KR102161892B1 - 특발성 폐섬유증 예방 또는 치료용 재조합 단백질을 포함하는 특발성 폐섬유증 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 Milk fat globule-EGF factor 8(MFG-E8) 단백질을 기반으로 재조합된 특발성 폐섬유증 예방 또는 치료용 재조합 단백질로서, 서열번호1의 아미노산 서열로 이루어져 특발성 폐섬유증에 의해 섬유화가 진행된 폐 조직을 근본적으로 치료하여 폐 기능을 정상 수준으로 회복시킬 수 있다.
아울러, 본 발명은 서열번호1의 아미노산 서열로 이루도록 Milk fat globule-EGF factor 8(MFG-E8) 단백질을 기반으로 재조합된 특발성 폐섬유증 예방 또는 치료용 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물에 관한 것이기도 하다.

Description

특발성 폐섬유증 예방 또는 치료용 재조합 단백질을 포함하는 특발성 폐섬유증 예방 또는 치료용 조성물 {COMPOSITION FOR IDIOPATHIC PULMONARY FIBROSIS TREATMENT OR PREVENTION CONTAINING RECOMBINANT PROTEIN FOR IDIOPATHIC PULMONARY FIBROSIS TREATMENT OR PREVENTION}
본 발명은 특발성 폐섬유증 예방 또는 치료용 재조합 단백질 및 이를 포함하는 특발성 폐섬유증 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
특발성 폐섬유증(Idiopathic Pulmonary Fibrosis)은 폐 간질 조직에 알 수 없는 원인으로 염증이 반복 발생하여 영구적인 상흔 및 조직 섬유화를 초래하여 폐 조직의 구조적 변화를 유발함으로써, 폐 기능이 저하되어 사망에 이르게 되는 치명적인 질환이다.
전 세계 약 5백만 명의 발병자가 있으며, 국내에서는 간질성 폐 질환 중 50%가 넘게 조사될 정도로 가장 흔히 발병하는 질환이다. 이러한 대부분의 특발성 폐섬유증은 만성적으로 1년 내지 2년에 걸쳐 천천히 발병하여 병이 진행될수록 호흡곤란이 심해져 일상적인 생활도 힘들어지게 된다.
현재 특발성 폐섬유증은 정확한 발병원인이 밝혀지지 않아 치료에 어려움을 겪고 있고, 항응고제, 티로신인산화효소(Tyrosine kinase) 억제제, ER-A 내피 수용체 길항체, 항섬유화 약물, 제산제 및 면역억제제의 병용 요법 등이 치료법으로 제시되고 있다.
이와 관련하여 특발성 폐섬유증 치료용 약학 조성물의 종래기술에 대한 선행문헌에는 대한민국 등록특허공보 제10-1845862호의"특발성 폐섬유증의 치료 또는 예방을 위한 약학적 조성물"(이하, '종래기술'이라고 함)이 있다.
특히, 2015년 특발성 폐섬유증 가이드라인의 업데이트 내용을 살펴보면 "특정 치료 전략의 우위 또는 단독 병용요법을 권고하고 있지 않다"라고 강조하며 치료 대상에 따라 적절한 치료 전략의 선택이 필요함을 강조 했다.
여기서, 특발성 폐섬유증 가이드라인은 임상 시험 결과를 바탕으로 앞 서 설명한 치료법 중 유해사건 발생률은 높지만 통계적 유의성이 없거나, 사망률 개선을 보인 일부의 치료법만을 조건부 권고하고 나머지는 강한 비권고 또는 권고 사항 제시를 지연하였다.
아울러, 이러한 종래기술을 비롯한 기존의 특발성 폐섬유증의 치료를 위해 마련된 약학 조성물의 경우, 부분적 치료 효과가 제공되거나 효과의 제공 수준이 미미하여 유의성을 갖추지 못하여 폐섬유증의 발병 혹은 진행을 지연하거나 치료할 수 있는 근본적 효과를 제공하지 못하는 문제점이 있었다.
또한, 종래기술을 비롯한 기존의 특발성 폐섬유증의 치료를 위해 마련된 약학 조성물의 경우, 화학 성분에 기초한 조성의 생체 친화성이 낮고, 부작용 발생률이 높았으며, 생산성을 고려한 대량 생산 및 품질 관리에서 어려움을 겪고 있다.
본 발명은 상기 문제점을 해결하기 위해 창작된 것으로써, 본 발명의 목적은 특발성 폐섬유증에 의해 섬유화가 진행된 폐 조직을 근본적으로 치료하여 폐 기능성을 정상 수준으로 회복시키고, 더 나아가 특발성 폐섬유증의 발병을 지연하거나 막을 수 있는 특발성 폐섬유증 예방 또는 치료용 재조합 단백질 및 이를 포함하는 조성물을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따른 특발성 폐섬유증 예방 또는 치료용 재조합 단백질은, Milk fat globule-EGF factor 8(MFG-E8) 단백질 기반의 재조합 단백질로서, 서열번호1의 아미노산 서열로 이루어진다.
여기서, Milk fat globule-EGF factor 8(MFG-E8) 단백질 기반의 재조합되어 서열번호1의 아미노산 서열로 이루는 특발성 폐섬유증 예방 또는 치료용 재조합 단백질은 폐 조직 내 Collagen, α-SMA(α-Smooth Muscle Actin) 및 인산화된 ERK(Extracellular signal-Regulated Kinase) 중 적어도 하나 이상의 발현을 현저히 감소시킬 수 있다.
또한, Milk fat globule-EGF factor 8(MFG-E8) 단백질 기반의 재조합되어 서열번호1의 아미노산 서열로 이루는 특발성 폐섬유증 예방 또는 치료용 재조합 단백질은 예방 또는 치료 대상 폐 조직 내 Col1a1, MMP-2, MMP-12 및 TIMP1 중 적어도 하나 이상의 발현을 현저히 감소시킬 수 있다.
또한, Milk fat globule-EGF factor 8(MFG-E8) 단백질 기반의 재조합되어 서열번호1의 아미노산 서열로 이루는 특발성 폐섬유증 예방 또는 치료용 재조합 단백질은 병변내 투여, 혈관내 투여, 피하 투여, 비강내 투여 또는 복강내 투여용으로 제형화될 수 있다.
한편, 상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따른 특발성 폐섬유증 예방 또는 치료용 조성물은, Milk fat globule-EGF factor 8(MFG-E8) 단백질 기반의 재조합되어 서열번호1의 아미노산 서열로 이루는 특발성 폐섬유증 예방 또는 치료용 재조합 단백질을 유효성분으로 포함한다.
또한, 상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 Milk fat globule-EGF factor 8(MFG-E8) 단백질 기반의 재조합되어 서열번호1의 아미노산 서열로 이루는 특발성 폐섬유증 예방 또는 치료용 재조합 단백질을 코딩하는 유전자를 또 다른 하나의 양태로서 제공한다.
또한, 상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 Milk fat globule-EGF factor 8(MFG-E8) 단백질 기반의 재조합되어 서열번호1의 아미노산 서열로 이루는 특발성 폐섬유증 예방 또는 치료용 재조합 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 또 다른 하나의 양태로서 제공한다.
본 발명에 의하면 다음과 같은 효과가 있다.
첫째, 특발성 폐섬유증 예방 또는 치료용 재조합 단백질을 통해 특발성 폐섬유증에 의해 치료대상의 폐 조직에 우수한 항섬유화 효과를 제공하여 폐 구조 및 기능을 정상 수준으로 회복시킬 수 있다.
둘째, 특발성 폐섬유증 예방 또는 치료용 재조합 단백질을 통해 특발성 폐섬유증에 의해 치료대상 폐 조직의 섬유화 지표인 Collagen 및 α-SMA(α-Smooth Muscle Actin)의 발현을 현저히 낮출 수 있다.
셋째, 특발성 폐섬유증 예방 또는 치료용 재조합 단백질을 통해 특발성 폐섬유증에 의해 치료대상 폐 조직의 섬유화 지표인 Col1a1, MMP-2, MMP-12 및 TIMP1의 발현을 현저히 낮출 수 있다.
넷째, 특발성 폐섬유증 예방 또는 치료용 재조합 단백질을 통해 특발성 폐섬유증에 의해 치료대상 폐 조직의 섬유화 유발과 관련된 신호전달체계의 하위인자인 인산화된 ERK(Extracellular signal-Regulated Kinase) 및 인산화된 SMAD2의 발현을 현저히 낮출 수 있다.
다섯째, 생체 친화적이고, 부작용이 적은 특발성 폐섬유증 예방 또는 치료용 재조합 단백질 및 이를 포함하는 조성물을 제공할 수 있다.
여섯째, 대량 생산 및 품질관리가 용이한 특발성 폐섬유증 예방 또는 치료용 재조합 단백질 및 이를 포함하는 조성물을 제공할 수 있다.
도1은 본 발명의 특발성 폐섬유증 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011)을 코딩하는 유전자가 삽입된 Backbone Vector의 구조를 도시하고 있다.
도2는 도1에 도시된 Backbone Vector의 구조 내 삽입될 수 있으며, 본 발명의 특발성 폐섬유증 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011)을 코딩하는 유전자의 DNA 염기서열을 도시하고 있다.
도3은 본 발명의 특발성 폐섬유증 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011)의 아미노산 서열을 도시하고 있다.
도4는 본 발명의 특발성 폐섬유증 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011)의 효과 검증을 위해 설계된 동물실험 모델의 제작 과정을 나타낸 모식도이다.
도5는 본 발명의 특발성 폐섬유증 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011)의 효과 검증을 위해 설계된 동물실험 모델들의 폐 조직 내 Collagen 및 α-SMA의 분포를 보여주는 염색 결과를 도시하고 있다.
도6은 본 발명의 특발성 폐섬유증 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011)의 효과 검증을 위해 설계된 동물실험 모델들의 폐 조직 내 폐 조직 섬유화 관련 바이오마커들의 발현양상을 나타낸 그래프이다.
도7은 본 발명의 특발성 폐섬유증 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011)의 효과 검증을 위해 설계된 동물실험 모델들의 폐 조직 내 폐 조직의 섬유화 유발과 관련된 신호전달체계의 하위인자들의 발현양상을 나타낸 그래프이다.
도8은 본 발명의 특발성 폐섬유증 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011)의 효과 검증을 위해 설계된 동물실험 모델 중 NP-011을 주입 시점을 달리한 두 시험군의 제작 과정을 나타낸 모식도이다.
도9는 본 발명의 특발성 폐섬유증 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011)의 효과 검증을 위해 설계된 동물실험 모델 중 3일차 시점에 NP-011을 주입한 동물실험 모델 시험군의 폐 조직 내 Collagen 및 α-SMA의 분포 변화를 비교한 염색 결과를 도시하고 있다.
도10은 본 발명의 특발성 폐섬유증 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011)의 효과 검증을 위해 설계된 동물실험 모델 중 5일차 시점에 NP-011을 주입한 동물실험 모델 시험군의 폐 조직 내 Collagen 및 α-SMA의 분포 변화를 비교한 염색 결과를 도시하고 있다.
도11은 본 발명의 특발성 폐섬유증 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011)의 효과 검증을 위해 설계된 동물실험 모델 중 3일차 시점에 NP-011을 주입한 동물실험 모델 시험군의 폐 조직 내 폐 조직의 섬유화 유발과 관련된 신호전달체계의 하위인자들의 발현양상 변화 및 차이를 비교한 그래프이다.
도12는 본 발명의 특발성 폐섬유증 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011)의 효과 검증을 위해 설계된 동물실험 모델 중 5일차 시점에 NP-011을 주입한 동물실험 모델 시험군의 폐 조직 내 폐 조직의 섬유화 유발과 관련된 신호전달체계의 하위인자들의 발현양상 변화 및 차이를 비교한 그래프이다.
도13은 본 발명의 특발성 폐섬유증 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011)의 효과 검증을 위해 설계된 동물실험 모델 중 3일차 시점에 NP-011을 주입한 동물실험 모델 시험군의 폐 조직 내 폐 조직 섬유화 관련 바이오마커들의 발현양상 변화 및 차이를 비교한 그래프이다.
본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 첨부된 도면을 참조하여 더 구체적으로 설명하되, 이미 주지된 기술적 부분에 대해서는 설명의 간결함을 위해 생략하거나 압축하기로 한다.
1. 특발성 폐섬유증 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011)에 관한 설명
본 발명에 따른 특발성 폐섬유증 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011)의 수득이 이루어지는 과정 및 수득된 단백질의 구조적 특징에 대해 이하에서 도1 내지 도3을 참조하여 상세하게 설명한다.
(1) 특발성 폐섬유증 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011)의 수득
먼저 특발성 폐섬유증 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011)의 발현 과정을 설명하면, Milk fat globule-EGF factor 8(MFG-E8) 단백질 구조 개량을 위해 Origene사의 MFG-E8(NM_005928) Human cDNA Clone (Cat. No. RG217163)을 구입하여, 이를 주형(Template)으로 사용하고 PCR을 진행하여 도2에 도시된 바와 같은 DNA 단편(fragments)을 획득(서열번호4 참고)한다.
그 후, 도1에 도시된 바와 같은 구조의 Mammalian expression Vector인 pLFCF Vector의 HindⅢ 및 SalⅠ 제한효소 부위(도1의 A부위)에 PCR 증폭을 통해 수득한 도2의 DNA 단편(서열번호4 참고)을 삽입하는 클로닝을 진행한다.
이 후, plasmid DNA를 추출하여 HEK293 세포로 형질도입(Transfection)하여 2일 후 배양액을 모아 FLAG resin으로 면역침강반응(IP, Immunoprecipitation)하여 웨스턴 블로팅(Western Blotting)으로 특발성 폐섬유증 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011)에 해당하는 재조합 단백질의 발현을 확인한다.
다음으로 특발성 폐섬유증 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011)의 대량 생산 과정을 설명하면, 발현의 확인을 거친 plasmid DNA를 Maxi prep을 통해 다량 확보한 후, HEK293 세포를 준비하여 대량의 plasmid DNA를 HEK293 세포에 형질도입하여 특발성 폐섬유증 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011)에 해당하는 재조합 단백질의 대량 생산을 수행할 수 있다.
다음으로 특발성 폐섬유증 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011)의 품질 관리를 위한 정제 과정을 설명하면, Corning사의 CellSTACK Cell Culture Chamer 10개를 준비하여 HEK293 세포를 도포한 뒤, 1600μg의 plasmid DNA와 3200μl의 Transfection Reagents를 상온에서 15분간 혼합한 후, 형질도입을 수행한다.
형질 도입 수행 4시간 뒤, 배양액을 교체해주고 6일간 추가 배양을 진행하였으며, 배양액은 2일마다 총 3번 수거하여 수거된 배양액에서 Affinity식 단백질 정제를 진행한다.
이와 같은 정제 과정은 각각의 단백질의 C-terminal에 FLAG 유전자가 발현(서열번호10 참고)되어 있으므로 FLAG affinity resin을 이용해 표적 단백질만 결합시킨 뒤, 세척 완충액(Washing Buffer)으로 세척하여 표적 단백질을 제외한 단백질들을 제거할 수 있다.
이 후, 용출 완충액(Elution Buffer)을 이용해 순수한 표적 단백질만을 추출한 뒤, 최종적으로 획득한 단백질 확인을 위해 SDS-PAGE를 진행하여 Coomassie Blue 염색 및 Anti-FLAG 항체를 이용한 웨스턴 블로팅(Western Blotting)을 통해 표적단백질의 생산 및 순도를 확인할 수 있다.
이와 같은 Milk fat globule-EGF factor 8(MFG-E8) 단백질에 기반을 두고 재조합되어 마련되는 특발성 폐섬유증 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011)의 발현을 위한 클로닝, 대량생산 및 정제 등을 위해 앞 서 설명된 일련의 구체적 과정은 이에 한정되는 것이 아니라, 아래 설명되어질 재조합 단백질의 구체적인 아미노산 서열 구조(서열번호1 및 도3 참고)의 구축을 위해 당업계의 기술자들에게 공지되고 자명한 수준의 기술을 이용한 다양한 방식으로 구현 가능하다.
예를 들어, Milk fat globule-EGF factor 8(MFG-E8) 단백질에 기반을 두고 재조합되어 마련되는 특발성 폐섬유증 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011)의 클로닝에 이용되는 발현 벡터의 구조, 형질전환 수행 대상, 생산 조건 및 형태, 정제 조건 및 형태 등의 기술은 다양하게 실시 가능하다.
아울러, Milk fat globule-EGF factor 8(MFG-E8) 단백질에 기반을 두고 재조합되어 마련되는 특발성 폐섬유증 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011)의 발현과 관련하여 발현 벡터에 클로닝되는 DNA 단편(fragments)의 구조 역시 도2의 구조를 기본으로 하되, 실시에 따라 특정 Signal Peptide를 코딩하는 특정 DNA 염기서열이 추가로 DNA 단편(fragments)에 연결되는 형태로 실시 될 수도 있다.
(2) 특발성 폐섬유증 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011)의 구조
앞 서 설명한, 재조합 단백질의 클로닝, 분리, 생산, 정제 등의 과정을 거쳐 최종적으로 마련되는 Milk fat globule-EGF factor 8(MFG-E8) 단백질 기반의 특발성 폐섬유증 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011)은 하기 서열목록 내 서열번호1 또는 도3에 도시된 바와 같은 아미노산 서열 구조를 갖춘다.
특징적으로, Milk fat globule-EGF factor 8(MFG-E8) 단백질 기반의 특발성 폐섬유증 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011)은 MFG-E8 단백질의 구조적 구성인 EGF-like Domain, C1 Domain 및 C2 Domain 중 EGF-like Domain(서열번호2 참고) 및 C1 Domain(서열번호3 참고)을 포함하는 구조로 재조합된다.
다시 말해, 본 발명의 Milk fat globule-EGF factor 8(MFG-E8) 단백질 기반의 특발성 폐섬유증 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011)은"EGF-like Domain+C1 Domain"의 아미노산 서열을 이루는 것을 기본 구조로 삼고 있고, C2 Domain이 구조 상 배제되어짐을 특징으로 한다.
이와 같은 본 발명의 Milk fat globule-EGF factor 8(MFG-E8) 단백질 기반의 특발성 폐섬유증 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011)은 특발성 폐섬유증 예방 또는 치료용으로 이용되는 약학적 조성물의 주요 유효성분으로 이용될 수 있다.
아울러, 본 발명의 Milk fat globule-EGF factor 8(MFG-E8) 단백질 기반의 특발성 폐섬유증 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011) 및 이를 주요 유효성분으로 하는 약학적 조성물은 병변내 투여, 혈관(동맥, 정맥 등)내 투여, 피하 투여, 비강내 투여, 복강내 투여 또는 특정 조직(폐 조직)내 투여용으로 제형화할 수 있다.
한편, 본 발명의 Milk fat globule-EGF factor 8(MFG-E8) 단백질 기반의 특발성 폐섬유증 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011)은 앞 서 설명한 재조합 단백질의 발현과 관련하여 발현 벡터에 클로닝되는 DNA 단편(fragments)의 구조적 실시 형태의 범위와 대응되어 실시에 따라 특정 Signal Peptide 구조의 추가 연결이 이루어질 수도 있다.
예를 들어, 특정 Signal Peptide 구조는"MPRPRLLAALCGALLCAPSLLVA"와 같은 아미노산 서열(서열번호5 참고)을 갖추어 EGF-like Domain 선단에 연결되는 형태로 실시 가능하나 이에 한정되지는 아니한다.
2. 특발성 폐섬유증 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011)의 효과 검증 시험 결과에 관한 설명
본 발명의 Milk fat globule-EGF factor 8(MFG-E8) 단백질 기반의 특발성 폐섬유증 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011)과 관련하여 해당 재조합 단백질에 기인한 특발성 폐섬유증 예방 또는 치료의 효과 수준 검증을 시험을 통해 확인하였으며, 해당 시험은 당업계의 기술자들에게 자명한 수단에 의한 성질 등을 정의하기 위한 목적으로 하기 실험 방법들을 이용하였다.
(1) 특발성 폐섬유증 동물모델의 제작 및 실험설계
우선, C57BL/6 생쥐에 3mg/kg의 블레오마이신(Bleomycin)을 기관 내 점적 주입하여 급성특발성 폐섬유증(Idiopathic Pulmonary Fibrosis) 유도 동물모델을 제작한다.
이를 통해 제작된 급성특발성 폐섬유증(Idiopathic Pulmonary Fibrosis) 유도 동물모델 생쥐(n=7)는 도면 기준'BLM'로 표시되는 모델군으로 분류하였으며, 급성특발성 폐섬유증 유발이 진행되지 않은 10주령의 C57BL/6 생쥐(n=5)인 동물모델은 정상적 대조군(Wild Type Control)인'CON'으로 분류하였다.
이 후, 제작 설계된 'BLM'모델군은 도4에 도시된 바와 같이 급성특발성 폐섬유증의 유도를 위한 블레오마이신(Bleomycin)의 주입 후 각각 3일째, 5일째, 7일째 및 14일째에 걸친 4회에 동안 동물모델 생쥐의 폐 조직을 추출하여 분석을 진행하였다.
다음으로, 본 발명의 특발성 폐섬유증 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011)의 효과 검증을 위한 실험군은 도8에 도시된 바와 같이 앞 서 제작된'BLM'모델군의 급성특발성 폐섬유증 유도 동물모델 생쥐에 1일 기준 160μg/kg의 NP-011을 생쥐 꼬리의 정맥 내에 투여하여 마련하였으며, 도면 기준'BLM+NP011'로 표시된다.
이와 같이 마련되는 'BLM+NP011'의 실험군은 도8에 도시된 바와 같이 특발성 폐섬유증 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011)의 투여시기를 달리하여 블레오마이신(Bleomycin)의 주입 후 3일 경과시점에 NP-011를 1회 주입한 제1실험군(CASE 1)과 블레오마이신(Bleomycin)의 주입 후 5일 경과시점에 NP-011를 1회 주입한 제2실험군(CASE 2)으로 분류하였다.
이를 통해 제작되는 제1실험군의 급성특발성 폐섬유증 유도 동물모델 생쥐(n=7)는 폐 조직의 추출을 통한 효과 분석의 진행을 블레오마이신(Bleomycin)의 주입 후 6일 경과시점에 수행했으며, 제2실험군의 급성특발성 폐섬유증 유도 동물모델 생쥐(n=7)는 폐 조직의 추출을 통한 효과 분석의 진행을 블레오마이신(Bleomycin)의 주입 후 8일 경과시점에 수행했다.
(2) 특발성 폐섬유증 동물모델의 발병 여부 및 수준 검증
우선적으로, 급성특발성 폐섬유증(Idiopathic Pulmonary Fibrosis) 유도 동물모델 생쥐로 제작된 'BLM'모델군의 급성특발성 폐섬유증 발병 여부 및 이로 인한 폐 조직의 변화를 관찰하기 위해 블레오마이신(Bleomycin)의 주입 후 각각 3일째, 5일째, 7일째 및 14일째에 걸친 4회에 동안 동물모델 생쥐의 폐 조직을 추출하여 조직 염색 분석 및 폐 조직 섬유화 관련 특정 성분의 발현 양상을 검증하였다.
먼저, 'BLM'모델군의 급성특발성 폐섬유증 유도 동물모델 생쥐들을 블레오마이신(Bleomycin)의 주입 후 각각 3일째, 5일째, 7일째 및 14일째가 경과된 시점마다 마취 후 심장관류를 통해 PBS를 주입 후 폐 조직을 적출하였다.
이와 같이 적출된 폐 조직은 4% PFA 용액에서 4일간 냉장 보관한 후, 파라핀(Paraffin)으로 포매한 폐 조직은 절편기(CM3050S, Leica)를 사용하여 4㎛의 두께로 잘라 슬라이드(silane coated slide)에 부착시켰다.
그 후, 각각의 폐 조직 내 콜라겐(Collagen) 및 α-SMA의 발현 분포를 평가하기 위해 Trichrome 염색 및 Sirius red 염색을 수행하였다.
여기서, Trichrome 염색의 경우, 먼저 폐 조직 절편을 자일렌에서 지방질이 제거되고, 100% 알코올 용액에서 수화하고, 수돗물로 세척된 슬라이드는 헤마톡실린(Hematoxylin)에서 5분간 염색, Biebrich Scarlet-Acid Fuchsin에서 15분간 염색, Phosphomolybdic/phosphotungstic acid에서 10분간, 아닐린블루(Aniline blue)에서 5분간 염색, 1% 아세트산(Acetic acid)서 3분간 잠갔다가 탈수과정을 거쳐 커버슬립으로 봉입하여 진행하였다.
아울러, Sirius red 염색의 경우, 먼저 폐 조직 절편을 자일렌에서 지방질이 제거되도록 하고, 연속적으로 알코올 용액 (100%, 95%, 80% 및 70%)을 거쳐 수화하고, 이 후 Sirius red에 7분간 염색하고 세척하여 탈수과정을 거친 뒤 커버슬립으로 봉입하여 진행하였다.
이와 같은 Trichrome 염색 및 Sirius red 염색을 마친 'BLM'모델군의 급성특발성 폐섬유증 유도 동물모델 생쥐들의 시기별 폐 조직 슬라이드는 형광현미경 (BX61; Olympus)하에서 이미지를 얻어 도5에 도시된 바와 같다.
구체적으로, 도5에 도시된 바와 같이 'BLM'모델군의 급성특발성 폐섬유증 유도 동물모델 생쥐들은 블레오마이신(Bleomycin)의 주입 후 3일째부터 폐 조직 내 주요 섬유화 지표인 콜라겐(Collagen)의 발현 분포가 조금 씩 증가하여 5일 이후로는 현저한 증가 추세를 보이고, 7일 째에는 가장 많은 증가 수준을 보이며, 14일 째에는 7일째와 유사한 수준을 보인다.
아울러, 구체적으로, 도5에 도시된 바와 같이 BLM'모델군의 급성특발성 폐섬유증 유도 동물모델 생쥐들은 블레오마이신(Bleomycin)의 주입 후 3일째부터 폐 조직 내 주요 섬유화 지표인 α-SMA(α-Smooth Muscle Actin)의 발현 분포가 혈관(Vessesl) 주변 및 세(細)기관지(Bronchiole) 주변에서 조금 씩 증가하여 시간이 지남에 따라 더욱 크게 증가하는 양상을 보인다.
다음으로, 'BLM'모델군의 급성특발성 폐섬유증 유도 동물모델 생쥐들을 블레오마이신(Bleomycin)의 주입 후 각각 3일째, 5일째, 7일째 및 14일째가 경과된 시점에서 적출된 폐 조직의 폐 조직 섬유화 관련 바이오 마커(Biomarker)들의 발현양상을 검증하였다.
구체적으로, 폐 조직에서의 섬유화 관련 바이오 마커들의 발현양상을 평가하기 위해서 프라이머를 이용한 중합효소연쇄반응(PCR, Polymerase chain reaction) 분석을 수행하였다.
여기서, 적출된 각각의 폐 조직 절편은 RNeasy mini kit를 사용하여 total RNA를 추출하고 reverse transcriptase PCR (RT-PCR)을 통하여 cDNA를 합성하였으며, 이와 같이 합성된 cDNA는 quantitative RT-PCR을 통하여 발현양상을 확인하였다.
또한, 이에 사용된 프라이머에 대한 서열구조(서열번호6 내지 서열번호9 참고)는 하기 표1과 같다.
섬유화 바이오마커 정방향(5'→3')
COL1A1 CTGGCGGTTCAGGTCCAATTTCCAGGCAATCCACGAGC
MMP-2 GCGATGTCGCCCCTAAAACAGCTGTATGTGATCTGGTTCTTGTCC
MMP-12 TGGTATTCAAGGAGATGCGGTTTGTGCCTTGAAAAC
TIMP1 GGGTTCCCCAGAAATCAACGAGACAGAGGCTTTCCATGACTGGGGTG
그 결과, 적출된 폐 조직의 폐 조직 섬유화 관련 바이오 마커(Biomarker)들의 적출 시점별 발현양상의 결과는 도6에 도시된 바와 같다.
구체적으로, 도6(도면참고- *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001)에 도시된 바와 같이 'BLM'모델군의 급성특발성 폐섬유증 유도 동물모델 생쥐들은 블레오마이신(Bleomycin)의 주입 후 'CON'정상적 대조군(Wild Type Control)의 정상 생쥐와 비교해 3일차부터 모두 폐 조직 내 섬유화 관련 바이오 마커들인 Col1a1, MMP-2, MMP-12 및 TIMP1의 발현이 큰 폭으로 높은 수준을 유지함을 확인할 수 있다.
다음으로, 'BLM'모델군의 급성특발성 폐섬유증 유도 동물모델 생쥐들을 블레오마이신(Bleomycin)의 주입 후 각각 3일째, 5일째, 7일째 및 14일째가 경과된 시점에서 적출된 폐 조직의 폐 조직 섬유화 관련 신호전달체계의 하위인자들의 발현양상을 검증하였다.
이를 위해, 적출된 각각의 폐 조직에서 MARK신호 및 TGFβ신호와 관련된 신호전달체계의 하위인자 발현양상을 확인하기 위해서는 웨스턴 블럿(Western blotting)을 수행하였다.
먼저, 적출된 각각의 폐 조직을 분쇄하여 단백질을 얻은 뒤 SDS-PAGE를 통하여 사이즈 별로 단백질을 분리하고 PVDF membrane에 옮겨 일차항체로 4℃C에서 면역반응시켰다. 이에 사용된 일차항체는 α-SMA(SC-53015), pERK(#4370), tERK(#4695), pSMAD2(3104S), tSMAD2(3102S) 및 Actin(SC-47778)와 같다.
그 후, HRP(Horse Radish Peroxidase)가 결합된 이차항체로 면역반응 시킨 뒤 현상하여 band를 얻고 정량화하였으며, 이에 따른 적출된 폐 조직의 폐 조직 섬유화 관련 신호전달체계의 하위인자들의 발현양상을 검증한 결과는 도7에 도시된 바와 같다.
구체적으로, 도7에 도시된 바와 같이 'BLM'모델군의 급성특발성 폐섬유증 유도 동물모델 생쥐들은 블레오마이신(Bleomycin)의 주입 후 'CON'정상적 대조군(Wild Type Control)의 정상 생쥐와 비교해 폐 조직 섬유화 관련 신호전달체계의 MARK신호 하위인자인 인산화된 형태의 ERK(Extracellular signal-Regulated Kinase) 발현이 5일째부터 증가를 보여 14일 째에는 큰 폭으로 증가되어 가장 높은 수준을 갖춘다.
또한, 도7에 도시된 바와 같이 'BLM'모델군의 급성특발성 폐섬유증 유도 동물모델 생쥐들은 블레오마이신(Bleomycin)의 주입 후 'CON'정상적 대조군(Wild Type Control)의 정상 생쥐와 비교해 폐 조직 섬유화 관련 신호전달체계의 TGFβ신호 하위인자인 인산화된 형태의 SMAD2 발현이 5일째부터 큰 폭으로 증가해 높은 수준을 갖추어 정상 수준과 큰 차이를 보인다.
아울러, 도7에 도시된 바와 같이 'BLM'모델군의 급성특발성 폐섬유증 유도 동물모델 생쥐들은 블레오마이신(Bleomycin)의 주입 후 'CON'정상적 대조군(Wild Type Control)의 정상 생쥐와 비교해 폐 조직 섬유화 관련 지표인 α-SMA 발현이 5일째부터 큰 폭으로 증가해 높은 수준을 갖추어 정상 수준과 큰 차이를 보인다.
즉, 'BLM'모델군의 급성특발성 폐섬유증 유도 동물모델 생쥐들은 블레오마이신(Bleomycin)의 주입을 통해 급성특발성 폐섬유증이 발병하였음을 알 수 있고, 구체적으로 폐 조직 내 폐 섬유화 주요 지표인 콜라겐(Collagen) 및 α-SMA의 발현, 폐 조직 섬유화 관련 바이오 마커인 Col1a1, MMP-2, MMP-12 및 TIMP1의 발현, 폐 조직 섬유화 관련 신호전달체계 MARK신호 및 TGFβ신호의 하위인자인 인산화된 형태의 ERK 및 인산화된 형태의 SMAD2 발현이 모두 정상 생쥐의 폐 조직에 비해 증가하여 높은 수준으로 차이를 나타낸다.
(3) 특발성 폐섬유증 동물모델의 Collagen 및 α-SMA 발현 검사
본 발명의 Milk fat globule-EGF factor 8(MFG-E8) 단백질 기반의 특발성 폐섬유증 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011)의 폐 조직 섬유화 방지 기능을 확인하기 위하여, 제1실험군 및 제2실험군에 해당하는 실험동물 생쥐의 폐 조직 내 콜라겐(Collagen) 및 α-SMA의 발현 양상을 검사하였다.
먼저, 'BLM+NP011'제1실험군의 급성특발성 폐섬유증 유도 동물모델 생쥐들을 블레오마이신(Bleomycin)의 주입 후 각각 3일째에 NP-011를 1회 주입 후 6일째가 경과된 시점에 마취 후 심장관류를 통해 PBS를 주입 후 폐 조직을 적출하였다.
아울러, BLM+NP011'제2실험군의 급성특발성 폐섬유증 유도 동물모델 생쥐들을 블레오마이신(Bleomycin)의 주입 후 각각 5일째에 NP-011를 1회 주입 후 8일째가 경과된 시점에 마취 후 심장관류를 통해 PBS를 주입 후 폐 조직을 적출하였다.
이와 같이 적출된 제1실험군과 제2실험군의 폐 조직을 이용한 폐 조직 내 콜라겐(Collagen) 및 α-SMA의 발현 분포 평가를 위한 Trichrome 염색 및 Sirius red 염색의 진행 방법 및 결과 도출 과정은 앞 서 설명한 'BLM'모델군의 급성특발성 폐섬유증 유도 동물모델 생쥐를 대상으로 한 방법과 동일하므로 생략한다.
이에 따라, Trichrome 염색 및 Sirius red 염색을 마친 제1실험군의 동물모델 생쥐들의 시기별 폐 조직 슬라이드는 형광현미경 (BX61; Olympus)하에서 이미지를 얻어 도9에 도시된 바와 같다.
이에 따라, Trichrome 염색 및 Sirius red 염색을 마친 제2실험군의 동물모델 생쥐들의 시기별 폐 조직 슬라이드는 형광현미경 (BX61; Olympus)하에서 이미지를 얻어 도10에 도시된 바와 같다.
구체적으로, 도9 및 도10에 도시된 바와 같이 'BLM+NP011'제1실험군 및 제2실험군의 동물모델 생쥐들은 NP-011의 주입 후 ' BLM'모델군의 급성특발성 폐섬유증 유도 동물모델 생쥐들에 비해 폐 조직 내 주요 섬유화 지표인 콜라겐(Collagen)의 발현 분포가 현저히 감소함을 알 수 있다.
아울러, 도9 및 도10에 도시된 바와 같이 'BLM+NP011'제1실험군 및 제2실험군의 동물모델 생쥐들은 NP-011의 주입 후 ' BLM'모델군의 급성특발성 폐섬유증 유도 동물모델 생쥐들에 비해 폐 조직 내 주요 섬유화 지표인 α-SMA의 발현 분포가 현저히 감소함을 알 수 있다.
다시 말해, 'BLM'모델군의 급성특발성 폐섬유증 유도 동물모델 생쥐들에 NP-011을 블레오마이신(Bleomycin)의 주입 후 3일째 또는 5일째의 시점에 투여하면 폐 조직 내 주요 섬유화 지표인 콜라겐(Collagen) 및 α-SMA의 발현 분포가 현저히 감소하여 폐 조직 섬유화 방지를 위한 우수한 수준의 항섬유화 효과를 제공할 수 있다.
(4) 특발성 폐섬유증 동물모델의 섬유화 관련 신호전달체계 변화 검사
본 발명의 Milk fat globule-EGF factor 8(MFG-E8) 단백질 기반의 특발성 폐섬유증 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011)의 폐 조직 섬유화 방지 기능을 확인하기 위하여, 제1실험군 및 제2실험군에 해당하는 실험동물 생쥐의 폐 조직 내 폐 조직 섬유화 관련 신호전달체계 MARK신호 및 TGFβ신호의 하위인자 발현 양상을 검사하였다.
먼저, 'BLM+NP011'제1실험군의 급성특발성 폐섬유증 유도 동물모델 생쥐들을 블레오마이신(Bleomycin)의 주입 후 각각 3일째에 NP-011를 1회 주입 후 6일째가 경과된 시점에 마취 후 심장관류를 통해 PBS를 주입 후 폐 조직을 적출하였다.
아울러, 'BLM+NP011'제2실험군의 급성특발성 폐섬유증 유도 동물모델 생쥐들을 블레오마이신(Bleomycin)의 주입 후 각각 5일째에 NP-011를 1회 주입 후 8일째가 경과된 시점에 마취 후 심장관류를 통해 PBS를 주입 후 폐 조직을 적출하였다.
이와 같이 적출된 제1실험군과 제2실험군의 폐 조직을 이용한 폐 조직 내 폐 조직 섬유화 관련 신호전달체계 MARK신호 및 TGFβ신호의 하위인자 발현 양상 검사를 위한 웨스턴 블럿(Western blotting) 기반의 검사 진행 방법 및 정량화 결과 도출 방법은 앞 서 설명한 'BLM'모델군의 급성특발성 폐섬유증 유도 동물모델 생쥐를 대상으로 한 방법과 동일하므로 생략한다.
이에 따라, 제1실험군의 동물모델 생쥐들의 적출된 폐 조직 내 폐 조직 섬유화 관련 신호전달체계의 하위인자들의 발현양상을 검증한 결과는 도11에 도시된 바와 같다.
또한, 제2실험군의 동물모델 생쥐들의 적출된 폐 조직 내 폐 조직 섬유화 관련 신호전달체계의 하위인자들의 발현양상을 검증한 결과는 도12에 도시된 바와 같다.
구체적으로, 도11에 도시된 바와 같이 'BLM+NP011'제1실험군의 동물모델 생쥐들은 NP-011의 주입 후 ' BLM'모델군의 급성특발성 폐섬유증 유도 동물모델 생쥐들에 비해 폐 조직 내 폐 조직 섬유화 관련 신호전달체계의 MARK신호 하위인자인 인산화된 형태의 ERK(Extracellular signal-Regulated Kinase) 발현이 현저히 감소함을 확인할 수 있다.
아울러, 도11에 도시된 바와 같이 'BLM+NP011'제1실험군의 동물모델 생쥐들은 NP-011의 주입 후 ' BLM'모델군의 급성특발성 폐섬유증 유도 동물모델 생쥐들에 비해 폐 조직 내 폐 조직 섬유화 관련 신호전달체계의 TGFβ신호 하위인자인 인산화된 형태의 SMAD2 발현이 역시 현저히 감소함을 확인할 수 있다.
또한, 도12에 도시된 바와 같이 'BLM+NP011'제2실험군의 동물모델 생쥐들은 NP-011의 주입 후 ' BLM'모델군의 급성특발성 폐섬유증 유도 동물모델 생쥐들에 비해 폐 조직 내 폐 조직 섬유화 관련 신호전달체계의 MARK신호 하위인자인 인산화된 형태의 ERK(Extracellular signal-Regulated Kinase) 발현이 현저히 감소하여 정상 생쥐의 발현 수준과 유사해짐을 확인할 수 있다.
아울러, 또한, 도12에 도시된 바와 같이 'BLM+NP011'제2실험군의 동물모델 생쥐들은 NP-011의 주입 후 ' BLM'모델군의 급성특발성 폐섬유증 유도 동물모델 생쥐들에 비해 폐 조직 내 주요 폐 조직 섬유화 지표인 α-SMA의 발현이 현저히 감소하여 정상 생쥐의 발현 수준과 유사해짐을 확인할 수 있다.
다시 말해, ' BLM'모델군의 급성특발성 폐섬유증 유도 동물모델 생쥐들에 NP-011을 블레오마이신(Bleomycin)의 주입 후 3일째 또는 5일째의 시점에 투여하면 폐 조직 내 폐 조직 섬유화 관련 신호전달체계 MARK신호 하위인자인 인산화된 형태의 ERK 및 TGFβ신호 하위인자인 인산화된 형태의 SMAD2의 발현이 급감하게 되고, 더 나아가 주요 폐 조직 섬유화 지표인 α-SMA의 발현 역시 현저히 감소하여 정상 생쥐의 발현 수준과 유사해져 폐 조직 섬유화 방지를 위한 우수한 수준의 항섬유화 효과를 제공할 수 있다.
(5) 특발성 폐섬유증 동물모델의 폐섬유화 관련 바이오마커 발현 검사
본 발명의 Milk fat globule-EGF factor 8(MFG-E8) 단백질 기반의 특발성 폐섬유증 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011)의 폐 조직 섬유화 방지 기능을 확인하기 위하여, 제1실험군에 해당하는 실험동물 생쥐의 폐 조직 내 폐 조직 섬유화 관련 바이오 마커인 Col1a1, MMP-2, MMP-12 및 TIMP1의 발현 양상을 검사하였다.
먼저, 'BLM+NP011'제1실험군의 급성특발성 폐섬유증 유도 동물모델 생쥐들을 블레오마이신(Bleomycin)의 주입 후 각각 3일째에 NP-011를 1회 주입 후 6일째가 경과된 시점에 마취 후 심장관류를 통해 PBS를 주입 후 폐 조직을 적출하였다.
이와 같이 적출된 제1실험군의 폐 조직을 이용한 폐 조직 내 폐 조직 섬유화 관련 바이오 마커들의 발현 분포 평가를 위한 프라이머를 이용한 중합효소연쇄반응(PCR, Polymerase chain reaction) 분석 방법, 이용되는 프라이머의 서열 및 결과 도출 과정은 앞 서 설명한 'BLM'모델군의 급성특발성 폐섬유증 유도 동물모델 생쥐를 대상으로 한 방법과 동일하므로 생략한다.
이에 따라, 제1실험군의 동물모델 생쥐들의 적출된 폐 조직 내 폐 조직 섬유화 관련 바이오 마커인 Col1a1, MMP-2, MMP-12 및 TIMP1의 발현 양상을 검증한 결과는 도13에 도시된 바와 같다.
구체적으로, 도13에 도시된 바와 같이 'BLM+NP011'제1실험군의 동물모델 생쥐들은 NP-011의 주입 후 'BLM'모델군의 급성특발성 폐섬유증 유도 동물모델 생쥐들에 비해 폐 조직 내 폐 조직 섬유화 관련 바이오 마커인 Col1a1, MMP-2, MMP-12 및 TIMP1의 발현이 현저히 감소하여 정상 생쥐의 발현 수준에 가까워짐을 확인할 수 있다.
다시 말해, 'BLM'모델군의 급성특발성 폐섬유증 유도 동물모델 생쥐들에 NP-011을 블레오마이신(Bleomycin)의 주입 후 3일째의 시점에 투여하면 폐 조직 내 폐 조직 섬유화 관련 바이오 마커인 Col1a1, MMP-2, MMP-12 및 TIMP1의 발현이 현저히 감소하여 정상 생쥐의 발현 수준과 유사해져 폐 조직 섬유화 방지를 위한 우수한 수준의 항섬유화 효과를 제공할 수 있다.
본 발명에 개시된 실시예는 본 발명의 기술 사상을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시예에 의해서 본 발명의 기술 사상의 범위가 한정되는 것은 아니다. 보호범위는 아래 청구범위에 의하여 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술 사상은 본 발명의 권리 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.
<110> NEXEL CO.,LTD. <120> RECOMBINANT PROTEIN FOR IDIOPATHIC PULMONARY FIBROSIS TREATMENT OR PREVENTION AND COMPOSITION FOR IDIOPATHIC PULMONARY FIBROSIS TREATMENT OR PREVENTION CONTAINING THEREOF <130> LP18-109 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 202 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RECOMBINANT PROTEIN(NP-011) FOR IDIOPATHIC PULMONARY FIBROSIS TREATMENT OR PREVENTION <400> 1 Leu Asp Ile Cys Ser Lys Asn Pro Cys His Asn Gly Gly Leu Cys Glu 1 5 10 15 Glu Ile Ser Gln Glu Val Arg Gly Asp Val Phe Pro Ser Tyr Thr Cys 20 25 30 Thr Cys Leu Lys Gly Tyr Ala Gly Asn His Cys Glu Thr Lys Cys Val 35 40 45 Glu Pro Leu Gly Met Glu Asn Gly Asn Ile Ala Asn Ser Gln Ile Ala 50 55 60 Ala Ser Ser Val Arg Val Thr Phe Leu Gly Leu Gln His Trp Val Pro 65 70 75 80 Glu Leu Ala Arg Leu Asn Arg Ala Gly Met Val Asn Ala Trp Thr Pro 85 90 95 Ser Ser Asn Asp Asp Asn Pro Trp Ile Gln Val Asn Leu Leu Arg Arg 100 105 110 Met Trp Val Thr Gly Val Val Thr Gln Gly Ala Ser Arg Leu Ala Ser 115 120 125 His Glu Tyr Leu Lys Ala Phe Lys Val Ala Tyr Ser Leu Asn Gly His 130 135 140 Glu Phe Asp Phe Ile His Asp Val Asn Lys Lys His Lys Glu Phe Val 145 150 155 160 Gly Asn Trp Asn Lys Asn Ala Val His Val Asn Leu Phe Glu Thr Pro 165 170 175 Val Glu Ala Gln Tyr Val Arg Leu Tyr Pro Thr Ser Cys His Thr Ala 180 185 190 Cys Thr Leu Arg Phe Glu Leu Leu Gly Cys 195 200 <210> 2 <211> 44 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EGF-like domain part in Recombinant Protein(NP-011) <400> 2 Leu Asp Ile Cys Ser Lys Asn Pro Cys His Asn Gly Gly Leu Cys Glu 1 5 10 15 Glu Ile Ser Gln Glu Val Arg Gly Asp Val Phe Pro Ser Tyr Thr Cys 20 25 30 Thr Cys Leu Lys Gly Tyr Ala Gly Asn His Cys Glu 35 40 <210> 3 <211> 158 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C1 domain part in Recombinant Protein(NP-011) <400> 3 Thr Lys Cys Val Glu Pro Leu Gly Met Glu Asn Gly Asn Ile Ala Asn 1 5 10 15 Ser Gln Ile Ala Ala Ser Ser Val Arg Val Thr Phe Leu Gly Leu Gln 20 25 30 His Trp Val Pro Glu Leu Ala Arg Leu Asn Arg Ala Gly Met Val Asn 35 40 45 Ala Trp Thr Pro Ser Ser Asn Asp Asp Asn Pro Trp Ile Gln Val Asn 50 55 60 Leu Leu Arg Arg Met Trp Val Thr Gly Val Val Thr Gln Gly Ala Ser 65 70 75 80 Arg Leu Ala Ser His Glu Tyr Leu Lys Ala Phe Lys Val Ala Tyr Ser 85 90 95 Leu Asn Gly His Glu Phe Asp Phe Ile His Asp Val Asn Lys Lys His 100 105 110 Lys Glu Phe Val Gly Asn Trp Asn Lys Asn Ala Val His Val Asn Leu 115 120 125 Phe Glu Thr Pro Val Glu Ala Gln Tyr Val Arg Leu Tyr Pro Thr Ser 130 135 140 Cys His Thr Ala Cys Thr Leu Arg Phe Glu Leu Leu Gly Cys 145 150 155 <210> 4 <211> 609 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA fragment encoding Recombinant Protein(NP-011) <400> 4 ctggatatct gcagcaaaaa cccgtgccac aacggtggcc tgtgcgagga aattagccaa 60 gaggtgcgtg gtgacgtttt cccgagctac acctgcacct gcctgaaggg ctatgcgggt 120 aaccactgcg agaccaaatg cgtggaaccg ctgggcatgg agaacggtaa catcgcgaac 180 agccagattg cggcgagcag cgtgcgtgtt acctttctgg gcctgcaaca ctgggttccg 240 gaactggcgc gtctgaaccg tgcgggtatg gttaacgcgt ggaccccgag cagcaacgac 300 gataacccgt ggatccaggt gaacctgctg cgtcgtatgt gggttaccgg cgtggttacc 360 cagggtgcga gccgtctggc gagccacgag tacctgaagg cgttcaaagt tgcgtatagc 420 ctgaacggcc acgaattcga ctttattcac gatgtgaaca agaaacacaa ggagttcgtt 480 ggtaactgga acaaaaacgc ggtgcacgtt aacctgtttg agaccccggt ggaagcgcag 540 tacgttcgtc tgtatccgac cagctgccac accgcgtgca ccctgcgttt tgaactgctg 600 ggttgctaa 609 <210> 5 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Signal peptide Example for NP-011 <400> 5 Met Pro Arg Pro Arg Leu Leu Ala Ala Leu Cys Gly Ala Leu Leu Cys 1 5 10 15 Ala Pro Ser Leu Leu Val Ala 20 <210> 6 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense primers for COL1A1 used for RT-PCR <400> 6 ctggcggttc aggtccaatt tccaggcaat ccacgagc 38 <210> 7 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense primers for MMP-2 used for RT-PCR <400> 7 gcgatgtcgc ccctaaaaca gctgtatgtg atctggttct tgtcc 45 <210> 8 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense primers for MMP-12 used for RT-PCR <400> 8 tggtattcaa ggagatgcgg tttgtgcctt gaaaac 36 <210> 9 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense primers for TIMP1 used for RT-PCR <400> 9 gggttcccca gaaatcaacg agacagaggc tttccatgac tggggtg 47 <210> 10 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FLAG tag in pLFCF Vector <400> 10 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 1 5

Claims (7)

  1. 서열번호1의 아미노산 서열로 이루어진 Milk fat globule-EGF factor 8(MFG-E8) 단백질 기반의 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는
    특발성 폐섬유증 예방 또는 치료용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 재조합 단백질은 예방 또는 치료 대상 폐 조직 내 Collagen, α-SMA(α-Smooth Muscle Actin) 및 인산화된 ERK(Extracellular signal-Regulated Kinase) 중 적어도 하나 이상의 발현을 감소시키는 것을 특징으로 하는
    특발성 폐섬유증 예방 또는 치료용 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 재조합 단백질은 예방 또는 치료 대상 폐 조직 내 Col1a1, MMP-2, MMP-12 및 TIMP1 중 적어도 하나 이상의 발현을 감소시키는 것을 특징으로 하는
    특발성 폐섬유증 예방 또는 치료용 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 특발성 폐섬유증 예방 또는 치료용 조성물은 병변내 투여, 혈관내 투여, 피하 투여, 비강내 투여 또는 복강내 투여용으로 제형화되는 것을 특징으로 하는
    특발성 폐섬유증 예방 또는 치료용 조성물.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
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