DE69728149T2 - Modifizierte liganden für den tie-2-rezeptor - Google Patents

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Description

  • Einleitung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der Gentechnik und insbesondere Gene für Rezeptor-Tyrosinkinasen und ihre zugehörigen Liganden, deren Insertion in rekombinante DNA-Vektoren und die Herstellung der codierten Proteine in Empfängerstämmen von Mikroorganismen und Empfänger-Eukaryontenzellen. Genauer betrifft die vorliegende Erfindung einen neuen modifizierten TIE-2-Liganden, der an den TIE-2-Rezeptor bindet, sowie Verfahren zur Herstellung und Verwendung des modifizierten Liganden. Die Erfindung stellt ferner eine Nucleinsäuresequenz, die den modifizierten Liganden codiert, und Verfahren zur Erzeugung einer Nucleinsäure, codierend den modifizierten Liganden, und des Genprodukts bereit. Der modifizierte TIE-2-Ligand sowie die Nucleinsäure, die ihn codiert, können bei der Diagnose und Behandlung von bestimmten Erkrankungen unter Beteiligung von Endothelzellen und assoziierten TIE-2-Rezeptoren wie neoplastische Erkrankungen in Verbindung mit der Tumorangiogenese, bei der Wundheilung, bei thromboembolischen Erkrankungen, Atherosklerose und entzündlichen Erkrankungen nützlich sein. Außerdem kann der modifizierte Ligand verwendet werden, um die Proliferation und/oder Differenzierung von hämatopoetischen Stammzellen zu fördern.
  • Allgemeiner können die hierin beschriebenen modifizierten TIE-2-Liganden, die einen Rezeptor aktivieren, verwendet werden, um das Wachstum, das Überleben, die Migration und/oder die Differenzierung und/oder die Stabilisierung oder Destabilisierung von Zellen, die den TIE-Rezeptor exprimieren, zu fördern. Ein biologisch aktiver, modifizierter TIE-2-Ligand kann für die in vitro-Aufrechterhaltung von Zellen, die den TIE-Rezeptor exprimieren, in der Kultur verwendet werden. Zellen und Gewebe, die den TIE-Rezeptor exprimieren, schließen zum Beispiel kardiale und vaskuläre Endothelzellen, das Linsenepithel und das Herzepikard sowie frühe hämatopoetische Zellen ein. In einer anderen Ausführungsform kann ein solcher menschlicher Ligand verwendet werden, um Zellen zu unterstützen, die so verändert werden, daß sie den TIE-Rezeptor exprimieren. Ferner können der modifizierte TIE-2-Ligand und sein zugehöriger Rezeptor in Testsystemen verwendet werden, um weitere Agonisten oder Antagonisten des Rezeptors zu identifizieren.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Das Verhalten von Zellen, welches für die Entwicklung, Aufrechterhaltung und Wiederherstellung von differenzierten Zellen und Geweben verantwortlich ist, wird großenteils durch interzelluläre Signale gesteuert, die mit Hilfe von Wachstumsfaktoren und ähnlichen Liganden und deren Rezeptoren übertragen werden. Die Rezeptoren befinden sich auf der Zelloberfläche der antwortenden Zellen und binden Peptide oder Polypeptide, die als Wachstumsfaktoren bekannt sind, sowie andere Hormon-ähnliche Liganden. Die Ergebnisse dieser Wechselwirkung sind schnelle biochemische Veränderungen in den antwortenden Zellen sowie eine schnelle und dauerhafte Nachregulierung der zellulären Genexpression. Einige Rezeptoren, die mit verschiedenen Zelloberflächen assoziiert sind, können spezifische Wachstumsfaktoren binden.
  • Die Phosphorylierung von Tyrosinresten in Proteinen durch Tyrosinkinasen ist einer der Schlüsselmechanismen, durch welche Signale über die Plasmamembran fortgeleitet werden. Einige der gegenwärtig bekannten Protein-Tyrosinkinase-Gene codieren Transmembranrezeptoren für Polypeptid-Wachstumsfaktoren und Hormone, wie den epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), Insulin, den Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor-I (IGF-I), die durch Thrombocyten gebildeten Wachstumsfaktoren (PDGF-A und -B) und die Fibroblasten-Wachstumsfaktoren (FGFs). (Heldin et al., Cell Regulation 1 (1990), 555–566; Ullrich et al., Cell 61 (1990), 243–254). In jedem Fall üben diese Wachstumsfaktoren ihre Wirkung über die Bindung an den extrazellulären Teil ihrer zugehörigen Rezeptoren aus, was zur Aktivierung der intrinsischen Tyrosinkinase führt, die auf dem cytoplasmatischen Abschnitt des Rezeptors vorliegt. Wachstumsfaktor-Rezeptoren von Endothelzellen sind wegen der möglichen Beteiligung von Wachstumsfaktoren an mehreren wichtigen physiologischen und pathologischen Prozessen wie Vaskulogenese, Angiogenese, Atherosklerose und entzündlichen Erkrankungen von besonderem Interesse. (Folkman et al., Science 235 (1987), 442–447). Auch die Rezeptoren von einigen hämatopoetischen Wachstumsfaktoren sind Tyrosinkinasen; diese schließen c-fms, welcher der Rezeptor für den Kolonie-stimulierenden Faktor 1 ist (Sherr et al., Cell 41 (1985), 665–676), sowie c-kit, einen primitiven Rezeptor für einen hämatopoetischen Wachstumsfaktor, beschrieben bei Huang et al., Cell 63 (1990), 225–233, ein.
  • Die Rezeptor-Tyrosinkinasen sind basierend auf der charakteristischen Struktur ihrer Ektodomänen in evolutionäre Unterfamilien eingeteilt worden. (Ullrich et al., Cell 61 (1990), 243–254). Solche Unterfamilien schließen EGF-Rezeptor-ähnliche Kinase (Unterklasse I) und Insulin-Rezeptor-ähnliche Kinase (Unterklasse II) ein, welche jeweils wieder kehrende homologe, Cystein-reiche Sequenzen in ihren extrazellulären Domänen enthalten. Eine einzelne Cystein-reiche Region kommt auch in den extrazellulären Domänen der ephähnlichen Kinasen vor. Hirai et al., Science 238 (1987), 1717–1720; Lindberg et al., Mol. Cell. Biol. 10 (1990), 6316–6324; Lhotak et al., Mol. Cell. Biol. 11 (1991), 2496–2502. PDGF-Rezeptoren sowie c-fms- und c-kit-Rezeptor-Tyrosinkinasen können in die Gruppe der Unterklasse III eingeteilt werden; während die FGF-Rezeptoren die Unterklasse IV bilden. Typisch für die Vertreter dieser beiden Unterklassen sind extrazelluläre Faltungseinheiten, die durch Disulfidbrücken innerhalb der Kette stabilisiert werden. Diese sogenannten Immunglobulin (Ig)-ähnlichen Faltungen sind in den Proteinen der Immunglobulin-Überfamilie zu finden, die eine große Vielzahl anderer Zelloberflächenrezeptoren mit entweder zellgebundenen oder löslichen Liganden enthält. Williams et al., Ann. Rev. Immunol. 6 (1988), 381–405.
  • Rezeptor-Tyrosinkinasen unterscheiden sich bezüglich ihrer Spezifität und Affinität. Im allgemeinen sind Rezeptor-Tyrosinkinasen Glycoproteine, bestehend aus: (1) einer extrazellulären Domäne, welche fähig ist, den/die spezifischen Wachstumsfaktoren) zu binden; (2) einer Transmembrandomäne, die üblicherweise ein alpha-Helix-Abschnitt des Proteins ist; (3) einer nahe der Membran liegenden Domäne, in der der Rezeptor reguliert werden kann, z. B. durch eine Proteinphosphorylierung; (4) einer Tyrosinkinase-Domäne, welche die enzymatische Komponente des Rezeptors ist; und (5) einem carboxyterminalen Schwanz, welcher bei vielen Rezeptoren an der Erkennung und Bindung der Substrate für die Tyrosinkinase beteiligt ist.
  • Es ist berichtet worden, daß Prozesse wie das alternative Exonspleißen und die alternative Auswahl eines Genpromotors oder von Polyadenylierungsstellen in der Lage sind, mehrere verschiedene Polypeptide aus dem gleichen Gen herzustellen. Diese Polypeptide können, aber müssen nicht, die vorstehend aufgeführten verschiedenen Domänen enthalten. Als Folge davon können einige extrazelluläre Domänen als separate, sezernierte Proteine exprimiert werden, und bei einigen Formen der Rezeptoren kann die Tyrosinkinase-Domäne fehlen, wobei sie nur die extrazelluläre Domäne, eingebaut in die Plasmamembran über die Transmembrandomäne, einschließlich eines kurzen carboxyterminalen Schwanzes enthalten.
  • Ein Gen, das eine Transmembran-Tyrosinkinase aus Endothelzellen codiert und ursprünglich mit Hilfe der RT-PCR als ein unbekanntes Tyrosinkinase-homologes cDNA-Fragment aus menschlichen Leukämiezellen identifiziert wurde, wurde durch Partanen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990), 8913–8917, beschrieben. Dieses Gen und das dadurch codierte Protein werden mit "TIE" bezeichnet, was eine Abkürzung für "Tyrosinkinase mit Ig- und EGF-Homologie-Domänen" ist. Partanen et al., Mol. Cell. Biol. 12 (1992), 1698–1707.
  • Es ist berichtet worden, daß tie-mRNA in allen Geweben des menschlichen Fötus und des Mausembryos vorhanden ist. Bei einer Untersuchung ist die tie-Botschaft in den kardialen und vaskulären Endothelzellen lokalisiert worden. Genauer ist die tie-mRNA im Endothel von Blutgefäßen und dem Endokard von 9,5 bis 18,5 Tagen alten Mausembryonen gefunden worden. Eine erhöhte tie-Expression wurde während der Gefäßneubildung in Verbindung mit der Entwicklung von Eierstockfollikeln und von Granulationsgewebe bei Hautwunden gezeigt. Korhonen et al., Blood 80 (1992), 2548–2555. Somit ist vorgeschlagen worden, daß TIEs eine Rolle bei der Angiogenese spielen, was für die Entwicklung von Behandlungen für solide Tumoren und einige andere Angiogenese-abhängigen Erkrankungen wie diabetische Retinophatie, Psoriasis, Atherosklerose und Arthritis wichtig ist.
  • Es ist berichtet worden, daß zwei strukturell verwandte Ratten-TIE-Rezeptorproteine durch verschiedene Gene mit verwandten Expressionsprofilen codiert werden. Ein Gen, bezeichnet als tie-1, ist das Ratten-Homolog zu dem menschlichem tie. Maisonpierre et al., Oncogene 8 (1993), 1631–1637. Das andere Gen, tie-2, kann das Ratten-Homolog des murinen tek-Gens sein, über das ähnlich wie für tie berichtet worden ist, daß es in der Maus ausschließlich in Endothelzellen und ihren mutmaßlichen Vorläufern exprimiert wird. Dumont et al., Oncogene 8 (1993), 1293–1301. Das menschliche Homolog von tie-2 ist bei Ziegler, US-Patent Nr. 5,447,860, erteilt am 5. September 1995 und hierin in seiner Gesamtheit eingeschlossen, beschrieben (worin es als "ork" bezeichnet wird).
  • Für beide Gene wurde festgestellt, daß sie verbreitet in Endothelzellen von embryonalen und postnatalen Geweben exprimiert werden. Bedeutende Mengen von tie-2-Transkripten waren auch in anderen embryonalen Zellpopulationen, einschließlich dem Linsenepithel, dem Herzepikard und Mesenchymregionen, vorhanden. Maisonpierre et al., Oncogene 8 (1993), 1631–1637.
  • Die überwiegende Expression des TIE-Rezeptors in Gefäßendothelen legt nahe, daß TIE eine Rolle bei der Entwicklung und Aufrechterhaltung des Gefäßsystems spielt. Dies könnte Funktionen bei der Determinierung, Proliferation, Differenzierung und Zellmigration sowie der Formung von Endothelzellen in Gefäßelemente einschließen. Untersuchungen von Maus-Embryonen, die bezüglich TIE-2 defizient sind, veranschaulichen ihre Wichtigkeit bei der Angiogenese, besonders für die Gefäßnetzbildung bei Endothelzellen. Sato T. N. et al., Nature 376 (1995), 70–74. Im ausgebildeten Gefäßsystem können die TIEs eine Funktion beim Überleben, bei der Aufrechterhaltung und bei der Reaktion auf pathogene Einflüsse von Endothelzellen haben.
  • Die TIE-Rezeptoren werden auch in primitiven hämatopoetischen Stammzellen, in B-Zellen und in einer Untergruppe der Megakaryocyten exprimiert, was auf die Rolle von Liganden hinweist, die an diese Rezeptoren in der frühen Hämatopoese, bei der Differenzierung und/oder Proliferation von B-Zellen und bei dem Differenzierungsweg von Megakaryocyten binden. Iwama et al., Biochem. Biophys. Research Communications 195 (1993), 301–309; Hashiyama et al., Blood 87 (1996), 93–101; Batard et al., Blood 87 (1996), 2212–2220.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die Erfindung stellt ein isoliertes Nucleinsäuremolekül bereit, das einen chimären TIE-2-Liganden codiert, umfassend eine N-terminale Domäne, eine Coiled-coil-Domäne und eine Fibrinogen-ähnliche Domäne, wobei mindestens zwei der Domänen von unterschiedlichen TIE-2-Liganden, gewählt aus dem TIE-2-Liganden 1, dem TIE-2-Liganden 2, dem TIE-Liganden 3 und dem TIE-Liganden 4, stammen.
  • In einer Ausführungsform codiert die Nucleinsäure einen chimären TIE-2-Liganden, wobei die N-terminale Domäne, die Coiled-coil-Domäne und die Fibrinogen-ähnliche Domäne aus dem TIE-2-Liganden 1 oder dem TIE-2-Liganden 2 stammen. Die Erfindung zieht andere Kombinationen unter Verwendung von weiteren Vertretern der TIE-2-Liganden-Familie in Betracht.
  • Die isolierte Nucleinsäure kann eine DNA, cDNA oder RNA sein. Die Erfindung sorgt auch für einen Vektor, umfassend ein isoliertes Nucleinsäuremolekül, das einen modifizierten TIE-2-Liganden codiert. Die Erfindung sorgt ferner für ein Wirt-Vektor-System für die Herstellung eines Polypeptids mit der biologischen Aktivität eines modifizierten TIE-2-Liganden in einer geeigneten Wirtszelle. Die geeignete Wirtszelle kann eine Bakterien-, Hefe, Insekten- oder Säugerzelle sein. Die Erfindung sorgt auch für ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids mit der biologischen Aktivität eines modifizierten TIE-2-Liganden, das die Züchtung von Zellen eines Wirt-Vektor-Systems unter Bedingungen; welche die Herstellung des Polypeptids erlauben, und die Gewinnung des auf diese Weise hergestellten Polypeptids umfaßt.
  • Die Erfindung stellt auch chimäre TIE-2-Liganden bereit, die durch eine Nucleinsäure der Erfindung codiert werden.
  • Die Erfindung, welche hierin ein isoliertes Nucleinsäuremolekül beschreibt, das einen chimären TIE-2-Liganden codiert, sorgt ferner für die Weiterentwicklung des Liganden zu einem Therapeutikum für die Behandlung von Patienten, welche an Störungen leiden, woran Zellen, Gewebe oder Organe beteiligt sind, die den TIE-2-Rezeptor exprimieren.
  • Die Erfindung sorgt ferner für Arzneimittel, umfassend einen chimären TIE-2-Liganden, wie hierin beschrieben, und einen pharmazeutisch verträglichen Träger. Solche Zusammensetzungen können zur Förderung der Gefäßneubildung in einem Patienten verwendet werden. In bestimmten Ausführungsformen können die erfindungsgemäßen chimären TIE-2-Liganden zur Beschleunigung der Wundheilung oder allein oder in Kombination mit anderen hämatopoetischen Faktoren zur Förderung der Proliferation oder Differenzierung von hämatopoetischen Stammzellen, B-Zellen oder Megakaryocyten verwendet werden.
  • Die vorliegende Erfindung sorgt auch für einen Antikörper, der spezifisch einen chimären TIE-2-Liganden bindet, wie hierin beschrieben, aber welcher nicht an einen nativen TIE-2-Liganden bindet. Der Antikörper kann monoclonal oder polyclonal sein. Somit sorgt die Erfindung ferner für Arzneimittel, umfassend einen Antikörper, der spezifisch an einen modifizierten TIE-2-Liganden bindet, in einem pharmazeutisch verträglichen Vehikel. Solche Zusammensetzungen können zur Blockierung des Blutgefäßwachstums in einem Säuger verwendet werden. Antikörper, die für den erfindungsgemäßen chimären TIE-2-Liganden spezifisch sind, können auch zur Überwachung des Verlaufs einer Therapie unter Verwendung des chimären TIE-2-Liganden verwendet werden.
  • In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung einen erfindungsgemäßen chimären TIE-2-Liganden, konjugiert an einen cytotoxischen Wirkstoff, und ein daraus hergestelltes Arzneimittel bereit.
  • Kurze Beschreibung der Figuren
  • 1A und 1B – Der TIE-2-Rezeptorkörper (TIE-2-RB) hemmt die Entwicklung von Blutgefäßen in der embryonalen Chorionallantoismembran (CAM) von Hühnern. Ein einziges Stück eines resorbierbaren Gelatineschaums (Gelfoam), durchtränkt mit 6 μg RB, wurde unmittelbar unter der CAM von 1 Tag alten Hühnerembryonen eingeführt. Nach einer Inkubation für weitere 3 Tage wurden die 4 Tage alten Embryonen und die umgebende CAM entnommen und untersucht. 1A: Embryonen, die mit EHK-1-RB (rEHK-1-ekto/hIgG1-Fc) behandelt wurden, waren lebensfähig und besaßen normal entwickelte Blutgefäße in ihrer umgebenden CAM. 1B: Sämtliche mit TIE-2-RB (rTIE-2-ekto/hIgG1- Fc) behandelten Embryonen waren tot, kleiner und praktisch völlig frei von umgebenden Blutgefäßen.
  • 2 – Vektor pJFE14.
  • 3 – Restriktionskarte von λgt10.
  • 4 – Nucleinsäuresequenz und daraus abgeleitete Aminosäuresequenz (Ein-Buchstaben-Code) des menschlichen TIE-2-Liganden 1 aus dem Clon λgt10, der den htie-2-Liganden 1 codiert.
  • 5 – Nucleinsäuresequenz und daraus abgeleitete Aminosäuresequenz (Ein-Buchstaben-Code) des menschlichen TIE-2-Liganden 1 aus dem T98G-Clon.
  • 6 – Nucleinsäuresequenz und daraus abgeleitete Aminosäuresequenz (Ein-Buchstaben-Code) des menschlichen TIE-2-Liganden 2 aus dem Clon pBluescript KS, der den menschlichen TIE-2-Liganden 2 codiert.
  • 7 – Western-Blot, der die Aktivierung des TIE-2-Rezeptors durch den TIE-2-Liganden 1 (Bahn L1), aber nicht durch den TIE-2-Liganden 2 (Bahn L2) oder die Kontrolle (Schein) zeigt.
  • 8 – Western-Blot, welcher zeigt, daß die vorherige Behandlung von HAEC-Zellen mit einem Überschuß des TIE-2-Liganden 2 (Bahn 2) der späteren Fähigkeit eines verdünnten TIE-2-Liganden 1 entgegenwirkt, den TIE-2-Rezeptor (TIE-2-R) zu aktivieren, verglichen mit der vorherigen Behandlung von HAEC-Zellen mit SCHEIN-Medium (Bahn 1).
  • 9 – Western-Blot, welcher die Fähigkeit von TL2 veranschaulicht, die TL1-Aktivierung des TIE-2-Rezeptors unter Verwendung der menschlichen Zellhybridlinie EA. hy926 kompetitiv zu hemmen.
  • 10 – Histogramm, das die Bindung an Ratten-TIE-2-IgG, welches an einer Oberfläche immobilisiert ist, durch einen TIE-2-Liganden in konzentrierten (10 ×) konditionierten Medien von C2C12-ras-, Rat2-ras-, SHEP- und T98G-Zellen wiedergibt. Die spezifische Bindung von Ratten-TIE-2 (rTIE-2) wird durch die signifikante Verringerung der Bindungsaktivität in Gegenwart von 25 μg/ml löslichem Ratten-TIE-2-RB im Vergleich zu einer geringfügigen Verringerung in Gegenwart von löslichem trkB-RB gezeigt.
  • 11 – Bindung des rekombinanten menschlichen TIE-2-Liganden 1 (hTL1) und des menschlichen TIE-2-Liganden 2 (hTL2) in COS-Zellüberständen an einen menschlichen TIE-2-Rezeptorkörper (RB), der an einer Oberfläche immobilisiert ist. Die spezifische Bindung des menschlichen TIE-2 wurde dadurch bestimmt, daß die Proben mit 25 μg/ml von entweder dem löslichen menschlichen TIE-2-RB oder dem trkB-RB inkubiert wurden; eine signifikante Verringerung der Bindungsaktivität wird nur für die Proben beobachtet, welche mit dem menschlichen TIE-2-RB inkubiert wurden.
  • 12 – Western-Blot, welcher zeigt, daß der TIE-2-Rezeptorkörper (bezeichnet als TIE-2-RB oder auch TIE-2-Fc) die Aktivierung von TIE-2-Rezeptoren durch den TIE-2-Liganden 1 (TL1) in HUVEC-Zellen blockiert, während ein nicht damit verwandter Rezeptorkörper (TRKB-Fc) diese Aktivierung nicht blockiert.
  • 13 – Agarosegele, die Verdünnungsreihen [unverdünnt (1) bis 10–4] der RT-PCR-Produkte von TL1 und TL2 zeigen, welche aus der fötalen Leber einer E14.5-Maus (Bahnen 1 – gesamt, Bahnen 2 – stromal angereichert, und Bahnen 4 – hämatopoetische c-kit+-TER119-Vorläuferzellen) und dem fötalen Thymus einer E14.5-Maus (Bahnen 2 – gesamt) zeigt.
  • 14 – Agarosegele, die Verdünnungsreihen [unverdünnt (1) bis 10–3] der RT-PCR-Produkte von TL1 und TL2 zeigen, die aus kortikalen Stromazellen (Bahnen 1 – CDR1+/A2B5-) und medullären Stromazellen (Bahn CDR1–/A2B5+) des fötalen Thymus einer E17.5-Maus erhalten wurden.
  • 15 – Schematische Darstellung der angenommen Funktion von TIE-2/TIE-Liganden bei der Angiogenese. TL1 ist durch (·) dargestellt, TL2 ist durch (*) wiedergegeben, TIE-2 ist durch (T) dargestellt, VEGF ist durch ([]) wiedergegeben, und flk-1 (ein VEGF-Rezeptor) ist durch (Y) wiedergegeben.
  • 16 – In situ-Hybridisierungs-Objektträger, welche das zeitliche Expressionsmuster von TIE-2, TL1, TL2 und VEGF während der Angiogenese in Verbindung mit der Follikelentwicklung und der Gelbkörperbildung im Eierstock einer Ratte zeigen, die mit dem Serum einer trächtigen Stute behandelt wurde. Spalte 1: früher prä-ovulatorischer Follikel; Spalte 2: prä-ovulatorischer Follikel; Spalte 3: früher Gelbkörper; und Spalte 4: atretischer Ovarialfollikel; Reihe A: Hellfeld; Reihe B: VEGF; Reihe C: TL2; Reihe D: TL1 und Reihe E: TIE-2-Rezeptor.
  • 17 – Vergleich der Aminosäuresequenzen eines reifen TL1-Proteins und eines reifen TL2-Proteins. Die TL1-Sequenz entspricht der in 4 angegebenen Sequenz, außer daß die mutmaßliche Leadersequenz entfernt worden ist. In ähnlicher Weise entspricht die TL2-Sequenz der in 6 angegebenen Sequenz, außer daß die mutmaßliche Leadersequenz entfernt worden ist. Pfeile zeigen die Reste Arg49, Cys245 und Arg264 von TL1 an, welche den Resten an den Aminosäurepositionen 69, 265 bzw. 284 von TL1 entsprechen, wie in 4 angegeben.
  • 18 – Western-Blot der kovalent verknüpften multimeren Struktur von TL1 und TL2 (Tafel A) und der Interkonversion von TL1 und TL2 durch die Mutation eines Cysteinrestes (Tafel B).
  • 19 – Eine typische Kurve der TIE-2-IgG-Bindung an einen immobilisierten TL1 in einem quantitativen, zellfreien Bindungstest.
  • 20 – Eine typische Kurve, welche die Bindung eines Ligandenkörpers des TIE-2-Liganden 1, umfassend die Fibrinogen-ähnliche Domäne des Liganden, gebunden an die Fc-Domäne von IgG (TL1-fFc), an die immobilisierte TIE-2-Ektodomäne in einem quantitativen, zellfreien Bindungstest zeigt.
  • 21 – Nucleotidsequenz und daraus abgeleitete Aminosäuresequenz (Ein-Buchstaben-Code) des TIE-Liganden 3. Die codierende Sequenz beginnt bei Position 47. Die Fibrinogen-ähnliche Domäne beginnt bei Position 929.
  • 22 – Vergleich der Aminosäuresequenzen von Vertretern der TIE-Liganden-Familie. mTL3 = Maus-TIE-Ligand 3; hTL1 = menschlicher TIE-2-Ligand 1; chTL1 = Hühner-TIE-2-Ligand 1; mTL1 = Maus-TIE-2-Ligand 1; mTL2 = Maus-TIE-2-Ligand 2; hTL2 = menschlicher TIE-2-Ligand 2. Die eingerahmten Bereiche zeigen konservierte homologe Regionen bei der Familienmitgliedern an.
  • 23 – Nucleotidsequenz und daraus abgeleitete Aminosäuresequenz (Ein-Buchstaben-Code) des TIE-Liganden 4. Der Pfeil zeigt die Nucleotidposition 569 an.
  • 24 – Nucleotidsequenz und daraus abgeleitete Aminosäuresequenz (Ein-Buchstaben-Code) eines chimären TIE-Liganden, welcher als 1N1C2F (Chimäre 1) bezeichnet wird. Die mutmaßliche Leadersequenz wird durch die Nucleotide 1–60 codiert.
  • 25 – Nucleotidsequenz und daraus abgeleitete Aminosäuresequenz (Ein-Buchstaben-Code) eines chimären TIE-Liganden, welcher als 2N2C1F (Chimäre 2) bezeichnet wird. Die mutmaßliche Leadersequenz wird durch die Nucleotide 1–48 codiert.
  • 26 – Nucleotidsequenz und daraus abgeleitete Aminosäuresequenz (Ein-Buchstaben-Code) eines chimären TIE-Liganden, welcher als 1N2C2F (Chimäre 3) bezeichnet wird. Die mutmaßliche Leadersequenz wird durch die Nucleotide 1–60 codiert.
  • 27 – Nucleotidsequenz und daraus abgeleitete Aminosäuresequenz (Ein-Buchstaben-Code) eines chimären TIE-Liganden, welcher als 2N1C1F (Chimäre 4) bezeichnet wird. Die mutmaßliche Leadersequenz wird durch die Nucleotide 1–48 codiert.
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Wie nachstehend ausführlicher beschrieben wird, haben die Anmelder neue, modifizierte chimäre TIE-Liganden hergestellt, welche an den TIE-2-Rezeptor binden. Die vorliegende Erfindung sorgt für eine Zusammensetzung, umfassend einen chimären TIE-2-Liganden, der im wesentlichen frei von anderen Proteinen ist.
  • Die erfindungsgemäßen chimären TIE-2-Liganden sind modifizierte TIE-2-Liganden, welche mindestens einen Teil eines ersten TIE-2-Liganden und einen Teil eines zweiten TIE-2-Liganden, der von dem ersten verschieden ist, umfassen. Als ein nichtbegrenzendes Beispiel ist der erste TIE-2-Ligand TL1 und ist der zweite TIE-2-Ligand TL2. Die Erfindung zieht andere Kombinationen unter Verwendung von weiteren Vertretern der TIE-2-Liganden-Familie in Betracht. Zum Beispiel sind andere Kombinationen zur Herstellung eines chimären TIE-2-Liganden möglich, einschließlich, aber nicht begrenzt auf, solche Kombinationen, wobei der erste Ligand gewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus TL1, TL2, TL3 und TL4, und der zweite Ligand, der von dem ersten Liganden verschieden ist, gewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus TL1, TL2, TL3 und TL4.
  • Die vorliegende Erfindung umfaßt die modifizierten, chimären TIE-2-Liganden und deren Aminosäuresequenzen als auch funktionell äquivalente Varianten davon sowie Proteine oder Peptide, umfassend Substitutionen, Deletionen oder Insertionsmutanten der beschriebenen Sequenzen, die an den TIE-2-Rezeptor binden und als Agonisten oder Antagonisten davon wirksam sind. Solche Varianten schließen diejenigen ein, worin Aminosäurereste innerhalb der Sequenz durch Reste substituiert sind, die einen stummen Austausch zur Folge haben. Zum Beispiel können ein oder mehrere Aminosäurereste innerhalb der Sequenz durch eine oder mehrere andere Aminosäuren mit ähnlicher Polarität, die als ein funktionelles Äquivalent wirksam sind, substituiert werden, woraus eine stumme Veränderung resultiert. Substituenten für eine Aminosäure innerhalb der Sequenz können aus anderen Vertretern der Klasse, zu welcher die Aminosäure gehört, gewählt sein. Zum Beispiel schließt die Klasse der unpolaren (hydrophoben) Aminosäuren Alanin, Leucin, Isoleucin, Valin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan und Methionin ein. Die polaren neutralen Aminosäuren schließen Glycin, Serin, Threonin, Cystein, Tyrosin, Asparagin und Glutamin ein. Die positiv geladenen (basischen) Aminosäuren schließen Arginin, Lysin und Histidin ein. Die negativ geladenen (sauren) Aminosäuren schließen Asparaginsäure und Glutaminsäure ein.
  • Im Schutzumfang der Erfindung sind auch Proteine oder Fragmente oder Derivate davon, welche die gleiche oder eine ähnliche biologische Aktivität wie die hierin beschrie benen modifizierten TIE-2-Liganden zeigen, sowie Derivate, die während oder nach der Translation unterschiedlich modifiziert werden, z. B. durch Glycosylierung, proteolytische Spaltung, Bindung an ein Antikörpermolekül oder einen anderen zellulären Liganden, etc., eingeschlossen. Funktionell äquivalente Moleküle schließen auch Moleküle ein, die Modifikationen enthalten, einschließlich N-terminale Modifikationen, die aus der Expression in einem bestimmten rekombinanten Wirt resultieren, wie zum Beispiel eine N-terminale Methylierung, die in bestimmten bakteriellen (z. B. E. coli) Expressionssystemen vorkommt.
  • Die vorliegende Erfindung umfaßt auch die Nucleotidsequenzen, welche die Proteine codieren, die hierin als modifizierte TIE-2-Liganden beschrieben werden, sowie Wirtszellen, einschließlich Hefen, Bakterien, Viren und Säugerzellen, die zur Herstellung der Proteine gentechnisch verändert werden, z. B. durch Transfektion, Transduktion, Infektion, Elektroporation oder Mikroinjektion einer Nucleinsäure, welche die hierin beschriebenen modifizierten TIE-2-Liganden codiert, in einem geeigneten Expressionsvektor. Die vorliegende Erfindung umfaßt auch das Einschleusen der Nucleinsäure, die modifizierte TIE-2-Liganden codiert, durch die Techniken der Gentherapie, wie zum Beispiel bei Finkel und Epstein, FASEB J. 9 (1995), 843–851; Guzman et al., PNAS (USA) 91 (1994), 10732–10736, beschrieben ist.
  • Der Fachmann erkennt auch, daß die vorliegende Erfindung DNA- und RNA-Sequenzen umfaßt, die mit einer Nucleotidsequenz, welche einen modifizierten TIE-2-Liganden codiert, unter Bedingungen einer moderaten Stringenz, wie zum Beispiel bei Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Bd. 1, S. 101–104, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), definiert, hybridisiert. Folglich schließt ein erfindungsgemäßes Nucleinsäuremolekül ein Molekül mit einer Nucleotidsequenz, abgeleitet aus einer Aminosäuresequenz eines modifizierten TIE-2-Liganden, welcher hergestellt wird, wie hierin beschrieben, sowie ein Molekül mit einer Nucleotidsequenz, die mit einer solchen Nucleotidsequenz hybridisiert, und auch eine Nucleotidsequenz, die bezüglich der vorstehenden Sequenzen als Ergebnis des genetischen Codes degeneriert ist, aber welche einen Liganden codiert, der an einen TIE-2-Rezeptor bindet und eine Aminosäuresequenz und andere primäre, sekundäre und tertiäre Eigenschaften aufweist, die ausreichend diejenigen des hierin beschriebenen modifizierten TIE-2-Liganden widerspiegeln, um auf das Molekül die gleiche biologische Aktivität wie die des hierin beschriebenen modifizierten TIE-2-Liganden zu übertragen, ein.
  • Die vorliegende Erfindung sorgt für ein isoliertes Nucleinsäuremolekül, codierend einen modifizierten TIE-2-Liganden, der den TIE-2-Rezeptor bindet und diesen aktiviert, umfassend eine Nucleotidsequenz, die den TIE-2-Liganden 1 codiert, worin der Teil der Nucleotidsequenz, welcher die N-terminale Domäne des TIE-2-Liganden 1 codiert, durch eine Nucleotidsequenz ersetzt ist, welche die N-terminale Domäne des TIE-2-Liganden 2 codiert. Die Erfindung sorgt auch für ein solches Nucleinsäuremolekül, das eine weitere Modifikation aufweist, so daß der Teil der Nucleotidsequenz, welcher die Coiled-coil-Domäne des TIE-2-Liganden 1 codiert, durch eine Nucleotidsequenz ersetzt ist, welche die Coiled-coil-Domäne des TIE-2-Liganden 2 codiert.
  • Die vorliegende Erfindung sorgt auch für ein isoliertes Nucleinsäuremolekül, codierend einen modifizierten TIE-2-Liganden, der den TIE-2-Rezeptor bindet und diesen aktiviert, umfassend eine Nucleotidsequenz, welche den TIE-2-Liganden 1 codiert, worin der Teil der Nucleotidsequenz, welcher die N-terminale Domäne des TIE-2-Liganden 1 codiert, durch eine Nucleotidsequenz ersetzt ist, welche die N-terminale Domäne des TIE-2-Liganden 2 codiert, und welche weiterhin derart modifiziert ist, daß sie eine andere Aminosäure anstelle des Cysteinrestes codiert, der durch die Nucleotide 784–787 codiert wird, wie in 27 angegeben. Vorzugsweise wird ein Serinrest für den Cysteinrest substituiert. In einer anderen Ausführungsform ist das Nucleinsäuremolekül weiterhin derart modifiziert, daß es eine andere Aminosäure anstelle des Argininrestes codiert, der durch die Nucleotide 199–201 codiert wird, wie in 27 angegeben. Vorzugsweise wird ein Serinrest für den Argininrest substituiert.
  • Die vorliegende Erfindung sorgt ferner für ein isoliertes Nucleinsäuremolekül, codierend einen modifizierten TIE-2-Liganden, der an den TIE-2-Rezeptor bindet, aber diesen nicht aktiviert, umfassend eine Nucleotidsequenz, die den TIE-2-Liganden 1 codiert, worin der Teil der Nucleotidsequenz, welcher die Fibrinogen-ähnliche Domäne des TIE-2-Liganden 1 codiert, durch eine Nucleotidsequenz ersetzt ist, welche die Fibrinogen-ähnliche Domäne des TIE-2-Liganden 2 codiert. Die Erfindung sorgt auch für ein solches Nucleinsäuremolekül, welches weiterhin derart modifiziert ist, daß der Teil der Nucleotidsequenz, welcher die Coiled-coil-Domäne des TIE-2-Liganden 1 codiert, durch eine Nucleotidsequenz ersetzt ist, welche die Coiled-coil-Domäne des TIE-2-Liganden 2 codiert.
  • Die Erfindung sorgt ferner für einen modifizierten TIE-2-Liganden, welcher durch irgendeines der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle codiert wird.
  • Die Erfindung stellt auch ein Nucleinsäuremolekül bereit, das einen chimären TIE-Liganden codiert, wie in 24, 25, 26 oder 27 angegeben. Die Erfindung stellt auch einen chimären TIE-Liganden bereit, wie in 24, 25, 26 oder 27 angegeben. Die Erfindung stellt ferner einen chimären TIE-Liganden bereit, wie in 27 angegeben, welcher derart modifiziert wurde, daß er eine andere Aminosäure anstelle des Cysteinrestes codiert, der durch die Nucleotide 784–787 codiert wird.
  • Jedes der Verfahren, welche dem Fachmann für die Insertion von DNA-Fragmenten in einen Vektor bekannt sind, kann angewendet werden, um Expressionsvektoren, die einen modifizierten TIE-2-Liganden codieren, unter Verwendung geeigneter Transkriptions/Translationskontrollsignale und der Sequenzen, welche das Protein codieren, zu konstruieren. Diese Verfahren können in vitro-DNA-Rekombinations- und -Synthesetechniken sowie in vivo-Rekombinationen (genetische Rekombination) einschließen. Die Expression einer Nucleinsäuresequenz, die einen modifizierten TIE-2-Liganden oder Peptidfragmente davon codiert, kann durch eine zweite Nucleinsäuresequenz reguliert werden, welche mit einer Sequenz, die einen modifizierten TIE-2-Liganden codiert, funktionell verbunden ist, so daß das Protein oder das Peptid des modifizierten TIE-2-Liganden in einem Wirt exprimiert wird, der mit dem rekombinanten DNA-Molekül transformiert wurde. Zum Beispiel kann die Expression eines hierin beschriebenen modifizierten TIE-2-Liganden durch irgendein Promotor/Enhancer-Element, das auf dem Fachgebiet bekannt ist, kontrolliert werden. Promotoren, die verwendet werden können, um die Expression des Liganden zu kontrollieren, schließen, aber sind nicht begrenzt auf, die lange terminale Wiederholung, wie bei Squinto et al. (Cell 65 (1991), 1–20) beschrieben; die frühe SV40-Promotorregion (Bernoist und Chambon, Nature 290, 304–310); den CMV-Promotor; die 5'-terminale Wiederholung von M-MuLV; den Promotor, welcher in der langen 3'-terminalen Wiederholung des Roussarkom-Virus enthalten ist (Yamamoto et al., Cell 22 (1980), 787–797); den Herpes-Thymidinkinase-Promotor (Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981), 144–1445); den Adenovirus-Promotor; die regulatorischen Sequenzen des Metallothionein-Gens (Brinster et al., Nature 269 (1982), 39–42; prokaryontische Expressionsvektoren wie den β-Lactamase-Promotor (Villa-Kamaroff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75 (1978), 3727–3731) oder den tac-Promotor (DeBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983), 21–25), vgl. auch "Useful Proteins From Rekombinant Bacteria" in Scientific American 242 (1980), 74–94; Promotorelemente aus Hefe oder anderen Pilzen wie den Gal4-Promotor, den ADH (Alkoholdehydrogenase)-Promotor, den PGK (Phosphoglycerinkinase)-Promotor oder den Promotor der alkalischen Phosphatase; und die folgen den tierischen Transkriptionskontrolleregionen, die eine Gewebespezifität zeigen und in transgenen Tieren verwendet worden sind: die Elastase-I-Gen-Kontrollregion, welche in azinären Pankreaszellen aktiv ist (Swift et al., Cell 38 (1984), 639–646; Ornitz et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50 (1986), 399–409; MacDonald, Hepatology 7 (1987), 425–515); die Insulin-Gen-Kontrollregion, welche in beta-Zellen der Bauchspeicheldrüse aktiv ist (Hanahan, Nature 315 (1985), 115–122); die Immunglobulin-Gen-Kontrollregion, welche in lymphoiden Zellen aktiv ist (Grosschedl et al., Cell 38 (1984), 647–658; Adames et al., Nature 318 (1985), 533–538; Alexander et al., Mol. Cell. Biol. 7 (1987), 1436–1444); die Maus-Brustdrüsentumorvirus-Kontrollregion, welche in Hoden-, Brust-, Lymphoid- und Mastzellen aktiv ist (Leder et al., Cell 45 (1986), 485–495); die Kontrollregion des Albumin-Gens, welche in der Leber aktiv ist (Pinkert et al., Genes and Devel. 1 (1987), 268–276); die Kontrollregion des alpha-Fetoproteins, welche in der Leber aktiv ist (Krumlauf et al., Mol. Cell. Biol. 5 (1985), 1639–1648; Hammer et al., Science 235 (1987), 53–58); die Kontrollregion des alpha-1-Antitrypsin-Gens, welche in der Leber aktiv ist (Kelsey et al., Genes and Devel. 1 (1987), 161–171); die Kontrollregion des beta-Globin-Gens, welche in myeloiden Zellen aktiv ist (Mogram et al., Nature 315 (1985), 338–340; Kollias et al., Cell 46 (1986), 89–94); die Kontrollregion des basischen Myelinproteins, welche in Oligodendrocyten im Gehirn aktiv ist (Readhead et al., Cell 48 (1987), 703–712); die Kontrollregion des Gens der leichten Kette 2 des Myosins, welche im Skelettmuskel aktiv ist (Shani, Nature 314 (1985), 283–286); und die Kontrollregion des Gonadotropin-Releasing-Hormons, welche im Hypothalamus aktiv ist (Mason et al., Science 234 (1986), 1372–1378), ein. Die Erfindung umfaßt ferner die Herstellung von Antisense-Verbindungen, welche fähig sind, mit einer RNA-Sequenz, die einen modifizierten TIE-2-Liganden codiert, spezifisch zu hybridisieren, um deren Expression zu modulieren. Ecker, US-Patent Nr. 5,166,195, erteilt am 24. November 1992.
  • Folglich werden erfindungsgemäß Expressionsvektoren, welche zur Replikation in einem bakteriellen oder eukaryontischen Wirt fähig sind, umfassend eine Nucleinsäure, die einen modifizierten TIE-2-Liganden codiert, wie hierin beschrieben, verwendet, um einen Wirt zu transfizieren und auf diese Weise die Expression einer solchen Nucleinsäure zu steuern, um einen modifizierten TIE-2-Liganden herzustellen, der dann in einer biologisch aktiven Form gewonnen werden kann. So wie hierin verwendet, schließt eine biologisch aktive Form eine Form ein, welche fähig ist, an den TIE-Rezeptor zu binden und eine biologische Antwort wie eine Differenzierungsfunktion oder eine Beeinflussung des Phäno typs der Zelle, die den Rezeptor exprimiert, hervorzurufen. Solche biologisch aktiven Formen können zum Beispiel die Phosphorylierung der Tyrosinkinase-Domäne des TIE-Rezeptors induzieren. Alternativ kann die biologische Aktivität eine Wirkung als ein Antagonist für den TIE-Rezeptor sein. In anderen Ausführungsformen ist die aktive Form eines modifizierten TIE-2-Liganden eine Form, welche den TIE-Rezeptor erkennen kann und auf diese Weise als ein Ansteuerungsmittel für den Rezeptor zur Verwendung bei der Diagnose als auch in der Therapie wirksam ist. Im Einklang mit solchen Ausführungsformen muß die aktive Form keine Veränderung des Phänotyps von Zellen, die den TIE exprimieren, hervorrufen.
  • Expressionsvektoren, enthaltend die Geninsertionen, können durch vier allgemeine Ansätze identifiziert werden: (a) eine DNA-DNA-Hybridisierung, (b) die Anwesenheit oder Abwesenheit von "Marker"-Genfunktionen, (c) die Expression von inserierten Sequenzen, und (d) einen PCR-Nachweis. Beim ersten Ansatz kann das Vorhandensein eines fremden Gens, inseriert in einen Expressionsvektor, durch DNA-DNA-Hybridisierung unter Verwendung von Sonden, umfassend Sequenzen, die homolog sind zu einem inserierten Gen, das einen modifizierten TIE-2-Liganden codiert, nachgewiesen werden. Beim zweiten Ansatz kann das rekombinante Vektor/Wirt-System identifiziert und basierend auf der Anwesenheit oder Abwesenheit von bestimmten "Marker"-Genfunktionen (z. B. Thymidinkinase-Aktivität, Resistenz gegen Antibiotika, Phänotyp-Transformation, Einschlußkörperbildung in Baculovirus, etc.), ausgelöst durch die Insertion von fremden Genen in den Vektor, selektiert werden. Zum Beispiel, falls eine Nucleinsäure, die einen modifizierten TIE-2-Liganden codiert, in die Marker-Gensequenz des Vektors inseriert wird, können Rekombinanten, welche die Insertion enthalten, durch das Fehlen der Marker-Genfunktion identifiziert werden. Beim dritten Ansatz können rekombinante Expressionsvektoren durch das Testen auf das fremde Genprodukt, welches durch die Rekombinante exprimiert wird, identifiziert werden. Solche Tests können zum Beispiel auf den physikalischen oder funktionellen Eigenschaften des Genprodukts eines modifizierten TIE-2-Liganden basieren; zum Beispiel durch Bindung des Liganden an den TIE-Rezeptor oder einen Teil davon, der zum Beispiel mit einem nachweisbaren Antikörper oder einem Teil davon markiert werden kann, oder durch Bindung an Antikörper, die gegen das Protein oder einen Teil davon eines modifizierten TIE-2-Liganden hergestellt werden. Die erfindungsgemäßen Zellen können vorübergehend oder vorzugsweise konstitutiv und anhaltend einen modifzierten TIE-2-Liganden, wie hierin beschrieben, exprimieren. Beim vierten Ansatz können DNA-Nucleotidprimer hergestellt werden, die einer tie-spezifischen DNA-Sequenz entsprechen. Diese Primer können dann für die PCR eines tie-Genfragments verwendet werden (PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, herausgegeben durch Michael A. Innis et al., Academic Press (1990)).
  • Der rekombinante Ligand kann durch irgendeine Technik gereinigt werden, welche die anschließende Bildung eines stabilen, biologisch aktiven Proteins ermöglicht. Vorzugsweise wird der Ligand in das Kulturmedium sezerniert, aus welchem er gewonnen wird. In einer anderen Ausführungsform kann der Ligand aus den Zellen entweder in Form von löslichen Proteinen oder als Einschlußkörper, aus welchen er durch 8 M Guanidiumhydrochlorid und eine Dialyse gemäß der hinreichend bekannten Methodik quantitativ extrahiert werden kann, gewonnen werden. Zur weiteren Reinigung des Liganden können eine Affinitätschromatographie, eine herkömmliche Ionenaustauschchromatographie, eine hydrophobe Wechselwirkungschromatographie, eine Umkehrphasenchromatographie oder eine Gelfiltration verwendet werden.
  • In weiteren Ausführungsformen der Erfindung, wie in den Beispielen ausführlicher beschrieben, kann ein Gen, das einen modifizierten TIE-2-Liganden codiert, verwendet werden, um ein endogenes Gen durch homologe Rekombination zu inaktivieren oder "auszuschalten" und auf diese Weise eine Zelle, ein Gewebe oder ein Tier zu erzeugen, die/das bezüglich des TIE-Liganden defizient ist. Beispielsweise und nicht als Begrenzung kann das Gen, das den rekombinanten TIE-Liganden 4 codiert, verändert werden, so daß es eine Insertionsmutation enthält, zum Beispiel das neo-Gen, welche das Gen, das den nativen TIE-Liganden 4 codiert, inaktiveren würde. Ein solches Konstrukt unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors kann durch eine Technik wie Transfektion, Transduktion oder Injektion in eine Zelle wie eine embryonale Stammzelle eingeschleust werden. Zellen, die das Konstrukt enthalten, können dann durch eine G418-Resistenz selektiert werden. Zellen ohne das Gen, das einen intakten TIE-Liganden 4 codiert, können dann z. B. durch ein Southern-Blot-Verfahren, einen PCR-Nachweis, ein Northern-Blot-Verfahren oder einen Expressionstest identifiziert werden. Zellen ohne das Gen, das einen intakten TIE-Liganden 4 codiert, können anschließend mit frühen Embryozellen fusioniert werden, um transgene Tiere zu erzeugen, die bezüglich eines solchen Liganden defizient sind. Ein solches Tier kann verwendet werden, um spezifische in vivo-Prozesse zu definieren, die normalerweise von dem Liganden abhängen.
  • Die vorliegende Erfindung sorgt auch für Antikörper gegen einen hierin beschriebenen modifizierten TIE-2-Liganden, die zum Nachweis des Liganden, zum Beispiel bei diagnostischen Anwendungen, nützlich sind. Zur Herstellung von monoclonalen Antikörpern, die gegen einen modifizierten TIE-2-Liganden gerichtet sind, kann irgendeine Technik, welche für die Herstellung von Antikörpermolekülen durch kontinuierliche Zelllinien in Kultur sorgt, angewendet werden. Zum Beispiel sind die Hybridomtechnik, die ursprünglich durch Köhler und Milstein (Nature 256 (1975), 495–497) entwickelt wurde, sowie die Triomtechnik, die menschliche B-Zell-Hybridomtechnik (Kozbor et al., Immunology Today 4 (1983), 72) und die EBV-Hybridomtechnik, um menschliche monoclonale Antikörper herzustellen (Cole et al., 1985, in "Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy", Alan R. Liss, Inc., S. 77–96), und ähnliche im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung eingeschlossen.
  • Die monoclonalen Antikörper können menschliche monoclonale Antikörper oder chimäre monoclonale Mensch-Maus-Antikörper (oder andere Spezies) sein. Menschliche monoclonale Antikörper können durch irgendeine der zahlreichen Techniken hergestellt werden, die auf dem Fachgebiet bekannt sind (z. B. Teng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983), 7308–7312; Kozbor et al., Immunology Today 4 (1983), 72–79; Olsson et al., Meth. Enzymol. 92 (1982), 3–16). Chimäre Antikörpermoleküle können derart hergestellt werden, daß sie eine Maus-Antigen-Bindungsdomäne mit menschlichen konstanten Regionen enthalten (Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984), 6851; Takeda et al., Nature 314 (1985), 452).
  • Verschiedene auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren können zur Herstellung von polyclonalen Antikörpern gegen die Epitope eines hierin beschriebenen modifizierten TIE-2-Liganden angewendet werden. Zur Herstellung eines Antikörpers können verschiedene Wirtstiere, einschließlich, aber nicht begrenzt auf, Kaninchen, Mäuse und Ratten, durch Injektion mit einem modifizierten TIE-2-Liganden oder einem Fragment oder einem Derivat davon immunisiert werden. Verschiedene Adjuvanzien können verwendet werden, um die Immunantwort abhängig von der Wirtspezies zu verstärken, und schließen, aber sind nicht begrenzt auf, Freundsches Adjuvans (komplettes und inkomplettes), Mineralgele wie Aluminiumhydroxid, grenzflächenaktive Stoffe wie Lysolecithin, Pluronic-Polyole, Polyanionen, Peptide, Ölemulsionen, KLH ("keyhole limpet hemocyanins"), Dinitrophenol und potentiell nützliche menschliche Adjuvanzien wie BCG (Bacillus Calmette-Guerin) und Corynebacterium parvum ein.
  • Ein molekularer Clon eines Antikörpers gegen ein ausgewähltes Epitop eines modifizierten TIE-2-Liganden kann durch bekannte Techniken hergestellt werden. Die DNA-Rekombinationsmethodik (vgl. z. B. Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York) kann angewendet werden, um Nucleinsäuresequenzen zu konstruieren, die ein monoclonales Antikörpermolekül oder eine Antigen-Bindungsregion davon codieren.
  • Die vorliegende Erfindung sorgt für Antikörpermoleküle sowie für Fragmente solcher Antikörpermoleküle. Antikörperfragmente, die den Idiotyp des Moleküls enthalten, können durch bekannte Techniken erzeugt werden. Zum Beispiel schließen solche Fragmente ein, aber sind nicht darauf begrenzt: das F(ab')2-Fragment, das durch Pepsinverdau des Antikörpermoleküls hergestellt werden kann; die Fab'-Fragmente, die durch Reduktion der Disulfidbrücken des F(ab')2-Fragments erzeugt werden können; und die Fab-Fragmente, die durch Behandlung des Antikörpermoleküls mit Papain und einem Reduktionsmittel erzeugt werden können. Antikörpermoleküle können durch bekannte Techniken gereinigt werden, z. B. durch Immunabsorptions- oder Immunaffinitätschromatographie, chromatographische Verfahren wie HPLC (Hochleistungsflüssigkeitschromatographie) oder eine Kombination davon.
  • Die vorliegende Erfindung umfaßt ferner einen Immuntest für das Messen der Menge eines modifizierten TIE-2-Liganden in einer biologischen Probe durch
    • a) Inkontaktbringen der biologischen Probe mit mindestens einem Antikörper, der einen modifizierten TIE-2-Liganden spezifisch bindet, so daß der Antikörper einen Komplex mit irgendeinem modifizierten TIE-2-Liganden bildet, der in der Probe vorhanden ist; und
    • b) Messen der Menge des Komplexes und auf diese Weise Messen der Menge des modifizierten TIE-2-Liganden in der biologischen Probe.
  • Die Erfindung umfaßt weiterhin einen Test für das Messen der Menge eines TIE-2-Rezeptors in einer biologischen Probe durch
    • a) Inkontaktbringen der biologischen Probe mit mindestens einem erfindungsgemäßen Liganden, so daß der Ligand einen Komplex mit dem TIE-Rezeptor bildet; und
    • b) Messen der Menge des Komplexes und auf diese Weise Messen der Menge des TIE-Rezeptors in der biologischen Probe.
  • Die vorliegende Erfindung sorgt auch für die Verwendung eines modifizierten TIE-2-Liganden, der den TIE-2-Rezeptor aktiviert, wie hierin beschrieben, um das Überleben und/oder das Wachstum und/oder die Migration und/oder die Differenzierung von Zellen, die den TIE-2-Rezeptor exprimieren, zu unterstützen. Folglich kann der Ligand als ein Zusatz verwendet werden, um zum Beispiel Endothelzellen in Kultur zu versorgen.
  • Ferner ermöglicht die Erzeugung eines modifizierten TIE-2-Liganden für den TIE-2-Rezeptor durch die Anmelder die Verwendung von Testsystemen, die zur Identifizierung von Agonisten oder Antagonisten des TIE-2-Rezeptors nützlich sind. Solche Testsysteme wären bei der Identifizierung von Molekülen nützlich, welche die Angiogenese fördern oder hemmen können. Zum Beispiel können in einer Ausführungsform Antagonisten des TIE-2-Rezeptors als Testmoleküle identifiziert werden, welche fähig sind, die Wechselwirkung des TIE-2-Rezeptors mit einem modifizierten TIE-2-Liganden, der an den TIE-2-Rezeptor bindet, zu stören. Solche Antagonisten werden identifiziert durch ihre Fähigkeit: 1) die Bindung eines biologisch aktiven, modifizierten TIE-2-Liganden an den Rezeptor zu blockieren, wie zum Beispiel unter Anwendung der BIAcore Biosensor-Technologie (BIAcore; Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ) gemessen wird; oder 2) die Fähigkeit eines biologisch aktiven, modifizierten TIE-2-Liganden zu blockieren, eine biologische Antwort hervorzurufen. Solche biologischen Antworten schließen, aber sind nicht begrenzt auf, die Phosphorylierung des TIE-Rezeptors oder von Stromabwärtskomponenten des TIE-Signalübertragungsweges oder das Überleben, das Wachstum oder die Differenzierung von Zellen, die den TIE-Rezeptor tragen, ein.
  • In einer Ausführungsform können Zellen, die derart verändert sind, daß sie den TIE-Rezeptor exprimieren, hinsichtlich des Wachstums von der Zugabe eines modifizierten TIE-2-Liganden abhängig sein. Solche Zellen stellen nützliche Testsysteme zur Identifizierung von weiteren Agonisten des TIE-Rezeptors oder von Antagonisten, welche fähig sind, die Aktivität des modifizierten TIE-2-Liganden auf solche Zellen zu hemmen, bereit. In einer anderen Ausführungsform können autokrine Zellen, welche derart verändert sind, daß sie sowohl einen modifizierten TIE-2-Liganden als auch den TIE-2-Rezeptor co-exprimieren können, nützliche Systeme für das Testen von möglichen Agonisten oder Antagonisten bereitstellen.
  • Daher sorgt die vorliegende Erfindung für das Einschleusen eines TIE-2-Rezeptors in Zellen, welche diesen Rezeptor normalerweise nicht exprimieren, wodurch ermöglicht wird, daß diese Zellen eine starke und einfach zu unterscheidende Antwort auf einen Liganden zeigen, der an diesen Rezeptor bindet. Der Typ der ausgelösten Antwort hängt von der verwendeten Zelle ab und nicht von dem spezifischen Rezeptor, der in die Zelle eingeschleust wurde. Geeignete Zelllinien können ausgewählt werden, um eine Antwort zu erhalten, die für das Untersuchen als auch für das Auffinden von Molekülen, die auf Tyrosinkinase-Rezeptoren einwirken können, von größtem Nutzen sind. Die Moleküle können beliebige Molekülarten sein, einschließlich, aber nicht begrenzt auf, Peptid- und Nicht-Peptidmoleküle, die in Systemen in einer An und Weise wirksam sind, die als rezeptorspezifisch beschrieben werden kann.
  • Eines der nützlicheren verwendbaren Systeme beinhaltet das Einschleusen eines TIE-Rezeptors (oder eines chimären Rezeptors, umfassend die extrazelluläre Domäne einer anderen Rezeptor-Tyrosinkinase, wie zum Beispiel trkC, und die intrazelluläre Domäne eines TIE-Rezeptors) in eine Fibroblasten-Zelllinie (z. B. NIH3T3-Zellen), so daß ein solcher Rezeptor, der normalerweise keine proliferativen oder anderen Antworten vermittelt, nach der Einschleusung in Fibroblasten durch eine Vielzahl von gut etablierten Verfahren dennoch untersucht werden kann, um die Wirkungen von Fibroblasten-Wachstumsfaktoren (z. B. Thymidineinbau oder andere Arten von Proliferationstests; vgl. van Zoelen, 1990, "The Use of Biological Assays For Detection of Polypeptid Growth Factors" in Progress Factor Research, Bd. 2, S. 131–152; Zhan und Goldfarb M., Mol. Cell. Biol., Bd. 6 (1986), S. 3541–3544) zu quantifizieren. Diese Tests besitzen den weiteren Vorteil, daß jede Präparation mit sowohl der Zelllinie, die den eingeschleusten Rezeptor besitzt, als auch mit der Stammzelllinie ohne den Rezeptor getestet werden kann. Es würden nur spezifische Wirkungen auf die Zelllinie mit dem Rezeptor beurteilt, da diese durch den eingeschleusten Rezeptor vermittelt werden. Solche Zellen können ferner derart verändert werden, daß sie einen modifizierten TIE-2-Liganden exprimieren, wodurch ein autokrines System erzeugt wird, welches zum Testen von Molekülen nützlich ist, die als Antagonisten/Agonisten dieser Wechselwirkung wirksam sind. Folglich sorgt die vorliegende Erfindung für Wirtszellen, die eine Nucleinsäure, codierend einen modifizierten TIE-2-Liganden, und eine Nucleinsäure, codierend den TIE-Rezeptor, umfassen.
  • Die Wechselwirkung zwischen dem TIE-Rezeptor und dem modifizierten TIE-2-Liganden stellt auch ein nützliches System zur Identifizierung von kleinen Molekülen bereit, die Agonisten oder Antagonisten des TIE-Rezeptors sind. Zum Beispiel können Fragmente, Mutanten oder Derivate eines modifizierten TIE-2-Liganden identifiziert werden, die an den TIE-Rezeptor binden, aber keine andere biologische Aktivität hervorrufen. In einer anderen Ausführungsform ermöglicht die Charakterisierung eines modifizierten TIE-2-Liganden die weitere Untersuchung der Eigenschaften von aktiven Teilen des Moleküls. Ferner erlaubt die Identifizierung eines Liganden die Bestimmung der Röntgenkristallstruktur des Rezeptor/Liganden-Komplexes, wodurch die Identifizierung der Bindungsstelle in dem Rezeptor er möglicht wird. Die Kenntnis der Bindungsstelle liefert nützliche Einblicke in den rationalen Aufbau von neuen Agonisten und Antagonisten.
  • Die spezifische Bindung eines Testmoleküls an den TIE-Rezeptor kann durch zahlreiche Verfahren gemessen werden. Zum Beispiel kann die tatsächliche Bindung eines Testmoleküls an Zellen, die den TIE exprimieren, nachgewiesen oder gemessen werden, indem (i) ein Testmolekül, das an die Oberfläche von intakten Zellen gebunden ist, (ii) ein Testmolekül, das mit dem TIE-Protein in Zelllysaten vernetzt ist, oder 3) ein Testmolekül, das an TIE in vitro gebunden ist, nachgewiesen oder gemessen wird. Die spezifische Wechselwirkung zwischen dem Testmolekül und TIE kann unter Verwendung von Reagenzien, welche die einzigartigen Eigenschaften dieser Wechselwirkung veranschaulichen, beurteilt werden.
  • Als ein spezifisches, nichtbegrenzendes Beispiel können die erfindungsgemäßen Verfahren wie folgt angewendet werden. Falls ein modifizierter TIE-2-Ligand in einer Probe gemessen werden soll, können verschiedene Verdünnungen der Probe (des Testmoleküls) parallel zu einer negativen Kontrolle (NC), enthaltend keine Aktivität des modifizierten TIE-2-Liganden, und einer positiven Kontrolle (PC), enthaltend eine bekannte Menge eines modifizierten TIE-2-Liganden, Zellen ausgesetzt werden, welche den TIE in Gegenwart eines nachweisbar markierten, modifizierten TIE-2-Liganden (in diesem Beispiel eines mit Iod radioaktiv markierten Liganden) exprimieren. Die Menge des modifizierten TIE-2-Liganden in der Testprobe kann durch Bestimmen der Menge des 125I-markierten, modifizierten TIE-2-Liganden, der an die Kontrollen und in jeder der Verdünnungen bindet, und dann Vergleichen der Probenwerte mit einer Standardkurve abgeschätzt werden. Je größer die Menge des modifizierten TIE-2-Liganden in der Probe ist, desto geringer ist die Menge des 125I-Liganden, die an den TIE bindet.
  • Die Menge des gebundenen 125I-Liganden kann durch Messen der Menge an Radioaktivität pro Zelle oder durch Vernetzen eines modifizierten TIE-2-Liganden mit Zelloberflächenproteinen unter Verwendung von DSS, wie bei Meakin und Shooter, Neuron 6 (1991), 153–163 beschrieben, und Nachweisen der Menge des markierten Proteins in Zellextrakten unter Verwendung von zum Beispiel einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese, welche ein markiertes Protein mit einer Größe nachweisen kann, die dem TIE-Rezeptor/modifizierten TIE-2-Liganden entspricht, bestimmt werden. Die spezifische Testmolekül/TIE-Wechselwirkung kann ferner durch Zugabe von verschiedenen Verdünnungen eines unmarkierten Kontroll-Liganden, der nicht an den TIE-Rezeptor bindet und daher keinen wesentlichen Effekt auf die Kompetition zwischen dem markierten modifizierten TIE-2-Liganden und dem Testmolekül um die TIE-Bindung haben sollte, untersucht werden. In einer anderen Ausführungsform kann davon ausgegangen werden, daß ein Molekül, das bekanntermaßen in der Lage ist, die Bindung zwischen dem TIE-Rezeptor und dem modifizierten TIE-2-Liganden aufzubrechen, wie zum Beispiel, aber nicht begrenzt auf, ein anti-TIE-Antikörper oder ein TIE-Rezeptorkörper, wie hierin beschrieben, die Kompetition zwischen dem 125I-modifizierten TIE-2-Liganden und dem Testmolekül um die Bindung an den TIE-Rezeptor stört.
  • Nachweisbar markierte, modifizierte TIE-2-Liganden schließen, aber sind nicht begrenzt auf, einen modifizierten TIE-2-Liganden ein, der an eine radioaktive Substanz, eine fluoreszierende Substanz, eine Substanz, die eine enzymatischen Aktivität besitzt, eine Substanz, die als ein Substrat für ein Enzym dienen kann (Enzyme und Substrate, die mit kolorimetrisch nachweisbaren Reaktionen assoziiert sind, werden bevorzugt), oder an eine Substanz, die durch ein Antikörpermolekül erkannt werden kann, das vorzugsweise ein nachweisbar markiertes Antikörpermolekül ist, kovalent oder nicht-kovalent gebunden ist.
  • In einer anderen Ausführungsform kann die spezifische Bindung eines Testmoleküls an TIE durch Beurteilung der sekundären biologischen Effekte der Bindung zwischen einem modifizierten TIE-2-Liganden und dem TIE-Rezeptor, einschließlich, aber nicht begrenzt auf, das Zellwachstum und/oder die Differenzierung oder die sehr frühe Genexpression oder die Phosphorylierung von TIE, gemessen werden. Zum Beispiel kann die Fähigkeit des Testmoleküls, eine Differenzierung zu induzieren, in Zellen, denen tie fehlt, und in vergleichbaren Zellen, die tie exprimieren, getestet werden. Die Differenzierung bei Zellen, die tie exprimieren, aber nicht bei vergleichbaren Zellen, denen tie fehlt, würde auf eine spezifische Testmolekül/TIE-Wechselwirkung hinweisen. Eine ähnliche Analyse könnte durch Nachweis einer sehr frühen Geninduktion (z. B. fos und jun) in tie-Minus- und tie-Plus-Zellen oder durch Nachweis einer Phosphorylierung von TIE unter Verwendung von üblichen Phosphorylierungstests, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, durchgeführt werden. Eine solche Analyse könnte bei der Identifizierung von Agonisten oder Antagonisten, die nicht kompetitiv an den TIE binden, nützlich sein.
  • In ähnlicher Weise sorgt die vorliegende Erfindung für ein Verfahren zur Identifizierung eines Moleküls, das die biologische Aktivität eines modifizierten TIE-2-Liganden besitzt, umfassend (i) das Aussetzen einer Zelle, die tie exprimiert, einem Testmolekül, und (ii) das Nachweisen der spezifischen Bindung des Testmoleküls an den TIE-Rezeptor, wobei die spezifische Bindung an TIE mit einer TIE-ähnlichen Aktivität positiv korreliert. Die spezifische Bindung kann durch entweder das Testen auf eine direkte Bindung oder auf die sekundären biologischen Effekte der Bindung, wie vorstehend besprochen, nachgewiesen werden. Ein solches Verfahren kann bei der Identifizierung von neuen Vertretern der TIE-Liganden-Familie oder in der Pharmaindustrie bei der Durchmusterung einer großen Gruppe von Peptid- und Nicht-Peptidmolekülen (z. B. Peptidomimetika) auf eine TIE-assoziierte, biologische Aktivität besonders nützlich sein. In einer bevorzugten, spezifischen, nichtbegrenzenden Ausführungsform der Erfindung kann ein großes Raster von Kulturvertiefungen hergestellt werden, die in alternierenden Reihen PC12-Zellen (oder Fibroblasten, vgl. nachstehend) enthalten, welche entweder tie-Minus sind oder verändert sind, so daß sie tie-Plus sind. Eine Vielzahl von Testmolekülen kann dann zugegeben werden, so daß jede Spalte des Rasters oder ein Teil davon ein anderes Testmolekül enthält. Jede Vertiefung könnte dann auf das Vorhandensein oder das Fehlen eines Wachstums und/oder einer Differenzierung beurteilt werden. Eine außerordentlich große Zahl von Testmolekülen könnte auf diese Weise auf eine solche Aktivität durchmustert werden.
  • In weiteren Ausführungsformen sorgt die Erfindung für Verfahren zum Nachweis oder zur Messung einer TIE-Liganden-ähnlichen Aktivität oder zur Identifizierung eines Moleküls mit einer solchen Aktivität, umfassend (i) das Aussetzen eines Testmoleküls einem TIE-Rezeptorprotein in vitro unter Bedingungen, welche erlauben, daß die Bindung erfolgt, und (ii) das Nachweisen der Bindung des Testmoleküls an das TIE-Rezeptorprotein, wobei die Bindung eines Testmoleküls an den TIE-Rezeptor mit einer TIE-Liganden-ähnlichen Aktivität korreliert. Im Einklang mit solchen Verfahren kann der TIE-Rezeptor im wesentlichen gereinigt sein oder nicht, an einen festen Träger (z. B. als eine Affinitätssäule oder als ein ELISA-Test) gebunden sein oder in eine künstliche Membran eingebaut sein. Die Bindung eines Testmoleküls an den TIE-Rezeptor kann durch ein beliebiges der auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren nachgewiesen werden. In bevorzugten Ausführungsformen kann die Bindung eines Testmoleküls durch Beurteilung seiner Fähigkeit, mit nachweisbar markierten, bekannten TIE-Liganden um die Bindung an den TIE-Rezeptor zu konkurrieren, nachgewiesen oder gemessen werden.
  • Die vorliegende Erfindung sorgt auch für ein Verfahren zum Nachweis der Fähigkeit eines Testmoleküls, als ein Antagonist einer TIE-Liganden-ähnlichen Aktivität wirksam zu sein, umfassend den Nachweis der Fähigkeit des Moleküls, einen Effekt der TIE-Liganden-Bindung an den TIE-Rezeptor auf einer Zelle, die den Rezeptor exprimiert, zu hemmen. Ein solcher Antagonist kann die Bindung zwischen dem TIE-Rezeptor und einem modifizier ten TIE-2-Liganden stören oder nicht. Die Effekte der Bindung eines modifizierten TIE-2-Liganden an den TIE-Rezeptor sind vorzugsweise biologische oder biochemische Effekte, einschließlich, aber nicht begrenzt auf, das Überleben oder die Proliferation von Zellen, die Zelltransformation, die sehr frühe Geninduktion oder die TIE-Phosphorylierung.
  • Die Erfindung sorgt ferner sowohl für ein Verfahren zur Identifizierung von Antikörpern oder anderen Molekülen, welche fähig sind, den Liganden zu neutralisieren oder die Bindung an den Rezeptor zu blockieren, als auch für die Moleküle, welche durch das Verfahren identifiziert werden. Als ein nichtbegrenzendes Beispiel kann das Verfahren mit Hilfe eines Tests durchgeführt werden, der begrifflich einem ELISA-Test ähnlich ist. Zum Beispiel kann ein TIE-Rezeptorkörper an einen festen Träger wie eine Kunststoffplatte mit mehreren Vertiefungen gebunden werden. Als Kontrolle kann eine bekannte Menge eines modifizierten TIE-2-Liganden, der mit einem Myc-Marker markiert worden ist, dann in die Vertiefung eingebracht werden, und irgendein markierter modifizierter TIE-2-Ligand, der an den Rezeptorkörper bindet, kann dann mit Hilfe eines Reporter-Antikörpers, der gegen den Myc-Marker gerichtet ist, identifiziert werden. Dieses Testsystem kann dann verwendet werden, um Testproben auf Moleküle zu durchmustern, welche fähig sind, i) an den markierten Liganden zu binden, oder ii) an den Rezeptorkörper zu binden und auf diese Weise die Bindung des markierten Liganden an den Rezeptorkörper zu blockieren. Zum Beispiel kann eine Testprobe, die ein mutmaßliches Molekül von Interesse zusammen mit einer bekannten Menge eines markierten Liganden enthält, in die Vertiefung eingebracht werden, und die Menge des markierten Liganden, die an den Rezeptorkörper bindet, kann gemessen werden. Durch Vergleichen der Menge des gebundenen markierten Liganden in der Testprobe mit der Menge in der Kontrolle können Proben mit Molekülen identifiziert werden, welche fähig sind, die Bindung des Liganden an den Rezeptor zu blockieren. Die auf diese Weise identifizierten Moleküle von Interesse können unter Anwendung von Verfahren, die dem Fachmann gut bekannt sind, isoliert werden.
  • Sobald ein Blocker der Ligandenbindung gefunden ist, wäre ein Fachmann in der Lage, sekundäre Tests durchführen, um zu bestimmen, ob der Blocker an den Rezeptor oder an den Liganden bindet, sowie Tests, um zu bestimmen, ob das Blockermolekül die biologische Aktivität des Liganden neutralisieren kann. Zum Beispiel wäre ein Fachmann unter Verwendung eines Bindungstests, der die BIAcore Biosensor-Technologie (oder das Äquivalent) verwendet, wobei entweder der TIE-Rezeptorkörper oder ein modifizierter TIE-2-Ligand oder -Ligandenkörper kovalent an einen festen Träger gebunden ist (z. B. Carboxy methyldextran auf einer Goldoberfläche), in der Lage, zu bestimmen, ob das Blockermolekül spezifisch an den Liganden, den Ligandenkörper oder an den Rezeptorkörper bindet. Um zu bestimmen, ob das Blockermolekül die biologische Aktivität des Liganden neutralisieren kann, könnte ein Fachmann einen Phosphorylierungstest (vgl. Beispiel 5) oder alternativ einen funktionellen Biotest wie einen Überlebenstest unter Verwendung von Primärkulturen, zum Beispiel von Endothelzellen, durchführen. In einer anderen Ausführungsform könnte ein Blockermolekül, das an den Rezeptorkörper bindet, ein Agonist sein, und ein Fachmann wäre in der Lage, das zu überprüfen, indem er einen geeigneten Test zur Identifizierung von weiteren Agonisten des TIE-Rezeptors durchführt.
  • Der TIE-2-Ligand 1 enthält eine "Coiled coil"-Domäne (die am 5'-Ende beginnt und sich ungefähr bis zu dem Nucleotid an Position 1160 von 4 und an Position 1157 von 5 erstreckt) und eine Fibrinogen-ähnliche Domäne (welche durch die Nucleotidsequenz von 4, beginnend ungefähr bei Position 1161 und bei Position 1158 von 5, codiert wird). Man nimmt an, daß die Fibrinogen-ähnliche Domäne des TIE-2-Liganden 2 bei oder etwa bei der gleichen Aminosäuresequenz wie bei dem Liganden 1 (FRDCA) beginnt, welche durch die Nucleotide codiert wird, die bei etwa 1197 von 6 beginnen. Man nimmt an, daß die Fibrinogen-ähnliche Domäne des TIE-Liganden-3 bei oder etwa bei der Aminosäuresequenz beginnt, welche durch die Nucleotide codiert wird, die etwa bei Position 929 beginnen, wie in 21 angegeben.
  • Die vorliegende Erfindung sorgt ferner für die Weiterentwicklung des Liganden, eines Fragments oder eines Derivats davon oder eines anderen Moleküls, das ein Rezeptor-Agonist oder -Antagonist ist, zu einem Therapeutikum zur Behandlung von Patienten, die an Störungen leiden, an welchen Zellen, Gewebe oder Organe beteiligt sind, die den TIE-Rezeptor exprimieren. Solche Moleküle können in einem Verfahren zur Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers oder in einem Diagnoseverfahren verwendet werden.
  • Da der TIE-Rezeptor in Verbindung mit Endothelzellen identifiziert worden ist und die Blockierung des TIE-2-Liganden 1, wie hierin gezeigt, anscheinend die Gefäßbildung hemmt, erwarten die Anmelder, daß ein hierin beschriebener modifizierter TIE-2-Ligand zur Induktion der Gefäßbildung bei Erkrankungen oder Störungen, wo eine solche Gefäßbildung angezeigt ist, nützlich sein kann. Solche Erkrankungen oder Störungen würden die Wundheilung, Ischämien und Diabetes einschließen. Die Liganden können in Tiermodellen getestet und therapeutisch verwendet werden, wie für andere Mittel wie den Gefäßendothel-Wachstumsfaktor (VEGF), einen anderen Endothelzell spezifischen Faktor, der angingen ist, beschrieben wurde. Ferrara et al., US-Patent Nr. 5,332,671, erteilt am 26. Juli 1994. Die Ferrara-Referenz sowie andere wissenschaftliche Untersuchungen beschreiben in vitro- und in vivo-Studien, die verwendet werden können, um den Effekt eines angiogenen Faktors bei der Erhöhung des Blutflusses in einem ischämischen Myokard, bei der Beschleunigung der Wundheilung oder bei anderen therapeutischen Ansätzen, wobei eine Blutgefäßneubildung erwünscht ist, zu veranschaulichen. (Vgl. Sudo et al., Europäische Patentanmeldung 0 550 296 A2, veröffentlicht am 7. Juli 1993; Banai et al., Circulation 89 (1994), 2183–2189; Unger et al., Am. J. Physiol. 266 (1994), H1588–H1595; Lazarous et al., Circulation 91 (1995), 145–153). Im Einklang mit der Erfindung kann ein modifizierter TIE-2-Ligand allein oder in Kombination mit einem oder mehreren zusätzlichen pharmazeutischen Wirkstoffverbindungen wie zum Beispiel VEGF oder dem basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) sowie Cytokinen, Neurotrophinen etc., verwendet werden.
  • Umgekehrt wären Antagonisten des TIE-Rezeptors wie modifizierte TIE-2-Liganden, die an den Rezeptor binden, ihn aber nicht aktivieren, wie hierin beschrieben, Rezeptorkörper, wie hierin in den Beispielen 2 und 3 beschrieben, und der TIE-2-Ligand 2, wie in Beispiel 9 beschrieben, nützlich, um die Gefäßbildung zu hemmen oder abzuschwächen und auf diese Weise zum Beispiel Tumorwachstum zu hemmen oder abzuschwächen. Diese Mittel können allein oder in Kombination mit anderen Zusammensetzungen verwendet werden, z. B. mit anti-VEGF-Antikörpern, für die gezeigt worden ist, daß sie bei Behandlung von Zuständen nützlich sind, wobei die Therapie den Zweck hat, die Angiogenese zu blockieren. Die Anmelder erwarten, daß ein hierin beschriebener modifizierter TIE-2-Ligand auch in Kombination mit Mitteln wie Cytokin-Antagonisten, z. B. IL-6-Antagonisten, welche bekanntermaßen eine Entzündung hemmen, verwendet werden können.
  • Zum Beispiel haben die Anmelder festgestellt, daß TIE-Liganden in Zellen exprimiert werden, die innerhalb oder in enger Assoziation mit Tumoren vorliegen. Beispielsweise scheint der TIE-2-Ligand 2 eng mit Tumorendothelzellen assoziiert zu sein. Demgemäß können er oder andere TIE-Antagonisten auch zum Beispiel bei der Hemmung oder Abschwächung des Tumorwachstums nützlich sein. Außerdem können TIE-Liganden oder -Ligandenkörper für die Abgabe von Toxinen an eine Zelle, die den Rezeptor trägt, nützlich sein. In einer anderen Ausführungsform können andere Moleküle wie Wachstumsfaktoren, Cytokine oder Nährstoffe an eine Zelle, die einen TIE-Rezeptor trägt, mit Hilfe von TIE-Liganden oder -Ligandenkörpern abgegeben werden. TIE-Liganden oder -Ligandenkörper, wie die hierin beschriebenen modifizierten TIE-2-Liganden, können auch als diagnostische Reagenzien für den TIE-Rezeptor verwendet werden, um den Rezeptor in vivo oder in vitro nachzuweisen. Wo der TIE-Rezeptor mit einem Krankheitszustand assoziiert ist, können TIE-Liganden oder -Ligandenkörper wie ein modifizierter TIE-2-Ligand als diagnostische Reagenzien zum Nachweis der Erkrankung durch zum Beispiel eine Gewebefärbung oder eine Ganzkörperabbildung nützlich sein. Solche Reagenzien schließen Radioisotope, Fluorochrome, Farbstoffe, Enzyme und Biotin ein. Solche Diagnose- oder Ansteuerungsmittel können hergestellt werden, wie bei Alitalo et al., WO 95/26364, veröffentlicht am 5. Oktober 1995, und bei Burrows F. und Thorpe P., PNAS (USA) 90 (1993), 8996–9000, hierin in seiner Gesamtheit eingeschlossen, beschrieben ist.
  • In anderen Ausführungsformen werden die TIE-Liganden oder ein hierin beschriebener modifizierter TIE-2-Ligand, der den Rezeptor aktiviert, als hämatopoetische Faktoren verwendet. Eine Vielzahl von hämatopoetischen Faktoren und ihren Rezeptoren sind an der Proliferation und/oder Differenzierung und/oder Migration der verschiedenen im Blut enthaltenen Zelltypen beteiligt. Da die TIE-Rezeptoren in frühen hämatopoetischen Zellen exprimiert werden, wird erwartet, daß die TIE-Liganden eine vergleichbare Rolle bei der Proliferation oder Differenzierung oder Migration dieser Zellen spielen. So können zum Beispiel TIE enthaltende Zusammensetzungen hergestellt, getestet, in biologischen Systemen in vitro und in vivo untersucht und therapeutisch verwendet werden, wie in einer der folgenden Referenzen beschrieben ist: Sousa, US-Patent Nr. 4,810,643; Lee et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985), 4360–4364; Wong et al., Science 228 (1985), 810–814; Yokota et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984), 1070; Bosselman et al., WO 905795, veröffentlicht am 2. Mai 1991, mit dem Titel "Stem Cell Factor"; und Kirkness et al., WO 95/19985, veröffentlicht am 27. Juli 1995, mit dem Titel "Haemopoietic Maturation Factor". Demgemäß kann ein modifizierter TIE-2-Ligand, der einen Rezeptor aktiviert, verwendet werden, um Zustände zu diagnostizieren oder zu behandeln, wobei die normale Hämatopoese supprimiert ist, einschließlich, aber nicht begrenzt auf, Anämie, Thrombocytopenie, Leukopenie und Granulocytopenie. In einer bevorzugten Ausführungsform kann ein modifizierter TIE-2-Ligand, der einen Rezeptor aktiviert, verwendet werden, um die Differenzierung von Blutzellvorläufern in Situationen, wo ein Patient an einer Krankheit leidet, wie dem erworbenen Immunschwächesyndrom (AIDS), welche eine Reduktion der normalen Blutzellspiegel verursacht hat, oder bei klinischen Gesamtbildern, bei denen eine Vermehrung von hämatopoetischen Populationen erwünscht ist, wie in Verbindung mit einer Knochenmarktransplantation, oder bei der Behandlung einer Aplasie oder einer Knochenmarkdepression, verursacht durch eine Bestrahlung, chemische Behandlung oder Chemotherapie, zu stimulieren.
  • Die erfindungsgemäßen modifizierten TIE-2-Liganden, die einen Rezeptor aktivieren, können allein oder in Kombination mit einem anderen pharmazeutischen Wirkstoff wie zum Beispiel Cytokine, Neurotrophine, Interleukine etc., verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform können die Liganden in Verbindung mit irgendeinem der vorstehend erwähnten Faktoren, die bekanntermaßen die Proliferation von Stammzellen oder anderen hämatopoetischen Vorläufern induzieren, oder mit Faktoren, die in dem Hämatopoeseweg später auf Zellen einwirken, einschließlich, aber nicht begrenzt auf, der hämatopoetische Reifungsfaktor, Thrombopoietin, der Stammzellfaktor, Erythropoietin, G-CSF, GM-CSF etc., verwendet werden.
  • In einer anderen Ausführungsform werden TIE-Rezeptor-Antagonisten bei der Diagnose oder Behandlung von Patienten verwendet, wobei das gewünschte Ergebnis die Hemmung eines hämatopoetischen Weges ist, wie zur Behandlung von myeloproliferativen oder anderen proliferativen Störungen von blutbildenden Organen wie Thrombocythämien, Polycythämien und Leukämien. In solchen Ausführungsformen kann die Behandlung die Verwendung einer therapeutisch wirksamen Menge eines modifizierten TIE-2-Liganden, eines TIE-Antikörpers oder eines Konjugats eines modifizierten TIE-2-Liganden, wie hierin beschrieben, umfassen.
  • Die vorliegende Erfindung sorgt auch für Arzneimittel, umfassend einen hierin beschriebenen modifizierten TIE-2-Liganden in einem pharmakologisch verträglichen Vehikel, welche systemisch oder lokal verabreicht werden können. Jede geeignete Verabreichungsweise, die auf dem Fachgebiet bekannt ist, kann verwendet werden, einschließlich, aber nicht begrenzt auf, intravenös, intrathekal, intraarteriell, intranasal, oral, subkutan, intraperitoneal oder durch örtliche Injektion oder ein chirurgisches Implantat. Formulierungen mit einer verzögerten Wirkstofffreisetzung werden auch bereitgestellt.
  • Die vorliegende Erfindung sorgt auch für einen Antikörper, der spezifisch an ein solches therapeutisches Molekül bindet. Der Antikörper kann monoclonal oder polyclonal sein. Die Erfindung sorgt auch für ein Verfahren unter Verwendung eines solchen monoclonalen oder polyclonalen Antikörpers zur Messung der Menge des therapeutischen Moleküls in einer Probe aus einem Patienten zum Zwecke der Überwachung des Verlaufs der Therapie.
  • Die Erfindung sorgt ferner für ein Verfahren zur Reinigung eines modifizierten TIE-2-Liganden, umfassend:
    • a) Koppeln von mindestens einem TIE-bindenden Substrat an eine feste Matrix;
    • b) Inkubieren des Substrats aus a) mit einem Zelllysat, so daß das Substrat einen Komplex mit einem modifizierten TIE-2-Liganden in dem Zelllysat bildet;
    • c) Waschen der festen Matrix; und
    • d) Eluieren des modifzierten TIE-2-Liganden von dem gekoppelten Substrat.
  • Das Substrat kann irgendein Stoff sein, der den modifizierten TIE-2-Liganden spezifisch bindet. In einer Ausführungsform ist das Substrat ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem anti-modifzierten TIE-2-Liganden-Antikörper, einem TIE-Rezeptor und einem TIE-Rezeptorkörper.
  • Die Erfindung sorgt auch für eine therapeutische Zusammensetzung, umfassend einen modifzierten TIE-2-Liganden, der einen Rezeptor aktiviert, in einem pharmazeutisch verträglichen Vehikel, welche zur Förderung der Gefäßneubildung in einem Patienten verwendet werden kann.
  • Außerdem sorgt die vorliegende Erfindung für ein Verfahren zur Identifizierung einer Zelle, die einen TIE-Rezeptor exprimiert, umfassend das Inkontaktbringen einer Zelle mit einem nachweisbar markierten, modifzierten TIE-2-Liganden unter Bedingungen, welche die Bindung des nachweisbar markierten Liganden an den TIE-Rezeptor erlauben, und die Bestimmung, ob der nachweisbar markierte Ligand an den TIE-Rezeptor gebunden ist, wodurch die Zelle als eine Zelle identifiziert wird, die einen TIE-Rezeptor exprimiert. Die vorliegende Erfindung sorgt auch für eine therapeutische Zusammensetzung, die einen modifzierten TIE-2-Liganden und ein daran konjugiertes cytotoxisches Mittel umfaßt. Das cytotoxische Mittel kann ein Radioisotop oder ein Toxin sein.
  • Die Erfindung sorgt auch für ein Verfahren zum Nachweis der Expression eines modifizierten TIE-2-Liganden durch eine Zelle, umfassend den Erhalt von mRNA aus der Zelle, das Inkontaktbringen der so erhaltenen mRNA mit einem markierten Nucleinsäuremolekül, das einen modifzierten TIE-2-Liganden codiert, unter Hybridisierungsbedingungen, das Bestimmen der Anwesenheit von mRNA, die mit dem markierten Molekül hybridisiert, und auf diese Weise das Nachweisen der Expression eines modifzierten TIE-2-Liganden in der Zelle.
  • Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren zum Nachweis der Expression eines modifizierten TIE-2-Liganden in Gewebeschnitten bereit, umfassend das Inkontaktbringen der Gewebeschnitte mit einem markierten Nucleinsäuremolekül, das einen modifizierten TIE-2-Liganden codiert, unter Hybridisierungsbedingungen, das Bestimmen der Anwesenheit von mRNA, die mit dem markierten Molekül hybridisiert, und auf diese Weise das Nachweisen der Expression eines modifizierten TIE-2-Liganden in den Gewebeschnitten.
  • Beispiel 1 – Identifizierung der ABAE-Zelllinie als Reporterzellen für den TIE-2-Rezeptor
  • Ausgereifte BAE-Zellen sind beim European Cell Culture Repository unter ECACC#92010601 registriert. (Vgl. PNAS 75 (1978), 2621). Northern (RNA)-Analysen ergaben mittlere Mengen von tie-2-Transkripten in der ABAE (Adult Bovine Arterial Endothelial, ausgereiften arteriellen Rinder-Endothel)-Zelllinie, was mit in situ-Hybridisierungsergebnissen übereinstimmt, die zeigten, daß tie-2-RNAs praktisch ausschließlich auf vaskuläre Endothelzellen begrenzt sind. Die Anmelder untersuchten daher ABAE-Zelllysate auf das Vorhandensein eines TIE-2-Proteins sowie den Umfang, in dem dieses TIE-2-Protein unter normalen Wachstumsbedingungen im Vergleich zum Wachstum bei Serummangel Tyrosin-phosphoryliert ist. ABAE-Zelllysate wurden geerntet und einer Immunpräzipitation unterzogen, gefolgt durch Western-Blot-Analysen der immunpräzipitierten Proteine mit TIE-2-spezifischen und Phosphotyrosin-spezifischen Antiseren. Das Weglassen oder das Einschließen von TIE-2-Peptiden als spezifische Blockierungsmoleküle während der TIE-2-Immunpräzipitation ermöglichte die eindeutige Identifizierung von TIE-2 als ein mäßig nachweisbares Protein von ~150 kD, dessen Anteile an Phosphotyrosin im Fließgleichgewicht durch den vorherigen Serummangel der Zellen sich auf nahezu nicht nachweisbare Mengen verringerten.
  • Die Züchtung der ABAE-Zellen und das Ernten der Zelllysate wurde wie folgt durchgeführt. ABAE-Zellen mit einer geringen Passagenzahl wurden als eine einzellige Schicht in einer Dichte von 2 × 106 Zellen/150 mm-Kunststoffpetrischale (Falcon) plattiert und in Dulbecco's modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), enthaltend 10% bovines Kälberserum (10% BCS), 2 mM L-Glutamin (Q) und jeweils 1% Penicillin und Streptomycin (P–S), in einer Atmosphäre von 5% CO2 gezüchtet. Vor dem Ernten der Zelllysate wurden die Zellen für 24 Stunden einem Serummangel in DMEM/Q/P-S ausgesetzt, gefolgt durch Absaugen des Mediums und Spülen der Platten mit eiskalter phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), supplementiert mit Natriumorthovanadat, Natriumfluorid und Natriumbenzamidin. Die Zellen wurden in einem kleinen Volumen dieses Spülpuffers lysiert, das mit 1% NP40-Detergens und den Proteaseinhibitoren PMSF und Aprotinin supplementiert worden war. Unlösliche Zelltrümmer wurden aus den Zelllysaten durch Zentrifugation bei 14.000 × g für 10 Minuten bei 4°C entfernt, und die Überstände wurden einer Immunpräzipitation mit Antiseren, die für den TIE-2-Rezeptor spezifisch sind, in An- oder Abwesenheit von blockierenden Peptiden, die zu ~20 μg/ml Lysat zugegeben wurden, unterzogen. Die immunpräzipitierten Proteine wurden durch eine PAGE (7,5%iges Laemmli-Gel) getrennt und dann mittels Elektrotransfer auf eine PVDF-Membran übertragen und entweder mit verschiedenen TIE-2- oder Phosphotyrosin-spezifischen Antiseren inkubiert. Das TIE-2-Protein wurde durch Inkubation der Membran mit HRP-gekoppelten sekundären Antiseren, gefolgt durch eine Behandlung mit ECL-Reagens (Amersham), sichtbar gemacht.
  • Beispiel 2 – Clonierung und Expression eines TIE-2-Rezeptorkörpers zur Untersuchung der TIE-2-Liganden-Wechselwirkungen auf Affinitätsbasis
  • Ein Expressionskonstrukt wurde erzeugt, das ein sezerniertes Protein ergibt, bestehend aus dem gesamten extrazellulären Teil des Ratten-TIE-2-Rezeptors, fusioniert mit der konstanten Region des menschlichen Immunglobulins Gamma-1 (IgG1-Fc). Dieses Fusionsprotein wird als TIE-2-"Rezeptorköper" (RB) bezeichnet, und normalerweise wäre zu erwarten, daß es unter Zugrundelegung der Bildung von Disulfidbrücken zwischen einzelnen IgG1-Fc-Schwänzen als ein Dimer in Lösung vorliegt. Der Fc-Teil des TIE-2-RB wurde wie folgt hergestellt. Ein DNA-Fragment, codierend den Fc-Teil eines menschlichen IgG1, der die Scharnierregion bis zu dem Carboxyterminus des Proteins umspannt, wurde aus menschlicher Plazenta-cDNA mittels PCR mit Oligonucleotiden, die der veröffentlichten Sequenz des menschlichen IgG1 entsprechen, amplifiziert. Das erhaltene DNA-Fragment wurde in einen Plasmidvektor cloniert. Geeignete DNA-Restriktionsfragmente aus einem Plasmid, codierend den vollständigen TIE-2-Rezeptor, und aus dem menschlichen IgG1-Fc-Plasmid wurden auf jeder Seite eines kurzen PCR abgeleiteten Fragments ligiert, das zur Fusion der codierenden Sequenzen des TIE-2- und des menschlichen IgG1-Fc-Proteins im Leseraster konstruiert wurde. Auf diese Weise wurde in dem erhaltenen TIE-2-Ektodomäne-Fc-Fusionsprotein das IgG1-Fc genau an die Stelle der Region gesetzt, welche die TIE-2-Transmembran- und Cytoplasmadomänen überspannt. Ein anderes Verfahren zur Herstellung von RBs ist bei Goodwin et al., Cell 73 (1993), 447–456, beschrieben.
  • Der TIE-2-RB wurde in Mengen im Milligrammbereich durch die Clonierung des DNA-Fragments von TIE-2-RB in den pVL1393-Baculovirus-Vektor und die anschließende Infektion der SF-21AE-Insektenzelllinie von Spodoptera frugiperda erhalten. Alternativ können die Zelllinie SF-9 (ATCC-Eingangsnr. CRL-1711) oder die Zelllinie BTI-TN-5b1-4 verwendet werden. DNA, die den TIE-2-RB codiert, wurde als ein EcoRI-NotI-Fragment in das Baculovirus-Transferplasmid pVL1393 cloniert. Die durch Cäsiumchlorid-Dichtegradientenzentrifugation gereinigte Plasmid-DNA wurde mit der viralen DNA durch Mischen von 3 μg Plasmid-DNA mit 0,5 μg Baculo-Gold-DNA (Pharminigen), gefolgt durch Einbringen in Liposomen unter Verwendung von 30 μg Lipofectin (Gibco-BRL), rekombiniert. Die DNA-Liposomen-Gemische wurden zu SF-21AE-Zellen (2 × 106 Zellen/60 mm-Schale) in TMN-FH-Medium (modifiziertes Grace-Insektenzellmedium (Gibco-BRL)) für 5 Stunden bei 27°C zugegeben, gefolgt durch eine Inkubation bei 27°C für 5 Tage in TMN-FH-Medium, supplementiert mit 5% fötalem Kälberserum. Das Gewebekulturmedium wurde zur Plaquereinigung von rekombinanten Viren geerntet, welche unter Anwendung von bereits beschriebenen Verfahren ausgeführt wurde (O'Reilly D. R., Miller L. K. und Luckow V. A., Baculovirus Expression Vectors – A Laboratory Manual, 1992, New York, W. H. Freeman), außer daß der Agaroseüberzug 125 μg/ml X-Gal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid; Gibco-BRL) enthielt. Nach 5-tägiger Inkubation bei 27°C wurden nicht-rekombinante Plaques aufgrund einer positiven chromogenen Reaktion mit dem X-Gal-Substrat bewertet und die Positionen davon wurden markiert. Rekombinante Plaques wurden dann durch Zugabe eines zweiten Überzugs, enthaltend 100 μg/ml MTT (3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazoliumbromid; Sigma), sichtbar gemacht. Mutmaßliche rekombinante Virusplaques wurden durch Pfropfenaspiration entnommen und durch mehrere Plaque-Isolierungsrunden gereinigt, um die Homogenität sicherzustellen. Virusstammlösungen wurden durch die aufeinanderfolgende Passage bei geringer Multiplizität eines plaquegereinigten Virus hergestellt. Stammlösungen mit geringer Passagenzahl eines Virusclons (vTIE-2-Rezeptorkörper) wurden hergestellt.
  • SF-21AE-Zellen wurden in einem serumfreien Medium (SF-900 II, Gibco-BRL), enthaltend 1 × Antibiotikum/Antimykotikum-Lösung (Gibco-BRL) und 25 mg/l Gentamycin (Gibco-BRL), gezüchtet. Pluronic F-68 wurde als ein Tensid bis zu einer Endkonzentration von 1 g/l zugegeben. Kulturen (41) wurden in einem Bioreaktor (Artisan Cell Station System) für mindestens drei Tage vor der Infektion vermehrt. Die Zellen wurden bei 27°C unter Begasen mit 50% gelöstem Sauerstoff bei einer Gasdurchflußrate von 80 ml/min (Belüftung mit einem Luftverteilerkranz) gezüchtet. Das Bewegen erfolgte mit Hilfe einer Schiffsschraube bei einer Rate von 100 UpM. Die Zellen wurden in der mittleren logarithmischen Wachstumsphase (~2 × 106 Zellen/ml) geerntet, durch Zentrifugation konzentriert und mit 5 Plaque-bildenden Einheiten des vTIE-2-Rezeptorkörpers pro Zelle infiziert. Die Zellen und das Inpfmaterial wurden mit frischem Medium auf ein Volumen von 400 ml gebracht, und das Virus wurde für 2 Stunden bei 27°C in einem Rotationskolben adsorbiert. Die Kultur wurde dann in einem Endvolumen von 8 l mit frischem serumfreiem Medium resuspendiert, und die Zellen wurden in dem Bioreaktor unter Verwendung der vorher beschriebenen Bedingungen inkubiert.
  • Das Kulturmedium der mit dem vTIE-2-Rezeptorkörper infizierten SF-21AE-Zellen wurde 72 Stunden nach der Infektion durch Zentrifugation (500 × g, 10 Minuten) gewonnen. Die Zellüberstände wurden mit NaOH auf einen pH-Wert von 8 eingestellt. EDTA wurde bis zu einer Endkonzentration von 10 mM zugegeben, und der pH-Wert des Überstands wurde wieder auf 8 eingestellt. Die Überstände wurden filtriert (0,45 μm, Millipore) und auf eine Protein A-Säule (Protein A-Sepharose-Fast Flow oder HiTrap-Protein A, beide von Pharmacia) aufgegeben. Die Säule wurde mit PBS, enthaltend 0,5 M NaCl, gewaschen, bis die Absorption bei 280 nm auf die Ausgangslinie zurückkehrte. Die Säule wurde in PBS gewaschen und mit 0,5 M Essigsäure eluiert. Die Säulenfraktionen wurden durch Elution in Röhrchen, enthaltend 1 M Tris. pH 9, sofort neutralisiert. Die Peakfraktionen, enthaltend den TIE-2-Rezeptorkörper, wurden vereinigt und gegen PBS dialysiert.
  • Beispiel 3 – Nachweis, daß TIE-2 eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung des Gefäßsystems spielt
  • Einblicke in die Funktion von TIE-2 wurden durch das Einbringen eines "Überschusses" des löslichen TIE-2-Rezeptorkörpers (TIE-2-RB) in ein sich entwickelndes System gewonnen. Die potentielle Fähigkeit von TIE-2-RB, einen zugänglichen TIE-2-Liganden zu binden und ihn auf diese Weise zu neutralisieren, könnte in einer beobachtbaren Unterbrechung der normalen Gefäßentwicklung und in einer Charakterisierung des Liganden resultieren. Um zu untersuchen, ob TIE-2-RB verwendet werden könnte, um die Gefäßentwicklung in frühen Hühnerembryonen zu unterbrechen, wurden kleine Stücke eines biologisch resorbierbaren Schaums mit TIE-2-RB durchtränkt und unmittelbar unter die Chorionallantoismembran an Positionen genau lateral zu dem primitiven Embryo eingeführt.
  • Frühe Hühnerembryonen entwickeln sich oben auf dem Eidotter aus einer kleinen Scheibe von Zellen, die von der Chorionallantoismembran (CAM) bedeckt ist. Die Endothelzellen, die das Gefäßsystem in dem Embryo auskleiden werden, entstehen aus sowohl extra- als auch intra-embryonalen Zellquellen. Extra-embryonal abgeleitete Endothelzellen, welche die Hauptquelle für Endothelzellen in dem Embryo bereitstellen, gehen aus Ansammlungen von Mesenchym hervor, die lateral um den Embryo selbst, direkt unter der CAM lokalisiert sind. Wenn diese Mesenchymzellen reifen, bringen sie einen gemeinsamen Vorläufer für sowohl die endothelialen als auch die hämatopoietischen Zellabstammungslinien, bezeichnet als Hämangioblast, hervor. Der Hämangioblast wiederum bringt eine Mischpopulation von Angioblasten (die Endothelzellenvorläufer) und Hämatoblasten (die pluripotenten hämatopoietischen Vorläufer) hervor. Die Bildung von Ansätzen des Blutkreislaufsystems beginnt, wenn sich Nachkommen der Endothelzellen absondern, um ein Bläschen mit einer einzelligen Wand zu bilden, das die primitiven Blutzellen umgibt. Die Proliferation und Migration dieser Zellkomponenten erzeugt schließlich ein ausgedehntes Netz von mit Blut gefüllten Mikrogefäßen unter der CAM, die letztendlich in den Embryo eindringen, um sich mit begrenzten, intra-embryonal abgegleiteten Gefäßelementen zu verbinden.
  • Gerade befruchtete Hühnereier, erhalten von Spafas, Inc. (Boston, MA), wurden bei 99,5°F, 55% relativer Feuchte inkubiert. Nach einer Entwicklung von etwa 24 h wurde die Eischale mit 70%igem Ethanol abgewischt, und ein Zahnarztbohrer wurde verwendet, um ein 1,5 cm großes Loch in das stumpfe Ende jedes Eies zu bohren. Die Schalenmembran wurde entfernt, um einen Luftraum direkt oberhalb des Embryos freizulegen. Kleine rechteckige Stücke von sterilem Gelfoam (Upjohn) wurden mit einem Skalpell zurechtgeschnitten und in gleiche Konzentrationen von entweder dem TIE-2- oder dem EHK-1-Rezeptorkörper eingetaucht. Der EHK-1-Rezeptorkörper wurde hergestellt, wie in Beispiel 2 angegeben, wobei die extrazelluläre Domäne von EHK-1 anstelle der extrazellulären Domäne von TIE-2 verwendet wurde (Maisonpierre et al., Oncogene 8 (1993), 3277–3288). Jedes Gelfoam-Stück absorbierte etwa 6 μg Protein in 30 μl. Sterile Uhrmacherpinzetten wurden verwendet, um einen kleinen Riß in die CAM an einer Position mehrere Millimeter lateral zu dem primitiven Embryo zu erzeugen. Der größte Teil des in RB eingeweichten Gelfoam-Stücks wurde unter die CAM eingeführt, und die Eischale wurde mit einem Stück Klebeband verschlossen. Andere Eier in einem ähnlichen Stadium wurden parallel mit dem RB der nicht damit verwandten, neuronal exprimierten Rezeptor-Tyrosinkinase, EHK-1, behandelt (Maisonpierre et al., Oncogene 8 (1993), 3277–3288). Die Entwicklung ließ man für 4 Tage voranschreiten, und anschließend wurden die Embryonen durch visuelle Überprüfung untersucht. Die Embryonen wurde entnommen, indem die Eischalen in Schalen mit angewärmtem PBS vorsichtig aufgebrochen wurden und der Embryo zusammen mit der umgebenden CAM vorsichtig abgeschnitten wurde. Von 12 Eiern, die alle mit RB behandelt wurden, hatten sich 6 TIE-2-RB- und 5 EHK- 1-RB-behandelte Embryonen über das zu Beginn des Experiments beobachtete Stadium hinaus entwickelt. Zwischen diesen entwickelten Embryonen wurde ein drastischer Unterschied beobachtet, wie in den 1A und 1B gezeigt. Die mit dem EHK-1-RB behandelten Embryonen schienen sich relativ normal entwickelt zu haben. Vier von fünf der EHK-1-Embryonen waren lebensfähig, wie durch das Vorhandensein eines schlagenden Herzens beurteilt wurde. Außerdem war das extra-embryonale Gefäßsystem, das aufgrund des Vorhandenseins von Erythrocyten visuell klar zu erkennen ist, stark entwickelt und dehnte sich mehrere Zentimeter lateral unter der CAM aus. Im Gegensatz dazu waren die mit dem TIE-2-RB behandelten Embryonen in ihrem Wachstum stark gehemmt und wiesen im Durchmesser eine Größe im Bereich von 2–5 mm auf, verglichen mit mehr als 10 mm im Durchmesser für die EHK-1-RB-Embryonen. Sämtliche der mit dem TIE-2-RB behandelten Embryonen waren tot, und ihre CAMs waren frei von Blutgefäßen. Die Fähigkeit von TIE-2-RB, die Gefäßentwicklung in Hühnern zu blockieren, zeigt, daß der TIE-2-Ligand für die Entwicklung des Gefäßsystems notwendig ist.
  • Beispiel 4 – Nachweis einer TIE-2-spezifischen Bindungsaktivität in konditioniertem Medium von der C2C12-Maus-Myoblasten-Zelllinie, die mit dem ras-Oncogen transformiert ist
  • Die Durchmusterung von 10fach konzentrierten, zellkonditionierten Medien (10 × CCMs) von verschiedenen Zelllinien auf das Vorhandensein einer spezifischen Bindungsaktivität eines löslichen TIE-2 (BIAcore; Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ) wies eine Bindungsaktivität in dem serumfreien Medium von C2C12-Zellen, transformiert mit dem ras-Oncogen (C2C12-ras), RAT-2-ras-Zellen (eine ras-transformierte Fibroblasten-Zelllinie), menschlichen Glioblastom-T98G-Zellen und der menschlichen Neuroblastom-Zelllinie, die als SHEP-1 bekannt ist, nach.
  • Das 10 × C2C12-ras-CCM stammte von einer stabil transfizierten Linie von C2C12-Myoblasten, die durch Transfektion mit der T-24-Mutante von H-ras durch übliche Verfahren auf Calciumphosphat-Basis onkogen transformiert wurden. Ein auf SV40 basierendes Neomycin-Resistenz-Expressionsplasmid wurde mit dem ras-Expressionsplasmid physikalisch verknüpft, um die Selektion von transfizierten Clonen zu ermöglichen. Die erhaltenen G418-resisenten ras-C2C12-Zellen wurden üblicherweise als eine einzellige Schicht auf Kunststoffschalen in DMEM/Glutamin/Penicillin-Streptomycin, supplementiert mit 10% fötalem Kälberserum (FCS), aufrechterhalten. Serumfreies 10 × C2C12-ras-CCM wurde hergestellt, indem die Zellen bei 60%iger Konfluenz in ein serumfreies, definiertes Medium für 12 Stunden überführt wurden (Zhan und Goldfarb, Mol. Cell. Biol. 6 (1986), 3541–3544; Zhan et al., Oncogene 1 (1987), 369–376). Das Medium wurde verworfen und durch frisches DMEM/Q/P-S für 24 Stunden ersetzt. Dieses Medium wurde gewonnen, und die Zellen wurden wieder mit frischem DMEM/Q/P-S versorgt, das nach weiteren 24 Stunden auch gewonnen wurde. Diese CCMs wurden mit den Proteaseinhibitoren PMSF (1 mM) und Aprotinin (10 μg/ml) supplementiert und auf sterilen Größenausschlußmembranen (Amicon) 10fach konzentriert. Die TIE-2-Bindungsaktivität konnte durch die Inkubation des Mediums mit einem Überschuß an TIE-2-RB, aber nicht durch die Inkubation mit dem EHK-1-RB vor der BIAcore-Analyse neutralisiert werden.
  • Die Bindungsaktivität des 10 × CCM wurde unter Anwendung der Biosensor-Technologie (BIAcore; Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ) gemessen, die biomolekulare Wechselwirkungen mit Hilfe der Oberflächenplasmonresonanz in Echtzeit überwacht. Ein gereinigter TIE-2-RB wurde über primäre Amine kovalent an die Carboxymethyldextran-Schicht eines CM5-Sensor-Chips mit Forschungsqualität (Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ) gekoppelt. Die Oberfläche des Sensor-Chips wurde unter Verwendung eines Gemisches aus N-Hydroxysuccinimid (NHS) und N-Ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC) aktiviert, gefolgt durch die Immobilisierung des TIE-2-RB (25 μg/ml, pH 4,5) und die Desaktivierung der nicht umgesetzten Stellen mit 1,0 M Ethanolamin (pH 8,5). Eine negative Kontrolloberfläche mit dem EHK-1-Rezeptorkörper wurde in ähnlicher Weise hergestellt.
  • Der in diesem System verwendete Laufpuffer war HBS (10 mM HEPES, 3,4 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0,005% P20-Tensid, pH 7,4). Die 10 × CCM-Proben wurden für 15 min bei 4°C zentrifugiert und unter Verwendung eines sterilen 0,45 μm-Filters, der wenig Protein bindet (Millipore, Bedford, MA), weiter gereinigt. Dextran (2 mg/ml) und P20-Tensid (0,005%) wurden zu jeder CMM-Probe zugegeben. Aliquots von 40 μl wurden entlang der immobilisierten Oberfläche bei einer Durchflußrate von 5 μl/min injiziert (entweder TIE-2 oder EHK-1), und die Rezeptor-Bindung wurde für 8 min überwacht. Die Bindungsaktivität (Resonanzeinheiten, RU) wurde als Unterschied zwischen einem Basiswert, bestimmt 30 sec vor der Probeninjektion, und einer 30 sec nach der Injektion durchgeführten Messung gemessen. Die Regeneration der Oberfläche wurde mit einem 12 μl-Stoß von 3 M MgCl2 erreicht.
  • Der Rauschpegel des Instruments beträgt 20 RU; daher kann eine Bindungsaktivität mit einem Signal über 20 RU als eine wirkliche Wechselwirkung mit dem Rezeptor interpretiert werden. Für C2C12-ras konditionierte Medien lagen die Bindungsaktivitäten im Bereich von 60–90 RU für die TIE-2-RB immobilisierte Oberfläche. Für die gleichen Proben, getestet auf einer EHK-1-RB immobilisierten Oberfläche, betrugen die gemessenen Aktivitäten weniger als 35 RU. Die spezifische Bindung an den TIE-2-Rezeptorkörper wurde durch Inkubation der Proben mit einem Überschuß an entweder dem löslichen TIE-2- oder dem EHK-1-RB vor dem Testen der Bindungsaktivität beurteilt. Die Zugabe des löslichen EHK-1-RB hatte keinen Effekt auf die TIE-2-Bindungsaktivität irgendeiner Probe, während in Gegenwart des löslichen TIE-2 die Bindung an die Oberfläche um zwei Drittel geringer ist als die Bindung, die in Abwesenheit von TIE-2 gemessen wurde. Ein Wiederholungstest unter Verwendung von > 50 × konzentriertem C2C12-ras-CCM ergab einen vierfachen Anstieg des TIE-2-spezifischen Bindungssignals verglichen mit dem Hintergrund.
  • Beispiel 5 – C2C12-ras-CCM enthält eine Aktivität, welche die Tyrosin-Phosphorylierung des TIE-2-Rezeptors induziert
  • 10 × C2C12-ras-CCM wurde auf seine Fähigkeit untersucht, die Tyrosin-Phosphorylierung von TIE-2 in ABAE-Zellen zu induzieren. Unter Serummangel gezüchtete ABAE-Zellen wurden kurz mit dem C2C12-ras-CCM inkubiert, lysiert und einer Immunpräzipitation und Western-Analysen, wie vorstehend beschrieben, unterzogen. Die Stimulierung der unter Serummangel gezüchteten ABAE-Zellen mit dem serumfreien 10 × C2C12-ras-CCM wurde wie folgt durchgeführt. Das Medium von ABAE-Zellen, die einem Serummangel ausgesetzt wurden, wie vorstehend beschrieben, wurde entfernt und durch entweder ein definiertes Medium oder 10 × CCM, welches auf 37°C vorgewärmt worden war, ersetzt. Nach 10 Minuten wurden die Medien entfernt, und die Zellen wurden auf Eis zweimal mit einem Überschuß an gekühltem PBS, supplementiert mit Orthovanadat/NaF/Benzamidin, gewaschen. Die Zelllyse und die TIE-2-spezifische Immunpräzipitation wurden durchgeführt, wie vorstehend beschrieben.
  • ABAE-Zellen, die für 10 Minuten mit dem definierten Medium inkubiert wurden, zeigten keine Induktion der TIE-2-Tyrosin-Phosphorylierung, während die Inkubation mit C2C12-ras-CCM mindestens eine 100fache Erhöhung der TIE-2-Phosphorylierung stimulierte. Diese Aktivität war durch die vorherige Inkubation des 10 × C2C12-ras-CCM für 90 Minuten bei Raumtemperatur mit 13 μg TIE-2-RB, gekoppelt an Protein-G-Sepharose-Kügelchen, praktisch vollständig erschöpft. In dem Medium, das mit Protein-G-Sepharose allein inkubiert wurde, war diese Phosphorylierungsaktivität nicht erschöpft.
  • Beispiel 6 – Expression und Clonierung des TIE-2-Liganden
  • COS-7-Zellen wurden in Dulbecco's modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), enthaltend 10% fötales Rinderserum (FBS), jeweils 1% Penicillin und Streptomycin (P/S) und 2 mM Glutamin, in einer Atmosphäre von 5% CO2 gezüchtet. Die Maus-Myoblasten-C2C12-ras-Zelllinie wurde in essentiellem Eagle-Minimalmedium (EMEM) mit 10% FBS, (P/S) und 2 mM Glutamin gezüchtet. cDNA-Clone vollständiger Länge des Maus-TIE-2-Liganden wurden durch Durchmustern einer C2C12-ras-cDNA-Bank in dem pJFE14-Vektor, exprimiert in COS-Zellen, erhalten. Dieser Vektor, wie in 2 gezeigt, ist eine modifizierte Ausführung des Vektors pSRα (Takebe et al., Mol. Cell. Biol. 8 (1988), 466–472). Die Genbank wurde unter Verwendung der zwei BSTX1-Restriktionsstellen in dem pJFE14-Vektor erzeugt.
  • COS-7-Zellen wurden vorübergehend mit entweder der pJFE14-Genbank oder einem Kontrollvektor durch das DEAE-Dextran-Transfektionsprotokoll transfiziert. Kurz zusammengefaßt wurden COS-7-Zellen in einer Dichte von 1,0 × 106 Zellen/100 mm-Platte 24 Stunden vor der Transfektion plattiert. Zur Transfektion wurden die Zellen in serumfreiem DMEM, enthaltend 400 μg/ml DEAE-Dextran, 1 μM Chloroquin und 2 mM Glutamin sowie 1 μg der geeigneten DNA, für 3–4 Stunden bei 37°C in einer Atmosphäre von 5% CO2 gezüchtet. Das Transfektionsmedium wurde abgesaugt und durch PBS mit 10% DMSO für 2–3 min ersetzt. Nach diesem DMSO-"Schock" wurden die COS-7-Zellen in DMEM mit 10% FBS, jeweils 1% Penicillin und Streptomycin und 2 mM Glutamin für 48 Stunden überführt.
  • Da der TIE-2-Ligand sezerniert wird, war es notwendig, die Zellen zu permeabilisieren, um die Bindung der Rezeptorkörper-Sonde an den Liganden nachzuweisen. Zwei Tage nach der Transfektion wurden die Zellen mit PBS gespült und dann mit PBS, enthaltend 1,8% Formaldehyd, für 15–30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Zellen wurden dann mit PBS gewaschen und für 15 min mit PBS, enthaltend 0,1% Triton X-100 und 10% Kälberserum, inkubiert, um die Zellen zu permeabilisieren und unspezifische Bindungsstellen zu blockieren.
  • Die Durchmusterung erfolgte durch direkte Lokalisierung einer Färbung unter Verwendung eines TIE-2-Rezeptorkörpers (RB), der aus der extrazellulären Domäne von TIE-2, fusioniert mit der konstanten Region von IgG1, bestand. Dieser Rezeptorkörper wurde hergestellt, wie in Beispiel 2 angegeben. Eine 100 mm-Schale mit transfizierten, fixierten und permeabilisierten COS-Zellen wurde untersucht, indem die Zellen für 30 min mit dem TIE-2-RB inkubiert wurden. Die Zellen wurden dann zweimal mit PBS gewaschen und weitere 30 min mit PBS/10% Kälberserum/anti-Mensch-IgG-alkalische Phosphatase-Konjugat inkubiert. Nach drei PBS-Waschungen wurden die Zellen mit dem Substrat für die alkalische Phosphatase für 30–60 min inkubiert. Die Schale wurde dann mikroskopisch auf das Vorhandensein von gefärbten Zellen überprüft. Für jede gefärbte Zelle wurde ein kleiner Bereich von Zellen, einschließlich der gefärbten Zelle, unter Verwendung der Spitze einer Kunststoffpipette von der Platte abgeschabt, und die Plasmid-DNA wurde dann gewonnen und zur Elektroporation von Bakterienzellen verwendet. Einzelne Bakterienkolonien, die aus der Elektroporation erhalten worden waren, wurden entnommen, und die aus diesen Kolonien präparierte Plasmid-DNA wurde verwendet, um COS-7-Zellen zu transfizieren, die auf die Expression des TIE-2-Liganden untersucht wurden, welche durch die Bindung davon an TIE-2-Rezeptorkörper nachgewiesen wurde. Dies ermöglichte die Identifizierung einzelner Clone, die den TIE-2-Liganden codieren. Eine Bestätigung der Expression des TIE-2-Liganden wurde durch die Phosphorylierung des TIE-2-Rezeptors unter Anwendung des in Beispiel 5 angegebenen Verfahrens erhalten. Ein Plasmid-Clon, der den TIE-2-Liganden codiert, wurde bei der ATCC am 7. Oktober 1994 unter der ATCC-Eingangsnummer 75910 hinterlegt und als "pJFE14, codierend den TIE-2-Liganden" bezeichnet.
  • Beispiel 7 – Isolierung und Sequenzierung eines cDNA-Clons vollständiger Länge, der den menschlichen TIE-2-Liganden codiert
  • Eine menschliche cDNA-Bank der fötalen Lunge in Lambda gt-10 (vgl. 3) wurde von Clontech Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA), erhalten. Plaques wurden in einer Dichte von 1,25 × 106/20 × 20 cm-Platte plattiert, und Replika-Filter wurden gemäß Standardverfahren abgenommen (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Seite 8.46, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York).
  • Die Isolierung von Clonen des menschlichen tie-2-Liganden- wurde wie folgt ausgeführt. Ein 2,2 kb großes XhoI-Fragment aus dem hinterlegten Clon des tie-2-Liganden (ATCC-Nr. 75910 – vgl. Beispiel 6 vorstehend) wurde durch Zufallspriming bis zu einer spezifischen Aktivität von etwa 5 × 108 CpM/ng markiert. Die Hybridisierung wurde bei 65°C in einer Hybridisierungslösung, enthaltend 0,5 mg/ml Lachssperma-DNA, ausgeführt. Die Filter wurden bei 65°C in 2 × SSC, 0,1 SDS gewaschen und über Nacht bei –70°C einem Kodak XAR-5-Film ausgesetzt. Positive Phagen wurden plaquegereinigt. Lysate mit hohen Phagentitern eines reinen Phagen wurden zur Isolierung von DNA mit Hilfe einer Qiagen-Säule mittels Standardtechniken verwendet (Qiagen, Inc., Chatsworth, CA; Katalog 1995, Seite 36). Die Phagen-DNA wurde mit EcoRI gespalten, um das clonierte cDNA-Fragment für die anschließende Subclonierung freizusetzen. Ein Lambda-Phagenvektor, enthaltend die DNA des menschlichen tie-2-Liganden, wurde bei der ATCC am 26. Oktober 1994 unter der Bezeichnung λgt10, codierend den htie-2-Liganden 1 (ATCC-Eingangsnummer 75928) hinterlegt. Die Phagen-DNA kann direkt einer DNA-Sequenzanalyse durch das Didesoxykettenterminationsverfahren unterzogen werden (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 5463–5467).
  • Die Subclonierung der DNA des menschlichen tie-2-Liganden in einen Säuger-Expressionsvektor kann wie folgt erreicht werden. Der Clon λgt10, welcher den htie-2-Liganden 1 codiert, enthält eine EcoRI-Stelle, welche sich 490 Basenpaare stromabwärts von dem Beginn der codierenden Sequenz für den menschlichen TIE-2-Liganden befindet. Die codierende Region kann unter Verwendung von einmaligen Restriktionsstellen stromaufwärts und stromabwärts des Initiations- bzw. Stoppcodons ausgeschnitten werden. Zum Beispiel kann eine SpeI-Stelle, die 70 bp 5' zu dem Initiationscodon vorkommt, und eine Bpu1102i-Stelle (auch bekannt als B1p1), die 265 bp 3' zu dem Stoppcodon angeordnet ist, verwendet werden, um die vollständige codierende Region auszuschneiden. Diese kann dann in den pJFE14-Clonierungsvektor unter Verwendung der XbaI-Stelle (die mit dem überhängenden SpeI-Ende kompatibel ist) und der PstI-Stelle (die PstI- und Bpu1102i-Stellen werden beide mit glatten Enden versehen) subcloniert werden.
  • Die codierende Region aus dem Clon λgt10, welche den htie-2-Liganden 1 codiert, wurde unter Verwendung des ABI 373A-DNA-Sequenzanalysegeräts und des Taq Dideoxy Terminator Cycle-Sequenzierungskits (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) sequenziert. Die Nucleotidsequenz und die daraus abgeleitete Aminosäuresequenz des menschlichen TIE-2-Liganden aus dem Clon λgt10, welcher den htie-2-Liganden 1 codiert, sind in 4 gezeigt.
  • Ferner wurden cDNA-Clone vollständiger Länge des menschlichen tie-2-Liganden durch Durchmustern einer cDNA-Bank des menschlichen Glioblastoms T98G in dem pJFE14-Vektor erhalten. Clone, die den menschlichen TIE-2-Liganden codieren, wurden mittels DNA-Hybridisierung unter Verwendung eines 2,2 kb großen XhoI-Fragments aus dem hinterlegten Clon des tie-2-Liganden (ATCC-Nr. 75910) als Sonde identifiziert (vgl. das vorstehende Beispiel 6). Die codierende Region wurde unter Verwendung des ABI 373A DNA-Sequenzanalysengeräts und des Taq Dideoxy Terminator Cycle-Sequenzierungskits (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) sequenziert. Diese Sequenz stimmte praktisch mit der Sequenz des Clons λgt10, der den htie-2-Liganden 1 codiert, überein. Wie in 4 gezeigt, enthält der Clon λgt10, der den htie-2-Liganden 1 codiert, einen zusätzlichen Glycinrest, welcher durch die Nucleotide 1114–1116 codiert wird. Die codierende Sequenz des Clons T98G enthält diesen Glycinrest nicht, aber stimmt sonst mit der codierenden Sequenz des Clons λgt10, welcher den htie-2-Liganden 1 codiert, überein. 5 gibt die Nucleotidsequenz und die daraus abgeleitete Aminosäuresequenz des menschlichen TIE-2-Liganden aus dem Clon T98G an.
  • Beispiel 8 – Isolierung und Sequenzierung eines zweiten cDNA-Clons vollständiger Länge, der den menschlichen TIE-2-Liganden codiert
  • Eine menschliche cDNA-Bank der fötalen Lunge in Lambda gt-10 (vgl. 3) wurde von Clontech Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA), erhalten. Plaques wurden in einer Dichte von 1,25 × 106/20 × 20 cm-Platte plattiert, und Replika-Filter wurden gemäß Standardverfahren abgenommen (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Seite 8.46, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York). Filter in doppelter Ausfertigung wurden bei niedriger Stringenz (2 × SSC, 55°C) mit Sonden durchmustert, welche für die Sequenz des menschlichen TIE-2-Liganden 1 hergestellt wurden. Einer der Filter in doppelter Ausfertigung wurde mit einer 5'-Sonde untersucht, welche die Aminosäuren 25–265 des menschlichen TIE-2-Liganden 1 codiert, wie in 4 angegeben. Der zweite der Filter in doppelter Ausfertigung wurde mit einer 3'-Sonde untersucht, welche die Aminosäuren 282–498 der Sequenz des menschlichen TIE-2-Liganden 1 codiert (vgl. 4). Beide Sonden wurden bei 55°C in einer Hybridisierungslösung, enthaltend 0,5 mg/ml Lachssperma-DNA, hybridisiert. Die Filter wurden in 2 × SSC bei 55°C gewaschen und über Nacht einem Röntgenfilm ausgesetzt. Ferner wurden Filter in doppelter Ausfertigung auch bei normaler Stringenz (2 × SSC, 65°C) mit der vollständigen codierenden Sonde des Maus-TIE-2-Liganden 1 (F3–15, XhoI-Insertion) hybridisiert. Drei positive Clone wurden ausgewählt, welche die folgenden Kriterien erfüllten: i) es ist keine Hybridisierung mit der vollständigen (Maus) Sonde bei normaler Stringenz beobachtet worden, und ii) es wurde eine Hybridisierung bei niedriger Stringenz mit sowohl der 5'- als auch der 3'-Sonde beobachtet. Der EcoRI-Verdau der Phagen-DNA, die aus diesen Clonen erhalten wurde, ergab zwei unabhängige Clone mit Insertionsgrößen von etwa 2.2 kb und etwa 1,8 kb auf. Die 2,2 kb große EcoRI-Insertion wurde in die EcoRI-Stellen von sowohl pBluescript KS (Stratagene) als auch einem Säuger-Expressionsvektor, der zur Verwendung in COS-Zellen geeignet ist, subcloniert. Zwei Orientierungen wurden für den Säuger-Expressionsvektor identifiziert. Die 2,2 kb-Insertion in pBluescript KS wurde bei der ATCC am 9. Dezember 1994 hinterlegt und als pBluescript KS, codierend den menschlichen TIE-2-Liganden 2, bezeichnet. Der Startpunkt der Sequenz, die den TIE-2-Liganden 2 codiert, liegt etwa 355 Basenpaare stromabwärts der pBluescript-EcoRI-Stelle.
  • COS-7-Zellen wurden vorübergehend mit entweder dem Expressionsvektor oder einem Kontrollvektor durch das DEAE-Dextran-Transfektionsprotokoll transfiziert. Kurz zusammengefaßt wurden COS-7-Zellen in einer Dichte von 1,0 × 106 Zellen/100 mm-Platte 24 Stunden vor der Transfektion plattiert. Zur Transfektion wurden die Zellen in serumfreiem DMEM, enthaltend 400 μg/ml DEAE-Dextran, 1 μM Chloroquin und 2 mM Glutamin sowie 1 μg der geeigneten DNA, für 3–4 Stunden bei 37°C in einer Atmosphäre von 5% CO2 gezüchtet. Das Transfektionsmedium wurde abgesaugt und durch phosphatgepufferte Salzlösung mit 10% DMSO für 2–3 min ersetzt. Nach diesem DMSO-"Schock" wurden die COS-7-Zellen in DMEM mit 10% FBS, jeweils 1% Penicillin und Streptomycin und 2 mM Glutamin für 48 Stunden überführt.
  • Da der TIE-2-Ligand sezerniert wird, war es notwendig, die Zellen zu permeabilisieren, um die Bindung der Rezeptorkörper-Sonde an den Liganden nachzuweisen. Transfizierte COS-7-Zellen wurden in einer Dichte von 1,0 × 106 Zellen/100 mm-Platte plattiert. Die Zellen wurden mit PBS gespült und dann mit PBS, enthaltend 1,8% Formaldehyd, für 15–30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Zellen wurden dann mit PBS gewaschen und für 15 min mit PBS, enthaltend 0,1% Triton X-100 und 10% Kälberserum, inkubiert, um die Zellen zu permeabilisieren und unspezifische Bindungsstellen zu blockieren. Die Durchmusterung erfolgte durch direkte Lokalisierung einer Färbung unter Verwendung eines TIE-2-Rezeptorkörpers, der aus der extrazellulären Domäne von TIE-2, fusioniert mit der konstanten Region von IgG1, bestand. Dieser Rezeptorkörper wurde hergestellt, wie in Beispiel 2 angegeben. Transfizierte COS-7-Zellen wurden durch Inkubation für 30 min mit dem TIE-2-Rezeptorkörper als Sonde untersucht. Die Zellen wurden dann zweimal mit PBS gewaschen, mit Methanol fixiert und dann für weitere 30 min mit PBS/10% Kälberserum/anti-Mensch-IgG-alkalische Phosphatase-Konjugat inkubiert. Nach drei PBS-Waschungen wurden die Zellen mit dem Substrat für die alkalische Phosphatase für 30–60 min inkubiert. Die Schale wurde dann mikroskopisch auf das Vorhandensein von gefärbten Zellen überprüft. Es wurde beobachtet, daß Zellen, die eine Orientierung des Clons, aber nicht die andere Orientierung exprimieren, den TIE-2-Rezeptorkörper binden.
  • Der Fachmann erkennt ohne weiteres, daß die beschriebenen Verfahren angewendet werden können, um andere verwandte Vertreter der TIE-2-Liganden-Familie zu identifizieren.
  • Die codierende Region aus dem Clon pBluescript KS, welcher den menschlichen TIE-2-Liganden 2 codiert, wurde unter Verwendung des ABI 373A-DNA-Sequenzanalysegeräts und des Taq Dideoxy Terminator Cycle-Sequenzierungskits (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) sequenziert. Die Nucleotidsequenz und die daraus abgeleitete Aminosäuresequenz des menschlichen TIE-2-Liganden aus dem Clon pBluescript KS, der den menschlichen TIE-2-Liganden 2 codiert, sind in 6 gezeigt.
  • Beispiel 9 – Der TIE-2-Ligand 2 ist ein Rezeptor-Antagonist
  • Konditionierte Medien von COS-Zellen, die entweder den TIE-2-Liganden 2 (TL2) oder den TIE-2-Liganden 1 (TL1) exprimieren, wurden bezüglich ihrer Fähigkeit verglichen, TIE-2-Rezeptoren zu aktivieren, die natürlicherweise in menschlichen Endothelzelllinien vorhanden sind.
  • Das Lipofectamin-Reagens (Gibco-BRL, Inc.) und empfohlene Protokolle wurden verwendet, um COS-7-Zellen mit entweder dem pJFE14-Expressionsvektor allein, dem pJFE14-Vektor, enthaltend die cDNA des menschlichen TIE-2-Liganden 1, oder mit einem pMT21-Expressionsvektor (Kaufman R. J., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985), 689–693), enthaltend die cDNA des menschlichen TIE-2-Liganden 2, zu transfizieren. COS-Medien, enthaltend sezernierte Liganden, wurden nach drei Tagen gewonnen und mittels Diafiltration (DIAFLO-Ultrafiltrationsmembranen; Amicon, Inc.) auf das 20fache eingeengt. Die Menge des aktiven TIE-2-Liganden 1 und TIE-2-Liganden 2, welche in diesen Medien vorhanden ist, wurde bestimmt und als die Menge (in Resonanzeinheiten, RU) der spezifischen Bindungsaktivität des TIE-2-Rezeptors, gemessen durch einen BIAcore-Bindungstest, ausgedrückt.
  • Northern (RNA)-Analysen wiesen signifikante Mengen der TIE-2-Transkripte in menschlichen primären HAEC-Enothel-Zellen (Human Aortic Endothelial Cells; menschliche Aortenendothelzellen) (Clonetics, Inc.) nach. Daher wurden diese Zellen verwendet, um zu untersuchen, ob der TIE-2-Rezeptor Tyrosin phosphoryliert ist, wenn er COS-Medien ausgesetzt wird, die TIE-2-Liganden enthalten. HAEC-Zellen wurden in einem komplettem Endothelzellen-Wachstumsmedium (Clonetics, Inc.) aufrechterhalten, das 5% fötales Rinderserum, löslichen Rinderhirnextrakt, 10 ng/ml menschlichen EGF, 1 mg/ml Hydrocortison, 50 mg/ml Gentamicin und 50 ng/ml Amphotericin-B enthielt. Die Bewertung, ob TL1 und TL2 den TIE-2-Rezeptor in den HAEC-Zellen aktivieren konnten, wurde wie folgt durchgeführt. Semikonfluente HAEC-Zellen wurden für zwei Stunden einem Serummangel in Glucose-reichem Dulbecco's MEM mit zugesetztem L-Glutamin und Penicillin-Streptomycin bei 37°C ausgesetzt, gefolgt durch Austausch des Mangelmediums durch konditionierte COS-Medien, enthaltend den Liganden, für 7 Minuten bei 37°C in einem 5% CO2-Brutschrank. Die Zellen wurden anschließend lysiert, und das TIE-2-Rezeptor-Protein wurde durch Immunpräzipitation der Lysate mit TIE-2-Peptid-Antiserum, gefolgt durch ein Western-Blot-Verfahren mit anti-Phosphotyrosin-Antiserum, genau wie in Beispiel 1 beschrieben, gewonnen. Die Ergebnisse sind in 7 gezeigt. Die Mengen an Phosphotyrosin in dem TIE-2-Rezeptor (TIE-2-R) wurden durch die Behandlung von HAEC-Zellen mit konditionierten COS-Medien des TIE-2-Liganden 1 induziert (Bahn L1), aber nicht durch konditionierte COS-Medien mit dem TIE-2-Liganden 2 (Bahn L2). SCHEIN ist ein konditioniertes Medium von COS-Zellen, die mit dem leeren JFE14-Vektor transfiziert wurden.
  • Der Beweis, daß sowohl TL1 als auch TL2 spezifisch an den TIE-2-Rezeptor binden, wurde unter Verwendung eines BIAcore-Tests zur Untersuchung der spezifischen Bindungsaktivitäten des TIE-2-Rezeptors in transfizierten COS-Medien und durch die Immunfärbung von TL1 und TL2 exprimierenden COS-Zellen mit TIE-2-Rezeptorkörpern erbracht.
  • Da TL2 den TIE-2-Rezeptor nicht aktivierte, machten sich die Anmelder daran, zu bestimmen, ob TL2 in der Lage sein könnte, als ein Antagonist der TL1-Aktivität wirksam zu sein. HAEC-Phosphorylierungstests wurden durchgeführt, wobei die Zellen zuerst mit einem "Überschuß" an TL2 inkubiert wurden, gefolgt durch die Zugabe des verdünnten TL1. Es wurde gefolgert, daß die vorherige Besetzung des TIE-2-Rezeptors aufgrund der hohen Mengen an TL2 die anschließende Stimulierung des Rezeptors nach der Exposition gegen TL1, der in einer begrenzenden Konzentration vorliegt, verhindern könnte.
  • Semikonfluente HAEC-Zellen wurden einem Serummangel ausgesetzt, wie vorstehend beschrieben, und dann für 3 min bei 37°C mit 1–2 ml 20 × COS/JFE14-TL2 konditioniertem Medium inkubiert. Kontrollplatten wurden mit 20 × Medium nur mit COS/JFE14 behandelt (MOCK). Die Platten wurden aus dem Brutschrank genommen, und dann wurden verschiedene Verdünnungen des COS/JFE14-TL1-Mediums zugegeben, gefolgt durch eine weitere Inkubation der Platten für 5–7 min bei 37°C. Die Zellen wurden anschließend gespült, lysiert, und die TIE-2-spezifische Tyrosin-Phosphorylierung in den Lysaten wurde durch eine Rezeptor-Immunpräzipitation und Western-Blot-Verfahren, wie vorstehend beschrieben, untersucht. Die TL1-Verdünnungen wurden unter Verwendung von 20 × COS/JFE14-TL1-Medium, verdünnt auf 2 ×, 0,5 ×, 0,1 × oder 0,02 ×, durch Zugabe von 20 × Medium nur mit COS/JFE14 hergestellt. Ein Test der anfänglichen 20 × TL1- und 20 × TL2-COS-Medien unter Anwendung der BIAcore-Biosensor-Technologie zeigte, daß sie ähnliche Mengen an TIE-2-spezifischen Bindungsaktivitäten enthielten, d. h. 445 RU und 511 für TL1 bzw. TL2. Die Ergebnisse des anti-Phosphotyrosin-Western-Blots, dargestellt in 8, zeigen, daß im Vergleich zur vorherigen Behandlung der HAEC-Zellen mit dem SCHEIN-Medium (Bahn 1) die vorherige Behandlung der HAEC-Zellen mit einem Überschuß des TIE-2-Liganden 2 (Bahn 2) der späteren Fähigkeit eines verdünnten TIE-2-Liganden 1 entgegenwirkt, den TIE-2-Rezeptor (TIE-2-R) zu aktivieren.
  • Die Fähigkeit von TL2, die TL1-Aktivierung des TIE-2-R kompetitiv zu hemmen, wurde ferner unter Verwendung der menschlichen Zellhybridlinie EA. hy926 (vgl. Beispiel 21 für eine ausführliche Beschreibung dieser Zelllinie und deren Aufrechterhaltung) veranschaulicht. Experimente wurden durchgeführt, wobei nicht-konzentrierte COS-Zellmedien, enthaltend TL1, in unterschiedlichen Verdünnungen mit entweder SCHEIN- oder TL2 konditionierten Medien gemischt und auf einlagige EA. hy926-Zellschichten, die einem Serummangel ausgesetzt wurden, für 5 Minuten bei 37°C aufgebracht wurden. Die Medien wurden dann entfernt, die Zellen mittels Lyse geerntet, und die TIE-2-spezifische Tyrosin-Phosphorylierung wurde durch Western-Blots, wie vorstehend beschrieben, untersucht. 9 zeigt ein Experiment, das drei Behandlungsgruppen beinhaltet, wie von links nach rechts zu sehen ist. Wie in den vier Bahnen auf der linken Seite gezeigt, aktivierte die Behandlung der EA. hy926-Zellen mit 1 × COS-TL1 allein den endogenen TIE-2-R in diesen Zellen stark, während das 1 × TL2-COS-Medium inaktiv war. Jedoch zeigte das Gemisch von TL1 mit entweder SCHEIN oder TL2, daß TL2 die Aktivität von TL1 in einer dosisabhängigen Weise blockieren kann. Bei den mittleren drei Bahnenpaaren verringerte sich der Anteil an TL2 (oder SCHEIN), während sich die Menge an TL1 in dem Gemisch entsprechend von 0,1 × auf 0,3 × erhöhte. Bei jedem dieser Mischungsverhältnisse zeigten die TL1 : TL2-Bahnen einen verminderten Grad der Phosphorylierung von TIE-2-R, verglichen mit dem der entsprechenden TL1: SCHEIN – Bahnen. Wenn die Menge an TL1 konstant gehalten wurde, und die Menge an TL2 (oder SCHEIN) verringert wurde, wurde jedoch ein Punkt erreicht (gezeigt in den drei Bahnenpaaren auf der rechten Seite), bei dem der TL2 in der Probe zu verdünnt war, um die TL1-Aktivität wirksam zu hemmen. Die relative Menge jedes Liganden, welche in diesen konditionierten COS-Medien vorhanden ist, konnte aus den Bindungseinheiten davon, wie durch den BIAcore-Test gemessen wurde, und aus Western-Blots der COS-Medien mit Liganden-spezifischen Antikörpern abgeschätzt werden. Folglich können die Anmelder schließen, daß nur ein geringfacher molarer Überschuß an TL2 erforderlich ist, um die Aktivität von TL1 in vitro wirksam zu blockieren. Dies ist wesentlich, da die Anmelder verschiedene Beispiele in vivo beobachtet haben (vgl. Beispiel 17 und 16), wo TL2-mRNAs eine beträchtliche Abundanz verglichen mit TL1 erreichen. Folglich kann TL2 eine wichtige physiologische Rolle bei der wirksamen Blockierung der Signalübertragung durch den TIE-2-R an diesen Stellen spielen.
  • Zusammengenommen bestätigen diese Daten, daß TL2 im Gegensatz zu TL1 nicht in der Lage ist, die Expression eines endogenen TIE-2-R in Endothelzellen zu stimulieren. Außerdem kann TL2 in einem geringfachen molaren Überschuß die TL1-Stimulierung des TIE-2-Rezeptors blockieren, was zeigt, daß TL2 ein natürlich vorkommender TIE-2-Rezeptor-Antagonist ist.
  • Beispiel 10 – Identifizierung einer TIE-2-spezifischen Bindungsaktivität in konditioniertem Medium und in COS-Zellüberständen
  • Die Bindungsaktivität von 10 × CCM von den Zelllinien C2C12-ras, Rat2-ras, SHEP und T98G oder von COS-Zellüberständen nach Transfektion mit entweder dem menschlichen TIE-2-Liganden 1 (hTL1) oder dem menschlichen TIE-2-Liganden 2 (hTL2) wurde unter Verwendung der Biosensor-Technologie gemessen (BIAcore; Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ), die biomolekulare Wechselwirkungen mit Hilfe der Oberflächenplasmonresonanz (SPR) in Echtzeit überwacht. Ein gereinigter Ratten- oder Mensch-TIE-2-RB wurde über primäre Amine kovalent an die Carboxymethyldextranschicht eines CM5-Sensor-Chips mit Forschungsqualität (Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ) gekoppelt. Die Oberfläche des Sensor-Chips wurde unter Verwendung eines Gemisches aus N-Hydroxysuccinimid (NHS) und N-Ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC) aktiviert, gefolgt durch die Immobilisierung des TIE-2-RB (25 μg/ml, pH 4,5) und die Desaktivierung der nicht umgesetzten Stellen mit 1,0 M Ethanolamin (pH 8,5). Im allgemeinen wurden 9.000 bis 10.000 RU jedes Rezeptorkörpers an den Sensor-Chip gekoppelt.
  • Der in diesem System verwendete Ladepuffer war HBS (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0,005% P20-Tensid, pH 7,4). Die Proben wurden für 15 min bei 4°C zentrifugiert und unter Verwendung eines sterilen 0,45 μm-Filters, der wenig Protein bindet (Millipore, Bedford, MA), weiter gereinigt. Dextran (2 mg/ml) und P20-Tensid (0,005%) wurden zu jeder Probe zugegeben. Aliquots von 40 μl wurden entlang der immobilisierten Oberfläche bei einer Durchflußrate von 5 μl/min injiziert (entweder Ratten- oder Mensch-TIE-2), und die Rezeptorbindung würde für 8 min überwacht. Die Bindungsaktivität (Resonanzeinheiten, RU) wurde als Unterschied zwischen einem Basiswert, der 30 sec vor der Probeninjektion bestimmt wurde, und einer Messung, die 30 sec nach der Injektion durchgeführt wurde, bestimmt. Die Regeneration der Oberfläche wurde mit einem 15 μl-Stoß von 3 M MgCl2 erreicht.
  • Die CCM-Proben (C2C12-ras, Rat2-ras, SHEP und T98G) wurden auf der Oberfläche mit dem immobilisierten Ratten-TIE-2-RB getestet, während der rekombinante hTL1 und hTL2 auf der Oberfläche mit dem immobilisierten Mensch-TIE-2-RB getestet wurden. In jedem Fall wurde die spezifische Bindung an den TIE-2-Rezeptorkörper durch Inkubation der Proben mit 25 μg/ml von entweder löslichem TIE-2-RB (Ratte oder Mensch) oder trkB-RB vor dem Testen der Bindungsaktivität abgeschätzt. Wie in den 10 und 11 gezeigt, rief die Zugabe des löslichen trkB-RB eine leichte Abnahme der TIE-2-Bindungsaktivität hervor, während die Zugabe des löslichen TIE-2-RB die Bindungsaktivität wesentlich verringert, verglichen mit der Bindungsaktivität, die in Abwesenheit von TIE-2-RB gemessen wurde.
  • Beispiel 11 – TIE-2-RB blockiert spezifisch die Aktivierung des TIE-2-Rezeptors durch den TIE-2-Liganden 1
  • Die Anmelder wollten nun feststellen, ob ein löslicher TIE-2-RB als ein kompetitiver Hemmstoff wirksam sein kann, um die Aktivierung des TIE-2-Rezeptors durch den TIE-2-Liganden 1 (TL1) zu blockieren. Dazu wurden COS-Medien, enthaltend TL1, vorher mit entweder TIE-2- oder trkB-RB inkubiert und dann hinsichtlich ihrer Fähigkeit verglichen, TIE-2-Rezeptoren zu aktivieren, die natürlicherweise in einer menschlichen Endothelzelllinie vorhanden sind.
  • Konditionierte COS-Medien wurden aus COS-7-Zellen erzeugt, die mit entweder dem pJFE14-Expressionsvektor allein (SCHEIN) oder dem pJFE14-Vektor, enthaltend die cDNA für den menschlichen TIE-2-Liganden 1 (TL1), transfiziert waren, und sie wurden geerntet, wie vorstehend in Beispiel 9 beschrieben, außer daß die Medien sterilfiltriert, aber nicht konzentriert wurden. Die Menge an TL1 wurde bestimmt und als die Menge (in Resonanzeinheiten, RU) der TIE-2-Rezeptor-spezifischen Bindungsaktivität, gemessen durch den BIAcore-Bindungstest, ausgedrückt.
  • Northern (RNA)-Analysen wiesen signifikante Mengen von tie-2-Transkripten in menschlichen primären HUVEC-Endothelzellen (Human Umbilical Vein Endothelial Cells; menschliche Endothelzellen der Umbilikalvene) (Clonetics, Inc.) nach. Daher wurden diese Zellen verwendet, um zu untersuchen, ob der TIE-2-Rezeptor Tyrosin-phosphoryliert werden kann, wenn er in Gegenwart von TIE-2- oder TrkB-RBs COS-Medien, enthaltend TL1, ausgesetzt wird. HUVEC-Zellen wurden bei 37°C, 5% CO2 in einem kompletten Endothelzellen-Wachstumsmedium (Clonetics, Inc.) aufrechterhalten, das 5% fötales Rinderserum, löslichen Rinderhirnextrakt, 10 μg/ml Heparin, 10 ng/ml menschlichen EGF, 1 μg/ml Hydrocortison, 50 μg/ml Gentamicin und 50 ng/ml Amphotericin-B enthielt. Die Beurteilung, ob TL1 den TIE-2-Rezeptor in den HUVEC-Zellen aktivieren konnte, wurde wie folgt durchgeführt. Konfluente Schalen von HUVEC-Zellen wurden für zwei bis vier Stunden einem Serummangel in Glucose-armen Dulbecco's MEM bei 37°C, 5% CO2 ausgesetzt, gefolgt durch eine 10-minütige Inkubation in einem Mangelmedium, welches 0,1 mM Natriumorthovanadat, einen wirksamen Hemmstoff von Phosphotyrosin-Phosphatasen, einschloß. Inzwischen wurden konditionierte COS-Medien für 30 min bei Raumtemperatur vorher mit entweder TIE-2- oder TrkB-RB, zugegeben zu 50 μg/ml, inkubiert. Das Mangelmedium wurde dann aus den HUVEC-Schalen entfernt und mit den RB enthaltenden COS-Medien für 7 Minuten bei 37°C inkubiert. Die HUVEC-Zellen wurden anschließend lysiert, und das TIE-2-Rezeptor-Protein wurde durch Immunpräzipitation mit TIE-2-Peptid-Antiserum, gefolgt durch ein Western-Blot-Verfahren mit einem anti-Phosphotyrosin-Antikörper, wie in Beispiel 1 beschrieben, gewonnen. Die Ergebnisse sind in 12 gezeigt. Die Phosphotyrosin-Anteile in dem TIE-2-Rezeptor wurden durch die Behandlung der HUVEC-Zellen mit dem TIE-2-Liganden 1 (TL1) induziert, relativ zu den Anteilen, die bei dem Kontrollmedium (SCHEIN) beobachtet wurden, und diese Induktion wird durch die vorherige Inkubation mit TIE-2-RB (TIE-2-Fc), aber nicht durch die Inkubation mit TrkB-RB (TrkB-Fc) blockiert. Diese Daten zeigen, daß ein löslicher TIE-2-RB als ein selektiver Hemmstoff wirksam sein kann, um die Aktivierung des TIE-2-Rezeptors durch den TIE-2-Liganden 1 zu blockieren.
  • Beispiel 12 – Konstruktion von TIE-2-Ligandenkörpern
  • Ein Expressionskonstrukt wurde erzeugt, das ein sezerniertes Protein ergibt, bestehend aus der gesamten codierenden Sequenz des menschlichen TIE-2-Liganden 1 (TL1) oder TIE-2-Liganden 2 (TL2), fusioniert mit der konstanten Region des menschlichen Immun globulins Gamma-1 (IgG1-Fc). Diese Fusionsproteine werden als TIE-2-"Ligandenkörper" (TL1-Fc oder TL2-Fc) bezeichnet. Der Fc-Teil von TL1-Fc und TL2-Fc wurde wie folgt hergestellt. Eine DNA-Fragment, codierend den Fc-Teil eines menschlichen IgG1, der die Scharnierregion bis zu dem Carboxyterminus des Proteins umspannt, wurde aus menschlicher Plazenta-cDNA mittels PCR mit Oligonucleotiden, die der veröffentlichten Sequenz des menschlichen IgG1 entsprechen, amplifiziert. Das erhaltene DNA-Fragment wurde in einen Plasmidvektor cloniert. Geeignete DNA-Restriktionsfragmente aus einem Plasmid, codierend den vollständigen TL1 oder TL2, und aus dem menschlichen IgG1-Fc-Plasmid wurden auf jeder Seite eines kurzen PCR-Fragments ligiert, das derart konstruiert wurde, daß es TL1 oder TL2 mit den codierenden Sequenzen des menschlichen IgG1-Fc-Proteins im Leseraster verknüpft.
  • TL2-Fc wurde durch die Clonierung des TL2-Fc-DNA-Fragments in den pVL1393-Baculovirus-Vektor und die anschließende Infektion der SF-21AE-Insektenzelllinie von Spodoptera frugiperda in Mengen im Milligrammbereich erhalten. Alternativ kann die Zelllinie SF-9 (ATCC-Eingangsnummer CRL-1711) oder die Zelllinie BTI-TN-5b1-4 verwendet werden. Die TL2-Fc codierende DNA wurde als ein EcoRI-NotI-Fragment in das Baculovirus-Transferplasmid pVL1393 cloniert. Die Plasmid-DNA wurde mit der viralen DNA durch Mischen von 3 μg Plasmid-DNA mit 0,5 μg Baculo-Gold-DNA (Pharminigen), gefolgt durch das Einbringen in Liposomen unter Verwendung von 30 μg Lipofectin (Gibco-BRL), rekombiniert. Die DNA-Liposomen-Gemische wurden zu SF-21AE-Zellen (2 × 106 Zellen/60 mm-Schale) in TMN-FH-Medium (modifiziertes Grace-Insektenzellmedium (Gibco-BRL)) für 5 Stunden bei 27°C zugegeben, gefolgt durch eine Inkubation bei 27°C für 5 Tage in TMN-FH-Medium, supplementiert mit 5% fötalem Kälberserum. Das Gewebekulturmedium wurde zur Plaquereinigung von rekombinanten Viren geerntet, welche unter Anwendung von bereits beschriebenen Verfahren ausgeführt wurde (O'Reilly D. R., Miller L. K. und Luckow V. A., Baculovirus Expression Vectors – A Laboratory Manual, 1992, New York: W. H. Freeman), außer daß der Agaroseüberzug 125 mg/ml X-Gal(5-Brom-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranosid; Gibco-BRL) enthielt. Nach 5-tägiger Inkubation bei 27°C wurden nicht-rekombinante Plaques durch eine positive chromogene Reaktion mit dem X-Gal-Substrat bewertet, und die Positionen davon wurden markiert. Rekombinante Plaques wurden dann durch Zugabe eines zweiten Überzugs, enthaltend 100 mg/ml MTT (3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid; Sigma), sichtbar gemacht. Mutmaßliche rekombinante Virusplaques wurden durch Propfenaspiration entnommen und durch mehrere Plaque-Isolierungsrunden gereinigt, um die Homogenität sicherzustellen. Virusstammlösungen wurden durch aufeinanderfolgende Passage bei geringer Multiplizität eines plaquegereinigten Virus hergestellt. Stammlösungen mit geringer Passagenzahl eines Virusclons (vTL2-Fc Clon#7) wurden hergestellt.
  • SF-21AE-Zellen wurden in serumfreien Medium (SF-900 II, Gibco-BRL), enthaltend 1 × Antibiotikum/Antimykotikum-Lösung (Gibco-BRL) und 25 mg/l Gentamycin (Gibco-BRL), gezüchtet. Pluronic F-68 wurde als ein Tensid bis zu einer Endkonzentration von 1 g/l zugegeben. Kulturen (41) wurden in einem Bioreaktor (Artisan Cell Station System) für mindestens drei Tage vor der Infektion vermehrt. Die Zellen wurden bei 27°C unter Begasen mit 50% gelöstem Sauerstoff bei einer Gasdurchflußrate von 80 ml/min (Belüftung über einen Luftverteilerring) gezüchtet. Das Bewegen erfolgt mit Hilfe einer Schiffsschraube bei einer Rate von 100 UpM. Die Zellen wurden in der mittleren logarithmischen Wachstumsphase (~2 × 106 Zellen/ml) geerntet, durch Zentrifugation konzentriert und mit 5 Plaque-bildenden Einheiten von vTL2-Fc pro Zelle infiziert. Die Zellen und das Inpfmaterial wurden mit frischem Medium auf ein Volumen von 400 ml gebracht, und das Virus wurde für 2 Stunden bei 27°C in einem Rotationskolben adsorbiert. Die Kultur wurde dann in einem Endvolumen von 81 mit frischem serumfreiem Medium resuspendiert, und die Zellen wurden in dem Bioreaktor unter Verwendung der vorher beschriebenen Bedingungen inkubiert.
  • Das Kulturmedium von vTL2-Fc-infizierten SF-21AE-Zellen wurde 72 Stunden nach der Infektion durch Zentrifugation (500 × g, 10 Minuten) gewonnen. Die Zellüberstände wurden mit NaOH auf einen pH-Wert von 8 eingestellt. EDTA wurde bis zu einer Endkonzentration von 10 mM zugegeben, und der pH-Wert des Überstands wurde wieder auf 8 eingestellt. Die Überstände wurden filtriert (0,45 μm, Millipore) und auf eine Protein A-Säule (Protein A-Sepharose-Fast Flow oder HiTrap-Protein A, beide von Pharmacia) aufgetragen. Die Säule wurde mit PBS, enthaltend 0,5 M NaCl, gewaschen, bis die Absorption bei 280 nm auf die Ausgangslinie zurückkehrte. Die Säule wurde in PBS gewaschen und mit 0,5 M Essigsäure eluiert. Die Säulenfraktionen wurden durch Elution in Röhrchen, enthaltend 1 M Tris, pH 9, sofort neutralisiert. Die Peakfraktionen, enthaltend das TL2-Fc, wurden vereinigt und gegen PBS dialysiert.
  • Beispiel 13 – Expression von TIE-1, TIE-2, TL1 und TL2 in einem Nierenzellkarzinom
  • In situ-Hybridisierungsexperimente wurden mit Tumorgewebe eines menschlichen Nierenzellkarzinoms unter Verwendung von TIE-1-, TIE-2-, TL1- und TL2-cDNA-Sonden durchgeführt. Die Expression von TIE-1, TIE-2, TL1 und TL2 war in dem Gefäßsystem des Tumors hochreguliert. Die Liganden-Expression schien entweder auf die vaskulären Endothelzellen (TL2) oder auf die unmittelbare Nähe der vaskulären Endothelzellen im Mesenchym (TL1) begrenzt zu sein. Es ist gezeigt worden, daß VEGF in diesem Tumorgewebe drastisch hochreguliert ist. Brown et al., Am. J. Pathol. 143 (1993), 1255–1262.
  • Beispiel 14 – Expression von TIE-1, TIE-2, TL1 und TL2 bei der Wundheilung
  • In situ-Hybridisierungsexperimente wurden mit Objektträgern von Gewebequerschnitten, erhalten aus einem kutanen Wundheilungsmodell bei der Ratte, unter Verwendung von TIE-1-, TIE-2-, TL1- und TL2-cDNA-Sonden durchgeführt. Das Wundheilungsmodell beinhaltete das Pressen eines kleinen Korkbohrers gegen die Haut einer Ratte und das Entfernen eines kleinen, zylinderförmigen Hautpfropfens. Wenn die Heilung an der Basis der Wunde beginnt, wird ein Gewebevertikalschnitt angefertigt und für die in situ-Hybridisierung verwendet. In der getesteten Gewebeprobe schienen TL1 und TL2 vier Tage nach der Verletzung in geringem Maße hochreguliert zu sein. Im Gegensatz zu der in geringem Maße hochregulierten Expression von TL1 und TL2 in diesem Gewebe ist die VEGF-Expression, welche der TL1- und TL2-Expression vorausgehen kann, drastisch hochreguliert.
  • Beispiel 15 – Expression von TIE-Liganden in der fötalen Leber und im fötalen Thymus
  • Eine reverse Transkriptions-PCR (RT-PCR) wurde mit der fötalen Leber einer E14.5-Maus und dem fötalen Thymus einer E17.5-Maus durchgeführt. Eine Agarosegelelektrophorese der RT-PCR-Produkte zeigte, daß in der fötalen Leber der Maus die RNA für den TIE-2-Liganden 1 (TL1) in der Stromaregion angereichert ist, aber in hämatopoetischen c-kit+TER119-Vorläuferzellen fehlt. In dem gleichen Gewebe ist die RNA für den TIE-2-Liganden 2 (TL2) in den Stromazellen angereichert, aber fehlt in den hämatopoetischen Vorläuferzellen (13). In dem fötalen Thymus der Maus ist TL2 in den Stromazellen angereichert (14).
  • Beispiel 16 – Das TIE-Rezeptor/Liganden-System bei der Angiogenese
  • Obwohl das TIE-2/TIE-Liganden-System eine wichtige Rolle bei der Biologie von Endothelzellen zu spielen scheint, ist nicht gezeigt worden, daß es eine wesentliche, aktive Rolle in der Früh- bis Intermediärphase der Gefäßbildung spielt (z. B. Proliferation und Migration von Angioblasten oder Endothelzellen, Tubulusbildung und andere Ereignisse in der frühen Phase der Gefäßmodellierung). Im Gegensatz zu den Rezeptoren und Faktoren, die bekanntermaßen diese Seiten der Gefäßsystementwicklung vermitteln, weist das zeitlich späte Muster der Expression von TIE-2 und TL1 im Verlauf der Gefäßbildung darauf hin, daß dieses System eine deutliche Funktion in den späten Phasen der Gefäßsystementwicklung, einschließlich der strukturellen und funktionellen Differenzierung und Stabilisierung von neuen Blutgefäßen, hat. Das Expressionsmuster von TIE-2/TL1 steht auch im Einklang mit einer fortgesetzten Rolle bei der Aufrechterhaltung der strukturellen Integrität und/oder der physiologischen Eigenschaften eines etablierten Gefäßsystems.
  • Der TIE-Ligand 2 (TL2) scheint ein kompetitiver Hemmstoff von TL1 zu sein. Die räumlichen, temporären Eigenschaften der TL2-Expression legen nahe, daß dieses einzelne Hemmstoffmolekül mehrere Kontext-abhängige Funktionen haben kann, die für eine geeignete Gefäßentwicklung oder -remodellierung essentiell sind (z. B. die Destabilisierung/Entdifferenzierung von ausgereiften Endothelzellen, was die Bildung neuer Gefäße aus dem bestehenden Gefäßsystem, die Hemmung einer ungeeigneten Blutgefäßbildung und die Rückbildung/Involution von ausgebildeten Blutgefäßen ermöglicht). 15 ist eine schematische Darstellung der angenommen Rolle der TIE-2/TIE-Liganden bei der Angiogenese. In dieser Figur ist TL1 durch (·) dargestellt, wird TL2 durch (*) wiedergegeben, ist TIE-2 durch (T) dargestellt, wird VEGF durch ([]) wiedergegeben und wird flk-1 (ein VEGF-Rezeptor) durch (Y) wiedergegeben.
  • Beispiel 17 – Expression von TIE-Liganden im weiblichen Fortpflanzungssystem: Expression im Eierstock
  • Vorläufige Beobachtungen, die bei Experimenten zur Untersuchung der Expression der TIE-Rezeptoren und -Liganden im weiblichen Fortpflanzungssystem gemacht wurden, stimmen mit der Hypothese überein, daß TL1 eine Rolle bei der Gefäßneubildung spielt, welche zeitweilig auf die Einwirkung von VEGF folgt. Das TL2-Expressionsmuster steht auch im Einklang mit einem Antagonismus der Wirkungsweise von TL1 und einer spezifischen Rolle bei der Gefäßrückbildung. Um dies zu bestätigen, kann die Expression von relevanten mRNAs nach der experimentellen Induktion der Follikel- und Lutealentwicklung untersucht werden, so daß ihre temporäre Beziehung zu verschiedenen Aspekten der Gefäßneubildung/Gefäßrückbildung eindeutiger definiert werden kann (z. B. in Verbindung mit der Färbung von Endothelzellen und mit Gefäßfüllungen). Die Angiogenese in Verbindung mit der Follikelentwicklung und der Gelbkörperbildung in eingestuften Eierstöcken von ausge wachsenen, weiblichen Ratten oder nach einem induzierten Follikelsprung in präpubertären Tieren wurde mit Hilfe der in situ-Hybridisierung verfolgt. 16 enthält Fotografien von Objektträgern einer in situ-Hybridisierung, welche das temporäre Expressionsmuster von TIE-2, TL1, TL2 und VEGF während des ovariellen Zyklus zeigen [Spalte 1: früher präovulatorischer Follikel; Spalte 2: prä-ovulatorischer Follikel; Spalte 3: früher Gelbkörper; und Spalte 4: atretischer Ovarialfollikel; Reihe A: Hellfeld; Reihe B: VEGF; Reihe C: TL2; Reihe D: TL1; und Reihe E: TIE-2-Rezeptor]. Diese Studien zeigten, daß VEGF, TL1 und TL2 in einer temporär und räumlich koordinierten Weise im Hinblick auf die Entwicklung und Rückbildung des Gefäßsystems im Eierstock, besonders im Hinblick auf die Etablierung des Gefäßsystems, das im Verlauf der Umwandlung eines Ovarialfollikels in einen Gelbkörper (CL) gebildet wird, exprimiert wird.
  • Kurz zusammengefaßt erhöht sich die VEGF-Expression in der Follikelkörnerschicht vor ihrer Vaskularisierung während des Prozesses der Luteinisierung. Während des Prozesses der CL-Bildung erscheinen die höchsten VEGF-Expressionsraten im Zentrum des sich entwickeenden CL in der Umgebung von luteinisierenden Zellen vor, die noch nicht vaskularisiert sind. Die VEGF-Spiegel bleiben mäßig hoch und sind in dem entwickelten CL diffus verteilt. Im Gegensatz dazu tritt eine merklich erhöhte Expression des TIE-2-Liganden 1 nur in der späten Phase des Prozesses der CL-Bildung, nachdem sich ein primäres Gefäßgeflecht etabliert hat, auf. Später erscheint die TL1-Expression in dem ganzen CL, zu diesem Zeitpunkt hat sich das definitive Kapillarennetz des CL etabliert.
  • TL2 zeigt ein komplexeres Expressionsmuster als entweder VEGF oder TL1. In dem sich entwickelnden CL wird TL2 in den höchsten Spiegeln auf der Vorderseite des sich entwickelnden Kapillarengeflechts zwischen der zentralen gefäßlosen Region des CL, wo die VEGF-Expression am höchsten ist, und dem äußersten Bereich des CL, wo die TL1-Expression überwiegt und wo der Luteinisierungsprozeß beendet ist und das Gefäßsystem am stärksten ausgebildet ist, exprimiert. TL2 scheint auch in hohen Spiegeln in der Follikelschicht von großen Follikeln, welche eine Atresie durchmachen, exprimiert zu werden. Obwohl TL1 auch in atretischen Follikeln erscheint, wird VEGF nicht exprimiert.
  • Das vorstehend beschriebene Expressionsmuster stimmt überwiegend mit einer Funktion von VEGF bei der Initiation der Angiogenese überein, wobei TL1 in einer späten Phase dieses Prozesses wirksam ist – zum Beispiel bei der Modellierung und/oder Stabilisierung des definitiven Gefäßnetzes. Im Gegensatz dazu ist TL2 sowohl in Bereichen einer aktiven Ausdehnung eines sich neu bildenden Gefäßnetzes (während der CL-Bildung) als auch in Regionen, kein neues Gefäßsystem ausbilden und in denen die Gefäßrückbildung im Gange ist (atretische Follikel), vorhanden. Dies weist auf eine dynamischere und komplexere Rolle von TL2 hin, möglicherweise in Verbindung mit der Destabilisierung eines bestehenden Gefäßsystems (notwendig für die Rückbildung) oder eines sich entwickelnden Gefäßsystems (notwendig für die dynamische Modellierung von sich neu bildenden Gefäßen).
  • Beispiel 18 – Rezeptorkörper-Bindungstest und Liganden-Bindungs- und -Kompetitionstest
  • Ein quantitativer zellfreier Bindungstest mit zwei wechselnden Anordnungen ist für den Nachweis von entweder der TIE-2-Rezeptorkörper-Bindung oder der Liganden-Bindung und -Kompetition entwickelt worden. Bei der Ausführung des Tests für die Rezeptorkörper-Bindung wird eine ELISA-Platte mit TIE-2-Liganden beschichtet (gereinigt oder teilweise gereinigt; entweder TL1 oder TL2). Anschließend wird der Rezeptorkörper in unterschiedlichen Konzentrationen zugegeben, welcher an den immobilisierten Liganden in einer dosisabhängigen Weise bindet. Nach zwei Stunden wird der überschüssige Rezeptorkörper abgewaschen; dann wird die an die Platte gebundene Menge unter Verwendung eines spezifischen anti-Mensch-Fc-Antikörpers, der mit alkalischer Phosphatase markiert ist, bestimmt. Der überschüssige Reporter-Antikörper wird abgewaschen, und anschließend wird die AP-Reaktion unter Verwendung eines farbigen Substrates entwickelt. Der Test wird unter Verwendung eines Spektrophotometers quantitativ ausgewertet. 19 zeigt eine typische TIE-2-IgG-Bindungskurve. Dieser Test ist verwendet worden, um die Integrität von TIE-2-IgG nach der Injektion in Ratten und Mäuse zu beurteilen. Der Test kann in dieser Anordnung auch als ein Liganden-Kompetitionstest verwendet werden, wobei gereinigte oder teilweise gereinigte TIE-Liganden mit dem immobilisierten Liganden um den Rezeptorkörper konkurrieren. Bei der Ausführung des Bindungstests für die Liganden-Bindung und -Kompetition wird eine ELISA-Platte mit der TIE-2-Ektodomäne beschichtet. Die Fc markierten Fragmente der Fibrinogen-ähnlichen Domäne der TIE-Liganden (TL1-fFc und TL2-fFc) binden dann an die Ektodomäne und können unter Verwendung desselben anti-Mensch-Fc-Antikörpers, wie vorstehend beschrieben, nachgewiesen werden. 20 zeigt ein Beispiel für die TL1-fFc-Bindung an die TIE-2-Ektodomäne. Diese Ausführung des Tests kann auch verwendet werden, um TL1-fFc-Spiegel in Serum oder anderen Proben quantitativ zu bestimmen. Falls ein unmarkierter Ligand (wiederum entweder gereinigt oder ungereinigt) zur gleichen Zeit wie das TL1-fFc zugegeben wird, setzt dann eine Kompetition zwischen dem markierten Liganden-Fragment und dem Liganden vollständiger Länge ein. Der Ligand vollständiger Länge kann das Fc markierte Fragment verdrängen, und eine Kompetitionskurve wird erstellt.
  • Beispiel 19 – Die EA. hy926-Zelllinie kann als eine Reporter-Zelllinie für die TIE-Liganden-Aktivität verwendet werden
  • EA. hy926 ist eine Zellhybridlinie, die durch Fusion von HUVEC-Zellen mit der menschlichen Zelllinie A549, abgeleitet aus einem Lungenkarzinom, etabliert wurde (Edgell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983), 3734–3737). Es ist festgestellt worden, daß EA. hy926-Zellen signifikante Mengen des TIE-2-Rezeptor-Proteins mit geringen Phosphotyrosin-Basismengen exprimieren. Die Dichte, bei der EA. hy926-Zellen vor ihrer Verwendung für die Rezeptor-Tests Passagen unterzogen werden, sowie ihr Konfluenzgrad zum Zeitpunkt des Tests können die Häufigkeit des TIE-2-Rezeptors und die relative Induzierbarkeit als Antwort auf die Behandlung mit dem Liganden beeinflussen. Durch Übernehmen des folgenden Schemas für die Züchtung dieser Zellen kann die EA. hy926-Zelllinie als ein zuverlässiges System für das Testen der Aktivität von TIE-2-Liganden verwendet werden.
  • EA. hy926-Zellen werden bei 1,5 × 106 Zellen in T-75-Flaschen (Falconware) überimpft und wieder jeden zweiten Tag mit Glucose-reichem Dulbecco's MEM, 10% fötalem Rinderserum, L-Glutamin, Penicillin-Streptomycin und 1 × Hypoxanthin-Aminopterin-Thymidin (HAT, Gibco-BRL) versorgt. Nach drei- bis viertägiger Züchtung werden die Zellen noch einmal bei 1,5 × 106 Zellen pro T-75-Flasche einer Passage unterzogen und weitere drei bis vier Tage gezüchtet. Für Phosphorylierungstests wurden Zellen, gezüchtet, wie vorstehend beschrieben, durch Ersetzen des Kulturmediums mit Glucose-reichem DMEM und Inkubieren für 2–3 Stunden bei 37°C einem Serummangel ausgesetzt. Dieses Medium wurde aus der Flasche abgesaugt, und Proben der konditionierten Medien oder des gereinigten Liganden wurden zu der Flasche in einem Gesamtvolumen von 1,5 ml zugegeben, gefolgt durch eine Inkubation bei 37°C für 5 Minuten. Die Flaschen wurden aus dem Brutschrank genommen und auf ein Eisbett gelegt. Das Medium wurde entfernt und durch 1,25 ml Lysepuffer, enthaltend 1% Nonidet P-40, 0,5% Natriumdesoxycholat, 0,1% SDS in 20 mM Tris, pH 7,6, 150 mM NaCl, 50 mM NaF, 1 mM Natriumorthovanadat, 5 mM Benzamidin und 1 mM EDTA, und enthaltend die Proteaseinhibitoren PMSF, Aprotinin und Leupeptin, ersetzt. Nach 10 Minuten auf Eis, um die Solubilisierung der Membran zu ermöglichen, wurden die Platten abgeschabt, und die Zelllysate wurden durch Mikrozentrifugation bei Höchstgeschwindigkeit für 10 Minuten bei 4°C geklärt. Der TIE-2-Rezeptor wurde aus dem geklärten Überstand durch Inkubation in der Kälte mit einem polyclonalen anti-TIE-2-Antiserum und Protein G-konjugierten Sepharose-Kügelchen immunpräzipitiert. Die Kügelchen wurden dreimal mit kaltem Zelllysepuffer gewaschen und für 5 Minuten in Laemmli-Probenpuffer gekocht, der dann auf 7,5%ige SDS-Polyacrylamid-Gele aufgegeben wurde. Die aufgetrennten Proteine wurden mittels Elektrotransfer auf eine PVDF (Lamblia-P)-Membran übertragen und dann einer Western-Blot-Analyse unter Verwendung eines anti-Phosphotyrosin-Antikörpers und des ECL-Reagens unterzogen. Der folgende Vergleich der Gesamtmengen des TIE-2-Proteins auf den gleichen Blots erfolgte durch das Ablösen des anti-Phosphotyrosin-Antikörpers und das erneute Inkubieren mit einem polyclonalen Antiserum, das für die Ektodomäne von TIE-2 spezifisch ist.
  • Beispiel 20 – Isolierung und Sequenzierung eines cDNA-Clons vollständiger Länge, der den Säuger-TIE-Liganden 3 codiert
  • Der TIE-Ligand 3 (TL3) wurde aus einer Maus-BAC-Genombank (Research Genetics) cloniert, indem Genbank-Duplikate mit entweder Maus-TL1- oder Maus-TL2-Sonden, die der gesamten codieren Sequenz dieser Gene entsprechen, hybridisiert wurden. Jede Kopie der Genbank wurde unter Verwendung von Phosphatpuffer bei 55°C über Nacht hybridisiert. Nach der Hybridisierung wurden die Filter unter Verwendung von 2 × SSC, 0,1% SDS bei 60°C gewaschen, gefolgt von der Exposition der Filter gegen einen Röntgenfilm. Starke Hybridisierungssignale wurden identifiziert, welche dem Maus-TL1 und dem Maus-TL2 entsprechen. Außerdem wurden Signale identifiziert, welche mit sowohl dem Maus-TL1 als auch dem Maus-TL2 schwach hybridisierten. Die diesen Clonen entsprechende DNA wurde gereinigt, dann mit Restriktionsenzymen gespalten, und zwei Fragmente, die mit den ursprünglichen Sonden hybridisierten, wurden in ein Bakterienplasmid subcloniert und sequenziert. Die Sequenz der Fragmente enthielt zwei Exons mit einer Homologie zu sowohl dem Maus-TL1 als auch dem Maus-TL2. Primer, welche für diese Sequenzen spezifisch waren, wurden als PCR-Primer verwendet, um Gewebe zu identifizieren, die Transkripte enthalten, welche TL3 entsprechen. Eine PCR-Bande, die TL3 entspricht, wurde in einer Maus-Uterus-cDNA-Bank in Lambda gt-11 (Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA) identifiziert.
  • Plaques wurden in einer Dichte von 1,25 × 106/20 × 20 cm-Platte plattiert, und Replika-Filter wurden gemäß Standardverfahren abgenommen (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Seite 8.46, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York). Doppelte Filter wurden bei "normaler" Stringenz (2 × SSC, 65°C) mit einer 200 bp großen, radioaktiv markierten PCR-Sonde durchmustert, die gegen die Sequenz des Maus-TL3 hergestellt wurde. Die Hybridisierung erfolgte bei 65°C in einer Lösung, die 0,5 mg/ml Lachssperma-DNA enthielt. Die Filter wurden in 2 × SSC bei 65°C gewaschen und für 6 Stunden einem Röntgenfilm ausgesetzt. Zwei positive Clone, die bei den Replika-Filtern doppelt hybridisierten, wurden ausgewählt. Ein EcoRI-Verdau der Phagen-DNA, die aus diesen Clonen erhalten wurde, ergab zwei unabhängige Clone mit Insertionsgrößen von etwa 1,2 kb und etwa 2,2 kb. Die 2,2 kb große EcoRI-Insertion wurde in die EcoRI-Stelle von pBluescript KS (Stratagene) subcloniert. Eine Sequenzanalyse zeigte, daß dem größeren Clon ein Initiations-Methionin und ein Signalpeptid fehlte, aber sonst eine Sonde codiert wurde, die zu sowohl dem Maus-TL1 als auch dem Maus-TL2 homolog ist.
  • Zwei TL3-spezifische PCR-Primer wurden dann wie folgt synthetisiert:
    US2: cctctgggctcgccagtttgttagg
    US 1: ccagctggcagatatcagg
  • Die folgenden PCR-Reaktionen wurden unter Verwendung von Expressionsbanken durchgeführt, die aus den Mauszelllinien C2C12-ras und MG87 abgeleitet wurden. Bei der primären PCR-Reaktion wurde der spezifische Primer US2 in Verbindung mit vektorspezifischen Oligonucleotiden verwendet, um die Amplifikation in jeder Orientierung zu ermöglichen. Die PCR wurde in einem Gesamtvolumen von 100 ml unter Verwendung von 35 Zyklen von 94°C, 1 min; 42°C oder 48°C für 1 min; und 72°C, 1 min durchgeführt. Die sekundäre PCR-Reaktion schloß den zweiten spezifischen Primer, US1, der in dem primären PCR-Produkt enthalten ist, in Verbindung mit den gleichen Vektor-Oligonucleotiden ein. Die sekundären Reaktionen wurden für 30 Zyklen unter Verwendung der gleichen Temperaturen und Zeiten, wie vorher, durchgeführt. Die PCR-Produkte wurden aus einem Gel isoliert und einer Sequenzanalyse unterzogen. Basierend auf den Sequenzen, die aus insgesamt vier unabhängigen PCR-Reaktionen unter Verwendung von zwei verschiedenen cDNA-Banken erhalten wurden, wurde das 5'-Ende der TL3-Sequenz abgeleitet. Eine Northern-Analyse wies mittlere bis geringe Mengen des Maus-TL3-Transkripts in der Maus-Plazenta nach. Die Expression des Maus-TL3 bestand aus einem Transkript von etwa 3 kb. Die vollständige TL3 codierende Sequenz ist in 21 angegeben.
  • Die Maus-TL3-Sequenz kann dann verwendet werden, um einen menschlichen Clon, enthaltend die codierende Sequenz des menschlichen TL3, durch Hybridisierung von entweder einer menschlichen genomischen oder einer cDNA-Bank mit einer Sonde, die dem Maus-TL3 entspricht, wie zum Beispiel bereits vorstehend in Beispiel 8 beschrieben, zu erhalten.
  • Beispiel 21 – Isolierung eines genomischen Clons vollständiger Länge, der den menschlichen TIE-Liganden 4 codiert
  • Der TIE-Ligand 4 wurde aus einer Maus-BAC-Genombank (BAC HUMAN (II); Genome Systems, Inc.) durch die Hybridisierung von Genbank-Duplikaten mit entweder einer radioaktiven Sonde für den menschlichen TL1, welche der gesamten codierenden Sequenz für die Fibrinogen-Domäne von TL1 entspricht (Nucleotide 1153 bis 1806 von 6), oder einer radioaktiven Sonde für den Maus-TL3, welche einem Segment von 186 Nucleotiden aus der Fibrinogen-Region des Maus-TL3 entspricht (Nucleotide 1307 bis 1492 von 21), cloniert. Jede Sonde wurde unter Verwendung von genau den gleichen Oligonucleotiden und üblichen PCR-Bedingungen, außer daß dCTP durch 32P-dCTP ersetzt wurde, mittels PCR markiert. Das PCR-Gemisch wurde dann über eine Gelfiltrationssäule geleitet, um die Sonde von dem freien 32P-dCTP zu trennen. Jede Kopie der Genbank wurde unter Verwendung von Phosphatpuffer und der radioaktiven Sonde bei 55°C über Nacht bei üblichen Hybridisierungsbedingungen hybridisiert. Nach der Hybridisierung wurden die Filter unter Verwendung von 2 × SSC, 0,1% SDS bei 55°C gewaschen, gefolgt durch die Exposition gegen einen Röntgenfilm. Starke Hybridisierungssignale wurden beobachtet, die dem menschlichen TL1 entsprechen. Außerdem wurden Signale identifiziert, die mit sowohl dem menschlichen TL1 als auch mit dem Maus-TL3 schwach hybridisierten. Die diesen Clonen entsprechende DNA wurde mittels üblicher Verfahren gereinigt, dann mit Restriktionsenzymen gespalten, und ein Fragment, das mit den ursprünglichen Sonden hybridisierte, wurde in ein Bakterienplasmid subcloniert und sequenziert. Die Sequenz des Fragments enthielt ein Exon mit einer Homologie zu sowohl dem menschlichen TL1 als auch dem Maus-TL3 und anderen Vertretern der TIE-Liganden-Familie. Primer, welche für diese Sequenzen spezifisch waren, können als PCR-Primer verwendet werden, um Gewebe zu identifizieren, die Transkripte enthalten, welche dem TL4 entsprechen.
  • Die vollständige Sequenz des menschlichen TL4 kann durch Sequenzieren des vollständigen BAC-Clons, welcher in den hinterlegten Bakterienzellen enthalten ist, erhalten werden. Exons können durch die Homologie mit bekannten Vertretern der TIE-Liganden-Familie wie TL1, TL2 und TL3 identifiziert werden. Die vollständige codierende Sequenz von TL4 kann dann durch das gemeinsame Spleißen der Exons aus dem genomischen Clon von TL4 bestimmt werden, welche wiederum verwendet werden kann, um das TL4-Protein herzustellen. Alternativ können die Exons als Sonden verwendet werden, um einen cDNA-Clon vollständiger Länge zu erhalten, welcher dann verwendet werden kann, um das TL4-Protein herzustellen. Exons können auch aus der Sequenz des BAC-Clons durch die Homologie mit Proteindomänen wie Fibrinogen-Domänen und Coild coil-Domänen oder mit Proteinsignalen wie Signalpeptidsequenzen identifiziert werden. Fehlende Exons aus dem BAC-Clon können durch Identifizierung von zusammenhängenden BAC-Clonen, zum Beispiel unter Verwendung der Enden des hinterlegten BAC-Clons als Sonden, um eine menschliche Genombank, wie die hierin verwendete, zu durchmustern, unter Verwendung der Exonsequenz, die in dem BAC-Clon enthalten ist, um eine cDNA-Bank zu durchmustern, oder durch Durchführung von entweder einem 5'- oder 3'-RACE-Verfahren unter Verwendung von Oligonucleotidprimern, welche auf den TL4-Exonsequenzen basieren, erhalten werden.
  • Identifizierung von weiteren Vertretern der TIE-Liganden-Familie
  • Die Sequenz des neuen TIE-Liganden 4 kann bei einer rationalen Suche nach weiteren Vertretern der TIE-Liganden-Familie unter Verwendung eines Ansatzes, welcher Nutzen zieht aus dem Vorhandensein von konservierten Segmenten mit einer starken Homologie zwischen den bekannten Familienmitgliedern, verwendet werden. Zum Beispiel zeigt eine Ausrichtung der Aminosäuresequenzen der TIE-Liganden gegeneinander mehrere Bereiche einer konservierten Sequenz (vgl. die eingerahmten Regionen von 22). Degenerierte Oligonucleotide, welche im wesentlichen auf diesen Bereichen basieren, in Kombination mit entweder bereits bekannten oder neuen Homologie-Segmenten von TIE-Liganden können verwendet werden, um neue TIE-Liganden zu identifizieren.
  • Die stark konservierten Regionen von TL1, TL2 und TL3 können bei der Konstruktion von degenerierten Oligonucleotidprimern verwendet werden, mit welchen PCR-Reaktionen unter Verwendung von cDNAs geprimt werden. cDNA-Matrizen können durch reverse Transkription von Gewebe-RNAs unter Verwendung von Oligo-d(T) oder anderen geeigneten Primern erzeugt werden. Aliquots der PCR-Reaktionen können dann einer Elektrophorese auf einem Agarosegel unterzogen werden. Die erhaltenen amplifizierten DNA-Fragmente können durch Insertion in Plasmide cloniert und sequenziert, und die DNA-Sequenzen mit den Sequenzen aller bekannten TIE-Liganden verglichen werden.
  • Nach Größe ausgewählte, amplifizierte DNA-Fragmente aus diesen PCR-Reaktionen können in Plasmide cloniert und durch Elektroporation in E. coli eingeschleust werden, und Transformanten können auf Selektionsagar plattiert werden. Bakterienkolonien der PCR-Transformation können durch Sequenzieren der Plasmid-DNAs, die durch übliche Plasmidverfahren gereinigt werden, untersucht werden.
  • Clonierte Fragmente, die ein Segment eines neuen TIE-Liganden enthalten, können als Hybridisierungssonden verwendet werden, um cDNA-Clone vollständiger Länge aus einer cDNA-Bank zu erhalten. Zum Beispiel kann die genomische Sequenz des menschlichen TL4 verwendet werden, um einen menschlichen cDNA-Clon zu erhalten, der die vollständige codierende Sequenz des menschlichen TL4 enthält, indem eine menschliche cDNA-Bank mit einer Sonde hybridisiert wird, die dem menschlichen TL4 entspricht, wie bereits beschrieben worden ist.
  • Beispiel 22 – Clonierung der vollständigen codierenden Sequenz von hTL4
  • Sowohl die 5'- als auch die 3'-codierende Sequenz aus dem genomischen Clon des menschlichen TL4, der den menschlichen TIE-Liganden 4 codiert (hTL4; ATCC-Eingangsnummer 98095), wurden durch Restriktionsenzymverdau, Southern-Blot und Hybridisierung des hTL4-Clons mit codierenden Sequenzen aus dem Maus-TL3, gefolgt durch die Subclonierung und Sequenzierung der hybridisierenden Fragmente, erhalten. Codierende Sequenzen, die den N-terminalen und C-terminalen Aminosäuren von hTL4 entsprechen, wurden verwendet, um PCR-Primer zu konstruieren (nachstehend gezeigt), die wiederum für die PCR-Amplifikation von TL4 aus einer menschlichen Eierstock-cDNA verwendet wurden. Eine PCR-Bande, welche dem menschlichen TL4 entspricht, wurde durch DNA-Sequenzierung unter Verwendung des ABI 373A-DNA-Sequenzanalysengeräts und des Taq Dideoxy Terminator Cycle-Sequenzierungskits (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) identifiziert. Die PCR-Bande wurde dann in den Vektor pCR-script subcloniert, und mehrere Plasmid-Clone wurden durch Sequenzieren analysiert. Die vollständige codierende Sequenz des menschlichen TL4 wurde dann zusammengestellt und ist in 23 dargestellt. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird das Nucleotid an Position 569 von A zu G verändert, woraus ein Aminosäureaustausch von Q zu R resultiert.
  • Die PCR-Primer, welche verwendet wurden wie vorstehend beschrieben wurden wie folgt entworfen:
  • Figure 00610001
  • Die Kleinbuchstaben gegen "Schwanz"-Sequenzen an, welche an die PCR-Primer angehängt wurden, um die Clonierung der amplifizierten PCR-Fragmente zu erleichtern.
  • Beispiel 23 – Konstruktion und Charakterisierung von modifizierten TIE-Liganden
  • Eine Genanalyse des TIE-2-Liganden 1 und des TIE-2-Liganden 2 (TL1 und TL2) wurde durchgeführt, um Einblicke in eine Reihe ihrer beobachteten Eigenschaften zu erhalten. Obwohl TL1 und TL2 eine ähnliche strukturelle Homologie gemeinsam haben, zeigen sie unterschiedliche physikalische und biologische Eigenschaften. Das auffallendste Merkmal, das die zwei Liganden unterscheidet, ist, daß, obwohl sie beide an den TIE-2-Rezeptor binden, TL1 ein Agonist ist, während TL2 ein Antagonist ist. Unter nicht-reduzierenden Elektrophoresebedingungen zeigen beide Proteine kovalente, multimere Strukturen. TL1 wird als ein Gemisch von Multimeren hergestellt, die durch Disulfidbrücken vernetzt sind und vorwiegend aus Trimeren und Spezies höherer Ordnung bestehen, wobei keine dimeren Spezies vorkommen. Jedoch wird TL2 praktisch ausschließlich als ein Dimer hergestellt. Während TL2 in den meisten Expressionssystemen in ausreichenden Mengen hergestellt wird, wird TL1 kaum exprimiert, und es ist schwierig, große Mengen davon herzustellen. Schließlich scheinen auch die Herstellungs- und Reinigungsbedingungen den TL1 für eine Inaktivierung durch eine proteolytische Spaltung an einer Stelle nahe dem Aminoterminus anfällig zu machen.
  • Um diese Unterschiede zu untersuchen, wurden mehrere modifizierte Liganden wie folgt konstruiert.
  • 23.1 Cystein-Substitution
  • Untersuchungen darüber, welche Faktoren zu den unterschiedlichen physikalischen und biologischen Eigenschaften der zwei Moleküle beitragen könnten, zeigten das Vorhandensein eines Cysteinrestes in TL1 (CYS 265 in 4; CYS 245 in 17), welcher der Fibrinogen-ähnlichen Domäne in TL1 vorausgeht, welcher aber in TL2 fehlt; d. h. es gab keinen entsprechenden Cysteinrest in TL2. Der CYS265-Rest in TL1 wird durch TGC codiert und liegt etwa bei den Nucleotiden 1102–1104 (vgl. 4) an der ungefähren Verbindungsstelle zwischen der Coiled-coil-Domäne und der Fibrinogen-ähnlichen Domäne. Da Cysteinreste im allgemeinen an der Bildung von Disulfidbrücken beteiligt sind, kann deren Anwesenheit sowohl zu der Tertiärstruktur als auch den biologischen Eigenschaften eines Moleküls beitragen. Daher wurde angenommen, daß die Anwesenheit des CYS265-Restes in TL1 zumindest teilweise für die unterschiedlichen Eigenschaften der zwei Moleküle verantwortlich sein könnte.
  • Um diese Hypothese zu überprüfen, wurde ein Expressionsplasmid konstruiert, das eine Mutation in TL1 enthielt, wobei das CYS (Rest 265 in 4; Rest 245 in 17) durch eine Aminosäure (Serin) ersetzt wurde, die keine Disulfidbrücken bildet. Zusätzlich zu dieser TL1/CYS-Mutante wurde ein zweites Expressionsplasmid konstruiert, worin die annähernd entsprechende Position in TL2 (Met-247 in 17) durch Mutation verändert wurde, so daß dieser Rest nun ein Cysteinrest war. Sowohl die nicht-mutierten als auch die mutierten Expressionsplasmide von TL1 und TL2 wurden vorübergehend in COS-7-Zellen transfiziert, und die Zellüberstände, welche die rekombinanten Proteine enthielten, wurden gewonnen. Proben davon wurden sowohl einer reduzierenden als auch einer nichtreduzierenden SDS/PAGE-Elektrophorese und anschließend einem Western-Blot-Verfahren unterzogen.
  • 18 zeigt die Western-Blots unter nicht-reduzierenden Bedingungen für sowohl die nicht-mutierten als auch die mutierten TL1- und TL2-Proteine, welche zeigen, daß die TL1/CYS–-Mutante in ähnlicher Weise wie TL2 als ein Dimer wandert, und daß die TL2/CYS+-Mutante in ähnlicheren Weise wie TL1 in der Lage ist, ein Trimer sowie Multimere höherer Ordnung zu bilden. Wenn die zwei mutierten Proteine auf ihre Fähigkeit getestet wurden, die Phosphorylierung in TIE-2 exprimierenden Zellen zu induzieren, war die TL1/CYS–-Mutante fähig, den TIE-2-Rezeptor zu aktivieren, während die TL2/CYS+-Mutante dazu nicht in der Lage war.
  • Auf diese Weise wurde festgestellt, daß, wenn der Cysteinrest (Rest 265 in 4; Rest 245 in 17) von TL1 genetisch zu einem Serinrest verändert wurde, die kovalente Struktur von TL1 derjenigen von TL2 ähnlich wurde; d. h. vorwiegend dimer. Das modifizierte TL1-Molekül verhielt sich noch als ein Agonist; folglich war die trimere Struktur und/oder die multimere Struktur höherer Ordnung nicht der bestimmende Faktor, welcher TL1 die Fähigkeit zur Aktivierung verleiht. Obwohl die Entfernung des Cysteinrestes ein Molekül mit wünschenswerteren Eigenschaften ergab, verbesserte sie die Produktionsrate von TL1 nicht.
  • 23.2. Deletion von Domänen
  • Die Nucleotidsequenzen, die TL1 und TL2 codieren, haben eine genetische Struktur gemeinsam, die basierend auf den Aminosäuresequenzen der reifen Proteine in drei Domänen unterteilt werden kann. Die letzten annähernd 215 Aminosäurereste jedes reifen Proteins enthalten sechs Cysteinreste und besitzen eine große Ähnlichkeit mit einer Fibrinogen-Domäne. Diese Region wurde folglich als die "Fibrinogen-ähnliche" Domäne oder "F-Domäne" bezeichnet. Für eine zentrale Region des reifen Proteins, enthaltend etwa 205 Reste, bestand eine große Wahrscheinlichkeit für die Annahme einer "Coiled-coil"-Struktur, und diese wurde als die "Coiled-coil"-Domäne oder "C-Domäne" bezeichnet. Die annähernd 55 aminoterminalen Reste des reifen Proteins enthielten zwei Cysteinreste, und für diese bestand eine geringe Wahrscheinlichkeit für eine "Coiled-coil"-Struktur. Diese Region wurde als die "N-terminale" Domäne oder "N-Domäne" bezeichnet. Die hierin beschriebenen modifizierten Liganden werden unter Verwendung einer Terminologie bezeichnet, wobei N = N-terminale Domäne, C = Coiled-coil-Domäne, F = Fibrinogen-ähnliche Domäne, und die Zahlen 1 und 2 auf TL1 bzw. TL2 verweisen. Folglich verweist 1 N auf die N-terminale Domäne von TL1, verweist 2F auf die Fibrinogen-ähnliche Domäne von TL2, usw.
  • Um zu untersuchen, ob die Fibrinogen-ähnliche Domäne (F-Domäne) der TIE-2-Liganden die Aktivität für die TIE-2-Aktivierung enthielt, wurden Expressionsplasmide konstruiert, worin die Coiled-coil-Domäne und die N-terminale Domäne deletiert wurden, wobei nur der Teil der DNA-Sequenz zurückbleibt, der die F-Domäne codiert (für TL1 beginnend in 4 bei etwa Nucleotid 1159, Aminosäurerest ARG-284; für TL2 beginnend entsprechend bei etwa Nucleotid 1200 in 6, Aminosäurerest 282). Dieses mutierte Konstrukt wurde dann vorübergehend in COS-Zellen transfiziert. Der Überstand, welcher das rekombinante Protein enthielt, wurde gewonnen. Die TL1/F-Domäne-Mutante wurde auf ihre Fähigkeit getestet, an den TIE-2-Rezeptor zu binden. Die Ergebnisse zeigten, daß die TL1/F-Domäne-Mutante als ein Monomer nicht in der Lage war, an TIE-2 in einer nachweisbaren Menge zu binden.
  • Wenn aber das TL1/F-Domäne-Monomer mit einem myc-Marker markiert und anschließend mit einem Antikörper, der gegen den myc-Marker gerichtet war, gruppiert wurde, zeigte es eine nachweisbare Bindung an TIE-2. Jedoch war die mit dem Antikörper gruppierte TL1/F-Domäne-Mutante nicht in der Lage, die Phosphorylierung in einer TIE-2 exprimierenden Zelllinie zu induzieren.
  • Auf diese Weise wurde festgestellt, daß die F-Domäne der TIE-2-Liganden an der Bindung an den Rezeptor beteiligt ist, aber daß ein verkürztes Molekül, welches nur aus der F-Domäne allein besteht, für die Bindung an den Rezeptor nicht ausreichend ist. Dies eröffnete die Möglichkeit, daß die Coiled-coil-Domäne für den Zusammenhalt mehrerer Fibrinogen-ähnlicher Domänen verantwortlich war, was für die Bindung an den Rezeptor wesentlich sein könnte. Bei einem Versuch, diese Hypothese zu bestätigen, wurde die F-Domäne mit dem Fc-Teil des menschlichen Antikörpers IgG1 fusioniert. Da Fc-Teile bei der Expression durch Säugerzellen dimerisieren, ahmten diese rekombinanten Proteine die theoretische Konfiguration der F-Domänen nach, wo die nativen Liganden dimerisieren. Dieses F-Domäne-Fc-Konstrukt band an den Rezeptor, aber konnte ihn nicht aktivieren. Anscheinend ist die Multimerisierung, die durch andere Regionen der Liganden hervorgerufen wird, notwendig, um zu ermöglichen, daß die Liganden an den TIE-2-Rezeptor binden. Außerdem müssen einige andere Faktoren außerhalb der F-Domäne zur Phosphorylierung des Rezeptors beitragen.
  • Anschließend wurden Mutanten konstruiert, worin die Fibrinogen-ähnliche Domäne fehlte, so daß sie nur die N-terminale Domäne und die Coiled-coil-Domäne enthielten. Diese waren nicht in der Lage, an den Rezeptor zu binden. Um die Funktion der N-terminalen Domäne bei der Rezeptor-Bindung und -Aktivierung zu untersuchen, wurden die Liganden verkürzt, so daß sie nur die C- und F-Domänen enthielten, und am N-Terminus mit einem FLAG-Marker markiert, wobei Konstrukte erzeugt wurden, welche als FLAG-1C1F und FLAG-2C2F bezeichnet wurden. Obwohl diese Moleküle in COS-7-Zellen, welche vorübergehend transfiziert wurden, so daß sie den TIE-2-Rezeptor exprimieren, eine starke Färbung hervorriefen, reagierten sie in einem Phosphorylierungstest nicht. Folglich enthält die N-Domäne einen wesentlichen Faktor für die Rezeptor-Aktivierung, obwohl, wie nachstehend offenbart, die Fähigkeit des chimären Moleküls 2N2C1F, den Rezeptor zu aktivieren, zeigt, daß selbst die N-Domäne eines inaktiven Liganden diese Funktion erfüllen kann.
  • Die bereits beschriebenen Unterschiede bezüglich des Verhaltens zwischen der myc-markierten F-Domänen-Verkürzung und der Fc-markierten F-Domänen-Verkürzung legten nahe, daß die TIE-Liganden nur in dimeren oder höheren multimeren Formen binden können. In der Tat zeigte eine nicht-reduzierende SDS-PAGE, daß die TIE-Liganden natürlicherweise in dimeren, trimeren und multimeren Formen vorliegen. Daß die FLAG- 1C1F- und FLAG-2C2F-Verkürzungen an den TIE-2-Rezeptor ohne Dimerisierung durch einen synthetischen Marker (wie Fc) binden können, während die F-Verkürzungen dies nicht können, legt nahe, daß die C-Region zumindest teilweise für die Aggregation der F-Domänen verantwortlich ist.
  • 23.3. Austauschkonstrukte (Chimäre)
  • Die Anmelder hatten festgestellt, daß die Produktionsrate von TL1 in COS-7-Zellen um etwa das 10fache geringer war als die Produktion von TL2. Daher wurden Chimären von TL1 und TL2 konstruiert, um zu versuchen, diesen Unterschied zu erklären und auch um die Aktivität als Agonist von TL1 im Vergleich zu der Aktivität als Antagonist von TL2 weiter zu charakterisieren.
  • Vier Chimären wurden konstruiert, worin entweder die N-terminale Domäne oder die Fibrinogen-ähnliche Domäne zwischen TL1 und TL2 ausgetauscht wurde, und unter Verwendung der bereits beschriebenen Terminologie bezeichnet, so daß zum Beispiel 1N1C2F auf eine Chimäre mit der N-terminalen Domäne und der Coiled-coil-Domäne aus TL1 zusammen mit der Fibrinogen-ähnlichen Domäne aus TL2 verweist. Vier Chimären wurden wie folgt konstruiert:
    Chimäre 1 – 1N1C2F
    Chimäre 2 – 2N2C1F
    Chimäre 3 – 1N2C2F
    Chimäre 4 – 2N1C1F
  • Die Nucleotid- und Aminosäuresequenzen der Chimären 1–4 sind jeweils in den 24–27 gezeigt.
  • Jede Chimäre wurde in einen separaten Expressionsvektor pJFE14 inseriert. Die Chimären wurden dann zusammen mit dem leeren pJFE14-Vektor, dem nativen TL1 und dem nativen TL2 als Kontrollen in COS-7-Zellen transfiziert, und die Kulturüberstände wurden gesammelt.
  • Um zu bestimmen, wie der Austausch die Expressionsrate der Liganden beeinflußte, wurde eine 1 : 5-Verdünnung und eine 1 : 50-Verdünnung der COS-7-Überstände durch ein Dot-Blot-Verfahren auf Nitrocellulose übertragen. Drei Liganden, welche die N-Domäne aus TL1 enthielten (d. h. der native TL1, 1N2C2F und 1N1C2F), wurden dann mit einem Kaninchen-Antikörper, der für den N-Terminus von TL1 spezifisch war, als Sonde untersucht. Drei Liganden, welche die N-Domäne aus TL2 enthielten (d. h. der native TL2, 2N1C1F und 2N2C1F), wurden mit einem Kaninchen-Antikörper, der für den N-Terminus von TL2 spezifisch war, als Sonde untersucht. Die Ergebnisse zeigten, daß die COS-7-Zellen ein Molekül, das die N-Domäne von TL2 enthält, in einer Menge exprimierten, die um etwa das 10fache höher war als die Menge eines Moleküls, das die N-Domäne aus TL1 enthält, unabhängig von der restlichen Zusammensetzung des Proteins. Die Schlußfolgerung war, daß die N-Domäne die Expressionsrate des Liganden in erster Linie kontrollieren muß.
  • Die nächste Frage war, ob die Chimären fähig sind, den TIE-2-Rezeptor zu aktivieren oder nicht. EA. hy926-Zellen wurden den vier Chimären sowie TL1 als eine positive Kontrolle für die Phosphorylierung und TL2 oder einem Überstand von COS-7-Zellen, die mit einem leeren pJFE14 transfiziert wurden, als negative Kontrollen für die Phosphorylierung ausgesetzt. Die Zellen wurden lysiert, und der TIE-2-Rezeptor wurde aus dem Zelllysat immunpräzipitiert und auf einer SDS-PAGE aufgetrennt. Die Proben wurden auf Western-Blots übertragen und mit einem anti-Phosphotyrosin-Antikörper als Sonde untersucht, um irgendwelche Rezeptoren nachzuweisen, die phosphoryliert worden sind. Überraschenderweise konnten nur die Konstrukte, welche die Fibrinogen-ähnliche Domäne aus TL1 enthalten (2N1C1F und 2N2C1F), den TIE-2-Rezeptor phosphorylieren. Folglich, obwohl die N-terminale Region von TL1 für die Aktivierung wesentlich ist, kann sie durch die N-terminale Region von TL2 ersetzt werden; d. h. die Information, die festlegt, ob der Ligand ein Agonist oder ein Antagonist ist, ist in Wirklichkeit in der Fibrinogen-ähnlichen Domäne enthalten.
  • Auf diese Weise wurde festgestellt, daß die F-Domäne zusätzlich zur Bindung an den TIE-2-Rezeptor für die Phosphorylierungsaktivität von TL1 verantwortlich ist. Ferner, wenn TL2, ein sonst inaktives Molekül, durch Austauschen der F-Domäne davon durch die F-Domäne von TL1 verändert wurde, war der veränderte TL2 als ein Agonist wirksam.
  • Das 2N1C1F-Konstrukt war jedoch etwas wirksamer. Das durch die Chimäre 2N1C1F hervorgerufene Signal schien etwas stärker als das Signal der Chimäre 2N2C1F zu sein, was zu der Vermutung führte, daß die C-Domäne von TL1, obwohl sie für die Phosphorylierung nicht entscheidend ist, die Wirksamkeit von TL1 erhöhen könnte. Jedoch, da die Proben, die für den Phosphorylierungstest verwendet wurden, im Hinblick auf die Konzentration des Liganden nicht normalisiert wurden, was es möglich, daß ein stärkeres Phosphorylierungssignal nur das Vorhandensein einer größeren Menge des Liganden anzeigte. Der Phosphorylierungstest wurde daher mit verschiedenen Mengen des Liganden wiederholt, um zu bestimmen, ob die aktiven Chimären unterschiedliche Wirksamkeiten zeigten. Die Konzentration des Liganden in den COS-7-Überständen von Liganden-Transfektionen wurde durch die BIAcore Biosensor-Technologie gemäß den bereits beschriebenen Verfahren bestimmt (Stitt T. N. et al., Cell 80 (1995), 661–670). BIAcore mißt die Bindungsaktivität eines Überstands an den TIE-2-Rezeptor in willkürlichen Einheiten, welche als Resonanzeinheiten (RU) bezeichnet werden. Im allgemeinen ist eine ziemlich gute Korrelation zwischen RUs und der Liganden-Konzentration beobachtet worden, wobei eine Aktivität von 400 RU etwa 1 μg Protein pro ml Überstand entspricht. Proben wurden auf Konzentrationen von jeweils 100 RU, 20 RU und 5 RU verdünnt, und der Phosphorylierungstest wurde wiederholt. Die Ergebnisse zeigten, daß die Chimäre 2N2C1F bei den gleichen Konzentrationen deutlich wirksamer als entweder der native TL1 oder die Chimäre 1N1C2F war.
  • Ein anderer interessanter Aspekt dieser Austauschkonstrukte ist ihre Expressionsrate. Jede der vier Chimären wurde auf ihre Produktionsrate in COS-Zellen, ihre Fähigkeit zur Bindung an TIE-2 und ihre Fähigkeit zur Phosphorylierung von TIE-2 untersucht. Die Ergebnisse dieser Experimente zeigten, daß die Chimären 1 und 3 in Mengen herstellt wurden, die mit TL1 vergleichbar waren, während die Chimären 2 und 4 in Mengen herstellt wurden, die mit TL2 vergleichbar waren. Folglich korrelierte eine hohe Proteinproduktion mit der N-terminalen Domäne von TL2. Außerdem, wenn mit EA. hy926-Endothelzellen getestet, waren die Chimären 2 und 4 aktiv, während die Chimären 1 und 3 nicht aktiv waren. Folglich korreliert die Aktivität (Phosphorylierung des Rezeptors) mit der Fibrinogen-ähnlichen Domäne von TL1. Die Chimären 2 und 4 besaßen daher jeweils die gewünschten Eigenschaften einer hohen Produktionsrate sowie einer agonistischen Aktivität.
  • 23.4. Gegen eine Proteolyse beständige Konstrukte
  • Basierend auf der Beobachtung, daß eine große Fraktion von TL1-Präparationen oft nahe dem N-Terminus proteolytisch gespalten wurde, wurde vorgeschlagen, daß ein Argininrest an Position 49 des reifen Proteins (vgl. 17) eine in Frage kommende Spaltstelle war, welche an der Regulierung der Aktivität des Proteins in vivo beteiligt sein könnte, und daß der Austausch des Argininrestes durch einen Serinrest (R49 > S) die Stabilität des Proteins erhöhen könnte, ohne notwendigerweise seine Aktivität zu beeinflussen. Eine solche Mutante von TL1 wurde hergestellt, und es wurde festgestellt, daß sie etwa so aktiv wie der native TL1, aber keine Resistenz gegen eine proteolytische Spaltung zeigte.
  • 23.5. Kombinationsmutanten
  • Das wirksamste Konstrukt der chimären Konstrukte, 2N1C1F, wurde zusätzlich derart verändert, daß der Cysteinrest, der durch die Nucleotide 784–787 codiert wird, wie in 27 gezeigt, in einen Serinrest umgewandelt wurde. Dieses Molekül (bezeichnet als 2N1C1F (C246S) wurde hinreichend exprimiert, konnte den Rezeptor wirksam aktivieren, war gegen eine proteolytische Spaltung beständig und lag vorwiegend als ein Dimer anstatt als ein Multimer höherer Ordnung vor. Folglich scheint die 2N-Domäne dem Molekül eine Proteaseresistenz zu verleihen. Schließlich wurde dieses Molekül weiter verändert, um die möglicherweise Protease-empfindliche Stelle zu entfernen, welche durch die Nucleotide 199–201 codiert wird, wie in 27 gezeigt, um ein Molekül zu erhalten (bezeichnet als 2N1C1F (R51 > S, C246 > S)), von welchem erwartet wurde, daß es aktivierend ist, hinreichend exprimiert wird, dimer ist und Protease-resistent ist.
  • Tabelle 1 faßt die hergestellten Konstrukte der modifizierten TIE-2-Liganden zusammen und charakterisiert jedes davon im Hinblick auf die Fähigkeit zur Bindung an den TIE-2-Rezeptor, die Fähigkeit zur Aktivierung des TIE-2-Rezeptors, der Art der gebildeten Struktur (Monomer, Dimer, etc.) und der relativen Produktionsraten davon. Der unmodifizierte TL1 (ungemustert) und TL2 (gestreift) sind mit den drei Domänen als Kästchen dargestellt. Folglich zeigen gestreifte Kästchen Domänen aus TL2 an. Der Cysteinrest an Position 245 des reifen TL1-Proteins ist durch ein "C" angegeben. Ein "X" durch das "C" gibt an, daß der Cysteinrest durch eine andere Aminosäure ersetzt ist, wie zum Beispiel in der TL1/CYS–-Mutante. In ähnlicher Weise gibt ein "X" durch das "R" in dem letzten Konstrukt die Substitution eines Arg-Restes an Position 49 des reifen TL1-Proteins an. Das "C" gibt ein modifiziertes TL2-Konstrukt wieder, das die TL2/CYS+-Mutante zeigt. Konstrukte mit Fc-Schwänzen oder einer flag-Markierung sind auch angegeben.
  • Unter Zugrundelegung der Lehren hierin, ist für den Fachmann ohne weiteres ersichtlich, daß weitere Konstrukte hergestellt werden können, um zusätzliche modifizierte und chimäre TIE-2-Liganden zu erzeugen, die andere Eigenschaften besitzen. Zum Beispiel kann man ein Konstrukt erzeugen, welches aus der N-terminalen Domäne von TL2 und der F-Domäne von TL1, fusioniert mit dem Fc-Teil des menschlichen Antikörpers IgG1, besteht. Es wäre zu erwarten, daß dieses Konstrukt an den TIE-2-Rezeptor bindet und ihn aktiviert. In ähnlicher Weise können andere Konstrukte unter Verwendung der Lehren hierin erzeugt werden und sind daher im Schutzumfang dieser Erfindung eingeschlossen.
  • 23.6. Material und Methoden
  • Konstruktion von Chimären
  • Austauschkonstrukte wurden in einen pJFE14-Vektor inseriert, worin die XbaI-Stelle gegen eine AscI-Stelle ausgetauscht wurde. Dieser Vektor wurde dann mit AscI und NotI gespalten, wobei ein AscI-NotI-Gerüst erhalten wurde. DNA-Fragmente für die Chimären wurden mittels PCR unter Verwendung von geeigneten Oligonucleotiden erzeugt.
  • Die FLAG-1C1F- und FLAG-2C2F-Insertionen wurden in ein pMT21-Vektorgerüst subcloniert, das mit EcoRI und NotI gespalten worden war. Die "CF"-Verkürzungen wurden durch eine PCR erhalten, und der FLAG-Marker und eine vorausgehende, ein Signal übertragende Trypsin-Sequenz wurden durch die Anelierung von synthetischen Oligonucleotiden konstruiert.
  • Transfektionen
  • Sämtliche Konstrukte wurden in COS-7-Zellen unter Verwendung von entweder DEAE-Dextran oder LipofectAMIN gemäß Standardprotokollen vorübergehend transfiziert. Die Zellkulturen wurden drei Tage nach der Transfektion geerntet und bei 1000 UpM für 1 Minute abzentrifugiert, und die Überstände wurden in frische Röhrchen überführt und bei –20°C gelagert.
  • Färbung von FLAG-1C1F transfizierten und FLAG-2C2F transfizierten Zellen
  • Schalen mit 6 Vertiefungen von COS-7-Zellen wurden vorübergehend mit dem TIE-2-Rezeptor transfiziert. Der COS-7-Überstand verschiedener Liganden-Transfektionen wurde für 30 Minuten mit den Zellen inkubiert, gefolgt von zwei Waschungen mit Phosphat gepufferter Salzlösung (PBS) ohne Magnesium oder Calcium. Die Zellen wurden in –20°C kaltem Methanol für 3 Minuten fixiert, einmal mit PBS gewaschen und mit dem anti-FLAG-M2-Antikörper (IBI; Verdünnung 1 : 3000) in PBS/10% Kälberserum (BCS) für 30 Minuten inkubiert. Die Zellen wurden einmal mit PBS gewaschen und mit einem an Alkalische Phosphatase (AP) konjugierten Ziege-anti-Maus-IgG-Antikörer (Promega; 1 : 1000) in PBS/10% BCS inkubiert. Die Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen und mit dem Phosphatsubstrat BCIP/NBT mit 1 mM Levamisol inkubiert.
  • Phosphorylierungstests
  • Die Verdünnung der COS-7-Überstände für die Dosis-Antwort-Studie erfolgte in den Überständen von COS-7-Zellen, die mit dem leeren Vektor pJFE14 transfiziert wurden. EA-Zellen, die natürlicherweise den TIE-2-Rezeptor exprimieren, wurden für > 2 Stunden einem Serummangel in serumfreien Medium ausgesetzt, gefolgt durch die Exposition gegen den geeigneten COS-7-Überstand für 10 Minuten bei 37°C in einer Atmosphäre von 5% CO2. Die Zellen wurden dann in eiskaltem PBS gespült und mit 1% NP40-Lysepuffer, enthaltend Proteaseinhibitoren (10 μg/ml Leupeptin, 10 μg/ml Aprotinin, 1 mM PMSF), lysiert, gefolgt durch eine Immunpräzipitation mit einem Antikörper, der für den TIE-2-Rezeptor spezifisch ist. Proben wurden dann einer Immunblot-Analyse unter Verwendung von anti-pTyr-Antikörpern unterzogen.
  • Dot-Blots
  • Die Proben wurden auf eine Nitrocellulosemembran aufgetragen, welche blockiert und mit den geeigneten Antikörpern als Sonde untersucht wurde.
  • 23.7. Herstellung eines chimären TIE-2-Liganden aus CHO-Zellen und Baculovirus infizierten Insektenzellen
  • Virusherstellung
  • Das Gen für den chimären Liganden (bezeichnet als 2N1C1F (C246S) wurde unter Anwendung von bereits beschriebenen Verfahren in ein Baculovirus-Expressionsplasmid eingebaut und mit viraler DNA rekombiniert, um ein rekombinantes Baculovirus zu erzeugen, vermehrt und gewonnen (O'Reilly D. R., Miller L. K. und Luckow V. A., Baculovirus Expression Vectors – A Laboratory Manual, 1992, New York, W. H. Freeman). SF21-Insektenzellen (Spodoptera frugiperda), erhalten von Invitrogen, wurden adaptiert und bei 27°C in serumfreiem SF900 II-Medium von Gibco vermehrt. Nicht-infizierte Zellen wurden bis zu einer Dichte von 1 × 106 Zellen/ml gezüchtet. Die Zelldichte wurde durch Zählen der lebensfähigen Zellen unter Verwendung eines Hämacytometers bestimmt. Die Virusstammlösung für den Liganden wurde zu dem Bioreaktor in einer geringen Multiplizität von 0,01–0,1 PBE/Zelle zugegeben, um die Infektion einzuleiten. Den Infektionsprozeß ließ man für 3–4 Tage voranschreiten, wodurch eine maximale Virusreplikation ohne das Auftreten einer wesentlichen Zelllyse ermöglicht wurde. Die Zellsuspension wurde aseptisch in sterile Zentrifugenröhrchen aliquotiert, und die Zellen wurden durch Zentrifugation (1600 UpM, 30 min) entfernt. Der zellfreie Überstand wurde in sterilen Fläschchen gesammelt und bei 4°C im Dunkeln bis zur weiteren Verwendung gelagert.
  • Der Virustiter wurde durch einen Plaquetest, wie durch O'Reilly, Miller und Luckow beschrieben, bestimmt. Das Verfahren wird in 60 mm-Gewebekulturschalen ausgeführt, die mit 1,5 × 106 Zellen beimpft werden. Verdünnungsreihen der Virusstammlösung werden zu den anhaftenden Zellen zugegeben, und das Gemisch wird unter Schütteln inkubiert, um die Adsorption des Virus an einzelne Zellen zu ermöglichen. Ein Agarüberzug wird zugegeben, und die Platten werden für 5 Tage bei 27°C inkubiert. Lebensfähige Zellen werden mit Neutralrot gefärbt, wobei kreisförmige Plaques sichtbar gemacht wurden, die gezählt wurden, um den Virustiter, ausgedrückt in Plaque-bildenden Einheiten pro Milliliter (PBE/ml), zu erhalten.
  • Infektion von Zellen zur Proteinherstellung
  • Nicht-infizierte SF21-Zellen wurden in Gewebekulturplatten gezüchtet, und das Virus, enthaltend das Gen des chimären Liganden, wurde in einer Multiplizität von 1–10 PBE/Zelle zugegeben. Das Virus ließ man für 90 Minuten bei 27°C unter vorsichtigem Schütteln adsorbieren, danach wurden die Zellen wieder mit frischen Mengen des serumfreien SF900 II-Mediums versorgt. Nach dreitägiger Züchtung bei 27°C wurden die Gewebekulturflüssigkeiten gewonnen, und der Ligand wurde durch ein Immunblot-Verfahren nachgewiesen.
  • CHO-Expression von Chimären des TIE-2-Liganden
  • Chimären des TIE-2-Liganden wurden in irgendeinen von mehreren Expressionsvektoren für Säugerzellen cloniert, einschließlich (aber nicht begrenzt auf) pJFE, pcDNA3, pMT21, pED oder andere. Plasmide wurden in CHO-DG44-Zellen (Urlaub G. und Chasin L. A., Isolation of Chinese Hamster Cell Mutants Deficient in Dihydrofolate Reductase Activity, Proc. Natl: Acad. Sci. USA 77 (1980), 4216–4220; Urlaub G., Kas E., Carothers A. M. und Chasin L. A., Deletion of the Diploid Dihydrofolate Locus From Cultured Mammalian Cells, Cell 33 (1983), 405–412) durch Calciumphosphatpräzipitation oder kationische Liposomen transfiziert. Im Falle von Vektoren, denen ein dhfr-selektierbarer Marker fehlt, wurde das Plasmid pSV2.dhfr in einem Molverhältnis von 20% zu dem Plasmid, das die Chimäre des TIE-Liganden enthält, cotransfiziert. DHFR+-Zellen wurden durch Züchtung in Selektionsmedium (ein Medium ohne Nucleoside und Nucleotide, enthaltend 10% dialysiertes fötales Kälberserum) selektiert, und Clone wurden auf die Herstellung von chimären TIE-Liganden durch ein Immunblot-Verfahren mit einem TIE-2-Rezeptorkörper durchmustert. Clone, die das gewünschte Protein exprimieren, wurden mehreren Genamplifikationsrunden unter Verwendung von abgestuften Konzentrationen von Methotrexat in Selektionsmedium unterworfen. Clone mit einer hohen Expression wurden nach der Genamplifikation durch ähnliche Immunblot-Techniken identifiziert.
  • Zelllinien, die chimäre TIE-Liganden exprimieren, wurden in einzelligen Schichten, Suspensionsflaschen, Rollerflaschen und Bioreaktoren in Selektionsmedium oder in Medium ohne eine Selektion gezüchtet, und können in serumfreien Mediumformulierungen gezüchtet werden. Tabelle 1: Mutationsanalyse von TIE-Liganden
    Figure 00730001
    • N. D.
    Nicht bestimmt.
  • Hinterlegungen
  • Die folgenden Hinterlegungen sind bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, gemäß dem Budapester Vertrag gemacht worden. Ein Plasmid-Clon, codierend einen TIE-2-Liganden, wurde bei der ATCC am 7. Oktober 1994 unter der Bezeichnung "pJFE14, codierend einen TIE-2-Liganden" unter der ATCC-Eingangsnummer 75910 hinterlegt. Ein rekombinantes Baculovirus aus Autographa californica, codierend einen TIE-2-Rezeptorkörper, wurde bei der ATCC am 7. Oktober 1994 unter der Bezeichnung "vTIE-2-Rezeptorkörper" unter der ATCC-Eingangsnummer VR2484 hinterlegt. Ein Lambda-Phagenvektor, enthaltend eine DNA für den menschlichen tie-2-Liganden, wurde bei der ATCC am 26. Oktober 1994 unter der Bezeichnung "lgt10, codierend den htie-2-Liganden 1" unter der ATCC-Eingangsnummer 75928 hinterlegt. Ein Plasmid-Clon, codierend einen zweiten TIE-2-Liganden, wurde bei der ATCC am 9. Dezember 1994 unter der Bezeichnung "pBluescript KS, codierend den menschlichen TIE-2-Liganden 2" unter der ATCC-Eingangsnummer 75963 hinterlegt. Der E. coli-Stamm DH10B, enthaltend das Plasmid pBeLoBac11 mit einer Geninsertion des menschlichen TL4, codierend den menschlichen TIE-Liganden 4, wurde bei der ATCC am 2. Juli 1996 unter der Bezeichnung "hTL-4" unter der ATCC-Eingangsnummer 98095 hinterlegt.
  • Die vorliegende Erfindung ist hinsichtlich des Schutzumfangs nicht auf die hierin beschriebenen spezifischen Ausführungsformen begrenzt. In der Tat werden Modifikationen der Erfindung, zusätzlich zu den hierin beschriebenen, für die Fachleute aus der obigen Beschreibung und den beigefügten Figuren ersichtlich. Solche Modifikationen sollen im Schutzumfang der beigefügten Patentansprüche eingeschlossen sein.
  • SEQUENZPROTOKOLL
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    • Aktenzeichen: REG 333-PCT
    • Internationale Anmeldungsnummer: Noch unbekannt
    • Internationales Einreichungsdatum: Hiermit eingereicht
    • Titel: Neue modifizierte Liganden
  • Ergänzungsblatt zu Rubrik B von Formblatt PCT/RO/134
  • Identifizierung weiterer Hinterlegungen
  • Zusätzlich zu der auf dem Formblatt PCT/RO/134 angegebenen Hinterlegung kennzeichnet der Anmelder die folgenden Hinterlegungen, die bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, USA, gemacht wurden, und beantragt, daß sie nur durch die Herausgabe einer Probe an einen Fachmann, der durch den Antragsteller benannt wird, zugänglich gemacht werden, wie auf dem beigefügten Formblatt angegeben ist.
    Datum der Hinterlegung Hinterlegungsnummer
    7. Oktober 1994 VR2484
    26. Oktober 1994 75928
    9. Dezember 1994 75963
    2. Juli 1996 90895

Claims (33)

  1. Isoliertes Nucleinsäuremolekül, welches einen chimären TIE-2-Liganden codiert, umfassend eine N-terminale Domäne, eine Coiled-coil-Domäne und eine Fibrinogen-ähnliche Domäne, wobei mindestens zwei Domänen von unterschiedlichen TIE-2-Liganden abgeleitet sind, die ausgewählt sind aus dem TIE-2-Liganden 1, dem TIE-2-Liganden 2, dem TIE-Liganden 3 und dem TIE-Liganden 4.
  2. Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1, welches einen chimären TIE-2-Liganden codiert, wobei die N-terminale Domäne, die Coiled-coil-Domäne und die Fibrinogen-ähnliche Domäne von dem TIE-2-Liganden 1 oder dem TIE-2-Liganden 2 abgeleitet sind.
  3. Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 2, welches einen chimären TIE-2-Liganden codiert, der an den TIE-2-Rezeptor bindet und ihn aktiviert, umfassend eine Nucleotidsequenz, welche den TIE-2-Liganden 1 codiert, wobei der Bereich der Nucleotidsequenz, welcher die N-terminale Domäne des TIE-2-Liganden 1 codiert, ersetzt ist durch eine Nucleotidsequenz, welche die N-terminale Domäne des TIE-2-Liganden 2 codiert.
  4. Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 3, wobei der Bereich der Nucleotidsequenz, welcher die Coiled-coil-Domäne des TIE-2-Liganden 1 codiert, ersetzt ist durch eine Nucleotidsequenz, welche die Coiled-coil-Domäne des TIE-2-Liganden 2 codiert.
  5. Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 3 oder 4, welches modifiziert ist, so dass es eine andere Aminosäure anstelle des Cysteinrestes codiert, welcher durch die in 27 dargestellten Nucleotide 784 bis 786 codiert wird.
  6. Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 5, welches so modifiziert ist, dass statt des Cysteinrestes ein Serinrest codiert wird.
  7. Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 5 oder 6, welches weiter modifiziert ist, so dass es eine andere Aminosäure anstelle des Argininrestes codiert, welcher durch die in 27 dargestellten Nucleotide 199 bis 201 codiert wird.
  8. Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 7, welches so modifiziert ist, dass statt des Argininrestes ein Serinrest codiert wird.
  9. Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 3, welches einen chimären TIE-2-Liganden codiert, der die in 27 dargestellte Aminosäuresequenz besitzt.
  10. Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 4, welches einen chimären TIE-2-Liganden codiert, der die in 25 dargestellte Aminosäuresequenz besitzt.
  11. Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 2, welches einen modifizierten TIE-2-Liganden codiert, der einen TIE-2 Rezeptor bindet aber nicht aktiviert, umfassend eine Nucleotidsequenz, welche den TIE-2-Liganden 1 codiert, wobei der Bereich der Nucleotidsequenz, welcher die Fibrinogen-ähnliche Domäne des TIE-2-Liganden codiert, ersetzt ist durch eine Nucleotidsequenz, die die Fibrinogen-ähnliche Domäne des TIE-2-Liganden 2 codiert.
  12. Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 11, wobei der Bereich der Nucleotidsequenz, welcher die Coiled-coil-Domäne des TIE-2-Liganden 1 codiert, ersetzt ist durch eine Nucleotidsequenz, die die Coiled-coil-Domäne des TIE-2-Liganden 2 codiert.
  13. Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 11, welches einen chimären TIE-2-Liganden codiert, der die in 24 dargestellte Aminosäuresequenz besitzt.
  14. Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 12, welches einen chimären TIE-2-Liganden codiert, der die in 26 dargestellte Aminosäuresequenz besitzt.
  15. Chimärer TIE-2-Ligand, codiert von einem Nucleinsäuremolekül eines der vorangehenden Ansprüche.
  16. Chimärer TIE-Ligand nach Anspruch 15, welcher die in 24, 25, 26 oder 27 dargestellte Aminosäuresequenz besitzt.
  17. Chimärer TIE-Ligand nach Anspruch 15, der die in 27 dargestellte Sequenz besitzt, aber modifiziert ist, so dass er eine andere Aminosäure anstelle des Cysteinrestes besitzt, welcher durch die Nucleotide 784 bis 786 codiert wird.
  18. Vektor, welcher ein Nucleinsäuremolekül nach einem der vorangehenden Ansprüche 1 bis 14 umfasst.
  19. Vektor nach Anspruch 18, wobei das Nucleinsäuremolekül funktionell verknüpft ist mit einer Expressionskontrollsequenz, die die Expressionssteuerung in einer Wirtszelle ermöglicht.
  20. Vektor nach Anspruch 18 oder 19, welcher ein Plasmid ist.
  21. Wirtsvektorsystem zur Herstellung eines chimären Liganden nach Anspruch 15, 16 oder 17, umfassend eine Wirtszelle und einen Vektor nach Anspruch 18, 19 oder 20.
  22. Wirtsvektorsystem nach Anspruch 21, wobei die Wirtszelle eine Bakterien-, Hefe-, Insekten- oder Säugerzelle ist.
  23. Verfahren zur Herstellung eines Liganden nach Anspruch 15, 16 oder 17, umfassend die Züchtung von Zellen eines Wirtsvektorsystems nach Anspruch 21 oder 22 unter Bedingungen, die die Herstellung des Liganden erlauben, sowie die Gewinnung des so hergestellten Liganden.
  24. Antikörper, welcher spezifisch den Liganden nach Anspruch 15, 16 oder 17 bindet und welcher nicht einen nativen TIE-2-Liganden bindet.
  25. Antikörper nach Anspruch 24, welcher ein monoclonaler Antikörper ist.
  26. Konjugat, umfassend einen Liganden nach einem der Ansprüche 15, 16 oder 17 und, daran konjugiert, einen cytotoxischen Wirkstoff.
  27. Konjugat nach Anspruch 26, wobei der cytotoxische Wirkstoff ein Radioisotop oder ein Toxin ist.
  28. Arzneimittel, umfassend einen chimären Liganden nach Anspruch 15, 16 oder 17 sowie einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
  29. Arzneimittel, umfassend einen Antikörper nach Anspruch 24 oder 25 sowie einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
  30. Arzneimittel, umfassend ein Konjugat nach Anspruch 26 oder 27 sowie einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
  31. Ligand nach Anspruch 15, 16 oder 17 zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers oder in einem Diagnoseverfahren.
  32. Antikörper nach Anspruch 24 zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers oder in einem Diagnoseverfahren.
  33. Konjugat nach Anspruch 26 zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers oder in einem Diagnoseverfahren.
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