細胞の集団を溶解する工程、本発明の抗体あるいは治療タンパク質（またはそのフラグメントもしくは改変体）に結合する抗体の少なくとも１つのフラグメントまたは改変体を含む本発明のアルブミン融合タンパク質を細胞溶解物に添加する工程、一定時間（例えば、１〜４時間）４０℃でインキュベートする工程、プロテインＡセファロースビーズおよび／またはプロテインＧセファロースビーズ（あるいは、アルブミン融合タンパク質が治療抗体の少なくとも１つのフラグメントまたは改変体を含む場合、適切な抗イディオタイプ抗体または抗アルブミン抗体でコーティングされたビーズ）を細胞溶解物に添加する工程、約１時間以上４０℃でインキュベートする工程、溶解緩衝液中でビーズを洗浄する工程、およびＳＤＳ／サンプル緩衝液中でビーズを再懸濁する工程を包含する。
本発明の抗体またはアルブミン融合タンパク質の、特定の抗原を免疫沈降する能力は、例えば、ウエスタンブロット分析により、アッセイされ得る。当業者は、抗体またはアルブミン融合タンパク質の抗原への結合を増加するように、そしてバックグラウンドを減少させるように改変され得るパラメータ（例えば、セファロースビーズを用いて細胞溶解物を事前にきれいにする工程）に関して、知識があり得る。免疫沈降プロトコルに関するさらなる考察については、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９９４、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１０．１６．１を参照のこと。
ウエスタンブロット分析は、一般に、タンパク質サンプルを調製する工程、ポリアクリルアミドゲル（例えば、抗原の分子量に応じた８％〜２０％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）中でのそのタンパク質サンプルの電気泳動、そのタンパク質サンプルをそのポリアクリルアミドゲルからニトロセルロース、ＰＶＤＦまたはナイロンのような膜に移す工程、ブロッキング溶液（例えば、３％ ＢＳＡまたは脱脂粉乳を有するＰＢＳ）中でその膜をブロックする工程、洗浄緩衝液（例えば、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ ２０）中でその膜を洗浄する工程、（ブロッキング緩衝液中に希釈した）本発明の抗体またはアルブミン融合タンパク質を膜に適用する工程、洗浄緩衝液中でその膜を洗浄する工程、ブロッキング緩衝液中で希釈された酵素基質（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）あるいは放射性分子（例えば、３２Ｐまたは１２５Ｉ）に結合した二次抗体（一次抗体を認識する、例えば、抗ヒト血清アルブミン抗体）を適用する工程、洗浄緩衝液中でその膜を洗浄する工程、ならびにその抗原の存在を検出する工程を包含する。当業者は、検出されるシグナルを増加させるように、そしてバックグラウンドノイズを減少させるように改変され得るパラメータに関して、知識があり得る。ウエスタンブロットプロトコルに関するさらなる考察については、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１０．８．１を参照のこと。
ＥＬＩＳＡは、抗原を調製する工程、９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルをその抗原でコーティングする工程、そのウェルに結合しなかった抗原を洗浄除去する工程、酵素基質（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）のような検出可能な化合物に結合した本発明の抗体またはアルブミン融合タンパク質（治療タンパク質に結合する抗体の少なくとも１つのフラグメントまたは改変体を含む）をそのウェルに添加し、そして一定時間インキュベートする工程、未結合のアルブミン融合タンパク質または非特異的に結合したアルブミン融合タンパク質を洗浄除去する工程、およびその抗体またはウェルをコーティングする抗原に特異的に結合するアルブミン融合タンパク質の存在を検出する工程を包含する。ＥＬＩＳＡにおいて、抗体またはアルブミン融合タンパク質は、検出可能な化合物に結合している必要はない；その代わり、検出可能な化合物に結合した第二の抗体（それぞれ、抗体またはアルブミン融合タンパク質を認識する）が、ウェルに添加され得る。さらに、ウェルを抗原でコーティングする代わりに、抗体またはアルブミン融合タンパク質がウェルにコーティングされ得る。この場合、検出可能な分子は、検出可能な化合物（例えば、酵素基質（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ））に結合体化された抗原であり得る。当業者は、検出されるシグナルを増加させるように改変され得るパラメータ、および当該分野において公知のＥＬＩＳＡの他のバリエーションに関して、知識があり得る。ＥＬＩＳＡに関するさらなる考察については、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１１．２．１を参照のこと。
タンパク質、抗原またはエピトープに対するアルブミン融合タンパク質の結合親和性および抗体−またはアルブミン融合タンパク質−タンパク質／抗原／エピトープ相互作用のオフ速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）が、競合結合アッセイにより決定され得る。競合結合アッセイの一つの例は、ラジオイムノアッセイであり、ラジオイムノアッセイは、標識抗原（例えば、３Ｈまたは１２５Ｉ）と、漸増量の非標識抗原の存在下での、本発明の抗体またはアルブミン融合タンパク質を用いるインキュベーション、および標識抗原に結合した抗体の検出を含む。特定のタンパク質、抗原またはエピトープに対する本発明の抗体またはアルブミン融合タンパク質の親和性、および結合オフレートは、スキャッチャードプロット分析によるデータから決定され得る。抗体またはアルブミン融合タンパク質と同じタンパク質、抗原またはエピトープに結合する第二のタンパク質との競合はまた、ラジオイムノアッセイを用いて決定され得る。この場合、タンパク質、抗原またはエピトープは、本発明のアルブミン融合タンパク質と同じタンパク質、抗原またはエピトープに結合する、漸増量の非標識の第二のタンパク質の存在下で、標識化合物（例えば、３Ｈまたは１２５Ｉ）に結合した本発明の抗体またはアルブミン融合タンパク質とともにインキュベートされる。
好ましい実施形態において、ＢＩＡｃｏｒｅ反応速度分析は、タンパク質、抗原またはエピトープに対する、本発明の抗体またはアルブミン融合タンパク質の結合のオン（ｏｎ）速度およびオフ（ｏｆｆ）速度を決定するために使用される。ＢＩＡｃｏｒｅ反応速度分析は、その表面上にそれぞれ固定化された、特異的ポリペプチド、抗原もしくはエピトープ、抗体もしくはアルブミン融合タンパク質との、チップからの抗体、アルブミン融合タンパク質、または特異的ポリペプチド、抗原もしくはエピトープの、結合および解離を分析する工程を包含する。
（治療用途）
本発明はさらに、抗体ベースの治療に関し、この治療は、１つ以上の開示された疾患、障害、または状態を処置するために、動物、好ましくは哺乳動物、そして最も好ましくはヒトの患者に、本発明の抗体、または治療タンパク質に結合する抗体の少なくともフラグメントもしくは改変体を含む本発明のアルブミン融合タンパク質を投与する工程を包含する。本発明の治療化合物としては、本発明の抗体（本明細書中に記載されるような、それらのフラグメント、アナログおよび誘導体を含む）、本発明の抗体をコードする核酸（本明細書中に記載されるような、それらのフラグメント、アナログおよび誘導体ならびに抗イディオタイプ抗体を含む）、治療タンパク質に結合する抗体の少なくとも１つのフラグメントまたは改変体を含む本発明のアルブミン融合タンパク質、ならびにこのようなアルブミン融合タンパク質をコードする核酸が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の抗体、または治療タンパク質に結合する抗体の少なくともフラグメントもしくは改変体を含む本発明のアルブミン融合タンパク質は、治療タンパク質の異常な発現および／または活性に関連した疾患、障害または状態（本明細書中に記載される任意の１つ以上の疾患、障害、または状態を含むがこれらに限定されない）を処置、阻害または予防するために使用され得る。治療タンパク質の異常な発現および／または活性に関連した疾患、障害または状態の処置および／または予防は、それらの疾患、障害または状態に関連した症状を緩和する工程を含むが、これに限定されない。本発明の抗体、または治療タンパク質に結合する抗体の少なくともフラグメントもしくは改変体を含む本発明のアルブミン融合タンパク質は、当該分野で公知であるか、または本明細書中に記載されるように、薬学的に受容可能な組成物中に提供され得る。
特異的かつ好ましい実施形態において、本発明は、抗体ベースの治療に関し、この治療は、１つ以上の疾患、障害、または状態（以下が挙げられるが、これらに限定されない：神経障害、免疫系障害、筋障害、生殖障害、胃腸障害、肺障害、心血管障害、腎障害、増殖障害ならびに／または癌性の疾患および状態、ならびに／あるいは本明細書中の他の箇所に記載されるもの）を処置するために、動物、好ましくは哺乳動物、そして最も好ましくはヒトの患者に、本発明の抗体、または治療タンパク質に結合する抗体の少なくともフラグメントもしくは改変体を含む本発明のアルブミン融合タンパク質を投与する工程を包含する。本発明の治療化合物としては、本発明の抗体（例えば、哺乳動物細胞の細胞表面上に発現される全長タンパク質に対する抗体；治療タンパク質のエピトープに対する抗体）ならびに本発明の抗体をコードする核酸（本明細書中に記載されるような、それらのフラグメント、アナログおよび誘導体ならびに抗イディオタイプ抗体を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の抗体、または治療タンパク質に結合する抗体の少なくともフラグメントもしくは改変体を含む本発明のアルブミン融合タンパク質は、治療タンパク質の異常な発現および／または活性に関連した疾患、障害または状態（本明細書中に記載される任意の１つ以上の疾患、障害、または状態を含むがこれらに限定されない）を処置、阻害または予防するために使用され得る。治療タンパク質の異常な発現および／または活性に関連した疾患、障害または状態の処置および／または予防は、それらの疾患、障害または状態に関連した症状を緩和する工程を含むが、これに限定されない。本発明の抗体は、当該分野で公知であるか、または本明細書中に記載されるように、薬学的に受容可能な組成物中に提供され得る。
治療タンパク質に結合する抗体の少なくともフラグメントまたは変異体を含む本発明の抗体または本発明のアルブミン融合タンパク質が治療的に使用され得る方法の概要は、結合治療タンパク質を、身体において局所的もしくは全身的に、または抗体の直接的な細胞傷害性（例えば、補体による媒介（ＣＤＣ）もしくはエフェクター細胞による媒介（ＡＤＣＣ））により結合させる工程を包含する。これらのアプローチのいくつかは、以下により詳細に記載される。本明細書中に提供される教示があれば、当業者は、治療タンパク質に結合する抗体の少なくともフラグメントまたは変異体を含む本発明の抗体または本発明のアルブミン融合タンパク質を、過度の実験なくして、診断、モニタリングまたは治療の目的のために使用する方法を知る。
治療タンパク質に結合する抗体の少なくともフラグメントまたは変異体を含む本発明の抗体または本発明のアルブミン融合タンパク質は、他のモノクローナル抗体もしくはキメラ抗体と組み合わせて、または例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−３およびＩＬ−７のようなリンホカインもしくは造血増殖因子（例えば、これは、抗体と相互作用するエフェクター細胞の数または活性が増加するように作用する）と組み合わせて、有利に利用され得る。
治療タンパク質に結合する抗体の少なくともフラグメントまたは変異体を含む本発明の抗体または本発明のアルブミン融合タンパク質は、単独で、または他の型の処置（例えば、放射線治療、化学療法、ホルモン性治療、免疫治療および抗腫瘍薬剤）と組み合わせて投与され得る。一般的に、患者のそれと同じ種である本来の種または反応性種の産物の投与（抗体の場合において）は、好まれる。従って、好ましい実施形態において、ヒト抗体、フラグメント誘導体、アナログまたは核酸は、治療または予防のためにヒト患者に投与される。
治療タンパク質、そのフラグメントもしくは領域に対して、高親和性および／または強力なインビボ阻害抗体および／または中和抗体を使用することは、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド（そのフラグメントを含む）に直結するイムノアッセイおよびそれに関連する障害の治療の両方のために好ましい。このような抗体、フラグメント、または領域は、好ましくは、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド（そのフラグメントを含む）に対する親和性を有する。好ましい結合親和性は、解離定数、または５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ未満のＫｄ（解離定数）を含む。さらに好ましい結合親和性は、それらと同じ解離定数、または５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、もしくは１０−８Ｍ未満のＫｄ（解離定数）を含む。なお、さらに好ましい結合親和性は、それらと同じ解離定数、または５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、もしくは１０−１５Ｍ未満のＫｄ（解離定数）を含む。
（遺伝子治療）
特定の実施形態において、治療タンパク質に結合する抗体の少なくともフラグメントまたは変異体を含む治療タンパク質またはアルブミン融合タンパク質に結合する抗体をコードする配列を含む核酸は、遺伝子治療の方法によって、治療タンパク質の異常な発現および／または活性に関連する疾患または障害を処置、阻害または妨害するために投与される。遺伝子治療とは、発現されるまたは発現可能な核酸の被験体への投与によって実施される治療をいう。本発明の実施形態において、核酸は、治療的効果を媒介するこれらのコードされたタンパク質を作製する。
当該分野で利用可能な遺伝子治療についての任意の方法は、本発明に従い使用され得る。代表的な方法は、本明細書中の他の部分により詳細に記載される。
（治療的または予防的活性の説明）
本発明の化合物または薬学的組成物は、好ましくは、ヒトでの使用の前にインビトロで、そして次いでインビボで、所望の治療活性または予防活性について試験される。例えば、化合物または薬学的組成物の、治療有用性または予防有用性を証明するためのインビトロアッセイとしては、細胞株または患者組織サンプルに対する化合物の効果が挙げられる。細胞株および／または組織サンプルに対する化合物または組成物の効果は、当業者に公知である技術（ロゼット形成アッセイおよび細胞溶解アッセイが挙げられるがこれらに限定されない）を利用して決定され得る。本発明に従って、特定の化合物の投与が示されるか否かを決定するために用いられ得るインビトロアッセイとしては、インビトロ細胞培養アッセイが挙げられ、このアッセイでは、患者組織サンプルが培養物において増殖し、そして化合物に曝されるか、そうでなければ化合物が投与され、そして、組織サンプルに対するそのような化合物の効果が観察される。
（治療的／予防的な投与および組成物）
本発明は、被験体への有効量の本発明の化合物または薬学的組成物の投与による処置、阻害および予防の方法を提供する。好ましい実施形態において、化合物は実質的に精製される（例えば、その効果を制限するかまたは望ましくない副作用を生じる物質は実質的にない）。被験体としては、好ましくは、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌなどの動物が挙げられるがそれらに限定されない動物であり、そして好ましくは哺乳動物であり、そして最も好ましくはヒトである。
化合物が核酸または免疫グロブリンを含む場合に使用され得る処方および投与方法は、上記に記載され；さらなる適切な処方および投与経路は、本明細書中で以下に記載されたものの中から選択され得る。
様々な送達系が公知であり、そして本発明の化合物を投与するために用いられ得る（例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセル、この化合物の発現が可能な組換え細胞中でのカプセル化、レセプター媒介エンドサイトーシス（例えば、ＷｕおよびＷｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２（１９８７）を参照のこと）、レトロウイルスまたは他のベクターの一部としての核酸の構築など）。導入方法としては、皮内、筋内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、および経口経路が挙げられるがそれらに限定されない。化合物または組成物は、任意の好都合な経路により（例えば、注入またはボーラス注射により、上皮または粘膜内層（例えば、口腔粘膜、直腸粘膜および腸粘膜など）を通しての吸収により）投与され得、そして他の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与され得る。投与は、全身的または局所的であり得る。さらに、本発明の薬学的化合物または組成物を、任意の適切な経路（脳室内注射および髄腔内注射を包含し；脳室内注射は、例えば、Ｏｍｍａｙａリザーバのようなリザーバに取り付けられた脳室内カテーテルにより容易にされ得る）により中枢神経系に導入することが望まれ得る。例えば、吸入器または噴霧器の使用、およびエアゾール化剤を用いた処方により、肺投与もまた使用され得る。
具体的な実施形態において、本発明の薬学的化合物または組成物を、処置の必要な領域に局所的に投与することが望まれ得る；これは、制限する目的ではないが、例えば、手術中の局部注入、局所適用（例えば、手術後の創傷包帯と組み合わせること）により、注射により、カテーテルにより、坐剤により、またはインプラント（このインプラントは、シアラスティック（ｓｉａｌａｓｔｉｃ）膜のような膜または繊維を含む、多孔性、非多孔性、または膠様材料である）により達成され得る。好ましくは、抗体を含む本発明のタンパク質を投与する際、タンパク質が吸収されない材料を使用するために注意が払われなければならない。
別の実施形態において、化合物または組成物は、小胞、特に、リポソーム中へ送達され得る（Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３（１９９０）；Ｔｒｅａｔら，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ，Ｌｏｐｅｚ−ＢｅｒｅｓｔｅｉｎおよびＦｉｄｌｅｒ（編），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，３５３〜３６５頁（１９８９）；Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ，同書３１７〜３２７頁を参照のこと；広く同書を参照のこと）。
さらに別の実施形態において、化合物または組成物は制御された放出系において送達され得る。１つの実施形態において、ポンプが用いられ得る（Ｌａｎｇｅｒ，（前出）；Ｓｅｆｔｏｎ，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１（１９８７）；Ｂｕｃｈｗａｌｄら，Ｓｕｒｇｅｒｙ ８８：５０７（１９８０）；Ｓａｕｄｅｋら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４（１９８９）を参照のこと）。別の実施形態において、高分子材料が用いられ得る（Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，ＬａｎｇｅｒおよびＷｉｓｅ（編），ＣＲＣ Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ（１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，ＳｍｏｌｅｎおよびＢａｌｌ（編），Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８４）；ＲａｎｇｅｒおよびＰｅｐｐａｓ，Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６１（１９８３）を参照のこと；Ｌｅｖｙら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１９０（１９８５）；Ｄｕｒｉｎｇら，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１（１９８９）；Ｈｏｗａｒｄら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５（１９８９）もまた参照のこと）。さらに別の実施形態において、制御された放出系は、治療標的、例えば、脳の近くに置かれ得、従って、全身用量の一部のみを必要とする（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，（前出），第２巻，１１５〜１３８頁（１９８４）を参照のこと）。
他の制御された放出系は、Ｌａｎｇｅｒにより総説において議論される（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３（１９９０））。
本発明の化合物がタンパク質をコードする核酸である、具体的な実施形態において、その核酸は、それを適切な核酸発現ベクターの一部として構成し、そしてそれが細胞内になるように投与することにより（例えば、レトロウイルスベクターの使用により（米国特許第４，９８０，２８６号を参照のこと）、または直接注射により、または微粒子ボンバードメント（例えば、遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ，Ｄｕｐｏｎｔ）の使用により、または脂質もしくは細胞表面レセプターもしくはトランスフェクト剤でコーティングすることにより、または核に入ることが公知であるホメオボックス様ペプチドと結合させて投与すること（例えば、Ｊｏｌｉｏｔら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１８６４−１８６８（１９９１）を参照のこと）などにより、そのコードされたタンパク質の発現を促進するようにインビボで投与され得る。あるいは、核酸は、細胞内に導入され得、そして、発現のために相同組換えにより宿主細胞ＤＮＡ内に組み込まれ得る。
本発明はまた、薬学的組成物を提供する。このような組成物は、治療有効量の化合物、および薬学的に受容可能なキャリアを含む。具体的な実施形態において、用語「薬学的に受容可能な」とは、動物における、そしてさらに特にヒトにおける使用のために、連邦規制当局もしくは米国政府により認められたか、または米国薬局方もしくは他の一般に認められた薬局方に列挙されたことを意味する。用語「キャリア」とは、治療剤とともに投与される、希釈剤、アジュバンド、賦形剤、またはビヒクルをいう。このような薬学的なキャリアは、水および油（石油起源、動物起源、植物起源、または合成起源の油（例えば、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油など）を含む）のような滅菌した液体であり得る。
水は、薬学的組成物が静脈内に投与される場合に、好ましいキャリアである。生理食塩水溶液、ならびにデキストロースおよびグリセロールの水溶液はまた、特に注射可能な溶液のために、液体キャリアとして使用され得る。適切な薬学的賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、イネ、フラワー、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、滑石、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。組成物はまた、所望されるならば、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含み得る。これらの組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、持続放出処方物などの形態を取り得る。この組成物は、従来の結合剤およびトリグリセリドのようなキャリアとともに、坐剤として処方され得る。経口処方物は、薬学的等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどのような標準キャリアを含み得る。適切な薬学的キャリアの例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載される。このような組成物は、治療有効量の化合物を、好ましくは精製された形態で、適切な量のキャリアとともに含んで、患者への適切な投与のための形態を提供する。処方物は、投与形態に適するべきである。
好ましい実施形態において、組成物は、慣用手順に従って、ヒトへの静脈内投与のために採用された薬学的組成物として、処方される。代表的には、静脈内投与のための組成物は、滅菌等張水性緩衝液の溶液である。必要な場合、組成物はまた、可溶化剤および注射の部位での痛みを緩和するリグノカインのような局部麻酔を含み得る。一般的には、成分は、別々にかまたは単一投薬形態で一緒に混合してのどちらかで、例えば、一定量の活性薬剤を示すアンプルまたは小袋（ｓａｃｈｅｔｔｅ）のような密封された容器中の凍結乾燥粉末または水を含まない濃縮物として供給される。組成物が注入により投与されるべき場合には、組成物は、滅菌した薬学的等級の水または生理食塩水を含む注入ボトルに分配され得る。組成物が注射により投与される場合、成分が投与の前に混合され得るように、注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルが提供され得る。
本発明の化合物は、中性のまたは塩の形態として処方され得る。薬学的に受容可能な塩としては、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来するもののようなアニオンとともに形成される塩、およびナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第２鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するもののようなカチオンとともに形成される塩が挙げられる。
この処置（本発明のポリペプチドの異常な発現および／または活性と関連する疾患または障害の抑制および予防）において効果的である本発明の化合物の量は、標準的な臨床技術により決定され得る。さらに、インビトロアッセイは、必要に応じて、使用して最適な投薬量の範囲を同定するのを助け得る。処方において使用されるべき正確な用量はまた、投与の経路、および疾患または障害の重篤さに依存し、そして開業医の判断および各患者の状況に従って決定されるべきである。有効用量は、インビトロまたは動物モデル試験系から得られた用量反応曲線から外挿され得る。
抗体に関して、患者に投与される投薬量は、代表的に、患者の体重１ｋｇあたり０．１ｍｇ〜１００ｍｇである。好ましくは、患者に投与される投薬量は、患者の体重１ｋｇあたり０．１ｍｇと２０ｍｇとの間であり、より好ましくは、患者の体重１ｋｇあたり１ｍｇ〜１０ｍｇである。一般に、ヒト抗体は、外来ポリペプチドへの免疫応答に起因して、他種由来の抗体よりもヒト体内で長い半減期を有する。従って、ヒト抗体の低い投薬量および頻度の低い投与は、しばしば可能である。さらに、本発明の抗体の投与の投薬量および頻度は、改変（例えば、脂溶化（ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ）のような）による抗体の取り込みおよび組織浸透（例えば、脳への）を増強することにより減少され得る。
（診断および画像化）
治療タンパク質（またはフラグメントもしくはそれらの変異体）（治療タンパク質に結合する抗体の少なくともフラグメントまたは変異体を含むアルブミン融合タンパク質を含む）に結合する標識化抗体、ならびにその誘導体およびそのアナログは、診断目的のために使用されて、治療タンパク質の異常な発現および活性に関連する疾患、障害または／および状態を検出、診断またはモニターし得る。本発明は、治療タンパク質の異常な発現の検出について提供し、これは、（ａ）目的のポリペプチドに特異的な１つ以上の抗体を使用して、個体の細胞または体液中の治療タンパク質の発現をアッセイする工程、および（ｂ）この遺伝子発現レベルと標準的な遺伝子発現のレベルを比較する工程、を包含し、これによって、その標準的な発現レベルと比較されるアッセイされたポリペプチド遺伝子発現レベルの増加または減少が、異常な発現を示す。
本発明は、障害を診断するための診断アッセイを提供し、このアッセイは、（ａ）治療タンパク質に特異的な少なくとも抗体の変異体のフラグメントを含む治療タンパク質またはアルブミン融合タンパク質に特異的な１つ以上の抗体を使用して、個体の細胞または体液中の治療タンパク質の発現をアッセイする工程、および（ｂ）この遺伝子発現レベルと標準的な遺伝子発現のレベルを比較する工程、を包含し、これによって、その標準的な発現レベルと比較されるアッセイされた治療タンパク質遺伝子発現レベルの増加または減少が、特定の障害を示す。癌に関して、個体由来の生検組織における比較的高い量の転写物の存在は、疾患の発生のための素因を示し得るか、または実際の臨床症状の出現前に疾患を検出するための手段を提供し得る。この型のより決定的な診断は、保健専門家に予防手段を使用させること、または早期の積極的な処置を可能にし得、これにより、癌の発生またはさらなる進行を予防する。
本発明の抗体または治療タンパク質に特異的な抗体の変異体の少なくともフラグメントを含むアルブミン融合タンパク質を使用して、当業者に公知の古典的な免疫組織学的方法を使用して生物学的サンプル中のタンパク質レベルをアッセイし得る（例えば、Ｊａｌｋａｎｅｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０１：９７６−９８５（１９８５）；Ｊａｌｋａｎｅｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０５：３０８７−３０９６（１９８７）を参照のこと）。タンパク質遺伝子発現を検出するために有用な、他の抗体に基づく他の方法としては、イムノアッセイ（例えば、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）および放射免疫測定法（ＲＩＡ））が挙げられる。適切な抗体アッセイ標識は、当該分野において公知であり、そして酵素標識（例えば、グルコースオキシダーゼ）；放射性同位体（例えば、ヨウ素（１２５Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１２Ｉｎ）、およびテクネチウム（９９Ｔｃ））；発光標識（例えば、ルミノール）；ならびに蛍光標識（例えば、フルオレセインおよびローダミン）、ならびにビオチンが挙げられる。
本発明の１つの局面は、動物、好ましくは哺乳動物、そして最も好ましくはヒトにおける、治療タンパク質の異常な発現と関連する疾患または障害の検出および診断である。１つの実施形態において、診断は、ａ）目的のポリペプチドに特異的に結合する有効量の標識化分子を被験体に（例えば、非経口的に、皮下に、または腹腔内に）投与する工程；ｂ）この治療タンパク質が発現する被験体内の部位でこの標識化分子が優先的に濃縮することを可能にするために（および結合していない標識化分子がバックグラウンドレベルまで除去されるために）投与後、時間間隔を待つ工程；ｃ）バックグラウンドレベルを決定する工程；およびｄ）この被験体中の標識化分子を検出する工程、を包含し、その結果、このバックグラウンドレベルを越える標識化分子の検出は、この被験体が治療タンパク質の異常な発現と関連する特定の疾患または障害を有することを示す。バックグラウンドレベルは、特定の系について以前に決定された標準的な値と、検出された標識化分子の量を比較する工程を包含する種々の方法により決定され得る。
被験体のサイズおよび用いられる画像化システムは、診断画像を生成するために必要な画像化部分の量を決定することが当該分野で理解される。放射性同位体部分の場合には、ヒト被験体について、注射される放射能の量は、通常、約５〜２０ミリキュリーの９９ｍＴｃの範囲である。次いで、標識された抗体、抗体フラグメントまたは治療タンパク質に結合する抗体の少なくともフラグメントまたは変異体を含むアルブミン融合タンパク質は、特定の治療タンパク質を含む細胞の位置に優先的に蓄積される。インビボ腫瘍画像化は、Ｓ．Ｗ．Ｂｕｒｃｈｉｅｌら、「Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ」（Ｔｕｍｏｒ Ｉｍａｇｉｎｇ：Ｔｈｅ Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒの第１３章、Ｓ．Ｗ．ＢｕｒｃｈｉｅｌおよびＢ．Ａ．Ｒｈｏｄｅｓ編、Ｍａｓｓｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ．（１９８２）に記載される。
用いられる標識の型および投与の様式を含む、いくつかの可変要素に依存して、標識された分子が被験体の部位に優先的に濃縮し、そして結合されていない標識された分子がバックグラウンドレベルまで一掃されることを可能にする、投与後の時間間隔は、６〜４８時間または６〜２４時間または６〜１２時間である。別の実施形態においては、投与後の時間間隔は、５〜２０日間または５〜１０日間である。
１つの実施形態においては、疾患または障害のモニタリングは、その疾患または障害を診断するための方法を繰り返すこと（例えば、最初の診断後１ヶ月、最初の診断後６ヶ月、最初の診断後１年など）により行われる。
標識された分子の存在は、インビボ走査について当該分野において公知の方法を用いて、患者から検出され得る。これらの方法は、用いられる標識の型に依存する。当業者は、特定の標識を検出するための適切な方法を決定し得る。本発明の診断方法において用いられ得る方法およびデバイスとしては、限定はされないが、コンピューター断層撮影（ＣＴ）、陽子（ｐｏｓｉｔｉｏｎ）射出断層撮影法（ＰＥＴ）のような全身走査、磁気共鳴像（ＭＲＩ）、および超音波診断法が挙げられる。
特定の実施形態においては、この分子は放射性同位体で標識され、そして放射線応答性の外科用機器を用いて患者から検出される（Ｔｈｕｒｓｔｏｎら、米国特許第５，４４１，０５０号）。別の実施形態においては、この分子は蛍光化合物で標識され、そして蛍光応答性の走査機器を用いて患者から検出される。別の実施形態においては、この分子は陽電子放出金属で標識され、そして陽子射出断層撮影法を用いて患者（ｐａｔｅｎｔ）から検出される。さらに別の実施形態においては、この分子は常磁性標識で標識され、そして磁気共鳴映像（ＭＲＩ）を用いて患者から検出される。アルブミン融合タンパク質を特異的に検出するが、アルブミンまたは治療タンパク質を単独で検出しない抗体は、好ましい実施形態である。これらは、明細書全体にわたって記載されるようなアルブミン融合タンパク質を検出するために使用され得る。
（キット）
本発明は、上記の方法において用いられ得るキットを提供する。１つの実施形態においては、キットは、１以上の容器中に、抗体（好ましくは精製された抗体）を備える。特定の実施形態においては、本発明のキットは、このキットに含まれる抗体と特異的に免疫反応性であるエピトープを含む、実質的に分離されたポリペプチドを備える。好ましくは、本発明のキットは、目的のポリペプチドと反応しないコントロール抗体を、さらに備える。別の特定の実施形態においては、本発明のキットは、目的のポリペプチドとの抗体の結合（例えば、この抗体は、検出可能な基質（例えば、抗体は、蛍光化合物、酵素基質、放射性化合物または発光化合物）と結合体化され得るか、あるいは第一の抗体を認識する第二の抗体は、検出可能な基質と結合体化され得る）を検出するための手段を備える。
本発明の別の特定の実施形態においては、このキットは、増殖性および／または癌性のポリヌクレオチドおよびポリペプチドに対して特異的な抗体を含む血清をスクリーニングする際に用いる診断用キットである。このようなキットは、目的のポリペプチドと反応しないコントロール抗体を備え得る。このようなキットは、少なくとも１つの抗ポリペプチド抗原抗体と特異的に免疫反応性であるエピトープを含む、実質的に単離されたポリペプチド抗原を備え得る。さらに、このようなキットは、この抗体の抗原への結合（例えば、この抗体は、フローサイトメトリーにより検出され得る、フルオレセインまたはローダミンのような蛍光化合物と結合体化され得る）を検出するための手段を備える。特定の実施形態においては、このキットは、組換え的に産生されたポリペプチド抗原または化学的に合成されたポリペプチド抗原を備え得る。このキットのポリペプチド抗原はまた、固体支持体に付着され得る。
より特定の実施形態においては、上記のキットの検出手段は、このポリペプチド抗原が付着される固体支持体を含む。このようなキットはまた、非付着レポーター標識抗ヒト抗体を備える。この実施形態においては、抗体のポリペプチド抗原との結合はこのレポーター標識抗体の結合により検出され得る。
さらなる実施形態においては、本発明は、本発明のポリペプチドの抗原を含む血清をスクリーニングする際に用いる診断用キットを含む。この診断用キットは、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド抗原と特異的に免疫反応性である、実質的に単離された抗体、およびこのポリヌクレオチドまたはポリペプチド抗原の抗体との結合を検出する手段を備える。１つの実施形態においては、この抗体は、固体支持体に付着される。特定の実施形態においては、この抗体は、モノクロナール抗体であり得る。このキットの検出手段は、第二の標識されたモノクロナール抗体を含み得る。あるいは、またはさらに、この検出手段は、標識された、競合抗原を含み得る。
１つの診断の構成においては、試験血清は、本発明の方法により得られる表面結合抗原を有する固相試薬と反応する。特異的な抗原抗体をこの試薬と結合させ、そして結合されない血清成分を洗浄により除去した後、固体支持体上に結合する抗抗原抗体の量に応じて、レポーターをこの試薬と結合させるために、この試薬をレポーター標識抗ヒト抗体と反応させる。この試薬は、結合されない標識抗体を除去するため、再び洗浄され、そしてこの試薬と会合したレポーターの量が決定される。代表的には、レポーターは、適切な蛍光測定基質、発光基質または比色基質（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の存在下で、この固相をインキュベートすることにより検出される酵素である。
上記のアッセイにおける固体表面試薬は、タンパク質材料を固体支持体材料（例えば、高分子ビーズ、計深棒、９６ウェルプレートまたは濾過材料）に付着させるための公知の技術により調製される。これらの付着方法としては、一般的に、支持体へのタンパク質の非特異的な吸着または固体支持体上の化学的に活性な基（例えば、活性化カルボキシル基、ヒドロキシル基、またはアルデヒド基）とのタンパク質の共有結合（ｃｏｖａｌｅｎｔ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）（代表的には、遊離アミン基を介する）が挙げられる。あるいは、ストレプトアビジンでコートされたプレートが、ビオチン化された抗原と共に使用され得る。
従って、本発明は、この診断方法を行うためのアッセイ系またはキットを提供する。このキットは、一般的に、表面結合された組換え抗原を有する支持体、および表面結合された抗抗原抗体を検出するための、レポーター標識された抗ヒト抗体を備える。
（アルブミン融合タンパク質）
本発明は、アルブミン融合タンパク質および疾患または障害を処置、妨害、または改善する方法に一般的に関する。本明細書において使用される場合、「アルブミン融合タンパク質」とは、少なくとも一つのアルブミン分子（もしくはフラグメントまたはそれらの変異体）の少なくとも一つの治療タンパク質（もしくはフラグメントまたはそれらの変異体）への融合によって形成されるタンパク質をいう。本発明のアルブミン融合タンパク質は、治療タンパク質の少なくともフラグメントまたは変異体およびヒト血清アルブミンの少なくともフラグメントまたは変異体を含み、好ましくは遺伝子融合によって（すなわち、アルブミン融合タンパク質は、治療タンパク質の全部または一部をコードするポリヌクレオチドが、アルブミンの全部または一部をコードするポリヌクレオチドと骨格内で結合される核酸の翻訳によって発生される）別の一つとともに連結され、または別の一つに連結される。治療タンパク質およびアルブミンタンパク質は、いったんアルブミン融合タンパク質の部分になると、各々アルブミン融合タンパク質の「部分」、「領域」または「成分」と言われ得る。
好ましい実施形態において、本発明は、表１または表２に記載されるポリヌクレオチドまたはアルブミン融合構築物によってコードされるアルブミン融合タンパク質を提供する。これらのアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドもまた、本発明によって包含される。
本発明の好ましいアルブミン融合タンパク質としては、以下によってコードされるアルブミン融合タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない：治療タンパク質（またはそのフラグメントもしくは改変体）の少なくとも１つの分子をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドにインフレームで連結された、アルブミン（またはそのフラグメントもしくは改変体）の少なくとも１つの分子をコードするポリヌクレオチドを含むかまたはこれからなる核酸分子；表１、表２または実施例中に記載されるように生成される、治療タンパク質（またはそのフラグメントもしくは改変体）の少なくとも１つの分子をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドにインフレームで連結された、アルブミン（またはそのフラグメントもしくは改変体）の少なくとも１つの分子をコードするポリヌクレオチドを含むかまたはこれからなる核酸分子；あるいは、例えば、以下のエレメントのうちの１つ以上をさらに含む、治療タンパク質（またはそのフラグメントもしくは改変体）の少なくとも１つの分子をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドにインフレームで連結された、アルブミン（またはそのフラグメントもしくは改変体）の少なくとも１つの分子をコードするポリヌクレオチドを含むかまたはこれからなる核酸分子：（１）機能的自己複製ベクター（例えば、シャトルベクター、発現ベクター、組み込みベクターおよび／または複製系が挙げられるが、これらに限定されない）、（２）転写開始のための領域（例えば、プロモーター領域（例えば、調節可能プロモーターまたは誘導性プロモーター、構成的プロモーター））、（３）転写終結のための領域、（４）リーダー配列、および（５）選択マーカー。
１実施形態において、本発明は、治療タンパク質（例えば、表１に記載されるような）および血清アルブミンタンパク質を含むかまたはこれらからなる、アルブミン融合タンパク質を提供する。他の実施形態において、本発明は、治療タンパク質の生物学的に活性なフラグメントおよび／または治療的に活性なフラグメントならびに血清アルブミンタンパク質を含むかまたはこれらからなる、アルブミン融合タンパク質を提供する。他の実施形態において、本発明は、治療タンパク質の生物学的に活性な改変体および／または治療的に活性な改変体ならびに血清アルブミンタンパク質を含むかまたはこれらからなる、アルブミン融合タンパク質を提供する。好ましい実施形態において、このアルブミン融合タンパク質の血清アルブミンタンパク質成分は、血清アルブミンの成熟部分である。
さらなる実施形態において、本発明は、治療タンパク質ならびに血清アルブミンタンパク質の生物学的に活性なフラグメントおよび／または治療的に活性なフラグメントを含むかまたはこれらからなる、アルブミン融合タンパク質を提供する。さらなる実施形態において、本発明は、治療タンパク質ならびに血清アルブミンタンパク質の生物学的に活性な改変体および／または治療的に活性な改変体を含むかまたはこれらからなる、アルブミン融合タンパク質を提供する。好ましい実施形態において、このアルブミン融合タンパク質の治療タンパク質部分は、治療タンパク質の成熟部分である。
さらなる実施形態において、本発明は、治療タンパク質の生物学的に活性なフラグメントもしくは改変体および／または治療的に活性なフラグメントもしくは改変体、ならびに血清アルブミンタンパク質の生物学的に活性なフラグメントもしくは改変体および／または治療的に活性なフラグメントもしくは改変体を含むかまたはこれらからなる、アルブミン融合タンパク質を提供する。好ましい実施形態において、本発明は、治療タンパク質の成熟部分および血清アルブミンの成熟部分を含むかまたはこれらからなる、アルブミン融合タンパク質を提供する。
好ましくは、このアルブミン融合タンパク質は、Ｎ末端部分としてＨＡを含み、そしてＣ末端部分として治療タンパク質を含む。あるいは、Ｎ末端部分として治療タンパク質を含み、そしてＣ末端部分としてＨＡを含むアルブミン融合タンパク質もまた、使用され得る。
他の実施形態において、このアルブミン融合タンパク質は、アルブミンのＮ末端およびＣ末端の両方に融合した治療タンパク質を有する。好ましい実施形態において、Ｎ末端で融合した治療タンパク質とＣ末端で融合した治療タンパク質とは、同じ治療タンパク質である。代替の好ましい実施形態において、Ｎ末端で融合した治療タンパク質とＣ末端で融合した治療タンパク質とは、異なる治療タンパク質である。別の好ましい実施形態において、Ｎ末端で融合した治療タンパク質とＣ末端で融合した治療タンパク質とは、同じかまたは関連する疾患、障害または状態（例えば、表１の「好ましい適応症Ｙ」の欄に列挙されるようなもの）を処置または予防するために使用され得る、異なる治療タンパク質である。別の好ましい実施形態において、Ｎ末端で融合した治療タンパク質とＣ末端で融合した治療タンパク質とは、一般に、患者において同時に（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ）、同時発生的に（ｃｏｎｓｕｒｒｅｎｔｌｙ）または連続的に発生するか、あるいは一般に、患者において互いに関連して発生することが、当該分野で公知である疾患または障害（例えば、表１の「好ましい適応症Ｙ」の欄に列挙されるようなもの）を処置、軽減または予防するために使用され得る、異なる治療タンパク質である。
複数の、アルブミンのＮ末端で融合した治療タンパク質およびＣ末端で融合した治療タンパク質を含む本発明の例示的な融合タンパク質としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＧＣＳＦ−ＨＳＡ−ＥＰＯ、ＥＰＯ−ＨＳＡ−ＧＣＳＦ、ＩＦＮα−ＨＳＡ−ＩＬ２、ＩＬ２−ＨＳＡ−ＩＦＮα、ＧＣＳＦ−ＨＳＡ−ＩＬ２、ＩＬ２−ＨＳＡ−ＧＣＳＦ、ＩＬ２−ＨＳＡ−ＥＰＯ、ＥＰＯ−ＨＳＡ−ＩＬ２、ＩＬ３−ＨＳＡ−ＥＰＯ、ＥＰＯ−ＨＳＡ−ＩＬ３、ＧＣＳＦ−ＨＳＡ−ＧＭＣＳＦ、ＧＭＣＳＦ−ＨＳＡ−ＧＣＳＦ、ＩＬ２−ＨＳＡ−ＧＭＣＳＦ、ＧＭＣＳＦ−ＨＳＡ−ＩＬ２、ＰＴＨ−ＨＳＡ−カルシトニン、カルシトニン−ＨＳＡ−ＰＴＨ、ＰＴＨ−ＰＴＨ−ＨＳＡ−カルシトニン、カルシトニン−ＨＳＡ−ＰＴＨ−ＰＴＨ、ＰＴＨ−カルシトニン−ＨＳＡ−ＰＴＨ、またはＰＴＨ−ＨＳＡ−カルシトニン−ＰＴＨ。
本発明のアルブミン融合タンパク質は、本発明のアルブミン融合タンパク質のＮ末端またはＣ末端、ならびに／あるいはアルブミンまたはその改変体のＮ末端またはＣ末端に融合した、所定の治療タンパク質Ｘまたはその改変体の、１つ、２つ、３つ、４つまたはそれ以上の分子を含むタンパク質を包含する。所定の治療タンパク質Ｘまたはその改変体の分子は、任意の数の方向（以下が挙げられるが、これらに限定されない：「頭から頭」方向（例えば、治療タンパク質Ｘの１つの分子のＮ末端が、治療タンパク質Ｘの別の分子のＮ末端に融合した場合）または「頭から尾」方向（例えば、治療タンパク質Ｘの１つの分子のＣ末端が、治療タンパク質Ｘの別の分子のＮ末端に融合した場合））であり得る。
１実施形態において、縦列配向した治療タンパク質Ｘポリペプチド（またはそのフラグメントもしくは改変体）の１つ、２つ、３つまたはそれ以上は、本発明のアルブミン融合タンパク質のＮ末端もしくはＣ末端、ならびに／またはアルブミンもしくはその改変体のＮ末端および／もしくはＣ末端に融合される。
特定の実施形態において、縦列配向したＰＴＨ分子の１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上は、アルブミンまたはその改変体のＮ末端またはＣ末端に融合される。例えば、縦列配向したＰＴＨ分子の１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上（アミノ酸１〜３４を含むかまたはこれらからなるＰＴＨ分子が挙げられるが、これに限定されない）は、アルブミンまたはその改変体のＮ末端またはＣ末端に融合される。ＰＴＨの複数のタンパク質部分を含む本発明の例示的融合タンパク質としては、以下が挙げられるが、これに限定されない：ＰＴＨ−ＰＴＨ−ＨＳＡ、ＨＳＡ−ＰＴＨ−ＰＴＨ、ＰＴＨ−ＰＴＨ−ＰＴＨ−ＨＳＡ、ＨＳＡ−ＰＴＨ−ＰＴＨ−ＰＴＨ、ＰＴＨ−ＰＴＨ−ＰＴＨ−ＰＴＨ−ＨＳＡまたはＨＳＡ−ＰＴＨ−ＰＴＨ−ＰＴＨ−ＰＴＨ。
別の特定の実施形態において、縦列配向したＧＬＰ−１分子の１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上は、アルブミンまたはその改変体のＮ末端またはＣ末端に融合される。例えば、縦列配向したＧＬＰ−１分子の１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上（アミノ酸７〜３６を含むかまたはこれらからなるＧＬＰ−１分子（残基８は、アラニンからグリシンに変異している）が挙げられるが、これに限定されない）（例えば、米国特許第５，５４５，６１８号（これは、その全体が本明細書中で参考として援用される）に開示される変異体を参照のこと）は、アルブミンまたはその改変体のＮ末端またはＣ末端に融合される。ＧＬＰ−１の複数のタンパク質部分を含む本発明の例示的融合タンパク質としては、以下が挙げられるが、これに限定されない：ＧＬＰ１−ＧＬＰ１−ＨＳＡ、ＨＳＡ−ＧＬＰ１−ＧＬＰ１、ＧＬＰ１変異体−ＧＬＰ１変異体−ＨＳＡ、ＨＳＡ−ＧＬＰ１変異体−ＧＬＰ１変異体、ＧＬＰ１変異体−ＧＬＰ１−ＨＳＡ、ＨＳＡ−ＧＬＰ１変異体−ＧＬＰ１、ＧＬＰ１−ＧＬＰ１変異体−ＨＳＡまたはＨＳＡ−ＧＬＰ１−ＧＬＰ１変異体。特に好ましい実施形態は、構築物ＩＤ番号３０７０のようなＧＬＰ−１縦列融合物およびこのような構築物によってコードされるタンパク質である。
本発明のアルブミン融合タンパク質は、本発明のアルブミン融合タンパク質のＮ末端またはＣ末端、ならびに／あるいはアルブミンまたはその改変体のＮ末端またはＣ末端に融合した、所定の治療タンパク質Ｘまたはその改変体の、１つ、２つ、３つ、４つまたはそれ以上の分子を含むタンパク質をさらに包含し、ここで、これらの分子は、ペプチドリンカーを介して連結されている。例としては、米国特許第５，０７３，６２７号（本明細書中で参考として援用される）に記載されるペプチドリンカーが挙げられる。ペプチドリンカーによって分離された複数の治療タンパク質Ｘポリペプチドを含むアルブミン融合タンパク質は、従来の組換えＤＮＡ技術を使用して生成され得る。リンカーは、大きいＨＳＡ分子に小さいペプチドを融合させる場合に、特に重要である。ペプチド自体は、ペプチドの縦列コピー（例えば、ＧＬＰ−１を参照のこと）を融合させることによってリンカーであり得るか、または他の公知のリンカーが使用され得る。リンカーを組み込む構築物は、表２に記載されるか、または配列番号Ｙを試験して明らかとなる。
さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質はまた、分子内および／または分子間のマルチマー形態の形成を可能にするような様式で、アルブミンまたはその改変体のＮ末端および／またはＣ末端に、治療タンパク質Ｘまたはその改変体を融合させることによって、生成され得る。本発明の１実施形態において、アルブミン融合タンパク質は、モノマー形態またはマルチマー形態（すなわち、ダイマー、トリマー、テトラマーおよびより高次のマルチマー）であり得る。本発明のさらなる実施形態において、アルブミン融合タンパク質の治療タンパク質部分は、モノマー形態またはマルチマー形態（すなわち、ダイマー、トリマー、テトラマーおよびより高次のマルチマー）であり得る。特定の実施形態において、アルブミン融合タンパク質の治療タンパク質部分は、マルチマー形態（すなわち、ダイマー、トリマー、テトラマーおよびより高次のマルチマー）であり、そしてそのアルブミンタンパク質部分は、モノマー形態である。
アルブミン部分が治療タンパク質部分のＮ末端および／またはＣ末端に融合されたアルブミン融合タンパク質に加えて、本発明のアルブミン融合タンパク質はまた、目的の治療タンパク質またはペプチド（例えば、表１に開示されるような治療タンパク質Ｘ、あるいは治療タンパク質に結合する抗体またはそのフラグメントもしくは改変体）を、ＨＡの内部領域に挿入することによって、生成され得る。例えば、ＨＡ分子のタンパク質配列において、多数のループまたはターンが、αヘリックスの終点と開始点との間に存在し、これらは、ジスルフィド結合によって安定化される。ＨＡの結晶構造から決定されるようなループ（ＰＤＢ同定子１ＡＯ６、１ＢＪ５、１ＢＫＥ、１ＢＭ０、１Ｅ７Ｅ〜１Ｅ７Ｉおよび１ＵＯＲ）は、大部分、分子本体からはなれて延びている。これらのループは、治療的に活性なペプチド（特に、二次構造が機能的であることを要するもの）または治療タンパク質の挿入または内部融合のために有用であり、特定の生物学的活性を有するアルブミン分子を本質的に生成する。
本発明のアルブミン融合タンパク質を生成するためにペプチドまたはポリペプチドが挿入され得るヒトアルブミン構造中のループは、以下を含む：Ｖａｌ５４〜Ａｓｎ６１、Ｔｈｒ７６〜Ａｓｐ８９、Ａｌａ９２〜Ｇｌｕ１００、Ｇｌｎ１７０〜Ａｌａ１７６、Ｈｉｓ２４７〜Ｇｌｕ２５２、Ｇｌｕ２６６〜Ｇｌｕ２７７、Ｇｌｕ２８０〜Ｈｉｓ２８８、Ａｌａ３６２〜Ｇｌｕ３６８、Ｌｙｓ４３９〜Ｐｒｏ４４７、Ｖａｌ４６２〜Ｌｙｓ４７５、Ｔｈｒ４７８〜Ｐｒｏ４８６およびＬｙｓ５６０〜Ｔｈｒ５６６。より好ましい実施形態において、ペプチドまたはポリペプチドは、成熟ヒトアルブミン（配列番号１０３８）のＶａｌ５４〜Ａｓｎ６１ループ、Ｇｌｎ１７０〜Ａｌａ１７６ループおよび／またはＬｙｓ５６０〜Ｔｈｒ５６６ループ中に挿入される。
挿入されるべきペプチドは、特定の生物学的活性についてスクリーニングされたファージディスプレイライブラリーまたは合成ペプチドライブラリーのいずれか、あるいは所望の機能を有する分子の活性な部分に由来し得る。さらに、ランダムペプチドライブラリーは、ＨＡ分子の特定のループ内に生成され得るか、またはＨＡ分子の特定のループへとランダム化ペプチドを挿入することによって生成され得、ここで、アミノ酸の全ての可能な組み合わせが提示される。
このようなライブラリーは、以下の方法の１つによって、ＨＡまたはＨＡのドメインフラグメントに対して作製され得る：
ＨＡまたはＨＡのドメインフラグメント内の１つ以上のペプチドループ内のアミノ酸のランダム化変異。ループ内の１つ、より多くまたは全ての残基のいずれかが、この様式で変異され得る。
長さＸｎ（ここで、Ｘはアミノ酸であり、ｎは残基の数である）のランダム化ペプチドの、ＨＡもしくはＨＡのドメインフラグメンの１つ以上のループの置換またはＨＡもしくはＨＡのドメインフラグメンの１つ以上のループへの挿入（すなわち、内部融合）；
（ａ）および／または（ｂ）に加えて、Ｎ末端、Ｃ末端、またはＮ末端およびＣ末端のペプチド／タンパク質融合。
ＨＡまたはＨＡのドメインフラグメントはまた、同じＨＡまたはＨＡのドメインフラグメントへの異なる標的に対する、異なるループの異なるスクリーニングに由来するペプチドを移植することによって、多官能性にされ得る。
好ましい実施形態において、ヒト血清アルブミンのループに挿入されるペプチドは、表１に開示される治療タンパク質のペプチドフラグメントまたはペプチド改変体である。より具体的には、本発明は、ヒト血清アルブミンのループに挿入された、少なくとも７、少なくとも８アミノ酸長、少なくとも９アミノ酸長、少なくとも１０アミノ酸長、少なくとも１１アミノ酸長、少なくとも１２アミノ酸長、少なくとも１３アミノ酸長、少なくとも１４アミノ酸長、少なくとも１５アミノ酸長、少なくとも２０アミノ酸長、少なくとも２５アミノ酸長、少なくとも３０アミノ酸長、少なくとも３５アミノ酸長または少なくとも４０アミノ酸長のペプチドフラグメントまたはペプチド改変体を含むアルブミン融合タンパク質を包含する。本発明はまた、ヒト血清アルブミンのＮ末端に融合した、少なくとも７、少なくとも８アミノ酸長、少なくとも９アミノ酸長、少なくとも１０アミノ酸長、少なくとも１１アミノ酸長、少なくとも１２アミノ酸長、少なくとも１３アミノ酸長、少なくとも１４アミノ酸長、少なくとも１５アミノ酸長、少なくとも２０アミノ酸長、少なくとも２５アミノ酸長、少なくとも３０アミノ酸長、少なくとも３５アミノ酸長または少なくとも４０アミノ酸長のペプチドフラグメントまたはペプチド改変体を含むアルブミン融合タンパク質を包含する。本発明はまた、ヒト血清アルブミンのＣ末端に融合した、少なくとも７、少なくとも８アミノ酸長、少なくとも９アミノ酸長、少なくとも１０アミノ酸長、少なくとも１１アミノ酸長、少なくとも１２アミノ酸長、少なくとも１３アミノ酸長、少なくとも１４アミノ酸長、少なくとも１５アミノ酸長、少なくとも２０アミノ酸長、少なくとも２５アミノ酸長、少なくとも３０アミノ酸長、少なくとも３５アミノ酸長または少なくとも４０アミノ酸長のペプチドフラグメントまたはペプチド改変体を含むアルブミン融合タンパク質を包含する。例えば、表１および表２に記載される短いペプチド（例えば、治療剤Ｙ）は、アルブミンループ中に挿入され得る。
一般に、本発明のアルブミン融合タンパク質は、１つのＨＡ由来領域および１つの治療タンパク質由来領域を有し得る。しかし、各タンパク質の複数の領域が、本発明のアルブミン融合タンパク質を作製するために使用され得る。同様に、１つより多い治療タンパク質が、本発明のアルブミン融合タンパク質を作製するために使用され得る。例えば、治療タンパク質は、ＨＡのＮ末端およびＣ末端の両方に融合され得る。このような構成において、治療タンパク質部分は、同じ治療タンパク質分子でも異なる治療タンパク質分子でもよい。二重機能的アルブミン融合タンパク質の構造は、Ｘ−ＨＡ−ＹまたはＹ−ＨＡ−Ｘとして示され得る。
例えば、抗ＢＬｙｓＴＭｓｃＦｖ−ＨＡ−ＩＦＮα−２ｂ融合物は、抗ＢＬｙｓＴＭｓｃＦｖによって、ＩＦＮα−２ｂに対する免疫応答を調節するために、調製され得る。代替法は、ＨＡ−抗ＢＬｙｓＴＭｓｃＦｖ融合物または他のＨＡ融合物と、機能（半減期など）に依存して種々の比率で混合した、ＨＡ融合物（例えば、ＨＡ−ＩＦＮα−２ｂ融合物）の二重（または多重でも）機能的用量を生成することである。
二重機能的または多重機能的なアルブミン融合タンパク質はまた、ＨＡの反対側の末端にて、タンパク質またはペプチドを介して標的器官または細胞型に、融合物の治療タンパク質部分を標的化するために、調製され得る。
公知の治療分子の融合物の代替として、これらのペプチドは、代表的には、６、８、１２、２０または２５またはＸｎ（ここで、Ｘはアミノ酸（ａａ）であり、ｎは残基の数である）のランダム化アミノ酸の、ＨＡまたはＨＡのドメインフラグメントのＮ末端、Ｃ末端、またはＮ末端およびＣ末端への融合物として構築されたライブラリーをスクリーニングすることによって、獲得され得、ここで、アミノ酸の全ての可能な組み合わせが提示された。このアプローチの特定の利点は、ＨＡ分子上のペプチドがインサイチュで選択され得、従って、任意の他の方法によって誘導され、次いでＨＡに結合されるペプチドについての場合と同様に、このペプチドの特性が、改変されるのではおそらくなく選択され得ることである。
さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質は、融合部分間にリンカーペプチドを含んで、これらの部分間のより大きい物理的分離を提供し得、従って、治療タンパク質部分のアクセス可能性（例えば、その同族レセプターへの結合について）を最大化し得る。このリンカーペプチドは、アミノ酸からなり得、その結果、これは、可撓性またはより剛性である。
リンカー配列は、プロテアーゼによってかまたは化学的に切断されて、成長ホルモン関連部分を生じ得る。好ましくは、このプロテアーゼは、宿主によって天然に産生されるプロテアーゼ（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅプロテアーゼｋｅｘ２または等価なプロテアーゼ）である。
従って、上記のように、本発明のアルブミン融合タンパク質は、以下の式：Ｒ１−Ｌ−Ｒ２；Ｒ２−Ｌ−Ｒ１またはＲ１−Ｌ−Ｒ２−Ｌ−Ｒ１を有し得、ここで、Ｒ１は、少なくとも１つの治療タンパク質、ペプチドまたはポリペプチドの配列であるが、同じ治療タンパク質では必ずしもなく、Ｌはリンカーであり、そしてＲ２は血清アルブミン配列である。
好ましい実施形態において、治療タンパク質を含む本発明のアルブミン融合タンパク質は、アルブミンと融合していない場合の同じ治療タンパク質の有効期間と比較して、有効期間が延びている。有効期間は、代表的に、溶液中またはいくつかの他の保存処方物中の治療タンパク質の治療活性が、治療活性の過度の損失なしに安定である期間をいう。多数の治療タンパク質は、その非融合状態では、高度に不安定である。以下に記載するように、これらの治療タンパク質の代表的な有効期間は、本発明のアルブミン融合タンパク質に組み込まれると、顕著に延長される。
「延長した（ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ）」または「延長した（ｅｘｔｅｎｄｅｄ）」有効期間を有する本発明のアルブミン融合タンパク質は、同じ保存条件および取扱い条件に供された標準と比較して、より高い治療活性を示す。この標準は、非融合の全長治療タンパク質であり得る。アルブミン融合タンパク質の治療タンパク質部分がアナログである場合、改変体である場合、または他のように変更されている場合、またはそのタンパク質についての完全配列を含まない場合、治療活性の延長は、そのアナログ、改変体、変更されたペプチドまたは完全配列の非融合の等価物と、代替的に比較され得る。例として、本発明のアルブミン融合タンパク質は、所定の時点で比較した場合に、標準と同じ保存条件および取り扱い条件に供された場合、標準の治療活性の約１００％より高い活性、または標準の治療活性の約１０５％、１１０％、１２０％、１３０％、１５０％もしくは２００％より高い活性を保持し得る。
有効期間はまた、保存開始時の治療活性に対して正規化した、保存後に残存する治療活性について、評価され得る。延長された治療活性によって示されるような、延長した有効期間を有する本発明のアルブミン融合タンパク質は、同じ条件に供された場合の、等価な非融合の治療タンパク質の治療活性の、約５０％より高い治療活性、約６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上の治療活性を保持し得る。例えば、実施例３８に考察されるように、全長ＨＡ配列に融合したｈＧＨを含む本発明のアルブミン融合タンパク質は、種々の温度条件下で、５週間以上までの期間にわたって、溶液中でその元の活性の約８０％以上を保持し得る。
（融合タンパク質の発現）
本発明のアルブミン融合タンパク質は、酵母、細菌のような微生物、またはヒトもしくは動物の細胞株からの分泌によって、組換え分子として産生され得る。好ましくは、このポリペプチドは、宿主細胞から分泌される。
本発明の特定の実施形態は、酵母において分泌を指向するのに有効なシグナル配列（特に、酵母由来のシグナル配列（特に、酵母宿主と同種のもの））をコードするＤＮＡ構築物、および本発明の第一の局面の融合分子を含み、シグナルポリペプチドと成熟ポリペプチドとの間には、酵母由来のプロ配列は存在しない。
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅインベルターゼシグナルは、酵母由来のシグナル配列の好ましい例である。
Ｐｏｚｎａｎｓｋｙら（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２３９：１８（１９８８））によって調製される種類の結合体（ここで、別々に調製されたポリペプチドは、化学的架橋によって連結されている）は、企図されない。
本発明はまた、本発明のアルブミン融合タンパク質を発現するように形質転換された、細胞（好ましくは酵母細胞）を包含する。形質転換された宿主細胞自体に加えて、本発明はまた、栄養培地中の、これらの細胞の培養物（好ましくは、モノクローナル（クローン性均質な）培養物またはモノクローナル培養物由来の培養物）を企図する。ポリペプチドが分泌される場合、この培地は、細胞と共に、または細胞が濾過もしくは遠心分離によって除去されている場合には細胞を含まずに、ポリペプチドを含む。多くの発現系（細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓおよびＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、糸状菌（例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、植物細胞、動物細胞および昆虫細胞を含む）が公知であり、そして使用され得る。
アルブミン融合タンパク質の生成において使用されるのに好ましい酵母株は、Ｄ８８、ＤＸＹ１およびＢＸＰ１０である。Ｄ８８［ｌｅｕ２−３、ｌｅｕ２−１２２、ｃａｎ１、ｐｒａ１、ｕｂｃ４］は、親株ＡＨ２２ｈｉｓ＋（ＤＢ１としても公知；例えば、Ｓｌｅｅｐら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：４２−４６（１９９０）を参照のこと）の誘導体である。この株は、ＬＥＵ２遺伝子を含む２ミクロンベースのプラスミドの栄養要求性選択を可能にする、ｌｅｕ２変異を含む。Ｄ８８はまた、グルコース過剰条件で、ＰＲＢ１の抑制を示す。ＰＲＢ１プロモーターは、通常、グルコースレベルおよび増殖段階をモニタリングする、２つのチェックポイントによって制御される。このプロモーターは、グルコース枯渇および静止期への進入の際に、野生型酵母において活性化される。株Ｄ８８は、グルコースによる抑制を示すが、静止期への進入の際に、誘導を維持する。ＰＲＡ１遺伝子は、酵母空胞プロテアーゼであるＹｓｃＡエンドプロテアーゼＡをコードし、このプロテアーゼは、ＥＲに局在する。ＵＢＣ４遺伝子は、ユビキチン化経路にあり、そしてユビキチン依存的な分解のための、短命なタンパク質および異常なタンパク質の標的化に関与している。このｕｂｃ４変異の単離は、細胞における発現プラスミドのコピー数を増大させ、そしてプラスミドから発現される所望のタンパク質の発現レベルを増大させることが見出されている（例えば、国際公開番号ＷＯ９９／００５０４（これは、その全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。
Ｄ８８の誘導体であるＤＸＹ１は、以下の遺伝子型を有する：［ｌｅｕ２−３、ｌｅｕ２−１２２、ｃａｎ１、ｐｒａ１、ｕｂｃ４、ｕｒａ３：：ｙａｐ３］。Ｄ８８において単離された変異に加えて、この株は、ＹＡＰ３プロテアーゼのノックアウトもまた有する。このプロテアーゼは、主に二塩基性残基（ＲＲ、ＲＫ、ＫＲ、ＫＫ）の切断をもたらすが、タンパク質中の単一の塩基性残基での切断もまた、促進し得る。このｙａｐ３変異の単離は、高レベルの全長ＨＳＡ産生を生じた（例えば、米国特許第５，９６５，３８６号およびＫｅｒｒｙ−Ｗｉｌｌｉａｍｓら、Ｙｅａｓｔ １４：１６１−１６９（１９９８）（これは、その全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。
ＢＸＰ１０は、以下の遺伝子型を有する：［ｌｅｕ２−３、ｌｅｕ２−１２２、ｃａｎ１、ｐｒａ１、ｕｂｃ４、ｕｒａ３、ｙａｐ３：：ＵＲＡ３、ｌｙｓ２、ｈｓｐ１５０：：ＬＹＳ２、ｐｍｔ１：：ＵＲＡ３］。ＤＸＹ１において単離された変異に加えて、この株はまた、ＰＭＴ１遺伝子およびＨＳＰ１５０遺伝子のノックアウトを有する。このＰＭＴ１遺伝子は、ドリチル（ｄｏｌｉｃｈｙｌ）−ホスフェート−Ｄ−マンノースタンパク質Ｏ−マンノシルトランスフェラーゼ（Ｐｍｔ）の、進化的に保存されたファミリーのメンバーである。Ｐｍｔ１ｐの膜貫通トポロジーは、これが、Ｏ結合グリコシル化において役割を有する、小胞体の膜内在性タンパク質であることを示唆する。この変異は、ＨＳＡ融合物のＯ結合グリコシル化を、低減／排除するように働く（例えば、国際公開番号ＷＯ００／４４７７２（これは、その全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。研究により、Ｈｓｐ１５０タンパク質が、イオン交換クロマトグラフィーによって、ｒＨＡから不十分に分離されることが明らかとなった。ＨＳＰ１５０遺伝子における変異は、標準的な精製技術による除去が困難であると証明されている、潜在的な混入物を除去する。例えば、米国特許第５，７８３，４２３号（これは、その全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。
所望のタンパク質は、例えば、宿主染色体に挿入されたコード配列または遊離プラスミド上のコード配列から、従来の方法で産生される。酵母は、エレクトロポレーションのような通常の方法のいずれかにおいて、所望のタンパク質のコード配列で形質転換される。
エレクトロポレーションによる酵母の形質転換方法は、ＢｅｃｋｅｒおよびＧｕａｒｅｎｔｅ（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９４，１８２に開示される。
首尾よく形質転換された細胞（すなわち、本発明のＤＮＡ構築物を含む細胞）は、周知技術によって同定され得る。例えば、発現構築物の導入から生じる細胞は、所望のポリペプチドを産生するように増殖し得る。細胞は収集され、そして溶解され、そのＤＮＡ内容物が、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ（１９７５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８、５０３またはＢｅｒｅｎｔら（１９８５）Ｂｉｏｔｅｃｈ．３、２０８によって記載されるような方法を使用して、ＤＮＡの存在について試験され得る。あるいは、上清中のタンパク質の存在は、抗体を使用して検出され得る。
有用な酵母プラスミドベクターとしては、ｐＲＳ４０３〜４０６およびｐＲＳ４１３〜４１６が挙げられ、そしてこれらは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ ９２０３７，ＵＳＡから一般に入手可能である。プラスミドｐＲＳ４０３、ｐＲＳ４０４、ｐＲＳ４０５およびｐＲＳ４０６は、酵母組み込みプラスミド（ＹＩｐ）であり、酵母選択マーカーのＨＩＳ３、７ＲＰ１、ＬＥＵ２およびＵＲＡ３を組み込んでいる。プラスミドｐＲＳ４１３〜４１６は、酵母染色体プラスミド（Ｙｃｐ）である。
酵母においてアルブミン融合タンパク質を発現させるために好ましいベクターとしては、ｐＰＰＣ０００５、ｐＳｃＣＨＳＡ、ｐＳｃＮＨＳＡおよびｐＣ４：ＨＳＡが挙げられ、これらは、実施例１において詳細に記載される。図２は、治療タンパク質をコードするポリヌクレオチドがクローニングされてＨＡ融合物を形成し得る、基本ベクターとして使用され得る、ｐＰＰＣ０００５プラスミドのマップを示す。これは、ＰＲＢ１ Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅプロモーター（ＰＲＢ１ｐ）、融合リーダー配列（ＦＬ）、ＨＡ（ｒＡＨ）をコードするＤＮＡおよびＡＤＨ１ Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅターミネーター配列を含む。融合リーダー配列の配列は、ヒト血清アルブミンのシグナルペプチド（配列番号１０９４）の最初の１９アミノ酸および接合因子α１プロモーターの最後の５アミノ酸（ＳＬＤＫＲ、その全体が本明細書中で参考として援用される、ＥＰ−Ａ−３８７ ３１９を参照のこと）からなる。
プラスミドｐＰＰＣ０００５、ｐＳｃＣＨＳＡ、ｐＳｃＮＨＳＡおよびｐＣ４：ＨＳＡは、２００１年４月１１日に、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ ２０１１０−２２０９に寄託され、そしてそれぞれ、受託番号ＡＴＣＣ ＰＴＡ−３２７８、ＰＴＡ−３２７６、ＰＴＡ−３２７９およびＰＴＡ−３２７７を与えられた。酵母でのアルブミン融合タンパク質の発現のために有用な別のベクターである、ｐＳＡＣ３５ベクターは、Ｓｌｅｅｐら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：４２（１９９０）中に記載され、これは、その全体が、本明細書中で参考として援用される。
アルブミン融合タンパク質を発現するために使用され得る別の酵母プロモーターは、ＭＥＴ２５プロモーターである。例えば、Ｄｏｍｉｎｉｋ Ｍｕｍｂｕｒｇ，Ｒｏｌｆ ＭｕｌｌｅｒおよびＭａｒｔｉｎ Ｆｕｎｋ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９４、Ｖｏｌ．２２、Ｎｏ．２５、ｐｐ．５７６７−５７６８を参照のこと。
このＭｅｔ２５プロモーターは、３８３塩基長（塩基−３８２〜−１）であり、そしてこのプロモーターによって発現される遺伝子もまた、Ｍｅｔ１５、Ｍｅｔ１７およびＹＬＲ３０３Ｗとして公知である。好ましい実施形態は、以下の配列を使用し、ここで、以下の配列の５’末端において、クローニングに使用されるＮｏｔ１部位に下線を付し、そして３’末端において、ＡＴＧ開始コドンに下線を付している。
Figure 2014043448
 相補的な接着末端を介して、ＤＮＡをベクターに作動可能に連結するための種々の方法が、開発されている。例えば、相補的なホモポリマー区域が、ベクターＤＮＡに挿入されるべきＤＮＡセグメントに付加され得る。次いで、このベクターおよびＤＮＡセグメントは、相補的なホモポリマーテイル間での水素結合によって連結されて、組換えＤＮＡ分子を形成する。
１つ以上の制限部位を含む合成リンカーは、ＤＮＡセグメントをベクターに連結する代替方法を提供する。エンドヌクレアーゼ制限消化によって生成されるＤＮＡセグメントは、バクテリオファージＴ４ ＤＮＡポリメラーゼまたはＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩ（これらは、その３’５’エキソヌクレオチド分解活性によって、突出したγ一本鎖末端を除去し、そしてそれらの重合活性によって、凹んだ３’末端を満たす（ｆｉｌｌ
ｉｎ）酵素である）で処理される。
従って、これらの活性の組み合わせは、平滑末端のＤＮＡセグメントを生成する。次いで、この平滑末端のセグメントは、平滑末端ＤＮＡ分子の連結を触媒し得る酵素（例えば、バクテリオファージのＴ４ ＤＮＡリガーゼ）の存在下で、モル濃度大過剰のリンカー分子とともにインキュベートされる。従って、反応産物は、その末端にポリマーリンカー配列を有するＤＮＡセグメントである。次いで、これらのＤＮＡセグメントは、適切な制限酵素で切断され、そしてこのＤＮＡセグメントの末端と適合する末端を生成する酵素を用いて切断された発現ベクターに連結される。
種々の制限エンドヌクレアーゼ部位を含む合成リンカーは、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ，Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ，ＣＴ，ＵＳＡを含む多数の供給源から市販される。
本発明に従ってＤＮＡを改変するための所望の方法は、例えば、ＨＡ改変体が調製される場合、Ｓａｉｋｉら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９，４８７−４９１によって開示されるようなポリメラーゼ連鎖反応を使用することである。この方法において、酵素的に増幅されるべきＤＮＡは、それ自体増幅されたＤＮＡに組み込まれる２つの特異的オリゴヌクレオチドプライマーによって隣接される。これらの特異的プライマーは、当該分野で公知の方法を使用して発現ベクター中にクローニングするために使用され得る制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含み得る。
アルブミン融合タンパク質を発現するための宿主として本発明の実施において有用であることが企図される酵母の例示的な属は、以下である：Ｐｉｃｈｉａ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ、Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃｉｔｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ、Ｄｅｂａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｍｅｔｓｃｈｕｎｉｋｏｗｉａ、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ、Ｌｅｕｃｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ、Ｂｏｔｒｙｏａｓｃｕｓ、Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ、Ｅｎｄｏｍｙｃｏｐｓｉｓなど。好ましい属は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、ＰｉｃｈｉａおよびＴｏｒｕｌａｓｐｏｒａからなる群より選択される属である。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．の例は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓ．ｉｔａｌｉｃｕｓおよびＳ．ｒｏｕｘｉｉである。
Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．の例は、Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｋ．ｌａｃｔｉｓおよびＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓである。適切なＴｏｒｕｌａｓｐｏｒａ種は、Ｔ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉである。Ｐｉｃｈｉａ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）ｓｐｐ．の例は、Ｐ．ａｎｇｕｓｔａ（以前にはＨ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、Ｐ．ａｎｏｍａｌａ（以前にはＨ．ａｎｏｍａｌａ）およびＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓである。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの形質転換方法は、一般に、ＥＰ ２５１ ７４４、ＥＰ ２５８ ０６７およびＷＯ ９０／０１０６３において教示され、これらは全て、参考として本明細書中で援用される。
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓの好ましい例示的な種としては、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓ．ｉｔａｌｉｃｕｓ、Ｓ．ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓおよびＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｒｏｕｘｉｉが挙げられる。Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓの好ましい例示的な種としては、Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓおよびＫ．ｌａｃｔｉｓが挙げられる。Ｈａｎｓｅｎｕｌａの好ましい例示的な種としては、Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ（現在ではＰｉｃｈｉａ ａｎｇｕｓｔａ）、Ｈ．ａｎｏｍａｌａ（現在ではＰｉｃｈｉａ ａｎｏｍａｌａ）およびＰｉｃｈｉａ ｃａｐｓｕｌａｔａが挙げられる。Ｐｉｃｈｉａ種のさらなる好ましい例示的な種としては、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓが挙げられる。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓの好ましい例示的な種としては、Ａ．ｎｉｇｅｒおよびＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓが挙げられる。Ｙａｒｒｏｗｉａの好ましい例示的な種としては、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａが挙げられる。多くの好ましい酵母種が、ＡＴＣＣから入手可能である。例えば、以下の好ましい酵母種がＡＴＣＣから入手可能であり、そしてアルブミン融合タンパク質の発現において有用である：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｈａｎｓｅｎ、有性世代株ＢＹ４７４３ ｙａｐ３変異体（ＡＴＣＣ受託番号４０２２７３１）；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｈａｎｓｅｎ、有性世代株ＢＹ４７４３ ｈｓｐ１５０変異体（ＡＴＣＣ受託番号４０２１２６６）；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｈａｎｓｅｎ、有性世代株ＢＹ４７４３ ｐｍｔ１変異体（ＡＴＣＣ 受託番号４０２３７９２）；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｈａｎｓｅｎ、有性世代（ＡＴＣＣ受託番号２０６２６；４４７７３；４４７７４および６２９９５）；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ Ａｎｄｒｅｗｓ ｅｔ Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ ｅｘ ｖａｎ ｄｅｒ Ｗａｌｔ、有性世代（ＡＴＣＣ受託番号６２９８７）；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ（Ｄｏｍｂｒｏｗｓｋｉ）ｖａｎ ｄｅｒ Ｗａｌｔ、有性世代（ＡＴＣＣ受託番号７６４９２）；Ｐｉｃｈｉａ ａｎｇｕｓｔａ（Ｔｅｕｎｉｓｓｏｎら）Ｋｕｒｔｚｍａｎ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ ｄｅ Ｍｏｒａｉｓ ｅｔ Ｍａｉａとして寄託される有性世代、有性世代（ＡＴＣＣ受託番号２６０１２）；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ｖａｎ Ｔｉｅｇｈｅｍ、無性世代（ＡＴＣＣ受託番号９０２９）；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ｖａｎ Ｔｉｅｇｈｅｍ、無性世代（ＡＴＣＣ受託番号１６４０４）；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ（Ｅｉｄａｍ）Ｗｉｎｔｅｒ、無性世代（ＡＴＣＣ受託番号４８７５６）；およびＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ（Ｗｉｃｋｅｒｈａｍら）ｖａｎ ｄｅｒ Ｗａｌｔ ｅｔ ｖｏｎ Ａｒｘ，有性世代（ＡＴＣＣ受託番号２０１８４７）。
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅについての適切なプロモーターとしては、ＰＧＫＩ遺伝子、ＧＡＬ１遺伝子、もしくはＧＡＬ１０遺伝子、ＣＹＣＩ、ＰＨＯ５、ＴＲＰＩ、ＡＤＨＩ、ＡＤＨ２、グリセルアルデヒド−３−リン酸塩デヒドロゲナーゼについての遺伝子、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸塩デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、トリオースリン酸塩イソメラーゼ、グルコキナーゼ、α−交配因子フェロモン、［交配因子フェロモン］、ＰＲＢＩプロモーター、ＧＵＴ２プロモーター、ＧＰＤＩプロモーター、および他のプロモーターの５’調節領域の部分または上流活性部位を有する５’調節領域の部分のハイブリッドに関するハイブリッドプロモーター（例えば、ＥＰ−Ａ−２５８０６７のプ
ロモーター）に関連するものが挙げられる。
Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅにおける使用のための便利な調節可能プロモーターは、Ｍａｕｎｄｒｅｌｌ（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５、１０８５７−１０８６４によって記載されるようなｎｍｔ遺伝子由来のチアミン抑制プロモーターおよびＨｏｆｆｍａｎ＆Ｗｉｎｓｔｏｎ（１９９０）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １２４、 ８０７−８１６によって記載されるようなグルコース抑制ｊｂｐｌ遺伝子プロモーターである。
異種遺伝子の発現のためにＰｉｃｈｉａを形質転換する方法は、例えば、Ｃｒｅｇｇら（１９９３）、および様々なＰｈｉｌｌｉｐ特許（例えば、参考として本明細書中に援用された米国特許第４，８５７，４６７号）において教示され、そしてＰｉｃｈｉａ発現キットは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＢＶ，Ｌｅｅｋ，ＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓおよびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから市販されている。適切なプロモーターとしては、ＡＯＸＩおよびＡＯＸ２が挙げられる。Ｇｌｅｅｓｏｎら（１９８６）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３２、３４５９−３４６５は、Ｈａｎｓｅｎｕｌａベクターおよび形質転換に関する情報を含み、適切なプロモーターは、ＭＯＸ１およびＦＭＤ１である；一方ＥＰ ３６１ ９９１、Ｆｌｅｅｒら（１９９１）およびＲｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒからの他の公報は、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．における異種タンパク質を発現する方法を教示し、適切なプロモーターは、ＰＧＫＩである。
転写終結シグナルは、好ましくは転写終結およびポリアデニル化のための適切なシグナルを含む真核細胞遺伝子の３’隣接配列である。適切な３’隣接配列は、例えば、使用される発現制御配列に自然に連結される遺伝子の配列であり得る（すなわち、プロモーター
に相当し得る）。あるいは、それらは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＡＤＨＩ遺伝子の終結配列が好ましい場合に異なり得る。
所望のアルブミン融合タンパクシ質は、選択された酵母において効果的な任意のリーダーであり得る分泌リーダー配列で最初に発現され得る。酵母において有用なリーダーは、以下である：
ＭＰＩＦ−１シグナル配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ信託番号ＡＡＢ５１１３４のアミノ酸１〜２１）ＭＫＶＳＶＡＡＬＳＣＬＭＬＶＴＡＬＧＳＱＡ （配列番号２１３２）
スタンニオカルシン（ｓｔａｎｎｉｏｃａｌｃｉｎ）シグナル配列（ＭＬＱＮＳＡＶＬＬＬＬＶＩＳＡＳＡ、配列番号１０５４）
ＨＳＡシグナル配列のプレ−プロ（ｐｒｅ−ｐｒｏ）領域（例えば、ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳＲＧＶＦＲＲ、配列番号１１７６）
ＨＳＡシグナル配列のプレ領域（例えば、ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳ， 配列番号１１７７）またはそれらの改変体（例えば、ＭＫＷＶＳＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳ）（配列番号１１６８）
転化酵素シグナル配列（例えば、ＭＬＬＱＡＦＬＦＬＬＡＧＦＡＡＫＩＳＡ、配列番号１１０８）
酵母交配因子αシグナル配列（例えば、ＭＲＦＰＳＩＦＴＡＶＬＡＦＡＡＳＳＡＬＡＡＰＶＮＴＴＴＥＤＥＴＡＱＩＰＡＥＡＶＩＧＹＳＤＬＥＧＤＦＤＶＡＶＬＰＦＳＮＳＴＮＮＧＬＬＦＩＮＴＴＩＡＳＩＡＡＫＥＥＧＶＳＬＥＫＲ、配列番号１１０９もしくはＭＲＦＰＳＩＦＴＡＶＬＡＦＡＡＳＳＡＬＡＡＰＶＮＴＴＴＥＤＥＴＡＱＩＰＡＥＡＶＩＧＹＳＤＬＥＧＤＦＤＶＡＶＬＰＦＳＮＳＴＮＮＧＬＬＦＩＮＴＴＩＡＳＩＡＡＫＥＥＧＶＳＬＤＫＲ、配列番号１１０９）
Ｋ．ｌａｃｔｉｓキラー毒素リーダー配列
ハイブリッドシグナル配列（例えば、ＭＫＷＶＳＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳＲＳＬＥＫＲ、配列番号１１１０）
ＨＳＡ／ＭＦα−１ハイブリッドシグナル配列（ＨＳＡ／ｋｅｘ２としてもまた公知）（例えば、ＭＫＷＶＳＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳＲＳＬＤＫＲ、配列番号１１１１）
Ｋ．ｌａｃｔｉｓキラー／ＭＦα−１融合リーダー配列（例えば、ＭＮＩＦＹＩＦＬＦＬＬＳＦＶＱＧＳＬＤＫＲ、配列番号１１６９）
免疫グロブリンＩｇシグナル配列（例えば、ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳ、配列番号１０９５）
Ｆｉｂｕｌｉｎ Ｂ前駆体シグナル配列（例えば、ＭＥＲＡＡＰＳＲＲＶＰＬＰＬＬＬＬＧＧＬＡＬＬＡＡＧＶＤＡ、配列番号１０９６）
クラスター前駆体シグナル配列（例えば、ＭＭＫＴＬＬＬＦＶＧＬＬＬＴＷＥＳＧＱＶＬＧ、配列番号１０９７）
インスリン様増殖因子結合タンパク質４シグナル配列（例えば、ＭＬＰＬＣＬＶＡＡＬＬＬＡＡＧＰＧＰＳＬＧ、配列番号１０９８）
ＨＳＡシグナル配列のプレ−プロ前領域の改変体（例えば、ＭＫＷＶＳＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳＲＧＶＦＲＲ（配列番号１１６７））、
ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＡＧＶＬＧ（配列番号１０９９）、
ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＳＧＶＬＧ（配列番号１１００），
ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＧＧＶＬＧ（配列番号１１０１），
改変されたＨＳＡリーダーＨＳＡ ＃６４
ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＡＧＶＳＧ（配列番号２１３３）；
改変されたＨＳＡリーダーＨＳＡ ＃６６
ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＧＧＶＳＧ（配列番号２１３４）；
改変されたＨＳＡ（Ａ１４）リーダー−
ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＡＧＶＳＧ（配列番号１１０２）；
改変されたＨＳＡ（Ｓ１４）リーダー（改変されたＨＳＡ ＃６５としてもまた公知）− ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＳＧＶＳＧ（配列番号１１０３）
改変されたＨＳＡ（Ｇ１４）リーダー−
ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＧＧＶＳＧ（配列番号１１０４）、またはＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＧＧＶＬＧＤＬＨＫＳ（配列番号１１０５）
コンセンサスシグナル配列（ＭＰＴＷＡＷＷＬＦＬＶＬＬＬＡＬＷＡＰＡＲＧ、配列番号１０５５）
酸ホスファターゼ（ＰＨ０５）リーダー（例えば、ＭＦＫＳＶＶＹＳＩＬＡＡＳＬＡＮＡ 配列番号２１３５）
ＭＦｏｚ−１のプレ配列
０グルカナーゼ（ＢＧＬ２）のプレ配列
キラー毒素リーダー
キラー毒素のプレ配列
ｋ．ｌａｃｔｉｓキラー毒素プレプロ（２９アミノ酸；プレの１６アミノ酸およびプロの１３アミノ酸）ＭＮＩＦＹＩＦＬＦＬＬＳＦＶＱＧＬＥＨＴＨＲＲＧＳＬＤＫＲ（配列番号２１３６）
Ｓ．ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓグルコアルニラーゼ（ｇｌｕｃｏａｎｙｌａｓｅ）Ｉ１分泌リーダー配列
Ｓ．ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓαガラクトシド（ＭＥＬ１）分泌リーダー配列
Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌｕｃｏａｒｎｙｌａｓｅリーダー配列
ＥＰ−Ａ−３８７ ３１９（参考として本明細書中で援用される）において開示されたハイブリッドリーダー
ｇｐ６７シグナル配列（バキュロウイルス発現系との関連）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ信託番号ＡＡＡ７２７５９のアミノ酸１〜１９）または
治療タンパク質Ｘの天然リーダー；
ＪＰ ６２−０９６０８６（９１１０３６５１６として認可される、参考として本明細書中で援用される）において開示されるような、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ転化酵素（ＳＵＣ２）リーダー；または
イヌリナーゼ−ＭＫＬＡＹＳＬＬＬＰＬＡＧＶＳＡＳＶＩＮＹＫＲ（配列番号２１３７）．
改変されたＴＡ５７プロペプチドリーダー改変体 ＃１−ＭＫＬＫＴＶＲＳＡＶＬＳＳＬＦＡＳＱＶＬＧＱＰＩＤＤＴＥＳＱＴＴＳＶＮＬＭＡＤＤＴＥＳＡＦＡＴＱＴＮＳＧＧＬＤＶＶＧＬＩＳＭＡＫＲ（配列番号２１２８）
改変されたＴＡ５７プロペプチドリーダー改変体 ＃２−ＭＫＬＫＴＶＲＳＡＶＬＳＳＬＦＡＳＱＶＬＧＱＰＩＤＤＴＥＳＱＴＴＳＶＮＬＭＡＤＤＴＥＳＡＦＡＴＱＴＮＳＧＧＬＤＶＶＧＬＩＳＭＡＥＥＧＥＰＫＲ（配列番号２１２９）
（アルブミン融合タンパク質の組換え産生および合成的産生のさらなる方法）
本発明はまた、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、宿主細胞、および合成技術および組換え技術によるアルブミン融合タンパク質の産生に関連する。例えば、ベクターは、ファージベクター、プラスミドベクター、ウイルスベクター、またはレトロウイルスベクターであり得る。レトロウイルスベクターは、複製コンピテント、または複製欠損であり得る。後者の場合、一般的にウイルス増殖は、補完性（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｉｎｇ）宿主細胞にのみ生じる。
本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、宿主における増殖のための選択マーカーを含むベクターに連結され得る。一般に、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈澱物のような沈澱物、または荷電脂質との複合体において導入される。ベクターがウイルスである場合、このベクターは、適切なパッケージング細胞株を使用してインビトロでパッケージングされ、次いで宿主細胞に形質導入され得る。
ポリヌクレオチド挿入物は、適切なプロモーター（いくつか挙げれば、例えば、ファージλＰＬプロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｐｈｏＡプロモーターおよびｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーターおよびＳＶ４０後期プロモーター、ならびにレトロウイルスＬＴＲのプロモーター）に作動可能に連結されるべきである。他の適切なプロモーターは当業者に公知である。発現構築物はさらに、転写開始、転写終結のための部位、および転写領域において、翻訳のためのリボソーム結合部位を含む。この構築物によって発現される転写物のコード部分は、好ましくは、始めに翻訳開始コドン、および翻訳されるべきポリペプチドの末端に適切に位置される終結コドン（ＵＡＡ、ＵＧＡまたはＵＡＧ）を含む。
示されるように、発現ベクターは、好ましくは少なくとも１つの選択マーカーを含む。
このようなマーカーは、真核細胞培養のためのジヒドロ葉酸レダクターゼ、Ｇ４１８、グルタミンシンターゼまたはネオマイシン耐性遺伝子、ならびにＥ．ｃｏｌｉおよび他の細菌において培養するためのテトラサイクリン、カナマイシンまたはアンピシリン耐性遺伝子を含む。適切な宿主の代表的な例は、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞）；真菌細胞（例えば、酵母細胞（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＡＴＣＣ受託番号２０１１７８）））；昆虫細胞（例えばＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９細胞）；動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＳＯ細胞、２９３細胞、およびＢｏｗｅｓメラノーマ細胞）；ならびに植物細胞を含むが、これらに限定されない。上記の宿主細胞のための適切な培養培地および条件は、当該分野で公知である。
細菌における使用のために好ましいベクターの中には、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０およびｐＱＥ−９（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．から入手可能）；ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．から入手可能）；およびｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．から入手可能）を含む。好ましい真核生物ベクターの中には、ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１およびｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能）；ならびにｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能）がある。酵母系における使用のために好ましい発現ベクターとしては、ｐＹＥＳ２、ｐＹＤ１、ｐＴＥＦ１／Ｚｅｏ、ｐＹＥＳ２／ＧＳ、ｐＰＩＣＺ、ｐＧＡＰＺ、ｐＧＡＰＺａｌｐｈ、ｐＰＩＣ９、ｐＰＩＣ３．５、ｐＨＩＬ−Ｄ２、ｐＨＩＬ−Ｓ１、ｐＰＩＣ３．５Ｋ、ｐＰＩＣ９Ｋ、およびＰＡＯ８１５（全てが、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｂａｄ，ＣＡから入手可能）が挙げられるがこれらに限定されない。他の適切なベクターは、当業者に容易に明らかである。
一つの実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、本発明のタンパク質の限局化を原核生物細胞または真核生物細胞の特定の画分を方向付け、そして／または原核生物細胞または真核生物細胞由来の本発明のタンパク質の分泌を方向付けるシグナル配列に融合され得る。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、周辺質空間にタンパク質の発現を方向づけることが望まれ得る。本発明のアルブミン融合タンパク質が、細菌の周辺質空間にポリペプチドの発現を方向づけるために融合され得るシグナル配列またはタンパク質（それらのフラグメント）の例としては、ｐｅｌＢシグナル配列、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）シグナル配列、ＭＢＰ、ｏｍｐＡシグナル配列、周辺質Ｅ．ｃｏｌｉ熱−不安定エンテロトキシンＢサブユニットのシグナル配列、およびアルカリンホスファターゼのシグナル配列が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかのベクターは、タンパク質（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから入手可能なベクターのｐＭＡＬ種（特定のｐＭＡＬ−ｐ種）の限局化を方向付ける融合タンパク質の構築のために市販されている。特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドアルブミン融合タンパク質は、ｐｅｌＢペクチン酸塩リアーゼシグナル配列に融合され得、グラム陰性細菌におけるこのようなポリペプチドの発現および精製の効率を増加する。
米国特許第５，５７６，１９５号および同第５，８４６，８１８号（この内容は、それら全体について参考として本明細書中で援用される）を参照のこと。
哺乳動物細胞におけるその分泌を方向付けるために本発明のアルブミン融合タンパク質に融合され得るシグナルペプチドの例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
ａ）ＭＰＩＦ−１シグナル配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ信託番号ＡＡＢ５１１３４のアミノ酸１−２１）ＭＫＶＳＶＡＡＬＳＣＬＭＬＶＴＡＬＧＳＱＡ（配列番号２１３２）
ｂ）スタンニオカルシン（ｓｔａｎｎｉｏｃａｌｃｉｎ）シグナル配列（ＭＬＱＮＳＡＶＬＬＬＬＶＩＳＡＳＡ、配列番号１０５４）
ｃ）ＨＳＡシグナル配列のプレ−プロ領域（例えば、ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳＲＧＶＦＲＲ、配列番号１１７６）
ｄ）ＨＳＡシグナル配列のプレ領域（例えば、ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳ、配列番号１１７７）またはそれらの改変体、例えば、ＭＫＷＶＳＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳ、（配列番号１１６８）
ｅ）転化酵素シグナル配列（例えば、ＭＬＬＱＡＦＬＦＬＬＡＧＦＡＡＫＩＳＡ、配列番号１１０８）
ｆ）酵母交配因子αシグナル配列（例えば、ＭＲＦＰＳＩＦＴＡＶＬＡＦＡＡＳＳＡＬＡＡＰＶＮＴＴＴＥＤＥＴＡＱＩＰＡＥＡＶＩＧＹＳＤＬＥＧＤＦＤＶＡＶＬＰＦＳＮＳＴＮＮＧＬＬＦＩＮＴＴＩＡＳＩＡＡＫＥＥＧＶＳＬＥＫＲ、配列番号１１０９またはＭＲＦＰＳＩＦＴＡＶＬＡＦＡＡＳＳＡＬＡＡＰＶＮＴＴＴＥＤＥＴＡＱＩＰＡＥＡＶＩＧＹＳＤＬＥＧＤＦＤＶＡＶＬＰＦＳＮＳＴＮＮＧＬＬＦＩＮＴＴＩＡＳＩＡＡＫＥＥＧＶＳＬＤＫＲ、配列番号１１０９）
ｇ）Ｋ．ｌａｃｔｉｓキラー毒素リーダー配列
ｈ）ハイブリッドシグナル配列（例えば、ＭＫＷＶＳＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳＲＳＬＥＫＲ、配列番号１１１０）
ｉ）ＨＳＡ／ＭＦα−１ハイブリッドシグナル配列（ＨＳＡ／ｋｅｘ２としてもまた公知）（例えば、ＭＫＷＶＳＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳＲＳＬＤＫＲ、配列番号１１１１）ｊ）Ｋ．ｌａｃｔｉｓキラー／ＭＦα−１融合リーダー配列（例えば、ＭＮＩＦＹＩＦＬＦＬＬＳＦＶＱＧＳＬＤＫＲ、配列番号１１６９）
ｋ）免疫グロブリンＩｇシグナル配列（例えば、ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳ、配列番号１０９５）
ｌ）Ｆｉｂｕｌｉｎ Ｂ前駆体シグナル配列（例えば、ＭＥＲＡＡＰＳＲＲＶＰＬＰＬＬＬＬＧＧＬＡＬＬＡＡＧＶＤＡ、配列番号１０９６）
ｍ）クルステリン（ｃｌｕｓｔｅｒｉｎ）前駆体シグナル配列（例えば、ＭＭＫＴＬＬＬＦＶＧＬＬＬＴＷＥＳＧＱＶＬＧ、配列番号１０９７）
ｎ）インスリン様増殖因子結合タンパク質４シグナル配列（例えば、ＭＬＰＬＣＬＶＡＡＬＬＬＡＡＧＰＧＰＳＬＧ、配列番号１０９８）
ｏ）以下のようなＨＳＡシグナル配列のプレ−プロ−領域の改変体、例えば、ＭＫＷＶＳＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳＲＧＶＦＲＲ（配列番号１１６７）、
ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＡＧＶＬＧ（配列番号１０９９）、
ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＳＧＶＬＧ（配列番号１１００）、
ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＧＧＶＬＧ（配列番号１１０１）、
改変されたＨＳＡリーダーＨＳＡ ＃６４
ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＡＧＶＳＧ（配列番号２１３３）；
改変されたＨＳＡリーダーＨＳＡ ＃６６
ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＧＧＶＳＧ（配列番号２１３４）；
改変されたＨＳＡ（Ａ１４）リーダー−
ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＡＧＶＳＧ（配列番号１１０２）；
改変されたＨＳＡ（Ｓ１４）リーダー（改変されたＨＳＡ ＃６５としてもまた公知）− ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＳＧＶＳＧ（配列番号１１０３）、
改変されたＨＳＡ（Ｇ１４）リーダー−
ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＧＧＶＳＧ（配列番号１１０４）、またはＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＧＧＶＬＧＤＬＨＫＳ（配列番号１１０５）
ｐ）コンセンサスシグナル配列（ＭＰＴＷＡＷＷＬＦＬＶＬＬＬＡＬＷＡＰＡＲＧ、配列番号１０５５）
ｑ）酸ホスファターゼ（ＰＨ０５）リーダー（例えば、ＭＦＫＳＶＶＹＳＩＬＡＡＳＬＡＮＡ、配列番号２１３５）
ｒ）ＭＦｏｚ−１のプレ配列
ｓ）０ グルカナ−ゼ（ＢＧＬ２）のプレ配列
ｔ）キラー毒素リーダー
ｕ）キラー毒素のプレ配列
ｖ）ｋ．ｌａｃｔｉｓキラー毒素プレプロ（２９アミノ酸；プレの１６アミノ酸およびプロの１３アミノ酸）ＭＮＩＦＹＩＦＬＦＬＬＳＦＶＱＧＬＥＨＴＨＲＲＧＳＬＤＫＲ（配列番号２１３６）
ｗ）Ｓ．ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓグルコアミラーゼＩＩ分泌リーダー配列
ｘ）Ｓ．ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓαガラクトシダーゼ（ＭＥＬ１）分泌リーダー配列
ｙ）Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌｕｃｏａｒｎｙｌａｓｅリーダー配列
ｚ）ＥＰ−Ａ−３８７ ３１９（参考として本明細書中で援用される）において開示されるハイブリッドリーダー
ａａ）ｇｐ６７シグナル配列（バキュロウイルス発現系との関連）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ信託番号ＡＡＡ７２７５９のアミノ酸１〜１９）または
ｂｂ）治療用タンパク質Ｘの天然リーダーＸ；
ｃｃ）ＪＰ６２−０９６０８６（９１１０３６５１６として認可され、参考として本明細書中で援用される）において開示されるような、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ転化酵素（ＳＵＣ２）リーダー；または
ｄｄ）イヌリナーゼ−ＭＫＬＡＹＳＬＬＬＰＬＡＧＶＳＡＳＶＩＮＹＫＲ（配列番号２１３７）
ｅｅ）改変されたＴＡ５７プロペプチドリーダー改変体 ＃１−ＭＫＬＫＴＶＲＳＡＶＬＳＳＬＦＡＳＱＶＬＧＱＰＩＤＤＴＥＳＱＴＴＳＶＮＬＭＡＤＤＴＥＳＡＦＡＴＱＴＮＳＧＧＬＤＶＶＧＬＩＳＭＡＫＲ（配列番号２１２８）。
ｆｆ）改変されたＴＡ５７プロペプチドリーダー改変体 ＃２−ＭＫＬＫＴＶＲＳＡＶＬＳＳＬＦＡＳＱＶＬＧＱＰＩＤＤＴＥＳＱＴＴＳＶＮＬＭＡＤＤＴＥＳＡＦＡＴＱＴＮＳＧＧＬＤＶＶＧＬＩＳＭＡＥＥＧＥＰＫＲ（配列番号２１２９）

グルタミンシンターゼ（ＧＳ）またはＤＨＦＲを、選択マーカーとして用いるベクターは、薬物（それぞれメチオニンスルホキシミン（ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ ｓｕｌｐｈｏｘｉｍｉｎｅ）またはメトトレキサート）の存在下で、増幅され得る。グルタミンシンターゼベースのベクターの利点は、グルタミンシンターゼ陰性の細胞株（例えば、マウス骨髄腫細胞株（ＮＳＯ））が利用可能であることである。グルタミンシンターゼ発現系はまた、グルタミンシンターゼ発現細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞）においても、さらなるインヒビターを提供して内因性遺伝子の機能を妨げることにより、機能し得る。グルタミンシンターゼ発現系およびその構成要素は、ＰＣＴ公開第ＷＯ８７／０４４６２号；同第ＷＯ８６／０５８０７号；同第ＷＯ８９／０１０３６号；同第ＷＯ８９／１０４０４号；および同第ＷＯ９１／０６６５７号（これらの全体が本明細書中で参考として援用される）において記載される。さらに、グルタミンシンターゼ発現ベクターは、Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｐｏｒｔｓｍｏｕｔｈ，ＮＨ）から得られ得る。ＧＳ発現系を用いた、マウス骨髄腫細胞におけるモノクローナル抗体の発現および生成は、Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎら，Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６９（１９９２）ならびにＢｉｂｌｉａおよびＲｏｂｉｎｓｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１１：１（１９９５）（本明細書中で参考として援用される）において記載される。
本発明はまた、本明細書中で記載される上記ベクター構築物を含む宿主細胞にも関し、そして本発明のヌクレオチド配列を含む宿主細胞をさらに含む。このヌクレオチド配列は、当該分野で公知の技術を使用して、１つ以上の異種制御領域（例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー）と作動可能に連結される。宿主細胞は、哺乳動物細胞（例えば、ヒト由来細胞）などの高等な真核生物細胞もしくは酵母細胞などの下等な真核生物細胞であり得るか、または宿主細胞は、細菌細胞のような原核生物細胞であり得る。挿入遺伝子配列の発現を調節する宿主菌株、または遺伝子産物を所望の特別な様式で改変もしくはプロセシングする宿主株が選択され得る。特定のプロモーターからの発現は、特定の誘導因子の存在下で、増大し得る；従って、遺伝子操作されたポリペプチドの発現は、制御され得る。その上、別々の宿主細胞は、翻訳ならびに翻訳後のタンパク質のプロセシングおよび改変（例えば、リン酸化、切断）について、特徴および特定の機構を有する。適切な細胞株は、発現する外来性のタンパク質の所望の改変およびプロセシングを確実にするように、選択され得る。
本発明の核酸および核酸構築物の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染、または他の方法によって達成され得る。このような方法は、Ｄａｖｉｓら、Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６）などの、多くの標準的研究室マニュアルにおいて記載される。本発明のポリペプチドが、実際に組換えベクターを欠く宿主細胞によって発現され得ることが、特に企図される。
本明細書において議論されるベクター構築物を含む宿主細胞を含むことに加えて、本発明はまた、脊椎動物起源（特に、哺乳動物起源）の一次（ｐｒｉｍａｒｙ）宿主細胞、二次（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ）宿主細胞、および不死化宿主細胞を含む。これらの宿主細胞は、内因性の遺伝物質（例えば、治療タンパク質に相当するコード配列は、治療タンパク質に相当するアルブミン融合タンパク質と置き換えられ得る）を欠失または置換するように操作されており、そして／または遺伝物質（例えば、異種ポリヌクレオチド配列）を含むように設計される（例えば、治療タンパク質に相当する本発明のアルブミン融合タンパク質のような異種ポリヌクレオチド配列が含まれる）。内因性ポリヌクレオチドと作動可能に連結する遺伝物質は、内因性のポリヌクレオチドを活性化、変更、および／または増幅し得る。
さらに、当該分野で公知の技術は、相同組換えを介して、異種ポリヌクレオチド（例えば、アルブミンタンパク質、またはそのフラグメントもしくは改変体をコードするポリヌクレオチド）および／または異種制御領域（例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー）を、治療タンパク質をコードする内因性ポリヌクレオチド配列と、作動可能に連結するために使用され得る（例えば、１９９７年６月２４日に発行された米国特許第５，６４１，６７０号；国際公開第ＷＯ ９６／２９４１１号；国際公開第ＷＯ ９４／１２６５０号；Ｋｏｌｌｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８９３２−８９３５（１９８９）；およびＺｉｊｌｓｔｒａら，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：４３５−４３８（１９８９）を参照のこと。これらの開示の各々は、それら全体において参考として援用される）。
本発明のアルブミン融合タンパク質は、硫酸アンモニウム沈澱またはエタノール沈澱、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、疎水性電荷相互作用クロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含む周知の方法によって組換え細胞培養物から回収され得、そして精製され得る。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）が精製のために使用される。
好ましい実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質は、アニオン交換クロマトグラフィーを使用して精製される。アニオン交換クロマトグラフィーとしては、Ｑ−セファロースカラム、ＤＥＡＥセファロースカラム、ポロス（ｐｏｒｏｓ）ＨＱカラム、ポロスＤＥＡＥカラム、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ Ｑカラム、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＱＡＥカラム、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＤＥＡＥカラム、リソース／ソースＱカラムおよびリソース／ソースＤＥＡＥカラム、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＱカラムならびにＦｒａｃｔｏｇｅｌ ＤＥＡＥカラムが挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質は、陽イオン交換クロマトグラフィーを使用して精製される。陽イオン交換クロマトグラフィーとしては、ＳＰ−セファロースカラム、ＣＭセファロースカラム、ポロス（ｐｏｒｏｓ）ＨＳカラム、ポロスＣＭカラム、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＳＰカラム、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＣＭカラム、リソース／ソースＳカラムおよびリソース／ソースＣＭカラム、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＳカラムおよびＦｒａｃｔｏｇｅｌ ＣＭカラムならびにこれらの等価物および類似物が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質は、疎水性相互作用クロマトグラフィーを使用して精製される。疎水性相互作用クロマトグラフィーとしては、フェニル−セファロースカラム、ブチル−セファロースカラム、メチル−セファロースカラム、オクチル−セファロースカラム、ヘキシル−セファロースカラム、ポロスフェニルカラム、ポロスブチルカラム、ポロスメチルカラム、ポロスオクチルカラム、ポロスヘキシルカラム、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌフェニルカラム、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌブチルカラム、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌメチルカラム、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌオクチルカラム、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌヘキシルカラム、リソース／ソースフェニルカラム、リソース／ソースブチルカラム、リソース／ソースメチルカラム、リソース／ソースオクチルカラム、リソース／ソースヘキシルカラム、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌフェニルカラム、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌブチルカラム、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌメチルカラム、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌオクチルカラム、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌヘキシルカラム、ならびにこれらの等価物および類似物が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質は、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して精製される。サイズ排除クロマトグラフィーとしては、セファロースＳ１００カラム、セファロースＳ２００カラム、セファロースＳ３００カラム、セファデックスレジンカラムならびにこれらの等価物および類似物が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質は、アフィニティークロマトグラフィーを使用して精製される。アフィニティークロマトグラフィーとしては、Ｍｉｍｅｔｉｃ Ｄｙｅアフィニティーカラム、ペプチドアフィニティーカラムおよび抗体アフィニティーカラムが挙げられるが、これらに限定されない。これらのカラムは、ＨＳＡまたは「融合標的」分子のどちらかに選択的である。
好ましい実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質は、上に列挙した１つ以上のクロマトグラフィー方法を使用して精製される。他の好ましい実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質は、以下の１つ以上のクロマトグラフィーカラムを使用して精製される：ＱセファロースＦＦカラム、ＳＰセファロースＦＦカラム、Ｑセファロース高性能カラム、ブルーセファロースＦＦカラム、ブルーカラム、フェニルセファロースＦＦカラム、ＤＥＡＥセファロースＦＦカラム、またはメチルカラム。
さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質は、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ ００／４４７７２号（本明細書中でその全体が参考として援用される）に記載された過程を使用して精製され得る。当業者は、この中で記載される過程を、本発明のアルブミン融合タンパク質の精製における使用のために、容易に変更し得る。
本発明のアルブミン融合タンパク質は、以下から回収され得る：化学合成手順の産物；および組換え技術により原核細胞宿主または真核細胞宿主から生成される産物（例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞が挙げられる）。組換え生成手順において使用される宿主に依存して、本発明のポリペプチドは、グリコシル化ポリペプチドまたは非グリコシル化ポリペプチドであり得る。さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質はまた、（幾つかの場合では、宿主媒介過程の結果として）冒頭のメチオニン残基の改変も含み得る。従って、全ての真核細胞において、翻訳開始コドンによってコードされるＮ末端メチオニンが、任意のタンパク質から、一般に、翻訳後に効率的に除去されることは、当該分野で周知である。殆どのタンパク質におけるＮ末端メチオニンはまた、殆どの原核生物においても効率的に除去されるが、幾つかのタンパク質については、Ｎ末端メチオニンが共有結合するアミノ酸の性質に依存して、この原核生物除去過程が非効率的である。
１つの実施形態において、酵母Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓは、真核細胞系において、本発明のアルブミン融合タンパク質を発現させるために使用される。Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓは、メタノールをその唯一の炭素供給源として代謝し得るメチル栄養性（ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃ）酵母である。メタノール代謝経路における主要な工程は、Ｏ２を使用してのホルムアルデヒドへのメタノールの酸化である。この反応は、酵素アルコールオキシダーゼによって触媒される。その唯一の炭素供給源としてメタノールを代謝するために、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓは、Ｏ２に対するアルコールオキシダーゼの比較的低い親和性に部分的に起因して、高レベルのアルコールオキシダーゼを生成しなければならない。結果的に、主要な炭素供給源としてメタノールに依存する増殖培地において、２つのアルコールオキシダーゼ遺伝子（ＡＯＸ１）のうちの１つのプロモーター領域は、非常に活性である。メタノールの存在下で、ＡＯＸ１遺伝子から産生されるアルコールオキシダーゼは、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓにおける総可溶性タンパク質のうちのおよそ３０％までを含む。Ｅｌｌｉｓ，Ｓ．Ｂ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１１１１〜２１（１９８５）；Ｋｏｕｔｚ，Ｐ．Ｊ．ら、Ｙｅａｓｔ ５：１６７〜７７（１９８９）；Ｔｓｃｈｏｐｐ，Ｊ．Ｆ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：３８５９〜７６（１９８７）を参照のこと。従って、ＡＯＸ１調節配列の全てまたは一部の転写調節下の異種コード配列（例えば、本発明のポリヌクレオチド）は、メタノールの存在下で増殖したＰｉｃｈｉａ酵母において、非常に高レベルで発現される。
１つの例において、プラスミドベクターｐＰＩＣ９Ｋは、「Ｐｉｃｈｉａ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」，Ｄ．Ｒ．ＨｉｇｇｉｎｓおよびＪ．Ｃｒｅｇｇ編（Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，１９９８）において本質的に記載されるように、Ｐｉｃｈｅａ酵母系において、本明細書中に示されるように本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするＤＮＡを発現させるために使用される。この発現ベクターは、マルチクローニング部位の上流に位置するＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓアルカリホスファターゼ（ＰＨＯ）分泌シグナルペプチド（すなわち、リーダー）に連結された強力なＡＯＸ１プロモーターの効力によって、本発明のポリペプチドの発現および分泌を可能にする。
多くの他の酵母ベクター（例えば、ｐＹＥＳ２、ｐＹＤ１、ｐＴＥＦ１／Ｚｅｏ、ｐＹＥＳ２／ＧＳ、ｐＰＩＣＺ、ｐＧＡＰＺ、ｐＧＡＰＺα、ｐＰＩＣ９、ｐＰＩＣ３．５、ｐＨＩＬ−Ｄ２、ｐＨＩＬ−Ｓ１、ｐＰＩＣ３．５Ｋ、およびＰＡＯ８１５）は、当業者が容易に理解するように、提案された発現構築物が必要とされる場合インフレームのＡＵＧを含む転写、翻訳、分泌（所望される場合）などの適切に配置されたシグナルを提供する限り、ｐＰＩＣ９Ｋの代わりに使用され得る。
別の実施形態において、異種コード配列（例えば、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドなど）の高レベルの発現は、本発明の異種ポリヌクレオチドを発現ベクター（例えば、ｐＧＡＰＺまたはｐＧＡＰＺαなど）中にクローニングし、そしてメタノールの非存在下で酵母培養物を増殖させることによって達成され得る。
さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質は、当該分野で公知の技術を用いて化学合成され得る（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，１９８３，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ．およびＨｕｎｋａｐｉｌｌｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，３１０：１０５−１１１（１９８４）を参照のこと）。例えば、ポリペプチドのフラグメントに対応するポリペプチドは、ペプチド合成機の使用により合成され得る。さらに、所望の場合、非古典的アミノ酸または化学的アミノ酸アナログが、置換または付加としてこのポリペプチド配列に導入され得る。非古典的アミノ酸としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：通常のアミノ酸のＤ異性体、２，４−ジアミノ酪酸、ａ−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、Ａｂｕ、２−アミノ酪酸、ｇ−Ａｂｕ、ｅ−Ａｈｘ、６−アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、ｂ−アラニン、フルオロアミノ酸、デザイナーアミノ酸（例えば、ｂ−メチルアミノ酸）、Ｃａ−メチルアミノ酸、Ｎａ−メチルアミノ酸、および一般のアミノ酸アナログ。さらに、アミノ酸はＤ（右旋性）またはＬ（左旋性）であり得る。
本発明は、翻訳の間または翻訳後に、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護基／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解切断、抗体分子または他の細胞性リガンドへの結合などによって示差的に改変される本発明のアルブミン融合タンパク質を含む。任意の多数の化学的改変は、以下を含むがこれらに限定されない公知の技術によって実施され得る：臭化シアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ４による特異的化学的切断；アセチル化、ホルミル化、酸化、還元；ツニカマイシンの存在下での代謝合成；など。
本発明によって含まれるさらなる翻訳後修飾としては、例えば、以下が挙げられる：Ｎ結合型もしくはＯ結合型の炭水化物鎖（Ｎ末端またはＣ末端のプロセシング）、アミノ酸骨格への化学部分の結合、Ｎ結合型もしくはＯ結合型の炭水化物鎖の化学修飾、および原核生物宿主細胞発現の結果としてのＮ末端メチオニン残基の付加もしくは欠失。このアルブミン融合タンパク質また、検出可能な標識（例えば、酵素標識、蛍光標識、同位体標識または親和性標識）を用いて改変して、このタンパク質の検出および単離が可能にされ得る。
適切な酵素の例としては、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられる；適切な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられる；適切な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン（ｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｏｎｅ）、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリトリンが挙げられる；発光物質の例としては、ルミノールが挙げられる；生物発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが挙げられる；そして適切な放射活性物質の例としては、ヨウ素（１２１Ｉ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１１Ｉｎ、１１２Ｉｎ、１１３ｍＩｎ、１１５ｍＩｎ）、テクネチウム（９９Ｔｃ、９９ｍＴｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素 （１８Ｆ）、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、および９７Ｒｕが、挙げられる。
特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質またはそのフラグメントもしくは改変体は、以下に挙げられるが限定はされない放射性金属イオンと結合する大環状のキレーターに結合する：１７７Ｌｕ、９０Ｙ、１６６Ｈｏ、および１５３Ｓｍ。このキレーターはポリペプチドに対する。好ましい実施形態において、大環状のキレーターと結合する放射性金属イオンは、１１１Ｉｎである。別の好ましい実施形態においては、大環状のキレーターと結合する放射性金属イオンは、９０Ｙである。特定の実施形態において、大環状のキレーターは、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸（ＤＯＴＡ）である。他の特定の実施形態において、ＤＯＴＡは、リンカー分子を介して本発明の抗体またはそのフラグメントに結合する。ＤＯＴＡが
ポリペプチドに結合するために有用なリンカー分子の例は、一般に当該分野で公知である。例えば、ＤｅＮａｒｄｏら，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４（１０）：２４８３−９０（１９９８）；Ｐｅｔｅｒｓｏｎら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１０（４）：５５３−７（１９９９）；およびＺｉｍｍｅｒｍａｎら，Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２６（８）：９４３−５０（１９９９）を、参照のこと。これらは、本明細書中で全体が参考として援用される。
上記のように、本発明のアルブミン融合タンパク質は、天然プロセス（例えば、翻訳後プロセシング）または当該分野で周知の化学的改変技術のいずれかによって、改変され得る。同じ型の改変が、所定のポリペプチドにおけるいくつかの部位で同じ程度または種々の程度で存在し得ることが、理解される。本発明のポリペプチドは、例えば、ユビキチン化の結果として分枝状であり得、そしてそのポリペプチドは、分枝を含むかまたは含まない、環状であり得る。環状ポリペプチド、分枝状ポリペプチドおよび分枝した環状のポリペプチドは、天然の翻訳後プロセスから生じ得るか、または合成方法によって作製され得る。修飾としては、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトール（ｐｈｏｓｐｈｏｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ）の共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、水酸化、ヨウ素化、メチル化、ミリチル化、酸化、ペグ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、タンパク質へのアミノ酸のトランスファーＲＮＡ媒介付加（例えば、アルギニル化）、およびユビキチン化が挙げられる。（例えば、ＰＲＯＴＥＩＮＳ−ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ，第２版，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）；ＰＯＳＴ−ＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮＡＬ ＣＯＶＡＬＥＮＴ ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ，Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１−１２頁（１９８３）；Ｓｅｉｆｔｅｒら，Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ １８２：６２６−６４６（１９９０）；Ｒａｔｔａｎら，Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ６６３：４８−６２（１９９２）を参照のこと）。
本発明のアルブミン融合タンパク質、および治療用タンパク質またはそのフラグメントもしくは改変体に結合する抗体は、マーカー配列（例えば、精製を容易にするためのペプチド）に融合され得る。好ましい実施形態において、このマーカーアミノ酸配列は、ヘキサヒスチジンペプチド（例えば、とりわけ、ｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ，９１３１１）にて提供されるタグである）であり、その多くは市販されている。Ｇｅｎｔｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８２１〜８２４（１９８９）に記載されるように、例えば、ヘキサヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製を提供する。精製のために有用な他のペプチドタグとしては、「ＨＡ」タグおよび「ｆｌａｇ」タグが挙げられるがこれらに限定されない。この「ＨＡ」タグは、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質に由来するエピトープに対応する（Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７（１９８４））。
さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質は、治療用部分（例えば細胞毒（例えば細胞増殖抑制因子もしくは細胞殺傷因子））、治療剤または放射性金属イオン（例えば、α−エミッタ−（例えば２１３Ｂｉ）など）に結合され得る。細胞毒または細胞毒性因子は、細胞に対して有害な任意の薬剤を含む。例としては、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｏｌ）、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン（ｃｏｌｃｈｉｃｉｎ）、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシン、ならびにそのアナログまたはホモログが、挙げられる。治療剤としては、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン（５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパ（ｔｈｉｏｅｐａ）クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、ならびにｃｉｓ−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アンスラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前はダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアンスラマイシン（ａｎｔｈｒａｍｙｃｉｎ）（ＡＭＣ））、ならびに抗有糸分裂剤（例えばビンクリスチンおよびビンブラスチン）が挙げられるが、それらに限定されない。
本発明の結合体は、所定の生物学的応答を改変するために用いられ得、治療薬剤または薬物成分は、古典的な化学的治療薬剤に限定されると解釈されるべきではない。例えば、薬物成分は、所望の生物学的活性を所有するタンパク質またはポリペプチドであり得る。
このようなタンパク質は、例えば、アブリン、リシンＡ、シュードモナスエキソトキシン、またはジフテリアトキシンのようなトキシン；腫瘍壊死因子、αインターフェロン、βインターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子、組織プラスミノゲン活性化因子、アポトーシス作用因子、例えば、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＡＩＭ Ｉ（国際公開番号第ＷＯ９７／３３８９９を参照のこと）、ＡＩＭ ＩＩ（国際公開番号第ＷＯ９７／３４９１１を参照のこと）、Ｆａｓリガンド（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、６：１５６７−１５７４（１９９４））、ＶＥＧＩ（国際公開番号第ＷＯ９９／２３１０５を参照のこと）、血栓性因子または抗血管形成因子、例えば、アンギオスタチンまたはエンドスタチンのようなタンパク質；または、例えば、リンホカイン、インターロイキン１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）、またはその他の成長因子のような生物学的応答改変剤を含み得る。このような治療成分をタンパク質（例えば、アルブミン融合タンパク質）に結合体化する技法は、当該分野で周知である。
アルブミン融合タンパク質はまた、固体支持体に付着され得、これは、本発明のアルブミン融合タンパク質よって結合されるか、それに結合するか、またはそれと会合するポリペプチドの免疫アッセイまたは精製に特に有用である。このような固体支持体は、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリビニルクロライドまたはポリプロピレンを含むが、これらに限定されるわけではない。
アルブミン融合タンパク質は、それに結合体化した治療成分とともに、またはなしで、単独、または細胞傷害性因子（単数または複数）および／またはサイトカイン（単数または複数）と組み合わせて、治療剤として用いられ得る。
本発明のアルブミン融合タンパク質が治療タンパク質を結合する抗体のＶＨドメインのみを含む実施形態では、治療タンパク質を結合する同じ抗体のＶＬドメインとの融合タンパク質を、ＶＨアルブミン融合タンパク質およびＶＬタンパク質が、翻訳後、（共有結合または非共有結合のいずれかにより）会合するように、同時発現することが必要および／または所望され得る。
本発明のアルブミン融合タンパク質が、治療タンパク質を結合する抗体のＶＬドメインのみを含む実施形態では、治療タンパク質を結合する同じ抗体のＶＨドメインとの融合タンパク質を、ＶＬアルブミン融合タンパク質およびＶＨタンパク質が、翻訳後、（共有結合または非共有結合のいずれかにより）会合するように、同時発現することが必要および／または所望され得る。
いくつかの治療抗体は、二特異性抗体であり、治療タンパク質を結合する抗体が、２つの異なる重鎖／軽鎖対、および２つの異なる結合部位を有する人工ハイブリッド抗体であることを意味する。その治療タンパク質に対応するアルブミン融合タンパク質を創製するために、このアルブミンタンパク質成分のＮ末端およびＣ末端の両方に融合されたｓｃＦｖフラグメントを有するアルブミン融合タンパク質を創製することが可能である。より詳細には、アルブミンのＮ末端に融合されたｓｃＦｖは、治療タンパク質を結合する当初の抗体の重鎖／軽鎖（ＶＨ／ＶＬ）対の一方に対応し得、そしてアルブミンのＣ末端に融合されたｓｃＦｖは、治療タンパク質を結合する当初の抗体の重鎖／軽鎖（ＶＨ／ＶＬ）対の他方に対応し得る。
本発明によってまた提供されるのは、ポリペプチドの増加した溶解度、安定性および循環時間、または低下した免疫原性のようなさらなる利点を提供し得る、本発明のアルブミン融合タンパク質の化学的に改変された誘導体である（米国特許第４，１７９，３３７号を参照のこと）。誘導体化のための化学的成分は、ポリエチレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコールコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコールなどのような水溶性ポリマーから選択され得る。アルブミン融合タンパク質は、この分子内のランダムな位置、またはこの分子内の所定の位置で改変され得、そして１つ、２つ、３つまたはそれ以上の付加された化学的成分を含み得る。
このポリマーは、任意の分子量であり得、そして分枝または非分枝であり得る。ポリエチレングリコールについては、好ましい分子量は、取扱いおよび製造における容易さのために、約１ｋＤａと約１００ｋＤａとの間である（用語「約」は、ポリエチレングリコールの調製物中で、いくつかの分子が述べられた分子量よりいくらか大きいか、または小さい重量であることを示す）。その他のサイズも、所望の治療プロフィール（例えば、所望の持続放出の持続期間、存在する場合生物学的活性に対する効果、取扱いの容易さ、抗原性の程度または欠如、および治療タンパク質またはアナログに対するポリエチレングリコールのその他の既知の効果）に依存して用いられ得る。例えば、このポリエチレングリコールは、約２００、５００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９５００、１０，０００、１０，５００、１１，０００、１１，５００、１２，０００、１２，５００、１３，０００、１３，５００、１４，０００、１４，５００、１５，０００、１５，５００、１６，０００、１６，５００、１７，０００、１７，５００、１８，０００、１８，５００、１９，０００、１９，５００、２０，０００、２５，０００、３０，０００、３５，０００、４０，０００、４５，０００、５０，０００、５５，０００、６０，０００、６５，０００、７０，０００、７５，０００、８０，０００、８５，０００、９０，０００、９５，０００、または１００，０００ｋＤａの平均分子量を有し得る。
上記のように、このポリエチレングリコールは、分枝構造を有し得る。分枝ポリエチレンは、例えば、米国特許第５，６４３，５７５号；Ｍｏｒｐｕｒｇｏら、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５６：５９−７２（１９９６）；Ｖｏｒｏｂｊｅｖら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １８：２７４５−２７５０（１９９９）；およびＣａｌｉｃｅｔｉら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１０：６３８−６４６（１９９９）に記載されており、その各々の開示は、本明細書中に参考として援用される。
このポリエチレングリコール分子（またはその他の化学的成分）は、タンパク質の機能的ドメインまたは抗原性ドメインに対する影響を考慮してタンパク質に付着されるべきである。当業者に利用可能な以下のような多くの付着方法があり、例えば、本明細書に参考として援用されるＥＰ ０ ４０１ ３８４に開示される方法（Ｇ−ＣＳＦへのＰＥＧの結合）；トレシルクロライドを用いるＧＭ−ＣＳＦのペグ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）を報告する、Ｍａｌｉｋら、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２０：１０２８−１０３５（１９９２）もまた参照のこと。例えば、ポリエチレングリコールは、遊離のアミノ基またはカルボキシル基のような、反応性基を経由してアミノ酸残基を通じて共有結合され得る。反応性基は、活性化されたポリエチレングリコール分子が結合し得るような基である。遊離のアミノ基を有するアミノ酸残基は、リジン残基およびＮ末端アミノ酸残基を含み得；遊離のカルボキシル基を有するアミノ酸残基は、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基およびＣ末端アミノ酸残基を含み得る。スルフヒドリル基もまた、ポリエチレングリコール分子を付着するための反応性基として用いられ得る。治療目的のための好ましいのは、Ｎ末端またはリジン基における付着のような、アミノ基における付着である。
上記で示唆されるように、ポリエチレングリコールは、任意の数のアミノ酸残基への結合を経由してタンパク質に付着され得る。例えば、ポリエチレングリコールは、リジン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、またはシステイン残基への共有結合を経由してタンパク質に結合され得る。１つ以上の反応化学薬品が、ポリエチレングリコールを、タンパク質の特定のアミノ酸残基（例えば、リジン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、またはシステイン）、またはタンパク質の１つ以上のタイプのアミノ酸残基（例えば、リジン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システインおよびそれらの組合せ）に付着するために採用され得る。
Ｎ末端において化学的に改変されるタンパク質が、具体的に所望され得る。本発明の組成物の例示として、ポリエチレングリコールを使用して、当業者は、種々のポリエチレングリコール分子（分子量、分枝などによって）、反応混合物中のポリエチレングリコール分子 対 タンパク質（ポリペプチド）分子の割合、行われるペグ化反応の型、および選択されるＮ末端ペグ化タンパク質を得る方法から選択し得る。Ｎ末端ペグ化調製物を得る（すなわち、この部分を、必要であれば、他のモノペグ化部分から分離する）方法は、Ｎ末端ペグ化物質をペグ化タンパク質分子の集団から精製することによってであり得る。Ｎ末端改変において化学的に改変された選択的タンパク質は、特定のタンパク質における誘導体化に利用可能な異なる型の第１級アミノ基（Ｎ末端に対してリジン）の異なる反応性を利用する還元型アルキル化によって達成され得る。適切な反応条件の下で、カルボキシル基含有ポリマーを用いたＮ末端でのタンパク質の実質的に選択的な誘導体化が達成される。
上記に示されるように、本発明のアルブミン融合タンパク質のペグ化は、任意の数の手段により達成され得る。例えば、ポリエチレングリコールは、アルブミン融合タンパク質に、直接にかまたは介在リンカーによってかのいずれかで結合され得る。ポリエチレングリコールをタンパク質に結合するためのリンカーなしの系は、Ｄｅｌｇａｄｏら，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａ．Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓ．９：２４９−３０４（１９９２）；Ｆｒａｎｃｉｓら，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｊ．ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌ．６８：１−１８（１９９８）；米国特許第４，００２，５３１号；米国特許第５，３４９，０５２号；ＷＯ９５／０６０５８；およびＷＯ９８／３２４６６（これらの各々の開示は、本明細書中に参考として援用される）記載される。
ポリエチレングリコールをタンパク質のアミノ酸残基に介入リンカーを使用せずに直接結合するための１つの系は、モノメトキシポリエチレングリコール（ＭＰＥＧ）のトレシルクロリド（ＣｌＳＯ２ＣＨ２ＣＦ３）を使用した修飾により生成される、トレシル化（ｔｒｅｓｙｌａｔｅｄ）ＭＰＥＧを使用する。タンパク質とトレシル化ＭＰＥＧとの反応の際に、ポリエチレングリコールは、そのタンパク質のアミン基に直接結合される。従って、本発明は、本発明のタンパク質と、２，２，２−トリフルオロエタン（ｔｒｉｆｌｕｏｒｅｏｔｈａｎｅ）スルホニル基を有するポリエチレングリコール分子とを反応させることによって生成される、タンパク質−ポリエチレングリコール結合体を包含する。
ポリエチレングリコールはまた、多くの異なる介入リンカーを使用してタンパク質に結合され得る。例えば、米国特許第５，６１２，４６０号（これらの開示全体は、本明細書中に参考として援用される）は、ポリエチレングリコールをタンパク質に連結するためのウレタンリンカーを開示する。タンパク質−ポリエチレングリコール結合体（ここでこのポリエチレングリコールは、リンカーによってタンパク質に結合される）はまた、タンパク質と、ＭＰＥＧ−スクシンイミジルスクシネート、１，１’−カルボニルジイミダゾールで活性化されたＭＰＥＧ、ＭＰＥＧ−２，４，５−トリクロロペニル（ｔｒｉｃｈｌｏｒｏｐｅｎｙｌ）カーボネート、ＭＰＥＧ−ｐ−ニトロフェノールカーボネート、および種々のＭＰＥＧ−スクシネート誘導体のような化合物との反応によって生成され得る。ポリエチレングリコールをタンパク質に結合するための、多くのさらなるポリエチレングリコール誘導体および反応化学は、国際公開番号ＷＯ９８／３２４６６（これらの開示全体は、本明細書中に参考として援用される）に記載される。本明細書中に記載される反応化学を使用して生成されるペグ化タンパク質生成物は、本発明の範囲内に包含される。
本発明の各アルブミン融合タンパク質に結合されるポリエチレングリコール部分の数（すなわち、置換の程度）もまた変化し得る。例えば、本発明のペグ化タンパク質は、平均して、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１２個、１５個、１７個、２０個またはそれ以上のポリエチレングリコール分子に連結され得る。同様に、平均した置換の程度は、１タンパク質分子あたり、１〜３個、２〜４個、３〜５個、４〜６個、５〜７個、６〜８個、７〜９個、８〜１０個、９〜１１個、１０〜１２個、１１〜１３個、１２〜１４個、１３〜１５個、１４〜１６個、１５〜１７個、１６〜１８個、１７〜１９個、または１８〜２０個のような、ポリエチレングリコール部分の範囲である。置換の程度を決定するための方法は、例えば、Ｄｅｌｇａｄｏら，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａ．Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓ．９：２４９−３０４（１９９２）において議論される。
本発明のポリペプチドは、硫酸アンモニウムもしくはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオン交換クロマトグラフィーもしくは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーが挙げられるが、これらに限定されない標準的な方法によって、化学合成および組換え細胞培養物から回収および精製され得る。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）は、精製のために使用される。タンパク質の再折りたたみのための周知の技術は、そのポリペプチドが、単離および／または精製の間に変性される場合、活性なコンホメーションを再生するために使用され得る。
本発明のアルブミン融合タンパク質の存在または量は、当該分野で周知のイムノアッセイであるＥＬＩＳＡを使用して決定され得る。１つのＥＬＩＳＡにおいて、本発明のアルブミン融合タンパク質を検出／定量するために有用なプロトコルは、ＥＬＩＳＡプレートを、抗ヒト血清アルブミン抗体でコーティングする工程、プレートをブロッキングして、非特異的結合を防止する工程、そのＥＬＩＳＡプレートを洗浄する工程、本発明のアルブミン融合タンパク質を含む溶液を（１以上の異なる濃度で）添加する工程、検出可能な標識に連結された二次抗治療用タンパク質特異的抗体を添加する工程（本明細書中に記載されるかまたはさもなければ当該分野で公知のように）、および二次抗体の存在を検出する工程を包含する。このプロトコルの代替的バージョンにおいて、ＥＬＩＳＡプレートは、抗治療用タンパク質特異的抗体でコーティングされ得、その標識二次試薬は、抗ヒトアルブミン特異的抗体であり得る。
（ポリヌクレオチドの使用）
本明細書中で同定されるポリヌクレオチドの各々は、多くの様式において試薬として使用され得る。以下の記載は、例示的であると見なされるべきであり、公知の技術を利用する。
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のアルブミン融合タンパク質を生成するために有用である。以下により詳細に記載されるように、本発明のポリヌクレオチド（アルブミン融合タンパク質をコードする）は、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドによってコードされるアルブミン融合タンパク質を発現する細胞、細胞株、または組織を作製するために、遺伝子操作において有用な組換えＤＮＡ法において使用され得る。
本発明のポリヌクレオチドはまた、遺伝子治療において有用である。遺伝子治療の１つの目的は、遺伝的欠損を矯正する試みにおいて、欠損遺伝子を有する生物に正常な遺伝子を挿入することである。本発明において開示されるポリヌクレオチドは、非常に正確な様式でこのような遺伝的欠損を標的化する手段を提供する。別の目的は、宿主ゲノムに存在しなかった新たな遺伝子を挿入し、それにより宿主細胞において新たな形質を生じさせることである。本発明によって包含される遺伝子治療法のさらなる非例示的例は、本明細書中で他の箇所により綿密に記載される（例えば、「遺伝子治療」と表された節ならびに実施例６３および６４を参照のこと）。
（ポリペプチドの使用）
本明細書中で同定される各々のポリペプチドは、多くの方法において使用され得る。以下の記述は、例示として考慮されるべきであり、そして公知の技術を利用する。
本発明のアルブミン融合タンパク質は、組織（例えば、ＡＢＣ免疫ペルオキシダーゼのような免疫組織化学アッセイ（Ｈｓｕら、Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．２９：５７７−５８０（１９８１））または細胞型（例えば、免疫細胞化学アッセイ）の差次的同定のための免疫学的プローブを提供するために有用である。
アルブミン融合タンパク質を使用して、当業者に公知の古典的な免疫組織学的な方法を用いて、生物学的サンプル中のポリペプチドのレベルをアッセイし得る（例えば、Ｊａｌｋａｎｅｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０１：９７６−９８５（１９８５）；Ｊａｌｋａｎｅｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０５：３０８７−３０９６（１９８７）を参照のこと）。タンパク質の遺伝子発現を検出するのに有用な他の方法には、免疫学的検定（例えば、酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ））が含まれる。適切なアッセイの標識は、当該分野で公知であり、そして酵素標識（例えば、グルコースオキシダーゼ）；放射性同位体（例えば、ヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１５ｍＩｎ、１１３ｍＩｎ、１１２Ｉｎ、１１１Ｉｎ）、およびテクネチウム（９９Ｔｃ、９９ｍＴｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕ；発光標識（例えば、ルミノール）；ならびに蛍光標識（例えば、フルオレセインおよびローダミン）ならびにビオチンが挙げられる。
本発明のアルブミン融合タンパク質はまた、画像化によりインビボで検出され得る。タンパク質のインビボ画像化のための抗体の標識またはマーカーは、Ｘ線撮影法、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、または電子スピン共鳴（ＥＳＲ）により検出可能なものを含む。Ｘ線撮影法のために適切な標識は、放射性同位体（例えば、バリウムまたはセシウム）を含み、これは検出可能な放射線を放射するが、被験体に対して明らかに有害ではない。ＮＭＲおよびＥＳＲのための適切なマーカーは、検出可能な特徴的なスピンを有するマーカー（例えば、重水素）を含み、これは、本発明のアルブミン融合タンパク質を発現する細胞株に生じた栄養分を標識することによりアルブミン融合タンパク質中に取り込まれ得る。
放射性同位体（例えば、１３１Ｉ、１１２Ｉｎ、９９ｍＴｃ、（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１５ｍＩｎ、１１３ｍＩｎ、１１２Ｉｎ、１１１Ｉｎ）、およびテクネチウム（９９Ｔｃ、９９ｍＴｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕ）、放射線不透過性物質、または核磁気共鳴により検出可能な材料のような適切な検出可能な画像化部分で標識された、アルブミン融合タンパク質は、免疫系の障害について検査されるべき哺乳動物に（例えば、非経口的、皮下、または腹腔内に）導入される。被験体のサイズおよび用いられる画像化システムは、診断画像を生成するために必要な画像化部分の量を決定することが当該分野で理解される。放射性同位体部分の場合には、ヒト被験体について、注射される放射能の量は、通常、９９ｍＴｃの約５〜２０ミリキュリーの範囲である。次いで、標識されたアルブミン融合タンパク質は、好ましくは、一つ以上のレセプター、リガンドまたは基質（本発明のアルブミン融合タンパク質を作製するために使用される治療タンパク質のものに相当する）が配置される体（例えば、器官、細胞、細胞外空間または細胞外マトリックス）中の位置に蓄積する。あるいは、アルブミン融合タンパク質が、治療抗体の少なくともフラグメントまたは変異体を含む場合において、次いで標識されたアルブミン融合タンパク質は、好ましくは、治療抗体（本発明のアルブミン融合タンパク質を作製するために使用される）によって結合されるものに相当するポリペプチド／エピトープが配置される体（例えば、器官、細胞、細胞外空間または細胞外マトリックス）中の位置に蓄積する。インビボ腫瘍画像化は、Ｓ．Ｗ．Ｂｕｒｃｈｉｅｌら、「Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ」（Ｔｕｍｏｒ Ｉｍａｇｉｎｇの第１３章：Ｔｈｅ Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ、Ｓ．Ｗ．ＢｕｒｃｈｉｅｌおよびＢ．Ａ．Ｒｈｏｄｅｓ編、Ｍａｓｓｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ．（１９８２））に記載される。本明細書中に記載されるプロトコルは、本発明のアルブミン融合タンパク質を用いて使用するために当業者によって容易に改善され得る。
１つの実施形態において、本発明は、異種ポリペプチドまたは核酸と会合する本発明のアルブミン融合タンパク質（例えば、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドおよび／または抗体）を投与することによる、細胞への本発明のアルブミン融合タンパク質の特異的な送達のための方法を提供する。１つの例において、本発明は、治療タンパク質を標的化細胞中へ送達するための方法を提供する。別の例において、本発明は、一本鎖核酸（例えば、アンチセンスまたはリボザイム）または二本鎖核酸（例えば、細胞のゲノムに組み込み得るか、またはエピソームにて複製し得、そして転写され得るＤＮＡ）を、標的化細胞に送達するための方法を提供する。
別の実施形態において、本発明は、毒素または細胞傷害性プロドラッグに関連する本発明のアルブミン融合タンパク質を投与することによる細胞の特異的な破壊（例えば、腫瘍細胞の破壊）のための方法を提供する。
「毒素」とは、内因性の細胞傷害性エフェクタ系、放射性同位体、ホロ毒素（ｈｏｌｏｔｏｘｉｎ）、改変型毒素、毒素の触媒サブユニット、または規定の条件下で細胞死を引き起こす細胞中もしくは細胞表面には通常存在しない任意の分子もしくは酵素を結合および活性化する１つ以上の化合物を意味する。本発明の方法に従って使用され得る毒素としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：当該分野で公知の放射性同位体、固有のまたは誘導された内因性の細胞傷害性エフェクタ系に結合する化合物（例えば、抗体（またはその補体固定含有部分））、チミジンキナーゼ、エンドヌクレアーゼ、ＲＮＡｓｅ、α毒素、リシン、アブリン、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ、ジフテリア毒素、サポリン、モモルジン（ｍｏｍｏｒｄｉｎ）、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、αサルシン（ｓａｒｃｉｎ）およびコレラ毒素。「毒素」はまた、細胞分裂停止剤もしくは細胞破壊剤、治療薬または放射活性金属イオン（例えば、α−放射体（例えば、２１３Ｂｉ））もしくは他の放射性同位体（例えば、１０３Ｐｄ、１３３Ｘｅ、１３１Ｉ、６８Ｇｅ、５７Ｃｏ、６５Ｚｎ、８５Ｓｒ、３２Ｐ、３５Ｓ、９０Ｙ、１５３Ｓｍ、１５３Ｇｄ、１６９Ｙｂ、５１Ｃｒ、５４Ｍｎ、７５Ｓｅ、１１３Ｓｎ、９０イットリウム、１１７スズ、１８６レニウム、１６６ホルミウム、および１８８レニウム）；発光標識（例えば、ルミノール）；および蛍光標識（例えば、フルオレセインおよびローダミン）、ならびにビオチンを含む。特定の実施形態において、本発明は、放射性同位体９０Ｙに関連する本発明のポリペプチドまたは本発明の抗体を投与することによって、細胞の特異的な消滅（例えば、腫瘍細胞の消滅）のための方法を提供する。別の特定の実施形態において、本発明は、放射性同位体１１１Ｉｎに関連する本発明のポリペプチドまたは本発明の抗体を投与することによって、細胞の特異的な消滅（例えば、腫瘍細胞の消滅）のための方法を提供する。さらに特定の実施形態において、本発明は、放射性同位位１３１Ｉに関連する本発明のポリペプチドまたは本発明の抗体を投与することによって、細胞の特異的な消滅（例えば、腫瘍細胞の消滅）のための方法を提供する。
当該分野において公知の技術は、本発明のポリペプチドを標識化するために適用され得る。このような技術としては、二官能性結合剤の使用（例えば、米国特許第５，７５６，０６５号；同第５，７１４，６３１号；同第５，６９６，２３９号；同第５，６５２，３６１号；同第５，５０５，９３１号；同第５，４８９，４２５号；同第５，４３５，９９０号；同第５，４２８，１３９号；同第５，３４２，６０４号；同第５，２７４，１１９号；同第４，９９４，５６０号；および同第５，８０８，００３号を参照のこと；これら各々の内容は、本明細書中に参考としてその全体を援用する）が挙げられるが、これに限定されない。
本発明のアルブミン融合タンパク質は、哺乳動物、好ましくはヒト中の様々な障害の診断、処置、妨害および／または予後のために有用である。このような障害としては、以下の節の見出しである「生物学的活性」の下で本明細書中に記載されるものが挙げられるが、これらに限定されない。
従って、本発明は、障害の診断方法を提供し、これは以下を含む：（ａ）本発明のアルブミン融合タンパク質を使用して個体の細胞または体液における特定のポリペプチドの発現レベルをアッセイする工程；および（ｂ）アッセイされたポリペプチドの発現レベルを標準のポリペプチドの発現レベルと比較し、それによって標準の発現レベルと比較してアッセイされたポリペプチドの発現レベルにおける増加または減少が障害を示す工程。癌に関しては、個体由来の生検された組織中の相対的に高い量の転写物の存在は、疾患の発症の素因を示し得るか、または実際の臨床的な症状が明らかとなる前に疾患を検出するための手段を提供し得る。より決定的なこのタイプの診断は、保健専門家がより早く予防策または積極的な処置を使用し、それによって癌の発症またはさらなる進行を防ぐことを可能にし得る。
さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質を用いて疾患または状態（例えば、神経障害、免疫系障害、筋肉障害、生殖障害、胃腸障害、肺障害、心血管障害、腎臓障害、増殖障害ならびに／または癌性疾患および状態など）を処置または予防し得る。例えば、患者は、ポリペプチドの非存在またはレベルの減少を元に戻すこと（例えば、インスリン）、異なるポリペプチドの不在またはレベルの減少を補充すること（例えば、ヘモグロビンＢに対するヘモグロビンＳ、ＳＯＤ、カタラーゼ、ＤＮＡ修復タンパク質）、ポリペプチドの活性を阻害すること（例えば、癌遺伝子または腫瘍抑制因子）、ポリペプチドの活性を活性化すること（例えば、レセプターに結合させることによって）、遊離リガンドについて膜結合レセプターと競合させることによって膜結合レセプターの活性を減少させること（例えば、炎症を低減させる際に用いられる可溶性ＴＮＦレセプター）、または所望の応答をもたらすこと（例えば、血管の成長の阻害、増殖細胞または組織に対する免疫応答の増強）の試みにおいて、本発明のポリペプチドが投与され得る。
特に、治療抗体の少なくともフラグメントまたは変異体を含むアルブミン融合タンパク質もまた用いられ、疾患（上記、および本明細書中のどこかに記載されるような）を処置し得る。例えば、治療抗体の少なくともフラグメントまたは変異体を含むアルブミン融合タンパク質の投与は、ポリペプチドを結合し得、そして／またはアルブミン融合タンパク質を作製するために使用される治療抗体が特異的に結合するポリペプチドを中和し得、そして／またはアルブミン融合タンパク質を作製するために使用される治療抗体が特異的に結合するポリペプチドの過剰産生を低減し得る。同様に、治療抗体の少なくともフラグメントまたは変異体を含むアルブミン融合タンパク質の投与は、膜（レセプター）に結合されるポリペプチドに結合することによって、アルブミン融合タンパク質を作製するために使用される治療抗体が特異的に結合するポリペプチドを活性化し得る。
少なくとも、本発明のアルブミン融合タンパク質は、当業者に周知の方法を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルまたは分子ふるいゲル濾過カラムの分子量マーカーとして使用され得る。宿主細胞の形質転換を評価する方法として、本発明のアルブミン融合タンパク質がまた用いられて、抗体を惹起し得、次いで、この抗体が使用されて、組換え細胞からの治療タンパク質、アルブミンタンパク質、および／または本発明のアルブミン融合タンパク質のタンパク質発現を測定する。さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質が使用され、以下の生物学的活性を試験し得る。
（診断アッセイ）
本発明の化合物は、哺乳動物（好ましくはヒト）における種々の障害の診断、処置、予防および／または予測のために有用である。このような障害としては、表１の相当する列、ならびに「免疫アッセイ」、「血液関連障害」、「過剰増殖障害」、「腎臓障害」、「心臓血管障害」、「呼吸障害」、「抗新脈管形成活性」、「細胞レベルでの疾患」、「創傷治癒および上皮細胞増殖」、「神経活性および神経学的疾患」、「内分泌障害」、「生殖系障害」、「感染障害」、「再発症」、および／または「胃腸障害」と見出しをつけた節のもとで本明細書において、各治療タンパク質について記載されたものが挙げられるが、これに限定されない。
多数の障害について、遺伝子発現の実質的に変更した（増大または減少した）レベルが、このような障害を有する個体から得た細胞または体液（例えば、血清、血漿、尿、精液、滑液または髄液）で、「標準」の遺伝子発現レベル、すなわち、障害を有さない個体由来の組織または体液中の発現レベルに比較して、検出され得る。従って、本発明は、障害の診断中に有用な診断方法を提供し、この方法は、個体由来の組織、細胞または体液でのポリペプチドをコードする遺伝子の発現レベルを測定する工程、および測定した遺伝子発現レベルを標準遺伝子発現レベルと比較する工程を包含し、そのことにより、標準と比較される遺伝子発現レベルの増加または減少が、障害の指標となる。これらの診断アッセイは、例えば、血液サンプル、生検組織、または剖検組織などにおいて、インビボまたはインビトロで実施され得る。
本発明はまた、予想指標として有用であり、これにより遺伝子発現の上昇または低下を示す患者は、悪い臨床結果を被る。
「ポリペプチドをコードする遺伝子の発現レベルをアッセイする」とは、特定のポリペプチドのレベル、または本発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡレベルを、第一の生物学的サンプルで、直接的（例えば、絶対タンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルの決定または評価によって）または相対的（例えば、第二の生物学的サンプルのポリペプチドレベルまたはｍＲＮＡレベルに対する比較によって）に、定性または定量的に測定または評価することを意図する。好ましくは、第一の生物学的サンプル中のポリペプチドレベルまたはｍＲＮＡレベルは、測定または評価され、そして標準ポリペプチドレベルまたはｍＲＮＡレベルと比較され、この標準は、障害を有さない個体から得た第二の生物学的サンプルから得られるか、または免疫系の障害を有さない個体集団からのレベルを平均して決定される。当該分野で理解されるように、一旦、標準ポリペプチドレベルまたはｍＲＮＡレベルが判明すると、比較のための標準として繰り返し使用され得る。
「生物学的サンプル」とは、本発明のポリペプチド（その一部を含む）またはｍＲＮＡを含有する、個体、細胞株、組織培養物、またはその他の供給源から得られた、任意の生物学的サンプルを意図する。示されるように、生物学的サンプルとしては、ポリペプチドの全長またはそのフラグメントまたはｍＲＮＡを発現することが見出された体液（例えば、血清、血漿、尿、滑液、および髄液）および組織供給源が挙げられる。哺乳動物から組織生検および体液を得る方法は、当該分野で周知である。生物学的サンプルが、ｍＲＮＡを含む場合、組織生検が好ましい供給源である。
全細胞ＲＮＡは、ＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉおよびＳａｃｃｈｉ（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２：１５６−１５９（１９８７））により記載される一段階グアニジウム−チオシアネート−フェノール−クロロホルム方法のような任意の適切な技術を用いて生物学的サンプルから単離され得る。次いで、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡのレベルが、任意の適切な方法を用いてアッセイされる。これらは、ノーザンブロット分析、Ｓ１ヌクレアーゼマッピング、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ポリメラーゼ連鎖反応と組み合わせた逆転写（ＲＴ−ＰＣＲ）、およびリガーゼ連鎖反応と組み合わせた逆転写（ＲＴ−ＬＣＲ）を包含する。
本発明はまた、ポリペプチドの正常なレベルおよび異常なレベルの決定を含む、生物学的サンプル（例えば、細胞および組織）中のポリペプチドのレベルを検出する定量アッセイおよび診断アッセイのような診断アッセイに関する。従って、例えば、正常なコントロール組織サンプルと比較した、アルブミン融合タンパク質に結合する、アルブミン融合タンパク質によって結合される、またはアルブミン融合タンパク質と関連するポリペプチドの過剰発現を検出するための本発明に従う診断アッセイは、腫瘍の存在を検出するために使用され得る。宿主由来のサンプルにおいて、本発明のアルブミン融合タンパク質に結合する、アルブミン融合タンパク質によって結合される、またはアルブミン融合タンパク質と関連するポリペプチドのレベルを決定するために使用され得るアッセイ技術は、当業者に周知である。このようなアッセイ方法としては、放射性免疫アッセイ、競合結合アッセイ、ウエスタンブロット分析、およびＥＬＩＳＡアッセイが挙げられる。生物学的サンプルにおけるポリペプチドレベルのアッセイは、任意の当該分野に公知の方法を用いて可能である。
生物学的サンプル中のポリペプチドレベルをアッセイすることは、技術を用いて可能である。例えば、組織におけるポリペプチド発現は、古典的な免疫組織学的方法（Ｊａｌｋａｎｅｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０１：９７６−９８５（１９８５）；Ｊａｌｋａｎｅｎ、Ｍ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０５：３０８７−３０９６（１９８７））を用いて研究され得る。ポリペプチド遺伝子発現を検出するために有用な他の方法は、免疫アッセイ（例えば、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）および放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ））を包含する。適切な抗体アッセイ標識は、当該分野で公知であり、そして酵素標識（例えば、グルコースオキシダーゼ）および放射性同位元素（例えば、ヨウ素（１２５Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１２Ｉｎ）、およびテクネチウム（９９ｍＴｃ）および蛍光標識（例えば、フルオレセインおよびローダミン）、ならびにビオチンを包含する。
分析されるべき組織または細胞型としては、一般的には、目的の遺伝子を発現することが公知であるか、またはそのことが予測される組織または細胞型（例えば、癌など）が挙げられる。本明細書中で使用されるタンパク質単離方法は、例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．およびＬａｎｅ，Ｄ．，１９８８「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（これは、その全体が本明細書中で参考として援用される））に記載される方法であり得る。単離された細胞は、細胞培養物または患者由来であり得る。培養物から採取された細胞の分析は、細胞ベースの遺伝子治療技術の一部として、あるいは遺伝子の発現に対する化合物の効果を試験するために使用され得る細胞の評価において必須の工程であり得る。
例えば、アルブミン融合タンパク質を使用して、本発明のアルブミン融合タンパク質に結合する、アルブミン融合タンパク質によって結合される、またはアルブミン融合タンパク質と関連するポリペプチドの存在を定量的にまたは定性的に検出し得る。これは、例えば、光学顕微鏡検出、フローサイトメトリー検出、または蛍光比色検出と一緒に蛍光的に標識されたアルブミン融合タンパク質を使用する免疫蛍光技術によって達成され得る。
好ましい実施形態において、本明細書中に開示される（表１に開示される）またはそうでなければ当該分野で公知である少なくとも治療タンパク質に特異的に結合する抗体の少なくともフラグメントまたは変異体を含むアルブミン融合タンパク質は、遺伝子産物、またはその保存された改変体もしくはペプチドフラグメントの存在を定量的にまたは定性的に検出するために用いられ得る。これは、例えば、光学顕微鏡、フローサイトメトリー、または蛍光定量検出と組み合わせた、蛍光標識した抗体を使用する免疫蛍光技術によって達成され得る。
本発明のアルブミン融合タンパク質は、本発明のアルブミン融合タンパク質に結合する、アルブミン融合タンパク質によって結合される、またはアルブミン融合タンパク質と関連するポリペプチドのインサイチュ検出のために、免疫蛍光、免疫電子顕微鏡または非免疫学的アッセイとしてさらに組織学的に使用され得る。インサイチュ検出は、患者由来の組織学的標本を除去すること、およびそれに本発明の標識した抗体またはポリペプチドを適用することによって達成され得る。アルブミン融合タンパク質は、好ましくは、生物学的サンプル上に標識したアルブミン融合タンパク質を覆うことによって適用される。このような手順の使用を通して、アルブミン融合タンパク質に結合する、アルブミン融合タンパク質によって結合される、またはアルブミン融合タンパク質と関連するポリペプチドの存在だけでなく、試験した組織におけるその分布も決定することが可能である。本発明を使用して、当業者は、広範種々の組織学的方法のいずれか（例えば、染色手順）が、例えば、インサイチュ検出を達成するために変更され得ることを容易に理解する。
アルブミン融合タンパク質に結合する、アルブミン融合タンパク質によって結合される、またはアルブミン融合タンパク質と関連するポリペプチドを検出する免疫アッセイおよび非免疫アッセイは、代表的に、遺伝子産物または保存された変異体もしくはそのペプチドフラグメントを結合し得る検出可能に標識された抗体の存在下で、サンプル（例えば、生物学的液体、組織抽出物、新鮮な収集された細胞、または細胞培養においてインキュベートされた細胞の溶解物）をインキュベートする工程、ならびに当該分野で周知の多数の技術のいずれかによって結合した抗体を検出する工程を包含する。
生物学的サンプルは、固相支持体またはキャリア（例えば、ニトロセルロース）あるいは細胞、細胞粒子もしくは可溶性タンパク質を固定し得る他の固体支持体と接触させられ得る。次いで、この支持体を、適切な緩衝液で洗浄し、続いて、本発明の検出可能なアルブミン融合タンパク質で処理し得る。この固相支持体を、次いで、緩衝液で２回洗浄し、非結合の抗体またはポリペプチドを除去し得る。必要に応じて、この抗体は、その後標識される。次いで、固体支持体上の固定された標識の量は、従来の方法によって検出され得る。
「固相支持体またはキャリア」とは、ポリペプチド（例えば、アルブミン融合タンパク質または本発明のアルブミン融合タンパク質に結合する、アルブミン融合タンパク質によって結合される、またはアルブミン融合タンパク質と関連するポリペプチド）を結合し得る任意の支持体を意図する。周知の支持体またはキャリアとしては、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然のおよび改変したセルロース、ポリアクリルアミド、斑糲岩、および磁鉄鉱が挙げられる。キャリアの性質は、本発明の目的のためにある程度可溶性であるかまたは不溶性のいずれかであり得る。支持体材料は、結合した分子が、ポリペプチドに結合し得る限り、実質的に任意の可能な構造配置を有し得る。従って、支持体の構造は、ビーズの場合は球状、あるいは試験管の内表面またはロッドの外表面の場合は円筒形であり得る。あるいは、表面は、平面（例えば、シート、試験ストリップなど）であり得る。好ましい支持体は、ポリスチレンビーズを含む。当業者には、抗体または抗原を結合し得る多くの他の適切なキャリアが公知であるか、または慣用的な実験の使用によって同一か確認することができる。
アルブミン融合タンパク質の所定のロットの結合活性は、周知の方法に従って決定され得る。当業者は、慣用的な実験を使用することによって各々の決定のための有効でかつ最適のアッセイ条件を決定し得る。
個体から得られた生物学的サンプルにおいてポリペプチドレベルをアッセイすることに加えて、ポリペプチドはまた、画像化によってインビボでも検出され得る。例えば、本発明の１つの実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質は、疾患の細胞または新生物細胞を画像化するために使用される。
本発明のアルブミン融合タンパク質をインビボで画像化するための抗体標識またはマーカーは、Ｘ線撮影、ＮＭＲ、ＭＲＩ、ＣＡＴスキャンもしくはＥＳＲにより検出可能なものが挙げられる。Ｘ線撮影のために、適切な標識としては、検出可能な放射線を放射するが被験体に対して明らかに有害でない、放射線同位元素（例えば、バリウムまたはセシウム）が挙げられる。ＮＭＲおよびＥＳＲのための適切なマーカーとしては、検出可能な特徴的なスピンを有するマーカー（例えば、重水素）が挙げられ、これらは、関連のハイブリドーマのための栄養素の標識化によりアルブミン融合タンパク質に取り込まれ得る。
さらに、存在が検出され得る本発明のアルブミン融合タンパク質が、投与され得る。例えば、放射性不透過性（ｒａｄｉｏ−ｏｐａｑｕｅ）化合物または他の適切な化合物で標識された本発明のアルブミン融合タンパク質は、投与され、標識抗体に関して上記に記載されるようにインビボで画像化され得る。さらにこのようなポリペプチドは、インビトロ診断手順のために使用され得る。
適切な検出可能な画像化部分（例えば、放射性同位元素（例えば、１３１Ｉ、１１２Ｉｎ、９９ｍＴｃ）、放射線不透過性物質、または核磁気共鳴により検出可能な材料）で標識されたポリペプチド特異的抗体または抗体フラグメントが、障害について試験される哺乳動物に（例えば、非経口で、皮下で、もしくは腹腔内で）導入される。被験体および使用される画像化システムの大きさが、診断画像を生じるのに必要とされる画像化部分の量を決定することは、当該分野で理解される。放射線同位元素部分の場合、ヒト被験体については、注入される放射能の量は、通常、約５〜２０ミリキュリーの９９ｍＴｃの範囲である。標識されたアルブミン融合タンパク質は、次いで、本発明のアルブミン融合タンパク質または本発明のアルブミン融合タンパク質に結合する、アルブミン融合タンパク質によって結合される、またはアルブミン融合タンパク質と関連する、ポリペプチドまたは他の基質を含む体内の位置に優先的に蓄積する。インビボ腫瘍イメージングは、Ｓ．Ｗ．Ｂｕｒｃｈｉｅｌら、「Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｆｒａｇｍｅｎｔ」により記載される（Ｔｕｍｏｒ Ｉｍａｇｉｎｇ：Ｔｈｅ Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ、Ｓ．Ｗ．ＢｕｒｃｈｉｅｌおよびＢ．Ａ．Ｒｈｏｄｅｓ編、Ｍａｓｓｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ．（１９８２）の１３章）。
本発明のアルブミン融合タンパク質が検出可能に標識され得る１つの方法は、レポーター酵素へ同様に連結し、そしてこの連結された産物を酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）に用いることによる（Ｖｏｌｌｅｒ，Ａ．「Ｔｈｅ Ｅｎｚｙｍｅ Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）」１９７８、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｈｏｒｉｚｏｎｓ ２：１−７、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）；Ｖｏｌｌｅｒら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．３１：５０７−５２０（１９７８）；Ｂｕｔｌｅｒ，Ｊ．Ｅ．、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３：４８２−５２３（１９８１）；Ｍａｇｇｉｏ，Ｅ．（編）１９８０、Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、ＰＴＰａｓｅＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、ＦＬ；Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｅ．ら（編）１９８１、Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、Ｋｇａｋｕ Ｓｈｏｉｎ、Ｔｏｋｙｏ）。抗体に結合するレポーター酵素は、適切な基質（好ましくは色素基質）と、例えば、分光光度法、蛍光法または可視手段によって検出され得る化学部分を生成するような様式で反応する。抗体を検出可能に標識するために使用されるレポーター酵素としては、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、δ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α−グリセロホスフェート、デヒドロゲナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、この検出は、このレポーター酵素に対する色素基質を用いる比色方法によって達成され得る。検出はまた、同様に調製された標準物質と比較して、基質の酵素反応の程度を視覚的に比較することによって達成され得る。
アルブミン融合タンパク質はまた、放射標識され得、そして種々の他の免疫アッセイのいずれかにおいて使用され得る。例えば、アルブミン融合タンパク質を放射性標識することによって、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）においてアルブミン融合タンパク質を使用することが可能である（例えば、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｂ．，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，Ｓｅｖｅｎｔｈ Ｔｒａｉｎｉｎｇ Ｃｏｕｒｓｅ ｏｎ Ｒａｄｉｏｌｉｇａｎｄ Ａｓｓａｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｔｈｅ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｍａｒｃｈ，１９８６を参照のこと（これは、本明細書中に参考として援用される））。放射性同位元素は、γカウンター、シンチレーションカウンター、またはオードラジオグラフィーを含む手段によって検出され得るが、これらに限定されない。
さらに、当該分野で公知のキレート剤分子は、アルブミン融合タンパク質を標識するために使用され得る。キレート剤は、本発明のアルブミン融合タンパク質と結合し、前記タンパク質を、放射性核種または蛍光標識を含む金属イオンで標識することを容易にし得る。
例えば、Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ，Ｒ．およびＭｅａｒｅｓ，Ｃ．Ｆ．，「Ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ Ａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｒａｄｉｏｍｅｔａｌ−ｌａｂｅｌｅｄ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」，（Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍａｇｉｎｇ ｗｉｔｈ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｄ．Ｍ．Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ編）Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｂｏｓｔｏｎ）；Ｓａｊｉ，Ｈ．，「Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ ｉｍａｇｉｎｇ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｇｅｎｔｓ：ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ．」Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ．１６：２０９−２４４（１９９９）；Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ Ｓ．Ｃ．およびＭｅａｓｅ Ｒ．Ｃ．，「Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ ｌｉｇａｎｄｓ，ｎｕｃｌｉｄｅｓ ａｎｄ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．」Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄ．Ａｐｐｌ．Ｉｎｓｔｒｕｍ．Ｂ １８：５８９−６０３（１９９１）；およびＬｉｕ，Ｓ．およびＥｄｗａｒｄｓ，Ｄ．Ｓ．，「Ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｈｅｌａｔｏｒｓ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｌａｎｔｈａｎｉｄｅ ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ．」Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１２：７−３４（２００１）を参照のこと。前記アルブミン融合タンパク質に共有結合し得る任意のキレート剤は、本発明に従って使用され得る。キレート剤は、アルブミン融合タンパク質に対するキレート部分と結合するリンカー部分をさらに含み得る。
１つの実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質は、非環式（キレート剤（例えば、ジエチレントリアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’−ペンタ酢酸（ＤＰＴＡ）、ＤＰＴＡのアナログ、およびＤＰＴＡの誘導体と結合する。非限定的な例として、
キレート剤は、２−（ｐ−イソチオシアネートベンジル）−６−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（１Ｂ４Ｍ−ＤＰＴＡ、ＭＸ−ＤＴＰＡとしても公知）、２−メチル−６−（ρ−ニトロベンジル）−１，４，７−トリアザヘプタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’−ペンタ酢酸（ニトロ−１Ｂ４Ｍ−ＤＰＴＡまたはニトロ−ＭＸ−ＤＴＰＡ）；２−
（ｐ−イソチオシアネートベンジル）−シクロヘキシルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＣＨＸ−ＤＴＰＡ）、またはＮ−［２−アミノ−３−（ρ−ニトロフェニル）プロピル］−トランス−シクロヘキサン−１，２−ジアミン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−ペンタ酢酸（ニトロ−ＣＨＸ−Ａ−ＤＴＰＡ）であり得る。
別の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質は、非環式テルピリジンキレート剤（例えば、６，６’’−ビス［［Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’−テトラ（カルボキシメチル）アミノ］メチル］−４’−（３−アミノ−４−メトキシフェニル）２，２’：
６’，２’’−テルピルジン（ＴＭＴ−アミン））と結合する。
特別な実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質に結合する大環状キレート剤は、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−テトラ酢酸（ＤＯＴＡ）である。別の特定の実施形態において、ＤＯＴＡは、リンカー分
子により、本発明のアルブミン融合タンパク質と結合するポリペプチドへのＤＯＴＡ結合に有用なリンカー分子の例は、当該分野で一般的に公知である−例えば、ＤｅＮａｒｄｏら，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４（１０）：２４８３−９０，１９９８；Ｐｅｔｅｒｓｏｎら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１０（４）：５５３−７，１９９９；およびＺｉｍｍｅｒｍａｎら，Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２６（８）：９４３−５０（これらの全体は、参考として本明細書によって援用される）を参照のこと。さらに、抗体に結合し得るキレート剤およびそれらを製造しかつ使用するための方法を開示する米国特許第５，６５２，３６１号および同第５，７５６，０６５号は、それらの全体を参考として本明細書によって援用される。抗体へのキレート剤の結合に焦点を合わせた米国特許第５，６５２，３６１号および同第５，７５６，０６５号を通じて、当業者は、それらに開示される方法を容易に適合させ、他のポリペプチドにキレート剤を結合させ得る。
結合が、活性化アーム、または官能基を介して、リガンドの炭素骨格に結合される大環状リガンドに基づく二官能性キレート剤は、以下により記載されるように利用され得る；Ｍ．Ｍｏｉら，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．４９：２６３９（１９８９）（２−ｐ−ニトロベンジル−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−テトラ酢酸）；Ｓ．Ｖ．Ｄｅｓｈｐａｎｄｅら，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．３１
：４７３（１９９０）；Ｇ．Ｒｕｓｅｒら， Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．１：３４５（１９９０）；Ｃ．Ｊ．Ｂｒｏａｎら，Ｊ．Ｃ． Ｓ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．２３：１７３９（１９９０）；およびＣ．Ｊ．Ａｎｄｅｒｓｏｎら，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．３６：８５０（１９９５）。
１つの実施形態において、大環状キレート剤（例えば、ポリアザ大環状キレート剤）（必要に応じて１つ以上のカルボキシル基、アミノ基、ヒドロキサメート基、ホスファネート基、またはリン酸基を含む）は、本発明のアルブミン融合タンパク質と結合する。別の実施形態において、キレート剤は、ＤＯＴＡ、ＤＯＴＡのアナログ、およびＤＯＴＡの誘導体からなる群より選択されるキレート剤である。
１つの実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質に結合し得る適切なキレート剤分子としては、ＤＯＸＡ（１−オキサ−４，７，１０−トリアザシクロドデカントリ酢酸）、ＮＯＴＡ（１，４，７−トリアザノナントリ酢酸）、ＴＥＴＡ（１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカンテトラ酢酸）、およびＴＨＴ（４’−（３−アミノ−４−メトキシ−フェニル）−６，６’’−ビス（Ｎ’，Ｎ’−ジカルボキシメチル−Ｎ−メチルヒドラジノ）−２，２’：６’，２’’−テルピリジン）、およびそれらのアナログおよび誘導体が挙げられる。例えば、Ｏｈｍｏｎｏら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３５：１５７−１６２（１９９２）；Ｋｕｎｇら，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２５：３２６−３３２（１９８４）；Ｊｕｒｉｓｓｏｎら，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９３：１１３７−１１５６（１９９３）；および米国特許第５，３６７，０８０号を参照のこと。別の適切なキレート剤としては、米国特許第４，６４７，４４７号；同第４，６８７，６５９号；同第４，８８５，３６３号；ＥＰ−Ａ−７１５６４；ＷＯ８９／００５５７；およびＥＰ−Ａ−２３２７５１に開示されるキレート剤が挙げられる。
別の実施形態において、本発明において使用され得る適切な大環状カルボン酸キレート剤としては、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−テトラ酢酸（ＤＯＴＡ）；１，４，８，１２−テトラアザシクロペンタデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−テトラ酢酸（１５Ｎ４）；１，４，７−テトラアザシクロノナン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−トリ酢酸（９Ｎ３）；１，５，９−トリアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−トリ酢酸（１２Ｎ３）；および６−ブロモアセトアミド−ベンジル−１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−テトラ酢酸（ＢＡＴ）が挙げられる。
本発明のアルブミン融合タンパク質に結合し得る好ましいキレート剤は、α−（５−イソチオシアナート−２−メトキシフェニル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラ酢酸（ＭｅＯ−ＤＯＴＡ−ＮＣＳとしても公知）である。α−（５−イソチオシアナート−２−メトキシフェニル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラ酢酸の塩またはエステルもまた使用され得る。
記載されるようなキレート剤に共有結合する本発明のアルブミン融合タンパク質は、（キレート剤の配位部位を介して）、治療目的、診断目的、または治療および診断目的に適切な放射性核種を用いて標識され得る。適切な金属の例としては、Ａｇ、Ａｔ、Ａｕ、Ｂｉ、Ｃｕ、Ｇａ、Ｈｏ、Ｉｎ、Ｌｕ、Ｐｂ、Ｐｄ、Ｐｍ、Ｐｒ、Ｒｂ、Ｒｅ、Ｒｈ、Ｓｃ、Ｓｒ、Ｔｃ、Ｔｌ、Ｙ、およびＹｂが挙げられる。診断目的のために使用される放射性核種の例は、Ｆｅ、Ｇｄ、１１１Ｉｎ、６７Ｇａ、または６８Ｇａである。別の実施形態において、診断目的で使用される放射性核種は、１１１Ｉｎまたは６７Ｇａである。治療目的で使用される放射性核種の例は、１６６Ｈｏ、１６５Ｄｙ、９０Ｙ、１１５ｍＩｎ、５２Ｆｅ、または７２Ｇａである。１つの実施形態において、治療目的で使用される放射性核種は、１６６Ｈｏまたは９０Ｙである。治療目的および診断目的の両方に使用される放射性核種の例としては、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１７５Ｙｂ、または４７Ｓｃが挙げられる。１つの実施形態において、放射性核種は、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１７５Ｙｂ、または１５９Ｇｄである。
好ましい金属放射性核種としては、９０Ｙ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、４７Ｓｃ、６７Ｇａ、５１Ｃｒ、１７７ｍＳｎ、６７Ｃｕ、１６７Ｔｍ、９７Ｒｕ、１８８Ｒｅ、１７７Ｌｕ、１９９Ａｕ、４７Ｓｃ、６７Ｇａ、５１Ｃｒ、１７７ｍＳｎ、６７Ｃｕ、１６７Ｔｍ、９５Ｒｕ、１８８Ｒｅ、１７７Ｌｕ、１９９Ａｕ、２０３Ｐｂおよび１４１Ｃｅが挙げられる。
特定の実施形態において、キレート剤が共有結合する本発明のアルブミン融合タンパク質は、９０Ｙ、１１１Ｉｎ、１７７Ｌｕ、１６６Ｈｏ、２１５Ｂｉ、および２２５Ａｃからなる群より選択される金属イオンを用いて標識され得る。
さらに、γ放射放射性核種（例えば、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、６７Ｇａ、および１６９Ｙｂ）は、診断画像化のための研究下で改良されるが、β放射体（例えば、６７Ｃｕ、１１１Ａｇ、１８６Ｒｅ、および９０Ｙ）は腫瘍治療における適用のために使用される。
他の有用な放射性核種としては、γ放射体例えば、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、６７Ｇａ、１６９Ｙｂ）およびβ放射体（例えば、６７Ｃｕ、１１１Ａｇ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅおよび９０Ｙ）ならびに目的の他の放射性核種（例えば、２１１Ａｔ、２１２Ｂｉ、１７７Ｌｕ、８６Ｒｂ、１０５Ｒｈ、１５３Ｓｍ、１９８Ａｕ、１４９Ｐｍ、８５Ｓｒ、１４２Ｐｒ、２１４Ｐｂ、１０９Ｐｄ、１６６Ｈｏ、２０８Ｔｌ、および４４Ｓｃ）が挙げられる。キレート剤に共有結合する本発明のアルブミン融合タンパク質は、上記の放射性核種を用いて標識され得る。
別の実施形態において、キレート剤に共有結合する本発明のアルブミン融合タンパク質は、遷移金属およびランタニド金属のイオンを含む常磁性金属イオン（例えば、原子番号２１〜２９、４２、４３、４４、または５７〜７１を有する金属、特にＣｒ、Ｖ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｌａ、Ｃｅ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｐｍ、Ｓｍ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｔｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｔｍ、Ｙｂ、およびＬｕのイオン）を用いて標識され得る。磁気応答画像化のための組成物において使用される常磁性金属としては、原子番号２１〜２９、４２、４４および５８〜７０を有する要素が挙げられる。
別の実施形態において、キレート剤に共有結合する本発明のアルブミン融合タンパク質は、蛍光金属イオン（ランタニド、特にＬａ、Ｃｅ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｐｍ、Ｓｍ、Ｅｕ（例えば、１５２Ｅｕ）、Ｇｄ、Ｔｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｔｍ、Ｙｂ、およびＬｕを含む）を用いて標識され得る。
別の実施形態において、キレート剤に共有結合する本発明のアルブミン融合タンパク質は、レポーター（Ｍｏ、Ｂｉ、Ｓｉ、およびＷの原子を含み得る）含有重金属を用いて標識され得る。
アルブミン融合タンパク質を蛍光化合物で標識することもまた可能である。蛍光標識されたアルブミン融合タンパク質が適切な波長の光に曝露される場合、次いでその存在は、蛍光に起因して検出され得る。最も一般的に使用される蛍光標識化合物の間では、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド（ｏｐｈｔｈａｌｄｅｈｙｄｅ）およびフルオレサミンがある。
アルブミン融合タンパク質はまた、１５２Ｅｕまたは他のランタニド系列のような蛍光発光金属を用いて検出可能に標識され得る。これらの金属は、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）またはエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＴＤＡ）のような金属キレート群を用いてアルブミン融合タンパク質に結合され得る。
アルブミン融合タンパク質はまた、化学発光化合物に結合することによって検出可能に標識され得る。次いで、化学発光タグ化アルブミン融合タンパク質の存在は、化学反応の経過の間に生じる発光の存在を検出することによって決定される。特に有用な化学発光標識化合物の例は、ルミノール、イソルミノール、セロマティックアクリジニウムエステル（ｔｈｅｒｏｍａｔｉｃ ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ ｅｓｔｅｒ）、イミダゾール、アクリジニウム塩およびオキサレートエステルである。
同様に、生物発光化合物を使用して、本発明のアルブミン融合タンパク質を標識し得る。生物発光は、触媒タンパク質が化学発光反応の効率を増加する生物系において見出される化学発光の型である。生物発光タンパク質の存在は、発光の存在を検出することによって決定される。標識目的のための重要な生物発光化合物は、ルシフェリン、ルシフェラーゼおよびエクオリンである。
（トランスジェニック生物体）
本発明のアルブミン融合タンパク質を発現するトランスジェニック生物体もまた、本発明に含まれる。トランスジェニック生物体は、一般的に組換え体、外因性または転移されたクローン化遺伝材料に改変された生物体である。このような遺伝材料は、しばしば形質転換体として言われる。形質転換体の核酸配列は、コードタンパク質の最適な発現および分泌に必要とされ得る、１つ以上の転写制御配列および他の核酸配列（例えば、イントロン）を含み得る。形質転換体は、生物体または生物体により生産される産物（例えば、生物体の乳（ｍｉｌｋ）、血液、尿、卵、髪または種子）からの再生を容易にする様式で、コードタンパク質の発現を支配するように設計され得る。形質転換体（は、標的動物の種と同種のゲノムまたは異種のゲノムに由来する核酸配列からなり得る。形質転換体は、特定の核酸配列が他の方法で普通見出されないゲノムの位置でか、または形質転換体の正常位置のいずれかで組み込まれ得る。
用語「生殖細胞株トランスジェニック生物体」とは、遺伝的変化または遺伝的情報が生殖細胞株に導入されたトランスジェニック生物体を言い、それにより、子孫に遺伝情報を伝えるためのトランスジェニック生物体の能力を与える。このような子孫が、実際にそのような変化または遺伝情報のいくつかまたは全てを有する場合、それらもまたトランスジェニック生物体である。変化または遺伝情報は、レシピエントが属する生物体の種と異なり得、特定のレシピエント個体とのみ異なり得、またはレシピエントによりすでに保有される遺伝的情報であり得る。最後の場合、その変化または誘導された遺伝子は、天然の遺伝子とは異なって発現され得る。
トランスジェニック生物体は、トランスジェニック動物またはトランスジェニック植物であり得る。トランスジェニック動物は、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、胚性幹細胞における遺伝子ターゲティングならびに組換えウイルス感染および組換えレトロウイルス感染を含む種々の異なる方法で作製され得る（米国特許第４，７３６，８６６号；同第５，６０２，３０７号；Ｍｕｌｌｉｎｓら（１９９３）Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ ２２（４）：６３０−６３３；Ｂｒｅｎｉｎら（１９９７）Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．６（２）９９−１１０；Ｔｕａｎ（編），Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｎｏ．６２，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（１９９７）を参照のこと）。核酸フラグメントを組換えコンピテント哺乳類動物細胞に導入する方法は、複数の核酸分子の共形質転換に有利な任意の方法であり得る。トランスジェニック動物を作製する詳細な手順は、当業者に容易に入手可能であり、米国特許第５，４８９，７４３号および同第５，６０２，３０７号における開示を含む。
多くの組換えマウスまたはトランスジェニックマウスが作製され、これらは、活性化したオンコジーン配列を発現するマウス（米国特許第４，７３６，８６６号）；サルＳＶ４０ Ｔ抗原配列発現マウス（米国特許第５，７２８，９１５号）；インターフェロン制御因子１（ＩＲＦ−１）の発現欠損マウス（米国特許第５，７３１，４９０号）；ドーパミン作用性機能不全を示すマウス（米国特許第５，７２３，７１９号）；血圧調節に関係する少なくとも１つのヒト遺伝子を発現するマウス（米国特許第５，７３１，４８９号）；自然に生じるアルツハイマー病において示される状態により大きな類似点を示すマウス（米国特許第５，７２０，９３６号）；細胞接着を媒介する能力が減少したマウス（米国特許第５，６０２，３０７号）；ウシ成長ホルモン遺伝子を保有するマウス（Ｃｌｕｔｔｅｒら（１９９６）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １４３（４）：１７５３−１７６０）；または十分なヒト抗体応答を生成する能力のあるマウス（ＭｃＣａｒｔｈｙ（１９９７）Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ ３４９（９０４９）：４０５）を含む。
マウスおよびラットは、多くのトランスジェニック研究のために選択された動物であるが、いくつかの例において、代替の動物種を使用することが好ましいか、または必要でさえある。トランスジェニックの手順は、種々の非マウス動物（ヒツジ、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコ、サル、チンパンジー、ハムスター、ウサギ、ウシおよびモルモットを含む）において首尾よく利用される（例えば、Ｋｉｍら（１９９７）Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．４６（４）：５１５−５２６；Ｈｏｕｄｅｂｉｎｅ（１９９５）Ｒｅｐｒｏｄ．Ｎｕｔｒ．Ｄｅｖ．３５（６）：６０９−６１７；Ｐｅｔｔｅｒｓ（１９９４）Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．Ｄｅｖ．６（５）：６４３−６４５；Ｓｃｈｎｉｅｋｅら（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７８（５３４６）：２１３０−２１３３；ａｎｄ Ａｍｏａｈ（１９９７）Ｊ．Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ７５（２）：５７８−５８５）を参照のこと）。
トランスジェニック哺乳動物の乳中に、本発明の形質転換体コードタンパク質の分泌を方向付けるため、形質転換体は、哺乳動物の上皮細胞において優先的に活性化されるプロモーターの制御下に置かれ得る。乳タンパク質をコードする遺伝子を調節するプロモーターは、矢酔えば、カゼイン、β―ラクトグロブリン、ホエー酸タンパク質、またはラクトアルブミンのプロモーターが好ましい（例えば、ＤｉＴｕｌｌｉｏ（１９９２）ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：７４−７７；Ｃｌａｒｋら（１９８９）ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：４８７−４９２；Ｇｏｒｔｏｎら（１９８７）ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５：１１８３−１１８７；およびＳｏｕｌｉｅｒら（１９９２）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｓ． ２９７：１３を参照のこと）。選択されたトランスジェニック哺乳動物は、大量の乳を生成し、長い授乳期を有する（例えば、ヤギ、ウシ、ラクダまたはヒツジ）。
本発明のアルブミン融合タンパク質はまた、トランスジェニック植物（例えば、ＤＮＡ形質転換体が、核ゲノムまたは色素体ゲノムに挿入された植物）において発現され得る。
外因性核酸を植物細胞またはプロトプラストに誘導するために使用される植物形質転換手順は、当該分野で公知である。一般的に、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１５３（「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ Ｐａｒｔ Ｄ」）１９８７，ＷｕおよびＧｒｏｓｓｍａｎ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓおよび欧州特許出願ＥＰ ６９３５５４を参照のこと。遺伝子操作された植物を生成するための方法はさらに、米国特許第５，２８３，１８４号、同第５， ４８２，８５２号、および欧州特許出願ＥＰ ６９３ ５５４（これらの全ては、参考として本明細書により援用される）において記載される。
（薬学的組成物または治療的組成物）
本発明のアルブミン融合タンパク質またはそれらの処方物は、任意の従来の方法（非経口（例えば、皮下または筋肉内）注入または静脈内注入を含む）により投与され得る。処置は、期間にわたって、単一の用量または複数の用量からなり得る。
本発明のアルブミン融合タンパク質は、単独で投与されることが可能であるが、１つ以上の受容可能なキャリアと共に薬学的処方物として存在することが好ましい。このキャリアは、アルブミン融合タンパク質と矛盾しないという意味で「受容可能」であるべきであり、それらのレシピエントに有害であるべきではない。代表的に、キャリアは、滅菌および無発熱物質である水または生理食塩水である。溶液中のそれらの拡張保存寿命に起因して、本発明のアルブミン融合タンパク質は、水性キャリア（例えば、滅菌無発熱物質水、生理食塩水または溶液中のそれらの拡張された保存寿命に起因する別の等張溶液）中の処方物に特によく適する。例えば、本発明の薬学的組成物は、あらかじめ水性形態で、例えば、分散される前、数週間または数ヶ月あるいはそれより長い時間に、十分に処方され得る。
例えば、アルブミン融合タンパク質を含有する処方物は、水性処方物におけるアルブミン融合タンパク質の拡張された保存寿命に考慮して調製され得る。上記のように、ＨＡに融合後、これら治療的タンパク質の多くの保存寿命が、著しく増加されるか、または延期される。
エアロゾル投与が適切な例において、本発明のアルブミン融合タンパク質は、標準手順を使用するエアロゾルとして処方され得る。用語「エアロゾル」は、細気管支または鼻経路に吸入可能な、本発明のアルブミン融合タンパク質の任意のガス保有懸濁相を含む。特に、エアロゾルは、定量吸入用量吸入器または噴霧器、あるいはミスト噴霧器において生成されるような、本発明のアルブミン融合タンパク質の水滴のガス保有懸濁液を含む。エアロゾルはまた、例えば、吸入デバイスから吸入によって送達され得る空気または他のキャリアガスに懸濁された本発明の化合物の乾燥粉末組成物を含む。ＧａｎｄｅｒｔｏｎおよびＪｏｎｅｓ，Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｔｏ ｔｈｅ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｔｒａｃｔ，Ｅｌｌｉｓ Ｈｏｒｗｏｏｄ（１９−８７）；Ｇｏｎｄａ（１９９０）Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ ６：２７３−３１３；およびＲａｅｂｕｒｎら，（１９９２）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２７：１４３−１５９を参照のこと。
本発明の処方物はまた、一部分、適切な種に由来するアルブミン融合タンパク質の成分の使用のため、代表的に非免疫原性であり得る。例えば、ヒトの使用に対し、治療的タンパク質およびアルブミン融合タンパク質のアルブミン部分の両方は、代表的にヒトである。いずれかの成分が非ヒト由来であるいくつかの場合において、その成分は主要アミノ酸の置換によりヒト化され得、その結果特異的なエピトープが、ヒト免疫系に対し、外因性というよりは、むしろ天然のヒトのようになる。
処方物は、単位投与形態で都合よく存在し得、そして薬学の当該分野で周知の任意の方法により調製され得る。このような方法は、１つ以上の付属成分を構成するキャリアとアルブミン融合タンパク質を結合させる工程を包含する。一般的に、活性成分を液体キャリアまたは微細な誘導固体キャリア、またはそれら両方と均一にかつ親密に結合させることによって、処方物が調製され、次いで、必要な場合、産物を形成する。
非経口投与に適切な処方物としては、抗酸化物、緩衝液、静菌剤および意図されるレシピエントのために処方物を適切にする溶液を含み得る水性滅菌注入溶液または非水性滅菌注入溶液；および懸濁剤および濃化剤を含み得る水性滅菌注入溶液または非水性滅菌注入溶液が挙げられる。処方物は、単位用量容器または複数用量容器（例えば、密封されたアンプル、バイアルまたはシリンジ）中に存在し得、そして、使用の直前に滅菌キャリア（例えば、注入用の水）の添加のみを必要とする凍結乾燥（親液性）状態で保存され得る。
即席注入溶液および懸濁液は、滅菌散剤から調製され得る。投与処方物は、本発明の多くのアルブミン融合タンパク質により示される拡張された血清半減期を供給する治療的タンパク質のための非融合標準処方物と比較して低いモル濃度またはより低い投与量で治療用タンパク質の一部を含み得る。
例として、本発明のアルブミン融合タンパク質が、１つ以上の治療的タンパク質領域として表１の「治療タンパク質：Ｘ」欄に列挙されたタンパク質の１つを含む場合、天然ｈＧＨの半減期と比較して、延長された血清半減期およびアルブミン融合タンパク質の半減期を考慮する間、投与形態は、ｈＧＨの有効性に比例するアルブミン融合タンパク質の有効性に基づいて計算され得る。成長ホルモンは、代表的に０．３〜３０．０ ＩＵ／ｋｇ／週（例えば、０．９〜１２．０ ＩＵ／ｋｇ／週）で投与され、１年またはそれ以上の間に、３つまたは７つに分けた投与量で与えられる。完全長ＧＨに融合する完全長ＨＡからなるアルブミン融合タンパク質において、等しい用量は、単位という点で、因子のより大きな重量を示すが、投与回数は、減少され得る（例えば、１週間に２回、１週間に１回またはそれ以下）。
本発明の処方物または組成物は、指示書またはアルブミン融合タンパク質成分の延長された半減期を言及する包装挿入物と共に包装され得るか、または共にキットに含まれ得る。例えば、このような指示書または包装挿入物は、本発明のアルブミン融合タンパク質の延期されたか、または延長された半減期に考慮した、推薦の保存状態（例えば、時間、温度、および光）に注意を向け得る。このような指示書または包装挿入物はまた、本発明のアルブミン融合タンパク質の特定の利点（例えば、野外において（調節された病院、診療所またはオフィス状態の外で）使用が求められ得る処方物のための保存の容易さ）に注意を向け得る。上記のように、本発明の処方物は、水性形態であり得、そして治療的活性の有意な欠損のないが決して理想的ではない環境下で保存され得る。
本発明のアルブミン融合タンパク質はまた、栄養補助として含まれ得る。例えば、本発明の特定のアルブミン融合タンパク質は、天然産物（アルブミン融合タンパク質を発現するトランスジェニック哺乳動物から得られる、乳、または乳製品）中に投与され得る。このような組成物はまた、アルブミン融合タンパク質を発現するトランスジェニック植物から得られる、植物体または植物産物を含み得る。アルブミン融合タンパク質はまた、他の公知の添加剤、キャリア、増量剤および希釈剤を有するか、または有さずに、粉末形態または錠剤形態で提供され得る。栄養補助は、Ｓｃｏｔｔ Ｈｅｇｅｎｈａｒｔ，Ｆｏｏｄ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｄｅｓｉｇｎ，Ｄｅｃ．１９９３に記載される。
本発明はまた、薬学的に受容可能なキャリアにおいて、有効量の本発明のアルブミン融合タンパク質または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド（アルブミン融合ポリヌクレオチド）を被験体に投与することによって、疾患または障害（例えば、本明細書中に開示される任意の１以上の疾患または障害）を処置および／または予防する方法を提供する。
アルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドを、個々の患者の臨床状態（特に、アルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドを単独で用いた処置の副作用）、送達部位、投与方法、投与計画および当業者に公知の他の因子を考慮に入れ、医療実施基準（ｇｏｏｄ ｍｅｄｉｃａｌ ｐｒａｃｔｉｃｅ）を遵守する方式で処方および投薬する。従って、本明細書において目的とする「有効量」は、このような考慮を行って決定される。
一般的提案として、用量当り、非経口的に投与されるアルブミン融合タンパク質の合計薬学的有効量は、患者体重の、約１μｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲にあるが、上記のようにこれは治療的裁量に委ねられる。さらに好ましくは、このホルモンについて、この用量は、少なくとも０．０１ｍｇ／ｋｇ／日、最も好ましくはヒトに対して約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日と約１ｍｇ／ｋｇ／日との間である。連続投与する場合、代表的には、アルブミン融合タンパク質を約１μｇ／ｋｇ／時間〜約５０μｇ／ｋｇ／時間の投薬速度で１日に１〜４回の注射かまたは連続皮下注入（例えばミニポンプを用いる）のいずれかにより投与する。静脈内用バッグ溶液もまた使用し得る。変化を観察するために必要な処置期間および応答が生じる処置後の間隔は、所望の効果に応じて変化するようである。
アルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドを、経口的、直腸内、非経口的、槽内（ｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｍａｌｌｙ）、膣内、腹腔内、局所的（粉剤、軟膏、ゲル、点滴剤、または経皮パッチによるなど）、口内あるいは経口または鼻腔スプレーとして投与し得る。「薬学的に受容可能なキャリア」とは、非毒性の固体、半固体または液体の充填剤、希釈剤、被包材または任意の型の製剤補助剤をいう。本明細書で用いる用語「非経口的」とは、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、皮下および関節内の注射および注入を含む投与の様式をいう。
本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドはまた、徐放性システムにより適切に投与される。徐放性アルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドの適切な例は、経口的、直腸内、非経口的、槽内、膣内、腹腔内、局所的（散剤、軟膏、ゲル、点滴剤、または経皮パッチによる）、口内あるいは経口または鼻腔スプレーとして投与される。「薬学的に受容可能なキャリア」とは、非毒性の固体、半固体または液体の充填剤、希釈剤、被包材または任意の型の製剤補助剤をいう。本明細書で用いる場合、用語「非経口的」とは、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、皮下および関節内の注射および注入を含む投与の様式をいう。
徐放性アルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドのさらなる例としては、適切なポリマー材料（例えば、成形品の形態の半透過性ポリマーマトリックス（例えば、フィルムまたはマイクロカプセル））、適切な疎水性材料（例えば、受容可能な油中の乳濁液として）またはイオン交換樹脂、および低可溶性誘導体（例えば、低可溶性塩）が挙げられる。
徐放性マトリックスとしては、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号、ＥＰ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸およびγ−エチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２２：５４７−５５６（１９８３））、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７（１９８１）、およびＬａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５（１９８２））、エチレンビニルアセテート（Ｌａｎｇｅｒら、同書）またはポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３，９８８）が挙げられる。
徐放性アルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドはまた、リポソームに封入された本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドを含む（一般には、Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３（１９９０）；Ｔｒｅａｔら，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ，Ｌｏｐｅｚ−ＢｅｒｅｓｔｅｉｎおよびＦｉｄｌｅｒ（編），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，３１７−３２７頁および３５３−３６５頁（１９８９）を参照のこと）。アルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドを含有するリポソームは、それ自体が公知である方法により調製される：ＤＥ３，２１８，１２１；Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８２：３６８８−３６９２（１９８５）；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）７７：４０３０−４０３４（１９８０）；ＥＰ５２，３２２；ＥＰ３６，６７６；ＥＰ８８，０４６；ＥＰ１４３，９４９；ＥＰ１４２，６４１；日本国特許出願第８３−１１８００８号；米国特許第４，４８５，０４５号および同第４，５４４，５４５号；ならびにＥＰ第１０２，３２４号。通常、リポソームは、小さな（約２００〜８００Å）ユニラメラ型であり、そこでは、脂質含有量は、約３０モル％コレステロールよりも多く、選択された割合が、最適な治療剤のために調整される。
なおさらなる実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、ポンプによって送達される（Ｌａｎｇｅｒ，前出；Ｓｅｆｔｏｎ，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１（１９８７）；Ｂｕｃｈｗａｌｄら，Ｓｕｒｇｅｒｙ ８８：５０７（１９８０）；Ｓａｕｄｅｋら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４（１９８９）を参照のこと）。
他の制御放出系は、Ｌａｎｇｅｒ（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３（１９９０））による総説において議論される。
非経口投与のために、１つの実施形態において、一般に、アルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、それを所望の程度の純度で、薬学的に受容可能なキャリア、すなわち用いる投薬量および濃度でレシピエントに対して毒性がなく、かつ処方物の他の成分と適合するものと、単位投薬量の注射可能な形態（溶液、懸濁液または乳濁液）で混合することにより処方される。例えば、この処方物は、好ましくは、酸化剤、および治療剤に対して有害であることが知られている他の化合物を含まない。
一般に、アルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドを液体キャリアまたは微細分割固体キャリアあるいはその両方と均一および緊密に接触させて処方物を調製する。次に、必要であれば、生成物を所望の処方物に成形する。好ましくは、キャリアは、非経口的キャリア、より好ましくはレシピエントの血液と等張である溶液である。このようなキャリアビヒクルの例としては、水、生理食塩水、リンゲル溶液およびデキストロース溶液が挙げられる。不揮発性油およびオレイン酸エチルのような非水性ビヒクルもまた、リポソームと同様に本明細書において有用である。
キャリアは、等張性および化学安定性を高める物質のような微量の添加剤を適切に含有する。このような物質は、用いる投薬量および濃度でレシピエントに対して毒性がなく、このような物質としては、リン酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、酢酸および他の有機酸またはその塩類のような緩衝剤；アスコルビン酸のような抗酸化剤；低分子量（約１０残基より少ない）ポリペプチド（例えば、ポリアルギニンまたはトリペプチド）；血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンのようなタンパク質；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸またはアルギニンのようなアミノ酸；セルロースまたはその誘導体、ブドウ糖、マンノースまたはデキストリンを含む、単糖類、二糖類、および他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート剤；マンニトールまたはソルビトールのような糖アルコール；ナトリウムのような対イオン；および／またはポリソルベート、ポロキサマーもしくはＰＥＧのような非イオン性界面活性剤が挙げられる。
アルブミン融合タンパク質は、代表的には約０．１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度で、約３〜８のｐＨで、このようなビヒクル中に処方される。前記の特定の賦形剤、キャリアまたは安定化剤を使用することにより、ポリペプチド塩が形成されることが理解される。
治療的投与に用いられる任意の医薬品は無菌状態であり得る。滅菌濾過膜（例えば０．２ミクロンメンブレン）で濾過することにより無菌状態は容易に達成される。一般に、アルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、滅菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下用注射針で穿刺可能なストッパー付の静脈内用溶液バッグまたはバイアルに配置される。
アルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、通常、単位用量または複数用量容器、例えば、密封アンプルまたはバイアルに、水溶液または再構成するための凍結乾燥処方物として貯蔵される。凍結乾燥処方物の例として、１０ｍｌのバイアルに、滅菌濾過した１％（ｗ／ｖ）アルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチド水溶液５ｍｌを充填し、そして得られる混合物を凍結乾燥する。凍結乾燥したアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドを、注射用静菌水を用いて再構成して注入溶液を調製する。
特定かつ好ましい実施形態において、アルブミン融合タンパク質処方物は、０．０１Ｍ リン酸ナトリウム、０．１５ｍＭ 塩化ナトリウム、融合タンパク質１ｍｇ当たり０．１６マイクロモル オクタン酸ナトリウム、１５マイクログラム／ミリリットル ポリソルベート８０、ｐＨ７．２を含む。別の特定かつ好ましい実施形態において、アルブミン融合タンパク質処方物は、０．０１Ｍ リン酸ナトリウム、０．１５ｍＭ 塩化ナトリウム、融合タンパク質１ｍｇ当たり０．１６マイクロモル オクタン酸ナトリウム、１５マイクログラム／ミリリットル ポリソルベート８０、ｐＨ７．２から成る。ｐＨおよび緩衝液は、生理学的条件に調合するように選択され、そして塩が、強壮剤として加えられる。オクタン酸ナトリウムは、溶液中のタンパク質の熱安定性を増加するためにその報告された能力に起因して選択された。最後に、ポリソルベートは、溶液の表面張力を低くし、そして容器密封系に対してアルブミン融合タンパク質の非特異的吸着を低くする遺伝子界面活性剤として加えられた。
本発明はまた、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドの１つ以上の成分を満たした一つ以上の容器を備える薬学的パックまたはキットを提供する。医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関が定めた形式の通知が、このような容器に付属し得、この通知は、ヒトへの投与に対する製造、使用または販売に関する政府機関による承認を表す。さらに、アルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドを他の治療用化合物と組み合わせて使用し得る。
本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、単独で、またはアジュバントと組み合わせて投与され得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドとともに投与され得るアジュバントとしては、以下が挙げられるが、それらに限定されない：ミョウバン、ミョウバン＋デオキシコール酸（ＩｍｍｕｎｏＡｇ）、ＭＴＰ−ＰＥ（Ｂｉｏｃｉｎｅ Ｃｏｒｐ．）、ＱＳ２１（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）、ＢＣＧ（例えば、ＴＨＥＲＡＣＹＳ（登録商標））、ＭＰＬおよびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍの生育不能調製物。特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、ミョウバンと組み合わせて投与される。別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、ＱＳ−２１と組み合わせて投与される。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドとともに投与され得るさらなるアジュバントとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：モノホスホリル脂質免疫調節剤、ＡｄｊｕＶａｘ １００ａ、ＱＳ−２１、ＱＳ−１８、ＣＲＬ１００５、アルミニウム塩、ＭＦ−５９、およびＶｉｒｏｓｏｍａｌアジュバント技術。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドとともに投与され得るワクチンとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＭＭＲ（麻疹、流行性耳下腺炎，風疹）、ポリオ（ｐｏｌｉｏ）、水痘、破傷風／ジフテリア、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｂ型インフルエンザ菌、百日咳（ｗｈｏｏｐｉｎｇ ｃｏｕｇｈ）、肺炎、インフルエンザ、ライム病、ロタウイルス、コレラ、黄熱病、日本脳炎、ポリオ（ｐｏｌｉｏｍｙｅｌｉｔｉｓ）、狂犬病、腸チフス、および百日咳（ｐｅｒｔｕｓｉｓ）に対する防御に指向するワクチン。組み合わせは、例えば、混合物として同時に、別々であるが同時にもしくは並行して；または逐次的にかのいずれかで投与され得る。これは、組み合わされた薬剤が治療混合物としてともに投与される提示を含み、そして組み合わせた薬剤が、別々であるが同時に（例えば、同じ個体へ別々の静脈ラインを通じての場合）投与される手順もまた含む。「組み合わせ」投与は、第１に、続いて第２に与えられる化合物または薬剤のうちの１つを別々に投与することをさらに含む。
本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、単独で、または他の治療的薬剤と組み合わせて投与され得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと組合せて投与され得るアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチド薬剤としては、以下が挙げられるが、それらに限定されない：化学療法剤、抗生物質、ステロイド性および非ステロイド性の抗炎症剤、従来の免疫療法剤、ならびに／または以下に記載される治療処置。組み合わせは、例えば、混合物として同時に、別々であるが同時にもしくは並行して；または逐次的にかのいずれかで投与され得る。これは、組み合わされた薬剤が、治療混合物としてともに投与される説明を含み、そして組み合わせた薬剤が、別々であるが同時に（例えば、同じ個体へ別々の静脈ラインを通じての場合）投与される手順もまた含む。「組み合わせ」投与は、第１に、続いて第２に与えられる化合物または薬剤のうちの１つを別々に投与することをさらに含む。
一つの実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、反凝固薬と組み合わせて投与される。本発明の組成物とともに投与され得る反凝固薬としては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：ヘパリン、低分子量ヘパリン、ワルファリンナトリウム（例えば、ＣＯＵＭＡＤＩＮ（登録商標））、ジクマロール、４−ヒドロキシクマリン、アニシンジオン（例えば、ＭＩＲＡＤＯＮＴＭ）、アセノクマロール（例えば、ニクマロン、ＳＩＮＴＨＲＯＭＥＴＭ）、インダン−１，３−ジオン、フェンプロクーモン（例えば、ＭＡＲＣＵＭＡＲＴＭ）、エチルビスクマセテート（ｅｔｈｙｌ ｂｉｓｃｏｕｍａｃｅｔａｔｅ）（例えば、ＴＲＯＭＥＸＡＮＴＭ）、およびアスピリン。特定の実施形態において、本発明の組成物は、ヘパリンおよび／またはワルファリンと組み合わせて投与される。別の特定の実施形態において、本発明の組成物は、ワルファリンと組み合わせて投与される。別の特定の実施形態において、本発明の組成物は、ワルファリンおよびアスピリンと組み合わせて投与される。別の特定の実施形態において、本発明の組成物は、ヘパリンと組み合わせて投与される。別の実施形態において、本発明の組成物は、ヘパリンおよびアスピリンと組み合わせて投与される。
別の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、血栓溶解薬物と組み合わせて投与される。本発明の組成物と組み合わせて投与され得る血栓溶解薬物としては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：プラスミノゲン、ｌｙｓ−プラスミノゲン、α２−抗プラスミン、ストレプトキナーゼ（例えば、ＫＡＢＩＫＩＮＡＳＥＴＭ）、アンチリスプラーゼ（ａｎｔｉｒｅｓｐｌａｃｅ）（例えば、ＥＭＩＮＡＳＥＴＭ）、組織プラスミノゲン活性化剤（ｔ−ＰＡ、アルテバーゼ（ａｌｔｅｖａｓｅ）、ＡＣＴＩＶＡＳＥＴＭ）、ウロキナーゼ（例えば、ＡＢＢＯＫＩＮＡＳＥＴＭ）、サウルプラーゼ（ｓａｕｒｕｐｌａｓｅ）（プロウロキナーゼ、単鎖ウロキナーゼ）、およびアミノカプロ酸（例えば、ＡＭＩＣＡＲＴＭ）。特定の実施形態において、本発明の組成物は、組織プラスミノゲン活性化剤およびアスピリンと組み合わせて投与される。
別の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、抗血小板薬物と組み合わせて投与される。本発明の組成物と組み合わせて投与され得る抗血小板薬物としては、アスピリン、ジピリダモール（例えば、ＰＥＲＳＡＮＴＩＮＥＴＭ）、およびチクロピジン（例えば、ＴＩＣＬＩＤＴＭ）が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと組み合わせる抗凝固薬、血栓溶解薬物および／または抗血小板薬物の使用は、血栓症、動脈血栓症、静脈血栓症、血栓塞栓症、肺塞栓症、性動脈硬化症、心筋梗塞、一過性脳虚血（乏血）発作、不安定狭心症の妨害、診断および／または処置について企図される。特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと組み合わせる抗凝固薬、血栓溶解薬物および／または抗血小板薬物の使用は、血管形成手順を伴い得る肛門周囲の血栓症の危険性を減少するため、非リウマチ性動脈原線維性を含む動脈原線維性を有する患者内の脳卒中の危険性を減少するため、人工心臓バルブおよび／または僧帽弁のバルブ疾患に関連する塞栓症の危険性を減少するため、伏在の移植片の不顕性出血について企図される。単独で、または抗血小板薬物、抗凝固薬および／または血栓溶解薬物と組み合わせての本発明の治療についての他の用途は、体外のデバイス（例えば、脈管内カニューレ、血液透析患者内の脈管アクセスシャウト、血液透析機器、および心肺バイパス機器）における不顕性出血の妨害が挙げられるが、これに限定されない。
特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、抗レトロウイルス薬剤、ヌクレオシド／ヌクレオチド逆転写酵素インヒビター（ＮＲＴＩ）、非ヌクレオシド逆転写酵素インヒビター（ＮＮＲＴＩ）、および／またはプロテアーゼインヒビター（ＰＩ）と組み合わせて投与される。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと組み合わせて投与され得るＮＲＴＩとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＲＥＴＲＯＶＩＲＴＭ（ジドブジン／ＡＺＴ）、ＶＩＤＥＸＴＭ（ジダノシン／ｄｄＩ）、ＨＩＶＩＤＴＭ（ザルシタビン／ｄｄＣ）、ＺＥＲＩＴＴＭ（スタブジン／ｄ４Ｔ）、ＥＰＩＶＩＲＴＭ（ラミブジン／３ＴＣ）、およびＣＯＭＢＩＶＩＲＴＭ（ジドブジン／ラミブジン）。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと組み合わせて投与され得るＮＮＲＴＩとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＶＩＲＡＭＵＮＥＴＭ（ネビラピン）、ＲＥＳＣＲＩＰＴＯＲＴＭ（デラビルジン）、およびＳＵＳＴＩＶＡＴＭ（エファビレンズ）。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと組み合わせて投与され得るプロテアーゼインヒビターとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＣＲＩＸＩＶＡＮＴＭ（インディナビル（ｉｎｄｉｎａｖｉｒ））、ＮＯＲＶＩＲＴＭ（リトナビル（ｒｉｔｏｎａｖｉｒ））、ＩＮＶＩＲＡＳＥＴＭ（サキナビル（ｓａｑｕｉｎａｖｉｒ））、およびＶＩＲＡＣＥＰＴＴＭ（ネルフィナビル（ｎｅｌｆｉｎａｖｉｒ））。特定の実施形態において、抗レトロウイルス薬剤、ヌクレオシド逆転写酵素インヒビター、非ヌクレオシド逆転写酵素インヒビター、および／またはプロテアーゼインヒビターは、ＡＩＤＳを処置するため、および／またはＨＩＶ感染を予防もしくは処置するために、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドとの任意の組み合わせで使用され得る。
さらなるＮＲＴＩとしては、以下を含む：ＬＯＤＥＮＯＳＩＮＥＴＭ（Ｆ−ｄｄＡ；酸安定性アデノシンＮＲＴＩ；Ｔｒｉａｎｇｌｅ／Ａｂｂｏｔｔ；ＣＯＶＩＲＡＣＩＬＴＭ（エントリシタビン（ｅｍｔｒｉｃｉｔａｂｉｎｅ）／ＦＴＣ；構造的にラミブジン（ｌａｍｉｖｕｄｉｎｅ）（３ＴＣ）に関連があるが、インビトロで３〜１０倍大きな活性を有する；Ｔｒｉａｎｇｌｅ／Ａｂｂｏｔｔ）；ｄＯＴＣ（ＢＣＨ−１０６５２もまた構造的にラミブジンに関連があるが、ラミブジン耐性単離物の実質的な割合に対して活性を維持したままである；Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａ）；Ａｄｅｆｏｖｉｒ（ＦＤＡによって抗ＨＩＶ治療に対する認可を拒絶された；Ｇｉｌｅａｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）；ＰＲＥＶＥＯＮ（登録商標）（Ａｄｅｆｏｖｉｒ Ｄｉｐｉｖｏｘｉｌ、アデホビル（ａｄｅｆｏｖｉｒ）の活性なプロドラック；その活性形態はＰＭＥＡ−ｐｐである）；ＴＥＮＯＦＯＶＩＲＴＭ（ビス−ＰＯＣ ＰＭＰＡ、ＰＭＰＡプロドラック；Ｇｉｌｅａｄ）；ＤＡＰＤ／ＤＸＧ（ＤＡＰＤの活性な代謝物；Ｔｒｉａｎｇｌｅ／Ａｂｂｏｔｔ）；Ｄ−Ｄ４ＦＣ（３ＴＣに関連し、ＡＺＴ／３ＴＣ−耐性ウイルスに対する活性を有する）；ＧＷ４２０８６７Ｘ（Ｇｌａｘｏ Ｗｅｌｌｃｏｍｅ）；ＺＩＡＧＥＮＴＭ（アバカビル（ａｂａｃａｖｉｒ）／１５９Ｕ８９；Ｇｌａｘｏ Ｗｅｌｌｃｏｍｅ Ｉｎｃ．）；ＣＳ−８７（３’アジド−２’，３’−ジデオキシウリジン；ＷＯ９９／６６９３６）；およびＳ−アシル−２−チオエチル（ＳＡＴＥ）を保有するβ−Ｌ−ＦＤ４Ｃおよびβ−Ｌ−Ｆｄ
ｄＣのプロドラック形態（ＷＯ９８／１７２８１）。
さらなるＮＮＲＴＩとしては、以下が挙げられる：ＣＯＡＣＴＩＮＯＮＴＭ（Ｅｍｉｖｉｒｉｎｅ／ＭＫＣ−４４２、ＨＥＰＴクラスの強力なＮＮＲＴＩ；Ｔｒｉａｎｇｌｅ／Ａｂｂｏｔｔ）；ＣＡＰＲＡＶＩＲＩＮＥＴＭ（ＡＧ−１５４９／Ｓ−１１５３、Ｋ１０３Ｎ改変体を含むウイルスに対する活性を有する次世代のＮＮＲＴＩ；Ａｇｏｕｒｏｎ）；ＰＮＵ−１４２７２１（前駆体（ｄｅｌａｖｉｒｄｉｎｅ）よりも２０〜５０倍大きな活性を有し、そしてＫ１０３Ｎ変異体に対して活性である；Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＆ Ｕｐｊｏｈｎ）；ＤＰＣ−９６１およびＤＰＣ−９６３（エファビレンツ（ｅｆａｖｉｒｅｎｚ）の第二世代の誘導体、Ｋ１０３Ｎ変異を有するウイルスに対して活性であるように設計される；ＤｕＰｏｎｔ）；ＧＷ−４２０８６７Ｘ（ＨＢＹ０９７よりも２５倍大きな活性を有し、そしてＫ１０３Ｎ変異体に対して活性である；Ｇｌａｘｏ Ｗｅｌｌｃｏｍｅ）；ＣＡＬＡＮＯＬＩＤＥ Ａ（ラテックスの木由来の天然に存在する薬剤；Ｙ１８１ＣおよびＫ１０３Ｎ変異のいずれかまたは両方を含むウイルスに対して活性）；ならびにＰｒｏｐｏｌｉｓ（ＷＯ９９／４９８３０）。
さらなるプロテアーゼインヒビターとしては、以下が挙げられる：ＬＯＰＩＮＡＶＩＴＭ（ＡＢＴ３７８／ｒ；Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）；ＢＭＳ−２３２６３２（アザペプチド；Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｒｅｓ Ｓｑｕｉｂｂ）；ＴＩＰＲＡＮＡＶＩＲＴＭ（ＰＮＵ−１４０６９０、非ペプシンジヒドロピロン；Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＆ Ｕｐｊｏｈｎ）；ＰＤ−１７８３９０（非ペプチド性ジヒドロピロン；Ｐａｒｋｅ−Ｄａｖｉｓ）；ＢＭＳ ２３２６３２（アザペプチド；Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）；Ｌ−７５６、４２３（インディナルビル（ｉｎｄｉｎａｖｉｒ）アナログ；Ｍｅｒｃｋ）；ＤＭＰ−４５０（環状ウレア化合物；Ａｖｉｄ ＆ ＤｕＰｏｎｔ）；ＡＧ−１７７６（プロテアーゼインヒビター耐性ウイルスに対するインビトロ活性を有するペプチド模倣物；Ａｇｏｕｒｏｎ）；ＶＸ−１７５／ＧＷ−４３３９０８（アンプレナビル（ａｍｐｒｅｎａｖｉｒ）のリン酸プロドラック；Ｖｅｒｔｅｘ ＆ Ｇｌａｘｏ Ｗｅｌｃｏｍｅ）；ＣＧＰ６１７５５（Ｃｉｂａ）；ならびにＡＧＥＮＥＲＡＳＥＴＭ（アンプレナビル；Ｇｌａｘｏ Ｗｅｌｌｃｏｍｅ Ｉｎｃ．）。
さらなる抗レトロウイルス剤としては、融合インヒビター／ｇｐ４１結合剤が挙げられる。融合インヒビター／ｇｐ４１結合剤としては、以下が挙げられる：Ｔ−２０（ＨＩＶ ｇｐ４１膜貫通タンパク質外部ドメインの残基６４３−６７８由来のペプチド（休止期においてｇｐ４１と結合し、そして紡錘細胞状態に対する形質転換を防止する；Ｔｒｉｍｅｒｉｓ）ならびにＴ−１２４９（第２世代融合インヒビター；Ｔｒｉｍｅｒｉｓ）。
さらなる抗レトロウイルス剤としては、融合インヒビター／ケモカインレセプターアンタゴニストが挙げられる。融合インヒビター／ケモカインレセプターアンタゴニストとしては、以下が挙げられる：ＣＸＣＲ４アンタゴニスト（例えば、ＡＭＤ ３１００（ビシクラム（ｂｉｃｙｃｌａｍ）））、ＳＤＦ−１およびそのアナログ、ならびにＡＬＸ４０−４Ｃ（カチオン性ペプチド）、Ｔ２２（１８個のアミノ酸ペプチド；Ｔｒｉｍｅｒｉｓ）ならびにＴ２２アナログＴ１３４およびＴ１４０；ＣＣＲ５アンタゴニスト（例えば、ＲＡＮＴＥＳ（９−６８）、ＡＯＰ−ＲＡＮＴＥＳ、ＮＮＹ−ＲＡＮＴＥＳ、およびＴＡＫ−７７９）；ならびにＣＣＲ５／ＣＸＣＲ４アンタゴニスト（例えば、ＮＳＣ ６５１０１６（ジスタマイシンアナログ））。ＣＣＲ２Ｂ、ＣＣＲ３、およびＣＣＲ６アンタゴニストがまた挙げられる。ケモカインレセプターアゴニスト（例えば、ＲＡＮＴＥＳ、ＳＤＦ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１βなど）はまた、融合を阻害し得る。
さらなる抗レトロウイルス剤は、インテグラーゼインヒビターを含む。インテグラーゼインヒビターとしては、以下が挙げられる：ジカフェオイルキナ酸（ＤＦＱＡ）；Ｌ−チコリ酸（ジカフェオイル酒石酸（ＤＣＴＡ））；キナリザリン（ＱＬＣ）および関連するアントラキノン；ＺＩＮＴＥＶＩＲＴＭ（ＡＲ １７７、真のインテグラーゼインヒビターでなく細胞表面で恐らく作用するオリゴヌクレオチド；Ａｒｏｎｄｅｘ）；ならびにナフトール（例えば、ＷＯ９８／５０３４７に記載されるナフトール）。
さらなる抗レトロウイルス剤としては、以下が挙げられる：ヒドロキシウレア様化合物（例えば、ＢＣＸ−３４（プリンヌクレオシドホスホリラーゼインヒビター；Ｂｉｏｃｒｙｓｔ）；リボヌクレオチドレダクターゼインヒビター（例えば、ＤＩＤＯＸＴＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｆｏｒ Ｈｅａｌｔｈ））；イノシンモノホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＩＭＰＤＨ）インヒビター（例えば、ＶＸ−４９７ （Ｖｅｒｔｅｘ））；ならびにマイコフォリック酸（ｍｙｃｏｐｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ）（例えば、ＣｅｌｌＣｅｐｔ（マイコフェノラートモフェチル（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌａｔｅ ｍｏｆｅｔｉｌ）；Ｒｏｃｈｅ）。
さらなる抗レトロウイルス剤としては、以下が挙げられる：ウイルスインテグラーゼのインヒビター、ウイルスゲノム核転座のインヒビター（例えば、アリーレンビス（メチルケトン）化合物）；ＨＩＶ侵入のインヒビター（例えば、ＡＯＰ−ＲＡＮＴＥＳ、ＮＮＹ−ＲＡＮＴＥＳ、ＲＡＮＴＥＳ−ＩｇＧ融合タンパク質、ＲＡＮＴＥＳの溶解性複合体およびグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）、ならびにＡＭＤ−３１００；ヌクレオカプシドジンクフィンガーインヒビター（例えば、ジチアン化合物；ＨＩＶ ＴａｔおよびＲｅｖの標的；ならびに薬学的エンハンサー（例えば、ＡＢＴ−３７８））。
他の抗レトロウイルス治療剤および補助治療剤としては、以下が挙げられる：サイトカインおよびリンホカイン（例えば、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＳＤＦ−１α、ＩＬ−２、ＰＲＯＬＥＵＫＩＮＴＭ（アデスロイキン（ａｌｄｅｓｌｅｕｋｉｎ）／Ｌ２−７００１；Ｃｈｉｒｏｎ）、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、およびＩＬ−１３）；インターフェロン（例えば、ＩＦＮ−α２ａ；ＴＮＦｓ、ＮＦｋＢ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、およびＩＬ−１０のアンタゴニスト）；免疫活性を調節する薬剤（例えば、シクロスポリンおよびプレドニゾン（ｐｒｅｄｎｉｓｏｎｅ））；ワクチン（例えば、ＲｅｍｕｎｅＴＭ（ＨＩＶ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ）、ＡＰＬ ４００−００３（Ａｐｏｌｌｏｎ）、組換えｇｐ１２０およびフラグメント、二価（Ｂ／Ｅ）組換えエンベロープ糖タンパク質、ｒｇｐ１２０ＣＭ２３５、ＭＮ ｒｇｐ１２０、ＳＦ−２ｒｇｐ１２０、ｇｐ１２０／可溶性ＣＤ４錯体、Ｄｅｌｔａ ＪＲ−ＦＬタンパク質、不連続ｇｐ１２０ Ｃ３／Ｃ４ドメイン由来の分枝合成ペプチド、融合成分イムノゲン、ならびにＧａｇ、Ｐｏｌ、Ｎｅｆ、およびＴａｔワクチン）；遺伝子ベース治療剤（例えば、遺伝子抑制エレメント（ＧＳＥ；ＷＯ９８／５４３６６）、およびイントラキン（ｉｎｔｒａｋｉｎｅｓ）（新しく合成されたＣＣＲ５の表面発現を遮断するためにＥＲに対して標的された、一般に改変されたＣＣケモカイン（Ｙａｎｇら、ＰＮＡＳ９４：１１５６７−７２（１９９７）；Ｃｈｅｎら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．３：１１１０−１６（１９９７））；抗体（例えば、抗−ＣＸＣＲ４抗体１２Ｇ５、抗−ＣＣＲ５抗体２Ｄ７、５Ｃ７、ＰＡ８、ＰＡ９、ＰＡ１０、ＰＡ１１、ＰＡ１２、およびＰＡ１４、抗−ＣＤ４抗体Ｑ４１２０およびＲＰＡ−Ｔ４、抗−ＣＣＲ３抗体７Ｂ１１、抗−ｇｐ１２０抗体１７ｂ、４８ｄ、４４７−５２Ｄ、２５７−Ｄ、２６８−Ｄおよび５０．１、抗−Ｔａｔ抗体、抗−ＴＮＦ−α抗体、およびモノクローナル抗体３３Ａ）；アリール炭化水素（ＡＨ）レセプターアゴニストおよびアンタゴニスト（例えば、ＴＣＤＤ、３，３’，４，４’，５−ペンタクロロビフェニル、３，３’，４，４’−テトラクロロビフェニル、およびα−ナフトフラボン（ＷＯ９８／３０２
１３））；ならびに抗酸化剤（例えば、ｇ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−システインエチルエステル（ｇ−ＧＣＥ；ＷＯ９９／５６７６４）。
さらなる実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、抗ウイルス剤と組合せて投与される。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと共に投与され得る抗ウイルス剤としては、アシクロビル、リバビリン、アマンタジン、レマンチジン（ｒｅｍａｎｔｉｄｉｎｅ）、マキサミン（ｍａｘａｍｉｎｅ）、またはチマルファシン（ｔｈｙｍａｌｆａｓｉｎ）が挙げられるが、これらに限定されない。特に、インターフェロンアルブミン融合タンパク質は、これらの任意の薬剤と組み合わせて投与され得る。さらに、インターフェロンαアルブミン融合タンパク質はまた、これらの任意の薬剤とともに投与され得、そして好ましくは、インターフェロンα２ａまたは２ｂアルブミン融合タンパク質は、これらの任意の薬剤とともに投与される。さらに、インターフェロンβアルブミン融合タンパク質はまた、これらの任意の薬剤とともに投与され得る。さらに、任意のＩＦＮハイブリッドアルブミン融合タンパク質はまた、これらの任意の薬剤と組み合わせて投与され得る。
最も好ましい実施形態において、インターフェロンアルブミン融合タンパク質は、リバビリンと組み合わせて投与される。さらに好ましい実施形態において、インターフェロンαアルブミン融合タンパク質は、リバビリンと組み合わせて投与される。さらに好ましい実施形態において、インターフェロンα２ａアルブミン融合タンパク質は、リバビリンと組み合わせて投与される。さらに好ましい実施形態において、インターフェロンα２ｂアルブミン融合タンパク質は、リバビリンと組み合わせて投与される。さらに好ましい実施形態において、インターフェロンβアルブミン融合タンパク質は、リバビリンと組み合わせて投与される。さらに好ましい実施形態において、ハイブリッドインターフェロンアルブミン融合タンパク質は、リバビリンと組み合わせて投与される。
他の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、抗日和見感染症薬剤と組み合わせて投与され得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと組み合わせて投与され得る抗日和見感染症薬剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＴＲＩＭＥＴＨＯＰＲＩＭ−ＳＵＬＦＡＭＥＴＨＯＸＡＺＯＬＥＴＭ、ＤＡＰＳＯＮＥＴＭ、ＰＥＮＴＡＭＩＤＩＮＥＴＭ、ＡＴＯＶＡＱＵＯＮＥＴＭ、ＩＳＯＮＩＡＺＩＤＴＭ、ＲＩＦＡＭＰＩＮＴＭ、ＰＹＲＡＺＩＮＡＭＩＤＥＴＭ、ＥＴＨＡＭＢＵＴＯＬＴＭ、ＲＩＦＡＢＵＴＩＮＴＭ、ＣＬＡＲＩＴＨＲＯＭＹＣＩＮＴＭ、ＡＺＩＴＨＲＯＭＹＣＩＮＴＭ、ＧＡＮＣＩＣＬＯＶＩＲＴＭ、ＦＯＳＣＡＲＮＥＴＴＭ、ＣＩＤＯＦＯＶＩＲＴＭ、ＦＬＵＣＯＮＡＺＯＬＥＴＭ、ＩＴＲＡＣＯＮＡＺＯＬＥＴＭ、ＫＥＴＯＣＯＮＡＺＯＬＥＴＭ、ＡＣＹＣＬＯＶＩＲＴＭ、ＦＡＭＣＩＣＯＬＶＩＲＴＭ、ＰＹＲＩＭＥＴＨＡＭＩＮＥＴＭ、ＬＥＵＣＯＶＯＲＩＮＴＭ、ＮＥＵＰＯＧＥＮＴＭ（フィルグラスチム（ｆｉｌｇｒａｓｔｉｍ）／Ｇ−ＣＳＦ）、およびＬＥＵＫＩＮＥＴＭ（サルグラモスチン（ｓａｒｇｒａｍｏｓｔｉｍ）／ＧＭ−ＣＳＦ）。特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、日和見Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ肺炎感染を予防的に処置または予防するために、ＴＲＩＭＥＴＨＯＰＲＩＭ−ＳＵＬＦＡＭＥＴＨＯＸＡＺＯＬＥＴＭ、ＤＡＰＳＯＮＥＴＭ、ＰＥＮＴＡＭＩＤＩＮＥＴＭ、および／またはＡＴＯＶＡＱＵＯＮＥＴＭとの任意の組み合わせで使用される。別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、日和見Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ複合感染を予防的に処置または予防するために、ＩＳＯＮＩＡＺＩＤＴＭ、ＲＩＦＡＭＰＩＮＴＭ、ＰＹＲＡＺＩＮＡＭＩＤＥＴＭ、および／またはＥＴＨＡＭＢＵＴＯＬＴＭとの任意の組み合わせで使用される。別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、日和見Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ感染を予防的に処置または予防するために、ＲＩＦＡＢＵＴＩＮＴＭ、ＣＬＡＲＩＴＨＲＯＭＹＣＩＮＴＭ、および／またはＡＺＩＴＨＲＯＭＹＣＩＮＴＭとの任意の組み合わせで使用される。別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、日和見サイトメガロウイルス感染を予防的に処置または予防するために、ＧＡＮＣＩＣＬＯＶＩＲＴＭ、ＦＯＳＣＡＲＮＥＴＴＭ、および／またはＣＩＤＯＦＯＶＩＲＴＭとの任意の組み合わせで使用される。別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、日和見真菌感染を予防的に処置または予防するために、ＦＬＵＣＯＮＡＺＯＬＥＴＭ、ＩＴＲＡＣＯＮＡＺＯＬＥＴＭ、および／またはＫＥＴＯＣＯＮＡＺＯＬＥＴＭとの任意の組み合わせで使用される。別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、日和見単純ヘルペスウイルスＩ型および／またはＩＩ型感染を予防的に処置または予防するために、ＡＣＹＣＬＯＶＩＲＴＭおよび／またはＦＡＭＣＩＣＯＬＶＩＲＴＭとの任意の組み合わせで使用される。別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、日和見Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ感染を予防的に処置または予防するために、ＰＹＲＩＭＥＴＨＡＭＩＮＥＴＭおよび／またはＬＥＵＣＯＶＯＲＩＮＴＭとの任意の組み合わせで使用される。別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、日和見細菌感染を予防的に処置または予防するために、ＬＥＵＣＯＶＯＲＩＮＴＭおよび／またはＮＥＵＰＯＧＥＮＴＭとの任意の組み合わせで使用される。
さらなる実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、抗生物質と組合せて投与される。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドとともに投与され得る抗生物質としては、アモキシシリン、β−ラクタマーゼ、アミノグリコシド、β−ラクタム（糖ペプチド）、β−ラクタマーゼ、クリンダマイシン、クロラムフェニコール、セファロスポリン、シプロフロキサシン、エリスロマイシン、フルオロキノロン、マクロライド、メトロニダゾール、ペニシリン、キノロン、ラパマイシン、リファンピン、ストレプトマイシン、スルホンアミド、テトラサイクリン、トリメトプリム、トリメトプリム−スルファメトキサゾール（ｓｕｌｆａｍｔｈｏｘａｚｏｌｅ）、およびバンコマイシンが挙げられるが、これらに限定されない。
他の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、免疫刺激剤と組み合わせて投与される。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと組み合わせて投与され得る免疫刺激剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：レバミゾ−ル（例えば、ＥＲＧＡＭＩＳＯＬＴＭ）、イソピリノサイン（ｉｓｏｐｒｉｎｏｓｉｎｅ）（例えば、ＩＮＯＳＩＰＬＥＸＴＭ）、インターフェロン（例えば、インターフェロンα）、およびインターロイキン（例えば、ＩＬ−２）。
他の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、免疫抑制剤と組み合わせて投与される。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと組み合わせて投与され得る免疫抑制剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ステロイド、シクロスポリン、シクロスポリンアナログ、シクロホスファミド メチルプレドニゾン、プレドニゾン、アザチオプリン、ＦＫ−５０６、１５−デオキシスペルグアリン（１５−ｄｅｏｘｙｓｐｅｒｇｕａｌｉｎ）、および応答するＴ細胞の機能を抑制することにより作用する他の免疫抑制剤。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと組み合わせて投与され得る他の免疫抑制剤としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：プレドニゾロン（ｐｒｅｄｏｎｉｓｏｌｏｎｅ）、メトトレキサート、サリドマイド、メトキサレン、ラパマイシン、レフルノミド、ミゾリビン（ＢＲＥＤＩＮＩＮＴＭ）、ブレキナル、デオキシスペルグアリン、およびアザスピラン（ａｚａｓｐｉｒａｎｅ）（ＳＫＦ １０５６８５）、ＯＲＴＨＯＣＬＯＮＥ ＯＫＴ（登録商標） ３（ｍｕｒｏｍｏｎａｂ−ＣＤ３）、ＳＡＮＤＩＭＭＵＮＥＴＭ、ＮＥＯＲＡＬＴＭ、ＳＡＮＧＤＹＡＴＭ（シクロスポリン）、ＰＲＯＧＲＡＦ（登録商標）（ＦＫ５０６、タクロリムス（ｔａｃｒｏｌｉｍｕｓ））、ＣＥＬＬＣＥＰＴ（登録商標）（マイコフェノラートモフェチル（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌａｔｅ ｍｏｔｅｆｉｌ），その活性な代謝産物は、ミコフェノール酸である）、ＩＭＵＲＡＮＴＭ（アザチオプリン）、グルココルチコステロイド、副腎皮質ステロイド（例えば、ＤＥＬＴＡＳＯＮＥＴＭ（プレドニゾン）およびＨＹＤＥＬＴＲＡＳＯＬＴＭ（プレドニゾロン））、ＦＯＬＥＸＴＭおよびＭＥＸＡＴＥＴＭ（メトトレキサート）、ＯＸＳＯＲＡＬＥＮ−ＵＬＴＲＡＴＭ（メトトレキサレン）ならびにＲＡＰＡＭＵＮＥＴＭ（シロリムス（ｓｉｒｏｌｉｍｕｓ））。特定の実施形態において、免疫抑制剤を使用して、器官移植または骨髄移植の拒絶を予防し得る。
さらなる実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、単独または１以上の静脈内免疫グロブリン調製物と組み合わせて投与される。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドとともに投与され得る静脈内免疫グロブリン調製物としては、ＧＡＭＭＡＲＴＭ、ＩＶＥＥＧＡＭＴＭ、ＳＡＮＤＯＧＬＯＢＵＬＩＮＴＭ、ＧＡＭＭＡＧＡＲＤ Ｓ／ＤＴＭＡＴＧＡＭＴＭ（抗胸腺細胞グロブリン（ｇｌｕｂｕｌｉｎ））およびＧＡＭＩＭＹＮＥＴＭが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、移植治療（例えば、骨髄移植）において静脈内免疫グロブリン調製物と組み合わせて投与される。
別の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、癌の治療のために、患者にインビボ、または細胞にインビトロのいずれかにおいて、単独で、または組み合わせ治療の一部として投与される。特定の実施形態において、アルブミン融合タンパク質、特にＩＬ−２−アルブミン融合は、癌についての消極的な免疫治療（例えば、Ｄｕｄｌｅｙら、ｗｗｗ．ｓｃｉｅｎｃｅｅｘｐｒｅｓｓ．ｏｒｇでのＳｃｉｅｎｃｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ、２００２年９月１９日（ここで、この全体は、参考として本明細書中で援用される）に記載されるような転移性メラノーマについての養子細胞転移治療）の間、繰り返し投与される。
特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、単独でかまたは抗炎症剤と組み合わせて投与される。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと組み合わせて投与され得る抗炎症剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：コルチコステロイド（例えば、ベタメタゾン、ブデソニド、コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾンおよびトリアムシノロン）、非ステロイド系抗炎症薬（例えば、ジクロフェナク ジフルニサル、エトドラク（ｅｔｏｄｏｌａｃ）、フェノプロフェン、フロクタフェニン、フルルビフロフェン、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、メクロフェナメート（ｍｅｃｌｏｆｅｎａｍａｔｅ）、メフェナム酸、メロキシカム（ｍｅｌｏｘｉｃａｍ）、ナブメトン、ナプロキセン、オキサプロジン、フェニルブタゾン、ピロキシカム、スリンダク、テノキシカム、チアプロフェン酸，およびトルメチン）、ならびに抗ヒスタミン剤、アミノアリールカルボン酸誘導体、アリール酢酸誘導体，アリール酪酸誘導体、アリールカルボン酸、アリールプロピオン酸誘導体、ピラゾール類，ピラゾロン類、サリチル酸誘導体、チアジンカルボキサミド、ｅ−アセトアミドカプロン酸、Ｓ−アデノシルメチオニン、３−アミノ−４−ヒドロキシ酪酸、アミキセトリン、ベンダザック、ベンジダミン、ブコローム、ジフェンピラミド、ジタゾール、エモルファゾン、グアイアズレン（ｇｕａｉａｚｕｌｅｎｅ）、ナブメトン、ニメスリド（ｎｉｍｅｓｕｌｉｄｅ）、オルゴテイン（ｏｒｇｏｔｅｉｎ）、オキサセプロール（ｏｘａｃｅｐｒｏｌ）、パラニリン（ｐａｒａｎｙｌｉｎｅ）、ペリソキサール、ピフオキシム（ｐｉｆｏｘｉｍｅ）、プロカゾン（ｐｒｏｑｕａｚｏｎｅ）、プロキサゾール、およびテニダプ（ｔｅｎｉｄａｐ）。
さらなる実施形態において、本発明の組成物は、単独でかまたは抗脈管形成剤と組み合わせて投与される。本発明の組成物と組み合わせて投与され得る抗脈管形成剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：アンギオスタチン（Ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ）（Ｅｎｔｒｅｍｅｄ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、トロポニン（Ｔｒｏｐｏｎｉｎ）−１（Ｂｏｓｔｏｎ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）、抗侵襲性因子、レチノイン酸およびその誘導体、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ）、スラミン、メタロプロテイナーゼ−１の組織インヒビター、メタロプロテイナーゼ−２の組織インヒビター、ＶＥＧＩ、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター−１、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター−２および種々の形態のより軽い「ｄ群」遷移金属。
より軽い「ｄ群」遷移金属には、例えばバナジウム、モリブデン、タングステン、チタン、ニオブおよびタンタル種が挙げられる。そのような遷移金属種は、遷移金属錯体を形成し得る。上記の遷移金属種の適切な錯体としては、オキソ遷移金属錯体が挙げられる。
バナジウム錯体の代表的な例としては、オキソバナジウム錯体（例えば、バナジン酸錯体およびバナジル錯体）が挙げられる。適切なバナジン酸錯体としては、メタバナジン酸錯体およびオルトバナジン酸錯体（例えば、メタバナジン酸アンモニウム、メタバナジン酸ナトリウムおよびオルトバナジン酸ナトリウム）が挙げられる。適切なバナジル錯体としては、例えば、バナジルアセチルアセトネート、ならびに硫酸バナジル一水和物および硫酸バナジル三水和物のような硫酸バナジル水和物を含む、硫酸バナジルが挙げられる。
タングステン錯体およびモリブデン錯体の代表的な例としてはまた、オキソ錯体が挙げられる。適切なオキソタングステン錯体としては、タングステン酸およびタングステンオキシド錯体が挙げられる。適切なタングテン酸錯体としては、タングステン酸アンモニウム、タングステン酸カルシウム、タングステン酸ナトリウム二水和物およびタングステン酸が挙げられる。適切なタングステンオキシドとしては、タングステン（ＩＶ）オキシドおよびタングステン（ＶＩ）オキシドが挙げられる。適切なオキソモリブデン錯体としては、モリブデン酸錯体、モリブデンオキシド錯体およびモリブデニル錯体が挙げられる。
適切なモリブデン酸錯体としては、モリブデン酸アンモニウムおよびその水和物、モリブデン酸ナトリウムおよびその水和物、ならびにモリブデン酸カリウムおよびその水和物が挙げられる。適切なモリブデンオキシドとしては、モリブデン（ＶＩ）オキシド、モリブデン（ＶＩ）オキシドおよびモリブデン酸が挙げられる。適切なモリブデニル錯体としては、例えば、モリブデニルアセチルアセトネートが挙げられる。他の適切なタングステン錯体およびモリブデン錯体としては、例えばグリセロール、酒石酸および糖由来のヒドロキソ誘導体が挙げられる。
広範な種々の他の抗脈管形成因子もまた、本発明の状況において利用され得る。代表的な例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：血小板因子４；硫酸プロタミン；硫酸化キチン誘導体（クイーンクラブ（ｑｕｅｅｎ ｃｒａｂ）の殻から調製される）（Ｍｕｒａｔａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５１：２２〜２６、１９９１）；硫酸化多糖ペプチドグリカン複合体（ＳＰ−ＰＧ）（この化合物の機能は、ステロイド（例えば、エストロゲン）およびクエン酸タモキシフェンの存在によって、増強され得る）；スタウロスポリン；基質代謝のモジュレーター（例えば、プロリンアナログ、シスヒドロキシプロリン、ｄ，Ｌ−３，４−デヒドロプロリン、チアプロリン、α，α−ジピリジル，アミノプロピオニトリルフマレートを含む）；４−プロピル−５−（４−ピリジニル）−２（３Ｈ）−オキサゾロン；メトトレキサート；ミトキサントロン；ヘパリン；インターフェロン；２マクログロブリン−血清；ＣｈＩＭＰ−３（Ｐａｖｌｏｆｆら、Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．２６７：１７３２１〜１７３２６、１９９２）；キモスタチン（Ｔｏｍｋｉｎｓｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．２８６：４７５〜４８０、１９９２）；シクロデキストリンテトラデカサルフェート；エポネマイシン（Ｅｐｏｎｅｍｙｃｉｎ）；カンプトセシン；フマギリン（Ｆｕｍａｇｉｌｌｉｎ）（Ｉｎｇｂｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５５〜５５７、１９９０）；チオリンゴ酸金ナトリウム（「ＧＳＴ」；ＭａｔｓｕｂａｒａおよびＺｉｆｆ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７９：１４４０〜１４４６、１９８７）；アンチコラゲナーゼ−血清；α２−抗プラスミン（Ｈｏｌｍｅｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２（４）：１６５９〜１６６４、１９８７）；ビサントレン（Ｂｉｓａｎｔｒｅｎｅ）（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）；ロベンザリット二ナトリウム（Ｎ−（２）−カルボキシフェニル−４−クロロアントロニル酸（ｃｈｌｏｒｏａｎｔｈｒｏｎｉｌｉｃ ａｃｉｄ）二ナトリウム、すなわち「ＣＣＡ」；Ｔａｋｅｕｃｈｉら、Ａｇｅｎｔｓ Ａｃｔｉｏｎｓ ３６：３１２〜３１６、１９９２）；およびメタロプロテイナーゼインヒビター（例えば、ＢＢ９４）。
本発明の状況においてまた、利用され得るさらなる抗脈管形成因子としては、サリドマイド（Ｃｅｌｇｅｎｅ，Ｗａｒｒｅｎ，ＮＪ）；血管拡張性ステロイド；ＡＧＭ−１４７０（Ｈ．ＢｒｅｍおよびＪ．Ｆｏｌｋｍａｎ Ｊ Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｓｕｒｇ．２８：４４５−５１（１９９３））；インテグリンαｖβ３アンタゴニスト（Ｃ．Ｓｔｏｒｇａｒｄ ら．，Ｊ Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０３：４７−５４（１９９９））；カルボキシアミノイミダゾール（ｃａｒｂｏｘｙｎａｍｉｎｏｌｍｉｄａｚｏｌｅ）；カルボキシアミドトリアゾール（ＣＡＩ）（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）；Ｃｏｎｂｒｅｔａｓｔａｔｉｎ Ａ−４（ＣＡ４Ｐ）（ＯＸｉＧＥＮＥ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）；Ｓｑｕａｌａｍｉｎｅ（Ｍａｇａｉｎｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｐｌｙｍｏｕｔｈ Ｍｅｅｔｉｎｇ，ＰＡ）；ＴＮＰ−４７０，（Ｔａｐ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）；ＺＤ−０１０１ ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ（Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ）；ＡＰＲＡ（ＣＴ２５８４）；Ｂｅｎｅｆｉｎ，Ｂｙｒｏｓｔａｔｉｎ−１（ＳＣ３３９５５５）；ＣＧＰ−４１２５１（ＰＫＣ ４１２）；ＣＭ１０１；Ｄｅｘｒａｚｏｘａｎｅ（ＩＣＲＦ１８７）；ＤＭＸＡＡ；エンドスタチン；Ｆｌａｖｏｐｒｉｄｉｏｌ；Ｇｅｎｅｓｔｅｉｎ；ＧＴＥ；ＩｍｍＴｈｅｒ；Ｉｒｅｓｓａ（ＺＤ１８３９）；Ｏｃｔｒｅｏｔｉｄｅ（ソマトスタチン）；Ｐａｎｒｅｔｉｎ；Ｐｅｎａｃｉｌｌａｍｉｎｅ；Ｐｈｏｔｏｐｏｉｎｔ；ＰＩ−８８；Ｐｒｉｎｏｍａｓｔａｔ（ＡＧ−３３４０）Ｐｕｒｌｙｔｉｎ；Ｓｕｒａｄｉｓｔａ（ＦＣＥ２６６４４）；タモキシフェン（Ｎｏｌｖａｄｅｘ）；Ｔａｚａｒｏｔｅｎｅ；テトラチオモリブデート；Ｘｅｌｏｄａ（Ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ）；および５−フルオロウラシルが挙げられる。
本発明の化合物と組合わせて投与され得る抗脈管形成薬剤は、種々の機構を通じて作用し得、これらの機構としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：細胞外マトリックスのタンパク質分解の阻害、増殖因子のような脈管形成誘導因子の機能を拮抗することによる内皮細胞−細胞外マトリックス接着分子の機能のブロック、および増殖している内皮細胞において発現されるインテグリンレセプターの阻害。細胞外マトリックスタンパク質分解を妨害し、そして本発明の組成物と組合わせて投与され得る抗脈管形成インヒビターの例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＡＧ−３３４０（Ａｇｏｕｒｏｎ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）、ＢＡＹ−１２−９５６６（Ｂａｙｅｒ，Ｗｅｓｔ Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）、ＢＭＳ−２７５２９１（Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）、ＣＧＳ−２７０３２Ａ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ，Ｅａｓｔ Ｈａｎｏｖｅｒ，ＮＪ）、Ｍａｒｉｍａｓｔａｔ（Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）およびＭｅｔａｓｔａｔ（Ａｅｔｅｒｎａ，Ｓｔ−Ｆｏｙ，Ｑｕｅｂｅｃ）。内皮細胞−細胞外マトリックス接着分子の機能をブロックすることにより作用し、そして本発明の組成物と組合わせて投与され得る抗脈管形成インヒビターの例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＥＭＤ−１２１９７４（Ｍｅｒｃｋ ＫｃｇａＡ Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）およびＶｉｔａｘｉｎ（Ｉｘｓｙｓ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ／Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）。脈管形成誘導因子と直接拮抗するかまたはこの誘導因子を阻害することにより作用し、そして本発明の組成物と組合わせて投与され得る抗脈管形成薬剤の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ａｎｇｉｏｚｙｍｅ（Ｒｉｂｏｚｙｍｅ，Ｂｏｕｌｄｅｒ，ＣＯ）、抗ＶＥＧＦ抗体（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｓ．Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）、ＰＴＫ−７８７／ＺＫ−２２５８４６（Ｎｏｖａｒｔｉｓ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＳＵ−１０１（Ｓｕｇｅｎ，Ｓ．Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）、ＳＵ−５４１６（Ｓｕｇｅｎ／Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｕｐｊｏｈｎ，Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ，ＮＪ）、およびＳＵ−６６６８（Ｓｕｇｅｎ）。他の抗脈管形成薬剤は、脈管形成を間接的に阻害するように作用する。本発明の組成物と組合わせて投与され得る脈管形成の間接的インヒビターの例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＩＭ−８６２（Ｃｙｔｒａｎ，Ｋｉｒｋｌａｎｄ，ＷＡ）、インターフェロン−α、ＩＬ−１２（Ｒｏｃｈｅ，Ｎｕｔｌｅｙ，ＮＪ）、およびペントサンポリスルフェート（Ｇｅｏｒｇｅｔｏｗｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ）。
特定の実施形態において、抗脈管形成薬剤と組み合わせた本発明の組成物の使用は、自己免疫疾患（例えば、本明細書中に記載の自己免疫疾患）の処置、予防、および／または回復のために企図される。
特定の実施形態において、抗脈管形成薬剤と組み合わせた本発明の組成物の使用は、関節炎の処置、予防、および／または回復のために企図される。さらに特定の実施形態において、抗脈管形成薬剤と組み合わせた本発明の組成物の使用は、慢性関節リウマチの処置、予防、および／または回復のために企図される。
別の実施形態において、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、脈管形成タンパク質または脈管形成タンパク質をコードするポリヌクレオチドと組み合わせて投与される。本発明の組成物と共に投与され得る脈管形成タンパク質の例としては、酸性および塩基性の線維芽細胞増殖因子、ＶＥＧＦ−１、ＶＥＧＦ−２、ＶＥＧＦ−３、上皮増殖因子αおよび表皮増殖因子β、血小板由来内皮細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、腫瘍壊死因子α、肝細胞増殖因子、インスリン様増殖因子、コロニー刺激因子、マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子、ならびに一酸化窒素シンターゼが挙げられるがこれらに限定されない。
さらなる実施形態において、本発明の組成物は、化学療法剤と組み合わせて投与される。本発明の治療剤と共に投与され得る化学療法剤としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：アルキル化剤（例えば、ナイトロジェンマスタード（例えば、メクロレタミン、シクロホスファミド、シクロホスファミド イホスファミド（Ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、メルファラン（Ｌ−サルコリシン）、およびクロランブシル）、エチレンイミン類およびメチルメラミン類（例えば、ヘキサメチルメラミンおよびチオテパ）、アルキルスルホネート類（例えば、ブスルファン）、ニトロソウレア類（例えば、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、セムスチン（メチル−ＣＣＮＵ）、およびストレプトゾシン（ストレプトゾトシン（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ））、トリアゼン類（例えば、ダカルバジン（ＤＴＩＣ；ジメチルトリアゼノイミダゾールカルボキサミド））、葉酸アナログ（例えば、メトトレキサート（アメトプテリン））、ピリミジンアナログ（例えば、フルオロウラシル（５−フルオロウラシル；５−ＦＵ）、フロクスウリジン（Ｆｌｏｘｕｒｉｄｉｎｅ）（フルオロデオキシウリジン；ＦｕｄＲ）、およびシタラビン（シトシンアラビノシド））、プリンアナログおよび関連インヒビター（例えば、メルカプトプリン（６−メルカプトプリン；６−ＭＰ）、チオグアニン（６−チオグアニン；ＴＧ）、およびペントスタチン（２’−デオキシコホルマイシン（ｄｅｏｘｙｃｏｆｏｒｍｙｃｉｎ）））、ビンカアルカロイド類（例えば、ビンブラスチン（ＶＬＢ、硫酸ビンブラスチン））およびビンクリスチン（硫酸ビンクリスチン））、エピポドフィロトキシン（例えば、エトポシドおよびテニポシド）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ）、ダウノルビシン（ダウノマイシン；ルビドマイシン）、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）、およびマイトマイシン（マイトマイシンＣ）、酵素（例えば、Ｌ−アスパラギナーゼ）、生物学的応答改変剤（例えば、インターフェロン−αおよびインターフェロン−α−２ｂ）、白金配位化合物（例えば、シスプラチン（ｃｉｓ−ＤＤＰ）およびカルボプラチン）、アントラセンジオン（ミトキサントロン）、置換尿素（例えば、ヒドロキシ尿素）、メチルヒドラジン誘導体（例えば、プロカルバジン（Ｎ−メチルヒドラジン；ＭＩＨ）、副腎皮質ステロイド（例えば、プレドニゾン）、プロゲスチン（例えば、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、メドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロン、および酢酸メゲストロール）、エストロゲン（例えば、ジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）、ジエチルスチルベストロールジホスフェート、エストラジオール、およびエチニルエストラジオール）、抗エストロゲン（例えば、タモキシフェン）、アンドロゲン（テストステロンプロプリオネート（Ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ ｐｒｏｐｒｉｏｎａｔｅ）、およびフルオキシメステロン）、抗アンドロゲン（例えば、フルタミド）、性腺刺激ホルモン放出ホルモンアナログ（例えば、ロイプロリド）、その他のホルモンおよびホルモンアナログ（例えば、メチルテストステロン、エストラムスチン、エストラムスチンリン酸ナトリウム、クロロトリアニセン、およびテストラクトン）、ならびにその他（例えば、ジカルバジン、グルタミン酸、およびミトタン）。
１つの実施形態において、本発明の組成物は、１以上の次の薬物と組み合わせて投与され得る：ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ（ＲｅｍｉｃａｄｅＴＭ Ｃｅｎｔｏｃｏｒ、Ｉｎｃ．としても公知）、Ｔｒｏｃａｄｅ（Ｒａｏｃｈｅ，ＲＯ−３２−３５５５）、Ｌｅｆｌｕｎｏｍｉｄｅ（Ｈｏｅｃｈｓｔ Ｍａｒｉｏｎ Ｒｏｕｓｓｅｌ製のＡｒａｖａＴＭとしても公知）、ＫｉｎｅｒｅｔＴＭ（Ａｍｇｅｎ、Ｉｎｃ．製のＡｎａｋｉｎｒａとしても公知である、ＩＬ−１レセプターアンタゴニスト）。
特定の実施形態において、本発明の組成物は、ＣＨＯＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニゾン）と組み合わせて投与されるか、ＣＨＯＰの１以上の成分の組み合わせで投与される。１つの実施形態において、本発明の組成物は、抗ＣＤ−２０抗体（ヒトモノクローナル抗ＣＤ２０抗体）と組み合わせて投与される。別の実施形態において、本発明の組成物は、抗ＣＤ２０抗体およびＣＨＯＰと組み合わせて投与されるか、または抗ＣＤ２０抗体ならびにＣＨＯＰの１以上の成分（特定のシクロホスファミドおよび／またはプレドニゾン）の任意の組合せで投与される。特定の実施形態において、本発明の組成物は、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂと組み合わせて投与される。さらなる実施形態において、本発明の組成物は、ＲｉｔｕｘｍａｂおよびＣＨＯＰと共に、またはＲｉｔｕｘｍａｂおよびＣＨＯＰの１以上の成分（詳細には、シクロホスファミドおよび／またはプレドニゾン）の任意の組み合わせと共に投与される。特定の実施形態において、本発明の組成物は、ｔｏｓｉｔｕｍｏｍａｂと組み合わせて投与される。さらなる実施形態において、本発明の組成物は、ｔｏｓｉｔｕｍｏｍａｂおよびＣＨＯＰと共に、またはｔｏｓｉｔｕｍｏｍａｂおよびＣＨＯＰの１以上の成分（詳細には、シクロホスファミドおよび／またはプレドニゾン）の任意の組合せと共に投与される。抗ＣＤ２０抗体は、必要に応じて、放射性同位体、毒素または細胞毒性薬物に結合し得る。
別の特定の実施形態において、本発明の組成物は、ＺｅｖａｌｉｎＴＭとの組合せで投与される。さらなる実施形態において、本発明の組成物は、ＺｅｖａｌｉｎＴＭおよびＣＨＯＰと共に、またはＺｅｖａｌｉｎＴＭおよびＣＨＯＰの成分（詳細には、シクロホスファミドおよび／またはプレドニゾン）の１以上の任意の組み合わせと共に投与される。
ＺｅｖａｌｉｎＴＭは、１以上の放射性同位体と結合し得る。特に好ましい同位体は、９０Ｙおよび１１１Ｉｎである。
さらなる実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、サイトカインと組み合わせて投与される。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドとともに投与され得るサイトカインとしては、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ１０、ＩＬ１２、ＩＬ１３、ＩＬ１５、抗ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αが挙げられるが、これらに限定されない。別の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、任意のインターロイキン（ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０およびＩＬ−２１を含むが、これらに限定されない）と共に投与され得る。
１つの実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、ＴＮＦファミリーのメンバーと組み合わせて投与される。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドとともに投与され得るＴＮＦ分子、ＴＮＦ関連分子またはＴＮＦ様分子としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：可溶性形態のＴＮＦ−α、リンホトキシン−α（ＬＴ−α、ＴＮＦ−βとしても公知）、ＬＴ−β（複合ヘテロトリマーＬＴ−α２−β中に見出される）、ＯＰＧＬ、ＦａｓＬ、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＤｃＲ３、ＯＸ４０Ｌ、ＴＮＦ−γ（国際公開番号ＷＯ９６／１４３２８）、ＡＩＭ−Ｉ（国際公開番号ＷＯ９７／３３８９９）、エンドカイン−α（国際公開番号ＷＯ９８／０７８８０）、ＯＰＧ、およびニュートロカイン−α（国際公開番号ＷＯ９８／１８９２１）、ＯＸ４０、および神経成長因子（ＮＧＦ）、ならびに可溶性形態のＦａｓ、ＣＤ３０、ＣＤ２７、ＣＤ４０および４−ＩＢＢ、ＴＲ２（国際公開番号ＷＯ９６／３４０９５）、ＤＲ３（国際公開番号ＷＯ９７／３３９０４）、ＤＲ４（国際公開番号ＷＯ９８／３２８５６）、ＴＲ５（国際公開番号ＷＯ９８／３０６９３）、ＴＲＡＮＫ、ＴＲ９（国際公開番号ＷＯ９８／５６８９２）、ＴＲ１０（国際公開番号ＷＯ９８／５４２０２）、３１２Ｃ２（国際公開番号ＷＯ９８／０６８４２）、およびＴＲ１２、ならびに可溶性形態のＣＤ１５４、ＣＤ７０、およびＣＤ１５３。
さらなる実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、脈管形成タンパク質と組み合わせて投与される。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドとともに投与され得る脈管形成タンパク質としては、欧州特許ＥＰ−３９９８１６に開示されるような神経膠腫誘導増殖因子（Ｇｉｌｉｏｍａ Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ）（ＧＤＧＦ）；欧州特許ＥＰ−６８２１１０に開示されるような血小板誘導増殖因子−Ａ（ＰＤＧＦ−Ａ）；欧州特許ＥＰ−２８２３１７に開示されるような血小板誘導増殖因子−Ｂ（ＰＤＧＦ−Ｂ）；国際公開番号ＷＯ９２／０６１９４号に開示されるような胎盤増殖因子（ＰＩＧＦ）；Ｈａｕｓｅｒら、Ｇｏｒｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ、４：２５９−２６８（１９９３）に開示されるような胎盤増殖因子−２（ＰＩＧＦ−２）；国際公開番号ＷＯ９０／１３６４９号に開示されるような血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；欧州特許ＥＰ−５０６４７７に開示されるような血管内皮増殖因子−Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）；国際公開番号ＷＯ９６／３９５１５号に開示されるような血管内皮増殖因子−２（ＶＥＧＦ−２）；血管内皮増殖因子−Ｂ（ＶＥＧＦ−３）；国際公開番号ＷＯ９６／２６７３６号に開示されるような血管内皮増殖因子Ｂ−１８６（ＶＥＧＦ−Ｂ１８６）；国際公開番号ＷＯ９８／０２５４３号に開示されるような血管内皮増殖因子−Ｄ（ＶＥＧＦ−Ｄ）；国際公開番号ＷＯ９８／０７８３２号に開示されるような血管内皮増殖因子−Ｄ（ＶＥＧＦ−Ｄ）；およびドイツ国特許ＤＥ１９６３９６０１に開示されるような血管内皮増殖因子−Ｅ（ＶＥＧＦ−Ｅ）が挙げられるが、これらに限定されない。上記の参考文献は、本明細書でその全体が参考として援用される。
さらなる実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、線維芽細胞増殖因子と組み合わせて投与される。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドとともに投与され得る線維芽細胞増殖因子としては、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−３、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−６、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−９、ＦＧＦ−１０、ＦＧＦ−１１、ＦＧＦ−１２、ＦＧＦ−１３、ＦＧＦ−１４、およびＦＧＦ−１５が挙げられるが、これらに限定されない。
さらなる実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、造血増殖因子と組み合わせて投与される。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと共に投与され得る造血増殖因子としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）（サルグラモスチン（ｓａｒｇｒａｍｏｓｔｉｍ）、ＬＥＵＫＩＮＥＴＭ、ＰＲＯＫＩＮＥＴＭ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）（フィルグラスチン（ｆｉｌｇｒａｓｔｉｍ）、ＮＥＵＰＯＧＥＮＴＭ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ、ＣＳＦ−１）エリトロポイエチン（エポエチンα、ＥＰＯＧＥＮＴＭ、ＰＲＯＣＲＩＴＴＭ）、幹細胞因子（ＳＣＦ、ｃ−ｋｉｔリガンド、スチール因子（ｓｔｅｅｌ ｆａｃｔｏｒ））、巨核球コロニー刺激因子、ＰＩＸＹ３２１（ＧＭＣＳＦ／ＩＬ−３融合タンパク質）、インターロイキン（特に、ＩＬ−１〜ＩＬ−１２のうちの任意の１つ以上）、インターフェロンγ、またはトロンボポエチン（ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ）。
特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、アドレナリン作動遮断薬（例えば、アセブトロール、アテノロール、ベタキソロール、ビソプロロール、カルテオロール、ラベタロール、メトプロロール、ナドロール、オクスプレノロール、ペンブトロール、ピンドロール、プロプラノロール、ソタロール、およびチモロールと組み合わせて投与される。
別の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、抗不整脈薬（例えば、アデノシン、アミドアロン（ａｍｉｄｏａｒｏｎｅ）、ブレチリウム、ジギタリス、ジゴキシン、ジギトキシン、ジリアゼン（ｄｉｌｉａｚｅｍ）、ジソピラミド、エスモロール、フレカイニド、リドカイン、メキシレチン、モリシジン（ｍｏｒｉｃｉｚｉｎｅ）、フェニトイン、プロカインアミド、Ｎ−アセチルプロカインアミド、プロパフェノン、プロプラノロール、キニジン、ソタロール、トカイニド、およびベラパミル）と組み合わせて投与される。
別の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、利尿薬（例えば、カルボニックアンヒドラーゼ−阻害剤（例えば、アセタゾラミド、ジクロルフェナミド、およびメタゾルアミド）、浸透圧性利尿薬（例えば、グリセリン、イソソルビド、マンニトール、および尿素）、Ｎａ＋−Ｋ＋−２Ｃｌ−シンポートを阻害する利尿薬（例えば、フロセミド、ブメタニド、アゾセミド、ピレタニド、トリパミド、エタクリン酸、ムゾリミン、およびトルセミド）、チアジドおよびチアジド様利尿薬（例えば、ベンドロフルメチアジド、ベンズチアジド、クロロチアジド、ヒドロクロロチアジド、ヒドロフルメチアジド、メチクロチアジド、ポリチアジド、トリコルメチアジド（ｔｒｉｃｈｏｒｍｅｔｈｉａｚｉｄｅ）、クロルタリドン、インダパミド、メトラゾン、およびキネサゾン（ｑｕｉｎｅｔｈａｚｏｎｅ））、カリウム保持性利尿薬（例えば、アミロライドおよびトリアムテレン）、ならびに鉱質コルチコイドレセプターアンタゴニスト（例えば、スピロノラクトン、カンレノン、およびカンレノ酸カリウム）と組み合わせて投与される。
１つの実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、内分泌物および／またはホルモン不均衡障害のための処置と組み合わせて投与される。内分泌物および／またはホルモン不均衡障害のための処置としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：１２７Ｉ、ヨウ素の放射性同位体（例えば、１３１Ｉおよび１２３Ｉ）；組換え成長ホルモン（例えば、ＨＵＭＡＴＲＯＰＥＴＭ（組換えソマトロピン）；成長ホルモンアナログ（例えば、ＰＲＯＴＲＯＰＩＮＴＭ（ソマトレム））；ドーパミンアゴニスト（例えば、ＰＡＲＬＯＤＥＬＴＭ（ブロモクリプチン）；ソマトスタチンアナログ（例えば、ＳＡＮＤＯＳＴＡＴＩＮＴＭ（オクトレオチド）；ゴナドトロピン調製物（例えば、ＰＲＥＧＮＹＬＴＭ、Ａ．Ｐ．Ｌ．ＴＭおよびＰＲＯＦＡＳＩＴＭ（絨毛性ゴナドトロピン（ＣＧ））、ＰＥＲＧＯＮＡＬＴＭ（メノトロピン）、およびＭＥＴＲＯＤＩＮＴＭ（尿性卵胞性刺激ホルモン（ｕＦＳＨ））；合成ヒトゴナドトロピン放出ホルモン調製物（例えば、ＦＡＣＴＲＥＬＴＭおよびＬＵＴＲＥＰＵＬＳＥＴＭ（塩酸ゴナドレリン）；合成ゴナドトロピンアゴニスト（例えば、ＬＵＰＲＯＮＴＭ（酢酸ロイプロリド）、ＳＵＰＰＲＥＬＩＮＴＭ（酢酸ヒストレリン（ｈｉｓｔｒｅｌｉｎ））、ＳＹＮＡＲＥＬＴＭ（酢酸ナファレリン）、およびＺＯＬＡＤＥＸＴＭ（酢酸ゴセレリンｅ）；甲状腺刺激ホルモン放出ホルモンの合成調製物（例えば，ＲＥＬＥＦＡＣＴ ＴＲＨＴＭおよびＴＨＹＰＩＮＯＮＥＴＭ（プロチレリン）；組換えヒトＴＳＨ（例えば、ＴＨＹＲＯＧＥＮＴＭ）；甲状腺ホルモンの天然異性体のナトリウム塩の合成調製物（例えば、Ｌ−Ｔ４ ＴＭ、ＳＹＮＴＨＲＯＩＤＴＭおよびＬＥＶＯＴＨＲＯＩＤＴＭ（レボチロキシンナトリウム）、Ｌ−Ｔ３ ＴＭ、ＣＹＴＯＭＥＬＴＭおよびＴＲＩＯＳＴＡＴＴＭ（リオチロインナトリウム（ｌｉｏｔｈｙｒｏｉｎｅ ｓｏｄｉｕｍ））、およびＴＨＹＲＯＬＡＲＴＭ（リオトリックス））；抗甲状腺化合物（例えば、６−ｎ−プロピルチオウラシル（プロピルチオウラシル）、１−メチル−２−メルカプトイミダゾールおよびＴＡＰＡＺＯＬＥＴＭ（メチマゾール）、ＮＥＯ−ＭＥＲＣＡＺＯＬＥＴＭ（カルビマゾール）；β−アドレナリン作動性レセプターアンタゴニスト（例えば、プロプラノロールおよびエスモロール）；Ｃａ２＋チャネル遮断薬；デキサメタゾンおよびヨウ素化放射線造影剤（例えば、ＴＥＬＥＰＡＱＵＥＴＭ（ヨーパン酸（ｉｏｐａｎｏｉｃ ａｃｉｄ））およびＯＲＡＧＲＡＦＩＮＴＭ（イポダートナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｉｐｏｄａｔｅ））。
内分泌物および／またはホルモン不均衡障害のさらなる処置としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：エストロゲンまたは結合型エストロゲン（例えば、ＥＳＴＲＡＣＥＴＭ（エストラジオール）、ＥＳＴＩＮＹＬＴＭ（エチニルエストラジオール）、ＰＲＥＭＡＲＩＮＴＭ、ＥＳＴＲＡＴＡＢＴＭ、ＯＲＴＨＯ−ＥＳＴＴＭ、ＯＧＥＮＴＭおよびエストロピペート（ｅｓｔｒｏｐｉｐａｔｅ）（エストロン）、ＥＳＴＲＯＶＩＳＴＭ（キネストロール）、ＥＳＴＲＡＤＥＲＭＴＭ（エストラジオール）、ＤＥＬＥＳＴＲＯＧＥＮＴＭおよびＶＡＬＥＲＧＥＮＴＭ（吉草酸エストラジオール）、ＤＥＰＯ−ＥＳＴＲＡＤＩＯＬ ＣＹＰＩＯＮＡＴＥＴＭおよびＥＳＴＲＯＪＥＣＴ ＬＡＴＭ（サイピオン酸（ｃｙｐｉｏｎａｔｅ）エストラジオール））；抗エストロゲン（例えば、ＮＯＬＶＡＤＥＸＴＭ（タモキシフェン）、ＳＥＲＯＰＨＥＮＥＴＭおよびＣＬＯＭＩＤＴＭ（クロミフェン）；プロゲスチン（例えば、ＤＵＲＡＬＵＴＩＮＴＭ（カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン）、ＭＰＡＴＭおよびＤＥＰＯ−ＰＲＯＶＥＲＡＴＭ（酢酸メドロキシプロゲステロン）、ＰＲＯＶＥＲＡＴＭおよびＣＹＣＲＩＮＴＭ（ＭＰＡ）、ＭＥＧＡＣＥＴＭ（酢酸メゲストロール）、ＮＯＲＬＵＴＩＮＴＭ（ノルエチンドロン）、ならびにＮＯＲＬＵＴＡＴＥＴＭおよびＡＹＧＥＳＴＩＮＴＭ（酢酸ノルエチンドロン））；プロゲステロンインプラント（例えば、ＮＯＲＰＬＡＮＴ ＳＹＳＴＥＭＴＭ（ノルゲストレルの皮下移植物））；抗黄体ホルモン（例えば、ＲＵ ４８６ＴＭ（ミフェプリストン）；ホルモン性避妊薬（例えば、ＥＮＯＶＩＤＴＭ（ノルエチノドレル＋メストラノール）、ＰＲＯＧＥＳＴＡＳＥＲＴＴＭ（プロゲステロンを放出する子宮内デバイス）、ＬＯＥＳＴＲＩＮＴＭ、ＢＲＥＶＩＣＯＮＴＭ、ＭＯＤＩＣＯＮＴＭ、ＧＥＮＯＲＡＴＭ、ＮＥＬＯＮＡＴＭ、ＮＯＲＩＮＹＬＴＭ、ＯＶＡＣＯＮ−３５ＴＭおよびＯＶＡＣＯＮ−５０ＴＭ（エチニルエストラジオール／ノルエチンドロン）、ＬＥＶＬＥＮＴＭ、ＮＯＲＤＥＴＴＥＴＭ、ＴＲＩ−ＬＥＶＬＥＮＴＭおよびＴＲＩＰＨＡＳＩＬ−２１ＴＭ（エチニルエストラジオール／レボノルゲストレル（ｌｅｖｏｎｏｒｇｅｓｔｒｅｌ）ＬＯ／ＯＶＲＡＬＴＭおよびＯＶＲＡＬＴＭ（エチニルエストラジオール／ノルゲストレル）、ＤＥＭＵＬＥＮＴＭ（エチニルエストラジオール／二酢酸エチノジオール）、ＮＯＲＩＮＹＬＴＭ、ＯＲＴＨＯ−ＮＯＶＵＭＴＭ、ＮＯＲＥＴＨＩＮＴＭ、ＧＥＮＯＲＡＴＭ、およびＮＥＬＯＶＡＴＭ（ノルエチンドロン／メストラノール）、ＤＥＳＯＧＥＮＴＭおよびＯＲＴＨＯ−ＣＥＰＴＴＭ（エチニルエストラジオール／デスゲストレル）、ＯＲＴＨＯ−ＣＹＣＬＥＮＴＭおよびＯＲＴＨＯ−ＴＲＩＣＹＣＬＥＮＴＭ（エチニルエストラジオール／ノルゲスチメート（ｎｏｒｇｅｓｔｉｍａｔｅ））、ＭＩＣＲＯＮＯＲＴＭおよびＮＯＲ−ＱＤＴＭ（ノルエチンドロン）、ならびにＯＶＲＥＴＴＥＴＭ（ノルゲストレル））。
内分泌物および／またはホルモン不均衡障害のためのさらなる処置としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：テストステロンエステル類（例えば、酢酸メテノロンおよびウンデカン酸テストステロン；非経口および経口アンドロゲン（例えば、ＴＥＳＴＯＪＥＣＴ−５０ＴＭ（テストステロン）、ＴＥＳＴＥＸＴＭ（プロピオン酸テストステロン）、ＤＥＬＡＴＥＳＴＲＹＬＴＭ（テストステロンエナンタート）、ＤＥＰＯ−ＴＥＳＴＯＳＴＥＲＯＮＥＴＭ（サイピオン酸テストステロン）、ＤＡＮＯＣＲＩＮＥＴＭ（ダナゾール）、ＨＡＬＯＴＥＳＴＩＮＴＭ（フルオキシメステロン）、ＯＲＥＴＯＮ ＭＥＴＨＹＬＴＭ、ＴＥＳＴＲＥＤＴＭおよびＶＩＲＩＬＯＮＴＭ（メチルテストステロン）、およびＯＸＡＮＤＲＩＮＴＭ（オキサンドロロン（ｏｘａｎｄｒｏｌｏｎｅ））；テストステロン経皮系（例えば、ＴＥＳＴＯＤＥＲＭＴＭ）；アンドロゲンレセプターアンタゴニストおよび５−α−レダクターゼインヒビター（例えば、ＡＮＤＲＯＣＵＲＴＭ）（酢酸シプロテロン）、ＥＵＬＥＸＩＮＴＭ（フルタミド）、およびＰＲＯＳＣＡＲＴＭ（フィナステリド）；副腎皮質刺激ホルモン調製物（例えば、ＣＯＲＴＲＯＳＹＮＴＭ（コシントロピン）；副腎皮質ステロイドおよびその合成アナログ（例えば、ＡＣＬＯＶＡＴＥＴＭ）（ジプロピオン酸アルクロメタゾン）、ＣＹＣＬＯＣＯＲＴＴＭ（アムシノニド）、ＢＥＣＬＯＶＥＮＴＴＭおよびＶＡＮＣＥＲＩＬＴＭ（ジプロピオン酸ベクロメタゾン）、ＣＥＬＥＳＴＯＮＥＴＭ（ベタメタゾン）、ＢＥＮＩＳＯＮＥＴＭおよびＵＴＩＣＯＲＴＴＭ（安息香酸ベタメタゾン）、ＤＩＰＲＯＳＯＮＥＴＭ（ジプロピオン酸ベタメタゾン）、ＣＥＬＥＳＴＯＮＥ ＰＨＯＳＰＨＡＴＥＴＭ（ベタメタゾンリン酸ナトリウム）、ＣＥＬＥＳＴＯＮＥ ＳＯＬＵＳＰＡＮＴＭ（ベタメタゾンリン酸ナトリウムおよび酢酸塩）、ＢＥＴＡ−ＶＡＬＴＭおよびＶＡＬＩＳＯＮＥＴＭ（吉草酸ベタメタゾン）、ＴＥＭＯＶＡＴＥＴＭ（プロピオン酸クロベタゾール）、ＣＬＯＤＥＲＭＴＭ（ピバル酸クロコルトロン）、ＣＯＲＴＥＦＴＭおよびＨＹＤＲＯＣＯＲＴＯＮＥＴＭ（コルチゾール（ヒドロコルチゾン））、ＨＹＤＲＯＣＯＲＴＯＮＥ ＡＣＥＴＡＴＥＴＭ（酢酸コルチゾール（ヒドロコルチゾン））、ＬＯＣＯＩＤＴＭ（酪酸コルチゾール（ヒドロコルチゾン））、ＨＹＤＲＯＣＯＲＴＯＮＥ ＰＨＯＳＰＨＡＴＥＴＭ（コルチゾール（ヒドロコルチゾン）リン酸ナトリウム）、Ａ−ＨＹＤＲＯＣＯＲＴＴＭおよびＳＯＬＵ ＣＯＲＴＥＦＴＭ（コルチゾール（ヒドロコルチゾン）コハク酸ナトリウム）、ＷＥＳＴＣＯＲＴＴＭ（吉草酸コルチゾール（ヒドロコルチゾン））、ＣＯＲＴＩＳＯＮＥ ＡＣＥＴＡＴＥＴＭ（酢酸コルチゾン）、ＤＥＳＯＷＥＮＴＭおよびＴＲＩＤＥＳＩＬＯＮＴＭ（デソニド）、ＴＯＰＩＣＯＲＴＴＭ（デスオキシメタゾン）、ＤＥＣＡＤＲＯＮＴＭ（デキサメタゾン）、ＤＥＣＡＤＲＯＮ ＬＡＴＭ（酢酸デキサメタゾン）、ＤＥＣＡＤＲＯＮ ＰＨＯＳＰＨＡＴＥＴＭおよびＨＥＸＡＤＲＯＬ ＰＨＯＳＰＨＡＴＥＴＭ（デキサメタゾンリン酸ナトリウム、ＦＬＯＲＯＮＥＴＭおよびＭＡＸＩＦＬＯＲＴＭ（ジ酢酸ジフロラゾン）、ＦＬＯＲＩＮＥＦ ＡＣＥＴＡＴＥＴＭ（酢酸フルドロコルチゾン）、ＡＥＲＯＢＩＤＴＭおよびＮＡＳＡＬＩＤＥＴＭ（フルニソリド）、ＦＬＵＯＮＩＤＴＭおよびＳＹＮＡＬＡＲＴＭ（フルオシノロンアセトニド）、ＬＩＤＥＸＴＭ（フルオシノニド）、ＦＬＵＯＲ−ＯＰＴＭおよびＦＭＬＴＭ（フルオロメトロン）、ＣＯＲＤＲＡＮＴＭ（フルランドレノリド）、ＨＡＬＯＧＴＭ（ハルシノニド）、ＨＭＳ ＬＩＺＵＩＦＩＬＭＴＭ（メドリゾン）、ＭＥＤＲＯＬＴＭ（メチルプレドニゾロン）、ＤＥＰＯ−ＭＥＤＲＯＬＴＭおよびＭＥＤＲＯＬ ＡＣＥＴＡＴＥＴＭ（酢酸メチルプレドニゾン）、Ａ−ＭＥＴＨＡＰＲＥＤＴＭおよびＳＯＬＵＭＥＤＲＯＬＴＭ（メチルプレドニゾロンコハク酸ナトリウム）、ＥＬＯＣＯＮＴＭ（モメタゾンフロエート（ｍｅｍｏｔａｓｏｎｅ ｆｕｒｏａｔｅ））、ＨＡＬＤＲＯＮＥＴＭ（酢酸パラメタゾン）、ＤＥＬＴＡ−ＣＯＲＴＥＦＴＭ（プレドニゾロン）、ＥＣＯＮＯＰＲＥＤＴＭ（酢酸プレドニゾロン）、ＨＹＤＥＬＴＲＡＳＯＬＴＭ（プレドニゾロンリン酸ナトリウム）、ＨＹＤＥＬＴＲＡ−Ｔ．Ｂ．ＡＴＭ（プレドニゾロンテブテート（ｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ ｔｅｂｕｔａｔｅ））、ＤＥＬＴＡＳＯＮＥＴＭ（プレドニゾン）、ＡＲＩＳＴＯＣＯＲＴＴＭおよびＫＥＮＡＣＯＲＴＴＭ（トリアムシノロン（ｔｒｉａｍｃｉｎｏｌｏｎｅ））、ＫＥＮＡＬＯＧＴＭ（トリアムシノロンアセトニド）、ＡＲＩＳＴＯＣＯＲＴＴＭおよびＫＥＮＡＣＯＲＴ ＤＩＡＣＥＴＡＴＥＴＭ（トリアムシノロンジアセテート）、ならびにＡＲＩＳＴＯＳＰＡＮＴＭ（トリアムシノロンヘキサアセトニド）；副腎皮質ステロイドの生合成および作用のインヒビター（例えば、ＣＹＴＡＤＲＥＮＴＭ（アミノグルテチミド）、ＮＩＺＯＲＡＬＴＭ（ケトコナゾール）、ＭＯＤＲＡＳＴＡＮＥＴＭ（トリロスタン）、およびＭＥＴＯＰＩＲＯＮＥＴＭ（メチラポン）；ウシ、ブタまたはヒトのインスリンまたはその混合物；インスリンアナログ；組換えヒトインスリン（例えば、ＨＵＭＵＬＩＮＴＭおよびＮＯＶＯＬＩＮＴＭ）；経口血糖降下剤（例えば、ＯＲＡＭＩＤＥＴＭおよびＯＲＩＮＡＳＥＴＭ（トルブタミド）、ＤＩＡＢＩＮＥＳＥＴＭ（クロルプロパミド）、ＴＯＬＡＭＩＤＥＴＭおよびＴＯＬＩＮＡＳＥＴＭ（トラザミド）、ＤＹＭＥＬＯＲＴＭ（アセトヘキサミド）、グリベンクラミド、ＭＩＣＲＯＮＡＳＥＴＭ、ＤＩＢＥＴＡＴＭおよびＧＬＹＮＡＳＥＴＭ（グリブリド）、ＧＬＵＣＯＴＲＯＬＴＭ（グリピジド）、およびＤＩＡＭＩＣＲＯＮＴＭ（グリクラジド）、ＧＬＵＣＯＰＨＡＧＥＴＭ（メトホルミン）、シグリタゾン、ピオグリタゾン、およびα−グルコシダーゼインヒビター；ウシまたはブタのグルカゴン；ソマトスタチン（例えば、ＳＡＮＤＯＳＴＡＴＩＮＴＭ（オクトレオチド）；ならびにジアゾキシド（例えば、ＰＲＯＧＬＹＣＥＭＴＭ（ジアゾキシド））。
１つの実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、子宮運動性障害のための処置と共に投与される。子宮運動性障害のための処置としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：エストロゲン薬剤（例えば、結合型エストロゲン（例えば、ＰＲＥＭＡＲＩＮ（登録商標）およびＥＳＴＲＡＴＡＢ（登録商標））、エストラジオール（例えば、ＣＬＩＭＡＲＡ（登録商標）およびＡＬＯＲＡ（登録商標））、エストロピペート（ｅｓｔｒｏｐｉｐａｔｅ）、およびクロロトリアニセン）；プロゲスチン薬剤（例えば、ＡＭＥＮ（登録商標）（メドロキシプロゲステロン）、ＭＩＣＲＯＮＯＲ（登録商標）（酢酸ノルエチンドロン（ｎｏｒｅｔｈｉｄｒｏｎｅ ａｃｅｔａｔｅ））、ＰＲＯＭＥＴＲＩＵＭ（登録商標）プロゲステロン、および酢酸メゲストロール）；ならびにエストロゲン／プロゲステロンの組合せ治療剤（例えば、結合型エストロゲン／メドロキシプロゲステロン（例えば、ＰＲＥＭＰＲＯＴＭおよびＰＲＥＭＰＨＡＳＥ（登録商標））および酢酸ノルエチンドロン／エチニルエストラジオール（例えば、ＦＥＭＨＲＴＴＭ）。
さらなる実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、鉄欠乏症および低色素性貧血を処置する際に有効な薬物と組み合わせて投与される。これらの薬物としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：硫酸第一鉄（硫酸鉄、ＦＥＯＳＯＬＴＭ）、フマル酸第一鉄（例えば、ＦＥＯＳＴＡＴＴＭ）、グルコン酸第一鉄（例えば、ＦＥＲＧＯＮＴＭ）、ポリサッカリド−鉄複合体（例えば、ＮＩＦＥＲＥＸＴＭ）、鉄デキストラン注射剤（例えば、ＩＮＦＥＤＴＭ）、硫酸第二銅、ピロキシジン、リボフラビン、ビタミンＢ１２、シアノコバラミン注射剤（例えば、ＲＥＤＩＳＯＬＴＭ、ＲＵＢＲＡＭＩＮ ＰＣＴＭ）、ヒドロキソコバラミン、葉酸（例えば、ＦＯＬＶＩＴＥＴＭ）、ロイコボリン（ホリニン酸、５−ＣＨＯＨ４ＰｔｅＧｌｕ、シトロボラム因子）またはＷＥＬＬＣＯＶＯＲＩＮ（ロイコボリンのカルシウム塩）、トランスフェリンまたはフェリチン。
特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、精神医学的障害を処置するために使用される薬剤と組み合わせて投与される。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと共に投与され得る精神医学的薬物としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：抗精神病薬（例えば、クロルプロマジン、クロルプロチキセン、クロザピン、フルフェナジン、ハロペリドール、ロキサピン、メソリダジン、モリンドン、オランザピン、ペルフェナジン、ピモジド、クエチアピン、リスペリドン、チオリダジン、チオチキセン、トリフルオペラジン、およびトリフルプロマジン）、抗躁薬（例えば、カルバマゼピン、ジバルプロックスナトリウム（ｄｉｖａｌｐｒｏｅｘ ｓｏｄｉｕｍ）、炭酸リチウム、およびクエン酸リチウム）、抗うつ薬（例えば、アミトリプチリン、アモキサピン、ブプロピオン（ｂｕｐｒｏｐｉｏｎ（アムフェブタモン））、シタロプラム、クロミプラミン、デシプラミン、ドキセピン、フルボキサミン、フルオキセチン、イミプラミン、イソカルボキサジド、マプロチリン、ミルタザピン、ネファゾドン、ノルトリプチリン、パロキセチン、フェネルジン、プロトリプチリン、セルトラリン、トラニルシプロミン、トラゾドン、トリミプラミン、およびベンラファキシン）、抗不安薬（例えば、アルプラゾラム、ブスピロン、クロルジアゼポキシド、クロラゼペート、ジアゼパム、ハラゼパム、ロラゼパム、オキサゼパム、およびプラゼパム）、ならびに興奮薬（例えば、ｄ−アンフェタミン、メチルフェニデート、およびペモリン）。
他の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、神経学的障害を処置するために使用される薬剤と組み合わせて投与される。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと共に投与され得る神経学的薬剤としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：鎮痙薬（例えば、カルバマゼピン、クロナゼパム、エトスクシミド、フェノバルビタール、フェニトイン、プリミドン、バルプロ酸、ジバルプロックスナトリウム、フェルバメート、ガバペンチン、ラモトリジン、レベチラセタム、オクスカルバゼピン、チアガビン（ｔｉａｇａｂｉｎｅ）、トピラマート、ゾニサミド、ジアゼパム、ロラゼパム、およびクロナゼパム）、抗振せん麻痺薬（例えば、レボドパ／カルビドパ、セレジリン、アマンチジン（ａｍａｎｔｉｄｉｎｅ）、ブロモクリプチン、ペルゴリド、ロピニロール、プラミペキソール、ベンズトロピン；ビペリデン；エトプロパジン；プロシクリジン；トリヘキシフェニジル、トルカポン（ｔｏｌｃａｐｏｎｅ））、およびＡＬＳ治療薬（例えば、リルゾール（ｒｉｌｕｚｏｌｅ））。
別の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、血管拡張剤および／またはカルシウムチャネル遮断薬と組み合わせて投与される。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと共に投与され得る血管拡張剤としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：アンギオテンシン変換酵素阻害薬（ＡＣＥ）インヒビター（例えば、パパベリン、イソクスプリン、ベナゼプリル、カプトプリル、シラザプリル、エナラプリル、エナラプリラート、フォシノプリル、リシノプリル、モエキシプリル、ペリンドプリル、キナプリル、ラミプリル、スピラプリル、トランドラプリル、およびニリドリン）ならびに硝酸塩（例えば、イソソルビドジニトレート、イソソルビジドモノニトレート、およびニトログリセリン）。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと組み合わせて投与され得るカルシウムチャネルブロッキング薬剤の例としては、アムロジピン、ベプリジル、フェロジピン、フルナリジン、イスラジピン、ニカルジピン、ニモジピン、およびベラパミルが挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、胃腸障害に対する処置と組み合わせて投与される。本発明のアルブミン癒合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと共に投与され得る胃腸障害の処置剤としては、Ｈ２ヒスタミンレセプターアンタゴニスト（例えば、ＴＡＧＡＭＥＴＴＭ（シメチジン）、ＺＡＮＴＡＣＴＭ（ラニチジン）、ＰＥＰＣＩＤＴＭ（ファモチジン）、およびＡＸＩＤＴＭ（ニザチジン））；Ｈ＋、Ｋ＋ＡＴＰａｓｅ（例えば、ＰＲＥＶＡＣＩＤＴＭ）およびＰＲＩＬＯＳＥＣＴＭ（オメプラゾール））；ビスマス化合物（例えば、ＰＥＰＴＯ−ＢＩＳＭＯＬＴＭ（ビスマスサブサリシレート）およびＤＥ−ＮＯＬ（ビスマスサブシトレートＴＭ））；種々の制酸剤；スクラルフェート；プロスタグランジンアナログ（例えば、ＣＹＴＯＴＥＣＴＭ（ミソプロストール））；ムスカリンコリンアンタゴニスト；緩下剤（例えば、表面緩下剤、刺激緩下剤、生理食塩水および浸透性緩下剤）；抗下痢剤（例えば、ＬＯＭＯＴＩＬＴＭ（ジフェノキシレート）、ＭＯＴＯＦＥＮＴＭ（ジフェノキシン）、およびＩＭＯＤＩＵＭＴＭ（ロペルアミド塩化水素））、ソマトスタチンの合成アナログ（例えば、ＳＡＮＤＯＳＴＡＴＩＮＴＭ（オクトレオチド）、抗嘔吐剤（例えば、ＺＯＦＲＡＮＴＭ（オンダンセトロン）、ＫＹＴＲＩＬＴＭ（グラニセトロン塩化水素）、トロピセトロン、ドラセトロン、メトクロプラミド、クロロプロマジン、ペルフェナジン、プロクロペラジン、プロメタジン、チエチルペラジン、トリフルプロマジン、ドンペリドン、ハロペリドール、ドロペリドール、トリメトベンザミド、デキサメサゾン、メチルプレドニソロン、ドロナビノール、およびナビロン）；Ｄ２アンタゴニスト（メトクロプラミド、トリメトベンザミドおよびクロロプロマジン）；胆汁塩；ケノデオキシコリン酸；ウルソデオキシコリン酸；および膵臓酵素調製物（例えば、膵臓および膵臓リパーゼ）が挙げられるが、これらに限定されない。
さらなる実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、他の治療レジメンまたは予防レジメン（例えば、放射線治療）と組み合わせて投与される。
本発明はまた、薬学的組成物（本発明のアルブミン融合タンパク質を含む）の１つ以上の成分で埋められる、１つ以上の内容物を含む薬学的パックまたはキットを提供する。このような容器に付随するものは、薬学的製品および生物学的製品の製造、使用または販売を制御する政府機関に指示された形態の注意書きであり得、この注意書きは、ヒト投与物の製造、使用または販売の機関による承認を反映する。
（遺伝子治療）
本発明のアルブミン融合タンパク質をコードする構築物は、遺伝子治療プロトコールの一部として使用され得、アルブミン融合タンパク質の治療有効投与量を送達し得る。核酸の、細胞へのインビボ導入に関する好ましいアプローチは、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードする核酸を含む、ウイルスベクターの使用による。ウイルスベクターを用いる細胞の導入は、標的細胞の大きな集団が、核酸を受け取り得るという利点を有する。
さらに、ウイルスベクター内にコードされる分子（例えば、ウイルスベクター内に含まれたｃＤＮＡとして）は、ウイルスベクター核酸を得た細胞内で効果的に発現される。
レトロウイルスベクターおよびアデノウイルスベクターは、アルブミン融合タンパク質をインビボでコードする外来性核酸分子の輸送のための組換え遺伝子送達系として使用され得る。これらのベクターは、細胞内への有効な核酸の送達を提供し、そして輸送された核酸は、宿主の染色体ＤＮＡに安定して組み込まれる。複製欠損レトロウイルスのみを生成する特異化細胞株（「パッケージ細胞」と名付けられた）の開発は、遺伝子治療に対する、レトロウイルスの有用性を高め、そして欠損レトロウイルスは、遺伝子治療の目的に対する、遺伝子輸送における使用に対し、特徴付けられる（例えば、Ｍｉｌｌｅｒ，（Ａ．Ｄ．（１９９０）Ｂｌｏｏｄ ７６：２７ １を参照のこと）。複製欠損レトロウイルスは、ビリオン（標準技術により、ヘルパーウイルスの使用を介して、標的細胞を感染させるために使用され得る）に閉じ込められ得る。組換えレトロウイルスを生成するため、およびインビボまたはインビトロで、このようなウイルスで細胞を感染させるプロトコールは、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら（編）Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，（１９８９），９．１０−９．１４章および他の標準的な実験室マニュアルにおいて見出され得る。
本発明で有用な、別のウイルス遺伝子送達系は、アデノウイルス由来ベクターを使用する。アデノウイルスゲノムは処理され得、その結果、目的の遺伝子産物をコードし、かつ発現するが、正常の溶解性ウイルスのライフサイクルにおいて複製する能力の観点では、非活性化されている。例えば、Ｂｅｒｋｎｅｒら，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ６：６１６（１９８８）；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１−４３４（１９９１）；およびＲｏｓｅｎｆｅｌｄら，Ｃｅｌｌ ６８：１４３−１５５（１９９２）を参照のこと。アデノウイルス株Ａｄ５型ｄ１３２４または他のアデノウイルス株（例えば、Ａｄ２、Ａｄ３、Ａｄ７など）に由来する適切なアデノウイルスベクターは、当業者に公知である。組換えアデノウイルスは、非分裂細胞に感染し得ない特定の環境において有利であり得、そして幅広い種類の細胞型（上皮細胞を含む（上に引用されたＲｏｓｅｎｆｅｌｄら、（１９９２））を感染するために使用され得る。さらに、ウイルス粒子は比較的安定かつ精製および濃縮のために修正可能であり、そして、上記のように、感染性のスペクトラムに影響するように、改変され得る。さらに、アデノウイルスＤＮＡ（およびそこに含まれる外来性のＤＮＡ）は、宿主細胞のゲノムに取り込まれないが、エピソームに残り、それにより、ＤＮＡが宿主ゲノム（例えば、レトロウイルス）中に組み込まれることを誘導する挿入突然変異誘発の結果として起り得る、可能性のある問題を避ける。しかし、大きな外因性ＤＮＡ（８キロベース）に対するアデノウイルスゲノムの保有能力は、他の遺伝子送達ベクターに関連する（Ｂｅｒｋｎｅｒら、上に引用される；Ｈａｊ−Ａｈｍａｎｄら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５７：２６７（１９８６））。
別の実施形態において、本発明の非ウイルス遺伝子送達は、標的化細胞により、被験核酸分子の吸収のためのエンドサイトーシス経路に関する。この型の例示的な遺伝子送達システムとしては、リポソーム由来系、ポリリジン結合体、および人工ウイルスエンベロープが挙げられる。代表的な実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードする核酸分子は、表面上に陽電荷を保有するリポソーム（例えば、リポフェクチン）中にトラップされ得、そして（必要に応じて）、標的組織の細胞表面抗原に対し、抗体でタグが付けられる（Ｍｉｚｕｎｏら（１９９２）Ｎｏ Ｓｈｉｎｋｅｉ Ｇｅｋａ ２０：５４７−５ ５ １；ＰＣＴ公開公報ＷＯ９１／０６３０９；日本特許出願１０４７３８１；および欧州特許公開公報ＥＰ−Ａ−４３０７５Ａ）。
本発明のアルブミン融合タンパク質をコードする遺伝子の遺伝子送達系は、任意の数の方法により、患者に導入され得る。例えば、遺伝子送達系の薬学的調製物は、全身に（例えば、静脈内注入により）導入され得、そして特定の標的細胞におけるタンパク質の特異的な変換が、遺伝子送達ビヒクル、レセプター遺伝子の発現を調節する転写制御配列に起因する、細胞型発現または組織型発現、あるいはそれらの組み合わせによって提供された。他の実施形態において、組換え遺伝子の初期送達は、確実に局在する動物に誘導することにより、より制限される。例えば、遺伝子送達ビヒクルは、カテーテル（米国特許第５，３２８，４７０を参照のこと）または定位注入（例えば、Ｃｈｅｎら（１９９４）ＰＮＡＳ ９１：３０５４−３０５７）により誘導され得る。遺伝子治療構築物の薬学的調製物は、受容可能な希釈剤中の遺伝子送達システムから本質的に成り得るか、または遺伝子送達ビヒクルが取り込まれる遅延放出マトリックスを含み得る。アルブミン融合タンパク質が、組換え細胞（例えば、レトロウイルスベクター）よりインタクトに生成される場合、薬学的調製物は、アルブミン融合タンパク質を生成する１つ以上の細胞を含み得る。
（さらなる遺伝子治療方法）
また本発明によって包含されるものは、障害、疾患および状態を処置または予防するための遺伝子治療方法である。この遺伝子治療方法は、本発明のアルブミン融合タンパク質の発現を達成するための、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡおよびアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ）配列の動物への導入に関する。この方法は、標的組織によるこの融合タンパク質の発現のために必要なプロモータおよび他の任意の遺伝因子と、作動可能に連結した本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを必要とする。このような遺伝子治療および送達技術は当該分野において公知である（例えば、本明細書中に参考として援用される、ＷＯ９０／１１０９２を参照のこと）。
従って、例えば、患者由来の細胞は、エキソビボで本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結したプロモーターを含むポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を用いて操作され得、次いで、操作された細胞は、本発明の融合タンパク質を用いて処置される患者に提供される。このような方法は、当該分野において周知である。例えば、Ｂｅｌｌｄｅｇｒｕｎ，Ａ．ら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８５：２０７−２１６（１９９３）；Ｆｅｒｒａｎｔｉｎｉ，Ｍ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５３：１１０７−１１１２（１９９３）；Ｆｅｒｒａｎｔｉｎｉ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １５３：４６０４−４６１５（１９９４）；Ｋａｉｄｏ，Ｔ．ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ６０：２２１−２２９（１９９５）；Ｏｇｕｒａ，Ｈ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５０：５１０２−５１０６（１９９０）；Ｓａｎｔｏｄｏｎａｔｏ，Ｌ．ら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ７：１−１０（１９９６）；Ｓａｎｔｏｄｏｎａｔｏ，Ｌ．ら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：１２４６−１２５５（１９９７）；およびＺｈａｎｇ，Ｊ．−Ｆ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：３１−３８（１９９６）を参照のこと。これらは、本明細書中に参考として援用される。１つの実施形態においては、操作される細胞は、動脈細胞である。この動脈細胞は、動脈、動脈の周囲の組織への直接的な注射を介して、またはカテーテル注入を介して患者に再導入され得る。
以下により詳細に考察されるように、このポリヌクレオチド構築物は、注射可能な物質を動物の細胞に送達する任意の方法（例えば、組織（心臓、筋肉、皮膚、肺、肝臓など）の間質空間への注射）により送達され得る。このポリヌクレオチド構築物は、薬学的に受容可能な液体または水性のキャリア中で送達され得る。
１つの実施形態においては、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、裸のポリヌクレオチドとして送達される。用語「裸の」ポリヌクレオチド、ＤＮＡまたはＲＮＡとは、細胞への侵入を補助し、促進し、または容易にするために作用するいかなる送達ビヒクル（ウイルス配列、ウイルス粒子、リポソーム処方物、リポフェクチンまたは沈殿剤などを含む）も含まない配列をいう。しかし、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、当業者に周知の方法により調製され得るリポソーム処方物中およびリポフェクチン処方物中などで送達され得る。このような方法は、例えば、米国特許第５，５９３，９７２号、同第５，５８９，４６６号および同第５，５８０，８５９号（これらは、本明細書中に参考として援用される）に記載される。
遺伝子治療方法において使用されるポリヌクレオチドベクター構築物は、好ましくは、宿主ゲノム中に組み込まれないかまたは複製を可能にする配列を含まない構築物である。
適切なベクターとしては、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能なｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１およびｐＳＧ；Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能なｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬ；ならびにＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能なｐＥＦ１／Ｖ５、ｐｃＤＮＡ３．１、およびｐＲｃ／ＣＭＶ２が挙げられる。他の適切なベクターは、当業者に容易に明らかである。
当業者に公知の任意の強力なプロモーターは、ポリヌクレオチド配列の発現を駆動するために用いられ得る。適切なプロモーターとしては、アデノウイルスプロモーター（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター）；または異種プロモーター（例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター）；ＲＳウイルス（ＲＳＶ）プロモーター；誘導性プロモーター（例えば、ＭＭＴプロモーター、メタロチオネインプロモーター）；熱ショックプロモーター；アルブミンプロモーター；ＡｐｏＡＩプロモーター；ヒトグロビンプロモーター；ウイルスチミジンキナーゼプロモーター（例えば、単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター）；レトロウイルスＬＴＲ；ｂ−アクチンプロモーター；およびヒト成長ホルモンプロモーターが挙げられる。このプロモーターはまた、本発明のポリヌクレオチドについてネイティブなプロモーターであり得る。
他の遺伝子治療技術とは異なり、裸の核酸配列を標的細胞に導入する１つの主要な利点は、その細胞におけるポリヌクレオチド合成の一過性の性質である。研究によって、非複製ＤＮＡ配列が細胞に導入されて、６ヶ月までの期間の間、所望のポリペプチドの産生を提供し得ることが示された。
ポリヌクレオチド構築物は、動物内の組織（筋肉、皮膚、脳、肺、肝臓、脾臓、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、血液、骨、軟骨、膵臓、腎臓、胆嚢、胃、腸、精巣、卵巣、子宮、直腸、神経系、眼、腺、および結合組織を包含する）の間隙空間に送達され得る。この組織の間隙空間は、器官組織の細網線維間の、細胞間の液体ムコ多糖類基質、血管または室の壁における弾性線維、線維性組織のコラーゲン線維、あるいは結合組織鞘性筋肉細胞（ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ ｔｉｓｓｕｅ ｅｎｓｈｅａｔｈｉｎｇ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌ）内または骨の裂孔中の同じ基質を包含する。これは、同様に、循環の血漿およびリンパチャンネルのリンパ液により占められた空間である。筋肉組織の間隙空間への送達は、以下で議論される理由のために好ましい。本発明のポリヌクレオチド構築物は、これらの細胞を含む組織への注射によって、好都合に送達され得る。本発明のポリヌクレオチド構築物は、好ましくは、分化した持続性の非分裂細胞に送達され、そしてその細胞において発現されるが、送達および発現は、非分化細胞または完全には分化していない細胞（例えば、血液の幹細胞または皮膚線維芽細胞）において達成され得る。インビボでの筋肉細胞は、ポリヌクレオチドを取り込み、そして発現する能力において、特に適格である。
裸の核酸配列注射のために、ＤＮＡまたはＲＮＡの有効投薬量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ体重から約５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲にある。好ましくは、この投薬量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇであり、そしてより好ましくは約０．０５ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇである。もちろん、当業者が認識するように、この投薬量は、注射の組織部位に応じて変化する。核酸配列の適切かつ有効な投薬量は、当業者によって容易に決定され得、そして処置される状態および投与経路に依存し得る。
好ましい投与経路は、組織の間隙空間への非経口注射経路による。しかし、他の非経口経路もまた用いられ得、これには、例えば、特に、肺または気管支の組織、咽喉または鼻の粘膜への送達のためのエアロゾル処方物の吸入が挙げられる。さらに、裸のＤＮＡ構築物が、血管形成術の間にこの手順において用いられるカテーテルによって動脈に送達され得る。
裸のポリヌクレオチドは、送達部位での直接の針注射、静脈内注射、局所投与、カテーテル注入、およびいわゆる「遺伝子銃」を含むがこれらに限定されない、当該分野で公知の任意の方法によって送達される。これらの送達方法は、当該分野で公知である。
この構築物はまた、ウイルス配列、ウイルス粒子、リポソーム処方物、リポフェクチン、沈殿剤などのような送達ビヒクルを用いて送達され得る。このような送達方法は、当該分野で公知である。
特定の実施形態において、ポリヌクレオチド構築物は、リポソーム調製物中で複合体化している。本発明にて使用するためのリポソーム調製物は、カチオン性（正に荷電した）、アニオン性（負に荷電した）および中性の調製物を包含する。しかしながら、カチオン性リポソームとポリアニオン性核酸との間で強固な荷電複合体を形成し得るので、カチオン性リポソームが特に好ましい。カチオン性リポソームは、機能的形態において、プラスミドＤＮＡ（本明細書中で参考として援用される、Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８７）８４：７４１３〜７４１６）；ｍＲＮＡ（本明細書中で参考として援用される、Ｍａｌｏｎｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８９）８６：６０７７〜６０８１）；および精製された転写因子（本明細書中で参考として援用される、Ｄｅｂｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９０）２６５：１０１８９〜１０１９２）の細胞内送達を媒介することが示されている。
カチオン性リポソームは容易に入手可能である。例えば、Ｎ［１−２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）リポソームは特に有用であり、そして商標ＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎのもとにＧＩＢＣＯ ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，Ｎ．Ｙ．（本明細書中で参考として援用される、Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８７）８４：７４１３〜７４１６をもまた参照のこと、）より入手可能である。他の市販のリポソームとしては、トランスフェクテース（ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｃｅ）（ＤＤＡＢ／ＤＯＰＥ）およびＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）が挙げられる。
当該分野で周知の技術を使用して、他のカチオン性リポソームを、容易に入手可能な物質より調製し得る。ＤＯＴＡＰ（１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン）リポソームの合成の記述に関して、例えばＰＣＴ公開番号ＷＯ９０／１１０９２（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。ＤＯＴＭＡリポソームの調製は文献にて説明されており、例えば、本明細書中で参考として援用される、Ｐ．Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４：７４１３〜７４１７を参照のこと。類似した方法を使用して、他のカチオン性脂質物質よりリポソームを調製し得る。
同様に、アニオン性リポソームおよび中性リポソームは、例えば、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，Ａｌａ．）から容易に入手可能であり、または容易に入手可能な物質を使用して簡単に調製され得る。そのような物質としてはとりわけ、ホスファチジル、コリン、コレステロール、ホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）が挙げられる。これらの物質はまた、ＤＯＴＭＡ出発物資およびＤＯＴＡＰ出発物質と適切な割合において混合され得る。これらの物質を使用してリポソームを生成する方法は、当該分野で周知である。
例えば、商業的に、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、およびジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を種々の組み合わせにおいて使用し、コレステロールを添加してもしなくても、従来のリポソームを生成し得る。従って、例えば、超音波処理バイアル中への窒素ガス流下で、各５０ｍｇのＤＯＰＧおよびＤＯＰＣを乾燥することにより、ＤＯＰＧ／ＤＯＰＣ小胞を調製し得る。このサンプルを一晩真空ポンプ下に置き、そして次の日、脱イオン水で水和する。次いで、浴を、１５ＥＣで循環させながら、最大設定にて、逆位カップ（浴タイプ）プローブを装備したＨｅａｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ モデル３５０超音波処理器を使用して、このサンプルを栓をしたバイアル中にて２時間超音波処理する。あるいは、負に荷電した小胞を、超音波処理なしで調製して多重膜小胞を生成し得るか、または核孔膜（ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ）を通して押し出すことにより別々の大きさの単膜小胞を生成し得る。他の方法は、当業者に公知でありそして利用可能である。
このリポソームとしては、多重膜小胞（ＭＬＶ）、小さな単膜小胞（ＳＵＶ）または大きな単膜小胞（ＬＵＶ）が挙げられ得、ＳＵＶが好ましい。当該分野で周知の方法を使用して、種々のリポソーム−核酸複合体が調製される。例えば、本明細書中で参考として援用される、Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９８３）、１０１：５１２〜５２７を参照のこと。例えば、核酸を含有するＭＬＶは、ガラスチューブの壁面にリン脂質の薄膜を堆積させ、そしてその後、カプセル化されるべき物質の溶液で水和することによって調製され得る。ＳＵＶはＭＬＶの長期超音波処理により調製され、単膜リポソームの均質集団を生成する。封入されるべき物質を、予め形成されたＭＬＶの懸濁液に添加し、次いで、超音波処理する。カチオン性脂質を含むリポソームを使用する場合、乾燥した脂質膜を、滅菌水または１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＮａＣｌのような等張性緩衝溶液のような適切な溶液中に再懸濁し、超音波処理し、次いで、予め形成されたリポソームをＤＮＡと直接混合する。正に荷電したリポソームのカチオン性ＤＮＡへの結合に起因して、リポソームおよびＤＮＡは非常に安定な複合体を形成する。ＳＵＶは、小核酸フラグメントを用いての用途を見出す。ＬＵＶは、当該分野で周知の多くの方法により調製される。一般に使用される方法としては、Ｃａ２＋−ＥＤＴＡキレート化（Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（１９７５）３９４：４８３；Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ（１９７９））１７：７７）；エーテル注入（Ｄｅａｍｅｒ，Ｄ．およびＢａｎｇｈａｍ，Ａ．、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（１９７６）４４３：６２９；Ｏｓｔｒｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｍ．（１９７７）７６：８３６；Ｆｒａｌｅｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７９）７６：３３４８）；界面活性剤透析（Ｅｎｏｃｈ，Ｈ．およびＳｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ，Ｐ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７９）７６：１４５）；および逆相エバポレーション（ＲＥＶ）（Ｆｒａｌｅｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８０）２５５：１０４３１；Ｓｚｏｋａ、Ｆ．およびＰａｐａｈａｄｊｏｐｕｏｌｏｓ，Ｄ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７８）７５：１４５；Ｓｃｈａｅｆｅｒ−Ｒｉｄｄｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８２）２１５：１６６）が挙げられ、これらの文献は本明細書中で参考として援用される。
一般に、ＤＮＡのリポソームに対する割合は約１０：１から約１：１０までである。好ましくは、その割合（ｒａｔｉｏｎ）は約５：１から約１：５までである。より好ましくは、その割合は約３：１から約１：３までである。さらにより好ましくは、その割合は約１：１である。
米国特許第５，６７６，９５４号（本明細書中で参考として援用される）はカチオン性リポソームキャリアと複合体化された遺伝物質のマウスへの注入について報告する。米国特許第４，８９７，３５５号、同第４，９４６，７８７号、同第５，０４９，３８６号、同第５，４５９，１２７号、同第５，５８９，４６６号、同第５，６９３，６２２号、同第５，５８０，８５９号、同第５，７０３，０５５号および国際公開第ＷＯ９４／９４６９号（これらは本明細書中で参考として援用される）は、ＤＮＡを細胞および哺乳動物にトランスフェクトする際に使用するためのカチオン性脂質を提供する。米国特許第５，５８９，４６６号、同第５，６９３，６２２号、同第５，５８０，８５９号、同第５，７０３，０５５号および国際公開第ＷＯ９４／９４６９号（これらは本明細書中で参考として援用される）は、ＤＮＡ−カチオン性脂質複合体を哺乳動物に送達する方法を提供する。
特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードする配列を含むＲＮＡを含むレトロウイルス粒子を使用して、エキソビボまたはインビボで細胞を操作する。レトロウイルスプラスミドベクターが由来し得るレトロウイルスとしては、モロニーマウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、ニワトリ白血病ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳癌ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。
このレトロウイルスプラスミドベクターを使用して、パッケージング細胞株を形質導入し、プロデューサー細胞株を形成する。トランスフェクトされ得るパッケージング細胞株の例としては、その全体が本明細書中で参考として援用される、Ｍｉｌｌｅｒ、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、１：５〜１４（１９９０）にて記載されるようなＰＥ５０１、ＰＡ３１７、Ｒ−２、Ｒ−ＡＭ、ＰＡ１２、Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−１９−１７−Ｈ２、ＲＣＲＥ、ＲＣＲＩＰ、ＧＰ＋Ｅ−８６、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２およびＤＡＮ細胞株が挙げられるが、これらに限定されない。このベクターは、当該分野で公知の任意の手段により、パッケージング細胞を形質導入し得る。そのような手段としては、エレクトロポレーション、リポソームの使用、およびＣａＰＯ４沈殿が挙げられるが、それらに限定されない。１つの代替法において、このレトロウイルスプラスミドベクターをリポソームにカプセル化し得るか、または脂質に結合し得て、次いで宿主に投与し得る。
このプロデューサー細胞株は、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む感染性レトロウイルスベクター粒子を産生する。次いで、そのようなレトロウイルスベクター粒子を使用して、インビトロまたはインビボのどちらかで、真核生物細胞を形質導入し得る。この形質導入された真核生物細胞は、本発明の融合タンパク質を発現する。
特定の他の実施形態において、アデノウイルスベクター中に含まれるポリヌクレオチドを用いて、エキソビボまたはインビボで細胞を操作する。アデノウイルスは、それが本発明の融合タンパク質をコードし、そして発現し、それと同時に通常の溶菌性ウイルス生活環にて複製するその能力に関して不活性化されるように操作され得る。アデノウイルス発現は、そのウイルスＤＮＡの宿主細胞染色体への組み込み無しに達成され、その結果、挿入性変異誘発についての心配が軽減される。さらに、アデノウイルスは、何年もの間、腸の生ワクチンとして優れた安全側面を伴って使用されている（Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ａ．Ｒ．ら（１９７４）、Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｄｉｓ．、１０９：２３３−２３８）。最終的に、アデノウイルス媒介性遺伝子移入が、コトンラットの肺へのα−１−アンチトリプシンおよびＣＦＴＲの移入を含む多くの例において実証されている（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，Ｍ．Ａ．ら（１９９１）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５２：４３１〜４３４；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら（１９９２）、Ｃｅｌｌ、６８：１４３〜１５５）。さらに、ヒト癌における原因物質としてアデノウイルスを確立しようとする広範な研究は、一様に否定的であった（Ｇｒｅｅｎ，Ｍ．ら（１９７９） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７６：６６０６）。
本発明において有用である適切なアデノウイルスベクターが、例えば、ＫｏｚａｒｓｋｙおよびＷｉｌｓｏｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌ． ３：４９９〜５０３（１９９３）；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｃｅｌｌ ６８：１４３〜１５５（１９９２）；Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔ．Ｔｈｅｒ． ４：７５９〜７６９（１９９３）；Ｙａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ． ７：３６２〜３６９（１９９４）；Ｗｉｌｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３６５：６９１〜６９２（１９９３）；および米国特許第５，６５２，２２４号に記載されており、これらの文献および特許は本明細書中で参考として援用される。例えば、アデノウイルスベクターＡｄ２が有用であり、そしてヒト２９３細胞にて増殖され得る。これらの細胞は、アデノウイルスのＥ１領域を含み、そして構成的にＥｌａおよびＥｌｂを発現し、このことは、このベクターから欠失している遺伝子の産物を提供することによって欠損アデノウイルスを補完する。Ａｄ２に加えて、他の多様なアデノウイルス（例えば、Ａｄ３、Ａｄ５、およびＡｄ７）もまた、本発明において有用である。
好ましくは、本発明において使用されるアデノウイルスは、複製欠損性である。複製欠損アデノウイルスは、感染性粒子を形成するために、ヘルパーウイルスおよび／またはパッケージング細胞株の助けを必要とする。得られたウイルスは、細胞に感染する能力があり、そしてプロモーターに作動可能に連結された目的のポリヌクレオチドを発現し得るが、ほとんどの細胞にて複製し得ない。複製欠損アデノウイルスは、次の遺伝子のすべてまたは一部のうちの１つ以上にて欠失され得る：Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ２ａまたはＬ１〜Ｌ５。
特定の他の実施形態において、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を使用して、エキソビボまたはインビボでこの細胞を操作する。ＡＡＶは、感染性粒子を生成するためにヘルパーウイルスを必要とする、天然に存在する欠損ウイルスである（Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７（１９９２））。ＡＡＶはまた、非分裂細胞の中にそのＤＮＡを組み込み得る数少ないウイルスの中の１つである。３００塩基対程度の小さいＡＡＶを含むベクターがパッケージされ得、そして組み込み得るが、外来性ＤＮＡのためのスペースは約４．５ｋｂに限られる。そのようなＡＡＶの生成および使用の方法は当該分野で公知である。例えば、米国特許第５，１３９，９４１号、同第５，１７３，４１４号、同第５，３５４，６７８号、同第５，４３６，１４６号、同第５，４７４，９３５号、同第５，４７８，７４５号および同第５，５８９，３７７号を参照のこと。
例えば、本発明において使用するために適切なＡＡＶベクターは、ＤＮＡ複製、キャプシド形成、および宿主細胞組み込みに必要な配列すべてを含む。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）において見出される方法のような、標準的クローニング方法を使用して、ポリヌクレオチド構築物を、このＡＡＶベクターに挿入する。次いで、リポフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿などを含む、任意の標準的技術を使用して、この組換えＡＡＶベクターを、ヘルパーウイルスに感染しているパッケージング細胞にトランスフェクトする。適切なヘルパーウイルスとしては、アデノウイルス、サイトメガロウイルス、ワクシニアウイルス、またはヘルペスウイルスが挙げられる。一旦パッケージング細胞がトランスフェクトおよび感染されると、それらはそのポリヌクレオチド構築物を含む感染性ＡＡＶウイルス粒子を生成する。次いで、エキソビボまたはインビボのいずれかで、これらのウイルス粒子を使用して真核生物細胞を形質導入する。この形質導入細胞は、そのゲノムに組み込まれたポリヌクレオチド構築物を含み、そして本発明の融合タンパク質を発現する。
遺伝子治療の別の方法は、相同組換え（例えば、米国特許第５，６４１，６７０号、１９９７年６月２４日発行；国際公開第ＷＯ９６／２９４１１号、１９９６年９月２６日公開；国際公開第ＷＯ９４／１２６５０号、１９９４年８月４日公開；Ｋｏｌｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８９３２〜８９３５（１９８９）；およびＺｉｊｌｓｔｒａら、Ｎａｔｕｒｅ ３４２：４３５〜４３８（１９８９）を参照のこと）を介して、異種制御領域および内在性ポリヌクレオチド配列（例えば、本発明のポリペプチドをコードしている配列）を作動可能に連結する工程を含む。この方法は、標的細胞中に存在しているが、通常はその細胞中で発現しないかまたは所望するよりも低いレベルで発現する、遺伝子の活性化を含む。
当該分野で既知の標準的技術を使用して、ポリヌクレオチド構築物を作製する。この構築物は、プロモーターを、そのプロモーターに隣接した標的化配列とともに含む。適切なプロモーターが、本明細書中に記載されている。標的化配列は、プロモーター−標的化配列と内在性配列との相同組換えを可能にするに十分にその内在性配列に対して相補的である。標的化配列は、所望される内在性ポリヌクレオチド配列の５’末端の十分近くに存在し、それゆえ、相同組換えに際して、そのプロモーターは、その内在性配列に作動可能に連結される。
このプロモーターおよび標的化配列は、ＰＣＲを使用して増幅され得る。好ましくは、この増幅されたプロモーターは、５’末端および３’末端に別の制限酵素部位を含む。好ましくは、第１の標的化配列の３’末端は、増幅されたプロモーターの５’末端と同じ制限酵素部位を含み、そして第２の標的化配列の５’末端は、増幅されたプロモーターの３’末端と同じ制限部位を含む。増幅されたプロモーターおよび標的化配列を消化し、そしてともに連結する。
裸のポリヌクレオチドとしてか、もしくは上記により詳細に記載されるようなリポソーム、ウイルス配列、ウイルス粒子、ウイルス全体、リポフェクション、沈殿剤などのようなトランスフェクション促進剤と一緒にかのいずれかで、このプロモーター−標的化配列構築物を細胞に送達する。直接針注射、静脈内注射、局所投与、カテーテル注入、粒子加速器などを含む任意の方法により、Ｐプロモーター−標的化配列を送達し得る。この方法を、下記により詳細に記載する。
プロモーター−標的化配列構築物は、細胞により取り込まれる。この構築物と内在性配列との間に相同組換えが起こり、その結果、内在性配列は、このプロモーターの制御下に配置される。次いで、このプロモーターは、内在性配列の発現を駆動する。
本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、そのタンパク質の分泌を促進する分泌シグナル配列を含む。代表的に、このシグナル配列は、コード領域の５’末端に向かってかまたは５’末端で発現される、そのポリヌクレオチドのコード領域に位置する。このシグナル配列は、目的のポリヌクレオチドに対して同種であってもよいしまたは異種であってもよく、そしてトランスフェクトされる細胞に対して同種であってもよいしまたは異種であってもよい。さらに、当該分野で公知の方法を使用して、このシグナル配列は化学合成され得る。
その投与形態によって、治療効果を提供するのに十分な量にて１つ以上の分子が発現される限り、上記のポリヌクレオチド構築物のうちのいずれかの任意の投与形態が使用され得る。これは、直接針注射、全身性注射、カテーテル注入、バイオリスティック（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）注射器、粒子加速器（すなわち、「遺伝子銃」）、ゲルフォームスポンジデポー（ｄｅｐｏｔ）、他の市販デポー（ｄｅｐｏｔ）物質、浸透圧ポンプ（例えば、Ａｌｚａミニポンプ）、経口用または坐剤用の固形（錠剤または丸剤）薬学的処方物、および手術中のデカンティング（ｄｅｃａｎｔｉｎｇ）または局所適用を含む。例えば、ラット肝臓およびラット脾臓へのリン酸カルシウム沈澱した裸のプラスミドの直接注射、または門脈へのタンパク質被覆プラスミドの直接注射は、ラット肝臓における外来遺伝子の遺伝子発現をもたらした（Ｋａｎｅｄａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４３：３７５（１９８９））。
局所投与の好ましい方法は、直接注射によるものである。好ましくは、送達ビヒクルと複合体を形成した本発明のアルブミン融合タンパク質は、動脈領域内部に直接注射により投与されるか、または動脈領域内部に局所投与される。動脈領域内部での組成物の局所投与とは、その組成物を動脈内に数センチメートル、好ましくは数ミリメートルで注射することを言う。
局所投与の別の方法は、本発明のポリヌクレオチド構築物を外科的創傷中または外科的創傷の周囲に接触させることである。例えば、患者は手術を経験し得、そしてこのポリヌクレオチド構築物がその創傷の内側の組織の表面上にコーティングされ得るか、またはこの構築物が、その創傷の内側の組織の領域に注入され得る。
全身投与に有用な治療組成物は、本発明の標的化された送達ビヒクルと複合体を形成した本発明の融合タンパク質を含む。全身投与で使用するために適切な送達ビヒクルは、特定部位に対してそのビヒクルを標的化するリガンドを含むリポソームを含む。特定の実施形態において、全身投与で使用するための適切な送達ビヒクルは、特定の部位にビヒクルを標的化するための本発明のアルブミン融合タンパク質を含むリポソームを含む。
全身投与の好ましい方法としては、静脈内注射、エアロゾル、経口および経皮（局所的）送達が挙げられる。当該分野で標準的な方法を使用して、静脈内注射が実行され得る。
当該分野で標準的な方法を使用して、エアロゾル送達もまた実行され得る（例えば、本明細書中で参考として援用される、Ｓｔｒｉｂｌｉｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １８９：１１２７７〜１１２８１（１９９２）を参照のこと）。動物の腸内の消化酵素による分解に耐える能力をもつキャリアに対して本発明のポリヌクレオチド構築物を複合体形成することにより、経口送達は実行され得る。そのようなキャリアの例としては、当該分野で公知であるもののような、プラスチックカプセルまたは錠剤が挙げられる。皮膚内へ通過可能な親油性試薬（例えば、ＤＭＳＯ）と本発明のポリヌクレオチド構築物を混合することによって、局所的送達は実行され得る。
送達される物質の有効量を決定することは、例えば、その物質の化学構造および生物学的活性、動物の年齢および体重、処置を必要とする正確な状態およびその重症度、ならびに投与経路を含む、多数の因子に依存し得る。処置の頻度は、１用量あたりの投与されるポリヌクレオチド構築物の量ならびに被験体の健康および病歴のような、多くの因子に依存する。正確な量、投薬回数および投薬のタイミングは、主治医または主治獣医により決定される。
本発明のアルブミン融合タンパク質は、任意の動物に、好ましくは哺乳動物および鳥類に投与され得る。好ましい哺乳動物としては、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ウシ、ウマおよびブタが挙げられ、特にヒトが好ましい。
（生物学的活性）
本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは１つ以上の生物学的活性を試験するアッセイにおいて使用され得る。あるアルブミン融合タンパク質および／またはアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが、ある特定のアッセイにおいて活性を示した場合、その融合タンパク質に対応する治療タンパク質はその生物学的活性に関連する疾患に関与している可能性がある。従って、その融合タンパク質は関連する疾患の治療に使用され得る。
好ましい実施形態において、本発明は、表１の「好ましい指標Ｙ」カラムに記載されている疾患および障害を治療する工程、患者に投与する工程を包含し、ここで、このような処置、予防、または改善は、治療タンパク質に一致する治療タンパク質部分を含む本発明のアルブミン融合タンパク質を所望し、この治療タンパク質は、表１の「治療タンパク質Ｘ」（表１の「好ましい指標Ｙ」カラムに列挙される処置されるべき疾患または障害同じぐらい新鮮な）において開示されている。
さらに好ましい実施形態において、本発明は、患者に対して投与する工程を含む、表１の「好ましい指標：Ｙ」カラムに特定の治療タンパク質に関して列挙される疾患または障害を処置する方法を包含し、ここで、このような治療、予防または改善は、治療タンパク質と一致する治療タンパク質部分を含む、本発明のアルブミン融合タンパク質が所望され、ここで、実施例における指標は、治療、予防または改善に有効な量で関連する。
配列番号Ｙをコードするポリヌクレオチドによりコードされる場合、アルブミン融合タンパク質が細胞より生成される本発明により特に企図される。ポリヌクレオチドが、細胞由来のコードタンパク質を発現するために使用される場合、細胞の天然分泌およびプロセシング工程は、表２のカラム４および／または１１にはっきりと列挙されるシグナル配列を欠くタンパク質を生成する。列挙されたシグナル配列の特定のアミノ酸配列は、本明細書中に示されるか、または当該分野で周知である。従って、本発明の最も好ましい実施形態は、細胞より誘導されたアルブミン融合タンパク質（これは、表２のカラム４および／または１１に示される、リーダー配列を欠く）を含む。最も好ましいポリオペプチドは、表２のカラム４および／または１１に列挙された特定のリーダー配列なしで、配列番号Ｙを含む。これらの２つの好ましい実施形態を含む組成物（薬学的組成物を含む）もまた、好ましい。これらのアルブミン融合タンパク質は、表１の「好ましい指標：Ｙカラムにおいて特定の治療タンパク質に関して列挙された疾患または障害の処置、予防、または改善のために、特に企図される。
好ましい実施形態において、本発明の融合タンパク質は、内分泌系の疾患および障害（例えば、以下のセクションの「内分泌障害」を参照のこと）、神経系の疾患および障害（例えば、以下のセクションの「神経学的障害」を参照のこと）、免疫系の疾患および障害（例えば、以下のセクションの「免疫活性」を参照のこと）、呼吸器系の疾患および障害（例えば、以下のセクションの「呼吸器障害」を参照のこと）、心臓血管系の疾患および障害（例えば、以下のセクションの「心臓血管障害」を参照のこと）、生殖系の疾患および障害（例えば、以下のセクションの「生殖系障害」を参照のこと）、消化系の疾患および障害（例えば、以下のセクションの「胃腸障害」を参照のこと）、細胞増殖に関連する疾患および／または障害（例えば、以下のセクションの「過剰増殖障害」を参照のこと）、ならびに／あるいは血液に関連する疾患および／または障害（例えば、以下のセクションの「血液関連障害」を参照のこと）に関連する疾患ならびに／あるいは障害の診断、予後、予防および／または処置において使用され得る。
ある種の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質は本発明の融合タンパク質の治療タンパク質の一部に対応する遺伝子が発現する組織に関連する疾病および／または疾患の診断および／または予後に使用しうる。
従って、本発明の融合タンパク質および本発明のアルブミン融合タンパク質をコード化するポリヌクレオチドは、以下の活性に関連する疾患および／または障害の診断、検知および／または治療に有用であり、これらの活性としては、ホルモン活性化、神経伝達活性、細胞シグナル伝達、細胞増殖、細胞分化、および細胞移動が挙げられるが、これらに限定されない。
より一般的には、本発明の融合タンパク質および本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは次の系に関連する疾病および／または疾患の診断、予後、予防および／または治療に利用され得る。
（免疫活性）
本発明のアルブミン融合タンパク質および本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、例えば、免疫細胞の増殖、分化もしくは動員（走化性）を活性化または阻害することによる、免疫系の疾患、障害および／または状態を処置、予防、診断および／または予後診断において有用であり得る。免疫細胞は、造血と呼ばれるプロセスを介して発生し、多能性幹細胞から骨髄性細胞（血小板、赤血球、好中球およびマクロファージ）およびリンパ系細胞（Ｂリンパ球およびＴリンパ球）を生成する。これらの免疫疾患、障害および／または状態の病因は、遺伝的、身体的（ｓｏｍａｔｉｃ）（例えば、癌およびいくつかの自己免疫性障害）、後天的（例えば、化学療法もしくは毒素による）または感染的であり得る。さらに、本発明の融合タンパク質および本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、特定の免疫系の疾患または障害のマーカーまたは検出物質（ｄｅｔｅｃｔｏｒ）として使用され得る。
別の実施形態において、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、免疫系の疾患および障害を処置するためおよび／または本発明のポリペプチドが発現される組織に関連する細胞によって生じた免疫応答を阻害または増強するために使用され得る。
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、免疫不全症（先天性または後天性の免疫不全症の両方を含む）の処置、予防、診断および／または予後に有用であり得る。免疫グロブリンレベル、Ｂ細胞機能および／またはＢ細胞数が減少するＢ細胞免疫不全症の例としては、以下が挙げられる：Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症（ブルートン病）、Ｘ連鎖小児性無ガンマグロブリン血症、過剰ＩｇＭを伴うＸ連鎖免疫不全症、過剰ＩｇＭを伴う非Ｘ連鎖免疫不全症、Ｘ連鎖リンパ球増殖症候群（ＸＬＰ）、無ガンマグロブリン血症（先天性および後天性無ガンマグロブリン血症を含む）、成体発症無ガンマグロブリン血症、後期発症無ガンマグロブリン血症、異常ガンマグロブリン血症、低ガンマグロブリン血症、不特定（ｕｎｓｐｅｃｉｆｅｄ）低ガンマグロブリン血症、劣性無ガンマグロブリン血症（スイス型）、選択的ＩｇＭ欠損症、選択的ＩｇＡ欠損症、選択的ＩｇＧサブクラス欠損症、ＩｇＧサブクラス欠損症（ＩｇＡ欠損症を伴うかまたは伴わない）、Ｉｇ欠損症（ＩｇＭの増加を伴う）、ＩｇＧおよびＩｇＡ欠損症（ＩｇＭの増加を伴う）、正常なＩｇまたはＩｇの上昇を伴う抗体欠損症、Ｉｇ重鎖欠乏、κ鎖欠損症、Ｂ細胞リンパ球増殖障害（ＢＬＰＤ）、分類不能型免疫不全（ＣＶＩＤ）、分類不能型免疫不全（ＣＶＩ）（後天性）、および一過性乳児低ガンマグロブリン血症。
特定の実施形態において、毛細血管拡張性運動失調または毛細血管拡張性運動失調に関連する状態が、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを使用して、処置、予防、診断および／または予後診断され得る。
Ｔ細胞および／またはＢ細胞の機能および／または数が減少される先天性の免疫不全症の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ディ・ジョージ異常、重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）（Ｘ連鎖ＳＣＩＤ、常染色体劣性ＳＣＩＤ、アデノシンデアミナーゼ欠損症、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）欠損症、クラスＩＩ ＭＨＣ欠損症（不全リンパ球症候群）、ヴィスコット−オールドリッチ症候群、および毛細血管拡張性運動失調を含むが、これらに限定されない）、胸腺発育不全、３次および４次咽頭嚢症候群、２２ｑ１１．２欠損、慢性粘膜皮膚カンジダ症、ナチュラルキラー細胞欠損症（ＮＫ）、特発性ＣＤ４＋Ｔリンパ球減少症、優性Ｔ細胞欠損（不特定）を伴う免疫不全症、および細胞媒介免疫の不特定免疫不全症。
特定の実施形態において、ディ・ジョージ異常またはディ・ジョージ異常に関連する状態が、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを使用して、処置、予防、診断および／または予後診断され得る。
本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを使用して処置、予防、診断および／または予後診断され得る、他の免疫不全症としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：慢性肉芽腫症、チェディアック−東病、ミエロペルオキシダーゼ欠損症、リンパ球グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ欠損症、Ｘ連鎖リンパ球増殖症候群（ＸＬＰ）、リンパ球接着欠損症、補体成分欠損症（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８および／またはＣ９欠損症を含む）、網様発育不全、胸腺リンパ形成不全、胸腺腫を伴う発育不全、重篤な先天性リンパ球減少症、免疫不全症を伴う形成異常、新生児好中球減少症、短肢小人症、およびＩｇによる免疫不全症を共存するネゼロフ症候群。
好ましい実施形態において、これらの免疫不全症および／または上記の免疫不全症に関連する状態は、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを使用して処置、予防、診断および／または予後診断され得る。
好ましい実施形態において、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、免疫不全個体間で免疫応答性をブーストするための薬剤として使用され得る。特定の実施形態において、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、Ｂ細胞および／またはＴ細胞免疫不全個体間で免疫応答性をブーストするための薬剤として使用され得る。
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、自己免疫障害の処置、予防、診断および／または予後診断において有用であり得る。多くの自己免疫障害は、免疫細胞によって自己物質を外来物質として不適切に認識されることによって生じる。この不適切な認識は、宿主組織の破壊を誘導する免疫応答を生じる。従って、免疫応答（特に、Ｔ細胞の増殖、分化または走化性）を阻害し得る本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの投与は、自己免疫障害の予防における効果的な治療であり得る。
本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドによって処置、予防、診断および／または予後診断され得る自己免疫疾患または障害としては、以下の１以上が挙げられるが、これらに限定されない：全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、強直性脊椎炎、多発性硬化症、自己免疫性甲状腺炎、橋本甲状腺病、自己免疫溶血性貧血、溶血性貧血、血小板減少症、自己免疫血小板減少症紫斑病、自己免疫新生児血小板減少症、特発性血小板減少症紫斑病、紫斑病（例えば、ヘーノホ−シェーンライン紫斑病）、自己免疫性血球減少症、グッドパスチャー症候群、尋常性天疱瘡、重症筋無力症、グレーブス病（甲状腺機能亢進症）、およびインスリン耐性糖尿病。
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで処置、予防および／または診断され得る自己免疫成分を有するであろうさらなる障害としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＩＩ型コラーゲン誘導性関節炎、抗リン脂質症候群、皮膚炎、アレルギー性脳脊髄炎、心筋炎、再発性多発性軟骨炎、リウマチ性心疾患、神経炎、ブドウ膜炎眼炎、多発性内分泌腺症、ライター病、スティッフマン症候群、自己免疫肺炎、自閉症、ギヤン−バレー症候群、インスリン依存性糖尿病、および自己免疫炎症性眼障害。
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで処置、予防、診断および／または予後診断され得る自己免疫成分を有するであろうさらなる障害としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：抗コラーゲン抗体を伴う強皮症（例えば、核小体および他の核抗体によってしばしば特徴付けられる）、混合結合組織病（例えば、可溶性核抗原（例えば、リボ核タンパク質）に対する抗体によってしばしば特徴付けられる）、多発性筋炎（例えば、非ヒストンＡＮＡによってしばしば特徴付けられる）、悪性貧血（例えば、抗壁細胞、ミクロソーム、および内因子抗体によってしばしば特徴付けられる）、特発性アジソン病（例えば、体液性および細胞媒介性の副腎細胞傷害性によってしばしば特徴付けられる）、不妊症（例えば、抗精子抗体によってしばしば特徴付けられる）、糸球体腎炎（例えば、糸球体基底膜抗体または免疫複合体によってしばしば特徴付けられる）、水疱性類天疱瘡（例えば、基底膜におけるＩｇＧおよび補体によってしばしば特徴付けられる）、シューグレン症候群（例えば、多組織抗体および／または特定の非ヒストンＡＮＡ（ＳＳ−Ｂ）によってしばしば特徴付けられる）、糖尿病（例えば、細胞媒介性および体液性島細胞抗体によってしばしば特徴付けられる）、およびアドレナリン作用性薬物耐性（ぜん息または嚢胞性線維症を伴うアドレナリン作用性薬物耐性を含む）（例えば、β−アドレナリン作用性レセプター抗体によってしばしば特徴付けられる）。
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで処置、予防、診断および／または予後診断され得る自己免疫成分を有するであろうさらなる障害としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：慢性活動性肝炎（例えば、平滑筋抗体によってしばしば特徴付けられる）、原発性胆汁性肝硬変（例えば、ミトコンドリア抗体によってしばしば特徴付けられる）、他の内分泌腺不全（例えば、いくつかの場合における特異的組織抗体によってしばしば特徴付けられる）、白斑（例えば、メラノサイト抗体によってしばしば特徴付けられる）、脈管炎（例えば、血管壁におけるＩｇおよび補体ならびに／または低い血清補体によってしばしば特徴付けられる）、ＭＩ後（例えば、心筋抗体によってしばしば特徴付けられる）、心臓切開症候群（例えば、心筋抗体によってしばしば特徴付けられる）、じんま疹（例えば、ＩｇＥに対するＩｇＧおよびＩｇＭ抗体によってしばしば特徴付けられる）、アトピー性皮膚炎（ＩｇＥに対するＩｇＧおよびＩｇＭ抗体によってしばしば特徴付けられる）、ぜん息（例えば、ＩｇＥに対するＩｇＧおよびＩｇＭ抗体によってしばしば特徴付けられる）、ならびに多くの他の炎症性、肉芽腫性、変性および萎縮性障害。
好ましい実施形態において、これらの自己免疫疾患および障害ならびに／または上記のこれらの疾患および障害に関連する障害および／または状態は、例えば、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを使用して、処置、予防、診断および／または予後診断される。特定の好ましい実施形態において、慢性関節リウマチは、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを使用して、処置、予防および／または診断される。
別の特定の好ましい実施形態において、全身性エリテマトーデスが、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて処置、予防、診断および／または予測される。別の特定の好ましい実施形態において、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、特発性血小板減少性紫斑病が処置、予防および／または診断される。
別の特定の好ましい実施形態において、ＩｇＡネフロパシーは、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、処置、予防および／または診断される。
好ましい実施形態において、自己免疫疾患および自己免疫障害ならびに／または上記の疾患および障害と関連する状態は、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、処置、予防、診断および／または予測される。
好ましい実施形態において、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、免疫抑制剤として使用される。
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、造血細胞の疾患、障害および／または状態の処置、予防、予測および／または診断において有用であり得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、白血球減少症、好中球減少症、貧血、および血小板減少症が挙げられるが、それらに限定されない、特定の（または多くの）型の造血細胞の減少に関連した疾患、障害および／または状態を処置または予防する試みにおいて、多能性幹細胞を含む造血細胞の分化および増殖を増加させるために用いられ得る。あるいは、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、組織球増殖症が挙げられるが、それらに限定されない、特定の（または多くの）型の造血細胞の減少に関連した疾患、障害および／または状態を処置または予防する試みにおいて、多能性幹細胞を含む造血細胞の分化および増殖を増加させるために用いられ得る。
アレルギー反応および状態（例えば、喘息（特にアレルギー性喘息）または他の呼吸障害）はまた、本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、処置、予防、診断および／または予測され得る。さらに、これらの分子は、アナフィラキシー、抗原性分子に対する過敏性、または血液型不適合を処置、予防、予測および／または診断するために用いられ得る。
さらに、本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ＩｇＥ媒介アレルギー応答を処置、予防、診断および／または予測するために使用され得る。このようなアレルギー反応としては、喘息、鼻炎および湿疹が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態において、本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、インビトロまたはインビボにおいてＩｇＥ濃度の調節に有用であり得る。
さらに、本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、炎症状態の診断、予測、予防および／または処置に使用される。例えば、本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、炎症応答に関与する細胞の活性化、増殖および／または分化を阻害し得るので、これらの分子を使用して、慢性および急性の両方の状態の炎症状態を、予防および処置し得る。このような炎症状態は以下を含むがこれらに限定されない。例えば、感染に関連する炎症（例えば、敗血症性ショック、敗血症、または全身炎症応答症候群）、虚血再灌流傷害に関連する炎症、内毒素致死に関連する炎症、補体媒介性超急性拒絶に関連する炎症、腎炎に関連する炎症、サイトカインまたはケモカインが誘導する肺傷害に関連する炎症、炎症性腸疾患に関連する炎症、クローン病に関連する炎症またはサイトカイン（例えば、ＴＮＦまたはＩＬ−１）の過剰生成から生じる炎症、呼吸器障害（例えば、喘息およびアレルギー）；胃腸障害（例えば、炎症性腸疾患）；癌（例えば、胃癌、卵巣癌、肺癌、膀胱癌、肝臓癌、および乳癌）；ＣＮＳ障害（例えば、多発性硬化症、虚血性脳損傷、および／または発作、外傷性脳損傷、神経変性性障害（例えば、パーキンソン病およびアルツハイマー病）、ＡＩＤＳ関連痴呆、およびプリオン病）；心血管障害（例えば、アテローム性動脈硬化症、心筋炎、心血管疾患、および心肺バイパス合併症）；ならびに炎症によって特徴付けられる多くのさらなる疾患、状態、および障害（例えば、肝炎、慢性関節リウマチ、痛風、外傷、膵炎、サルコイドーシス、皮膚炎、腎虚血再還流障害、グレーヴス病、全身性エリテマトーデス、真性糖尿病、および同種異系移植拒絶）。
炎症は、基礎的な防御機構なので、炎症障害は、実質的に体の任意の組織に影響を与え得る。従って、本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、以下を挙げられるがこれらに限定されない、組織特異的炎症障害の処置に使用される。副腎炎、肺胞炎、胆管炎、虫垂炎、亀頭炎、眼瞼炎、気管支炎、滑液胞炎、心臓炎、蜂巣炎、子宮管炎、胆嚢炎、声帯炎、蝸牛炎、大腸炎、結膜炎、膀胱炎、皮膚炎、憩室炎、脳炎、心内膜炎、食道炎、耳管炎、繊維組織炎、濾胞炎、胃炎、胃腸炎、歯肉炎、舌炎、肝脾炎、角膜炎、迷路炎、喉頭炎、リンパ管炎、乳腺炎、縦隔炎、髄膜炎、子宮炎、粘膜炎、心筋炎、筋炎、鼓膜炎、腎炎、神経炎、精巣炎、骨髄炎、耳炎、心膜炎、腱周囲炎、腹膜炎、喉頭炎、静脈炎、灰白髄炎、前立腺炎、歯髄炎、網膜炎、鼻炎、卵管炎、強膜炎、強膜脈絡膜炎、陰嚢炎、静脈洞炎、脊椎炎、脂肪組織炎、口内炎、滑膜炎、耳管炎、腱炎、扁桃炎、尿道炎、および膣炎。
特定の実施形態において、本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、器官移植拒絶および対宿主性移植片病の診断、予測、予防および／または処置に有用である。器官拒絶は、免疫応答を通した移植された組織の宿主免疫細胞破壊によって起こる。
同様に、免疫反応はまた、ＧＶＨＤに関するが、この場合、外来の移植された免疫細胞が、宿主組織を破壊する。本発明のポリペプチド、抗体、もしくはポリヌクレオチドおよび／またはそのアゴニストもしくはアンタゴニスト（免疫応答、特にＴ細胞の活性化、増殖、分化、または走化性を阻害する）は、器官拒絶またはＧＶＨＤを予防するのに有効な治療であり得る。特定の実施形態において、本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド（免疫応答、特にＴ細胞の活性化、増殖、分化、または走化性を阻害する）は、実験的アレルギー拒絶および超急性異種移植拒絶を予防するのに有効な治療であり得る。
他の実施形態において、本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、以下に挙げられるが、それらに限定されない、免疫複合疾患の診断、予測、予防および／または処置に有用であり得る。血清病、後連鎖球菌性糸球体腎炎（ｐｏｓｔ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ ｇｌｏｍｅｒｕｌｏｎｅｐｈｒｉｔｉｓ）、結節性多発動脈炎、および免疫複合誘導性脈管炎。
本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、感染性因子の処置、検出および／または予防に使用され得る。例えば、免疫応答を増大することによって、特にＢ細胞および／またはＴ細胞の増殖、活性化および／または分化を増大することによって、感染性疾患は、処置、検出、および／または予防され得る。免疫応答は、既存の免疫応答を増大するか、または新しい免疫応答を惹起するかのいずれかによって、増大され得る。あるいは、本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、免疫応答の必然的な惹起なしに、感染性因子（感染性因子の適用列挙の節などで述べる）を直接阻害し得る。
別の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、抗原に対する免疫応答を増大するワクチンアジュバントとして使用される。特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、腫瘍特異的な免疫応答を増大するアジュバントとして使用される。
別の特定の実施形態において、本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、抗ウイルス免疫応答を増大するためのアジュバントとして使用される。アジュバントとして本発明の組成物を用いて増強され得る抗ウイルス免疫応答としては、ウイルスおよび本明細書において記載されるかさもなければ当該分野で公知のウイルス関連疾患もしくは症状が挙げられる。特定の実施形態において、本発明の組成物は、以下：ＡＩＤＳ、髄膜炎、デング、ＥＢＶ、および肝炎（例えば、Ｂ型肝炎）からなる群より選択される、ウイルス、疾患または症状に対する免疫応答を増強するためのアジュバントとして用いられる。別の特定の実施形態において、本発明の組成物は、以下：ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、ＲＳウイルス、デング、ロタウイルス、日本脳炎、インフルエンザＡおよびＢ、パラインフルエンザ、麻疹、サイトメガロウイルス、狂犬病、Ｊｕｎｉｎウイルス、チクングニヤウイルス、リフトバレー熱、単純疱疹、および黄熱病からなる群より選択されるウイルス、疾患または症状に対する免疫応答を増強するアジュバントとして用いられる。
別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、抗細菌免疫応答または抗真菌免疫応答を増大するためのアジュバントとして使用される。アジュバントとして本発明の組成物を使用して増大され得る抗細菌免疫応答または抗真菌免疫応答としては、細菌または真菌、および本明細書中に記載されるか、または、さもなくば当該分野で公知の疾患または症状に関連する細菌または真菌が挙げられる。特定の実施形態において、本発明の組成物は、細菌または真菌、疾患、または症状（これは、破傷風、ジフテリア、ボツリスム、およびＢ型髄膜炎からなる群から選択される）に対する免疫応答を増大するためのアジュバントとして使用される。
別の特定の実施形態において、本発明の組成物は、細菌または真菌、疾患、または症状（これは、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｐａｒａｔｙｐｈｉ、Ｍｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｇｒｏｕｐ Ｂ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐｐ．、Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｅｎｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ Ｅ．ｃｏｌｉ、およびＢｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉからなる群から選択される）に対する免疫応答を増大するためのアジュバントとして使用される。
別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、抗寄生生物免疫応答を増大するためのアジュバントとして使用される。アジュバントとして本発明の組成物を使用して増大され得る抗寄生生物免疫応答としては、寄生生物、および本明細書中に記載されるかまたはさもなくば、当該分野で公知の疾患または症状に関連する寄生生物が挙げられる。特定の実施形態において、本発明の組成物は、寄生生物に対する免疫応答を増大するためのアジュバントとして使用される。別の特定の実施形態において、本発明の組成物は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ（マラリア）またはＬｅｉｓｈｍａｎｉａに対する免疫応答を増大するためのアジュバントとして使用される。
別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、例えば、単核性食細胞の漸増および活性化を予防することによって、珪胚症、サイコイドーシス、および特発性肺線維症を含む感染疾患の処置に使用され得る。
別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドに対する免疫介在応答を阻害するか、または増大する抗体の産生のための抗体として使用される。
１つの実施形態として、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、免疫系をブーストし、１つ以上の抗体（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、およびＩｇＥ）の量の増大を生じ、高い親和性の抗体産生および免疫グロブリンクラス転換（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＥ）を誘導し、および／または免疫応答を増大するための動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、ブタ、ミニブタ、ニワトリ、ラクダ、ヤギ、ウマ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、非ヒト霊長類、およびヒト、最も好ましくはヒト）に投与される。
別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、病原体に対するＢ細胞応答性の刺激物質として使用される。
別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、Ｔ細胞のアクチベーターとして使用される。
別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、免疫抑制性治療を受ける前の、個体の免疫状態を増大させる薬剤として使用される。
別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、より高い親和性抗体を誘導するための薬剤として使用される。
別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、血清免疫グロブリン濃度を増加するための薬剤として使用される。
別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、免疫無防備状態の個体の回復を促進するための薬剤として使用される。
別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、高齢の集団および新生児の間の免疫応答性をブーストするための薬剤として使用される。
別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、骨髄移植および／または他の移植（例えば、同種異系または外因性の器官移植）の前、間、または後の免疫系エンハンサーとして使用される。移植に関して、本発明の組成物は、移植の前、同時、および／または後に投与され得る。特定の実施形態において、本発明の組成物は、移植の後、Ｔ細胞集団の回復の開始前に投与される。別の特定の実施形態において、本発明の組成物は、移植の後、Ｔ細胞集団の回復の開始後であるが、Ｂ細胞集団の完全な回復の前に最初に投与される。
別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、Ｂ細胞機能の後天的欠損を有する個体間で免疫応答性をブーストするための薬剤として使用される。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを投与することによって寛解または処置され得る、Ｂ細胞機能の後天的欠損を生じる状態としては、ＨＩＶ感染、ＡＩＤＳ、骨髄移植、およびＢ細胞慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）が挙げられるが、これらに限定されない。
別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、一時的な免疫不全を有する個体間で免疫応答性をブーストするための薬剤として使用される。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを投与することによって寛解または処置され得る、一時的な免疫不全を生じる状態としては、ウイルス感染（例えば、インフルエンザ）からの回復、栄養失調に関連する状態、感染性単核細胞症からの回復、またはストレスに関連する状態、麻疹からの回復、輸血からの回復および手術からの回復が挙げられるが、これらに限定されない。
別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、単球、樹状細胞および／またはＢ細胞による抗原提示のレギュレーターとして使用される。１つの実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、インビトロまたはインビボで抗原提示を増強するかまたは抗原提示をアンタゴナイズする。さらに、関連する実施形態において、この抗原提示の増強またはアンタゴナイズは、抗腫瘍処置としてかまたは免疫系を調節するために有用であり得る。
別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、個体の免疫系を、ＴＨ１細胞性応答とは反対に、体液性応答（すなわち、ＴＨ２）の発生に指向するための薬剤として使用される。
別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、腫瘍増殖を誘導し、従って、腫瘍を抗腫瘍性薬剤に対してより感受性にするための手段として使用される。例えば、多発性骨髄腫は、緩慢な細胞分裂（ｄｉｖｉｄｉｎｇ）の疾患であり、従って、実質的に全ての抗腫瘍性レジメンに対して不応性である。これらの細胞は、より迅速に増殖させた場合、これらの感受性プロフィールは、おそらく変化するであろう。
別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ＡＩＤＳ、慢性リンパ球障害および／または分類不能性免疫不全症（Ｃｏｍｍｏｎ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｉｍｍｕｎｏｄｉｆｉｃｉｅｎｃｙ）のような病理におけるＢ細胞の産生の刺激因子として使用される。
別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、手術、外傷または遺伝的欠陥後のリンパ組織の生成および／または再生のための治療として使用される。別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、移植前の骨髄サンプルの前処理として使用される。
別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ＳＣＩＤ患者の間で観察されるような免疫不全症／免疫欠損を生じる遺伝性の障害のための遺伝子ベースの治療として使用される。
別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、単球に影響を及ぼす寄生生物疾患（例えば、リーシュマニア属（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ））に対して防御するために単球／マクロファージを活性化する手段として使用される。
別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドによって誘発される分泌サイトカインを調節する手段として使用される。
別の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、獣医学的医療に適用され得るような、本明細書中に記載の１つ以上の適用において使用される。
別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、外来因子または自己に対する種々の局面の免疫応答をブロックする手段として使用される。所望され得る特定の局面の免疫応答をブロックする疾患または状態の例としては、狼瘡および関節炎のような自己免疫障害、ならびに皮膚アレルギー、炎症、腸疾患、損傷に対する免疫応答性および病原体に関する疾患／障害が挙げられる。
別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、自己免疫疾患（例えば、特発性血小板減少性紫斑病、全身性エリテマトーデスおよびＭＳ）に関連するＢ細胞増殖およびＩｇ分泌を妨げるための治療として使用される。
別の特定の実施形態において、本発明のポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、および／または本発明のアルブミン融合タンパク質のアゴニストもしくはアンタゴニストおよび／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、内皮細胞におけるＢ細胞および／またはＴ細胞の遊走のインヒビターとして使用される。この活性は、組織構造または同属の応答を破壊し、そして例えば、免疫応答の破壊および敗血症のブロックにおいて有用である。
別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、未定量有意性の単一クローン性高ガンマグロブリン血症（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ｇａｍｍｏｐａｔｈｙ ｏｆ ｕｎｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ）（ＭＧＵＳ）、ヴァルデンストレーム疾患、関連する特発性単一クローン性高ガンマグロブリン血症、およびプラスマ細胞腫のような疾患における、慢性の高ガンマグロブリン血症事象のための治療として使用される。
別の特定の実施形態において、本発明の組成物は、例えば、特定の自己免疫疾患および慢性炎症疾患および感染性疾患における、マクロファージおよびその前駆体、ならびに好中球、好塩基球、Ｂリンパ球およびいくつかのＴ細胞サブセット（例えば、活性化Ｔ細胞およびＣＤ８細胞傷害性Ｔ細胞ならびにナチュラルキラー細胞）の、ポリペプチド走化性および活性化を阻害するために使用され得る。自己免疫疾患の例は、本明細書中に記載され、その自己免疫疾患の例としては、多発性硬化症およびインスリン依存性糖尿病が挙げられる。
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、例えば、好酸球の産生および遊走を妨げることによって、特発性好酸球増多症候群を処置するために使用され得る。
別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、相補的介在細胞溶解を増大する、または阻害するために使用される。
別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、抗体依存性細胞性細胞毒性を増大する、または阻害するために使用される。
別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、例えば、動脈壁における単球浸潤を妨げることによって、アテローム性動脈硬化症を処置するために使用され得る。
別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、成人呼吸促進症候群（ＡＲＤＳ）を処置するために使用され得る。
別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、創傷および組織の修復の刺激、新脈管形成の刺激、および／または血管またはリンパの疾患または障害の修復の刺激において有用であり得る。さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、粘膜表面の再生を刺激するために使用され得る。
特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、原発性または後天性の免疫不全、欠損性の血清免疫グロブリン産生、再発性の感染および／または免疫系機能不全によって特徴付けられる障害を診断、予測、処置および／または予防するために使用される。さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、関節、骨、皮膚および／または耳下腺の感染、血液由来の感染（例えば、敗血症、髄膜炎、敗血症性関節炎および／または骨髄炎）、自己免疫疾患（例えば、本明細書中に開示されるような自己免疫疾患）、炎症性障害、および悪性疾患、ならびに／あるいはこれらの感染、疾患および／または悪性疾患に関連する任意の疾患または障害または状態（ＣＶＩＤ、他の原発性免疫不全、ＨＩＶ疾患、ＣＬＬ、再発性気管支炎、静脈洞炎、中耳炎、結膜炎、肺炎、肝炎、髄膜炎、帯状ヘルペス（例えば、重篤な帯状ヘルペス）および／またはニューモシスティスを含むが、これらに限定されない）を処置または予防するために使用され得る。本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドによって予防、診断、予測、および／または処置され得る他の疾患および傷害として、ＨＩＶ感染、ＨＴＬＶ−ＢＬＶ感染、リンパ球減少、食細胞殺細菌機能不全、血小板減少、およびヘモグロビン尿症が挙げられるが、それらに限定されない。
別の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、分類不能型免疫不全疾患（Ｃｏｍｍｏｎ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｄｉｓｅａｓｅ）（「ＣＶＩＤ」；「後天性無ガンマグロブリン血症」および「後天性低ガンマグロブリン血症」としても公知である）またはこの疾患のサブセットを有する個体を、処置および／または診断するために使用される。
特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、免疫細胞あるいは、免疫組織関連癌または新生物を含む癌または新生物の診断、予測、予防および／または処置に使用され得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドによって、予防、診断または処置され得る癌または新生物の例として、以下に挙げられるが、それらに限定されない。急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病、プラスマ細胞腫、多発性骨髄腫、バーキットリンパ腫、ＥＢＶ変換性（ＥＢＶ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ）疾患、および／または本明細書中の他の箇所で「過剰増殖障害」と題される節に記載される疾患および障害。
別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ラージＢ細胞リンパ腫の細胞増殖を減少するための治療として使用される。
別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、慢性骨髄性白血病に関連するＢ細胞およびＩｇの関与を減少する手段として使用される。
特定の実施形態において、本発明の組成物は、Ｂ細胞免疫不全個体（例えば、部分的または完全な脾臓摘出術をうけた個体など）の間で免疫応答性をブーストするための因子として使用される。
（血液関連障害）
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを使用して、止血性活性（出血を止めること）または血栓崩壊活性（血餅形成）を調節し得る。例えば、止血活性または血栓崩壊活性を増大させることにより、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを使用し、血液凝固の疾患、障害および／または状態（例えば、無線維素原血症、因子欠損症、血友病）、血液血小板の疾患、障害および／または状態（例えば、血小板減少症）、あるいは外傷、手術または他の原因から生じる創傷を処置または予防し得る。あるいは、止血活性または血栓崩壊活性を減少させ得る本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを使用し、凝血を阻害または溶解し得る。心臓発作（梗塞）、発作（ｓｔｒｏｋｅ）または瘢痕の処置または予防において、これらの分子は重要であり得る。
特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、血栓症、動脈血栓症、静脈血栓症、血栓塞栓症、肺塞栓症、アテローム硬化症、心筋梗塞、一過性脳虚血発作、不安定狭心症の予防、診断、予測および／または処置に使用され得る。特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、伏在静脈移植片の閉塞の予防のため血管形成術の手順に伴い得るような処置した周囲で起きる血栓症（ｐｅｒｉｐｒｏｃｅｄｕｒａｌ ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ）の危険性を減らすために、非リウマチ性心房細動を含む心房細動を有する患者における発作の危険性を減らすために、人工心臓弁および／または増帽弁疾患に関連した塞栓症の危険性を減らすために、使用され得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドのための他の使用としては、体外装置（例えば、脈管内カニューレ、血液透析の患者における脈管アクセスシャント、血液透析機、および心肺バイパス機）における閉塞の予防が挙げられるが、それらに限定されない。
別の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドが発現している組織に関連する血液および／または血液形成器官の疾患および障害の予防、診断、予測および／または処置に使用され得る。
本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、造血活性（血球の形成）を調節に使用され得る。例えば、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、全ての、またはサブセットの血球（例えば、赤血球、リンパ球（Ｂ細胞またはＴ細胞）、脊髄細胞（例えば、好塩基球、好酸球、好中球、肥満細胞、マクロファージ）および血小板など）の量を増大するのに使用される。血球の量、または血球のサブセットの量を減少する能力は、以下に記載される貧血および白血球減少症の予防、検出、診断および／または処置に有用であり得る。あるいは、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、全ての、またはサブセットの血球（例えば、赤血球、リンパ球（Ｂ細胞またはＴ細胞）、脊髄細胞（例えば好塩基球、好酸球、好中球、肥満細胞、マクロファージ）および血小板）の量を減らすのに使用され得る。血球の量、または血球のサブセットの量を減少する能力は、白血球増加症（例えば、好酸球増加症など）の予防、検出、診断および／または処置に有用であり得る。
本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、血液悪液質を予防、処置、または診断するために使用され得る。
貧血は、赤血球の数またはその中のヘモグロビン（酸素を運ぶタンパク質）の量が正常を下回る、状態である。貧血は、過度の出血、減少した赤血球生成、または増加した赤血球細胞破壊（溶血）によって引き起こされ得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、貧血を処置、予防、および／または診断する際に有用であり得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドにより処置、予防または診断され得る貧血としては、鉄欠乏性貧血、血色素減少症、小球性貧血、萎黄病、遺伝性鉄芽球性貧血、特発性後天性鉄芽球性貧血、赤血球形成不全症、巨赤芽球性貧血（例えば、悪性貧血、（ビタミンＢ１２欠乏）および葉酸欠乏性貧血）、再生不良性貧血、溶血性貧血（例えば、自己免疫溶血性貧血、細血管異常性溶血性貧血、および発作性夜間血色素尿症）が、挙げられる。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、疾患に関連する貧血を処置、予防、および／または診断する際に有用であり得、この疾患に関連する貧血としては、全身性エリテマトーデスに関連する貧血、ガンに関連する貧血、リンパ腫に関連する貧血、慢性腎疾患に関連する貧血、および腫脹した脾臓に関連する貧血が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、薬物処置から生じる貧血を処置、予防および／または診断する際に有用であり得、そのような貧血は、例えば、メチルドパに関連する貧血、ダプソンに関連する貧血、および／またはサルファ剤に関連する貧血である。さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、異常な赤血球構造に関連する貧血を処置、予防、および／または診断する際に有用であり得、このような貧血としては、遺伝性球状赤血球、遺伝性楕円赤血球症、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ欠損、および鎌状赤血球貧血が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ヘモグロビン異常（例えば、鎌状赤血球貧血、ヘモグロビンＣ症、ヘモグロビンＳ−Ｃ症、およびヘモグロビンＥ症に関連した異常）を処置、予防、および／または診断するにおいて有用であり得る。さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、サラセミア（α−サラセミアおよびβ−サラセミアのメジャー形態およびマイナー形態を含むが、これらに限定されない）を診断、予後判定、予防および／または処置するにおいて有用であり得る。
別の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、血小板減少症（例えば、特発性血小板減少性紫斑病、および血栓性血小板減少性紫斑病）、ヴォン・ヴィレブランド病、遺伝性血小板障害（例えば、蓄積プール症（ｓｔｏｒａｇｅ ｐｏｏｌ ｄｉｓｅａｓｅ）（例えば、チェディアック−東病およびヘルマンスキー−パドラック症候群）、トロンボキサンＡ２機能不全、血小板無力症、およびベルナール−スーリエ症候群）、溶血性尿毒症症候群、血友病（ｈｅｍｏｐｈｅｌｉａ）（例えば、血友病Ａまたは第ＶＩＩ因子欠損、およびクリスマス病または第ＩＸ因子欠損）、遺伝性出血性毛細管拡張症（ランデュ−オースラー−ウェーバー症候群としてもまた公知）、アレルギー性紫斑病（ヘーノホ−シェーンライン紫斑病）および汎発性血管内凝固症候群が挙げられるが、これらに限定されない出血障害を診断、予後判定、予防および／または処置する際に有用であり得る。
血液の凝固時間に対する、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの効果は、全血部分トロンボプラスチン時間（ＰＴＴ）、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）、活性凝固時間（ＡＣＴ）、再石灰化活性凝固時間またはリー−ホワイト凝固時間が挙げられるが、これらに限定されない、当該分野で公知の任意の凝固試験を使用してモニターされ得る。
いくつかの疾患および種々の薬物は、血小板機能不全を引き起こし得る。従って、特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、後天性血小板機能不全（例えば、腎不全、白血病、多発性骨髄腫、肝臓の肝硬変、および全身性エリテマトーデスに関連する血小板機能不全、ならびに薬物処置（高用量でのアスピリン、チクロピジン、非ステロイド性抗炎症薬（関節炎、疼痛、および捻挫に使用される）、およびペニシリンによる処置を含む）に関連する血小板機能不全）を診断、予後判定、予防および／または処置する際に有用であり得る。
別の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、白血球数の増加もしくは減少によって特徴付けられるか、または白血球数の増加もしくは減少に関連する疾患および障害を診断、予後判定、予防および／または処置する際に有用であり得る。白血球減少症は、白血球数が、正常未満に減少する場合に生じる。白血球減少症としては、好中球減少症およびリンパ球減少症が挙げられるが、これらに限定されない。正常と比較した白血球数の増加は、白血球増加症として公知である。身体は、感染の間に、増加した数の白血球を産生する。従って、白血球増加症は、単純に、感染を反映する通常の生理的パラメーターであり得る。あるいは、白血球増加症は、損傷または癌のような他の疾患の指標であり得る。
白血球増加症（Ｌｅｏｋｏｃｙｔｏｓｅｓ）としては、好酸球増加症およびマクロファージの蓄積が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、白血球減少症を診断、予後判定、予防および／または処置する際に有用であり得る。他の特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、白血球増加症を診断、予後判定、予防および／または処置する際に有用であり得る。
白血球減少症は、すべての型の白血球が概して減少した状態であり得るか、または特定の型の白血球の特異的枯渇であり得る。従って、特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、好中球数の減少（好中球減少症として公知）を診断、予後判定、予防および／または処置する際に有用であり得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドによって診断、予後判定、予防および／または処置され得る好中球減少症としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：乳児遺伝性顆粒球減少症（ｉｎｆａｎｔｉｌｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｏｓｉｓ）、家族性好中球減少症、周期性好中球減少症、食事性欠損（例えば、ビタミンＢ１２欠損または葉酸欠損）から生じるかまたはこれに関連する好中球減少症、薬物処置（例えば、抗生物質レジメン（例えば、ペニシリン処置）、スルホンアミド処置、抗凝固薬処置、鎮痙薬物、抗甲状腺性薬物、および癌化学療法）から生じるかまたは薬物処置に関連した好中球減少症、およびいくつかの細菌感染またはウイルス感染、アレルギー性障害、自己免疫疾患、個体が膨張した脾臓を有し（例えば、フェルティ症候群、マラリア、およびサルコイドーシス）、そしていくつかの薬物処置レジメンを有する状態に関連して生じ得る好中球破壊の増加から生じる好中球減少症。
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ストレス、薬物処置（例えば、コルチコステロイドを用いる薬物処置、癌化学療法、および／または放射線治療）、ＡＩＤ感染、および／または他の疾患（例えば、癌、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、慢性感染、いくつかのウイルス感染、および／または遺伝性障害（例えば、ディ・ジョージ症候群、ヴィスコット−オールドリッチ症候群、重症複合型免疫不全、毛細血管拡張性運動失調）など）から生じるかまたはそれらに関連するリンパ球減少症を含むが、これに限定されないリンパ球減少症（Ｂリンパ球および／またはＴリンパ球の数の減少）を診断、予後判定、予防および／または処置する際に有用であり得る。
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ゴシェ病、ニーマン−ピック病、レテラー−ジーヴェ病、およびハンド−シュラー−クリスチャン病を含むが、これらに限定されない、マクロファージ数および／またはマクロファージ機能に関連した疾患および障害を診断、予後判定、予防および／または処置する際に有用であり得る。
別の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、特発性好酸球増多症候群、好酸球増多−筋痛症候群、およびハンド−シュラー−クリスチャン病を含むが、これらに限定されない、好酸球数および／または好酸球機能に関連した疾患および障害を診断、予後判定、予防および／または処置する際に有用であり得る。
さらに別の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、急性リンパ性（リンパ芽球性）白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性（骨髄性（ｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ）、骨髄性（ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ）、骨髄芽球性または骨髄単球性）白血病、慢性リンパ性白血病（例えば、Ｂ細胞白血病、Ｔ細胞白血病、セザリー症候群、およびヘアリーセル白血病）、慢性骨髄性（骨髄性（ｍｙｅｌｏｉｄ）、骨髄性（ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ）または顆粒球性）白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、および菌状息肉腫を含むが、これらに限定されない白血病およびリンパ腫を診断、予後判定、予防および／または処置するにおいて有用であり得る。
他の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、形質細胞異形成、単一クローン性高ガンマグロブリン血症、意義不明の単一クローン性高ガンマグロブリン血症（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ｇａｍｍｏｐａｔｈｉｅｓ ｏｆ ｕｎｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ）、多発性骨髄腫、マクログロブリン血症、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、クリオグロブリン血症、およびレーノー現象を含むが、これらに限定されないプラスマ細胞の疾患および障害を診断、予後判定、予防および／または処置する際に有用であり得る。
他の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、真性赤血球増加症、相対的赤血球増加症、二次的赤血球増加症（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｐｏｌｙｃｙｔｈｅｍｉａ）、骨髄線維症、急性骨髄線維症、原因不明骨髄様化生、血小板血症（一次的および二次的血小板血症の両方を含む）、および慢性骨髄性白血病を含むが、これらに限定されない、骨髄増殖性障害を処置、予防および／または診断する際に有用であり得る。
他の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、外科手術の前に、血球産生を増加させるための処置として有用であり得る。
他の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、好中球、食作用、スーパーオキシド産生、抗体依存性細胞傷害性、好酸球およびマクロファージの移動を増強するための薬剤として有用であり得る。
他の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、幹細胞フェレーシスの前に、循環系の幹細胞数を増加させるための薬剤として有用であり得る。別の特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、血小板フェレーシスの前に、循環系の幹細胞数を増加させるための薬剤として有用であり得る。
他の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、サイトカイン産生を増加させるための薬剤として有用であり得る。
他の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、一次造血障害を予防、診断および／または処置する際に有用であり得る。
（過剰増殖性障害）
特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、過剰増殖性障害（新生物を含む）を処置または検出するために使用され得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、直接的相互作用または間接的相互作用を通して、障害の増殖を阻害し得る。あるいは、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、過剰増殖性障害を阻害し得る他の細胞を増殖し得る。
例えば、免疫応答を増加させることによって、特に、過剰増殖性障害の抗原性の質を増加させることかまたはＴ細胞を増殖、分化、もしくは動員することによって、過剰増殖性障害は処置され得る。この免疫応答は、既存の免疫応答を増強することか、または新たな免疫応答を開始することのいずれかによって増加され得る。あるいは、免疫応答を減少させることはまた、過剰増殖性障害を処置する方法であり得る（例えば、化学療法剤）。
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドによって処置または検出され得る過剰増殖性障害の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：結腸、腹部、骨、乳房、消化器系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（腎上体、上皮小体、下垂体、精巣、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭頸部、神経（中枢および末梢）、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸郭、および泌尿性器管に位置づけられる新生物。
同様に、他の過剰増殖性障害もまた、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドによって処置または検出され得る。このような過剰増殖性障害の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：急性小児性リンパ芽球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌腫、成体（原発性（ｐｒｉｍａｒｙ））肝細胞癌、成体（原発性（ｐｒｉｍａｒｙ））肝臓癌、成体急性リンパ性白血病、成体急性骨髄性白血病、成体ホジキン病、成体ホジキンリンパ腫、成体リンパ性白血病、成体非ホジキンリンパ腫、成体原発性肝臓癌、成体軟組織肉腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、ＡＩＤＳ関連悪性疾患、肛門癌、星状細胞腫、胆管癌、膀胱癌、骨の癌、脳幹グリオーム、脳腫瘍、乳癌、腎盤および尿管の癌、中枢神経系（原発性）リンパ腫、中枢神経系リンパ腫、小脳星状細胞腫、大脳星状細胞腫、子宮頸癌、小児性（原発性）肝細胞癌、小児性（原発性）肝臓癌、小児性急性リンパ芽球性白血病、小児性急性骨髄性白血病、小児性脳幹グリオーム、小児性小脳星状細胞腫、小児性大脳星状細胞腫、小児性頭蓋外胚細胞腫瘍（Ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ Ｅｘｔｒａｃｒａｎｉａｌ Ｇｅｒｍ Ｃｅｌｌ Ｔｕｍｏｒ）、小児性ホジキン病、小児性ホジキンリンパ腫、小児性視床下部および視路グリオーム（Ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ Ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｉｃ ａｎｄ Ｖｉｓｕａｌ Ｐａｔｈｗａｙ Ｇｌｉｏｍａ）、小児性リンパ芽急性白血病、小児性髄芽腫、小児性非ホジキンリンパ腫、小児性松果体およびテント上未分化神経外胚葉性腫瘍、小児性原発性肝臓癌、小児性横紋筋肉腫、小児性軟組織肉腫、小児性視路および視床下部グリオーム、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、結腸癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、内分泌膵島細胞癌腫、子宮内膜癌、上衣腫、上皮癌、食道癌、ユーイング肉腫および関連の腫瘍、膵外分泌癌（Ｅｘｏｃｒｉｎｅ Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｃａｎｃｅｒ）、頭蓋外胚細胞腫瘍（Ｅｘｔｒａｃｒａｎｉａｌ Ｇｅｒｍ Ｃｅｌｌ Ｔｕｍｏｒ）、性腺外胚細胞腫瘍（Ｅｘｔｒａｇｏｎａｄａｌ Ｇｅｒｍ Ｃｅｌｌ Ｔｕｍｏｒ）、肝外胆管癌、眼の癌、雌性乳癌、ゴシェ病、胆嚢癌、胃癌、胃腸類癌腫、胃腸腫瘍、胚細胞腫瘍（Ｇｅｒｍ Ｃｅｌｌ Ｔｕｍｏｒ）、妊娠期栄養膜腫瘍（Ｇｅｓｔａｔｉｏｎａｌ Ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ Ｔｕｍｏｒ）、ヘアリーセル白血病、頭頸部の癌、肝細胞癌、ホジキン病、ホジキンリンパ腫、高ガンマグロブリン血症、下咽頭癌、腸の癌、眼内黒色腫、島細胞癌腫、島細胞膵臓癌、カポージ肉腫、腎臓癌、喉頭癌、口唇および口腔の癌、肝臓癌、肺癌、リンパ増殖性（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ）障害、マクログロブリン血症、雄性乳癌、悪性中皮腫、悪性胸腺腫、髄芽腫、黒色腫、中皮腫、転移性潜在性原発性扁平上皮頸癌（Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ Ｏｃｃｕｌｔ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｓｑｕａｍｏｕｓ Ｎｅｃｋ Ｃａｎｃｅｒ）、転移性原発性扁平上皮頸癌（Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｓｑｕａｍｏｕｓ Ｎｅｃｋ Ｃａｎｃｅｒ）、転移性扁平上皮頸癌（Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ Ｓｑｕａｍｏｕｓ Ｎｅｃｋ Ｃａｎｃｅｒ）、多発性骨髄腫、多発性骨髄腫／プラスマ細胞新生物、脊髄形成異常症候群、骨髄性白血病（Ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ Ｌｅｕｋｅｍｉａ）、骨髄性白血病（Ｍｙｅｌｏｉｄ Ｌｅｕｋｅｍｉａ）、骨髄増殖性障害、鼻腔および副鼻腔の癌、鼻咽頭癌、神経芽腫、妊娠期の非ホジキンリンパ腫、非黒色腫皮膚癌（Ｎｏｎｍｅｌａｎｏｍａ Ｓｋｉｎ Ｃａｎｃｅｒ）、非小細胞肺癌、潜在性原発性転移性扁平上皮頸癌（Ｏｃｃｕｌｔ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ Ｓｑｕａｍｏｕｓ Ｎｅｃｋ Ｃａｎｃｅｒ）、口腔咽頭癌、骨／悪性線維性肉腫、骨肉腫／悪性線維性組織球腫、骨の骨肉腫／悪性線維性組織球腫、卵巣上皮癌、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣境界型腫瘍、膵臓癌、パラプロテイン血症、紫斑、上皮小体癌、陰茎癌、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、プラスマ細胞新生物／多発性骨髄腫、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性肝臓癌、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌、腎盤および尿管の癌、網膜芽腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、サルコイドーシス肉腫、セザリー症候群、皮膚癌、小細胞肺癌、小腸癌、軟組織肉腫、扁平上皮頸癌、胃癌、テント上未分化神経外胚葉性および松果体腫瘍、Ｔ細胞リンパ腫、精巣癌、胸腺腫、甲状腺癌、腎盤および尿管の移行上皮癌、移行性の腎盤および尿管の癌、栄養膜腫瘍、尿管および腎盤細胞の癌、尿道癌、子宮癌、子宮肉腫、膣の癌、視路および視床下部グリオーム、外陰部の癌、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、ウィルムス腫、ならびに任意の他の過剰増殖性疾患、および新形成であって、上記に列挙された器官系に位置付けられるもの。
別の好ましい実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、前悪性状態の診断、予後判断、予防および／または処置、ならびに上に記載されるような障害を含むがこれらに限定されない腫瘍性状態または悪性状態への進行の予防を行う。このような使用が示されるのは、腫瘍性または癌（特に、ここで、過形成、化生、または最も特には形成異常からなる非腫瘍性の細胞増殖が起こっている（このような異常な増殖状態の総説について、ＲｏｂｂｉｎｓおよびＡｎｇｅｌｌ，１９７６，Ｂａｓｉｃ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，第２版，Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，６８〜７９頁）を参照）への前述の進行が知られるか、または疑われる状況においてである。
過形成は、制御された細胞増殖形態であり、これは、構造または機能において有意な変化を伴わない、組織または器官における細胞数の増大を含む。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、診断、予後判断、予防および／または処置し得る過形成障害としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：脈管濾胞性縦隔リンパ節増殖、好酸球増加随伴性血管類リンパ組織増殖症、非定型メラニン細胞過形成、基底細胞過形成、良性巨大リンパ節増殖、セメント質過形成、先天性副腎過形成、先天性脂腺増生症、嚢胞性増殖、乳房嚢胞性過形成、義歯性線維症、導管過形成、子宮内膜過形成、線維筋過形成、局所性上皮肥厚、歯肉増殖、炎症性線維性過形成、炎症性乳頭状過形成、血管内乳頭状内皮過形成、結節性前立腺過形成、結節性再生過形成、偽上皮腫性増殖、老年性脂腺増生症、ならびに疣贅性肥厚。
化生は、成体の細胞または完全に分化した細胞の１つの型が、別の型の成体の細胞に代わる制御された細胞増殖形態である。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、診断、予後判断、予防および／または処置し得る化生障害としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：原因不明骨髄様化生、アポクリン化生、非定型化性（ａｔｙｐｉｃａｌ ｍｅｔａｐｌａｓｉａ）、自己実質化生、結合組織化生、上皮化生、腸上皮化生、化生性貧血、変形骨化、異形成性ポリープ、骨髄化生、原発性骨髄様化生、二次性骨髄様化生、扁平化生、羊膜の扁平化生、および症候性骨髄化生。
形成異常は、頻繁に癌の前兆であり、そして主に上皮において見出される；形成異常は、非腫瘍性細胞増殖の最も乱れた形態であり、これは、個々の細胞の一様性の損失および細胞の構築的配向の喪失を含む。形成異常細胞は、しばしば異常に大きく、深く染色される核を有し、そして多態性を呈する。形成異常は、特徴的に慢性的な過敏または炎症の存在するところに生じる。本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、診断、予後判断、予防および／または処置し得る形成異常障害としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：無汗性外胚葉性形成異常、前後形成異常、窒息性胸郭形成異常、心房指（ａｔｒｉｏｄｉｇｉｔａｌ）形成異常、気管支肺異形成症、終脳形成異常、子宮頸部形成異常、軟骨外胚葉性形成異常、鎖骨頭蓋骨形成不全、先天性外胚葉性形成異常、頭蓋骨幹形成異常、頭蓋骨手根骨足根骨形成不全、頭蓋骨幹端形成異常、ぞうげ質異形成症、骨幹形成異常、外胚葉性形成異常、エナメル質形成異常、脳−眼球異形成（ｅｎｃｅｐｈａｌｏ−ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、足根骨肥大、多発性骨端形成異常、点状骨端形成異常、上皮形成異常、顔面指趾生殖器形成異常、家族性顎骨の線維性形成障害、家族性白色襞性形成異常、線維筋性形成異常、線維性骨形成異常、開花性骨異形成症、遺伝性腎性−網膜性形成異常（ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ ｒｅｎａｌ−ｒｅｔｉｎａｌ ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、発汗性外胚葉性形成異常、無汗性外胚葉形成異常症、リンパ球減少性胸腺形成異常、乳房形成異常、顎顔面形成異常、骨幹端形成異常、モンディーニ型内耳形成異常、単発性線維性形成異常、粘膜上皮形成異常、多発性骨端形成異常、眼耳脊椎形成異常、眼歯指形成異常、眼脊椎形成異常、歯牙形成不全、眼下顎四肢形成不全、根尖性セメント質異形成症、多発性線維性骨形成異常、偽軟骨発育不全脊椎骨端形成異常、網膜形成異常、中隔−視覚異形成症、脊椎骨端形成異常、および心室橈骨形成異常。
さらに本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、診断、予後判断、予防および／または処置し得る前腫瘍性障害としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：良性の異常増殖障害（例えば、良性腫瘍、線維嚢胞状態、組織肥大、腸ポリープ、結腸ポリープ、および食道形成異常）、白斑症、角化症、ボーエン病、農夫皮膚、日光口唇炎、および日光性角化症。
別の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、ポリペプチドが発現される組織に関する障害の診断および／または予後判断し得る。
別の実施形態において、本明細書において記載されるように毒素または放射性同位元素に結合した、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、本明細書中に記載されるものを含むが、これらに限定されない癌および新生物を処置し得る。さらなる好ましい実施形態において、本明細書において記載されるように毒素または放射性同位元素に結合した、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、急性骨髄性白血病を処置し得る。
さらに本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、アポトーシスに影響し得、したがって細胞生存の増大またはアポトーシスの阻害に関する多くの疾患を処置する際に有用である。例えば、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて診断、予後判断、予防、および／または処置し得る細胞生存の増大またはアポトーシスの阻害に関する疾患としては、以下が挙げられる：癌（例えば、濾胞性リンパ腫、ｐ５３変異を伴う癌、およびホルモン依存性腫瘍（以下を含むが、これらに限定されない：結腸癌、心臓性腫瘍（ｃａｒｄｉａｃ ｔｕｍｏｒｓ）、膵臓癌、黒色腫、網膜芽腫、神経膠芽腫、肺癌、腸癌、精巣癌、胃癌、神経芽腫、粘液腫、筋腫、リンパ腫、内皮腫、骨芽細胞腫、骨巨細胞腫、骨肉腫、軟骨肉腫、腺腫、乳癌、前立腺癌、カポージ肉腫、および卵巣癌））；自己免疫障害（例えば、多発性硬化症、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、胆汁性肝硬変、ベーチェット病（Ｂｅｈｃｅｔ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、クローン病、多発性筋炎、全身性エリテマトーデス、ならびに免疫性糸球体腎炎（ｉｍｍｕｎｅ−ｒｅｌａｔｅｄ ｇｌｏｍｅｒｕｌｏｎｅｐｈｒｉｔｉｓ）および慢性関節リウマチ）ならびにウイルス感染（例えば、ヘルペスウイルス、ポックスウイルスおよびアデノウイルス）炎症、対宿主性移植片病、急性移植片拒絶、ならびに慢性移植片拒絶。
好ましい実施形態において、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、癌（特に上に列挙したもの）の増殖、進行、および／または転移を阻害する。
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドによって、診断、予後判断、予防および／または処置され得る、細胞の生存を増大させることに関するさらなる疾患または状態としては、以下の進行および／または転移が挙げられるが、これらに限定されない：悪性腫瘍および関連する障害（例えば、白血病（急性白血病（例えば、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病（骨髄芽球性白血病、前骨髄性白血病（ｐｒｏｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ）、骨髄単球性白血病、単球性白血病および赤白血病を含む））、ならびに慢性白血病（例えば、慢性骨髄性白血病（顆粒球性白血病）および慢性リンパ性白血病）を含む）、真性赤血球増加、リンパ腫（例えば、ホジキン病および非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、Ｈ鎖病、および固形腫瘍（これらは、以下が挙げられるが、これらに限定されない：肉腫および癌（例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮性肉腫（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、リンパ管肉腫、リンパ管内皮腫、骨膜腫、中皮腫、ユーイング腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原生癌、腎細胞癌、ヘパトーム、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胎生期癌、ウィルムス腫、頚部癌、精巣癌、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫（ｅｍａｎｇｉｏｂｌａｓｔｏｍａ）、聴神経鞘腫（ａｃｏｕｓｔｉｃ ｎｅｕｒｏｍａ）、乏突起神経膠腫、髄膜腫（ｍｅｎａｎｇｉｏｍａ）、黒色腫、神経芽腫、ならびに網膜芽腫））。
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドによって、診断、予後判断、予防および／または処置され得る、アポトーシスを増大させることに関する疾患は、以下を含む：ＡＩＤＳ；神経変性障害（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、色素性網膜炎、小脳変性、および脳腫瘍または原発性関連疾患（ｐｒｉｏｒ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｄｉｓｅａｓｅ））；自己免疫障害（例えば、多発性硬化症、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、胆汁性肝硬変、ベーチェット病（Ｂｅｈｃｅｔ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、クローン病、多発性筋炎、全身性エリテマトーデス、および免疫関連糸球体腎炎（ｉｍｍｕｎｅ−ｒｅｌａｔｅｄ ｇｌｏｍｅｒｕｌｏｎｅｐｈｒｉｔｉｓ）および慢性関節リウマチ）、脊髄形成異常症候群（例えば、再生不良性貧血）、対宿主性移植片病、虚血性障害（例えば、心筋梗塞、発作、および再灌流障害に起因するもの）、肝障害（例えば、肝炎に関連する肝障害、虚血／再灌流障害、胆汁うっ滞（ｃｈｏｌｅｓｔｏｓｉｓ）（胆管障害）、および肝癌）；毒素誘導性肝疾患（例えば、アルコールに起因するもの）、敗血症性ショック、悪液質ならびに食欲不振。
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドによって、診断、予後判断、予防および／または処置され得る、過剰増殖性の疾患および／または障害としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：肝、腹部、骨、胸、消化器系、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、上皮小体、下垂体、精巣、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭、および首、神経系（中枢神経および末梢神経）、リンパ系、骨盤、皮膚、柔組織、脾臓、胸郭および泌尿性器路に位置する新生物。
同様に、他の過剰増殖障害もまた、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドによって、診断、予後判断、予防および／または処置され得る。このような過剰増殖障害の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：高ガンマグロブリン血症、リンパ球増殖障害、パラプロテイン血症、紫斑病、サルコイドーシス、セザリー症候群、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、ゴシェ病、組織球増殖症、および新形成に加えて、上に列挙した器官系に位置する他の任意の過剰増殖疾患。
別の好ましい実施形態は、本発明および／またはそのタンパク質融合物またはそのフラグメントを使用する遺伝子治療によって、異常な細胞分裂を阻害するために本発明のポリヌクレオチドを利用する。
従って、本発明は、異常に増殖する細胞中に、本発明のポリヌクレオチドを挿入することによって細胞増殖性障害を処置するための方法を提供し、ここでこのポリヌクレオチドは、その発現を抑制する。
本発明の別の実施形態は、個体において細胞増殖性障害を処置する方法を提供し、この方法は、異常に増殖する細胞（単数または複数）に本発明の１つ以上の活性遺伝子コピーを投与する工程を包含する。好ましい実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、そのポリヌクレオチドをコードするＤＮＡ配列を発現する際に有効な、組換え発現ベクターを含むＤＮＡ構築物である。本発明の別の好ましい実施形態において、本発明の融合タンパク質をコードするＤＮＡ構築物は、レトロウイルス（またはより好ましくは、アデノウイルスベクター）を利用して処置されるべき細胞中に、挿入される（Ｇ．Ｊ．Ｎａｂｅｌら、ＰＮＡＳ １９９９ ９６：３２４〜３２６（本明細書により参考として援用される）を参照のこと）。最も好ましい実施形態において、このウイルスベクターは欠損性であり、そして、非増殖細胞を形質転換せず、増殖する細胞のみ形質転換する。さらに、好ましい実施形態において、単独でか、他のポリヌクレオチドと組み合わせてか、または他のポリヌクレオチドと融合されてのいずれかで、増殖する細胞中に挿入される本発明のポリヌクレオチドは、その後、外部刺激（すなわち、磁気、特定の低分子、化学物質または薬物の投与など）を介して調節され得、この外部刺激は、コードされるタンパク質産物の発現を誘導するように、このポリヌクレオチドの上流のプロモーターに対して作用する。
このように、本発明の有益な治療効果は、この外部刺激に基づいて明らかに調節され（すなわち、本発明の発現を増加、減少または阻害し）得る。
本発明のポリヌクレオチドは、腫瘍性遺伝子または抗原の発現を抑制する際に有用であり得る。「腫瘍性遺伝子の発現を抑制する」とは、この遺伝子の転写の抑制、この遺伝子転写物（プレメッセージＲＮＡ）の破壊、スプライシングの阻害、メッセンジャーＲＮＡの破壊、タンパク質の翻訳後改変の妨害、タンパク質の崩壊、またはタンパク質の正常な機能の阻害を意図する。
異常に増殖している細胞への局所投与のために、本発明のポリヌクレオチドは、当業者に公知の任意の方法によって投与され得る。この方法には、トランスフェクション、エレクトロポレーション、細胞の微量注入、もしくはリポソームのようなビヒクル、リポフェクション、または裸のポリヌクレオチドとして、あるいは、本明細書全体を通して記載される任意の他の方法が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のポリヌクレオチドは、当業者に公知のレトロウイルスベクター（Ｇｉｌｂｏａ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４４：８４５（１９８２）；Ｈｏｃｋｅ，Ｎａｔｕｒｅ ３２０：２７５（１９８６）；Ｗｉｌｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：３０１４）、ワクシニアウイルス系（Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｙら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．５：３４０３（１９８５）、または他の効率的なＤＮＡ送達系（Ｙａｔｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ ３１３：８１２（１９８５））のような公知の遺伝子送達系（しかし、これらの限定されない）によって送達され得る。これらの参考文献は例示のみであり、そして本明細書中で参考として援用される。異常に増殖している細胞を特異的に送達またはトランスフェクトし、そして非分裂の細胞を残すために、当業者に公知のレトロウイルス、またはアデノウイルス（当該分野において記載され、そして本明細書中の他の箇所において記載されるような）送達系を利用することが好ましい。宿主ＤＮＡ複製は、レトロウイルスＤＮＡを組み込むために必要とされ、そしてレトロウイルスは、その生活環に必要とされるレトロウイルス遺伝子を欠損するので、自律複製し得ない。本発明のポリヌクレオチドのためにこのようなレトロウイルス送達系を利用することは、この遺伝子および構築物を異常に増殖している細胞へと標的化し、そして分裂していない正常細胞を残す。
本発明のポリヌクレオチドは、疾患部位に直接的に注射針をガイドするために使用される画像化デバイスを使用することによって、内部の器官、体腔などにおける細胞増殖性障害／疾患の部位に直接的に送達され得る。本発明のポリヌクレオチドはまた、外科的介入の時点で、疾患部位に投与され得る。
「細胞増殖性疾患」とは、良性であろうと悪性であろうと、細胞、細胞群、または組織の単一または複数の局所的異常増殖によって特徴付けられる、器官、腔、または身体部分のいずれか１つまたはいずれかの組み合わせに罹患する、ヒトまたは動物の任意の疾患または障害を意味する。
本発明のポリヌクレオチドの任意の量が、それらが処理された細胞の増殖に対して生物学的に阻害する効果を有する限り、投与され得る。さらに、同一部位に同時に、本発明の１より多くのポリヌクレオチドを投与することが可能である。「生物学的に阻害する」とは、部分的または全体的な増殖阻害、ならびに細胞の増殖または成長の速度減少を意味する。生物学的に阻害性の用量は、組織培養物中の標的の悪性細胞増殖または異常増殖の細胞増殖、動物および細胞培養物中の腫瘍増殖に対する本発明のポリヌクレオチドの効果を評価することによって、または当業者に公知の任意の他の方法によって、決定され得る。
さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、単独でか、タンパク質融合物としてか、または本明細書中の他の箇所に記載されるように直接的または間接的に他のポリペプチドと組み合わせるかのいずれかで、増殖性の細胞または組織の新脈管形成を阻害する際に有用である。最も好ましい実施形態では、この抗新脈管形成作用は、例えば、造血性腫瘍特異的細胞（例えば、腫瘍関連マクロファージ）の阻害を通して、間接的に達成され得る（Ｊｏｓｅｐｈ ＩＢら，Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ，９０（２１）：１６４８−５３（１９９８）（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、アポトーシスの誘導を通して増殖性の細胞または組織を阻害する際に有用であり得る。これらの融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、例えば、死ドメイン（ｄｅａｔｈ−ｄｏｍａｉｎ）レセプター（例えば、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）レセプター−１、ＣＤ９５（Ｆａｓ／ＡＰＯ−１）、ＴＮＦレセプター関連アポトーシス媒介性タンパク質（ＴＲＡＭＰ）およびＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）レセプター−１および−２（Ｓｃｈｕｌｚｅ−Ｏｓｔｈｏｆｆ Ｋら，Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２５４（３）：４３９−５９（１９９８）（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと））の活性化において、増殖性の細胞および組織のアポトーシスを誘導するように、直接的または間接的のいずれかで作用し得る。さらに、本発明の別の好ましい実施形態では、これらの融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、アポトーシスを活性化する他のタンパク質の活性化におけるような他の機構を通してか、あるいは単独または低分子薬物もしくはアジュバント（例えば、アポプトニン（ａｐｏｐｔｏｎｉｎ）、ガレクチン（ｇａｌｅｃｔｉｎ）、チオレドキシン、抗炎症性タンパク質（例えば、Ｍｕｔａｔ Ｒｅｓ ４００（１−２）：４４７−５５（１９９８），Ｍｅｄ Ｈｙｐｏｔｈｅｓｅｓ．５０（５）：４２３−３３（１９９８），Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ Ｉｎｔｅｒａｃｔ．Ａｐｒ ２４；１１１−１１２：２３−３４（１９９８），Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．７６（６）：４０２−１２（１９９８），Ｉｎｔ Ｊ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅａｃｔ；２０（１）：３−１５（１９９８）（これらはすべて、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと））と組み合わせてかのいずれかで、このタンパク質の発現を刺激することを通して、アポトーシスを誘導し得る。
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、増殖性細胞または組織の転移を阻害する際に有用である。阻害は、本明細書中他の箇所に記載されるように、これらのアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドを投与する工程の直接的結果として、または間接的に（例えば、転移を阻害することが公知のタンパク質（例えば、α４インテグリン）の発現を活性化する）生じ得る（例えば、本明細書中に参考として援用される、Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９８；２３１：１２５−４１を参照のこと）。本発明のこのような治療的影響は、単独で、または低分子薬物もしくはアジュバントと組み合わせてかのいずれかで達成され得る。
別の実施形態において、本発明は、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む組成物を、本発明のアルブミン融合タンパク質によって結合された、このタンパク質に結合する、またはこのタンパク質に関連するポリペプチドを発現する標的とされた細胞に送達する方法を提供する。本発明のアルブミン融合タンパク質は、異種ポリペプチド、異種核酸、毒素、またはプロドラッグと、疎水性、親水性、イオン性および／または共有結合的な相互作用を通じて結合され得る。
本発明のアルブミン融合タンパク質は、増殖性抗原および免疫原に対して、直接的（例えば、本発明のアルブミン融合タンパク質が「ワクチン接種」された場合、上記の抗原および免疫原に対して応答するように免疫応答を生じる）または間接的（例えば、免疫応答を増強することが公知のタンパク質（例えば、ケモカイン）の発現を活性化することにおいて）のいずれかで、増殖している細胞または組織の免疫原性および／または抗原性を増強する際に有用である。
（腎臓障害）
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを使用して、腎臓系の障害を、処置、予防、診断、および／または予後判定し得る。本発明の組成物を用いて診断、予後判定、予防、および／または処置され得る腎臓障害としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：腎不全、腎炎、腎臓の血管障害、代謝性腎臓障害および先天性腎臓障害、腎臓の尿障害、自己免疫障害、硬化症および壊死、電解質不均等、および腎臓癌。
本発明の組成物を用いて診断、予後判定、予防、および／または処置され得る腎疾患としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：急性腎不全、慢性腎不全、アテローム塞栓症、末期腎臓疾患、腎臓の炎症性疾患（例えば、急性糸球体腎炎、感染後糸球体腎炎、急速進行性糸球体腎炎、ネフローゼ症候群、膜性糸球体腎炎、家族性ネフローゼ症候群、膜性増殖性糸球体腎炎ＩおよびＩＩ、メサンギウム増殖性糸球体腎炎、慢性糸球体腎炎、急性尿細管間質性腎炎、慢性尿細管間質性腎炎、急性溶連菌感染後性糸球体腎炎（ＰＳＧＮ）、腎盂腎炎、ループス腎炎、慢性腎炎、間質性腎炎、および溶連菌感染後性糸球体腎炎）、腎臓の血管障害（例えば、腎感染、アテローム塞栓症性腎臓疾患、皮質壊死、悪性腎硬化症、腎静脈血栓症、腎貫流低下（ｒｅｎａｌ ｕｎｄｅｒｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）、腎性網膜症（ｒｅｎａｌ ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ）、腎虚血再灌流（ｒｅｎａｌ ｉｓｃｈｅｍｉａ−ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）、腎動脈塞栓症、および腎動脈狭窄）、そして尿管疾患に起因する腎障害（例えば、腎盂腎炎、水腎症、尿石症（腎結石症、腎石症）、逆流性腎症、尿管感染、尿閉（ｕｒｉｎａｒｙ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ）、および急性または慢性片側閉塞性尿路疾患）。
さらに、本発明の組成物を用いて、腎臓の代謝障害および先天性障害（例えば、尿毒症、腎アミロイドーシス、腎性骨形成異常症、尿細管性アシドーシス、腎性糖尿、腎原性尿崩症、シスチン尿症、ファンコーニ症候群、腎性くる病（ｒｅｎａｌ ｆｉｂｒｏｃｙｓｔｉｃ ｏｓｔｅｏｓｉｓ（ｒｅｎａｌ ｒｉｃｋｅｔｓ））、ハートナップ病、バーター症候群、リドル症候群、多発性嚢胞腎疾患、髄質嚢胞病、髄質海綿腎、アルポート症候群、爪−膝蓋骨症候群、先天性ネフローゼ症候群、クラッシュ症候群、馬蹄腎、糖尿病性ニューロパシー、腎原性尿崩症、鎮痛薬性腎症、腎結石、および膜性腎症）、ならびに腎臓の自己免疫障害（例えば、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、グッドパスチャー症候群、ＩｇＡ腎症、およびＩｇＭメサンギウム増殖性糸球体腎炎））を診断、予後判定、予防、および／または処置し得る。
本発明の組成物をまた用いて、以下を診断、予後判定、予防、および／または処置し得る：腎臓の硬化性障害または壊死性障害（例えば、糸球体硬化症、糖尿病性腎症、巣状分節状糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）、壊死性糸球体腎炎、および腎乳頭壊死）、腎臓の癌（例えば、腎腫、副腎腫、腎芽細胞腫、腎細胞癌、移行上皮癌、腎腺癌、扁平上皮癌、およびウィルムス腫）、ならびに電解質不均等（例えば、腎石灰、膿尿、水腫、水腎、蛋白尿、低ナトリウム血症、高ナトリウム血症、低カリウム血症、高カリウム血症、低カルシウム血症、高カルシウム血症、低リン酸血症、および高リン酸血症）。
本発明の組成物は、当該分野で公知である任意の方法を使用して投与され得、これらの方法としては、送達部位における直接的針注射、静脈内注射、局所投与、カテーテル注入、微粒子銃（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）注射、粒子加速器、ゲルフォームスポンジデポー、他の市販デポー物質、浸透圧ポンプ、経口または坐剤の固形薬学的処方物、手術中のデカンティングまたは局所適用、エアロゾル送達が挙げられるが、これらに限定されない。そのような方法は当該分野で公知である。本発明の組成物は、下記でより詳細に記載される、治療剤（Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）の一部として投与され得る。ポリヌクレオチドを送達する方法は本明細書中でより詳細に記載される。
（心臓血管障害）
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを使用して、四肢虚血のような末梢動脈疾患を含むが、これらに限定されない心臓血管障害を処置、予防、診断、および／または予後判定し得る。
心臓血管障害としては、動動脈瘻（ａｒｔｅｒｉｏ−ａｒｔｅｒｉａｌ ｆｉｓｔｕｌａ）、動静脈瘻、大脳動静脈先天異常、先天性心欠陥（ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ ｈｅａｒｔ ｄｅｆｅｃｔｓ）、肺動脈弁閉鎖症、およびシミター症候群のような心臓血管異常が挙げられるが、これらに限定されない。先天性心欠陥としては、大動脈縮窄（ａｏｒｔｉｃ ｏａｒｃｔａｔｉｏｎ）、三房心、冠状脈管奇形（ｃｏｒｏｎａｒｙ ｖｅｓｓｅｌ ａｎｏｍａｌｉｅｓ）、交差心、右胸心、開存性動脈管（ｐａｔｅｎｔ ｄｕｃｔｕｓ ａｒｔｅｒｉｏｓｕｓ）、エブスタイン奇形、アイゼンメンガー複合症、左心室発育不全症候群、左胸心、ファロー四徴症、大血管転位症、両大血管右室起始症、三尖弁閉鎖症、動脈管遺残、および心中隔欠損症（ｈｅａｒｔ ｓｅｐｔａｌ ｄｅｆｅｃｔｓ）（例えば、大動脈肺動脈中隔欠損症（ａｏｒｔｏｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｓｅｐｔａｌ ｄｅｆｅｃｔ）、心内膜床欠損症、リュタンバッシェ症候群、ファロー三徴症、心室心中隔欠損症（ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｈｅａｒｔ ｓｅｐｔａｌ ｄｅｆｅｃｔｓ））が挙げられるが、これらに限定されない。
心臓血管障害としてはまた、不整脈、カルチノイド心臓病、高心拍出量（ｈｉｇｈ ｃａｒｄｉａｃ ｏｕｔｐｕｔ）、低心拍出量（ｌｏｗ ｃａｒｄｉａｃ ｏｕｔｐｕｔ）、心タンポナーデ、心内膜炎（細菌性を含む）、心臓動脈瘤、心停止、うっ血性心不全、うっ血性心筋症、発作性呼吸困難、心臓水腫、心肥大、うっ血性心筋症、左心室肥大、右心室肥大、梗塞後心破裂（ｐｏｓｔ−ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ ｈｅａｒｔ ｒｕｐｔｕｒｅ）、心室中隔破裂、心臓弁疾患、心筋疾患、心筋虚血、心内膜液浸出、心外膜炎（梗塞性および結核性を含む）、気心膜症、心膜切開後症候群、右心疾患、リウマチ性心疾患、心室機能不全、充血、心臓血管妊娠合併症（ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｐｒｅｇｎａｎｃｙ ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、シミター症候群、心血管梅毒、および心血管結核（ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のような心臓病が挙げられるが、これらに限定されない。
不整脈としては、洞性不整脈、心房性細動、心房粗動、徐脈、期外収縮、アダムズ−ストークス症候群、脚ブロック、洞房ブロック、長ＱＴ症候群（ｌｏｎｇ ＱＴ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、副収縮、ローン−ギャノング−レヴァイン症候群、マヘーム型早期興奮症候群（Ｍａｈａｉｍ−ｔｙｐｅ ｐｒｅ−ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、ウルフ−パーキンソン−ホワイト症候群、洞不全症候群、頻拍、および心室性細動が挙げられるが、これらに限定されない。頻拍としては、発作性頻拍、上室性頻拍、心室固有調律促進、房室結節性再入頻拍（ａｔｒｉｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｎｏｄａｌ ｒｅｅｎｔｒｙ ｔａｃｈｙｃａｒｄｉａ）、異所心房性頻拍、異所接合部頻拍、洞房結節性再入頻拍（ｓｉｎｏａｔｒｉａｌ ｎｏｄａｌ ｒｅｅｎｔｒｙ ｔａｃｈｙｃａｒｄｉａ）、洞性頻拍、トルサード・ド・ポワント、および心室性頻拍が挙げられる。
心臓弁疾患としては、大動脈弁機能不全症、大動脈弁狭窄症、心雑音（ｈｅａｒ ｍｕｒｍｕｒｓ）、大動脈弁逸脱症、僧帽弁逸脱症、三尖弁逸脱症、僧帽弁機能不全、僧帽弁狭窄症、肺動脈弁閉鎖症、肺動脈弁機能不全、肺動脈弁狭窄症、三尖閉鎖症、三尖弁機能不全、および三尖弁狭窄症が挙げられる。
心筋疾患としては、アルコール性心筋症、うっ血性心筋症、肥大型心筋症、弁下部性大動脈狭搾症、弁下部性肺動脈狭搾症、拘束型心筋症、シャーガス心筋症、心内膜線維弾性症、心内膜心筋線維症、キーンズ症候群、心筋再灌流障害、および心筋炎が挙げられるが、これらに限定されない。
心筋性虚血としては、狭心症、冠動脈瘤、冠動脈硬化、冠動脈血栓症、冠動脈血管痙攣、心筋梗塞、および心筋気絶（ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｓｔｕｎｎｉｎｇ）のような冠動脈疾患が挙げられるが、これらに限定されない。
心臓血管疾患としてはまた、動脈瘤、血管形成異常、血管腫症、細菌性血管腫症状、ヒッペル−リンダラ疾患（Ｈｉｐｐｅｌ−Ｌｉｎｄａｕ Ｄｉｓｅａｓｅ）、クリペル−トルノネー−ウェーバー症候群、スタージ−ウェーバー症候群、血管運動神経性水腫、大動脈疾患、高安動脈炎、大動脈炎、ルリーシュ症候群、動脈閉塞疾患、動脈炎、動脈内膜炎（ｅｎａｒｔｅｒｉｔｉｓ）、結節性多発性動脈炎、脳血管障害、糖尿病性血管障害、糖尿病性網膜症、塞栓症、血栓症、先端紅痛症、痔、肝静脈閉塞障害、高血圧、低血圧、虚血、末梢血管疾患、静脈炎、肺静脈閉塞疾患、レーノー病、ＣＲＥＳＴ症候群、網膜静脈閉塞、シミター症候群、上大静脈症候群、毛細血管拡張症、毛細血管拡張性運動失調（ａｔａｃｉａ ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｓｉａ）、遺伝性出血性毛細管拡張症、精索静脈瘤、拡張蛇行静脈、静脈瘤性潰瘍、脈管炎、および静脈機能不全のような血管疾患が挙げられる。
動脈瘤としては、解離性動脈瘤、偽動脈瘤、感染した動脈瘤、破裂した動脈瘤、大動脈性動脈瘤、大脳性動脈瘤、冠動脈瘤、心動脈瘤、および腸骨性動脈瘤が挙げられるが、これらに限定されない。
動脈閉塞疾患としては、動脈硬化症、間欠性跛行、頸動脈狭窄症、線維筋性形成異常、腸間膜性血管閉塞、モヤモヤ病、腎動脈閉塞、網膜動脈閉塞、および閉塞性血栓性血管炎が挙げられるが、これらに限定されない。
脳血管障害としては、頸動脈疾患、脳のアミロイドアンギオパチー、大脳動脈瘤、大脳無酸素症、大脳動脈硬化、大脳動静脈先天異常、大脳動脈疾患、大脳の塞栓症および血栓症、頸動脈血栓症、洞血栓症、ヴァレンベルク症候群、大脳出血、硬膜上血腫、硬膜下血腫、クモ膜下出血（ｓｕｂａｒａｘｈｎｏｉｄ ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ）、大脳梗塞、大脳虚血（一過性を含む）、鎖骨下動脈盗血症候群、室周白軟化症（ｐｅｒｉｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｌｅｕｋｏｍａｌａｃｉａ）、血管性頭痛、群発性頭痛、片頭痛、および椎骨基部（ｖｅｒｔｅｂｒｏｂａｓｉｌａｒ）機能不全が挙げられるが、これらに限定されない。
塞栓症としては、空気塞栓症、羊水塞栓症、コレステロール塞栓症、爪先チアノーゼ症候群、脂肪塞栓症、肺動脈塞栓症、および血栓塞栓症が挙げられるが、これらに限定されない。血栓症としては、冠状動脈血栓症、肝静脈血栓症、網膜静脈閉塞、頸動脈血栓症、洞血栓症、ヴァレンベルク症候群、および血栓性静脈炎が挙げられるが、これらに限定されない。
虚血性障害としては、大脳虚血、虚血性大腸炎、仕切り症候群（ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、前仕切り症候群（ａｎｔｅｒｉｏｒ ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、心筋虚血、再灌流傷害、および末梢四肢虚血が挙げられるが、これらに限定されない。脈管炎としては、大動脈炎、動脈炎、ベーチェット（Ｂｅｈｃｅｔ）症候群、チャーグ−ストラウス症候群、粘膜皮膚リンパ節症候群、閉塞性血栓性血管炎、過敏性血管炎、シェーンライン−ヘーノホ紫斑病（Ｓｃｈｏｅｎｌｅｉｎ−Ｈｅｎｏｃｈ ｐｕｒｐｕｒａ）、アレルギー性皮膚血管炎およびヴェーゲナー肉芽腫症が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、当該分野で公知である任意の方法を使用して投与され得、これらの方法としては、送達部位における直接的針注射、静脈内注射、局所投与、カテーテル注入、微粒子銃（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）注射、粒子加速器、ゲルフォームスポンジデポー、他の市販デポー物質、浸透圧ポンプ、経口または坐剤の固形薬学的処方物、手術中のデカンティングまたは局所適用、エアロゾル送達が挙げられるが、これらに限定されない。そのような方法は当該分野で公知である。ポリヌクレオチドを送達する方法は本明細書中でより詳細に記載される。
（呼吸性障害）
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、呼吸系の疾患および／または障害の処置、予防、診断、および／または予後判定するために用いられ得る。
呼吸系の疾患および障害としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：鼻前庭炎、非アレルギー性鼻炎（例えば、急性鼻炎、慢性鼻炎、アトロピン様鼻炎、血管運動神経性鼻炎）、鼻ポリープ、および副鼻腔炎、若年性血管線維腫、鼻の癌および若年性乳頭腫、声帯ポリープ、声帯結節（歌手結節）、接触潰瘍、声帯麻痺、喉頭気腫、咽頭炎（例えば、ウイルス性および細菌性）、扁桃炎、扁桃蜂巣炎、副咽頭間隙膿瘍、喉頭炎、喉頭気腫、ならびに咽頭癌（例えば、鼻咽頭の癌、扁桃癌、咽頭癌）、肺癌（例えば、扁平上皮細胞腫、小細胞腫（燕麦細胞腫）、大細胞腫、および腺癌）、アレルギー性障害（好酸球性肺炎、過敏性肺炎（例えば、外因性アレルギー性肺胞炎、アレルギー性間質肺炎、有機塵埃塵肺症、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、喘息、ヴェーゲナー肉芽腫症（肉芽腫性脈管炎）、グッドパスチャー症候群））、肺炎（例えば、細菌肺炎（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（連鎖球菌肺炎）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ブドウ球菌肺炎）、グラム陰性細菌肺炎（例えば、ＫｌｅｂｓｉｅｌｌおよびＰｓｅｕｄｏｍａｓ ｓｐｐ．により引き起こされる）、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ肺炎、Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ肺炎、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ（レジオネラ性疾患）、ならびにＣｈｌａｍｙｄｉａ ｐｓｉｔｔａｃｉ（オウム病））、そしてウイルス肺炎（例えば、インフルエンザ、水痘（Ｃｈｉｃｋｅｎｐｏｘ）（水痘（ｖａｒｉｃｅｌｌａ））。
呼吸系のさらなる疾患および障害としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：細気管支炎、ポリオ、クループ、ＲＳウイルス感染、おたふくかぜ、伝染性紅斑（第五病）、小児バラ疹、進行性風疹汎脳炎、風疹、および亜急性硬化性汎脳炎）、真菌肺炎（例えば、ヒストプラスマ症、コクシジオイデス真菌症、ブラストミセス症、重篤に抑制される免疫系を有する人々における真菌感染（例えば、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓにより引き起こされるクリプトコックス症；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．により引き起こされるアスペルギルス症；Ｃａｎｄｉｄａにより引き起こされるカンジダ症；およびムコール菌症）、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ（ニューモシスティス肺炎）、異型肺炎（例えば、ＭｙｃｏｐｌａｓｍａおよびＣｈｌａｍｙｄｉａ ｓｐｐ．）、日和見感染性肺炎、院内感染肺炎、化学性肺炎、ならびに吸引性肺炎、胸膜疾患（例えば、胸膜炎、胸水、および気胸症（例えば、単純自発性気胸症、複雑自発性気胸症、緊張気胸症））、気道閉塞疾患（例えば、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、気腫、急性気管支炎または慢性気管支炎）、職業性肺疾患（例えば、珪肺症、黒色肺（炭坑夫塵肺症）、石綿肺症、ベリリウム症、職業性喘息、綿肺症、ならびに良性塵肺症）、浸潤性肺疾患（例えば、肺線維症（例えば、線維化肺胞炎、通常型間質性肺炎）、特発性肺線維症、剥離性間質性肺炎、リンパ球性間質性肺炎、原因不明性組織球増殖症（例えば、レテラー−ジーヴェ病、ハンド−シュラー−クリスチャン病、好酸球性肉芽腫）、特発性肺ヘモジデリン沈着、サルコイドーシスおよび肺胞蛋白症）、急性呼吸窮迫症候群（例えば、成人呼吸促進症候群とも呼ばれる）、水腫、肺動脈塞栓症、気管支炎（例えば、ウイルス性、細菌性）、気管支拡張症、無気肺、肺膿瘍（例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓまたはＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａによって引き起こされる）、そして嚢胞性線維症。
（抗新脈管形成活性）
新脈管形成の内因性の、刺激因子とインヒビターとの間の天然に存在する平衡は、阻害影響が優勢である平衡である。Ｒａｓｔｉｎｅｊａｄら、Ｃｅｌｌ ５６：３４５〜３５５（１９８９）。新生血管形成が正常な生理学的条件下において生じるまれな場合（例えば、創傷治癒、器官再生、胚発生、および雌性生殖プロセス）において、新脈管形成は、厳密に調節され、そして空間的および時間的に定められる。病的な新脈管形成の条件（例えば、固形腫瘍増殖を特徴付ける）の下において、これらの調節の制御はできない。調節されていない新脈管形成は病的になり、そして多くの新生物性疾患および非新生物性疾患の進行を維持する。多くの重篤な疾患は、固形腫瘍の増殖および転移、関節炎、いくつかの型の眼の障害および乾癬を含む、異常な新生血管形成により支配される。例えば、Ｍｏｓｅｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．９：６３０〜６３４（１９９１）；Ｆｏｌｋｍａｎら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３３３：１７５７〜１７６３（１９９５）；Ａｕｅｒｂａｃｈら、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．２９：４０１〜４１１（１９８５）；Ｆｏｌｋｍａｎ、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ＫｌｅｉｎおよびＷｅｉｎｈｏｕｓｅ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１７５〜２０３頁（１９８５）；Ｐａｔｚ、Ａｍ．Ｊ．Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ．９４：７１５〜７４３（１９８２）；およびＦｏｌｋｍａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２１：７１９〜７２５（１９８３）による概説を参照のこと。多くの病的状態において、新脈管形成のプロセスは、その疾患状態に寄与する。例えば、固形腫瘍の増殖が新脈管形成に依存することを示唆する有意なデータが蓄積されている。ＦｏｌｋｍａｎおよびＫｌａｇｓｂｒｕｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３５：４４２〜４４７（１９８７）。
本発明は、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの投与による新生血管形成に関連する疾患または障害の処置を提供する。本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストを用いて処置し得る悪性状態および転移性状態には、本明細書に記載の悪性疾患、固形腫瘍、および癌、ならびに当該分野で公知の他のもの（このような障害の総説については、Ｆｉｓｈｍａｎら、Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第２版、Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（１９８５）を参照のこと）が挙げられるが、これらに限定されない。従って、本発明は、新脈管形成関連疾患および／または障害の処置の方法を提供し、この方法は、治療有効量の、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、その処置の必要な個体に投与する工程を包含する。例えば、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、癌または腫瘍を治療的に処置するために、種々のさらなる方法で利用され得る。本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで処置され得る癌としては、前立腺癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、胃癌、膵臓癌、喉頭癌、食道癌、精巣癌、肝臓癌、耳下腺癌、胆管癌、結腸癌、直腸癌、頸部癌、子宮癌、子宮内膜癌、腎臓癌、膀胱癌、甲状腺癌を含む固形腫瘍；原発性腫瘍および転移；黒色腫；膠芽腫；カポージ肉腫；平滑筋肉腫；非小細胞肺癌；結腸直腸癌；進行性（ａｄｖａｎｃｅｄ）悪性疾患；および血液から生じる腫瘍（例えば、白血病）が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、皮膚癌、頭頸部腫瘍、乳房腫瘍およびカポージ肉腫のような癌を処置するために、局所送達され得る。
なお他の局面において、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、例えば膀胱内投与によって膀胱癌の表面形態を処置するために利用され得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、注射またはカテーテルを介して、腫瘍に直接的に、または腫瘍部位付近に送達され得る。当然のことながら、当業者が理解するように、適切な投与様式は、処置されるべき癌によって変化する。他の送達様式は本明細書中において議論される。
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、癌に加えて、他の障害（新脈管形成を含む）を処置する際に有用であり得る。これらの障害としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：良性腫瘍（例えば、血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ、および化膿性肉芽腫）；動脈硬化プラーク；眼の脈管形成疾患（例えば、糖尿病性網膜症、未熟網膜症、黄斑変性、角膜移植拒絶、血管新生緑内障、水晶体後線維増殖、ルベオーシス、網膜芽細胞腫、ブドウ膜炎（ｕｖｉｅｔｉｓ）および眼の翼状片（Ｐｔｅｒｙｇｉａ）（異常な血管増殖））；慢性関節リウマチ；乾癬；遅延型創傷治癒；子宮内膜症；脈管形成；顆粒化；過形成性瘢痕（ケロイド）；偽関節骨折；強皮症；トラコーマ；血管接着；心筋の新脈管形成；冠状側副枝（ｃｏｒｏｎａｒｙ ｃｏｌｌａｔｅｒａｌｓ）；大脳側副枝；動静脈奇形；虚血性四肢新脈管形成；オースラー−ウェーバー（Ｏｓｌｅｒ−Ｗｅｂｂｅｒ）症候群；プラーク新生血管形成；毛細血管拡張症；血友病性関節；血管線維腫；線維筋性形成異常；創傷顆粒化；クローン病；およびアテローム性動脈硬化症。
例えば、本発明の１つの局面において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを過形成性瘢痕またはケロイドに投与する工程を包含する、過形成性瘢痕およびケロイドを処置するための方法が提供される。
本発明の１つの実施形態において、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、過形成性瘢痕またはケロイドに、これらの病変の進行を妨げるために直接注射される。この治療は、過形成性瘢痕およびケロイド（例えば、やけど）の発生を生じることが知られている状態の予防処置において特に価値があり、そして好ましくは、増殖期が進行する時間（最初の傷害の約１４日後）を有した後であるが、過形成性瘢痕またはケロイドの発生の前に開始される。上述のように、本発明はまた、眼の新生血管形成疾患（例えば、角膜新生血管形成、血管新生緑内障、増殖性糖尿病網膜症、水晶体後線維増殖および黄斑変性を含む）を処置するための方法を提供する。
さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて処置され得る新生血管形成に関連する眼の障害としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：血管新生緑内障、糖尿病網膜症、網膜芽細胞腫、水晶体後線維増殖症、ブドウ膜炎、未熟網膜症、黄斑変性、角膜移植新生血管形成、ならびに他の眼の炎症性疾患、眼の腫瘍、および脈絡膜または虹彩の新生血管形成に関連する疾患。例えば、Ｗａｌｔｍａｎら、Ａｍ．Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｌ．８５：７０４〜７１０（１９７８）およびＧａｒｔｎｅｒら、Ｓｕｒｖ．Ｏｐｈｔｈａｌ．２２：２９１〜３１２（１９７８）による総説を参照のこと。
従って、本発明の１つの局面において、治療有効量の化合物（本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド）を患者に対して、血管の形成が阻害されるように角膜に投与する工程を包含する、角膜新生血管形成（角膜移植新生血管形成を含む）のような眼の新生血管形成疾患を処置するための方法が、提供される。簡潔には、角膜は、通常には血管を欠く組織である。しかし、特定の病的状態において、毛細血管は、縁の角膜周囲脈管叢から角膜に伸長し得る。角膜が血管化されるようになる場合、角膜はまた混濁されるようになり、患者の視力の衰えを生じる。角膜が完全に不透明になる（ｏｐａｃｉｔａｔｅ）場合に、視力喪失が完全になり得る。広範な種々の障害は、例えば、以下を含む角膜新生血管形成を生じ得る：角膜感染（例えば、トラコーマ、単純ヘルペス角膜炎、リーシュマニア症およびオンコセルカ症）、免疫学的プロセス（例えば、移植片拒絶およびスティーヴンズ−ジョンソン症候群）、アルカリやけど、外傷、炎症（任意の原因による）、毒性および栄養欠乏状態、ならびにコンタクトレンズを装着することの合併症として。
特に好ましい実施形態において、本発明は、生理食塩水（眼に用いる調製物において一般に使用される任意の保存剤および抗菌剤と組合せて）中で局所投与のために調製され得、そして点眼剤形態で投与され得る。溶液または懸濁液は、その純粋な形態で調製され得、そして１日に数回投与され得る。あるいは、上記のように調製される抗脈管形成組成物はまた、角膜に直接投与され得る。好ましい実施形態において、抗脈管形成組成物は、角膜に結合する粘膜接着性ポリマーとともに調製される。さらなる実施形態において、抗脈管形成因子または抗脈管形成組成物は、従来のステロイド治療に対する補助剤として利用され得る。局所治療はまた、脈管形成応答（例えば、化学的やけど）を誘導する高い可能性を有することが公知である角膜病変において予防的に有用であり得る。これらの場合において、処置（おそらくステロイドと組み合わせられる）は、その後の合併症を予防するのを補助するために直ちに開始され得る。
他の実施形態において、上記の化合物は、角膜支質に直接、顕微鏡の案内の下で眼科医によって注入され得る。好ましい注射部位は、個々の病巣の形態で変化し得るが、投与の目標は、脈管構造の前進している面に組成物を置くこと（すなわち、血管と正常な角膜との間に分散される）である。ほとんどの場合において、これは、前進している血管から角膜を「防御」するための縁周囲（ｐｅｒｉｌｉｍｂｉｃ）角膜注射を含む。この方法はまた、角膜新生血管形成を予防的に防ぐために、角膜傷害の直後に利用され得る。この状況において、この物質は、角膜病巣とその所望されない潜在的な血液供給の縁との間に分散して縁周囲角膜に注射され得る。このような方法はまた、類似の様式で、移植された角膜の毛細血管浸潤を予防するために利用され得る。徐放形態において、注入は、１年に２〜３回のみ必要とされ得る。ステロイドもまた、注入溶液に添加され、その注射自体から生じる炎症を低減し得る。
本発明の別の局面において、患者に、血管の形成を阻害するように、治療有効量の本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを眼に投与する工程を包含する、血管新生緑内障を処置するための方法が提供される。１つの実施形態において、化合物は、血管新生緑内障の早期形態を処置するために、眼に局所投与され得る。他の実施形態において、化合物は、前方角（ａｎｔｅｒｉｏｒ ｃｈａｍｂｅｒ ａｎｇｌｅ）の領域に注入によって移植され得る。他の実施形態において、化合物はまた、化合物が眼房水に連続的に放出されるように、任意の位置に置かれ得る。本発明の別の局面において、患者に、血管の形成が阻害されるように、治療有効量の本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを眼に投与する工程を包含する、増殖性糖尿病性網膜症を処置するための方法が提供される。
本発明の特に好ましい実施形態において、増殖性糖尿病性網膜症は、網膜における本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドポリヌクレオチド、ポリペプチド、アンタゴニストおよび／またはアゴニストの局所濃度を増加させるために、眼房水または硝子体への注入によって処置され得る。好ましくは、この処置は、光凝固を必要とする重篤な疾患の獲得の前に開始されるべきである。
本発明の別の局面において、血管の形成が阻害されるように、患者に、治療有効量の本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを眼に投与する工程を包含する、水晶体後線維増殖症を処置するための方法が、提供される。化合物は、硝子体内注射を介して、および／または眼内移植を介して局所投与され得る。
さらに、この本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで処置され得る障害としては、以下が挙げられるが、それらに限定されない：血管腫、関節炎、乾癬、血管線維腫、アテローム性プラーク、遅延型創傷治癒、顆粒化、血友病性関節、過形成性瘢痕、偽関節骨折、オースラー−ウェーバー（Ｏｓｌｅｒ−Ｗｅｂｅｒ）症候群、化膿性肉芽腫、強皮症、トラコーマ、および血管接着。
さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで処置、予防、診断、および／または予後判定され得る障害および／または状態としては、以下が挙げられるが、それらに限定されない：固形腫瘍、血液由来の（ｂｌｏｏｄ ｂｏｒｎ）腫瘍（例えば、白血病）、腫瘍転移、カポージ肉腫、良性腫瘍（例えば、血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ、および化膿性肉芽腫）、慢性関節リウマチ、乾癬、眼の脈管形成疾患（例えば、糖尿病性網膜症、未熟網膜症、黄斑変性、角膜移植拒絶、血管新生緑内障、水晶体後線維増殖症、ルベオーシス、網膜芽細胞腫、およびブドウ膜炎）、遅延型創傷治癒、子宮内膜症、脈管形成、顆粒化、過形成性瘢痕（ケロイド）、偽関節骨折、強皮症、トラコーマ、血管接着、心筋の新脈管形成、冠状側副枝（ｃｏｒｏｎａｒｙ ｃｏｌｌａｔｅｒａｌｓ）、大脳側副枝、動静脈奇形、虚血性四肢新脈管形成、オースラー−ウェーバー症候群、プラーク新生血管形成、毛細血管拡張症、血友病性関節、血管線維腫、線維筋性形成異常、創傷顆粒化、クローン病、アテローム性動脈硬化症、産児制限薬剤（月経を制御する、胎芽着床のために必要な血管新生を予防することによる）、病原性の結果（例えば、ネコ引っかき病（Ｒｏｃｈｅｌｅ ｍｉｎａｌｉａ ｑｕｉｎｔｏｓａ）、潰瘍（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）、バルトネラ症および細菌性血管腫症状）のような新脈管形成を有する疾患。
産児制限方法の１つの局面において、胎芽着床をブロックするに十分な化合物の量は、性交および受精が起こる前またはその後に投与され、従って産児制限の有効な方法、おそらく「事後用（ｍｏｒｎｉｎｇ ａｆｔｅｒ）」方法を提供する。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、月経を制御することにおいて使用され得るか、または子宮内膜症の処置における腹膜洗浄液として、もしくは腹膜移植のためのいずれかで投与され得る。
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、縫合（ｓｔｉｔｃｈ）肉芽腫を予防するために、外科縫合に組み込まれ得る。
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、広範な種々の外科手順において利用され得る。例えば、本発明の１つの局面において、組成物（例えば、スプレーまたはフィルムの形態において）は、悪性組織から正常な周囲の組織を分離するため、そして／または周囲の組織への疾患の広がりを予防するために、腫瘍の除去の前に、領域をコートまたはスプレーするために利用され得る。本発明の他の局面において、組成物（例えば、スプレーの形態において）は、腫瘍をコートするため、または所望の場所において新脈管形成を阻害するために、内視鏡手順を介して送達され得る。本発明のなお他の局面において、本発明の抗脈管形成組成物でコートされている外科メッシュが、外科メッシュが利用され得る任意の手順において利用され得る。例えば、本発明の１つの実施形態において、抗脈管形成組成物を有した外科メッシュレーデン（ｌａｄｅｎ）は、構造に対する支持を提供するため、そして一定の量の抗脈管形成因子を放出するために、腹部癌切除手術の間（例えば、結腸切除の後）に利用され得る。
本発明のさらなる局面において、癌の局所的再発およびその部位での新しい血管の形成が阻害されるように、切除後に本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを腫瘍の切除縁に投与する工程を包含する、腫瘍切除部位を処置するための方法が提供される。本発明の１つの実施形態において、抗脈管形成化合物は、腫瘍切除部位に直接投与される（例えば、塗布、ブラッシング（ｂｒｕｓｈｉｎｇ）、または他の方法で抗脈管形成化合物で腫瘍の切除縁をコートすることによって適用される）。あるいは、抗脈管形成化合物は、投与前に公知の外科ペーストに組み込まれ得る。本発明の特に好ましい実施形態において、抗脈管形成化合物は、悪性疾患についての肝切除後および神経外科手術後に適用される。
本発明の１つの局面において、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、広範な種々の腫瘍（例えば、乳房腫瘍、結腸腫瘍、脳腫瘍および肝腫瘍を含む）の切除縁に投与され得る。例えば、本発明の１つの実施形態において、抗脈管形成化合物は、切除後に、神経学的腫瘍の部位に、その部位での新しい血管の形成が阻害されるように投与され得る。
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、他の抗脈管形成因子とともに投与され得る。他の抗脈管形成因子の代表的な例としては以下が挙げられる：抗侵襲性因子、レチノイン酸およびその誘導体、パクリタキセル、スラミン、メタロプロテイナーゼ−１の組織インヒビター、メタロプロテイナーゼ−２の組織インヒビター、プラスミノーゲン活性化インヒビター−１、プラスミノーゲン活性化インヒビター−２および種々の形態のより軽い「ｄ群」遷移金属。
より軽い「ｄ群」遷移金属には、例えばバナジウム、モリブデン、タングステン、チタン、ニオブおよびタンタル種が挙げられる。そのような遷移金属種は、遷移金属錯体を形成し得る。上記の遷移金属種の適切な錯体としては、オキソ遷移金属錯体が挙げられる。
バナジウム錯体の代表的な例としては、バナデート錯体およびバナジル錯体のようなオキソバナジウム錯体が挙げられる。適切なバナデート錯体としては、例えばメタバナジン酸アンモニウム、メタバナジン酸ナトリウムおよびオルトバナジン酸ナトリウムのようなメタバナデート錯体およびオルトバナデート錯体が挙げられる。適切なバナジル錯体としては、例えばバナジルアセチルアセトネートおよび硫酸バナジル（硫酸バナジル一水和物および硫酸バナジル三水和物のような硫酸バナジル水和物を含む）が挙げられる。
タングステン錯体およびモリブデン錯体の代表的な例としてはまた、オキソ錯体が挙げられる。適切なオキソタングステン錯体としては、タングステート錯体およびタングステンオキシド錯体が挙げられる。適切なタングステート錯体としては、タングステン酸アンモニウム、タングステン酸カルシウム、タングステン酸ナトリウム二水和物およびタングステン酸が挙げられる。適切なタングステンオキシドとしては、タングステン（ＩＶ）オキシドおよびタングステン（ＶＩ）オキシドが挙げられる。適切なオキソモリブデン錯体としては、モリブデート、モリブデンオキシドおよびモリブデニル錯体が挙げられる。適切なモリブデート錯体としては、モリブデン酸アンモニウムおよびその水和物、モリブデン酸ナトリウムおよびその水和物、ならびにモリブデン酸カリウムおよびその水和物が挙げられる。適切なモリブデンオキシドとしては、モリブデン（ＶＩ）オキシド、モリブデン（ＶＩ）オキシドおよびモリブデン酸が挙げられる。適切なモリブデニル錯体としては、例えばモリブデニルアセチルアセトネートが挙げられる。他の適切なタングステン錯体およびモリブデン錯体としては、例えばグリセロール、酒石酸および糖由来のヒドロキソ誘導体が挙げられる。
広範な種々の他の抗脈管形成因子もまた、本発明の状況において利用され得る。代表的な例としては、以下が挙げられる：血小板因子４；硫酸プロタミン；硫酸化キチン誘導体（クイーンクラブ（ｑｕｅｅｎ ｃｒａｂ）の殻から調製される）（Ｍｕｒａｔａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５１：２２〜２６、１９９１）；硫酸化多糖ペプチドグリカン複合体（ＳＰ−ＰＧ）（この化合物の機能は、ステロイド（例えば、エストロゲン）およびクエン酸タモキシフェンの存在によって、増強され得る）；スタウロスポリン；基質代謝の調節因子（例えば、プロリンアナログ、シスヒドロキシプロリン、ｄ，Ｌ−３，４−デヒドロプロリン、チアプロリン、α，α−ジピリジル，アミノプロピオニトリルフマレートを含む）；４−プロピル−５−（４−ピリジニル）−２（３Ｈ）−オキサゾロン；メトトレキサート；ミトザントロン；ヘパリン；インターフェロン；２マクログロブリン−血清；ＣｈＩＭＰ−３（Ｐａｖｌｏｆｆら、Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．２６７：１７３２１〜１７３２６、１９９２）；キモスタチン（Ｔｏｍｋｉｎｓｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．２８６：４７５〜４８０、１９９２）；シクロデキストリンテトラデカサルフェート；エポネマイシン；カンプトテシン；フマギリン（Ｉｎｇｂｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５５〜５５７、１９９０）；チオリンゴ酸金ナトリウム（「ＧＳＴ」；ＭａｔｓｕｂａｒａおよびＺｉｆｆ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７９：１４４０〜１４４６、１９８７）；アンチコラゲナーゼ−血清；α２−抗プラスミン（Ｈｏｌｍｅｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２（４）：１６５９〜１６６４、１９８７）；ビサントレン（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）；ロベンザリット二ナトリウム（Ｎ−（２）−カルボキシフェニル−４−クロロアントロニル酸（ｃｈｌｏｒｏａｎｔｈｒｏｎｉｌｉｃ ａｃｉｄ）二ナトリウム、すなわち「ＣＣＡ」；Ｔａｋｅｕｃｈｉら、Ａｇｅｎｔｓ Ａｃｔｉｏｎｓ ３６：３１２〜３１６、１９９２）；サリドマイド；Ａｎｇｏｓｔａｔｉｃステロイド；ＡＧＭ−１４７０；カルボキシアミノイミダゾール（ｃａｒｂｏｘｙｎａｍｉｎｏｌｍｉｄａｚｏｌｅ）；およびメタロプロテイナーゼインヒビター（例えば、ＢＢ９４）。
（細胞レベルでの疾患）
本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドによって処置、予防、診断、および／または予後判定され得る細胞生存の増大あるいはアポトーシスの阻害に関連する疾患には、癌（例えば、濾胞性リンパ腫、ｐ５３変異を有する癌腫、およびホルモン依存性腫瘍、これらは以下：結腸癌、心臓腫瘍、膵臓癌、黒色腫、網膜芽細胞腫、神経膠芽細胞腫、肺癌、腸癌、精巣癌、胃癌、神経芽細胞腫、粘液腫、筋腫、リンパ腫、内皮腫、骨芽細胞腫、骨巨細胞腫、骨肉腫、軟骨肉腫、腺腫、乳癌、前立腺癌、カポージ肉腫および卵巣癌を含むが、これらに限定されない）；自己免疫障害（例えば、多発性硬化症、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、胆汁性肝硬変、ベーチェット病（Ｂｅｈｃｅｔ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、クローン病、多発性筋炎、全身性エリテマトーデスおよび免疫関連糸球体腎炎ならびに慢性関節リウマチ）およびウイルス感染（例えば、ヘルペスウイルス、ポックスウイルスおよびアデノウイルス）、炎症、対宿主性移植片病、急性移植片拒絶、ならびに慢性移植片拒絶、が挙げられる。
好ましい実施形態において、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、特に上記に列挙される、癌の増殖、進行、および／または転移（ｍｅｔａｓｉｓ）を阻害するために使用される。
本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドによって処置あるいは検出され得る細胞生存の増大に関連するさらなる疾患または状態には、悪性疾患の進行および／または転移ならびに以下のような関連する障害が挙げられるが、これらに限定されない：白血病（急性白血病（例えば、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病（骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性および赤白血病を含む）を含む）ならびに慢性白血病（例えば、慢性骨髄性（顆粒球性）白血病および慢性リンパ球性白血病））、真性赤血球増加症、リンパ腫（例えば、ホジキン病および非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、Ｈ鎖病、ならびに固形腫瘍（肉腫および癌腫（例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、リンパ管肉腫、リンパ管内皮腫、骨膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌腫、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原生癌、腎細胞癌、肝細胞癌腫、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、頸部癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、神経膠星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫（ｍｅｎａｎｇｉｏｍａ）、黒色腫、神経芽細胞腫、および網膜芽細胞腫）を含むが、これらに限定されない）。
本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドによって処置、予防、診断、および／または予後判定され得るアポトーシスの増大に関連する疾患には、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＡＩＤＳ；神経変性障害（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、色素性網膜炎、小脳変性および脳腫瘍または以前に関連した疾患）；自己免疫障害（例えば、多発性硬化症、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、胆汁性肝硬変、ベーチェット病（Ｂｅｈｃｅｔ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、クローン病、多発性筋炎、全身性エリテマトーデスおよび免疫関連糸球体腎炎ならびに慢性関節リウマチ）、脊髄形成異常症候群（例えば、再生不良性貧血）、対宿主性移植片病、虚血性傷害（心筋梗塞、発作および再灌流傷害によって生じるようなもの）、肝臓傷害（例えば、肝炎関連肝臓傷害、虚血／再灌流傷害、胆汁うっ滞（ｃｈｏｌｅｓｔｏｓｉｓ）（胆管傷害）および肝臓癌）；毒物誘導性肝臓疾患（アルコールによって引き起こされるようなもの）、敗血症性ショック、悪液質ならびに食欲不振。
（創傷治癒および上皮細胞増殖）
本発明のなおさらなる局面に従って、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、治療目的のため、例えば、創傷治癒の目的のために上皮細胞増殖および基底ケラチノサイトを刺激するため、ならびに毛包生成および皮膚創傷の治癒を刺激するために、利用するプロセスが提供される。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、以下を含む創傷治癒を刺激する際に臨床的に有用であり得る：外科的創傷、切除の創傷、深い創傷（真皮および表皮の損傷を含む）、眼組織の創傷、歯組織の創傷、口腔創傷、糖尿病性潰瘍、皮膚の潰瘍、肘の潰瘍、動脈の潰瘍、静脈うっ滞潰瘍、熱への曝露または化学物質から生ずる熱傷、および他の異常な創傷治癒状態（例えば、尿毒症、栄養失調、ビタミン欠乏、ならびにステロイド、放射線療法および抗腫瘍性薬物および代謝拮抗物質を用いる全身性処置に関連する合併症。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、皮膚損失後の皮膚の回復を促進するために使用され得る。
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、創傷床（ｗｏｕｎｄ ｂｅｄ）への皮膚移植片の接着を増大するため、および創傷床からの再上皮形成を刺激するために使用され得る。以下は、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが創傷床への接着を増大するために使用され得る、移植片の型である：自家移植片、人工皮膚、同種移植片（ａｌｌｏｇｒａｆｔ）、自己植皮片、自己表皮移植片（ａｕｔｏｅｐｄｅｒｍｉｃ ｇｒａｆｔ）、無血管性（ａｖａｃｕｌａｒ）移植片、ブレア−ブラウン移植片、骨移植片、胚胎組織移植片、真皮移植片、遅延移植片、皮膚移植片、表皮移植片、筋膜移植片、全層皮膚移植片、異種移植片（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｇｒａｆｔ）、異種移植片（ｘｅｎｏｇｒａｆｔ）、同種移植片（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｇｒａｆｔ）、増殖性移植片、層板状移植片、網状移植片、粘膜移植片、オリエ−ティールシュ移植片、大網移植片、パッチの移植片（ｐａｔｃｈ ｇｒａｆｔ）、茎状移植片、全層移植片（ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｇｒａｆｔ）、分層植皮片（ｓｐｌｉｔ ｓｋｉｎ ｇｒａｆｔ）、分層植皮片（ｔｈｉｃｋ ｓｐｌｉｔ ｇｒａｆｔ）。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、皮膚の強度を助長するため、および加齢した皮膚の外見を改善するために使用され得る。
本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、肝細胞増殖、および肺、乳房、膵臓、胃、小腸、および大腸における上皮細胞増殖における変化を生じると考えられる。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、上皮細胞（例えば、皮脂細胞（ｓｅｂｏｃｙｔｅ）、毛包、肝細胞、ＩＩ型肺胞上皮細胞（ｔｙｐｅ ＩＩ ｐｎｅｕｍｏｃｙｔｅ）、ムチン産生杯細胞、および他の上皮細胞、ならびに皮膚、肺、肝臓、および胃腸管内に含まれるそれらの前駆体）の増殖を促進し得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、内皮細胞、ケラチノサイト、および基底ケラチノサイトの増殖を促進し得る。
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、放射線、化学療法処置またはウイルス感染から生じる腸の毒性の副作用を低減するために使用され得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、小腸粘膜に対して細胞保護的な（ｃｙｔｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ）効果を有し得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、化学療法およびウイルス感染から生じる粘膜炎（ｍｕｃｏｓｉｔｉｓ）（口潰瘍）の治癒を刺激し得る。
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、やけどを含む、完全な厚さおよび部分的な厚さの皮膚欠損における皮膚の完全な再生（すなわち、毛包、汗腺、および皮脂腺の再増殖）、乾癬のような他の皮膚欠損の処置においてさらに使用され得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、表皮水疱症（これらの損傷の再上皮形成を促進することによる頻繁な開放性かつ疼痛性の水疱を生じる、下層の真皮への表皮の接着の欠損）を処置するために使用され得る。
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、胃潰瘍および十二指腸（ｄｏｕｄｅｎａｌ）潰瘍を処置し、そして粘膜の内層の瘢痕形成ならびに腺の粘膜および十二指腸の粘膜の内層の再生による治癒を、より迅速に補助するために使用され得る。炎症性腸疾患、例えば、クローン病および潰瘍性大腸炎は、それぞれ、小腸または大腸の粘膜表面の破壊を生じる疾患である。従って、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、粘膜表面の再表面形成（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）を促進して、より迅速な炎症性腸疾患の治癒を補助し、そして炎症性腸疾患の進行を予防するために、使用され得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いる処置は、胃腸管全体の粘液の産生に対して有意な効果を有すると予期され、そして摂取された有害な物質からかまたは外科手術後に、腸粘膜を有害な物質から保護するために使用され得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、その発現不足に関連する疾患を処置するために使用され得る。
さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、種々の病的状態に起因する肺への損傷を予防および治癒するために使用され得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、急性または慢性の肺損傷を予防または処置するために、肺胞および細気管支（ｂｒｏｃｈｉｏｌａｒ）上皮の増殖および分化を刺激し得、そしてその修復を促進し得る。例えば、肺胞（ａｖｅｏｌｉ）の進行性の損失を生じる気腫、および細気管支上皮および肺胞の壊死を生じる吸入傷害（ｉｎｈａｌａｔｉｏｎ ｉｎｊｕｒｙ）（すなわち、煙の吸入およびやけどから生じる）は、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、アゴニストまたはアンタゴニストを使用して、効果的に処置され得る。また、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ＩＩ型肺胞上皮細胞の増殖および分化を刺激するために使用され得、これは、未熟な乳児における肺硝子膜症（例えば、乳児呼吸窮迫症候群および気管支肺異形成症）のような疾患を処置または予防するのを助け得る。
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、肝細胞の増殖および分化を刺激し得、従って、肝臓の疾患および病状（例えば、肝硬変により生じる劇症肝不全、ウイルス性肝炎および毒性物質（すなわち、アセトアミノフェン、四塩化炭素（ｃａｒｂｏｎ ｔｅｔｒａｈｏｌｏｒｉｄｅ）、および当該分野で公知の他の肝臓毒素）により生じる肝臓損傷）を緩和または処置するために用いられ得る。
さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、真性糖尿病の発症を処置または予防するために使用され得る。新たにＩ型糖尿病およびＩＩ型糖尿病と診断された患者において、いくらかの島細胞機能が残っている場合、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、その疾患の永続的な発現を、緩和、遅延または予防するように、その島機能を維持するために使用され得る。また、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、島細胞機能を改善または促進するための島細胞移植における補助として使用され得る。
（ニューロンの活性および神経学的疾患）
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、脳および／または神経系の疾患、障害、損傷、または傷害の診断および／または処置のために使用され得る。本発明の組成物（例えば、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド）を用いて処置され得る神経系の疾患には、軸索の切断、ニューロンの減少もしくは変性、または脱髄のいずれかを引き起こす、神経系損傷および疾患、障害および／または状態が挙げられるが、これらに限定されない。本発明に従って、患者（ヒト患者および非ヒト哺乳動物患者を含む）において処置され得る神経系病変には、以下の中枢神経系（脊髄、脳を含む）または末梢神経系のいずれかの病変が挙げられるが、これらに限定されない：（１）虚血病変（ここで、神経系の一部における酸素不足により、ニューロンの損傷または死が生じ、これには大脳梗塞もしくは虚血、または脊髄梗塞もしくは虚血が挙げられる）；（２）外傷病変（身体的損傷により生じるかまたは手術に関連する病変、例えば、神経系の一部分を切断する病変、または圧縮損傷を含む）；（３）悪性病変（ここで、神経系の一部分は、神経系関連悪性疾患もしくは非神経系組織由来の悪性疾患のいずれかである悪性組織により破壊または損傷される）；（４）感染性病変（ここで、神経系の一部分は、例えば、膿瘍による感染の結果として、破壊または損傷されるか、あるいはヒト免疫不全ウイルス、帯状ヘルペスもしくは単純ヘルペスウイルスによる感染と関連するか、ライム病、結核、梅毒に関連する）；（５）変性病変（ここで、神経系の一部分は、変性プロセスの結果として破壊または損傷され、これには、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンティングトン病または筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）に関連する変性が挙げられるが、これらに限定されない）；（６）栄養性の疾患、障害および／または状態に関連する病変（ここで、神経系の一部分は、栄養障害または代謝障害によって破壊または損傷され、これには、ビタミンＢ１２欠乏症、葉酸欠乏症、ヴェルニッケ病、タバコ−アルコール弱視、マルキアファーヴァ−ビニャーミ病（脳梁の一次変性）およびアルコール小脳変性が挙げられるが、これらに限定されない）；（７）全身性疾患に関連する神経性病変（糖尿病（糖尿病性ニューロパシー、ベル麻痺）、全身性エリテマトーデス、癌または類肉腫症が挙げられるが、これらに限定されない）；（８）毒性物質（アルコール、鉛または特定の神経毒を含む）により生じる病変；ならびに（９）脱髄性病変（ここで、神経系の一部分は、脱髄性執権によって破壊または損傷され、これには、多発性硬化症、ヒト免疫不全ウイルス関連脊髄障害、横断脊髄障害または種々の病因、進行性多病巣性白質脳障害、および橋中央ミエリン溶解が挙げられるが、これらに限定されない）。
１つの実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、低酸素症の損傷効果から神経細胞を保護するために用いられる。さらに好ましい実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、大脳低酸素症の損傷作用から神経細胞を保護するために用いられる。この実施形態によると、本発明の組成物は、大脳低酸素症に関連する神経細胞損傷を処置または予防するために用いられる。この実施形態の１つの非限定局面において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、大脳虚血と関連する神経細胞損傷を処置または予防するために用いられる。この実施形態の別の非限定局面において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、大脳梗塞に関連する神経細胞損傷を処置または予防するために用いられる。
別の好ましいこの実施形態において本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、脳卒中に関連する神経細胞損傷を処置または予防するために用いられる。特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、脳卒中に関連する大脳神経細胞損傷を処置または予防するために用いられる。
別の好ましいこの実施形態において本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、心臓発作に関連する神経細胞損傷を処置または予防するために用いられる。特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、心臓発作に関連する大脳神経細胞損傷を処置または予防するために用いられる。
神経系障害を処置または予防するのに有用な本発明の組成物は、ニューロンの生存または分化の促進における生物学的活性について試験することによって、選択され得る。例えば、制限する目的ではないが、以下の効果のいずれかを誘発する本発明の組成物は、本発明によると有用であり得る：（１）低酸素または低酸素状態の存在または非存在下のいずれかの培養におけるニューロンの増加した生存時間；（２）培地またはインビボにおけるニューロンの増加した出芽；（３）培地またはインビボにおけるニューロン関連分子（例えば、運動ニューロンに関して、コリンアセチルトランスフェラーゼまたはアセチルコリンステラーゼ）の増加した産生；あるいは（４）インビボにおけるニューロン機能障害の軽減した症状。このような効果は、当該分野で公知の任意の方法によって測定され得る。
好ましくは、非制限的な実施形態において、ニューロンの増加した生存時間は、本明細書中に記載される方法、またはそうでなければ当該分野で公知の方法（例えば、Ｚｈａｎｇら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９７：３６３７−４２（２０００）、または、Ａｒａｋａｗａら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１０：３５０７〜３５１５（１９９０）など）を使用して慣用的に測定され得；ニューロンの増加した出芽は、当該分野で公知の方法（例えば、Ｐｅｓｔｒｏｎｋら（Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．７０：６５〜８２（１９８０））またはＢｒｏｗｎら（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．４：１７〜４２（１９８１））に記載される方法）によって検出され得；ニューロン関連分子の増加した産生は、当該分野で公知の技術を使用し、測定されるべき分子に基づいて、バイオアッセイ、酵素アッセイ、抗体結合、ノーザンブロットアッセイなどによって、測定され得；そして運動ニューロンの機能障害は、運動ニューロン障害の物理的発現（例えば、弱さ、運動ニューロンの伝導速度、または機能障害）を評価することによって、測定され得る。
特定の実施形態において、本発明に従って処置され得る運動ニューロンの障害には、運動ニューロンおよび神経系の他の成分に影響を与え得る障害（例えば、梗塞、感染、毒素への暴露、外傷、外科的損傷、変性疾患、または悪性疾患）、ならびにニューロンに選択的に影響する障害（例えば、筋萎縮性側索硬化症）が挙げられるが、これらに限定されず、そしてこれには、進行性脊髄性筋萎縮症、進行性球延髄麻痺、原発性側索硬化症、小児筋萎縮および若年性筋萎縮、小児期の進行性球麻痺（ファチオ−ロンデ病）、ポリオおよびポリオ後症状、ならびに遺伝性運動感覚性神経障害（シャルコー−マリー−トゥース病）が挙げられるが、これらに限定されない。
さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ニューロン生存、シナプス形成；伝達；神経分化などにおいて役割を果たし得る。従って、本発明の組成物（本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む）は、学習および／または認識の障害を含むがこれに限定されない、これらの役割に関連する疾患または障害を、診断、および／または処置または予防するのに用いられ得る。本発明の組成物は、神経変性性疾患状態および／または行動障害の処置または予防において有用であり得る。このような神経変性性疾患状態および／または行動障害としては以下が挙げられるがこれらに限定されない：アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、ツレット症候群、精神分裂病、躁病、痴呆、偏執症、強迫性障害、鬱病、恐慌性障害、学習障害、ＡＬＳ、精神病、自閉、および行動変化（栄養補給、睡眠パターン、平衡、および知覚の障害を含む）。さらに、本発明の組成物は、発生中の胚、または伴性障害に関連する発生の障害の処置、予防および／または検出において役割を果たし得る。
さらに、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、以下を含むが挙げられるがこれらに限定されない脳血管障害に関連する、疾患、傷害、障害または、損傷から、神経細胞を防御するのに有用であり得る：脳血管障害（例えば、頸動脈血栓症、頸動脈狭窄またはモヤモヤ病）、脳のアミロイドアンギオパチー、大脳動脈瘤、脳低酸素症、大脳動脈硬化症、大脳動静脈奇形、大脳動脈疾患、脳塞栓症および血栓（例えば、頸動脈血栓症、洞血栓症およびヴァレンベルク症候群）、硬膜上血腫（例えば、硬膜外血腫または硬膜下血腫およびクモ膜下出血）、脳亀裂骨折、脳虚血（例えば、一過性脳虚血、鎖骨下動脈盗血症候群、または椎骨脳底不全（ｖｅｒｔｅｂｒｏｂａｓｉｌａｒ ｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｃｙ））、血管性痴呆（たとえば、多発脳梗塞性痴呆）、脳室周囲白質軟化症、ならびに血管性頭痛（例えば、群発性頭痛）。
本発明のなおさらなる局面によれば、治療目的で、例えば神経学的細胞増殖および／または分化を刺激するために、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを利用するためのプロセスが提供される。
従って、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、神経学的疾患を処置、および／または検出するために用いられ得る。さらに、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、特定の神経系疾患または傷害のマーカーまたは検出因子として用いられ得る。
本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて処置または検出され得る神経学的疾患の例としては、以下が挙げられる：脳疾患（例えば、母系フェニルケトン尿症のようなフェニルケトン尿症を含む代謝性脳疾患）、ピルビン酸カルボキシラーゼ欠乏症、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体欠乏症、ヴェルニッケ脳障害、脳水腫、テント下（ｉｎｆｒａｔｅｎｔｏｒｉａｌ）新生物を含む小脳性新生物のような脳新生物、脈絡叢新生物のような脳室新生物、視床下部性新生物、テント上新生物、キャナヴァン病、毛細血管拡張性運動失調のような脊髄小脳性退化を含む小脳性運動失調のような小脳疾患、小脳性共同運動障害、フリードライヒ失調症、マチャド−ジョセフ病、オリーブ橋小脳萎縮、テント下新生物のような小脳性新生物、びまん性軸周囲性脳炎、球様細胞白質萎縮症、異染性白質萎縮症および亜急性硬化性汎脳炎のようなびまん性脳硬化。
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて処置または検出され得るさらなる神経学的疾患としては、以下が挙げられる：脳血管障害（例えば、頸動脈血栓症、頸動脈狭窄およびモヤモヤ病を含む頸動脈疾患）、脳のアミロイドアンギオパチー、大脳動脈瘤、大脳動脈硬化症、大脳動静脈奇形、大脳動脈疾患、頸動脈血栓症、洞血栓症およびヴァレンベルク症候群のような脳塞栓症および血栓症、硬膜上血腫、硬膜下血腫およびクモ膜下出血のような脳出血、脳亀裂骨折、一過性脳虚血、鎖骨下動脈盗血症候群および椎骨脳底不全（ｖｅｒｔｅｂｒｏｂａｓｉｌａｒ ｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）のような脳虚血、多発脳梗塞性痴呆のような血管性痴呆、脳室周囲白質軟化症、群発性頭痛のような血管性頭痛。
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて処置または検出され得るさらなる神経学的疾患としては以下が挙げられる：エイズ痴呆複合症のような痴呆症、アルツハイマー病およびクロイツフェルト−ヤーコプ病のような初老期痴呆、アルツハイマー病および進行性核上性麻痺のような老年痴呆、多発脳梗塞性痴呆のような血管性痴呆、びまん性軸周囲性脳炎のような脳炎、流行性脳炎、日本脳炎、セントルイス脳炎、マダニ媒介性脳炎および西ナイル熱のようなウイルス性脳炎、急性播種性脳脊髄炎、ブドウ膜髄膜炎症候群、脳炎後パーキンソン病および亜球性硬化性汎脳炎のような髄膜脳脊髄炎、室周白斑症のような脳軟化症、点頭痙攣を含む全身てんかんのようなてんかん、アプサンスてんかん（ａｂｓｅｎｃｅ ｅｐｉｌｅｐｓｙ）、ＭＥＲＲＦ症候群を含むミオクローヌスてんかん、強直・間代てんかん、複雑部分てんかん、前頭葉てんかんおよび側頭葉てんかんのような部分てんかん、外傷後てんかん、持続性部分てんかんのようなてんかん重積持続状態、ハレルフォルデン−シュパッツ症候群。
本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて処置または検出され得るさらなる神経学的疾患としては、以下が挙げられる：ダンディ−ウォーカー症候群および正常圧水頭症のような水頭症、視床下部性新生物のような視床下部性疾患、大脳マラリア、脱力発作を含むナルコレプシー、延髄ポリオ（ｂｕｌｂａｒ ｐｏｉｏｍｙｅｌｉｔｉｓ）、大脳偽腫瘍、レット症候群、ライ症候群、視床疾患、大脳トキソプラスマ症、頭蓋内結核腫およびツェルヴェーガー症候群、エイズ痴呆複合症のような中枢神経系感染、脳膿瘍、硬膜下蓄膿症、ウマの脳脊髄炎のような脳脊髄炎、ベネズエラウマ脳脊髄炎、壊死性出血性脳脊髄炎、ビスナ、ならびに大脳マラリア。
本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて処置または検出され得るさらなる神経学的疾患としては、以下が挙げられる：クモ膜炎のような髄膜炎、リンパ球性脈絡髄膜炎を含むウイルス性髄膜炎のような無菌性髄膜炎、ヘモフィルス髄膜炎を含む細菌性髄膜炎、リステリア髄膜炎、ウォーターハウス−フリーデリックセン症候群のような髄膜炎菌性脳脊髄膜炎、肺炎球菌髄膜炎および髄膜結核症、クリプトコックス髄膜炎のような真菌性髄膜炎、硬膜下滲出、ブドウ膜髄膜脳炎症候群のような髄膜脳炎、横行脊髄炎（ｔｒａｎｓｖｅｒｓｅ ｍｙｅｌｉｔｉｓ）のような脊髄炎、脊髄ろうのような神経梅毒、延髄ポリオおよびポリオ後症候群を含むポリオ、プリオン病（例えば、クロイツフェルト−ヤーコプ病、ウシの海綿状脳症、ゲルストコン−シュトロイスラー症候群、クールー、スクラピー）、ならびに大脳トキソプラスマ症。
本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて処置または検出され得るさらなる神経学的疾患としては、以下が挙げられる：テント下新生物のような小脳性新生物を含む脳新生物のような中枢神経系新生物、脈絡叢新生物、視床下部性新生物およびテント上新生物のような脳室新生物、髄膜新生物、硬膜外新生物を含む脊髄新生物、キャナヴァン病のような脱髄疾患、副腎脳白質ジストロフィーを含むびまん性大脳硬化症（ｄｉｆｆｕｓｅ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｓｃｅｌｏｒｉｓ）、びまん性軸周囲性脳炎、球様細胞白質萎縮症、異染性白質萎縮症のようびまん性大脳硬化症、アレルギー性脳脊髄炎、壊死性出血性脳脊髄炎、進行性多病巣性白質脳障害、多発性硬化症、橋中央ミエリン溶解、横行脊髄炎、視神経脊髄炎、スクラピー、脊柱前弯症、慢性疲労症候群、ビスナ、高圧神経質症候群（Ｈｉｇｈ Ｐｒｅｓｓｕｒｅ Ｎｅｒｖｏｕｓ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、髄膜症、先天性筋無緊張症のような脊髄疾患、筋萎縮性側索硬化症、ヴェルドニッヒ−ホフマン病のような棘筋萎縮、脊髄圧搾、硬膜外新生物のような脊髄新生物、脊髄空洞症、脊髄ろう、スティッフマン症候群、母親由来１５ ｑ‐１３微少欠損のような精神遅滞、ネコ鳴き症候群、ド・ランゲ症候群、ダウン症候群、ガングリオシドーシスＧ（Ｍ１）のようなガングリオシドーシス、ザントホフ病、テイ−サックス病、ハートナップ病、ホモシスチン尿症、ローレンス−ムーン−ビードル症候群、レッシュ−ナイハン症候群、カエデシロップ病、フコース蓄積症のようなムコリピドーシス、ニューロンセロイド脂褐素沈着症、眼脳腎症候群、母系フェニルケトン尿のようなフェニルケトン尿症、プラーダー−ヴィリ症候群、レット症候群、ルービンスタイン−テービ症候群、結節硬化症、ＷＡＧＲ症候群、全前脳症のような神経系異常、水無能症（ｈｙｄｒａｎｇｅｎｃｅｐｈａｌｙ）を含む無能症のような神経管不全、アルノルト−キアーリ奇形、脳ヘルニア、髄膜瘤、髄膜脊髄瘤、嚢胞性二分脊椎および潜在性二分脊椎のような脊髄癒合不全。
本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて処置または検出され得るさらなる神経学的疾患としては、以下が挙げられる：シャルコー−マリー疾患を含む遺伝性の運動および感覚ニューロン障害、遺伝性 視覚萎縮症、レフスム病、遺伝性痙性対麻痺、ヴェルドニッヒ−ホフマン病、先天性痛覚脱失症および家族性自律神経障害のような遺伝性感覚および自律性ニューロパシー、神経学的症状発現（例えば、ゲルストマン症候群を含む失認）、逆向性健忘症のような健忘症、失行症、神経因性膀胱、脱力発作、難聴、部分聴覚欠失、大声（ｌｕｄｎｅｓｓ）レクルートメントおよび耳鳴を含む聴覚障害のような情報伝達障害、失書症、名称失語症、ブロカ失語症およびヴェルニッケ失語症を含む失語症のような言語障害、急性失読症のような失読症、言語発育障害、名称失語症、ブロカ失語症およびヴェルニッケ失語症を含む失語症のような発語障害、蓄積障害、構語障害、反響言語、無言症およびどもりを含む発語障害のような情報伝達障害、失声症および嗄声のような発声障害、除脳硬直状態、せん妄、線維束性攣縮、幻覚、髄膜症、母親由来１５ ｑ‐１３微少欠損、運動失調、アテトーシス、舞踏病、失調症、運動低下症、筋肉緊張低下、ミオクローヌス、チック、斜頸および振せんのような運動障害、スティッフマン症候群のような筋肉硬直のような筋肉緊張亢進、筋肉痙性、耳帯状疱疹を含む顔面神経麻痺のような神経麻痺、胃不全麻痺、片麻痺、複視のような眼筋麻痺、デュエーン症候群、ホルナー症候群、キーンズ症候群のような慢性進行性外眼筋麻痺症、球麻痺、熱帯性痙攣不全対麻痺、ブラウン−セカール症候群、四肢麻痺、呼吸麻痺および声帯麻痺のような対麻痺、不全麻痺、幻肢、無味覚症および味覚不全のような味覚障害、弱視、失明、色覚異常、複視、半盲、視野暗点および準正常視覚（ｓｕｂｎｏｒｍａｌ ｖｉｓｉｏｎ）のような視覚障害、クライネ−レヴィン症候群、不眠症および夢遊症を含む過眠症のような睡眠障害、開口障害のような痙縮、昏睡、持続性植物状態および失神およびめまいのような意識消失、先天性筋無緊張症のような神経筋疾患、筋萎縮性側索硬化症、ランバート−イートン筋無力症症候群、運動神経疾患、棘筋萎縮、シャルコー−マリー疾患およびヴェルドニッヒ−ホフマン病のような筋萎縮、後ポリオ症候群、筋ジストロフィー、重症筋無力症、萎縮性筋緊張症、先天性筋緊張症、ネマリンミオパシー、家族性期性四肢麻痺、多発性パラミロクローヌス（Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｐａｒａｍｙｌｏｃｌｏｎｕｓ）、熱帯性痙攣不全対麻痺およびスティッフマン症候群、先端肢端疼痛症のような末梢神経系疾患、腎アミロイドーシス、アーディー症候群、Ｂａｒｒｅ−Ｌｉｅｏｕ症候群、家族性自律神経障害、ホルナー症候群、反射性交感神経性ジストロフィーおよびシャイ−ドレーガー症候群のような自律神経系疾患、神経線維腫症２を含む聴神経腫のような内耳神経疾患のような脳神経疾患、顔面神経痛のような顔面神経疾患、メルカーソン−ローゼンタール症候群、弱視を含む眼球運動性障害、眼振、眼球運動麻痺、デュエーン症候群のような眼筋麻痺、ホルナー症候群、キーンズ症候群を含む慢性進行性外眼筋麻痺症、内斜視および外斜視のような斜視、動眼神経麻痺、遺伝性眼萎縮症を含む眼萎縮症のような眼神経疾患、視神経円板結晶腔、視神経脊髄炎のような視神経炎、乳頭水腫、三叉神経痛、声帯麻痺、視神経脊髄炎および脊柱前弯症のような脱髄疾患、糖尿病性足のような糖尿病性ニューロパシー。
本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて処置または検出され得るさらなる神経学的疾患としては、以下が挙げられる：手根管症候群のような神経圧搾症候群、足根管症候群、頸肋症候群のような胸郭出口症候群、尺骨神経圧搾症候群、カウザルギー、頸腕神経痛、顔面神経痛および三叉神経痛のような神経痛、実験的アレルギー性神経炎、眼神経炎、多発性神経炎、多発性神経根神経炎および神経根炎（例えば、多発性神経根炎、遺伝性運動および感覚ニューロパシー（例えば、シャルコー−マリエ疾患、遺伝性眼萎縮症、レフサム病、遺伝性痙性対麻痺およびヴェルドニッヒ−ホフマン病、遺伝性感覚および自律神経ニューロパシー（先天性痛覚脱失および家族性自律神経障害を含む）、ＰＯＥＭＳ症候群、坐骨神経痛、味覚性発汗症候群およびテタニー））のような神経炎。
（内分泌障害）
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを使用して、ホルモンアンバランスに関連する障害および／または疾患、ならびに／あるいは内分泌系の障害または疾患を処置、予防、診断、および／または予後し得る。
内分泌系の腺により分泌されるホルモンは、身体発育、性的機能、代謝、および他の機能を制御する。障害は、２つの方法で分類される：ホルモンの産生における障害、およびホルモンに応答する組織の不全。これらのホルモンアンバランスおよび内分泌系疾患、障害または状態の病因は、遺伝的、体細胞性（例えば、癌およびいくつかの自己免疫疾患）、後天性（例えば、化学治療、損傷または毒素によって）、または感染性であり得る。さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、内分泌系および／またはホルモンアンバランスに関連する特定の疾患または障害のマーカーまたはディテクターとして使用され得る。
内分泌系および／またはホルモンアンバランスおよび／または疾患は、子宮運動の障害を含み、これには以下が挙げられるが、これらに限定されない：妊娠および分娩時の合併症（例えば、早期分娩、過期妊娠、自然流産、ならびに遅延分娩および停止した分娩）；ならびに月経周期の障害および／または疾患（例えば、月経困難症および子宮内膜症）。
内分泌系および／またはホルモンアンバランス障害および／または疾患としては、膵臓の障害および／または疾患（例えば、真性糖尿病、尿崩症、先天性白内障欠損、褐色細胞腫−島細胞腫瘍症候群）；副腎の障害および／または疾患（例えば、アディソン病、コルチコステロイド欠損、男性化作用疾患、多毛症、クッシング症候群、高アルドステロン症、褐色細胞腫）；下垂体の障害および／または疾患（例えば、下垂体機能亢進症、下垂体機能低下症、下垂体性小人症、下垂体腺腫、汎下垂体機能低下症、先端巨大症、巨人症）；甲状腺の障害および／または疾患（甲状腺機能亢進症、甲状腺機能低下症、プラマー病、グレーヴズ病（毒性散在甲状腺腫）、毒性小結節甲状腺種、甲状腺炎（橋本甲状腺炎、亜急性肉芽腫性甲状腺炎、およびサイレントリンパ球性甲状腺炎）、ペンドレッド症候群、粘液水腫、クレチン病、甲状腺中毒症、甲状腺ホルモン縮合障害、チミン形成不全症、甲状腺のヒュルトレ細胞腫瘍、甲状腺癌、甲状腺悪性腫瘍、髄様甲状腺癌が挙げられるが、これらに限定されない）；副甲状腺の障害および／または疾患（例えば、上皮小体機能亢進症、上皮小体機能低下症）；視床下部の障害および／または疾患。
さらに、内分泌系および／またはホルモンアンバランス障害および／または疾患はまた、癌を含む精巣または卵巣の障害および／または疾患を含み得る。他の精巣または卵巣の障害および／または疾患としては、例えば、卵巣癌、多嚢胞性卵巣症候群、クラインフェルター症候群、バニシング精巣症候群（両側性無精巣）、ライディヒ細胞先天性欠損、潜伏精巣症、ヌーナン症候群、筋緊張性ジストロフィー、精巣の毛細血管種（良性）、精巣の新形成および新精巣がさらに挙げられる。
さらに、内分泌系および／またはホルモンアンバランス障害および／または疾患はまた、例えば、多内分泌腺機能低下症候群、褐色細胞腫、神経芽細胞腫、多発性内分泌腺腫症、ならびに内分泌組織の障害および／または癌を含み得る。
別の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療タンパク質部分に相当する治療タンパク質が発現される組織に関連する内分泌疾患および／または障害を診断、予後、予防および／または処置するために使用され得る。
（生殖器系障害）
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、生殖器系の疾患および／または障害を診断、処置または予防するために使用され得る。本発明の組成物によって処置され得る生殖器系の障害としては、生殖器損傷、感染、腫瘍性障害、先天性欠損、および不妊症を生じる疾患または障害、妊娠、分娩または出産の合併症、および出産後の困難が挙げられるが、これらに限定されない。
生殖器系障害および／または疾患としては、以下を含む精巣の疾患および／または障害が挙げられる：精巣萎縮症、精巣性女性化症候群、潜在精巣症（片側および両側）、無精巣症、異所性精巣、精巣上体および／または耳下腺性精巣（典型的に、感染（例えば、淋疾、おたふくかぜ、結核、および梅毒）から生じる）、精巣捻転症、結節性精管炎、生殖細胞腫瘍（例えば、精上皮腫、胎児性細胞癌、奇形癌、絨毛癌、卵黄嚢腫瘍、奇形腫）、支質腫瘍（例えば、ライディヒ細胞腺腫）、水瘤、血種、精索静脈瘤、精液瘤、鼡径ヘルニア、および精液産生の障害（例えば、線毛不動症候群、無精液症、精子無力症、無精子症、精子過少症、奇形精子症）。
生殖器系障害としてはまた、例えば以下のような前立腺の障害が挙げられ得る：急性非細菌性前立腺炎、慢性非細菌性前立腺炎、急性細菌性前立腺炎、慢性細菌性前立腺炎、前立腺膀胱炎、前立腺症、肉芽腫性前立腺炎、マラコプラキア、良性前立腺肥大または肥厚、および前立腺腫瘍性障害（腺癌をふくむ）、移行上皮癌、腺管癌、および扁平上皮癌。
さらに、本発明の組成物は、以下を含む陰茎または尿道の障害または疾患の診断、処置および／または予防において有用である：炎症性障害（例えば、亀頭包皮炎、閉塞性乾燥性亀頭炎、包茎、嵌頓包茎、梅毒、単純疱疹ウイルス、淋疾、非淋菌性尿道炎、クラミジア、マイコプラスマ、トリコモナス、ＨＩＶ、ＡＩＤＳ、ライター症候群、尖圭コンジローム、扁平コンジローム、および真珠陰茎丘疹）；尿道障害（例えば、尿道下裂、尿道上裂、および包茎）；前悪性病巣（ケーラー紅色肥厚症、ボーエン病、ボーエノイド・バピュローシス、ブシュケ−レーヴェンシュタインの巨大コンジローム、およびいぼ状癌を含む）；陰茎癌（扁平上皮癌、インサイチュにおける癌、いぼ状癌、および播種性陰茎癌を含む）；尿道新形成障害（尿道海綿体癌、球海綿体筋尿道癌、および尿道前立腺部癌を含む）；ならびに勃起障害（例えば、プリアピスム、ペーロニー病、勃起不全、およびインポテンス）。
さらに、精管の疾患および／または障害としては、脈管炎およびＣＢＡＶＤ（精管の先天性両側性欠損）が挙げられ；さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、精嚢の疾患および／または障害（包虫症、先天性塩化物下痢、および多発性嚢胞腎疾患を含む）を診断、処置および／または予防するために使用され得る。
他の男性生殖器系の障害および／または疾患としては、例えば、クラインフェルター症候群、ヤング症候群、早漏、真性糖尿病、嚢胞性線維症、カルタゲナー症候群、高熱、多発性硬化症、および女性型乳房が挙げられる。
さらに、ポリヌクレオチド、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、以下を含む膣および外陰の疾患および／または障害の診断、処置および／または予防において使用され得る：細菌性腟炎、カンジダ膣炎、単純疱疹ウイルス、軟性下疳、鼡径部肉芽腫、性病性リンパ肉芽腫、疥癬、ヒト乳頭腫、膣外傷、外陰外傷、腺疾患、クラミジア膣炎、淋疾、腟トリコモナス、尖圭コンジローム、梅毒、伝染性軟属腫、萎縮性腟炎、パジェット病、硬化性萎縮、扁平苔癬、外陰病変、トキシックショック症候群、腟痙、外陰腟炎、外陰腟前庭炎、および新形成障害（例えば、扁平上皮過形成、腎臓明細胞癌、基底細胞癌、黒色腫、バルトリン腺の癌、および外陰上皮新形成）。
子宮の障害および／または疾患としては、以下が挙げられる：月経困難症、後傾子宮、子宮内膜症、フィブロイド、腺筋症、無排卵性出血、無月経、クッシング症候群、胞状奇胎、アッシェルマン症候群、早期閉経、性的早熟、子宮ポリープ、機能不全性不正子宮出血（例えば、迷走ホルモンシグナルに起因する）、および新形成障害（例えば、腺癌、平滑筋肉腫、および肉腫）。さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、以下のような子宮異常のマーカーまたはディテクターとして、ならびに子宮異常の診断、処置および／または予防において有用であり得る：双角子宮、中隔子宮、単角子宮、非空腔性不全角を有する単角子宮、非交通空腔不全角を有する単角子宮、交通空腔角を有する単角子宮、弓状子宮、子宮二空洞およびＴ型子宮。
卵巣疾患および／または障害としては、以下が挙げられる：無排卵、多嚢胞性卵巣（スタイン−リーヴェンサール症候群）、卵巣嚢胞、卵巣機能不全、ゴナドトロピンに対して非感受性の卵巣、アンドロゲンの卵巣過剰産生、右卵巣静脈症候群、無月経、多毛症、および卵巣癌（一次および二次癌増殖、セルトリ−ライディヒ腫瘍、卵巣の類内膜癌、卵巣乳頭漿液性腺癌、卵巣粘液性腺癌、および卵巣クルーケンベルク腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない）。
頸部疾患および／または障害としては、以下が挙げられる：子宮頸管炎、慢性子宮頸管炎、粘液膿性子宮頸管炎、子宮頸部形成異常、頸部ポリープ、ナーボト嚢胞、頸部びらん、頸部機能不全、および頸部新形成（例えば、頸部癌、扁平化生、扁平上皮癌、腺扁平上皮細胞新形成および円柱細胞新形成を含む）。
さらに、生殖器系の疾患および／または障害としては、以下を含む妊娠の障害および／または疾患が挙げられる：流産および死産（例えば、早期流産、晩期流産、自然流産、人工流産、治療的流産、切迫流産、稽留流産、不全流産、完全流産、習慣性流産、稽留流産、および敗血性流産）；異所性妊娠、貧血、Ｒｈ不適合、妊娠中の膣出血、妊娠糖尿病、子宮内発育遅延、羊水過多症、ＨＥＬＬＰ症候群、常位胎盤早期剥離、前置胎盤、悪阻、子かん前症、子かん、妊娠性ヘルペス、および妊娠のじんま疹。さらに、本発明のポリヌクレオチド、ポリオペプチド、およびアゴニストまたはアンタゴニストは、以下を含む妊娠を複雑にし得る疾患を診断、処置および／または予防するために使用され得る：心臓疾患、心不全、リウマチ性心疾患、先天性心疾患、僧帽弁逸脱症、高血圧、貧血、腎臓疾患、感染症（例えば、風疹、サイトメガロウイルス、トキソプラスマ症、感染性肝炎、クラミジア、ＨＩＶ、ＡＩＤＳ、および陰部ヘルペス）、真性糖尿病、グレーヴズ病、甲状腺炎、甲状腺機能低下症、橋本甲状腺炎、慢性活動性肝炎、肝硬変、原発性胆汁性肝硬変、ぜん息、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、重症筋無力症、特発性血小板減少性紫斑病、虫垂炎、卵巣嚢胞、胆嚢障害、および腸の閉塞症。
分娩および出産に関連する合併症としては、膜の早期破裂（ｐｒｅｍａｔｕｒｅ ｒｕｐｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ）、早産、後期妊娠（ｐｏｓｔ−ｔｅｒｍ ｐｒｅｇｎａｎｃｙ）、過熟妊娠、非常に遅く進行する分娩（ｌａｂｏｒ ｔｈａｔ ｐｒｏｇｒｅｓｓｅｓ ｔｏｏ ｓｌｏｗｌｙ）、胎児仮死（例えば、異常な心拍数（胎児性または母性）、呼吸の問題、および異常な胎児位置）、肩甲難産、臍帯脱出症、羊水塞栓症、および異常な子宮の出血が、挙げられる。
さらに、分娩期後の疾患および／または障害としては、子宮内膜炎、子宮筋層炎、子宮傍結合組織炎、腹膜炎、骨盤血栓性静脈炎、肺動脈塞栓症、内毒素血症、腎盂腎炎、伏在性血栓性静脈炎、乳腺炎、膀胱炎、分娩後出血、および反転性子宮（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｕｔｅｒｕｓ）が挙げられる。
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドにより診断、処置、および／または予防され得る雌性生殖器系の他の障害ならびに／または疾患としては、例えば、ターナー症候群、偽半陰陽、月経前緊張症候群、骨盤炎症性疾患、骨盤うっ血（ｐｅｌｖｉｃ ｃｏｎｇｅｓｔｉｏｎ）（血管充血（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｇｏｒｇｅｍｅｎｔ））、不感症、無オルガスム症、性交疼痛症、破裂性（ｒｕｐｔｕｒｅｄ）ファローピウス管、および中間痛。
（感染性疾患）
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、感染因子を処置または検出するするために使用され得る。例えば、免疫応答を上昇させることによって、特にＢ細胞および／またはＴ細胞の増殖および分化を増加させることによって、感染性疾患が処置され得る。免疫応答は、既存の免疫応答を上昇させるか、または新たな免疫応答を開始させるかのいずれかにより上昇され得る。あるいは、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、必ずしも免疫応答を誘発することなく、感染因子を直接阻害し得る。
ウイルスは、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドにより処置または検出され得る疾患または症状を引き起こし得る感染因子の一例である。ウイルスの例としては、以下のＤＮＡおよびＲＮＡのウイルスおよびウイルス科が挙げられるがこれらに限定されない：アルボウイルス、アデノウイルス科、アレナウイルス科、アルテリウイルス、ビルナウイルス科、ブンヤウイルス科、カルシウイルス科、サルコウイルス科（Ｃｉｒｃｏｖｉｒｉｄａｅ）、コロナウイルス科、デング熱、ＥＢＶ、ＨＩＶ、フラビウイルス科、ヘパドナウイルス科（肝炎）、ヘルペスウイルス科（例えば、サイトメガロウイルス、単純ヘルペス、ヘルペス帯状疱疹）、モノネガウイルス（Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒｕｓ）（例えば、パラミクソウイルス科、麻疹ウイルス、ラブドウイルス科）、オルソミクソウイルス科（例えば、インフルエンザＡ、インフルエンザＢ、およびパラインフルエンザ）、パピローマウイルス、パポバウイルス科、パルボウイルス科、ピコルナウイルス科、ポックスウイルス科（例えば、痘瘡またはワクシニア）、レオウイルス科（例えば、ロタウイルス）、レトロウイルス科（ＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ−ＩＩ、レンチウイルス）、およびトガウイルス科（例えば、ルビウイルス属）。これらの科内に入るウイルスは、以下を含むがこれらに限定されない種々の疾患または症状を引き起こし得る：関節炎、細気管支炎（ｂｒｏｎｃｈｉｏｌｌｉｔｉｓ）、呼吸性シンシチウムウイルス、脳炎、眼性感染症（例えば、結膜炎、角膜炎）、慢性疲労症候群、肝炎（Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｅ型、慢性活動性、デルタ）、日本脳炎Ｂ型、アルゼンチン出血熱、チングニア、リフトバレー熱、黄熱病、髄膜炎、日和見感染症（例えば、ＡＩＤＳ）、肺炎、バーキットリンパ腫、水痘、出血熱、麻疹、流行性耳下腺炎、パラインフルエンザ、狂犬病、感冒、ポリオ、白血病、風疹、性感染症、皮膚病（例えば、カポージ、いぼ）、およびウイルス血症。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、任意のこれらの症状または疾患が処置または検出され得る。特定の実施形態において、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、以下の処置に使用される：髄膜炎、デング熱、ＥＢＶ、および／または肝炎（例えば、Ｂ型肝炎）。さらなる特定の実施形態において、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、１以上の他の市販の肝炎ワクチンに非応答性の患者を処置するために使用される。さらに特定の実施形態において、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ＡＩＤＳを処置するために使用される。
同様に、疾患または症状を引き起こし得、かつ本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドによって処置または検出され得る細菌性因子あるいは真菌性因子は、以下のグラム陰性およびグラム陽性細菌および細菌科ならびに真菌を含むがこれらに限定されない：Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ（例えば、Ｎｏｒｃａｒｄｉａ）、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｏｓｉｓ、Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｓｉｓ）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（例えば、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｏｓｉｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ（例えば、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、Ｂｒｕｃｅｌｌａ、Ｃａｎｄｉｄｉａ、Ｃａｍｐｙｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ（例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｉｃｉｌｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｏｄｅｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えば、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｔｈｅｒｉａｅ）、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｄｅｒｍａｔｏｃｙｃｏｓｅｓ、Ｅ．ｃｏｌｉ（例えば、Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅ．ｃｏｌｉおよびＥｎｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ（例えば、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ、Ｈｅａｍｏｐｈｉｌｕｓ（例えば、ＨｅａｍｏｐｈｉｌｕｓインフルエンザＢ型）、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ（例えば、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅおよびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、Ｖｉｂｒｉｏ（例えば、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｃｅａｅ（例えば、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｃｅａｅ ｇｏｎｏｒｒｈｅａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｃｅａｅ Ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ（例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｃｅａｅ、Ｓｐｉｒｏｃｈｅｔｅｓ（例えば、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｓｐｐ．、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｓｐｐ．、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｓｐｐ．）、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、Ｍｅｎｉｎｇｉｏｃｏｃｃｕｓ、ＰｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓならびにＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよびＡ群、Ｂ群およびＣ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、およびＵｒｅａｐｌａｓｍａｓ。これらの細菌または真菌の科は、以下を含むがこれらに限定されない疾患または症状を引き起こし得る：抗生物質耐性の感染、菌血症、心内膜炎、敗血症、眼感染症（例えば、結膜炎）、ブドウ膜炎、結核、歯肉炎、細菌性の下痢、日和見感染症（例えば、ＡＩＤＳに関連した感染症）、爪周囲炎、プロテーゼ関連感染症、虫歯、ライター病、気道感染症（例えば、百日咳または蓄膿症）、セプシス、ライム病、ネコ引っ掻き病、赤痢、パラチフス熱、食中毒、レジオネラ症、慢性炎および急性炎、紅斑、酵母感染、腸チフス、肺炎、淋病、髄膜炎（例えば、髄膜炎Ａ型およびＢ型）、クラミジア、梅毒、ジフテリア、ライ病、ブルセラ病、消化性潰瘍、炭疽、自然流産、出生時欠損、肺炎、肺の感染、難聴、失明、傾眠、倦怠、嘔吐、慢性下痢、クローン病、大腸炎、腟の病気、不妊症、骨盤炎症性疾患、カンジタ症、パラ結核、結核、狼瘡、ボツリヌス中毒、壊疽、破傷風、膿痂疹、リウマチ熱、猩紅熱、性感染病、皮膚病（例えば、蜂巣炎、皮膚真菌症（ｄｅｒｍａｔｏｃｙｃｏｓｅｓ））、毒血症、尿路感染症、創傷感染症、ｎｏｓｃｏｍｉａｌ感染。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを使用して、任意のこれらの症状もしくは疾患を処置または検出し得る。特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、以下を処置するために使用される：破傷風、ジフテリア、ボツリヌス中毒、および／またはＢ型髄膜炎。
さらに、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドにより処置、予防および／または診断され得る、寄生生物性因子が引き起こす疾患または症状としては以下のファミリーまたはクラスが挙げられるがこれらに限定されない：アメーバ症、バベシア症、コクシジウム症、クリプトスポリジウム症、二核アメーバ症（Ｄｉｅｎｔａｍｏｅｂｉａｓｉｓ）、交疫、外部寄生生物性、ジアルジア鞭毛虫症、蠕虫症、リーシュマニア症、住血吸虫症（Ｓｃｈｉｓｔｉｓｏｍａ）、タイレリア症、トキソプラスマ症、トリパノソーマ症、およびトリコモナス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ）症、ならびに胞子虫症（Ｓｐｏｒｏｚｏａｎ）（例えば、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｒａｘ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｉｕｍ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅおよびＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ）。これらの寄生生物は、以下を含むがこれらに限定されない種々の疾患または症状を引き起こし得る：疥癬、ツツガムシ病、眼性感染症、腸疾患（例えば、赤痢、ジアルジア鞭毛虫症）、肝臓疾患、肺疾患、日和見感染症（例えば、ＡＩＤＳ関連）、マラリア、妊娠合併症、およびトキソプラスマ症。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、任意のこれらの症状または疾患を処置、予防および／または診断し得る。特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、マラリアを処置、予防および／または診断するために使用される。
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、患者に有効量の本発明のアルブミン融合タンパク質を投与するか、または患者から細胞を取り出して、本発明のポリヌクレオチドをこの細胞に供給し、そして操作した細胞を患者に戻す（エキソビボ治療）かのいずれかによるものであり得る。さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはワクチン中の抗原として使用されて、感染性疾患に対する免疫応答を惹起し得る。
（再生）
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、細胞を分化させ、増殖させ、そして誘引して、組織の再生を導き得る（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７６：５９−８７（１９９７）を参照のこと）。組織の再生を用いて、先天性欠損、外傷（創傷、熱傷、切開、または潰瘍）、加齢、疾患（例えば、骨粗鬆症、変形性関節炎（ｏｓｔｅｏｃａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、歯周病、肝不全）、美容形成手術を含む手術、線維症、再灌流傷害、もしくは全身性サイトカイン損傷により損傷を受けた組織を修復、置換、または保護し得る。
本発明を用いて再生し得る組織としては、以下が挙げられる：器官（例えば、膵臓、肝臓、腸、腎臓、皮膚、内皮）、筋肉（平滑筋、骨格筋、または心筋）、血管系（血管およびリンパ管を含む）、神経、造血、および骨格（骨、軟骨、腱、および靭帯）の組織。好ましくは、再生は、瘢痕なく、または瘢痕が低減されて生じる。再生はまた、新脈管形成を含み得る。
さらに、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、治癒するのが困難な組織の再生を増加させ得る。例えば、腱／靭帯の再生を増大させることによって、損傷後の回復時間が早まる。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、損傷を回避する試みにおいて予防的に使用され得る。処置され得る特定の疾患は、腱炎、手根管症候群、および他の腱欠損または靭帯欠損を含む。非治癒創傷の組織再生のさらなる例としては、褥瘡性潰瘍、脈管不全、外科的創傷、および外傷性創傷に関連する潰瘍が挙げられる。
同様に、神経および脳組織はまた、神経細胞を増殖および分化させるために本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを使用することによって再生され得る。本方法を用いて処置され得る疾患としては、中枢神経系疾患および末梢神経系疾患、神経障害、または機械的および外傷性の障害（例えば、脊髄障害、頭部外傷、脳血管疾患、および発作（ｓｔｏｋｅ））が挙げられる。詳細には、末梢神経傷害と関連する疾患、末梢神経障害（例えば、化学療法または他の医学的療法から生じる）、局在神経障害、および中枢神経系疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、およびシャイ−ドレーガー症候群）はすべて、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて処置、予防および／または診断され得る。
（胃腸障害）
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを使用して、炎症性疾患および／または状態、感染、癌（例えば、腸の新生物（小腸のカルチノイド類癌腫、小腸の非ホジキンリンパ腫、小腸のリンパ腫））、および潰瘍（例えば、消化性潰瘍）を含む胃腸傷害を処置、予防、診断、および／または予後を判定し得る。
胃腸障害として、えん下困難、えん下痛、食道の炎症、消化性食道炎、胃逆流（ｇａｓｔｒｉｃ ｒｅｆｌｕｘ）、粘膜下線維症および狭窄、マロリー−ヴァイス病変、平滑筋腫、脂肪腫、表皮癌、腺癌、胃の遺残障害、胃腸炎、胃の萎縮症、胃（ｇａｓｔｒｉｃ）／胃（ｓｔｏｍａｃｈ）癌、胃のポリープ、悪性貧血のような自己免疫疾患、幽門狭窄症、胃炎（細菌性、ウイルス性、好酸性、ストレス誘導性、慢性びらん性、萎縮性、プラスマ細胞、およびメネトリエ病）、および腹膜疾患（例えば、、乳び腹水、腹腔内出血、腸管膜嚢、腸間膜リンパ節炎、腸管膜血管閉塞、皮下脂肪組織炎、新生物、腹膜炎、気腹、乳児横隔膜膿瘍（ｂｕｂｐｈｒｅｎｉｃ ａｂｓｃｅｓｓ））が挙げられる。
胃腸障害としてはまた、小腸に関連する障害（例えば、吸収不良症候群、膨満、過敏性腸症候群（ｉｒｒｉｔａｂｌｅ ｂｏｗｅｌ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、糖不耐性、腹腔疾患、十二指腸潰瘍、十二指腸炎、熱帯性スプルー、ホウィップル病、腸リンパ管拡張症、クローン病、虫垂炎、回腸の便秘、メッケル憩室、複数の憩室（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｄｉｖｅｒｔｉｃｕｌａ）、小腸および大腸の完全な回旋不全、リンパ腫）、ならびに細菌性および寄生虫性疾患（例えば、旅行者下痢、チフスおよびパラチフス、コレラ、回虫（Ａｓｃａｒｉａｓｉｓ ｌｕｍｂｒｉｃｉｄｅｓ）、鉤虫（Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ ｄｕｏｄｅｎａｌｅ）、線虫（Ｅｎｔｅｒｏｂｉｕｓ ｖｅｒｍｉｃｕｌａｒｉｓ）、条虫類（Ｔａｅｎｉａ ｓａｇｉｎａｔａ）、Ｅｃｈｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｇｒａｎｕｌｏｓｕｓ、Ｄｉｐｈｙｌｌｏｂｏｔｈｒｉｕｍ ｓｐｐ．、およびＴ．ｓｏｌｉｕｍによる感染）が挙げられる。
肝臓疾患および／または障害として、肝臓内胆汁うっ滞（アラギール（ａｌａｇｉｌｌｅ）症候群、胆汁性肝硬変）、脂肪肝（アルコール性脂肪肝、ライ症候群）、肝静脈血栓症、ヘパトレントリキュラー（ｈｅｐａｔｏｌｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）変性、肝腫、肝肺症候群、肝腎症候群、門脈圧亢進症（食道静脈瘤および胃静脈瘤）、肝膿瘍（アメーバ性肝膿瘍）、肝硬変（アルコール性、胆汁および実験的）、アルコール性肝疾患（脂肪肝、肝炎、肝硬変）、寄生虫性（肝性エキノコックス症、肝蛭症、アメーバ性肝膿瘍）、黄疸（溶血性、肝細胞性、および胆汁うっ滞性）、胆汁うっ滞、門脈圧亢進症、肝肥大、腹水、肝炎（アルコール性肝炎、動物性肝炎、慢性肝炎（自己免疫性、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｄ型肝炎、薬物誘導性）、毒性肝炎、ウイルス性ヒト肝炎（Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｄ型肝炎、Ｅ型肝炎）、ウィルソン病、肉芽腫性肝炎、二次性胆汁性肝硬変（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｂｉｌｉａｒｙ ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ）、肝性脳障害、門脈圧亢進症、静脈瘤、肝性脳障害、一次性胆汁性肝硬変（ｐｒｉｍａｒｙ ｂｉｌｉａｒｙ ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ）、原発性硬化性胆管炎、肝細胞腺腫、血管腫、胆汁石、肝不全（肝性脳障害、急性肝不全）、および肝性新生物（ｌｉｖｅｒ ｎｅｏｐｌａｓｍｓ）（血管筋脂肪腫、石灰化肝転移（ｃａｌｃｉｆｉｅｄ ｌｉｖｅｒ ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ）、嚢胞性肝転移、上皮腫瘍、線維層板肝細胞癌（ｆｉｂｒｏｌａｍｅｌｌａｒ ｈｅｐａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）、病巣結節過形成（ｆｏｃａｌ ｎｏｄｕｌａｒ ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ）、肝細胞腺腫、血性胆汁嚢胞腺腫（ｈｅｐａｔｏｂｉｌｉａｒｙ ｃｙｓｔａｄｅｎｏｍａ）、胚芽腫、肝細胞癌、肝癌（ｈｅｐａｔｏｍａ）、肝癌（ｌｉｖｅｒ ｃａｎｃｅｒ）、肝臓血管内皮腫、間葉過誤腫（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｈａｍａｒｔｏｍａ）、肝臓の間葉腫瘍、結節再生過形成（ｎｏｄｕｌａｒ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ）、良性肝癌（肝嚢胞（単純嚢胞（Ｓｉｍｐｌｅ ｃｙｓｔ）、多嚢胞性肝疾患、血性胆汁嚢胞腺腫（Ｈｅｐａｔｏｂｉｌｉａｒｙ ｃｙｓｔａｄｅｎｏｍａ）、総胆管嚢胞）、間葉腫瘍（間葉過誤腫、乳児先天性血管内皮腫、血管腫、肝臓紫斑病、脂肪腫、炎症性偽腫瘍、ミスセラネウス（Ｍｉｓｃｅｌｌａｎｅｏｕｓ））、上皮腫瘍（胆管上皮（胆管過誤腫、胆管腺腫）、肝細胞（腺腫、病巣結節過形成、結節再生過形成））、転移性肝臓腫瘍（肝細胞、胚芽腫、肝細胞癌、胆管細胞（ｃｈｏｌａｎｇｉｏｃｅｌｌｕｌａｒ）、胆管癌、嚢胞腺癌、血管の癌、血管肉腫、カポージ肉腫、血管内皮腫、他の腫瘍、胎生期肉腫（ｅｍｂｒｙｏｎａｌ ｓａｒｃｏｍａ）、線維肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、癌肉腫、奇形腫、カルチノイド、扁平上皮癌、原発性リンパ腫））、肝臓紫斑病、赤芽肝性ポルフィリン症（ｅｒｙｔｈｒｏｈｅｐａｔｉｃ ｐｏｒｐｈｙｒｉａ）、肝性ポルフィリン症（急性間欠性ポルフィリン症、晩発性皮膚ポルフィリン症）、ツェルヴェーガー症候群）が挙げられる。
膵臓疾患および／または障害として、急性膵炎、慢性膵炎（急性壊死膵炎（ａｃｕｔｅ ｎｅｃｒｏｔｉｚｉｎｇ ｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓ）、アルコール性膵炎）、新生物（膵臓の腺癌、嚢胞腺癌、インスリノーマ、ガストリノーマ、およびグルカゴノーマ、嚢胞性新生物、島細胞腫瘍、膵臓芽腫（ｐａｎｃｒｅｏｂｌａｓｔｏｍａ）、および他の膵臓疾患（例えば、嚢胞性線維症、嚢胞（膵臓偽嚢胞、膵臓フィステル、不全））が挙げられる。
胆嚢疾患として、胆石（胆石症および総胆管結石症）、胆嚢摘出後症候群、胆嚢の憩室症、急性胆嚢炎、慢性胆嚢炎、胆管腫瘍および涙嚢腫が挙げられる。
大腸の疾患および／または障害として、抗生物質関連大腸炎、憩室炎、潰瘍性大腸炎、後天性巨大結腸、膿瘍、真菌性感染および細菌性感染、肛門直腸疾患（例えば、裂溝、痔）、結腸疾患（大腸炎、結腸新生物（結腸癌（ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ）、腺腫様結腸ポリープ（例えば、絨毛腺腫）、結腸癌（ｃｏｌｏｎ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、結腸直腸癌）、結腸憩室炎、大腸憩室、巨大結腸（ヒルシュスプルング病、有害な巨大結腸）；Ｓ状疾患（ｓｉｇｍｏｉｄ ｄｉｓｅａｓｅｓ）（直腸結腸炎、シグモイン（ｓｉｇｍｏｉｎ）新生物））、便秘症、クローン病、下痢（乳児期下痢、赤痢）、十二指腸疾患（十二指腸新生物、十二指腸閉塞症、十二指腸潰瘍、十二指腸炎）、腸炎（ｅｎｔｅｒｉｔｉｓ）（腸炎（ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｓ））、ＨＩＶ腸症、回腸疾患（回腸新生物、回腸炎）、免疫増殖性小腸疾患、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎、クローン病）、腸閉鎖、寄生虫病（アニサキス症、バランチジウム症、ブラストシスティス属感染症、クリプトスポリジウム症、二核アメーバ症（ｄｉｅｎｔａｍｏｅｂｉａｓｉｓ）、アメーバ赤痢、ジアルジア鞭毛虫症）、腸フィステル（直腸フィステル）、腸新生物（盲端新生物、結腸新生物、十二指腸新生物、回腸新生物、腸ポリープ、空腸新生物、直腸新生物）、腸閉塞（輸入脚症候群、十二指腸閉塞、楔合便（ｉｍｐａｃｔｅｄ ｆｅｃｅｓ）、腸偽閉塞（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｐｓｅｕｄｏ−ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）（盲腸捻転）、重積症）、腸閉鎖（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｐｅｒｆｏｒａｔｉｏｎ）、腸ポリープ（結腸ポリープ、ガードナー症候群、ポイツ−ジェガーズ症候群）、空腸疾患（空腸新生物）、吸収不良症候群（盲係蹄症候群、セリアック病（ｃｅｌｉａｃ ｄｉｓｅａｓｅ）、乳糖不耐症、短腸症候群、熱帯性スプルー、ホウィップル病）、腸間膜血管閉塞（ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃ ｖａｓｃｕｌａｒ ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ）、腸壁嚢胞状気腫、蛋白喪失性腸症（腸リンパギエクタシス（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｌｙｍｐｈａｇｉｅｃｔａｓｉｓ））、腸疾患（肛門疾患、便失禁、痔、直腸炎、腸フィステル、脱腸、直腸瘤）、消化性潰瘍（十二指腸潰瘍、消化性食道炎、出血、穿孔、胃潰瘍、ゾリンジャー−エリソン症候群）、胃切除後症候群（ダンピング症候群）、胃障害（例えば、塩酸欠乏症、胃十二指腸の逆流（胆汁逆流）、胃洞血管膨張（ｇａｓｔｒｉｃ ａｎｔｒａｌ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｃｔａｓｉａ）、胃フィステル、胃排出口閉塞（ｇａｓｔｒｉｃ ｏｕｔｌｅｔ ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）、胃炎（萎縮性または肥大性）、胃不全麻痺、胃拡張、胃憩室、胃新生物（胃癌、胃ポリープ、胃腺癌、増殖性胃ポリープ）、胃破裂、胃潰瘍、胃閉塞）、結核、内臓下垂症、嘔吐（例えば、吐血、妊娠悪阻、手術後悪心（ｐｏｓｔｏｐｅｒａｔｉｖｅ ｎａｕｓｅａ）および手術後嘔吐）および出血性大腸炎が挙げられる。
さらに胃腸系の疾患および／または障害として、胆汁管障害（例えば、胃壁破裂症）、フィステル（例えば、胆道フィステル、食道フィステル、胃フィステル、腸フィステル、膵臓フィステル）、新生物（例えば、胆汁管新生物、食道新生物（例えば、食道の腺癌）、食道扁平上皮癌、胃腸新生物、膵臓新生物（例えば、膵臓の腺癌）、膵臓のムチン嚢胞性新生物、膵臓嚢胞性新生物、膵臓芽腫および腹膜新生物）、食道疾患（例えば、水疱性疾患、カンジダ症、グリコゲンアカントシス、潰瘍形成、バレット食道静脈瘤、閉鎖症、嚢胞、憩室（例えば、ツェンカー憩室）、フィステル（例えば、気管食道フィステル）、運動性疾患（例えば、ＣＲＥＳＴ症候群、嚥下疾患、アカラシア、痙縮、食道逆流）、新生物、穿孔（例えば、ブールハーフェ症候群、マロリー−ヴァイス症候群）、狭窄症、食道炎、横隔膜ヘルニア（例えば、裂孔ヘルニア）；胃腸疾患（例えば、胃腸炎 （例えば、コレラ病、ノーウォークウイルス感染））、出血（例えば、吐血、メレナ、消化性潰瘍出血）、胃新生物（胃癌、胃ポリープ、胃腺癌、胃癌））、ヘルニア（例えば、先天性横隔膜ヘルニア、大腿ヘルニア、鼡径ヘルニア、閉鎖孔ヘルニア、臍ヘルニア、腹壁ヘルニア）、および腸疾患（例えば、盲端疾患（虫垂炎、盲端新生物））が挙げられる。
（走化性）
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、走化性活性を有し得る。走化性分子は、細胞（例えば、単球、線維芽細胞、好中球、Ｔ細胞、肥満細胞、好酸球、上皮細胞および／または内皮細胞）を、身体中の特定の部位（例えば、炎症、感染、または過剰増殖の部位）に誘引または動員する。次いで、動員された細胞は、特定の外傷または異常性を撃退および／または治癒し得る。
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、特定の細胞の走化性活性を増大し得る。次いで、これらの走化性分子を使用して、身体中の特定の位置に標的化した細胞の数を増加させることによって、炎症、感染、過剰増殖性の疾患、障害および／もしくは状態、または任意の免疫系障害を処置し得る。例えば、走化性分子を使用して、傷害を受けた位置に免疫細胞を誘引することによって、組織に対する創傷および他の外傷を処置し得る。本発明の走化性分子はまた、線維芽細胞を誘引し得、これは創傷を処置するために使用され得る。
本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが走化性活性を阻害し得ることもまた意図される。これらの分子はまた障害を処置するために使用され得る。従って、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、走化性のインヒビターとして使用され得る。
（結合活性）
本発明のアルブミン融合タンパク質は、この融合タンパク質の治療タンパク質部分に結合する分子、またはこの融合タンパク質の治療タンパク質部分が結合する分子についてスクリーニングするために使用され得る。この融合タンパク質とこの分子との結合は、結合した融合タンパク質または分子の活性を活性化（アゴニスト）、増大、阻害（アンタゴニスト）、または減少させ得る。そのような分子の例としては、抗体、オリゴヌクレオチド、タンパク質（例えば、レセプター）、または低分子が挙げられる。
好ましくは、この分子は、本発明の融合タンパク質の治療タンパク質部分の天然のリガンド（例えば、リガンドのフラグメント）、または天然の基質、リガンド、構造的模倣物、もしくは機能的模倣物に密接に関連する（Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １（２）：第５章（１９９１）を参照のこと）。同様に、この分子は、本発明のアルブミン融合タンパク質が結合する天然のレセプター、または少なくとも、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療タンパク質部分によって結合され得るレセプターのフラグメント（例えば、活性部位）に密接に関連し得る。いずれの場合においても、この分子は、公知の技術を用いて合理的に設計され得る。
好ましくは、これらの分子についてのスクリーニングは、本発明のアルブミン融合タンパク質を発現する適切な細胞を産生する工程を包含する。好ましい細胞としては、哺乳動物、酵母、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ、またはＥ．ｃｏｌｉ由来の細胞が挙げられる。
アッセイは、本発明のアルブミン融合タンパク質への候補化合物の結合を単純に試験し得、ここで結合は、標識によって、または標識された競合物との競合に関するアッセイにおいて検出される。さらに、アッセイは、候補化合物がこの融合タンパク質への結合によって生成されるシグナルを生じるか否かを試験し得る。
あるいは、アッセイは、無細胞調製物、固体支持体に接着された融合タンパク質／分子、化学ライブラリー、または天然産物の混合物を用いて実施され得る。アッセイはまた、候補化合物を、アルブミン融合タンパク質を含む溶液と混合する工程、融合タンパク質／分子の活性または結合を測定する工程、および融合タンパク質／分子の活性または結合を、標準と比較する工程を単純に包含し得る。
好ましくは、ＥＬＩＳＡアッセイは、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を使用して、サンプル（例えば、生物学的サンプル）における融合タンパク質のレベルまたは活性を測定し得る。抗体は、アルブミン融合タンパク質への直接的もしくは間接的のいずれかの結合、または基質についてのアルブミン融合タンパク質との競合によって、融合タンパク質のレベルまたは活性を測定し得る。
さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療タンパク質部分が結合するレセプターは、当業者に公知の多くの方法（例えば、リガンドパニングおよびＦＡＣＳソーティング（Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎ．，１（２）、第５章（１９９１））によって同定され得る。例えば、発現クローニングは、ポリアデニル化ＲＮＡがこのアルブミン融合タンパク質に応答する細胞から調製される場合に用いられ、例えば、ＮＩＨ３Ｔ３細胞（これは、ＦＧＦファミリータンパク質に対する複数のレセプターを含むことが公知である）、およびＳＣ−３細胞、およびこのＲＮＡから作製されたｃＤＮＡライブラリーは、プールに分けられ、そしてこのアルブミン融合タンパク質に応答性でないＣＯＳ細胞または他の細胞をトランスフェクトするために使用される。ガラススライド上で増殖しているトランスフェクトされた細胞は、それらを標識化した後に、本発明のアルブミン融合タンパク質に曝露される。このアルブミン融合タンパク質は、種々の手段（部位特異的プロテインキナーゼに対する認識部位のヨウ素化または封入を含む）によって標識化され得る。
固定化およびインキュベーション後、スライドは、オートラジオグラフィー分析に供される。陽性プールを同定し、そしてサブプールを、反復性のサププール化および再スクリーニングプロセスを使用して調製および再びトランスフェクトして、最終的に推定レセプターをコードする単一のクローンを生じる。
レセプター同定のための代替のアプローチとして、標識アルブミン融合タンパク質は、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療タンパク質成分についてレセプター分子を発現する調製物を、細胞膜と光親和性に連結し得るか、または抽出し得る。架橋された材料は、ＰＡＧＥ分析によって分解され、そしてＸ線フィルムに曝露される。融合タンパク質のレセプターを含む標識複合体が切り出され得、ペプチドフラグメントへと分離され得、そしてタンパク質微量配列決定に供され得る。微量配列決定から得られるアミノ酸配列を使用して、１組の縮重オリゴヌクレオチドプローブを設計してｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、推定レセプターをコードする遺伝子を同定する。
さらに、遺伝子シャッフリング、モチーフシャッフリング、エキソンシャッフリング、および／またはコドンシャッフリングの技術（集合的に「ＤＮＡシャッフリング」という）を利用して、融合タンパク質、および／または本発明のアルブミン融合タンパク質の治療タンパク質部分もしくはアルブミン成分の活性を調節し得、それによって本発明のアルブミン融合タンパク質のアゴニストおよびアンタゴニストを効果的に生成する。一般に、米国特許第５，６０５，７９３号、同第５，８１１，２３８号、同第５，８３０，７２１号、同第５，８３４，２５２号、および同第５，８３７，４５８号、ならびにＰａｔｔｅｎ，Ｐ．Ａ．ら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：７２４〜３３（１９９７）；Ｈａｒａｙａｍａ，Ｓ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６（２）：７６〜８２（１９９８）；Ｈａｎｓｓｏｎ，Ｌ．Ｏ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８７：２６５〜７６（１９９９）；ならびにＬｏｒｅｎｚｏ，Ｍ．Ｍ．およびＢｌａｓｃｏ，Ｒ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２４（２）：３０８〜１３（１９９８）（これらの特許および刊行物の各々は、本明細書において参考として援用される）を参照のこと。１つの実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの変更は、ＤＮＡシャッフリングによって達成され得る。ＤＮＡシャッフリングは、相同組換えまたは部位特異的な組換えによる、２つ以上のＤＮＡセグメントの、所望の分子への構築を含む。別の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、およびコードされたアルブミン融合タンパク質は、組換えの前に、誤りがちな（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ）ＰＣＲ、ランダムヌクレオチド挿入または他の方法によるランダム変異誘発に供することによって、変更され得る。別の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質の１つ以上の成分、モチーフ、切片、部分、ドメイン、フラグメントなどは、１つ以上の異種分子の１つ以上の成分、モチーフ、切片、部分、ドメイン、フラグメントなどと組換えられ得る。好ましい実施形態において、この異種分子は、ファミリーのメンバーである。さらに好ましい実施形態において、この異種分子は、例えば、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）−α、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、ＴＧＦ−β、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、アクチビンＡおよびアクチビンＢ、デカペンタプレジック（ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ）（ｄｐｐ）、６０Ａ、ＯＰ−２、ドーサリン（ｄｏｒｓａｌｉｎ）、増殖分化因子（ＧＤＦ）、結節（ｎｏｄａｌ）、ＭＩＳ、インヒビン−α、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β５、および神経膠由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）のような増殖因子である。
他の好ましいフラグメントは、治療タンパク質部分および／または本発明のアルブミン融合タンパク質のアルブミン成分の生物学的に活性なフラグメントである。生物学的に活性なフラグメントは、治療タンパク質部分および／または本発明のアルブミン融合タンパク質のアルブミン成分の活性に類似の活性を示すが、必ずしも治療タンパク質部分および／または本発明のアルブミン融合タンパク質のアルブミン成分の活性に同一ではないフラグメントである。このフラグメントの生物学的活性は、改善された所望の活性、または減少した所望されない活性を含み得る。
さらに、本発明は、本発明のアルブミン融合タンパク質の作用を調節する化合物を同定するために化合物をスクリーニングする方法を提供する。このようなアッセイの例は、哺乳動物線維芽細胞、本発明のアルブミン融合タンパク質、スクリーニングされるべき化合物および３［Ｈ］チミジンを、線維芽細胞が通常増殖する細胞培養条件下で合わせる工程を包含する。コントロールアッセイは、スクリーニングされるべき化合物の非存在下で実施され得、そしてこの化合物の存在下での線維芽細胞の増殖の量と比較して、各々の場合における３［Ｈ］チミジンの取り込みの決定によって、この化合物が増殖を刺激するか否かを決定し得る。線維芽細胞の増殖の量は、３［Ｈ］チミジンの取り込みを測定する液体シンチレーションクロマトグラフィーによって測定される。アゴニスト化合物およびアンタゴニスト化合物の両方が、この手順により同定され得る。
別の方法において、本発明の融合タンパク質の治療タンパク質成分に対するレセプターを発現する哺乳動物細胞または膜調製物は、この化合物の存在下において標識化した本発明の融合タンパク質とともにインキュベートされる。次いで、この化合物がこの相互作用を増強またはブロックする能力が、測定され得る。あるいは、スクリーニングされるべき化合物の相互作用に従う既知のセカンドメッセンジャー系の応答およびレセプターが測定され、そしてこの化合物がこのレセプターに結合し、そしてセカンドメッセンジャー応答を誘発する能力を測定して、この化合物が潜在的なアゴニストまたはアンタゴニストであるか否かを決定する。このようなセカンドメッセンジャー系には、ｃＡＭＰグアニル酸シクラーゼ、イオンチャネルまたはホスホイノシチド加水分解が挙げられるが、これらに限定されない。
これらの上記のアッセイの全ては、診断マーカーまたは予後マーカーとして使用され得る。これらのアッセイを用いて発見される分子は、融合タンパク質／分子を活性化または阻害することによって、疾患を処置するか、あるいは患者に特定の結果（例えば、血管増殖）をもたらすために使用され得る。さらに、アッセイは、適切に操作された細胞または組織からの本発明のアルブミン融合タンパク質の産生を阻害または増強し得る因子を発見し得る。
従って、本発明は、以下の工程を含む本発明のアルブミン融合タンパク質に結合する化合物を同定する方法を包含する：（ａ）候補結合化合物を本発明のアルブミン融合タンパク質とともにインキュベートする工程；および（ｂ）結合が生じたか否かを決定する工程。さらに、本発明は、以下の工程を含むアゴニスト／アンタゴニストを同定する方法を包含する：（ａ）候補化合物を本発明のアルブミン融合タンパク質とともにインキュベートする工程、（ｂ）生物学的活性をアッセイする工程、および（ｂ）融合タンパク質の生物学的活性が改変されているか否かを決定する工程。
（標的化された送達）
別の実施形態において、本発明は、組成物を、本発明のアルブミン融合タンパク質の成分についてのレセプターを発現する標的化細胞に送達する方法を提供する。
本明細書中で議論される場合、本発明の融合タンパク質は、異種ポリペプチド、異種核酸、毒素またはプロドラッグと、疎水性、親水性、イオン性および／または共有結合性の相互作用を介して会合し得る。１つの実施形態において、本発明は、異種ポリペプチドまたは核酸と会合した本発明の融合タンパク質（抗体を含む）を投与することによる、本発明の組成物の細胞への特異的な送達のための方法を提供する。１つの例において、本発明は、治療タンパク質を標的化細胞中へ送達するための方法を提供する。別の例において、本発明は、一本鎖核酸（例えば、アンチセンスまたはリボザイム）あるいは二本鎖核酸（例えば、細胞のゲノムに組み込まれ得るか、またはエピソームにて複製し得、そして転写され得る、ＤＮＡ）を、標的化細胞に送達するための方法を提供する。
別の実施形態において、本発明は、毒素または細胞傷害性プロドラッグと会合した本発明のアルブミン融合タンパク質（例えば、本発明のポリペプチドまたは本発明の抗体）を投与することによる細胞の特異的破壊（例えば、腫瘍細胞の破壊）のための方法を提供する。
「毒素」とは、内因性の細胞傷害性エフェクター系、放射性同位体、ホロ毒素（ｈｏｌｏｔｏｘｉｎ）、改変型毒素、毒素の触媒サブユニット、または規定の条件下で細胞死を引き起こす細胞中もしくは細胞表面には通常存在しない任意の分子もしくは酵素を、結合および活性化する化合物を意味する。本発明の方法に従って使用され得る毒素としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：当該分野で公知の放射性同位体、固有のまたは誘導された内因性の細胞傷害性エフェクター系を結合する化合物（例えば、抗体（またはその一部を含む補体固定）、チミジンキナーゼ、エンドヌクレアーゼ、ＲＮＡｓｅ、α毒素、リシン、アブリン、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ内毒素Ａ、ジフテリア毒素、サポリン、モモルジン（ｍｏｍｏｒｄｉｎ）、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、α−サルシン（ｓａｒｃｉｎ）およびコレラ毒素。「細胞傷害性プロドラッグ」とは、通常細胞内に存在する酵素によって、細胞傷害性化合物へと変換される非毒性の化合物を意味する。本発明の方法に従って使用され得る細胞傷害性プロドラッグとしては、安息香酸マスタードアルキル化剤のグルタミル誘導体、エトポシドまたはマイトマイシンＣのリン酸誘導体、シトシンアラビノシド、ダウノルビシン、およびドキソルビシンのフェノキシアセトアミド誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
（薬物スクリーニング）
本発明のアルブミン融合タンパク質またはアルブミン融合タンパク質の治療タンパク質部分に相当するタンパク質の活性を改変する分子についてスクリーニングするための、本発明のアルブミン融合タンパク質、またはこれらの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの使用が、さらに意図される。このような方法は、融合タンパク質を、アンタゴニスト活性またはアゴニスト活性を有することが疑われる選択された化合物と接触させる工程、および結合に続いてこの融合タンパク質の活性をアッセイする工程を包含する。
本発明は、種々の薬物スクリーニング技術のいずれかにおいて、本発明のアルブミン融合タンパク質、またはそれらの結合フラグメントを使用することによって治療用化合物をスクリーニングするために特に有用である。このような試験に用いられるアルブミン融合タンパク質は、固体支持体に固定化され得、細胞表面上に発現され得、溶液中で遊離であり得、または細胞内に局在化され得る。薬物スクリーニングの１つの方法は、アルブミン融合タンパク質を発現する組換え核酸を用いて安定に形質転換される真核生物宿主細胞または原核生物宿主細胞を利用する。薬物は、競合結合アッセイにおいて、このような形質転換細胞に対してスクリーニングされる。例えば、試験されている薬剤と本発明のアルブミン融合タンパク質との間の複合体の形成（ｆｏｒｍｕｌａｔｏｎ）を測定し得る。
従って、本発明は、本発明のアルブミン融合タンパク質によって媒介される活性に影響を及ぼす薬物または任意の他の薬剤についてのスクリーニング方法を提供する。これらの方法は、当該分野で周知の方法によって、このような薬剤を本発明のアルブミン融合タンパク質もしくはそのフラグメントと接触させる工程、およびこの薬剤とこのアルブミン融合タンパク質もしくはそのフラグメントとの間の複合体の存在についてアッセイする工程を包含する。このような競合結合アッセイにおいて、スクリーニングされる薬剤は、代表的に、標識化される。インキュベーション後に、遊離の薬剤は、結合形態中に存在する薬剤から分離され、そして遊離または複合体化されていない標識の量は、特定の薬剤が本発明のアルブミン融合タンパク質に結合する能力の尺度である。
薬物スクリーニングについての別の技術は、本発明のアルブミン融合タンパク質に対する適切な結合親和性を有する化合物に対するハイスループットスクリーニングを提供し、そして欧州特許出願８４／０３５６４（１９８４年９月１３日公開）（これは、本明細書中で参考として援用される）に非常に詳細に記載される。簡潔にいうと、大量の異なる小さなペプチド試験化合物は、固体基材（例えば、プラスチックピンまたはいくつかの他の表面）上で合成される。ペプチド試験化合物を、本発明のアルブミン融合タンパク質と反応させ、そして洗浄する。次いで、結合したペプチドは、当該分野で周知の方法によって検出される。精製されたアルブミン融合タンパク質は、前述の薬物スクリーニング技術での使用のためにプレート上に直接コーディングされる。さらに、非中和抗体を使用して、このペプチドを捕捉し得、そして固体支持体上にそれを固定し得る。
本発明はまた、競合薬物スクリーニングアッセイの使用を意図し、ここで、本発明のアルブミン融合タンパク質を結合し得る中和抗体は、アルブミン融合タンパク質またはそのフラグメントに対する結合について試験化合物と特異的に競合する。この様式において、抗体を使用して、本発明のアルブミン融合タンパク質と１つ以上の抗原性エピトープを共有する任意のペプチドの存在を検出する。
（結合ペプチドおよび他の分子）
本発明はまた、本発明のアルブミン融合タンパク質に結合するポリペプチドおよび非ポリペプチドを同定するためのスクリーニング方法、ならびにそれによって同定された結合分子を含む。これらの結合分子は、例えば、本発明のアルブミン融合タンパク質のアゴニストおよびアンタゴニストとして有用である。そのようなアゴニストおよびアンタゴニストは、本発明に従って、以下に詳細に記載される治療実施形態において使用され得る。
この方法は、以下の工程を包含する：
ａ．本発明のアルブミン融合タンパク質を多数の分子と接触させる工程；および
ｂ．アルブミン融合タンパク質に結合する分子を同定する工程。
本発明のアルブミン融合タンパク質を多数の分子と接触させる工程は、多数の方法によってもたらされ得る。例えば、アルブミン融合タンパク質を固体支持体上に固定化させ、そして多数の分子の溶液を固定したポリペプチドと接触させることを意図し得る。このような手順は、固定した本発明のアルブミン融合タンパク質から構成される親和性マトリックスを用いるアフィニティークロマトグラフィープロセスに類似している。次いで、アルブミン融合タンパク質に対して選択的な親和性を有する分子が、親和性選択によって精製され得る。固体支持体の性質、アルブミン融合タンパク質のこの固体支持体への付着に関するプロセス、溶媒、および親和性単離または親和性選択の条件は、大部分が慣用的であり、そして当業者に周知である。
あるいは、多数のポリペプチドはまた、ポリペプチドのサブセットまたは個々のポリペプチドを含む実質的に別々の画分へ分離され得る。例えば、多数のポリペプチドは、ゲル電気泳動、カラムクロマトグラフィーなどポリペプチドの分離に関して当業者に公知の方法によって、分離され得る。個々のポリペプチドはまた、宿主細胞の外部表面上またはほぼ外部表面に発現されるような様式で、形質転換された宿主細胞（例えば、組換えファージ）によって産生され得る。次いで、個々の単離物は、アルブミン融合タンパク質によって「プローブ化」され得、必要に応じて発現に必要とされるであろうインデューサーの存在下で、アルブミン融合タンパク質と個々のクローンとの間で任意の選択的親和性相互作用が起こったか否かが決定される。アルブミン融合タンパク質を個々のポリペプチドを含む各画分と接触させる前に、これらのポリペプチドはまず、さらなる簡便性のために固体支持体に移され得る。そのような固体支持体は、単に、例えばニトロセルロースまたはナイロンでできたフィルター膜の断片であり得る。この様式において、陽性クローンは、形質転換宿主細胞の発現ライブラリーの集団（これらは、本発明のアルブミン融合タンパク質に対して選択的親和性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ構築物を持つ）から同定され得る。さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質に対して選択的親和性を有するポリペプチドのアミノ酸配列が、従来の手段によって直接決定され得るか、またはこのポリペプチドをコードするＤＮＡのコード配列が、頻繁により簡便に決定され得る。次いで、一次配列が、対応するＤＮＡ配列から推定され得る。アミノ酸配列がポリペプチド自身から決定されるものである場合、微小配列決定技術を使用し得る。この配列決定技術は、質量分析法を含み得る。
特定の状況において、選択的親和性相互作用の存在を決定または検出しようと試みる前に、未結合のポリペプチドを、本発明のアルブミン融合タンパク質および多数のポリペプチドの混合物から洗浄除去することが望ましくあり得る。このような洗浄工程は、本発明のアルブミン融合タンパク質または多数のポリペプチドが固体支持体に結合している場合に、特に望ましくあり得る。
本方法に従って提供される多数の分子は、多様性ライブラリー（例えば、本発明のアルブミン融合タンパク質へ特異的に結合する分子をスクリーニングし得るランダムまたはコンビナトリアルの、ペプチドライブラリーまたは非ペプチドライブラリー）として提供され得る。使用され得る多くのライブラリー（例えば、化学合成ライブラリー、組換えライブラリー（例えば、ファージディスプレイライブラリー）、およびインビトロ翻訳ベースのライブラリー）が、当該分野で公知である。化学合成ライブラリーの例は、以下に記載される：Ｆｏｄｏｒら、１９９１、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：７６７−７７３；Ｈｏｕｇｈｔｅｎら、１９９１、Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８４−８６；Ｌａｍら、１９９１、Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２−８４；Ｍｅｄｙｎｓｋｉ、１９９４、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：７０９−７１０；Ｇａｌｌｏｐら、１９９４、Ｊ．Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３７（９）：１２３３−１２５１；Ｏｈｌｍｅｙｅｒら、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：１０９２２−１０９２６；Ｅｒｂら、１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：１１４２２−１１４２６；Ｈｏｕｇｈｔｅｎら、１９９２，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：４１２；Ｊａｙａｗｉｃｋｒｅｍｅら、１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：１６１４−１６１８；Ｓａｌｍｏｎら、１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：１１７０８−１１７１２；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９３／２０２４２；ならびにＢｒｅｎｎｅｒおよびＬｅｒｎｅｒ、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：５３８１−５３８３。
ファージディスプレイライブラリーの例は、以下に記載される：ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６−３９０；Ｄｅｖｌｉｎら、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９：４０４−４０６；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ，Ｒ．Ｂ．ら、１９９２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７１１−７１８）；Ｌｅｎｓｔｒａ、１９９２、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１５２：１４９−１５７；Ｋａｙら、１９９３、Ｇｅｎｅ １２８：５９−６５；ならびにＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／１８３１８（１９９４年８月１８日）。
インビトロ翻訳ベースのライブラリーとしては、以下：ＰＣＴ公開番号ＷＯ９１／０５０５８（１９９１年４月１８日）；およびＭａｔｔｈｅａｋｉｓら、１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：９０２２−９０２６に記載されるものが挙げられるが、これらに限定されない。
非ペプチドライブラリーの例として、ベンゾジアゼピンライブラリー（例えば、Ｂｕｎｉｎら、１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：４７０８−４７１２を参照のこと）が、使用のために適応され得る。ペプトイドライブラリー（Ｓｉｍｏｎら、１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：９３６７−９３７１）がまた使用され得る。使用され得るライブラリーの別の例は、Ｏｓｔｒｅｓｈら（１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：１１１３８−１１１４２）によって記載され、ここでは、ペプチド中のアミド官能基が、過剰にメチル化（ｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｅ）されて、化学的に形質転換されたコンビナトリアルライブラリーを生成する。
本発明において有用である種々の非ペプチドライブラリーは、大きい。例えば、ＥｃｋｅｒおよびＣｒｏｏｋｅ（１９９５，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３：３５１−３６０）は、種々のライブラリーの基礎を形成する化学種の間として、ベンゾジアゼピン、ヒダントイン、ピペラジンジオン、ビフェニル、糖アナログ、β−メルカプトケトン、アリール酢酸、アシルピペラジン、ベンゾピラン、キューバン（ｃｕｂａｎｅ）、キサンチン、アミンイミドおよびオキサゾロンを列挙している。
非ペプチドライブラリーは、２つの型に大きく分類され得る：修飾されたモノマーおよびオリゴマー。修飾モノマーライブラリーは、比較的単純な骨格構造を使用し、この上に種々の官能基が付加される。しばしば、骨格は、既知の有用な薬理学的活性を有する分子である。例えば、骨格は、ベンゾジアゼピン構造であり得る。
非ペプチドオリゴマーライブラリーは、モノマーの順序に依存して新規な形状を作製する様式で共にアセンブルされる、多数のモノマーを使用する。使用されるモノマー単位の間には、カルバメート、ピロリノン（ｐｙｒｒｏｌｉｎｏｎｅ）およびモルホリノがある。ペプトイド（側鎖がα炭素よりもαアミノ基に結合するペプチド様オリゴマー）は、非ペプチドオリゴマーライブラリーの別のバージョンの基礎を形成する。最初の非ペプチドオリゴマーライブラリーは、単一型のモノマーを使用し、従って、反復骨格を含む。近年のライブラリーは、１つより多くのモノマーを使用し、自由度が添加されたライブラリーを与える。
ライブラリーをスクリーニングすることは、多様な一般的に公知の方法のいずれかによって達成され得る。例えば、ペプチドライブラリーのスクリーニングを開示する以下の参考文献を参照のこと：ＰａｒｍｌｅｙおよびＳｍｉｔｈ、１９８９、Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２５１：２１５−２１８；ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６−３９０；Ｆｏｗｌｋｅｓら、１９９２；ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：４２２−４２７；Ｏｌｄｅｎｂｕｒｇら、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：５３９３−５３９７；Ｙｕら、１９９４、Ｃｅｌｌ ７６：９３３−９４５；Ｓｔａｕｄｔら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：５７７−５８０；Ｂｏｃｋら、１９９２、Ｎａｔｕｒｅ ３５５：５６４−５６６；Ｔｕｅｒｋら、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：６９８８−６９９２；Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎら、１９９２、Ｎａｔｕｒｅ ３５５：８５０−８５２；米国特許第５，０９６，８１５号、米国特許第５，２２３，４０９号、および米国特許第５，１９８，３４６号（全てＬａｄｎｅｒらに対して）；ＲｅｂａｒおよびＰａｂｏ、１９９３、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６３：６７１−６７３；ならびにＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／１８３１８。
特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質を結合する分子を同定するためのスクリーニングは、ライブラリーのメンバーを固相に固定化された本発明のアルブミン融合タンパク質と接触させ、そしてアルブミン融合タンパク質に結合するこれらのライブラリーメンバーを収集することによって実行され得る。そのようなスクリーニング方法の例の、「パニング」と呼ばれる技術は、例として、ＰａｒｍｌｅｙおよびＳｍｉｔｈ，１９８８，Ｇｅｎｅ ７３：３０５−３１８；Ｆｏｗｌｋｅｓら、１９９２，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：４２２−４２７；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／１８３１８；ならびにその中に引用される参考文献に記載される。
別の実施形態において、酵母中の相互作用タンパク質を選択するためのツーハイブリッドシステム（ＦｉｅｌｄｓおよびＳｏｎｇ，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ ３４０：２４５−２４６；Ｃｈｉｅｎら、１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：９５７８−９５８２）が、本発明のポリペプチドに特異的に結合する分子を同定するために使用され得る。
結合分子がポリペプチドである場合、このポリペプチドは、任意のペプチドライブラリー（ランダムペプチドライブラリー、コンビナトリアルペプチドライブラリー、またはバイアスペプチドライブラリーを含む）から簡便に選択され得る。用語「バイアス（ｂｉａｓｅｄ）」は、この場合のペプチドにおいて、ライブラリーを作製する方法が、生じる分子収集の多様性を支配する１つ以上のパラメーターを制限するように操作されることを意味するために本明細書中に使用される。
従って、本当にランダムなペプチドライブラリーは、ペプチドの所定の位置に特定のアミノ酸を見出す可能性が全て２０のアミノ酸に関して同じである、ペプチドの収集物を作製する。しかし、例えば、リジンがアミノ酸５つ毎に生じることを特定するかまたはデカペプチドライブラリーの４位、８位および９位がアルギニンのみを含むように固定して特定することによって、バイアスがライブラリーに導入され得る。明らかに、バイアスの多くの型は、意図され得、そして本発明は、任意の特定のバイアスに制限されない。さらに、本発明は、特定の型のペプチドライブラリー（例えば、ファージディスプレイペプチドライブラリーおよびＤＮＡ挿入物と共にλファージベクターを含むＤＮＡ構築物を使用するライブラリー）を意図する。
上記のように、結合分子（ポリペプチドである）の場合、このポリペプチドは、約６から約６０未満のアミノ酸残基を有し、好ましくは約６〜約１０アミノ酸残基、そしてより好ましくは約６〜約２２アミノ酸であり得る。別の実施形態において、結合ポリペプチドは、１５〜１００の範囲のアミノ酸、または２０〜５０の範囲のアミノ酸を有する。
選択された結合ポリペプチドは、化学合成または組換え発現によって得られ得る。
（他の活性）
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、血管内皮細胞増殖を刺激する能力の結果として、種々の疾患状態（例えば、血栓症、動脈硬化、および他の心臓血管の状態）に起因する虚血組織の血管再生を刺激するための処置において利用され得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドをまた利用して、上記で議論されるように新脈管形成および肢の再形成を刺激し得る。
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、傷害、熱傷、手術後組織修復、および潰瘍に起因する創傷の処置にもまた利用し得る。なぜなら、それらは異なる起源の種々の細胞（例えば、線維芽細胞および骨格筋細胞）に対してマイトジェン性であり、それゆえ損傷した組織または疾患組織の修復または置換を促進するからである。
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、ニューロンの成長を刺激し、そして特定のニューロンの障害または神経変性状態（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、およびＡＩＤＳ関連複合体）において生じるニューロンの損傷を処置および予防するために利用し得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、軟骨細胞増殖を刺激する能力を有し得、それゆえ、これらは、骨および歯周の再形成を増強し、そして組織移植片または骨の移植片における補助のために利用され得る。
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドをまた利用して、ケラチノサイト増殖を刺激することにより、日焼けに起因する皮膚の老化を予防し得る。
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドをまた、抜け毛を予防するために利用し得る。なぜなら、ＦＧＦファミリーのメンバーは、髪形成細胞を活性化し、そしてメラノサイト増殖を促進するからである。同じ系列にそって、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを利用して、他のサイトカインと組み合わせて使用した場合、造血細胞および骨髄細胞の増殖および分化を刺激し得る。
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドをまた利用して、移植前の器官を維持し得るか、または一次組織の細胞培養を支持するために使用し得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、初期胚における分化のための中胚葉起源の組織を誘導するために利用され得る。
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、先に議論されるように造血系統に加えて、胚性幹細胞の分化もしくは増殖を増加または減少し得る。
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、哺乳動物の特徴（例えば、身長、体重、毛の色、眼の色、皮膚、脂肪組織の割合、色素沈着、大きさ、および形（例えば、美容外科））を調節するために使用され得る。同様に、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、異化作用、同化作用、プロセシング、利用、およびエネルギーの貯蔵に影響を及ぼす哺乳動物の代謝を調節するために使用され得る。
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、バイオリズム、カリカディック（ｃａｒｉｃａｄｉｃ）リズム、うつ病（抑うつ性の障害を含む）、暴力の傾向、痛に対する耐性、生殖能力（好ましくは、アクチビンまたはインヒビン様活性によって）、ホルモンレベルもしくは内分泌レベル、食欲、性欲、記憶、ストレス、または他の認知の質に影響を及ぼすことによって、哺乳動物の精神状態または身体状態を変更するために使用され得る。
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、貯蔵能力、脂肪含有量、脂質、タンパク質、炭水化物、ビタミン、ミネラル、補因子、または他の栄養成分を増加または減少させるような食品添加物または保存剤として使用され得る。
上記で引用される適用は、広範な種々の宿主における用途を有する。そのような宿主としては、ヒト、ネズミ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、マウス、ラット、ハムスター、ブタ、ミニブタ（ｍｉｃｒｏ−ｐｉｇ）、ニワトリ、ヤギ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、非ヒト霊長類、およびヒトが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、宿主は、マウス、ウサギ、ヤギ、モルモット、ニワトリ、ラット、ハムスター、ブタ、ヒツジ、イヌまたはネコである。好ましい実施形態において、宿主は、哺乳動物である。最も好ましい実施形態において、宿主は、ヒトである。
本発明を一般的に記載したように、同様のことは、以下の実施例に参考として容易に理解され、そして指示されるように提供され、そして制限することを意図されない。
さらなる説明を有することなく、当業者は、前記説明および以下の指示例を使用して、本発明において見出される変化を作製し、そして利用し得、そして請求の範囲に記載される方法を実施し得る。従って、以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を特異的に指示し、そして任意の方法において開示の残部を制限するように構築されない。
（実施例１：ｐＳｃＮＨＳＡおよびｐＳｃＣＨＳＡの生成
ベクターｐＳｃＮＨＳＡ （ＡＴＣＣ信託番号ＰＴＡ−３２７９）およびｐＳｃＣＨＳＡ （ＡＴＣＣ信託番号ＰＴＡ−３２７６）ｐＰＰＣ０００５ （ＡＴＣＣ信託番号ＰＴＡ−３２７８）の誘導体であり、そして治療用タンパク質またはフラグメントまたはそれらの変異体をコードするポリヌクレオチドが、ヒト血清アルブミン「ＨＳＡ」をコードするポリヌクレオチドを有する翻訳フレームに隣接してまたは翻訳フレーム中に挿入されるクローニングベクターとして使用される。ｐＳｃＣＨＳＡは、治療用タンパク質ＨＳＡ融合を生じるために使用され得、一方ｐＳｃＮＨＳＡは、ＨＳＡ治療用タンパク質融合を生じるために使用され得る。
（ｐＳｃＣＨＳＡの生成：治療的部分に対するアルブミン部分Ｃ末端とのアルブミン融合）
成熟アルブミンタンパク質をコードするＤＮＡに対する治療的タンパク質Ｎ末端をコードするＤＮＡのクローニングを促進させるためのベクターを、ｐＰＰＣ０００５におけるキメラＨＳＡシグナルペプチドをコードする核酸配列がＸｈｏＩ部位およびＣｌａＩ部位を含むように変更することによって作製した。
まず、ｐＰＰＣ０００５に固有のＸｈｏＩ部位およびＣｌａＩ部位（ＡＤＨ１終結配列の３’に位置する）を、ＸｈｏＩおよびＣｌａＩでｐＰＰＣ０００５を消化することによって排除し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで突出末端を削り、平滑末端を再ライゲーションしてｐＰＰＣ０００６を作製した。
次に、ＸｈｏＩ制限酵素認識部位およびＣｌａＩ制限酵素認識部位を、２ラウンドＰＣＲを用いて、ｐＰＰＣ０００６中のＨＳＡ（ＨＳＡリーダーのキメラおよび接合因子α「ＭＡＦ」由来のｋｅｘ２部位）のシグナルペプチドをコードする核酸配列中に操作した。
ＰＣＲの第一ラウンドにおいて、配列番号１０３９および配列番号１０４０として示したプライマーを用いた増幅を行った。配列番号１０３９として示したプライマーは、ＨＳＡのシグナルペプチド配列の部分、接合因子αリーダー配列由来のｋｅｘ２部位、およびＨＳＡの成熟形態のアミノ末端の部分をコードする核酸配列を含む。この配列に４つの点変異を導入し、キメラシグナルペプチドおよびＨＳＡの成熟形態の接合部に見出されるＸｈｏＩ部位およびＣｌａＩ部位を作製した。これらの４つの点変異は、以下に示した配列中に下線を引いて示す。ｐＰＰＣ０００５において、５’から３’までのこれらの４つの位置のヌクレオチドは、Ｔ、Ｇ、ＴおよびＧである。
５’−ＧＣＣＴＣＧＡＧＡＡＡＡＧＡＧＡＴＧＣＡＣＡＣＡＡＧＡＧＴＧＡＧＧＴＴＧＣＴＣＡＴＣＧＡＴＴＴＡＡＡＧＡＴＴＴＧＧＧ−３’ （配列番号１０３９）および５’−ＡＡＴＣＧＡＴＧＡＧＣＡＡＣＣＴＣＡＣＴＣＴＴＧＴＧＴＧＣＡＴＣＴＣＴＴＴＴ
ＣＴＣＧＡＧＧＣＴＣＣＴＧＧＡＡＴＡＡＧＣ−３’ （配列番号１０４０）。次いで、ＰＣＲの第二円形は、上流隣接プライマー５’−ＴＡＣＡＡＡＣＴＴＡＡＧＡＧＴＣＣＡＡＴＴＡＧＣ−３’ （配列番号１０４１）および下流隣接プライマー５’−ＣＡＣＴＴＣＴＣＴＡＧＡＧＴＧＧＴＴＴＣＡＴＡＴＧＴＣＴＴ−３’ （配列番号１０４２）を用
いて実施された。 次いで、得られたＰＣＲ産物を精製し、そしてＡｆｌ ＩＩおよびＸｂａ Ｉで消化し、そしてｐＰＰＣ０００６中の同じ部位に連結して、ｐＳｃＣＨＳＡを作製した。得られたプラスミドは、シグナル配列へと操作された、Ｘｈｏ Ｉ部位およびＣｌａ Ｉ部位を有する。Ｘｈｏ Ｉ部位の存在は、ＬＤＫＲからＬＥＫＲへの、シグナル配列の末端に１アミノ酸変化を生じる。このＤからＥへの変化は、５’ Ｓａｌ Ｉ部位（これは、Ｘｈｏ Ｉ部位と適合性である）および３’ Ｃｌａ Ｉ部位を有する、アルブミン融合タンパク質の治療剤部分をコードするポリヌクレオチドを含む核酸配列が、ｐＳｃＣＨＳＡのＸｈｏ Ｉ部位およびＣｌａ Ｉ部位に連結される場合、最終的なアルブミン融合タンパク質発現プラスミド中に存在しない。Ｓａｌ ＩおよびＸｈｏ Ｉの連結は、シグナルペプチド配列の元のアミノ酸配列を回復させる。アルブミン融合タンパク質の治療剤部分をコードするＤＮＡは、Ｋｅｘ２部位（Ｋｅｘ２は、シグナルペプチドの最後の二塩基性アミノ酸配列ＫＲの後ろで切断する）の後ろでかつＣｌａ Ｉ部位の前に挿入され得る。
（ｐＳｃＮＨＳＡの作製：治療剤部分に対するアルブミン部分Ｎ末端のアルブミン融合体）
成熟アルブミンタンパク質をコードするＤＮＡのＣ末端へと、治療剤タンパク質部分をコードするＤＮＡをクローニングするのを容易にするベクターを、３つの８塩基対制限部位をｐＳｃＣＨＳＡに付加することにより作製した。Ａｓｃ Ｉ制限部位、Ｆｓｅ Ｉ制限部位、およびＰｍｅ Ｉ制限部位を、成熟ＨＳＡタンパク質をコードする核酸配列の末端にて、Ｂｓｕ３６ Ｉ部位とＨｉｎｄ ＩＩＩ部位との間に添加した。これを、下線を付したＡｓｃ Ｉ制限部位、Ｆｓｅ Ｉ制限部位、およびＰｍｅ Ｉ制限部位を含む２つの相補的合成プライマー（配列番号１０４３および配列番号１０４４）の使用により達成した。
５’−ＡＡＧＣＴＧＣＣＴＴＡＧＧＣＴＴＡＴＡＡＴＡＡＧＧＣＧＣＧＣＣＧＧＣＣＧＧＣＣＧＴＴＴＡＡＡＣＴＡＡＧＣＴＴＡＡＴＴＣＴ−３’ （配列番号１０４３）および
５−ＡＧＡＡＴＴＡＡＧＣＴＴＡＧＴＴＴＡＡＡＣＧＧＣＣＧＧＣＣＧＧＣＧＣＧＣＣＴＴＡＴＴＡＴＡＡＧＣＣＴＡＡＧＧＣＡＧＣＴＴ−３’ （配列番号１０４４）．これらのプライマーを、Ｂｓｕ３６ Ｉ およびＨｉｎｄ ＩＩＩを用いてアニールし、そして消化し、そしてｐＳｃＮＨＳＡを作製するｐＳｃＣＨＳＡにおける同様の部位に結合した。
（実施例２：酵母形質転換のための一般的な構築物生成）
ベクターｐＳｃＮＨＳＡおよびｐＳｃＣＨＳＡは、治療用タンパク質またはフラグメントまたはそれらの変異体をコードするポリヌクレオチドが、成熟したヒト血清アルブミン「ＨＳＡ」をコードするポリヌクレオチドに隣接して挿入されるクローニングベクターとして使用され得る。ｐＳｃＣＨＳＡは、治療用融合ＨＳＡ融合を生じるために使用されるが、ｐＳｃＮＨＳＡは、ＨＳＡ治療用タンパク質融合を生じるために使用され得る。
（ＨＳＡ−治療タンパク質融合産物を含むアルブミン融合構築物の産生）
治療タンパク質をコードするＤＮＡ（例えば、配列番号Ｘで示される、または当該分野で公知の配列）は、融合構築物の産生を容易にするプライマー（例えば、制限部位を加えることにより、継ぎ目のない融合をコードすることにより、リンカー配列をコードすることにより、など）を用いてＰＣＲ増幅され得る。例えば、当業者は、治療タンパク質をコードする（かつＢｓｕ３６Ｉ部位を含む）ＤＮＡの５’末端上にＨＳＡの成熟形態の最後の４つのアミノ酸をコードするポリヌクレオチドを加える５’プライマー；そして停止コドンおよび配列をコードする治療タンパク質の３’末端上の適切なクローニング部位を加える３’プライマーを設計し得る。例えば、治療タンパク質をコードするのに用いられる順方向プライマーは、配列
Figure 2014043448
 （配列番号１０４５）を有し得、ここで下線が引かれた配列は、Ｂｓｕ３６Ｉ部位であり、大文字のヌクレオチドは、成熟ＨＳＡタンパク質の最後の４つのアミノ酸（ＡＬＧＬ）をコードし、そして（Ｎ）１５は、目的の治療タンパク質をコードする最初の１５のヌクレオチドと同一である。同様に、治療タンパク質をコードするＤＮＡを増幅するのに用いられる逆方向プライマーは、配列
Figure 2014043448
 （配列番号１０４６）を有し得、ここでイタリック体で書かれた配列は、Ｐｍｅ Ｉ部位であり、二重に下線が引かれた配列は、Ｆｓｅ Ｉ部位であり、単一の下線が引かれた配列は、Ａｓｃ Ｉ部位であり、囲まれたヌクレオチドは、２つの直列の停止コドンの逆方向の相補鎖であり、（Ｎ）１５は、目的の治療タンパク質をコードする最後の１５のヌクレオチドの相補鎖と同一である。一旦ＰＣＲ産物が増幅されると、この産物はＢｓｕ３６Ｉおよび（Ａｓｃ Ｉ、Ｆｓｅ Ｉ、またはＰｍｅ Ｉ）の１つで切られ、ｐＳｃＮＨＳＡに連結される。
ＨＳＡキメラリーダー配列中のＸｈｏ Ｉ部位の存在は、キメラシグナル配列（すなわち、ＬＤＫＲ（配列番号２１３９）からＬＥＫＲ（配列番号２１４０）へのＨＳＡ−ｋｅｘ２シグナル配列）の末端における単一のアミノ酸変化を作り出す。
（遺伝子−ＨＳＡ融合産物を含むアルブミン融合構築物の産生）
上記の方法と同様に、治療タンパク質をコードするＤＮＡは、以下のプライマーを用いてＰＣＲ増幅され得る：Ｓａｌ Ｉ部位を含み、治療タンパク質をコードするＤＮＡの５’末端上のＨＳＡリーダー配列、ＤＫＲの最後の３つのアミノ酸をコードするポリヌクレオチドを加える５’プライマー；および治療タンパク質をコードするＤＮＡの３’末端上にＣｌａ Ｉ部位を含む成熟ＨＳＡの最初のいくつかのアミノ酸をコードするポリヌクレ
オチドを加える３’プライマー。例えば、治療タンパク質をコードするＤＮＡを増幅するのに用いられる順方向プライマーは、配列
Figure 2014043448
 （配列番号１０４７）を含み得、ここで下線を引いた配列は、Ｓａｌ Ｉ部位であり、大文字のヌクレオチドは、ＨＳＡリーダー配列の最後の３つのアミノ酸（ＤＫＲ）をコードし、そして（Ｎ）１５は、目的の治療タンパク質をコードする最初の１５のヌクレオチドと同一である。同様に、治療タンパク質をコードするＤＮＡを逆方向プライマーは、配列
Figure 2014043448
 （配列番号１０４８）であり、ここでイタリック体の配列は、Ｃｌａ Ｉ部位であり、下線が引かれたヌクレオチドは、ＨＳＡ
Figure 2014043448
 の成熟形態の最初の９アミノ酸をコードするＤＮＡの逆方向相補鎖であり、そして（Ｎ）１５は、目的の治療タンパク質をコードする最後の１５ヌクレオチドの逆方向の相補鎖である。一旦ＰＣＲ産物が増幅されると、この産物は、Ｓａｌ ＩおよびＣｌａで切られ、Ｘｈｏ ＩおよびＣｌａ Ｉで消化されたｐＳｃＣＨＳＡに連結される。異なるシグナル配列またはリーダー配列が、所望され得、例えば、転化酵素「ＩＮＶ」（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託Ｐ００７２４）、交配因子α「ＭＡＦ」（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＡ１８４０５）、ＭＰＩＦ（遺伝子配列ＡＡＦ８２９３６）、フィブリン Ｂ（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託Ｐ２３１４２）、クラステリン（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託Ｐ１０９０９）、インスリン様増殖因子結合タンパク質４（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託Ｐ２２６９２）、およびＨＳＡリーダー配列の順列は、当該分野で公知の標準的な方法によって適切なベクターにサブクローニングされ得る。
（酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける発現に適合性のアルブミン融合構築物の産生）
次いで、ｐＳｃＮＨＳＡまたはｐＳｃＣＨＳＡから作製されるＮ末端またはＣ末端アルブミン融合タンパク質のいずれかをコードするＤＮＡを含むＮｏｔ Ｉフラグメントが、ＬＥＵ２選択マーカーを有するｐＳＡＣ３５のＮｏｔ Ｉ部位にクローニングされ得る。
次いで、生じるベクターは、酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの発現システムの形質転換に用いられる。
（実施例３：酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける一般的発現）
酢酸リチウム形質転換、エレクトロポレーション、または当該分野で公知の、およびもしくはＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，およびＭａｎｉａｔｉｓ．１９８９．“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２版”１−３巻、およびＡｕｓｕｂｅｌら、２０００．Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ａｎｄ Ｈａｒｖａｒｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”，１−４巻に記載されるような他の方法により、酵母発現に適合性の発現ベクターが、酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中に形質転換され得る。この発現ベクターは、形質転換により、酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＤＸＹ１、Ｄ８８、またはＢＸＰ１０に導入される。個々の形質転換体が、例えば、１０ｍＬ ＹＥＰＤ（１％ ｗ／ｖ酵母抽出物、２％ｗ／ｖ、ペプトン、２％ｗ／ｖ、デキストロース）中３０℃で３日間の間、増殖し得、そして細胞は、６０時間の増殖の後、固定相に集められ得る。上清は、１０分間３０００ｇで細胞を除去することで集められ得る。
ｐＳＡＣ３５（Ｓｌｅｅｐら、１９９０、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：４２そして図３を参照のこと）は、ＬＥＵ選択マーカーに加えて、完全酵母２μｍプラスミドを含み、複製機能、ＰＲＢ１プロモーター、およびＡＤＨ１終止シグナルを提供する。
（実施例４：酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるアルブミン融合から発現されるアルブミン融合タンパク質の一般的精製）
好ましい実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質は、治療タンパク質またはその部分の成熟形態（例えば、表１に列挙される治療タンパク質の成熟形態、または表２に配列番号Ｚとして示される治療タンパク質の成熟形態）のＮ末端またはＣ末端のいずれかに融合するＨＳＡの成熟形態を含む。本発明の１つの実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質は、発現のために使用される宿主の分泌経路における発生期の融合ポリペプチドを方向付けるシグナル配列を、さらに含む。好ましい実施形態において、シグナル配列によってコードされるシグナルペプチドが除去され、そして成熟アルブミン融合タンパク質が、培養培地中に直接分泌される。本発明のアルブミン融合タンパク質は、好ましくは異種シグナル配列（例えば、特定の治療タンパク質の非天然シグナル配列）（ＭＡＦ、ＩＮＶ、Ｉｇ、フィブリン Ｂ、クラステリン、インスリン様増殖因子結合タンパク質４、改変体ＨＳＡリーダー配列（キメラＨＳＡ／ＭＡＦリーダー配列が挙げられるが、これに限定されない）、または当該分野において公知である他の異種シグナル配列が挙げられるが、これらに限定されない）を含む。表２に列挙されるシグナル配列ならびに／または上の明細書中の「融合タンパク質の発現」および／もしくは「アルブミン融合タンパク質の組み換えおよび合成的産生のさらなる方法」節において列挙されるシグナル配列として、特に好ましい。好ましい実施形態において、本発明の融合タンパク質は、Ｎ末端メチオニン残基を含む。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（フラグメントおよび／または改変体を含む）もまた、本発明に包含される。
上記のような酵母中で発現されるアルブミン融合タンパク質は、以下のようなＤｙａｘペプチド親和カラム上の小規模で精製され得る。アルブミン融合タンパク質を発現する酵母からの上清は、３ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ６．２、２０ｍＭ ＮａＣｌおよび０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０に対してダイアフィルター（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｅ）し、体積を減少し、色素を除去する。次いで、この溶液を０．２２μｍデバイスを通して濾過する。この濾液を、Ｄｙａｘペプチド親和カラム上に装填する。このカラムを１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．２緩衝液で溶出する。タンパク質を含むピークフラクションを、５倍に濃縮した後ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で集め、分析する。
大規模な精製のために、以下の方法を利用し得る。２Ｌを超える上製を、ダイアフィルターし、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ８．０の５００ｍＬに濃縮する。濃縮されたタンパク質溶液を、予め平衡化した５０ｍＬ ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラム上に装填し、このカラムを洗浄し、そしてタンパク質を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．０における０〜０．４Ｍ ＮａＣｌからのＮａＣｌの直線的勾配で溶出する。タンパク質を含むこれらのフラクションをプールし、０．５Ｍリン酸ナトリウム（ＮａＨ２ＰＯ４）を有するｐＨ６．８に調節する。最終濃度０．９Ｍの（ＮＨ４）２ＳＯ４が、タンパク質溶液に加えられ、そして全ての溶液を、予め平衡化した５０ｍＬ Ｂｕｔｙｌ６５０Ｓカラム上に装填した。このタンパク質を、硫酸アンモニウム（０Ｍ （ＮＨ４）２ＳＯ４に対して０．９）の直線的勾配で溶出する。アルブミン融合を有するこれらのフラクションを再びプールし、１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４／クエン酸緩衝液ｐＨ５．７５に対してダイアフィルトレートし、５０ｍＬの予め平衡化したＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラム上に装填する。このタンパク質を、０−０．５ＭのＮａＣｌ直線勾配で溶出する。目的のタンパク質を含むフラクションを混合し、この緩衝液を、Ａｍｉｃｏｎコンセントレーター（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ）で１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４／クエン酸ｐＨ６．２５に変え、この伝導率は、２．５ｍＳ／ｃｍより低い。このタンパク質溶液は、１５ｍＬの予め平衡化されたＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ高性能カラム上に装填され、このカラムを洗浄し、そしてこのタンパク質を０〜０．１５Ｍ ＮａＣｌのＮａＣｌ直線勾配で溶出する。次いで、この精製されたタンパク質を、緩衝液交換により特異的な緩衝液組成物に処方し得る。
（実施例５：哺乳動物細胞トランスフェクションについての一般的な構築物の産生）
（哺乳動物細胞株においての発現に適合性のアルブミン融合構築物の産生）
アルブミン融合構築物が、哺乳動物細胞培養系における使用のための発現ベクターにおいて産生され得る。治療タンパク質をコードするＤＮＡが、当該分野で公知の標準的な方法（例えば、ＰＣＲ増幅、制限消化、および結合）により哺乳動物発現ベクターにおいてＨＳＡへのＮ末端またはＣ末端をクローニングし得る。一旦発現ベクターが構築されると、哺乳動物発現系へのトランスフェクションが、進行し得る。適切なベクター（例えば、ｐＣ４ベクター、および／またはＬｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｐｏｒｔｓｍｏｕｔｈ，ＮＨ）から入手可能なベクターを含むが、これらに限定されない）が、当該分野で公知である。
ヒト血清アルブミンをコードするＤＮＡを、哺乳動物培養系に適切な、プラスミドｐＣ４：ＨＳＡ（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３２７７）を作り出すｐＣ４ベクターにクローニングする。このベクターは、メトトレキサートの存在下、選択を可能にする遺伝子ジヒドロ葉酸レダクターゼ「ＤＨＦＲ」を有する。
ｐＣ４：ＨＳＡベクターは、ＣＨＯ細胞におけるアルブミン融合タンパク質の発現について適切である。発現のために、他の哺乳動物細胞培養系において、アルブミン融合タンパク質をコードするＤＮＡを含む、あるいはこれから成るフラグメントを代替の発現ベクターにサブクローニングすることが所望され得る。例えば、成熟アルブミン融合タンパク質をコードするＤＮＡを含む、あるいはこれから成るフラグメントを、別の発現ベクター（本明細書中に記載される任意の哺乳動物発現ベクターを含むが、これらに限定されない）にサブクローニングさせ得る。
好ましい実施形態において、アルブミン融合構築物をコードするＤＮＡが、ＮＳ０細胞における発現について当該分野で公知の手段により、Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｐｏｒｔｓｍｏｕｔｈ，ＮＨ）により提供されるベクターに、サブクローニングされる。
（ＨＳＡ治療タンパク質融合産物を含むアルブミン融合構築物の生成）
ｐＣ４：ＨＳＡ（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３２７７）を用いて、治療タンパク質部分が、成熟アルブミン配列のＣ末端である、アルブミン融合構築物を生成する。例えば、ベクターのＢｓｕ ３６ＩとＡｓｃ Ｉ制限部位との間の治療タンパク質のフラグメントまたはその改変体をコードするＤＮＡを、クローニングし得る。Ｂｓｕ ３６ＩおよびＡｓｃ Ｉへクローニングする場合、酵母ベクター系（配列番号１０４５および配列番号１０４６）にクローニングするのに用いられる同じプライマー設計が、利用され得る（実施例２を参照のこと）。
（遺伝子ＨＳＡ融合産物を含むアルブミン融合構築物の産生）
ｐＣ４：ＨＳＡ（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３２７７）を用いて、治療タンパク質部分が成熟アルブミン配列のＮ末端にクローニングされるアルブミン融合構築物が、産生され得る。例えば、ｐＣ４：ＨＳＡのＢａｍ ＨＩ（またはＨｉｎｄ ＩＩＩ）とＣｌａ Ｉとの間の治療タンパク質自体のシグナル配列を有する治療タンパク質をコードするＤＮＡをクローニングし得る。Ｂａｍ ＨＩまたはＨｉｎｄ ＩＩＩ部位のいずれかにクローニングするとき、Ｋｏｚａｋ配列
Figure 2014043448
 を含み、その後に治療タンパク質をコードするＤＮＡの翻訳開始部分を含むことが好ましい。治療タンパク質が、シグナル配列を含まない場合、治療タンパク質をコードするＤＮＡを、ｐＣ４：ＨＳＡのＸｈｏ ＩとＣｌａ Ｉ部位との間でクローニングし得る。Ｘｈｏ Ｉ部位を用いる場合、以下の５’（配列番号１０５２）および３’（配列番号１０５３）例示的プライマーが、用いられ得る：
Figure 2014043448
 ５’プライマー（配列番号１０５２）において、下線が引かれた配列は、Ｘｈｏ部位である；そしてこのＸｈｏ部位およびＸｈｏ Ｉ部位に続くＤＮＡは、天然のヒト血清アルブミンのリーダー配列の最後の７つのアミノ酸をコードする。配列番号１０５２において、「（Ｎ）１８」は、目的の治療タンパク質をコードする最初の１８ヌクレオチドと同一なＤＮＡである。３’プライマー（配列番号１０５３）において、下線が引かれた配列は、Ｃｌａ Ｉ部位であり、そしてこのＣｌａ Ｉ部位およびそれに続くＤＮＡは、成熟ＨＳＡタンパク質（配列番号１０３８）の最初の１０アミノ酸をコードするＤＮＡの逆方向補完物である。配列番号１０５３において、「（Ｎ）１８」は、目的の治療タンパク質をコードする最後の１８ヌクレオチドをコードするＤＮＡの逆方向相補鎖である。これらの２つのプライマーを用いて、目的の治療タンパク質をＰＣＲ増幅し得、ＰＣＲ産物を精製し得、Ｘｈｏ ＩおよびＣｌａ Ｉ制限酵素でこの産物を消化し得、そしてｐＣ４：ＨＳＡベクター中のＸｈｏ ＩおよびＣｌａ部位にクローニングし得る。
代替のリーダー配列が所望される場合、天然のアルブミンリーダー配列は、キメラアルブミンリーダー、すなわち、ＨＳＡ−ｋｅｘ２シグナルペプチド、または当該分野で公知の標準的な方法による代替のリーダーで置換され得る。（例えば、当業者が、代替のリーダーを所定の順序でＰＣＲ増幅し、リーディングフレームを維持する一方、ＰＣＲ産物をアルブミンリーダーの代わりにアルブミン融合構築物にサブクローニングする）
（実施例６：哺乳動物細胞株における一般的な発現）
哺乳動物細胞株における発現と適合性の発現ベクターにおいて産生されるアルブミン融合構築物が、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクトアミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）、エレクトロポレーション、または当該分野で公知のおよび／またはＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，およびＭａｎｉａｔｉｓ １９８９「分子クローニング：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２版」およびＡｕｓｕｂｅｌら、２０００ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ａｎｄ Ｈａｒｖａｒｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」１−４巻に記載されるような、他のトランスフェクション方法により、適切な細胞株にトランスフェクトし得る。次いで、トランスフェクトされる細胞を、発現ベクターにおける選択可能なマーカーにより決定される選択剤の存在により選択する。
ｐＣ４発現ベクター（ＡＴＣＣ受託番号２０９６４６）は、プラスミドｐＳＶ２−ＤＨＦＲ（ＡＴＣＣ受託番号３７１４６）の誘導体である。ｐＣ４は、強力なプロモーター、Ｒｏｕｓ Ｓａｒｃｏｍａ ＶｉｒｕｓのＬｏｎｇ Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｒｅｐｅａｔｓ「ＬＴＲ」（Ｃｕｌｌｅｎら、１９８５年３月，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４３８−４４７）およびＣｙｔｏＭｅｇａｌｏ Ｖｉｒｕｓ「ＣＭＶ」エンハンサー（Ｂｏｓｈａｒｔら、１９８５，Ｃｅｌｌ ４１：５２１−５３０）のフラグメントを含む。このベクターはまた、３’イントロン、ポリアデニル化およびラットプレプロインスリン遺伝子の終止シグナル、ならびにＳＶ４０初期プロモーターの制御下のマウスＤＨＦＲ遺伝子を含む。チャイニーズハムスター卵巣「ＣＨＯ」細胞または活性なＤＨＦＲ遺伝子を欠失している他の細胞株が、トランスフェクションのために用いられる。当該分野で公知の方法によるｐＣ４におけるアルブミン融合構築物のＣＨＯ細胞へのトランスフェクションが、ＣＨＯ細胞中のアルブミン融合タンパク質の発現を可能にし、これにリーダー配列開裂および上清への分泌が続く。次いで、アルブミン融合タンパク質を、上清からさらに精製する。
ｐＥＥ１２．１発現ベクターが、Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｐｏｒｔｓｍｏｕｔｈ，ＮＨ）により提供され、これはｐＥＥ６（ＳｔｅｐｈｅｎｓおよびＣｏｃｋｅｔｔ，１９８９，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：７１１０）の誘導体である。このベクターは、プロモーター、エンハンサーおよび目的の配列の上流である、ヒトＣｙｔｏＭｅｇａｌｏ Ｖｉｒｕｓ「ｈＣＭＶ−ＭＩＥ」のＭａｊｏｒ Ｉｍｍｅｄｉａｔｅ Ｅａｒｌｙ遺伝子（国際公開番号ＷＯ８９／０１０３６）の完全５’非翻訳領域、ならびに選択的なメチオニンスルフォキシミン（ｓｕｌｐｈｏｘｉｍｉｎｅ）含有媒体におけるトランスフェクトされた細胞の選択の目的のためのＧｌｕｔａｍｉｎｅ Ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ遺伝子（Ｍｕｒｐｈｙら、１９９１，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．２２７：２７７−２７９；Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎら、１９９２，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６９−１７５；米国特許ＵＳ５，１２２，４６４）を含む。当該分野で公知の方法によりｐＥＥ１２．１において作られるアルブミン融合構築物のＮＳ０細胞（国際公開番号ＷＯ８６／０５８０７）へのトランスフェクションが、ＮＳ０細胞におけるアルブミン融合タンパク質の発現を可能にし、これにリーダー配列開裂、および上清への分泌が続く。次いで、アルブミン融合タンパク質を、本明細書中で記載される技術または当該分野で公知の他の方法を用いて、上清からさらに精製する。
アルブミン融合タンパク質の発現が、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット、逆相ＨＰＬＣ分析、または当該分野で公知の他の方法により、分析され得る。
アルブミン融合タンパク質でトランスフェクトされる安定なＣＨＯおよびＮＳ０細胞株が、当該分野で公知の方法（例えば、リポフェクトアミントランスフェクション）により生成され、例えば、選択可能なマーカーとして、またはグルタミンが存在しない場合の増殖を介してジヒドロ葉酸レダクターゼを有するベクターについて１００ｎＭメトトレキサートで選択される。発現レベルが、例えば、第一に、第一の抗体として抗ＨＳＡ血清を用いて、または、第二に、第一の抗体として所定のアルブミン融合タンパク質の治療タンパク質部分に指向される血清含有抗体を用いて免疫ブロットすることにより、試験され得る。
発現レベルが、第一の抗体として抗ＨＳＡ血清で免疫ブロット検出することにより、試験される。特異的な生産速度が、捕捉抗体が、アルブミン融合の治療タンパク質部分に向かうモノクローナル抗体であり得、検出抗体が、モノクローナル抗ＨＳＡビオチン化抗体であり得る（または逆もまた同じ）、ＥＬＩＳＡを経て決定され、これにホースラディッシュペルオキシダーゼ／ストレプトアビジン結合および製造者のプロトコルに従う分析が続く。
（実施例７：哺乳動物細胞株におけるアルブミン融合タンパク質から発現されるアルブミン融合タンパク質の一般的な精製）
好ましい実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質は、治療タンパク質またはその部分（例えば、表１に列挙される治療タンパク質の成熟形態、または表２に配列番号Ｚとして示される治療タンパク質の成熟形態）の成熟形態のＮ末端またはＣ末端のいずれかに融合されたＨＳＡの成熟形態を含む。本発明の１実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質は、さらに発現のために用いられる宿主の分泌経路における発生期の融合ポリペプチドを方向付けるシグナル配列を、さらに含む。さらに好ましい実施形態において、シグナル配列によってコードされるシグナルペプチドが除去され、そして成熟アルブミン融合タンパク質が、培養培地中に直接分泌される。本発明のアルブミン融合タンパク質は、好ましくは異種シグナル配列（例えば、特定の治療タンパク質の非天然シグナル配列）（ＭＡＦ、ＩＮＶ、Ｉｇ、フィブリン Ｂ、クラステリン、インスリン様増殖因子結合タンパク質４、改変体ＨＳＡリーダー配列（キメラＨＳＡ／ＭＡＦリーダー配列が挙げられるが、これに限定されない）、または当該分野において公知である他の異種シグナル配列が挙げられるが、これらに限定されない）を含む。表２に列挙されるシグナル配列ならびに／または上の明細書中の「融合タンパク質の発現」および／もしくは「アルブミン融合タンパク質の組み換えおよび合成的産生のさらなる方法」節において列挙されるシグナル配列として、特に好ましい。好ましい実施形態において、本発明の融合タンパク質は、Ｎ末端メチオニン残基をさらに含む。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（フラグメントおよび／または改変体を含む）もまた、本発明に包含される。
哺乳動物細胞株上清由来のアルブミン融合タンパク質が、用いられる発現系に従う異なるプロトコルに従って精製される。
（ＣＨＯおよび２９３細胞株からの精製）
ＣＨＯ細胞上清由来または一時的にトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞上清由来のアルブミン融合タンパク質の精製は、リン酸ナトリウム緩衝液およびリン酸塩勾配溶出を用いるアニオン性ＨＱ樹脂を有する最初の捕捉を含み得、塩勾配溶出を用いるＢｌｕｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦカラム上の親和クロマトグラフィーがこれに続く。Ｂｌｕｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦは、主なＢＳＡ／ｆｅｔｕｉｎ汚染物質を除去する。リン酸塩勾配を用いるＰｏｒｏｓ ＰＩ ５０樹脂のさらなる精製が、エンドトキシン汚染物質を除去および低減させ得、ならびにアルブミン融合タンパク質を濃縮し得る。
（ＮＳ０細胞株から精製）
ＮＳ０細胞上清由来のアルブミン融合タンパク質の精製は、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅアニオン交換クロマトグラフィーを含み得、段階溶出を用いるＳＰ−セファロース精製がこれに続き、段階溶出を用いるＰｈｅｎｙｌ−６５０Ｍ、および、最終的には、ダイアフィルトレーションがこれに続く。
次いで、精製したタンパク質が、緩衝液交換により処方され得る。
（実施例８：構築物ＩＤ１９６６、ＥＰＯ−ＨＳＡ、産生）
構築物ＩＤ１９６６（ｐＣ４．ＥＰＯ：Ｍ１−Ｄ１９２．ＨＳＡ）は、ＥＰＯ−ＨＳＡ融合タンパク質をコードし、この融合タンパク質は、ＥＰＯネイティブリーダー配列および哺乳動物発現ベクターｐＣ４にクローニングされたＨＳＡの成熟形態のアミノ末端に融合した、最終Ａｒｇ残基（すなわち、Ｍ１−Ｄ１９２）を除く成熟ＥＰＯタンパク質を含む。
（構築物１９６６についてのＥＰＯ ｃＤＮＡのクローニング）
ＥＰＯをコードするＤＮＡを、以下に記載されるプライマーＥＰＯ１およびＥＰＯ２を使用して増幅し、Ｂａｍ ＨＩ／Ｃｌａ Ｉで切断し、そしてＢａｍ ＨＩ／Ｃｌａ Ｉ切断されたｐＣ４：ＨＳＡに連結した。構築物ＩＤ番号１９６６は、成熟ＨＳＡタンパク質、続いて成熟ＨＳＡタンパク質を含む、アルブミン融合タンパク質をコードする（表２における構築物１９６６についての配列番号２９７を参照のこと）。
天然のリーダー配列を含む全長ＥＰＯをコードするポリヌクレオチドのＰＣＲ増幅のために適切な２つのオリゴヌクレオチド（ＥＰＯ１およびＥＰＯ２）を合成した。
Figure 2014043448
 ＥＰＯ１は、Ｂａｍ ＨＩクローニング部位（斜体で示される）を組み込み、全長ＥＰＯのＯＲＦの最初の３５アミノ酸をコードするＤＮＡの前にｋｏｚａｋ配列（二重下線を引いて示される）を結び付ける。ＥＰＯ２において、下線を引かれた配列は、Ｃｌａ Ｉ部位であり；そしてＣｌａ Ｉ部位およびそれに続くＤＮＡは、成熟ＨＳＡタンパク質の最初の１０個のアミノ酸をコードするＤＮＡの逆相補体である（配列番号１０３８）。ＥＰＯ２において太字の核酸配列は、ＥＰＯの全長形態のアミノ酸残基Ｇｌｕ−１８６〜Ａｓｐ１９２をコードする最後の２２個のヌクレオチドの逆相補体である。これらの２つのプライマーを使用して、最終Ａｒｇ残基を除いた全長ＥＰＯタンパク質を、ＰＣＲ増幅した。アニーリング温度および伸長温度ならびにアニーリング回数および伸長回数が、各々の特異的なプライマー対およびテンプレートについて経験的に決定されなければならない。
ＰＣＲ産物を精製し（例えば、Ｗｉｚａｒｄ ＰＣＲ Ｐｒｅｐｓ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ））、続いてＢａｍ ＨＩおよびＣｌａ Ｉで消化した。そしてゲル電気泳動によるＢａｍ ＨＩ−Ｃｌａ Ｉフラグメントのさらなる精製の後、この産物をＢａｍ ＨＩ／Ｃｌａ Ｉで消化されたｐＣ４：ＨＳＡにクローニングし、構築物番号１９６６を産生した。
さらに、発現されたアルブミン融合タンパク質のＮ末端の、アミノ酸配列決定による分析により、予測されたＥＰＯ配列の存在を確認した（以下を参照のこと）。
本発明のＥＰＯアルブミン融合タンパク質は、好ましくは、最終Ａｒｇ残基を欠失するＥＰＯの成熟形態（すなわち、Ａｌａ−２８〜Ａｓｐ−１９２）のＮ末端またはＣ末端のいずれかに融合した、ＨＳＡの成熟形態（すなわち、Ａｓｐ−２５〜Ｌｅｕ−６０９）を含む。本発明の１つの実施形態において、本発明のＥＰＯアルブミン融合タンパク質は、発現のために使用される宿主の分泌経路における発生期の融合ポリペプチドを方向付けるシグナル配列を、さらに含む。さらに好ましい実施形態において、シグナル配列によってコードされるシグナルペプチドが除去され、そして成熟ＥＰＯアルブミン融合タンパク質が、培養培地中に直接分泌される。本発明のＥＰＯアルブミン融合タンパク質は、異種シグナル配列（ＭＡＦ、ＩＮＶ、Ｉｇ、Ｆｉｂｕｌｉｎ Ｂ、Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎ、インスリン様増殖因子結合タンパク質４、改変体ＨＳＡリーダー配列（キメラＨＳＡ／ＭＡＦリーダー配列が挙げられるが、これに限定されない）、または当該分野において公知である他の異種シグナル配列が挙げられるが、これらに限定されない）を含み得る。好ましい実施形態において、本発明のＥＰＯアルブミン融合タンパク質は、ネイティブＥＰＯシグナル配列を含む。さらに好ましい実施形態において、本発明のＥＰＯアルブミン融合タンパク質は、Ｎ末端メチオニン残基をさらに含む。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（フラグメントおよび／または改変体を含む）もまた、本発明に包含される。
（構築物ＩＤ１９６６の発現および精製）
（２９３Ｔ細胞またはＣＨＯ細胞のいずれかにおける発現）
構築物１９６６を、当該分野において公知の方法（例えば、リポフェクタミントランスフェクション）によって２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、そして１００ｎＭメトトレキサートを用いて選択した（実施例６を参照のこと）。発現レベルを、抗ＨＳＡ血清を一次抗体として用いる免疫ブロット検出によって、試験し、特異的な産生速度を、捕捉のためのモノクローナル抗ヒトＥＰＯ抗体（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）および検出のためのＢｉｏｔｒｅｎｄモノクローナル抗ＨＳＡビオチン化抗体を用いるＥＬＩＳＡを介して、続いてホースラディシュペルオキシダーゼ／ストレプトアビジン結合および分析により決定した。
（２９３Ｔ細胞上清からの精製）
構築物ＩＤ番号１９６６から２９３Ｔ細胞において発現された、分泌ＥＰＯ−ＨＳＡ融合タンパク質を含む２９３Ｔ細胞上清を、実施例７に記載されるように精製した。具体的には、最初の捕捉を、陰イオン性ＨＱ−５０樹脂を用いて、段階溶出を使用してｐＨ７．２で、実施し、続いてｐＨ７．２で、段階溶出を再び利用するＢｌｕｅセファロースカラムクロマトグラフィーを使用して実施した。プールされたフラクションは、段階溶出を用いてＨＱ−５０樹脂を通過させた。この溶出したサンプルを、Ｐｈｅｎｙｌ−６５０Ｍカラム上に載せ、ｐＨ７．２で勾配溶出で溶出した。溶出したサンプルを、ＨＱ−５０樹脂を三回通過させた。目的のフラクションは、５０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４＋２００ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．２）にダイアフィルトレーションされた。Ｎ末端配列決定は、ＥＰＯの成熟形態のアミノ末端配列（すなわち、ＡＰＰＲＬＩ）を生じた。９０ｋＤａのおよその分子量のタンパク質が得られた。１リットルの２９３Ｔ細胞上清あたり０．４２ｍｇのタンパク質の最終収量が得られた。
（ＣＨＯ細胞上清からの精製）
ＣＨＯ細胞において構築物番号１９６６から発現されるＥＰＯアルブミン融合タンパク質を含む細胞上清を、実施例７に記載されるように精製した。具体的には、濃縮された１．４Ｌのサンプルの最初の捕捉を、リン酸ナトリウム緩衝液およびリン酸塩勾配溶出（０−１００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２）を使用して、アニオン性Ｐｏｒｏｓ ＨＱ ５０樹脂を用いて実施した。カラムに載せる前に、このサンプルを、伝導性が５．０ｍＳより小さくなるまで、さらなるカラムクロマトグラフィー精製と同様に３ｍＭリン酸塩に希釈した。ＨＱ樹脂を１０ｍＭリン酸ナトリウム（サンプル装填の前でｐＨ７．２）で平衡化した。ＥＰＯ−ＨＳＡを２０ｍＳ、または５０ｍＳリン酸ナトリウムで溶出した。
第２の精製工程は、親和クロマトグラフィーを含んだ。３ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を用いる５ｍＳ未満の伝導性に適合した、以前のＨＱ樹脂からの組み合わされたフラクションを、１２５ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）で平衡化したＢｌｕｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦカラムに載せた。０−３Ｍ ＮａＣｌの塩勾配が、０．５Ｍと１．０ＭＮａＣｌとの間のＥＰＯ−ＨＳＡを溶出した。Ｂｌｕｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦは、主なＢＳＡ／ｆｅｔｕｉｎ汚染物質を除去する。エンドトキシン汚染物質を除去し、および低減し、ならびにＥＰＯ−ＨＳＡタンパク質を濃縮するＰｏｒｏｓ ＰＩ５０樹脂を含む第３のカラムに、所望されるフラクションの伝導性は、再び適合され、そしてプールされたフラクションが、載せられた。その樹脂は、２５ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）で平衡化された。ＥＰＯ−ＨＳＡを、１０ｍＭ−１００ｍＭリン酸塩勾配で溶出した。最終緩衝組成物は、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．２）であった。８７．７ｋＤａのおよそのタンパク質分子量を得た。１リットルの上清あたり８．９ｍｇのタンパク質の最終収量を得た。Ｎ末端配列決定が、ＥＰＯの成熟形態のアミノ末端に対応する配列ＡＰＰＲＬを産生した。
（インビトロＴＦ−１細胞増殖アッセイ）
（方法）
ＥＰＯアルブミン融合タンパク質の生物学的活性を、インビトロＴＦ−１細胞増殖アッセイにおいて測定し得る。ＴＦ１細胞株が、Ｋｉｔａｍｕｒａら（Ｋｉｔａｍｕｒａ，Ｔ．ら、１９８９、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１４０：３２３−３３４）により確立された。ＴＦ−１細胞が、重症の汎血球減少症の３５歳の日本人男性由来のヘパリン化された骨髄吸引サンプルから誘導された。ＴＦ−１細胞株は、複数のサイトカインに応答性の結果としての骨髄先祖細胞の増殖および分化を調査するために良好なシステムを提供する。
ＴＦ−１細胞増殖アッセイ（Ｋｉｔａｍｕｒａ，Ｔ．ら、１９８９、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１４０：３２３−３３４）：ヒトＴＦ−１細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−２００３）を、１０％ＦＢＳ、１Ｘ ｐｅｎ−ｓｔｒｅｐ、１Ｘ Ｌ−グルタミン、および２ｎｇ／ｍＬヒトＧＭ−ＣＳＦをＲＰＭＩ １６４０培地に１×１０６細胞／ｍＬまで拡散する。細胞を、新鮮な培地中１：１０または１：２０に希釈することにより、２〜３日毎に継代した。アッセイ開始の日において、細胞を、５０ｍＬの容量のＲＰＭＩ１６４０／１０％ＦＢＳで３回洗い、ＧＭ−ＣＳＦを除去し、そしてＲＰＭＩ１６４０／１０％中１×１０５細胞／ｍＬで再懸濁する。細胞を、底が平らなＴＣ処理された９６ウェルプレート中、１０，０００細胞／ウェルで平板培養する。コントロールタンパク質の３倍連続希釈を、１０Ｕ／ｍＬ〜０．００１Ｕ／ｍＬ（最終濃度）の範囲でＲＰＭＩ中行ない、ここで１Ｕ＝１０ｎｇタンパク質である；各々の希釈液の０．１ｍＬを、各々のウェルにおいて０．２ｍＬの最終容積について細胞を含む３重ウェルに加える。コントロールタンパク質に応答する細胞増殖およびアルブミン融合タンパク質を、３Ｈ−チミジン（０．５ｕＣｉ／ウェル）の取り込みを測定することにより、決定する。このアッセイを、３Ｈ−チミジンを加える前の２４時間、４８時間、または７２時間のインキュベーション時間にて、および加えた後の４〜２４時間の間、実行する。アルブミン融合タンパク質の分子量の部分のみが、希釈液がまた、モル比に対して適合され得る場合、事実上治療タンパク質分子（すなわち、融合の治療タンパク質部分）である。
（構築物１９６６によりコードされるアルブミン融合タンパク質についてのインビトロＴＦ−１細胞増殖アッセイ）
（方法）
ＴＦ−１細胞増殖アッセイ：ヒトＴＦ−１細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−２００３）を、１０％ＦＢＳ、１Ｘ ｐｅｎ−ｓｔｒｅｐ、１Ｘ Ｌ−グルタミン、および２ｎｇ／ｍＬヒトＧＭ−ＣＳＦをＲＰＭＩ培地に１×１０６細胞／ｍＬの最大密度まで拡散する。細胞を、新鮮な培地中１：１０または１：２０に希釈することにより、２〜３日毎に継代した。アッセイ開始の日において、細胞を、５０ｍＬの容量のＲＰＭＩ１６４０／１０％ＦＢＳで３回洗い、ＧＭ−ＣＳＦを除去し、そしてＲＰＭＩ１６４０／１０％中１×１０５細胞／ｍＬで再懸濁した。細胞を、底が平らなＴＣ処理された９６ウェルプレート中、１０，０００細胞／ウェルで平板培養した。ｈｒＥＰＯ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｉｎｃ．，ＲＤＩ）の３倍連続希釈を、１０Ｕ／ｍＬ〜０．００１Ｕ／ｍＬ（最終濃度）の範囲でＲＰＭＩ１６４０／１０％中行ない、ここで１Ｕ＝１０ｎｇタンパク質であった；各々の希釈液の０．１ｍＬを、各々のウェルにおいて０．２ｍＬの最終容積について細胞を含む３重ウェルに加えた。ｈｒＥＰＯに応答する細胞増殖応答およびＥＰＯアルブミン融合タンパク質を、３Ｈ−チミジン（０．５μＣｉ／ウェル）の取り込みを測定することにより、決定した。このアッセイを、３Ｈ−チミジンを加える前の２４時間、４８時間、または７２時間のインキュベーション時間にて、および加えた後の４〜２４時間の間、実行した。ＥＰＯアルブミン融合タンパク質の分子量の１／３のみが、希釈液がまた、モル比に対して適合され得る場合、事実上ＥＰＯ分子である。
（結果）
構築物１９６６を発現する２９３Ｔ細胞由来の上清または構築物１９６６を発現するＣＨＯ細胞から誘導されたＥＰＯ−ＨＳＡアルブミン誘導タンパク質を、ＥＰＯ活性についての上のアッセイで試験した。平均して、ｒｈＥＰＯの５倍より大きいＥＣ５０が、確立された（図４を参照のこと）。
（ヘマトクリットを測定するためのインビボマウスＨａｒｌａｎ）
（方法）
このマウスモデルは、ヘマトクリット上の効果を測定することによりインビボのタンパク質の治療活性を測定する手段を提供する。
インビボマウスモデル（すなわち、６〜８週齢雌ＤＢＡ／２ＮＨｓｄマウス（Ｈａｒｌａｎ））を、静脈内に、腹腔内に、または皮下に、７日間の間毎日、または１日おきに２μｇ／ｋｇにて、および他の濃度にてコントロールタンパク質または３０μｇ／ｋｇにて、および他の濃度にてアルブミン融合タンパク質の投与におけるヘマトクリットに対する効果をモニタリングすることを、確立した。ヘマトクリットを、針で尾静脈を刺し、ヘパリン処理されたマイクロキャピラリーチューブで血液を集め、次いで実験の期間にわたってチューブをスピニングさせることで決定する。また、特定の実験に対して、脾臓を収集し、秤量する。他の投薬スケジュールは、当該分野の範囲内で公知であり、このアッセイの使用のために容易に適合され得る。
（構築物１９６６によりコードされるアルブミン融合タンパク質の活性が、ヘマトクリットを測定するためのインビボＨａｒｌａｎマウスモデルを用いてアッセイされ得る。） （方法）
６〜８週齢雌ＤＢＡ／２ＮＨｓｄマウス（Ｈａｒｌａｎ）のインビボマウスモデルを用いて、０日目、２日目、４日目および６日目に０．５μｇ／ｋｇ、１．５μｇ／ｋｇ、４．５μｇ／ｋｇ、１２μｇ／ｋｇの投薬量で、ｒｈＥＰＯ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，カタロク番号ＲＤＩ−ＰＢ１１９６５）の投与、ならびに皮下、「ＳＣ」で０日目、２日目、４日目、および６日目に２μｇ／ｋｇ、６μｇ／ｋｇ、１８μｇ／ｋｇ、および５４μｇ／ｋｇの濃度で構築物１９６６によりコードされる精製したアルブミン融合タンパク質の投与において、ＥＰＯ活性の程度をモニタリングした。
ヘマトクリットを、０日目および７日目に針で尾静脈を刺し、へパリン処理されたマイクロキャオイラリーチューブで血液を収集し、そして続いて実験の期間にわたってチューブをスピニングすることにより、決定した。ＥＰＯアルブミン融合タンパク質のより多くの投薬量は、コントロール組換えヒトＥＰＯ、「ｒｈＥＰＯ」（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，カタロク番号ＲＤＩ−ＰＢ１１９６５）と比べて、大よそ等モルである。
（結果）
組換えヒトＥＰＯまたはＥＰＯアルブミン融合タンパク質のいずれかで処理された０日〜７日のヘマトクリットにおいて有意な増加があった（実施例５を参照のこと）。しかし、構築物１９６６によりコードされるＥＰＯアルブミン融合タンパク質は、ヘマトクリットレベルにおいてｒｈＥＰＯコントロールよりもより強烈な効果を有するようであった。
構築物１９６６によりコードされるＥＰＯアルブミン融合タンパク質の５２μｇ／ｋｇの３投薬量／週または１５６μｇ／ｋｇの１投薬量／週の皮下投与が、０日〜８日のヘマトクリットにおける４０％を超える変化またはこれに等しい変化を引き起こした（図６を参照のこと）。ヘマトクリットにおける％変化は、三重投薬量に対して４０％近くに保たれるか、または一週間の間にｒｈＥＰＯの１２μｇ／ｋｇの３投薬量皮下投与に対して３０％近くから１０％未満までの低下と反対に、１４日目において単一の投薬量に対して２０％以下に抑制されるかのいずれかである。高められたヘマトクリットは、より通常のレベルに低下するｒｈＥＰＯタンパク質により誘導されるヘマトクリットレベルと比較して、最後の皮下投与の後１週間の期間にわたって構築物１９６６によりコードされるＥＰＯアルブミン融合タンパク質で保たれるようである。
アルブミン融合タンパク質の１５０μｇ／ｋｇで静脈内注射されたＤＢＡマウスが、ｒｈＥＰＯより７倍ゆっくりとこのＥＰＯアルブミン融合タンパク質を取り除いた。
（実施例９：構築物ＩＤ１９８１、ＨＳＡ−ＥＰＯ、産生）
構築物ＩＤ１９８１（ｐＣ４．ＥＰＯ：ＨＳＡ−ＥＰＯ．Ａ２８−Ｄ１９２）は、ＥＰＯアルブミン融合タンパク質をコードし、この融合タンパク質は、ネイティブＨＳＡリーダー配列および哺乳動物発現ベクターｐＣ４にクローニングされたＥＰＯの成熟形態のアミノ末端に融合した、最終Ａｒｇ残基を除くＤＮＡを含む。
（構築物１９８１についてのＥＰＯ ｃＤＮＡのクローニング）
ＥＰＯをコードするＤＮＡを、以下に記載されるプライマーＥＰＯ３およびＥＰＯ４を使用して増幅し、Ｂｓｕ ３６Ｉ／Ａｓｃ Ｉで切断し、そしてＢｓｕ ３６Ｉ／Ａｓｃ Ｉ切断されたｐＣ４：ＨＳＡに連結した。構築物ＩＤ番号１９８１は、ＨＳＡの成熟形態、およびＥＰＯの成熟形態、Ａｌａ ２８〜Ａｓｐ１９２を含む、アルブミン融合タンパク質をコードする（Ｇｅｎｂａｎｋ登録ＡＡＡ５２４００）。
ＥＰＯの成熟形態（表２における構築物１９８１についての配列番号Ｘを参照のこと）コードするポリヌクレオチドのＰＣＲ増幅のために適切な２つのオリゴヌクレオチド（ＥＰＯ３およびＥＰＯ４）を合成した。
Figure 2014043448
 ＥＰＯ３は、Ｂｓｕ ３６Ｉクローニング部位（下線で示される）およびＥＰＯの成熟形態の最初の８アミノ酸をコードするＨＳＡの最後の４アミノ酸残基および２６ヌクレオチド（イタリック体）をコードするヌクレオチドを組み込む。ＥＰＯ４において、Ａｓｃ Ｉ部位は、下線を引かれ（配列番号８０６）、そして最後の２８ヌクレオチド（イタリック体）は、最終Ａｒｇ残基を除いたＥＰＯの最後の９個のアミノ酸残基をコードするＤＮＡの逆相補体である（一般的な構築物クローニングについては実施例５を参照のこと）。これらのプライマーを使用して精製されたＰＣＲ増幅体を精製し、Ｂｓｕ ３６Ｉ／Ａｓｃ Ｉ制限酵素で消化し、そしてｐＣ４：ＨＳＡベクターのＢｓｕ ３６Ｉ／Ａｓｃ Ｉ部位へクローニングした。
ＰＣＲ産物を精製し（例えば、Ｗｉｚａｒｄ ＰＣＲ Ｐｒｅｐｓ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ））、続いてＢｓｕ ３６ＩおよびＡｓｃ Ｉで消化した。そしてゲル電気泳動によるＢｓｕ ３６Ｉ−Ａｓｃ Ｉフラグメントのさらなる精製の後、この産物をＢｓｕ ３６Ｉ／Ａｓｃ Ｉで消化されたｐＣ４：ＨＳＡにクローニングし、構築物番号１９８１を産生した。
さらに、発現されたアルブミン融合タンパク質のＮ末端の、アミノ酸配列決定による分析は、予測されたＨＳＡ配列の存在を確認した（以下を参照のこと）。
本発明のＥＰＯアルブミン融合タンパク質は、好ましくは、最終Ａｒｇ残基を欠失するＥＰＯの成熟形態（すなわち、Ａｌａ−２８〜Ａｓｐ−１９２）のＮ末端またはＣ末端のいずれかに融合した、ＨＳＡの成熟形態（すなわち、Ａｓｐ−２５〜Ｌｅｕ−６０９）を含む。本発明の１つの実施形態において、本発明のＥＰＯアルブミン融合タンパク質は、発現のために使用される宿主の分泌経路における発生期の融合ポリペプチドを方向付けるシグナル配列を、さらに含む。さらに好ましい実施形態において、シグナル配列によってコードされるシグナルペプチドが除去され、そして成熟ＥＰＯアルブミン融合タンパク質が、培養培地中に直接分泌される。本発明のＥＰＯアルブミン融合タンパク質は、異種シグナル配列（ＭＡＦ、ＩＮＶ、Ｉｇ、Ｆｉｂｕｌｉｎ Ｂ、Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎ、インスリン様増殖因子結合タンパク質４、改変体ＨＳＡリーダー配列（キメラＨＳＡ／ＭＡＦリーダー配列が挙げられるが、これに限定されない）、または当該分野において公知である他の異種シグナル配列が挙げられるが、これらに限定されない）を含み得る。好ましい実施形態において、本発明のＥＰＯアルブミン融合タンパク質は、ネイティブＥＰＯシグナル配列を含む。さらに好ましい実施形態において、本発明のＥＰＯアルブミン融合タンパク質は、Ｎ末端メチオニン残基をさらに含む。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（フラグメントおよび／または改変体を含む）もまた、本発明に包含される。
（構築物ＩＤ１９８１の発現および精製）
（ＣＨＯ細胞の発現）
構築物１９８１を、実施例６および８に記載されるように、ＣＨＯ細胞にトランスフェクトした。発現レベルおよび特異的な産生速度を、実施例８に記載されるように決定した。
（ＣＨＯ上清からの精製）
構築物ＩＤ番号１９８１からＣＨＯ細胞において発現された、ＥＰＯアルブミン融合タンパク質を含む細胞上清を、実施例７および８に記載されるように精製した。Ｎ末端配列決定が、ＤＡＨＫＳ（ＨＳＡの成熟形態のアミノ末端の配列）を産生した。１リットルの上清あたり１４ｍｇのタンパク質を得た。およその分子量８５．７ｋＤａを得た。
（構築物１９８１についてのインビトロＴＦ−１細胞増殖アッセイ）
（方法）
構築物１９８１によりコードされるＥＰＯアルブミン融合タンパク質についてのインビトロＴＦ−１細胞増殖アッセイが、実施例８において「構築物１９６６についてのインビトロＴＦ−１細胞増殖アッセイ」で始まる副節で記載されたように以前に実行した。
（結果）
構築物１９８１を発現するＣＨＯ細胞からの上清を、ＨＳＡ−ＥＰＯアルブミン融合タンパク質について９０％以上精製し、そして実施例８記載されるようなアッセイにおいて試験した。平均して、ｒｈＥＰＯの５倍より大きいＥＣ５０が、確立された（実施例４および７を参照のこと）
（構築物１９８１の活性が、ヘマトクリットを測定するためのインビボマウスモデルＨａｒｌａｎを使用してアッセイされ得る）
（方法）
インビボＨａｒｌａｎマウスモデルを、構築物１９８１によりコードされるコントロールｒｈＥＰＯまたはＥＰＯアルブミン融合タンパク質のいずれかの皮下投与において、ヘマトクリットレベルを測定するために使用した。このアッセイを、実施例８において副節表題「構築物１９６６の活性が、ヘマトクリットを測定するためのインビボマウスモデルＨａｒｌａｎを使用してアッセイされ得る」で以前に記載されるように実行した。
（結果）
ｒｈＥＰＯまたはＥＰＯアルブミン融合タンパク質のいずれかで処理された動物について、０日〜７日のヘマトクリットにおける有意な増加があった（図５を参照のこと）。しかし、構築物１９８１によりコードされるＥＰＯアルブミン融合タンパク質は、ヘマトクリットレベルにおいてｒｈＥＰＯコントロールよりもより強烈な効果を有するようであった。
アルブミン融合構築物１９８１によりコードされるＥＰＯアルブミン融合タンパク質の１５０μｇ／ｋｇで静脈内注射されたＤＢＡマウスが、ｒｈＥＰＯより７倍ゆっくりとこのＥＰＯアルブミン融合タンパク質を取り除いた。
（実施例１０：構築物ＩＤ１９９７、ＨＳＡ−ＥＰＯ、産生）
構築物ＩＤ１９９７（ｐＥＥ１２．１：ＥＰＯ Ｍ１−Ｄ１９２．ＨＳＡ）は、ＥＰＯアルブミン融合タンパク質をコードするＤＮＡを含み、この融合タンパク質は、最終Ａｒｇ残基を除く全長ＥＰＯタンパク質（ネイティブリーダー配列を含む）、すなわちＭ１−Ｄ１９２を有し、および哺乳動物発現ベクターｐＥＥ１２．１にクローニングされたＨＳＡの成熟形態のアミノ末端に融合されている。
（構築物１９９７についてのＥＰＯ ｃＤＮＡのクローニング）
ＥＰＯをコードするＤＮＡを、以下に記載されるプライマーＥＰＯ５およびＥＰＯ６を使用して増幅し、Ｅｃｏ ＲＩ／Ｃｌａ Ｉで切断し、そしてＥｃｏ ＲＩ／Ｃｌａ Ｉ切断されたｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，１６００ Ｆａｒａｄａｙ Ａｖｅ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ ９２００８）に連結した。ｐｃＤＮＡ３．ＥＰＯ Ｍ１−Ｄ１９２．ＨＳＡを、Ｅｃｏ ＲＩ／Ｈｉｎｄ ＩＩＩを消化してＥＰＯ Ｍ１−Ｄ１９２．ＨＳＡ発現カセットフラグメントを放出し、Ｅｃｏ ＲＩ／Ｈｉｎｄ ＩＩＩ消化されたｐＥＥ１２．１．にクローニングした。構築物ＩＤ番号１９９７は、リーダー配列を含むアルブミン融合タンパク質およびＥＰＯの成熟形態、続いて成熟ＥＰＯタンパク質をコードする（構築物１９９７についての表２における配列番号Ｙを参照のこと）。
ＥＰＯ（配列番号Ｘ、構築物１９９７についての表２）、ＥＰＯ５およびＥＰＯ６をコードするポリヌクレオチドのＰＣＲ増幅のために適切な２つのオリゴヌクレオチド（ＥＰＯ５およびＥＰＯ６）を合成した。
Figure 2014043448
 ＥＰＯ５は、Ｅｃｏ ＲＩ部位（イタリック体で示される）およびｋｏｚａｋ配列（下線で示される）を組み込み、続いて、全長ＥＰＯのＯＲＦの最初の３５アミノ酸をコードするＤＮＡを組み込む。ＥＰＯ６において、イタリック体の配列は、Ｃｌａ Ｉ部位であり、下線を引かれた配列は、ＨＳＡタンパク質の成熟形態の最初の最初の９アミノ酸をコードするＤＮＡの逆相補体であり（ＤＡＨＫＳＥＶＡＨ、配列番号１１０６）、そしてＨＳＡの逆相補体に続く配列は、最後のＡｒｇ−１９３アミノ酸を含まないＥＰＯの最後の７アミノ酸をコードする、最後の２３ヌクレオチドの逆相補体である。これらの２つのプライマーを使用して、全長ＥＰＯタンパク質をコードするＤＮＡを、実施例８のようにＰＣＲ増幅した。
ＰＣＲ産物を精製し、続いてＥｃｏ ＲＩおよびＣｌａ Ｉで消化した。そしてゲル電気泳動によるＥｃｏ ＲＩ−Ｃｌａ Ｉフラグメントのさらなる精製の後、この産物をＥｃｏ ＲＩ／Ｃｌａ Ｉで消化されたｐｃＤＮＡ３にクローニングした。発現カセットを含むＥｃｏ ＲＩ／Ｈｉｎｄ ＩＩＩフラグメントをｐｃＤＮＡ３．ＥＰＯ．Ｍ１−Ｄ１９２．ＨＳＡから生成し、そしてＥｃｏ ＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化されたｐＥＥ１２．１にサブクローニングし、構築物番号１９９７を得た。
さらに、アミノ酸配列決定によるアルブミン融合タンパク質のＮ末端の分析は、予測されたＥＰＯ配列の存在を確かめた。（以下を参照のこと）。
本発明のＥＰＯアルブミン融合タンパク質は、好ましくは、最終Ａｒｇ残基を欠失するＥＰＯの成熟形態（すなわち、Ａｌａ−２８〜Ａｓｐ−１９２）のＮ末端またはＣ末端のいずれかに融合した、ＨＳＡの成熟形態（すなわち、Ａｓｐ−２５〜Ｌｅｕ−６０９）を含む。本発明の１つの実施形態において、本発明のＥＰＯアルブミン融合タンパク質は、発現のために使用される宿主の分泌経路における発生期の融合ポリペプチドを方向付けるシグナル配列を、さらに含む。さらに好ましい実施形態において、シグナル配列によってコードされるシグナルペプチドが除去され、そして成熟ＥＰＯアルブミン融合タンパク質が、培養培地中に直接分泌される。本発明のＥＰＯアルブミン融合タンパク質は、異種シグナル配列（ＭＡＦ、ＩＮＶ、Ｉｇ、Ｆｉｂｕｌｉｎ Ｂ、Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎ、インスリン様増殖因子結合タンパク質４、改変体ＨＳＡリーダー配列（キメラＨＳＡ／ＭＡＦリーダー配列が挙げられるが、これに限定されない）、または当該分野において公知である他の異種シグナル配列が挙げられるが、これらに限定されない）を含み得る。好ましい実施形態において、本発明のＥＰＯアルブミン融合タンパク質は、ネイティブＥＰＯシグナル配列を含む。さらに好ましい実施形態において、本発明のＥＰＯアルブミン融合タンパク質は、Ｎ末端メチオニン残基をさらに含む。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（フラグメントおよび／または改変体を含む）もまた、本発明に包含される。
（構築物ＩＤ１９９７の発現および精製）
（ＮＳ０細胞の発現）
構築物１９９７を、実施例６に記載されるように、ＮＳ０細胞にトランスフェクトした。発現レベルおよび特異的な産生速度を、実施例８に記載されるように決定した。
（ＮＳ０細胞上清からの精製）
構築物１９９７でトランスフェクトされるＮＳ０細胞由来の５００ｍＬ細胞上清からのアルブミン融合タンパク質の精製は、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ中０〜１ＭのＮａＣｌ勾配を使用する、ｐＨ７．４におけるＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ陰イオン交換クロマトグラフィー、続いて５〜４０ｍＭのクエン酸ナトリウム勾配を用いる、ｐＨ６．５におけるＰｏｒｏｓ ＰＩ ５０陰イオン交換クロマトグラフィー、および１０ｍＭクエン酸（ｐＨ６．５）および１４０ｍＭ ＮａＣｌの最終緩衝液濃度（実施例７を参照のこと）への、６ＤＶについてのダイアフィルトレーションを包含する。Ｎ末端配列決定は、配列ＡＰＰＲＬＩを生じるはずであり、これは、ＥＰＯの成熟形態のアミノ末端である。このタンパク質は、８７．７ｋＤａのおよそのＭＷを有する。上清１リットル当たり５２．２ｍｇのタンパク質の最終収量が、得られた。
より大きい規模の精製（例えば、５０ＬのＮＳ０細胞上清）については、約８〜１０Ｌに濃縮され得る。次いで、濃縮されたサンプルは、ｐＨ７．５で、５０ｍＭ ＮａＯＡｃ（ｐＨ６．０）および１５０ｍＭ ＮａＣｌからなる段階溶出を使用して、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ陰イオン交換カラム（１０×１９ｃｍ、１．５Ｌ）に通され得る。次いで、溶出されたサンプルは、０．７５％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ １００とともに、室温で６０分間ウイルス感染され得る。次いで、ＳＤＲ−逆相クロマトグラフィー（１０ｃｍ×１０ｃｍ、０．８Ｌ）を、ｐＨ６．０で、５０ｍＭ ＮａＯＡｃおよび１５０ｍＭ ＮａＣｌとともに、またはその逆で使用して、サンプルをＳＰ−セファロースカラムに、ｐＨ４．８で、５０ｍＭ ＮａＯＡｃ（ｐＨ６．０）および１５０ｍＭ ＮａＣｌを使用して通され得る。続いて、ＤＶ５０濾過して、全てのウイルス成分を除去する。続いて、Ｐｈｅｎｙｌ−６５０Ｍクロマトグラフィー（２０ｃｍ×１２ｃｍ、３．８Ｌ）を、３５０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４および５０ｍＭ ＮａＯＡｃからなる段階溶出、あるいは５０ｍＭ ＮａＯＡｃ（ｐＨ６．０）からなる段階溶出を使用して、ｐＨ６．０で行い得る。６〜８ＤＶについてのダイアフィルトレーションは、緩衝液の、所望の最終濃度の緩衝液（１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４＋５８ｍＭスクロース＋１２０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．２）または１０ｍＭクエン酸（ｐＨ６．５）および１４０ｍＭ ＮａＣｌのいずれかへの交換を可能にする。
（構築物１９９７についてのインビトロＴＦ−１細胞増殖アッセイ）
（方法）
構築物１９９７によりコードされるＥＰＯ−ＨＳＡアルブミン融合タンパク質についてのインビトロＴＦ−１細胞増殖アッセイが、実施例８において「構築物１９６６についてのインビトロＴＦ−１細胞増殖アッセイ」で始まる副節で記載されたように以前に実行した。
構築物１９９７を発現するＮＳ０細胞からの上清を、ＥＰＯ−ＨＳＡアルブミン融合タンパク質について９０％以上精製し、そして実施例８記載されるようなアッセイにおいて試験した。平均して、ｒｈＥＰＯの５倍より大きいＥＣ５０が、確立された（実施例７を参照のこと）
（構築物１９９７の活性が、ヘマトクリットを測定するためのインビボマウスモデルＨａｒｌａｎを使用してアッセイされ得る）
（方法）
インビボＨａｒｌａｎマウスモデルが、０日、２日、４日および６日の種々の投薬量での構築物１９８１によりコードされるコントロールｒｈＥＰＯまたはＥＰＯアルブミン融合タンパク質のいずれかの皮下投与において、ヘマトクリットレベルを測定するために使用した。このアッセイを、実施例８において副節表題「構築物１９６６の活性が、ヘマトクリットを測定するためのインビボマウスモデルＨａｒｌａｎを使用してアッセイされ得る」で以前に記載されるように実行した。ヘマトクリットを、０日目、８日目、および１４日面で決定した。
（結果）
ｒｈＥＰＯまたはＥＰＯアルブミン融合タンパク質のいずれかで処理された動物について、０日〜８日のヘマトクリットにおける有意な増加があった（図８を参照のこと）。しかし、構築物１９６６によりコードされるＥＰＯアルブミン融合タンパク質の場合として、構築物１９９７によりコードされるＥＰＯアルブミン融合タンパク質の５２μｇ／ｋｇの３投与量／週の皮下投与は、一週間当たりｒｈＥＰＯの１２μｇ／ｋｇ皮下投与レベルの３回の投与量について３０％〜１０％未満の衰退と反対に、１４日目の１５％未満に軽減される０日〜８日のヘマトクリットにおける３０％に近い変化を引き起こした。
ＥＢＯアルブミン融合構築物によりコードされるＥＰＯアルブミン融合タンパク質の１５０μｇ／ｋｇで静脈内注射されたＤＢＡマウスが、ｒｈＥＰＯより７倍ゆっくりとこのＥＰＯアルブミン融合タンパク質を取り除いた。
（実施例１１：構築物ＩＤ２２９４、ＥＰＯ−ＨＳＡ、産生）
構築物ＩＤ２２９４（ｐＣ４．ＥＰＯ Ｒ１４０Ｇ．ＨＳＡ）は、ＥＰＯアルブミン融合タンパク質をコードし、この融合タンパク質は、全長ＥＰＯタンパク質（ネイティブリーダー配列を含む）、すなわちＭ１−Ｄ１９２を有し、および哺乳動物発現ベクターｐＣ４にクローニングされたＨＳＡの成熟形態のアミノ末端に融合した、最終Ａｒｇ残基を除くＤＮＡを含む。
（構築物２２９４についてのＥＰＯ ｃＤＮＡのクローニング）
構築物ＩＤ番号２２９４は、リーダー配列およびＥＰＯの成熟形態を含むアルブミン融合タンパク質、続いて成熟ＨＳＡタンパク質をコードする。構築物ＩＤ番号２２９４が、２工程のＰＣＲ法においてテンプレートとして、構築物ＩＤ番号１９６６（すなわちｐＣ４：ＥＰＯ．Ｍ１−Ｄ１９２．ＨＳＡ）を用いることにより生成された。
ＥＰＯ（配列番号Ｘ、構築物２２９４について、表２）をコードするポリヌクレオチドのＰＣＲ増幅のために適切な４つのオリゴヌクレオチド（ＥＰＯ７、ＥＰＯ８、ＥＰＯ９およびＥＰＯ１０）を合成した。
Figure 2014043448
 ＰＣＲ増幅の最初の段階で、構築物１９６６の最初のＮ末端フラグメントおよびＣ末端フラグメントが、独立して増幅された。Ｎ末端フラグメントを、プライマーＥＰＯ７およびＥＰＯ８を用いて生成した。ＥＰＯ７は、Ｂａｍ ＨＩ（イタリック体で示される）を組み込み、そしてｋｏｚａｋ配列（下線で示される）、続いて全長ＥＰＯのＯＲＦの最初の６アミノ酸をコードする最初の１８ヌクレオチドを有する。ＥＰＯ８プライマーは、アミノ酸１４０でのＡｒｇ残基をコードするコドンＣＧＡ（太字で強調される）が、Ｇｌｙ残基をコードするコドンＧＧＡに変更される。Ｃ末端フラグメントを、プライマーＥＰＯ９およびＥＰＯ１０を用いて生成した。ＥＰＯ９において、下線が引かれた配列は、Ｃｌａ Ｉ部位であり、そしてＣｌａ Ｉ部位およびそれに続くＤＮＡは、成熟ＨＳＡタンパク質の最初の１０アミノ酸をコードするＤＮＡの逆相補体である。ＥＰＯ９において、最後の５ヌクレオチドは、全長ＥＰＯにおける最後の５ヌクレオチドの逆相補体に対応し、これは最終Ａｒｇ−１９３残基を欠失する。ＥＰＯ１０プライマーは、アミノ酸１４０でのＡｒｇ残基をコードするコドンＣＧＡ（太字で強調される）が、Ｇｌｙ残基をコードするコドンＧＧＡに変更されることを除いて、ＥＰＯの全長形態の１３６〜１４３アミノ酸をコードする核酸配列を含む。ＰＣＲ増幅の第２の段階において、プライマーＥＰＯ７およびＥＰＯ９が、Ａｒｇ−１４０を有する全長ＥＰＯを、反応混合物が、ＰＣＲ増幅されたＮ末端フラグメントおよびＰＣＲ増幅されたＣ末端フラグメントの両方を含んだ、Ｇｌｙ変異まで増幅するのに用いた。
ＰＣＲ産物を精製し、続いてＢａｍ ＨＩおよびＣｌａ Ｉで消化した。そしてゲル電気泳動によるＢａｍ ＨＩ−Ｃｌａ Ｉフラグメントのさらなる精製の後、この産物をＢａｍ ＨＩ／Ｃｌａ Ｉで消化されたｐＣ４：ＨＳＡにクローニングし、構築物番号２２９４を得た。
さらに、アミノ酸配列決定によるアルブミン融合タンパク質のＮ末端の分析は、予測されたＥＰＯ配列の存在を確かめた。（以下を参照のこと）。
本発明のＥＰＯアルブミン融合タンパク質は、好ましくは、最終Ａｒｇ残基を欠失するＥＰＯの成熟形態（すなわち、Ａｌａ−２８〜Ａｓｐ−１９２）のＮ末端またはＣ末端のいずれかに融合した、ＨＳＡの成熟形態（すなわち、Ａｓｐ−２５〜Ｌｅｕ−６０９）を含む。本発明の１つの実施形態において、本発明のＥＰＯアルブミン融合タンパク質は、発現のために使用される宿主の分泌経路における発生期の融合ポリペプチドを方向付けるシグナル配列を、さらに含む。さらに好ましい実施形態において、シグナル配列によってコードされるシグナルペプチドが除去され、そして成熟ＥＰＯアルブミン融合タンパク質が、培養培地中に直接分泌される。本発明のＥＰＯアルブミン融合タンパク質は、異種シグナル配列（ＭＡＦ、ＩＮＶ、Ｉｇ、Ｆｉｂｕｌｉｎ Ｂ、Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎ、インスリン様増殖因子結合タンパク質４、改変体ＨＳＡリーダー配列（キメラＨＳＡ／ＭＡＦリーダー配列が挙げられるが、これに限定されない）、または当該分野において公知である他の異種シグナル配列が挙げられるが、これらに限定されない）を含み得る。好ましい実施形態において、本発明のＥＰＯアルブミン融合タンパク質は、ネイティブＥＰＯシグナル配列を含む。さらに好ましい実施形態において、本発明のＥＰＯアルブミン融合タンパク質は、Ｎ末端メチオニン残基をさらに含む。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（フラグメントおよび／または改変体を含む）もまた、本発明に包含される。
（構築物ＩＤ２２９４の発現および精製）
（ＣＨＯ細胞における発現）
実施例６および８に記載されるようにして、構築物２２９４をＣＨＯ細胞にトランスフェクト得る。発現レベルおよび比産生率（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ ｒａｔｅ）を、実施例８に記載されるようにして決定し得る。
（ＣＨＯ上清からの精製）
ＣＨＯ細胞において構築物ＩＤ ＃２２９４から発現されたＥＰＯ−ＨＳＡ融合タンパク質を含む細胞上清を、実施例７および８のようにして精製し得る。Ｎ末端の配列決定は、ＥＰＯの成熟形態のアミノ末端に対応する配列ＡＰＰＲＬＩ（配列番号２１４１）を生じるはずであり、約８７．７ｋＤａのＭＷのタンパク質を生じるはずである。
（構築物２２９４についてのインビトロＴＦ−１細胞増殖アッセイ）
（方法）
構築物２２９４によってコードされるＥＰＯ−ＨＳＡアルブミン融合物についてのインビトロＴＦ−１細胞増殖アッセイを、実施例８において副節の表題「構築物１９６６についてのインビトロＴＦ−１細胞増殖アッセイ」の下で先に記載されたようにして実施し得る。
（構築物２２９４の活性は、ヘマトクリットの測定のためのインビボＨａｒｌａｎマウスモデルを使用してアッセイされ得る）
実施例８において副節の表題「ヘマトクリットの測定のためのインビボＨａｒｌａｎマウスモデル」の下で先に記載されるようなインビボＨａｒｌａｎマウスモデルを使用して、構築物２２９４によりコードされるＥＰＯアルブミン融合タンパク質のヘマトクリットレベルを測定し得る。
（実施例１２：構築物ＩＤ２２９８、ＥＰＯ−ＨＳＡ、産生）
構築物ＩＤ２２９８（ｐＥＥ１２．１：ＥＰＯ．Ｒ１４０Ｇ．ＨＳＡ）は、ＥＰＯアルブミン融合タンパク質をコードするＤＮＡを含み、この融合タンパク質は、哺乳動物発現ベクターｐＥＥ１２．１にクローニングされたＨＳＡの成熟形態のアミノ末端に融合された、最後のＡｒｇ残基を除く全長ＥＰＯタンパク質（ネイティブのリーダー配列を含む）（すなわち、Ａｒｇ−１４０をＧｌｙに変異する点変異を有するＭ１−Ｄ１９２）を有する。
（構築物２２９８についてのＥＰＯ ｃＤＮＡのクローニング）
構築物ＩＤ ＃２２９８は、ＥＰＯのリーダー配列および成熟形態を含むアルブミン融合タンパク質、続いて成熟ＨＳＡタンパク質をコードする。構築物ＩＤ ＃２２９８を、構築物ＩＤ ＃１９９７（すなわち、ｐＥＥ１２．１：ＥＰＯ．Ｍ１−Ｄ１９２．ＨＳＡ）をＰＣＲ変異誘発のためのテンプレートとして使用することによって作製した。
構築物ＩＤ ＃１９９７のテンプレートのＰＣＲ増幅のために適切な２つのオリゴヌクレオチド（ＥＰＯ１１およびＥＰＯ１２）を、合成した。
Figure 2014043448
 ＥＰＯ１１アンチセンスプライマーは、全長形態のＥＰＯのアミノ酸１３５〜１４５にわたる配列の逆相補体を含む（アミノ酸１４０におけるＡｒｇをコードするコドンＣＧＡ（太字で強調されている）が、Ｇｌｙ残基をコードするコドンＧＧＡに変更されていることを例外とする）。ＥＰＯ１２センスプライマーは、全長形態のＥＰＯのアミノ酸１３５〜１４５をコードする核酸配列を含む（アミノ酸１４０におけるＡｒｇ残基をコードするコドンＣＧＡ（太字で強調されている）が、Ｇｌｙ残基をコードするコドンＧＧＡに変更されていることを例外とする）。部位特異的変異誘発キットおよびＳｔｒａｔａｇｅｎｅからのプロトコルを使用して、ＰＣＲ反応は、ＡｒｇからＧｌｙへの変異を除く、構築物ＩＤ ＃１９９７の全テンプレートを作製した。このＰＣＲ産物をＤｐｎ Ｉで消化し、コンピテントＸＬ１ Ｂｌｕｅ細菌に形質転換し、そしてコロニーを配列決定して、確認した。Ｄｐｎ Ｉエンドヌクレアーゼは、メチル化および半メチル化されたＤＮＡに対して特異的であり、そして配列５’−ＧｍＡＴＣ−３’を標的化する。Ｄｐｎ Ｉを使用して、親ＤＮＡテンプレートを消化し、変異含有合成ＤＮＡを選択する。
さらに、発現されたアルブミン融合タンパク質のＮ末端の、アミノ酸配列決定による分析は、予測されたＥＰＯ配列の存在を確認し得る（以下を参照のこと）。
本発明のＥＰＯアルブミン融合タンパク質は、好ましくは、最後のＡｒｇ残基を欠くＥＰＯの成熟形態（すなわち、Ａｌａ−２８〜Ａｓｐ−１９２）のＮ末端またはＣ末端のいずれかに融合した、ＨＳＡの成熟形態（すなわち、Ａｓｐ−２５〜Ｌｅｕ−６０９）を含む。本発明の１つの実施形態において、本発明のＥＰＯアルブミン融合タンパク質は、発現のために使用される宿主の分泌経路における発生期の融合ポリペプチドを方向付けるシグナル配列を、さらに含む。さらに好ましい実施形態において、シグナル配列によってコードされるシグナルペプチドが除去され、そして成熟ＥＰＯアルブミン融合タンパク質が、培養培地中に直接分泌される。本発明のＥＰＯアルブミン融合タンパク質は、異種シグナル配列（ＭＡＦ、ＩＮＶ、Ｉｇ、Ｆｉｂｕｌｉｎ Ｂ、Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎ、インスリン様増殖因子結合タンパク質４、改変体ＨＳＡリーダー配列（キメラＨＳＡ／ＭＡＦリーダー配列が挙げられるが、これに限定されない）、または当該分野において公知である他の異種シグナル配列が挙げられるが、これらに限定されない）を含み得る。好ましい実施形態において、本発明のＥＰＯアルブミン融合タンパク質は、ネイティブＥＰＯシグナル配列を含む。さらに好ましい実施形態において、本発明のＥＰＯアルブミン融合タンパク質は、Ｎ末端メチオニン残基をさらに含む。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（フラグメントおよび／または改変体を含む）もまた、本発明に包含される。
（構築物ＩＤ２２９８の発現および精製）
（ＮＳ０細胞における発現）
実施例６および１０に記載されるようにして、構築物２２９８をＮＳ０細胞にトランスフェクトし得る。発現レベルおよび比産生率を、実施例８に記載されるようにして決定し得る。
（ＮＳ０細胞上清からの精製）
ＮＳ０細胞において構築物ＩＤ ＃２２９８から発現されたＥＰＯ−ＨＳＡ融合タンパク質を含む細胞上清を、実施例７および１０のようにして精製し得る。Ｎ末端の配列決定は、ＥＰＯの成熟形態のアミノ末端に対応する配列ＡＰＰＲＬＩ（配列番号２１４１）を生じるはずであり、約８７．７ｋＤａのＭＷのタンパク質を生じるはずである。
（構築物２２９８についてのインビトロＴＦ−１細胞増殖アッセイ）
（方法）
構築物２２９８によってコードされるＥＰＯ−ＨＳＡアルブミン融合タンパク質についてのインビトロＴＦ−１細胞増殖アッセイを、実施例８において副節の表題「構築物１９６６によってコードされるアルブミン融合タンパク質についてのインビトロＴＦ−１細胞増殖アッセイ」、および実施例１０において副節の表題「構築物１９９７についてのインビトロＴＦ−１細胞増殖アッセイ」の下で先に記載されたようにして実施し得る。
（構築物２２９８の活性は、ヘマトクリットの測定のためのインビボＨａｒｌａｎマウスモデルを使用してアッセイされ得る）
実施例８において副節の表題「ヘマトクリットの測定のためのインビボＨａｒｌａｎマウスモデル」の下および実施例１０で先に記載されるようなインビボＨａｒｌａｎマウスモデルを使用して、構築物２２９８によりコードされるＥＰＯアルブミン融合タンパク質のヘマトクリットレベルを測定し得る。
（実施例１３：構築物ＩＤ２３２５、ＥＰＯ−ＨＳＡ、産生）
最適化された構築物ＩＤ２３２５（ｐＣ４．ＥＰＯ：Ｍ１−Ｄ１９２．ＨＳＡ）コドンは、ＥＰＯアルブミン融合タンパク質をコードするＤＮＡを含み、この融合タンパク質は、哺乳動物発現ベクターｐＣ４にクローニングされたＨＳＡの成熟形態のアミノ末端に融合された、全長ＥＰＯタンパク質（ネイティブのリーダー配列を含む）（すなわち、Ａｒｇ−１４０からＧｌｙへの点変異を有するＭ１−Ｄ１９２）を有する。
（構築物２３２５についてのＥＰＯ ｃＤＮＡのクローニング）
ＥＰＯオープンリーディングフレームをコードするＤＮＡは、野生型ＥＰＯ遺伝子配列にハイブリダイズしないように最適化されたコドンであった。ＥＰＯをコードするポリヌクレオチドを、６個の重複オリゴヌクレオチドによってＰＣＲ生成し、そしてＴＡベクターにクローニングした。構築物ＩＤ ＃２３２５は、リーダー配列およびＥＰＯの成熟形態、続いて成熟ＨＳＡタンパク質を含むアルブミン融合タンパク質をコードする。
さらに、発現されたアルブミン融合タンパク質のＮ末端の、アミノ酸配列決定による分析は、予測されたＥＰＯ配列の存在を確認し得る（以下を参照のこと）。
本発明のＥＰＯアルブミン融合タンパク質は、好ましくは、最後のＡｒｇ残基を欠くＥＰＯの成熟形態（すなわち、Ａｌａ−２８〜Ａｓｐ−１９２）のＮ末端またはＣ末端のいずれかに融合した、ＨＳＡの成熟形態（すなわち、Ａｓｐ−２５〜Ｌｅｕ−６０９）を含む。本発明の１つの実施形態において、本発明のＥＰＯアルブミン融合タンパク質は、発現のために使用される宿主の分泌経路における発生期の融合ポリペプチドを方向付けるシグナル配列を、さらに含む。さらに好ましい実施形態において、シグナル配列によってコードされるシグナルペプチドが除去され、そして成熟ＥＰＯアルブミン融合タンパク質が、培養培地中に直接分泌される。本発明のＥＰＯアルブミン融合タンパク質は、異種シグナル配列（ＭＡＦ、ＩＮＶ、Ｉｇ、Ｆｉｂｕｌｉｎ Ｂ、Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎ、インスリン様増殖因子結合タンパク質４、改変体ＨＳＡリーダー配列（キメラＨＳＡ／ＭＡＦリーダー配列が挙げられるが、これに限定されない）、または当該分野において公知である他の異種シグナル配列が挙げられるが、これらに限定されない）を含み得る。好ましい実施形態において、本発明のＥＰＯアルブミン融合タンパク質は、ネイティブＥＰＯシグナル配列を含む。さらに好ましい実施形態において、本発明のＥＰＯアルブミン融合タンパク質は、Ｎ末端メチオニン残基をさらに含む。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（フラグメントおよび／または改変体を含む）もまた、本発明に包含される。
（構築物ＩＤ２３２５の発現および精製）
（ＣＨＯ細胞における発現）
実施例６および８に記載されるようにして、構築物２３２５をＣＨＯ細胞にトランスフェクトし得る。発現レベルおよび比産生率を、実施例８に記載されるようにして決定し得る。
（ＣＨＯ上清からの精製）
ＣＨＯ細胞において構築物ＩＤ ＃２３２５から発現されたＥＰＯ−ＨＳＡ融合タンパク質を含む細胞上清を、実施例７および８に記載の方法により精製し得る。Ｎ末端の配列決定は、ＥＰＯの成熟形態のアミノ末端に対応する配列ＡＰＰＲＬＩ（配列番号２１４１）を生じるはずであり、約８７．７ｋＤａのＭＷのタンパク質を生じるはずである。
（構築物２３２５についてのインビトロＴＦ−１細胞増殖アッセイ）
（方法）
構築物２３２５によってコードされるＥＰＯ−ＨＳＡアルブミン融合物についてのインビトロＴＦ−１細胞増殖アッセイを、実施例８において副節の表題「構築物１９６６についてのインビトロＴＦ−１細胞増殖アッセイ」の下で先に記載されたようにして実施し得る。
（構築物２３２５の活性は、ヘマトクリットの測定のためのインビボＨａｒｌａｎマウスモデルを使用してアッセイされ得る）
実施例８において副節の表題「ヘマトクリットの測定のためのインビボＨａｒｌａｎマウスモデル」の下で先に記載されるようなインビボＨａｒｌａｎマウスモデルを使用して、構築物２３２５によりコードされるＥＰＯアルブミン融合タンパク質のヘマトクリットレベルを測定し得る。
（実施例１４：ＥＰＯアルブミン融合タンパク質の適応症）
上記のインビトロアッセイおよびインビボアッセイからの結果は、ＥＰＯアルブミン融合タンパク質が、種々の状態（末期腎臓疾患（透析患者）、透析前の慢性腎不全、ジドブジン処置されたＨＩＶ患者、化学療法中の癌患者、および未熟児が挙げられるが、これらに限定されない）によって引き起こされる出血障害および貧血の処置において使用され得ることを示す。ＥＰＯアルブミン融合タンパク質はまた、選択的な非心臓の非脈管の手術を受けている貧血患者における手術前において、輸血の必要性を減少させるために使用され得る。これらの薬剤の開発における適応症としては、以下が挙げられる：再生不良性貧血および他の難治性貧血、炎症性腸疾患における難治性貧血、ならびに選択的整形外科手術における輸血逃避。腎疾患および腫瘍における貧血は、構築物１９６６、１９８１、１９９７、２２９４、２２９８および２３２５によりコードされるＥＰＯアルブミン融合タンパク質についての２つの主な適応症である。
（実施例１５：構築物ＩＤ１８１２、ＩＬ２−ＨＳＡ、産生）
構築物ＩＤ１８１２（ｐＳＡＣ３５：ＩＬ２．Ａ２１−Ｔ１５３．ＨＳＡ）は、ＩＬ２アルブミン融合タンパク質をコードするＤＮＡを含み、この融合タンパク質は、酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ発現ベクターｐＳＡＣ３５におけるＨＳＡの成熟形態のアミノ末端に融合された、ＨＳＡキメラリーダー配列（すなわち、ＨＳＡ−ｋｅｘ２シグナルペプチド）、成熟ＩＬ２タンパク質形態（すなわち、Ａ２１−Ｔ１５３）を有する。
（ＩＬ２ ｃＤＮＡのクローニング）
ＩＬ２をコードするポリヌクレオチドを、以下に記載されるプライマーＩＬ２−１およびＩＬ２−２を使用してＰＣＲ増幅した。これらの増幅体（ａｍｐｌｉｍｅｒ）を、Ｓａｌ Ｉ／Ｃｌａ Ｉで切断し、そしてＸｈｏ Ｉ／Ｃｌａ Ｉで切断したｐＳｃＣＨＳＡに連結した。構築物ＩＤ ＃１８１２は、ＨＳＡのキメラリーダー配列、ＩＬ２の成熟形態、続いて成熟ＨＳＡタンパク質を含むアルブミン融合タンパク質をコードする。
ＩＬ２の成熟形態をコードするポリヌクレオチドのＰＣＲ増幅のために適切な２つのオリゴヌクレオチド（ＩＬ２−１およびＩＬ２−２）を合成した：
Figure 2014043448
 ＩＬ２−１は、Ｓａｌ Ｉクローニング部位（下線を引いて示される）、ＨＳＡキメラリーダー配列の最後の３アミノ酸残基をコードするヌクレオチド、およびＩＬ２の成熟形態の最初の８アミノ酸残基をコードする２４ヌクレオチドを組み込む。ＩＬ２−２において、Ｃｌａ Ｉ部位（下線を引いて示される）およびそれに続くＤＮＡは、成熟ＨＳＡタンパク質（配列番号１０３８）の最初の１０個のアミノ酸をコードするＤＮＡの逆相補体であり、そして最後の２４個のヌクレオチドは、ＩＬ２の最後の８個のアミノ酸残基をコードするＤＮＡの逆相補体である（実施例２を参照のこと）。ＩＬ２−ＨＳＡのＰＣＲ増幅体を、これらのプライマーを使用して産生し、精製し、Ｓａｌ Ｉ制限酵素およびＣｌａ Ｉ制限酵素で消化し、そしてｐＳｃＣＨＳＡベクターのＸｈｏ Ｉ部位およびＣｌａ Ｉ部位にクローニングした。配列を確認した後に、このＩＬ２アルブミン融合タンパク質をコードする発現カセットを、Ｎｏｔ Ｉフラグメントとして、ｐＳＡＣ３５にサブクローニングした。
さらに、発現されたアルブミン融合タンパク質のＮ末端の、アミノ酸配列決定による分析は、予測されたＩＬ２配列の存在を確認し得る（以下を参照のこと）。
本発明のＩＬ２アルブミン融合タンパク質は、好ましくはＩＬ２の成熟形態（すなわち、Ａｌａ−２１〜Ｔｈｒ−１５３）のＮ末端またはＣ末端のいずれかに融合した、ＨＳＡの成熟形態（すなわち、Ａｓｐ−２５〜Ｌｅｕ−６０９）を含む。本発明の１つの実施形態において、本発明のＩＬ２アルブミン融合タンパク質は、発現のために使用される宿主の分泌経路における発生期の融合ポリペプチドを方向付けるシグナル配列を、さらに含む。さらに好ましい実施形態において、シグナル配列によってコードされるシグナルペプチドが除去され、そして成熟ＩＬ２アルブミン融合タンパク質が、培養培地中に直接分泌される。本発明のＩＬ２アルブミン融合タンパク質は、異種シグナル配列（ＭＡＦ、ＩＮＶ、Ｉｇ、Ｆｉｂｕｌｉｎ Ｂ、Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎ、インスリン様増殖因子結合タンパク質４、改変体ＨＳＡリーダー配列（キメラＨＳＡ／ＭＡＦリーダー配列が挙げられるが、これに限定されない）、または当該分野において公知である他の異種シグナル配列が挙げられるが、これらに限定されない）を含み得る。好ましい実施形態において、本発明のＩＬ２アルブミン融合タンパク質は、ネイティブＩＬ２シグナル配列を含む。さらに好ましい実施形態において、本発明のＩＬ２アルブミン融合タンパク質は、Ｎ末端メチオニン残基をさらに含む。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（フラグメントおよび／または改変体を含む）もまた、本発明に包含される。
（構築物ＩＤ １８１２の発現および精製）
（酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける発現）
構築物１８１２の、酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＢＸＰ１０へのトランスフェクションを、当該分野で公知の方法によって実施し（実施例３を参照のこと）、細胞を、増殖の７２時間後に、定常状態において収集した。構築物１８１２によりトランスフェクトされた酵母由来の上清を、３０００ｇで１０分間、細胞を浄化することによって収集した。
発現レベルを、抗ＨＳＡ血清（Ｋｅｎｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を一次抗体として用いて、免疫ブロット検出によって試験した。約８５ｋＤａの分子量のＩＬ２アルブミン融合タンパク質を得た。比産生率を、ＥＬＩＳＡによって決定し、ここで捕獲抗体は、ＵＳ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ＃Ａ１３２７−５３モノクローナル抗ＨＳＡ抗体またはモノクローナル抗ヒトＩＬ２抗体（例えば、Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ ＃ＡＨＣＯ４２２、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ ＃５５５０５１、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＃ＭＡＢ２０２、またはＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＃ＭＡＢ６０２由来）であり、そして検出抗体は、それぞれ、モノクローナル抗ヒトＩＬ２−ビオチン化抗体（例えば、Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ ＃ＡＨＣ０６９またはＥｎｄｏｇｅｎ／Ｐｉｅｒｃｅ ＃Ｍ−６００−Ｂ由来）、またはモノクローナル抗ＨＳＡ抗体（Ｂｉｏｔｒｅｎｄ ＃４Ｔ２４）であり、結合体は、西洋ワサビペルオキシダーゼ／ストレプトアビジン（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，＃ＳＡ−５００４）であり、そして基質は、ＫＰＬ ＴＭＢペルオキシダーゼ基質（ＫＰＬ ＃５０−７６−０１）であった。分析を、製造者のプロトコルに従って、および／または当該分野で公知の方法によって、実施した。
（酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞上清からの精製）
酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞における構築物ＩＤ ＃１８１２から発現されたＩＬ２アルブミン融合タンパク質を含む細胞上清を、Ｄｙａｘペプチドアフィニティーカラムによる小スケールで（実施例４を参照のこと）、または以下の５工程による大スケールのいずれかで精製した：ダイアフィルトレーション、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラムを使用する陰イオン交換クロマトグラフィー、Ｂｕｔｙｌ ６５０Ｓカラムを使用する疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラムを使用する陽イオン交換クロマトグラフィーまたはＢｌｕｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィー、およびＱ−セファロース高速カラムクロマトグラフィーを使用する高速クロマトグラフィー（実施例４を参照のこと）。ＩＬ２アルブミン融合タンパク質は、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラムから、１００〜２５０ｍＭのＮａＣｌで溶出し、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラムから、１５０〜２５０ｍＭのＮａＣｌで溶出し、そして、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅカラムから、５〜７．５ｍＳ／ｃｍで溶出した。Ｎ末端配列決定は、ＩＬ２の成熟形態のアミノの末端に対応する配列ＡＰＴＳＳＳＴを生じるはずである。
（ＩＬ２の活性は、インビトロＴおよびＮＫ細胞株増殖アッセイを使用してアッセイされ得る）
マウスＣＴＬＬ Ｔ細胞株を使用し、これは細胞の増殖および生存について、ＩＬ２に対して完全に依存性である。この細胞株は、高レベルの高親和性ＩＬ２レセプターを発現し、そして非常に低い用量のＩＬ２に対して極めて感受性である。
（方法）
ＣＴＬＬ−２細胞（マウスＩＬ２依存性Ｔ細胞株）を、５ｎｇ／ｍＬの組換えＩＬ２およびＢＭＥを含むＲＰＭＩ １０％ ＦＢＳ中で増殖させる。アッセイの前に、これらの細胞を、ＰＢＳで二回洗浄して、ＩＬ２を除去する。１×１０４細胞／ウェルを、９６ウェルプレートに、ＲＰＭＩ １０％ ＦＢＳの最終容量２００μｌで播種した。酵母および２９３Ｔの上清を、１０％、５％および１％の最終濃度で試験する。さらに、組換えヒトＩＬ２、「ｈｆＩＬ２」を、ネガティブコントロールの上清（ＨＳＡのみ）中で希釈して、組換えタンパク質の安定性に対する培地の影響を試験する。これらの細胞を、３７℃で２０時間培養し、次いで、１μＣｉの３Ｈ−チミジンで６時間パルスする。増殖を、チミジン取り込みによって測定し、各サンプルを三重で試験する。
（構築物１８１２によってコードされるＩＬ２アルブミン融合タンパク質の活性は、インビトロＴおよびＮＫ細胞株増殖アッセイを使用してアッセイされ得る）
（方法）
ＣＴＬＬ−２細胞（マウスＩＬ２依存性Ｔ細胞株）を、５ｎｇ／ｍＬの組換えＩＬ２およびＢＭＥを含むＲＰＭＩ １０％ ＦＢＳ中で増殖させた。アッセイの前に、これらの細胞を、ＰＢＳで二回洗浄して、ＩＬ２を除去した。１×１０４細胞／ウェルを、９６ウェルプレートに、ＲＰＭＩ １０％ ＦＢＳの最終容量２００μｌで播種した。酵母および２９３Ｔの上清を、１０％、５％および１％の最終濃度で試験した。さらに、組換えヒトＩＬ２、「ｒｈＩＬ２」を、ネガティブコントロールの上清（ＨＳＡのみ）中で希釈して、組換えタンパク質の安定性に対する培地の影響を試験した。これらの細胞を、３７℃で２０時間培養し、次いで、１μＣｉの３Ｈ−チミジンで６時間パルした。増殖を、チミジン取り込みによって測定し、各サンプルを三重で試験した。
（結果）
ＩＬ２アルブミン融合構築物ＩＤ ＃１８１２は、用量依存性の様式で、ＣＴＬＬ−２細胞の増殖を刺激した（図９を参照のこと）。
（構築物１８１２によってコードされるＩＬ２アルブミン融合タンパク質の活性は、インビボＢＡＬＢ／ｃモデルを使用してアッセイされ得る：治療に対するＲＥＮＣＡ腫瘍応答）
マウスモデルは、ＢＡＬＢ／ｃマウスのＲＥＮＣＡ腺癌を用いる。これらの研究で使用されるＲＥＮＣＡ腫瘍は自然に生じた。このＲＥＮＣＡ腫瘍は、元々、ＮＣＩ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）のＤｒ．Ｓａｒａｈ Ｓｔｅｗａｒｔによって単離された。ＲＥＮＣＡ腫瘍は、５０個程度の少ない生存細胞の移入後、次第に増殖し、そして、腎臓内移植物から局所的リンパ節、肺、肝臓および脾臓、ならびに他の器官へ自発的に転移する。ＲＥＮＣＡの免疫原性は、低〜中程度であることが決定されている。ＲＥＮＣＡ保有マウスは、通常、１×１０５個のＲＥＮＣＡ腫瘍細胞の腎臓内注射後３５〜４０日以内に、死亡する。同じ数の細胞のＲＥＮＣＡ腫瘍細胞を腹腔内投与されたマウスは、通常、３０〜５０日以内に死亡する。
（方法）
ＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜８週齢）（ｎ＝１０）の中腹部に、インビボ第４継代から得られた１０５個のＲＥＮＣＡ細胞を皮下注射した。プラセボ（ＰＢＳ）、ＨＳＡ、ｒｈＩＬ２（０．１２２ｍｇ／ｋｇ／ＱＤまたは２００，０００または３００，０００Ｕ／マウス）、またはＩＬ２アルブミン融合タンパク質（０．６１ｍｇ／ｋｇ）での毎日（ＱＤ）または一日おき（ＱＯＤ）の１０日後、マウスを、腫瘍播種後１４、１７、２１、２５、２８または３１日目における腫瘍サイズにおける変化についてモニタリングした。データを、ドット分析において表し、ここで各ドットは単一の動物を表す。各群における横線は、平均値を表す（図１０を参照のこと）。
（結果）
構築物ＩＤ ＃１８１２によってコードされるＩＬ２アルブミン融合タンパク質を、上記アッセイにおいて試験した。
毎日または一日おきの、構築物ＩＤ ＃１８１２から発現されたＩＬ２アルブミン融合タンパク質の投与は、腫瘍増殖に対して有意な影響を示し、増殖の遅延および／または腫瘍サイズの縮小を生じた。一日おきの投与は、より有利であった。なぜなら、耐性レベルがより大きかったからである（図１０を参照のこと）。播種の日から３１日目までに、ＩＬ２アルブミン融合産物を投与された１０匹のマウスのうち３匹のマウスは、腫瘍を有さず、２匹のみが、減少した腫瘍の徴候を示し、そして４匹のマウスが、収縮したと考えられる小さな腫瘍を有していた。１匹のマウスのみが、この処置に対して有利に応答しなかった。ＩＬ２アルブミン融合タンパク質での毎日の処置はまた、腫瘍の増殖の遅延または実際の収縮を生じた（実験終了日において、１０匹のうち２匹は、腫瘍を有さず、残りの７匹のマウスは小さな腫瘍を有し、そして２匹は、大きな腫瘍を有した）。０．６１ｍｇ／ｋｇのＩＬ２アルブミン融合タンパク質を投与されたすべての動物は、終了日に生存しており、一方、プラセボ（ＰＢＳ）を投与されたマウスのうちわずか４０％、およびＨＳＡを投与されたマウスの７０％が生存していた。生物学的効果は、２００，０００Ｕ／マウスまたは３００，０００Ｕ／マウスのいずれかの組換えヒトＩＬ２の毎日の投与よりもはるかに大きく示された。組換えヒトＩＬ２は、腫瘍増殖に対する乏しい効果しか有さなかった（ｒｈＩＬ２を投与されたすべてのマウスは、腫瘍を発生し、そして観察された唯一の効果は増殖遅延であった）。ｒｈＩＬ２（２００，０００または３００，０００Ｕ／ｍＬ）を投与された１０匹のマウスのうち、３匹は、３１日までに死亡した。試験された０．１２２ｍｇ／ｋｇ／日の低い投与量は、腫瘍増殖を阻害することも、腫瘍関連の死からマウスを助けることもなかった。ＩＬ２アルブミン融合タンパク質は、インビボＲＥＮＣＡ増殖を強力に阻害し、そしていくつかの場合において、腫瘍からの完全な回復を生じた。
（実施例１６：構築物ＩＤ２０３０、ＩＬ２−ＨＳＡ、産生）
構築物ＩＤ２０３０（ｐＳＡＣ３５：ｙｃｏＩＬ２．Ａ２１−Ｔ１５３．ＨＳＡ）は、ＩＬ２アルブミン融合タンパク質をコードするＤＮＡを含み、この融合タンパク質は、酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ発現ベクターｐＳＡＣ３５におけるＨＳＡの成熟形態のアミノ末端に融合された、ＨＳＡキメラリーダー配列（すなわち、ＨＳＡ−ｋｅｘ２シグナルペプチド）、ＩＬ２タンパク質の成熟形態（すなわち、Ａ２１−Ｔ１５３）を有する。
（ＩＬ２ ｃＤＮＡのクローニング）
ＩＬ２オープンリーディングフレーム「ＯＲＦ」ＤＮＡは、野生型ＩＬ２遺伝子にハイブリダイズしないように最適化されたコドンであった。コドン最適化ＩＬ２をコードするポリヌクレオチドを、６個の重複オリゴヌクレオチドによってＰＣＲ生成し、そしてＴＡベクターにクローニングした。このコドン最適化ＩＬ２をコードするポリヌクレオチドを、以下に記載されるプライマーＩＬ２−３およびＩＬ２−４を使用してこのクローンからＰＣＲ増幅し、Ｓａｌ Ｉ／Ｃｌａ Ｉで切断し、そしてＸｈｏ Ｉ／Ｃｌａ Ｉで切断したｐＳｃＣＨＳＡに連結した。構築物ＩＤ ＃２０３０は、ＨＳＡのキメラリーダー配列、およびＨＳＡの成熟形態のアミノ末端に融合されたＩＬ２の成熟形態を含むアルブミン融合タンパク質をコードする。
ＩＬ２の成熟形態をコードするコドン最適化ポリヌクレオチドのＰＣＲ増幅のために適切な２つのオリゴヌクレオチド（ＩＬ２−３およびＩＬ２−４）を合成した。
Figure 2014043448
 ＩＬ２−３は、Ｓａｌ Ｉクローニング部位（下線を引いて示される）、ＨＳＡキメラリーダー配列の最後の３アミノ酸残基をコードするヌクレオチド、およびＩＬ２の成熟形態の最初の８アミノ酸残基をコードする２４ヌクレオチドを含む。ＩＬ２−４において、Ｃｌａ Ｉ部位（下線を引いて示される）およびそれに続くＤＮＡは、成熟ＨＳＡタンパク質（配列番号１０３８）の最初の１０個のアミノ酸をコードするＤＮＡの逆相補体であり、そして最後の２４個のヌクレオチドは、ＩＬ２の最後の８個のアミノ酸残基をコードするＤＮＡの逆相補体である（実施例２を参照のこと）。ＰＣＲ増幅体を、３つのプライマーを使用して産生し、精製し、Ｓａｌ Ｉ制限酵素およびＣｌａ Ｉ制限酵素で消化し、そしてｐＳｃＣＨＳＡベクターのＸｈｏ Ｉ部位およびＣｌａ Ｉ部位にクローニングした。配列を確認した後に、このＮｏｔ Ｉフラグメント含有ＩＬ２ｂアルブミン融合タンパク質発現カセットを、Ｎｏｔ Ｉで切断されるｐＳＡＣ３５にサブクローニングした。
さらに、発現されたアルブミン融合タンパク質のＮ末端の、アミノ酸配列決定による分析は、予測されたＩＬ２配列の存在を確認し得る（以下を参照のこと）。
本発明のＩＬ２アルブミン融合タンパク質は、好ましくはＩＬ２の成熟形態（すなわち、Ａｌａ−２１〜Ｔｈｒ−１５３）のＮ末端またはＣ末端のいずれかに融合した、ＨＳＡの成熟形態（すなわち、Ａｓｐ−２５〜Ｌｅｕ−６０９）を含む。本発明の１つの実施形態において、本発明のＩＬ２アルブミン融合タンパク質は、発現のために使用される宿主の分泌経路における発生期の融合ポリペプチドを方向付けるシグナル配列を、さらに含む。さらに好ましい実施形態において、シグナル配列によってコードされるシグナルペプチドが除去され、そして成熟ＩＬ２アルブミン融合タンパク質が、培養培地中に直接分泌される。本発明のＩＬ２アルブミン融合タンパク質は、異種シグナル配列（ＭＡＦ、ＩＮＶ、Ｉｇ、Ｆｉｂｕｌｉｎ Ｂ、Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎ、インスリン様増殖因子結合タンパク質４、改変体ＨＳＡリーダー配列（キメラＨＳＡ／ＭＡＦリーダー配列が挙げられるが、これに限定されない）、または当該分野において公知である他の異種シグナル配列が挙げられるが、これらに限定されない）を含み得る。好ましい実施形態において、本発明のＩＬ２アルブミン融合タンパク質は、ネイティブＩＬ２シグナル配列を含む。さらに好ましい実施形態において、本発明のＩＬ２アルブミン融合タンパク質は、Ｎ末端メチオニン残基をさらに含む。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（フラグメントおよび／または改変体を含む）もまた、本発明に包含される。
（構築物２０３０の発現および精製）
（酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける発現）
酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＢＸＰ１０へのトランスフェクションを、当該分野で公知の方法によって（実施例３を参照のこと）、構築物ＩＤ １８１２について先に記載されたようにして（実施例１５を参照のこと）実施し得る。
（酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞上清からの精製）
酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞における構築物ＩＤ ＃２０３０から発現されたＩＬ２−ＨＳＡを含む細胞上清を、Ｄｙａｘペプチドアフィニティーカラムによる小スケールで（実施例４を参照のこと）、または以下の５工程による大スケールのいずれかで精製し得る：ダイアフィルトレーション、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラムを使用する陰イオン交換クロマトグラフィー、Ｂｕｔｙｌ ６５０Ｓカラムを使用する疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラムを使用する陽イオン交換クロマトグラフィーまたはＢｌｕｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィー、およびＱ−セファロース高速カラムクロマトグラフィーを使用する高速クロマトグラフィー（実施例４および実施例１５を参照のこと）。Ｎ末端配列決定は、ＩＬ２の成熟形態のアミノ末端に対応する配列ＡＰＴＳＳＳＴ（配列番号２１４２）を生じるはずである。
（構築物２０３０によってコードされるＩＬ２アルブミン融合タンパク質の活性は、インビトロＴおよびＮＫ細胞株増殖アッセイを使用してアッセイされ得る）
構築物ＩＤ２０３０の活性は、実施例１５のようなインビトロＴおよびＮＫ細胞株増殖アッセイを使用してアッセイされ得る。
（構築物２０３０によってコードされるＩＬ２アルブミン融合タンパク質の活性は、インビボＢＡＬＢ／ｃモデルを使用してアッセイされ得る：治療に対するＲＥＮＣＡ腫瘍応答）
構築物２０３０によってコードされるＩＬ２アルブミン融合タンパク質の活性は、実施例１５に記載されるようなインビボＢＡＬＢ／ｃモデルを使用してアッセイされ得、ここで治療に対するＲＥＮＣＡ腫瘍応答がモニタリングされる。
（実施例１７：構築物ＩＤ２０３１、ＨＳＡ−ＩＬ２、産生）
構築物ＩＤ２０３１（ｐＳＡＣ３５：ＨＳＡ．ｙｃｏＩＬ２．Ａ２１−Ｔ１５３）は、ＩＬ２アルブミン融合タンパク質をコードするＤＮＡを含み、この融合タンパク質は、酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ発現ベクターｐＳＡＣ３５におけるＩＬ２の成熟形態（Ａ２１−Ｔ１５３）のアミノ末端に融合された、ＨＳＡキメラリーダー配列（すなわち、ＨＳＡ−ｋｅｘ２シグナルペプチド）を含むＨＳＡ全長配列を有する。
（ＩＬ２ ｃＤＮＡのクローニング）
ＩＬ２オープンリーディングフレーム「ＯＲＦ」ＤＮＡは、野生型ＩＬ２遺伝子にハイブリダイズしないように最適化されたコドンであった。コドン最適化ＩＬ２をコードするポリヌクレオチドを、６個の重複オリゴヌクレオチドによってＰＣＲ生成し、そしてＴＡベクターにクローニングした。このコドン最適化ＩＬ２をコードするポリヌクレオチドを、以下に記載されるプライマーＩＬ２−５およびＩＬ２−６を使用してこのコドンからＰＣＲ増幅し、Ｂｓｕ ３６Ｉ／Ｐｍｅ Ｉで切断し、そしてＢｓｕ ３６Ｉ／Ｐｍｅ Ｉで切断したｐＳｃＮＨＳＡに連結した。構築物ＩＤ ＃２０３１は、ＨＳＡのキメラリーダー配列および成熟形態、ならびにＩＬ２の成熟形態を含むアルブミン融合タンパク質をコードする。
ＩＬ２の成熟形態をコードするポリヌクレオチドの最適化されたコドンのＰＣＲ増幅のために適切な２つのオリゴヌクレオチド（ＩＬ２−５およびＩＬ２−６）を合成した。
Figure 2014043448
 ＩＬ２−５は、Ｂｓｕ ３６Ｉクローニング部位（下線を引いて示される）、ＨＳＡの成熟形態の最後の４アミノ酸残基をコードするヌクレオチド、およびＩＬ２の成熟形態の最初の８アミノ酸残基をコードする２４ヌクレオチドを含む。ＩＬ２−６において、Ｐｍｅ Ｉ部位は、下線を引いて示され（配列番号８３４）、そして最後の２４ヌクレオチドは、ＩＬ２の最後の８アミノ酸残基をコードするＤＮＡの逆相補体である（実施例２を参照のこと）。ＰＣＲ増幅体を、これらのプライマーを使用して産生し、精製し、Ｂｓｕ ３６Ｉ制限酵素およびＰｍｅ Ｉ制限酵素で消化し、そしてｐＳｃＮＨＳＡベクターのＢｓｕ ３６Ｉ部位およびＰｍｅ Ｉ部位にクローニングした。配列を確認した後に、このＩＬ２アルブミン融合タンパク質発現カセットを含むＮｏｔ Ｉフラグメントを、Ｎｏｔ Ｉで切断したｐＳＡＣ３５にサブクローニングした。
さらに、発現されたアルブミン融合タンパク質のＮ末端の、アミノ酸配列決定による分析は、予測されたＨＳＡ配列の存在を確認し得る（以下を参照のこと）。
本発明のＩＬ２アルブミン融合タンパク質は、好ましくはＩＬ２の成熟形態（すなわち、Ａｌａ−２１〜Ｔｈｒ−１５３）のＮ末端またはＣ末端のいずれかに融合した、ＨＳＡの成熟形態（すなわち、Ａｓｐ−２５〜Ｌｅｕ−６０９）を含む。本発明の１つの実施形態において、本発明のＩＬ２アルブミン融合タンパク質は、発現のために使用される宿主の分泌経路における発生期の融合ポリペプチドを方向付けるシグナル配列を、さらに含む。さらに好ましい実施形態において、シグナル配列によってコードされるシグナルペプチドが除去され、そして成熟ＩＬ２アルブミン融合タンパク質が、培養培地中に直接分泌される。本発明のＩＬ２アルブミン融合タンパク質は、異種シグナル配列（ＭＡＦ、ＩＮＶ、Ｉｇ、Ｆｉｂｕｌｉｎ Ｂ、Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎ、インスリン様増殖因子結合タンパク質４、改変体ＨＳＡリーダー配列（キメラＨＳＡ／ＭＡＦリーダー配列が挙げられるが、これに限定されない）、または当該分野において公知である他の異種シグナル配列が挙げられるが、これらに限定されない）を含み得る。好ましい実施形態において、本発明のＩＬ２アルブミン融合タンパク質は、ネイティブＩＬ２シグナル配列を含む。さらに好ましい実施形態において、本発明のＩＬ２アルブミン融合タンパク質は、Ｎ末端メチオニン残基をさらに含む。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（フラグメントおよび／または改変体を含む）もまた、本発明に包含される。
（構築物ＩＤ ２０３１の発現および精製）
（酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける発現）
酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＢＸＰ１０へのトランスフェクションを、当該分野で公知の方法によって（実施例３を参照のこと）、構築物ＩＤ １８１２について先に記載されたようにして（実施例１５を参照のこと）実施し得る。
（酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞上清からの精製）
酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞において構築物ＩＤ ＃２０３１から発現されたＨＳＡ−ＩＬ２を含む細胞上清を、Ｄｙａｘペプチドアフィニティーカラムによる小スケールで（実施例４を参照のこと）、または以下の５工程による大スケールのいずれかで精製し得る：ダイアフィルトレーション、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラムを使用する陰イオン交換クロマトグラフィー、Ｂｕｔｙｌ ６５０Ｓカラムを使用する疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラムを使用する陽イオン交換クロマトグラフィーまたはＢｌｕｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィー、およびＱ−セファロース高速カラムクロマトグラフィーを使用する高速クロマトグラフィー（実施例４および実施例１５を参照のこと）。Ｎ末端配列決定は、ＨＳＡの成熟形態のアミノの末端に対応する配列ＤＡＨＫＳ（配列番号２１４３）を生じるはずである。
（構築物２０３１によってコードされるＩＬ２アルブミン融合タンパク質の活性は、インビトロＴおよびＮＫ細胞株増殖アッセイを使用してアッセイされ得る）
構築物ＩＤ ２０３１の活性は、実施例１５に記載されるようにして、インビトロＴおよびＮＫ細胞株増殖アッセイを使用してアッセイされ得る。
（構築物２０３１によってコードされるＩＬ２アルブミン融合タンパク質の活性は、インビボＢＡＬＢ／ｃモデルを使用してアッセイされ得る：治療に対するＲＥＮＣＡ腫瘍応答）
構築物２０３１によってコードされるＩＬ２アルブミン融合タンパク質の活性は、実施例１５に記載されるようなインビボＢＡＬＢ／ｃモデルを使用してアッセイされ得、ここで治療に対するＲＥＮＣＡ腫瘍応答がモニタリングされる。
（実施例１８：ＩＬ２アルブミン融合タンパク質についての適応症）
ＩＬ２アルブミン融合タンパク質（構築物１８１２、２０３０および２０３１によってコードされるものが挙げられるが、これらに限定されない）の適応症としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：固形腫瘍、転移性腎細胞癌腫、転移性黒色腫、悪性黒色腫、腎細胞癌腫、ＨＩＶ感染の処置（ＡＩＤＳ）、炎症性腸障害、カポージ肉腫、白血病、多発性硬化症、慢性関節リウマチ、移植拒絶、Ｉ型糖尿病、肺癌、急性骨髄性白血病、Ｃ型肝炎、非ホジキンリンパ腫、および卵巣癌。
（実施例１９：構築物ＩＤ１６４２、ＧＣＳＦ−ＨＳＡ、産生）
構築物ＩＤ１６４２（ｐＳＡＣ３５：ＧＣＳＦ．Ｔ３１−Ｐ２０４．ＨＳＡ）は、ＧＣＳＦアルブミン融合タンパク質をコードするＤＮＡを含み、この融合タンパク質は、酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ発現ベクターｐＳＡＣ３５におけるＨＳＡの成熟形態のアミノ末端に融合された、ＨＳＡキメラリーダー配列（すなわち、ＨＳＡ−ｋｅｘ２シグナルペプチド）、顆粒球コロニー刺激因子、「Ｇ−ＣＳＦ」タンパク質（すなわち、Ｔ３１−Ｐ２０４）の「短い形態」の成熟形態を有する。
（ＧＣＳＦ ｃＤＮＡのクローニング）
ＧＣＳＦをコードするポリヌクレオチドを、以下に記載されるプライマーＧＣＳＦ−１およびＧＣＳＦ−２を使用してＰＣＲ増幅した。増幅体を、Ｓａｌ Ｉ／Ｃｌａ Ｉで切断し、Ｘｈｏ Ｉ／Ｃｌａ Ｉで切断されたｐＳｃＣＨＳＡに連結した。構築物ＩＤ ＃１６４２は、ＨＳＡのキメラリーダー配列、ＧＣＳＦの成熟形態、続いて成熟ＨＳＡタンパク質を含む、アルブミン融合タンパク質をコードするＤＮＡを含む。
ＧＣＳＦの成熟形態をコードするポリヌクレオチドのＰＣＲ増幅のために適切な２つのオリゴヌクレオチド（ＧＣＳＦ−１およびＧＣＳＦ−２）を合成した：
Figure 2014043448
 ＧＣＳＦ−１は、Ｓａｌ Ｉクローニング部位（下線を引いて示される）、ＨＳＡキメラリーダー配列の最後の３アミノ酸残基をコードするヌクレオチド、およびＧＣＳＦの成熟形態の最初の６アミノ酸残基をコードする２０ヌクレオチドを含む。ＧＣＳＦ−２において、Ｃｌａ Ｉ部位（下線を引いて示される）およびそれに続くＤＮＡは、成熟ＨＳＡタンパク質（配列番号１０３８）の最初の１０個のアミノ酸をコードするＤＮＡの逆相補体であり、そして最後の２１個のヌクレオチドは、ＧＣＳＦの最後の７個のアミノ酸残基をコードするＤＮＡの逆相補体である。ＰＣＲ増幅体（ａｍｐｌｉｍｅｒ）を、これらのプライマーを使用して産生し、精製し、Ｓａｌ Ｉ制限酵素およびＣｌａ Ｉ制限酵素で消化し、そしてｐＳｃＣＨＳＡベクターのＸｈｏ Ｉ部位およびＣｌａ Ｉ部位にクローニングした。配列を確認した後に、このＧＣＳＦアルブミン融合発現カセットを含むＮｏｔ Ｉフラグメントを、Ｎｏｔ Ｉで切断されたｐＳＡＣ３５にサブクローニングした。
さらに、発現されたアルブミン融合タンパク質のＮ末端の、アミノ酸配列決定による分析は、予測されたＧＣＳＦ配列の存在を確認した（以下を参照のこと）。
本発明のＧＣＳＦアルブミン融合タンパク質は、好ましくはＧＣＳＦの成熟形態（すなわち、Ｔｈｒ−３１〜Ｐｒｏ−２０４）のＮ末端またはＣ末端のいずれかに融合した、ＨＳＡの成熟形態（すなわち、Ａｓｐ−２５〜Ｌｅｕ−６０９）を含む。本発明の１つの実施形態において、本発明のＧＣＳＦアルブミン融合タンパク質は、発現のために使用される宿主の分泌経路における発生期の融合ポリペプチドを方向付けるシグナル配列を、さらに含む。さらに好ましい実施形態において、シグナル配列によってコードされるシグナルペプチドが除去され、そして成熟ＧＣＳＦアルブミン融合タンパク質が、培養培地中に直接分泌される。本発明のＧＣＳＦアルブミン融合タンパク質は、異種シグナル配列（ＭＡＦ、ＩＮＶ、Ｉｇ、Ｆｉｂｕｌｉｎ Ｂ、Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎ、インスリン様増殖因子結合タンパク質４、改変体ＨＳＡリーダー配列（キメラＨＳＡ／ＭＡＦリーダー配列が挙げられるが、これに限定されない）、または当該分野において公知である他の異種シグナル配列が挙げられるが、これらに限定されない）を含み得る。好ましい実施形態において、本発明のＧＣＳＦアルブミン融合タンパク質は、ネイティブＧＣＳＦシグナル配列を含む。さらに好ましい実施形態において、本発明のＧＣＳＦアルブミン融合タンパク質は、Ｎ末端メチオニン残基をさらに含む。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（フラグメントおよび／または改変体を含む）もまた、本発明に包含される。
（構築物ＩＤ １６４２の発現および精製）
（酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける発現）
構築物１６４２の、酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株Ｄ８８、ＢＸＰ１０およびＤＸＹ１−ａＹＡＰ３変異体への形質転換を、当該分野で公知の方法によって実施した（実施例３を参照のこと）。この形質転換された酵母が、融合構築物によってコードされるタンパク質を産生する場合、予備的な「ハロアッセイ（ｈａｌｏ ａｓｓａｙ）」を実施した。ＨＳＡ融合タンパク質の、抗ＨＳＡ抗体を含む寒天培地への分泌は、不溶性「沈降素」のリングまたはハロの形成を生じる。このハロのサイズは、産生されるＨＳＡタンパク質の量に比例する。ＬＥＵ２＋原栄養菌を、デキストロースを含有する合成完全ロイシンドロップアウト培地（「ＳＣＤ−Ｌｅｕ」）上で選択した。選択されたコロニーおよびポジティブコントロールを、抗ＨＳＡ抗体を含有するＢＭＭＤプレートにグリッド（ｇｒｉｄ）した。増殖後、これらのプレートを、４℃でインキュベートして、沈降素リングを形成させた。「ハロアッセイ」に基づいて、構築物１６４２の形質転換からのコロニーは、タンパク質を産生した。分泌の程度を確立するために、形質転換された細胞を、懸濁液中で４８時間増殖させた後に、定常期で収集した。３０００ｇで１０分間細胞を除去することによって、上清を収集した。発現レベルを、抗ＨＳＡ血清（Ｋｅｎｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、またはアルブミン融合タンパク質の治療タンパク質部分（すなわちＧＣＳＦ）に対する抗体を用いる免疫ブロット検出によって試験した。約８８ｋＤａの分子量のＧＣＳＦアルブミン融合タンパク質を得た。精製のための作業可能な量を得るために、酵母形質転換体を、１ＬのＢＭＭ培地中、１５０ｒｐｍで２９．５℃で播種した。この培養物を、遠心分離し、０．４５ ｍフィルターに通した。比産生率を、ＥＬＩＳＡによって決定し、ここで、例えば、捕獲抗体は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｃｌｏｎｅ ３３１６．１１１モノクローナルマウス抗ＧＣＳＦであり、検出抗体は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＢＡＦ２１４（すなわち、Ｃｌｏｎｅ ＡＣＮ０３００８１）ビオチン化ヤギ抗ヒトＧＣＳＦ抗体であり、結合体は、西洋ワサビペルオキシダーゼ／ストレプトアビジン（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，＃ＳＡ−５００４）であり、そして基質は、ＫＰＬ ＴＭＢ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ ＃５０−７６−０１）であり、ここで、この分析は、製造者のプロトコルに従って、および／または当該分野で公知の方法によって実施される。
（酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞上清からの精製）
アルブミン融合タンパク質の一般的な精製手順は、実施例４に記載されている。ＧＣＳＦアルブミン融合タンパク質の精製は、以下に詳細に記載される。別の精製スキームは、実施例２０に記載される。
（工程１：フェニル高速フロークロマトグラフィー（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ））
構築物１６４２によってコードされるＧＣＳＦ−ＨＳＡを含有する酵母培養物上清（３Ｌ）を、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．２）中１Ｍの硫酸アンモニウムを含むフェニル高速フローカラムに充填した。このカラムを、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．２）中１Ｍの硫酸アンモニウム、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．２）中０．２Ｍの硫酸アンモニウム、次いで緩衝液で洗浄した。ＧＣＳＦ−ＨＳＡ融合タンパク質を、水（Ｗａｔｅｒ Ｆｏｒ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ ｗａｔｅｒ ＷＦＩ）で溶出した。
（工程２：ＳＰ高速フロークロマトグラフィー（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ））
工程１の溶出物を、等量の溶液（１０．３ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４および４．８５ｍＭのクエン酸から構成される、ｐＨ５．０）と混合した。この混合物を、ＳＰ高速フローカラムに充填し、そして溶液（１０．３ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４および４．８５ｍＭのクエン酸中０．５ＭのＮａＣｌからなる、ｐＨ５．０）で溶出した。次いで、このカラムを、溶液（１０．３ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４および４．８５ｍＭのクエン酸中１ＭのＮａＣｌからなる、ｐＨ５．０）でストリップした。
（工程３：メチルＨＩＣクロマトグラフィー（ＢｉｏＲａｄ））
工程２の溶出物を、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．２）中１Ｍの硫酸アンモニウム（１４３ｍＳ）の最終濃度まで滴定し、メチルＨＩＣカラムに充填した。このカラムを、ベースラインまで洗浄し、次いで５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．２）中０．６Ｍの硫酸アンモニウムで洗浄した。０．６Ｍの硫酸アンモニウムから０Ｍの硫酸アンモニウムの勾配を開始した。最後に、このカラムを、ＷＦＩおよび０．５ＭのＮａＯＨでストリップした。サンプル中の多量の不純物は、より低い硫酸アンモニウム濃度で溶出し、それにより高純度のＧＣＳＦ−ＨＳＡ融合物を与えた。
（工程４：ＣＭ高速フロークロマトグラフィー（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ））
工程３の溶出物を、ＷＦＩで５ｍＳ（ｐＨ５．５）まで希釈し、そしてＣＭカラムに３００ｃｍ／時間で充填した。このカラムを、１１ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４および４ｍＭのクエン酸中０．５ＭのＮａＣｌ（ｐＨ５．５）で溶出した。このカラムを、１１ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４および４ｍＭのクエン酸中１ＭのＮａＣｌ（ｐＨ５．５）でストリップした。
（工程５：限外濾過／ダイアフィルトレーション（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）
精製された産物を、リン酸緩衝化生理食塩水（「ＰＢＳ」）（ｐＨ７．２）中に限外濾過およびダイアフィルトレーションした。
構築物１６４２によってコードされる精製されたＧＣＳＦアルブミン融合タンパク質を、ＳＤＳ／ＰＡＧＥによって、純度について分析した。これは、＞９５％純粋であった。このタンパク質を配列決定して確認し、またこのタンパク質は、「ＴＰＬＧＰ」（配列番号２１４４）のＮ末端配列を用いるＮ末端配列分析によって、９０％の純度を示した。
（ＧＣＳＦの活性は、インビトロＮＦＳ−６０細胞増殖アッセイによってアッセイされ得る）
（方法）
ＧＣＳＦ活性を評価するために、ＮＳＦ−６０細胞、ＮＦＳマウスのＰｒｉｍａｒｙ Ｌａｋｅ Ｃａｓｃｉｔｕｓ野生エコトロピックウイルス誘導性腫瘍由来の骨髄性因子依存性細胞株を用いる。
（細胞の増殖および調製）
細胞を、最初に、Ｔ−７５ｃｍ２のフラスコ中に、増殖培地（１０％ ウシ胎児血清、「ＦＢＳ」、１×ペニシリン／ストレプトマイシン、１×Ｌ−グルタミン（最終濃度２ｍＭ）、および組換えマウスインターロイキン−３（ＩＬ３）（３０ｎｇ／ｍＬ）を含む、ＲＰＭＩ １６４０）中約１．５×１０４細胞／ｍＬで播種する。細胞を、２日おきに、１：１０〜１：２０のどこかでスプリットし、そして新鮮な培地中に再播種する。
（ＮＦＳ−６０バイオアッセイ）
ＮＦＳ−６０アッセイを、Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎら（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎら、１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３，ｐｐ５０１０−４）に記載されるようにして実施する。簡単に述べると、アッセイを実施する前日に、細胞を、ＩＬ３を含む新鮮なアッセイ増殖培地中に、１．０×１０５まで再播種する。翌日、細胞を、５０ｍＬのコニカルチューブに移し、低速で遠心分離し、そして血清も増殖因子も含まないプレーンＲＰＭＩで２回洗浄する。ペレットを、２５ｍＬに再懸濁し、続いて細胞を計数する。細胞を、もう一度遠心分離し、そして作業濃度であるが、ＩＬ３を含まない増殖培地（上記）中に再懸濁する。細胞を、９６ウェル丸底ＴＣ処理プレートに、１×１０５細胞／ウェルでプレーティングする。漸増する用量のＧＣＳＦを各ウェルに、最終容量０．１ｍＬまで添加する。アッセイを、三重で行う。細胞を、２４時間培養し、細胞増殖のレベルを決定する。３Ｈ−チミジン（５μＣｉ／ｍＬ）を、実験の終了の４時間前に添加する。次いで、細胞を、ガラス繊維フィルター上に、細胞収集器を使用して収集し、そして３Ｈ−チミジンで標識されたＤＮＡの量を、ＴＯＰ−Ｃｏｕｎｔを使用して計数する。
（構築物ＩＤ ＃１６４２によってコードされるＧＣＳＦアルブミン融合の活性は、インビトロＮＦＳ−６０細胞増殖アッセイを使用してアッセイされ得る）
（方法）
構築物１６４２によってコードされるＧＳＣＦアルブミン融合タンパク質を、上記のインビトロＮＦＳ−６０細胞増殖バイオアッセイで試験した。
（細胞の増殖および調製）
細胞を、上記のようにして調製した。
（ＮＦＳ−６０バイオアッセイ）
アッセイを実施する前日に、細胞を、ＩＬ３を含む新鮮なアッセイ増殖培地中に、１．０×１０５まで再播種した。翌日、細胞を、５０ｍＬのコニカルチューブに移し、低速で遠心分離し、そして血清も増殖因子も含まないプレーンＲＰＭＩで２回洗浄した。ペレットを、２５ｍＬに再懸濁し、続いて細胞を計数した。細胞を、もう一度遠心分離し、そして作業濃度であるが、ＩＬ３を含まない増殖培地（上記）中に再懸濁した。細胞を、９６ウェル丸底ＴＣ処理プレートに、１×１０５細胞／ウェルでプレーティングした。漸増する用量のＨＳＡ、組換えヒトＧＣＳＦ（ｒｈＧＣＳＦ）または酵母上清から部分的に精製されたＧＣＳＦアルブミン融合タンパク質のいずれかを、個々のウェルに、最終容量０．１ｍＬまで添加する。アッセイを、三重で行った。細胞を、２４時間培養し、細胞増殖のレベルを決定した。３Ｈ−チミジン（５μＣｉ／ｍＬ）を、実験の終了の４時間前に添加した。次いで、細胞を、ガラス繊維フィルター上に、細胞収集器を使用して収集し、そして３Ｈ−チミジンで標識されたＤＮＡを、ＴＯＰ−Ｃｏｕｎｔを使用して計数した。
（結果）
構築物１６４２は、ＮＦＳ−６０細胞増殖活性を、用量依存性の様式で引き起こす能力を実証し、一方で、ＨＳＡ単独を発現する酵母由来のコントロール上清は、いずれの活性をも生じなかった（図１１を参照のこと）。
（ＧＣＳＦの活性は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを使用してインビボでアッセイされ得る） （固定剤としてのＧＣＳＦ）
Ｇ−ＣＳＦは、顆粒球を周囲に固定し得、かつマウスに投与された場合、全白血球（ＷＢＣ）数を増加させ得る。組換えヒトＧＣＳＦ（ｒｈＧＣＳＦ）は、組換えマウスＧＣＳＦ（ｒｍＧＣＳＦ）と交差反応する。
（方法）
注射を開始する前に、マウスの耳にタグを付ける。マウスに、７日間連続して、１日二回、５ｇ（ｎ＝５）または１０ｇ（ｎ＝５）のいずれかで、ｒｈＧＣＳＦ（Ｎｅｕｐｏｇｅｎ，ＡＭＥＮ）を腹腔内注射する。コントロールマウス（ｎ＝３）には、Ｈｅｐｅｓ緩衝化生理食塩水（ＨＢＳＳ）を投与する。最後のｒｈＧＣＳＦ投与の２４時間後、末梢血を尾から採取し、そして顆粒球数および全ＷＢＣ数について分析する。
（結果）
両方の用量のｒｈＧＣＳＦは、顆粒球の頻度および全数の両方、ならびに全ＷＢＣ数を効率的に増加させる（図１２を参照のこと）。この効果は、最終のｒｈＧＣＳＦ腹腔内投与の２４時間後に明白である。この効果は、一過性であり、顆粒球の数は、５日目までに通常の値に戻る。
（構築物ＩＤ＃１６４２によってコードされるＧＣＳＦアルブミン融合タンパク質の活性は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを使用してインビボでアッセイされ得る：固定剤としてのＧＣＳＦ−ＨＳＡ）
（方法）
構築物１６４２によってコードされるＧＣＳＦアルブミン融合タンパク質は、上記の手順に従ってアッセイされ得る。簡単に述べると、注射を開始する前に、マウスの耳にタグを付ける。マウスに、７日間連続して、１日二回、５ｇ（ｎ＝５）または１０ｇ（ｎ＝５）のいずれかで、ｒｈＧＣＳＦ（コントロールとして）、またはＧＣＳＦアルブミン融合タンパク質を腹腔内注射する。さらなるコントロールマウス（ｎ＝３）には、Ｈｅｐｅｓ緩衝化生理食塩水（「ＨＢＳＳ」）を投与する。最後のＧＣＳＦ投与の２４時間後、末梢血を尾から採取し、そして顆粒球数および全ＷＢＣ数について分析し得る。
（実施例２０：構築物ＩＤ１６４３、ＨＳＡ−ＧＣＳＦ、産生）
構築物ＩＤ１６４３（ｐＳＡＣ３５：ＨＳＡ．ＧＣＳＦ．Ｔ３１−Ｐ２０４）は、ＧＣＳＦアルブミン融合タンパク質をコードするＤＮＡを含み、この融合タンパク質は、酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ発現ベクターｐＳＡＣ３５におけるＧＣＳＦタンパク質の成熟形態（すなわち、Ａ２１−Ｔ１５３）のアミノ末端に融合された、ＨＳＡキメラリーダー配列（すなわち、ＨＳＡ−ｋｅｘ２シグナルペプチド）を含む全長ＨＳＡタンパク質を有する。
（ＧＣＳＦ ｃＤＮＡのクローニング）
ＧＣＳＦをコードするポリヌクレオチドを、以下に記載されるプライマーＧＣＳＦ−３およびＧＣＳＦ−４を使用してＰＣＲ増幅した。増幅体を、Ｂｓｕ ３６Ｉ／Ａｓｃ Ｉで切断し、Ｂｓｕ ３６Ｉ／Ａｓｃ Ｉで切断されたｐＳｃＮＨＳＡに連結した。構築物ＩＤ ＃１６４３は、ＨＳＡのキメラリーダー配列、およびＨＳＡの成熟形態、およびＧＣＳＦの成熟形態を含む、アルブミン融合タンパク質をコードする。
ＧＣＳＦの成熟形態をコードするポリヌクレオチドのＰＣＲ増幅のために適切な２つのオリゴヌクレオチド（ＧＣＳＦ−３およびＧＣＳＦ−４）を合成した：
Figure 2014043448
 ＧＣＳＦ−３は、Ｂｓｕ ３６Ｉクローニング部位（下線を引いて示される）、およびＨＳＡの成熟形態の最後の４アミノ酸残基をコードするヌクレオチド、ならびにＧＣＳＦの成熟形態の最初の６アミノ酸残基をコードする２０ヌクレオチドを含む。ＧＣＳＦ−４において、Ａｓｃ Ｉ部位は、下線を引いて示され、そして最後の２４ヌクレオチドは、ＧＣＳＦの最後の８アミノ酸残基をコードするＤＮＡの逆相補体である。ＨＳＡ−ＧＣＳＦのＰＣＲ増幅体を、これらのプライマーを使用して産生し、精製し、Ｂｓｕ ３６Ｉ制限酵素およびＡｓｃ Ｉ制限酵素で消化し、そしてｐＳｃＮＨＳＡベクターのＢｓｕ ３６Ｉ部位およびＡｓｃ Ｉ部位にクローニングした。配列を確認した後に、このＧＣＳＦアルブミン融合タンパク質をコードする発現カセットを、Ｎｏｔ ＩフラグメントとしてｐＳＡＣ３５にサブクローニングした。
さらに、発現されたアルブミン融合タンパク質のＮ末端の、アミノ酸配列決定による分析は、予測されたＨＳＡ配列の存在を確認した（以下を参照のこと）。
本発明のＧＣＳＦアルブミン融合タンパク質は、好ましくは、ＧＣＳＦの成熟形態（すなわち、Ｔｈｒ−３１〜Ｐｒｏ−２０４）のＮ末端またはＣ末端のいずれかに融合した、ＨＳＡの成熟形態（すなわち、Ａｓｐ−２５〜Ｌｅｕ６０９）を含む。本発明の１つの実施形態において、本発明のＧＣＳＦアルブミン融合タンパク質は、発現のために使用される宿主の分泌経路における発生期の融合ポリペプチドを方向付けるシグナル配列を、さらに含む。さらに好ましい実施形態において、シグナル配列によってコードされるシグナルペプチドが除去され、そして成熟ＧＣＳＦアルブミン融合タンパク質が、培養培地中に直接分泌される。本発明のＧＣＳＦアルブミン融合タンパク質は、異種シグナル配列（ＭＡＦ、ＩＮＶ、Ｉｇ、Ｆｉｂｕｌｉｎ Ｂ、Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎ、インスリン様増殖因子結合タンパク質４、改変体ＨＳＡリーダー配列（キメラＨＳＡ／ＭＡＦリーダー配列が挙げられるが、これに限定されない）、または当該分野において公知である他の異種シグナル配列が挙げられるが、これらに限定されない）を含み得る。好ましい実施形態において、本発明のＧＣＳＦアルブミン融合タンパク質は、ネイティブＧＣＳＦシグナル配列を含む。さらに好ましい実施形態において、本発明のＧＣＳＦアルブミン融合タンパク質は、Ｎ末端メチオニン残基をさらに含む。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（フラグメントおよび／または改変体を含む）もまた、本発明に包含される。
（構築物ＩＤ１６４３の発現および精製）
（酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける発現）
構築物１６４３の、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ内への形質転換を、当該分野において公知の方法によって（実施例３を参照のこと）、そして構築物ＩＤ１６４２について以前に記載されたように（実施例１９を参照のこと）実施した。
（酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞上清からの精製）
アルブミン融合タンパク質の精製のための一般的な手順は、実施例４に記載されている。酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞において、構築物ＩＤ番号１６４３から発現されるＧＣＳＦアルブミン融合タンパク質を含む細胞上清を、以下の方法に従って精製した。別の精製スキームは、実施例１９に記載されている。
（工程１：フェニルセファロース迅速フロー（ｈｓ）、ｐＨ７．２）
醗酵上清（３．５Ｌ）を、硫酸アンモニウムで１３９ｍＳおよびｐＨ７．２に調整し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．２）中１Ｍの最終濃度にした。フェニルセファロースカラムを、３００ｃｍ／ｈｒの流量で充填した。このカラムを５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）で洗浄した。一連の低塩溶出を実施して、夾雑タンパク質を除去し、その後、ＷＦＩ溶出によって、標的タンパク質を溶出した。このカラムのＮａＯＨ除去は、かなりの部分の標的タンパク質が、先の処理によって除去されないことを明らかにした。
（工程２：Ｍｉｍｅｔｉｃ Ｂｌｕｅ、ｐＨ６．５）
溶出した標的タンパク質を、２０ｍＭクエン酸リン酸緩衝液（ＣＰＢ）（ｐＨ６．５）でダイアフィルター（ｄｉａｆｉｌｔｅｒ）し、次いで、予め２０ｍＭのＣＰＢ（ｐＨ６．５）緩衝液で平衡化したＭｉｍｅｔｉｃ Ｂｌｕｅカラムに充填した。このカラムを、１０カラム体積で、平衡化緩衝液で洗浄した。次いで、標的タンパク質の大部分を、０．２Ｍ ＮａＣｌ洗浄で溶出した。より高い塩濃度の溶出溶液（１Ｍおよび２ＭのＮａＣｌ）は、何らかの標的タンパク質を明らかにした。しかし、ＨＰＬＣ−ＳＥＣをこれらの画分に対して実施した場合、大部分の標的タンパク質は、凝集物として観察された。この精製工程は、８５％より高純度の標的タンパク質を生じた。
（工程３：Ｑ ＨＰ、ｐＨ６．５）
標的タンパク質を２０ｍＭのＣＰＢ（ｐＨ６．５）（５倍）で希釈して、５ｍＳ未満の導電率にし、そしてＱ ＨＰ樹脂に充填した。一連の溶出（１００ｍＭ、２００ｍＭ、５００ｍＭ、および１ＭのＮａＣｌ）を実施した。標的タンパク質は、１００ｍＭのＮａＣｌで溶出した。
（工程４：ＳＰ ＦＦ、ｐＨ５．５）
標的タンパク質を、２０ｍＭのＣＰＢ（ｐＨ５．０）で希釈し、そしてｐＨを５．０に調整した。標的タンパク質を、ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦカラムに充填した。このカラムを、５カラム体積の平衡化緩衝液で洗浄した。４５ｋＤａの夾雑タンパク質（ＨＳＡのタンパク質分解したフラグメント）は、この樹脂に結合せず、そして充填フロースルー（ｆｌｏｗ ｔｈｒｕ）（ＬＦＴ）中で観察された。標的タンパク質は、０〜５００ｍＭのＮａＣｌの浅い傾斜で溶出した。標的タンパク質は、約２５０ｍＭのＮａＣｌで溶出した。標的タンパク質を、２０ｍＭのＣＰＢ（ｐＨ６．５）の最終貯蔵緩衝液中にダイアフィルトレーションした。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析は、９５％より高純度の８８ｋＤａのタンパク質を同定した。Ｎ末端配列決定の結果、主要な配列は「ＤＡＨＫＳ」（配列番号２１４３）であり、これは、ＨＳＡの成熟形態のアミノ末端である。最終的な緩衝液の組成は、２０ｍＭのＣＰＢ（ｐＨ６．５）である。３．５Ｌの培養上清から、１．９４ｍｇのタンパク質が精製された。
（構築物ＩＤ番号１６４３によってコードされるＧＣＳＦアルブミン融合タンパク質の活性は、インビトロＮＦＳ−６０細胞増殖アッセイを使用してアッセイされ得る。）
（方法）
構築物１６４３によってコードされるＧＣＳＦアルブミン融合タンパク質を、副節の表題「ＧＣＳＦの活性はインビトロＮＦＳ−６０細胞増殖アッセイを使用してアッセイされ得る」および「構築物ＩＤ番号１６４２によってコードされるＧＣＳＦアルブミン融合物の活性はインビトロＮＦＳ−６０細胞増殖アッセイを使用してアッセイされ得る」の下の実施例１９において先に記載されたインビトロＮＦＳ−６０細胞増殖バイオアッセイにおいて試験した。
（結果）
構築物１６４３は、ＮＦＳ−６０細胞増殖を、用量依存性の様式で引き起こす能力を実証し、一方で、ＨＳＡ単独を用いたコントロール上清は、いずれの活性をも生じなかった（図１１を参照のこと）。
（構築物ＩＤ番号１６４３によってコードされるＧＣＳＦアルブミン融合物の活性は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを使用して、ＧＣＳＦ−ＨＳＡを改変剤として、インビボでアッセイされ得る。）
（方法）
構築物１６４３によってコードされるＧＣＳＦアルブミン融合タンパク質は、副節の表題「ＧＣＳＦの活性は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを使用して、ＧＣＳＦ−ＨＳＡを改変剤として、インビボでアッセイされ得る」および「構築物ＩＤ番号１６４２によってコードされるＧＣＳＦアルブミン融合物の活性は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを使用して、ＧＣＳＦ−ＨＳＡを改変剤として、インビボでアッセイされ得る。」の下の実施例１９において先に記載された手順に従って、アッセイされ得る。
（実施例２１：ＧＣＳＦアルブミン融合タンパク質の適応症）
上記アッセイにおけるＧＣＳＦアルブミン融合タンパク質の活性に基づいて、ＧＣＳＦアルブミン融合タンパク質は、炎症性障害、骨芽細胞白血病、一次好中球減少症（例えば、Ｋｏｓｔｍａｎｎ症候群）、二次好中球減少症、好中球減少症の予防、ＨＩＶ感染患者における好中球減少症の予防および処置、化学療法に関連する好中球減少症の予防および処置、好中球減少症に関連する感染、脊髄嚢胞（ｍｙｅｌｏｐｙｓｐｌａｓｉａ）、ならびに自己免疫障害、造血前駆細胞の動員、骨髄移植、急性骨髄性白血病、非ホジキンリンパ腫、急性リンパ芽球性白血病、ホジキン病、亢進性骨髄回復、およびグリコゲン貯蔵疾患を、化学的予防、処置、予防、ならびに／または診断する際に、有用である。
（実施例２２：構築物ＩＤ２３６３、ＧＦＳＦ−ＨＳＡ−ＥＰＯ．Ａ２８−Ｄ１９２、産生）
構築物ＩＤ２３６３（ｐＣ４：ＧＣＳＦ．ＨＳＡ．ＥＰＯ−Ａ２８−Ｄ１９２）は、ＧＣＳＦ−ＨＳＡ−ＥＰＯ三重融合タンパク質をコードするＤＮＡを含む。この三重融合タンパク質は、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）の全長形態を有し、ＨＳＡの成熟形態のアミノ末端に融合するタンパク質であり、このＨＳＡは、ＥＰＯの成熟形態のアミノ末端（すなわち、アミノ酸Ａ２８−Ｄ１９２）に融合しており、ＣＨＯ哺乳動物細胞株発現ベクターｐＣ４における最後のＡｒｇ残基を例外とする。
（ＧＣＳＦ−ＨＳＡ−ＥＰＯ ｃＤＮＡのクローニング）
構築物ＩＤ番号１６４２、すなわち、ｐＳＡＣ３５：ＨＧＣＳＦ．Ｔ３１−Ｐ２０４．ＨＳＡ（実施例１９）をテンプレートとして使用して、構築物２３６３の一部を産生した。以下のポリヌクレオチドを合成した：
Figure 2014043448
 ＧＣＳＦの全長配列を、プライマーＧＣＳＦ／ＥＰＯ−１、ＧＣＳＦ／ＥＰＯ−２、ＧＣＳＦ／ＥＰＯ−３、およびＧＣＳＦ／ＥＰＯ−４の組み合わせを使用して、３段階オーバーラッピングＰＣＲ反応において産生した。プライマーＧＣＳＦ／ＥＰＯ−１、ＧＣＳＦ／ＥＰＯ−３およびＧＣＳＦ／ＥＰＯ−４は、ＧＣＳＦの全長のアミノ末端にまたがる配列からなる。プライマーＧＣＳＦ／ＥＰＯ−２は、ＨＳＡのアミノ酸Ｓｅｒ−２１６〜Ａｌａ−２２５にまたがる配列の逆相補体からなる。第一のＰＣＲ反応は、構築物１６４２をテンプレートとして、ならびにプライマーＧＣＳＦ／ＥＰＯ−１およびＧＣＳＦ／ＥＰＯ−２を含んだ。第一のＰＣＲ反応から得られた産物を、第二のＰＣＲ反応においてテンプレートとして使用し、この反応は、プライマーＧＣＳＦ／ＥＰＯ−３およびＧＣＳＦ／ＥＰＯ−２を含んだ。第二のＰＣＲ反応から得られた産物を、第三のＰＣＲ反応においてテンプレートとして使用し、この反応は、プライマーＧＣＳＦ／ＥＰＯ−４およびＧＣＳＦ／ＥＰＯ−２を含んだ。プライマーＧＣＳＦ／ＥＰＯ−４は、Ｂａｍ ＨＩ部位（斜体で示される）、引き続いてＫｏｚａｋ配列（下線を引かれて示される）を有する。最後のＰＣＲ産物は、５’Ｂａｍ ＨＩ制限部位、引き続いて適切なＫｏｚａｋ配列、その全長ＧＣＳＦコード配列全体およびＨＳＡオープンリーディングフレーム（Ａｓｐ−２５〜Ａｌａ−２２５）の一部を含む。Ｃｌａ Ｉ部位は、ＨＳＡの成熟形態のポリヌクレオチド配列に固有であり、そしてＨＳＡの成熟形態の５’末端のすぐ近くに位置する。Ｂａｍ ＨＩ−Ｃｌａ Ｉフラグメントを、同様に消化したｐＣ４．ＨＳＡ．ＥＰＯ．Ａ２８−Ｄ１９２構築物ＩＤ番号１９８１にクローニングした。
構築物ＩＤ番号２３６３は、ＧＣＳＦのリーダーおよび成熟形態、続いて成熟ＨＳＡタンパク質、続いてＥＰＯの成熟形態を含む、アルブミン融合タンパク質をコードする。
さらに、発現されたアルブミン融合タンパク質の、アミノ酸配列決定によるＮ末端の分析は、予測されたＧＣＳＦ配列の存在を確認し得る（以下を参照のこと）。
本発明のＧＣＳＦ／ＥＰＯアルブミン融合タンパク質は、好ましくは、ＧＣＳＦの成熟形態（すなわち、Ｔｈｒ−３１〜Ｐｒｏ−２０４）のＮ末端またはＣ末端のいずれかに融合し、そしてＥＰＯの成熟形態（すなわち、Ａｌａ−２８〜Ａｓｐ−１９２）のＮ末端またはＣ末端のいずれかに融合した、ＨＳＡの成熟形態（すなわち、Ａｓｐ−２５〜Ｌｅｕ−６０９）を含む。本発明の１つの実施形態において、本発明のＧＳＣＳＦ／ＥＰＯアルブミン融合タンパク質は、発現のために使用される宿主の分泌経路における発生期の融合ポリペプチドを方向付ける、シグナル配列をさらに含む。さらに好ましい実施形態において、シグナル配列によってコードされるシグナルペプチドは、除去され、そして成熟ＧＣＳＦ／ＥＰＯアルブミン融合タンパク質が、培養倍地中に直接分泌される。本発明のＧＣＳＦ／ＥＰＯアルブミン融合タンパク質は、異種シグナル配列（ＭＡＦ、ＩＮＶ、Ｉｇ、Ｆｉｂｕｌｉｎ Ｂ、Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎ、インスリン様増殖因子結合タンパク質４、改変体ＨＳＡリーダー配列（キメラＨＳＡ／ＭＡＦリーダー配列が挙げられるが、これに限定されない）、または当該分野において公知である他の異種シグナル配列が挙げられるが、これらに限定されない）を含み得る。好ましい実施形態において、本発明のＧＣＳＦ／ＥＰＯアルブミン融合タンパク質は、ネイティブＧＣＳＦシグナル配列またはネイティブＥＰＯシグナル配列のいずれかを含む。さらに好ましい実施形態において、本発明のＧＣＳＦ／ＥＰＯアルブミン融合タンパク質は、Ｎ末端メチオニン残基をさらに含む。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（フラグメントおよび／または改変体を含む）もまた、本発明に包含される。
（構築物ＩＤ２３６３の発現および精製）
（ＣＨＯ細胞における発現）
構築物２３６３は、実施例６および８に先に記載されるように、ＣＨＯ細胞内にトランスフェクトされ得る。
（ＣＨＯ上清からの精製）
アルブミン融合タンパク質についての一般的な精製手順は、実施例７に記載されている。構築物２３６３によってコードされる三重融合タンパク質ＧＣＳＦ−ＨＳＡ−ＥＰＯは、実施例７および９において先に記載されたように精製され得る。Ｎ末端配列決定は、ＧＣＳＦの成熟形態に対応する、配列ＴＰＬＧＰ（配列番号２１４４）を生じるはずである。
（構築物ＩＤ番号２３６３によってコードされるＧＣＳＦ−ＨＳＡ−ＥＰＯの活性は、インビトロＴＦ−１細胞増殖アッセイおよびインビトロＮＦＳ−６０細胞増殖アッセイを使用してアッセイされ得る。）
（方法）
構築物２３６３によってコードされる三重融合タンパク質ＧＣＳＦ−ＨＳＡ−ＥＰＯの活性を、実施例９において副節の表題「構築物１９８１についてのインビトロＴＦ−１細胞増殖アッセイ」の下で先に記載されたようなインビトロＴＦ−１細胞増殖アッセイにおいて、および実施例１９において副節の表題「構築物ＩＤ番号１６４２によってコードされるＧＣＳＦアルブミン融合物の活性は、インビトロＮＦＳ−６０細胞増殖アッセイを使用してアッセイされ得る」の下で先に記載されたようなインビトロＮＦＳ−６０細胞増殖アッセイにおいて、アッセイした。
（結果）
構築物２３６３によってコードされるＧＣＳＦ−ＨＳＡ−ＥＰＯアルブミン融合物は、ＴＦ−１細胞とＮＦＳ−６０細胞との両方の増殖を実証した。
（構築物ＩＤ番号２３６３によってコードされるＧＣＳＦ−ＨＳＡ−ＥＰＯアルブミン融合物の活性はインビボでアッセイされ得る。）
構築物２３６３によってコードされる三重融合タンパク質ＧＣＳＦ−ＨＳＡ−ＥＰＯの活性を、実施例９において副節の表題「構築物１９８１の活性は、ヘマトクリットを測定するためのインビボＨａｒｌａｎマウスモデルを使用してアッセイされ得る」の下で先に記載されたように、インビボＨａｒｌａｎマウスモデルにおいて、およびＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて（ここで、ＧＣＳＦ−ＨＳＡ−ＥＰＯは動員剤である）、実施例１９において副節の表題「構築物ＩＤ番号１６４２によってコードされるＧＣＳＦアルブミン融合物の活性は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを使用して：ＧＣＳＦ−ＨＳＡを動員剤としてインビボでアッセイされ得る」の下で先に記載されたように、アッセイし、ヘマトクリットレベルを測定し得る。
（実施例２３：構築物ＩＤ２３７３、ＧＣＳＦ−ＨＳＡ−ＥＰＯ．Ａ２８−Ｄ１９２、産生）
構築物ＩＤ２３７３（ｐＣ４：ＧＣＳＦ．ＨＳＡ．ＥＰＯ−Ａ２８−Ｄ１９２．Ｒ１４０Ｇ）は、ＧＣＳＦ−ＨＳＡ−ＥＰＯ三重融合タンパク質をコードするＤＮＡを含む。この三重融合タンパク質は、顆粒球コロニー刺激因子「Ｇ−ＣＳＦ」の全長形態を有し、ＨＳＡの成熟形態のアミノ末端に融合するタンパク質であり、このＨＳＡは、ＥＰＯの成熟形態のアミノ末端（すなわち、Ａ２８−Ｄ１９２）に融合しており、ＣＨＯ哺乳動物細胞株発現ベクターｐＣ４において、Ａｒｇ−１４０のＧｌｙへの変異を有する。
（構築物２３７３についてのＥＰＯ ｃＤＮＡのクローニング）
構築物ＩＤ番号２３７３は、ＧＣＳＦのリーダー配列および成熟形態、続いて成熟ＨＳＡタンパク質、続いてＥＰＯの成熟形態（これは、Ａｒｇ−１４０からＧｌｙへの変異を有する）を含む、アルブミン融合タンパク質をコードする（配列番号４０１）。構築物ＩＤ番号２３７３を、構築物ＩＤ番号２３６３（すなわち、ｐＣ４：ＧＣＳＦ．ＨＳＡ．ＥＰＯ．Ｒ１４０Ｇ）をＰＣＲ変異誘発のためのテンプレートとして使用して、産生した。
構築物ＩＤ番号２３６３のテンプレートのＰＣＲ増幅のために適切な４つのオリゴヌクレオチド（ＧＣＳＦ／ＥＰＯ−５、ＧＣＳＦ／ＥＰＯ−６、ＧＣＳＦ／ＥＰＯ−７、およびＧＣＳＦ／ＥＰＯ−８）を合成した。
Figure 2014043448
 構築物２３７３を、ネスティッド（ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲ増幅によって、構築物２３６３をテンプレートとして使用して産生した。第一回のＰＣＲ増幅において、構築物ＩＤ２３６３のＮ末端フラグメントおよびＣ末端フラグメントを、独立して増幅した。Ｎ末端フラグメントを、プライマーＧＣＳＦ／ＥＰＯ−５およびＧＣＳＦ／ＥＰＯ−６を使用して産生した。ＧＣＳＦ／ＥＰＯ−５は、ＨＳＡの全長形態のアミノ酸残基３３４〜３４０をコードする核酸配列に対応する。ＧＣＳＦ／ＥＰＯ−６プライマーは、ＥＰＯの全長形態のアミノ酸１３６〜１４３にわたる配列の逆相補体を含む（アミノ酸１４０におけるＡｒｇ残基をコードするコドンＣＧＡ（太字で強調されている）がＧｌｙ残基をコードするコドンＧＧＡに変更されていることを例外とする）。Ｃ末端フラグメントを、プライマーＧＣＳＦ／ＥＰＯ−７およびＧＣＳＦ／ＥＰＯ−８を使用して産生した。ＧＣＳＦ／ＥＰＯ−７プライマーは、ＥＰＯの全長形態のアミノ酸１３６〜１４３をコードする核酸配列を含む（アミノ酸１４０におけるＡｒｇ残基をコードするコドンＣＧＡ（太字で強調されている）がＧｌｙ残基をコードするコドンＧＧＡに変更されていることを例外とする）。ＧＣＳＦ／ＥＰＯ−８において、この配列は、終止コドンの下流のｐＣ４ベクター内のヌクレオチドを含む。第二回のＰＣＲ増幅において、プライマーＧＣＳＦ／ＥＰＯ−５およびＧＣＳＦ／ＥＰＯ−８を使用して、ＧＣＳＦ−ＨＳＡ−ＥＰＯ三重融合タンパク質を増幅した。この三重融合タンパク質は、ＨＳＡの成熟形態のアミノ末端に融合するＧ−ＣＳＦの全長形態を有し、このＨＳＡは、Ａｒｇ−１４０からＧｌｙへの変異を有するＥＰＯの全長形態のアミノ末端（すなわち、Ａ２８−Ｄ１９２）に融合している。この反応混合物は、ＰＣＲ増幅されたＮ末端フラグメントおよびＰＣＲ増幅されたＣ末端フラグメントの両方を含んだ。
ＰＣＲ産物を精製し、次いで、Ｂｓｕ３６ＩおよびＡｓｃＩで消化した。Ｂｓｕ３６Ｉ−ＡｓｃＩフラグメントの、ゲル電気泳動によるさらなる精製の後、この産物を、Ｂｓｕ３６Ｉ／ＡｓｃＩで消化された構築物２３６３にクローニングして、構築物ＩＤ番号２３７３を生じた。
さらに、アミノ酸配列決定によるアルブミン融合タンパク質のＮ末端の分析は、予測されたＧＣＳＦ配列の存在を確認し得る（以下を参照のこと）。
本発明のＧＣＳＦ／ＥＰＯアルブミン融合タンパク質は、好ましくは、ＧＣＳＦの成熟形態（すなわち、Ｔｈｒ−３１〜Ｐｒｏ−２４０）のＮ末端またはＣ末端のいずれかに融合し、そしてＥＰＯの成熟形態（すなわち、Ａｌａ２８〜Ａｓｐ−１９２）のＮ末端またはＣ末端のいずれかに融合した、ＨＳＡの成熟形態（すなわち、Ａｓｐ−２５〜Ｌｅｕ−６０９）を含む。本発明の１つの実施形態において、本発明のＧＣＳＦ／ＥＰＯアルブミン融合タンパク質は、発現のために使用される宿主の分泌経路における発生期の融合ポリペプチドを方向付けるシグナル配列を、さらに含む。さらに好ましい実施形態において、シグナル配列によってコードされるシグナルペプチドが除去され、そして成熟ＧＣＳＦ／ＥＰＯアルブミン融合タンパク質が、培養培地中に直接分泌される。本発明のＧＣＳＦ／ＥＰＯアルブミン融合タンパク質は、異種シグナル配列（ＭＡＦ、ＩＮＶ、Ｉｇ、Ｆｉｂｕｌｉｎ Ｂ、Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎ、インスリン様増殖因子結合タンパク質４、改変体ＨＳＡリーダー配列（キメラＨＳＡ／ＭＡＦリーダー配列が挙げられるが、これに限定されない）、または当該分野において公知である他の異種シグナル配列が挙げられるが、これらに限定されない）を含み得る。好ましい実施形態において、本発明のＧＣＳＦ／ＥＰＯアルブミン融合タンパク質は、ネイティブＧＣＳＦシグナル配列またはネイティブＥＰＯシグナル配列のいずれかを含む。さらに好ましい実施形態において、本発明のＧＣＳＦ／ＥＰＯアルブミン融合タンパク質は、Ｎ末端メチオニン残基をさらに含む。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（フラグメントおよび／または改変体を含む）もまた、本発明に包含される。
（構築物ＩＤ２３７３の発現および精製）
（ＣＨＯ細胞における発現）
構築物２３７３は、実施例６および８に先に記載されるように、ＣＨＯ細胞内にトランスフェクトされ得る。
（ＣＨＯ上清からの精製）
アルブミン融合タンパク質についての一般的な精製手順は、実施例７に記載されている。構築物２３７３によってコードされる三重融合タンパク質ＧＣＳＦ−ＨＳＡ−ＥＰＯ．Ｒ１４０Ｇは、実施例７および８において先に記載されたように精製され得る。Ｎ末端配列決定は、ＧＣＳＦの成熟形態に対応する、配列ＴＰＬＧＰ（配列番号２１４４）を生じるはずである。
（構築物ＩＤ番号２３７３によってコードされるＧＣＳＦ−ＨＳＡ−ＥＰＯ．Ｒ１４０Ｇの活性は、インビトロＴＦ−１細胞増殖アッセイおよびインビトロＮＦＳ−６０細胞増殖アッセイを使用してアッセイされ得る。）
（方法）
構築物２３７３によってコードされる三重融合タンパク質ＧＣＳＦ−ＨＳＡ−ＥＰＯ．Ｒ１４０Ｇの活性を、実施例９において副節の表題「構築物１９８１についてのインビトロＴＦ−１細胞増殖アッセイ」の下で先に記載されたようなインビトロＴＦ−１細胞増殖アッセイにおいて、および実施例１９において副節の表題「構築物ＩＤ番号１６４２によってコードされるＧＣＳＦアルブミン融合物の活性は、インビトロＮＦＳ−６０細胞増殖アッセイを使用してアッセイされ得る」の下で先に記載されたようなインビトロＮＦＳ−６０細胞増殖アッセイにおいて、アッセイし得る。
（結果）
構築物２３７３によってコードされるＧＣＳＦ−ＨＳＡ−ＥＰＯ．Ｒ１４０Ｇアルブミン融合物は、ＴＦ−１細胞とＮＦＳ−６０細胞との両方の増殖を実証した。
（構築物ＩＤ番号２３７３によってコードされるＧＣＳＦ−ＨＳＡ−ＥＰＯ．Ｒ１４０Ｇアルブミン融合物の活性はインビボでアッセイされ得る。）
（方法）
構築物２３７３によってコードされる三重融合タンパク質ＧＣＳＦ−ＨＳＡ−ＥＰＯ．Ｒ１４０Ｇの活性を、実施例９において副節の表題「構築物１９８１の活性は、ヘマトクリットを測定するためのインビボＨａｒｌａｎマウスモデルを使用してアッセイされ得る」の下で先に記載されたように、インビボＨａｒｌａｎマウスモデルにおいて、およびＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて（ここで、ＧＣＳＦ−ＨＳＡ−ＥＰＯは動員剤である）、実施例１９において副節の表題「構築物ＩＤ番号１６４２によってコードされるＧＣＳＦアルブミン融合物の活性は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを使用して：ＧＣＳＦ−ＨＳＡを動員剤としてインビボでアッセイされ得る」の下で先に記載されたように、アッセイし、ヘマトクリットレベルを測定し得る。
（実施例２４：ＧＣＳＦ−ＨＳＡ−ＥＰＯ三重融合物の適応症）
ＧＣＳＦ、ＥＰＯおよびＨＳＡを含む三重融合タンパク質（構築物２３６３および２３７３によってコードされるものが挙げられるが、これらに限定されない）の適応症としては、ＥＰＯアルブミン融合タンパク質およびＧＣＳＦアルブミン融合タンパク質について詳述した適応症が挙げられ得、種々の状態（末期腎臓疾患（透析患者）、透析前の慢性腎不全、ジドブジン処置されたＨＩＶ患者、化学療法中の癌患者、および未熟児が挙げられるが、これらに限定されない）によって引き起こされる出血障害および貧血；輸血の必要性を減少させるために、選択的な非心臓の非脈管の手術を受けている貧血患者における手術前；再生不良性貧血および他の難治性貧血、炎症性腸疾患における難治性貧血、ならびに選択的整形外科化学防御における輸血逃避；炎症性障害、骨髄細胞白血病、一次好中球減少症（例えば、Ｋｏｓｔｍａｎｎ症候群）、二次好中球減少症の処置、予防、および／または診断、好中球減少症の予防、ＨＩＶ感染患者における好中球減少症の予防および処置、化学療法に関連する好中球減少症の予防および処置、好中球減少症に関連する感染、脊髄嚢胞、ならびに自己免疫障害、造血前駆細胞の動員、骨髄移植、急性骨髄性白血病、非ホジキンリンパ腫、急性リンパ芽球性白血病、ホジキン病、加速骨髄回復、ならびにグリコゲン貯蔵疾患；が挙げられるが、これらに限定されない。
（実施例２５：構築物ＩＤ２０５３、ＩＦＮｂ−ＨＳＡ、産生）
構築物ＩＤ２０５３（ｐＥＥ１２．１：ＩＦＮｂ．ＨＳＡ）は、ＩＦＮｂアルブミン融合タンパク質をコードするＤＮＡを含み、この融合タンパク質は、ＮＳ０発現ベクターｐＥＥ１２．１におけるＨＳＡの成熟形態のアミノ末端に融合した、ネイティブＩＦＮｂリーダー配列を含む全長ＩＦＮｂタンパク質を有する。
（ＩＦＮｂ ｃＤＮＡのクローニング）
ＩＦＮｂをコードするポリヌクレオチドを、以下に記載されるプライマーＩＦＮｂ−１およびＩＦＮｂ−２を使用してＰＣＲ増幅し、Ｂａｍ ＨＩ／Ｃｌａ Ｉで切断し、そしてＢａｍ ＨＩ／Ｃｌａ Ｉ切断されたｐＣ４：ＨＳＡに連結して、構築物２０１１を生じた。構築物ＩＤ番号２０１１由来のＥｃｏ ＲＩ／Ｅｃｏ ＲＩフラグメントを、ｐＥＥ１２．１のＥｃｏ ＲＩ部位にサブクローニングし、構築物ＩＤ番号２０５３を産生した。構築物ＩＤ番号２０５３は、ＩＦＮｂのリーダー配列および成熟形態、続いて成熟ＨＳＡタンパク質を含む、アルブミン融合タンパク質をコードするＤＮＡを含む。
ＩＦＮｂの全長をコードするポリヌクレオチドのＰＣＲ増幅のために適切な２つのオリゴヌクレオチド（ＩＦＮｂ−１およびＩＦＮｂ−２）を合成した：
Figure 2014043448
 ＩＦＮｂ−１プライマーは、Ｂａｍ ＨＩクローニング部位（下線を引いて示される）、Ｅｃｏ ＲＩクローニング部位、およびＫｏｚａｋ配列（斜体で示される）、続いてＩＦＮｂの全長形態の最初の２７個のアミノ酸をコードする８０個のヌクレオチドを含む。ＩＦＮｂ−２において、Ｃｌａ Ｉ部位（下線を引いて示される）およびそれに続くＤＮＡは、成熟ＨＳＡタンパク質（配列番号１０３８）の最初の１０個のアミノ酸をコードするＤＮＡの逆相補体であり、そして最後の１８個のヌクレオチドは、ＩＦＮｂの最後の６個のアミノ酸残基をコードするＤＮＡの逆相補体である（実施例２を参照のこと）。ＰＣＲ増幅体（ａｍｐｌｉｍｅｒ）を、３つのプライマーを使用して産生し、精製し、Ｂａｍ ＨＩ制限酵素およびＣｌａ Ｉ制限酵素で消化し、そしてｐＣ４：ＨＳＡベクターのＢａｍ ＨＩ部位およびＣｌａ Ｉ部位にクローニングした。配列を確認した後に、ＩＦＮｂアルブミン融合タンパク質発現カセットを含むＥｃｏ ＲＩフラグメントを、Ｅｃｏ ＲＩ消化されたｐＥＥ１２．１にサブクローニングした。
さらに、発現されたアルブミン融合タンパク質のＮ末端の、アミノ酸配列決定による分析は、予測されたＩＦＮｂ配列の存在を確認し得る（以下を参照のこと）。
本発明のＩＦＮｂアルブミン融合タンパク質は、好ましくは、ＩＦＮｂの成熟形態（すなわち、Ｍｅｔ−２２〜Ａｓｎ−１８７）のＮ末端またはＣ末端のいずれかに融合した、ＨＳＡの成熟形態（すなわち、Ａｓｐ−２５〜Ｌｅｕ−６０９）を含む。本発明の１つの実施形態において、本発明のＩＦＮｂアルブミン融合タンパク質は、発現のために使用される宿主の分泌経路における発生期の融合ポリペプチドを方向付けるシグナル配列を、さらに含む。さらに好ましい実施形態において、シグナル配列によってコードされるシグナルペプチドが除去され、そして成熟ＩＦＮｂアルブミン融合タンパク質が、培養培地中に直接分泌される。本発明のＩＦＮｂアルブミン融合タンパク質は、異種シグナル配列（ＭＡＦ、ＩＮＶ、Ｉｇ、Ｆｉｂｕｌｉｎ Ｂ、Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎ、インスリン様増殖因子結合タンパク質４、改変体ＨＳＡリーダー配列（キメラＨＳＡ／ＭＡＦリーダー配列が挙げられるが、これに限定されない）、または当該分野において公知である他の異種シグナル配列が挙げられるが、これらに限定されない）を含み得る。好ましい実施形態において、本発明のＩＦＮｂアルブミン融合タンパク質は、ネイティブＩＦＮｂを含む。さらに好ましい実施形態において、本発明のＩＦＮｂアルブミン融合タンパク質は、Ｎ末端メチオニン残基をさらに含む。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（フラグメントおよび／または改変体を含む）もまた、本発明に包含される。
（構築物ＩＤ２０５３の発現および精製）
（マウス骨髄腫ＮＳ０細胞株における発現）
構築物ＩＤ番号２０５３（ｐＥＥ１２．１：ＩＦＮｂ−ＨＳＡ）を、当該分野において公知の方法によって、ＮＳ０細胞にエレクトロポレーションした（実施例６を参照のこと）。
（ＮＳ０細胞上清からの精製）
ＮＳ０細胞上清からのＩＦＮｂ−ＨＳＡの精製は、実施例１０に記載される方法に従い得る。この方法は、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ中０〜１ＭのＮａＣｌ勾配を使用する、ｐＨ７．４におけるＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ陰イオン交換クロマトグラフィー、続いて５〜４０ｍＭのクエン酸ナトリウム勾配を用いる、ｐＨ６．５におけるＰｏｒｏｓ ＰＩ ５０陰イオン交換クロマトグラフィー、および１０ｍＭクエン酸（ｐＨ６．５）および１４０ｍＭ ＮａＣｌの最終緩衝液濃度への、６ＤＶについてのダイアフィルトレーションを包含する。Ｎ末端配列決定は、配列ＭＳＹＮＬＬを生じるはずであり、これは、ＩＦＮｂの成熟形態のアミノ末端である。このタンパク質は、８８．５ｋＤａのおよそのＭＷを有する。
より大きい規模の精製（例えば、５０ＬのＮＳ０細胞上清）については、約８〜１０Ｌに濃縮され得る。次いで、濃縮されたサンプルは、ｐＨ７．５で、５０ｍＭ ＮａＯＡｃ（ｐＨ６．０）および１５０ｍＭ ＮａＣｌからなる段階溶出を使用して、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ陰イオン交換カラム（１０×１９ｃｍ、１．５Ｌ）に通され得る。次いで、溶出されたサンプルは、０．７５％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ １００とともに、室温で６０分間ウイルス不活性化され得る。次いで、ＳＤＲ−逆相クロマトグラフィー（１０ｃｍ×１０ｃｍ、０．８Ｌ）を、ｐＨ６．０で、５０ｍＭ ＮａＯＡｃおよび１５０ｍＭ ＮａＣｌとともに、またはその逆で使用して、サンプルをＳＰ−セファロースカラムに、ｐＨ４．８で、５０ｍＭ ＮａＯＡｃ（ｐＨ６．０）および１５０ｍＭ ＮａＣｌの段階溶出を使用して通され得る。続いて、ＤＶ５０濾過して、全てのウイルス成分を除去する。続いて、Ｐｈｅｎｙｌ−６５０Ｍクロマトグラフィー（２０ｃｍ×１２ｃｍ、３．８Ｌ）を、３５０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４および５０ｍＭ ＮａＯＡｃからなる段階溶出、あるいは５０ｍＭ ＮａＯＡｃ（ｐＨ６．０）からなる段階溶出を使用して、ｐＨ６．０で行い得る。６〜８ＤＶについてのダイアフィルトレーションは、緩衝液の、所望の最終濃度の緩衝液（１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４＋５８ｍＭスクロース＋１２０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．２）または１０ｍＭクエン酸（ｐＨ６．５）および１４０ｍＭ ＮａＣｌまたは２５ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１００ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．２）のいずれか）への交換を可能にする。
（ＩＦＮｂの活性は、インビトロＩＳＲＥ−ＳＥＡＰアッセイを使用してアッセイされ得る。）
全てのＩ型インターフェロンタンパク質は、共通のレセプター複合体および類似のＪａｋ／ＳＴＡＴシグナル伝達経路（これは最終的に、インターフェロン配列応答性エレメント（「ＩＳＲＥ」）を介する、インターフェロン（「ＩＦＮ」）応答性遺伝子の活性化となる）を介してシグナル伝達する。Ｉ型ＩＦＮ活性についての好都合なアッセイは、下流レポーター遺伝子に融合したＩＳＲＥエレメントの複数のコピーを含む、プロモーター−レポーターベースのアッセイ系である。安定なＨＥＫ２９３細胞株が産生され得、そしてＩＳＲＥ−ＳＥＡＰレポーター遺伝子の安定に一体化されたコピーを含み、この細胞株は、Ｉ型ＩＦＮに対して非常に感受性であり、そして濃度の５ｌｏｇにわたる直線性を示す。
（ＩＦＮｂ−ＨＳＡ ＮＳ０安定クローンのスクリーニングの方法）
構築物２０５３を、ＮＳ０細胞に、実施例６に記載されるようにエレクトロポレーションした。構築物ＩＤ番号２０５３でトランスフェクトしたＮＳ０細胞を、ＩＳＲＥ−ＳＥＡＰアッセイにおいて馴化した増殖培地を試験することによって、活性についてスクリーニングした。ＩＳＲＥ−ＳＥＡＰ／２９３Ｆレポーター細胞を、３×１０４細胞／ウェルで、９６ウェルのポリＤ−リジンでコーティングされたプレートに、処理の１日前にプレートした。レポーター細胞を、構築物ＩＤ２０５３によってコードされるＩＦＮｂアルブミン融合タンパク質またはコントロールとしてｒｈＩＦＮｂの馴化上清または精製調製物の種々の希釈物（１：５００および１：５０００が挙げられるが、これらに限定されない）で処理した。次いで、レポーター細胞を、２４時間インキュベートし、その後、ＳＥＡＰレポーター遺伝子化学発光アッセイ（Ｒｏｃｈｅカタログ番号１７７９８４２）において使用するために、４０Ｌを取り出した。組換えヒトインターフェロンβ（「ｒｈＩＦＮｂ」（Ｂｉｏｇｅｎ））を、陽性コントロールとして使用した。
（結果）
ＮＳ０発現したＩＦＮｂ−ＨＳＡの精製調製物は、ｒｈＩＦＮｂ（Ｂｉｏｇｅｎ）（これは、１．８×１０−１０ｇ／ｍＬのＥＣ５０を有した）より大きいＥＣ５０（９．３×１０−９ｇ／ｍＬ）を有した（図１３を参照のこと）。
（インターフェロンによるＯＡＳのインビボ導入）
（方法）
ＯＡＳ酵素（２’−５’−オリゴアデニレートシンテターゼ）を、抗ウイルス感染に応答して、インターフェロンによって、転写レベルで活性化する。インターフェロン構築物の効果を、処置されたサルから血液サンプルを得、そしてこれらのサンプルを２つのＯＡＳ ｍＲＮＡ（ｐ４１およびｐ６９）の転写活性化について分析することによって測定し得る。０．５ｍＬの体積の白血球が、１つの群あたり４匹の動物から、７の異なる時点（１匹の動物あたり０日目、１日目、２日目、４日目、８日目、１０日目、および１４日目）で得られ得る。種々の群は、ビヒクルコントロールの注射を、静脈内および／または皮下注射で、１日目に３０ｇ／ｋｇおよび／または３００ｇ／ｋｇのＩＦＮアルブミン融合タンパク質、ならびに１日目、３日目、および５日目に、陽性コントロールとして４０ｇ／ｋｇのインターフェロンα（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ）の皮下注射を含み得る。ｐ４１ ｍＲＮＡ転写物およびｐ６９ ｍＲＮＡ転写物のレベルを、リアルタイム定量ＰＣＲ（Ｔａｑｍａｎ）によって、ｐ４１−ＯＡＳおよびｐ６９−ＯＡＳに特異的なプローブを使用して、決定し得る。ＯＡＳ ｍＲＮＡレベルを、１８ＳリボソームＲＮＡ内因性コントロールに対して定量し得る。
（構築物ＩＤ２０５３によってコードされるインターフェロンβアルブミン融合物による、ＯＡＳのインビボ導入）
（方法）
構築物２０５３によってコードされるＨＳＡ−ＩＦＮｂ融合タンパク質の活性を、副節の表題「インターフェロンによるＯＳのインビボ導入」の下で先に上に記載されたようなインビボＯＡＳアッセイにおいて、アッセイし得る。
（実施例２６：ＩＦＮｂアルブミン融合タンパク質についての適応症）
ＩＦＮβアルブミン融合タンパク質（構築物２０５３によってコードされるものが挙げられるが、これらに限定されない）は、多発性硬化症を処置し、予防し、軽減し、そして／または検出するために使用され得る。他の適応症としては、黒色腫、固体腫瘍、癌、細菌感染、化学防御、栓球減少症、ＨＩＶ感染、前立腺癌、癌、血液学的悪性腫瘍、血液学的障害、前白血病、神経膠腫、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ヒトパピローマウイルス、肺繊維症、加齢性黄斑変性、脳癌、神経膠腫多型、肝癌、悪性黒色腫、結腸直腸癌、クローン病、神経変性、非小細胞肺癌、慢性関節リウマチ、および潰瘍性大腸炎が挙げられるが、これらに限定されない。
（実施例２７：構築物ＩＤ１９４１、ＨＳＡ−ＰＴＨ８４、産生）
構築物ＩＤ１９４１（ｐＣ４．ＨＳＡ．ＰＴＨ８４）は、ＨＳＡ−ＰＴＨ８４融合タンパク質をコードし、この融合タンパク質は、哺乳動物発現ベクターｐＣ４にクローニングされたヒト副甲状腺ホルモン（「ＰＴＨ８４」）の成熟形態のＳｅｒ−１〜Ｇｌｎ−８４に融合した、ネイティブＨＳＡリーダー配列を含むＨＳＡの全長を含む。
（構築物１９４１についてのＰＴＨ８４ ｃＤＮＡのクローニング）
ＰＴＨ８４をコードするＤＮＡを、以下に記載されるプライマーＰＴＨ８４−１およびＰＴＨ８４−２を使用して増幅し、Ｂｓｕ ３６Ｉ／Ｎｏｔ Ｉで切断し、そしてＢｕｓ ３６Ｉ／Ｎｏｔ Ｉ切断されたｐＣ４：ＨＳＡに連結した。構築物ＩＤ番号１９４１は、ネイティブＨＳＡリーダー配列、続いて成熟ＰＴＨ８４タンパク質を含む、ＨＳＡの全長形態を含む、アルブミン融合タンパク質をコードする。
ＰＴＨ８４の成熟形態をコードするポリヌクレオチドのＰＣＲ増幅のために適切な２つのプライマー（ＰＴＨ８４−１およびＰＴＨ８４−２）を合成した。
Figure 2014043448
 ＰＴＨ８４−１は、Ｂｕｓ−３６Ｉクローニング部位（下線を引いて示される）、続いてＰＴＨ８４の成熟形態のアミノ酸残基Ｓｅｒ−１〜Ａｓｎ−１０と結合体化した、ＨＳＡの成熟形態の末端（最後のＬｅｕが存在しない）に対応するアミノ酸残基Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙをコードする核酸配列を含む。ＰＴＨ８４−２において、Ｎｏｔ Ｉ部位は、下線を引いて示され、そしてそれに続く核酸配列は、成熟ＰＴＨ８４タンパク質の最後の１１個のアミノ酸をコードするＤＮＡの逆相補体に対応する。これらの２つのプライマーを使用して、ＰＴＨ８４タンパク質をＰＣＲ増幅した。
さらに、発現されたアルブミン融合タンパク質のＮ末端の、アミノ酸配列決定による分析は、予測されたＨＳＡ配列の存在を確認した（以下を参照のこと）。
本発明のＰＴＨ８４アルブミン融合タンパク質は、好ましくは、ＰＴＨ８４の成熟形態（すなわち、Ｓｅｒ−１〜Ｇｌｎ−８４）のＮ末端またはＣ末端のいずれかに融合した、ＨＳＡの成熟形態（すなわち、Ａｓｐ−２５〜Ｌｅｕ−６０９）を含む。本発明の１つの実施形態において、本発明のＰＴＨ８４アルブミン融合タンパク質は、発現のために使用される宿主の分泌経路における発生期の融合ポリペプチドを方向付けるシグナル配列を、さらに含む。さらに好ましい実施形態において、シグナル配列によってコードされるシグナルペプチドが除去され、そして成熟ＰＴＨ８４アルブミン融合タンパク質が、培養培地中に直接分泌される。本発明のＰＴＨ８４アルブミン融合タンパク質は、異種シグナル配列（ＭＡＦ、ＩＮＶ、Ｉｇ、Ｆｉｂｕｌｉｎ Ｂ、Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎ、インスリン様増殖因子結合タンパク質４、改変体ＨＳＡリーダー配列（キメラＨＳＡ／ＭＡＦリーダー配列が挙げられるが、これに限定されない）、または当該分野において公知である他の異種シグナル配列が挙げられるが、これらに限定されない）を含み得る。好ましい実施形態において、本発明のＰＴＨ８４アルブミン融合タンパク質は、ネイティブＰＴＨ８４を含む。さらに好ましい実施形態において、本発明のＰＴＨ８４アルブミン融合タンパク質は、Ｎ末端メチオニン残基をさらに含む。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（フラグメントおよび／または改変体を含む）もまた、本発明に包含される。
（構築物ＩＤ１９４１の発現および精製）
（２９３Ｔ細胞における発現）
構築物１９４１を、当該分野において公知の方法（例えば、リポフェクタミントランスフェクション）によって２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、そして１００ｎＭメトトレキサートを用いて選択した（実施例６を参照のこと）。発現レベルを、抗ＨＳＡ血清を一次抗体として用いる免疫ブロット検出によって、試験した。
（２９３Ｔ細胞上清からの精製）
構築物ＩＤ番号１９４１から２９３Ｔ細胞において発現された、分泌ＨＳＡ−ＰＴＨ８４融合タンパク質を含む２９３Ｔ細胞上清を、実施例７に記載されるように精製した。具体的には、最初の捕捉を、陰イオン性ＨＱ−５０樹脂を用いて、ｐＨ７．２で、リン酸ナトリウム緩衝液（２０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．２））および０〜０．５Ｍ ＮａＣｌの１６カラム体積の塩勾配溶出、続いてＰｈｅｎｙｌ ６５０Ｍ樹脂（Ｔｏｓｏｈａａｓ製）を用いて、３６カラム体積の２．７５〜０Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ７．２）の塩勾配溶出を使用する疎水性相互作用クロマトグラフィー（「ＨＩＣ」）を使用して実施した。ここで、サンプルは、１８０ｍＳの最終導電率を有した。このサンプルを、ＨＱ Ｐｏｒｏｓ ５０樹脂および０．１５Ｍ ＮａＣｌ増分の塩段階溶出を使用して濃縮した。最終緩衝組成物は、２５ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４＋１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．２）からなった。Ｎ末端配列決定は、ＨＳＡの成熟形態のアミノ末端配列（すなわち、ＤＡＨＫＳ、配列番号２１４３）を生じた。７８ｋＤａのおよそのＭＷのタンパク質が得られた。１リットルの２９３Ｔ細胞上清あたり０．７８ｍｇのタンパク質の最終収量が得られた。
（ＳａＯＳ２細胞における環状ＡＭＰのインビトロ導入）
（方法）
ＰＴＨ８４アルブミン融合タンパク質の生物学的活性を、ＳａＯＳ−２（骨肉腫細胞株）が使用されるインビトロアッセイにおいて測定し得る。ＰＴＨは、アデニレートシクラーゼを活性化し、これによって、細胞内環状ＡＭＰレベルを増加させる。
（ＳａＯＳ−２細胞におけるｃＡＭＰの導入：）
ＳａＯＳ−２細胞を、８．０×１０４細胞／ウェルの密度で、実験の開始の２４時間前に継代培養する。実験の日に、細胞を２時間、血清飢餓させ、次いで、陽性コントロール（例えば、５ｍｇ／ｍＬのフォルスコリン（ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ））、組換えＰＴＨ、またはＰＴＨアルブミン融合タンパク質で１０分間処理する。処理後、これらの細胞をリンスし、そして細胞内環状ＡＭＰを冷エタノールで抽出する。エタノール抽出物を凍結乾燥させ、そしてさらなる使用のために−８０℃で貯蔵する。サンプル中に存在する環状ＡＭＰの量を、ＥＬＩＳＡによって、製造業者のプロトコル（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）に従って定量する。
（構築物１９４１によってコードされるアルブミン融合タンパク質による、ＳａＯＳ２細胞中の環状ＡＭＰのインビトロ導入）
（方法）
構築物１９４１によってコードされるＰＴＨアルブミン融合タンパク質による、ＳａＯＳ２細胞中の環状ＡＭＰの導入を測定するためのインビトロアッセイを、先に上で記載したように実施し得る。
（インビボ：ＴＰＴＸ動物におけるカルシウムの誘導された放出）
（方法）
ＰＴＨ活性を、ＰＴＨアルブミン融合タンパク質が、低カルシウム食餌の甲状腺上皮小体切除術（「ＴＰＴＸ」）の施行、および副甲状腺ホルモン処理の後に骨の鉱物質除去を低下させる能力をモニタリングすることによって、試験する。
これらの動物は、Ｖｏｔｔａら、１９９７、Ｊ．Ｂｏｎｅ ａｎｄ Ｍｉｎｅｒａｌ Ｒｅｓ．，１２：１３９６−１４０６；Ｍｉｌｌｅｓｔら、１９９７、Ｂｏｎｅ，２０：４６５−４７１；ならびにＩｗａｔａら、１９９７、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ，４０：４９９−５０９によって示唆されるように、薬理学的応答における変動性を示す。従って、１群あたり５匹と８匹との間の甲状腺上皮小体切除された動物（外部販売者から購入した）を使用する。これらの動物は、１日おきにサイロキシンの補充注射を受ける。各実験は、いくつかの群を含む：（１）プラシーボおよび服甲状腺ホルモン（ＰＴＨ１〜３４）注射群（それぞれ、陰性コントロールおよび陽性コントロールに対応する）；（２〜５）ＰＴＨアルブミン融合タンパク質を、０．１〜１２μｇ／ｋｇの範囲の種々の濃度で、静脈内、腹腔内、皮下、および筋肉内に、副甲状腺ホルモン処理の前、間または後に注射される；（６）いくつかの実験について、システインプロテアーゼインヒビターが試験される。
イソフルオラン麻酔された状態で、左大腿静脈および左大腿動脈または甲状腺動脈のいずれかに、ヘパリン化生理食塩水を満たしたＰＥ−５０ポリエチレンチュービングに融合させたＰＥ−１０チュービングをカニューレ挿入する。これらのカテーテルを皮下に通し、首筋において外に出し、そして皮膚に固定する。動物を、実験のために使用される前に約１８時間回復させ、この時間の間に、これらの動物は、カルシウムのない食事を与えられる。実験の経過の間、３つの血液サンプル（各２００ｍＬ）を、甲状腺または大腿のカテーテルを介して、注入の２時間後、４時間後、および６時間後に採取する。より長い時点（例えば、１８時間目）もまた望ましくあり得る。
ヒトＰＴＨ１〜３４、陽性コントロール、および全血におけるイオン化カルシウムレベルの外観の間の用量関係を確立した（データは示されない）。
（構築物１９４１によってコードされるアルブミン融合タンパク質の活性は、ＴＰＴＸ動物を使用してアッセイされ得る。）
構築物１９４１によってコードされるＰＴＨアルブミン融合タンパク質の活性を、ＴＰＴＸ動物、および表題「インビボ：ＴＰＴＸ動物におけるカルシウムの誘導された放出」の下で上に記載されたインビボアッセイを使用して、測定し得る。
（インビボで卵巣切除された雌性ラットモデル）
（方法）
ＰＴＨ活性を、卵巣切除された雌性のＬｅｗｉｓラットまたはＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットにおいて骨形成を誘導する能力をモニタリングすることによって、試験する。
手術を、８から９週齢の雌性のＬｅｗｉｓラットまたはＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットに対して実施し、そして実験を、手術後７〜１０日目まで開始しない。血液、尿および左脛骨由来のサンプルを、１群あたり９〜１２匹の動物から毎週得る。種々の群は、４週間毎日生理食塩水を注射された偽コントロール、４週間毎日生理食塩水を注射された卵巣切除ラット、および毎週５回ラットＰＴＨペプチド１〜３４を１０ｇ／ｋｇで皮下注射された卵巣切除ラットを含み得る。組織収集の第４週であり最終週に続いて、骨密度測定分析のために、脛骨を、Ｓｌｅｌｅｔｅｃｈに送付する。
試験したパラメータは、体重、７０％エタノール中での左脛骨における骨密度測定、血液からの血清ピリジノリン（ｐｙｒｉｄｉｎｏｌｉｎｅ）、ならびに尿デオキシピリジノリンおよびα螺旋タンパク質である。尿サンプルを、午前中に採取する。血液を、心臓を出血させることにより得、そして血清をＥＬＩＳＡ分析のためにとっておく。骨密度測定を、近位脛骨において実施する。左大腿を、ひざのすぐ上で骨切断器で切断し得る。前足もまた、遠位脛骨を切断することによって除去し得る。エタノール中で皮膚に横方向に切込みを入れ、前足の残りを７０％エタノールを満たした５０ｃｃチューブに入れる。このチューブを、輸送まで室温で貯蔵する。ラット脛骨の標本を、試験の日に室温に解凍する。切除したラット脛骨を、抹消定量コンピュータ連動断層撮影（ｐＱＣＴ、ＸＣＴ−ＲＭ、Ｎｏｒｌａｎｄ／Ｓｔｒａｔｅｃ）を使用する骨鉱物密度の密度測定に供する。走査を、近位脛骨部位（近位端から離れて全長の１２％）において実施する。１つの０．５ｍｍスライスを採取する。走査を、全体として（骨全体）、または実験および内部境界の閾値図示を使用して（皮質骨）、または外側縁部から剥離することによって骨組織全体の４５％である領域として（海綿骨）分析する。次いで、骨鉱物の密度、面積および内容物を、システムソフトウェアによって決定する。偽動物と卵巣切除動物との間の差異を、各異なる時点において、ＳＡＳ統計ソフトウェア（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃｏｒｙ，ＮＣ）を使用して、両側ｔ検定によって決定する。Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ検定を、平均の統計学的比較のために使用する。０．０５未満のＰ値を、統計学的に有意とみなす。
（構築物１９４１によってコードされるアルブミン融合タンパク質の活性は、インビボ卵巣切除雌性ラットモデルを使用してアッセイされ得る。）
構築物１９４１によってコードされるＰＴＨアルブミン融合タンパク質の活性を、表題「インビボで卵巣切除された雌性ラットモデル」の下で上に記載されたインビボアッセイを使用して測定し得る。
（実施例２８：構築物ＩＤ１９４９、ＨＳＡ８４−ＨＳＡ、産生）
構築物ＩＤ１９４９（ｐＣ４．ＨＳＡ８４．Ｓ１−Ｑ８４．ＨＳＡ）は、ＰＴＨ８４−ＨＳＡ融合タンパク質をコードし、この融合タンパク質は、ＭＰＩＦリーダー配列、続いて哺乳動物発現ベクターｐＣ４にクローニングされたＨＳＡの成熟形態のアミノ末端に融合した、ＰＴＨ８４の成熟形態（すなわち、Ｓｅｒ−１〜Ｇｌｎ−８４）を含む。
（構築物１９４９についてのＰＴＨ８４ ｃＤＮＡのクローニング）
ＰＴＨ８４をコードするＤＮＡを、以下に記載されるプライマーＰＴＨ８４−３およびＰＴＨ８４−４を使用して増幅し、Ｂａｍ ＨＩ／ＳｐｅＩで切断し、そしてＢａｍ ＨＩ／ＸｂａＩ切断されたｐＣ４：ＨＳＡに連結した。構築物ＩＤ番号１９４９は、成熟ＰＴＨ８４タンパク質、続いてＨＳＡの成熟形態を含む、アルブミン融合タンパク質をコードする。
ＰＴＨ８４の成熟形態をコードするポリヌクレオチドのＰＣＲ増幅のために適切な２つのプライマー（ＰＴＨ８４−３およびＰＴＨ８４−４）を合成した。
Figure 2014043448
 ＰＴＨ８４−３は、Ｂａｍ−ＨＩクローニング部位（斜体で示される）、続いてＭＰＩＦシグナルペプチドをコードする核酸配列（下線を引いて示される）およびＰＴＨ８４の成熟形態のアミノ酸残基Ｓｅｒ−１〜Ｍｅｔ−８をコードする核酸配列（太字で示される）を含む。ＰＴＨ８４−４において、ＳｐｅＩ部位は、斜体で示され、そしてそれに続く核酸配列は、成熟ＰＴＨ８４タンパク質の最後の１０個のアミノ酸をコードするＤＮＡの逆相補体に対応する（太字で示される）。これらの２つのプライマーを使用して、ＰＴＨ８４タンパク質をＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ増幅体を精製し、Ｂａｍ ＨＩおよびＳｐｅＩで消化し、そしてＢａｍ ＨＩ／ＸｂａＩ切断されたｐＣ４：ＨＳＡに連結した。
ＰＴＨ８４−４プライマーへのＳｐｅＩクローニング部位の導入の結果として、２つのさらなるアミノ酸残基（すなわち、ＴｈｒおよびＳｅｒ）が、ＰＴＨ８４とＨＳＡとの間に存在する。
発現されたアルブミン融合タンパク質のＮ末端の、アミノ酸配列決定によるさらなる分析は、予測されたＰＴＨ８４配列の存在を確認した（以下を参照のこと）。
本発明のＰＴＨ８４アルブミン融合タンパク質は、好ましくは、ＰＴＨ８４の成熟形態（すなわち、Ｓｅｒ−１〜Ｇｌｎ−８４）のＮ末端またはＣ末端のいずれかに融合した、ＨＳＡの成熟形態（すなわち、Ａｓｐ−２５〜Ｌｅｕ−６０９）を含む。本発明の１つの実施形態において、本発明のＰＴＨ８４アルブミン融合タンパク質は、発現のために使用される宿主の分泌経路における発生期の融合ポリペプチドを方向付けるシグナル配列を、さらに含む。さらに好ましい実施形態において、シグナル配列によってコードされるシグナルペプチドが除去され、そして成熟ＰＴＨ８４アルブミン融合タンパク質が、培養培地中に直接分泌される。本発明のＰＴＨ８４アルブミン融合タンパク質は、異種シグナル配列（ＭＡＦ、ＩＮＶ、Ｉｇ、Ｆｉｂｕｌｉｎ Ｂ、Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎ、インスリン様増殖因子結合タンパク質４、改変体ＨＳＡリーダー配列（キメラＨＳＡ／ＭＡＦリーダー配列が挙げられるが、これに限定されない）、または当該分野において公知である他の異種シグナル配列が挙げられるが、これらに限定されない）を含み得る。好ましい実施形態において、本発明のＰＴＨ８４アルブミン融合タンパク質は、ネイティブＰＴＨ８４を含む。さらに好ましい実施形態において、本発明のＰＴＨ８４アルブミン融合タンパク質は、Ｎ末端メチオニン残基をさらに含む。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（フラグメントおよび／または改変体を含む）もまた、本発明に包含される。
（構築物ＩＤ１９４９の発現および精製）
（２９３Ｔ細胞における発現）
構築物１９４９を、当該分野において公知の方法（例えば、リポフェクタミントランスフェクション）によって２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、そして１００ｎＭメトトレキサートを用いて選択した（実施例６を参照のこと）。発現レベルを、抗ＨＳＡ血清を一次抗体として用いる免疫ブロット検出によって、試験した。
（２９３Ｔ細胞上清からの精製）
構築物ＩＤ番号１９４９から２９３Ｔ細胞において発現された、分泌ＰＴＨ８４−ＨＳＡ融合タンパク質を含む２９３Ｔ細胞上清を、実施例７に記載されるように精製した。具体的には、最初の捕捉を、陰イオン性ＨＱ−５０樹脂を用いて、ｐＨ７．２で、リン酸ナトリウム緩衝液（２５ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．２））および０〜０．５Ｍ ＮａＣｌの１６カラム体積の塩勾配溶出、続いてＰｈｅｎｙｌ ６５０Ｍ樹脂（Ｔｏｓｏｈａａｓ製）を用いて、３６カラム体積の２．７５〜０Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ７．２）の塩勾配溶出を使用する疎水性相互作用クロマトグラフィー（「ＨＩＣ」）を使用して実施した。ここで、サンプルは、１８０ｍＳの最終導電率を有した。このサンプルを、ＨＱ Ｐｏｒｏｓ ５０樹脂および０．１５Ｍ ＮａＣｌ増分の塩段階溶出を使用して濃縮した。最終緩衝組成物は、２５ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４＋１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．２）からなった。Ｎ末端配列決定は、ＰＴＨ８４の成熟形態のアミノ末端配列（すなわち、ＳＶＳＥＩ、配列番号２１４５）を生じた。７８ｋＤａのおよそのＭＷのタンパク質が得られた。１リットルの２９３Ｔ細胞上清あたり０．３２ｍｇのタンパク質の最終収量が得られた。
（構築物１９４９によってコードされるアルブミン融合タンパク質による、ＳａＯＳ２細胞中の環状ＡＭＰのインビトロ導入）
（結果）
構築物１９４９を発現する２９３Ｔ細胞由来の精製ＨＳＡ−ＰＴＨ８４アルブミン融合タンパク質を、副題の表題「ＳａＯＳ２細胞における環状ＡＭＰのインビトロ導入」の下で実施例２７において記載されたインビトロアッセイにおいて、試験した。ＨＳＡ−ＰＴＨ８４は、細胞内環状ＡＭＰレベルの増加を誘導した。
（構築物１９４９によってコードされるアルブミン融合タンパク質の活性は、ＴＰＴＸ動物を使用してアッセイされ得る。）
構築物１９４９によってコードされるＰＴＨアルブミン融合タンパク質の活性を、ＴＰＴＸ動物、および副節の表題「インビボ：ＴＰＴＸ動物におけるカルシウムの誘導された放出」の下で実施例２７に記載されたインビボアッセイを使用して、測定し得る。
（構築物１９４９によってコードされるアルブミン融合タンパク質の活性は、インビボで卵巣切除された雌性ラットモデルを使用してアッセイされ得る。）
構築物１９４９によってコードされるＰＴＨアルブミン融合タンパク質の活性を、ＴＰＴＸ動物、および副節の表題「インビボで卵巣切除された雌性ラットモデル」の下で実施例２７に記載されたインビボアッセイを使用して、測定し得る。
（実施例２９：構築物ＩＤ２０２１、ＰＴＨ８４−ＨＳＡ、産生）
構築物ＩＤ２０２１（ｐＣ４．ＰＴＨ８４．Ｓ１−Ｑ８４．ＨＳＡ）は、ＰＴＨ８４−ＨＳＡ融合タンパク質をコードし、この融合タンパク質は、ネイティブＨＳＡリーダー配列、続いて哺乳動物発現ベクターｐＣ４にクローニングされたＨＳＡの成熟形態のアミノ末端に融合した、ＰＴＨ８４の成熟形態（すなわち、Ｓｅｒ−１〜Ｇｌｎ−８４）を含む。
（構築物２０２１についてのＰＴＨ８４ ｃＤＮＡのクローニング）
ＰＴＨ８４をコードするＤＮＡを、以下に記載されるプライマーＰＴＨ８４−５およびＰＴＨ８４−６を使用して増幅し、Ｘｈｏ Ｉ／Ｃｌａ Ｉで切断し、そしてＸｈｏ Ｉ／Ｃｌａ Ｉ切断されたｐＣ４：ＨＳＡに連結した。構築物ＩＤ番号２０２１は、成熟ＰＴＨ８４タンパク質、続いてＨＳＡの成熟形態を含む、アルブミン融合タンパク質をコードする（実施例５を参照のこと）。
ＰＴＨ８４の成熟形態をコードするポリヌクレオチドのＰＣＲ増幅のために適切な２つのプライマー（ＰＴＨ８４−５およびＰＴＨ８４−６）を合成した。
Figure 2014043448
 ＰＴＨ８４−５は、Ｘｈｏ Ｉクローニング部位（斜体で示される）を組み込む。Ｘｈｏ Ｉ部位は、それに続く核酸配列（下線を引いて示される）と組み合わせられて、ＨＳＡのキメラシグナルペプチドの最後の４つのアミノ酸残基をコードする。太字の核酸配列は、ＰＴＨ８４の成熟形態のアミノ酸残基Ｓｅｒ−１〜Ａｓｎ−１０をコードする。ＰＴＨ８４−６において、Ｃｌａ Ｉ部位は、斜体で示され、そしてそれに続く核酸配列（下線を引いて示される）は、ＨＳＡの成熟形態の最初の１０個のアミノ酸をコードするＤＮＡの逆相補体に対応する。ＰＴＨ８４−６において太字で強調される核酸配列は、ＰＴＨ８４の成熟形態の最後の１１個のアミノ酸をコードするＤＮＡの逆相補体に対応する。これらの２つのプライマーを使用して、ＰＴＨ８４タンパク質をＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ増幅体を精製し、Ｘｈｏ ＩおよびＣｌａ Ｉで消化し、そしてＸｈｏ Ｉ／Ｃｌａ Ｉ切断されたｐＣ４：ＨＳＡに連結した。
さらに、発現されたアルブミン融合タンパク質のＮ末端の、アミノ酸配列決定による分析は、予測されたＰＴＨ８４配列の存在を確認し得る（以下を参照のこと）。
本発明のＰＴＨ８４アルブミン融合タンパク質は、好ましくは、ＰＴＨ８４の成熟形態（すなわち、Ｓｅｒ−１〜Ｇｌｎ−８４）のＮ末端またはＣ末端のいずれかに融合した、ＨＳＡの成熟形態（すなわち、Ａｓｐ−２５〜Ｌｅｕ−６０９）を含む。本発明の１つの実施形態において、本発明のＰＴＨ８４アルブミン融合タンパク質は、発現のために使用される宿主の分泌経路における発生期の融合ポリペプチドを方向付けるシグナル配列を、さらに含む。さらに好ましい実施形態において、シグナル配列によってコードされるシグナルペプチドが除去され、そして成熟ＰＴＨ８４アルブミン融合タンパク質が、培養培地中に直接分泌される。本発明のＰＴＨ８４アルブミン融合タンパク質は、異種シグナル配列（ＭＡＦ、ＩＮＶ、Ｉｇ、Ｆｉｂｕｌｉｎ Ｂ、Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎ、インスリン様増殖因子結合タンパク質４、改変体ＨＳＡリーダー配列（キメラＨＳＡ／ＭＡＦリーダー配列が挙げられるが、これに限定されない）、または当該分野において公知である他の異種シグナル配列が挙げられるが、これらに限定されない）を含み得る。好ましい実施形態において、本発明のＰＴＨ８４アルブミン融合タンパク質は、ネイティブＰＴＨ８４を含む。さらに好ましい実施形態において、本発明のＰＴＨ８４アルブミン融合タンパク質は、Ｎ末端メチオニン残基をさらに含む。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（フラグメントおよび／または改変体を含む）もまた、本発明に包含される。
（構築物ＩＤ２０２１の発現および精製）
（２９３Ｔ細胞における発現）
構築物２０２１を、当該分野において公知の方法（例えば、リポフェクタミントランスフェクション）によって２９３Ｔ細胞細胞にトランスフェクトし得、そして１００ｎＭメトトレキサートで選択し得る（実施例６を参照のこと）。発現レベルを、１次抗体として抗ＨＳＡ血清を用いた免疫ブロット検出によって試験し得る。
（２９３Ｔ細胞上清からの精製）
２９３Ｔ細胞中で構築物ＩＤ番号２０２１から発現した分泌性ＰＴＨ８４−ＨＳＡ融合タンパク質を含む２９３Ｔ細胞上清を、実施例７で記載するように精製し得る。特に、サンプルが１８０ｍＳの最終伝導性を有する場合、初期の捕捉を、陰イオンＨＱ−５０樹脂でｐＨ７．２でリン酸ナトリウム緩衝液（２５ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．２））および１６倍のカラム容量の０〜０．５Ｍ ＮａＣｌの塩勾配溶離を使用して実行し得、そのあと３６倍のカラム容量の２．７５〜０Ｍ ＮａＣｌの塩勾配溶離をｐＨ７．２で使用するＰｈｅｎｙｌ６５０Ｍ樹脂（Ｔｏｓｏｈａａｓから）での疎水的相互作用クロマトグラフィー、「ＨＩＣ」を行う。サンプルを、ＨＱ Ｐｏｒｏｓ ５０樹脂および０．１５ｍＭの増加ＮａＣｌの塩段階溶離を使用して濃縮し得る。最終的な緩衝組成は、２５ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４＋１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．２）からなり得る。Ｎ末端の配列決定は、ＰＴＨ８４の成熟形態のアミノ末端配列（すなわち、ＳＶＳＥＩ）を生じるはずである。およそＭＷが７８ｋＤａのタンパク質が得られるはずである。
（構築物２０２１によってコードされるアルブミン融合タンパク質によるＳａＯＳ２細胞におけるサイクリックＡＭＰのインビトロ誘導）
構築物２０２１を発現する２９３Ｔ細胞に由来するＨＳＡ−ＰＴＨ８４アルブミン融合タンパク質を、表題「ＳａＳＯ２細胞におけるサイクリックＡＭＰのインビトロ誘導」の下で、実施例２７において記載するインビトロアッセイにおいて試験し得る。
（構築物２０２１によってコードされるアルブミン融合タンパク質の活性を、ＴＰＴＸ動物を使用してアッセイし得る）
構築物２０２１によってコードされるＰＴＨアルブミン融合タンパク質の活性を、表題「インビボ：ＴＰＴＸ動物におけるカルシウムの誘導放出」の下で実施例２７において記載するＴＰＴＸ動物およびインビボアッセイを使用して測定し得る。
（構築物２０２１によってコードされるアルブミン融合タンパク質の活性を、インビボで卵巣摘出された雌性ラットモデルを使用してアッセイし得る）
構築物２０２１によってコードされるＰＴＨアルブミン融合タンパク質の活性は、表題「インビボで卵巣摘出された雌性ラットモデル」の下で実施例２７において記載するインビボアッセイを使用して測定し得る。
（実施例３０：ＰＴＨ８４アルブミン融合タンパク質についての指標）
上述したインビトロおよびインビボアッセイからの結果は、ＰＴＨ８４アルブミン融合タンパク質が骨粗鬆症、悪性の高カルシウム血症、およびパジェット病の処置、予防、および／または診断のために有用であることを示す。
（実施例３１：構築物ＩＤ２２４９（ＩＦＮａ２−ＨＳＡ）生成）
構築物ＩＤ２２４９（ｐＳＡＣ３５：ＩＦＮａ２．ＨＳＡ）は、酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ発現ベクターｐＳＡＣ３５においてＨＳＡの成熟形態のアミノ酸末端に融合した、ＨＳＡキメラリーダー配列、続くＩＦＮａ２タンパク質の成熟形態（すなわち、Ｃ１−Ｅ１６５）を有するＩＦＮａ２アルブミン融合タンパク質をコードするＤＮＡを含む。
（ＩＦＮａ２ ｃＤＮＡのクローニング）
ＩＦＮａ２をコードするポリヌクレオチドを、以下に記載するプライマーＩＦＮａ２−１およびＩＦＮａ２−２を使用してＰＣＲ増幅した。このＰＣＲ増幅物をＳａｌＩ／ＣｌａＩで切断し、そしてＸｈｏＩ／ＣｌａＩ切断したｓＰｃＣＨＳＡにライゲーションした。構築物ＩＤ番号２２４９は、ＨＳＡのキメラリーダー配列、ＩＦＮａ２の成熟形態、続く成熟ＨＳＡタンパク質を含むアルブミン融合タンパク質をコードする。
成熟形態ＩＦＮａ２、ＩＦＮａ２−１およびＩＦＮａ２−２をコードするポリヌクレオチドのＰＣＲ増幅に適切な２つのオリゴヌクレオチドを合成した；
Figure 2014043448
 ＩＦＮａ２−１プライマーは、ＳａｌＩクローニング部位（下線で示される）、キメラＨＳＡリーダー配列の最後の３個のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド、およびＩＦＮａ２の成熟形態の最初の７個のアミノ酸残基をコードする２２ヌクレオチド（太字で示される）を組み込む。ＩＦＮａ２−２において、ＣｌａＩ部位（下線で示される）およびそれに続くＤＮＡは、成熟ＨＳＡタンパク質の最初の１０個のアミノ酸をコードするＤＮＡの逆相補鎖であり、そして最後の２２個のヌクレオチド（太字で示される）は、ＩＦＮａ２の最後の７個のアミノ酸をコードするＤＮＡの逆相補鎖である（実施例２を参照のこと）。ＩＦＮａ２−ＨＳＡのＰＣＲ増幅物をこれらのプライマーを使用して生成し、精製し、ＳａｌＩおよびＣｌａＩ制限酵素で消化し、そしてｐＳｃＣＨＳＡベクターのＸｈｏＩおよびＣｌａＩ部位でクローニングした。配列を確認した後、このＩＦＮａ２アルブミン融合タンパク質をコードする発現カセットはＮｏｔＩで消化したｐＳＡＣ３５にサブクローニングした。
さらに、アミノ酸配列決定による、発現したアルブミン融合タンパク質のＮ末端の分析は、予想されるＩＦＮａ２配列の存在を確認し得る（以下の参照）。
異なるリーダー配列を使用する他のＩＦＮａ２アルブミン融合タンパク質を、当該分野において公知の方法によって構築してきた（実施例２を参照のこと）。種々のリーダー配列の例としては、インベルターゼ「ＩＮＶ」（構築物２３４３および２４１０）および交配接合α因子「ＭＡＦ］（構築物２３６６）が挙げられるが、これらに限定されない。これらのＩＦＮａ２アルブミン融合タンパク質を以前に記載したようなｐＣ４（構築物２３８２）およびｐＥＥ１２．１のような哺乳動物発現ベクターにサブクローニングし得る（実施例５を参照のこと）。ＨＳＡにＣ末端を融合させた治療部分を有するＩＦＮａ２アルブミン融合タンパク質をまた構築し得る（構築物２３８１）。
本発明のＩＦＮａ２アルブミン融合タンパク質は、好ましくは、ＩＦＮａ２の成熟形態（すなわち、Ｃｙｓ−１〜Ｇｌｕ−１６５）のＮ末端またはＣ末端のいずれかに融合した、ＨＳＡの成熟形態（すなわち、Ａｓｐ−２５〜Ｌｅｕ−６０９）を含む。本発明の１つの実施形態において、本発明のＩＦＮａ２アルブミン融合タンパク質は、さらに、発現のために使用される宿主の分泌経路に初期の（初期の）融合ポリペプチドを指示するシグナル配列を含む。さらに好ましい実施形態において、シグナル配列によってコードされるシグナルペプチドを除去し、そして成熟ＩＦＮａ２アルブミン融合タンパク質が培養培地中に直接分泌される。本発明のＩＦＮａ２アルブミン融合タンパク質は、当該分野で公知の異種シグナル配列（ＭＡＦ、ＩＮＶ、Ｉｇ、フィブリンＢ、クラステリン（Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎ）、インスリン様成長因子結合タンパク質４、ＨＳＡリーダー配列改変体（キメラＨＳＡ／ＭＡＦリーダー配列が挙げられるが、これに限定されない）が挙げられるが、これらに限定されない）または他の異種シグナル配列を含み得る。好ましい実施形態において、本発明のＩＦＮａ２アルブミン融合タンパク質は、ネイティブのＩＦＮａ２を含む。さらに好ましい実施形態において、本発明のＩＦＮａ２アルブミン融合タンパク質は、さらにＮ末端メチオニン残基を含む。これらのポリペプチド（フラグメントおよび／または改変体を含む）をコードするポリヌクレオチドがまた、本発明によって含まれる。
（構築物ＩＤ２２４９の発現および精製）
（酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける発現）
構築物２２４９の、酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＢＸＰ１０での形質転換を、当該分野で公知の方法によって実行した（実施例３を参照のこと）。細胞を７２時間の増殖後、定常期に回収し得る。上清を、細胞を３０００ｇで１０分間不純物除去することで回収する。発現レベルを、抗ＨＳＡ血清（Ｋｅｎｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で、またはこの１次抗体として免疫ブロット検出によって試験し得る。およそ８８．５ｋＤａの分子量のＩＦＮａ２アルブミン融合タンパク質を回収し得る。
（酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞上清からの精製）
酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞において構築物ＩＤ番号２２４９から発現したＩＦＮａ２アルブミン融合タンパク質を含む細胞上清を、Ｄｙａｘペプチドアフィニティカラム上で小スケールで（実施例４を参照のこと）、または以下の５ステップ：ダイアフィルトレーション、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラムを使用する陰イオン交換クロマトグラフィー、Ｂｕｔｙｌ ６５０Ｓカラムを使用する疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ ＦｌｏｗカラムまたはＢｌｕｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィーを使用する陽イオン交換クロマトグラフィー、およびＱ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｍａｎｃｅカラムクロマトグラフィーを使用する高性能クロマトグラフィーによる大スケール（実施例４を参照のこと）のいずれかで精製し得る。ＩＦＮａ２アルブミン融合タンパク質を、１００〜２５０ｍＭ ＮａＣｌでＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラムから、１５０〜２５０ｍＭ ＮａＣｌでＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラムから、および５〜７．５ｍＳ／ｃｍでＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅカラムから溶出し得る。Ｎ末端の配列決定は、ＩＦＮａ２の成熟形態に対応する配列ＣＤＬＰＱ（配列番号２１４６）を生じるはずである。
（ＩＦＮａ２の活性を、インビトロＩＳＲＥ−ＳＥＡＰアッセイを使用してアッセイし得る）
（方法）
構築物ＩＤ番号２２４９によってコードされるＩＦＮａ２アルブミン融合タンパク質を、実施例２５において前もって記載したようなＩＳＲＥ−ＳＥＡＰアッセイにおいて、活性について試験し得る。簡単に言えば、ＩＳＲＥ−ＳＥＡＰ／２９３Ｆレポーター細胞株に対してＩＳＲＥシグナル伝達を指向する能力について、馴化酵母上清を１：１０００の希釈で試験した。ＩＳＲＥ−ＳＥＡＰ／２９３Ｆレポーター細胞を、処理１日前に、３×１０４細胞／ウェルで９６ウェルのポリ−Ｄ−リジンでコートされたプレート中にプレーティングした。次いで、ＳＥＡＰ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ｇｅｎｅ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ａｓｓａｙ（Ｒｏｃｈｅカタログ番号１７７９８４２）における使用のために４０μＬを除去する前に、レポーター細胞を１８時間または２４時間インキュベートした。組み換えヒトＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎβ「ｒｈＩＦＮｂ」（Ｂｉｏｇｅｎ）を、陽性コントロールとして使用した。
（結果）
ＩＦＮａ２−ＨＳＡの精製された調製物は、ＩＳＲＥ−ＳＥＡＰアッセイにおいて、１０−１〜１０１ｎｇ／ｍＬ（図１５を参照のこと）または１０−１０〜１０−８ｎｇ／ｍＬ（図１６を参照のこと）の範囲にある濃度にわたって比較的直線的な増加を証明した。
（構築物ＩＤ２２４９によってコードされるインターフェロンα融合物によるＯＡＳのインビボ誘導）
（方法）
ＯＡＳ酵素（２’−５’−オリゴアデニレートシンテターゼ）を、抗ウイルス感染に応じてインターフェロンによって、転写レベルで活性化する。インターフェロン構築の効果
を、処置したサルから血液サンプルを回収すること、およびこれらのサンプルを２つのＯＡＳ ｍＲＮＡ（ｐ４１およびｐ６９）の転写活性について分析することによって測定し得る。０．５ｍＬ容量の全血を、１群あたり４頭の動物から７つの異なる時間点（１匹の動物あたり、０日目、１日目、２日目、４日目、８日目、１０日目、および１４日目）で回収した。種々の群は、ビヒクルコントロール（１日目に３０μｇ／ｋｇのＨＳＡ−ＩＦＮの静脈注射、１日目に３０μｇ／ｋｇのＨＳＡ−ＩＦＮの皮下注射、１日目に３００μｇ／ｋｇのＨＳＡ−ＩＦＮの皮下注射）、ならびに陽性コントロールとして、１日目、３日目、および５日目に４０μｇ／ｋｇのインターフェロンα（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ）の皮下注射を含む。ｐ４１およびｐ６９のｍＲＮＡ転写物のレベルを、ｐ４１−ＯＡＳおよびｐ６９−ＯＡＳに特異的なプローブを使用するリアルタイム定量ＰＣＲ（Ｔａｑｍａｎ）によって決定した。ＯＡＳのｍＲＮＡレベルを、１８ＳリボソームＲＮＡ内因性制御と比較して定量した。構築物２２４９によってコードされるアルブミン融合タンパク質を類似の実験に供し得る。
（結果）
ｐ４１ＯＡＳおよびｐ６９ＯＡＳの両方についてのｍＲＮＡ転写レベルにおける有意な増加が、ＩＦＮａを処置したサルとは対照的にＨＳＡ−インターフェロンを処置したサルにおいて観察された（ｐ４１のデータについて図１７を参照のこと）。効果は１０日近く続いた。
（実施例３２：ＩＦＮａ２アルブミン融合タンパク質についての指標）
多発性硬化症を処置し、予防し、改善し、そして／または検出するためにＩＦＮαアルブミン融合タンパク質（構築物２２４９、２３４３、２４１０、２３６６、２３８２、および２３８１によってコードされるタンパク質を含むが、これらに限定されない）を使用し得る。他の指標としては、Ｃ型肝炎、腫瘍学での使用、癌、肝炎、ヒトパピローマウイルス、線維筋腫症、シェーグレン症候群、ヘアリーセル白血病、慢性骨髄性白血病、ＡＩＤＳ関連のカポージ肉腫、慢性Ｂ型肝炎、悪性黒色腫、非ホジキンリンパ種、外部尖圭コンジローム、ＨＩＶ感染、小細胞肺癌、血液学的な悪性疾患、単純ヘルペスウイルス感染、多発性硬化症、ウイルス性出血熱、固形腫瘍、腎臓癌、骨髄傷害、骨傷害、膀胱癌、胃癌、Ｄ型肝炎、多発性骨髄腫、Ｉ型糖尿病、ウイルス感染、皮膚型Ｔ細胞リンパ腫、子宮頚部形成異常、慢性疲労症候群、および腎臓癌が挙げられるが、これらに限定されない。
好ましくは、ＩＦＮα−アルブミン融合タンパク質またはＩＦＮハイブリッド融合タンパク質は、ＣＣＲ５アンタゴニストとの組み合わせ、さらに、少なくとも１つのリバビリン、ＩＬ−２、ＩＬ−１２と関連して、処置が施されていない成人患者および小児患者ならびに処置が施された成人患者および小児患者におけるＨＩＶ−１感染、ＨＣＶ、またはＨＩＶ−１とＨＣＶの共感染の処置のための薬剤の調製のために、ペンタフサイド（ｐｅｎｔａｆｕｓｉｄｅ）単独または抗ＨＩＶ薬物治療（例えば、ＨＡＡＲＴ）との組み合わせで投与される。
（実施例３３：構築物ＩＤ２２５０（ＨＳＡ−インスリン（ＧＹＧ））生成）
構築物ＩＤ２２５０（ｐＳＡＣ３５．ＨＳＡ．ＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＹＧ）．Ｆ１−Ｎ６２）は、酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ発現ベクターｐＳＡＣ３５にクローニングした３２位のＴｙｒで合成一本鎖で長時間作用型のインスリンアナログ（ＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＹ３２Ｇ））のアミノ末端に融合した全長のＨＳＡ（ネイティブなＨＳＡリーダー配列を含む）を含む、ＨＳＡ−ＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＹＧ）融合タンパク質をコードする。
（構築物２２５０のためのＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＹＧ）ｃＤＮＡのクローニング）
ＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＹＧ）の合成一本形態をコードするＤＮＡを、４つの重複するプライマーを使用してＰＣＲ合成した。プロインスリンのプロセシングの必要性を除去し、そして正確な一本鎖タンパク質の折り畳みを確実にするために、プロインスリンｃＤＮＡの中間領域のＣペプチドに対応する配列を、インスリン成長因子１（「ＩＧＦ−１」）のＣドメイン（ＧＹ３２ＧＳＳＳＲＲＡＰＱＴ、配列番号２１４７）によって置換した。配列は酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける発現のためにコドン最適化した。このＰＣＲフラグメントを消化し、そしてＢｓｕ３６１／ＡｓｃＩで消化したｐＳｃＮＨＳＡにサブクローニングした。次いで、ＮｏｔＩフラグメントをｐＳＡＣ３５プラスミドにサブクローニングした。構築物ＩＤ番号２２５０は、合成一本鎖形態のＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＹＧ）のアミノ末端に融合した全長ＨＳＡ（ネイティブなＨＳＡリーダー配列を含む）をコードする。
ＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＹＧ）、ＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＹＧ）−１およびＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＹＧ）−２の合成一本鎖形態をコードするポリヌクレオチドのＰＣＲ増幅に適切な４つの重複するオリゴヌクレオチドの５’プライマーおよび３’プライマーを合成した：
Figure 2014043448
 ＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＹＧ）−１は、Ｂｓｕ３６Ｉクローニング部位（イタリック体で示される）を組み込み、そしてＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＹＧ）の合成一本鎖形態のＯＲＦの最初の２１個のアミノ酸（太字で示される）をコードする。ＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＹＧ）−２において、イタリック体にした配列は、ＡｓｃＩ部位である。ＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＹＧ）−２において、太字にされた配列は、ＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＹＧ）の合成一本鎖形態のアミノ酸残基Ｃｙｓ−４９〜Ａｓｎ−６３をコードする最後の４９個のヌクレオチドの逆相補鎖である。これらの２つのプライマーで、ＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＹＧ）の合成一本鎖形態をＰＣＲ増幅した。それぞれ特異的なプライマー対およびテンプレートについてのアニーリング温度および時間ならびに伸長温度および時間を、経験的に決定しなければならない。
ＰＣＲ産物を精製し（例えば、Ｗｉｚａｒｄ ＰＣＲ Ｐｒｅｐｓ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ）を使用して）、ついでＢｓｕ３６ＩおよびＡｓｃＩで消化した。ゲル電気泳動によるＢｓｕ３６Ｉ−ＡｓｃＩフラグメントのさらなる精製後、この産物をＢｓｕ３６Ｉ／ＡｓｃＩで消化したｐＳｃＮＨＳＡにクローニングした。さらにＮｏｔＩフラグメントをｐＳＡＣ３５にサブクローニングして、構築物ＩＤ番号２２５０を得た。
アミノ酸配列決定による発現したアルブミン融合タンパク質のＮ末端のさらなる分析は、予想される成熟ＨＳＡ配列の存在を確認するはずである（以下を参照のこと）。
本発明のＩＮＳＵＬＩＮアルブミン融合タンパク質は、好ましくは、ＩＮＳＵＬＩＮの合成一本鎖アナログ（すなわち、Ｐｈｅ−１〜Ａｓｎ−６２）のＮ末端またはＣ末端のいずれかに融合するＨＳＡの成熟形態（すなわち、Ａｓｐ−２５〜Ｌｅｕ−６０９）を含む；プロインスリンｃＤＮＡの中間領域のＣペプチドに対応する配列を、インスリン成長因子１（「ＩＧＦ−１」）のＣドメイン（ＧＹ３２ＧＳＳＳＲＲＡＰＱＴ、配列番号２１４７）によって置換した。本発明の１つの実施形態において、本発明のＩＮＳＵＬＩＮアルブミン融合タンパク質は、さらに、発現のために使用する宿主の分泌経路に初期の融合ポリペプチドを指向するシグナル配列を含む。さらに好ましい実施形態において、シグナル配列によってコードされるシグナルペプチドを除去し、そして成熟ＩＮＳＵＬＩＮアルブミン融合タンパク質が培養培地中に直接分泌される。本発明のＩＮＳＵＬＩＮアルブミン融合タンパク質は、異種シグナル配列（ＭＡＦ、ＩＮＶ、Ｉｇ、フィブリンＢ、クラステリン、インスリン様成長因子結合タンパク質４、ＨＳＡリーダー配列改変体（キメラＨＳＡ／ＭＡＦリーダー配列が挙げられるが、これに限定されない）が挙げられるが、これらに限定されない）または当該分野において公知の他の異種シグナル配列を含み得る。好ましい実施形態において、本発明のＩＮＳＵＬＩＮアルブミン融合タンパク質は、ネイティブのＩＮＳＵＬＩＮを含む。さらに好ましい実施形態において、本発明のＩＮＳＵＬＩＮアルブミン融合タンパク質は、さらにＮ末端メチオニン残基を含む。これらのポリペプチド（フラグメントおよび／または改変体を含む）をコードするポリヌクレオチドがまた、本発明によって含まれる。
（構築物ＩＤ２２５０の発現および精製）
（酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける発現）
構築物２２５０を、当該分野において公知の方法によって酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで形質転換し得る（実施例３を参照のこと）。発現レベルを、１次抗体として抗ＨＳＡ血清を用いる免疫ブロット検出法によって試験し得る。
（酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞上清からの精製）
酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて、構築物ＩＤ番号２２５０から発現した分泌性のＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＹＧ）アルブミン融合タンパク質を含む細胞上清を、実施例４において記載したように精製し得る。このアルブミン融合タンパク質のＮ末端配列決定は、ＨＳＡの成熟形態のアミノ末端に対応する配列ＤＡＨＫＳ（配列番号２１４３）を生じるはずである。
（構築物２２５０によってコードされるアルブミン融合タンパク質の存在下でのインビトロでの［３Ｈ］−２−デオキシグルコース取り込みアッセイ）
（方法）
構築物２２５０によってコードされるＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＹＧ）アルブミン融合タンパク質の存在下での３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞中の糖の取り込みを測定するためのインビトロアッセイを、実施例４１において以下に記載したように実行した。ＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＹＧ）アルブミン融合タンパク質を試験するために使用され得る当該分野において公知の他のアッセイとしては、グリコーゲン合成キナーゼ−３（ＧＳＫ−３）を介するＬ６ラット筋芽細胞増殖アッセイならびにラットリンゴ酸デヒドロゲナーゼプロモーター（ｒＭＥＰ）−ＳＥＡＰレポーター、ステロール調節エレメント結合タンパク質（ＳＲＥＢＰ）−ＳＥＡＰレポーター，脂肪酸合成（ＦＡＳ）−ＳＥＡＰレポーター、およびホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）−ＳＥＡＰレポーターを含むＨＡＩＩｅレポーターアッセイ（実施例４８を参照のこと）が挙げられるが、これらに限定されない。
（結果）
構築物２２５０によってコードされるインスリンアルブミン融合タンパク質を発現する形質転換された酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに由来する上清は、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞における糖の取り込み／輸送活性を証明した（図１８を参照のこと）。
（構築物２２５０によってコードされるアルブミン融合タンパク質の存在下での、インビトロ膵臓細胞株の増殖アッセイ）
（方法）
構築物２２５０によってコードされるＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＹＧ）アルブミン融合タンパク質の存在下で管上皮膵臓ＡＲＩＰ細胞株のインスリン産生β細胞への分化および増殖を測定し、そして／またはインスリン産生ＲＩＮ−Ｍβ細胞株の増殖を測定するためのインビトロアッセイを、表題「実施例４２：膵臓細胞株への［３Ｈ］チミジン取り込みのインビトロでのアッセイ」の下で以下に記載するように実行し得る。
（構築物２２５０によってコードされるアルブミン融合タンパク質の活性を、糖尿病ＮＯＤおよび／またはＮＩＤＤＭマウスモデルを使用してインビボでアッセイし得る）
構築物２２５０によってコードされるＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＹＧ）アルブミン融合タンパク質の活性を、表題「実施例４４：ＮＯＤマウスにおける糖尿病の発生」、「実施例４５：ＮＯＤマウスの組織学的実験」、および「実施例４７：ＮＩＤＤＭのインビボマウスモデル」の下で以下に記載するＮＯＤおよび／またはＮＩＤＤＭマウスモデルを使用して測定し得る。
（実施例３４：構築物ＩＤ２２５５（インスリン（ＧＹＧ）−ＨＳＡ）生成）
構築物ＩＤ２２５５（ｐＳＡＣ３５．ＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＹＧ）．Ｆ１−Ｎ６２．ＨＳＡ）は、酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ発現ベクターｐＳＡＣ３５にクローニングした３２位のＴｙｒで合成一本鎖で長時間作用型のインスリンアナログ（ＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＹ３２Ｇ））のアミノ末端に融合し、これは、次にＨＳＡの成熟形態に融合されたＨＳＡのＨＳＡキメラリーダー配列を含み、ＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＹＧ）−ＨＳＡ融合タンパク質をコードする。
（構築物２２５５のためのＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＹＧ）ｃＤＮＡのクローニング）
ＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＹＧ）の合成一本鎖形態をコードするＤＮＡを、４つの重複するプライマーを使用してＰＣＲ生成した。プロインスリンのプロセシングの必要性を除去し、そして正確な一本鎖タンパク質の折り畳みを確実にするために、プロインスリンｃＤＮＡの中間領域のＣペプチドに対応する配列をインスリン成長因子１（「ＩＧＦ−１」）のＣドメイン（ＧＹ３２ＧＳＳＳＲＲＡＰＱＴ、配列番号２１４７）によって置換した。配列は酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける発現のためにコドン最適化した。このＰＣＲフラグメントをＳａｌＩ／ＣｌａＩで消化し、そしてＸｈｏＩ／ＣｌａＩで消化したｐＳｃＣＨＳＡにサブクローニングした。次いで、ＮｏｔＩフラグメントをｐＳＡＣ３５プラスミドにサブクローニングした。構築物ＩＤ番号２２５０は、合成一本鎖形態のＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＹＧ）のアミノ末端に融合したＨＳＡのキメラリーダー配列をＨＳＡの成熟形態に続いてコードする。
ＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＹＧ）、ＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＹＧ）−３およびＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＹＧ）−４の合成一本鎖形態をコードするポリヌクレオチドのＰＣＲ増幅に適切な４つの重複するオリゴヌクレオチドの５’プライマーおよび３’プライマーを合成した：
Figure 2014043448
 ＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＹＧ）−３は、ＳａｌＩクローニング部位（イタリック体で示される）およびＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＹＧ）の合成一本鎖形態のＯＲＦの最初の２１個のアミノ酸（太字で示される）をコードするＤＮＡを組み込む。ＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＹＧ）−４において、イタリック体化された配列は、ＣｌａＩ部位であり；そしてこのＣｌａＩ部位およびそれに続くＤＮＡは、成熟ＨＳＡタンパク質の最初の１０個のアミノ酸をコードするＤＮＡの逆相補鎖である。太字にされた配列は、ＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＹＧ）の合成一本鎖形態の最後の１５個のアミノ酸残基Ｃｙｓ−４９〜Ａｓｎ−６３をコードする４６個のヌクレオチドの逆相補鎖である。これらの２つのプライマーで、ＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＹＧ）の合成一本鎖形態を、アニーリング、アニーリングされたプライマーの伸長、ＳａｌＩおよびＣｌａＩでの消化、およびＸｈｏＩ／ＣｌａＩで消化したｐＳｃＣＨＳＡへのサブクローニングによって生成した。次いで、このクローン由来のＮｏｔＩフラグメントをｐＳＡＣ３５のＮｏｔＩ部位にライゲーションして、構築物ＩＤ２２５５を生成した。構築物ＩＤ番号２２５５は、キメラリーダー配列、ＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＹＧ）の合成一本鎖、およびＨＳＡの成熟形態を含むアルブミン融合タンパク質をコードする。
アミノ酸配列決定による、発現したアルブミン融合タンパク質のＮ末端のさらなる分析は、予想されるＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＹＧ）配列の存在を確認するはずである（以下を参照のこと）。
本発明のＩＮＳＵＬＩＮアルブミン融合タンパク質は、好ましくは、ＩＮＳＵＬＩＮの合成一本鎖アナログ（すなわち、Ｐｈｅ−１〜Ａｓｎ−６２）のＮ末端またはＣ末端のいずれかに融合するＨＳＡの成熟形態（すなわち、Ａｓｐ−２５〜Ｌｅｕ−６０９）を含む；プロインスリンｃＤＮＡの中間領域のＣペプチドに対応する配列を、インスリン成長因子１（「ＩＧＦ−１」）のＣドメイン（ＧＹ３２ＧＳＳＳＲＲＡＰＱＴ、配列番号２１４７）によって置換した。本発明の１つの実施形態において、本発明のＩＮＳＵＬＩＮアルブミン融合タンパク質は、さらに、発現のために使用する宿主の分泌経路に初期の融合ポリペプチドヲ指向するシグナル配列を含む。さらに好ましい実施形態において、シグナル配列によってコードされるシグナルペプチドを除去し、そして成熟ＩＮＳＵＬＩＮアルブミン融合タンパク質が培養培地中に直接分泌される。本発明のＩＮＳＵＬＩＮアルブミン融合タンパク質は、異種シグナル配列（ＭＡＦ、ＩＮＶ、Ｉｇ、フィブリンＢ、クラステリン、インスリン様成長因子結合タンパク質４、ＨＳＡリーダー配列改変体（キメラＨＳＡ／ＭＡＦリーダー配列が挙げられるが、これに限定されない）が挙げられるが、これらに限定されない）または当該分野において公知の他の異種シグナル配列を含み得る。好ましい実施形態において、本発明のＩＮＳＵＬＩＮアルブミン融合タンパク質は、ネイティブのＩＮＳＵＬＩＮを含む。さらに好ましい実施形態において、本発明のＩＮＳＵＬＩＮアルブミン融合タンパク質は、さらにＮ末端メチオニン残基を含む。これらのポリペプチド（フラグメントおよび／または改変体を含む）をコードするポリヌクレオチドがまた、本発明によって含まれる。
（構築物ＩＤ２２５５の発現および精製）
（酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける発現）
構築物２２５５を、当該分野において公知の方法によって酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで形質転換し得る（実施例３を参照のこと）。発現レベルを、１次抗体として抗ＨＳＡ血清を用いる免疫ブロット検出法によって試験し得る。
（酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞上清からの精製）
酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて、構築物ＩＤ番号２２５５から発現した分泌性のＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＹＧ）アルブミン融合タンパク質を含む細胞上清を、実施例４において記載するように精製し得る。この発現しそして精製したアルブミン融合タンパク質のＮ末端配列決定は、合成一本鎖形態で長時間作用型のインスリンアナログ（ＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＹ３２Ｇ））のアミノ末端に対応するＦＶＮＱＨを生じるはずである。
（構築物２２５５によってコードされるアルブミン融合タンパク質の存在下でのインビトロでの［３Ｈ］−２−デオキシグルコース取り込みアッセイ）
（方法）
構築物２２５５によってコードされるＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＹＧ）アルブミン融合タンパク質の存在下での３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞中の糖の取り込みを測定するためのインビトロアッセイを、実施例４１において以下に記載するように実行した。ＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＹＧ）アルブミン融合タンパク質を試験するために使用され得る当該分野において公知の他のアッセイとしては、グリコーゲン合成キナーゼ−３（ＧＳＫ−３）を介するＬ６ラット筋芽細胞増殖アッセイならびにラットリンゴ酸酵素プロモーター（ｒＭＥＰ）−ＳＥＡＰレポーター、ステロール調節エレメント結合タンパク質（ＳＲＥＢＰ）−ＳＥＡＰレポーター，脂肪酸合成（ＦＡＳ）−ＳＥＡＰレポーター、およびホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）−ＳＥＡＰレポーターを含むＨ４ＩＩｅレポーターアッセイ（実施例４８を参照のこと）が挙げられるが、これらに限定されない。
（構築物２２５５によってコードされるアルブミン融合タンパク質の存在下での、インビトロ膵臓細胞株の増殖アッセイ）
（方法）
構築物２２５５によってコードされるＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＹＧ）アルブミン融合タンパク質の存在下で管上皮膵臓ＡＲＩＰ細胞株のインスリン産生β細胞への分化および増殖を測定し、そして／またはインスリン産生ＲＩＮ−Ｍβ細胞株の増殖を測定するためのインビトロアッセイを、表題「実施例４２：膵臓細胞株への［３Ｈ］チミジン取り込みのインビトロでのアッセイ」の下で以下に記載するように実行し得る。
（構築物２２５５によってコードされるアルブミン融合タンパク質の活性を、糖尿病ＮＯＤおよび／またはＮＩＤＤＭマウスモデルを使用してインビボでアッセイし得る）
構築物２２５５によってコードされるＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＹＧ）アルブミン融合タンパク質の活性を、表題「実施例４４：ＮＯＤマウスにおける糖尿病の発生」、「実施例４５：ＮＯＤマウスの組織学的実験」、および「実施例４７：ＮＩＤＤＭのインビボマウスモデル」の下で以下に記載するＮＯＤおよび／またはＮＩＤＤＭマウスモデルを使用して測定し得る。
（実施例３５：構築物ＩＤ２２７６（ＨＳＡ−インスリン（ＧＧＧ））の生成）
構築物ＩＤ２２７６（ｐＳＡＣ３５．ＨＳＡ．ＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＧＧ）．Ｆ１−Ｎ５８）は、酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ発現ベクターｐＳＡＣ３５にクローニングした３２位のＧｌｙで合成一本鎖で長時間作用型のインスリンアナログ（ＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＧ３２Ｇ））のアミノ末端に融合した、全長ＨＳＡ（ネイティブのＨＳＡリーダー配列を含む）を含む、ＨＳＡ−ＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＧＧ）融合タンパク質をコードする。
（構築物２２７６のためのＩＳＵＬＩＮ（ＧＧＧ）ｃＤＮＡのクローニング）
ＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＧＧ）の合成一本鎖形態をコードするＤＮＡを、４つの重複するプライマーを使用してＰＣＲ生成した。プロインスリンのプロセシングの必要性を除去し、そして正確な一本鎖タンパク質の折り畳みを確実にするために、プロインスリンｃＤＮＡの中間領域のＣペプチドに対応する配列を合成リンカー（「ＧＧ３２ＧＰＧＫＲ」）（配列番号２１４８）によって置換した。配列は酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける発現のためにコドン最適化した。このＰＣＲフラグメントを消化し、そしてＢｓｕ３６１／ＡｓｃＩで消化したｐＳｃＮＨＳＡにサブクローニングした。次いで、ＮｏｔＩフラグメントをｐＳＡＣ３５プラスミドにサブクローニングした。構築物ＩＤ番号２２７６は、ＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＧＧ）の合成一本鎖形態のアミノ末端に融合する、ネイティブのＨＳＡリーダー配列を含む全長ＨＳＡをコードする。
ＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＧＧ）、ＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＧＧ）−１およびＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＧＧ）−２の合成一本鎖形態をコードするポリヌクレオチドのＰＣＲ増幅に適切な４つの重複するオリゴヌクレオチドの５’プライマーおよび３’プライマーを合成した：
Figure 2014043448
 ＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＧＧ）−５は、Ｂｓｕ３６Ｉクローニング部位（イタリック体で示される）を組み込み、そしてＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＧＧ）の合成一本鎖形態のＯＲＦの最初の２１個のアミノ酸（太字で示される）をコードする。ＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＧＧ）−６において、イタリック体化された配列は、ＡｓｃＩ部位である。ＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＧＧ）−６において、太字にされた配列は、ＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＧＧ）の合成一本鎖形態のアミノ酸残基Ｃｙｓ−４４〜Ａｓｎ−５８をコードする最後の４９個のヌクレオチドの逆相補鎖である。これらの２つのプライマーで、ＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＧＧ）の合成一本鎖形態をＰＣＲ増幅した。それぞれ特異的なプライマー対およびテンプレートについてのアニーリング温度および時間ならびに伸長温度および時間を、経験的に決定しなければならない。
ＰＣＲ産物を精製し（例えば、Ｗｉｚａｒｄ ＰＣＲ Ｐｒｅｐｓ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ）を使用して）、ついでＢｓｕ３６ＩおよびＡｓｃＩで消化した。ゲル電気泳動によるＢｓｕ３６Ｉ−ＡｓｃＩフラグメントのさらなる精製後、この産物をＢｓｕ３６Ｉ／ＡｓｃＩで消化したｐＳｃＮＨＳＡにクローニングした。構築物ＩＤ番号２２７６を供するために、さらにＮｏｔＩフラグメントをｐＳＡＣ３５にサブクローニングした。
アミノ酸配列決定による、発現したアルブミン融合タンパク質のＮ末端のさらなる分析により、予想される成熟ＨＳＡ配列の存在を確認するはずである（以下を参照のこと）。
本発明のＩＮＳＵＬＩＮアルブミン融合タンパク質は、好ましくは、ＩＮＳＵＬＩＮの合成一本鎖アナログ（すなわち、Ｐｈｅ−１〜Ａｓｎ−５８）のＮ末端またはＣ末端のいずれかに融合されるＨＳＡの成熟形態（すなわち、Ａｓｐ−２５〜Ｌｅｕ−６０９）を含む；プロインスリンｃＤＮＡの中間領域のＣペプチドに対応する配列を、合成リンカー（「ＧＧ３２ＧＰＧＫＲ」）（配列番号２１４８）によって置換した。本発明の１つの実施形態において、本発明のＩＮＳＵＬＩＮアルブミン融合タンパク質は、さらに発現のために使用される宿主の分泌経路における成り始めの融合ポリペプチドを指向するシグナル配列を含む。さらに好ましい実施形態において、シグナル配列によってコードされるシグナルペプチドを除去し、そして成熟ＩＮＳＵＬＩＮアルブミン融合タンパク質が培養培地中に直接分泌される。本発明のＩＮＳＵＬＩＮアルブミン融合タンパク質は、当該分野において公知の異種シグナル配列（ＭＡＦ、ＩＮＶ、Ｉｇ、フィブリンＢ、クラステリン、インスリン様成長因子結合タンパク質４、ＨＳＡリーダー配列改変体（キメラＨＳＡ／ＭＡＦリーダー配列が挙げられるが、これに限定されない）が挙げられるが、これらに限定されない）または他の異種シグナル配列を含み得る。好ましい実施形態において、本発明のＩＮＳＵＬＩＮアルブミン融合タンパク質は、ネイティブのＩＮＳＵＬＩＮを含む。さらに好ましい実施形態において、本発明のＩＮＳＵＬＩＮアルブミン融合タンパク質は、さらにＮ末端メチオニン残基を含む。これらのポリペプチド（フラグメントおよび／または改変体を含む）をコードするポリヌクレオチドがまた、本発明によって含まれる。
（構築物ＩＤ２２７６の発現および精製）
（酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける発現）
構築物２２７６を、当該分野において公知の方法（実施例３を参照のこと）によって酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに形質転換し得る。発現レベルを、１次抗体として抗ＨＳＡ血清を用いる免疫ブロット検出法によって試験し得る。
（酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞上清からの精製）
酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて、構築物ＩＤ番号２２７６から発現した分泌性のＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＧＧ）アルブミン融合タンパク質を含む細胞上清を、実施例４において記載されたように精製し得る。Ｎ末端配列決定は、ＨＳＡの成熟形態のアミノ末端に対応するＤＡＨＫＳ（配列番号２１４３）を生じるはずである。
（構築物２２７６によってコードされるアルブミン融合タンパク質の存在下でのインビトロでの［３Ｈ］−２−デオキシグルコース取り込みアッセイ）
（方法）
構築物２２７６によってコードされるＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＧＧ）アルブミン融合タンパク質の存在下での３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞中の糖の取り込みを測定するためのインビトロアッセイを、実施例４１において以下に記載するように実行した。ＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＧＧ）アルブミン融合タンパク質を試験するために使用され得る当該分野において公知の他のアッセイとしては、グリコーゲン合成キナーゼ−３（ＧＳＫ−３）を介するＬ６ラット筋芽細胞増殖アッセイならびにラットリンゴ酸デヒドロゲナーゼプロモーター（ｒＭＥＰ）−ＳＥＡＰレポーター、ステロール調節エレメント結合タンパク質（ＳＲＥＢＰ）−ＳＥＡＰレポーター，脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ）−ＳＥＡＰレポーター、およびホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）−ＳＥＡＰレポーターを含むＨＡＩＩｅレポーターアッセイ（実施例４８を参照のこと）が挙げられるが、これらに限定されない。
（結果）
構築物２２７６によってコードされるインスリンアルブミン融合物を発現する形質転換された酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに由来する上清は、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞におけるグルコースの取り込み／輸送活性を証明した（図１８を参照のこと）。
（構築物２２７６によってコードされるアルブミン融合タンパク質の存在下での、インビトロ膵臓細胞株の増殖アッセイ）
（方法）
構築物２２７６によってコードされるＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＧＧ）アルブミン融合タンパク質の存在下で管上皮膵臓ＡＲＩＰ細胞株のインスリン産生β細胞への分化および増殖を測定し、そして／またはインスリン産生ＲＩＮ−Ｍβ細胞株の増殖を測定するためのインビトロアッセイを、表題「実施例４２：膵臓細胞株への［３Ｈ］チミジン取り込みのインビトロでのアッセイ」の下で以下に記載するように実行し得る。
（構築物２２７６によってコードされるアルブミン融合タンパク質の活性を、糖尿病ＮＯＤおよび／またはＮＩＤＤＭマウスモデルを使用してインビボでアッセイし得る）
構築物２２７６によってコードされるＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＧＧ）アルブミン融合タンパク質の活性を、表題「実施例４４：ＮＯＤマウスにおける糖尿病の発生」、「実施例４５：ＮＯＤマウスの組織学的試験」、および「実施例４７：ＮＩＤＤＭのインビボマウスモデル」の下で以下に記載するＮＯＤおよび／またはＮＩＤＤＭマウスモデルを使用して測定され得る。
（実施例３６：構築物ＩＤ２２７８（インスリン（ＧＧＧ）−ＨＳＡ）の生成）
構築物ＩＤ２２７８（ｐＳＡＣ３５．ＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＧＧ）．ＨＳＡ）は、酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ発現ベクターｐＳＡＣ３５にクローニングされたＨＳＡのＨＳＡキメラリーダー配列を含む、３２位のＧｌｙで合成一本鎖で長時間作用型のインスリンアナログ（ＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＧ３２Ｇ））のアミノ末端に融合された、次にＨＳＡの成熟形態に融合され、ＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＧＧ）−ＨＳＡ融合タンパク質をコードする。
（構築物２２７８のためのＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＧＧ）ｃＤＮＡのクローニング）
ＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＧＧ）の合成一本鎖形態をコードするＤＮＡを、４つの重複するプライマーを使用してＰＣＲ生成した。プロインスリンのプロセシングの必要性を除去し、そして正確な一本鎖タンパク質の折り畳みを確実にするために、プロインスリンｃＤＮＡの中間領域のＣペプチドに対応する配列を、合成リンカー（「ＧＧ３２ＧＰＧＫＲ」）（配列番号２１４８）によって置換した。配列は酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける発現のためにコドン最適化した。このＰＣＲフラグメントをＳａｌＩ／ＣｌａＩで消化し、そしてＸｈｏＩ／ＣｌａＩで消化したｐＳｃＣＨＳＡにサブクローニングした。次いで、ＮｏｔＩフラグメントをｐＳＡＣ３５プラスミドにサブクローニングした。構築物ＩＤ番号２２７８は、合成一本鎖形態のＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＧＧ）のアミノ末端に引き続いてＨＳＡの成熟形態に融合したＨＳＡのキメラリーダー配列をコードする。
ＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＧＧ）、ＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＧＧ）−７およびＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＧＧ）−８の合成一本鎖形態をコードするポリヌクレオチドのＰＣＲ増幅に適切な４つの重複するオリゴヌクレオチドの５’プライマーおよび３’プライマーを合成した：
Figure 2014043448
 ＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＧＧ）−７は、ＳａｌＩクローニング部位（イタリック体で示される）およびＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＧＧ）の合成一本鎖形態のＯＲＦの最初の２１個のアミノ酸（太字で示される）をコードするＤＮＡを組み込む。ＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＧＧ）−８において、イタリック体化された配列は、ＣｌａＩ部位であり；そしてこのＣｌａＩ部位およびそれに続くＤＮＡは、成熟ＨＳＡタンパク質の最初の１０個のアミノ酸をコードするＤＮＡの逆相補鎖である。太字にされた配列は、ＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＧＧ）の合成一本鎖形態の最後の１５個のアミノ酸残基Ｃｙｓ−４４〜Ａｓｎ−５８をコードする４６個のヌクレオチドの逆相補鎖である。これらの２つのプライマーで、ＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＧＧ）の合成一本鎖形態を、アニーリングし、アニーリングされたプライマーの伸長、ＳａｌＩおよびＣｌａＩでの消化、およびＸｈｏＩ／ＣｌａＩで消化したｐＳｃＣＨＳＡへのサブクローニングによって生成した。次いで、構築物ＩＤ２２７８を生成するために、このクローン由来のＮｏｔＩフラグメントを、ｐＳＡＣ３５のＮｏｔＩ部位にライゲーションした。構築物ＩＤ番号２２７８は、キメラリーダー配列、ＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＧＧ）の合成一本鎖、およびＨＳＡの成熟形態を含むアルブミン融合タンパク質をコードする。
アミノ酸配列決定による、発現したアルブミン融合タンパク質のＮ末端のさらなる分析は、予想されるＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＧＧ）配列の存在を確認するはずである（以下を参照のこと）。
本発明のＩＮＳＵＬＩＮアルブミン融合タンパク質は、好ましくは、ＩＮＳＵＬＩＮの合成一本鎖アナログ（すなわち、Ｐｈｅ−１〜Ａｓｎ−５８）のＮ末端またはＣ末端のいずれかに融合するＨＳＡの成熟形態（すなわち、Ａｓｐ−２５〜Ｌｅｕ−６０９）を含む；プロインスリンｃＤＮＡの中間領域のＣペプチドに対応する配列を、合成リンカー（「ＧＧ３２ＧＰＧＫＲ」）（配列番号２１４８）によって置換した。本発明の１つの実施形態において、本発明のＩＮＳＵＬＩＮアルブミン融合タンパク質は、さらに発現のために使用する宿主の分泌経路における成り始めの融合ポリペプチドを指向するシグナル配列を含む。さらに好ましい実施形態において、シグナル配列によってコードされるシグナルペプチドを除去し、そして成熟ＩＮＳＵＬＩＮアルブミン融合タンパク質が培養培地中に直接分泌される。本発明のＩＮＳＵＬＩＮアルブミン融合タンパク質は、当該分野において公知の異種シグナル配列（ＭＡＦ、ＩＮＶ、Ｉｇ、フィブリンＢ、クラステリン、インスリン様成長因子結合タンパク質４、ＨＳＡリーダー配列改変体（キメラＨＳＡ／ＭＡＦリーダー配列が挙げられるが、これに限定されない）が挙げられるが、これらに限定されない）または他の異種シグナル配列を含み得る。好ましい実施形態において、本発明のＩＮＳＵＬＩＮアルブミン融合タンパク質は、ネイティブのＩＮＳＵＬＩＮを含む。さらに好ましい実施形態において、本発明のＩＮＳＵＬＩＮアルブミン融合タンパク質は、さらにＮ末端メチオニン残基を含む。これらのポリペプチド（フラグメントおよび／または改変体を含む）をコードするポリヌクレオチドがまた、本発明によって含まれる。
（構築物ＩＤ２２７８の発現および精製）
（酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける発現）
構築物２２７８を、当該分野において公知の方法によって酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで形質転換し得る（実施例３を参照のこと）。発現レベルを、１次抗体として抗ＨＳＡ血清を用いる免疫ブロット検出法によって試験し得る。
（酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞上清からの精製）
酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて、構築物ＩＤ番号２２７８から発現した分泌性のＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＧＧ）アルブミン融合タンパク質を含む細胞上清を、実施例４において記載されたように精製し得る。この発現しそして精製したアルブミン融合タンパク質のＮ末端配列決定は、合成一本鎖形態で長時間作用型のインスリンアナログ（ＩＮＳＵＬＩＮ（ＣＧ３２Ｇ））のアミノ末端に対応するＦＶＮＱＨ（配列番号２１４９）を生じるはずである。
（構築物２２７８によってコードされるアルブミン融合タンパク質の存在下でのインビトロでの［３Ｈ］−２−デオキシグルコース取り込みアッセイ）
（方法）
構築物２２７８によってコードされるＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＧＧ）アルブミン融合タンパク質の存在下での３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞中のグルコースの取り込みを測定するためのインビトロアッセイを、実施例４１において以下に記載するように実行し得る。ＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＧＧ）アルブミン融合タンパク質を試験するために使用され得る当該分野において公知の他のアッセイとしては、グリコーゲン合成キナーゼ−３（ＧＳＫ−３）を介するＬ６ラット筋芽細胞増殖アッセイならびにラットリンゴ酸酵素プロモーター（ｒＭＥＰ）−ＳＥＡＰレポーター、ステロール調節エレメント結合タンパク質（ＳＲＥＢＰ）−ＳＥＡＰレポーター，脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ）−ＳＥＡＰレポーター、およびホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）−ＳＥＡＰレポーターを含むＨ４ＩＩｅレポーターアッセイ（実施例４８を参照のこと）が挙げられるが、これらに限定されない。
（構築物２２７８によってコードされるアルブミン融合タンパク質の存在下での、インビトロ膵臓細胞株の増殖アッセイ）
（方法）
構築物２２７８によってコードされるＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＧＧ）アルブミン融合タンパク質の存在下で管上皮膵臓ＡＲＩＰ細胞株のインスリン産生β細胞への分化および増殖を測定し、そして／またはインスリン産生ＲＩＮ−Ｍβ細胞株の増殖を測定するためのインビトロアッセイを、表題「実施例４２：膵臓細胞株への［３Ｈ］チミジン取り込みのインビトロでのアッセイ」の下で以下に記載するように実行し得る。
（構築物２２７８によってコードされるアルブミン融合タンパク質の活性を、糖尿病ＮＯＤおよび／またはＮＩＤＤＭマウスモデルを使用してインビボでアッセイし得る）
構築物２２７８によってコードされるＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＧＧ）アルブミン融合タンパク質の活性を、表題「実施例４４：ＮＯＤマウスにおける糖尿病の発生」、「実施例４５：ＮＯＤマウスの組織学的試験」、および「実施例４７：ＮＩＤＤＭのインビボマウスモデル」の下で以下に記載するＮＯＤおよび／またはＮＩＤＤＭマウスモデルを使用して測定し得る。
（実施例３７：インスリンアルブミン融合タンパク質のための指標）
上述したインビトロアッセイからの結果は、インスリンアルブミン融合タンパク質が、高血糖、インスリン抵抗性、インスリン欠損症、高脂血症、高ケトン尿症、ならびに糖尿病、１型糖尿病および２型糖尿病の処置、予防、および／または診断のために有用であることを示す。
（実施例３８：ＨＳＡ−ｈＧＨ融合タンパク質の調製）
ＨＳＡ−ｈＧＨ融合タンパク質を、以下のとおり調製した。
（ｈＧＨ ｃＤＮＡのクローニング）
ｈＧＨ ｃＤＮＡを、ヒトの下垂体のｃＤＮＡライブラリー（カタログ番号ＨＬ１０９７ｖ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）からＰＣＲ増幅によって得た。ｈＧＨ ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅に適切な２つのオリゴヌクレオチド（ＨＧＨ１およびＨＧＨ２）を、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３８０Ｂ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒを使用して合成した。
Figure 2014043448
 ＨＧＨ１およびＨＧＨ２は、ｈＧＨ ｃＤＮＡ配列（Ｍａｒｔｉａｌら，１９７９）の同じ位置のものとは、ＰＣＲ増幅後、ＥｃｏＲＩ部位をこのｃＤＮＡの５’末端に導入し、そしてＢａｍＨＩ部位をこのｃＤＮＡの３’末端に導入するように、それぞれ、２個および３個のヌクレオチドで異なった。さらに、ＨＧＨ２は、ｈＧＨ配列のすぐ下流にＨｉｎｄＩＩＩ部位を含んだ。
Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ−Ｃｅｔｕｓ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ９６００およびＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ−Ｃｅｔｕｓ ＰＣＲキットを使用するＰＣＲ増幅を、ｃＤＮＡライブラリーのファージ粒子から単離した一本鎖ＤＮＡテンプレートを使用して、以下のとおり実行した：１０μＬのファージ粒子を１０μＬのファージ溶解緩衝液（ＴＥ緩衝液中に２８０μｇ／ｍＬのプロテイナーゼ Ｋ）の添加によって溶解し、そして５５℃で１５分間インキュベートし、続いて８５°Ｃで１５分間インキュベートした。１分間氷上でインキュベーションした後、ファージの残屑を、１４，０００ｒｐｍで３分間遠心分離することによってペレット化した。ＰＣＲ混合物は、６μＬのこのＤＮＡテンプレート、０．１μＭの各プライマーおよび２００μＭの各デオキシリボヌクレオチドを含んだ。９４℃で３０秒の変性、６５℃で３０秒のアニーリングおよび７２℃で３０秒の伸長（１サイクルあたり１秒伸長時間を増やす）の３０サイクルでＰＣＲを実行する。。
ゲル電気泳動によるこの反応の分析は、予想されるサイズ（５８９塩基対）の単体の産物を示した。
このＰＣＲ産物を、Ｗｉｚａｒｄ ＰＣＲ Ｐｒｅｐｓ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ）を使用して精製し、次いで、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した。ゲル電気泳動によるＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントのさらなる精製後、ｐＨＧＨ１を供与するために、この産物をＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＵＣ１９（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）にクローニングした。ＥｃｏＲＩ ＨｉｎｄＩＩＩ領域のＤＮＡ配列決定は、それぞれＥｃｏＲＩ部位およびＢａｍＨＩ部位を導入した５’末端および３’末端を除いて、このＰＣＲ産物が配列上でｈＧＨ配列（Ｍａｒｔｉａｌら，１９７９）と同一であることを示した。
（ｈＧＨ ｃＤＮＡの発現）
ｐＢＳＴ（＋）を形成するために、ファージミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｂｅ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のポリリンカー配列を、オリゴヌクレオチドリンカーを挿入することによって置換し、ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩとの間で、２つの７５マーオリゴヌクレオチドをアニーリングすることによって形成した。新規のポリリンカーは、独特のＮｏｔＩ部位を含んだ。
ｐＨＳＡ１を形成するために、ＰＲＢＩプロモーター、ＨＳＡ／ＭＦα−１ハイブリッドリーダー配列をコードするＤＮＡ、ＨＳＡをコードするＤＮＡおよびＡＤＨ１ターミネーターを含むｐＡＹＥ３０９（ＥＰ ４３１ ８８０）のＮｏｔＩ ＨＳＡ発現カセットを、ｐＢＳＴ（＋）に移入した。ｐＨＳＡ２を形成するために、ＨＳＡコード配列をＨｉｎｄＩＩＩでの消化によってこのプラスミドから除去し、続いて再ライゲーションした。
ｈＧＨ ｃＤＮＡのクローニングは、プロｈＧＨの配列および成熟ｈＧＨの配列の最初の８塩基対（ｂｐ）を決失するｈＧＨコード領域を提供した。酵母からｈＧＨを分泌させるための発現プラスミドを構築するために、酵母のプロモーター、シグナルペプチドおよびｈＧＨ配列の最初の８ｂｐを、以下のとおりクローニングしたｈＧＨ配列の５’末端に結合した：２つの合成オリゴヌクレオチド（ＨＧＨ３およびＨＧＨ４）（ＳｆａＮＩ粘着末端およびＥｃｏＲＩ粘着末端でアニーリングし得る粘着末端を有するＤＮＡの二本鎖フラグメントを生成するような方法で、互いにアニーリングし得る）を介して、ｐＨＳＡ１からのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｆａＮＩフラグメントを、ｐＨＧＨＩからのＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩの５’末端に結合した：
Figure 2014043448
 ｐＨＧＨ２を作るために、このように形成したＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを、ＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＨＳＡ２にクローニングした。その結果、ｈＧＨ ｃＤＮＡをＰＲＢＩプロモーターおよびＨＳＡ／ＭＦα−１融合リーダー配列の下流に位置付けた（国際公開ＷＯ ９０／０１０６３を参照のこと）。ｐＨＧＨ１２を作るために、ｐＨＧＨ２において含まれるＮｏｔＩ発現カセット（ｈＧＨ ｃＤＮＡの下流にＡＤＨＩターミネーターを含んだ）を、ＮｏｔＩで消化したｐＳＡＣ３５（Ｓｌｅｅｐら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：４２（１９９０））にクローニングした。このプラスミドは、複製機能を提供するように２μｍプラスミド全体および形質転換株の選択のためのＬＥＵ２遺伝子を含んだ。
ｐＨＧＨ１２を形質転換によってＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｄ８８に導入し、そして個々の形質転換株を３日間３０°Ｃで１０ｍＬのＹＥＰＤ（１％ ｗ／ｖ酵母抽出物、２％ ｗ／ｖ、ペプトン、２％ ｗ／ｖ、ブドウ糖）中で増殖させた。
細胞の遠心分離後、この上清をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって試験し、そして予想されるサイズであり、そしてウェスタンブロット上で抗ｈＧＨ抗血清（Ｓｉｇｍａ、Ｐｏｏｌｅ、ＵＫ）によって認識されるタンパク質を含むことを見出した。
（ＨＳＡ−ｈＧＨ融合タンパク質のクローニングおよび発現）
ＨＳＡ ｃＤＮＡをｈＧＨ ｃＤＮＡの５’末端に融合させるために、ｐＨＳＡ１ ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｂｓｕ３６１のフラグメント（ＨＳＡ ｃＤＮＡの大部分を含む）を、２つのオリゴヌクレオチド（ＨＧＨ７およびＨＧＨ８）を介して、ｐＨＧＨ１ ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント（ｈＧＨ ｃＤＮＡの大部分を含む）に結合した。
Figure 2014043448
 ｐＨＧＨ１０を作るために、このように形成されたＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを、ＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＨＳＡ２にクローニングし、そしてｐＨＧＨ１６を作るために、このプラスミドのＮｏｔＩ発現カセットを、ＮｏｔＩで消化したｐＳＡＣ３５にクローニングした。
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｄ８８を形質転換するためにｐＨＧＨ１６を使用し、そして培養上清を上述するように分析した。およそ８８ｋＤの分子量を有する優位なバンドが観察され、これは、ＨＳＡおよびｈＧＨを組み合わせた質量と一致した。抗ＨＳＡ抗血清および抗ｈＧＨ抗血清（Ｓｉｇｍａ）を使用するウェスタンブロットは、アルブミン融合タンパク質の２つの構成部分の存在を確認した。
このアルブミン融合タンパク質を、陽イオン交換クロマトグラフィー、引き続く陰イオン交換およびゲル透過クロマトグラフィーによって培養上清から精製した。アミノ酸配列決定によるこのタンパク質のＮ末端分析は、予想されるアルブミン配列の存在を確認した。
インビトロでの成長ホルモン活性のアッセイ（Ｅａｌｅｙら，Ｇｒｏｗｔｈ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ５：３６（１９９５））は、アルブミン融合タンパク質が完全なｈＧＨ活性を保持することを示した。下垂体を切除したラット体重増加モデルにおいて（ヨーロッパ薬局方（１９８７，単行書５５６）において記載されたように本質的に実行した）、同じ数の活性ユニット（上記のインビトロアッセイをベースにした）を日常的に投与した場合、この融合分子はｈＧＨよりも効力があった。アルブミン融合タンパク質を４日ごとに１回投与するさらなる実験は、ｈＧＨの毎日の投与に類似の全体増殖応答を示した。１２５Ｉ標識したタンパク質をラットに投与する薬物動態実験は、アルブミン融合タンパク質についての循環半減期において、ｈＧＨと比較しておよそ１０倍の増加を示した。
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅインベルターゼ（ＳＵＣ２）リーダー配列をコードするＤＮＡを、コードされるリーダー配列およびＨＳＡを配列との連結部（↓）が以下の通りであるように、ハイブリッドリーダーについての配列と置換する類似のプラスミドを構築した：
Figure 2014043448
 Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＤＢＩへの導入に関して、このプラスミドは、ｐＨＧＨ１６で観察されるものと類似のレベルで、アルブミン融合タンパク質の発現および分泌に指向した。このアルブミン融合タンパク質のＮ末端の分析は、成熟タンパク質からリーダー配列の正確で効率的な切断を示した。
（ｈＧＨ−ＨＳＡ融合タンパク質のクローニングおよび発現）
ｈＧＨ ｃＤＮＡをＨＳＡ ｃＤＮＡの５’末端に融合するために、ＥｃｏＮ１部位をコード領域の５’末端近くに導入するために、最初にＨＳＡ ｃＤＮＡを部位特異的変異誘発によって変化させた。これを、ｐＨＳＡＩおよび合成オリゴヌクレオチド（ＬＥＵ４）から調製される一本鎖ＤＮＡテンプレートを使用するＫｕｎｋｅｌら（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７（１９８７））の方法によって、実行した：
Figure 2014043448
 このオリゴヌクレオチドを使用する部位特異的変異誘発は、ＨＳＡ ｃＤＮＡのコード領域をＬｙｓ４からＬｅｕ４に変化させた（Ｋ４Ｌ）。しかし、２つのオリゴヌクレオチド（ＨＧＨ５およびＨＧＨ６）を介して、ｐＨＧＨ２ Ｎｏｔ１−ＢａｍＨＩフラグメントを突然変異させたｐＨＳＡＩのＥｃｏＮＩ−Ｎｏｔ１フラグメントに連結することによって、ｈＧＨ ｃＤＮＡを続いて５’末端に連結した場合、この変化を修復した：
Figure 2014043448
 ｐＨＧＨ１４を作るために、このように形成したＮｏｔ１フラグメントを、Ｎｏｔ１で消化したｐＳＡＣ３５にクローニングした。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｄ８８を形質転換するためにｐＨＧＨ１４を使用し、そして培養上清を上記のように分析した。ｈＧＨおよびＨＳＡを組み合わせた質量に一致するおよそ８８ｋＤの分子量を有する優位なバンドが観察された。抗ＨＳＡ抗血清および抗ｈＧＨ抗血清を使用するウェスタンブロットは、このアルブミン融合タンパク質の２つの構成部分の存在を確認した。
このアルブミン融合タンパク質を、陽イオン交換クロマトグラフィー、引き続く陰イオン交換およびゲル透過クロマトグラフィーによって培養上清から精製した。アミノ酸配列決定によるこのタンパク質のＮ末端分析は、予想されるｈＧＨ配列の存在を確認した。
インビトロ研究は、このアルブミン融合タンパク質がｈＧＨ活性を維持するが、上述されるように、Ｎ末端位置として全長ＨＳＡ（１−５８５）およびＣ末端位置としてｈＧＨを含むアルブミン融合タンパク質より効力が有意に低いことを示した。
（ＨＳＡのドメインへのｈＧＨの融合物の発現のためのプラスミドの構築）
ｈＧＨ分子がＨＳＡの最初の２つのドメイン（残基１〜３８７）に融合した融合ポリペプチドを作った。オリゴヌクレオチドＨＧＨ１１およびＨＧＨ１２を介して、ＨＳＡのドメイン１および２についてのコード配列のほとんどを含むｐＨＳＡ１ ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｓａｐ１フラグメントを、ｐＨＧＨＩ ＥｃｏＲ１−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントに連結することによってｈＧＨのＮ末端への融合を達成した。
Figure 2014043448
 ｐＨＧＨ３７を作るために、このように形成したＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを、ＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＨＳＡ２にクローニングし、そしてこのプラスミドのＮｏｔ１発現カセットをＮｏｔ１で消化したｐＳＡＣ３５にクローニングした。
結果として生じたプラスミド（ｐＨＧＨ３８）は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＤＢ１に形質転換した場合、融合ポリペプチドの上清中への分泌を指向することが見出される発現カセットを含んだ。抗ＨＳＡ抗血清および抗ｈＧＨ抗血清を使用するウェスタンブロットは、このアルブミン融合タンパク質の２つの構成部分の存在を確認した。
アルブミン融合タンパク質を陽イオン交換クロマトグラフィー、引き続くゲル透過クロマトグラフィーによって培養上清から精製した。
精製したタンパク質を用いたインビボ研究は、循環半減期がｈＧＨのものより長く、そして上述したように、Ｎ末端位置として全長のＨＳＡ（１〜５８５）およびＣ末端位置としてｈＧＨを含むアルブミン融合タンパク質のものと類似であったことを示した。インビトロ研究は、このアルブミン融合タンパク質がｈＧＨ活性を保持することを示した。
上に詳述されるような類似の戦略を使用して、Ｎ末端部分としてＨＳＡの第１ドメイン（残基１−１９４）およびＣ末端部分としてｈＧＨを含むアルブミン融合タンパク質を、クローン化し、そしてＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＤＢＬで発現した。抗ＨＳＡ抗血清および抗ｈＧＨ抗血清を使用する培養上清のウェスタンブロッティングは、アルブミン融合タンパク質の２つの構成部分の存在を確認した。
（可撓性リンカー配列を使用するＨＳＡのｈＧＨへの融合）
可撓性リンカー（［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｎ（配列番号２１５０）の反復単位を含み、ここでｎは、２または３のいずれかであった）を、以下のオリゴヌクレオチドＨＧＨ１６、ＨＧＨ１７、ＨＧＨ１８およびＨＧＨ１９のクローニングによってＨＳＡとｈＧＨアルブミン融合タンパク質との間に導入した。
Figure 2014043448
 ＨＧＨ１６のＨＧＨ１７とのアニーリングが、ｎ＝２を生じ、その一方で、ＨＧＨ１９にアニールされたＨＧＨ１８は、ｎ＝３を生じた。アニーリング後、二本鎖オリゴヌクレオチドを、ｐＨＧＨ１から単離されたＥｃｏＲＩ−Ｂｓｕ３６１フラグメントを、Ｂｓｕ３６１消化ｐＨＧＨ１０にクローン化し、ｐＨＧＨ５６（ここで、ｎ＝２）およびｐＨＧＨ５７（ここで、ｎ＝３）を作製した。これらのプラスミドからのＮｏｔＩ発現カセットを、ＮｏｔＩ消化ｐＳＡＣ３５にクローン化し、それぞれ、ｐＨＧＨ５８およびｐＨＧＨ５９を作製した。
ｐＨＧＨ５６およびｐＨＧＨ５７を作製するためのオリゴヌクレオチドのクローニングは、リンカー配列にＢａｍＨＩ部位を導入した。従って、ｐＨＧＨ５６からのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメントをｐＨＧＨ５７からのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントへと連結すること（ｎ＝１を作製）、またはｐＨＧＨ５７からのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメントをｐＨＧＨ５６からのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントへと連結すること（ｎ＝２を作製）によって、ｎ＝１およびｎ＝４であるリンカー配列を構築することが可能であった。これらのフラグメントのｐＨＳＡ２のＨｉｎｄＩＩＩ部位へのクローン化は、ｐＨＧＨ６０（ここで、ｎ＝１）およびｐＨＧＨ６１（ここで、ｎ＝４）を生じた。ｐＨＧＨ６０およびｐＨＧＨ６１からのＮｏｔＩ発現カセットを、ＮｏｔＩ消化ｐＳＡＣ３５にクローン化し、それぞれ、ｐＨＧＨ６２およびｐＨＧＨ６３を作製した。
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのｐＨＧＨ５８、ｐＨＧＨ５９、ｐＨＧＨ６２およびｐＨＧＨ６３での形質転換は、上清に融合タンパク質を分泌する形質転換体を生じた。抗ＨＳＡ抗血清および抗ｈＧＨ抗血清を使用するウェスタンブロッティングは、アルブミン融合タンパク質の２つの構成部分の存在を確認した。
アルブミン融合タンパク質を、カチオン交換クロマトグラフィーによって培養上清から精製し、その後、アニオン交換クロマトグラフィーおよびゲル透過クロマトグラフィーで精製した。アミノ酸配列決定によるタンパク質のＮ末端の分析は、予想されるアルブミン配列存在を確認した。エレクトロスプレー質量分析による精製タンパク質の分析は、上記されるＨＳＡ−ｈＧＨ融合タンパク質に比較して、３１５ Ｄ（ｎ＝１）、６３０ Ｄ（ｎ＝２）、９４５ Ｄ（ｎ＝３）および１２６０ Ｄ（ｎ＝４）の質量の増加を確認した。精製タンパク質を、インビトロで活性であると確認した。
本発明のｈＧＨアルブミン融合タンパク質は、好ましくは、成熟形態のｈＧＨのＮ末端またはＣ−末端のいずれかに融合された、成熟形態のＨＳＡ（すなわち、Ａｓｐ−２５〜Ｌｅｕ−６０９）を含む。本発明の１つの実施形態において、本発明のｈＧＨアルブミン融合タンパク質は、発現のために使用される宿主の分泌経路における新生融合タンパク質を指向するシグナル配列をさらに含む。さらに好ましい実施形態において、シグナル配列によってコードされるシグナルペプチドが、除去され、成熟ｈＧＨアルブミン融合タンパク質が、培養培地中に直接分泌される。本発明のｈＧＨアルブミン融合タンパク質は、異種シグナル配列を含み得、これとしては、ＭＡＦ、ＩＮＶ、Ｉｇ、フィブリンＢ、クラスタリン、インシュリン様増殖因子結合タンパク質４、改変体ＨＳＡリーダ−配列（キメラＨＳＡ／ＭＡＦリーダー配列、または当該分野で公知の他の異種シグナル配列が挙げられるがこれらに限定されない）が挙げられるがこれらに限定されない。好ましい実施形態において、本発明のｈＧＨアルブミン融合タンパク質は、ネイティブなｈＧＨを含む。さらに好ましい実施形態において、本発明のｈＧＨアルブミン癒合タンパク質は、Ｎ末端メチオニン残基をさらに含む。これらのポリペプチド（フラグメントおよび／または改変体を含む）をコードするポリヌクレオチドはまた、本発明によって含まれる。
（ＨＳＡ−ｈＧＨ融合タンパク質の増加した貯蔵寿命：方法）
ＨＳＡ−ｈＧＨおよびｈＧＨを、５％ウマ血清を含む細胞培養培地中に、最終濃度１００〜２００μｇ／ｍｌまで、別々に希釈し、４℃、３７℃または５０℃でインキュベートした。ゼロ時間およびその後１週間に１回の間隔で、サンプルのアリコートを、Ｎｂ２細胞増殖アッセイにおいてこれらの生物学的活性について試験し、データを、コントロール（時間ゼロでのｈＧＨ溶液）の生物学的活性について正規化した。他のアッセイにおいて、ｈＧＨおよびＨＳＡ−ｈＧＨを、リン酸緩衝液中で４℃、３７℃、および５０℃でインキュベートした。
Ｎｂ２細胞増殖アッセイ：これらの細胞の増殖は、ｈＧＨまたは他の乳腺刺激ホルモンに依存する。代表的な実験において、１０４細胞／ウェルを、５〜１０％のウマ血清を含む培地（例えば、ＤＭＥＭ）中の異なる濃度のｈＧＨまたはＨＳＡ−ｈＧＨの存在下で９６ウェルプレート中で、インキュベーター中で２４〜４８時間プレートした。インキュベーション期間の後、１：１０容積のＭＴＴ（Ｈ２Ｏ中、５ｍｇ／ｍｌ）を、各ウェルに添加し、プレートを、さらに６〜１６時間インキュベートする。増殖する細胞は、ＭＴＴを不溶性ホルマザンに転換する。ホルマザンは、酸性イソプロパノールによって可溶化され、生成された色を、マイクロタイタープレートリーダー上、５７０ｎｍで測定する。ホルマザン形成の程度は、細胞増殖のレベルを反映する。
（ＨＳＡ−ｈＧＨ融合タンパク質の増加した貯蔵寿命：結果）
治療タンパク質のアルブミンへの融合は、水性溶液または他の溶液中での安定性を付与する。ＨＳＡ融合タンパク質の貯蔵寿命は、３７℃で５週間までの、細胞培養培地中での貯蔵後に残存する、ＨＳＡ−ｈＧＨの生物学的活性に関して、延長される。２００μｇ／ｍｌ ＨＳＡ−ｈＧＨの溶液を、５％ウシ血清を含む組織培養培地中で調製し、そして、この溶液は、ゼロ時間で開始し、３７℃でインキュベートされる。示される時間で、サンプルを、除去し、最終濃度２ｎｇ／ｍｌで、Ｎｂ２細胞アッセイにおいてその生物学的活性について試験した。ＨＳＡ−ｈＧＨの生物学的活性は、３７℃での５週間のインキュベーションの後、本質的にインタクトのまま（実験バリエーション以内）である。この実験のためにコントロールとして使用される組換えｈＧＨは、実験の第１週においてその生物学的活性を喪失した。
３週間までの間の、４℃、３７℃、または５０℃での細胞培養培地の保存の後、ＨＳＡ−ｈＧＨは安定であった。時間ゼロで、ＨＳＡ−ｈＧＨの溶液を、５％ウシ血清を含む組織培養培地中で調製し、４℃、３７℃、または５０℃でインキュベートした。示された期間で、サンプルを、除去し、最終濃度６０ｎｇ／ｍｌで、Ｎｂ２細胞アッセイにおいてその生物学的活性についてアッセイした。ＨＳＡ−ｈＧＨは、インキュベーション後、少なくとも３週間の間試験された全ての温度で初期活性を９０％超えて保持し、その一方で、ｈＧＨは、最初の週以内にその生物学的活性を喪失する。活性のこのレベルは、３７℃で少なくとも７週間および５０℃で少なくとも５週間、さらに保持される。これらの結果は、ＨＳＡ−ｈＧＨが、温度ストレス下でさえ、水性溶液中で高度に安定であることを示す。
ＨＳＡ−ｈＧＨの生物学的活性は、Ｎｂ２細胞増殖アッセイにおいてｈＧＨに比べて、安定であった。Ｎｂ２細胞を、時間ゼロで添加された、漸増濃度の組換えｈＧＨの存在下で増殖した。細胞を、２４時間または４８時間インキュベートし、その後、ＭＴＴ法によって増殖の程度を測定した。アッセイにおけるＨＳＡ−ｈＧＨの増加した安定性は、２４時間で、４８時間と本質的に同じ増殖活性を生じ、その一方で、ｈＧＨは、４８時間のインキュベーションの後、増殖活性の有意な減少を示す。ｈＧＨに比べて、ＨＳＡ−ｈＧＨは、１日後より低い生物学的有効性を有し、アルブミン融合タンパク質は、ｈＧＨより５分の１の有効性である。しかし、２日後、ＨＳＡ−ｈＧＨは、アッセイにおいてｈＧＨの短い寿命に起因して、ｈＧＨと本質的に同じ有効性を示す。アルブミン融合タンパク質としての、このｈＧＨの安定性の増加は、タンパク質の生物学的活性に対する主要な予期されない影響を有する。
（実施例３９：ｈＧＨアルブミン融合タンパク質の指示）
インビトロアッセイおよびインビボアッセイからの結果は、ｈＧＨアルブミン融合タンパク質が、先端巨大症、増殖欠損、成長不全および内因性成長ホルモン置換、成長ホルモン欠乏、２歳以上の幼児の増殖欠損および増殖遅延プラーダーヴィリ症候群、不完全成長（ｇｒｏｗｔｈ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）、慢性腎機能不全に関連する増殖欠損、閉経後骨粗鬆症、火傷、悪液質、癌悪液質、小人症、代謝障害、肥満症、腎不全、ターナー症候群（小児および成人）、結合組織炎、骨折処置、薄志弱行、またはＡＩＤＳるいそうを、処置、予防、検出、診断、および／または改善するために使用し得る。
（実施例４０：寄託されたサンプルからの選択されたｃＤＮＡクローンの単離）
本発明のアルブミン融合構築物の多くは、表３において示されるようにＡＴＣＣに寄託された。アルブミン融合構築物は、以下の発現ベクターのいずれか１つを含み得る：酵母Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ発現ベクター：ｐＳＡＣ３５、哺乳動物発現ベクターｐＣ４、または哺乳動物発現ベクターｐＥＥ１２．１。
ｐＳＡＣ３５ベクター（Ｓｌｅｅｐら、１９９０，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：４２）、ｐＣ４ベクター（ＡＴＣＣ受託番号２０９６４６；Ｃｕｌｌｅｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４３８−４４７（１９８５）；Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ ４１：５２１−５３０（１９８５））、およびｐＥＥ１２．１ベクター（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｉｎｃ．；ＳｔｅｐｈｅｎｓおよびＣｏｃｋｅｔｔ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：７１１０（１９８９）；国際公開番号ＷＯ８９／０１０３６；Ｍｕｒｐｈｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．２２７：２７７−２７９（１９９１）；Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６９−１７５（１９９２）；米国特許第５，１２２，４６４号；国際公開番号ＷＯ８６／０５８０７）は、細菌細胞の増殖のためのアンピシリン耐性遺伝子を含む。これらのベクターおよび／またはこれらを含むアルブミン融合構築物は、Ｈａｎａｈａｎのような当該分野で記載される技術を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ株（例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，１１０１１ Ｎ．Ｔｏｒｒｅｙ Ｐｉｎｅｓ Ｒｏａｄ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，９２０３７））中に形質転換され得、１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬｕｒｉａ−Ｂｔｏｔｈ寒天プレート上に広げられ、３７℃で一晩増殖される。
任意の所定のアルブミン融合構築物について表３に引用されるＡＴＣＣ受託番号を割り当てられたサンプルにおける寄託された材料はまた、１つ以上のさらなるアルブミン融合構築物を含み得、各々は、異なるアルブミン融合タンパク質をコードする。従って、同じＡＴＣＣ受託番号を共有する寄託物は、少なくとも表３の対応する列において同定されるアルブミン融合構築物を含む。
２つのアプローチが、表３において、アルブミン融合構築物について引用されるプラスミドＤＮＡの寄託されたサンプル由来の特定のアルブミン融合構築物を単離するために使用され得る。
（方法１：スクリーニング）
第１に、当該分野で公知の方法を使用して、アルブミン融合構築物を、表１中の個々の構築物ＩＤ番号についての配列番号Ｘに対応するポリヌクレオチドプローブを使用して、寄託されたプラスミドＤＮＡのサンプルをスクリーニングすることによって、直接単離し得る。例えば、３０〜４０ヌクレオチドを有する特定のポリヌクレオチドは、報告された配列に従ってＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＤＮＡ合成機を使用して合成され得る。オリゴヌクレオチドは、例えば、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを使用して３２Ｐ−γ−ＡＴＰを用いて標識され得、慣用的な方法に従って精製される。（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ，ＮＹ（１９８２）。）所定のＡＴＣＣ寄託物由来のアルブミン融合構築物を、上記されるように、当業者に公知の技術を使用して適切な宿主（例えば、ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））（例えば、これらは、ベクター供給業者によって提供されるか、または上に引用される関連刊行物または特許中に提供される）中に形質転換する。形質転換体を、プレート当たり約１５０形質転換体（コロニー）の密度まで、１．５％寒天プレート（適切な選択薬剤（例えば、アンピシリン）を含む）上にプレートする。これらのプレートを、細菌コロニースクリーニングのための慣用的な方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版（１９８９），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，第１．９３頁〜第１．１０４頁）または当業者に公知の他の技術に従ってＮｙｌｏｎ膜を使用してスクリーニングする。
（方法２：ＰＣＲ）
あるいは、所定のアルブミン融合タンパク質をコードするＤＮＡは、例えば、所定のアルブミン融合タンパク質をコードするＤＮＡに対して５’側および３’側の寄託されたアルブミン融合構築物に対してハイブリダイズする１７〜２０ヌクレオチドの２つのプライマーを使用することによって、配列番号Ｘを有する寄託されたアルブミン融合構築物のサンプルから増幅され得る。ポリメラーゼ連鎖反応を、慣用的な条件下で、例えば、０．５μｇの上記ｃＤＮＡテンプレートとの反応混合物（２５μｌ）中で、実施する。従来の反応混合物は、１．５〜５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．０１％（ｗ／ｖ）ゼラチン、各２０μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、２５ｐｍｏｌの各プライマーおよび０．２５単位のＴａｑポリメラーゼである。３５サイクルのＰＣＲ（９４℃１分間の変性；５５℃１分間のアニーリング；７２℃１分間の伸長）を、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ自動化サーマルサイクラーを使用して実施する。増幅産物を、アガロースゲル電気泳動によって分析し、予想される分子量を有するバンドを切り出し、精製する。ＰＣＲ産物は、サブクローニングによって選択された配列であることが示され、ＤＮＡ産物を配列決定する。
いくつかの方法が、寄託されたクローン中に存在しないかもしれない遺伝子の５’非コード部分または３’非コード部分の同定のために利用可能である。これらの方法としては、フィルタープロービング、特定のプローブを使用するクローン富化、ならびに当該分野で公知の５’「ＲＡＣＥ」プロトコルおよび３’「ＲＡＣＥ」プロトコルに類似するかまたは同一のプロトコルが挙げられるがこれらに限定されない。例えば、５’ＲＡＣＥに類
似の方法は、所望の全長転写物の欠けている５’末端を生成するために利用可能である。
（Ｆｒｏｍｏｎｔ−Ｒａｃｉｎｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２１（７）：１６８３−１６８４（１９９３））。
簡潔には、特定のＲＮＡオリゴヌクレオチドを、おそらく全長遺伝子ＲＮＡ転写物を含むＲＮＡの集団の５’末端に連結する。連結されたＲＮＡオリゴヌクレオチドに特異的なプライマーおよび目的の遺伝子の公知の配列に対して特異的なプライマーを含むプライマーセットを、所望の全長遺伝子の５’部分をＰＣＲ増幅するために使用する。次いで、この増幅された産物を、配列決定し、全長遺伝子を生成するために使用し得る。
この上記方法は、所望の供給源から単離された全ＲＮＡで開始するが、ポリ−Ａ＋ ＲＮＡを、使用し得る。次いで、ＲＮＡ調製物を、必要な場合、ホスファターゼで処理し、分解されたＲＮＡまたは損傷したＲＮＡ上の５’リン酸基を除去し得る。このＲＮＡは、後のＲＮＡリガーゼ工程に干渉し得る。次いで、ホスファターゼを、不活性化するべきであり、ＲＮＡを、タバコ酸ピロホスファターゼで処理し、メッセンジャーＲＮＡの５’末端に存在するキャップ構造を除去する。この反応は、キャップ切断ＲＮＡの５’末端に５’リン酸基を残し、これは、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼを使用してＲＮＡオリゴヌクレオチド
に連結され得る。
この改変されたＲＮＡ調製物を、遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを使用する、第１鎖ｃＤＮＡ合成のためのテンプレートとして使用する。第１鎖合成反応を、連結されたＲＮＡオリゴヌクレオチドに対して特異的なプライマーおよび目的の遺伝子の公知の配列に対して特異的なプライマーを使用して、所望の５’末端のＰＣＲ増幅のためのテンプレートとして使用する。次いで、得られた産物を、配列決定し、そして分析し、５’末端配列が所定の遺伝子に属することを確認する。
（実施例４１：［３Ｈ］−２−デオキシグルコース取り込みアッセイ）
脂肪、骨格筋、および肝臓は、インシュリン感受性組織である。インシュリンは、これらの組織へのグルコース取り込み／輸送を刺激し得る。脂肪および骨格筋の場合、インシュリンは、分化された細胞内区画から細胞表面まで、グルコース輸送体４分子（ＧＬＵＴ４）のトランスロケーションを最終的に導く、シグナル伝達を開始する。一旦、細胞表面上にくると、ＧＬＵＴ４は、グルコース取り込み／輸送を可能にする。
（［３Ｈ］−２−デオキシグルコース取り込み）
多くの脂肪関連細胞株および筋肉関連細胞株を、糖尿病の処置について列挙される、任意の１つ以上の治療薬物の組み合わせの非存在下または存在下において、グルコース取り込み／輸送活性について試験し得る。特に、３Ｔ３−Ｌ１マウス線維芽細胞およびＬ６マウス骨格筋細胞は、それぞれ、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞および筋管に分化され得、［３Ｈ］−２−デオキシグルコース取り込みアッセイについての適切なインビトロモデルとして働く（Ｕｒｓｏら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２７４（４３）：３０８６４−７３（１９９９）；Ｗａｎｇら、Ｊ Ｍｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ，１９（３）：２４１−８（１９９７）；Ｈａｓｐｅｌら、Ｊ Ｍｅｍｂｒ Ｂｉｏｌ，１６９（１）：４５−５３（１９９９）；Ｔｓａｋｉｒｉｄｉｓら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１３６（１０）：４３１５−２２（１９９５））。簡潔には、２×１０５細胞／１００μＬの脂肪細胞または分化されたＬ６細胞を、分化後培地中の９６ウェル組織培養（「ＴＣ」処理された）（すなわち、５０μｇ／ｍＬのポリ−Ｌ−リジンでコートされた）プレートに移し、そして５％ ＣＯ２中で３７℃で一晩インキュベートした。細胞を、無血清低グルコースＤＭＥＭ培地で一度洗浄し、次いで、１ｎＭのインシュリンの非存在下または存在下で、１００μＬ／ウェルの同じ培地および１００μＬ／ウェルの緩衝液または糖尿病の処置について列挙された１つ以上の治療薬物（例えば、漸増濃度の１ｎＭ、１０ｎＭ、および１００ｎＭの本発明の治療剤（例えば、配列番号Ｙとして開示された特定の融合物ならびにそのフラグメントおよび改変体））の組み合わせのいずれかで、３７℃で１６時間枯渇する。プレートを、１００μＬ／ウェルのＨＥＰＥＳ緩衝化生理食塩水を用いて３回洗浄する。インシュリンを、１０μＭ標識［３Ｈ］−２−デオキシグルコース（Ａｍｅｒｓｈａｍ，＃ＴＲＫ６７２）および１０μＭ非標識２−デオキシグルコース（ＳＩＧＭＡ，Ｄ−３１７９）の存在下で、ＨＥＰＥＳ緩衝化生理食塩水中で、３７℃で３０分間、１ｎＭで添加する。コントロールとして、インシュリンの非存在下であることを除いて、同じ条件を実施する。最終濃度の１０μＭのサイトカラシンＢ（ＳＩＧＭＡ，Ｃ６７６２）を、非特異的取り込みを測定するために別々のウェルに１００μＬ／ウェルで添加する。細胞を、ＨＥＰＥＳ緩衝化生理食塩水で３回洗浄する。標識された、すなわち１０μＭの［３Ｈ］−２−デオキシグルコースおよび標識されない、すなわち１０μＭの２−デオキシグルコースを、室温で１０分間添加した。細胞を、冷リン酸緩衝化生理食塩水「ＰＢＳ」で３回洗浄する。細胞は、０．２Ｎ ＮａＯＨの１５０μＬ／ウェルの添加および続いての室温で２０分間の振盪を伴うインキュベーションの際に溶解される。次いで、サンプルをシンチレーションバイアルに移し、それに５ｍＬのシンチレーション流体を添加する。バイアルを、β−シンチレーションカウンターにおいて計数する。二連の条件における取り込み（差異は、インシュリンの非存在または存在である）は、以下の方程式を用いて決定される：［（１分当たりのインシュリン計数「ｃｐｍ」−非特異的ｃｐｍ）／（インシュリンなしｃｐｍ−非特異的ｃｐｍ）］。平均応答は、脂肪細胞および筋管に対するコントロールのそれぞれ約５倍および３倍の限度内に含まれる。
（細胞の分化）
細胞を、Ｔ−７５ｃｍ２フラスコ中で完全にコンフルエントにさせる。培地を除去し、２５ｍＬの分化前培地で、４８時間置換する。細胞を、５％ ＣＯ２、８５％湿度で、３７℃でインキュベートする。４８時間後、分化前培地を、除去し、２５ｍＬの分化培地で４８時間置換する。細胞を、再度、５％ ＣＯ２、８５％湿度で、３７℃でインキュベートする。４８時間後、培地を除去し、３０ｍＬの分化後培地で置換する。分化後培地を、１４〜２０日間または完全な分化が達成されるまで維持する。培地を、２〜３日毎に交換する。ヒト脂肪細胞を、Ｚｅｎ−Ｂｉｏ，ＩＮＣ（＃ＳＡ−１０９６）から購入し得る。
（実施例４２：［３Ｈ］−チミジンの膵臓細胞株への取り込みのインビトロアッセイ） ＧＬＰ−１が、時間依存性様式および用量依存性様式で、ラット膵臓管上皮細胞株ＡＲＩＰの分化を低下することが最近示された。この分化は、Ｉｓｌｅｔ Ｄｕｏｄｅｎａｌ Ｈｏｍｅｏｂｏｘ−１（ＩＤＸ−１）ｍＲＮＡレベルおよびインシュリンｍＲＮＡレベルの増加に関連する（Ｈｕｉら、２００１，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，５０（４）：７８５−９６）。次いで、ＩＤＸ−１は、ＧＬＰ−１レセプターのｍＲＮＡレベルを増加する。
（試験された細胞型）
（ＲＩＮ−Ｍ細胞）
これらの細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ細胞株番号ＣＲＬ−２０５７）から入手可能である。ＲＩＮ−Ｍ細胞株は、放射線誘導された移植可能なラット島細胞腫瘍に由来した。この株を、腫瘍のヌードマウス異種移植片から樹立する。この細胞は、島ポリペプチドホルモンを産生し、分泌し、そしてＬ−ドーパデカルボキシラーゼ（アミン前駆体取り込みおよび脱炭酸（すなわち、ＡＰＵＤ）活性を有する細胞に対するマーカー）を産生する。
（ＡＲＩＰ細胞）
Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ細胞株番号ＣＲＬ−１６７４）から入手可能な上皮形態学の膵臓外分泌細胞が存在する。参考文献：Ｊｅｓｓｏｐ，Ｎ．Ｗ．およびＨａｙ，Ｒ．Ｊ．，「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｔｗｏ ｒａｔ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｅｘｏｃｒｉｎｅ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｂｌｅ ｔｕｍｏｒｓ」Ｖｉｔｒｏ １６：２１２，（１９８０）；Ｃｏｃｋｅｌｌ，Ｍ．ら、「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｔｈａｔ ｉｎｔｅｒａｃｔｓ ｗｉｔｈ ａ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ａｃｉｎａｒ ｐａｎｃｒｅａｓ」Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９：２４６４−２４７６，（１９８９）；Ｒｏｕｘ，Ｅ．ら、「Ｔｈｅ ｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒＰＴＦ１ ｃｏｎｔａｉｎｓ ｔｗｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｕｂｕｎｉｔｓ ｔｈａｔ ｉｎｔｅｒａｃｔ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ＤＮＡ」Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．３：１６１３−１６２４，（１９８９）；ならびにＨｕｉ，Ｈ．ら、「Ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ ｐｅｐｔｉｄｅ １ ｉｎｄｕｃｅｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｓｌｅｔ ｄｕｏｄｅｎａｌｈｏｍｅｏｂｏｘ−１− ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｄｕｃｔａｌ ｃｅｌｌｓ ｉｎｔｏ ｉｎｓｕｌｉｎ−ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ ｃｅｌｌｓ」Ｄｉａｂｅｔｅｓ ５０：７８５−７９６（２００１）もまた参照のこと。
（細胞の調製）
ＲＩＮ−Ｍ細胞株を、１０％ウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ，＃ＳＨ３００８８．０３）を含むＲＰＭＩ １６４０培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ，＃ＳＨ３０００２７．０１）中で増殖し、１：３〜１：６の比で、６〜８日毎に植え継がれる。培地を、３〜４日毎に交換する。
ＡＲＩＰ（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１６７４）細胞株を、１．５ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウムおよび１０％ウシ胎仔血清を含むように調製された、２ｍＭ Ｌ−グルタミンを含むハムのＦ１２Ｋ培地（ＡＴＣＣ＃３０−２００４）中で増殖される。ＡＲＩＰ細胞株を、１：３〜１：６の比で、１週間に２回植え継ぐ。培地を、３〜４日毎に交換する。
（アッセイプロトコル）
細胞を、９６ウェルプレート中で４０００細胞／ウェルで接種し、そして５０％交会まで４８〜７２時間培養した。細胞を、１００μＬ／ウェルで血清を含まない媒体に変えた。４８〜７２時間インキュベート後、披験発明の血清および／または治療（例えば、本発明のアルブミン融合タンパク質およびフラグメントおよびそれらの改変体）を、ウェルに加える。インキュベーションは、さらに３６時間継続する。［３Ｈ］−Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ（５−２０Ｃｉ／ｍｍｏｌ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ、＃ＴＲＫ１２０）を、マイクロＣｕｒｉｅｓ／５マイクロリットルに希釈する。３６時間のインキュベーション後、５マイクロリットルを、さらに２４時間で１ウェル当たり加える。この反応を、冷Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌ ｉｎｅ、「ＰＢＳ」で一度、徐々に細胞を洗浄することによって終結した。次いで、細胞を、４℃で１５分間、１００マイクロリットルの１０％氷冷ＴＣＡで固定する。ＰＢＳを除去し、そして２００マイクロリットルの０．２Ｎ ＮａＯＨを加える。プレートを、撹拌しながら室温で１時間インキュベートする。溶液を、シンチレーションバイアルに移動し、そして水溶液と適合する５ｍＬのシンチレーション流体を加え、そして活発に撹拌する。バイアルを、βシンチレーション計数器で計数する。陰性コントロールの場合、緩衝液だけを使用する。陽性コントロールの場合、胎児子ウシ血清を使用する。
（実施例４３：糖尿（Ｇｌｙｃｏｕｒｉｎｅ）についてのアッセイ）
糖尿（すなわち、尿中の過剰の糖分）は、糖尿病の疾患状態の指標を提供するために、容易にアッセイされ得る。正常な患者サンプルと比較した場合に患者サンブルにおける過剰の尿は、ＩＤＤＭおよびＮＩＤＤＭの症状である。ＩＤＤＭおよびＮＩＤＤＭを患う患者の処置の有効性は、尿中の過剰のグルコース量の得られた減少によって示される。ＩＤＤＭおよびＮＩＤＤＭをモニタリングする好ましい実施形態において、患者からの尿サンプルを、当該分野で公知の技術を使用して、グルコースの存在についてアッセイする。ヒトにおける糖尿は、１００ｍｌあたり１００ｍｇを超える尿グルコース濃度によって定義される。糖尿を示す患者における過剰な糖分レベルは、血液サンブルを得、そして血清グルコースをアッセイすることによって、すっとより正確に測定され得る。
（実施例４４：ＮＯＤマウスにおける糖尿病の発症）
雌性ＮＯＤ（非肥満性糖尿病）マウスを、ヒトにおいて見出されるコースと同様のコースを用いてＩＤＤＭを表すことによって特徴付けられるが、この疾患は雄性ＮＯＤマウスより雌性ＮＯＤマウスにおいてより深刻である。以後、他に規定されないなら、用語「ＮＯＤマウス」とは、雌性ＮＯＤマウスをいう。ＮＯＤマウスは、慢性自己免疫疾患によって引き起こされる、ベータ細胞の進行性の崩壊を有する。従って、ＮＯＤマウスは、正常血糖値（ｅｕｇｌｙｃｅｍｉａ）または正常血中グルコースレベルを有して生を始める。しかし、約１５〜１６週齢までに、ＮＯＤマウスは高血糖値になり始める。このことは、そのマウスの大部分の膵臓β細胞の崩壊、およびそれに対応して膵臓が十分なインスリンを産生不能であることを示す。従って、疾患の原因および進行の両方は、ヒトＩＤＤＭ患者と同様である。
免疫処置レジメンの有効性についてのインビボアッセイを、雌性ＮＯＤ／ＬｔＪマウス（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，Ｍｅより市販される）において評価し得る。文献において、８０％の雌性マウスが２４週齢までに糖尿病を進行させ、そして膵島炎（ｉｎｓｕｌｉｔｉｓ）の発症が６週齢と８週例との間に進行させることが、報告されている。ＮＯＤマウスは、同系交配され、そして種々の免疫制御性ストラテジーに対して高度に応答性である。成体のＮＯＤマウス（６〜８週齢）は、平均重量２０〜２５ｇを有する。
これらのマウスは、未処置であるか（コントロール）、または単独でかもしくは上記の他の治療剤組成物と併用して、本発明の治療法（例えば、本発明のアルブミン融合タンパク質、ならびにそれらのフラグメントおよび改変体）で処置される。糖尿病の進行に対するこれらの種々の処置の有効性を、以下のように測定し得る。
１４週齢で、雌性ＮＯＤマウスを、グルコース寛容性に従って表現型決定（ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）し得る。グルコース寛容性を、腹膜内グルコース寛容性テスト（ＩＰＧＴＴ）で測定し得る。簡潔に述べると、０分およびグルコース腹膜内注射（体重１ｋｇあたり１ｇ）の６０分後、 血液を眼窩近傍叢（ｐａｒａｏｒｂｉｔａｌ ｐｌｅｘｕｓ）より引き出す。正常な寛容性は、０分で１４４ｍｇ％未満の血漿グルコース、または６０分で１６０ｍｇ未満の血漿グルコースとして定義される。血中グルコースレベルを、Ｇｌｕｃｏｍｅｔｅｒ Ｅｌｉｔｅ装置を用いて決定し得る。
この表現型分析に基づき、動物を異なる実験グループに配分し得る。具体的には、より血中グルコースレベルを上昇させた動物を、不能性のグルコース寛容性グループに割り当て得る。これらのマウスに、任意に給餌し得、そして酸性化した水（ｐＨ２．３）を供給し得る。
グルコース寛容性マウスおよびグルコース不寛容性マウスを、さらに、コントロールグループ、本発明のアルブミン融合タンパク質グループ、およびアルブミン融合タンパク質／治療剤組成物併用グループに分け得る。コントロールグループのマウスは、毎日（週あたり６回）ビヒクルの腹膜内注射を受け得る。アルブミン融合タンパク質グループのマウスは、毎日（週あたり６回）、ビヒクル中での本発明の治療剤（例えば、本発明のアルブミン融合タンパク質ならびにそのフラグメントおよび改変体）の腹膜内注射を受け得る。アルブミン融合タンパク質／治療剤組成物併用グループのマウスは、アルブミン融合タンパク質および上記の治療剤組成物の併用の両方を受け得る。
ＮＯＤマウスにおける尿中グルコースレベルを、Ｌａｂｓｔｉｘ（Ｂａｙｅｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を使用して、１週おきベースで決定し得る。体重および液体摂取量もまた、１週おきベースで決定し得る。糖尿病の発症を、２つの連続的な決定に対する糖尿の発生後に規定する。処置の１０週後、さらなるＩＰＧＴＴを実施し得、そして動物を翌日に屠殺し得る。
１０週のコースの処置にわたって、グルコース寛容性グループおよびグルコース不寛容性グループ両方のコントロール動物は、それぞれ６０％および８６％の割合で糖尿病を進行させる（Ｇｒｏｓｓらの米国特許第５，８６６，５４６号を参照のこと）。従って、処置介入がなされない場合に最初にはグルコース寛容性であるＮＯＤマウスにおいてさえ、高い割合で糖尿病が起こる。
処置前および処置後に、ＮＯＤマウスにおける血中グルコースレベルを測定することによって、結果を確認し得る。記載される全てのグループにおいて、グルコース寛容性マウスおよびグルコース不寛容性マウスの両方における血中グルコースレベルを、上記のように測定する。
代替の実施形態において、本発明の治療剤（例えば、配列番号Ｙに開示される特定の融合タンパク質ならびにそれらのフラグメントおよび改変体）を分光学的分析を用いて定量し得、そして注射前に、適切なタンパク質量を、投与量あたり５０．ｍｕ．ｌのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁し得る。各々のマウスの背側の皮膚の下に、１週おきの２回の注射を皮下投与し得る。免疫処置の前に、２つの別々の機会でモニタリングを実施し得、そして処置全体を通して週ごとにモニタリングを実施し得、そしてそれ以降も継続し得る。グルコースレベルについて、尿を毎週試験し得る（Ｋｅｔｏ−Ｄｉａｓｔｉｘ．ＲＴＭ．；Ｍｉｌｅｓ Ｉｎｃ．，Ｋａｎｋａｋｅｅ，Ｉｌｌ．）そして糖尿のマウスを、血清グルコースについて確認し得る（ＭｅｄｉＳｅｎｓｅ，Ｉｎｃ．Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓ）。飢餓時の血糖値が２．５ｇ／Ｌより大きい場合に糖尿病が分析され得る。
（実施例４５：ＮＯＤマウスの組織学的試験）
ＮＯＤマウスからの組織サンプルの組織学的試験は、本発明の組成物および／または本発明の組成物および糖尿病のための他の治療剤との併用が、膵臓中のβ細胞の相対濃度を増加させる能力を、実証し得る。実験方法は、以下の通りである。
実施例４４からのマウスを、処置期間の最後に屠殺し、そしてその膵臓からの組織サンプルを取り出し得る。これらのサンプルを、０．９％の生理食塩水中の１０％ホルマリン中で固定し得、そしてワックス中に包埋し得る。免疫標識化のために、５系列の５．ｍｕ．ｍの切片の２つの組を、１５０．ｍｕ．ｍの切断間隔で切断し得る。切片をインスリン（モルモット抗インスリン抗血清、１：１０００希釈、ＩＣＮ Ｔｈａｍｅｓ Ｕ．Ｋ．）およびグルカゴン（ウサギ抗グルカゴン抗血清、１：２０００希釈）について、免疫標識化し得、そしてペルオキシダーゼ結合体化抗ハムスター抗血清（Ｄａｋｏ，Ｈｉｇｈ Ｗｙｃｏｍｂｅ，Ｕ．Ｋ．）またはペルオキシダーゼ結合体化抗ウサギ抗血清（１：５０希釈、Ｄａｋｏ）を用いて検出し得る。
本発明の組成物は、グルコース寛容性動物またはグルコース不寛容性動物において糖尿病の臨床的症状に対して行う場合と同程度に強力な、β細胞の目視重量に対する効果を有しても、有していなくてもよい。
（実施例４６：膵臓β細胞移植併用治療）
特に標的自己組織が重篤に損傷を受けている場合、移植は自己免疫疾患の処置の一般の形態である。例えば、膵臓移植およびランゲルハンス島細胞移植は、ＩＤＤＭに対する通常の処置選択肢であるが、これらに限定されない（例えば、Ｓｔｅｗａｔｔら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ＆ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ８６（３）９８４−９８８（２００１）；Ｂｒｕｎｉｃａｒｄｉ，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．Ｐｒｏｃ．２８：２１３８−４０（１９９６）；Ｋｅｎｄａｌｌ ＆ Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｄｉａｂａｔｅｓ Ｍｅｔａｂ．２２：１５７−１６３（１９９６）；Ｈａｍａｎｏら，Ｋｏｂｅ Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．４２：９３−１０４（１９９６）；Ｌａｒｓｅｎ ＆ Ｓｔｒａｔｔａ，Ｄｉａｂａｔｅｓ Ｍｅｔａｂ．２２：１３９−１４６（１９９６）；およびＫｉｋｈａｂｗａｌａら，Ａｍ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．１７１：５１６−５２０（１９９６）を参照のこと）。任意の移植方法に関して、自己免疫疾患患者に対する移植治療は、移植組織の宿主からの拒絶の危険性を最低にするための処置を包含する。しかし、自己免疫疾患は、元の自己組織に損傷を与えた、予め存在する宿主の自己免疫応答が、移植組織に対して同じ損傷効果をもたらすという、さらなる別個の危険性を含む。従って、本発明は、自己免疫疾患の移植治療を受ける個体において、免疫調節剤および／または免疫抑制剤と併用して本発明のアルブミン融合タンパク質を用いて、自己免疫膵臓疾患の処置のための方法および組成物を包含する。
本発明に従って、上記のアルブミン融合ベースの組成物および処方物を、最初に元の自己組織に対して指向される宿主個体の自己免疫応答から生じた、移植器官、移植組織または移植細胞に対する損傷を防止または処置するために、投与する。移植前および移植後の両方に、２〜４投与量で各１週おきに、投与を実施し得る。
ランゲルハンス島細胞細胞移植または膵臓移植において、以下の免疫調節剤および／または免疫抑制剤を、本発明のアルブミン融合治療剤と一緒に使用し得る：ＡＩ−４０１、ＣＤＰ−５７１（抗ＴＮＦモノクローナル抗体）、ＣＧ−１０８８、Ｄｉａｍｙｄ（糖尿病ワクチン）、ＩＣＭ３（抗ＩＣＡＭ−３モノクローナル抗体）、リノミド（ｌｉｎｏｍｉｄ）（Ｒｏｑｕｉｎｉｍｅｘ）、ＮＢＩ−６０２４（改変ペプチドリガンド）、ＴＭ−２７、ＶＸ−７４０（ＨＭＲ−３４８０）、カスパーゼ８プロテアーゼインヒビター、サリドマイド、ｈＯＫＴ３γ１（Ａｌａ−ａｌａ）（抗ＣＤ３モノクローナル抗体）、経口インターフェロンα、経口乳酸菌、およびＬｙｍｐｈｏＳｔａｔ−Ｂ（登録商標）が挙げられるが、これらに限定されない。
（実施例４７：ＮＩＤＤＭのインビボマウスモデル）
Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から３週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを入手し得、そして慣用的な食餌、または高脂肪食（重量あたり３５．５重量％；Ｂｉｏｓｅｒｖ．Ｆｒｅｎｃｈｔｏｗｎ，ＮＪ）もしくは高フルクトース食（重量あたり６０重量％；Ｈａｒｌａｎ Ｔｅｋｌａｄ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のいずれかを、給餌し得る。規則的な食餌は、重量あたり４．５重量％の脂肪、重量あたり２３重量％のタンパク質、重量あたり３１．９重量％の炭水化物、重量あたり３．７重量％のフルクトースおよび重量あたり５．３重量％の繊維からなる。高脂肪（ラード）食は、重量あたり３５．５重量％の脂肪、重量あたり２０重量％のタンパク質、重量あたり３６．４重量％の炭水化物、重量あたり０．０重量％のフルクトースおよび重量あたり０．１重量％の繊維からなる。高フルクトース食は、 重量あたり５重量％の脂肪、重量あたり２０重量％のタンパク質、重量あたり０．０重量％の炭水化物、重量あたり６０重量％のフルクトースおよび重量あたり９．４重量％の繊維からなる。ケージあたり５匹以下、２２℃＋／−３℃に温度制御し且つ２０％湿潤制御した部屋で、１２時間の日照（午前６時〜午後６時）／暗サイクルで、これらのマウスを飼育し得る（Ｌｕｏら，１９９８，Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ４７（６）：６６３−８，「Ｎｏｎｇｅｎｅｔｉｃ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｎｏｎ−ｉｎｓｕｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｄｉａｂａｔｅｓ ｍｅｌｌｉｔｕｓ」；Ｌａｒｓｅｎら，Ｄｉａｂａｔｅｓ ５０（１１）：２５３０−９（２００１），「Ｓｙｓｔｅｍｉｃ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｌｏｎｇ−ａｃｔｉｎｇ ＧＬＰ−１ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ ＮＮ２２１１ ｉｎｄｕｃｅｓ ｌａｓｔｉｎｇ ａｎｄ ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ｗｅｉｇｈｔ ｌｏｓｓ ｉｎ ｂｏｔｈ ｎｏｒｍａｌ ａｎｄ ｏｂｅｓｅ ｒａｔｓ」）。３週間それぞれの食餌にさらした後、体重ｋｇあたり１００ｍｇでのストレプトゾシン「ＳＴＺ」（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）またはビヒクル（０．０５モル／Ｌのクエン酸、ｐＨ４．５）のいずれかを、マウスに腹膜内注射し得、そして続く４週間、同じ食餌で維持し得る。非飢餓条件の下で、ＳＴＺの１週後、２週後および４週後に、尾の遠位部分を切断することによって血液を得る。サンプルを使用して、非飢餓の血漿グルコース濃度およびインスリン濃度を測定する。体重および食餌摂取を、週ごとに記録する。
インスリンがグルコース処理を刺激する能力に対する高脂肪食の影響を直接決定するために、３つのグループのマウス（脂肪食給餌マウス、ビヒクルを注射した通常食給餌マウス、および上記の７週間の期間の最後にＳＴＺを注射した脂肪食給餌マウス）に、これらの実験を開始し得る。実験前に、マウスを４時間飢餓させ得る。第１系列の実験において、マウスをメチルフルラン（Ｐｉｔｍａｎ−Ｍｏｏｒ，Ｍｕｎｄｅｌｅｉｎ，ＩＬ）吸引で麻酔し得る。正規のインスリン（Ｓｉｇｍａ）を、尾部静脈を介して静脈注射（［ＩＶ］、ｋｇ体重あたり０．１Ｕ）し得、そして注射の３分後、６分後、９分後、１２分後および１５分後に異なる尾部静脈から血液を収集し得る。これらのサンプルについて血漿グルコース濃度を決定し得、そして薬理動態学／薬理動力学ソフトウェアプログラムのＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｎｓｕｌｔｉｎｇ，Ａｐｅｘ，ＮＣ）を使用して、血漿からのグルコース消失の半減期（ｔ１／２）を決定し得る。
第２系列の実験において、腹膜内のペントバルビタールナトリウム（Ｓｉｇｍａ）でマウスを麻酔し得る。腹腔を開腹し、そして腹静脈を露出させ、そして２４ゲージＩＶカテーテル（Ｊｏｈｎｓｏｎ−Ｊｏｈｎｓｏｎ Ｍｅｄｉｃａｌ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＴＸ）でカテーテル挿管した。このカテーテルを、腹静脈に隣接した筋肉組織に固定し、シリンジ接続部の下側で切断し、そして予め充填したＰＥ５０プラスチックチューブにフック固定し、これを次いで注入溶液を有するシリンジに接続する。次いで、腹腔を縫合して閉じる。このアプローチでは、胴体の下側部分からの血液の逆流の妨害が全くない。マウスに、継続してグルコース（２４．１ｍｇ／ｋｇ／分）およびインスリン（１０ｍＵ／ｋｇ／分）を、注入容量１０μＬ／分で注入した。血漿グルコース濃度および血漿インスリン濃度の測定のために、注入開始の９０分後、１０５分後、１２０分後および１３５分後に、後方眼窩（ｒｅｔｒｏ−ｏｒｂｉｔａｌ）血液サンプル（各々７０μＬ）を取り出し得る。これら４つのサンプルの平均を使用して、各々の動物についての安定状態血漿グルコース濃度（ＳＳＰＧ）および安定状態血漿インスリン濃度（ＳＳＰＩ）を評価し得る。
最後に、本適用の治療剤組成物であるアルブミン融合タンパク質が、単独でかまたは糖尿病の処置のために列挙された治療的薬物のいずれか１つ以上との併用のいずれかで、血漿グルコースを減少させる能力を評価するための実験を、ＳＴＺ注射した以下の２つのグループの「ＮＩＤＤＭ」マウスモデルにおいて実施する：（１）脂肪食給餌したＣ５７ＢＬ／６Ｊ、および（２）フルクトース給餌したＣ５７ＢＬ／６Ｊ。これらの研究についてのマウスの血漿グルコース濃度は、２５５〜５５５ｍｇ／ｄＬにわたり得る。マウスを、ビヒクルを用いた処置、または単独でかもしくは糖尿病の処置のために列挙された治療的薬物のいずれか１つ以上との併用のいずれかでの本発明のアルブミン融合タンパク質を用いた処置のいずれかに、ランダムに割り当てる。全部で３つの投与量を投与し得る。最初の投薬前および最後の投薬の３時間後に、血漿グルコース濃度の測定のために、尾部静脈血液サンプルを取り出し得る。
酵素比色アッセイである、ＳｉｇｍａからのＧｌｕｃｏｓｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ 番号３１５）を使用して、血漿グルコース濃度を決定し得る。Ｌｉｎｃｏ ＲｅｓｅａｒｃｈからのＲａｔ Ｉｎｓｕｌｉｎ ＲＩＡ Ｋｉｔ（＃ＲＩ−１３Ｋ；Ｓｔ．Ｃｈａｒｌｅｓ，ＭＯ）を使用して、血漿インスリンレベルを決定し得る。
（実施例４８：インスリン作用の関与を確立するインビトロＨ４ＩＩｅ−ＳＥＡＰレポーターアッセイ）
（種々のＨ４ＩＩｅレポーター）
Ｈ４ＩＩｅ／ｒＭＥＰ−ＳＥＡＰ：ラットから単離されたリンゴ酸酵素プロモーター（ｒＭＥＰ）は、インスリン経路において存在するＰＰＡＲ−γエレメントを含む。このレポーター構築物を、肝臓Ｈ４ＩＩｅ細胞株に安定にトランスフェクトする。
Ｈ４ＩＩｅ／ＳＲＥＢＰ−ＳＥＡＰ：ステロール制御エレメント結合タンパク質（ＳＲＥＢＰ−１ｃ）は、多くのインスリン応答性遺伝子（例えば、脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ））のプロモーターに対して作用し、そして線維芽細胞、褐色脂肪細胞および肝細胞における脂肪酸代謝において重要な遺伝子の発現を制御する、転写因子である。ＳＲＥＢＰ−１ｃはまた、褐色脂肪細胞決定分化因子１（ＡＤＤ−１）としても公知であり、褐色脂肪細胞における遺伝子発現に対してインスリンの効果の主用なメディエーターとみなされる。
その活性は、インスリンレベル、ステロールレベルおよびグルコースレベルによって調節される。このレポーター構築物を、肝臓Ｈ４ＩＩｅ細胞株に安定にトランスフェクトする。
Ｈ４ＩＩｅ／ＦＡＳ−ＳＥＡＰ：脂肪酸合成酵素の構築物は、最小限のＳＲＥＢＰ応答性ＦＡＳプロモーターを含む。このレポーター構築物を、肝臓Ｈ４ＩＩｅ細胞株に安定にトランスフェクトする。
Ｈ４ＩＩｅ／ＰＥＰＣＫ−ＳＥＡＰ：ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）プロモーターは、ＰＥＰＣＫ活性を調節するＰＥＰＣＫ遺伝子転写のホルモン性制御の主要な部位である。ＰＥＰＣＫは、肝臓の糖新生における、統合され且つ速度制御する段階を触媒し、そして従って、正常な限定内で血中グルコースレベルを維持するために、注意深く制御されねばならない。このレポーター構築物を、肝臓Ｈ４ＩＩｅ細胞株に安定にトランスフェクトする。
これのレポーター構築物をまた、３Ｔ３−Ｌ１線維芽細胞およびＬ６筋芽細胞に安定にトランスフェクトし得る。次いで、これらの安定細胞株を、実施例４１に先に記載したように、３Ｔ３−Ｌ１褐色脂肪細胞およびＬ６筋管へと分化させる。次いで、これらの分化した細胞株を、以下に記載するＳＥＡＰアッセイにおいて使用し得る。
（増殖培地およびアッセイ媒体）
増殖培地は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１０％ウシ血清、１％ ＮＥＡＡ、１×ペニシリン／ストレプトマイシン、および０．７５ｍｇ／ｍＬ Ｇ４１８（Ｈ４ＩＩｅ／ｒＦＡＳ−ＳＥＡＰおよびＨ４ＩＩｅ／ＳＲＥＢＰ−ＳＥＡＰに対して）または０．５０ｍｇ／ｍＬ Ｇ４１８（Ｈ４ＩＩｅ／ｒＭＥＰ−ＳＥＡＰに対して）を含む。Ｈ４ＩＩｅ／ＰＥＰＣＫ−ＳＥＡＰに対して、増殖培地は、１０％ ＦＢＳ、１％ ペニシリン／ストレプトマイシン、１５ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝化生理食塩水および０．５０ｍｇ／ｍＬ Ｇ４１８からなる。
Ｈ４ＩＩｅ／ｒＦＡＳ−ＳＥＡＰレポーター、Ｈ４ＩＩｅ／ＳＲＥＢＰ−ＳＥＡＰレポーターおよびＨ４ＩＩｅ／ｒＭＥＰ−ＳＥＡＰレポーターに対するアッセイ媒体は、低グルコースＤＭＥＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１％ ＮＥＡＡ、１×ペニシリン／ストレプトマイシンからなる。Ｈ４ＩＩｅ／ＰＥＰＣＫ−ＳＥＡＰレポーターに対するアッセイ媒体は、０．１％ ＦＢＳ、１％ ペニシリン／ストレプトマイシンおよび１５ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝化生理食塩水からなる。
（方法）
９６ウェルプレートを、対数増殖期の細胞が接着するまで、ウェルあたり１００μＬの増殖培地中に、ウェルあたり７５，０００個の細胞播種する。増殖培地をアッセイ媒体（ウェルあたり２００μＬ）に交換することによって、細胞を４８時間飢餓させる。（例えば、Ｈ４ＩＩｅ／ＰＥＰＣＫ−ＳＥＡＰに対して、０．５μＭのデキサメタゾンを含むアッセイ媒体をウェルあたり１００μＬで添加し、そして約２０時間インキュベートする）。このアッセイ媒体を、その後ウェルあたり１００μＬの新鮮なアッセイ媒体に交換し、そして本発明の治療剤（例えば、本発明のアルブミン融合タンパク質ならびにそのフラグメントおよび改変体）を発現するトランスフェクト細胞株から得られた細胞上清の５０μＬのアリコートを、ウェルに添加する。空のベクターをトランスフェクトされた細胞株を、ネガティブコントロールとして使用する。ウェルへの１０ｎＭおよび／または１００ｎＭのインスリンの添加を、ポジティブコントロールとして使用する。４８時間のインキュベーション後、馴化培地を収集し、そしてＳＥＡＰ活性を測定する（Ｐｈｏｓｐｈａ−ＬｉｇｈｔＳｙｓｔｅｍプロトコル，Ｔｒｏｐｉｘ ＃ＢＰ２５００）。簡潔に述べると、サンプルを希釈緩衝液で希釈し、そして６５℃で３０分間インキュベートして、内因性の非胎盤形態のＳＥＡＰを不活性化させる。希釈したサンプルの５０μＬアリコートを、非胎盤性ＳＥＡＰアイソザイムに対して活性なインヒビター混合物を含む、５０μＬのＳＥＡＰ Ａｓｓａｙ Ｂｕｆｆｅｒと共に混合し、そしてさらに５分間インキュベートする。ＣＳＰＤ化学発光基質の５０μＬアリコート（これは、Ｅｍｅｒａｌｄ発光増強剤中に１：２０に希釈される）をこの混合物に添加し、そして１５〜２０分間インキュベートする。プレートを、Ｄｙｎｅｘプレートルミノメーターで解読する。
（実施例４９：ＨＡ−サイトカイン融合タンパク質またはＨＡ−増殖因子融合タンパク質（例えば、ＥＰＯ、ＧＭＣＳＦ、ＧＣＳＦ）の調製）
目的のサイトカインまたは増殖因子（例えば、ＥＰＯ）のｃＤＮＡを、ｃＤＮＡライブラリーから、ＲＴ−ＰＣＲによって、および一連の重複合成オリゴヌクレオチドプライマーを使用するＰＣＲによって（標準的方法を使用する全て）を含む種々の手段によって、単離し得る。これら全てのタンパク質についてのヌクレオチド配列は、公知でありそして利用可能である（例えば、米国特許第４，７０３，０８８号、同４，８１０，６４３号および同５，９０８，７６３号）。、このｃＤＮＡを５’末端および３’末端で調製して、ＨＡのためのｃＤＮＡを含むベクターへのｃＤＮＡのクローニングのため、制限部位（オ
リゴヌクレオチドリンカーが使用され得るもののような制限部位）を形成し得る。これは、Ｎ末端またはＣ末端に、スペーサー配列を使用しても使用してなくてもよい。ＥＰＯ（または他のサイトカイン）のｃＤＮＡを、ベクター（例えば、ｐＰＰＣ０００５（図２）、ｐＳｃＣＨＳＡ、ｐＳｃＮＨＳＡ、またはｐＣ４）にクローニングする：次いで、完全な発現カセットが存在するＨＳＡを切り出しそしてプラスミドｐＳＡＣ３５へと挿入して、酵母中でのアルブミン融合タンパク質の発現を可能にする。酵母から分泌されるアルブミン融合タンパク質を、収集し得、そして培地から精製し得、そしてその生物学的活性についてテストし得る。哺乳動物細胞株における発現のために、同様の手順が当てはめられるが、使用される発現カセットが哺乳動物のプロモーター、リーダー配列およびターミネーター（実施例１を参照のこと）を使用することを除く。次いで、この発現カセットを切り出し、そして哺乳動物細胞株のトランスフェクションに適したプラスミドへと挿入する。
（実施例５０：ＨＡ−ＩＦＮ融合タンパク質（例えば、ＩＦＮα）の調製）
ＩＦＮαのような目的のインターフェロンのｃＤＮＡを、種々の手段によって、単離し得る。種々の手段としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：全て標準的な方法を用いる、ｃＤＮＡライブラリーから、一連の重複する合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲまたはＰＣＲによって。インターフェロン（例えば、ＩＦＮα）の核酸配列は、例えば、米国特許第５，３２６，８５９および４，５８８，５８５号において、およびＥＰ３２，１３４において、ならびにＧｅｎＢａｎｋのような公のデータべースにおいて、公知であり、かつ利用可能である。ｃＤＮＡを、５’末端および３’末端において改変して、制限部位を生成し得る。その結果、オリゴヌクレオチドリンカー
を使用して、ｃＤＮＡを、ＨＡのｃＤＮＡをクローニングするためのベクター中にクローニングすることができる。このことは、ＨＡ配列のＮ末端またはＣ末端において、スペーサー配列を用いて、または用いることなく、なし得る。ＩＦＮα（または他のインターフェロン）ｃＤＮＡを、ｐＰＰＣ０００５（図２）、ｐＳｃＣＨＳＡ、ｐＳｃＮＨＳＡ、またはｐＣ４：ＨＳＡのようなベクター中にクローニングする。次に、このようなベクターから、完全な発現カセットを切りだし、そして、プラスミドｐＳＡＣ３５中に挿入して、酵母中でのアルブミン融合タンパク質の発現を可能にする。次に、酵母から分泌されたアルブミン融合タンパク質を培地から収集して、精製し、その生物学的活性について、試験し得る。哺乳動物細胞株における発現のために、使用する発現カセットが哺乳動物プロモーター、リーダー配列およびターミネーターを使用する以外は、同様の手順を適用する（実施例１を参照のこと）。次に、この発現カセットを切りだし、そして、哺乳動物細胞株のトランスフェクションに適切なプラスミド中に挿入する。
（バイアルからの最大のタンパク質回収）
本発明のアルブミン融合タンパク質は、低濃度で包装された場合であっても、高度に安定である。さらに、低タンパク質濃度にも関わらず、水溶液がバイアルの壁に対する結合を最小限にするための他のタンパク質を含まない場合であっても、良好な融合タンパク質の回収が、観察される。バイアルに収容されたＨＡ−ＩＦＮ溶液の回収を、ストックしておいた溶液と比較した。６または３０μｇ／ｍｌのＨＡ−ＩＦＮ溶液を、バイアル中に入れて、４℃で保存した。４８から７２時間後、最初の１０ｎｇのサンプルに相当する容量を、取り出し、そしてＩＦＮサンドイッチＥＬＩＳＡで測定した。推定された容量を、高濃度ストック溶液の容量と比較した。示されるように、これらバイアルにおいて、サンプルは、実質的に損失しなかった。このことは、バイアルの壁に対するサンプルの損失を防ぐために、外来の物質（例えば、アルブミン）を添加する必要がないことを示す。
（インビボにおける、ＨＡ−α−ＩＦＮ融合物の安定性およびバイオアベイラビリティ）
インビボにおける、ＨＡ−α−ＩＦＮ融合分子の安定性およびバイオアベイラビリティを決定するために、（酵母より）精製された融合分子を、サルに投与した。ＨＡ−α−ＩＦＮ融合物から処方された薬学的組成物は、延長された血清半減期およびバイオアベイラビリティを、説明し得る。従って、薬学的組成物を、天然のα−インターフェロン分子と比較して、より低い投薬量のα−インターフェロン活性を含むように、処方し得る。
ＨＡ−α−ＩＦＮ融合物を含む薬学的組成物を使用して、α−ＩＦＮの投与によって変調され得る任意の疾患または疾患状態を有する患者における疾患を、処置または予防し得る。そのような疾患としては、毛様細胞白血病、カポジ肉腫、生殖器および肛門のいぼ、慢性Ｂ型肝炎、慢性非Ａ非Ｂ型肝炎（特にＣ型肝炎）、Ｄ型肝炎、慢性骨髄性白血病、腎臓細胞癌腫、膀胱癌腫、卵巣癌腫および頚部癌腫、皮膚癌、再発性の呼吸器乳頭腫症、非ホジキンＴ細胞リンパ腫および皮膚Ｔ細胞リンパ腫、メラノーマ、多発性骨髄腫、ＡＩＤＳ、多発性硬化症、グリア芽細胞腫、などが挙げられるが、これらに限定されない（ＡＨＦＳ Ｄｒｕｇ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、１９９７のインターフェロンαを参照のこと）。
従って、本発明は、ヒトへの投与のための適切な投薬量を含む、ＨＡ−α−ＩＦＮ融合タンパク質、ポリペプチドまたはペプチド処方物を含む。本発明はまた、そのような処置を必要とする患者を処置する方法を含む。そのような方法は、少なくとも１つのＨＡ−α−ＩＦＮ融合タンパク質、ポリペプチド、ペプチドを含む薬学的組成物を投与する工程を、少なくとも包含する。
（二機能性ＨＡ−α−ＩＦＮ融合物）
ＨＡ−α−ＩＦＮ発現ベクターを改変して、二機能性ＨＡ−α−ＩＦＮ融合タンパク質の発現のための挿入物を含ませてもよい。例えば、目的の第二のタンパク質のｃＤＮＡを、二重の終止コドンを除去するか、またはコード配列の下流に移動させた後に、「ｒＨＡ−α−ＩＦＮ」配列の下流にフレームを合わせて、挿入し得る。
二機能性ＨＡ−α−ＩＦＮ融合タンパク質の１つのバリエーションにおいて、Ｂリンパ球刺激タンパク質に対する抗体またはフラグメント（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号４４５５１３９）、またはポリペプチドを、融合分子のＨＡ成分の１つの末端に融合し得る。この二機能性タンパク質は、融合物のα−ＩＦＮ成分によって生じる任意の免疫応答を調整するために、有用である。
（実施例５１：ＨＡ−ホルモン融合タンパク質（例えば、インスリン、ＬＨ、ＦＳＨ）の調製）
目的のホルモン（例えば、インスリン）のｃＤＮＡを、種々の手段によって、単離し得る。種々の手段としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：全て標準的な方法を用いる、ｃＤＮＡライブラリーから、一連の重複する合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲまたはＰＣＲによって。これらタンパク質全てのヌクレオチド配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋのような公のデータべースにおいて、公知であり、かつ利用可能である。ｃＤＮＡを、５’末端および３’末端において改変して、制限部位を生成し得る。その結果、オリゴヌクレオチドリンカーを使用して、ｃＤＮＡを、ＨＡのｃＤＮＡをクローニングするためのベクター中にクローニングすることができる。このことは、Ｎ末端またはＣ末端において、スペーサー配列を用いて、または用いることなく、なし得る。ホルモンのｃＤＮＡを、ｐＰＰＣ０００５（図２）、ｐＳｃＣＨＳＡ、ｐＳｃＮＨＳＡ、またはｐＣ４：ＨＳＡのようなベクター中にクローニングする。次に、このようなベクターから、完全な発現カセットを切りだし、そして、プラスミドｐＳＡＣ３５中に挿入して、酵母中でのアルブミン融合タンパク質の発現を可能にする。次に、酵母から分泌されたアルブミン融合タンパク質を培地から収集して、精製し、その生物学的活性について、試験し得る。哺乳動物細胞株における発現のために、使用する発現カセットが哺乳動物プロモーター、リーダー配列およびターミネーターを使用する以外は、同様の手順を適用する（実施例１を参照のこと）。次に、この発現カセットを切りだし、そして、哺乳動物細胞株のトランスフェクションに適切なプラスミド中に挿入する。
（実施例５２：ＨＡ可溶性レセプタータンパク質またはＨＡ結合タンパク質の融合タンパク質（例えば、ＨＡ−ＴＮＦレセプター）の調製）
ＴＮＦレセプターのような目的の可溶性レセプタータンパク質または結合タンパク質のｃＤＮＡを、種々の手段によって、単離し得る。種々の手段としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：全て標準的な方法を用いる、ｃＤＮＡライブラリーから、一連の重複する合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲまたはＰＣＲによって。これらタンパク質全てのヌクレオチド配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋのような公のデータべースにおいて、公知であり、かつ利用可能である。ｃＤＮＡを、５’末端および３’末端において改変して、制限部位を生成し得る。その結果、オリゴヌクレオチドリンカーを使用して、ｃＤＮＡを、ＨＡのｃＤＮＡをクローニングするためのベクター中にクローニングすることができる。このことは、Ｎ末端またはＣ末端において、スペーサー配列を用いて、または用いることなく、なし得る。レセプターのｃＤＮＡを、ｐＰＰＣ０００５（図２）、ｐＳｃＣＨＳＡ、ｐＳｃＮＨＳＡ、またはｐＣ４：ＨＳＡのようなベクター中にクローニングする。次に、このようなベクターから、完全な発現カセットを切りだし、そして、プラスミドｐＳＡＣ３５中に挿入して、酵母中でのアルブミン融合タンパク質の発現を可能にする。次に、酵母から分泌されたアルブミン融合タンパク質を培地から収集して、精製し、その生物学的活性について、試験し得る。哺乳動物細胞株における発現のために、使用する発現カセットが哺乳動物プロモーター、リーダー配列およびターミネーターを使用する以外は、同様の手順を適用する（実施例１を参照のこと）。次に、この発現カセットを切りだし、そして、哺乳動物細胞株のトランスフェクションに適切なプラスミド中に挿入する。
（実施例５３：ＨＡ−増殖因子（例えば、ＨＡ−ＩＧＦ−１融合タンパク質）の調製）
ＩＧＦ−１のような目的の増殖因子のｃＤＮＡを、種々の手段によって、単離し得る。種々の手段としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：全て標準的な方法を用いる、ｃＤＮＡライブラリーから、一連の重複する合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲまたはＰＣＲによって（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０００６０９を参照のこと）。ｃＤＮＡを、５’末端および３’末端において改変して、制限部位を生成し得る。その結果、オリゴヌクレオチドリンカーを使用して、ｃＤＮＡを
、ＨＡのｃＤＮＡをクローニングするためのベクター中にクローニングすることができる。このことは、Ｎ末端またはＣ末端において、スペーサー配列を用いて、または用いることなく、なし得る。増殖因子のｃＤＮＡを、ｐＰＰＣ０００５（図２）、ｐＳｃＣＨＳＡ、ｐＳｃＮＨＳＡ、またはｐＣ４：ＨＳＡのようなベクター中にクローニングする。次に、このようなベクターから、完全な発現カセットを切りだし、そして、プラスミドｐＳＡＣ３５中に挿入して、酵母中でのアルブミン融合タンパク質の発現を可能にする。次に、酵母から分泌されたアルブミン融合タンパク質を培地から収集して、精製し、その生物学的活性について、試験し得る。哺乳動物細胞株における発現のために、使用する発現カセットが哺乳動物プロモーター、リーダー配列およびターミネーターを使用する以外は、同様の手順を適用する（実施例１を参照のこと）。次に、この発現カセットを切りだし、そして、哺乳動物細胞株のトランスフェクションに適切なプラスミド中に挿入する。
（実施例５４：ＨＡ−単鎖抗体融合タンパク質の調製）
単鎖抗体を、いくつかの方法によって産生する。その方法としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ファージライブラリーからの選択、抗体のｃＤＮＡをクローニングし、隣接する定常領域をプライマーとして使用して可変領域をクローニングすることによる特異的抗体の可変領域のクローニング、または任意の特異的抗体の可変領域に対応するオリゴヌクレオチドの合成。ｃＤＮＡを、５’末端および３’末端において改変して、制限部位を生成し得る。その結果、オリゴヌクレオチドリンカーを使用して、ｃＤＮＡを、ＨＡのｃＤＮＡをクローニングするためのベクター中にクローニングすることができる。このことは、Ｎ末端またはＣ末端において、スペーサー配列を用いて、または用いることなく、なし得る。細胞のｃＤＮＡを、ｐＰＰＣ０００５（図２）、ｐＳｃＣＨＳＡ、ｐＳｃＮＨＳＡ、またはｐＣ４：ＨＳＡのようなベクター中にクローニングする。次に、このようなベクターから、完全な発現カセットを切りだし、そして、プラスミドｐＳＡＣ３５中に挿入して、酵母中でのアルブミン融合タンパク質の発現を可能にする。
本発明の融合タンパク質において、ＶＨおよびＶＬを、以下の手段の１つ、またはその組み合わせによって、連結し得る：ＶＨのＣ末端とＶＬのＮ末端との間のペプチドリンカー；ＶＨおよびＶＬが分泌の際に切断され、次に自己会合する、ＶＨとＶＬとの間のＫｅｘ２ｐプロテアーゼ切断部位；ならびに、ＶＨとＶＬとの間でジスルフィド結合を形成し、お互いに連結し得る位置にある、システイン残基。代替的なオプションは、ＶＨをＨＡまたはＨＡドメインフラグメントのＮ末端に配置し、そしてＶＬをＨＡまたはＨＡドメインフラグメントのＣ末端に配置することである。
次に、酵母から分泌されたアルブミン融合タンパク質を培地から収集して、精製し、その活性について、試験し得る。哺乳動物細胞株における発現のために、使用する発現カセットが哺乳動物プロモーター、リーダー配列およびターミネーターを使用する以外は、同様の手順を適用する（実施例１を参照のこと）。次に、この発現カセットを切りだし、そして、哺乳動物細胞株のトランスフェクションに適切なプラスミド中に挿入する。この様式において産生された抗体を、培地から精製して、標準的な免疫化学的方法を用いて、抗原との結合について試験し得る。
（実施例５５：ＨＡ−細胞接着分子融合タンパク質の調製）
目的の細胞接着分子のｃＤＮＡを、種々の手段によって、単離し得る。種々の手段としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：全て標準的な方法を用いる、ｃＤＮＡライブラリーから、一連の重複する合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲまたはＰＣＲによって。公知の細胞接着分子のヌクレオチド配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋのような公のデータべースにおいて、公知であり、かつ利用可能である。ｃＤＮＡを、５’末端および３’末端において改変して、制限部位を生成し得る。その結果、オリゴヌクレオチドリンカーを使用して、ｃＤＮＡを、ＨＡのｃＤＮＡをクローニングす
るためのベクター中にクローニングすることができる。このことは、Ｎ末端またはＣ末端において、スペーサー配列を用いて、または用いることなく、なし得る。細胞接着分子のｃＤＮＡを、ｐＰＰＣ０００５（図２）、ｐＳｃＣＨＳＡ、ｐＳｃＮＨＳＡ、またはｐＣ４：ＨＳＡのようなベクター中にクローニングする。次に、このようなベクターから、完全な発現カセットを切りだし、そして、プラスミドｐＳＡＣ３５中に挿入して、酵母中でのアルブミン融合タンパク質の発現を可能にする。次に、酵母から分泌されたアルブミン融合タンパク質を培地から収集して、精製し、その生物学的活性について、試験し得る。哺乳動物細胞株における発現のために、使用する発現カセットが哺乳動物プロモーター、リーダー配列およびターミネーターを使用する以外は、同様の手順を適用する（実施例１を参照のこと）。次に、この発現カセットを切りだし、そして、哺乳動物細胞株のトランスフェクションに適切なプラスミド中に挿入する。
（実施例５６：ＨＡ融合タンパク質（例えば、ＨＡ抗ウイルスインヒビター、ＨＡ抗菌性インヒビター、ＨＡ酵素インヒビターおよびＨＡ抗アレルギータンパク質）としての阻害因子およびペプチドの調製）
目的のペプチド（例えば、抗菌性ペプチド）のｃＤＮＡは、ｃＤＮＡライブラリーから、種々の手段（一連の重複合成オリゴヌクレオチドプライマーを使用するＲＴ−ＰＣＲおよびＰＣＲ（これら全ては標準的方法を使用する）を含むが、排他的ではない）によって単離され得る。ｃＤＮＡは、５’末端および３’末端で変更されて、制限部位を生成し得、その結果、オリゴヌクレオチドリンカーは、ＨＡのｃＤＮＡを含むベクターへのｃＤＮＡのクローニングのために使用され得る。これは、スペーサー配列を使用するかまたは使用せずに、Ｎ末端またはＣ末端においてであり得る。ペプチドｃＤＮＡは、ｐＰＰＣ０００５（図２）、ｐＳｃＣＨＳＡ、ｐＳｃＮＨＳＡまたはｐＣ４：ＨＳＡのようなベクターにクローニングされ、次いで、このベクターから、完全発現カセットが切り出され、そしてプラスミドｐＳＡＣ３５に挿入されて、酵母におけるアルブミン融合タンパク質の発現を可能にする。酵母から分泌されたアルブミン融合タンパク質は、次いで、収集され、そして培地から精製され、そしてその生物学的活性について試験され得る。哺乳動物細胞株における発現について、使用される発現カセットが哺乳動物プロモーター、リーダー配列およびターミネーターを使用する以外は、類似の手順が採用される（実施例１を参照のこと）。次いで、この発現カセットが、切り出され、そして哺乳動物細胞株のトランスフェクションに適したプラスミドに挿入される。
（実施例５７：標的付けられたＨＡ融合タンパク質の調製）
目的のタンパク質のｃＤＮＡを、標準的な分子生物学的方法を用いて、ｃＤＮＡライブラリーから単離し得るか、または、いくつかの重複するオリゴヌクレオチドを用いて合成し得る。適切なヌクレオチドを、ｃＤＮＡ中で操作して、都合よい制限部位を形成し得、そしてｈＧＨについて記載された方法と同様にして、タンパク質ｃＤＮＡの、アルブミンｃＤＮＡへの付着を可能にし得る。標的化タンパク質またはペプチドのｃＤＮＡ（例えば、単鎖抗体、あるいはタンパク質を細胞内に向け得る核局在化シグナルのようなペプチド）を、アルブミンの他の末端に融合し得る。目的のタンパク質および標的化ペプチドを、アルブミンｃＤＮＡとの融合を可能にするベクター（例えば、ｐＰＰＣ０００５（図２）、ｐＳｃＣＨＳＡ、ｐＳｃＮＨＳＡ、またはｐＣ４：ＨＳＡ）中にクローニングする。この様式において、アルブミンのＮ末端およびＣ末端の両方を、他のタンパク質と融合する。次に、融合したｃＤＮＡを、ｐＰＰＣ０００５から切り出し、そしてｐＳＡＣ３５のようなプラスミド中に挿入して、酵母中でのアルブミン融合タンパク質の発現を可能にする。上記の手順の全ては、分子生物学の標準的方法を用いて行うことができる。酵母から分泌されたアルブミン融合タンパク質を、培地から回収および精製して、適切な生化学的試験および生物学的試験を用いて、その生物学的活性および標的化活性について試験する。
（実施例５８：ＨＡ−酵素融合体の調製）
目的の酵素のｃＤＮＡを、種々の手段（排他的ではないが、全て標準的な方法を用いる、以下の手順が挙げられる、ｃＤＮＡライブラリーから、ＲＴ−ＰＣＲによって、および一連の重複する合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いるＰＣＲによって）によって単離し得る。ｃＤＮＡを、５’末端および３’末端で改変して、制限部位を作ることができ、その結果、オリゴヌクレオチドリンカーを、ｃＤＮＡをＨＡのｃＤＮＡを含むベクター
中にクローニングするために、使用し得る。この手順は、スペーサー配列を用いて、または用いることなく、Ｎ末端またはＣ末端において、なし得る。酵素ｃＤＮＡを、ｐＰＰＣ０００５（図２）、ｐＳｃＣＨＳＡ、ｐＳｃＮＨＳＡ、またはｐＣ４：ＨＳＡのようなベクター中にクローニングし、次に、そのベクターから、完全な発現カセットを切り出し、そしてプラスミドｐＳＡＣ３５中に挿入し、酵母でのアルブミン融合タンパク質の発現を可能にする。次に、酵母から分泌されたアルブミン融合タンパク質を、培地から回収して精製し、その生物学的活性について試験する。哺乳動物細胞株での発現のために、使用する発現カセットが哺乳動物のプロモーター、リーダー配列、およびターミネーターを用いる以外は、類似の手順を適用する（実施例１を参照のこと）。次にこの発現カセットを切り出し、そして哺乳動物細胞株へのトランスフェクションに適切なプラスミド中に挿入する。
（実施例５９：アルブミン融合タンパク質の細菌発現）
細菌のシグナル配列を含む、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、ＤＮＡ配列の５’末端および３’末端に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅し、挿入フラグメントを合成する。挿入物をコードするポリヌク
レオチドを増幅するために使用するプライマーは、増幅産物を発現ベクター中にクローニングするために、好ましくは、制限部位（例えば、ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩ）を、プライマーの５’末端に含む。例えば、ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩは、細菌発現ベクターｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）の制限酵素部位に対応する。このプラスミドベクターは、抗生物質耐性（Ａｍｐｒ）、細菌の複製起点（ｏｒｉ）、ＩＰＴＧ−調節可能なプロモーター／オペレーター（Ｐ／Ｏ）、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、６−ヒスチジンタグ（６−Ｈｉｓ）、および制限酵素クローニング部位をコードする。
ｐＱＥ−９ベクターを、ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで消化し、そして増幅したフラグメントを、細菌ＲＢＳで開始する読み枠を維持しながら、ｐＱＥ−９ベクターに連結する。次に、連結混合物を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｍ１５／ｒｅｐ４（ｌａｃＩリプレッサーを発現し、そしてまた、カナマイシン耐性を付与する（Ｋａｎｒ）プラスミドｐＲＥＰ４を多コピーで含む）（Ｑｕｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）を形質転換する。形質転換体を、ＬＢプレート上で増殖する能力によって同定し、そしてアンピシリン／カナマイシン耐性コロニーを選択する。プラスミドＤＮＡを単離し、そして制限分析によって確認する。
所望の構築物を含むクローンを、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）およびカナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）の両方を補充したＬＢ培地中の液体培養中で、オーバーナイト（Ｏ／Ｎ）で増殖させる。Ｏ／Ｎ培養物を使用して、１：１００から１：２５０の割合で、大量の培地に接種する。細胞を、光学密度６００（Ｏ．Ｄ．６００）が０．４から０．６の間まで、増殖させる。次に、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を、終濃度１ｍＭで添加する。ＩＰＴＧは、ｌａｃＩリプレッサーを不活化し、Ｐ／Ｏを空の状態にし、増加した遺伝子発現をもたらすことによって、誘導する。
細胞を、さらに３〜４時間増殖させる。次に、細胞を遠心によって収集する（６０００×ｇ、２０分）。細胞のペレットをカオトロピック剤である６ＭのグアニジンＨＣｌ、または、好ましくは、８Ｍ尿素、そして、０．１４Ｍより高濃度の２−メルカプトエタノール中で、３〜４時間、４℃で攪拌することによって、可溶化する（例えば、Ｂｕｒｔｏｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７９：３７９−３８７（１９８９）を参照のこと）。細胞のデブリを、遠心によって除去し、そしてポリペプチドを含む上清を、ニッケル−ニトリロ三酢酸（「Ｎｉ−ＮＴＡ」）アフィニティー樹脂カラム（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．前出より入手可能）上にロードする。６×Ｈｉｓタグを有するタンパク質は、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂に高親和性で結合し、そして単純なワンステップ手順で精製され得る（詳細については、Ｔｈｅ ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔ（１９９５）、ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．、前出、を参照のこと）。
手短には、上清を、６Ｍ グアニジン−ＨＣｌ（ｐＨ８）中でカラムにロードする。カラムを最初に、１０容量の６Ｍ グアニジン−ＨＣｌ、ｐＨ８で洗浄し、次に、１０容量の６Ｍ グアニジン−ＨＣｌ、ｐＨ６で洗浄し、最後に、ポリペプチドを６Ｍ グアニジン−ＨＣｌ、ｐＨ５で溶出する。
次に、精製したタンパク質を、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）、または２００ｍＭ ＮａＣｌを加えた５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ６緩衝液に対して、透析することによって、再生する。あるいは、タンパク質を、Ｎｉ−ＮＴＡカラムに固定化している間に、首尾よくリフォールディングし得る。例示的な条件は、以下のとおりである：プロテアーゼインヒビターを含む、５００ｍＭ ＮａＣｌ，２０％ グリセロール、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ７．４中でのリニアの６Ｍ〜１Ｍの尿素のグラジエントを用いる再生。再生は、１．５時間以上行うべきである。再生後、タンパク質を２５０ｍＭのイミダゾールを添加して溶出する。イミダゾールを、ＰＢＳまたは２００ｍＭ ＮａＣｌを加えた５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ６緩衝液に対する、最終的な透析工程によって除去する。精製したタンパク質を、４℃で保存するか、または−８０℃で凍結する。
上記の発現ベクターに加えて、本発明はさらに、ｐＨＥ４ａ（ＡＴＣＣアクセッション番号２０９６４５、１９９８年２月２５日寄託）と称する発現ベクターを含む。このベクターは、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結したファージのオペレーターエレメントおよびプロモーターエレメントを含む（ｐＨＥ４ａ（ＡＴＣＣアクセッション番号２０９６４５、１９９８年２月２５日寄託）と称する）。このベクターは、以下を含む：１）選択マーカーとしてのネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、２）Ｅ．ｃｏｌｉの複製起点、３）Ｔ５ファージプロモーター配列、４）２つのｌａｃオペレーター配列、５）シャイン−ダルガルノ配列、および６）ラクトースオペロンリプレッサー遺伝子（ｌａｃＩｑ）。複製起点（ｏｒｉＣ）は、ｐＵＣ１９（ＬＴＩ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）に由来する。プロモーターおよびオペレーター配列は、合成される。
ＤＮＡを、ベクターをＮｄｅＩおよびＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩまたはＡｓｐ７１８によって制限し、制限された産物をゲルに泳動し、そしてより大きなフラグメントを単離することによって、ｐＨＥ４ａ中に挿入し得る（スタッファーフラグメントは、約３１０塩基対である）。ＤＮＡ挿入物を、本明細書中に記載されるか、またはそうでなければ、当該分野において公知のＰＣＲプロトコールに従って、ＮｄｅＩ（５’プライマー）およびＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩまたはＡｓｐ７１８（３’プライマー）についての制限部位を有するＰＣＲプライマーを用いて、生成する。ＰＣＲ挿入物を、ゲルで精製し、そして適合する酵素を用いて制限する、挿入物およびベクターを、標準的なプロトコールに従って、連結する。
操作したベクターを、上記のプロトコールにおいて置換し、細菌の系においてタンパク質を発現し得る。
（実施例６０：哺乳動物細胞におけるアルブミン融合タンパク質の発現）
本発明のアルブミン融合タンパク質を、哺乳動物細胞内で発現し得る。典型的な哺乳動物発現ベクターは、ｍＲＮＡの転写開始を媒介するプロモーターエレメント、タンパク質コード配列、および転写終結および転写物のポリアデニル化に必要なシグナルを含む。さらなるエレメントとしては、エンハンサー、Ｋｏｚａｋ配列、およびＲＮＡスプライシングのためのドナー部位およびアクセプター部位に隣接する介在配列が挙げられる。高度に効率的な転写が、ＳＶ４０の初期プロモーターおよび後期プロモーター、レトロウイルス（例えば、ＲＳＶ、ＨＴＬＶＩ、ＨＩＶＩ）の長い末端反復（ＬＴＲ）、ならびにサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の初期プロモーターによって達成される。しかし、細胞性のエレメントもまた、使用し得る（例えば、ヒトアクチンプロモーター）。
本発明の実施における使用のための適切な発現ベクターとしては、例えば、（ｐＳＶＬおよびｐＭＳＧ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、ｐＲＳＶｃａｔ（ＡＴＣＣ ３７１５２）、ｐＳＶ２ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ ３７１４６）、ｐＢＣ１２ＭＩ（ＡＴＣＣ ６７１０９）、ｐＣＭＶＳｐｏｒｔ２．０、ならびにｐＣＭＶＳｐｏｒｔ３．０のようなベクターが挙げられる。使用され得る哺乳動物宿主細胞としては、限定されることはないが、ヒトのＨｅｌａ細胞、２９３細胞、Ｈ９細胞、およびジャーカット細胞、マウスのＮＩＨ３Ｔ３細胞およびＣ１２７細胞、Ｃｏｓ１細胞、Ｃｏｓ７細胞およびＣＶ１細胞、ウズラのＱＣ１−３細胞、マウスのＬ細胞、およびチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が挙げられる。
あるいは、アルブミン融合タンパク質を、染色体に組み込まれたアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、安定な細胞株において発現することができる。ＤＨＦＲ、ｇｐｔ、ネオマイシン、またはハイグロマイシンのような選択マーカーとのコトランスフェクションは、トランスフェクトした細胞の同定および単離を可能にする。
融合タンパク質をコードするトランスフェクションされたポリヌクレオチドを増幅させ、大量のコードされた融合タンパク質を発現し得る。ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸還元酵素）マーカーは、数百個または数千個ものコピー数の目的の遺伝子を保持する細胞株の作製に有用である。（例えば、Ａｌｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３：１３５７−１３７０（１９７８）；Ｈａｍｌｉｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１０９７：１０７−１４３（１９９０）；Ｐａｇｅら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：６４−６８（１９９１）を参照のこと。）別の有用な選択マーカーは、酵素グルタミンシンターゼ（ＧＳ）である（Ｍｕｒｐｈｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．２２７：２７７−２７９（１９９１）；Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６９−１７５（１９９２））。これらのマーカーを用いて、哺乳動物細胞を、選択培地中で増殖して、高度に耐性な細胞を、選択する。これらの細胞株は、染色体中に組み込まれた、増幅された遺伝子を含む。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞およびＮＳＯ細胞は、しばしば、タンパク質の産生に使用される。
プラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣアクセッション番号３７１４６）、発現ベクターｐＣ４（ＡＴＣＣアクセッション番号２０９６４６）、およびｐＣ６（ＡＴＣＣアクセッション番号Ｎｏ．２０９６４７）は、ラウス肉腫ウイルスの強力なプロモーター（ＬＴＲ）（Ｃｕｌｌｅｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４３８−４４７（Ｍａｒｃｈ，１９８５））、およびＣＭＶ−エンハンサー（Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ ４１：５２１−５３０（１９８５））を含む。複数のクローニング部位（例えば、制限酵素切断部位である、ＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩおよびＡｓｐ７１８を有する）は、目的の遺伝子のクローニングを促進する。ベクターはまた、ラットのプレプロインスリン遺伝子の３’イントロン、ポリアデニル化シグナルおよび終結シグナル、ならびにＳＶ４０初期プロモーターの制御下のマウスＤＨＦＲ遺伝子を含む。
具体的には、例えば、プラスミドｐＣ６を、当該分野において公知の手順によって、適切な制限酵素で消化し、次に、ウシ小腸ホスファターゼを用いて、脱リン酸化する。次に、ベクターを１％アガロースゲルから単離する。
本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、当該分野において公知の技術を用いて生成し、そしてこのポリヌクレオチドを、当該分野において公知のＰＣＲ技術を用いて増幅する。天然に生じるシグナル配列を使用して、本発明の融合タンパク質を産生する場合、ベクターは、第２のシグナルペプチドを必要としない。あるいは、天然に生じるシグナル配列を使用しない場合、ベクターを改変して、異種のシグナル配列を含ませ得る（例えば、国際公開ＷＯ９６／３４８９１号を参照のこと）。
本発明の融合タンパク質をコードする増幅されたフラグメントを、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」、ＢＩＯ １０１ Ｉｎｃ．、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａ．）を用いて、１％アガロースから単離する。次に、フラグメントを適切な制限酵素を用いて消化し、そして再度、１％アガロースにおいて精製する。
次に、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードする増幅したフラグメントを、同一の制限酵素で消化し、そして１％アガロースゲルで精製する。次に、単離されたフラグメントおよび脱リン酸化したベクターを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて連結する。次に、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１またはＸＬ−１ Ｂｌｕｅ細胞を、形質転換し、そして、例えば、制限酵素分析を用いて、プラスミドｐＣ６中に挿入されたフラグメントを含む細菌を同定する。
活性なＤＨＦＲ遺伝子を欠損するチャイニーズハムスター卵巣細胞を用いて、トランスフェクションする。５μｇの発現プラスミドｐＣ６またはｐＣ４を、リポフェクションを用いて、０．５μｇのプラスミドｐＳＶｎｅｏとコトランスフェクションする（Ｆｅｌｇｎｅｒら、前出）。プラスミドｐＳＶ２−ｎｅｏは、優性選択マーカーである、Ｇ４１８を含む一群の抗生物質に対する耐性を付与する酵素をコードするＴｎ５由来のｎｅｏ遺伝子を含む。細胞を、１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を補充したアルファマイナスＭＥＭに播種する。２日後、細胞をトリプシン処理し、そして、１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を添加した、１０、２５、または５０ｎｇ／ｍｌのメトトレキサートを補充したアルファマイナスＭＥＭ中のハイブリドーマクローニングプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、ドイツ）中に播種する。約１０〜１４日後、単一のクローンをトリプシン処理し、次に、６ウェルのペトリ皿、または１０ｍｌのフラスコに、異なる濃度のメトトレキサート（５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、４００ｎＭ、８００ｎＭ）を用いて、播種する。次に、最も高濃度のメトトレキサートで増殖するクローンを、なおより高濃度のメトトレキサート（１μＭ、２μＭ、５μＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ）を含む新たな６ウェルプレートに移す。同じ手順を、１００〜２００μＭの濃度で増殖するクローンが得られるまで反復する。所望の融合タンパク質の発現を、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットによって、または逆相ＨＰＬＣ分析によって、分析する。
（実施例６１：多重融合（ｍｕｌｔｉｆｕｓｉｏｎ）の融合）
アルブミン融合タンパク質（例えば、アルブミン（あるいはそのフラグメントまたは改変体）と融合した治療的タンパク質（あるいはそのフラグメントまたは改変体）が挙げられる）は、さらに他のタンパク質と融合し、「多重融合タンパク質」を生じ得る。これらの多重融合タンパク質は、様々な適用に使用され得る。例えば、本発明のアルブミン融合タンパク質とＨｉｓタグ、ＨＡタグ、プロテインＡ、ＩｇＧドメイン、およびマルトース結合タンパク質とを融合させることで、精製が容易になる（例えば、ＥＰ Ａ ３９４、８２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ３３１：８４−８６（１９８８）を参照のこと）。本発明のポリペプチドと融合された核局在化シグナルは、タンパク質を特定の細胞下領域に標的化し得るが、一方、共有結合性のヘテロ二量体またはホモ二量体はアルブミン融合タンパク質の活性を増加または低下させ得る。さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質とさらなるタンパク質配列との融合は、さらに融合タンパク質の可溶性および／または安定性を向上させ得る。前述の融合タンパク質は、当該技術分野で公知の技術を使用するかまたは慣用的な改変をすることによって、および／あるいは次のプロトコル（これはポリペプチドとＩｇＧ分子との融合の概説するものである）を改変することによって、製造され得る。
簡単に述べると、ＩｇＧ分子のヒトＦｃ部分は、以下に示す配列の５’末端および３’末端にわたるプライマーを用いて、ＰＣＲで増幅され得る。これらのプライマーはまた、発現ベクター、好ましくは哺乳動物または酵母の発現ベクター、へのクローニングを容易にするような便利な制限酵素部位を有すべきである。
例えば、ｐＣ４（ＡＴＣＣ受託番号２０９６４６）が使用される場合、ヒトＦｃ部分はＢａｍＨ’クローニング部位に連結され得る。３’ＢａｍＨ’部位が破壊されるはずであることに注意すべきである。次に、ヒトＦｃ部分を含むベクターはＢａｍＨ’に再度切り出され、ベクターに直線化し、そして本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド（当該技術分野の公知の技術を用いて生成および単離される）がこのＢａｍＨ’部位に連結される。本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは終止コドンを持たずにクローニングされ、そうでなければＦｃ含有融合タンパク質が生産されないということに注意すべきである。
本発明のアルブミン融合タンパク質を生産するために、天然のシグナル配列が用いられた場合、ｐＣ４は第２のシグナルペプチドを必要としない。あるいは、天然のシグナル配列が用いられない場合、ベクターは異種のシグナル配列（例えば、国際公開番号ＷＯ９６／３４８９１を参照のこと）を含むように改変され得る。
ヒトＩｇＧ Ｆｃ部分：
Figure 2014043448
 （実施例６２：アルブミン融合タンパク質由来の抗体の産生）
（ハイブリドーマ技術）
本発明のアルブミン融合タンパク質および本発明のアルブミン融合タンパク質の１部分（例えば、融合タンパク質の治療的タンパク質部分またはアルブミン部分）に結合する抗体は、様々な方法（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、第２章を参照のこと）によって調製され得る。そのような方法の１例として、本発明のアルブミン融合タンパク質または本発明のアルブミン融合タンパク質の１部分の調製物が、調製され、実質的に天然の汚染物を含まないように精製される。その後、そのような調製物はより大きな比活性を有するポリクローナル血清を生産するために、動物に導入される。
本発明のアルブミン融合タンパク質または本発明のアルブミン融合タンパク質の１部分に特異的なモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５（１９７５）；Ｋｏｈｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｌｏｌ．６：５１１（１９７６）；Ｋｏｈｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｌｏｌ．６：２９２（１９７６）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．、ｐｐ．５６３−６８１（１９８１））を用いて、調製される。一般に、動物（好ましくはマウス）は、本発明のアルブミン融合タンパク質または本発明のアルブミン融合タンパク質の１部分によって免疫される。そのようなマウスの脾臓細胞が抽出され、適切な骨髄腫細胞株と融合させられる。いずれの適切な骨髄腫細胞株も、本発明に従って使用され得る；しかし、親骨髄腫細胞株（ＳＰ２Ｏ）（ＡＴＣＣから利用可能である）の使用が好ましい。融合後、その結果生じたハイブリドーマ細胞は、ＨＡＴ培地中で選択的に維持され、その後、Ｗａｎｄｓら（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ８０：２２５−２３２（１９８１））によって記載されているように、限界希釈によってクローニングされる。そのような選択を介して得られたハイブリドーマ細胞は、その後、本発明のアルブミン融合タンパク質または本発明のアルブミン融合タンパク質の一部分に結合し得る抗体を分泌するクローンを同定するために、アッセイされる。
あるいは、本発明のアルブミン融合タンパク質または本発明のアルブミン融合タンパク質の一部分に結合し得るさらなる抗体が、抗イデオタイプ抗体を用いた２工程の手順により生産され得る。そのような方法は、抗体はそれ自体が抗原であり、そのため、２次抗体に結合する抗体を得ることが可能であるという事実を利用している。本方法に従って、抗体に特異的なタンパク質は動物、好ましくはマウスを免疫するために使用される。その後、そのような動物の脾臓細胞はハイブリドーマ細胞を生産するために使用され、このハイブリドーマ細胞は、本発明のアルブミン融合タンパク質（または本発明のアルブミン融合タンパク質の一部分）に特異的な抗体に結合する能力が本発明の融合タンパク質または本発明のアルブミン融合タンパク質の１部分によってブロックされ得る抗体を産生するクローンを同定するために、スクリーニングされる。そのような抗体は、本発明の融合タンパク質（または本発明のアルブミン融合タンパク質の１部分）に特異的な抗体に対する、抗イデオタイプ抗体を含み、本発明の融合タンパク質（または本発明のアルブミン融合タンパク質の１部分）に特異的な抗体のさらなる形成を誘導する目的で、動物に免疫するために使用される。
ヒトにおける抗体のインビボ使用のために、抗体は「ヒト化」される。そのような抗体は上述のモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞由来の遺伝的構築物を用いることで、産生され得る。キメラおよびヒト化抗体を生産する方法は、当該技術分野において公知であり、本明細書中で議論されている（総説として、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ２２９：１２０２（１９８５）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ４：２１４（１９８６）；Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許番号４，８１６，５６７；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら、ＥＰ１７１４９６；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、ＥＰ１７３４９４；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、ＷＯ８６０１５３３；Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、国際公開番号８７０２６７１；Ｂｏｕｌｉａｎｎｅら、Ｎａｔｕｒｅ３１２：６４３（１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ３１４：２６８（１９８５）を参照のこと）。
（ｓｃＦｖｓのライブラリー由来の、本発明のアルブミン融合タンパク質または本発明のアルブミン融合タンパク質の１部分に対する抗体フラグメントの単離）
ヒトＰＢＬから単離された天然のＶ遺伝子は、本発明のアルブミン融合タンパク質または本発明のアルブミン融合タンパク質の一部分に対する反応性を含む抗体フラグメントのライブラリーに構築されている。そこには、ドナーがさらされてもよいし、またはさらされなくてもよい。（例えば、本明細書においてその全体が参考として援用される米国特許番号５，８８５，７９３を参照のこと）
（ライブラリーのレスキュー）
ｓｃＦｖｓのライブラリーは、国際公開番号ＷＯ９２／０１０４７に記載されているように、ヒトＰＢＬのＲＮＡから構築されている。抗体フラグメントを提示しているファージをレスキューするために、ファージミドを保有する約１０９個のＥ．ｃｏｌｉが使用され、１％ グルコースおよび１００μｇ／ｍｌ アンピシリンを含む２×ＴＹ（２×ＴＹ−ＡＭＰ−ＧＬＵ）（５０ｍｌ）に播種され、Ｏ．Ｄ．が０．８になるまで振とうしながら増殖させる。この培養液のうち５ｍｌが、２×ＴＹ−ＡＭＰ−ＧＬＵ（５０ｍｌ）に播種するために使用され、２×１０８ＴＵのデルタ遺伝子３ヘルパー（Ｍ１３デルタ遺伝子’’’、国際公開番号ＷＯ９２／０１０４７を参照のこと）が添加され、振とうせずに３７℃で４５分、その後、振とうしながら３７℃で４５分、培養液がインキュベートされる。培養液は４０００ｒ．ｐ．ｍ．で１０分間の間、遠心分離され、ペレットは、１００μｇ／ｍｌ アンピシリンおよび５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含む２×ＴＹ（２ｌ）に再懸濁され、一晩増殖させられる。ファージは、国際公開番号ＷＯ９２／０１０４７に記載されているように、調製される。
Ｍ１３デルタ遺伝子ＩＩＩは、次のように調製される：Ｍ１３デルタ遺伝子ＩＩＩヘルパーファージは遺伝子ＩＩＩタンパク質をコードしておらず、そのため、抗体フラグメントを提示しているファージ（ミド）が抗原への大きな結合能力を持っている。感染性のＭ１３デルタ遺伝子ＩＩＩ粒子は、ファージの形態形成の間に、野生型の遺伝子ＩＩＩタンパク質を提供するｐＵＣ１９派生物を保有する細胞中で、ヘルパーファージが増えることによって、作られる。培養液は、振とうさせずに３７℃で１時間、その後、振とうしながらさらに３７℃で１時間インキュベートされる。細胞は、スピンダウンされ（ＩＥＣ−Ｃｅｎｔｒａ ８，４００ｒ．ｐ．ｍ．で１０分間）、１００μｇ／ｍｌ アンピシリンおよび２５μｇ／ｍｌカナマイシンを含む２×ＴＹブロス（２×ＴＹ−ＡＭＰ−ＫＡＮ）（３００ｍｌ）に再懸濁され、振とうしながら３７℃で一晩増殖させられた。ファージ粒子は、２回のＰＥＧ沈降（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９９０）によって、培養培地から生成され、集められ、２ｍｌのＰＢＳに再懸濁され、０．４５μｍフィルターを通されて、最終濃度が約１０１３単位／ｍｌ（アンピシリン耐性クローン）となった。
（ライブラリーのパニング）
イムノチューブ（Ｎｕｎｃ）がＰＢＳ中で、１００μｇ／ｍｌまたは１０μｇ／ｍｌの本発明のアルブミン融合タンパク質または本発明のアルブミン融合タンパク質の１部分（４ｍｌ）によって一晩ーティングされた。チューブは３７℃で２時間、２％ Ｍａｒｖｅｌ−ＰＢＳによってブロックされ、その後、ＰＢＳで３回洗浄される。約１０１３ＴＵのファージがチューブに適用され、ターンテーブルの上および下で横に倒したまま、室温で３０分、インキュベートされる。そして、さらに１．５時間静置したままにしておかれる。チューブはＰＢＳ ０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０で１０回およびＰＢＳで１０回、洗浄される。ファージは１ｍｌの１００ｍＭトリエチルアミンを加え、ターンテーブル上および下で１５分間、回転させる（この後、溶液がすぐに０．５ｍｌの１．０Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）で中和される）ことで溶出される。その後、ファージは、溶出されたファージを細菌と３７℃で３０分間、インキュベートすることにより、１０ｍｌの中ログ期のＥ．ｃｏｌｉ ＴＧ１に感染させるために使用される。その後、このＥ．ｃｏｌｉは、１％ グルコースおよび１００μｇ／ｍｌ アンピシリンを含むＴＹＥプレートにプレートされる。そして、その結果生じた細菌ライブラリーは、ファージを調製するために上で記載したように、この後の選択の段階でデルタ遺伝子３ヘルパーファージによってレスキューされる。その後、このプロセスでは、親和性精製が計４回繰り返され、ここでＰＢＳ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０で２０回、３回目と４回目においてはＰＢＳで２０回、チューブを洗浄される。
（結合体の特徴付け）
第３回目、第４回目の選択から溶出されたファージは、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ２１５１を感染させるために使用され、アッセイよる単一のコロニーから可溶性ｓｃＦｖが生産される（Ｍａｒｋｓら、１９９１）。ＥＬＩＳＡ法が、５０ｍＭ重炭酸イオン緩衝剤（ｐＨ９．６）中で、１０ｐｇ／ｍｌの本発明のアルブミン融合タンパク質または本発明のアルブミン融合タンパク質の１部分のいずれかでコートされたマイクロタイトレプレートによって、実施される。ＥＬＩＳＡでポジティブなクローンは、さらにＰＣＲフィンガープリンティング法（例えば、国際公開番号ＷＯ９２／０１０４７を参照のこと）、およびその後の配列決定によって、特徴付けられる。これらのＥＬＩＳＡポジティブクローンはまた、当該技術分野において公知である技術（例えば、エピトープマッピング、結合親和性、レセプターシグナル伝達、抗体／抗原結合をブロックするかまたは競合的に阻害する能力、および競合的アゴニスト活性またはアンタゴニスト活性）によって、さらに特徴付けられ得る。
（実施例６３：エキソビボでの遺伝子治療を使用する処置の方法）
遺伝子治療の１つの方法は、線維芽細胞を移植し、これは、本発明のアルブミン融合タンパク質を患者へと発現し得る。一般的に、線維芽細胞は、皮膚生検によって被験体から得られる。得られた組織を、組織培養培地に配置し、小片に分離する。この組織の小塊を組織培養フラスコの湿潤表面に配置し、約１０片を各フラスコに配置する。フラスコを上下に振り、硬く閉めて、室温で一晩置く。室温で２４時間後、フラスコを反転させ、組織塊を、フラスコの底部に固定されたままにし、新鮮な培地（例えば、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２培地（１０％ＦＲＳ、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含む））を加える。次いで、フラスコを３７℃で約１週間インキュベートする。
このときに、新鮮な培地を加え、続いて、数日ごとに入れ替える。培養のさらに２週間後、線維芽細胞の単層が、現れる。この単層をトリプシン処理し、より大きいフラスコにスケールを合わせる。
ｐＭＶ−７（Ｌｉｒｓｃｈｍｅｉｅｒ，Ｐ．Ｔ．ら，ＤＮＡ，７：２１９−２５（１９８８））（Ｍｏｌｏｎｅｙマウス肉腫ウイルスおｎ長末端反復に隣接する）を、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩにより消化し、続いて、子ウシ腸ホスファターゼにより処理する。線形ベクターをアガロースゲル上で分画し、ガラスビーズを使用して精製する。
本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、当該分野で公知の技術を使用して生成され得、ＰＣＲプライマーを用いて増幅され得、これは、５’末端配列および３’末端配列に対応し、必要に応じて、適切な制限部位を有し、必要であれば、開始コドン／終止コドンを有する。好ましくは、５’プライマーは、ＥｃｏＲＩ部位を含み、３’プライマーは、ＨｉｎｄＩＩＩ部位を含む。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼの存在下、当量のＭｏｌｏｎｅｙマウス肉腫ウイルス線形背骨ならびに増幅されたＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを一緒に加える。得られる混合物を２つのフラグメントの連結に適切な条件下で維持する。次いで、連結混合物を使用して、細菌ＨＢ１０１を形質転換し、次いで、ベクターが適切に挿入された目的の遺伝子を有することを確認する目的で、これを寒天（カナマイシンを含む）上にプレーティングする。
両性（ａｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ）ｐＡ３１７またはＧＰ＋ａｍ１２パッケージ細胞を、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）（１０％子ウシ血清（ＣＳ）、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含む）中で、コンフルエント密度まで組織培養で増殖する。次いで、この遺伝子を含むＭＳＶベクターを培地に加え、パッケージ細胞をベクターにより変換する。ここで、パッケージ細胞は、環先生ウイルス粒子（遺伝子（ここで、パッケージ細胞はプロデューサー細胞と称される）を含む）を生成する。
新鮮な培地を変換されたプロデューサー細胞に加え、続いて、この培地をコンフルエントプロデューサー細胞の１０ｃｍプレートから回収する。消費培地（感染性ウイルス粒子を含む）を、ミルポアフィルターを通じて濾過し、解離したプロデューサー細胞を除去し、次いで、この培地を使用して、繊維が細胞を感染させる。培地を線維芽細胞の半コンフルエントプレートから除去し、プロデューサー細胞からの培地により迅速に置換する。この培地を除去し、新鮮な培地で置換する。ウイルスの力価が高い場合、実質的に全ての線維芽細胞が感染され、選択の必要はない。力価が非常に低い場合、選択可能なマーカー（例えば、ｎｅｏまたはｈｉｓ）を有するレトロウイルスベクターを使用することが必要である。一旦、線維芽細胞が効率的に感染されると、線維芽細胞を分析して、アルブミン融合タンパク質が産生されたか否かを決定する。
次いで、単独またはｃｙｔｏｄｅｘ３マイクロキャリアビーズ上でコンフルエンスまで増殖した後に、操作された線維芽細胞を宿主に移植する。
（実施例６４：インビボでの遺伝子治療を使用する処置の方法）
本発明の別の局面は、インビボ遺伝子治療法を使用して、障害、疾患および状態を処置することである。遺伝子治療法は、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードする裸の核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ）の動物への導入に関する。本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、標的組織によってポリペプチドの発現に必要なプロモーターまたは任意の他の遺伝子エレメントに作動可能に連結（すなわち、会合）され得る。このような遺伝子治療および送達技術および方法は、当該分野で公知である。例えば、Ｗ０９０／１１０９２， Ｗ０９８／１１７７９ ； 米国特許第５６９３６２２， 同第５７０５１５１号， 同第５５８０８５９号 ； Ｔａｂａｔａら， Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ． Ｒｅｓ． ３５ （３）： ４７０−４７９ （１９９７）； Ｃｈａｏら， Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｒｅｓ． ３５ （６）： ５１７−５２２ （１９９７）； Ｗｏｌｆｆ， Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ． Ｄｉｓｏｒｄ． ７ （５）： ３１４−３１８ （１９９７）； Ｓｃｈｗａｒｔｚら， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ３ （５）： ４０５−４１１ （１９９６）； Ｔｓｕｒｕｍｉら， Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ９４ （１２）： ３２８１− ３２９０ （１９９６）（本明細書で参考として援用される）。
ポリヌクレオチド構築物は、注射可能な物質を動物の細胞に送達する任意の方法（例えば、組織の間質空間（心臓、筋肉、皮膚、肺、肝臓、腸など）への注射）によって送達され得る。ポリヌクレオチド構築物は、薬学的に受容可能な液体または水性キャリアで送達され得る。
用語「裸の」ポリヌクレオチド、ＤＮＡまたはＲＮＡとは、細胞への進入を補助、増進または促進するように作用する任意の送達ビヒクル（ウイルス配列、ウイルス粒子、リポソーム処方物、リポフェクチンまたは沈殿剤など）を含まない配列をいう。しかし、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、リポソーム処方物で送達され得（例えば、Ｆｅｌｇｎｅｒ Ｐ． Ｌら． （１９９５） Ａｎｎ． ＮＹ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ７７２： １２６−１３９およびＡｂｄａｌｌａｈ Ｂ．ら． （１９９５） Ｂｉｏｌ． Ｃｅｌｌ ８５ （１） ： １−７に教示されているもの）、これらは、当業者に周知の方法によって調製され得る。
遺伝子治療法において使用されるポリヌクレオチドベクター構築物は、好ましくは、宿主ゲノムへ一体化も、複製を可能にする配列を含みもしない構築物である。当業者に公知の任意の強力なプロモーターは、ＤＮＡの発現を駆動させるために使用され得る。他の遺伝子治療技術とは異なり、裸の核酸配列を標的細胞に導入することの１つの主要な利点は、細胞におけるポリヌクレオチド合成の一時的な性質である。非複製ＤＮＡ配列が、細胞に導入されて、６ヶ月までの期間で所望のポリペプチドの産生を提供し得ることが、研究により示されている。
ポリヌクレオチド構築物は、動物内の以下の組織の間質空間に送達され得る：筋肉、皮膚、脳、配、肝臓、秘蔵、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、血液、骨、軟骨、膵臓、腎臓、胆嚢、胃、腸、精巣、卵巣、子宮、直腸、神経系、眼、腺、および結合組織。これらの組織の間質空間は、細胞間流体、器官組織の細網線維間にあるムコ多糖マトリクス、脈管または室の壁の弾性線維、線維性組織のコラーゲン線維、または筋肉細胞を覆う結合組織内もしくは骨の空隙内の同じマトリクスを含む。それは、同様に、循環血漿およびリンパチャネルのリンパ流体により占められた空間である。筋組織の間質空間への送達が、以下に考察される理由から好ましい。それらは、これらの細胞を含む組織に注射によって簡便に送達され得る。それらは、好ましくは、分化された非分裂細胞へと、持続的に送達および発現されるが、送達および発現は、非分化の細胞またはより完全には分化していない細胞（例えば、血液の幹細胞または皮膚線維芽細胞）において達成され得る。インビボで、筋細胞は、ポリヌクレオチドの取り込みおよび発現の能力において特に有能である。
裸のポリヌクレオチド注射について、ＤＮＡまたはＲＮＡの有効投薬量は、約０．０５ｇ／ｋｇ体重〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。好ましくは、投薬量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、そしてより好ましくは、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇである。もちろん、当業者が理解するように、この投薬量は、注射する組織によって変化する。核酸配列の適切かつ有効な投薬量は、当業者によって容易に決定され得、処置される状態および投与経路に依存し得る。好ましい投与経路は、組織の間質空間への注射という非経口経路によるものである。しかし、他の非経口経路（例えば、肺または気管支組織、喉または鼻の粘膜への送達については、特に、エアロゾル処方物の吸入）もまた、使用され得る。さらに、裸のポリヌクレオチド構築物は、手技において使用されるカテーテルによる血管形成の間に、動脈へと送達され得る。
筋肉内に注射されたポリヌクレオチドのインビボでの投薬量応答効果は、以下のように決定される。本発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡの産生に適切なテンプレートＤＮＡを、標準的な組換えＤＮＡ方法論に従って調製する。テンプレートＤＮＡ（これは、環状または線形のいずれでもよい）を、裸のＤＮＡとして使用するか、またはリポソームと複合体化させる。次いで、マウスの四頭筋に、種々の量のテンプレートＤＮＡを注射する。
５〜６週齢のメスおよびオスのＢａｌｂ／Ｃマウスを、０，３ｍｌの２．５％Ａｂｅｒｔｉｎによる腹腔内注射によって麻酔する。１．５ｃｍの切開を前部大腿に作製し、四頭筋を直接視覚化する。１ｃｃ注射器の２７ゲージ針を通して１分間にわたり、膝への筋肉の遠位注射部位から約０．５ｃｍおよび深さ約０．２ｃｍで、０．１ｍｌのキャリアにより、テンプレートＤＮＡを注射した。将来の局在化のために、縫合糸を注入部位に配置し、そして皮膚をステンレス鋼クリップで閉じる。
適切なインキュベーション時間（例えば、７日）後、筋肉抽出物を、四頭筋全体を切開することによって調製する。個々の四頭筋の各５番目の断面をタンパク質発現について組織化学的に染色する。融合たんぱく質についての時間経過は、異なるマウス由来の四頭筋を異なる時間において回収することを除いて、類似の様式で実施し得る。注射後の筋肉内のＤＮＡの持続性は、注射したマウスおよびコントロールマウスからの全細胞ＤＮＡおよびＨＩＲＴ上清を調製後の、サザンブロット分析により決定され得る。マウスにおける上述の実験の結果を使用して、ヒトおよび他の動物にける、裸のＤＮＡを使用する適切なパラメータおよび他の処置パラメータを補間し得る。
（実施例６５：トランスジェニック動物）
本発明のアルブミン融合タンパク質はまた、トランスジェニック動物において発現され得る。任意の種の動物（マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、ブタ、小ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウシならびに非ヒト霊長類（例えば、ヒヒ、サル、およびチンパンジー）が挙げられるが、これらに限定されない）を使用して、トランスジェニック動物を生成し得る。特定の実施形態において、本明細書で記載される技術またはそうでなければ当該分野で公知の技術を使用して、ヒトにおいて遺伝子治療プロトコルの一部として本発明の融合タンパク質を発現する。
当該分野で公知の任意の技術を使用して、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを動物に導入し、トランスジェニック動物の初代系統を生成し得る。このような技術としては、このような技術としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：前核マイクロインジェクション（Ｐａｔｅｒｓｏｎら， Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ４０： ６９１−６９８ （１９９４）； Ｃａｒｖｅｒら， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （ＮＹ） １１： １２６３−１２７０ （１９９３）； Ｗｒｉｇｈｔら， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （ＮＹ） ９： ８３０−８３４ （１９９１）；およびＨｏｐｐｅら， 米国特許第４，８７３， １９１号（１９８９））；生殖系統（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｕｔｔｅｎら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ， ＵＳＡ ８２： ６１４８−６１５２ （１９８５））、芽細胞または胚細胞へのレトロウイルス媒介性遺伝子移入；胚性幹細胞における遺伝子標的化（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら， Ｃｅｌｌ ５６： ３１３−３２１ （１９８９））；細胞または胚のエレクトロポレーション（Ｌｏ， １９８３， Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ３： １８０３− １８１４（１９８３））；遺伝子銃を使用する本発明のポリヌクレオチドの導入（例えば、Ｕｌｍｅｒら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９： １７４５ （１９９３）を参照のこと）；核酸構築物の胚性胸膜能幹細胞への導入および幹細胞の芽細胞への移入；ならびに精液媒介性遺伝子移入（Ｌａｖｉｔｒａｎｏら， Ｃｅｌｌ ５７： ７１７−７２３ （１９８９））；など。このような技術の総説としては、Ｇｏｒｄｏｎ， ”Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｎｉｍａｌｓ， ”Ｉｎｔｌ． Ｒｅｖ． Ｃｙｔｏｌ． １１５： １７１−２２９ （１９８９）（これは、その全体が本
明細書で参考として援用される）を参照のこと。
当該分野で公知の任意の技術（例えば、休止へと誘導された、培養された胚性胎児、または成体細胞由来の核の除核された卵母細胞への核移入（Ｃａｍｐｅｌｌら， Ｎａｔｕｒｅ ３８０ ： ６４−６６ （１９９６）； Ｗｉｌｍｕｔら， Ｎａｔｕｒｅ ３８５： ８１０−８１３ （１９９７）））を使用して、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むトランスジェニッククローンを生成し得る。
本発明は、細胞全体に本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを保有するトランスジェニック動物、ならびに細胞全体ではないが、幾らかこれらのポリヌクレオチドを保有する動物（すなわち、モザイク動物またはキメラ動物）を提供する。トランスジーンは、単一のトランスジーンとしてか、またはコンカタマー（ｃｏｎｃａｔａｍｅｒ）における複数のコピー（例えば、頭頭連結または頭尾連結）として一体化され得る。このトランスジーンはまた、例えば、Ｌａｓｋｏら（Ｌａｓｋｏら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９： ６２３２−６２３６ （１９９２） ）の教示に従うことによって、特定の細胞型へと選択的に導入され得、そして活性化され得る。細胞型特異的活性化に必要な調節配列は、目的の特定の細胞型に依存し、当業者に対して明らかである。本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが、治療タンパク質部分または本発明のアルブミン融合タンパク質に対応する内因性遺伝子の染色体部位に一体化されることが望まれる場合、遺伝子標的化が好ましい。簡単に言うと、このような技術が、利用される場合、内因性遺伝子に相同性の幾つかのヌクレオチド配列を含むベクターは、染色体配列による相同性組換えを介する、内因性遺伝子のヌクレオチド配列への一体化およびその機能の破壊の目的のために設計される。トランスジーンはまた、特定の細胞型に選択的に導入され得、従って、例えば、Ｇｕら（Ｇｕら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６５： １０３−１０６ （１９９４） ）の教示に従うことによって、その細胞型のみにおいて内因性遺伝子を不活性化し得る。このような細胞特異的不活性化に必要な調節配列は、目的の特定の細胞型に依存し、当業者に対して明らかである。
一旦、トランスジェニック動物が生成されると、組換え遺伝子の発現を、標準的技術を利用してアッセイし得る。初期スクリーニングは、動物組織を分析するためのサザンブロット分析またはＰＣＲ技術によって達成され、本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの一体化が生じたことを検証し得る。トランスジェニック動物の組織における、本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドのｍＲＮＡ発現のレベルはまた、以下が挙げられるが、これらに限定されない技術を使用して評価され得る：動物から得られる組織サンプルのノーザンブロット分析、インサイチュハイブリダイゼーション分析、および逆転写酵素ＰＣＲ（ｒｔ−ＰＣＲ）。融合タンパク質発現組織のサンプルはまた、融合タンパク質に特異的な抗体を使用して、免疫細胞化学的に、または免疫組織化学的に評価され得る。
一旦、創始動物が生成されると、それらを繁殖し、同系交配し、異種交配し、または交雑育種して、特定の動物のコロニーを生成し得る。このような繁殖ストラテジーの例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：創始動物と１つより多い一体化部位とを異種交配して、別々の系統を確立する；別々の系統を同系交配して、各トランスジーンのさらなる発現の効果に起因して、より高いレベルでトランスジーンを発現する化合物トランスジェニック体を生成する；所定の一体化部位にヘテロ接合性の動物を生成するように、ヘテロ接合トランスジェニック動物を交配させて、発現を補強し、かつ、ＤＮＡ分析による動物のスクリーニングの必要性を排除する；別個のヘテロ接合体系統を交配させて、化合物ヘテロ接合体系統またはホモ接合体系統を生成する；ならびに目的の実験モデルに適切な別個のバックグランドに対してトランスジーン（すなわち、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド）を配置するように繁殖する。
本発明のトランスジェニック動物は、以下が挙げられるが、これらに限定されない用途を有する：本発明の融合タンパク質の生物学的機能を推定するのに有用な動物モデル系ならびに本発明の融合タンパク質の治療タンパク質および／またはアルブミン成分、異常な発現に関連する状態および／または障害の研究、ならびにこのような状態および／または障害を改善するのに有効な化合物のスクリーニング。
（実施例６６：Ｂ細胞および分化の刺激または増殖を検出するアッセイ）
機能的体液性免疫応答の生成には、Ｂ連結細胞とそれらの微小環境との間に可溶性かつ同族のシグナル伝達が必要である。シグナルは、Ｂ連結細胞がそのプログラムされた発達を持続し得るポジティブな刺激か、または細胞にその現在の発達経路を停止するように指示するネガティブな刺激を与え得る。今日まで、多くの刺激性シグナルおよび阻害性シグナルが、Ｂ細胞応答（ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４およびＩＬ−１５）に影響を及ぼすことが見出されている。興味深いことに、これらのシグナルは、それら単独では弱いエフェクターであるが、種々の同時刺激性タンパク質と組み合わせると、Ｂ細胞集団の間で、活性化、増殖、分化、ホーミング（ｈｏｍｉｎｇ）、寛容性および死を誘導し得る。
Ｂ細胞同時刺激性タンパク質の最もよく研究されたクラスの１つは、ＴＮＦスーパーファミリーである。このファミリーにおいて、それぞれのリガンドであるＣＤ１５４、ＣＤ７０、およびＣＤ１５３をともなうＣＤ４０、ＣＤ２７、およびＣＤ３０は、種々の免疫応答を調節することが見出されている。これらのＢ細胞集団およびこれらの前駆体の増殖および分化の検出および／または観察を可能にするアッセイは、増殖および分化の点においてこれらのＢ細胞集団に対する種々のタンパク質の効果を決定する価値あるツールである。以下に列挙される２つのアッセイは、Ｂ細胞集団およびこれらの前駆体の分化、増殖、または阻害の検出を可能にするように設計される。
インビトロアッセイ− 本発明のアルブミン融合タンパク質（治療タンパク質のフラグメントもしくは改変体ならびに／またはアルブミンあるいは種々のアルブミンのフラグメントもしくは改変体を含む）は、Ｂ細胞集団およびこれらの前駆体において活性化、増殖、分化、阻害および／または死を誘導するそれらの能力について評価され得る。精製されたヒト扁桃Ｂ細胞に対する本発明のアルブミン融合タンパク質の活性（０．１〜１０，０００ｎｇ／ｍＬの範囲の投薬量に対して定量的に測定された）を、標準的なＢリンパ細胞同時刺激アッセイにおいて評価し、ここで、プライム剤としてのホルマリン固定Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃｏｗａｎ Ｉ （ＳＡＣ）または固定化抗ヒトＩｇＭ抗体のいずれかの存在下で、精製された扁桃Ｂ細胞を培養する。第２のシグナル（例えば、ＩＬ−２およびＩＬ−１５）は、ＳＡＣとＩｇＭとの架橋と共同作用して、トリチウム化チミジン取り込みによって測定されるように、Ｂ細胞増殖を誘導する。新規な相乗効果剤は、このアッセイを使用して容易に同定され得る。このアッセイは、磁気ビーズ（ＭＡＣＳ）またはＣＤ３ポジティブ細胞の欠損によってヒト扁桃Ｂ細胞を単離する工程を包含する。得られる細胞集団は、ＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）の発現によって評価されるようにＢ細胞が９５％より多い。
各サンプルの種々の希釈物を、９６ウェルプレートの個々のウェルにプレーティングし、これに、１５０μＬの全容量の培養培地（ＲＰＭＩ１６４０であり、１０％ ＦＢＳ， ５ Ｘ １０−５Ｍ ２ＭＥ， １００Ｕ／ｍｌ ペニシリン， １０ｕｇ／ｍｌ ストレプトマイシン，および１０−５ ＳＡＣの希釈物を含む）に懸濁された１０５Ｂ細胞を加える。要素添加の７２時間後に、３Ｈ−チミジン（６．７ Ｃｉ／ｍＭ）による２０時間のパルス（１ｕＣｉ／ウェル）を開始することによって、増殖または阻害を定量する。ポジティブおよびネガティブのコントロールは、それぞれＩＬ２および培地である。
インビボアッセイ− １日に２回緩衝液のみか、または本発明のアルブミン融合タンパク質（治療タンパク質のフラグメントもしくは改変体ならびに／またはアルブミンあるいは種々のアルブミンのフラグメントもしくは改変体を含む）を、ＢＡＬＢ／ｃマウスに注射（ｉ．ｐ．）する。マウスは、４日連続してこの処理を受け、この時点で、それらを屠殺して、種々の組織および血清を分析のために回収する。正常脾臓および本発明のアルブミン融合タンパク質により処理された脾臓からのＨ＆Ｅセクションの比較により、脾臓細胞に対する融合タンパク質の活性の結果（例えば、抹消動脈リンパ鞘の拡散、および／または赤脾髄の有核声望の有意な増加）が同定され、このことは、Ｂ細胞集団の分化および増殖の活性化を示し得る。Ｂ細胞マーカーである抗ＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）を用いる免疫組織化学的研究を使用して、脾臓細胞に対する任意の生理学的変化（例えば、脾臓分離）が、確立されたＴ細胞領域に浸潤するゆるく規定されたＢ細胞領域内での増加したＢ細胞提示に起因するか否かを決定する。
アルブミン融合タンパク質により処理されたマウス由来の脾臓のフローサイトメトリ分析を使用して、アルブミン融合タンパク質が、コントロールマウスにおいて観察される以上に、ＴｈＢ＋， ＣＤ４５Ｒ （Ｂ２２０） ｄｕｌｌ Ｂ細胞の比率を増加させるか否かを示す。
同様に、インビボでの増加した成熟Ｂ細胞提示の予測された結果は、比較的増大した血漿Ｉｇ力価である。従って、血漿ＩｇＭおよびＩｇＡのレベルは、緩衝液と融合タンパク質処理されたマウスとの間に匹敵する。
（実施例６７：Ｔ細胞増殖アッセイ）
ＣＤ３誘導性増殖アッセイをＰＢＭＣに対して実施し、そして３Ｈ−チミジンの取り込みによって測定する。このアッセイは以下のように実施する。９６ウェルプレートを、ＣＤ３に対して１００μｌ／ウェルのｍＡｂ（ＨＩＴ３ａ，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）か、またはイソ型適合コントロールｍＡｂ（Ｂ３３．１）により、４℃で一晩コーティング（０．０５Ｍ 炭酸塩緩衝液中１μｇ／ｍｌ、ｐＨ９．５）し、次いで、ＰＢＳで３回洗浄する。Ｆ／Ｈ勾配遠心分離により、ヒト抹消血からＰＢＭＣを単離し、ＲＰＭＩ（１０％ ＦＣＳおよびＰ／Ｓを含む）中、種々の濃度の本発明のアルブミン融合タンパク質（治療タンパク質のフラグメントもしくは改変体ならびに／またはアルブミンあるいは種々のアルブミンのフラグメントもしくは改変体を含む）（全容量２００μｌ）の存在下で、ｍＡｂコーティングプレートの４連のウェル（５ ｘ １０４ウェル）に加える。関連タンパク質緩衝液および培地単独をコントロールとする。３７℃での４８時間の培養後、１０００ｒｐｍで２分間回転させ、そして１００μｌの上清を除去し、増殖に対する影響が観察される場合、ＩＬ−２（または他のサイトカイン）の測定のために−２０℃で保存する。
１００μｌの培地（０．５ｕＣｉの３Ｈ−チミジン）をウェルに補充し、そして、３７℃で１８〜２４時間培養する。ウェルを回収し、増殖の測定のように、３Ｈ−チミジンの取り込みを使用する。抗ＣＤ３単独は、増殖についてのポジティブコントロールである。ＩＬ−２（１００Ｕ／ｍｌ）をまた、コントロールとして使用し、これは、増殖を増強する。Ｔ細胞の増殖を誘導しないコントロール抗体を、本発明の融合タンパク質の効果についてのネガティブコントロールとして使用する。
（実施例６８：ＭＨＣクラスＩＩ、同時刺激分子および細胞接着分子の発現、ならびに単球および単球由来ヒト樹状細胞の細胞分化に関する本発明の融合タンパク質の影響）
樹状細胞を、末梢血において見出される増殖前駆体の拡大によって生成する：接着ＰＢＣＭまたはエルトリエーションした単球画分は、ＧＭ−ＣＳＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）およびＥＬ−４（２０ｎｇ／ｍｌ）とともに７〜１０日間培養する。これらの樹状細胞を、未成熟細胞（ＣＤ１、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０およびＭＨＣクラスＩＩ抗原の発現）の特徴的な表現型を有する。ＴＮＦ−αのような活性化因子での処理は、表面の表現型（ＮＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ、同時刺激分子および細胞接着分子の発現増加、ＦＣγＲＩＩの下方調節、ＣＤ８３の上方調節）の迅速な変化を生じさせる。これらの変化は、抗原提示能力の増強、および樹状細胞の成熟に関連する。
表面抗原のＦＡＣＳ分析を以下のように実施する。細胞を、逓増濃度の本発明のアルブミン融合タンパク質またはＬＰＳ（ポジティブコントロール）で、１〜３日間処理し、１％ＢＳＡおよび０．０２ｍＭアジ化ナトリウムを含有するＰＢＳで洗浄し、次いで適切なＦＩＴＣ標識化モノクローナル抗体またはＰＥ標識化モノクローナル抗体（１：２０希釈）で、４℃にて３０分間インキュベートする。さらなる洗浄後、標識した細胞をフローサイトメトリー（ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ））によって分析する。
（サイトカイン産生の影響）
樹状細胞（特に、ＩＬ−１２）によって産生されたサイトカインは、Ｔ細胞依存性免疫応答の阻害において重要である。ＩＬ−２は、Ｔｈ１ヘルパーＴ細胞免疫応答の発達に強く影響し、細胞傷害性Ｔ細胞機能およびＮＫ細胞機能を誘導する。ＥＬＩＳＡを使用して、以下のようにＩＬ−１２放出を測定する。樹状細胞（１０６／ｍｌ）を、逓増濃度の本発明のアルブミン融合タンパク質を用いて２４時間処理する。ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）を、ポジティブコントロールとして細胞培養物に添加する。次いで、これらの細胞培養物からの上清を回収し、市販のＥＬＩＳＡキット（例えば、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ））を用いてＩＬ−１２含有量について分析する。キットに添付された標準的なプロトコルを使用する。
（ＭＨＣクラスＩＩ、同時刺激分子および接着分子の発現の影響）
細胞表面抗原の３つの主要なファミリー（接着分子、抗原提示に関与する分子、およびＦｃレセプター）が、単球において観察され得る。ＨＭＣクラスＩＩ抗原および他の同時発現分子（例えば、Ｂ７およびＩＣＡＭ−１）の発現調節は、単球の抗原提示能力およびＴ細胞を誘導する能力における変化を生じ得る。Ｆｃレセプターの発現増加は、単球細胞傷害性活性、サイトカイン放出および食作用の改善に関連し得る。
ＦＡＣＳ分析を使用して、以下のように表現抗原を試験する。単球を、逓増濃度の本発明のアルブミン融合タンパク質またはＬＰＳ（ポジティブコントロール）で、１〜５日間処理し、１％ＢＳＡおよび０．０２ｍＭアジ化ナトリウムを含有するＰＢＳで洗浄し、次いで適切なＦＩＴＣ標識化モノクローナル抗体またはＰＥ標識化モノクローナル抗体（１：２０希釈）で、４℃にて３０分間インキュベートする。さらなる洗浄後、標識した細胞をフローサイトメトリー（ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ））によって分析する。
（単球の活性化および／または増強された生存）
単球を活性化（または、不活性化）および／または単球の生存を増強（または単球の生存減少）させる分子についてのアッセイは、当該分野で公知であり、本発明の分子が単球のインヒビターまたはアクチベーターとして機能するか否かを決定するために慣用的に適応され得る。本発明のアルブミン融合タンパク質は、以下に記載される３つのアッセイを用いてスクリーニングされ得る。これらのアッセイの各々について、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ ｇｒａｄｉｅｎｔ （Ｓｉｇｍａ）による遠心分離によって、単一のｄｏｎｏｒ ｌｅｕｋｏｐａｃｋ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒｅｄ Ｃｒｏｓｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ）から精製する。単球を、向流遠心分離エルトリエーションによってＰＢＭＣから単離する。
（単球生存アッセイ）
血清の非存在下または他の刺激下で培養された場合、ヒト末梢血単球は次第に死滅する。単球の死は、内部調節プロセス（アポトーシス）の結果である。ＴＮＦ−αのような活性化因子を培養に添加すると、細胞の生存およびＤＮＡ断片化からの保護を劇的に改善する。プロピジウムアイオダイド（ＰＩ）染色を使用して、以下のようにアポトーシスを測定する。単球を、血清を含まない培地（ポジティブコントロール）、１００ｎｇ／ｍｌ ＴＮＦ−αの存在下（ネガティブコントロール）、および多様な濃度の試験される融合タンパク質の存在下において、ポリプロピレンチューブ中で４８時間培養する。細胞を、最終濃度５μｇ／ｍｌのＰＩ含有ＰＢＳ中で、２×１０６個／１ｍｌの濃度で懸濁し、次いでＦＡＣＳｃａｎ分析の前、５分間にわたって室温でインキュベートする。ＰＩの取り込みは、この実験パラダイムにおいて、ＤＮＡ断片化と相関することが実証されている。
（サイトカイン放出の影響）
単球／マクロファージの重要な機能は、刺激後のサイトカイン放出を介する免疫系の他の細胞集団に関するその調節活性である。サイトカイン放出を測定するためのＥＬＩＳＡを、以下のように実施する。ヒト単球を、５×１０５細胞／ｍｌの密度で、逓増濃度の本発明のアルブミン融合タンパク質、および同じ条件下であるがこの融合タンパク質の非存在下において培養する。ＩＬ−２産生について、これらの細胞を、融合タンパク質の存在下において、ＩＦＮ（１００Ｕ／ｍｌ）で一晩プライミングする。次いで、ＬＰＳ （１０ ｎｇ／ｍｌ）を添加する。条件付けした培地を、２４時間後に回収し、使用するまで凍結保存する。次いで、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１０、ＭＣＰ−１およびＩＬ−８の測定を、市販のＥＬＩＳＡキット（例えば、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ））を用いて、キットに添付された標準的なプロトコルに使用して実施する。
（酸化的バースト）
精製した単球を、２〜１×１０５細胞／ウェルで９６ウェルにプレートする。本発明の逓増濃度の融合タンパク質を、総体積０．２ｍｌ培養培地（ＲＰＭＩ １６４０＋１０％ ＦＣＳ、グルタミンおよび抗生物質）においてウェルに添加する。３日間のインキュベーション後、これらのプレートを遠心分離し、そして培地をウェルから除去する。マクロファージ単層について、１ウェルあたり０．２ｍｌのフェノールレッド溶液（１４０ｍＭ ＮａＣＩ、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ ７．０）、５．５ｍＭデキストロース、０．５６ｍＭフェノールレッドおよび１９Ｕ／ｍｌのＨＲＰＯ）を、刺激剤（２００ｎＭ ＰＭＡ）とともに添加する。これらのプレートを３７℃で２時間インキュベートし、反応を１ウェルあたり１Ｎ ＮａＯＨ（２０μｌ）を添加して停止させる。吸光度を６１０ｎｍで読み取る。マクロファージによって産生されるＨ２Ｏ２量を測定するために、モル濃度が既知のＨ２Ｏ２溶液標準曲線を各実験について実施する。
（実施例６９：本発明の融合タンパク質の生物学的影響）
（星状細胞および神経アッセイ）
本発明のアルブミン融合タンパク質は、皮質神経細胞の生存、神経突起成長、または表現型の分化を促進する活性について、およびグリア繊維性酸性タンパク質免疫保護細胞、星状細胞の増殖誘導について試験し得る。バイオアッセイについての皮質細胞の選択は、皮質構造におけるＦＧＦ−１およびＦＧＦ−２の遍在的発現、ならびに以前に報告されているＦＧＦ−２処理による皮質神経細胞生存の促進に基づく。例えば、チミジン取り込みアッセイは、これらの細胞における本発明のアルブミン融合タンパク質の活性を解明するために使用され得る。
さらに、インビトロでの皮質神経細胞または海馬神経細胞におけるＦＧＦ−２（塩基性ＦＧＦ）の生物学的影響を記載する以前の報告は、これらの両方において、神経細胞の生存および神経突起成長の増加を実証している（Ｗａｌｉｃｋｅら、「Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｆ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ｎｅｕｒｏｎｓ ａｎｄ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｎｅｕｒｉｔｅ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ．」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８３：３０１２−３０１６．（１９８６）、（この全体が、参考として本明細書中に援用される）。しかし、ＰＣ−１２細胞に関して行われた実験による報告は、これらの２つの反応は、必ずしも同じ意味ではなく、試験されたＦＧＦだけでなく標的細胞上に発現されるレセプターにも依存し得ることを示唆する。初代皮質神経細胞培養パラダイムを使用して、神経突起成長を誘導する本発明のアルブミン融合タンパク質の能力を、例えば、チミジン取り込みアッセイを用いて、ＦＧＦ−２で達成された反応と比較し得る。
（線維芽細胞アッセイおよび内皮細胞アッセイ）
ヒト肺線維芽細胞を、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から入手し、そしてＣｌｏｎｅｔｉｃｓからの増殖培地で維持する。真皮性微小血管内皮細胞をＣｅｌｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から得る。増殖アッセイについては、ヒト肺線維芽細胞および真皮性微小血管内皮細胞を、９６ウェルプレートの増殖培地中で１日間、５，０００細胞／ウェルで培養し得る。次いでこの細胞を０．１％ＢＳＡ基礎培地中で１日間インキュベートする。新鮮な０．１％ＢＳＡ培地で培地を置換した後、細胞を本発明の試験融合タンパク質と３日間インキュベートする。Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ（Ａｌｍａｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ，ＣＡ）を１０％の最終濃度になるように各ウェルに添加する。この細胞を４時間インキュベートする。細胞生存度をＣｙｔｏＦｌｕｏｒ蛍光リーダーでの読取りにより測定する。ＰＧＥ２アッセイについては、ヒト肺線維芽細胞を、９６ウェルプレート中で１日間、５，０００細胞／ウェルで培養する。０．１％ＢＳＡ基礎培地に培地を交換した後、細胞をＩＬ−１αとともに、またはそれをともなわずに、ＦＧＦ−２または本発明の融合タンパク質と２４時間インキュベートする。上清を収集し、そしてＥＩＡキット（Ｃａｙｍａｎ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）によりＰＧＥ２についてアッセイする。ＩＬ−６アッセイについては、ヒト肺線維芽細胞を、９６ウェルプレート中で１日間、５，０００細胞／ウェルで培養する。０．１％ＢＳＡ基礎培地に培地を交換した後、細胞を本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはＩＬ−１αとともに、またはそれをともなわずに、ＦＧＦ−２と２４時間インキュベートする。上清を収集し、そしてＥＬＩＳＡキット（Ｅｎｄｏｇｅｎ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）によりＩＬ−６についてアッセイする。
ヒト肺線維芽細胞をＦＧＦ−２または本発明のアルブミン融合タンパク質とともに基礎培地中で３日間培養し、その後、線維芽細胞の増殖に対する効果を評価するためＡｌａｍａｒ Ｂｌｕｅを添加する。ＦＧＦ−２は、本発明のアルブミン融合タンパク質での刺激と匹敵して用いられ得る１０〜２５００ｎｇ／ｍｌの刺激を示すはずである。
（［３Ｈ］チミジン取り込みアッセイに基づく細胞増殖）
以下の［３Ｈ］チミジン組み込みアッセイは、細胞（例えば、線維芽細胞、上皮細胞または未成熟筋細胞）の増殖に対する治療タンパク質（例えば、増殖因子タンパク質）の効果を測定するために使用され得る。
サブコンフルエント培養物は、無血清培地における、１８時間のインキュベーションによってＧ１相で停止される。次いで、治療タンパク質は、２４時間の間添加され、最後の４時間の間、培養物は、０．３３μＭの最終濃度（２５Ｃｉ／ｍｍｏｌ、Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）で［３Ｈ］チミジンで標識される。取り込まれた［３Ｈ］チミジンは、２４時間、氷冷１０％トリクロロ酢酸で沈殿される。次いで、細胞は、氷冷１０％トリクロロ酢酸で、次いで、氷冷水で連続的にリンスされる。０．５Ｍ ＮａＯＨでの溶解に続いて、溶解物およびＰＢＳリンス（５００ｍｌ）をプールし、そして放射能の量が測定される。
（パーキンソンモデル）
パーキンソン病における運動機能の喪失は、黒質線条体のドーパミン作動性投射ニューロンの変性から生じる線条体ドーパミンの欠乏に起因する。広範に特徴付けされたパーキンソン病の動物モデルは、１−メチル−４フェニル１，２，３，６−テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）の全身投与を含む。ＣＮＳにおいて、ＭＰＴＰは、星状細胞により取り込まれ、そしてモノアミンオキシダーゼＢにより１−メチル−４−フェニルピリジン（ＭＰＰ＋）に異化され、そして放出される。引き続き、ＭＰＰ＋は、ドーパミンの高親和性再取り込みトランスポーターによりドーパミン作動性ニューロンに能動的に蓄積する。次いで、ＭＰＰ＋は、電気化学勾配によりミトコンドリア中で濃縮され、そしてニコチン酸アミドアデニン二リン酸：ユビキノン酸化還元酵素（複合体Ｉ）を選択的に阻害し、これにより電子伝達を妨害し、そして最終的に活性酸素を生成する。
ＦＧＦ−２（塩基性ＦＧＦ）が黒質のドーパミン作動性ニューロンへの栄養活性を有することが組織培養パラダイムにおいて実証されている（Ｆｅｒｒａｒｉら、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１９８９）。近年、Ｕｎｓｉｃｋｅｒ博士のグループは、線条体のゲル型インプラントでのＦＧＦ−２投与がＭＰＴＰ曝露と関連する毒性から黒質のドーパミン作動性ニューロンのほぼ完全な防御を生じることを実証している（ＯｔｔｏおよびＵｎｓｉｃｋｅｒ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，１９９０）。
ＦＧＦ−２を用いたデータに基づいて、本発明のアルブミン融合タンパク質は、インビトロにおけるドーパミン作動性ニューロン生存を増強する際において、本発明のアルブミン融合タンパク質がＦＧＦ−２の作用と類似の作用を有するか否かを決定するために評価され得、そして、本発明のアルブミン融合タンパク質はまた、線条体におけるドーパミン作動性ニューロンを、ＭＰＴＰ処理と関連する損傷からの防御についてインビボで試験され得る。本発明のアルブミン融合タンパク質の潜在的効果を、まずドーパミン性ニューロン細胞培養パラダイムにおいてインビトロで試験する。妊娠１４日のＷｉｓｔａｒラット胚由来の中脳底板を解剖することにより、培養物を調製する。組織をトリプシンで分離し、そしてポリオルチニン−ラミニンでコートしたカバーガラスに２００，０００細胞／ｃｍ２の密度で播く。この細胞をダルベッコ改変イーグル培地およびホルモン補充物（ＮＩ）を含有するＦ１２培地中で維持する。インビトロで８日後培養物をパラホルムアミドで固定し、そしてチロシンヒドロキシラーゼ（ドーパミン作動性ニューロンについての特異的マーカー）での免疫組織化学染色のために処理する。分離した細胞培養物を胚性ラットから調製する。培養培地を３日ごとに変化させ、そしてこの因子をまたその時点ごとに添加する。
ドーパミン作動性ニューロンを妊娠１４日（ドーパミン作動性前駆細胞が増殖する段階を過ぎる発生時間）で動物から単離するので、チロシンヒドロキシラーゼ免疫陽性ニューロンの数の増加は、インビトロで生存しているドーパミン作動性ニューロンの数の増加を示す。従って、もし本発明の治療タンパク質がドーパミン作動性ニューロンの生存を延長するように作用するならば、この融合タンパク質がパーキンソン病に関与し得ることを示唆する。
（実施例７０：脈管内皮細胞の増殖に対する本発明のアルブミン融合タンパク質の効果）
１日目に、ヒト臍帯静脈上皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、４％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１６単位／ｍｌへパリン、および５０単位／ｍｌ上皮細胞増殖補充物（ＥＣＧＳ、Ｂｉｏｔｅｃｈｉｎｉｑｕｅ，Ｉｎｃ．）を含むＭ１９９培地中に、２〜５×１０４細胞／３５ｍｍディッシュ密度で播種する。２日目に、培地を、１０％ＦＢＳ、８単位／ｍｌへパリンを含むＭ１９９と置き換えた。本発明のアルブミン融合タンパク質、およびポジティブコントロール（例えば、ＶＥＧＦおよび基礎的なＦＧＦ（ｂＦＧＦ）が種々の濃度で添加される。４日目および６日目に、培地を置換する。８日目に、細胞数を、Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅｒを用いて決定する。
ＨＵＶＥＣの数の増加は、融合タンパク質が脈管内皮細胞を増殖し得ることを示し、一方、ＨＵＶＥＣの数の減少は、融合タンパク質が脈管内皮細胞を阻害することを示す。
（実施例７１：ラット角膜創傷治癒モデル）
この動物モデルは、本発明のアルブミン融合ポリペプチドの、新生血管形成に対する効果を示す。実験プロトコルは、以下を含む：
角膜の中心から支質層へと１〜１．５ｍｍの長さの切開を作ること。
眼の外側の角膜に面する切開の唇縁の下にへらを挿入すること。
ポケットを作ること（その基底は、眼の縁から１〜１．５ｍｍである）。
５０ｎｇ〜５μｇの本発明のアルブミン融合タンパク質を含むペレットを、ポケット内に配置すること。
本発明のアルブミン融合タンパク質での処置をまた、２０ｍｇ〜５００ｍｇの投薬量範囲内で（毎日の処置を５日間）角膜創傷に局所的に適用し得る。
（実施例７２：糖尿病マウスおよび糖質コルチコイド損傷創傷治癒モデル）
（糖尿病ｄｂ＋／ｄｂ＋マウスモデル）
本発明のアルブミン融合タンパク質が治癒プロセスを促進することを実証するために、創傷治癒の遺伝的糖尿病マウスモデルを、使用する。ｄｂ＋／ｄｂ＋マウスにおける全層（ｆｕｌｌ ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ）創傷治癒モデルは、損傷創傷治癒の十分に特徴付けられた、臨床的に関連性のある、そして再現可能なモデルである。糖尿病性創傷の治癒は、収縮よりむしろ肉芽組織の形成および再上皮形成に依存する（Ｇａｒｔｎｅｒ，Ｍ．Ｈ．ら、Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．５２：３８９（１９９２）；Ｇｒｅｅｎｈａｌｇｈ，Ｄ．Ｇ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１３６：１２３５（１９９０））。
この糖尿病動物は、ＩＩ型真性糖尿病において観察される特徴的な特性の多くを有する。ホモ接合（ｄｂ＋／ｄｂ＋）マウスは、それらの正常なヘテロ接合（ｄｂ＋／＋ｍ）同腹仔と比較して肥満である。変異糖尿病（ｄｂ＋／ｄｂ＋）マウスは、第４染色体上に単一の常染色体性の劣性変異（ｄｂ＋）を有する（Ｃｏｌｅｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：２８３−２９３（１９８２））。動物は、多食症、多渇症、および多尿症を示す。変異糖尿病マウス（ｄｂ＋／ｄｂ＋）は、上昇した血中グルコース、増加したまたは正常なインスリンレベル、および抑制された細胞媒介性免疫を有する（Ｍａｎｄｅｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２０：１３７５（１９７８）；Ｄｅｂｒａｙ−Ｓａｃｈｓ，Ｍ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５１（１）：１−７（１９８３）；Ｌｅｉｔｅｒら、Ａｍ．Ｊ．ｏｆ Ｐａｔｈｏｌ．１１４：４６−５５（１９８５））。末梢神経障害、心筋合併症、および微小血管損傷、基底膜肥厚、および糸球体濾過異常は、これらの動物において記載されている（Ｎｏｒｉｄｏ，Ｆ．ら、Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．８３（２）：２２１−２３２（１９８４）；Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ２９（１）：６０−６７（１９８０）；Ｇｉａｃｏｍｅｌｌｉら、Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ．４０（４）：４６０−４７３（１９７９）；Ｃｏｌｅｍａｎ，Ｄ．Ｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ ３１（補遺）：１−６（１９８２））。これらのホモ接合糖尿病マウスは、高血糖症を発症し、そしてこれは、ヒトＩＩ型糖尿病に類似してインスリンに対して耐性である（Ｍａｎｄｅｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２０：１３７５−１３７７（１９７８））。
これらの動物において観察された特徴は、このモデルにおける治癒が、ヒト糖尿病において観察される治癒に類似し得ることを示唆する（Ｇｒｅｅｎｈａｌｇｈら、Ａｍ．Ｊ．ｏｆ Ｐａｔｈｏｌ．１３６：１２３５−１２４６（１９９０））。
遺伝的糖尿病の雌性Ｃ５７ＢＬ／ＫｓＪ（ｄｂ＋／ｄｂ＋）マウス、およびそれらの非糖尿病（ｄｂ＋／＋ｍ）へテロ接合性同腹仔を、この研究に用いる（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。これらの動物を６週齢で購入し、そしてこれらの動物は研究の開始時に８週齢である。動物を個別に飼育し、そして自由に食物および水を与える。全ての操作を、無菌技術を用いて行う。この実験を、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＩｎｃのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ａｎｄ ｔｈｅ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓの規則およびガイドラインに従って行う。
創傷プロトコルを、以前に報告された方法（Ｔｓｕｂｏｉ，Ｒ．およびＲｉｆｋｉｎ，Ｄ．Ｂ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７２：２４５−２５１（１９９０））に従って行う。
簡単には、創傷させる日に、動物を、脱イオン水に溶解したＡｖｅｒｔｉｎ（０．０１ｍｇ／ｍＬ）、２，２，２−トリブロモエタノールおよび２−メチル−２−ブタノールの腹腔内注射で麻酔する。この動物の背面領域を剃毛し、そして皮膚を７０％エタノール溶液およびヨウ素で洗浄する。手術範囲を、創傷させる前に滅菌ガーゼで乾燥させる。次いで、８ｍｍの全層の創傷を、Ｋｅｙｅｓ組織パンチを用いて作製する。創傷させた直後に、周囲の皮膚を、創傷の拡大を取り除くために穏やかに伸ばす。実験の間この創傷を開放させる。処置の適用を、創傷させた日から開始して５日間連続で、局所的に与える。処置の前に、創傷を、滅菌生理食塩水およびガーゼスポンジを用いて穏やかに洗浄する。
創傷を視覚的に検査し、そして手術の日およびその後２日間隔で、固定した距離で写真撮影する。創傷閉鎖を、１〜５日目および８日目の毎日の測定により決定する。創傷を目盛り付き（Ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ）Ｊａｍｅｓｏｎカリパスを用いて水平および垂直に測定する。肉芽組織がもはや目に見えずかつ創傷を連続した上皮が覆う場合に、創傷を治癒したとみなす。
本発明のアルブミン融合タンパク質を、ビヒクル中で８日間、異なる用量の範囲（１日あたり創傷あたり４ｍｇ〜５００ｍｇ）を用いて投与する。ビヒクルコントロール群には、５０ｍＬのビヒクル溶液を与えた。
動物を、８日目にペントバルビタールナトリウム（３００ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射で安楽死させる。次いで、創傷および周囲の皮膚を、組織学および免疫組織化学のために収集する。組織標本を、さらなる処理のために、生検スポンジの間の組織カセット内で１０％中性緩衝化ホルマリン中に置く。
各々１０匹の動物（５匹の糖尿病および５匹の非糖尿病コントロール）の３つの群：１）ビヒクルプラシーボコントロール、２）非処置群、および３）処置群を、評価する。
創傷閉鎖を、水平軸および垂直軸で面積を測定すること、および創傷の面積の合計を得ることにより分析する。次いで、収縮を、最初の創傷の面積（０日）と処置後（８日）の面積との間の差異を確立することにより評価する。１日目のこの創傷面積は、６４ｍｍ２（皮膚パンチに対応するサイズ）である。計算を以下の式を用いて行う：
ａ．［８日目の開放面積］−［１日目の開放面積］／［１日目の開放面積］。
標本を１０％緩衝化ホルマリン中に固定し、そしてパラフィン包埋塊を、創傷表面に対して垂直に切り出し（５ｍｍ）、そしてＲｅｉｃｈｅｒｔ−Ｊｕｎｇミクロトームを用いて切断する。慣用的なヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を、二等分した創傷の横断切片で行う。創傷の組織学的試験を用いて、修復した皮膚の治癒プロセスおよび形態的な外見を、本発明のアルブミン融合タンパク質を用いる処置によって改変したかどうかを評価する。この評価は、細胞蓄積、炎症細胞、毛細管、線維芽細胞、再上皮形成、および表皮成熟の存在の検証を含む（Ｇｒｅｅｎｈａｌｇｈ，Ｄ．Ｇ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１３６：１２３５（１９９０））。目盛り付きレンズマイクロメーターを盲検観察者（ｂｌｉｎｄｅｄ ｏｂｓｅｒｖｅｒ）が用いる。
組織切片をまた、ＡＢＣ Ｅｌｉｔｅ検出システムを使用してポリクローナルウサギ抗ヒトケラチン抗体で免疫組織化学的に染色する。ヒト皮膚を陽性組織コントロールとして用いる一方、非免疫ＩｇＧを陰性コントロールとして用いる。ケラチノサイト増殖を、目盛り付きレンズマイクロメーターを用いて創傷の再上皮形成の程度を評価することによって決定する。
皮膚標本における増殖細胞核抗原／サイクリン（ＰＣＮＡ）を、ＡＢＣ Ｅｌｉｔｅ検出システムを用いて抗ＰＣＮＡ抗体（１：５０）を使用することにより実証する。ヒト結腸癌は、陽性組織コントロールとして役割を果たし得、そしてヒト脳組織を、陰性組織コントロールとして用い得る。各標本は、１次抗体の脱落および非免疫マウスＩｇＧとの置換を有する切片を含んだ。これらの切片の順位は、０〜８のスケール（わずかな増殖を反映するより低い側のスケール〜激しい増殖を反映するより高い側）の増殖の程度に基づく。
実験データを、片側ｔ検定を用いて分析する。＜０．０５のｐ値を有意とみなす。
（ステロイド障害性ラットモデル）
ステロイドによる創傷治癒の阻害は、種々のインビトロ系およびインビボ系において十分に実証されている（Ｗａｈｌ，Ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄｓ ａｎｄ Ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ：Ａｎｔｉ−Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｓｔｅｒｏｉｄ Ａｃｔｉｏｎ：Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｓｐｅｃｔｓ．２８０−３０２（１９８９）； Ｗａｈｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１５：４７６−４８１（１９７５）；Ｗｅｒｂら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４７：１６８４−１６９４（１９７８））。糖質コルチコイドは、新脈管形成を阻害すること、血管透過性（Ｅｂｅｒｔら、Ａｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．３７：７０１−７０５（１９５２））、線維芽細胞増殖、およびコラーゲン合成（Ｂｅｃｋら、Ｇｒｏｗｓ Ｆａｃｔｏｒｓ．５：２９５−３０４（１９９１）；Ｈａｙｎｅｓら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．６１：７０３−７９７（１９７８））を低下させること、ならびに循環する単球の一過性の減少を生じること（Ｈａｙｎｅｓら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．６１：７０３−７９７（１９７８）；Ｗａｈｌ，「Ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄｓ ａｎｄ ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ」：Ａｎｔｉｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｓｔｅｒｏｉｄ Ａｃｔｉｏｎ：Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｓｐｅｃｔｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２８０−３０２頁（１９８９））によって創傷治癒を遅延させる。障害性創傷治癒に対するステロイドの全身性投与は、ラットにおいて十分に確立された現象である（Ｂｅｃｋら、Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ．５：２９５−３０４（１９９１）； Ｈａｙｎｅｓら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．６１：７０３−７９７（１９７８） ；Ｗａｈｌ，「Ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄｓ ａｎｄ ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ」：Ａｎｔｉｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｓｔｅｒｏｉｄ Ａｃｔｉｏｎ：Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｓｐｅｃｔｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２８０−３０２頁（１９８９）；Ｐｉｅｒｃｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：２２２９−２２３３（１９８９））。
本発明のアルブミン融合タンパク質が治癒プロセスを促進し得ることを実証するために、治癒が、メチルプレドニゾロンの全身性投与により損なわれた、ラットの全層切除皮膚創傷に対する本発明のアルブミン融合タンパク質の複数の局所適用の効果を評価する。
若年成体の雄性Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット（体重２５０〜３００ｇ）（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）をこの実験に用いる。この動物を、８週齢で購入する。研究の開始時は９週齢である。ラットの治癒応答は、創傷の時点で、メチルプレドニゾロンの全身性投与（１７ｍｇ／ｋｇ／ラット、筋肉内）により損なわれる。動物を個別に飼育し、そして自由に食物と水を与える。全ての操作を、無菌技術を用いて行う。この研究を、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＩｎｃのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ａｎｄ ｔｈｅ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓの規則およびガイドラインに従って行う。
創傷プロトコルは、上記に従う。創傷させる日に、動物をケタミン（５０ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（５ｍｇ／ｋｇ）の筋肉内注射で麻酔する。この動物の背面領域を剃毛し、そして皮膚を７０％エタノールおよびヨウ素溶液で洗浄する。手術範囲を、創傷させる前に滅菌ガーゼで乾燥させる。８ｍｍの全層創傷をＫｅｙｅｓ組織パンチを用いて作製する。実験の間、この創傷を開放する。試験物質の適用を、創傷させ、次いでメチルメチルプレドニゾロン投与した日から開始して、７日間連続で、１日１回、局所的に与える。処置の前に、創傷を滅菌生理食塩水およびガーゼスポンジを用いて穏やかに洗浄する。
創傷を視覚的に検査し、そして創傷させた日および処置の終りに、固定した距離で写真撮影する。創傷閉鎖を、１〜５日目の毎日および８日目の測定により決定する。創傷を目盛り付き（Ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ）Ｊａｍｅｓｏｎノギスを用いて水平および垂直に測定する。創傷を、肉芽組織がもはや目に見えずかつ創傷を連続した上皮が覆う場合に、治癒したとみなす。
本発明の融合タンパク質を、ビヒクル中で８日間、異なる用量の範囲（１日あたり創傷あたり４ｍｇ〜５００ｍｇ）を用いて投与する。ビヒクルコントロール群は、５０ｍＬのビヒクル溶液を受けた。
動物を、８日目にペントバルビタールナトリウム（３００ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射で安楽死させる。次いで、創傷および周囲の皮膚を、組織学のために収集する。組織標本を、さらなるプロセシングのために、生検スポンジの間の組織カセット内で１０％中性緩衝化ホルマリン中に置く。
各々１０匹の動物（メチルプレドニゾロンを用いる５匹および糖質コルチコイドを用いない５匹）の４つの群を評価する：１）非処置群、２）ビヒクルプラシーボコントロール、および３）処置群。
創傷閉鎖を、垂直軸および水平軸で面積を測定すること、および創傷の面積の合計を得ることにより分析する。次いで、閉鎖を、最初の創傷の面積（０日）と処置後（８日）の面積との間の差異を確立することにより評価する。１日目のこの創傷面積は、６４ｍｍ２（皮膚パンチに対応するサイズ）である。計算を以下の式を用いて行う：
ａ．［８日目の開放面積］−［１日目の開放面積］／［１日目の開放面積］。
標本を１０％緩衝化ホルマリン中に固定し、そしてパラフィン包埋塊を、創傷表面に対して垂直に切り出し（５ｍｍ）、そしてＯｌｙｍｐｕｓミクロトームを用いて切断する。慣用的なヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を、二等分した創傷の横断切片で行う。創傷の組織学的試験は、修復した皮膚の治癒プロセスおよび形態的な外見を、本発明のアルブミン融合タンパク質を用いる処置によって改善したかどうかを評価することを可能にする。目盛り付きレンズマイクロメーターを盲検観察者（ｂｌｉｎｄｅｄ ｏｂｓｅｒｖｅｒ）が用いて、創傷の隙間の距離を決定する。
実験データを、片側ｔ検定を用いて分析する。＜０．０５のｐ値を有意とみなす。
（実施例７３：リンパ水腫（ｌｙｍｐｈａｄｅｍａ）動物モデル）
この実験アプローチの目的は、ラット後肢におけるリンパ管形成（ｌｙｍｐｈａｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）およびリンパの循環系の再確立における本発明のアルブミン融合タンパク質の治療的効果を試験するための、適切かつ一貫したリンパ水腫モデルを作製することである。有効性は、罹患した肢の腫脹体積、リンパ脈管の量の定量、総血漿タンパク質の量、および組織病理学により測定される。急性リンパ水腫は、７〜１０日間観察される。恐らくより重要なことは、水腫の慢性進行は、３〜４週間まで続く。
手術を始める前に、血液サンプルを、タンパク質濃度分析のために採血する。雄性ラット（体重約３５０ｇ）に、ペントバルビタールを投薬する。次いで、右肢を膝から股関節部まで剃毛する。この剃毛した範囲を７０％ＥｔＯＨに浸したガーゼで拭く。血液を、血清総タンパク質試験のために採血する。周径測定および体積測定を行った後に、２つの測定レベル（踵の０．５ｃｍ上、足背の中間点）に印をつけた後、足へ色素を注射する。右足背および左足背の両方の内皮に、０．０５ｍｌの１％Ｅｖａｎ’ｓ Ｂｌｕｅを注射する。次いで、足への色素の注射の後、周径測定および体積測定を行う。
目印として膝関節を用いて、中肢鼡径部切開を、大腿血管の位置を確認できるように環状に行う。鉗子および止血剤を用いて、皮膚弁を切開し、そして分離する。大腿血管の位置確認後、血管の横に沿ってかつ血管の下に走るリンパ管を位置確認する。次いで、この範囲の主要なリンパ管を、電気凝固縫合結紮（ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌｌｙ ｓｕｔｕｒｅ ｌｉｇａｔｅ）する。
顕微鏡を用いて、肢の背の筋肉（半腱様筋（ｓｅｍｉｔｅｎｄｉｎｏｓｉｓ）および内転筋の付近）を平滑に切開する。次いで、膝窩リンパ節の位置を確認する。次いで、２つの近位リンパ管および２つの遠位リンパ管、ならびに膝窩節の遠位血液供給部を縫合糸により結紮する。次いで、膝窩リンパ節および任意の付随する脂肪組織を、結合組織を切断することによって取り除く。
この手順で生じるいかなる軽度の出血をも管理するように注意すること。リンパ管を閉塞した後、皮膚弁を、液体皮膚（Ｖｅｔｂｏｎｄ）（ＡＪ Ｂｕｃｋ）を使用することによって密封する。別々の皮膚縁を、脚の周囲に約０．５ｃｍのギャップを残しながらその下の筋肉組織に密封する。皮膚はまた、必要なときにその下の筋肉に縫合することによって固定してもよい。
感染を回避するために、動物を、メッシュを用いて個別に収容する（床敷きなし）。回復した動物を、最適な水腫ピークを通して毎日チェックする。このピークは、代表的には５〜７日まで生じる。次いで、プラトーの水腫ピークを観察する。リンパ水腫の強度を評価するために、各肢上の２つの指定した場所の周径および体積を、手術の前および７日間毎日測定する。リンパ水腫に対する血漿タンパク質の効果を決定し、そしてタンパク質分析が有用な試験視野計であるか否かもまた調査する。コントロール肢および水腫肢の両方の重量を、２箇所で評価する。分析を盲目様式（ｂｌｉｎｄ ｍａｎｎｅｒ）で行う。
周径測定：肢の動きを防止するための短期気体麻酔のもとで、布巻尺を使用して、肢の周径を測定する。測定を、距骨および足背面にて、２人の異なる人物によって行い、次いで、これらの２つの読み取りを平均する。読み取りを、コントロール肢および水腫肢の両方から得る。
体積測定：手術の日に、動物をペントバルビタールで麻酔し、そして手術の前に試験する。毎日の体積測定のために、動物を短期ハロタン麻酔（迅速な固定化およびすばやい回復）のもとにおき、両方の脚を剃毛し、そして耐水性マーカーを用いて脚に等しく印をつける。脚を、最初に水に漬け、次いで各々印をしたレベルまで装置に漬け、次いでＢｕｘｃｏ水腫ソフトウェア（Ｃｈｅｎ／Ｖｉｃｔｏｒ）によって測定する。データを一方の人物によって記録し、一方もう一方の人は、しるしを付けた領域まで脚を漬ける。
血液−血漿タンパク質測定：手術の前に血液を取り出し、遠心分離し、そして血清を分離し、次いで、全タンパク質およびＣａ２＋比較について結論付ける。
肢重量比較：血液を取り出した後、この動物を、組織収集のために調製する。この肢を、キリチン（ｑｕｉｌｌｉｔｉｎｅ）を用いて切断し、次いで、実験用脚とコントロール脚の両方を、結紮して切断し、そして秤量する。２回目の秤量を、脛踵（ｔｉｂｉｏ−ｃａｃａｎｅａｌ）関節を外し、そして足を秤量して行う。
組織学的調製：膝（膝窩）領域の後ろに位置する横筋を切り出し、そして金属型に配置し、ｆｒｅｅｚｅＧｅｌで満たし、冷メチルブタンに漬け、切断するまで標識したサンプルバッグに−８０℃にて配置する。切断の際に、筋肉を、蛍光顕微鏡のもとで、リンパ管について観察する。
（実施例７４：ＴＮＦα誘導性接着分子発現の本発明のアルブミン融合タンパク質による抑制）
炎症および新脈管形成の領域に対するリンパ球の漸増は、リンパ球上の細胞表面接着分子（ＣＡＭ）と血管内皮との間の特異的なレセプター−リガンド相互作用に関する。この接着プロセスは、通常の設定および病理学的設定の両方において、細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）、血管細胞接着分子−１（ＶＣＡＭ−１）、および内皮細胞（ＥＣ）における内皮白血球接着分子−１（Ｅ−セレクチン）発現を含む、多段階カスケードに続く。これらの分子および他の分子の血管内皮における発現は、白血球が局所血管系に接着し得、そして炎症応答の発生の間に局所組織に溢出し得る効率を決定する。サイトカインおよび増殖因子の局所濃度は、これらのＣＡＭの発現の調節に関与する。
腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）（強力なプロ炎症性サイトカイン）は、内皮細胞における３つ全てのＣＡＭの刺激因子であり、そして広範な種々の炎症応答に関与し得、しばしば病理学的結果をもたらす。
ＴＮＦ−α誘導性ＣＡＭ発現の抑制を媒介する本発明のアルブミン融合タンパク質の潜在能力を試験し得る。改変型ＥＬＩＳＡアッセイ（これは、固相吸着剤としてＥＣを使用する）を使用して、ＦＧＦファミリーのタンパク質のメンバーを用いて同時刺激した場合に、ＴＮＦ−α処理タンパク質ＥＣにおけるＣＡＭ発現の量を測定する。
この実験を行うために、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）培養物を、プールした索採取物から得、そして１０％ＦＣＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充した増殖培地（ＥＧＭ−２；Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）中で、５％ＣＯ２を含む３７℃の加湿インキュベーターにおいて維持する。ＨＵＶＥＣを、ＥＧＭ培地中１×１０４細胞／ウェルの濃度で、９６ウェルプレート中に、３７℃で１８〜２４時間またはコンフルエントになるまで播種する。続いて、単層を、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ−１６４０の無血清溶液で３回洗浄し、そして所定のサイトカインおよび／または増殖因子を用いて、２４時間３７℃にて処理した。インキュベーション後、次いで、この細胞を、ＣＡＭ発現について評価する。
ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、標準的な９６ウェルプレートにおいてコンフルエントになるまで増殖させる。増殖培地を、細胞から取り除き、そして９０μｌの１９９培地（１０％ＦＢＳ）に置き換える。試験のためのサンプルおよびポジティブまたはネガティブコントロールを、このプレートに三連で添加する（１０μｌ容量）。プレートを、３７℃にて、５時間（セレクチンおよびインテグリン発現）または２４時間（インテグリン発現のみ）のいずれかでインキュベートする。プレートを吸引して、培地を除去し、そして１００μｌの０．１％パラホルムアルデヒド−ＰＢＳ（Ｃａ＋＋およびＭｇ＋＋を有する）を各ウェルに添加する。プレートを、４℃にて３０分間保持する。
次いで、固定液をウェルから除去し、そしてウェルをＰＢＳ（＋Ｃａ、Ｍｇ）＋０．５％ＢＳＡを用いて１回洗浄し、そして排水する。このウェルを乾燥させないこと。１０μｌの希釈した一次抗体を、試験ウェルおよびコントロールウェルに添加する。抗ＩＣＡＭ−１−Ｂｉｏｔｉｎ、抗ＶＣＡＭ−１−Ｂｉｏｔｉｎおよび抗Ｅ−セレクチン−Ｂｉｏｔｉｎを、１０μｇ／ｍｌの濃度（０．１ｍｇ／ｍｌストック抗体の１：１０希釈）で使用する。細胞を、加湿した環境において、３７℃にて３０分間インキュベートする。ウェルを、ＰＢＳ（＋Ｃａ、Ｍｇ）＋０．５％ＢＳＡを用いて３回洗浄する。
次いで、２０μｌの希釈したＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ−Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈｏｔａｓｅ（１：５，０００希釈）を各ウェルに添加し、そして３７℃にて３０分間インキュベートする。ウェルを、ＰＢＳ（＋Ｃａ、Ｍｇ）＋０．５％ＢＳＡを用いて３回洗浄する。１錠のｐ−ニトロフェノールホスフェート（ｐＮＰＰ）を、５ｍｌのグリシン緩衝液（ｐＨ１０．４）に溶解させる。グリシン緩衝液中のｐＮＰＰ基質１００μｌを、各試験ウェルに添加する。三連の標準ウェルを、グリシン緩衝液中のＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ−Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈｏｔａｓｅの操作希釈（ｗｏｒｋｉｎｇ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）（１：５，０００（１００）＞１０−０．５＞１０−１＞１０−１．５）から調製する。５μｌの各希釈物を、三連のウェルに添加し、そして各ウェル中の得られたＡＰ含量は、５．５０ｎｇ、１．７４ｎｇ、０．５５ｎｇ、０．１８ｎｇである。次いで、１００μｌのｐＮＰＰ試薬を、標準ウェルの各々に添加しなければならない。このプレートを、３７℃にて４時間インキューベートしなければならない。３Ｍ ＮａＯＨの５０μｌの容量を全てのウェルに添加する。この結果を、プレートリーダーにおいて４０５ｎｍにて定量する。バックグラウンド減算オプションを、グリシン緩衝液のみで満たしたブランクウェルにおいて使用する。このテンプレートを、各々の標準ウェルにおけるＡＰ結合体の濃度を示すように設定する［５．５０ｎｇ；１．７４ｎｇ；０．５５ｎｇ；０．１８ｎｇ］。結果を、各サンプル中の結合したＡＰ結合体の量として示す。
（実施例７５：ＧＡＳレポーター構築物の構築）
細胞の分化および増殖に関与する１つのシグナル伝達経路は、Ｊａｋｓ−ＳＴＡＴ経路と呼ばれる。Ｊａｋｓ−ＳＴＡＴ経路において活性化されたタンパク質は、多くの遺伝子のプロモーターに位置する、γ活性化部位「ＧＡＳ」エレメントまたはインターフェロン感受性応答エレメント（「ＩＳＲＥ」）に結合する。これらのエレメントに対するタンパク質の結合は、関連する遺伝子の発現を変化させる。
ＧＡＳエレメントおよびＩＳＲＥエレメントは、転写のシグナルトランスデューサーおよび転写のアクチベーター、すなわち「ＳＴＡＴ」と呼ばれるクラスの転写因子によって認識される。ＳＴＡＴファミリーには６つのメンバーが存在する。Ｓｔａｔ１およびＳｔａｔ３は、Ｓｔａｔ２と同様に（ＩＦＮαに対する応答が広範であるように）、多くの細胞型において存在する。Ｓｔａｔ４は、より限定されており、そして多くの細胞型には存在しないが、ＩＬ−１２での処理後のＴヘルパークラスＩ細胞に見出されている。Ｓｔａｔ５は、元々は乳房成長因子と呼ばれたが、骨髄細胞を含む他の細胞においてより高い濃度で見出されている。それは、多くのサイトカインによって組織培養細胞において活性化され得る。
ＳＴＡＴは活性化されて、Ｊａｎｕｓ Ｋｉｎａｓｅ（「Ｊａｋｓ」）ファミリーとして知られる１セットのキナーゼによるチロシンリン酸化に際して細胞質から核へ移動する。Ｊａｋｓは、可溶性のチロシンキナーゼの独特のファミリーの代表であり、そしてＴｙｋ２、Ｊａｋ１、Ｊａｋ２、およびＪａｋ３を含む。これらのキナーゼは、有意な配列類似性を示し、そして一般には休止細胞において触媒的に不活性である。
Ｊａｋｓは、以下の表によって要約されるように広範なレセプターによって活性化される。（ＳｃｈｉｄｌｅｒおよびＤａｒｎｅｌｌ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６４：６２１−５１（１９９５）による総説から改変）。Ｊａｋｓを活性化し得るサイトカインレセプターファミリーは、２つの群に分けられる：（ａ）クラス１は、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、Ｅｐｏ、ＰＲＬ、ＧＨ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＬＩＦ、ＣＮＴＦ、およびトロンボポエチンに対するレセプターを含み；そして（ｂ）クラス２は、ＩＦＮ−ａ、ＩＦＮ−ｇ、およびＩＬ−１０を含む。クラス１レセプターは、保存されたシステインモチーフ（４つの保存されたシステインおよび１つのトリプトファンのセット）、およびＷＳＸＷＳモチーフ（Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｘａａ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ（配列番号１１１３）をコードする膜近接領域）を共有する。
従って、リガンドのレセプターへの結合の際に、Ｊａｋｓは活性化され、これは次いでＳＴＡＴを活性化し、これは、次いで移動し、そしてＧＡＳエレメントに結合する。この全プロセスは、Ｊａｋｓ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路に包含される。それゆえ、ＧＡＳまたはＩＳＲＥエレメントの結合によって反映されるＪａｋｓ−ＳＴＡＴ経路の活性化は、細胞の増殖および分化に関与するタンパク質を示すために使用され得る。例えば、増殖因子およびサイトカインは、Ｊａｋｓ−ＳＴＡＴ経路を活性化することが知られている。（以下の表を参照のこと）。従って、レポーター分子に連結したＧＡＳエレメントを使用することにより、Ｊａｋｓ−ＳＴＡＴ経路のアクチベーターが同定され得る。
Figure 2014043448
 実施例７８〜８０に記載される生物学的アッセイにおいて使用されるプロモーターエレメントを含む合成ＧＡＳを構築するために、ＰＣＲに基づいたストラテジーを用いてＧＡＳ−ＳＶ４０プロモーター配列を生成する。５’プライマーは、ＩＲＦ１プロモーターにおいて見出され、そして一定の範囲のサイトカインでの誘導の際にＳＴＡＴに結合することが以前に実証されたＧＡＳ結合部位の４つの直列のコピーを含むが（Ｒｏｔｈｍａｎら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １：４５７−４６８（１９９４））、他のＧＡＳエレメントまたはＩＳＲＥエレメントを代わりに使用し得る。５’プライマーはまた、ＳＶ４０初期プロモーター配列に対して相補的な１８ｂｐの配列も含み、そしてＸｈｏＩ部位に隣接する。５’プライマーの配列は以下である：
Figure 2014043448
 下流プライマーはＳＶ４０プロモーターに対して相補的であり、そしてＨｉｎｄ ＩＩＩ部位に隣接する：５’：ＧＣＧＧＣＡＡＧＣＴＴＴＴＴＧＣＡＡＡＧＣＣＴＡＧＧＣ：３’（配列番号１１１５）。
ＰＣＲ増幅を、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手したＢ−ｇａｌ：プロモータープラスミド中に存在するＳＶ４０プロモーターのテンプレートを用いて実施する。得られたＰＣＲフラグメントをＸｈｏＩ／Ｈｉｎｄ ＩＩＩを用いて消化し、そしてＢＬＳＫ２−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にサブクローニングする。正方向および逆方向のプライマーを用いる配列決定により、挿入物が以下の配列を含むことを確認する：
Figure 2014043448
 このＧＡＳプロモーターエレメントがＳＶ４０プロモーターに結合されると、次に、ＧＡＳ：ＳＥＡＰ２レポーター構築物を操作する。ここで、レポーター分子は、分泌アルカリホスファターゼ、すなわち「ＳＥＡＰ」である。しかし、明らかに、この実施例または他の実施例のいずれにおいても、任意のレポーター分子が、ＳＥＡＰの代わりとなり得る。ＳＥＡＰの代わりに使用され得る周知のレポーター分子としては、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、または抗体により検出可能な任意のタンパク質が挙げられる。
上記の配列により確認された合成ＧＡＳ−ＳＶ４０プロモーターエレメントを、ＧＡＳ−ＳＥＡＰベクターを作製するために、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩを用いて、増幅したＧＡＳ：ＳＶ４０プロモーターエレメントでＳＶ４０プロモーターを有効に置換し、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手したｐＳＥＡＰ−プロモーターベクターにサブクローニングする。しかし、このベクターはネオマイシン耐性遺伝子を含まず、それゆえ、哺乳動物の発現系には好ましくない。
従って、ＧＡＳ−ＳＥＡＰレポーターを発現する哺乳動物の安定な細胞株を作製するために、ＧＡＳ−ＳＥＡＰカセットを、ＳａｌＩおよびＮｏｔＩを用いてＧＡＳ−ＳＥＡＰベクターから取り出し、そしてＧＡＳ−ＳＥＡＰ／Ｎｅｏベクターを作製するために、マルチクローニング部位におけるこれらの制限部位を用いて、ネオマイシン耐性遺伝子を含む骨格ベクター（例えば、ｐＧＦＰ−１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））に挿入する。一旦、このベクターを哺乳動物細胞にトランスフェクトすれば、次いでこのベクターは、実施例７８〜８０に記載されるようにＧＡＳ結合についてのレポーター分子として使用され得る。
他の構築物を、上記の説明を使用し、そしてＧＡＳを異なるプロモーター配列で置換して、作製し得る。例えば、ＮＦ−ＫＢおよびＥＧＲプロモーター配列を含むレポーター分子の構築を、実施例７８〜８２に記載する。しかし、多くの他のプロモーターを、これらの実施例に記載のプロトコルを使用して置換し得る。例えば、ＳＲＥ、ＩＬ−２、ＮＦＡＴ、またはオステオカルシンのプロモーターを単独で、または組み合わせて（例えば、ＧＡＳ／ＮＦ−ＫＢ／ＥＧＲ、ＧＡＳ／ＮＦ−ＫＢ、Ｉｌ−２／ＮＦＡＴ、またはＮＦ−ＫＢ／ＧＡＳ）置換し得る。同様に、他の細胞株（例えば、ＨＥＬＡ（上皮細胞）、ＨＵＶＥＣ（内皮細胞）、Ｒｅｈ（Ｂ細胞）、Ｓａｏｓ−２（骨芽細胞）、ＨＵＶＡＣ（大動脈細胞）、または心筋細胞）を、レポーター構築物の活性を試験するために使用し得る。
（実施例７６：ＳＥＡＰ活性についてのアッセイ）
本明細書中に開示される実施例に記載されるアッセイのためのレポーター分子として、ＳＥＡＰ活性を、以下の一般的な手順に従ってＴｒｏｐｉｘ Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｌｉｇｈｔ Ｋｉｔ（カタログ番号ＢＰ−４００）を用いてアッセイする。Ｔｒｏｐｉｘ Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｌｉｇｈｔ Ｋｉｔは、以下で使用される希釈緩衝液、アッセイ緩衝液、および反応緩衝液を供給する。
ディスペンサーに２．５×希釈緩衝液を満たし、そして１５μｌの２．５×希釈緩衝液を本発明のアルブミン融合タンパク質を含む３５μｌの上清を含むオプティプレート（Ｏｐｔｉｐｌａｔｅ）に分与する。プラスチックシーラーでプレートをシールし、そして６５℃で３０分間インキュベートする。一様でない加温を避けるためにオプティプレートを離しておく。
サンプルを室温まで１５分間冷却する。ディスペンサーを空にし、そしてアッセイ緩衝液を満たす。５０ｍｌのアッセイ緩衝液を添加し、そして室温で５分間インキュベートする。ディスペンサーを空にし、そして反応緩衝液を満たす（以下の表を参照のこと）。５０μｌの反応緩衝液を添加し、そして室温で２０分間インキュベートする。化学発光シグナルの強度は時間依存的であり、そしてルミノメーターで５つのプレートを読み取るために約１０分間を費やすので、１回に５つのプレートを処理し、１０分後に２つ目のセットを開始するべきである。
ルミノメーターにおける相対的な光の単位（ｌｉｇｈｔ ｕｎｉｔ）を読み取る。ブランクとしてＨ１２をセットし、そして結果を印字する。化学発光の増加は、レポーター活性を示す。
Figure 2014043448
 （実施例７７：ニューロン活性を同定するアッセイ）
細胞が分化および増殖を経る場合、一群の遺伝子が多くの異なるシグナル伝達経路を介して活性化される。これらの遺伝子の１つであるＥＧＲ１（初期増殖応答遺伝子１）は、活性化時に種々の組織および細胞型において誘導される。ＥＧＲ１のプロモーターはこのような誘導を担う。レポーター分子に結合したＥＧＲ１プロモーターを使用して、細胞を活性化する本発明のアルブミン融合タンパク質の能力を評価し得る。
詳細には、以下のプロトコルをＰＣ１２細胞株におけるニューロン活性を評価するために使用する。ＰＣ１２細胞（ラット褐色細胞腫（ｐｈｅｎｏｃｈｒｏｍｏｃｙｔｏｍａ）細胞）は、多くのマイトジェン（例えば、ＴＰＡ（テトラデカノイルホルボールアセテート）、ＮＧＦ（神経成長因子）、およびＥＧＦ（上皮増殖因子））での活性化により、増殖および／または分化することが公知である。この処理の間にＥＧＲ１遺伝子発現を活性化する。従って、ＳＥＡＰレポーターに結合したＥＧＲプロモーターを含む構築物でＰＣ１２細胞を安定にトランスフェクトすることにより、本発明のアルブミン融合タンパク質によるＰＣ１２細胞の活性化を評価し得る。
ＥＧＲ／ＳＥＡＰレポーター構築物を以下のプロトコルにより組み立て得る。ＥＧＲ−１プロモーター配列（−６３３〜＋１）（Ｓａｋａｍｏｔｏ Ｋら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ６：８６７−８７１（１９９１））を以下のプライマーを用いて、ヒトゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅し得る：
第１のプライマー：５’ＧＣＧＣＴＣＧＡＧＧＧＡＴＧＡＣＡＧＣＧＡＴＡＧＡＡＣＣＣＣＧＧ−３’（配列番号１１１７）
第２のプライマー：５’ＧＣＧＡＡＧＣＴＴＣＧＣＧＡＣＴＣＣＣＣＧＧＡＴＣＣＧＣＣＴＣ−３’（配列番号１１１８）。
次いで、実施例７５において作製したＧＡＳ：ＳＥＡＰ／Ｎｅｏベクターを使用して、ＥＧＲ１増幅産物をこのベクターに挿入し得る。制限酵素ＸｈｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩを使用してＧＡＳ：ＳＥＡＰ／Ｎｅｏベクターを直鎖状化し、ＧＡＳ／ＳＶ４０スタッファー（ｓｔｕｆｆｅｒ）を取り除く。これらと同じ酵素を用いて、ＥＧＲ１増幅産物を制限処理する。ベクターとＥＧＲ１プロモーターとを連結する。
細胞培養のための９６ウェルプレートを調製するために、コーティング溶液（コラーゲンＩ型（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．カタログ番号０８−１１５）の３０％エタノール（滅菌濾過）での１：３０希釈）を１つの１０ｃｍプレートあたり２ｍｌ、または９６ウェルプレートのウェルあたり５０ｍｌ添加し、そして２時間風乾させる。
ＰＣ１２細胞を、予めコートした１０ｃｍ組織培養ディッシュ上で、ペニシリン（１００単位／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を補充した、１０％ウマ血清（ＪＲＨ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ、カタログ番号１２４４９−７８Ｐ）、５％熱非働化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ）中で慣用的に増殖させる。１つから４つへの分割を３〜４日毎に行う。細胞を掻き取ることによりプレートから取り出し、そして１５回より多く上下にピペッティングして再懸濁する。
ＥＧＲ／ＳＥＡＰ／Ｎｅｏ構築物を、当該分野で公知の技術を使用して、ＰＣ１２にトランスフェクトする。ＥＧＲ−ＳＥＡＰ／ＰＣ１２安定細胞を、３００μｇ／ｍｌのＧ４１８中で細胞を増殖させることにより得る。Ｇ４１８を含まない培地を慣用的な増殖のために使用するが、１〜２ヶ月毎に、細胞を２継代の間、３００μｇ／ｍｌのＧ４１８中で再増殖させるべきである。
ニューロン活性をアッセイするために、およそ７０〜８０％コンフルエントで細胞を有する１０ｃｍプレートを、古い培地を除去することによりスクリーニングする。細胞をＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）を用いて１回洗浄する。次いで、細胞を低血清培地（抗生物質とともに１％ウマ血清および０．５％ ＦＢＳを含むＲＰＭＩ−１６４０）中で一晩、飢餓（ｓｔａｒｖｅ）させる。
翌朝、培地を除去し、そしてＰＢＳで細胞を洗浄する。プレートから細胞を掻き取り、細胞を２ｍｌの低血清培地中で懸濁する。細胞数をカウントし、そしてより低血清の培地を添加し、５×１０５細胞／ｍｌの最終細胞密度に到達させる。
２００μｌの細胞懸濁液を９６ウェルプレートの各ウェルに添加する（１×１０５細胞／ウェルに等しい）。一連の種々の濃度の本発明のアルブミン融合タンパク質を、３７℃で４８〜７２時間添加する。ポジティブコントロールとして、ＥＧＲを介してＰＣ１２細胞を活性化することが公知の成長因子（例えば、５０ｎｇ／μｌの神経成長因子（ＮＧＦ））を使用し得る。代表的には、５０倍を超えるＳＥＡＰ誘導がポジティブコントロールウェルにおいて見られる。当該分野において公知の技術を用いておよび／または実施例７６に記載されるように、ＳＥＡＰアッセイを慣用的に実施し得る。
（実施例７８：Ｔ細胞の活性についてのアッセイ）
以下のプロトコルを使用して、因子を同定すること、および本発明のアルブミン融合タンパク質がＴ細胞を増殖および／または分化するか否かを決定することによって、Ｔ細胞活性を評価する。Ｔ細胞の活性を実施例７５で作製したＧＡＳ／ＳＥＡＰ／Ｎｅｏ構築物を用いて評価する。従って、ＳＥＡＰ活性を増加させる因子は、Ｊａｋｓ−ＳＴＡＴＳシグナル伝達経路を活性化する能力を示す。このアッセイに使用したＴ細胞は、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＴＩＢ−１５２）であるが、Ｍｏｌｔ−３細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−１５５２）およびＭｏｌｔ−４細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−１５８２）細胞もまた使用し得る。
Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞は、リンパ芽球性ＣＤ４＋ Ｔｈ１ヘルパー細胞である。安定な細胞株を作製するために、およそ２００万のＪｕｒｋａｔ細胞をＤＭＲＩＥ−Ｃ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、ＧＡＳ−ＳＥＡＰ／ｎｅｏベクターでトランスフェクトする（以下に記載のトランスフェクション手順）。トランスフェクトした細胞を、およそ２０，０００細胞／ウェルの密度で播種し、そして１ｍｇ／ｍｌのジェネティシン（ｇｅｎｔｉｃｉｎ）に対して耐性であるトランスフェクト体を選択する。耐性コロニーを増殖させ、次いで、漸増する濃度のインターフェロンγに対するそれらの応答について試験する。選択したクローンの用量応答を示す。
詳細には、以下のプロトコルにより、２００μｌの細胞を含む７５のウェルについて十分な細胞を得る。従って、複数の９６ウェルプレートについて十分な細胞を産生するために、これをスケールアップするか、または複数で実施するかのいずれかを行う。Ｊｕｒｋａｔ細胞をＲＰＭＩ＋１０％血清および１％のＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐ中で維持する。Ｔ２５フラスコ中で２．５ｍｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と１０μｇのプラスミドＤＮＡとを組み合わせる。５０μｌのＤＭＲＩＥ−Ｃを含む２．５ｍｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭを添加し、そして、室温で１５〜４５分間インキュベートする。
インキュベート時間の間、細胞濃度をカウントし、必要な細胞数（トランスフェクションあたり１０７個）をスピンダウンし、そして最終濃度が１０７細胞／ｍｌとなるようにＯＰＴＩ−ＭＥＭ中で再懸濁する。次いで、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ中の１×１０７個の細胞の１ｍｌをＴ２５フラスコに加え、そして３７℃で６時間インキュベートする。インキュベーションの後、１０ｍｌのＲＰＭＩ＋１５％の血清を添加する。
Ｊｕｒｋａｔ：ＧＡＳ−ＳＥＡＰ安定レポーター株をＲＰＭＩ＋１０％血清、１ｍｇ／ｍｌジェネティシン、および１％のＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐ中で維持する。これらの細胞は、本発明の１つ以上の種々の濃度の融合タンパク質で処理される。
融合タンパク質での処理日に細胞を洗浄すべきであり、そして１ｍｌあたり５００，０００個の細胞の密度となるように新鮮なＲＰＭＩ＋１０％血清中に再懸濁するべきである。必要な細胞の正確な数は、スクリーニングされる融合タンパク質の数および融合タンパク質の異なる濃度の数に依存する。１枚の９６ウェルプレートについて、およそ１０００万個の細胞（１０枚のプレートについて１億個の細胞）を必要とする。
融合タンパク質で処理したＪｕｒｋａｔ細胞を含むウェルディッシュをインキュベーターに４８時間置く（注記：この時間は４８〜７２時間の間で変更可能である）。次いで、各ウェルから３５μｌのサンプルを１２チャンネルのピペットを用いて、不透明な９６ウェルプレートに移す。不透明なプレートを（セロファンのカバーを用いて）覆うべきであり、そして実施例７６に従ってＳＥＡＰアッセイを実施するまで、−２０℃で保存するべきである。残存する処理した細胞を含むプレートを４℃に置き、そして、所望するならば、特定のウェル上でのアッセイを繰り返すための物質の供給源として供する。
ポジティブコントロールとして、１００ユニット／ｍｌのインターフェロンγを使用し得、これは、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞を活性化することが公知である。代表的には、３０倍を超える誘導が、ポジティブコントロールのウェルにおいて観察される。
上述のプロトコルは、一過性および安定性の両方のトランスフェクト細胞の作製に用いられ得、このことは当業者に明らかである。
（実施例７９：Ｔ細胞の活性についてのアッセイ）
ＮＦ−ＫＢ（核因子ＫＢ）は、広範な種々の薬剤（炎症性サイトカインであるＩＬ−１およびＴＮＦ、ＣＤ３０およびＣＤ４０、リンホトキシン−αおよびリンホトキシン−βを含む）により、ＬＰＳまたはトロンビンへの曝露により、ならびに特定のウイルス遺伝子産物の発現により活性化される転写因子である。転写因子として、ＮＦ−ＫＢは免疫細胞の活性化に関与する遺伝子の発現、アポトーシスの制御（ＮＦ−ＫＢは、アポトーシスから細胞を保護するようである）、Ｂ細胞およびＴ細胞の発生、抗ウイルス応答および抗菌応答、ならびに複数のストレス応答を調節する。
刺激されない条件において、ＮＦ−ＫＢは、Ｉ−ＫＢ（インヒビターＫＢ）を有する細胞質に保持される。しかし、刺激の際に、Ｉ−ＫＢはリン酸化され、そして分解され、ＮＦ−ＫＢの核への往復（ｓｈｕｔｔｌｅ）を引き起こし、これにより標的遺伝子の転写を活性化する。ＮＦ−ＫＢにより活性化される標的遺伝子としては、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＣＡＭ−１およびクラス１ＭＨＣが挙げられる。
その中心的な役割および一定の範囲の刺激に応答する能力に起因して、ＮＦ−ＫＢプロモーターエレメントを利用するレポーター構築物を、融合タンパク質をスクリーニングするために使用する。ＮＦ−ＫＢのアクチベーターまたはインヒビターは、疾患の処置、予防および／または診断に有用である。例えば、ＮＦ−ＫＢのインヒビターを、急性または慢性的なＮＦ−ＫＢの活性化に関連する疾患（例えば、慢性関節リウマチ）を処置するために使用し得る。
ＮＦ−ＫＢプロモーターエレメントを含むベクターを構築するために、ＰＣＲに基づいたストラテジーを用いる。上流のプライマーは、ＮＦ−ＫＢ結合部位（ＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＣ）（配列番号１１１９）の４つの直列のコピー、ＳＶ４０初期プロモーター配列の５’末端に対して相補的な１８ｂｐの配列を含み、そしてＸｈｏＩ部位に隣接する：
５’：ＧＣＧＧＣＣＴＣＧＡＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＣＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＡＴＣＣＴＧＣＣＡＴＣＴＣＡＡＴＴＡＧ：３’（配列番号１１２０）。
下流プライマーは、ＳＶ４０プロモーターの３’末端に対して相補的であり、そしてＨｉｎｄＩＩＩ部位に隣接する：
５’：ＧＣＧＧＣＡＡＧＣＴＴＴＴＴＧＣＡＡＡＧＣＣＴＡＧＧＣ：３’（配列番号１１１５）。
ＰＣＲ増幅を、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手したｐＢ−ｇａｌ：プロモータープラスミドに存在するＳＶ４０プロモーターのテンプレートを使用して実施する。得られたＰＣＲフラグメントをＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そしてＢＬＳＫ２−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にサブクローニングする。Ｔ７およびＴ３プライマーを用いる配列決定により、挿入物が以下の配列を含むことを確認する：
Figure 2014043448
 次に、ＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを使用して、ｐＳＥＡＰ２−プロモータープラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に存在するＳＶ４０最小プロモーターエレメントをこのＮＦ−ＫＢ／ＳＶ４０フラグメントで置換する。しかし、このベクターはネオマイシン耐性遺伝子を含まず、そしてそれゆえ哺乳動物の発現系には好ましくない。
安定な哺乳動物細胞株を作製するために、ＮＦ−ＫＢ／ＳＶ４０／ＳＥＡＰカセットを制限酵素ＳａｌＩおよびＮｏｔＩを使用して上記のＮＦ−ＫＢ／ＳＥＡＰベクターから取り出し、そしてネオマイシン耐性を含むベクターに挿入する。詳細には、ＳａｌＩおよびＮｏｔＩでｐＧＦＰ−１を制限処理した後に、ＮＦ−ＫＢ／ＳＶ４０／ＳＥＡＰカセットをｐＧＦＰ−１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に挿入し、ＧＦＰ遺伝子を置換した。
一旦、ＮＦ−ＫＢ／ＳＶ４０／ＳＥＡＰ／Ｎｅｏベクターを作製した後は、実施例７６に記載のプロトコルに従って、安定なＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞を作製し、そして維持する。同様に、これらの安定なＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞を含む融合タンパク質をアッセイするための方法がまた、実施例７６に記載される。ポジティブコントロールとして、外因性のＴＮＦα（０．１、１、１０ｎｇ）をウェルＨ９、Ｈ１０、およびＨ１１に添加し、代表的には、５〜１０倍の活性化が観察される。
（実施例８０：骨髄性活性を同定するアッセイ）
以下のプロトコルを使用して、融合タンパク質が骨髄性細胞を増殖および／または分化させるか否かを決定することにより本発明のアルブミン融合タンパク質の骨髄性活性を評価する。骨髄性細胞の活性を実施例７５において産生されたＧＡＳ／ＳＥＡＰ／Ｎｅｏ構築物を用いて評価する。従って、ＳＥＡＰ活性を増加させる因子は、Ｊａｋｓ−ＳＴＡＴＳシグナル伝達経路を活性化させる能力を示す。このアッセイに使用した骨髄性細胞は、Ｕ９３７（前単球（ｐｒｅ−ｍｏｎｏｃｙｔｅ）細胞株である）が、ＴＦ−１、ＨＬ６０、またはＫＧ１も使用し得る。
Ｕ９３７細胞を、実施例７５において産生されたＧＡＳ／ＳＥＡＰ／Ｎｅｏ構築物で、一過性にトランスフェクトするために、ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎ法（Ｋｈａｒｂａｎｄａら、１９９４，Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ ＆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，５：２５９−２６５）を用いる。最初に、２×１０７個のＵ９３７細胞を収集し、そしてＰＢＳで洗浄する。Ｕ９３７細胞を、通常、１００単位／ｍｌのペニシリンおよび１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充した１０％熱不活性化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ １６４０培地中で増殖させる。
次に、０．５ｍｇ／ｍｌ ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎ、８μｇのＧＡＳ−ＳＥＡＰ２プラスミドＤＮＡ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、３７５μＭ Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、および６７５μＭ ＣａＣｌ２を含む１ｍｌの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．４）緩衝液に細胞を懸濁する。３７℃で４５分間インキュベートする。
１０％ ＦＢＳを含むＲＰＭＩ １６４０培地で細胞を洗浄し、次いで、１０ｍｌの完全培地に再懸濁し、そして３７℃で３６時間インキュベートする。
ＧＡＳ−ＳＥＡＰ／Ｕ９３７安定細胞を、４００μｇ／ｍｌのＧ４１８中で細胞を増殖させることにより得る。慣用的な増殖のためにＧ４１８を含まない培地を使用するが、１〜２ヶ月毎に細胞を二継代の間、４００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８中で再増殖させるべきである。
これらの細胞を１×１０８個の細胞（これは１０枚の９６ウェルプレートアッセイのために十分である）を収集することにより試験し、そしてＰＢＳで洗浄する。上記の２００ｍｌの増殖培地中に、５×１０５細胞／ｍｌの最終密度で細胞を懸濁する。９６ウェルプレートにおいて１ウェルあたり２００μｌの細胞（すなわち、１×１０５細胞／ウェル）をプレートする。
異なる濃度の融合タンパク質を添加する。３７℃で４８〜７２時間インキュベートする。陽性コントロールとして、１００単位／ｍｌのインターフェロンγを使用し得、これはＵ９３７細胞を活性化させることが公知である。代表的には、３０倍を超える誘導が、陽性コントロールウェルにおいて観察される。当該分野で公知の方法および／または実施例７６に記載のプロトコルに従って上清をＳＥＡＰアッセイする。
（実施例８１：低分子の濃度および膜透過性の変化を同定するアッセイ）
レセプターへのリガンドの結合は、カルシウム、カリウム、ナトリウムのような低分子およびｐＨの細胞内レベルを変化させ、ならびに膜電位を変化させることが公知である。これらの変化を特定細胞のレセプターに結合する融合タンパク質を同定するためのアッセイで測定し得る。以下のプロトコルは、カルシウムについてのアッセイを記載するが、このプロトコルは、カリウム、ナトリウム、ｐＨ、膜電位、または蛍光プローブにより検出可能な任意の他の低分子の変化を検出するように容易に改変され得る。
以下のアッセイは、蛍光測定画像化プレートリーダー（Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ）（「ＦＬＩＰＲ」）を使用して低分子と結合する蛍光分子（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）の変化を測定する。明らかに、低分子を検出する任意の蛍光分子を、本明細書で用いるカルシウム蛍光分子、ｆｌｕｏ−４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ，Ｉｎｃ．；カタログ番号：Ｆ−１４２０２）の代わりに使用し得る。
接着細胞については、細胞を１０，０００〜２０，０００細胞／ウェルで、底が透明なＣｏ−ｓｔａｒ黒色９６ウェルプレートに播種する。プレートをＣＯ２インキュベーター内で２０時間インキュベートする。接着細胞をＢｉｏｔｅｋ洗浄器内で２００μｌのＨＢＳＳ（ハンクス平衡塩類溶液）で二回洗浄し、最後の洗浄後、１００μｌの緩衝液を残す。
１ｍｇ／ｍｌのｆｌｕｏ−４のストック溶液を１０％プルロニック酸（ｐｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）ＤＭＳＯで作製する。細胞にｆｌｕｏ−４を負荷するため、１２μｇ／ｍｌのｆｌｕｏ−４（５０μｌ）を各ウェルに添加する。このプレートをＣＯ２インキュベーター中、３７℃で６０分間インキュベートする。プレートをＢｉｏｔｅｋ洗浄器で、ＨＢＳＳにより４回洗浄し、１００μｌの緩衝液を残す。
非接着細胞については、細胞を培養培地からスピンダウンする。細胞を、５０ｍｌのコニカルチューブ内でＨＢＳＳを用いて２〜５×１０６細胞／ｍｌに再懸濁する。細胞懸濁液各１ｍｌあたりに対し、１０％プルロニック酸ＤＭＳＯ中の１ｍｇ／ｍｌ ｆｌｕｏ−４溶液４μｌを添加する。次に、チューブを３７℃の水浴中に３０〜６０分間置く。細胞をＨＢＳＳで二回洗浄し、１×１０６細胞／ｍｌに再懸濁し、そしてマイクロプレートに１００μｌ／ウェルで分配する。プレートを１０００ｒｐｍで５分間遠心分離する。次に、プレートをＤｅｎｌｅｙ Ｃｅｌｌ Ｗａｓｈ中で２００μｌで一回洗浄した後、吸引工程により最終容量を１００μｌにする。
非細胞ベースのアッセイについて、各ウェルは、ｆｌｕｏ−４のような蛍光分子を含有する。融合タンパク質をウェルに添加し、そして蛍光の変化を検出する。
細胞内カルシウムの蛍光を測定するために、ＦＬＩＰＲを以下のパラメーターについて設定する：（１）システムゲイン（Ｓｙｓｔｅｍ ｇａｉｎ）は、３００〜８００ｍＷであり；（２）曝露時間は、０．４秒間であり；（３）カメラＦ／ストップは、Ｆ／２であり；（４）励起は４８８ｎｍであり；（５）発光は５３０ｎｍであり；そして（６）サンプル添加は５０μｌである。５３０ｎｍでお発光の増加は、本発明のアルブミン融合タンパク質または本発明のアルブミン融合タンパク質によって誘導される分子のいずれかの分子に起因する、細胞外シグナル伝達事象を示し、これは、細胞内Ｃａ＋＋濃度の増加を生じる。
（実施例８２：チロシンキナーゼ活性を同定するアッセイ）
プロテインチロシンキナーゼ（ＰＴＫ）は、多様な群の膜貫通キナーゼおよび細胞質キナーゼを表す。レセプタープロテインチロシンキナーゼ（ＲＰＴＫ）群内に、ＰＤＧＦ、ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＮＧＦ、ＨＧＦおよびインスリンレセプターサブファミリーを含む、一定の範囲のマイトジェン性および代謝性成長因子のレセプターがある。さらに、対応するリガンドが未知である大きなＲＰＴＫのファミリーがある。ＲＰＴＫのリガンドは、主として分泌される低分子量タンパク質を含むが、膜結合型および細胞外マトリックスタンパク質も含む。
リガンドによるＲＰＴＫの活性化は、リガンド媒介レセプター二量体化を含み、これはレセプターサブユニットのトランスリン酸化および細胞質チロシンキナーゼの活性化を生じる。細胞質チロシンキナーゼとしては、ｓｒｃファミリー（例えば、ｓｒｃ、ｙｅｓ、ｌｃｋ、ｌｙｎ、ｆｙｎ）のレセプター関連チロシンキナーゼ、ならびにＪａｋファミリーのような非レセプター結合型および細胞質ゾルタンパク質チロシンキナーゼが挙げられる。これらのメンバーは、レセプターのサイトカインスーパーファミリー（例えば、インターロイキン、インターフェロン、ＧＭ−ＣＳＦおよびレプチン（Ｌｅｐｔｉｎ））によって誘発されるシグナル伝達を媒介する。
チロシンキナーゼ活性を刺激し得る公知の因子は広範であるので、本発明のアルブミン融合タンパク質または本発明のアルブミン融合タンパク質によって誘導される分子が、チロシンキナーゼシグナル伝達経路を活性化し得るか否かを同定することは興味深い。従って、以下のプロトコルを設計して、チロシンキナーゼシグナル伝達経路を活性化し得るこのような分子を同定する。
標的細胞（例えば、初代ケラチノサイト）を約２５，０００細胞／ウェルの密度で、Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ（Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ，ＩＬ）から購入した９６ウェルＬｏｐｒｏｄｙｎｅ Ｓｉｌｅｎｔ Ｓｃｒｅｅｎ Ｐｌａｔｅに播種する。プレートを１００％エタノールで３０分間、二回リンスして滅菌し、水でリンスし、そして一晩乾燥させる。いくつかのプレートを、１００ｍｌの細胞培養グレードＩ型コラーゲン（５０ｍｇ／ｍｌ）、ゼラチン（２％）またはポリリジン（５０ｍｇ／ｍｌ）（これらは全て、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入し得る）で、またはＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）から購入した１０％ Ｍａｔｒｉｇｅｌ、あるいは仔ウシ血清で２時間コーティングし、ＰＢＳでリンスし、そして４℃で保存する。増殖培地に５，０００細胞／ウェルを播種し、製造業者のＡｌａｍａｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ，ＣＡ）が記載するように、ａｌａｍａｒＢｌｕｅを使用して４８時間後に細胞数を間接定量することにより、これらのプレート上の細胞増殖をアッセイする。Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）のＦａｌｃｏｎプレートカバー＃３０７１を使用して、Ｌｏｐｒｏｄｙｎｅ Ｓｉｌｅｎｔ Ｓｃｒｅｅｎ Ｐｌａｔｅを覆う。Ｆａｌｃｏｎ Ｍｉｃｒｏｔｅｓｔ ＩＩＩ細胞培養プレートもまた、いくつかの増殖実験において使用され得る。
抽出物を調製するために、Ａ４３１細胞をＬｏｐｒｏｄｙｎｅプレートのナイロンメンブレン上に播種し（２０，０００／２００ｍｌ／ウェル）、そして完全培地中で一晩培養する。細胞を、無血清基本培地中で２４時間インキュベートして静止させる。ＥＧＦ（６０ｎｇ／ｍｌ）または異なる濃度の本発明のアルブミン融合タンパク質で５〜２０分間処理した後、培地を除去し、そして１００ｍｌの抽出緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．１％ＳＤＳ、２ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、２ｍＭ Ｎａ４Ｐ２Ｏ７およびＢｏｅｈｅｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）から入手したプロテアーゼインヒビターのカクテル（＃１８３６１７０））を各ウェルに添加し、そしてプレートを回転振盪器上、４℃で５分間振盪する。次に、プレートを真空トランスファーマニホルド（ｖａｃｕｕｍ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｍａｎｉｆｏｌｄ）に設置し、そしてハウスバキュームを使用して抽出物を各ウェルの底の０．４５ｍｍ膜を通して濾過する。抽出物をバキュームマニホールドの底の９６ウェル捕獲／アッセイプレートに集め、そして直ちに氷上に置く。遠心分離により明澄化した抽出物を得るため、界面活性剤で５分間可溶化した後、各ウェルの含有物を取り出し、そして４℃にて１６，０００×ｇで１５分間遠心分離する。
濾過抽出物をチロシンキナーゼ活性のレベルについて試験する。チロシンキナーゼ活性を検出する多数の方法が公知であるが、本明細書においては方法の一つを記載する。
一般的に、特定の基質（ビオチン化ペプチド）上のチロシン残基をリン酸化する能力を決定することにより、本発明のアルブミン融合タンパク質のチロシンキナーゼ活性を評価する。この目的に使用され得るビオチン化ペプチドとしては、ＰＳＫ１（細胞分裂キナーゼｃｄｃ２−ｐ３４のアミノ酸６〜２０に相当）およびＰＳＫ２（ガストリンのアミノ酸１〜１７に相当）が挙げられる。両方のペプチドは、一定範囲のチロシンキナーゼの基質であり、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍから入手可能である。
以下の成分を順に添加することにより、チロシンキナーゼ反応を設定する。まず、５μＭビオチン化ペプチド１０μｌを添加した後、次いで、１０μｌのＡＴＰ／Ｍｇ２＋（５ｍＭ ＡＴＰ／５０ｍＭ ＭｇＣｌ２）、次いで１０μｌの５×アッセイ緩衝液（４０ｍＭ塩酸イミダゾール、ｐＨ７．３、４０ｍＭ β−グリセロリン酸塩、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１００ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭ ＭｎＣｌ２、０．５ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）、次いでバナジン酸ナトリウム（１ｍＭ）５μｌ、次いで水５μｌを添加する。成分を穏やかに混合し、反応混合物を３０℃で２分間プレインキュベートする。コントロール酵素または濾過上清（１０μｌ）を加えて反応を開始させる。
次に、１２０ｍＭ ＥＤＴＡ（１０μｌ）を添加することによりチロシンキナーゼアッセイ反応を停止し、その反応物を氷上に置く。
反応混合物の５０μｌのアリコートをマイクロタイタープレート（ＭＴＰ）モジュールに移し、３７℃で２０分間インキュベートすることにより、チロシンキナーゼ活性を決定する。これにより、ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖａｄｉｎ）コーティング９６ウェルプレートをビオチン化ペプチドと会合させる。ＭＴＰモジュールを３００μｌ／ウェルのＰＢＳで４回洗浄する。次に、７５μｌの西洋ワサビペルオキシダーゼに結合体化した抗ホスホチロシン（ｐｈｏｓｐｏｔｙｒｏｓｉｎｅ）抗体（抗Ｐ−Ｔｙｒ−ＰＯＤ（０．５ｕ／ｍｌ））を、各ウェルに添加し、そして３７℃で１時間インキュベートする。ウェルを上記のように洗浄する。
次に、１００μｌのペルオキシダーゼ基質溶液（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を加え、室温で少なくとも５分間（最長３０分間）インキュベートする。ＥＬＩＳＡリーダーを使用して、４０５ｎｍにおけるサンプルの吸光度を測定する。結合したペルオキシダーゼ活性のレベルをＥＬＩＳＡリーダーを使用して定量する。これは、チロシンキナーゼ活性のレベルを反映する。
（実施例８３：リン酸化活性を同定するアッセイ）
実施例８２に記載のタンパク質チロシンキナーゼ活性アッセイの可能性のある代替物および／または補体（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔ）として、主要な細胞内シグナル伝達中間体の活性化（リン酸化）を検出するアッセイもまた使用し得る。例えば、下記のように、一つの特定のアッセイは、Ｅｒｋ−１キナーゼおよびＥｒｋ−２キナーゼのチロシンリン酸化を検出し得る。しかし、Ｒａｆ、ＪＮＫ、ｐ３８ ＭＡＰ、Ｍａｐキナーゼキナーゼ（ＭＥＫ）、ＭＥＫキナーゼ、Ｓｒｃ、筋肉特異的キナーゼ（ＭｕＳＫ）、ＩＲＡＫ、ＴｅｃおよびＪａｎｕｓのような他の分子、ならびに他の任意のホスホセリン、ホスホチロシンまたはホスホスレオニン分子のリン酸化を、以下のアッセイにおいてこれらの分子でＥｒｋ−１またはＥｒｋ−２を置き換えることにより検出し得る。
詳細には、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートのウェルを０．１ｍｌのプロテインＧ（１μｇ／ｍｌ）により室温（ＲＴ）で２時間コーティングしてアッセイプレートを作製する。次に、プレートをＰＢＳでリンスし、そして３％ＢＳＡ／ＰＢＳによりＲＴで１時間ブロックする。次に、プロテインＧプレートをＥｒｋ−１およびＥｒｋ−２に対する二つの市販のモノクローナル抗体（１００ｎｇ／ウェル）（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で処理（ＲＴで１時間）する。（他の分子を検出するために、上記の任意の分子を検出するモノクローナル抗体を交換することにより、この工程を容易に改変し得る）。ＰＢＳで３〜５回リンスした後、使用時まで、プレートを４℃で貯蔵する。
Ａ４３１細胞を２０，０００／ウェルで９６ウェルＬｏｐｒｏｄｙｎｅフィルタープレートに播種し、そして増殖培地中で一晩培養する。次に、細胞を基本培地（ＤＭＥＭ）中で４８時間飢餓させ、次いでＥＧＦ（６ｎｇ／ウェル）または種々の濃度の本発明の融合タンパク質で５〜２０分間処理する。次に、細胞を可溶化し、そして抽出物を濾過して直接アッセイプレート中に入れる。
抽出物を用いてＲＴで１時間インキュベートした後、ウェルを再度リンスする。陽性コントロールとして、市販のＭＡＰキナーゼ調製物（１０ｎｇ／ウェル）をＡ４３１抽出物の代わりに使用する。次に、プレートを、Ｅｒｋ−１キナーゼおよびＥｒｋ−２キナーゼのリン酸化エピトープを特異的に認識する市販のポリクローナル（ウサギ）抗体（１μｇ／ｍｌ）で処理する（ＲＴで１時間）。この抗体を標準的な手順によりビオチン化する。次に、Ｗａｌｌａｃ ＤＥＬＦＩＡ装置内で、結合ポリクローナル抗体をユーロピウムストレプトアビジンおよびユーロピウム蛍光増強剤と連続的にインキュベートする（時間分解性蛍光）ことによって定量する。バックグラウンドを超える蛍光シグナルの増加は、本発明の融合タンパク質によるリン酸化または本発明のアルブミン融合タンパク質によって誘導される分子を示す。
（実施例８４：骨髄ＣＤ３４＋細胞増殖の刺激についてのアッセイ）
このアッセイは、ヒトＣＤ３４＋が、造血増殖因子の存在下で増殖する能力に基づき、そしてＣＤ３４＋細胞の増殖を刺激する本発明の融合タンパク質の能力を評価する。
最も熟成した前駆体は、単一シグナルのみに応答することが以前に示されている。より未熟な前駆体は、応答するために少なくとも２つのシグナルを必要とする。従って、広範な先祖細胞の造血活性に対する本発明の融合タンパク質の効果を試験するために、このアッセイは、造血増殖因子の存在下または非存在下において、所定の本発明の融合タンパク質を含む。単離された細胞を、試験サンプルと組み合わせて、幹細胞因子（ＳＣＦ）の存在下で、５日間培養する。ＳＣＦのみは、骨髄（ＢＭ）細胞の増殖に対して、非常に制限された効果を有し、「生存」因子としてのみ、このような条件下で作用する。しかし、これらの細胞（例えば、ＩＬ−３）に対する刺激効果を示す任意の因子と組み合わせると、ＳＣＦは、相乗効果を生じる。従って、試験された融合タンパク質が、造血祖先に対する刺激効果を有する場合、このような活性は、容易に検出され得る。正常なＢＭ細胞は、低レベルの細胞周期（ｃｙｃｌｉｎｇ ｃｅｌｌ）を有するので、所定の融合タンパク質のいかなる阻害効果も検出されないようである。従って、先祖に対する阻害効果についてのアッセイが、好ましくは、ＳＣＦ＋ＩＬ＋３でのインビトロ刺激に最初に供され、次いで、このような誘起増殖の阻害のために評価される化合物と接触させられる細胞において試験される。
簡潔には、ＣＤ３４＋細胞は、当該分野で公知の方法を使用して単離される。これらの細胞は、解凍され、そして、培地（１％ Ｌ−グルタミンを有するＱＢＳＦ ６０ 無血清培地（５００ｍｌ）（Ｑｕａｌｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ Ｃａｔ＃ １６０−２０４−１０１））に再懸濁される。２００×ｇでのいくらか穏やかな遠心分離の後、細胞は、１時間静置される。細胞数を２．５×１０５細胞／ｍｌに調節する。この時間の間、１００μｌの滅菌水を９６ウェルプレートの周辺ウェルに添加する。このアッセイにおいて、本発明のアルブミン融合タンパク質で試験され得るサイトカインは、５０ｎｇ／ｍｌのｒｈＳＣＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，Ｃａｔ＃ ２５５−ＳＣ）のみであり、そして３０ｎｇ／ｍｌのｒｈＳＣＦとｒｈＩＬ−３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，Ｃａｔ＃ ２０３−ＭＬ）との組み合わせである。１時間後、１０μｌの調製されたサイトカイン、種々の濃度の本発明のアルブミン融合タンパク質および２０μｌの希釈された細胞を、培地に添加し、この培地は、１００μｌの最終全体積にするためにすでにウェル中に存在する。次いで、このプレートを３７℃／５％ ＣＯ２インキュベータに５日間置く。
アッセイを行う（ｈａｒｖｅｓｔ）１８時間前に、０．５μＣｉ／ウェルの［３Ｈ］チミジンを、各ウェルに１０μｌの体積で添加し、増殖率を決定する。この実験は、Ｔｏｍｔｅｃ Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ ９６を使用して、細胞を、各９６ウェルプレートからフィルターマットに収集することによって終結される。収集後、フィルターマットを乾燥し、トリムし、そして１つのＯｍｎｉｆｉｌｔｅｒプレートおよび１つのＯｍｎｉＦｉｌｔｅｒトレイからなるＯｍｎｉｆｉｌｔｅｒアセンブリに置く。６０μｌのＭｉｃｒｏｓｃｉｎｔを各ウェルに添加し、そしてプレートをＴｏｐＳｅａｌ−Ａプレスオンフィーリングフィルムで密閉する。バーコード１５ステッカーを計数のために、第１のプレートに固定する。次いで、密閉されたプレートを充填し、そして放射能のレベルを、Ｐａｒｃｋａｒｄ Ｔｏｐ Ｃｏｕｎｔを介して決定し、プリントされたデータを分析のために収集する。放射能レベルは、細胞増殖の量を反映する。
本実施例に記載される研究は、骨髄ＣＤ３４＋細胞増殖を刺激する、所定の融合タンパク質の活性を試験する。当業者は、本発明のアルブミン融合タンパク質およびポリヌクレオチド（例えば、遺伝子治療）ならびにそのアゴニストおよびアンタゴニストの活性を試験するために、例示された実施例を容易に改変し得る。骨髄ＣＤ３４＋細胞の増殖を刺激する本発明のアルブミン融合タンパク質の能力は、この融合タンパク質に対応するアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドが、免疫系および造血に影響する障害の診断および処置に有用であることを示す。代表的な用途は、上記の「免疫活性」および「感染疾患」の節、ならびに本明細書中の他の箇所に記載される。
（実施例８５：細胞外マトリックス増強細胞応答（ＥＭＥＣＲ）についてのアッセイ） 細胞外マトリックス増強細胞応答（ＥＭＥＣＲ）アッセイの目的は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）誘導シグナルに関連して、造血幹細胞に作用する本発明の融合タンパク質の能力を評価することである。
周囲のミクロ環境から受けるシグナルに関連して、細胞は、調節因子に応答する。例えば、線維芽細胞、ならびに内皮幹細胞および上皮幹細胞は、ＥＣＭからのシグナルの非存在下で、複製することができない。造血幹細胞は、骨髄中で自己再生を起こし得るが、インビトロ懸濁液培養では自己再生を起こさない。インビトロで自己再生を起こす幹細胞の能力は、間質（ｓｔｒｏｍａｌ）細胞およびＥＣＭタンパク質フィブロネクチン（ｆｎ）とのそれらの相互作用に依存する。細胞のｆｎへの吸着は、α５．β１およびα４．β１インテグリンレセプターによって媒介され、これらのレセプターは、ヒトおよびマウス造血幹細胞によって発現される。ＥＣＭ環境で組み込み、そして幹細胞の自己再生の刺激の原因である因子は未だ同定されていない。このような因子の発見は、遺伝子治療および脊髄移植適用における重要な目的である。
簡潔には、ポリスチレンの組織培養処理されていない９６ウェルプレートは、０．２μｇ／ｃｍ２のコーティング濃度でｆｎフラグメントでコートされる。マウス骨髄細胞を、０．２ｍｌの無血清培地（１，０００細胞／ウェル）にプレートする。ＩＬ−３（５ｎｇ／ｍｌ）＋ＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で培養された細胞は、幹細胞の自己再生が期待されず、明確な分化が期待される条件で、ポジティブコントロールとして作用する。
本発明のアルブミン融合タンパク質は、ＳＣＦ（５．０ｎｇ／ｍｌ）の存在下、または非存在下で適切なネガティブコントロールとともに試験され、ここで、本発明のアルブミン融合タンパク質を含む投与される組成物の容量は、全アッセイ体積の１０％を示す。次いで、プレートされた細胞を、低酸素環境（５％ＣＯ２、７％Ｏ２および８８％Ｎ２）の組織培養インキュベーターで７日間インキュベートすることによって増殖させる。次いで、ウェル内の増殖細胞の数を、細胞ＤＮＡへのチミジン組込みを測定することによって定量する。アッセイにおけるポジティブヒットの確認は、細胞の表現型の特徴付けを必要とし、この特徴付けは、培養系をスケールアップし、そして細胞表面抗原およびＦＡＣＳｃａｎに対する適切な抗体試薬を使用することによって達成される。
本発明の特定の融合タンパク質は、造血祖先の刺激薬であることが見出される場合、この融合タンパク質に対応する融合タンパク質およびポリヌクレオチドは、免疫系および造血に影響する障害の診断および処置に有用であり得る。代表的な用途は、上記の「免疫活性」および「感染疾患」の節、ならびに本明細書の他の箇所に記載される。融合タンパク質はまた、種々の血液連鎖の幹細胞および先駆細胞（ｃｏｍｍｉｔｅｄ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）の拡張において、そして種々の細胞の型の分化および／または増殖において有用であり得る。
さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質および本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、造血細胞の増殖および分化を阻害するために使用され、そしてそれによって、化学療法の間に、化学療法薬剤から骨髄幹細胞を保護するために使用され得る。この抗増殖効果は、より高い用量の化学療法薬剤の投与、従って、より有効な化学治療処置を可能にし得る。
さらに、本発明の融合タンパク質および本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドもまた、造血関連障害（例えば、貧血、汎血球減少症、白血球減少症、血小板減少症、または白血病）の処置および診断に有用であり得る。なぜなら、間質細胞は、造血系列の細胞の生成において重要であるからである。これらの用途としては、骨髄細胞エキソビボ培養、骨髄移植、骨髄再形成、新形成の放射線療法または化学療法が、挙げられる。
（実施例８６：ヒト皮膚線維芽細胞および大動脈平滑筋細胞の増殖）
本発明の融合タンパク質を、正常なヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）およびヒト大動脈平滑筋細胞（ＡｏＳＭＣ）の培養物に添加し、そして２つの同時アッセイを各サンプルを用いて実施する。第１のアッセイは、正常なヒト線維芽細胞（ＮＨＤＦ）または大動脈平滑筋細胞（ＡｏＳＭＣ）の増殖に対する、融合タンパク質の効果を試験する。線維芽細胞または平滑筋細胞の異常な増殖は、いくつかの病理学的プロセス（繊維症および再狭窄を含む）の一部である。第２のアッセイは、ＮＨＤＦおよびＳＭＣの両方によるＩＬ６産生を試験する。ＩＬ６産生は、機能的活性化の指標である、活性化細胞は、多数のサイトカインおよび他の因子の産生の増加を有し、これは、炎症誘発性（ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）または免疫調節性の結果を生じ得る。アッセイは、同時刺激活性または阻害活性をチェックするために、同時ＴＮＦα刺激とともに行い、そして同時ＴＮＦα刺激なしで行う。
簡単に述べると、１日目に、９６ウェルの黒いプレートに、１００μｌ培養培地中に１０００細胞／ウェル（ＮＨＤＦ）または２０００細胞／ウェル（ＡｏＳＭＣ）を配置する。ＮＨＤＦ培養培地は、以下：Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ ＦＢ基礎培地、１ｍｇ／ｍｌ ｈＦＧＦ、５ｍｇ／ｍｌインスリン、５０ｍｇ／ｍｌゲンタマイシン、２％ ＦＢＳを含み、一方ＡｏＳＭＣ培養培地は、以下：Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ ＳＭ基礎培地、０．５μｇ／ｍｌ ｈＦＧＦ、５ｍｇ／ｍｌインスリン、１μｇ／ｍｌ ｈＦＧＦ、５０ｍｇ／ｍｌゲンタマイシン、５０μｇ／ｍｌ Ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ Ｂ、５％ ＦＢＳを含む。３７℃で少なくとも４〜５時間のインキュベーション後、培養培地を吸引し、増殖停止培地で置換する。ＮＨＤＦ用の増殖停止培地は、線維芽細胞基礎培地、５０ｍｇ／ｍｌゲンタマイシン、２％ ＦＢＳを含み、一方ＡｏＳＭＣ用の増殖停止培地は、ＳＭ基礎培地、５０ｍｇ／ｍｌゲンタマイシン、５０μｇ／ｍｌ Ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ Ｂ、０．４％ ＦＢＳを含む。３７℃で２日目までインキュベートする。
２日目、本発明のアルブミン融合タンパク質の系列希釈物およびテンプレートを、それらが常に、培地コントロールおよび既知のタンパク質コントロールを含むように、設計する。刺激実験および阻害実験の両方について、タンパク質を増殖停止培地で希釈する。阻害実験について、ＴＮＦａを、最終濃度２ｎｇ／ｍｌ（ＮＨＤＦ）または５ｎｇ／ｍｌ（ＡｏＳＭＣ）まで添加する。コントロールまたは本発明のアルブミン融合タンパク質を含む１／３容量の培地を添加し、そして５日目まで、３７℃／５％ ＣＯ２にてインキュベートする。
各ウェルから６０μｌを別の標識９６ウェルプレートに移し、プレートシーラーで覆い、そして６日目まで４℃で（ＩＬ６ ＥＬＩＳＡのために）保存する。細胞培養プレート中の残りの１００μｌに、その培養物容量の１０％に等しい量（１０μｌ）のＡｌａｍａｒ Ｂｌｕｅを無菌的に添加する。プレートを３〜４時間の間インキュベーターに戻す。
次いで、５３０ｎｍでの励起および５９０ｎｍでの放射を伴う蛍光を、ＣｙｔｏＦｌｕｏｒを使用して測定する。これにより、増殖刺激／阻害のデータを得る。
５日目、ＩＬ−６ ＥＬＩＳＡを、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に希釈した５０〜１００μｌ／ウェルの抗ヒトＩＬ−６モノクローナル抗体で９６ウェルプレートをコーティングすることによって実施し、室温でＯＮをインキュベートする。
６日目、プレートの中身を流しに空け、そしてペーパータオル上で吸い取る。４％ ＢＳＡを含むＰＢＳを含むアッセイ緩衝液を調製する。プレートを、ＰＢＳ中の２００μ／ウェルのＰｉｅｒｃｅ Ｓｕｐｅｒ Ｂｌｏｃｋブロッキング緩衝液で１〜２時間ブロックし、次いで、洗浄緩衝液（ＰＢＳ，０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０）でプレートを洗浄する。プレートをペーパータオル上で吸い取る。次いで、０．５０ｍｇ／ｍｌに希釈した抗ヒトＩＬ−６モノクローナルビオチン標識抗体５０μｌ／ウェルを添加する。ＩＬ−６ストックの培地中の希釈物を作製する（３０ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、３ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、０．３ｎｇ／ｍｌ、０ｎｇ／ｍｌ）。二連のサンプルをプレートの最上列に添加する。プレートを覆い、そして振盪機上で室温で２時間インキュベートする。
プレートを洗浄緩衝液で洗浄し、ペーパータオル上で吸い取る。ＥＵ標識ストレプトアビジンをアッセイ緩衝液中に１：１０００希釈し、そして１００μｌ／ウェルを添加する。プレートを覆い、そして室温で１時間インキュベートする。プレートを再び洗浄緩衝液で洗浄し、そしてペーパータオル上で吸い取る。
１００μｌ／ウェルの増強溶液を添加する。５分間振盪する。Ｗａｌｌａｃ ＤＥＬＦＩＡ蛍光測定器でプレートを読み取る。各アッセイでの三連のサンプルからの読み取りを、表にして平均をとる。
このアッセイにおける陽性の結果は、ＡｏＳＭＣ細胞増殖を示唆し、そしてアルブミン融合タンパク質が皮膚線維芽細胞増殖および／または平滑筋細胞増殖に関与し得ることを示唆する。陽性の結果はまた、融合タンパク質および融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの多くの潜在的な使用を示唆する。例えば、本明細書の全体にわたって記載されるように、炎症および免疫応答、創傷の治癒、ならびに新脈管形成。特に、融合タンパク質は、創傷の治癒および皮膚の再生、ならびに脈管形成（血管およびリンパ管の両方）の促進に使用され得る。脈管の成長は、例えば、心臓血管疾患の処置において使用され得る。さらに、このアッセイにおいて拮抗活性を示す融合タンパク質は、抗脈管（例えば、抗新脈管形成）として作用することによって、新脈管形成を含む、疾患、障害、および／または状態を処置する際に有用であり得る。これらの疾患、障害、および／または状態、例えば以下：悪性腫瘍、固形腫瘍、良性腫瘍（例えば、血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ、および化膿性肉芽腫）；関節硬化性斑（ａｒｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｉｃ ｐｌａｑｕｅ）；眼の脈管形成疾患（例えば、糖尿病性網膜障害、未熟児の網膜障害、黄斑変性、角膜移植拒絶、血管新生緑内障、水晶体後線維増殖症、皮膚潮紅、網膜芽細胞腫、ぶどう膜炎、および眼の翼状片（異常な血管の成長））；慢性関節リウマチ；乾癬；遅延性の創傷の治癒；子宮内膜症；脈管形成；顆粒形成；過形成性瘢痕（ケロイド）；非結合性骨折（ｎｏｎｕｎｉｏｎ ｆｒａｃｔｕｒｅ）；強皮症；トラコーマ；脈管接着；心筋新脈管形成；冠状側副枝；大脳側副枝；動静脈奇形；虚血性の肢の新脈管形成；Ｏｓｌｅｒ−Ｗｅｂｂｅｒ症候群；斑の新生血管形成；毛細血管拡張症；血友病性関節；血管線維腫；線維性筋性形成異常症；創傷肉芽化；クローン病；およびアテローム性硬化症などは、当該分野において公知でありそして／または本明細書中で記載される。さらに、このアッセイにおいてアンタゴニストとして作用するアルブミン融合タンパク質は、当該分野において公知でありそして／または本明細書中で記載される、抗過増殖性疾患および／または抗炎症性疾患を処置する際に有用であり得る。
（実施例８７：内皮細胞上での細胞接着分子（ＣＡＭ）の発現）
リンパ球の、炎症および新脈管形成の領域に対する動員は、リンパ球上の細胞表面接着分子（ＣＡＭ）と脈管内皮との間の特異的なレセプタリガンド相互作用を含む。接着プロセスは、正常の環境および病的な環境の両方において、多段階のカスケードに従い、このカスケードは、内皮細胞（ＥＣ）上での細胞内接着分子１（ＩＣＡＭ−１）、脈管細胞接着分子１（ＶＣＡＭ−１）、および内皮性白血球接着分子１（Ｅ−セレクチン）の発現を含む。脈管内皮上でのこれらの分子などの発現は、白血球が局所的な脈環構造と接着し、そして炎症性応答の進行の間に局所的な組織へと溢出し得る効率を決定する。サイトカインおよび増殖因子の局所的濃度は、これらのＣＡＭの発現の調節に関与する。
簡単には、内皮細胞（例えば、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ））を、標準９６ウェルプレート中でコンフルエンスまで増殖する。増殖培地を、細胞から除去し、そして１００μｌの１９９ Ｍｅｄｉｕｍ（１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ））で置き換える。試験のためのサンプル（本発明のアルブミン融合タンパク質を含む）および陽性コントロールまたは陰性コントロールを、３連（１０μｌの容量ずつ）のプレートに添加する。次いで、プレートを、３７℃で、５時間（セレクチンおよびインテグリンの発現）かまたは２４時間（インテグリンの発現のみ）のいずれかの間インキュベートする。プレートを、培地を除去するために吸引し、そして１００μｌの０．１％パラホルムアルデヒド−ＰＢＳ（Ｃａ＋＋およびＭｇ＋＋含有）を各ウェルに添加する。プレートを４℃で３０分間保持する。固定剤をウェルから除去し、そしてウェルをＰＢＳ（＋Ｃａ、Ｍｇ）＋０．５％ＢＳＡで１回洗浄し、そして水気を切る。１０μｌの希釈した一次抗体を、試験ウェルおよびコントロールウェルに添加する。抗ＩＣＡＭ−１−ビオチン、抗ＶＣＡＭ−１−ビオチン、および抗Ｅ−セレクチン−ビオチンを、１０μｇ／ｍｌの濃度（０．１ｍｇ／ｍｌのストック抗体の１：１０希釈）で使用する。細胞を３７℃で３０分間、加湿された環境においてインキュベートする。ウェルを、ＰＢＳ（＋Ｃａ、Ｍｇ）＋０．５％ＢＳＡで３回洗浄する。２０μｌの希釈されたＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ−Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈｏｔａｓｅ（１：５，０００希釈、本明細書中で作業用希釈液といわれる）を各ウェルに添加し、そして３７℃で３０分間インキュベートする。ウェルを、ＰＢＳ（＋Ｃａ、Ｍｇ）＋０．５％ＢＳＡで３回洗浄し、排出する。５ｍｌのグリシン緩衝液（ｐＨ１０．４）につき１錠のｐ−ニトロフェノールホスフェート（ｐＮＰＰ）を溶解する。グリシン緩衝液中の１００μｌのｐＮＰＰ基質を各試験ウェルに添加する。３連の標準ウェルを、グリシン緩衝液中のＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ−Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈｏｔａｓｅ；１：５，０００（１００）＞１０−０．５＞１０−１＞１０−１．５の作業用希釈液から調製する。各希釈液の５μｌを３連のウェルに添加すると、各ウェル中の得られるＡＰ含有量は、５．５ｎｇ、１．７４ｎｇ、０．５５ｎｇ、０．１８ｎｇである。次いで、１００μｌのｐＮＮＰ試薬を標準ウェルの各々に添加する。このプレートを、３７℃で４時間インキュベートする。５０μｌの容量の３Ｍ ＮａＯＨを、全てのウェルに添加する。このプレートを、グリシン緩衝液のみを充填したブランクウェルでのバックグラウンド除去オプションを使用して、４０５ｎｍのプレートリーダーで読む。さらに、テンプレートを、各標準ウェル［５．５０ｎｇ；１．７４ｎｇ；０．５５ｎｇ；０．１８ｎｇ］中のＡＰ結合体の濃度を示すように調整する。結果を、各サンプル中の結合したＡＰ共重合体の量として示す。
（実施例８８：Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ内皮細胞増殖アッセイ）
このアッセイを使用して、ウシリンパ内皮細胞（ＬＥＣ）、ウシ大動脈内皮細胞（ＢＡＥＣ）、またはヒト微小血管子宮筋細胞（ＵＴＭＥＣ）のｂＦＧＦ誘導増殖のタンパク質媒介性阻害を定量的に決定し得る。このアッセイは、代謝活性の検出に基づく、蛍光定量的な増殖インジケーターを組み込む。標準Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ増殖アッセイを、内皮細胞刺激の供給源として添加した１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを含むＥＧＭ−２ＭＶ中で調製する。このアッセイは、増殖培地および細胞濃度がわずかに変化した様々な内皮細胞と共に使用され得る。試験されるべきタンパク質バッチの希釈物を、適切に希釈する。ｂＦＧＦなしの無血清培地（ＢＩＢＣＯ ＳＦＭ）を、非刺激コントロールとして使用し、そしてＡｎｇｉｏｓｔａｔｉｎまたはＴＳＰ−１を、既知の阻害コントロールとして含める。
簡単には、ＬＥＣ、ＢＡＥＣまたはＵＴＭＥＣを、９６ウェルプレートに、５０００〜２０００細胞／ウェルの密度で、増殖培地に播種し、そして３７℃で一晩放置する。この細胞の一晩のインキュベーションの後、増殖培地を除去し、そしてＧＩＢＣＯ ＥＣ−ＳＦＭで置き換える。この細胞を、追加のｂＦＧＦを含む３連のウェル中で、本発明のアルブミン融合タンパク質またはコントロールタンパク質サンプルの適切な希釈物（ＳＦＭ中で調製）で、１０ｎｇ／ｍｌの濃度まで処理する。一旦、細胞をサンプルで処理すると、プレート（単数または複数）を、３７℃のインキュベーターに３日間戻す。３日後、１０ｍｌのストックａｌａｍａｒ ｂｌｕｅ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｃａｔ＃ ＤＡＬ１１００）を、各ウェルに添加し、そしてプレート（単数または複数）を、３７℃のインキュベーターに４時間戻す。次いで、このプレート（単数または複数）を、ＣｙｔｏＦｌｕｏｒ蛍光リーダーを使用して、５３０ｎｍ励起および５９０ｎｍ発光で読みとる。直接出力を、相対蛍光単位で記録する。
Ａｌａｍａｒ ｂｌｕｅは、細胞増殖から生じる増殖培地の化学的還元に応答して、蛍光を発しかつ色を変化する、酸化−還元指示薬である。培養中で細胞が増殖するにつれて、生得代謝活性によりすぐ周辺の環境の化学的還元が生じる。増殖に関する還元により、この指示薬は、酸化（非蛍光性の青色）形態から還元（蛍光性赤色）形態に変化し得る。
すなわち、刺激された増殖は、より強いシグナルを生成し、そして阻害された増殖は、より弱いシグナルを生成し、そして全シグナルは細胞の総数ならびにそれらの代謝活性に比例する。活性のバックグラウンドレベルは、飢餓培地のみを用いて観察される。これを陽性コントロールサンプル（増殖培地中のｂＦＧＦ）およびタンパク質希釈物から観察される出力と比較する。
（実施例８９：混合リンパ球反応の阻害の検出）
このアッセイを使用して、本発明の融合タンパク質による混合リンパ球反応（ＭＬＲ）の阻害を検出および評価し得る。ＭＬＲの阻害は、細胞増殖および生存度、相互作用する細胞における同時刺激分子の調節、リンパ球と補助細胞との間の接着の調節、または補助細胞によるサイトカイン産生の調節に対する直接効果に起因し得る。複数の細胞は、ＭＬＲを阻害する本発明のアルブミン融合タンパク質によって標的化され得る。なぜなら、このアッセイで使用される末梢血液単核画分は、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球およびナチュラルキラーリンパ球、ならびに単球および樹状細胞を含むためである。
ＭＬＲを阻害することが見出された本発明のアルブミン融合タンパク質は、リンパ球および単球の活性化または増殖に関する疾患における用途を見出し得る。これには、喘息、関節炎、糖尿病、炎症性の皮膚状態、乾癬、湿疹、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、糸球体腎炎、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、動脈硬化症、肝硬変、対宿主性移植片病、対移植片性宿主病、肝炎、白血病およびリンパ腫のような疾患が挙げられるが、これらに限定されない。
簡単には、ヒトドナー由来のＰＢＭＣを、Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（ＬＳＭ（登録商標）、密度 １．０７７０ｇ／ｍｌ、Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ、ＰＡ）を使用する密度勾配遠心分離によって精製する。２人のドナー由来のＰＢＭＣを、１０％ ＦＣＳおよび２ｍＭ グルタミンを補ったＲＰＭＩ−１６４０（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）中、２×１０６細胞／ｍｌに調整する。第３のドナー由来のＰＢＭＣを、２×１０５細胞／ｍｌに調整する。各ドナー由来の５０μｌのＰＢＭＣを、９６ウェル丸底マイクロタイタープレートのウェルに添加する。本融合タンパク質試験材料の希釈物（５０μｌ）を、三連でマイクロタイターウェルに添加する。（目的のタンパク質の）試験サンプルと１：４の最終希釈になるまで添加し；ｒｈｕＩＬ−２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、カタログ番号 ２０２−ＩＬ）を、１μｇ／ｍｌの最終濃度になるまで添加し；抗−ＣＤ４ ｍＡｂ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、クローン ３４９３０．１１、カタログ番号 ＭＡＢ３７９）を１０μｇ／ｍｌの最終濃度になるまで添加する。細胞を、５％ ＣＯ２中、３７℃で７〜８日間培養し、そして１μＣの［３Ｈ］チミジンを、培養の最後の１６時間でウェルに添加する。細胞を収集し、そしてチミジンの取込みを、Ｐａｃｋａｒｄ ＴｏｐＣｏｕｎｔを使用して決定する。データを、３連の測定値の平均および標準偏差として表す。
目的の融合タンパク質のサンプルを、別個の実験でスクリーンし、そして陰性コントロール処理、抗−ＣＤ４ ｍＡＢ（これはリンパ球の増殖を阻害する）、および陽性コントロール処理、ＩＬ−２（組換え物質または上清として）（これは、リンパ球の増殖を促進する）と比較する。
（実施例９０：プロテアーゼ活性についてのアッセイ）
以下のアッセイは、本発明のアルブミン融合タンパク質のプロテアーゼ活性を評価するために使用され得る。
ゼラチンおよびカゼイン酵素電気泳動法を、本質的に記載のように実施する（Ｈｅｕｓｅｎら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０２：１９６−２０２（１９８０）；Ｗｉｌｓｏｎら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｕｒｏｌｏｇｙ、１４９：６５３−６５８（１９９３））。サンプルを、１％ゼラチンまたはカゼインを含む１０％ポリアクリルアミド／０．１％ＳＤＳゲルで泳動し、２．５％トリトン中に室温で１時間浸漬し、そして０．１Ｍグリシン（ｐＨ８．３）中に３７℃で５〜１６時間浸漬する。アミド中での染色後、タンパク質分解の黒色領域が、濃紺のバックグラウンドに対する明瞭な領域として出現する。トリプシン（Ｓｉｇｍａ Ｔ８６４２）を、陽性コントロールとして使用する。
プロテアーゼ活性はまた、ｎ−α−ベンゾイル−Ｌ−アルギニンエチルエステル（ＢＡＥＥ）（Ｓｉｇｍａ Ｂ−４５００）の開裂をモニタリングすることによって決定される。反応を、（２５ｍＭＮａＰＯ４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、および１ｍＭ ＢＡＥＥ）、ｐＨ７．５で調整する。サンプルを添加し、２６０ｎｍでの吸光度の変化を、Ｂｅｃｋｍａｎ ＤＵ−６分光光度計を用いて時間駆動様式（ｔｉｍｅ− ｄｒｉｖｅ ｍｏｄｅ）でモニターする。トリプシンを、陽性コントロールとして使用する。
さらなるアッセイを、２８０ｎｍでの吸光度として測定するかまたはＦｏｌｉｎ法を用いた比色分析で測定したカゼインまたはヘモグロビンからの酸可溶性ペプチドの遊離に基づいて、Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ、５（１９８４）に記載されるように実施する。他のアッセイは、色素形成基質の可溶化を含む（Ｗａｒｄ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１−３１７（１９８３））。
（実施例９１：セリンプロテアーゼ基質特異性の同定）
当該分野で公知の方法または本明細書中に記載された方法を用いて、セリンプロテアーゼ活性を有する本発明のアルブミン融合タンパク質の基質特異性を決定し得る。基質特異性決定の好ましい方法は、ＧＢ ２ ３２４ ５２９（本明細書中にその全体が援用される）に記載されるように、合成コンビナトリアルライブラリーの位置的スキャニングの使用による方法である。
（実施例９２：リガンド結合アッセイ）
以下のアッセイは、本発明のアルブミン融合タンパク質のリガンド結合活性を評価するために用いられ得る。
リガンド結合アッセイは、レセプター薬理学を確認するための直接法を提供し、高速形式に適応可能である。本発明のアルブミン融合タンパク質に対する精製リガンドを放射性同位体標識して、結合研究のために高い比放射能（５０〜２０００ Ｃｉ／ｍｍｏｌ）にする。次いで、放射性同位体標識のプロセスが融合タンパク質に対するリガンドの活性を低下させないように、決定を行う。緩衝液、イオン、ｐＨおよび他の調節因子（例えば、ヌクレオチド）に関するアッセイ条件を最適化して、膜のポリペプチド源および細胞全体のポリペプチド源の両方についての有効なシグナル対ノイズ比を構築する。これらのアッセイについて、特異的ポリペプチド結合を、総関連放射活性から、過剰の非標識競合リガンドの存在下で測定した放射活性を引いた差として規定する。可能な場合、残留非特異的結合を規定するために、１つより多くの競合リガンドを使用する。
（実施例９３：アフリカツメガエル卵母細胞における機能的アッセイ）
本発明のアルブミン融合タンパク質をコードする線状化プラスミドテンプレート由来のキャップＲＮＡ転写物を、標準手順に従ってＲＮＡポリメラーゼを用いてインビトロで合成する。インビトロ転写物を、０．２ｍｇ／ｍｌの最終濃度で水中に懸濁する。卵巣葉を成体雌性カエルから取り出し、第Ｖ段階の濾胞除去した卵母細胞を得、そしてＲＮＡ転写物（１０ｎｇ／卵母細胞）を、微量注入装置を用いて５０ｎｌボーラスで注射する。２電極電圧クランプを用いて、融合タンパク質およびポリペプチドアゴニスト曝露に対する個々のアフリカツメガエル卵母細胞由来の電流を測定する。室温でＣａ２＋を含まないバルト培地（Ｂａｒｔｈ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ）において記録を行う。このアフリカツメガエル系を、リガンドの活性化のための公知のリガンドおよび組織／細胞抽出物のスクリーニングに使用し得る。
（実施例９４：微量生理機能測定（ｍｉｃｒｏｐｈｙｓｉｏｍｅｒｉｃ）アッセイ）
多種多様の二次メッセンジャー系（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ｓｙｓｔｅｍ）の活性化により、細胞から少量の酸が噴出する。形成された酸は、主に、細胞内シグナル伝達プロセスを刺激するのに必要な代謝活性の増大の結果である。細胞周囲の培地のｐＨ変化は非常に小さいが、ＣＹＴＯＳＥＮＳＯＲ微量生理機能測定器（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｌｔｄ．，Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，Ｃａｌｉｆ．）によって検出可能である。従って、ＣＹＴＯＳＥＮＳＯＲは、エネルギーを利用した細胞内シグナル伝達系と共役する二次メッセンジャーを活性化する本発明のアルブミン融合タンパク質の能力を、検出可能である。
（実施例９５：抽出物／細胞上清スクリーニング）
今のところ同系の活性化リガンド（アゴニスト）が存在しない多数の哺乳類レセプタが存在する。従って、これらのレセプターに対する活性リガンドは、現在まで同定されたとしてリガンドバンク内に含まれていないかもしれない。従って、本発明のアルブミン融合タンパク質はまた、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分および／またはアルブミンタンパク質部分についての天然のリガンドを同定するために、組織抽出物に対して、（カルシウム、ｃＡＭＰ、微量生理機能測定器、卵母細胞電気生理学など機能的スクリーニングを使用して）機能的にスクリーニングされ得る。陽性の機能的応答を生じる抽出物は、活性化リガンドが単離および同定されるまで、連続して細分画され得る。
（実施例９６：ＡＴＰ結合アッセイ）
以下のアッセイが、本発明の融合タンパク質のＡＴＰ結合アッセイを評価するために使用され得る。
本発明のアルブミン融合タンパク質のＡＴＰ結合活性は、米国特許第５，８５８，７１９号（その全体が参考として本明細書中に援用される）に記載されるＡＴＰ結合アッセイを用いて検出され得る。簡単には、本発明のアルブミン融合タンパク質へのＡＴＰ結合を、競合アッセイにおける８−アジド−ＡＴＰでの光親和性標識を介して測定する。１ｍｇ／ｍｌのＡＢＣ輸送タンパク質を含む反応混合物を、種々の濃度のＡＴＰまたは非加水分解性のＡＴＰアナログであるアデニル−５’−イミドニリン酸と、４℃で１０分間インキュベートする。８−アジド−ＡＴＰ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍ．Ｃｏｒｐ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ．）に８−アジド−ＡＴＰ（３２Ｐ−ＡＴＰ）（５ｍＣｉ／Ｌｍｏｌ，ＩＣＮ，Ｉｒｖｉｎｅ ＣＡ．）を加えた混合物を、１００μＭの最終濃度までに添加し、０．５ｍｌアリコートを、氷上の磁器製スポットプレートのウェル中に配置する。このプレートを、短波２５４ｎｍのＵＶランプを用いて、プレートから２．５ｃｍの距離で、１分間隔で２回（その間に１分の冷却間隔を置いて）照射する。反応を、２ｍＭの最終濃度までジチオスレイトールを添加することによって、停止する。このインキュベーションを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動、乾燥、およびオートラジオグラフィーに供す。本発明のアルブミン融合タンパク質に対応するタンパク質バンドを切り取り、放射活性を定量化する。ＡＴＰまたはアデニル（ａｄｅｎｌｙ）−５’−イミドニリン酸を増大することによる放射活性の低下は、融合タンパク質に対するＡＴＰ親和性の尺度を提供する。
（実施例９７：リン酸化アッセイ）
本発明のアルブミン融合タンパク質のリン酸化活性についてのアッセイのために、米国特許第５，９５８，４０５号（これは、参考として本明細書中に援用される）に記載されるように、リン酸化アッセイを利用する。簡単には、リン酸化活性は、γ標識化３２Ｐ−ＡＴＰを用いてタンパク質基質をリン酸化し、そしてγ放射性同位体カウンターを用いて取り込まれた放射活性を定量化することによって、測定され得る。本発明の融合タンパク質を、タンパク質基質、３２Ｐ−ＡＴＰおよびキナーゼ緩衝液と共にインキュベートする。次いで、基質に取り込まれた３２Ｐを、電気泳動によって遊離の３２Ｐ−ＡＴＰから分離し、この取り込まれた３２Ｐをカウントし、そして陰性コントロールと比較する。陰性コントロール以上の放射活性カウントが、融合タンパク質のリン酸化活性を示す。
（実施例９８：ポリペプチドリガンドの存在下での本発明のアルブミン融合タンパク質のリン酸化活性（活性化）の検出）
当該分野で公知の方法または本明細書に記載される方法を使用して、本発明のアルブミン融合タンパク質のリン酸化活性を決定し得る。リン酸化活性を決定する好ましい方法は、米国特許第５，８１７，４７１号（本明細書中に参考として援用される）に記載されるように、チロシンリン酸化アッセイを使用する。
（実施例９９：本発明のアルブミン融合タンパク質と相互作用するシグナル伝達タンパク質の同定）
本発明のアルブミン融合タンパク質を、シグナル伝達経路タンパク質またはレセプタータンパク質の同定、特徴付けおよび精製のための研究手段として供し得る。簡単には、本発明の標識融合タンパク質は、それが相互作用する分子の精製のための試薬として有益である。親和性精製の１つの実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質は、クロマトグラフィーカラムに共有結合される。推定の標的細胞（例えば、癌組織）に由来する無細胞抽出液をカラムに通し、適切な親和性を有する分子をアルブミン融合タンパク質に結合する。このタンパク質複合体をカラムから回収し、分離し、そして回収された分子をＮ末端タンパク質配列決定に供する。次いで、このアミノ酸配列を使用して、補足分子を同定するか、または適切なｃＤＮＡライブラリーから関連遺伝子をクローニングするための縮重オリゴヌクレオチドプローブを設計する。
（実施例１００：ＩＬ−６バイオアッセイ）
本発明のアルブミン融合タンパク質の増殖性効果を試験するための種々のアッセイが、当該分野で公知である。例えば、そのような１つのアッセイは、Ｍａｒｚら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，９５：３２５１−５６（１９９８）、本明細書中に参考として援用される）によって記載されるような、ＩＬ−６バイオアッセイである。３７℃で６８時間後、生細胞の数を、テトラゾリウム塩チアゾリルブルー（ｔｈｉａｚｏｌｙｌ ｂｌｕｅ）（ＭＴＴ）を添加してさらに３７℃で４時間インキュベートすることによって、測定する。Ｂ９細胞をＳＤＳによって溶解し、光学密度を５７０ｎｍで測定する。ＩＬ−６を含むコントロール（陽性）およびサイトカインを含まないコントロール（陰性）。簡単には、ＩＬ−６依存性マウスＢ９細胞を、ＩＬ−６を含まない培地中で３回洗浄し、５０μｌ中に５，０００細胞／ウェルの濃度でプレートし、そして５０μｌの本発明の融合タンパク質を添加する。利用する。陰性コントロールと比較して増強された試験サンプル（本発明のアルブミン融合タンパク質を含む）における増殖は、融合タンパク質によって媒介された増殖性効果を示す。
（実施例１０１：ニワトリ胚ニューロン生存の支持）
交感神経細胞生存度が、本発明のアルブミン融合タンパク質によって支持されるか否かを試験するために、Ｓｅｎａｌｄｉらのニワトリ胚ニューロン生存アッセイが利用され得る（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，９６：１１４５８−６３（１９９８）、これは、本明細書中に参考として援用される）。簡単には、運動ニューロンおよび交感神経を、ニワトリ胚から単離し、Ｌ１５培地（１０％ ＦＣＳ、グルコース、亜セレン酸ナトリウム、プロゲステロン、コナルブミン、プトレシン、およびインスリンを含む；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ．）ならびにダルベッコ改変イーグル培地［１０％ ＦＣＳ、グルタミン、ペニシリン、および２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．２）を含む；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ．］中に、それぞれ再懸濁し、異なる濃度の本発明の精製融合タンパク質の存在下で、ならびに陰性コントロールはサイトカインを全く含まずに、５％ ＣＯ２中で３７℃でインキュベートする。３日後、ニューロン生存を、細胞形態学の評価によって、Ｍｏｓｍａｎｎの比色分析アッセイ（Ｍｏｓｍａｎｎ，Ｔ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，６５：５５−６３（１９８３））を使用して決定する。サイトカインを含まないコントロールと比較して増強されたニューロン細胞生存度は、アルブミン融合タンパク質がニューロン細胞の生存を高める能力を示す。
（実施例１０２：ホスファターゼ活性についてのアッセイ）
以下のアッセイは、本発明のアルブミン融合タンパク質のセリン／トレオニンホスファターゼ（ＰＴＰアーゼ）活性を評価するのに使用され得る。
セリン／トレオニンホスファターゼ（ＰＴＰａｓｅ）活性についてアッセイするために、当業者に広く公知のアッセイが利用され得る。例えば、本発明のアルブミン融合タンパク質のセリン／トレオニンホスファターゼ（ＰＳＰアーゼ）活性は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．製のＰＳＰアーゼアッセイキットを用いて測定され得る。ミエリン塩基性タンパク質（ＭｙＢＰ）（ＰＳＰアーゼのための基質）を、［３２Ｐ］ＡＴＰの存在下でｃＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼを用いて、セリン残基およびトレオニン残基にてリン酸化する。次いで、タンパク質セリン／トレオニンホスファターゼ活性を、３２Ｐ標識ＭｙＢＰからの無機リン酸の遊離を測定することによって決定する。
（実施例１０３：他のタンパク質とのセリン／トレオニンホスファターゼの相互作用） セリン／トレオニンホスファターゼ活性を有する本発明の融合タンパク質（例えば、実施例１０２において決定されるような）は、例えば、さらなる相互作用タンパク質またはレセプタータンパク質あるいは他のシグナル伝達経路タンパク質の同定、特徴付けおよび精製のための研究手段として有用である。簡単には、本発明の標識融合タンパク質は、この融合タンパク質とが相互作用する分子の精製のための試薬として有用である。アフィニティ精製の１つの実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質は、クロマトグラフィーカラムに共有結合的に結合する。推定標的細胞由来の無細胞抽出液（例えば、神経細胞または肝細胞）は、カラムを通過し、適切な親和性を有する分子が、この融合タンパク質に結合する。融合タンパク質−複合体をカラムから回収し、分離し、そして回収した分子をＮ末端タンパク質配列決定に供す。次いで、このアミノ酸配列を用いて、捕捉分子を同定するか、または適切なｃＤＮＡライブラリー由来の関連遺伝子をクローニングするための縮重オリゴヌクレオチドプローブを設計する。
（実施例１０４：ヘパラナーゼ活性についてのアッセイ）
本発明のアルブミン融合タンパク質のヘパラナーゼ活性についてのアッセイに使用され得る当該分野で公知の多数のアッセイがある。１つの実施例において、本発明のアルブミン融合タンパク質のヘパラナーゼ活性を、Ｖｌｏｄａｖｓｋｙら（Ｖｌｏｄａｖｓｋｙら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，５：７９３−８０２（１９９９））に記載されるようにアッセイする。簡単には、細胞溶解産物、馴化培地、インタクトな細胞（１×１０６細胞／３５ｍｍディッシュ）、細胞培養上清、または精製融合タンパク質を、３７℃で１８時間、ｐＨ６．２〜６．６で、３５Ｓ標識ＥＣＭまたは可溶性ＥＣＭ誘導性のピークＩプロテオグリカンと共にインキュベートする。このインキュベーション培地を遠心し、そして上清をＳｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂカラム（０．９×３０ｃｍ）を用いたゲル濾過によって分析する。画分をＰＢＳで溶出し、それらの放射活性を測定する。ヘパラン硫酸側鎖の分解フラグメントを、０．５＜Ｋａｖ＜０．８（ピークＩＩ）で、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６Ｂから溶出する。各実験を、少なくとも３回行う。「ピークＩＩ」に相当するフラグメントは、Ｖｌｏｄａｖｓｋｙによって記載されるように、ヘパラン硫酸の開裂における本発明のアルブミン融合タンパク質の活性を示す。
（実施例１０５：生体分子の固定化）
この実施例は、非宿主細胞脂質二重層構築物中の本発明のアルブミン融合タンパク質の安定化のための方法（例えば、Ｂｉｅｒｉら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ １７：１１０５−１１０８（１９９９）（これによって、その全体が参考として本明細書中に援用される）を参照のこと）を提供し、この方法は、上記の種々の機能的アッセイにおける本発明の融合タンパク質の研究のために適合され得る。簡単には、ビオチン化についての糖質特異的化学を用いて、本発明のアルブミン融合タンパク質にビオチンタグを拘束し、固定化の際の均一な方向を可能にする。洗浄された膜中の本発明のアルブミン融合タンパク質の５０μＭ溶液を、２０ｍＭ ＮａＩＯ４、１．５ｍｇ／ｍｌ（４ｍＭ）ＢＡＣＨまたは２ｍｇ／ｍｌ（７．５ｍＭ）ビオチン−ヒドラジド（反応容量、１５０μｌ）と共に、室温で１時間インキュベートする。次いで、このサンプルを、まず４℃で５時間、１時間後毎に緩衝液を交換して透析（Ｐｉｅｒｃｅ Ｓｌｉｄｅａｌｉｚｅｒ Ｃａｓｓｅｔｔ，１０ｋＤａカットオフ；Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ ＩＬ）を行い、最終的に５００ｍｌ緩衝液Ｒ（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣ１２、１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７）で１２時間、透析する。キュベットに添加する直前に、このサンプルを緩衝液ＲＯＧ５０（５０ｍＭオクチルグルコシドを追加した緩衝液Ｒ）で１：５に希釈する。
（実施例１０６：メタロプロテイナーゼ活性についてのアッセイ）
メタロプロテイナーゼは、金属イオン（例えば、Ｚｎ２＋）を触媒機構として用いるペプチド加水分解酵素である。本発明のアルブミン融合タンパク質のメタロプロテイナーゼ活性を、当該分野で公知の方法に従ってアッセイし得る。以下の例示的方法が提供される：
（α−２−マクログロブリンのタンパク質分解）
プロテイナーゼ活性を確認するために、本発明の精製融合タンパク質を、１×アッセイ緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、０．２Ｍ ＮａＣＩ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、２５μＭ ＺｎＣｌ２および０．０５％ Ｂｒｉｊ−３５）中で、基質α−２−マクログロブリン（０．２単位／ｍｌ；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）と混合し、３７℃で１〜５日間インキュベートする。トリプシンを、陽性コントロールとして使用する。陰性コントロールは、アッセイ緩衝液中にα−２−マクログロブリンのみを含む。サンプルを収集し、５％の２−メルカプトエタノールを含むＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液中で５分間煮沸し、次いで８％ ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにロードする。電気泳動後、これらのタンパク質を銀染色によって可視化する。タンパク質分解は、陰性コントロールと比較した低分子量バンドの出現によって明らかである。
（メタロプロテイナーゼ阻害剤によるα−２−マクログロブリンタンパク分解の阻害） 公知のメタロプロテイナーゼ阻害剤（金属キレート剤（ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡおよびＨｇＣｌ２）、ペプチドメタロプロテイナーゼ阻害剤（ＴＩＭＰ−１およびＴＩＭＰ−２）、および市販用低分子ＭＭＰ阻害剤）もまた、本発明のアルブミン融合タンパク質タンパク分解活性を特徴付けるために使用し得る。使用し得る３つの合成ＭＭＰ阻害剤は：ＭＭＰ阻害剤 Ｉ、「ＭＭＰ−１に対しておよびＭＭＰ−８に対してＩＣ５０＝１．０μＭ ；ＭＭＰ−９に対してＩＣ５０＝３０μＭ；ＭＭＰ−３に対してＩＣ５０＝１５０μＭ」；ＭＭＰ−３（ストロメリシン−１）阻害剤Ｉ「ＭＭＰ−３に対してＩＣ５０＝５μＭ」、およびＭＭＰ−３阻害剤ＩＩ「ＭＭＰ−３に対してＫｉ＝１３０ｎＭ」；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍを通じて入手可能な阻害剤（各々、カタログ番号４４４２５０、４４４２１８および４４４２２５）である。簡潔には、異なる濃度の低分子ＭＭＰ阻害剤を、本発明の精製融合タンパク質（５０μｇ／ｍｌ）と２２．９μｌ １ＸＨＥＰＥＳ緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、０．２Ｍ Ｎａｃｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、２５μＭ ＺｎＣｌ２および０．０５％Ｂｒｉｊ−３５）中で混合し、室温（２４℃）にて２時間インキュベートし、次いで、７．１μＬの基質α−２−マクログロブリン（０．２単位／ｍｌ）を添加し、３７℃で２０時間インキュベートする。４Ｘサンプル緩衝液の添加によってこの反応を止め、直ちに５分間煮沸する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、このタンパク質のバンドを銀染色によって可視化する。
（合成蛍光発生ペプチド基質切断アッセイ）
例示されたメタロプロテイナーゼ活性を有する本発明の融合タンパク質についての基質特異性を、当該分野で公知の技術（例えば、合成蛍光発生ペプチド基質（ＢＡＣＨＥＭ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃから購入した））を用いて決定し得る。試験基質としては、Ｍ−１９８５、Ｍ−２２２５、Ｍ−２１０５、Ｍ−２１１０およびＭ−２２５５が挙げられる。最初の４つの基質は、ＭＭＰ基質であり、そして最後の一つの基質は、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）転換酵素（ＴＡＣＥ）の基質である。これらの基質を、好ましくは、１：１のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）および水中で調製する。ストック溶液は、５０〜５００μＭである。蛍光アッセイを、一定温度の水浴槽が装備されたＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＬＳ ５０Ｂ ルミネセンス分光計を用いて実施する。励起λは３２８ｎｍであり、放出λは３９３ｎｍである。簡潔には、このアッセイを、１７６μｌ １ＸＨＥＰＥＳ緩衝液（０．２Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、０．０５％ Ｂｒｉｊ−３５および５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５）を４μｌの基質溶液（５０μＭ）とともに２５℃にて１５分間インキュベートすることにより実施し、次いで、アッセイキュベットへ２０μｌの本発明の精製融合タンパク質を添加する。基質の最終濃度は１μＭである。初期の加水分解速度を３０分間モニターする。
（実施例１０７：ＶＨドメインおよびＶＬドメインの同定およびクローニング）
特定の抗体を発現する細胞株から、ＶＨドメインおよびＶＬドメインを同定およびクローン化するための一つの方法は、抗体を発現する細胞株から作製されたｃＤＮＡに対してＶＨ特異的プライマーおよびＶＬ特異的プライマーを用いて、ＰＣＲを実施することである。簡潔には、ＲＮＡを、細胞株から単離し、そして、ＥＢＶ細胞株により発現される抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインを増幅するために設計されたＲＴーＰＣＲのテンプレートとして使用する。細胞を、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ．ＭＤ）で溶解し得、１／５量のクロロホルムで抽出する。クロロホルム添加後、溶液を室温で１０分間インキュベートし、そして、卓上遠心分離機にて、４℃で１５分間１４，０００ｒｐｍにて遠心分離する。上清を収集し、そしてＲＮＡを等量のイソプロパノールを用いて沈殿化する。沈殿化ＲＮＡを、卓上遠心分離機にて、４℃で１５分間１４，０００ｒｐｍにて遠心分離することによって、ペレットにする。遠心分離後、上清を捨て、７５％エタノールを用いて洗浄する。洗浄後、ＲＮＡを再度、４℃で５分間８００ｒｐｍにて遠心分離する。この上清を捨て、そしてこのペレットを風乾する。ＲＮＡをＤＥＰＣ水で溶解し、６０℃で１０分間加熱する。ＲＮＡ量は、光学密度測定を用いて決定し得る。
当該分野で周知の方法によれば、逆転写酵素およびランダムヘキサマープライマーを用いて、ｃＤＮＡを１．５μｇ〜２．５μｇのＲＮＡから合成し得る。次いで、ｃＤＮＡをＶＨドメインおよびＶＬドメインのＰＣＲ増幅のためのテンプレートとして使用する。ＶＨ遺伝子およびＶＬ遺伝子を増幅するために使用されるプライマーを、表７に示す。代表的に、ＰＣＲ反応は、単一５’プライマーおよび単一３’プライマーを使用する。時には、利用できるＲＮＡテンプレート量が限定される場合、またはより高い効率のために、５’プライマー群および／または３’プライマー群を使用し得る。例えば、時々、５つすべてのＶＨ−５’プライマーおよび全ＪＨ３’プライマーを、単一ＰＣＲ反応で使用する。
このＰＣＲ反応を、１ＸＰＣＲ緩衝液、２ｍＭの各ｄＮＴＰ、０．７単位のＨｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｔａｑポリメラーゼ、５’プライマー混合物、３’プライマー混合物および７．５μｌのｃＤＮＡを含む５０μｌ量で実施する。ＶＨおよびＶＬの両方の５’プ
ライマーおよび３’プライマー混合物を、各々２２ｐｍｏｌｅの個々のプライマーおよび２８ｐｍｏｌｅの個々のプライマーを共にプールすることによって、作製し得る。ＰＣＲ条件は：９６℃で５分間；その後、９４℃で１分間、５０℃で１分間、および７２℃で１分間の２５サイクル；その後、７２℃で１０分間伸長サイクルが続く。この反応が完了した後、サンプルチューブを４℃で保管する。
Figure 2014043448
 次いで、ＰＣＲサンプルを１．３％のアガロースゲルで電気泳動する。予測するサイズのＤＮＡバンド（ＶＨドメインについて約約５０６塩基対、およびＶＬドメインについて３４４塩基対）を、ゲルから切り出し得、そして、当該分野で周知の方法を用いて精製し得る。精製ＰＣＲ産物を、ＰＣＲクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｉｎｃ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡからのＴＡベクター）へ連結し得る。Ｅ．ｃｏｌｉのトランスフェクションおよび青色／白色の選別後、別個のクローン化ＰＣＲ産物を単離し得る。次いで、クローン化されたＰＣＲ産物を、当該分野で一般に公知の方法を用いて配列決定し得る。
ＶＨドメインおよびＶＬドメインを含むＰＣＲバンドもまた、全長Ｉｇ発現ベクターを作製するために使用し得る。ＶＨドメインおよびＶＬドメインを、重鎖（例えば、ヒトＩｇＧ１もしくはヒトＩｇＧ４）定常領域または軽鎖（ヒトκもしくはヒトλ）定常領域のヌクレオチド配列を含有するベクターへクローン化し得て、適切な宿主細胞へトランスフェクトした場合、完全重鎖分子または完全軽鎖分子を、これらのベクターから発現し得る。さらに、クローン化した重鎖および軽鎖が、一つの細胞株内にて（一つのベクターまたは二つのベクターのいずれかから）双方発現する場合、それらは、細胞培養培地へ分泌される完全機能性抗体分子へと、組み立てられ得る。完全抗体分子をコードする発現ベクターを作製するために、ＶＨ抗体ドメインおよびＶＬ抗体ドメインをコードするポリヌクレオチドを用いる方法は、当該分野内で周知である。
（実施例１０８：構築物ＩＤ ２６７２、ＨＳＡ−Ｔ２０、作製）
構築物ＩＤ２６７２（配列番号１１８６）、ｐＳＡＣ３５：ＨＳＡ．Ｔ２０は、酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ発現ベクターｐＳＡＣ３５に、ＨＩＶ−１阻害ペプチド Ｔ２０のアミノ末端（すなわち、Ｙ６４３−Ｆ６７８）へ融合させた全長ＨＳＡを有する、Ｔ２０アルブミン融合タンパク質をコードするＤＮＡを含有する。Ｔ２０ペプチドは、ＨＩＶ−１膜貫通タンパク質ｇｐ４１の外部ドメイン由来であり、これは、ＨＩＶ−１感染に対して阻害活性を有することが示されている。
（Ｔ２０ ｃＤＮＡのクローニング）
Ｔ２０をコードするポリヌクレオチドを、以下に記載される、４つのオーバーラップするプライマーＴ２０−１、Ｔ２０−２、Ｔ２０−３およびＴ２０−４を用いて、ＰＣＲで作製した。この配列は、酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでの発現のために最適化されたコドンであった。そのＰＣＲフラグメントをＢｓｕ ３６Ｉ／Ａｓｃ Ｉで切断し、そしてＢｓｕ ３６Ｉ／Ａｓｃ Ｉ切断したｐＳｃＮＨＳＡへ連結した。次いで、Ｎｏｔ Ｉ フラグメントをｐＳＡＣ３５プラスミドへサブクローンした。構築物ＩＤ番号２６７２は、全長ＨＳＡおよびＨＩＶ−１阻害ペプチドＴ２０（すなわち、Ｔｙｒ−６４３〜Ｐｈｅ−６７８（配列番号１１８８））を含むアルブミン融合タンパク質コードする。
ＨＩＶ−１阻害ペプチドＴ２０、ＨＩＶ−１阻害ペプチドＴ２０−１およびＨＩＶ−１阻害ペプチドＴ２０−４をコードするポリヌクレオチドのＰＣＲ増幅のために適切な、４つのオーバーラップするオリゴヌクレオチドの５’プライマーおよび３’プライマーを合成した：
Figure 2014043448
 Ｔ２０−１は、Ｂｓｕ ３６Ｉクローニング部位（下線で表記）、およびＨＳＡ成熟形態（配列番号１０３８）の最後の４つのアミノ酸残基をコードするヌクレオチド、およびＨＩＶ−１阻害ペプチドＴ２０の最初の８アミノ酸残基（すなわち、Ｔｙｒ−６４３からＬｅｕ−６５０）をコードする２４ヌクレオチド（太字で表記）へ取り込む。Ｔ２０−４において、Ａｓｃ Ｉ部位に下線を付しており、そして最後の３１ヌクレオチド（太字で表記）は、ＨＩＶ−１阻害ペプチドＴ２０の最後の１０アミノ酸残基（Ａｓｐ−６６９からＰｈｅ−６７８）をコードするＤＮＡの逆相補体である。Ｔ２０−２オリゴヌクレオチドおよびＴ２０−３オリゴヌクレオチドは、互いにオーバーラップし、そして各々、Ｔ２０−１およびＴ２０−４とオーバーラップしそしてＨＩＶ−１阻害ペプチドＴ２０をコードする。ＰＣＲ産物を精製し（例えば、Ｗｉｚａｒｄ ＰＣＲ Ｐｒｅｐｓ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ）を使用）、次いで、Ｂｓｕ３６ＩおよびＡｓｃＩで消化した。さらに、ゲル電気泳動によるＢｓｕ３６Ｉ−ＡｓｃＩフラグメントの精製後、この産物をＢｓｕ３６Ｉ／ＡｓｃＩで消化したｐＳｃＮＨＳＡへクローン化した。配列を確認した後、このＴ２０アルブミン融合タンパク質をコードする発現カセットを、Ｎｏｔ ＩフラグメントとしてｐＳＡＣ３５へサブクローンした。さらに、Ｎｏｔ Ｉフラグメントを、ｐＳＡＣ３５へサブクローンして構築物ＩＤ番号２６７２を得た。
さらに、アミノ酸配列決定による発現されるアルブミン融合タンパク質のＮ末端の分析は、予測されるＨＳＡ配列（以下参照）の存在を確認し得る。
本発明のＴ２０アルブミン融合タンパク質は、好ましくは、ＨＩＶ−１阻害ペプチドＴ２０（すなわち、Ｔｙｒ−６４３からＰｈｅ−６７８）のＮ末端またはＣ末端のいずれかに融合された、ＨＳＡの成熟形態（すなわち、Ａｓｐ−２５からＬｅｕ−６０９）を含有する。本発明の一つの実施形態において、本発明のＴ２０アルブミン融合タンパク質は、さらに、発現のために使用される宿主の分泌経路において、新生融合タンパク質を指向するシグナル配列を含有する。さらに好ましい実施形態において、シグナル配列によってコードされるシグナルペプチドは、除去され、そして、成熟Ｔ２０アルブミン融合タンパク質は、培養培地へ直接分泌される。本発明のＴ２０アルブミン融合タンパク質は、異種シグナル配列を含み得、ＭＡＦ、ＩＮＶ、Ｉｇ、フィブリンＢ、クラスタリン、インスリン様増殖因子結合タンパク質４、改変体ＨＳＡリーダー配列（キメラＨＳＡ／ＭＡＦリーダー配列が挙げられるが、これに限定されない）または当該分野で公知の他の異種シグナル配列が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、本発明のＴ２０アルブミン融合タンパク質は、天然ＨＩＶ−１膜貫通タンパク質ｇｐ４１シグナル配列を含む。さらに好ましい実施形態において、本発明のＴ２０アルブミン融合タンパク質は、さらに、Ｎ末端にメチオニン残基を含む。これらのポリペプチド（フラグメントおよび／または改変体を含む）をコードするポリヌクレオチドはまた、本発明によって包含される。
（構築物ＩＤ２６７２の発現および精製）
（酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでの発現）
構築物２６７２を、当該分野で公知の方法（実施例３を参照）によって、酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅへ形質転換し得る。発現レベルを、一次抗体として抗ＨＳＡ血清を用いる免疫ブロット検出により試験し得る。
（酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞上清からの精製）
酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて、構築物ＩＤ番号２６７２から発現された分泌性Ｔ２０アルブミン融合タンパク質を含む細胞上清を、実施例４に記載されるように、精製し得る。アルブミン融合タンパク質のＮ末端の配列決定は、ＨＳＡ成熟形態のアミノ末端に対応する、配列ＤＡＨＫＳ（配列番号２１４３）を生じる。
（Ｔ２０活性は、インビトロ感染性アッセイおよび／または細胞−細胞融合阻害アッセイを用いてアッセイされ得る）
インビトロ感染性アッセイおよび細胞−細胞融合阻害アッセイは、Ｗｉｌｄら、「Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｔｏ ａ ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ ａｌｐｈａ−ｈｅｌｉｃａｌ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ ｇｐ４１ ａｒｅ ｐｏｔｅｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１：９７７０−９７７４（１９９４）に記載される。
（方法）
高い力価のウイルスストックは、上記（Ｗｉｌｄ、Ｃ．ら、「Ａ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ：ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｖｉｒａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０５３７−１０５４１（１９９２））に記載されるように、ＣＥＭヒト白血病細胞にて調製され得る。感染力価を、ＡＡ５連続細胞株およびＣＥＭ連続細胞株での終点希釈によって評価し得る。上清に存在する逆転写酵素（ＲＴ）活性は、首尾良い感染についての基準として、受け取り得る。５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）は、ＲｅｅｄおよびＭｕｅｎｃｈ（Ｗｉｌｄら、「Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｔｏ ａ ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ ａｌｐｈａ−ｈｅｌｉｃａｌ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ ｇｐ４１ ａｒｅ ｐｏｔｅｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１：９７７０−９７７４（１９９４））の式を用いることによって計測され得る。初代ＨＩＶ−１単離株を、正常ドナー由来の活性化末梢血単核細胞（「ＰＢＭＣ」）中で増殖し得る。
Ｔ２０アルブミン融合タンパク質が基本型の細胞フリーの（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ）ウイルス（すなわち、ＨＩＶ−１ＬＡＩまたはＨＩＶ−１ＮＩＨＺ）の感染を阻害する能力を、種々の濃度のＴ２０アルブミン融合タンパク質を含む細胞フリーのウイルスの段階希釈をＡＡ５またはＣＥＭ標的細胞とともにインキュベートすることによって評価し得る。Ｔ２０アルブミン融合タンパク質を、初代単離体およびこの基本型ＨＩＶ−１ＬＡＩ単離体に対して、標的細胞としてＰＢＭＣを使用する類似のアッセイにおいて試験し得る。両アッセイを、Ｗｉｌｄら、１９９２において記載されるように実行する。
Ｔ２０アルブミン融合タンパク質が、ウイルス媒介性細胞−細胞融合をブロックする能力を、Ｗｉｌｄら、１９９２において以前に記載されるように評価し得る。簡単に言えば、およそ７×１０４個のＭＯＬＴ−４細胞を１０４個のＣＥＭ細胞とともに培養し得、そして９６ウェルプレート（領域の半分がクラスターであるプレート；Ｃｏｓｔａｒ）において１００μＬの培養培地中でＨＩＶ−１単離体を慢性的に感染させ得る。Ｔ２０アルブミン融合タンパク質を１０μＬ添加し得、そしてこの細胞混合物を２４時間３７℃でインキュベートし得る。このとき、多核性の巨細胞を顕微鏡検査によって４０倍率で判断し得る。
（構築物ＩＤ番号２６７２によってコードされるＴ２０アルブミン融合の活性は、インビトロ感染性アッセイおよび／または細胞−細胞融合阻害アッセイを使用して評価され得る）
（方法）
構築物２６７２によってコードされるＴ２０アルブミン融合タンパク質は、サブセクション表題「Ｔ２０の活性は、インビトロ感染性アッセイおよび／または細胞−細胞融合阻害アッセイを使用してアッセイされ得る」の下で上述されたような、インビトロ感染性バイオアッセイおよび細胞−細胞融合阻害アッセイにおいて試験され得る。
（実施例１０９：構築物ＩＤ２６７３、Ｔ２０−ＨＳＡの生成）
構築ＩＤ２６７３（ｐＳＡＣ３５：Ｔ２０．ＨＳＡ）は、酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ発現ベクターｐＳＡＣ３５において、ＨＳＡの成熟形態のアミノ末端と融合した、ＨＳＡキメラリーダー配列（すなわち、ＨＳＡ−ｋｅｘ２シグナルペプチド）、続くＨＩＶ−１阻害性ペプチドＴ２０（すなわち、Ｙ６４３−Ｆ６７８）を有するＴ２０アルブミン融合タンパク質をコードするＤＮＡを含む。
（Ｔ２０ ｃＤＮＡのクローニング）
ＨＩＶ−１阻害性ペプチドをコードするＤＮＡを、４つの重複プライマーを使用してＰＣＲ生成した。この配列を、酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける発現のためにコドン最適化した。ＰＣＲフラグメントをＳａｌ Ｉ／Ｃｌａ Ｉで消化し、そしてＸｈｏ Ｉ／Ｃｌａ Ｉで消化したｐＳｃＣＨＳＡにサブクローニングした。次いで、Ｎｏｔ ＩフラグメントをｐＳＡＣ３５プラスミドにサブクローニングした。構築物ＩＤ番号２６７３は、ＨＩＶ−１阻害性ペプチドＴ２０と融合したＨＳＡのキメラリーダー配列（すなわち、Ｔｙｒ−６４３〜Ｐｈｅ−６７８）、続くＨＳＡの成熟形態をコードする。
ＨＩＶ−１阻害性ペプチドＴ２０をコードするポリヌクレオチドのＰＣＲ増幅に適切な４つの重複オリゴヌクレオチドの５’プライマーおよび３’プライマー（Ｔ２０−５およびＴ２０−６）を合成した。
Figure 2014043448
 Ｔ２０−５は、Ｓａｌ Ｉクローニング部位（下線で示される）、ＨＳＡキメラリーダー配列の最後の３アミノ酸残基をコードするヌクレオチド、およびＨＩＶ−１阻害性ペプチドＴ２０の最初の８アミノ酸（太字で示される）（すなわち、Ｔｙｒ−６４３〜Ｌｅｕ−６５０）をコードするＤＮＡを組み込む。Ｔ２０−６において、下線の配列はＣｌａ Ｉ部位であり；そしてこのＣｌａ Ｉ部位およびこれに続くＤＮＡは、成熟ＨＳＡタンパク質（配列番号１０３８）の最初の１０アミノ酸をコードするＤＮＡの逆相補体である。太字の配列は、ＨＩＶ−１阻害性ペプチドＴ２０の最後の１０アミノ酸残基（Ａｓｐ−６６９〜Ｐｈｅ−６７８）をコードする３１ヌクレオチドの逆相補体である。Ｔ２０−２およびＴ２０−３オリゴヌクレオチド（実施例１０８におけるような）は互いに、そしてそれぞれＴ２０−５およびＴ２０−６と重複し、そしてＨＩＶ−１阻害性ペプチドＴ２０をコードする。これらのプライマーを使用して、ＨＩＶ−１阻害性ペプチドＴ２０を、アニーリング、アニーリングされたプライマーの伸長、Ｓａｌ ＩおよびＣｌａ Ｉでの消化、ならびにＸｈｏ Ｉ／Ｃｌａ Ｉで消化されたｐＳｃＣＨＳＡへのサブクローニングによって生成した。配列を確認した後、Ｔ２０アルブミン融合発現カセットを含むＮｏｔ Ｉフラグメントを、構築物ＩＤ２６７３を生成するためにＮｏｔ Ｉで切断したｐＳＡＣ３５にサブクローニングした。構築物ＩＤ番号２６７３は、キメラリーダー配列、ＨＩＶ−１阻害性ペプチドＴ２０、およびＨＳＡの成熟形態を含むアルブミン融合タンパク質をコードする。
さらに、アミノ酸配列決定による、発現したアルブミン融合タンパク質のＮ末端の分析は、予想されるＴ２０配列（以下を参照のこと）の存在を確認し得る。
本発明のＴ２０アルブミン融合タンパク質は、好ましくは、ＨＩＶ−１阻害性ペプチドＴ２０（すなわち、Ｔｙｒ−６４３〜Ｐｈｅ−６７８）のＮ末端またはＣ末端のいずれかに融合したＨＳＡの成熟形態（すなわち、Ａｓｐ−２５〜Ｌｅｕ−６０９）を含む。本発明の１つの実施形態において、本発明のＴ２０アルブミン融合タンパク質は、さらに、発現のために使用した宿主の分泌経路において新生融合ポリペプチドを方向付けるシグナル配列を含む。さらに好ましい実施形態において、シグナル配列によってコードされるシグナルペプチドを除去し、そして成熟Ｔ２０アルブミン融合タンパク質が培養培地中に直接分泌される。本発明のＴ２０アルブミン融合タンパク質は、異種シグナル配列（ＭＡＦ、ＩＮＶ、Ｉｇ、フィブリンＢ、クラステリン（Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎ）、インスリン様成長因子結合タンパク質４、ＨＳＡリーダー配列改変体（キメラＨＳＡ／ＭＡＦリーダー配列が挙げられるが、これに限定されない）または当該分野で公知の他の異種シグナル配列が挙げられるが、これらに限定されない）を含み得る。好ましい実施形態において、本発明のＴ２０アルブミン融合タンパク質は、ネイティブのＨＩＶ−１膜貫通タンパク質ｇｐ４１シグナル配列を含む。さらに好ましい実施形態において、本発明のＴ２０アルブミン融合タンパク質は、さらにＮ末端メチオニン残基を含む。これらのポリペプチド（フラグメントおよび／または改変体を含む）をコードするポリヌクレオチドがまた、本発明によって包含される。
（構築物ＩＤ２６７３の発現および精製）
（酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける発現）
構築物２６７３を、当該分野で公知の方法によって酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに形質転換し得る（実施例３を参照のこと）。発現レベルを、１次抗体として抗ＨＳＡ血清を用いて免疫ブロット検出により試験し得る。
（酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞上清からの精製）
酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて、構築物ＩＤ番号２６７３から発現した分泌性Ｔ２０アルブミン融合タンパク質を含む細胞上清を、実施例４において記載されるように精製し得る。発現し、そして精製したアルブミン融合タンパク質のＮ末端配列決定は、ＨＩＶ−１阻害性ペプチドＴ２０のアミノ末端に対応するＹＴＳＬＩ（配列番号２１５１）を生じるはずである。
（構築物ＩＤ番号２６７３によってコードされるＴ２０アルブミン融合物の活性は、インビトロ感染性アッセイおよび／または細胞−細胞融合阻害アッセイを使用してアッセイされ得る）
（方法）
構築物２６７３によってコードされるＴ２０アルブミン融合タンパク質は、サブセクション表題「Ｔ２０の活性は、インビトロ感染性アッセイおよび／または細胞−細胞融合阻害アッセイを使用してアッセイされ得る」の下で、実施例１０８において上述されたように、インビトロ感染性バイオアッセイおよび細胞−細胞融合阻害アッセイにおいて試験され得る。
（実施例１１０：Ｔ２０アルブミン融合タンパク質のための指標）
上記のアッセイにおけるＴ２０アルブミン融合タンパク質の活性に基づいて、Ｔ２０アルブミン融合タンパク質は、ＨＩＶ、ＡＩＤＳおよび／またはＳＩＶ（サル免疫不全ウイルス）感染の処置、予防、および／または診断において有用である。
（実施例１１１：構築物ＩＤ２６６７（ＨＳＡ−Ｔ１２４９）の生成）
構築物ＩＤ２６６７（ｐＳＡＣ３５：ＨＳＡ．Ｔ１２４９）は、酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ発現ベクターｐＳＡＣ３５において、第２世代の融合インヒビターペプチド「Ｔ１２４９」（すなわち、Ｗ１−Ｆ３９）のアミノ末端と融合した、全長ＨＳＡタンパク質（ネイティブのＨＳＡリーダー配列を含む）を有するＴ１２４９アルブミン融合タンパク質をコードするＤＮＡを含む。このＴ１２４９ペプチドは、ＨＩＶ−１膜貫通タンパク質ｇｐ４１に由来する第２世代の融合インヒビターであり、そしてＨＩＶ−１感染に対して阻害活性を有することが示される。
（Ｔ１２４９ ｃＤＮＡのクローニング）
Ｔ１２４９をコードするポリヌクレオチドを、以下に記載する４つの重複プライマー、Ｔ１２４９−１、Ｔ１２４９−２、Ｔ１２４９−３およびＴ１２４９−４を使用してＰＣＲ生成した。この配列は、酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける発現のためにコドン最適化した。ＰＣＲフラグメントをＢｓｕ ３６Ｉ／Ａｓｃ Ｉで切断し、そしてＢｓｕ ３６Ｉ／Ａｓｃ Ｉで切断したｐＳｃＮＨＳＡにライゲーションした。次いで、Ｎｏｔ ＩフラグメントをｐＳＡＣ３５プラスミドにサブクローニングした。構築物ＩＤ番号２６６７は、Ｔ１２４９ペプチド（すなわち、Ｔｒｐ−１〜Ｐｈｅ−３９）に融合した全長ＨＳＡタンパク質（ネイティブＨＳＡリーダー配列を含む）を含むアルブミン融合タンパク質をコードする。
Ｔ１２４９ペプチドをコードするポリヌクレオチドのＰＣＲ増幅に適切な４つの重複オリゴヌクレオチドの５’プライマーおよび３’プライマー（Ｔ１２４９−１およびＴ１２４９−４）を合成した。
Figure 2014043448
Figure 2014043448
 Ｔ１２４９−１は、Ｂｓｕ ３６Ｉクローニング部位（下線で示される）およびＨＳＡの成熟形態（配列番号１０３８）の最後の４アミノ酸残基をコードするヌクレオチドおよびＴ１２４９ペプチドの最初の７アミノ酸残基（すなわち、Ｔｒｐ−１〜Ｌｙｓ−７）をコードする２１ヌクレオチド（太字で示される）を組み込む。Ｔ１２４９−４において、Ａｓｃ Ｉ部位は下線が引かれ、そして最後の３０ヌクレオチド（太字で示される）は、Ｔ１２４９ペプチドの最後の１０アミノ酸残基（Ａｓｐ−３０〜Ｐｈｅ−３９）をコードするＤＮＡの逆相補体である。Ｔ１２４９−２オリゴヌクレオチドおよびＴ１２４９−３オリゴヌクレオチドは、互いに、そしてそれぞれＴ１２４９−１およびＴ１２４９−４と重複し、そしてＴ１２４９ペプチドをコードする。ＰＣＲ産物を精製し（例えば、Ｗｉｚａｒｄ ＰＣＲ Ｐｒｅｐｓ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ）を使用して）、そしてＢｓｕ ３６ＩおよびＡｓｃ Ｉで消化した。ゲル電気泳動によるＢｓｕ ３６Ｉ−Ａｓｃ Ｉフラグメントのさらなる精製後、この産物を、Ｂｓｕ ３６Ｉ／Ａｓｃ Ｉで消化したｐＳｃＮＨＳＡにクローニングした。配列を確認した後、このＴ１２４９アルブミン融合タンパク質をコードする発現カセットを、Ｎｏｔ ＩフラグメントとしてｐＳＡＣ３５にサブクローニングした。Ｎｏｔ Ｉフラグメントをさらに、ｐＳＡＣ３５にサブクローニングして、構築ＩＤ番号２６６７を供与した。
さらに、アミノ酸配列決定による発現したアルブミン融合タンパク質のＮ末端分析は、発現したＨＳＡ配列の存在を確認し得る（以下を参照のこと）。
本発明のＴ１２４９アルブミン融合タンパク質は、好ましくは、ＨＩＶ−１抑制性ペプチドＴ１２４９（すなわち、Ｔｒｐ−１〜Ｐｈｅ−３９）のＮ末端またはＣ末端のいずれかに融合した、ＨＳＡの成熟形態（すなわち、Ａｓｐ−２５〜Ｌｅｕ−６０９）を含む。本発明の１つの実施形態において、本発明のＴ１２４９アルブミン融合タンパク質はさらに、発現のために使用した宿主の分泌経路における新生融合ポリペプチドを方向付けるシグナル配列を含む。さらに好ましい実施形態において、シグナル配列によってコードされるシグナルペプチドを除去し、そして成熟Ｔ１２４９アルブミン融合タンパク質は、培養培地中に直接分泌される。本発明のＴ１２４９アルブミン融合タンパク質は、異種シグナル配列（ＭＡＦ、ＩＦＶ、Ｉｇ、フィブリン Ｂ、クラステリン、インスリン様増殖因子結合タンパク質４、ＨＳＡリーダー配列改変体（キメラＨＳＡ／ＭＡＦリーダー配列が挙げられるが、これに限定されない）または当該分野で公知の他の異種シグナル配列が挙げられるが、これらに限定されない）を含み得る。好ましい実施形態において、本発明のＴ１２４９アルブミン融合タンパク質は、ネイティブのＨＩＶ−１膜貫通タンパク質ｇｐ４１シグナル配列を含む。さらに好ましい実施形態において、本発明のＴ１２４９アルブミン融合タンパク質は、さらにＮ末端メチオニン残基を含む。これらのポリペプチド（フラグメントおよび／または改変体を含む）をコードするポリヌクレオチドがまた、本発明によって包含される。
（構築物ＩＤ２６６７の発現および精製）
（酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける発現）
構築物２６６７は、当該分野で公知の方法（実施例３を参照）により、酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ内に形質転換され得る。発現レベルは、抗ＨＳＡ血清を一次抗体として用いた免疫ブロット検出により、試験され得る。
（酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞上清からの精製）
分泌されたＴ１２４９アルブミン融合タンパク質（酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中の構築物ＩＤ＃２６６７から発現される）を含む細胞上清は、実施例４において記載されるように、精製され得る。アルブミン融合タンパク質のＮ末端配列決定は、配列ＤＡＨＫＳ（ＨＳＡの成熟形態のアミノ末端に相当する）を生じる。
（構築物ＩＤ＃２６６７によってコードされるＴ１２４９アルブミン融合タンパク質の活性は、インビトロ感染性アッセイおよび／または細胞間融合阻害アッセイを使用してアッセイされ得る）
（方法）
構築物２６６７によってコードされるＴ１２４９アルブミン融合タンパク質は、実施例１０８における小節の表題「Ｔ２０の活性は、インビトロ感染性アッセイおよび／または細胞間融合阻害アッセイを使用してアッセイされ得る」下で上記されるように、インビトロ感染性バイオアッセイおよび細胞間融合阻害アッセイにおいて、試験され得る。
（実施例１１２：構築物ＩＤ２６７０（Ｔ１２４９−ＨＳＡ）生成）
構築物ＩＤ２６７０、ｐＳＡＣ３５：Ｔ１２４９．ＨＳＡは、Ｔ１２４９アルブミン融合タンパク質をコードするＤＮＡを含む。この融合タンパク質は、ＨＳＡキメラリーダー配列（すなわち、ＨＳＡ−ｋｅｘ２シグナルペプチド、第二世代融合インヒビターペプチド、「Ｔ１２４９」（すなわち、酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ発現ベクターｐＳＡＣ３５におけるＨＳＡの成熟形態のアミノ末端に融合したＷ１−Ｆ３９））を有する。
（Ｔ１２４９ ｃＤＮＡのクローニング）
第二世代融合インヒビターペプチドをコードするＤＮＡを、４つの重複プライマーを使用して、ＰＣＲ生成した。この配列は、酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける発現のために最適化されたコドンであった。ＰＣＲフラグメントを、ＳａｌＩ／ＣｌａＩを用いて切断し、そしてＸｈｏＩ／ＣｌａＩ切断したｐＳｃＣＨＳＡ内にサブクローニングした。ＮｏｔＩフラグメントを、次いで、ｐＳＡＣ３５プラスミド内にサブクローニングした。構築物ＩＤ＃２６７０は、Ｔ１２４９ペプチド（すなわち、Ｔｒｐ−１〜Ｐｈｅ−３９）に融合したＨＳＡのキメラリーダー配列をコードし、ＨＳＡの成熟形態がそれに続く。
Ｔ１２４９ペプチド（Ｔ１２４９−５およびＴ１２４９−６）をコードするポリヌクレオチドのＰＣＲ増幅に適切な４つの重複オリゴヌクレオチドの５’プライマーおよび３’プライマーを、合成した：
Figure 2014043448
 Ｔ１２４９−５は、ＳａｌＩクローニング部位（下線で示す）、ＨＳＡキメラリーダー配列の最後の３アミノ酸残基をコードするヌクレオチド、およびＴ１２４９ペプチドの最初の７アミノ酸（すなわち、Ｔｒｐ−１〜Ｌｙｓ−７）をコードするＤＮＡ（太字で示す）を、組み込んでいる。Ｔ１２４９−６において、下線で示される配列は、ＣｌａＩ部位である；そしてＣｌａＩ部位およびそれに続くＤＮＡは、成熟ＨＳＡタンパク質（配列番号１０３８）の最初の１０アミノ酸をコードするＤＮＡの逆相補鎖である。太字で示される配列は、Ｔ１２４９ペプチドの最後の１０アミノ酸残基（Ａｓｐ−３０〜Ｐｈｅ−３９）をコードする、３０ヌクレオチドの逆相補鎖である。Ｔ１２４９−２オリゴヌクレオチドおよびＴ１２４９−３オリゴヌクレオチドは、（実施例１１１のように）互いに重複し、そしてそれぞれＴ１２４９−５オリゴヌクレオチドおよびＴ１２４９−６オリゴヌクレオチドに重複し、そしてＴ１２４９ペプチドをコードする。これらのプライマーを使用し、アニーリングさせ、アニーリングさせたプライマーを伸長させ、ＳａｌＩおよびＣｌａＩを用いて切断し、そしてＸｈｏＩ／ＣｌａＩ切断したｐＳｃＣＨＳＡ内にサブクローニングすることによって、Ｔ１２４９ペプチドを、産生した。配列を確認した後、Ｔ１２４９アルブミン融合発現カセットを含むＮｏｔＩフラグメントを、ＮｏｔＩを用いて切断したｐＳＡＣ３５内にサブクローニングし、構築物ＩＤ２６７０を生成させた。構築物ＩＤ＃２６７０は、キメラリーダー配列、Ｔ１２４９ペプチド、およびＨＳＡの成熟形態を含むアルブミン融合タンパク質を、コードする。
さらに、発現されたアルブミン融合タンパク質の、アミノ酸配列決定によるＮ末端の分析は、予想されるＴ１２４９配列の存在を、確認し得る（以下を参照）。
本発明のＴ１２４９アルブミン融合タンパク質は、好ましくは、ＨＳＡの成熟形態（すなわち、Ａｓｐ−２５〜Ｌｅｕ−６０９）を含み、このＨＳＡの成熟形態は、Ｔ１２４９ペプチド（すなわち、Ｔｒｐ−１〜Ｐｈｅ−３９）のＮ末端またはＣ末端のどちらかに結合される。本発明の一実施形態において、本発明のＴ１２４９アルブミン融合タンパク質は、新たに産生される融合ポリペプチドの発現のために使用される宿主の分泌経路へと導くシグナル配列を、さらに含む。さらに好ましい実施形態において、シグナル配列によってコードされるシグナルペプチドは除去され、そして成熟Ｔ１２４９アルブミン融合タンパク質が、培養液中に直接分泌される。本発明のＴ１２４９アルブミン融合タンパク質は、異種のシグナル配列を含み得る。異種のシグナル配列としては、ＭＡＦ、ＩＮＶ、Ｉｇ、フィブリンＢ、クラスタリン、インスリン様成長因子結合タンパク質４、改変体ＨＳＡリーダー配列が挙げられるが、これらに限定されない。改変体ＨＳＡリーダー配列としては、キメラＨＳＡ／ＭＡＦリーダー配列、または当該分野で公知の他の異種シグナル配列が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、本発明のＴ１２４９アルブミン融合タンパク質は、ネイティブのＨＩＶ−１膜貫通タンパク質ｇｐ４１シグナル配列を含む。さらに好ましい実施形態において、本発明のＴ１２４９アルブミン融合タンパク質は、Ｎ末端メチオニン残基を、さらに含む。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（フラグメントおよび／または改変体を含む）もまた、本発明に含まれる。
（構築物ＩＤ＃２６７０によってコードされるＴ１２４９アルブミン融合体の活性は、インビトロ感染性アッセイおよび／または細胞間融合阻害アッセイを使用してアッセイされ得る）
（方法）
構築物２６７０によってコードされるＴ１２４９アルブミン融合タンパク質は、上記の実施例１０８における小節の表題「Ｔ２０の活性は、インビトロ感染性アッセイおよび／または細胞間融合阻害アッセイを使用してアッセイされ得る」において記載されるように、インビトロ感染性バイオアッセイおよび細胞間融合阻害アッセイにおいて、試験され得る。
（実施例１１３：Ｔ１２４９アルブミン融合タンパク質の適応）
上のアッセイにおけるＴ１２４９アルブミン融合タンパク質の活性に基づき、Ｔ１２４９アルブミン融合タンパク質は、ＨＩＶ、ＡＩＤＳ、および／またはＳＩＶ（サル免疫不全ウイルス）感染の処置、予防、および／または診断において、有用である。
（実施例１１４：構築物ＩＤ２７０２（ＨＳＡ−ＧＣＳＦ．Ｔ３１−Ｌ２０１）生成） 構築物ＩＤ２７０２、ｐＳＡＣ３５：ＨＳＡ．ＧＣＳＦ．Ｔ３１−Ｌ２０１は、ＧＣＳＦアルブミン融合タンパク質をコードするＤＮＡを含む。この構築物は、酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ発現ベクターｐＳＡＣ３５中に、ＨＳＡ／ｋｅｘ２リーダー配列の下流およびＧＣＳＦのＴ３１〜Ｌ２０１のアミノ酸の上流に融合した成熟ＨＳＡを有する。
（ＧＣＳＦ ｃＤＮＡのクローニング）
ＧＣＳＦ Ｃ末端欠失変異体をコードするポリヌクレオチドを、以下に記載するＧＣＳＦ−５プライマーおよびＧＣＳＦ−６プライマーを使用して、ＰＣＲ増幅した。この増幅産物を、Ｂｓｕ３６Ｉ／ＡｓｃＩを用いて切断し、そしてｐＳｃＮＨＳＡ内にサブクローニングした。構築物ＩＤ＃２７０２は、ＨＳＡ／ｋｅｘ２リーダー配列の下流およびＧＣＳＦのＴ３１〜Ｌ２０１のアミノ酸の上流に融合した成熟ＨＳＡを含むアルブミン融合タンパク質をコードする。
ＧＣＳＦ Ｃ末端欠失変異体をコードする、ポリヌクレオチドのＰＣＲ増幅に適切な２つのオリゴヌクレオチド（ＧＣＳＦ−５およびＧＣＳＦ−６）プライマーを、合成した：
Figure 2014043448
 ＧＣＳＦ−５は、Ｂｓｕ３６Ｉクローニング部位（下線で示す）、ならびにＨＳＡの最後の６アミノ酸、および成熟ＧＣＳＦの最初の６アミノ酸（アミノ酸Ｔ３１〜Ａ３６）をコードするヌクレオチドを、組み込んでいる。ＧＣＳＦ−６は、ＡｓｃＩクローニング部位（下線で示す）を含み、そして最後の２５塩基は、ＧＣＳＦ Ｃ末端欠失変異体の最後の８アミノ酸残基（Ｓ１９４〜Ｌ２０１）をコードするＤＮＡの逆相補鎖である。これらのプライマーを用いて産生されたＰＣＲ産物を精製し（例えば、Ｗｉｚａｒｄ ＰＣＲ Ｐｒｅｐｓ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して）、次いでＢｓｕ３６ＩおよびＡｓｃＩを用いて切断した。ゲル電気泳動法によるＢｓｕ３６Ｉ／ＡｓｃＩ ＰＣＲフラグメントのさらなる精製の後、この産物を、Ｂｓｕ３６Ｉ／ＡｓｃＩ切断されたｐＳｃＮＨＳＡ内にクローン化した。配列を確認した後、このＧＣＳＦアルブミン融合タンパク質をコードする発現カセットを、ｐＳＡＣ３５内に、ＮｏｔＩフラグメントとしてサブクローニングした。
発現されたアルブミン融合タンパク質のＮ末端の、アミノ酸配列決定によるさらなる分析は、予想されたＨＳＡ配列（以下を参照）の存在を、確認し得る。
本発明のＧＣＳＦアルブミン融合タンパク質は、好ましくはＨＳＡの成熟形態（すなわち、Ａｓｐ−２５〜Ｌｅｕ−６０９）を含み、このＨＳＡ成熟形態は、ＧＣＳＦ Ｃ末端欠失変異体（すなわち、Ｔ３１〜Ｌ２０１）のＮ末端またはＣ末端のどちらかに融合される。本発明の一実施形態において、本発明のＧＣＳＦアルブミン融合タンパク質は、新たに産生される融合ポリペプチドを、発現に使用される宿主の分泌経路に導くシグナル配列を、さらに含む。さらに好ましい実施形態において、シグナル配列によってコードされるシグナルペプチドは除去され、そして成熟ＧＣＳＦアルブミン融合タンパク質が、培養培地中に直接分泌される。本発明のＧＣＳＦアルブミン融合タンパク質は、異種のシグナル配列を含み得る。異種のシグナル配列としては、ＭＦα−１、インベルターゼ、Ｉｇ、フィブリンＢ、クラスタリン、インスリン様成長因子結合タンパク質４、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ殺傷性毒素（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ ｋｉｌｌｅｒ ｔｏｘｉｎ）、および改変体ＨＳＡリーダー配列が挙げられるが、これらに限定はされない。改変体ＨＳＡリーダー配列としては、キメラＨＳＡ／ＭＦα−１（ＨＳＡ／ｋｅｘ２）リーダー配列、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ／ＭＦα−１リーダー配列、キメラまたは当該分野で公知の他の異種シグナル配列が挙げられるが、これらに限定はされない。さらに好ましい実施形態において、本発明のＧＣＳＦアルブミン融合タンパク質は、ネイティブのＧＣＳＦシグナル配列を含む。さらに好ましい実施形態において、本発明のＧＣＳＦアルブミン融合タンパク質は、Ｎ末端メチオニン残基を、さらに含む。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（フラグメントおよび／または改変体を含む）もまた、本発明に含まれる。
（構築物ＩＤ＃２７０２の発現および精製）
（酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける発現）
構築物＃２７０２を、当該分野で公知の方法（実施例３を参照）により、および構築物ＩＤ＃１６４２に関して上記に記載された（実施例１９を参照）ように、酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ内に形質転換した。発現レベルは、抗ＨＳＡ血清を一次抗体として用いた免疫ブロット検出法により、試験された（データは示さず）。
（酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞上清からの精製）
アルブミン融合タンパク質の精製のための一般的手順は、実施例４において記載される。酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中の構築物ＩＤ＃２７０２から発現されるＧＣＳＦアルブミン融合タンパク質を含む細胞上清を、実施例２０において記載されるように、精製した。アルブミン融合タンパク質のＮ末端配列決定は、配列ＤＡＨＫＳ（ＨＳＡの成熟形態のアミノ末端に相当する）を生じる。
（構築物＃２７０２によってコードされるＧＣＳＦアルブミン融合タンパク質の活性は、インビトロＮＦＳ−６０細胞増殖アッセイを使用してアッセイされ得る）
（方法）
構築物２７０２によってコードされるＧＣＳＦアルブミン融合タンパク質を、実施例１９における小節の表題「ＧＣＳＦの活性は、インビトロＮＦＳ−６０細胞増殖アッセイを使用してアッセイされ得る」および「構築物ＩＤ＃１６４２によってコードされるＧＣＳＦアルブミン融合タンパク質の活性は、インビトロＮＦＳ−６０細胞増殖アッセイを使用してアッセイされ得る」下で上記に記載されるように、インビトロＮＦＳ−６０細胞増殖バイオアッセイを使用して、試験した。
（結果）
部分精製された、構築物１６３４（ＨＳＡ−ＧＣＳＦ）によってコードされるＧＣＳＦアルブミン融合タンパク質、および、構築物２７０２によってコードされるＧＣＳＦ Ｃ末端欠失変異体アルブミン融合タンパク質（Ｌ−１７１）の両方は、ＮＦＳ−６０細胞増殖を引き起こす能力を実証し、Ｃ末端欠失変異体は、より強力な増殖効果を示した（図１９を参照）。予期しなかったことに、構築物２７０２によってコードされる融合タンパク質は、構築物１６４３によってコードされる融合タンパク質より、２〜３倍高い活性を示した。代替のＧＣＳＦアルブミン融合構築物は、成熟ＧＣＳＦのアミノ酸残基１〜１６９に融合するアルブミンおよび成熟ＧＣＳＦのアミノ酸残基１〜１７０に融合するアルブミンを含む。
（実施例１１５：構築物ＩＤ２８７６（ＨＳＡ−ＩＦＮαハイブリッド））
構築物ＩＤ２８７６ ｐＳＡＣ３５：ＨＳＡ．ＩＦＮαＡ（Ｃ１−Ｑ９１）／Ｄ（Ｌ９３−Ｅ１６６）Ｒ２３Ｋ、Ａ１１３Ｖは、ＩＦＮαハイブリッドアルブミン融合タンパク質をコードするＤＮＡを含み、このＤＮＡは、酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ発現ベクターｐＳＡＣ３５中に、ＨＳＡ／ｋｅｘ２リーダー配列の下流およびＩＦＮαＡ／Ｄハイブリッドのアミノ酸配列の上流に融合した成熟ＨＳＡを有する。ハイブリッドＩＦＮの組成に関しては、最初の９１アミノ酸はＩＦＮα２（ＩＦＮαＡとも呼ばれる）サブタイプ由来であり、残りの７５アミノ酸は、ＩＦＮα１（ＩＦＮαＤ）由来である。本発明者らは、２つの点変異（Ｒ２３Ｋ、Ａ１１３Ｖ）を組み込んだ。この融合体を、ＰＣＲによって産生し、そして酵母発現ベクターｐＳＡＣ３５内のＨＳＡの下流に融合させた。
（結果）
（ＣＩＤ２８７６発現および精製）
酵母株ＢＸＰ−１０を、ｐＳＡＣ３５：ＣＩＤ２８７６を用いて形質転換し、形質転換体を、発酵のために選択した。５リットル発酵を行い、上清を分析したところ、高発現（およそ５００ｍｇ／ｌ）が実証された。上清の少量の一部を、試験的に精製した。ＣＩＤ２８７６タンパク質（Ｎ末端配列に基づき、９５％以上純粋）のおよそ１ｍｇを、ブルーセファロースを通した精製、次いでゲルろ過、次にＱ−アニオン変換を、行った後に得た。残りの発酵出発物質は、必要に応じて、さらなる精製の為に利用可能である。
（ＩＳＲＥ活性）
全てのＩ型ＩＦＮは、共通のＩＦＮレセプター複合体の関与およびＩＳＲＥシグナル伝達経路の活性化を通して、その活性を媒介する。この経路を通した遺伝子転写の活性化は、抗増殖、抗ウイルスおよび免疫調節を含むＩＦＮに関連した、細胞応答をもたらす。レポーターベースの戦略を使用して、ＣＩＤ ２８７６がＩＳＲＥシグナル伝達経路を活性化する能力を、決定した。ＣＩＤ ２８７６が、ＩＳＲＥ経路の強力なアクチベーターであることを見出し、２．７ｎｇ／ｍｌのＥＣ５０を、実証した（データは示さず）。この結果は、このアッセイ系におけるＣＩＤ３１６５の効力と、有望に匹敵する。
（抗ウイルス活性）
ＩＦＮの重要な活性は、ＩＦＮのウイルス感染に対する細胞保護を仲介する能力である。殆どのヒトＩ型ＩＦＮが、種に制限された様式において抗ウイルス活性を示すが、他方、本研究において使用されるハイブリッドＩＦＮは、マウス細胞において活性であることが、実証された。従って、ＣＩＤ ２８７６の抗ウイルス活性を、ＥＭＣＶによって感染させたマウス細胞株Ｌ９２９において、評価した。結果は、ＣＩＤ ２８７６は、複数の種にわたる様式で（ｃｒｏｓｓ ｓｐｅｃｉｅｓ ｍａｎｎｅｒ）、抗ウイルス活性を実証することを示す（データは示さず）。
（実施例１１６：ＩＮＳ−１細胞におけるインスリンｍＲＮＡのインビトロ刺激により測定される、構築物３０７０（ＧＬＰ−１ アルブミン融合物）の活性）
近年、ＧＬＰ−１が、膵臓β細胞において、インスリンｍＲＮＡの発現を増加させることが示されている（Ｂｕｔｅａｕら，Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ １９９９ Ｊｕｌ；４２（７）：８５６−６４）。従って、ＣＩＤ ３０７０によってコードされるＧＬＰ−１アルブミン融合タンパク質の、インスリンｍＲＮＡを刺激する能力を、膵臓β細胞株ＩＮＳ−１（８３２／１３）を使用して、評価した。
図１４は、ＩＮＳ−１（８３２／１３）細胞における、ＧＬＰ−１または構築物ＩＤ３０７０によりコードされるＧＬＰ−１アルブミン融合タンパク質（ＣＩＤ ３０７０タンパク質）を用いた処理後の、インスリンｍＲＮＡの定常状態レベルを、図示する。ＧＬＰ−１およびＣＩＤ ３０７０タンパク質の両方が、インスリン遺伝子の転写を刺激する。最初のバー（黒）は、無処理の細胞を表す。バー２〜４（白）は、示された濃度のＧＬＰ−１で処理した細胞を表す。バー５〜７（灰色）は、示された濃度のＣＩＤ ３０７０タンパク質で処理した細胞を表す。
本発明は、上述の記載および実施例で特に説明された以外のやり方で、実施され得ることが明らかである。本発明の多くの改変および変更が、上述の教示から見て可能であり、従って、添付される請求の範囲内にある。
引用されたそれぞれの文献の開示全体（特許、特許出願、特許公報、雑誌の論文、要約、研究室マニュアル、書籍、または他の開示）は、本出願において参照された、データベース（ＧｅｎＢａｎｋ、ＧｅｎｅＳｅｑ、またはＣＡＳ Ｒｅｇｉｓｔｒｙなど）に特異的なアイデンティファイアーを通して得られる情報と同じく、その全体が本明細書中で参考として援用される。
さらに、以下のそれぞれの米国出願の明細書および配列表は、その全体が本明細書中で参考として援用される：米国出願番号第６０／３４１，８１１号（２００１年１２月２１日出願）；米国出願番号第６０／３６０，０００号（２００２年２月２８日出願）；米国出願番号第６０／３７８，９５０号（２００２年５月１０日出願）；米国出願番号第６０／３９８，００８号（２００２年７月２４日出願）；米国出願番号第６０／４１１，３５５号（２００２年９月１８日出願）；米国出願番号第６０／４１４，９８４号（２００２年１０月２日出願）；米国出願番号第６０／４１７，６１１号（２００２年１０月１１日出願）；米国出願番号第６０／４２０，２４６号（２００２年１０月２３日出願）；米国出願番号第６０／４２３，６２３号（２００２年１１月５日出願）；米国出願番号第６０／３５０，３５８号（２００２年１月２４日出願）；米国出願番号第６０／３５９，３７０号（２００２年２月２６日出願）；米国出願番号第６０／３６７，５００号（２００２年３月２７日出願）；米国出願番号第６０／４０２，１３１号（２００２年８月９日出願）；米国出願番号第６０／４０２，７０８号（２００２年８月１３日出願）；米国出願番号第６０／３５１，３６０号（２００２年１月２８日出願）；米国出願番号第６０／３８２，６１７号（２００２年５月２４日出願）；米国出願番号第６０／３８３，１２３号（２００２年５月２８日出願）；米国出願番号第６０／３８５，７０８号（２００２年６月５日出願）；米国出願番号第６０／３９４，６２５号（２００２年７月１０日出願）；米国出願番号第６０／４１１，４２６号（２００２年９月１８日出願）；米国出願番号第６０／３７０，２２７号（２００２年４月８日出願）；米国出願番号第６０／３５１，３６０号（２００２年１月２８日出願）；米国出願番号第６０／３８２，６１７号（２００２年５月２４日出願）；米国出願番号第６０／３８３，１２３号（２００２年５月２８日出願）；米国出願番号第６０／３８５，７０８号（２００２年６月５日出願）；米国出願番号第６０／３９４，６２５号（２００２年７月１０日出願）；および米国出願番号第６０／４１１，４２６号（２００２年９月１８日出願）。さらに、本明細書と同時に、２００２年１２月２３日に出願される、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．代理人整理番号ＰＦ５７４ＰＣＴの米国出願の明細書および配列表は、本明細書でその全体が参考として援用される。
Figure 2014043448
 （カナダ）
出願人は、出願に基づきカナダ国特許が発行されるか、あるいは同出願が拒絶または放棄されて回復され得なくなるかもしくは取り下げられるまでは、特許庁長官（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎｅｒ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ）が、長官により指名された独立の専門家に対してのみ出願中で言及された寄託済みの生物学的材料のサンプルの供与を許可する旨を請求し、出願人は、国際出願の公表のための技術的な準備が完了する前に、書面によりその旨を国際事務局に告知しなければならない。
（ノルウェー）
出願人はここにおいて、出願が（ノルウェー特許庁により）公開に付されるかあるいは公開を経ずにノルウェー特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、ノルウェー特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能にされる時点以前に、出願人によりノルウェー特許庁に対してなされるものとする。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、ノルウェー特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
（オーストラリア）
出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は、特許の付与前において、あるいは出願の放棄（ｌａｐｓｉｎｇ）、拒絶あるいは取り下げ前において、発明に対し利害関係を有さない当業者である対象者（ｓｋｉｌｌｅｄ ａｄｄｒｅｓｓｅｅ）に対してのみ行われる旨を、告知するものである（オーストラリア国特許法第３．２５（３）号規定）。
（フィンランド）
出願人はここにおいて、出願が（特許および統制委員会（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ）により）公開に付されるかあるいは公開を経ずに国立特許および法規委員会による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。
（英国）
出願人はここにおいて、微生物のサンプルは専門家に対してのみ利用可能にされる旨を、請求する。この旨の請求は、出願の国際公表のための技術的な準備が完了する前に、出願人により国際事務局に対してなされなければならない。
（デンマーク）
出願人はここにおいて、出願が（デンマーク特許庁により）公開に付されるかあるいは公開を経ずにデンマーク特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、デンマーク特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能にされる時点以前に、出願人によりデンマーク特許庁に対してなされるものとする。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、デンマーク特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
（スウェーデン）
出願人はここにおいて、出願が（スウェーデン特許庁により）公開に付されるかあるいは公開を経ずにスウェーデン特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、優先日から１６ヶ月が経過するよりも前に、出願人により国際事務局に対してなされるものとする（好ましくはＰＣＴ Ａｐｐｌｉｃａｎｔ’ｓ ＧｕｉｄｅのＶｏｌｕｍｅ Ｉのａｎｎｅｘ Ｚに記載された書式ＰＣＴ／ＲＯ／１３４による）。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、スウェーデン特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
（オランダ）
出願人はここにおいて、オランダ特許の発行日まで、あるいは出願が拒絶、取り下げまたは放棄（ｌａｐｓｅｄ）される日までは、特許規則３１Ｆ（１）の規定に基づき、微生物が専門家へのサンプル供与の形でのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、オランダ王国特許法の第２２Ｃ条または第２５条に基づき出願が公に利用可能にされる日のうちいずれか早い方の日付よりも前に、出願人によりオランダ工業所有権局に対して提出されるものとする。

Claims (29)

  1. アルブミン融合タンパク質であって、以下：
    （ａ）治療タンパク質：Ｘおよび配列番号１０３８のアミノ酸配列を含むアルブミン； （ｂ）治療タンパク質：Ｘおよび配列番号１０３８のアミノ酸配列のフラグメントまたは改変体であって、ここで、該フラグメントまたは改変体は、アルブミン活性を有する； （ｃ）治療タンパク質：Ｘおよび配列番号１０３８のアミノ酸配列のフラグメントまたは改変体であって、ここで、該フラグメントまたは改変体は、アルブミン活性を有し、そしてさらに、ここで、該アルブミン活性は、非融合状態での治療タンパク質：Ｘの有効期間と比較して、該治療タンパク質：Ｘの有効期間を延長する能力である；
    （ｄ）治療タンパク質：Ｘおよび配列番号１０３８のアミノ酸配列のフラグメントまたは改変体であって、ここで、該フラグメントまたは改変体は、アルブミン活性を有し、そしてさらに、ここで、該フラグメントまたは改変体は、配列番号１０３８のアミノ酸１〜３８７のアミノ酸配列を含む；
    （ｅ）治療タンパク質：Ｘのフラグメントまたは改変体および配列番号１０３８のアミノ酸配列を含むアルブミンのフラグメントまたは改変体であって、ここで、該フラグメントまたは改変体は、治療タンパク質：Ｘの生物学的活性を有する；
    （ｆ）（ａ）〜（ｅ）の、治療タンパク質：Ｘ、またはそのフラグメントもしくは改変体、およびアルブミン、またはそのフラグメントもしくは改変体であって、ここで、該治療タンパク質：Ｘ、またはそのフラグメントもしくは改変体は、該アルブミンのＮ末端、または該アルブミンのフラグメントもしくは改変体のＮ末端に融合される；
    （ｇ）（ａ）〜（ｅ）の、治療タンパク質：Ｘ、またはそのフラグメントもしくは改変体、およびアルブミン、またはそのフラグメントもしくは改変体であって、ここで、該治療タンパク質：Ｘ、またはそのフラグメントもしくは改変体は、該アルブミンのＣ末端、または該アルブミンのフラグメントもしくは改変体のＣ末端に融合される；
    （ｈ）（ａ）〜（ｅ）の、治療タンパク質：Ｘ、またはそのフラグメントもしくは改変体、およびアルブミン、またはそのフラグメントもしくは改変体であって、ここで、該治療タンパク質：Ｘ、またはそのフラグメントもしくは改変体は、該アルブミンのＮ末端およびＣ末端、または該アルブミンのフラグメントもしくは改変体のＮ末端およびＣ末端に融合される；
    （ｉ）（ａ）〜（ｅ）の、治療タンパク質：Ｘ、またはそのフラグメントもしくは改変体であって、第一治療タンパク質：Ｘ、またはそのフラグメントもしくは改変体、および第二治療タンパク質：Ｘ、またはそのフラグメントもしくは改変体を含み、ここで、該第一治療タンパク質：Ｘ、またはそのフラグメントもしくは改変体は、該第二治療タンパク質：Ｘ、またはそのフラグメントもしくは改変体と異なる；
    （ｊ）（ａ）〜（ｉ）の、治療タンパク質：Ｘ、またはそのフラグメントもしくは改変体、およびアルブミン、またはそのフラグメントもしくは改変体であって、ここで、該治療タンパク質：Ｘ、またはそのフラグメントもしくは改変体は、リンカーによって該アルブミン、またはそのフラグメントもしくは改変体から分離される；ならびに
    （ｋ）（ａ）〜（ｊ）の、治療タンパク質：Ｘ、またはそのフラグメントもしくは改変体、およびアルブミン、またはそのフラグメントもしくは改変体であって、ここで、該アルブミン融合タンパク質は、以下の式：
    Ｒ１−Ｌ−Ｒ２；Ｒ２−Ｌ−Ｒ１；またはＲ１−Ｌ−Ｒ２−Ｌ−Ｒ１
    を有し、そしてさらに、ここで、Ｒ１は、治療タンパク質：Ｘ、またはそのフラグメントもしくは改変体であり、Ｌは、ペプチドリンカーであり、そしてＲ２は、配列番号１０３８のアミノ酸配列を含むアルブミン、またはアルブミンのフラグメントもしくは改変体である、
    からなる群から選択されるメンバーを含む、アルブミン融合タンパク質。
  2. 請求項１に記載のアルブミン融合タンパク質であって、ここで、該アルブミン融合タンパク質の有効期間は、非融合状態での前記治療タンパク質：Ｘ、またはそのフラグメントもしくは改変体の有効期間より大きい、アルブミン融合タンパク質。
  3. 請求項１に記載のアルブミン融合タンパク質であって、ここで、アルブミン、またはそのフラグメントもしくは改変体に融合された、治療タンパク質：Ｘ、またはそのフラグメントもしくは改変体のインビトロ生物学的活性は、非融合状態での治療タンパク質：Ｘ、またはそのフラグメントもしくは改変体のインビトロ生物学的活性より大きい、アルブミン融合タンパク質。
  4. 請求項１に記載のアルブミン融合タンパク質であって、ここで、アルブミン、またはそのフラグメントもしくは改変体に融合された、治療タンパク質：Ｘ、またはそのフラグメントもしくは改変体のインビボ生物学的活性は、非融合状態での治療タンパク質：Ｘ、またはそのフラグメントもしくは改変体のインビボ生物学的活性より大きい、アルブミン融合タンパク質。
  5. アルブミン融合タンパク質であって、アルブミン、またはそのフラグメントもしくは改変体中に挿入された、治療タンパク質：Ｘ、またはそのフラグメントもしくは改変体を含み、配列番号１０３８のアミノ酸配列またはそのフラグメントもしくは改変体を含む、アルブミン融合タンパク質。
  6. アルブミン融合タンパク質であって、アルブミン、またはそのフラグメントもしくは改変体中に挿入された、治療タンパク質：Ｘ、またはそのフラグメントもしくは改変体を含み、以下：
    （ａ）配列番号１０３８の５４〜６１のアミノ酸；
    （ｂ）配列番号１０３８の７６〜８９のアミノ酸；
    （ｃ）配列番号１０３８の９２〜１００のアミノ酸；
    （ｄ）配列番号１０３８の１７０〜１７６のアミノ酸；
    （ｅ）配列番号１０３８の２４７〜２５２のアミノ酸；
    （ｆ）配列番号１０３８の２６６〜２７７のアミノ酸；
    （ｇ）配列番号１０３８の２８０〜２８８のアミノ酸；
    （ｈ）配列番号１０３８の３６２〜３６８のアミノ酸；
    （ｉ）配列番号１０３８の４３９〜４４７のアミノ酸；
    （ｊ）配列番号１０３８の４６２〜４７５のアミノ酸；
    （ｋ）配列番号１０３８の４７８〜４８６のアミノ酸；および
    （ｌ）配列番号１０３８の５６０〜５６６のアミノ酸、
    からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、アルブミン融合タンパク質。
  7. 請求項５に記載のアルブミン融合タンパク質であって、ここで、該アルブミン融合タンパク質は、非融合状態での前記治療タンパク質：Ｘ、またはそのフラグメントもしくは改変体の有効期間と比較した場合、前記治療タンパク質：Ｘ、またはそのフラグメントもしくは改変体の有効期間を延長するのに十分なアルブミンの部分を含む、アルブミン融合タンパク質。
  8. 請求項６に記載のアルブミン融合タンパク質であって、ここで、該アルブミン融合タンパク質は、非融合状態での前記治療タンパク質：Ｘ、またはそのフラグメントもしくは改変体の有効期間と比較した場合、前記治療タンパク質：Ｘ、またはそのフラグメントもしくは改変体の有効期間を延長するのに十分なアルブミンの部分を含む、アルブミン融合タンパク質。
  9. 請求項５に記載のアルブミン融合タンパク質であって、ここで、該アルブミン融合タンパク質は、非融合状態での前記治療タンパク質：Ｘ、またはそのフラグメントもしくは改変体のインビトロ生物学的活性と比較した場合、前記アルブミンに融合された治療タンパク質：Ｘ、またはそのフラグメントもしくは改変体のインビトロ生物学的活性を延長するのに十分なアルブミンの部分を含む、アルブミン融合タンパク質。
  10. 請求項６に記載のアルブミン融合タンパク質であって、ここで、該アルブミン融合タンパク質は、非融合状態での前記治療タンパク質：Ｘ、またはそのフラグメントもしくは改変体のインビトロ生物学的活性と比較した場合、前記アルブミンに融合された治療タンパク質：Ｘ、またはそのフラグメントもしくは改変体のインビトロ生物学的活性を延長するのに十分なアルブミンの部分を含む、アルブミン融合タンパク質。
  11. 請求項５に記載のアルブミン融合タンパク質であって、ここで、該アルブミン融合タンパク質は、非融合状態での前記治療タンパク質：Ｘ、またはそのフラグメントもしくは改変体のインビボ生物学的活性と比較した場合、前記アルブミンに融合された治療タンパク質：Ｘ、またはそのフラグメントもしくは改変体のインビボ生物学的活性を延長するのに十分なアルブミンの部分を含む、アルブミン融合タンパク質。
  12. 請求項６に記載のアルブミン融合タンパク質であって、ここで、該アルブミン融合タンパク質は、非融合状態での治療タンパク質：Ｘ、またはそのフラグメントもしくは改変体のインビボ生物学的活性と比較した場合、アルブミンに融合された治療タンパク質：Ｘ、またはそのフラグメントもしくは改変体のインビボ生物学的活性を保つために十分なアルブミンの一部を含む、アルブミン融合タンパク質。
  13. グリコシル化されない、請求項１〜１２のいずれか１つに記載のアルブミン融合タンパク質。
  14. 酵母中で発現される、請求項１〜１２のいずれか１つに記載のアルブミン融合タンパク質。
  15. 請求項１４に記載のアルブミン融合タンパク質であって、ここで、前記酵母は、グリコシル化欠乏である、アルブミン融合タンパク質。
  16. 請求項１４に記載のアルブミン融合タンパク質であって、ここで、前記酵母は、グリコシル化欠乏およびプロテアーゼ欠乏である、アルブミン融合タンパク質。
  17. 哺乳動物細胞によって発現される、請求項１〜１２のいずれか１つに記載のアルブミン融合タンパク質。
  18. 請求項１〜１２のいずれか１つに記載のアルブミン融合タンパク質であって、ここで、該アルブミン融合タンパク質は、培養物中で哺乳動物細胞によって発現される、アルブミン融合タンパク質。
  19. 請求項１〜１２のいずれか１つに記載のアルブミン融合タンパク質であって、ここで、該アルブミン融合タンパク質は、分泌リーダー配列をさらに含む、アルブミン融合タンパク質。
  20. 請求項１〜１２のいずれか１つに記載のアルブミン融合タンパク質および薬学的に受容可能なキャリアを含む、組成物。
  21. 請求項２０に記載の組成物を含む、キット。
  22. 患者における疾患または障害を処置する方法であって、請求項１〜１２のいずれか１つに記載のアルブミン融合タンパク質を投与する工程を包含する、方法。
  23. 請求項２２に記載の方法であって、ここで、前記疾患または障害は、適応症：Ｙを含む、方法。
  24. 治療タンパク質：Ｘ、またはそのフラグメントもしくは改変体によって調節される疾患または障害を有する患者を処置する方法であって、請求項１〜１２のいずれか１つに記載のアルブミン融合タンパク質の有効な量を投与する工程を包含する、方法。
  25. 請求項２４に記載の方法であって、ここで、前記疾患または障害は、適応症：Ｙである、方法。
  26. 治療タンパク質：Ｘ、またはそのフラグメントもしくは改変体の貯蔵寿命を延長する方法であって、非融合状態での前記治療タンパク質：Ｘ、またはそのフラグメントもしくは改変体の有効期間と比較して、前記治療タンパク質：Ｘ、またはそのフラグメントもしくは改変体の有効期間を延長するのに十分、該治療タンパク質：Ｘ、またはそのフラグメントもしくは改変体をアルブミン、またはそのフラグメントもしくは改変体に融合する工程を包含する、方法。
  27. 請求項１〜１２のいずれか１つに記載のアルブミン融合たんぱく質をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子。
  28. 請求項２７に記載の核酸分子を含むベクター。
  29. 請求項２８に記載の核酸分子を含む宿主細胞。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9526733D0 (en) 1995-12-30 1996-02-28 Delta Biotechnology Ltd Fusion proteins
US20060084082A1 (en) * 1997-03-07 2006-04-20 Human Genome Sciences, Inc. 186 human secreted proteins
US7625859B1 (en) 2000-02-16 2009-12-01 Oregon Health & Science University HER-2 binding antagonists
US7393823B1 (en) 1999-01-20 2008-07-01 Oregon Health And Science University HER-2 binding antagonists
US20030095967A1 (en) 1999-01-25 2003-05-22 Mackay Fabienne BAFF, inhibitors thereof and their use in the modulation of B-cell response and treatment of autoimmune disorders
US20050100991A1 (en) * 2001-04-12 2005-05-12 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
CA2405557C (en) 2000-04-12 2013-09-24 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
US8022270B2 (en) 2000-07-31 2011-09-20 Biolex Therapeutics, Inc. Expression of biologically active polypeptides in duckweed
US7632983B2 (en) 2000-07-31 2009-12-15 Biolex Therapeutics, Inc. Expression of monoclonal antibodies in duckweed
CZ306180B6 (cs) 2000-12-07 2016-09-14 Eli Lilly And Company GLP-1 fúzní proteiny
US8231878B2 (en) 2001-03-20 2012-07-31 Cosmo Research & Development S.P.A. Receptor trem (triggering receptor expressed on myeloid cells) and uses thereof
US8981061B2 (en) 2001-03-20 2015-03-17 Novo Nordisk A/S Receptor TREM (triggering receptor expressed on myeloid cells) and uses thereof
US20050244931A1 (en) * 2001-04-12 2005-11-03 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
US7507413B2 (en) * 2001-04-12 2009-03-24 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
US20050123925A1 (en) 2002-11-15 2005-06-09 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
EP2261250B1 (en) 2001-12-21 2015-07-01 Human Genome Sciences, Inc. GCSF-Albumin fusion proteins
AU2002364587A1 (en) 2001-12-21 2003-07-30 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
KR101271635B1 (ko) * 2001-12-21 2013-06-12 휴먼 게놈 사이언시즈, 인코포레이티드 알부민 융합 단백질
US20080194481A1 (en) 2001-12-21 2008-08-14 Human Genome Sciences, Inc. Albumin Fusion Proteins
NZ534492A (en) * 2002-02-07 2009-10-30 Novozymes Delta Ltd Albumin-fused kunitz domain peptides
US20050222023A1 (en) * 2002-02-07 2005-10-06 Hans-Peter Hauser Albumin-fused kunitz domain peptides
US20060241027A1 (en) * 2002-02-07 2006-10-26 Hans-Peter Hauser Hiv inhibiting proteins
CN101172091B (zh) * 2007-09-25 2011-04-27 北京美福源生物医药科技有限公司 含人血清白蛋白与皮肤细胞生长因子的融合蛋白护肤产品制备工艺和用途
CN1241946C (zh) * 2002-07-01 2006-02-15 美国福源集团 对多种细胞具刺激增生作用的人血清白蛋白重组融合蛋白
US7731947B2 (en) 2003-11-17 2010-06-08 Intarcia Therapeutics, Inc. Composition and dosage form comprising an interferon particle formulation and suspending vehicle
EP1594530A4 (en) * 2003-01-22 2006-10-11 Human Genome Sciences Inc HYBRID PROTEINS OF ALBUMIN
US7077176B2 (en) 2003-04-28 2006-07-18 Medical Instill Technologies, Inc. Container with valve assembly for filling and dispensing substances, and apparatus and method for filling
TWI353991B (en) 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
US20070161087A1 (en) * 2003-05-29 2007-07-12 Wolfgang Glaesner Glp-1 fusion proteins
PT1641823E (pt) * 2003-06-12 2011-11-08 Lilly Co Eli Proteínas de fusão de análogos de glp-1
US7176292B2 (en) * 2003-09-11 2007-02-13 Dialean, Ltd. Ghrelin variant protein
JP2007508332A (ja) * 2003-10-17 2007-04-05 ノボ　ノルディスク　アクティーゼルスカブ 併用療法
EP1704164B1 (en) * 2003-12-03 2011-12-28 Kröz, Monika Interleukin-11 fusion proteins
EP1729795B1 (en) * 2004-02-09 2016-02-03 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
EP1789440A4 (en) * 2004-02-11 2008-03-12 Amylin Pharmaceuticals Inc REASONS FOR THE FAMILY OF PANCREATIC POLYPEPTIDES AND POLYPEPTIDES CONTAINING THEM
US20050232981A1 (en) 2004-04-15 2005-10-20 Ben-Sasson Shmuel A Compositions capable of facilitating penetration across a biological barrier
US20070219131A1 (en) * 2004-04-15 2007-09-20 Ben-Sasson Shmuel A Compositions capable of facilitating penetration across a biological barrier
ES2365023T3 (es) 2004-04-21 2011-09-20 Enobia Pharma Inc. Conjugados de administración ósea y método de uso de los mismos para dirigir proteínas a hueso.
CN101005871A (zh) * 2004-04-27 2007-07-25 生命治疗有限公司 代谢性解毒系统和方法
SI1771474T1 (sl) 2004-07-20 2010-06-30 Genentech Inc Inhibitorji angiopoetinu podobnega proteina kombinacije in njihova uporaba
HUE029170T2 (en) 2004-07-20 2017-03-28 Genentech Inc Preparations and methods for the use of angiopoietin-like protein 4
US8604185B2 (en) 2004-07-20 2013-12-10 Genentech, Inc. Inhibitors of angiopoietin-like 4 protein, combinations, and their use
EP2332563A3 (en) 2004-10-13 2013-03-13 The Washington University Use of BAFF to treat sepsis
ZA200701792B (en) 2004-10-25 2008-12-31 Cytos Biotechnology Ag Gastric inhibitory polypeptide (GIP) antigen arrays and uses thereof
GB0426146D0 (en) 2004-11-29 2004-12-29 Bioxell Spa Therapeutic peptides and method
CN101128487B (zh) 2004-12-02 2012-10-10 杜门蒂斯有限公司 靶向血清白蛋白和glp-1或pyy的双特异性结构域抗体
EP1828241A1 (en) * 2004-12-23 2007-09-05 Laboratoires Serono S.A. G-csf polypeptides and uses thereof
US11246913B2 (en) 2005-02-03 2022-02-15 Intarcia Therapeutics, Inc. Suspension formulation comprising an insulinotropic peptide
WO2006083761A2 (en) 2005-02-03 2006-08-10 Alza Corporation Solvent/polymer solutions as suspension vehicles
EP1909822B1 (en) * 2005-06-29 2013-09-25 Yeda Research And Development Co., Ltd. Recombinant interferon alpha 2 (ifn alpha 2) mutants
EP1924596A4 (en) * 2005-08-12 2009-07-29 Human Genome Sciences Inc ALBUM INFUSION PROTEINS
HUE038947T2 (hu) * 2005-08-26 2018-12-28 Ares Trading Sa Eljárás glikozilált béta-interferon elõállítására
US20100021480A1 (en) * 2005-10-27 2010-01-28 Peptron Co., Ltd Bioactive substance-blood protein conjugate and stabilization of a bioactive substance using the same
DK1965823T3 (en) 2005-11-04 2016-08-22 Glaxosmithkline Llc Corp Service Company Methods of administering hypoglycemics
CN101384621A (zh) * 2005-11-10 2009-03-11 受体生物公司 产生受体和配体同种型的方法
US20080280328A1 (en) * 2005-11-18 2008-11-13 Novozymes A/S Glucoamylase Variants
US20080260746A1 (en) * 2005-11-24 2008-10-23 Laboratoires Serono Sa Erythropoietin Polypeptides and Uses Thereof
WO2007065918A2 (en) * 2005-12-09 2007-06-14 Ares Trading S.A. Method for purifying fsh or a fsh mutant
EP1971355B1 (en) 2005-12-20 2020-03-11 Duke University Methods and compositions for delivering active agents with enhanced pharmacological properties
US20130172274A1 (en) 2005-12-20 2013-07-04 Duke University Methods and compositions for delivering active agents with enhanced pharmacological properties
US8841255B2 (en) 2005-12-20 2014-09-23 Duke University Therapeutic agents comprising fusions of vasoactive intestinal peptide and elastic peptides
EP1976876A4 (en) * 2005-12-22 2010-01-13 Conjuchem Biotechnologies Inc PROCESS FOR PRODUCING PREFORMED ALBUMIN CONJUGATES AND THERAPEUTIC AGENT
US10351615B2 (en) 2006-02-03 2019-07-16 Opko Biologics Ltd. Methods of treatment with long-acting growth hormone
US8048849B2 (en) 2006-02-03 2011-11-01 Modigene, Inc. Long-acting polypeptides and methods of producing same
US9458444B2 (en) 2006-02-03 2016-10-04 Opko Biologics Ltd. Long-acting coagulation factors and methods of producing same
US8304386B2 (en) * 2006-02-03 2012-11-06 Prolor Biotech, Inc. Long-acting growth hormone and methods of producing same
US9249407B2 (en) 2006-02-03 2016-02-02 Opko Biologics Ltd. Long-acting coagulation factors and methods of producing same
US8946155B2 (en) 2006-02-03 2015-02-03 Opko Biologics Ltd. Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same
US8759292B2 (en) 2006-02-03 2014-06-24 Prolor Biotech, Llc Long-acting coagulation factors and methods of producing same
US7553941B2 (en) * 2006-02-03 2009-06-30 Modigene Inc Long-acting polypeptides and methods of producing same
US8450269B2 (en) 2006-02-03 2013-05-28 Prolor Biotech Ltd. Long-acting growth hormone and methods of producing same
US10221228B2 (en) 2006-02-03 2019-03-05 Opko Biologics Ltd. Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same
US20140113860A1 (en) 2006-02-03 2014-04-24 Prolor Biotech Ltd. Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same
US8476234B2 (en) * 2006-02-03 2013-07-02 Prolor Biotech Inc. Long-acting coagulation factors and methods of producing same
US20150038413A1 (en) 2006-02-03 2015-02-05 Opko Biologics Ltd. Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same
US8048848B2 (en) 2006-02-03 2011-11-01 Prolor Biotech Ltd. Long-acting interferons and derivatives thereof and methods thereof
EP1816201A1 (en) 2006-02-06 2007-08-08 CSL Behring GmbH Modified coagulation factor VIIa with extended half-life
US20080261893A1 (en) * 2006-02-24 2008-10-23 Denise Barbut Topical corneal analgesia using neurotensin receptor agonists and synergistic neurotensin combinations without delaying wound healing
CN101432025B (zh) 2006-03-21 2012-04-04 安米林药品公司 肽-肽酶抑制剂结合物及其使用方法
WO2007112940A2 (en) * 2006-03-31 2007-10-11 Ablynx N.V. Albumin-derived amino acid sequence, use thereof for increasing the half-life of therapeutic proteins and of other therapeutic compounds and entities, and constructs comprising the same
JP5566101B2 (ja) 2006-04-24 2014-08-06 メディカル・インスティル・テクノロジーズ・インコーポレイテッド 針貫通可能かつレーザ再密閉可能な凍結乾燥装置およびこれに関連する方法
CA2651855C (en) 2006-05-30 2011-08-02 Intarcia Therapeutics, Inc. Two-piece, internal-channel osmotic delivery system flow modulator
BRPI0712383A2 (pt) 2006-06-07 2012-07-10 Human Genome Sciences Inc proteìnas de fusão da albumina
US9505823B2 (en) 2006-08-07 2016-11-29 TEV A Biopharmaceuticals USA, Inc. Albumin-insulin fusion proteins
ES2422864T3 (es) 2006-08-09 2013-09-16 Intarcia Therapeutics, Inc Sistemas de liberación osmótica y unidades de pistón
JO2945B1 (en) * 2006-09-13 2016-03-15 سميث كلاين بيتشام كوربوريشن Methods of giving prolonged hypoglycemic agents
KR101722305B1 (ko) 2007-01-30 2017-03-31 에피백스, 인크. 조절 ｔ 세포 에피토프, 그의 조성물 및 용도
AU2008218199B2 (en) * 2007-02-22 2013-10-31 Genentech, Inc. Methods for detecting inflammatory bowel disease
WO2008112540A2 (en) * 2007-03-09 2008-09-18 Vectorlogics, Inc. Cells for adenovirus vector and protein production
EP2131651B1 (en) * 2007-03-12 2013-05-22 Sarentis Therapeutics, Inc. Topical corneal analgesia using neurotensin receptor agonists
PT2157967E (pt) 2007-04-23 2013-04-03 Intarcia Therapeutics Inc Formulações de suspensões de péptidos insulinotrópicos e suas utilizações
WO2008137471A2 (en) * 2007-05-02 2008-11-13 Ambrx, Inc. Modified interferon beta polypeptides and their uses
WO2009042922A2 (en) 2007-09-27 2009-04-02 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Peptide-peptidase inhibitor conjugates and methods of making and using same
AU2008314689A1 (en) * 2007-10-22 2009-04-30 Merck Serono S.A. Method for purifying an Fc-containing protein
WO2009053358A1 (en) * 2007-10-22 2009-04-30 Merck Serono S.A. Method for purifying fc-fusion proteins
CA2708762A1 (en) * 2007-12-11 2009-06-18 Conjuchem Biotechnologies Inc. Formulation of insulinotropic peptide conjugates
US20100297081A1 (en) * 2007-12-18 2010-11-25 Huang Yanshan Pharmaceutical formulation containing recombinant human serum albumin-interferon alpha fusion protein
EP2240155B1 (en) 2008-02-13 2012-06-06 Intarcia Therapeutics, Inc Devices, formulations, and methods for delivery of multiple beneficial agents
CA2718480A1 (en) 2008-03-31 2009-10-08 Glaxo Group Limited Drug fusions and conjugates
EP2860260A1 (en) * 2008-04-11 2015-04-15 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Human serum albumin linkers and conjugates thereof
US8476408B2 (en) * 2008-06-13 2013-07-02 Alize Pharma Sas Unacylated ghrelin and analogs as therapeutic agents for vascular remodeling in diabetic patients and treatment of cardiovascular disease
WO2009158704A2 (en) 2008-06-27 2009-12-30 Duke University Therapeutic agents comprising elastin-like peptides
GB0815039D0 (en) * 2008-08-19 2008-09-24 Secr Defence Protein expression
BRPI0918652B1 (pt) 2008-09-17 2021-10-19 Chiasma, Inc. Composição farmacêutica compreendendo um meio hidrofóbico e uma forma sólida que compreende polipeptídeo e sal de ácido graxo de cadeia média, processo de produção da mesma e forma de dosagem oral
US20110171219A1 (en) * 2008-09-19 2011-07-14 Fahar Merchant Treating cancer stem cells using targeted cargo proteins
US8632986B2 (en) 2008-10-28 2014-01-21 Uladzimir A. Murauski Methods and kits for detection of toxemia
EP2344519B1 (en) 2008-11-07 2016-09-28 The General Hospital Corporation C-terminal fragments of glucagon-like peptide-1 (glp-1)
WO2010056732A1 (en) 2008-11-12 2010-05-20 Marv Enterprises Llc Utilization of stents for the treatment of blood borne carcinomas
CN102282168A (zh) * 2008-11-18 2011-12-14 梅里麦克制药股份有限公司 人血清白蛋白接头以及其结合物
ES2620610T3 (es) * 2008-12-10 2017-06-29 Glaxosmithkline Llc Composiciones farmacéuticas de albiglutide
US20100227818A1 (en) * 2009-01-16 2010-09-09 Teva Biopharmaceuticals Usa, Inc. Recombinant Human Albumin-Human Granulocyte Colony Stimulating Factor For The Prevention Of Neutropenia
AU2014202190B2 (en) * 2009-01-16 2016-03-17 Teva Pharmaceutical Industries Ltd. New Stable Formulations of Recombinant Human Albumin-Human Granulocyte Colony Stimulating Factor Fusion Protein
WO2010081494A1 (en) * 2009-01-19 2010-07-22 King Faisal Specialist Hospital And Research Centre A method of increasing protein expression in eukaryotic cells
EP2391714B2 (en) 2009-01-30 2019-07-24 Whitehead Institute for Biomedical Research Methods for ligation and uses thereof
EP2396347B1 (en) * 2009-02-11 2017-04-12 Albumedix A/S Albumin variants and conjugates
US9238878B2 (en) 2009-02-17 2016-01-19 Redwood Bioscience, Inc. Aldehyde-tagged protein-based drug carriers and methods of use
WO2010107789A1 (en) * 2009-03-17 2010-09-23 Marv Enterprises Llc Sequential extracorporeal treatment of bodily fluids
EP2411054A2 (en) 2009-03-27 2012-02-01 Glaxo Group Limited Drug fusions and conjugates
US9403898B2 (en) 2009-05-07 2016-08-02 Novozymes Biopharma Dk A/S Method for purifying albumin
US9663778B2 (en) 2009-07-09 2017-05-30 OPKO Biologies Ltd. Long-acting coagulation factors and methods of producing same
AU2010282250B2 (en) 2009-08-14 2015-11-12 Immunoforge Co., Ltd. Modified Vasoactive Intestinal Peptides
CN101993485B (zh) 2009-08-20 2013-04-17 重庆富进生物医药有限公司 促胰岛素分泌肽类似物同源二聚体及其用途
AU2010290077C1 (en) 2009-08-24 2015-12-03 Bioverativ Therapeutics Inc. Coagulation factor IX compositions and methods of making and using same
US8451450B2 (en) * 2009-09-14 2013-05-28 Bio-Rad Laboratories, Inc. Near real time optical phase conjugation
KR101823699B1 (ko) 2009-09-28 2018-01-30 인타르시아 세라퓨틱스 인코포레이티드 실질 항정상태 약물 전달의 신속 확립 및/또는 종결
MX2012003939A (es) 2009-09-30 2012-07-30 Glaxo Group Ltd Fusiones y conjugados de farmaco.
AU2010311332B2 (en) 2009-10-30 2015-04-23 Albumedix Ltd. Albumin variants
WO2011053545A1 (en) * 2009-10-30 2011-05-05 Merck Sharp & Dohme Corp. Granulocyte-colony stimulating factor produced in glycoengineered pichia pastoris
AU2010325787B2 (en) 2009-12-06 2016-05-12 Bioverativ Therapeutics Inc. Factor VIII-Fc chimeric and hybrid polypeptides, and methods of use thereof
NZ601034A (en) 2009-12-08 2013-07-26 Teva Pharma Bche albumin fusions for the treatment of cocaine abuse
JP5969458B2 (ja) * 2010-04-09 2016-08-17 アルブミディクス アクティーゼルスカブ アルブミン誘導体及び変異体
EP2566502A4 (en) 2010-05-04 2013-10-09 Glaxosmithkline Llc METHODS OF TREATING OR PREVENTING CARDIOVASCULAR DISORDERS AND PROVIDING CARDIOVASCULAR PROTECTION
NZ605348A (en) 2010-07-09 2015-01-30 Biogen Idec Hemophilia Inc Factor ix polypeptides and methods of use thereof
NZ605400A (en) 2010-07-09 2015-05-29 Biogen Idec Hemophilia Inc Chimeric clotting factors
WO2012012271A2 (en) * 2010-07-19 2012-01-26 Sialix, Inc. Novel glycosylated polypeptides
EP2621519B1 (en) 2010-09-28 2017-06-28 Aegerion Pharmaceuticals, Inc. Leptin-abd fusion polypeptides with enhanced duration of action
US8892184B2 (en) 2010-10-18 2014-11-18 Siemens Medical Solutions Usa, Inc. Systems and methods for reducing interference in a dual modality imaging system
CN102453095A (zh) * 2010-11-01 2012-05-16 天津药物研究院 含有glp-1的融合蛋白、制备方法及其应用
US20130225496A1 (en) 2010-11-01 2013-08-29 Novozymes Biopharma Dk A/S Albumin Variants
EP2658979B1 (en) 2010-12-27 2018-02-14 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Compositions comprising natriuretic peptides and methods of use thereof
AU2012205301B2 (en) 2011-01-14 2017-01-05 Redwood Bioscience, Inc. Aldehyde-tagged immunoglobulin polypeptides and method of use thereof
KR20140044305A (ko) * 2011-02-09 2014-04-14 글락소스미스클라인 엘엘씨 동결건조된 제제
US20120208755A1 (en) 2011-02-16 2012-08-16 Intarcia Therapeutics, Inc. Compositions, Devices and Methods of Use Thereof for the Treatment of Cancers
US10064915B2 (en) 2011-02-28 2018-09-04 Korea University Research And Business Foundation Fusion protein comprising albumin and retinol-binding protein
WO2012118323A2 (ko) 2011-02-28 2012-09-07 고려대학교 산학협력단 알부민과 레티놀 결합 단백질의 융합 단백질
US9701732B2 (en) 2011-02-28 2017-07-11 Korea University Research And Business Foundation Fusion protein comprising albumin and retinol-binding protein
CA2828811C (en) 2011-03-03 2021-09-21 Zymeworks Inc. Multivalent heteromultimer scaffold design and constructs
US9089312B2 (en) 2011-03-10 2015-07-28 Western New England University Tamponade for biopsy surgery and method of operation
US9205131B2 (en) * 2011-03-30 2015-12-08 The Regents Of The University Of California Use of IL-17D for the treatment and prevention of cancers
WO2012136790A1 (en) 2011-04-07 2012-10-11 Glaxo Group Limited Compositions comprising fusion proteins or conjugates with an improved half -life
WO2012136792A2 (en) 2011-04-07 2012-10-11 Glaxo Group Limited Cck compositions
US8558546B2 (en) * 2011-04-13 2013-10-15 Mark Griswold Relaxometry
WO2012150319A1 (en) 2011-05-05 2012-11-08 Novozymes Biopharma Dk A/S Albumin variants
EP2709648A4 (en) 2011-05-19 2015-04-08 Geysen Hendrik M COMPOUNDS FOR BINDING TO THE ERYTHROPOIETIN RECEPTOR
CA2873553C (en) 2011-06-06 2020-01-28 Phasebio Pharmaceuticals, Inc. Use of modified vasoactive intestinal peptides in the treatment of hypertension
SI2717898T1 (sl) 2011-06-10 2019-07-31 Bioverativ Therapeutics Inc. Spojine prokoagulantov in metode za njihovo uporabo
US9925246B2 (en) 2011-06-13 2018-03-27 Neumedicines, Inc. Mitigation of cutaneous injury with IL-12
CN103764665A (zh) 2011-06-28 2014-04-30 怀特黑德生物医学研究所 使用分选酶安装用于蛋白质连接的点击化学柄
BR112014000042A2 (pt) 2011-07-05 2017-02-21 Novozymes Biopharma Dk As composição, meio de cultura celular, uso de uma composição, e, método para cultivar células
WO2013006692A2 (en) 2011-07-06 2013-01-10 The General Hospital Corporation Methods of treatment using a pentapeptide derived from the c-terminus of glucagon-like peptide 1 (glp-1)
WO2013009545A1 (en) * 2011-07-08 2013-01-17 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Engineered polypeptides having enhanced duration of action with reduced immunogenicity
EP3513804B1 (en) 2011-07-08 2022-03-23 Bioverativ Therapeutics Inc. Factor viii chimeric and hybrid polypeptides, and methods of use thereof
US10656167B2 (en) 2011-07-25 2020-05-19 Bioverativ Therapeutics Inc. Assays to monitor bleeding disorders
AU2012296588B2 (en) 2011-08-17 2017-07-27 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Transferrin-tumstatin fusion protein and methods for producing and using the same
US20140193514A1 (en) * 2011-08-19 2014-07-10 Marv Enterprises Method for the Treatment of Cancer
US9730913B2 (en) * 2011-10-13 2017-08-15 The Johns Hopkins University High affinity beta lactamase inhibitors
WO2013075066A2 (en) 2011-11-18 2013-05-23 Eleven Biotherapeutics, Inc. Proteins with improved half-life and other properties
AU2013208007A1 (en) 2012-01-09 2014-07-31 The Scripps Research Institute Humanized antibodies with ultralong CDR3
CA2863224A1 (en) 2012-01-09 2013-07-18 The Scripps Research Institute Ultralong complementarity determining regions and uses thereof
WO2013106787A1 (en) 2012-01-12 2013-07-18 Biogen Idec Ma Inc. Chimeric factor viii polypeptides and uses thereof
US9550830B2 (en) 2012-02-15 2017-01-24 Novo Nordisk A/S Antibodies that bind and block triggering receptor expressed on myeloid cells-1 (TREM-1)
EP3196214B1 (en) 2012-02-15 2019-07-31 Novo Nordisk A/S Antibodies that bind and block triggering receptor expressed on myeloid cells-1 (trem-1)
RS63870B1 (sr) 2012-02-15 2023-01-31 Bioverativ Therapeutics Inc Sastavi faktora viii i postupci za pravljenje i upotrebu istih
PL2814842T3 (pl) 2012-02-15 2018-12-31 Novo Nordisk A/S Przeciwciała wiążące białko 1 rozpoznające peptydoglikan
NZ628014A (en) 2012-02-15 2016-09-30 Biogen Ma Inc Recombinant factor viii proteins
WO2013124325A1 (en) 2012-02-20 2013-08-29 Murauski Uladzimir A Methods and kits for detection of active malignancy
MX2014010278A (es) 2012-03-16 2015-03-05 Novozymes Biopharma Dk As Variantes de albumina.
WO2013148405A2 (en) * 2012-03-27 2013-10-03 Felder Mitchell S Treatment for atherosclerosis
EP2830646B1 (en) 2012-03-27 2018-03-07 NGM Biopharmaceuticals, Inc. Compositions and methods of use for treating metabolic disorders
WO2013151649A1 (en) 2012-04-04 2013-10-10 Sialix Inc Glycan-interacting compounds
EP2838552A4 (en) 2012-04-19 2016-05-18 Opko Biolog Ltd OXYNTOMODULIN VARIANTS WITH EXTENDED ACTION AND PROCESSES FOR PRODUCING SAME
JP2015523332A (ja) 2012-05-16 2015-08-13 グラクソ グループ リミテッドＧｌａｘｏ Ｇｒｏｕｐ Ｌｉｍｉｔｅｄ 経口投与のためのポリペプチド搭載ｐｏｃａナノ粒子
KR20220051197A (ko) 2012-05-17 2022-04-26 익스텐드 바이오사이언시즈, 인크. 개선된 약물 전달용 캐리어
EP2851429B1 (en) 2012-05-18 2019-07-24 Adda Biotech Inc. Protein and protein conjugate for diabetes treatment, and applications thereof
US10052366B2 (en) 2012-05-21 2018-08-21 Alexion Pharmaceuticsl, Inc. Compositions comprising alkaline phosphatase and/or natriuretic peptide and methods of use thereof
AU2013270682A1 (en) 2012-06-08 2014-12-11 Biogen Ma Inc. Procoagulant compounds
EP2863940A4 (en) 2012-06-08 2016-08-10 Biogen Ma Inc CHIMERIC COAGULATION FACTORS
US10023628B2 (en) 2012-07-06 2018-07-17 Bioverativ Therapeutics Inc. Cell line expressing single chain factor VIII polypeptides and uses thereof
KR102403545B1 (ko) 2012-07-11 2022-05-30 바이오버라티브 테라퓨틱스 인크. Xten 및 폰 빌레브란트 인자 단백질과의 viii 인자 복합체 및 이의 용도
CA2878640C (en) 2012-07-13 2023-10-24 Zymeworks Inc. Multivalent heteromultimer scaffold design and constructs
CN102816244A (zh) * 2012-08-23 2012-12-12 无锡和邦生物科技有限公司 一种Exendin-4肽与人血清白蛋白HSA的融合蛋白及其制备方法
US20150202287A1 (en) 2012-08-30 2015-07-23 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Combination therapies comprising anti-erbb3 agents
US20150252345A1 (en) 2012-09-25 2015-09-10 Biogen Idec Ma Inc. Methods of Using FIX Polypeptides
UA116217C2 (uk) 2012-10-09 2018-02-26 Санофі Пептидна сполука як подвійний агоніст рецепторів glp1-1 та глюкагону
AU2013331000B2 (en) 2012-10-18 2018-04-19 Bioverativ Therapeutics Inc. Methods of using a fixed dose of a clotting factor
WO2014070953A1 (en) 2012-10-30 2014-05-08 Biogen Idec Ma Inc. Methods of Using FVIII Polypeptide
MX2015005363A (es) 2012-11-08 2015-11-06 Novozymes Biopharma Dk As Variantes de albumina.
SG10202010383YA (en) 2012-11-20 2020-11-27 Opko Biologics Ltd Method of increasing the hydrodynamic volume of polypeptides by attaching to gonadotrophin carboxy terminal peptides
AU2013359550A1 (en) * 2012-12-12 2015-07-23 Teva Pharmaceutical Industries Ltd. Fusion of human growth hormone and albumin, formulation and uses thereof
CN104902920A (zh) 2012-12-21 2015-09-09 赛诺菲 作为glp1/gip双重激动剂或glp1/gip/胰高血糖素三重激动剂的毒蜥外泌肽-4衍生物
US9644021B2 (en) 2013-01-11 2017-05-09 The California Institute For Biomedical Research Bovine fusion antibodies
US9409662B2 (en) 2013-01-15 2016-08-09 Teva Pharmaceutical Industries, Ltd. Formulations of albu-BChE, preparation and uses thereof
US9161966B2 (en) 2013-01-30 2015-10-20 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. GDF15 mutein polypeptides
JP6272907B2 (ja) 2013-01-30 2018-01-31 エヌジーエム バイオファーマシューティカルズ インコーポレイテッド 代謝障害の処置における組成物及び使用方法
ES2959747T3 (es) 2013-02-15 2024-02-28 Bioverativ Therapeutics Inc Gen del factor VIII optimizado
EP3318124A3 (en) 2013-02-16 2018-05-30 Albumedix A/S Pharmacokinetic animal model
US9926570B2 (en) * 2013-03-06 2018-03-27 Glaxosmithkline Llc Host cells and methods of use
KR20160029731A (ko) 2013-03-12 2016-03-15 더 제너럴 하스피탈 코포레이션 변형된 뮐러관 억제 물질(mis) 단백질 및 질환 치료를 위한 그 용도
US20140271538A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Teva Pharmaceutical Industries Ltd. Recombinant Human Albumin-Human Granulocyte Colony Stimulating Factor for the Prevention of Neutropenia in Pediatric Patients
ES2926798T3 (es) 2013-03-15 2022-10-28 Bioverativ Therapeutics Inc Formulaciones de polipéptido de factor VIII
SG11201505926VA (en) 2013-03-15 2015-09-29 Biogen Ma Inc Factor ix polypeptide formulations
US9849066B2 (en) 2013-04-24 2017-12-26 Corning Incorporated Delamination resistant pharmaceutical glass containers containing active pharmaceutical ingredients
US20160207978A1 (en) * 2013-05-06 2016-07-21 Cell Machines Inc. Methods and compositions related to large scale production of proteins
SG10201913738YA (en) 2013-06-28 2020-03-30 Bioverativ Therapeutics Inc Thrombin cleavable linker with xten and its uses thereof
CN105814074B (zh) 2013-07-18 2020-04-21 图鲁斯生物科学有限责任公司 具有超长互补决定区的人源化抗体
US20160311885A1 (en) 2013-08-14 2016-10-27 Biogen Ma Inc. Recombinant factor viii proteins
EP3033097B1 (en) 2013-08-14 2021-03-10 Bioverativ Therapeutics Inc. Factor viii-xten fusions and uses thereof
AU2014321760A1 (en) 2013-09-20 2016-05-05 Massachusetts Eye And Ear Infirmary Uses of modified mullerian inhibiting substance (MIS) proteins for the treatment of neurodegenerative diseases
HUE057005T2 (hu) 2013-09-25 2022-04-28 Bioverativ Therapeutics Inc Oszlopon történõ vírusinaktiváló eljárások
CN103554266B (zh) * 2013-10-11 2015-05-27 哈尔滨医科大学 一种具有抗肿瘤作用的肿瘤抑素融合肽及其制备方法和应用
US20150158926A1 (en) 2013-10-21 2015-06-11 Opko Biologics, Ltd. Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same
CN103656618B (zh) * 2013-10-25 2016-06-08 广东药学院 治疗皮肤创伤的多肽纳米纤维凝胶制剂、制备方法及应用
WO2015070014A1 (en) 2013-11-08 2015-05-14 Biogen Idec Ma Inc. Procoagulant fusion compound
EP4332839A3 (en) 2013-12-06 2024-06-05 Bioverativ Therapeutics Inc. Population pharmacokinetics tools and uses thereof
WO2015089321A2 (en) 2013-12-11 2015-06-18 The General Hospital Corporation Use of mullerian inhibiting substance (mis) proteins for contraception and ovarian reserve preservation
EP3080149A1 (en) 2013-12-13 2016-10-19 Sanofi Dual glp-1/glucagon receptor agonists
WO2015086729A1 (en) 2013-12-13 2015-06-18 Sanofi Dual glp-1/gip receptor agonists
WO2015086730A1 (en) 2013-12-13 2015-06-18 Sanofi Non-acylated exendin-4 peptide analogues
TW201609795A (zh) 2013-12-13 2016-03-16 賽諾菲公司 作為雙重ｇｌｐ－１／ｇｉｐ受體促效劑的艾塞那肽－４（ｅｘｅｎｄｉｎ－４）胜肽類似物
CN117106095A (zh) 2014-01-10 2023-11-24 比奥贝拉蒂治疗公司 因子viii嵌合蛋白及其用途
US20160376330A1 (en) 2014-02-28 2016-12-29 Novo Nordisk A/S Mating factor alpha pro-peptide variants
EP3123090A4 (en) 2014-03-24 2017-12-13 Bioverativ Therapeutics Inc. Lyophilized factor ix formulations
TW201625668A (zh) 2014-04-07 2016-07-16 賽諾菲公司 作為胜肽性雙重ｇｌｐ－１／昇糖素受體激動劑之艾塞那肽－４衍生物
TW201625670A (zh) 2014-04-07 2016-07-16 賽諾菲公司 衍生自ｅｘｅｎｄｉｎ－４之雙重ｇｌｐ－１／升糖素受體促效劑
TW201625669A (zh) 2014-04-07 2016-07-16 賽諾菲公司 衍生自艾塞那肽－４（Ｅｘｅｎｄｉｎ－４）之肽類雙重ＧＬＰ－１／升糖素受體促效劑
EP3137899A2 (en) 2014-05-02 2017-03-08 Cerenis Therapeutics Holding SA Hdl therapy markers
US11052132B2 (en) 2014-05-08 2021-07-06 Phasebio Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for treating cystic fibrosis
US9932381B2 (en) 2014-06-18 2018-04-03 Sanofi Exendin-4 derivatives as selective glucagon receptor agonists
WO2016004113A1 (en) 2014-06-30 2016-01-07 Biogen Ma Inc. Optimized factor ix gene
WO2016007873A1 (en) 2014-07-11 2016-01-14 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods for treating craniosynostosis
RS65136B1 (sr) 2014-07-17 2024-02-29 Novo Nordisk As Mutageza usmerena na lokaciju trem-1 antitela za smanjenje viskoziteta
KR20170065026A (ko) 2014-07-30 2017-06-12 엔지엠 바이오파마슈티컬스, 아이엔씨. 대사 장애 치료용으로 이용되는 조성물 및 방법
US9616114B1 (en) 2014-09-18 2017-04-11 David Gordon Bermudes Modified bacteria having improved pharmacokinetics and tumor colonization enhancing antitumor activity
MA40524A (fr) 2014-09-26 2021-03-17 Bayer Pharma AG Dérivés d'adrénomédulline stabilisés et leur utilisation
US9889085B1 (en) 2014-09-30 2018-02-13 Intarcia Therapeutics, Inc. Therapeutic methods for the treatment of diabetes and related conditions for patients with high baseline HbA1c
WO2016054494A1 (en) * 2014-10-03 2016-04-07 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for treatment of conditions associated with elevated triglycerides
EP3207130B1 (en) 2014-10-14 2019-08-07 Halozyme, Inc. Compositions of adenosine deaminase-2 (ada2), variants thereof and methods of using same
EP3220961B1 (en) 2014-10-22 2023-07-05 Extend Biosciences, Inc. Therapeutic vitamin d conjugates
US9789197B2 (en) 2014-10-22 2017-10-17 Extend Biosciences, Inc. RNAi vitamin D conjugates
US9616109B2 (en) 2014-10-22 2017-04-11 Extend Biosciences, Inc. Insulin vitamin D conjugates
MA40835A (fr) 2014-10-23 2017-08-29 Biogen Ma Inc Anticorps anti-gpiib/iiia et leurs utilisations
MA40861A (fr) 2014-10-31 2017-09-05 Biogen Ma Inc Anticorps anti-glycoprotéines iib/iiia
MY186702A (en) 2014-10-31 2021-08-11 Ngm Biopharmaceuticals Inc Compositions and methods of use for treating metabolic disorders
DK3218005T5 (da) 2014-11-12 2024-10-14 Seagen Inc Glycan-interagerende forbindelser og anvendelsesfremgangsmåder
US9879087B2 (en) 2014-11-12 2018-01-30 Siamab Therapeutics, Inc. Glycan-interacting compounds and methods of use
US10449236B2 (en) 2014-12-05 2019-10-22 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Treating seizure with recombinant alkaline phosphatase
CA2973883A1 (en) 2015-01-28 2016-08-04 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating a subject with an alkaline phosphatase deficiency
US10238709B2 (en) 2015-02-03 2019-03-26 Chiasma, Inc. Method of treating diseases
EP3256151B1 (en) 2015-02-09 2020-08-05 Phasebio Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for treating muscle disease and disorders
US10925639B2 (en) 2015-06-03 2021-02-23 Intarcia Therapeutics, Inc. Implant placement and removal systems
AR105319A1 (es) 2015-06-05 2017-09-27 Sanofi Sa Profármacos que comprenden un conjugado agonista dual de glp-1 / glucagón conector ácido hialurónico
KR102662956B1 (ko) 2015-06-19 2024-05-03 옵코 바이오로직스 리미티드 장기-작용성 응고 인자 및 그의 제조 방법
AR105284A1 (es) 2015-07-10 2017-09-20 Sanofi Sa Derivados de exendina-4 como agonistas peptídicos duales específicos de los receptores de glp-1 / glucagón
TWI741992B (zh) 2015-08-03 2021-10-11 美商百歐維拉提夫治療公司 因子ｉｘ融合蛋白以及其製備及使用方法
US11352612B2 (en) 2015-08-17 2022-06-07 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Manufacturing of alkaline phosphatases
WO2017029407A1 (en) 2015-08-20 2017-02-23 Albumedix A/S Albumin variants and conjugates
EP4374913A3 (en) * 2015-09-08 2024-08-14 JCR Pharmaceuticals Co., Ltd. Novel human serum albumin mutant
JP7014721B2 (ja) 2015-09-18 2022-02-01 ディーエヌエーアールエックス インビボでの核酸発現のためのシステム及び方法
WO2017058822A1 (en) 2015-09-28 2017-04-06 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Identifying effective dosage regimens for tissue non-specific alkaline phosphatase (tnsalp)-enzyme replacement therapy of hypophosphatasia
CN106589130B (zh) * 2015-10-14 2019-11-01 阿思科力(苏州)生物科技有限公司 一种Slit2D2-HSA重组蛋白及其在治疗脓毒症中的应用
EP3368062A4 (en) 2015-10-30 2019-07-03 Alexion Pharmaceuticals, Inc. METHODS OF TREATING CRANIOSYNOSTOSIS IN A PATIENT
WO2017072310A1 (en) * 2015-10-30 2017-05-04 Medimmune Limited Prevention of n-terminal truncation in igg light chains
IL302822A (en) 2015-11-12 2023-07-01 Seagen Inc Compounds interacting with glycans and methods of use
HRP20221089T1 (hr) 2016-02-01 2022-11-25 Bioverativ Therapeutics Inc. Optimizirani geni faktora viii
WO2017155569A1 (en) 2016-03-08 2017-09-14 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating hypophosphatasia in children
JP2017165713A (ja) 2016-03-14 2017-09-21 Ｊｃｒファーマ株式会社 血清アルブミン−２０ｋ成長ホルモン融合タンパク質
TWI815793B (zh) 2016-03-31 2023-09-21 美商恩格姆生物製藥公司 結合蛋白質及其使用方法
WO2017173395A1 (en) 2016-04-01 2017-10-05 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating hypophosphatasia in adolescents and adults
CA3019726A1 (en) 2016-04-01 2017-10-05 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Treating muscle weakness with alkaline phosphatases
US11208632B2 (en) 2016-04-26 2021-12-28 R.P. Scherer Technologies, Llc Antibody conjugates and methods of making and using the same
BR112018072783A2 (pt) 2016-05-06 2019-03-12 Phasebio Pharmaceuticals, Inc. proteínas de fusão elp para liberação controlada e retardada
KR102574993B1 (ko) 2016-05-16 2023-09-06 인타르시아 세라퓨틱스 인코포레이티드 글루카곤-수용체 선택적 폴리펩티드 및 이들의 이용 방법
USD860451S1 (en) 2016-06-02 2019-09-17 Intarcia Therapeutics, Inc. Implant removal tool
USD840030S1 (en) 2016-06-02 2019-02-05 Intarcia Therapeutics, Inc. Implant placement guide
US10988744B2 (en) 2016-06-06 2021-04-27 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Method of producing alkaline phosphatase
EA201990255A1 (ru) 2016-07-11 2019-07-31 Опко Байолоджикс Лтд Фактор свертывания крови vii пролонгированного действия и способы его получения
WO2018026742A1 (en) * 2016-08-01 2018-02-08 Askgene Pharma Inc. Novel antibody-albumin-drug conjugates (aadc) and methods for using them
EP3500289B1 (en) 2016-08-18 2024-10-09 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Asfotase alfa for use in treating tracheobronchomalacia
EP3535585A1 (en) 2016-11-04 2019-09-11 Aarhus Universitet Identification and treatment of tumors characterized by an overexpression of the neonatal fc receptor
EP3541847A4 (en) 2016-11-17 2020-07-08 Seattle Genetics, Inc. COMPOUNDS INTERACTING WITH GLYCANE AND METHODS OF USE
CN110520149A (zh) 2016-12-02 2019-11-29 比奥维拉迪维治疗股份有限公司 诱导对凝血因子的免疫耐受性的方法
EP3548066A1 (en) 2016-12-02 2019-10-09 Bioverativ Therapeutics Inc. Methods of treating hemophilic arthropathy using chimeric clotting factors
US11180535B1 (en) 2016-12-07 2021-11-23 David Gordon Bermudes Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
EP3554532B1 (en) * 2016-12-13 2024-09-25 Defensin Therapeutics ApS Hbd2 for use in the treatment of inflammatory conditions of the lungs
US11518793B2 (en) 2016-12-14 2022-12-06 The General Hospital Corporation Mullerian inhibiting substance (MIS) proteins for ovarian and uterine oncoprotection, and ovarian reserve and uterine preservation
US20200031895A1 (en) 2016-12-16 2020-01-30 Biogen Ma Inc. Stabilized proteolytically activated growth differentiation factor 11
KR20190104039A (ko) 2017-01-03 2019-09-05 인타르시아 세라퓨틱스 인코포레이티드 Glp-1 수용체 효능제의 연속적인 투여 및 약물의 동시-투여를 포함하는 방법
AU2018215092A1 (en) 2017-01-31 2019-08-29 Bioverativ Therapeutics Inc. Factor IX fusion proteins and methods of making and using same
EP3585411A4 (en) * 2017-02-21 2020-12-16 The Regents Of The University Of Michigan IL-22BP COMPOSITIONS AND METHODS OF TREATMENT OF DISEASES THEREOF
KR20240044544A (ko) 2017-03-03 2024-04-04 씨젠 인크. 글리칸-상호작용 화합물 및 사용 방법
EP3600428A4 (en) 2017-03-23 2020-08-26 Dnarx SYSTEMS AND METHODS FOR THE EXPRESSION OF NUCLEIC ACIDS IN VIVO
US10767164B2 (en) 2017-03-30 2020-09-08 The Research Foundation For The State University Of New York Microenvironments for self-assembly of islet organoids from stem cells differentiation
CN110719786A (zh) 2017-03-31 2020-01-21 阿雷克森制药公司 用于治疗成人和青少年的低磷酸酯酶症(hpp)的方法
US20200171128A1 (en) * 2017-05-19 2020-06-04 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Compositions and methods for improving cognition
US20210163986A1 (en) 2017-08-09 2021-06-03 Bioverativ Therapeutics Inc. Nucleic acid molecules and uses thereof
BR112020003403A2 (pt) 2017-08-18 2020-08-25 Neutrolis Inc. enzimas de dnase engenheiradas e uso na terapia
KR102399458B1 (ko) * 2017-10-27 2022-05-17 사바 라이프 사이언스 에이비 면역-분석 플랫폼들 상 분석을 위한 세포-기반의 분석들을 최적화하기 위한 분비된 리포터-펩타이드들
CN111315775A (zh) 2017-11-10 2020-06-19 恩格姆生物制药公司 Angptl8-结合剂及其使用方法
AU2019215063A1 (en) 2018-02-01 2020-09-03 Bioverativ Therapeutics, Inc. Use of lentiviral vectors expressing Factor VIII
CA3094112A1 (en) 2018-03-28 2019-10-03 Bristol-Myers Squibb Company Interleukin-2/interleukin-2 receptor alpha fusion proteins and methods of use
EP3773684A1 (en) 2018-03-30 2021-02-17 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Manufacturing of glycoproteins
AU2019248547A1 (en) 2018-04-02 2020-09-10 Bristol-Myers Squibb Company Anti-TREM-1 antibodies and uses thereof
KR20210021468A (ko) 2018-05-14 2021-02-26 웨어울프 세라퓨틱스, 인크. 활성화가능한 사이토카인 폴리펩타이드 및 이의 사용 방법
AU2019271148B2 (en) 2018-05-14 2023-07-06 Werewolf Therapeutics, Inc. Activatable interleukin-2 polypeptides and methods of use thereof
JP2021523878A (ja) 2018-05-18 2021-09-09 バイオベラティブ セラピューティクス インコーポレイテッド 血友病ａを処置する方法
BR112020026512A2 (pt) 2018-07-03 2021-04-06 Bristol-Myers Squibb Company Formulações de fgf-21
KR20200135618A (ko) 2019-05-23 2020-12-03 ㈜ 디앤디파마텍 폴리펩티드를 포함하는 비알코올성 지방간 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물
EP3823659A4 (en) 2018-07-19 2022-06-22 D&D Pharmatech Inc. PHARMACEUTICAL COMPOSITION WITH A POLYPEPTIDE
US20200069817A1 (en) 2018-08-09 2020-03-05 Bioverativ Therapeutics Inc. Nucleic acid molecules and uses thereof for non-viral gene therapy
WO2020056242A1 (en) * 2018-09-14 2020-03-19 Billion Bottle Project Ultraviolet (uv) dosimetry
CA3116023A1 (en) 2018-10-11 2020-04-16 Intarcia Therapeutics, Inc. Human amylin analog polypeptides and methods of use
CN109762069B (zh) * 2018-11-05 2022-01-14 广州领晟医疗科技有限公司 一种融合蛋白、其药物组合物及用途
US20220119494A1 (en) * 2018-11-14 2022-04-21 Sudershan Biotech Pvt Ltd Recombinant vector, host cell and process for production of human serum albumin
CN113396223A (zh) 2018-12-06 2021-09-14 比奥维拉迪维治疗股份有限公司 表达因子ix的慢病毒载体的用途
CN109627343A (zh) * 2018-12-27 2019-04-16 北京美福源生物医药科技有限公司 长效细胞因子基因衍生物融合蛋白
KR20210121137A (ko) 2019-01-29 2021-10-07 샤이어-엔피에스 파마슈티칼즈, 인크. 부갑상선 호르몬 변이체
WO2020232305A1 (en) 2019-05-14 2020-11-19 Werewolf Therapeutics, Inc. Separation moieties and methods and use thereof
CA3143584A1 (en) 2019-06-18 2020-12-24 Bayer Aktiengesellschaft Adrenomedullin-analogues for long-term stabilization and their use
CU20220016A7 (es) 2019-09-06 2022-10-11 Novartis Ag Proteínas de fusión terapéuticas
WO2021067389A1 (en) 2019-09-30 2021-04-08 Bioverativ Therapeutics Inc. Lentiviral vector formulations
CA3157859A1 (en) * 2019-10-15 2021-04-22 Modernatx, Inc. Mrnas encoding immune modulating polypeptides and uses thereof
WO2021075526A1 (ja) 2019-10-17 2021-04-22 Ｊｃｒファーマ株式会社 血清アルブミンと成長ホルモンの融合蛋白質の製造方法
EP4059512A4 (en) 2019-10-30 2023-12-06 JCR Pharmaceuticals Co., Ltd. AQUEOUS PHARMACEUTICAL COMPOSITION CONTAINING SERUM ALBUMIN FUSION PROTEIN AND GROWTH HORMONE
WO2021097376A1 (en) 2019-11-14 2021-05-20 Werewolf Therapeutics, Inc. Activatable cytokine polypeptides and methods of use thereof
CA3155541A1 (en) * 2019-11-27 2021-06-03 Ravi Chandra BEERAM Nucleic acids, vectors, host cells and methods for production of fructosyltransferase from aspergillus japonicus
US20230227804A1 (en) * 2019-11-27 2023-07-20 Revelations Biotech Pvt Ltd Nucleic Acids, Vectors, Host Cells and Methods for Production of Beta-Fructofuranosidase from Aspergillus Niger
WO2021111143A1 (en) 2019-12-04 2021-06-10 Albumedix Limited Methods and compositions produced thereby
US20230357356A1 (en) * 2020-04-14 2023-11-09 Senelix Co., Ltd. Recombinant fusion protein for preventing or treating fibrotic diseases
EP4186928A4 (en) * 2020-07-08 2024-10-09 Nanjing Normal University FUSION POLYPEPTIDE AND POLYPEPTIDE DIMER, AND USE THEREOF
JP2023538533A (ja) 2020-08-07 2023-09-08 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー 線維症の処置のための、ｃｃｒ２／５拮抗剤と組み合わせたｆｇｆ２１
CN112724259B (zh) * 2020-11-16 2022-12-20 天津林达生物科技有限公司 人血清白蛋白与白介素2的融合蛋白及其用途
US20240123031A1 (en) 2020-11-25 2024-04-18 Bristol-Myers Squibb Company Methods of treating liver diseases
US11141457B1 (en) 2020-12-28 2021-10-12 Amryt Endo, Inc. Oral octreotide therapy and contraceptive methods
WO2022159414A1 (en) 2021-01-22 2022-07-28 University Of Rochester Erythropoietin for gastroinfestinal dysfunction
CN112915106A (zh) * 2021-02-05 2021-06-08 张虎山 一种肿瘤免疫微环境调控剂的制备及其应用
CA3173631A1 (en) 2021-02-12 2022-08-18 Walter C. Voegtli Alkaline phosphatase polypeptides and methods of use thereof
CN114539426B (zh) * 2022-03-02 2023-07-07 山东仙普爱瑞科技股份有限公司 一种含干扰素α的融合蛋白、表达该融合蛋白的重组菌株及其制备方法
EP4442251A1 (en) 2023-04-05 2024-10-09 Albumedix Ltd Formulations and uses thereof

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS62192399A (ja) * 1986-02-15 1987-08-22 ベ−リングヴエルケ・アクチエンゲゼルシヤフト インシユリン誘導体およびそれらの製造方法
JPH07503368A (ja) * 1992-01-31 1995-04-13 ローン−プーラン・ロレ・ソシエテ・アノニム 新規な生物活性ポリペプチド類，ならびにそれらの製造および含有薬学組成物
JPH11501506A (ja) * 1994-12-12 1999-02-09 ベス イスラエル デアコネス メディカル センター キメラ型サイトカインおよびその利用
JP2000502901A (ja) * 1995-12-30 2000-03-14 デルタ、バイオテクノロジー、リミテッド 成長ホルモンおよび血清アルブミンに対する組換え融合タンパク質
WO2001005826A2 (en) * 1999-07-19 2001-01-25 Gpc Biotech Inc. Chimeric polypeptides of serum albumin and uses related thereto
WO2001077317A1 (en) * 2000-04-07 2001-10-18 Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha Method of amplifying nucleic acid by using double-stranded nucleic acid as template
WO2001079258A1 (en) * 2000-04-12 2001-10-25 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins

Family Cites Families (636)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US1172046A (en) * 1915-07-30 1916-02-15 Henry Psencik Plow.
US5625041A (en) 1990-09-12 1997-04-29 Delta Biotechnology Limited Purification of proteins
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
DE2449885C3 (de) 1974-10-21 1980-04-30 Biotest-Serum-Institut Gmbh, 6000 Frankfurt Verfahren zur Herstellung von chemisch modifizierten haltbaren Hämoglobinpräparaten sowie das nach diesem Verfahren hergestellte modifizierte Hämoglobinpräparat
US4002531A (en) 1976-01-22 1977-01-11 Pierce Chemical Company Modifying enzymes with polyethylene glycol and product produced thereby
US4363877B1 (en) 1977-09-23 1998-05-26 Univ California Recombinant dna transfer vectors
US4440859A (en) 1977-05-27 1984-04-03 The Regents Of The University Of California Method for producing recombinant bacterial plasmids containing the coding sequences of higher organisms
US4264731A (en) 1977-05-27 1981-04-28 The Regents Of The University Of California DNA Joining method
US4283489A (en) 1977-09-23 1981-08-11 The Regents Of The University Of California Purification of nucleotide sequences suitable for expression in bacteria
US4407948A (en) 1977-09-23 1983-10-04 The Regents Of The University Of California Purification of nucleotide sequences suitable for expression in bacteria
US4366246A (en) 1977-11-08 1982-12-28 Genentech, Inc. Method for microbial polypeptide expression
US4263428A (en) 1978-03-24 1981-04-21 The Regents Of The University Of California Bis-anthracycline nucleic acid function inhibitors and improved method for administering the same
US4652525A (en) 1978-04-19 1987-03-24 The Regents Of The University Of California Recombinant bacterial plasmids containing the coding sequences of insulin genes
US4447538A (en) 1978-04-19 1984-05-08 Regents Of The University Of California Microorganism containing gene for human chorionic somatomammotropin
US4246731A (en) * 1978-06-12 1981-01-27 Miro Carl F Window frame assembly
US4342832A (en) 1979-07-05 1982-08-03 Genentech, Inc. Method of constructing a replicable cloning vehicle having quasi-synthetic genes
AU538665B2 (en) 1979-10-30 1984-08-23 Juridical Foundation, Japanese Foundation For Cancer Research Human interferon dna
US4444887A (en) 1979-12-10 1984-04-24 Sloan-Kettering Institute Process for making human antibody producing B-lymphocytes
EP0032134B2 (en) 1980-01-08 1993-10-13 Biogen, Inc. Dna sequences, recombinant dna molecules and processes for producing human interferon-alpha like polypeptides
DE3177213D1 (de) 1980-04-03 1990-10-18 Biogen Inc Dns-sequenzen, rekombinante dns-molekuele und verfahren zur herstellung von dem menschlichen fibroblast-interferon.
US4414510A (en) 1980-05-28 1983-11-08 General Electric Company Low cost sensing system and method employing anistropic magneto-resistive ferrite member
DE3023787A1 (de) 1980-06-25 1982-01-21 Studiengesellschaft Kohle mbH, 4330 Mülheim Verfahren zur erhoehung der inkorporation und der expression von genetischem material in die kerne von intakten zellen mit hilfe von liposomen
US6610830B1 (en) 1980-07-01 2003-08-26 Hoffman-La Roche Inc. Microbial production of mature human leukocyte interferons
IT1139487B (it) 1980-09-25 1986-09-24 Genentech Inc Produzione microbica di interferone di fibroblasti umani
ATE12348T1 (de) 1980-11-10 1985-04-15 Gersonde Klaus Prof Dr Verfahren zur herstellung von lipid-vesikeln durch ultraschallbehandlung, anwendung des verfahrens und vorrichtung zur durchfuehrung des verfahrens.
DE3273787D1 (en) 1981-02-04 1986-11-20 Japan Found Cancer Human interferon-beta gene
IE52535B1 (en) 1981-02-16 1987-12-09 Ici Plc Continuous release pharmaceutical compositions
NZ199722A (en) 1981-02-25 1985-12-13 Genentech Inc Dna transfer vector for expression of exogenous polypeptide in yeast;transformed yeast strain
JPS57149228A (en) 1981-03-11 1982-09-14 Ajinomoto Co Inc Novel erythropoietin and its preparation
US4792602A (en) 1981-06-19 1988-12-20 Cornell Research Foundation, Inc. Adaptors, and synthesis and cloning of proinsulin genes
CA1204682A (en) 1981-06-19 1986-05-20 Saran A. Narang Adaptors, and synthesis and cloning of proinsulin genes
US4714681A (en) 1981-07-01 1987-12-22 The Board Of Reagents, The University Of Texas System Cancer Center Quadroma cells and trioma cells and methods for the production of same
US4474893A (en) 1981-07-01 1984-10-02 The University of Texas System Cancer Center Recombinant monoclonal antibodies
US4485045A (en) 1981-07-06 1984-11-27 Research Corporation Synthetic phosphatidyl cholines useful in forming liposomes
DE3129906C3 (de) 1981-07-24 1996-12-19 Schering Ag Paramagnetische Komplexsalze, deren Herstellung und Mittel zur Verwendung bei der NMR-Diagnostik
US4647447A (en) 1981-07-24 1987-03-03 Schering Aktiengesellschaft Diagnostic media
IL66614A (en) 1981-08-28 1985-09-29 Genentech Inc Method of constructing a dna sequence encoding a polypeptide,microbial production of human serum albumin,and pharmaceutical compositions comprising it
AU561343B2 (en) 1981-10-19 1987-05-07 Genentech Inc. Human immune interferon by recombinant dna
EP0079739A3 (en) 1981-11-12 1984-08-08 The Upjohn Company Albumin-based nucleotides, their replication and use, and plasmids for use therein
EP0091527A3 (en) 1981-12-14 1984-07-25 The President And Fellows Of Harvard College Dna sequences, recombinant dna molecules and processes for producing human serum albumin-like polypeptides
JPS58118008A (ja) 1982-01-06 1983-07-13 Nec Corp デ−タ処理装置
WO1983002461A1 (en) 1982-01-19 1983-07-21 Cetus Corp Multiclass hybrid interferons
EP0088046B1 (de) 1982-02-17 1987-12-09 Ciba-Geigy Ag Lipide in wässriger Phase
US4450103A (en) 1982-03-01 1984-05-22 Cetus Corporation Process for recovering human IFN-β from a transformed microorganism
US4775622A (en) 1982-03-08 1988-10-04 Genentech, Inc. Expression, processing and secretion of heterologous protein by yeast
CA1341562C (en) 1982-03-31 2007-11-27 Tadatsugu Taniguchi Gene coded for interleukin-2 polypeptide, recombinant dna carrying the said gene, a living cell line possessing the recombinant dna, and method for producing interleukin-2 using the said cell
DE3377363D1 (en) 1982-03-31 1988-08-18 Ajinomoto Kk Gene coding for interleukin-2 polypeptide, recombinant dna carrying said gene, cell lines possessing the recombinant dna,and method for producing interleukin-2 using said cells
US5824330A (en) 1982-04-20 1998-10-20 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Highly purified interleukin-2 and method
US4925919A (en) 1984-04-25 1990-05-15 Roland Mertelsmann Purified interleukin 2
US4778879A (en) 1982-04-20 1988-10-18 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Highly purified human interleukin 2 and method
US4499188A (en) 1982-05-05 1985-02-12 Cetus Corporation Bacterial production of heterologous polypeptides under the control of a repressible promoter-operator
US6936694B1 (en) 1982-05-06 2005-08-30 Intermune, Inc. Manufacture and expression of large structural genes
DE3218121A1 (de) 1982-05-14 1983-11-17 Leskovar, Peter, Dr.-Ing., 8000 München Arzneimittel zur tumorbehandlung
EP0102324A3 (de) 1982-07-29 1984-11-07 Ciba-Geigy Ag Lipide und Tenside in wässriger Phase
US4716111A (en) 1982-08-11 1987-12-29 Trustees Of Boston University Process for producing human antibodies
US4490289A (en) 1982-09-16 1984-12-25 Hoffmann-La Roche Inc. Homogeneous human interleukin 2
JPS5945835U (ja) 1982-09-16 1984-03-27 株式会社東芝 回路しや断器の消弧装置
US4992271A (en) 1982-09-23 1991-02-12 Cetus Corporation Formulation for lipophilic IL-2 proteins
US4462940A (en) 1982-09-23 1984-07-31 Cetus Corporation Process for the recovery of human β-interferon-like polypeptides
IE56026B1 (en) 1982-10-19 1991-03-27 Cetus Corp Cysteine-depleted muteins of biologically active proteins
US4741900A (en) 1982-11-16 1988-05-03 Cytogen Corporation Antibody-metal ion complexes
DE3382547D1 (de) 1983-01-12 1992-05-27 Chiron Corp Sekretorische expression in eukaryoten.
US4840934A (en) 1983-01-25 1989-06-20 Eleanor Roosevelt Institute For Cancer Research, Inc. Therapeutic method using T cell growth factor
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
DK172738B1 (da) 1983-04-07 1999-06-21 Chiron Corp Fremgangsmåde til at udtrykke modent insulin og DNA-struktur til anvendelse ved fremgangsmåden
US4914026A (en) 1983-04-07 1990-04-03 Chiron Corporation Alpha factor leader sequence directed secretion of insulin
US5015575A (en) 1983-04-07 1991-05-14 Chiron Corporation Hybrid DNA synthesis of insulin
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
JPS60501140A (ja) 1983-04-22 1985-07-25 アムジエン 酵母による外因性ポリペプチドの分泌
NZ207926A (en) 1983-04-25 1988-04-29 Genentech Inc Use of yeast #a#-factor to assist in expression of proteins heterologus to yeast
US5010003A (en) 1983-04-25 1991-04-23 Genentech, Inc. Use of yeast homologous signals to secrete heterologous proteins
CA1196863A (en) 1983-06-08 1985-11-19 Mattheus F.A. Goosen Slow release injectable insulin composition
US4544545A (en) 1983-06-20 1985-10-01 Trustees University Of Massachusetts Liposomes containing modified cholesterol for organ targeting
HUT35524A (en) 1983-08-02 1985-07-29 Hoechst Ag Process for preparing pharmaceutical compositions containing regulatory /regulative/ peptides providing for the retarded release of the active substance
JPS6087792A (ja) 1983-09-23 1985-05-17 ジェネックス・コーポレイション 雑種制御領域
DE3486459D1 (de) 1983-09-26 1997-12-11 Udo Dr Med Ehrenfeld Mittel und Erzeugnis für die Diagnose und Therapie von Tumoren sowie zur Behandlung von Schwächen der zelligen und humoralen Immunabwehr
EP0143949B1 (en) 1983-11-01 1988-10-12 TERUMO KABUSHIKI KAISHA trading as TERUMO CORPORATION Pharmaceutical composition containing urokinase
JPS60115528A (ja) 1983-11-28 1985-06-22 Takeda Chem Ind Ltd ヒトインタ―ロイキン―２蛋白質を含有する抗腫瘍用または免疫機能低下疾患治療用組成物
GB8334102D0 (en) 1983-12-21 1984-02-01 Searle & Co Interferons with cysteine pattern
NZ210501A (en) 1983-12-13 1991-08-27 Kirin Amgen Inc Erythropoietin produced by procaryotic or eucaryotic expression of an exogenous dna sequence
US4855238A (en) 1983-12-16 1989-08-08 Genentech, Inc. Recombinant gamma interferons having enhanced stability and methods therefor
GB8334261D0 (en) 1983-12-22 1984-02-01 Bass Plc Fermentation processes
IT1185503B (it) 1984-01-11 1987-11-12 Univ New York Cloni di odna di eritropietina umana
US4908433A (en) 1984-04-25 1990-03-13 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Uses of interleukin-2
US4908434A (en) 1984-04-25 1990-03-13 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Process for preparing purified interleukin-2
CA1213537A (en) 1984-05-01 1986-11-04 Canadian Patents And Development Limited - Societe Canadienne Des Brevets Et D'exploitation Limitee Polypeptide expression method
DK58285D0 (da) 1984-05-30 1985-02-08 Novo Industri As Peptider samt fremstilling og anvendelse deraf
EP0172619A1 (en) 1984-06-20 1986-02-26 Takeda Chemical Industries, Ltd. Novel transformant and use thereof
US4736866B1 (en) 1984-06-22 1988-04-12 Transgenic non-human mammals
JPS61227526A (ja) 1984-07-25 1986-10-09 Chugai Pharmaceut Co Ltd 新規なコロニー刺激因子
US5807715A (en) 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
US4687659A (en) 1984-11-13 1987-08-18 Salutar, Inc. Diamide-DTPA-paramagnetic contrast agents for MR imaging
US4959314A (en) 1984-11-09 1990-09-25 Cetus Corporation Cysteine-depleted muteins of biologically active proteins
IL77081A (en) 1984-12-04 1999-10-28 Genetics Inst AND sequence encoding human erythropoietin, a process for its preparation and a pharmacological preparation of human erythropoietin
US5049386A (en) 1985-01-07 1991-09-17 Syntex (U.S.A.) Inc. N-ω,(ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω,(ω-1)-dialkenyloxy)Alk-1-YL-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US4897355A (en) 1985-01-07 1990-01-30 Syntex (U.S.A.) Inc. N[ω,(ω-1)-dialkyloxy]- and N-[ω,(ω-1)-dialkenyloxy]-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US4946787A (en) 1985-01-07 1990-08-07 Syntex (U.S.A.) Inc. N-(ω,(ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω,(ω-1)-dialkenyloxy)-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US4677195A (en) 1985-01-11 1987-06-30 Genetics Institute, Inc. Method for the purification of erythropoietin and erythropoietin compositions
US4970300A (en) 1985-02-01 1990-11-13 New York University Modified factor VIII
GB8504099D0 (en) 1985-02-18 1985-03-20 Wellcome Found Physiologically active substances
DK129385A (da) 1985-03-22 1986-09-23 Novo Industri As Peptider og fremstilling deraf
FR2579224B1 (fr) 1985-03-25 1987-05-22 Genetica Procede de preparation microbiologique de la serum-albumine humaine
ATE63757T1 (de) 1985-03-28 1991-06-15 Chiron Corp Expression durch verwendung von fusionsgenen fuer proteinproduktion.
US4751180A (en) 1985-03-28 1988-06-14 Chiron Corporation Expression using fused genes providing for protein product
CA1319120C (en) 1985-04-01 1993-06-15 John Henry Kenten Transformed myeloma cell-line and a process for the expression of a gene coding for a eukaryotic polypeptide employing same
GB8510219D0 (en) 1985-04-22 1985-05-30 Bass Plc Isolation of fermentation products
EP0206733A1 (en) 1985-06-17 1986-12-30 Genex Corporation Cloned human serum albumin gene
US4980286A (en) 1985-07-05 1990-12-25 Whitehead Institute For Biomedical Research In vivo introduction and expression of foreign genetic material in epithelial cells
US4810643A (en) 1985-08-23 1989-03-07 Kirin- Amgen Inc. Production of pluripotent granulocyte colony-stimulating factor
US5102872A (en) 1985-09-20 1992-04-07 Cetus Corporation Controlled-release formulations of interleukin-2
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
JPH0618778B2 (ja) 1985-10-04 1994-03-16 中外製薬株式会社 白血球減少症治療剤
JPS6296086A (ja) 1985-10-21 1987-05-02 Agency Of Ind Science & Technol 複合プラスミド
US5139941A (en) 1985-10-31 1992-08-18 University Of Florida Research Foundation, Inc. AAV transduction vectors
CA1295563C (en) 1985-11-01 1992-02-11 Robert T. Garvin Production of active proteins containing cystine residues
US5576195A (en) 1985-11-01 1996-11-19 Xoma Corporation Vectors with pectate lyase signal sequence
CA1295566C (en) 1987-07-21 1992-02-11 Robert T. Garvin Characterization and structure of genes for protease a and protease b from streptomyces griseus
US5641663A (en) 1985-11-06 1997-06-24 Cangene Corporation Expression system for the secretion of bioactive human granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) and other heterologous proteins from steptomyces
US5013824A (en) * 1985-11-19 1991-05-07 Schering Corporation Human interleukin-4 peptides and conjugates thereof
JPH0780930B2 (ja) 1985-12-26 1995-08-30 三井石油化学工業株式会社 α−オレフインの重合方法
JPH0645551B2 (ja) 1986-01-07 1994-06-15 塩野義製薬株式会社 インタ−ロイキン−２組成物
CA1297005C (en) 1986-01-22 1992-03-10 Masahiko Tamura Pharmaceutical agent for the treatment of myelogenous leukemia
ATE65403T1 (de) 1986-01-22 1991-08-15 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Pharmazeutischer stoff fuer die foerderung der wiederherstellung der haematopoietischen faehigkeit.
US4885363A (en) 1987-04-24 1989-12-05 E. R. Squibb & Sons, Inc. 1-substituted-1,4,7-triscarboxymethyl-1,4,7,10-tetraazacyclododecane and analogs
DE3772785D1 (de) 1986-01-23 1991-10-17 Squibb & Sons Inc 1-substituiertes-4,7,10-triscarboxymethyl-1,4,7,10-tetraazacyclododecan und analoga.
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
FR2594846B1 (fr) 1986-02-21 1989-10-20 Genetica Procede de preparation de la serum albumine humaine mature
EP0237019A3 (en) 1986-03-14 1988-03-09 Toray Industries, Inc. Interferon conjugate and production thereof using recombinant gene
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
IT1203758B (it) 1986-03-27 1989-02-23 Univ Roma Vettori di clonazione e di espressione di geni eterologhi in lieviti e lieviti trasformati con tali vettori
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
DK179286D0 (da) 1986-04-18 1986-04-18 Nordisk Gentofte Insulinpraeparat
US4765980A (en) 1986-04-28 1988-08-23 International Minerals & Chemical Corp. Stabilized porcine growth hormone
US4859609A (en) 1986-04-30 1989-08-22 Genentech, Inc. Novel receptors for efficient determination of ligands and their antagonists or agonists
US5028422A (en) 1986-05-27 1991-07-02 Schering Corporation Treatment of basal cell carcinoma intralesionally with recombinant human alpha interferon
US5985599A (en) 1986-05-29 1999-11-16 The Austin Research Institute FC receptor for immunoglobulin
GB8615701D0 (en) 1986-06-27 1986-08-06 Delta Biotechnology Ltd Stable gene integration vector
IT1196484B (it) 1986-07-11 1988-11-16 Sclavo Spa Vettore ad espressione e secrezione in lieviti,utile per la preparazione di proteine eterologhe
GR871067B (en) 1986-07-18 1987-11-19 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Process for producing stable pharmaceutical preparation containing granulocyte colony stimulating factor
US4857467A (en) 1986-07-23 1989-08-15 Phillips Petroleum Company Carbon and energy source markers for transformation of strains of the genes Pichia
US4801575A (en) 1986-07-30 1989-01-31 The Regents Of The University Of California Chimeric peptides for neuropeptide delivery through the blood-brain barrier
US5002764A (en) 1986-08-12 1991-03-26 Schering Corporation Treatment of actinic keratoses with alpha2 interferon
GB8620926D0 (en) 1986-08-29 1986-10-08 Delta Biotechnology Ltd Yeast promoter
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US4929442A (en) 1986-09-26 1990-05-29 Exovir, Inc. Compositions suitable for human topical application including a growth factor and/or related materials
US5508031A (en) 1986-11-21 1996-04-16 Cetus Oncology Corporation Method for treating biological damage using a free-radial scavenger and interleukin-2
WO1988007057A1 (en) 1987-03-13 1988-09-22 Amgen Inc. Purified platelet-derived growth factor and methods for purification thereof
US4835260A (en) 1987-03-20 1989-05-30 Genetics Institute, Inc. Erythropoietin composition
GB8707398D0 (en) * 1987-03-27 1987-04-29 Coopers Animal Health Biologically active molecules
HU213344B (en) 1987-04-09 1997-05-28 Delta Biotechnology Ltd Process for producing of stable dezintegrating plasmid-vectors
DE3855504T2 (de) 1987-04-22 1997-01-23 Chiron Corp Rekombinante Herstellung von A-Ketten-Polypeptiden von PDGF
US5258498A (en) 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
US5489425A (en) 1987-06-24 1996-02-06 The Dow Chemical Company Functionalized polyamine chelants
US4994560A (en) 1987-06-24 1991-02-19 The Dow Chemical Company Functionalized polyamine chelants and radioactive rhodium complexes thereof for conjugation to antibodies
WO1989000557A1 (en) 1987-07-16 1989-01-26 Cockbain, Julian, Roderick, Michaelson Aminopolycarboxylic acids and derivatives thereof
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
CA1323850C (en) 1987-07-28 1993-11-02 Johannes A. Van Den Berg Kluyveromyces as a host strain
JPH0622784Y2 (ja) 1987-08-04 1994-06-15 東洋シヤッター株式会社 オ−バ−ドア用可動中柱の高さ調整装置
JP2627899B2 (ja) 1987-08-19 1997-07-09 株式会社 ビタミン研究所 遺伝子封入リポソームの製法
SE459586B (sv) 1987-09-14 1989-07-17 Mta Szegedi Biolog Koezponti Strukturgen som kodar foer autentiskt humant serum albumin och foerfarande foer dess framstaellning
US5336603A (en) 1987-10-02 1994-08-09 Genentech, Inc. CD4 adheson variants
NZ226414A (en) 1987-10-02 1992-07-28 Genentech Inc Cd4 peptide adhesion variants and their preparation and use
GB8725529D0 (en) 1987-10-30 1987-12-02 Delta Biotechnology Ltd Polypeptides
JPH0811074B2 (ja) 1987-10-30 1996-02-07 財団法人化学及血清療法研究所 プレアルブミンをコードする遺伝子を組込んだ組換えプラスミドおよびこれを用いたプレアルブミンの製法
GB8726953D0 (en) 1987-11-18 1987-12-23 Delta Biotechnology Ltd Yeast expression system
JP2791418B2 (ja) 1987-12-02 1998-08-27 株式会社ミドリ十字 異種蛋白質の製造方法、組換えｄｎａ、形質転換体
PT89484B (pt) 1988-01-22 1994-03-31 Gen Hospital Corp Genes clonados codificadores de proteinas de fusao ig-cd4 e sua utilizacao
JPH01240191A (ja) 1988-02-16 1989-09-25 Green Cross Corp:The 酵母で機能する新規シグナルペプチドおよびこれを用いた異種蛋白質の分泌発現
JPH01215289A (ja) 1988-02-22 1989-08-29 Toa Nenryo Kogyo Kk 遺伝子組換えによる正常ヒト血清アルブミンａの製造方法
JPH01302543A (ja) 1988-02-26 1989-12-06 Fujitsu Ltd トラッキングエラー検知方法とその検知方法に使用する回折格子・光検知器
US5066489A (en) 1988-03-28 1991-11-19 Cetus Corporation Combination therapy of IL-2 and DTIC for the treatment of melanoma
US4999339A (en) 1988-03-28 1991-03-12 Cetus Corporation Combination therapy of IL-2 and DTIC for the treatment of melanoma
US5763394A (en) * 1988-04-15 1998-06-09 Genentech, Inc. Human growth hormone aqueous formulation
US5096707A (en) 1988-04-15 1992-03-17 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Flavone-8-acetic acid and interleukin-2 in a method of treating certain cancers
US5061488A (en) 1988-04-15 1991-10-29 The United States Of America As Represented Department Of Health & Human Services Flavone-8-acetic acid and interleukin-2 for cancer therapy
US5981485A (en) 1997-07-14 1999-11-09 Genentech, Inc. Human growth hormone aqueous formulation
US5096885A (en) 1988-04-15 1992-03-17 Genentech, Inc. Human growth hormone formulation
GB8809129D0 (en) 1988-04-18 1988-05-18 Celltech Ltd Recombinant dna methods vectors and host cells
IL89992A0 (en) 1988-04-25 1989-12-15 Phillips Petroleum Co Expression of human serum albumin in methylotrophic yeasts
IL89989A0 (en) 1988-04-25 1989-12-15 Phillips Petroleum Co Expression of human interleukin-2 in methylotrophic yeasts
US5126129A (en) 1988-05-23 1992-06-30 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health & Human Services Cancer therapy using interleukin-2 and flavone compounds
DE58906966D1 (de) 1988-06-23 1994-03-24 Hoechst Ag Mini-Proinsulin, seine Herstellung und Verwendung.
CN1033030C (zh) 1988-06-24 1996-10-16 唐化学原料公司 大环双官能螯合剂及其配合物和抗体共轭物的制备方法
NZ229700A (en) 1988-06-24 1993-01-27 Dow Chemical Co Tetraazacyclododecane derivatives containing a linker/spacer moiety capable of forming antibody conjugates; complexes with radionuclides and conjugates of such compounds and complexes with antibodies or antibody fragments
US5756065A (en) 1988-06-24 1998-05-26 The Dow Chemical Company Macrocyclic tetraazacyclododecane conjugates and their use as diagnostic and therapeutic agents
US5274119A (en) 1988-07-01 1993-12-28 The Dow Chemical Company Vicinal diols
EP0387319B1 (en) 1988-07-23 1996-03-06 Delta Biotechnology Limited Secretory leader sequences
US4925648A (en) 1988-07-29 1990-05-15 Immunomedics, Inc. Detection and treatment of infectious and inflammatory lesions
FR2635115B1 (fr) 1988-08-05 1992-04-03 Rhone Poulenc Sante Procede de preparation de la serum albumine humaine a partir d'une levure
FR2649991B2 (fr) 1988-08-05 1994-03-04 Rhone Poulenc Sante Utilisation de derives stables du plasmide pkd1 pour l'expression et la secretion de proteines heterologues dans les levures du genre kluyveromyces
US5601819A (en) 1988-08-11 1997-02-11 The General Hospital Corporation Bispecific antibodies for selective immune regulation and for selective immune cell binding
AU4216689A (en) 1988-08-11 1990-03-05 California Biotechnology, Inc. Method for stabilizing heterologous protein expression and vectors for use therein
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
EP0768377A1 (en) 1988-09-02 1997-04-16 Protein Engineering Corporation Generation and selection of recombinant varied binding proteins
US5260202A (en) 1988-09-07 1993-11-09 Delta Biotechnology Limited Fermentation method
JPH02227079A (ja) 1988-10-06 1990-09-10 Tonen Corp ヒト血清アルブミン断片
US5298243A (en) 1988-10-20 1994-03-29 Denki Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha Colony stimulating factor-gelatin conjugate
US5349052A (en) 1988-10-20 1994-09-20 Royal Free Hospital School Of Medicine Process for fractionating polyethylene glycol (PEG)-protein adducts and an adduct for PEG and granulocyte-macrophage colony stimulating factor
JPH02117384A (ja) 1988-10-26 1990-05-01 Tonen Corp 酵母宿主によるヒト血清アルブミンａの製造
US5759802A (en) 1988-10-26 1998-06-02 Tonen Corporation Production of human serum alubumin A
DE68929151T2 (de) 1988-10-28 2000-07-20 Genentech, Inc. Verfahren zum nachweis von aktiven domänen und aminosäureresten in polypeptiden und hormonvarianten
US5342604A (en) 1988-10-31 1994-08-30 The Dow Chemical Company Complexes possessing ortho ligating functionality
US5696239A (en) 1988-10-31 1997-12-09 The Dow Chemical Company Conjugates possessing ortho ligating functionality and complexes thereof
US5256410A (en) 1988-12-01 1993-10-26 Schering Corporation Treatment of squamous cell carcinoma intralesionally with recombinant human alpha interferon
CA2006596C (en) 1988-12-22 2000-09-05 Rika Ishikawa Chemically-modified g-csf
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
DK105489D0 (da) 1989-03-03 1989-03-03 Novo Nordisk As Polypeptid
US5116964A (en) 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
US5705363A (en) 1989-03-02 1998-01-06 The Women's Research Institute Recombinant production of human interferon τ polypeptides and nucleic acids
JPH04504246A (ja) 1989-03-20 1992-07-30 ザ・ジェネラル・ホスピタル・コーポレーション インシュリン刺激ホルモン
US5693622A (en) 1989-03-21 1997-12-02 Vical Incorporated Expression of exogenous polynucleotide sequences cardiac muscle of a mammal
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
ATE165516T1 (de) 1989-03-21 1998-05-15 Vical Inc Expression von exogenen polynukleotidsequenzen in wirbeltieren
US5231020A (en) 1989-03-30 1993-07-27 Dna Plant Technology Corporation Genetic engineering of novel plant phenotypes
US5328470A (en) 1989-03-31 1994-07-12 The Regents Of The University Of Michigan Treatment of diseases by site-specific instillation of cells or site-specific transformation of cells and kits therefor
ES2034790T3 (es) 1989-04-11 1993-04-01 Boehringer Ingelheim International Gmbh Empleo de al menos una citroquina para la preparacion de un medicamento para el tratamiento sistematico de lesiones preneoplasticas.
EP0395918A3 (en) 1989-04-13 1991-10-23 Vascular Laboratory, Inc. Plasminogen activator complex of pure pro-urokinase covalently bound by a disulfide bridge to human serum albumin
US5324844A (en) 1989-04-19 1994-06-28 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides
ATE92107T1 (de) 1989-04-29 1993-08-15 Delta Biotechnology Ltd N-terminale fragmente von menschliches serumalbumin enthaltenden fusionsproteinen.
US5766883A (en) 1989-04-29 1998-06-16 Delta Biotechnology Limited Polypeptides
GB8909916D0 (en) 1989-04-29 1989-06-14 Delta Biotechnology Ltd Polypeptides
US5332671A (en) 1989-05-12 1994-07-26 Genetech, Inc. Production of vascular endothelial cell growth factor and DNA encoding same
CA2017379C (en) 1989-05-24 2002-06-25 Kenneth A. Thomas, Jr. Purification and characterization of a glioma-derived growth factor
US5808003A (en) 1989-05-26 1998-09-15 Perimmune Holdings, Inc. Polyaminocarboxylate chelators
DE69021335T2 (de) 1989-06-09 1996-04-11 Gropep Pty. Ltd., Adelaide Wachstumshormonfusionsproteine.
ATE144793T1 (de) 1989-06-29 1996-11-15 Medarex Inc Bispezifische reagenzien für die aids-therapie
US5413923A (en) 1989-07-25 1995-05-09 Cell Genesys, Inc. Homologous recombination for universal donor cells and chimeric mammalian hosts
DE3924746A1 (de) 1989-07-26 1991-01-31 Behringwerke Ag Erythropoietin (epo)-peptide und dagegen gerichtete antikoerper
FR2650598B1 (fr) 1989-08-03 1994-06-03 Rhone Poulenc Sante Derives de l'albumine a fonction therapeutique
CU22222A1 (es) 1989-08-03 1995-01-31 Cigb Procedimiento para la expresion de proteinas heterologicas producidas de forma fusionada en escherichia coli, su uso, vectores de expresion y cepas recombinantes
US5073627A (en) 1989-08-22 1991-12-17 Immunex Corporation Fusion proteins comprising GM-CSF and IL-3
WO1991002754A1 (en) 1989-08-22 1991-03-07 Immunex Corporation Fusion proteins comprising gm-csf and il-3
US5436146A (en) 1989-09-07 1995-07-25 The Trustees Of Princeton University Helper-free stocks of recombinant adeno-associated virus vectors
US6063373A (en) * 1989-09-19 2000-05-16 Maxim Pharmaceuticals, Inc. Enhanced activation of NK cells using an NK cell activator and a hydrogen peroxide scavenger or inhibitor
CA1340994C (en) 1989-09-21 2000-05-16 Rudolf Edgar Dr. Falk Treatment of conditions and disease
WO1991005052A1 (en) 1989-09-28 1991-04-18 Leningradsky Gosudarstvenny Universitet Method for obtaining a polypeptide with human-interleukin-2 activity, secreted by yeast cells, saccharomyces cerevisiae
FR2653020B1 (fr) 1989-10-17 1993-03-26 Roussel Uclaf Utilisation d'un polypeptide ayant l'activite de l'interleukine 2 humaine pour la preparation de compositions pharmaceutiques destinees au traitement des leucemies.
US5667986A (en) * 1989-10-18 1997-09-16 Delta Biotechnology Limited Yeast promoter for expressing heterologous polypeptides
GB8924021D0 (en) 1989-10-25 1989-12-13 Celltech Ltd Recombinant dna method and vectors for the use therein
US5676954A (en) 1989-11-03 1997-10-14 Vanderbilt University Method of in vivo delivery of functioning foreign genes
DE69031305T2 (de) 1989-11-03 1998-03-26 Univ Vanderbilt Verfahren zur in vivo-verabreichung von funktionsfähigen fremden genen
DK608589D0 (da) 1989-12-01 1989-12-01 Holm Arne Kemisk fremgangsmaade
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
JPH03201987A (ja) 1989-12-29 1991-09-03 Tonen Corp ヒト血清アルブミン断片
US5116944A (en) 1989-12-29 1992-05-26 Neorx Corporation Conjugates having improved characteristics for in vivo administration
US5780225A (en) 1990-01-12 1998-07-14 Stratagene Method for generating libaries of antibody genes comprising amplification of diverse antibody DNAs and methods for using these libraries for the production of diverse antigen combining molecules
AU7247191A (en) 1990-01-11 1991-08-05 Molecular Affinities Corporation Production of antibodies using gene libraries
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
DE69120146T2 (de) 1990-01-12 1996-12-12 Cell Genesys Inc Erzeugung xenogener antikörper
US5545618A (en) 1990-01-24 1996-08-13 Buckley; Douglas I. GLP-1 analogs useful for diabetes treatment
ATE164852T1 (de) 1990-01-24 1998-04-15 Douglas I Buckley Glp-1-analoga verwendbar in der diabetesbehandlung
JPH04211375A (ja) 1990-02-05 1992-08-03 Ajinomoto Co Inc 合成遺伝子及びそれを用いたヒト血清アルブミンの製造法
US5208018A (en) 1990-03-19 1993-05-04 Brigham And Women's Hospital Treatment of cachexia with interleukin 2
FR2660863B1 (fr) 1990-04-17 1994-01-21 Roussel Uclaf Utilisation d'un polypeptide ayant l'activite de l'interleukine 2 humaine pour preparer une composition pharmaceutique destinee au traitement de cancers primitifs de la plevre.
US5264618A (en) 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
WO1991018088A1 (en) 1990-05-23 1991-11-28 The United States Of America, Represented By The Secretary, United States Department Of Commerce Adeno-associated virus (aav)-based eucaryotic vectors
GB9013017D0 (en) * 1990-06-11 1990-08-01 Mars Uk Ltd Compounds
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
AU650893B2 (en) 1990-07-10 1994-07-07 Boehringer Ingelheim International Gmbh O-glycosylated alpha-2 interferon
US5225341A (en) 1990-07-19 1993-07-06 The Regents Of The University Of California Biologically safe plant transformation system using a ds transposon
US5202239A (en) 1990-08-07 1993-04-13 Scios Nova Inc. Expression of recombinant polypeptides with improved purification
US5071872A (en) 1990-08-14 1991-12-10 The Ohio State University Research Foundation Method for improving interleukin-2 activity using aci-reductone compounds
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
DK0814159T3 (da) 1990-08-29 2005-10-24 Genpharm Int Transgene, ikke-humane dyr, der er i stand til at danne heterologe antistoffer
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
IT1242149B (it) 1990-09-27 1994-02-16 Consiglio Nazionale Ricerche Sequenza di nucleotidi codificante per una proteina umana con proprieta' regolative dell'angiogenesi
US5698426A (en) 1990-09-28 1997-12-16 Ixsys, Incorporated Surface expression libraries of heteromeric receptors
ES2129029T5 (es) 1990-10-05 2005-10-16 Celldex Therapeutics, Inc. Inmunoestimulacion dirigida con reactivos biespecificos.
JPH07108232B2 (ja) 1990-10-09 1995-11-22 エム・ディ・リサーチ株式会社 ペプチド又は蛋白質の製造方法
JPH0638771Y2 (ja) 1990-10-26 1994-10-12 株式会社カンセイ エアバック制御装置
EP0557300B1 (en) 1990-10-29 1997-11-19 Chiron Corporation Bispecific antibodies, method of production, and uses thereof
FR2668368B1 (fr) 1990-10-30 1995-03-10 Roussel Uclaf Utilisation d'un polypeptide ayant l'activite de l'interleukine 2 humaine pour preparer une composition pharmaceutique destinee au traitement des tumeurs malignes epitheliales.
US5173414A (en) 1990-10-30 1992-12-22 Applied Immune Sciences, Inc. Production of recombinant adeno-associated virus vectors
US5353535A (en) 1990-11-05 1994-10-11 Plumly George W Floor type advertising apparatus
US5367080A (en) 1990-11-08 1994-11-22 Sterling Winthrop Inc. Complexing agents and targeting radioactive immunoreagents useful in therapeutic and diagnostic imaging compositions and methods
US5830452A (en) 1990-11-20 1998-11-03 Chiron Corporation Method for enhancing the anti-tumor therapeutic index of interleukin-2
WO1992009690A2 (en) 1990-12-03 1992-06-11 Genentech, Inc. Enrichment method for variant proteins with altered binding properties
US5272070A (en) 1991-03-08 1993-12-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Method for the preparation of cell lines producing Man3 GlcNac 2 asparagine-linked gylcans and cell lines produced thereby
EP0503583A1 (en) 1991-03-12 1992-09-16 Takeda Chemical Industries, Ltd. Composition for sustained release of erythropoietin
EP0506477B1 (en) 1991-03-28 1999-06-23 Merck & Co. Inc. Vascular endothelial cell growth factor C subunit
DK1471142T3 (da) 1991-04-10 2009-03-09 Scripps Research Inst Heterodimere receptor-biblioteker under anvendelse af fagemider
EP0509841A3 (en) 1991-04-18 1993-08-18 Tonen Corporation Co-expression system of protein disulfide isomerase gene and useful polypeptide gene and process for producing the polypeptide using its system
CA2058820C (en) 1991-04-25 2003-07-15 Kotikanyad Sreekrishna Expression cassettes and vectors for the secretion of human serum albumin in pichia pastoris cells
US5330901A (en) 1991-04-26 1994-07-19 Research Corporation Technologies, Inc. Expression of human serum albumin in Pichia pastoris
AU665758B2 (en) 1991-04-26 1996-01-18 Surface Active Limited Novel antibodies, and methods for their use
FR2676070B1 (fr) 1991-04-30 1994-09-30 Rhone Poulenc Rorer Sa Promoteur de levure et son utilisation.
US5646012A (en) 1991-04-30 1997-07-08 Rhone-Poulenc Rorer S.A. Yeast promoter and use thereof
DE69233482T2 (de) 1991-05-17 2006-01-12 Merck & Co., Inc. Verfahren zur Verminderung der Immunogenität der variablen Antikörperdomänen
US5304473A (en) 1991-06-11 1994-04-19 Eli Lilly And Company A-C-B proinsulin, method of manufacturing and using same, and intermediates in insulin production
CA2110799A1 (en) 1991-06-14 1992-12-23 Arnold H. Horwitz Microbially-produced antibody fragments and their conjugates
FR2677996B1 (fr) 1991-06-21 1993-08-27 Rhone Poulenc Rorer Sa Vecteurs de clonage et/ou d'expression preparation et utilisation.
US5851795A (en) 1991-06-27 1998-12-22 Bristol-Myers Squibb Company Soluble CTLA4 molecules and uses thereof
US5844095A (en) 1991-06-27 1998-12-01 Bristol-Myers Squibb Company CTLA4 Ig fusion proteins
WO1993000109A1 (en) 1991-06-28 1993-01-07 Genentech, Inc. Method of stimulating immune response using growth hormone
US5633146A (en) * 1991-07-02 1997-05-27 Rhone-Poulenc Rorer S.A. Method for producing recombinant proteins and host cells used therein
US5223408A (en) 1991-07-11 1993-06-29 Genentech, Inc. Method for making variant secreted proteins with altered properties
JPH05292972A (ja) 1991-07-29 1993-11-09 Tonen Corp 改良された酵母発現系
EP0597010A4 (en) 1991-07-31 1996-12-27 Rhone Poulenc Rorer Int Transgenic protein production.
US5723719A (en) 1991-08-08 1998-03-03 Health Research Inc. Transgenic mouse as model for diseases involving dopaminergic dysfunction
DE4126968A1 (de) 1991-08-14 1993-02-18 Detlev Prof Dr Med Ganten Transgene ratten, die in ihrem genom mindestens ein menschliches gen enthalten, das an der blutdruckregulation beteiligt ist
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
US5641670A (en) 1991-11-05 1997-06-24 Transkaryotic Therapies, Inc. Protein production and protein delivery
US6270989B1 (en) 1991-11-05 2001-08-07 Transkaryotic Therapies, Inc. Protein production and delivery
PT101031B (pt) * 1991-11-05 2002-07-31 Transkaryotic Therapies Inc Processo para o fornecimento de proteinas por terapia genetica
CA2122717C (en) 1991-11-08 2003-07-15 David C. Anderson Hemoglobins as drug delivery agents
ES2313867T3 (es) 1991-12-02 2009-03-16 Medical Research Council Produccion de anticuerpos anti-auto de repertorios de segmentos de anticuerpo expresados en la superficie de fagos.
US6348327B1 (en) * 1991-12-06 2002-02-19 Genentech, Inc. Non-endocrine animal host cells capable of expressing variant proinsulin and processing the same to form active, mature insulin and methods of culturing such cells
US5428139A (en) 1991-12-10 1995-06-27 The Dow Chemical Company Bicyclopolyazamacrocyclophosphonic acid complexes for use as radiopharmaceuticals
WO1993014200A1 (en) 1992-01-07 1993-07-22 Tsi Corporation Transgenic animal models for alzheimer's disease
GB9200417D0 (en) 1992-01-09 1992-02-26 Bagshawe Kenneth D Cytotoxic drug therapy
FR2686620B1 (fr) 1992-01-27 1995-06-23 Rhone Poulenc Rorer Sa Serum-albumine humaine, preparation et utilisation.
FR2686901A1 (fr) 1992-01-31 1993-08-06 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides antithrombotiques, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
FR2686900B1 (fr) * 1992-01-31 1995-07-21 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides ayant une activite de stimulation des colonies de granulocytes, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
DE69332948T2 (de) 1992-03-05 2003-11-27 Board Of Regents, The University Of Texas System Verwendung von Immunokonjugate zur Diagnose und/oder Therapie der vaskularisierten Tumoren
US5230886A (en) 1992-03-18 1993-07-27 Trustees Of Boston University Tumor cell suppression
DK36392D0 (da) 1992-03-19 1992-03-19 Novo Nordisk As Anvendelse af kemisk forbindelse
USRE37302E1 (en) 1992-03-19 2001-07-31 Novo Nordisk A/S Peptide
DK36492D0 (da) 1992-03-19 1992-03-19 Novo Nordisk As Praeparat
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
US5460954A (en) 1992-04-01 1995-10-24 Cheil Foods & Chemicals, Inc. Production of human proinsulin using a novel vector system
US5229109A (en) 1992-04-14 1993-07-20 Board Of Regents, The University Of Texas System Low toxicity interleukin-2 analogues for use in immunotherapy
HU218069B (hu) 1992-06-09 2000-05-28 Hoppe Ag. Kilincses zárrendszer
AU671117B2 (en) 1992-06-15 1996-08-15 Scios Inc. Glucagon-like peptide and insulinotropin derivatives
US5686268A (en) * 1992-06-19 1997-11-11 Pfizer Inc. Fused proteins
US5505931A (en) 1993-03-04 1996-04-09 The Dow Chemical Company Acid cleavable compounds, their preparation and use as bifunctional acid-labile crosslinking agents
FR2694294B1 (fr) 1992-07-30 1994-09-09 Rhone Poulenc Rorer Sa Promoteur de levure et son utilisateur.
CA2489978A1 (en) 1992-07-31 1994-02-17 Genentech, Inc. Human growth hormone aqueous formulation
US5602307A (en) 1992-08-12 1997-02-11 Baylor College Of Medicine Non-human animal having predefined allele of a cellular adhesion gene
DE4244915C2 (de) 1992-08-14 1998-12-03 Widmar Prof Dr Tanner DNA-Moleküle codierend Proteine, die an der O-Glykosylierung von Proteinen beteiligt sind
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
US5728553A (en) * 1992-09-23 1998-03-17 Delta Biotechnology Limited High purity albumin and method of producing
US5731490A (en) 1992-09-29 1998-03-24 The Ontario Cancer Institute Mutant mouse lacking the expression of interferon regulatory factor 1 (IRF-1)
AU5171293A (en) 1992-10-14 1994-05-09 Regents Of The University Of Colorado, The Ion-pairing of drugs for improved efficacy and delivery
FR2697752B1 (fr) * 1992-11-10 1995-04-14 Rhone Poulenc Rorer Sa Compositions antitumorales contenant des dérivés du taxane.
TW402639B (en) 1992-12-03 2000-08-21 Transkaryotic Therapies Inc Protein production and protein delivery
US5478745A (en) 1992-12-04 1995-12-26 University Of Pittsburgh Recombinant viral vector system
US5441050A (en) 1992-12-18 1995-08-15 Neoprobe Corporation Radiation responsive surgical instrument
US6221958B1 (en) * 1993-01-06 2001-04-24 Societe De Conseils De Recherches Et D'applications Scientifiques, Sas Ionic molecular conjugates of biodegradable polyesters and bioactive polypeptides
US5489743A (en) 1993-01-19 1996-02-06 Amgen Inc. Transgenic animal models for thrombocytopenia
US5593972A (en) 1993-01-26 1997-01-14 The Wistar Institute Genetic immunization
US5441734A (en) 1993-02-25 1995-08-15 Schering Corporation Metal-interferon-alpha crystals
US5780021A (en) 1993-03-05 1998-07-14 Georgetown University Method for treating type 1 diabetes using α-interferon and/or β-i
US6284727B1 (en) 1993-04-07 2001-09-04 Scios, Inc. Prolonged delivery of peptides
NZ250844A (en) 1993-04-07 1996-03-26 Pfizer Treatment of non-insulin dependant diabetes with peptides; composition
WO1994024160A2 (en) 1993-04-21 1994-10-27 Brigham And Women's Hospital Erythropoietin muteins with enhanced activity
GB9308581D0 (en) 1993-04-26 1993-06-09 Univ Manitoba A method for induction of antigen-specific suppression of immune-response
US5910488A (en) 1993-06-07 1999-06-08 Vical Incorporated Plasmids suitable for gene therapy
DK82893D0 (da) * 1993-07-08 1993-07-08 Novo Nordisk As Peptid
US5512459A (en) 1993-07-20 1996-04-30 Bionebraska, Inc. Enzymatic method for modification or recombinant polypeptides
CA2168584C (en) 1993-08-09 2008-10-14 Edward Baral A method for sensitization of cancer cells for killer cell mediated lysis
IL192290A0 (en) 1993-08-17 2008-12-29 Kirin Amgen Inc Erythropoietin analogs
GB9317618D0 (en) 1993-08-24 1993-10-06 Royal Free Hosp School Med Polymer modifications
WO1995005848A1 (en) 1993-08-24 1995-03-02 Novo Nordisk A/S Protracted glp-1
US5521086A (en) 1993-09-16 1996-05-28 Cephalon, Inc. Secretion sequence for the production of a heterologous protein in yeast
US5643575A (en) 1993-10-27 1997-07-01 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5459031A (en) 1993-11-05 1995-10-17 Amgen Inc. Methods for controlling sialic acid derivatives in recombinant glycoproteins
WO1995015982A2 (en) 1993-12-08 1995-06-15 Genzyme Corporation Process for generating specific antibodies
CA2137206A1 (en) 1993-12-09 1995-06-10 John A. Galloway Glucagon-like insulinotropic peptides, compositions and methods
US5705483A (en) 1993-12-09 1998-01-06 Eli Lilly And Company Glucagon-like insulinotropic peptides, compositions and methods
WO1995016708A1 (en) 1993-12-17 1995-06-22 Novo Nordisk A/S Proinsulin-like compounds
DK144093D0 (ja) 1993-12-23 1993-12-23 Novo Nordisk As
EP1231268B1 (en) 1994-01-31 2005-07-27 Trustees Of Boston University Polyclonal antibody libraries
GB9404270D0 (en) 1994-03-05 1994-04-20 Delta Biotechnology Ltd Yeast strains and modified albumins
US6608182B1 (en) 1994-03-08 2003-08-19 Human Genome Sciences, Inc. Human vascular endothelial growth factor 2
US5652352A (en) 1994-03-31 1997-07-29 Amgen Inc. Afamin: a human serum albumin-like gene
US5629286A (en) 1994-03-31 1997-05-13 Brewitt; Barbara Homeopathic dilutions of growth factors
US5646113A (en) 1994-04-07 1997-07-08 Genentech, Inc. Treatment of partial growth hormone insensitivity syndrome
FR2719593B1 (fr) 1994-05-06 1996-05-31 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur préparation et composition pharmaceutique les contenant.
GB9409496D0 (en) 1994-05-12 1994-06-29 London Health Ass Method for improving glycaemic control in diabetes
GB9411356D0 (en) 1994-06-07 1994-07-27 Delta Biotechnology Ltd Yeast strains
US5516637A (en) 1994-06-10 1996-05-14 Dade International Inc. Method involving display of protein binding pairs on the surface of bacterial pili and bacteriophage
US5985660A (en) 1994-06-15 1999-11-16 Systemix, Inc. Method of identifying biological response modifiers involved in dendritic and/or lymphoid progenitor cell proliferation and/or differentiation
US5639642A (en) 1994-06-16 1997-06-17 Novo Nordisk A/S Synthetic leader peptide sequences
US5623054A (en) 1994-06-23 1997-04-22 The General Hospital Corporation Crucifer AFT proteins and uses thereof
CN1180843C (zh) 1994-07-27 2004-12-22 昆士兰医学研究所 多表位疫苗
JPH0851982A (ja) 1994-08-11 1996-02-27 Asahi Glass Co Ltd ヒト血清アルブミンをコードする改変された遺伝子
JPH0853500A (ja) 1994-08-11 1996-02-27 Asahi Glass Co Ltd 融合タンパク質および該タンパク質をコードする遺伝子
JPH0859509A (ja) 1994-08-16 1996-03-05 Teijin Ltd サイトメガロウイルス抗原血症治療剤およびサイトメガロウイルス感染症治療剤
US5574008A (en) 1994-08-30 1996-11-12 Eli Lilly And Company Biologically active fragments of glucagon-like insulinotropic peptide
US6071923A (en) 1994-09-16 2000-06-06 Bar-Ilan University Retinoyloxy aryl-substituted alkylene butyrates useful for the treatment of cancer and other proliferative diseases
US5512549A (en) 1994-10-18 1996-04-30 Eli Lilly And Company Glucagon-like insulinotropic peptide analogs, compositions, and methods of use
DE69434988T2 (de) 1994-11-07 2008-03-06 Human Genome Sciences, Inc. Tumornekrose-faktor-gamma
FR2726471B1 (fr) 1994-11-07 1997-01-31 Pf Medicament Procede pour ameliorer l'immunogenicite d'un compose immunogene ou d'un haptene et application a la preparation de vaccins
FR2726576B1 (fr) 1994-11-07 1997-01-31 Pf Medicament Production de peptides analogues de peptides hydrophobes, peptide recombinant, sequence d'adn correspondante
AT403167B (de) 1994-11-14 1997-11-25 Immuno Ag Selektion und expression von fremdproteinen mittels eines selektions-amplifikations-systems
AU4415796A (en) 1994-12-07 1996-06-26 Bionebraska, Inc. Production of c-terminal amidated peptides from recombinant protein constructs
AU700605B2 (en) 1994-12-07 1999-01-07 Bionebraska, Inc. Production of peptides using recombinant fusion protein constructs
US20010006943A1 (en) 1994-12-23 2001-07-05 Ejvind Jensen Protracted GLP-1 compositions
ATE234625T1 (de) 1994-12-23 2003-04-15 Novo Nordisk As Glp-1 zusammensetzungen mit verlängerter wirkdauer
US5652224A (en) 1995-02-24 1997-07-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods and compositions for gene therapy for the treatment of defects in lipoprotein metabolism
US5928939A (en) 1995-03-01 1999-07-27 Ludwig Institute For Cancer Research Vascular endothelial growth factor-b and dna coding therefor
JP2758154B2 (ja) 1995-04-06 1998-05-28 エフ・ホフマン−ラ ロシユ アーゲー インターフェロンを含む液体製剤
US6184201B1 (en) 1995-04-14 2001-02-06 Nps Allelix Corp. Intestinotrophic glucagon-like peptide-2 analogs
EP0822984A4 (en) 1995-04-27 2000-05-03 Human Genome Sciences Inc TUMOR NECROSIS FACTOR RECEPTORS IN MEN
EP1709970A1 (en) 1995-04-27 2006-10-11 Abgenix, Inc. Human antibodies against EGFR, derived from immunized xenomice
AU2466895A (en) 1995-04-28 1996-11-18 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
IL118127A0 (en) 1995-05-05 1996-09-12 Lilly Co Eli Single chain insulin with high bioactivity
US5728915A (en) 1995-05-08 1998-03-17 Children's Hospital, Inc. Transgenic mice which express simian SV 40 T-antigen under control of the retinoblastoma gene promoter
US6387365B1 (en) 1995-05-19 2002-05-14 Schering Corporation Combination therapy for chronic hepatitis C infection
US5741815A (en) * 1995-06-02 1998-04-21 Lai; Ching-San Methods for in vivo reduction of nitric oxide levels and compositions useful therefor
US5804162A (en) 1995-06-07 1998-09-08 Alliance Pharmaceutical Corp. Gas emulsions stabilized with fluorinated ethers having low Ostwald coefficients
US5728707A (en) * 1995-07-21 1998-03-17 Constantia Gruppe Treatment and prevention of primary and metastatic neoplasms with salts of aminoimidazole carboxamide
US5811097A (en) 1995-07-25 1998-09-22 The Regents Of The University Of California Blockade of T lymphocyte down-regulation associated with CTLA-4 signaling
JPH0940699A (ja) * 1995-07-28 1997-02-10 Sanwa Kagaku Kenkyusho Co Ltd ポリペプチド及びその用途
US5840542A (en) 1995-07-28 1998-11-24 Mogam Biotechnology Research Institute Method for manufacture of proinsulin with high export yield
DE19530865A1 (de) 1995-08-22 1997-02-27 Michael Dr Med Nauck Wirkstoff sowie Mittel zur parenteralen Ernährung
JPH0995455A (ja) 1995-09-29 1997-04-08 Sumitomo Pharmaceut Co Ltd 腎機能改善剤
US5766620A (en) * 1995-10-23 1998-06-16 Theratech, Inc. Buccal delivery of glucagon-like insulinotropic peptides
US5849322A (en) 1995-10-23 1998-12-15 Theratech, Inc. Compositions and methods for buccal delivery of pharmaceutical agents
US5702717A (en) 1995-10-25 1997-12-30 Macromed, Inc. Thermosensitive biodegradable polymers based on poly(ether-ester)block copolymers
AU7473096A (en) 1995-11-02 1997-05-22 Schering Corporation Continuous low-dose cytokine infusion therapy
US6048964A (en) 1995-12-12 2000-04-11 Stryker Corporation Compositions and therapeutic methods using morphogenic proteins and stimulatory factors
JP3533857B2 (ja) * 1995-12-25 2004-05-31 富士レビオ株式会社 梅毒トレポネマ融合抗原及び該融合抗原を用いた抗梅毒トレポネマ抗体の測定方法
US6110707A (en) 1996-01-19 2000-08-29 Board Of Regents, The University Of Texas System Recombinant expression of proteins from secretory cell lines
US6087129A (en) 1996-01-19 2000-07-11 Betagene, Inc. Recombinant expression of proteins from secretory cell lines
EP0910578A2 (en) 1996-01-19 1999-04-28 The Board Of Regents, The University Of Texas System Recombinant expression of proteins from secretory cell lines
US5767097A (en) * 1996-01-23 1998-06-16 Icn Pharmaceuticals, Inc. Specific modulation of Th1/Th2 cytokine expression by ribavirin in activated T-lymphocytes
US6150337A (en) 1996-01-23 2000-11-21 Icn Pharmaceuticals, Inc. Specific modulation of Th1/Th2 cytokine expression by Ribavirin in activated T-lymphocytes
JP2978435B2 (ja) 1996-01-24 1999-11-15 チッソ株式会社 アクリロキシプロピルシランの製造方法
US5616724A (en) 1996-02-21 1997-04-01 Cephalon, Inc. Fused pyrrolo[2,3-c]carbazole-6-ones
US6045788A (en) * 1996-02-28 2000-04-04 Cornell Research Foundation, Inc. Method of stimulation of immune response with low doses of IL-2
DE19639601A1 (de) 1996-02-28 1997-09-04 Bayer Ag Parapockenviren, die Fremd-DNA enthalten, ihre Herstellung und ihre Verwendung in Impfstoffen
US5912229A (en) 1996-03-01 1999-06-15 Novo Nordisk Als Use of a pharmaceutical composition comprising an appetite-suppressing peptide
DK1975177T3 (da) 1996-03-01 2011-07-25 Novo Nordisk As Appetitundertrykkende peptid, formuleringer dermed og anvendelse deraf
JP3794748B2 (ja) * 1996-03-04 2006-07-12 第一アスビオファーマ株式会社 メタノール代謝系を有する微生物の培養法
WO1997033904A1 (en) 1996-03-12 1997-09-18 Human Genome Sciences, Inc. Death domain containing receptors
DK0889949T3 (da) 1996-03-13 2003-09-22 Delta Biotechnology Ltd Fermenteringskontrol
AU5711196A (en) 1996-03-14 1997-10-01 Human Genome Sciences, Inc. Apoptosis inducing molecule i
WO1997034997A1 (en) 1996-03-21 1997-09-25 Human Genome Sciences, Inc. Human endometrial specific steroid-binding factor i, ii and iii
JP2000508522A (ja) 1996-03-22 2000-07-11 ヒューマン・ジェノム・サイエンシズ・インコーポレイテッド アポトーシス誘導分子ｉｉ
WO1997039132A1 (en) 1996-04-16 1997-10-23 University Of Miami Stabilized preparations of human troponins and modifications thereof, diagnostic assay methods and assay kits
US5919815A (en) 1996-05-22 1999-07-06 Neuromedica, Inc. Taxane compounds and compositions
JP4172726B2 (ja) 1996-05-22 2008-10-29 ルイトポルド・ファーマシューティカルズ・インコーポレーテッド シス―ドコサヘキサエン酸とドセタキセルとの共有複合体を含有する製剤
US6300065B1 (en) * 1996-05-31 2001-10-09 Board Of Trustees Of The University Of Illinois Yeast cell surface display of proteins and uses thereof
ES2150832B1 (es) 1996-06-12 2001-06-16 Fichtel & Sachs Ag Dispositivo de maniobra para la maniobra, en particular maniobra neumatica, de un embrague de friccion.
US6110891A (en) 1996-06-21 2000-08-29 Alizyme Therapeutics Ltd. Lectin compositions and uses thereof
GB2318352A (en) 1996-06-25 1998-04-22 Dejan Markovic Polypeptides mimicking the activity of human erythropoietin
GB9613858D0 (en) 1996-07-02 1996-09-04 Cortecs Ltd Hydrophobic preparations
US5932547A (en) 1996-07-03 1999-08-03 Alza Corporation Non-aqueous polar aprotic peptide formulations
US6110703A (en) 1996-07-05 2000-08-29 Novo Nordisk A/S Method for the production of polypeptides
ES2242227T5 (es) 1996-07-15 2011-12-09 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Nuevo factor de tipo vegf.
PE99498A1 (es) 1996-07-26 1999-01-21 Novartis Ag Polipeptidos de fusion
EP0918859A1 (en) * 1996-08-02 1999-06-02 ZymoGenetics, Inc. Testis-specific insulin homolog polypeptides
EP0920505B1 (en) 1996-08-16 2008-06-04 Schering Corporation Mammalian cell surface antigens; related reagents
EP2025682A3 (en) 1996-08-16 2009-06-17 Human Genome Sciences, Inc. Human endokine alpha
ES2251740T3 (es) 1996-08-23 2006-05-01 Ludwig Institute For Cancer Research Factor de crecimiento de celulas de endotelio vascular d recombinante (vegf-d).
US6458924B2 (en) 1996-08-30 2002-10-01 Novo Nordisk A/S Derivatives of GLP-1 analogs
US6006753A (en) 1996-08-30 1999-12-28 Eli Lilly And Company Use of GLP-1 or analogs to abolish catabolic changes after surgery
US6277819B1 (en) * 1996-08-30 2001-08-21 Eli Lilly And Company Use of GLP-1 or analogs in treatment of myocardial infarction
US5922761A (en) 1996-09-06 1999-07-13 Medinox, Inc. Methods for in vivo reduction of iron levels and compositions useful therefor
WO1998011136A1 (en) 1996-09-09 1998-03-19 Novo Nordisk A/S A cDNA AND PEPTIDE WITH RELATION TO CANCER AND WEIGHT LOSS
US20020052309A1 (en) 1996-09-11 2002-05-02 Athanasius A. Anagnostou Method of treating endothelial injury
WO1998012344A1 (en) 1996-09-18 1998-03-26 Human Genome Sciences, Inc. Human tumor necrosis factor receptor-like genes
US5916771A (en) 1996-10-11 1999-06-29 Abgenix, Inc. Production of a multimeric protein by cell fusion method
US5955508A (en) * 1996-10-15 1999-09-21 Loyola University Of Chicago Method for the enhancement of lymphocyte activity against opportunistic microbial pathogens
WO1998017281A1 (en) 1996-10-24 1998-04-30 Vion Pharmaceuticals, Inc. MONOPHOSPHATE PRODRUGS OF β-L-FD4C AND β-L-FddC AS POTENT ANTIVIRAL AGENTS
ATE302272T1 (de) 1996-10-25 2005-09-15 Human Genome Sciences Inc Neutrokin alpha
US5908830A (en) 1996-10-31 1999-06-01 Merck & Co., Inc. Combination therapy for the treatment of diabetes and obesity
EP1306092A3 (en) 1996-11-05 2003-05-07 Eli Lilly & Company Use of GLP-1 and analogs administered peripherally, in regulation of obesity
UA65549C2 (uk) 1996-11-05 2004-04-15 Елі Ліллі Енд Компані Спосіб регулювання ожиріння шляхом периферійного введення аналогів та похідних glp-1 (варіанти) та фармацевтична композиція
ATE366584T1 (de) 1996-11-12 2007-08-15 Novo Nordisk As Verwendung von glp-1 peptiden
CA2273194C (en) 1996-12-03 2011-02-01 Abgenix, Inc. Transgenic mammals having human ig loci including plural vh and vk regions and antibodies produced therefrom
US6130248A (en) 1996-12-30 2000-10-10 Bar-Ilan University Tricarboxylic acid-containing oxyalkyl esters and uses thereof
US5833994A (en) 1997-01-08 1998-11-10 Paracelsian, Inc. Use of the AH receptor and AH receptor ligands to treat or prevent cytopathicity of viral infection
DE69837996T2 (de) 1997-01-14 2008-02-28 Human Genome Sciences, Inc. Tumornekrosefaktor-rezeptoren 6 alpha& 6 beta
US6261801B1 (en) 1997-01-14 2001-07-17 Human Genome Sceineces, Inc. Nucleic acids encoding tumor necrosis factor receptor 5
EP0954589A1 (en) * 1997-01-24 1999-11-10 Novo Nordisk A/S Synthetic leader peptide sequences
WO1998032856A1 (en) 1997-01-28 1998-07-30 Human Genome Sciences, Inc. Death domain containing receptor 4 (dr4: death receptor 4), member of the tnf-receptor superfamily and binding to trail (ap02-l)
JP2001508783A (ja) 1997-01-29 2001-07-03 ポリマスク・ファーマシューティカルズ・パブリック・リミテッド・カンパニー Ｐｅｇ化法
AU746826B2 (en) 1997-02-13 2002-05-02 Regents Of The University Of California, The Production of mature proteins in plants
US7026447B2 (en) * 1997-10-09 2006-04-11 Human Genome Sciences, Inc. 53 human secreted proteins
US6110970A (en) 1997-03-11 2000-08-29 Beacon Laboratories, Inc. Nitrogen-containing oxyalkylene esters and uses thereof
US6124495A (en) 1997-03-11 2000-09-26 Beacon Laboratories, Inc. Unsaturated oxyalkylene esters and uses thereof
US5939455A (en) 1997-03-11 1999-08-17 Beacon Laboratories, Inc. Therapeutic augmentation of oxyalkylene diesters and butyric acid derivatives
US6110955A (en) 1997-03-11 2000-08-29 Beacon Laboratories, Inc. Metabolically stabilized oxyalkylene esters and uses thereof
US6030961A (en) * 1997-03-11 2000-02-29 Bar-Ilan Research & Development Co., Ltd. Oxyalkylene phosphate compounds and uses thereof
US5846774A (en) 1997-03-21 1998-12-08 Bionebraska, Inc. Chlorella virus promoters
US6627729B1 (en) * 1997-03-24 2003-09-30 Zymogenetics, Inc. TML peptides
JP2002510193A (ja) 1997-03-31 2002-04-02 イーライ・リリー・アンド・カンパニー グルカゴン様ペプチド−１類似体
TR199902553T2 (xx) 1997-04-14 2000-03-21 Micromet Gesellschaft F�R Biomedizinische Forschung Mbh �nsan v�cuduna kar�� antijen resept�rlerinin �retimi i�in yeni metod ve kullan�mlar�.
AR012448A1 (es) 1997-04-18 2000-10-18 Ipsen Pharma Biotech Composicion en forma de microcapsulas o de implantes que comprende un excipiente biodegradable, polimero o co-polimero, o una mezcla de talesexcipientes, y una sustancia activa o una mezcla de sustancias activas, procedimiento para la preparacion de una sustancia soluble en agua de elevada
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
WO1998050347A1 (en) 1997-05-05 1998-11-12 The Regents Of The University Of California Naphthols useful in antiviral methods
CA2292790A1 (en) 1997-05-30 1998-12-03 Human Genome Sciences, Inc. Human tumor necrosis factor receptor tr10
US6071743A (en) 1997-06-02 2000-06-06 Subsidiary No. 3, Inc. Compositions and methods for inhibiting human immunodeficiency virus infection by down-regulating human cellular genes
AU7830398A (en) 1997-06-11 1998-12-30 Human Genome Sciences, Inc. Human tumor necrosis factor receptor tr9
GB9713412D0 (en) 1997-06-26 1997-08-27 Delta Biotechnology Ltd Improved protein expression strains
DE69726571T2 (de) 1997-09-01 2004-11-04 Aventis Pharma Deutschland Gmbh Rekombinantes humanes Erythropoietin mit vorteilhaftem Glykosylierungsmuster
JP3201987B2 (ja) 1997-09-09 2001-08-27 株式会社オーレック 草刈装置
HUP9701554D0 (en) 1997-09-18 1997-11-28 Human Oltoanyagtermeloe Gyogys Pharmaceutical composition containing plazma proteins
US6172046B1 (en) * 1997-09-21 2001-01-09 Schering Corporation Combination therapy for eradicating detectable HCV-RNA in patients having chronic Hepatitis C infection
US6472373B1 (en) 1997-09-21 2002-10-29 Schering Corporation Combination therapy for eradicating detectable HCV-RNA in antiviral treatment naive patients having chronic hepatitis C infection
DK1136075T3 (da) 1997-09-21 2003-04-28 Schering Corp Kombinationsterapi til udryddelse aff detekterbart HCV-RNA i patienter med kronisk hepatitis C infektion
PT1017413E (pt) 1997-09-23 2003-02-28 Rentschler Biotech Gmbh Formulacoes liquidas de interferao (beta)
US6117949A (en) 1998-10-01 2000-09-12 Macromed, Inc. Biodegradable low molecular weight triblock poly (lactide-co-glycolide) polyethylene glycol copolymers having reverse thermal gelation properties
US6201072B1 (en) * 1997-10-03 2001-03-13 Macromed, Inc. Biodegradable low molecular weight triblock poly(lactide-co- glycolide) polyethylene glycol copolymers having reverse thermal gelation properties
US6004573A (en) 1997-10-03 1999-12-21 Macromed, Inc. Biodegradable low molecular weight triblock poly(lactide-co-glycolide) polyethylene glycol copolymers having reverse thermal gelation properties
JP2001519179A (ja) 1997-10-09 2001-10-23 ヒューマン ジノーム サイエンシーズ， インコーポレイテッド ５３個のヒト分泌タンパク質
KR20010031713A (ko) 1997-11-03 2001-04-16 벤슨 로버트 에이치. 맥관형성 및 종양 성장 억제제인 맥관 내피 세포 성장억제제
TR200001580T2 (tr) 1997-12-03 2000-12-21 Roche Diagnostics Gmbh Spesifik etkinliği yüksek eritropoyetin
EP1049486A4 (en) 1997-12-05 2006-01-04 Lilly Co Eli GLP-1 FORMULATIONS
ES2216335T3 (es) * 1997-12-08 2004-10-16 Bristol-Myers Squibb Company Nuevas sales de metformina y procedimiento.
DE69824039T2 (de) 1997-12-08 2005-08-18 Lexigen Pharmaceuticals Corp., Lexington Heterodimäre fusionsproteine zur verwendung für gezielte immuntherapie und allgemeine immunerregung
US6380357B2 (en) 1997-12-16 2002-04-30 Eli Lilly And Company Glucagon-like peptide-1 crystals
KR100253916B1 (ko) 1997-12-29 2000-05-01 김충환 사람 인슐린 전구체의 제조방법
US5951996A (en) 1998-02-04 1999-09-14 Czeizler Zaharia; Veronica L. Treatment of chronic diffuse GI bleeding with erythropoietin
US6221378B1 (en) * 1998-02-10 2001-04-24 Generex Pharmaceuticals Incorporated Mixed micellar delivery system and method of preparation
US6017545A (en) * 1998-02-10 2000-01-25 Modi; Pankaj Mixed micellar delivery system and method of preparation
JP4677095B2 (ja) 1998-02-13 2011-04-27 アミリン・ファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド エキセンジンおよびｇｌｐ−１の変力および利尿効果
JP2002512175A (ja) 1998-02-27 2002-04-23 ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ Ｇｌｐ−１類似体の誘導体類
EP1056774A1 (en) * 1998-02-27 2000-12-06 Novo Nordisk A/S N-terminally truncated glp-1 derivatives
WO1999047160A1 (en) 1998-03-13 1999-09-23 Novo Nordisk A/S Stabilized aqueous peptide solutions
AU3087599A (en) 1998-03-19 1999-10-11 Bionebraska, Inc. Human appetite control by glucagon-like peptide receptor binding compounds
DE19813802A1 (de) 1998-03-27 1999-11-11 Retro Tech Gmbh Anti-virale Wirkung von Propolis durch Inhibition viraler Nukleinsäure Polymerasen
WO1999053064A2 (en) 1998-04-13 1999-10-21 Modex Therapeutiques, S.A. Methods of delivering glp-1
CA2270320A1 (en) 1998-04-28 1999-10-28 Patricia Lee Brubaker Novel microsphere composition
US6251868B1 (en) 1998-04-30 2001-06-26 Teijin Limited Method for treating a human immunodeficiency virus infection
CN1119352C (zh) 1998-05-15 2003-08-27 中国科学院上海生物化学研究所 人血清白蛋白在毕赤酵母中的表达与纯化
JP5281726B2 (ja) 1998-05-15 2013-09-04 メルク・シャープ・アンド・ドーム・コーポレーション 慢性Ｃ型肝炎感染を有する、抗ウイルス処置を受けていない患者における、リバビリンおよびインターフェロンαを含む併用療法
SE9802080D0 (sv) 1998-06-11 1998-06-11 Hellstroem Pharmaceutical composition for the treatment of functional dyspepsia and/or irritable bowel syndrome and new use of substances therein
TR200100079T2 (tr) 1998-06-12 2001-06-21 Bionebraska, Inc. Glikoza karşı ß-hücre tepkisini arttıran glukagon benzeri peptid-1
EP1088084B1 (en) * 1998-06-15 2006-09-13 GTC Biotherapeutics, Inc. Erythropoietin analog-human serum albumin fusion protein
CN1105727C (zh) 1998-06-17 2003-04-16 上海海济医药生物工程有限公司 重组人血清白蛋白的生产方法
BR9911457A (pt) 1998-06-24 2001-12-11 Univ Emory Uso de 3'-azida-2', 3'-dideoxiuridina em combinaçãocom drogas anti-hiv adicionais para a manufaturade um medicamento para o tratamento de hiv
CA2336112A1 (en) 1998-06-30 2000-01-13 Flemming Manique Seeding crystals for the preparation of peptides or proteins
AU8508398A (en) 1998-07-15 2000-02-07 Wisconsin Alumni Research Foundation Treatment of diabetes with synthetic beta cells
EP1306091A3 (en) 1998-07-31 2003-05-21 Novo Nordisk A/S Stimulation of beta cell proliferation
GB9817084D0 (en) 1998-08-06 1998-10-07 Wood Christopher B A method for promoting extra-heptic production of proteins for the correction of hypoalbuminaemia,anaemia,thrombocytopenia and/or coagulation disorders
US7056734B1 (en) 1998-08-10 2006-06-06 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services, Nih Differentiation of non-insulin producing cells into insulin producing cells by GLP-1 or exendin-4 and uses thereof
US6346543B1 (en) * 1998-08-17 2002-02-12 Aventis Pharma S.A. Use of a taxoid to treat abnormal cell proliferation in the brain
WO2000012116A1 (en) 1998-08-28 2000-03-09 Eli Lilly And Company Method for administering insulinotropic peptides
MY155270A (en) 1998-09-24 2015-09-30 Lilly Co Eli Use of glp-1 or analogs in treatment of stroke
US6193997B1 (en) * 1998-09-27 2001-02-27 Generex Pharmaceuticals Inc. Proteinic drug delivery system using membrane mimetics
US6290987B1 (en) 1998-09-27 2001-09-18 Generex Pharmaceuticals, Inc. Mixed liposome pharmaceutical formulation with amphiphiles and phospholipids
US6284725B1 (en) 1998-10-08 2001-09-04 Bionebraska, Inc. Metabolic intervention with GLP-1 to improve the function of ischemic and reperfused tissue
US7259136B2 (en) * 1999-04-30 2007-08-21 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treating peripheral vascular disease
US6429197B1 (en) 1998-10-08 2002-08-06 Bionebraska, Inc. Metabolic intervention with GLP-1 or its biologically active analogues to improve the function of the ischemic and reperfused brain
WO2000023094A2 (en) 1998-10-16 2000-04-27 Immunex Corporation Methods of inhibiting platelet activation and recruitment
SI1813624T1 (sl) 1998-10-23 2010-12-31 Amgen Inc Postopki in sestavki za prepeäśevanje in zdravljenje anemije
CN1325443A (zh) 1998-10-30 2001-12-05 诺沃奇梅兹有限公司 具有减弱的变应原性的糖基化蛋白
JP2002531089A (ja) 1998-11-30 2002-09-24 イーライ・リリー・アンド・カンパニー 赤血球産生性化合物
US6048891A (en) 1998-12-17 2000-04-11 Loma Linda University Medical Center Use of γ-tocopherol and its oxidative metabolite LLU-α in the treatment of natriuretic disease
US6312665B1 (en) 1998-12-21 2001-11-06 Generex Pharmaceuticals Incorporated Aerosol formulations for buccal and pulmonary application
US6271200B1 (en) 1998-12-21 2001-08-07 Generex Pharmaceuticals Inc. Proteinic drug delivery system using aerosolized membrane-mimetic amphiphiles
US6294153B1 (en) 1998-12-21 2001-09-25 Generex Pharmaceuticals, Inc. Aerosol pharmaceutical formulation for pulmonary and nasal delivery
CA2358107C (en) 1998-12-22 2011-08-23 Eli Lilly And Company Shelf-stable formulation of glucagon-like peptide-1
GB9902000D0 (en) 1999-01-30 1999-03-17 Delta Biotechnology Ltd Process
JP2002542183A (ja) 1999-04-16 2002-12-10 ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ 成形可能な乾燥した医薬製剤
US6287588B1 (en) 1999-04-29 2001-09-11 Macromed, Inc. Agent delivering system comprised of microparticle and biodegradable gel with an improved releasing profile and methods of use thereof
DE19921537A1 (de) 1999-05-11 2000-11-23 Dieter Hoersch Verfahren zur Induzierung von Zellwachstum durch Verwendung geeigneter Mittel
US6348192B1 (en) * 1999-05-11 2002-02-19 Bayer Corporation Interleukin-2 mutein expressed from mammalian cells
US6514500B1 (en) 1999-10-15 2003-02-04 Conjuchem, Inc. Long lasting synthetic glucagon like peptide {GLP-!}
ES2209885T3 (es) 1999-05-17 2004-07-01 Conjuchem, Inc. Peptidos insulinotropicos de larga duracion.
JP2003530070A (ja) 1999-05-19 2003-10-14 レキシジェン ファーマシューティカルズ コーポレイション Ｆｃ融合タンパク質としてのインターフェロン−αタンパク質の発現および搬出
US6344180B1 (en) 1999-06-15 2002-02-05 Bionebraska, Inc. GLP-1 as a diagnostic test to determine β-cell function and the presence of the condition of IGT and type II diabetes
WO2000078333A2 (en) 1999-06-21 2000-12-28 Eli Lilly And Company Synergetic use of thiazolidinediones with glucagon-like peptide-1 and agonists thereof to treat non-insulin dependant diabetes
JO2291B1 (en) 1999-07-02 2005-09-12 اف . هوفمان لاروش ايه جي Erythropoietin derivatives
US20020048571A1 (en) 1999-07-19 2002-04-25 Jeno Gyuris Chimeric polypeptides of serum albumin and uses related thereto
US7144574B2 (en) * 1999-08-27 2006-12-05 Maxygen Aps Interferon β variants and conjugates
TWI260321B (en) 1999-09-22 2006-08-21 Bristol Myers Squibb Co Substituted acid derivatives useful as antidiabetic and antiobesity agents and method
PH12000002657B1 (en) 1999-10-12 2006-02-21 Bristol Myers Squibb Co C-aryl glucoside SGLT2 inhibitors
EP1224309A2 (en) 1999-10-21 2002-07-24 Monsanto Company Post-translational modification of recombinant proteins produced in plants
AU1226901A (en) 1999-10-22 2001-05-08 Amgen, Inc. Biodegradable microparticles with novel erythropoietin stimulating protein
WO2001032200A1 (en) 1999-11-03 2001-05-10 Novo Nordisk A/S Use of a growth hormone or a growth hormone secretagogue for appetite-suppression or induction of satiety
CA2324801A1 (en) 1999-11-10 2001-05-10 Andrew Gordon Swick Use of apo b secretion/mtp inhibitors and anti-obesity agents
US6569832B1 (en) * 1999-11-12 2003-05-27 Novo Nordisk A/S Inhibition of beta cell degeneration
AU2154401A (en) 1999-11-12 2001-05-30 Merck Patent Gmbh Erythropoietin forms with improved properties
AU778929B2 (en) 1999-12-06 2004-12-23 General Hospital Corporation, The Pancreatic stem cells and their use in transplantation
US20020025306A1 (en) 2000-01-07 2002-02-28 Baetge Edward E. Methods of increasing the glucose responsiveness of pancreatic ss-cells
EP1125579A3 (en) 2000-01-18 2003-01-02 Pfizer Products Inc. Uses of agrp-melanocortin receptor binding modulating compounds
EP1257577B1 (en) 2000-01-27 2004-04-21 Eli Lilly And Company Process for solubilizing glucagon-like peptide 1 (glp-1) compounds
AU2001228327A1 (en) 2000-01-31 2001-08-14 Novo-Nordisk A/S Crystallisation of a glp-1 analogue
AU2001252201A1 (en) 2000-03-14 2001-09-24 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Effects of glucagon-like peptide-1 (7-36) on antro-pyloro-duodenal motility
JP4237375B2 (ja) * 2000-03-31 2009-03-11 アスビオファーマ株式会社 虚血性疾患の処置又は予防に用いる医薬組成物
US20050100991A1 (en) 2001-04-12 2005-05-12 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
US6946134B1 (en) * 2000-04-12 2005-09-20 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
JP5022551B2 (ja) 2000-04-21 2012-09-12 アムジエン・インコーポレーテツド 貧血の予防及び治療用の方法及び組成物
IL142707A0 (en) 2000-04-27 2002-03-10 Pfizer Prod Inc Methods of treating obesity using a neurotensin receptor ligand
BRPI0110914B8 (pt) * 2000-05-15 2021-05-25 Hoffmann La Roche 'composição farmacêutica líquida, processo para preparação da mesma e uso de uma composicão farmacêutica'
CA2380423A1 (en) 2000-05-17 2001-11-22 Bionebraska, Inc. Peptide pharmaceutical formulations
KR100518046B1 (ko) 2000-05-19 2005-10-04 아밀린 파마슈티칼스, 인크. Ｇｌｐ-1을 사용한 급성 관상동맥 증후군의 치료
DK1695983T3 (da) 2000-06-16 2009-05-18 Lilly Co Eli Glucagon-lignende peptid-1 analoger
DK1326630T3 (da) 2000-09-18 2008-09-15 Sanos Bioscience As Anvendelse af GLP-2-peptider
WO2002034285A2 (en) * 2000-10-20 2002-05-02 Coolidge Thomas R Treatment of hibernating myocardium and diabetic cardiomyopathy with a glp-1 peptide
US7101561B2 (en) * 2000-12-01 2006-09-05 Innogenetics N.V. Purified hepatitis C virus envelope proteins for diagnostic and therapeutic use
AU2002221222A1 (en) 2000-12-04 2002-06-18 Biovitrum Ab Novel method and use
CZ306180B6 (cs) 2000-12-07 2016-09-14 Eli Lilly And Company GLP-1 fúzní proteiny
AU2002228608A1 (en) 2000-12-13 2002-06-24 Eli Lilly And Company Amidated glucagon-like peptide-1
WO2002047716A2 (en) 2000-12-13 2002-06-20 Eli Lilly And Company Chronic treatment regimen using glucagon-like insulinotropic peptides
WO2002066062A2 (en) 2001-02-01 2002-08-29 Drucker Daniel J Enhancement of glp-2 activity
KR100399337B1 (ko) 2001-02-07 2003-09-26 드림바이오젠 주식회사 단백질의 무세포 번역후수식법
WO2002069994A2 (en) 2001-03-07 2002-09-12 Novo Nordisk A/S Combined use of derivatives of glp-1 analogs and ppar ligands
US20020169128A1 (en) 2001-04-09 2002-11-14 Geroge Sigounas Erythropoietin ameliorates chemotherapy-induced toxicity in vivo
US20050054051A1 (en) 2001-04-12 2005-03-10 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
US20050244931A1 (en) 2001-04-12 2005-11-03 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
US20060084794A1 (en) 2001-04-12 2006-04-20 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
US7507413B2 (en) 2001-04-12 2009-03-24 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
WO2002085406A1 (en) 2001-04-24 2002-10-31 Restoragen, Inc. Methods and compositions for treating conditions associated with insulin resistance
CA2446739A1 (en) * 2001-05-25 2002-12-05 Human Genome Sciences, Inc. Chemokine beta-1 fusion proteins
AU2002308706A1 (en) 2001-06-01 2002-12-16 Eli Lilly And Company Glp-1 formulations with protracted time action
AU2002319381A1 (en) 2001-06-20 2003-01-21 Merck Sante Use of antidiabetics for making a medicine with cicatrizing effect
US20030119734A1 (en) 2001-06-28 2003-06-26 Flink James M. Stable formulation of modified GLP-1
DE60228972D1 (de) 2001-07-31 2008-10-30 Us Gov Health & Human Serv Glp 1 exendin 4 peptidanaloga und deren verwendungen
AU2002327430A1 (en) 2001-08-08 2003-02-24 Genzyme Corporation Methods for treating diabetes and other blood sugar disorders
US7186797B2 (en) 2001-08-10 2007-03-06 Epix Pharmaceuticals, Inc. Polypeptide conjugates with extended circulating half-lives
HUP0501192A3 (en) 2001-08-23 2006-06-28 Lilly Co Eli Glucagon-like peptide-1 analogs
WO2003030821A2 (en) 2001-10-05 2003-04-17 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
CN101724075B (zh) * 2001-10-10 2014-04-30 诺和诺德公司 肽的重构和糖缀合
US20080194481A1 (en) 2001-12-21 2008-08-14 Human Genome Sciences, Inc. Albumin Fusion Proteins
EP2261250B1 (en) * 2001-12-21 2015-07-01 Human Genome Sciences, Inc. GCSF-Albumin fusion proteins
WO2003054182A2 (en) 2001-12-21 2003-07-03 Nexia Biotechnologies, Inc. Production of butyrylcholinesterases in transgenic mammals
KR101271635B1 (ko) 2001-12-21 2013-06-12 휴먼 게놈 사이언시즈, 인코포레이티드 알부민 융합 단백질
US20080167238A1 (en) * 2001-12-21 2008-07-10 Human Genome Sciences, Inc. Albumin Fusion Proteins
AU2002364587A1 (en) 2001-12-21 2003-07-30 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
US6682190B2 (en) * 2002-01-31 2004-01-27 Hewlett-Packard Development Company, L.P. Controlling media curl in print-zone
EP1572936A2 (en) 2002-03-05 2005-09-14 Eli Lilly And Company Heterologous g-csf fusion proteins
WO2003084563A1 (en) 2002-04-04 2003-10-16 Novo Nordisk A/S Glp-1 agonist and cardiovascular complications
CN1241946C (zh) 2002-07-01 2006-02-15 美国福源集团 对多种细胞具刺激增生作用的人血清白蛋白重组融合蛋白
JP4211375B2 (ja) 2002-12-10 2009-01-21 セイコーエプソン株式会社 データ転送制御方法、データ転送回路装置およびこれを備えた印刷装置
US6913890B2 (en) 2002-12-18 2005-07-05 Palo Alto Research Center Incorporated Process for preparing albumin protein conjugated oligonucleotide probes
EP1594530A4 (en) 2003-01-22 2006-10-11 Human Genome Sciences Inc HYBRID PROTEINS OF ALBUMIN
PT1641823E (pt) 2003-06-12 2011-11-08 Lilly Co Eli Proteínas de fusão de análogos de glp-1
EP1729795B1 (en) * 2004-02-09 2016-02-03 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
US20060051859A1 (en) * 2004-09-09 2006-03-09 Yan Fu Long acting human interferon analogs
AU2005323063B2 (en) 2004-12-24 2011-01-27 Amylin Pharmaceuticals, Llc Use of GLP-1 and agonists thereof to prevent cardiac myocyte apoptosis
US8946149B2 (en) 2005-04-11 2015-02-03 Amylin Pharmaceuticals, Llc Use of exendin and analogs thereof to delay or prevent cardiac remodeling
EP1924596A4 (en) 2005-08-12 2009-07-29 Human Genome Sciences Inc ALBUM INFUSION PROTEINS
US8008257B2 (en) * 2005-10-20 2011-08-30 University Of Ottawa Heart Institute ANF fusion proteins
WO2007139941A2 (en) * 2006-05-26 2007-12-06 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Composition and methods for treatment of congestive heart failure
BRPI0712383A2 (pt) 2006-06-07 2012-07-10 Human Genome Sciences Inc proteìnas de fusão da albumina
US20090209469A1 (en) 2006-08-04 2009-08-20 Dennis Kim Use of Exendins and GLP-1 Receptor Agonists for Altering Lipoprotein Particle Size and Subclass Composition

Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS62192399A (ja) * 1986-02-15 1987-08-22 ベ−リングヴエルケ・アクチエンゲゼルシヤフト インシユリン誘導体およびそれらの製造方法
JPH07503368A (ja) * 1992-01-31 1995-04-13 ローン−プーラン・ロレ・ソシエテ・アノニム 新規な生物活性ポリペプチド類，ならびにそれらの製造および含有薬学組成物
JPH11501506A (ja) * 1994-12-12 1999-02-09 ベス イスラエル デアコネス メディカル センター キメラ型サイトカインおよびその利用
JP2000502901A (ja) * 1995-12-30 2000-03-14 デルタ、バイオテクノロジー、リミテッド 成長ホルモンおよび血清アルブミンに対する組換え融合タンパク質
WO2001005826A2 (en) * 1999-07-19 2001-01-25 Gpc Biotech Inc. Chimeric polypeptides of serum albumin and uses related thereto
WO2001077317A1 (en) * 2000-04-07 2001-10-18 Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha Method of amplifying nucleic acid by using double-stranded nucleic acid as template
WO2001079258A1 (en) * 2000-04-12 2001-10-25 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
WO2001079444A2 (en) * 2000-04-12 2001-10-25 Human Genome Sciences, Inc Albumin fusion proteins
WO2001079480A1 (en) * 2000-04-12 2001-10-25 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
WO2001079442A2 (en) * 2000-04-12 2001-10-25 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
WO2001079271A1 (en) * 2000-04-12 2001-10-25 Principia Pharmaceutical Corporation Albumin fusion proteins

Also Published As

Publication number Publication date
US8071539B2 (en) 2011-12-06
US20140303077A1 (en) 2014-10-09
JP2011015690A (ja) 2011-01-27
US20150329619A1 (en) 2015-11-19
EP2277889A2 (en) 2011-01-26
US20110009312A1 (en) 2011-01-13
US20090099073A1 (en) 2009-04-16
US7847079B2 (en) 2010-12-07
US20080161243A1 (en) 2008-07-03
EP1463751A2 (en) 2004-10-06
US20080153751A1 (en) 2008-06-26
JP2013172734A (ja) 2013-09-05
WO2003060071A3 (en) 2004-02-26
JP2005514060A (ja) 2005-05-19
AU2002364586A1 (en) 2003-07-30
EP1997829A1 (en) 2008-12-03
CY1114265T1 (el) 2016-04-13
AU2002364586A8 (en) 2003-07-30
JP5705418B2 (ja) 2015-04-22
US20170096472A1 (en) 2017-04-06
US9296809B2 (en) 2016-03-29
US20080167240A1 (en) 2008-07-10
US7141547B2 (en) 2006-11-28
JP2006176514A (ja) 2006-07-06
EP2277888A3 (en) 2011-04-27
PT1463751E (pt) 2013-08-26
US20140179596A1 (en) 2014-06-26
US8012464B2 (en) 2011-09-06
JP2013208118A (ja) 2013-10-10
DK1463751T3 (da) 2013-08-26
US20130150296A1 (en) 2013-06-13
CA2471363C (en) 2014-02-11
JP5829245B2 (ja) 2015-12-09
US20150203568A1 (en) 2015-07-23
US20080213886A1 (en) 2008-09-04
CA2841097A1 (en) 2003-07-24
EP1463751A4 (en) 2005-03-23
US20120046221A1 (en) 2012-02-23
US20070259815A1 (en) 2007-11-08
US20060276396A1 (en) 2006-12-07
EP2261250A1 (en) 2010-12-15
US8993517B2 (en) 2015-03-31
US8252739B2 (en) 2012-08-28
EP2277889B1 (en) 2014-07-09
JP2015126746A (ja) 2015-07-09
EP2277889A3 (en) 2011-04-27
EP2277888A2 (en) 2011-01-26
US7799759B2 (en) 2010-09-21
US20070244047A1 (en) 2007-10-18
US8513189B2 (en) 2013-08-20
US20090093402A1 (en) 2009-04-09
US7592010B2 (en) 2009-09-22
US20050186664A1 (en) 2005-08-25
EP2277910A1 (en) 2011-01-26
US20060194735A1 (en) 2006-08-31
US20080167239A1 (en) 2008-07-10
CA2471363A1 (en) 2003-07-24
CY2014040I1 (el) 2016-04-13
JP2009213477A (ja) 2009-09-24
EP2990417A1 (en) 2016-03-02
ES2545090T3 (es) 2015-09-08
ES2425738T3 (es) 2013-10-17
JP2015120714A (ja) 2015-07-02
US20080146503A1 (en) 2008-06-19
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