KR100481560B1 - 변형된 ｔｉｅ-2-수용체 리간드 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 하나이상의 아미노산 부가, 결실 또는 치환 또는 예로, 인간 IgG-1 의 Fc 부분과 함께 표지에 의해 변형되었으나, TIE-2 수용체에 결합하는 능력을 간직하는 변형된 TIE-2 리간드를 제공한다. 본 발명은 적어도 첫번째 TIE-2 리간드의 일부 그리고 첫번째와 다른 두번째 리간드의 일부로 구성되는 키메라 TIE-2 리간드인 변형된 TIE-2 리간드를 더 제공한다. 특수 구체예에서, 본 발명은 적어도 TIE-2 리간드-1 의 일부 그리고 TIE-2 리간드-2 의 일부로 구성되는 키메라 TIE 리간드를 더 제공한다. 이외에도, 본 발명은 기술된 변형된 TIE-2 리간드를 암호화하는 분리된 핵산분자를 제공한다. 본 발명은 혈관성장을 차단하는 방법은 물론 치료조성물, 신혈관신생을 촉진하는 방법, TIE 수용체를 발현하는 세포의 증식 또는 분화를 촉진하는 방법 그리고 인간에서 종양증식을 약화 또는 예방하는 방법을 또한 제공한다.

Description

변형된 ＴＩＥ-2-수용체 리간드{MODIFIED TIE-2-RECEPTOR LIGANDS}
본 발명은 일반적으로 유전공학 분야 그리고 더 상세하게는 수용체 티로신 키나제 및 그들의 동종 리간드, 재조합형 DNA 벡터안으로 그들의 삽입, 그리고 미생물의 수용균주 및 수용체 진핵생물 세포에서의 암호화된 단백질의 제조에 관한 것이다. 더 구체적으로 본 발명은, 변형된 리간드를 제조 및 사용하는 방법은 물론, TIE-2 수용체에 결합하는 신규한 변형된 TIE-2 리간드에 촛점이 맞추어져 있다. 본 발명은 변형된 리간드를 암호화하는 핵산서열, 그리고 변형된 리간드 및 유전자 산물을 암호화하는 핵산을 생성하는 방법을 더 제공한다. 그것을 암호화하는 핵산은 물론 변형된 TIE-2 리간드는 종양혈관형성, 창상치유, 혈전색전성 질환, 죽상경화증 및 염증성 질환을 포함하는 종양성 질환같은 내피세포 및 TIE 수용체와 관련된 어느 질환의 치료 및 진단에 유용하다. 이 외에도, 변형된 리간드는 조혈간세포의 증식 및/또는 분화를 촉진하는데 사용된다.
더 일반적으로, 여기에 기재된 수용체를 활성화하는 변형된 TIE-2 리간드는 TIE 수용체를 발현하는 세포의 성장, 생존, 이동, 및/또는 분화 그리고/또는 안정 또는 불안정을 촉진하는데 사용된다. 생물학적으로 활성인 변형된 TIE-2 리간드는 배양액에서 TIE 수용체를 발현하는 세포를 시험관내 유지하는데 사용된다. TIE 수용체를 발현하는 세포 및 조직은, 예를들면, 심장 및 혈관내피 세포, 수정체 상피 및 심장외막 그리고 조혈간세포를 포함한다.
대안으로, 그와 같은 인간 리간드는 TIE 수용체를 발현하기 위해 조작되는 세포를 지원하는데 사용된다. 더우기, 변형된 TIE-2 리간드 및 그것의 동종 수용체는 수용체의 아고니스트 또는 길항제를 동정하기 위한 분석시스템에 사용된다.
분화된 세포 및 조직의 발달, 유지, 및 수복에 책임이 있는 세포행동은 거의 대부분이 성장인자 및 유사한 리간드 그리고 그들의 수용체를 통해 전달되는 세포사이의 신호에 의해 조절된다. 수용체는 반응세포의 세포표면상에 위치해 있고 그리고 그들은 다른 호르몬-유사 리간드는 물론 성장인자로 알려진 펩티드 및 폴리펩티드를 결합한다. 이런 상호작용의 결과는 신속하고 장기적인 세포내 유전자 발현의 재조정은 물론 반응세포에 신속한 생화학적 변화를 일으킨다. 다양한 세포표면에 결합된 여러개의 수용체가 특이적인 성장인자에 결합한다.
티로신 키나제에 의한 단백질에서의 티로신 잔기의 인산화는 신호가 원형질막을 통해 형질도입 되는 주요 방식중의 하나이다. 현재알려진 여러개의 단백질 티로신 키나제 유전자는 상피성 성장인자 (EGF), 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자-1 (IGF-1), 혈소판 유도 성장인자 (PDGF-A 및 -B), 그리고 결합조직 형성세포 (FGFs) 같은 폴리펩티드 성장인자 및 호르몬에 대한 막횡단 수용체를 암호화한다 (Heldin et al., Cell Regulation, 1:555-566 (1990); Ullrich, et al., Cell, 61:243-54 (1990). 각 경우에, 이들 성장인자는 수용체의 세포질 일부상에 존재하는 내재성 티로신 키나제의 활성을 유도하는 그들의 동종수용체 세포바깥 일부에 결합해서 그들의 작용을 발휘한다. 내피세포의 성장인자 수용체는 맥관형성, 혈관형성, 죽상경화증 및 염증성 질환같은 중요한 여러 생리적 및 병리적 과정에 성장인자의 관련 가능성 때문에 특히 관심을 끈다 (Folkman, et al. Science, 235: 442-447 (1987)). 또한 여러개의 조혈 성장인자의 수용체는 티로신 키나제다; 이들은 콜로니 촉진인자 1 수용체인 c-frms, Sherr, et al., Cell, 41: 665-676 (1985), 그리고 Huang, et al., Cell, 63: 225-33 (1990)에 보고된 초기 조혈 성장인자 수용체인 c-kit를 포함한다.
수용체 티로신 키나제는 그들의 외부영역의 구조특징에 기초한 진화적 서브패밀리로 분류되어왔다. (Ullrich, et al. Cell, 61: 243-54 (1990)). 그와같은 서브패밀리는 EGF 수용체 유사체 키나제 (서브클래스 I) 및 인슐린 수용체 키나제 (서브클래스 II)를 포함하는데, 그것의 각각은 그들의 세포외 영역에서 반복되는 시스테인-풍부 상동서열을 포함한다. 하나의 시스테인-풍부 영역은 eph-유사 키나제의 세포외 도메인에서 또한 발견된다. Hirai, et al., Science, 238: 1717-1720 (1987); Lindberg, et al. Mol. Cell. Biol., 10:6316-24 (1990); Lhotak, et al., Mol. Cell. Biol. 11: 2496-2502 (1991). c-fms 및 c-kit 수용체 티로신 키나제는 물론 PDGF 수용체는 서브클래스 III으로 그룹지워지는 반면에; FGF 수용체는 서브클래스 IV를 구성한다. 이들 서브클래스 구성원 둘다에서 전형적인 것은 내부사슬 이황화 결합에 의해 안정되는 세포외 접힘(folding) 유니트이다. 소위 면역글로블린 (Ig)-유사 접힘체는 세포결합 또는 수용성 리간드를 갖는 광범위하고 다양한 다른 세포표면 수용체를 포함하는 면역글로블린 수퍼패밀리의 단백질에서 발견된다. Williams, et al., Ann, Rev. Immunol., 6: 381-405 (1988).
수용체 티로신 키나제는 그들의 특이성 및 친화성에서 상이하다. 일반적으로, 수용체 티로신 키나제는 (1) 특이적 성장인자를 결합시킬수 있는 세포외 도메인; (2) 보통 단백질의 α-나선 부분인 막횡단 도메인; (3) 수용체가, 예를들어, 단백질 인산화에 의해 조절되는 근접막 도메인; (4) 수용체의 효소성분인 티로신 키나제 도메인; 그리고 (5) 많은 수용체에 티로신 키나제에 대한 기질의 인식 및 결합에 관련되는 카르복시 말단 꼬리부로 구성되는 당단백질이다.
대안의 엑손(exon) 스플라이싱(splicing) 및 대안의 유전자 프로모터(promoter) 또는 폴리아데닐화(polyadenylation) 부위의 선택 같은 과정이 동일 유전자로부터 여러개의 구별되는 폴리펩티드를 제조할 수 있다고 보고되어 왔다. 이들 폴리펩티드는 상기 기술된 다양한 도메인을 포함하거나 또는 포함하지 않는다. 그 결과로, 몇개의 세포외 도메인은 분리된, 분비 단백질로서 발현되고, 수용체의 몇가지 형태는 티로신 키나제 도메인이 결여되고, 막횡단 도메인 플러스 짧은 카르복실 말단꼬리부를 통해 원형질막에 삽입된 세포외 영역만을 함유한다. 본래 인간백혈병 세포로부터 알려지지 않은 티로신 키나제-상동 cDNA 단편으로서 RT-PCR에 의해 동정된 내피세포 막횡단 티로신 키나제를 암호화하는 유전자는 Partanen, et al., Proc, Natl. Acad. Sci. USA, 87: 8913-8917 (1990) 에 의해 기술되었다. 이 유전자 및 그것의 암호화된 단백질은 "Ig 및 EGF 상동도메인을 가지는 티로신 키나제"의 약자인 "TIE"로 불리운다. Partanen, et al. Mol. Cell. Biol. 12: 1698-1707 (1992).
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tie mRNA는 인간 태아 및 마우스 배 조직에 존재하는 것으로 보고되어 왔다. tie 메시지는 조사했을때 심장 및 혈관 내피세포에 집중되어 있었다. 구체적으로, tie mRNA는 9.5 내지 18.5일령의 마우스 배의 혈관내피 및 심내막에 집중되어 있다. 증강된 tie 발현은 피부창상에 발생하는 난포 및 입상조직과 관련된 신혈관신생 동안에 보여졌다. Korhonen, et al. Blood 80: 2548-2555 (1992). 따라서, TIEs는 당뇨병 망막변증, 건선, 죽상경화증 및 관절염 같은 다른 여러개의 맥관형성-의존질환 및 고형종양에 대한 치료제를 개발하는데 중요한 맥관을 형성하는 역할을 하는 것으로 시사되어왔다.
두개의 구조적으로 관련이있는 래트 TIE 수용체 단백질은 관련된 발현형태를 가지는 구별되는 유전자에 의해 암호화 되는 것으로 보고 되었다. tie-1으로 명칭된 하나의 유전자는 인간 tie의 래트 동종체다. Maisonpierre, et al., Oncogene 8: 1631-1637 (1993). 다른 나머지 유전자인 tie-2는 유사체 tie와 마찬가지로 마우스에서 내피세포 및 그들의 추정되는 선대에서 배타적으로 발현되는 것으로 보고된 마우스 tek 유전자의 래트 동종체이다. Dumont, et al. Oncogene 8: 1293-1301 (1993). tie-2의 인간 동종체는 그것의 전체가 여기에 수록된 1995년, 9월 5일에 발행된 Ziegler, 미국특허 5,447,860호 (그것은 "ork"로 언급됨)에 기재된다.
삭제
두 유전자 모두가 배(胚) 및 생후조직의 내피세포에서 광범위하게 발현되는 것으로 알려졌다. 수정체 상피, 심장외막 및 간엽을 포함해 다른 태아 세포군에 유의 수준의 tie-2 전사체가 또한 존재하였다. Maisonpierre, et al., Oncogene 8: 1631-1637 (1993).
혈관내피에 TIE 수용체의 우세한 발현은 TIE가 혈관계의 발달 및 유지하는데 역할을 하는 것을 시사한다. 이것은 내피세포 결정, 성장, 분화 및 세포이동 그리고 혈관성분 안으로 패턴화(patterning) 되게하는 역활을 포함할 수 있다. TIE-2가 결핍된 마우스 배 분석은 혈관형성에 있어서 특히, 내피세포에 혈관망 형성에 TIE-2의 중요성을 예시한다. Sato, T.N., et al., Nature 376:70-74 (1995). 성숙된 혈관계에서, TIEs는 내피세포 생존, 유지 및 병원균 영향에 대한 반응에서 작용할 수 있다.
TIE 수용체는 초기 조혈간세포, B 세포 그리고 거핵세포의 서브세트에서 또한 발현되서, 또한 초기 조혈, B세포의 분화 및/또는 증식, 그리고 거핵세포 분화경로에서 이들 수용체에 결합하는 리간드의 역할을 또한 시사한다. Iwama, et al. Biochem. Biophys. Research Communications 195:301-309 (1993); Hashiyama, et al. Blood 87:93-101 (1996), Batard, et al. Blood 87:2212-2220 (1996).
도 1A 및 도 1B-TIE-2 수용체본체(TIE-2 RB)는 닭의 배 융모막요막(CAM) 에서 혈관발달을 억제한다. 6μg의 RB로 함침된 재흡수 가능한 겔라틴 포말 (Gelfoam)의 단일단편을 1일된 닭의 배 융모막요막 밑으로 즉시 삽입시켰다. 3일 더 배양한 후에, 4일된 배 및 에워싸는 CAM이 제거되었고 검사되었다. 도 1A: EHK-1 RB (rEHK-1 ecto/hIgG1 Fc)로 처리된 배는 생존하였고 그들의 주변 CAM에서 정상적으로 발생된 혈관을 가졌다. 도 1B : TIE-2 RB (r TIE-2 ecto/h IgG1 Fc)로 처리된 모든 배는 죽었고, 크기가 감소되었고 거의 완전히 주변 혈관이 없었다.
도 2는 벡터 pJFE14.
도 3은 λgt10 의 제한 유전자 지도.
도 4는 htie-2 리간드 1을 암호화하는 클론 λgt10 으로부터 유추된 인간 TIE-2 리간드 1의 아미노산 서열(단문자코드) 및 핵산서열.
도 5는 T98G 클론으로부터 유추된, 인간 TIE-2 리간드의 아미노산 서열(단문자 코드) 및 핵산서열.
도 6은 인간 TIE 2 리간드 2를 암호화하는 클론 pBluescript KS로부터 유추된, 인간 TIE-2 리간드 2의 아미노산 서열(단문자 코드) 및 핵산서열.
도 7은 TIE-2 리간드 1 (레인 L1)에 의하여는 TIE-2 수용체의 활성화를 나타내지만 TIE-2 리간드 2 (레인 L2) 또는 대조군 (Mock)에 의해서는 나타내지 않는 웨스턴 블랏(western blot).
도 8은 과량의 TIE-2 리간드 2 (레인 2)로의 HAEC 세포의 전처리는, MOCK 배지(레인 1)로의 HAEC 세포의 전처리와 비교했을 때 TIE-2 수용체 (TIE2-R)을 활성화 하기위해 TIE-2 리간드를 희석시키는 후속되는 능력에 대하여 길항작용 하는 것을 나타내는 웨스턴 블랏.
도 9는 인간 잡종세포주인 EA.hy926을 이용해 TIE-2 수용체의 TL1 활성화를 경쟁적으로 억제하는 TL2의 능력을 보여주는 웨스턴 블랏.
도 10은 C2C12 ras, Rat2 ras, SHEP, 그리고 T98G 농축(10X)된 조건배지에 있는 TIE-2 리간드에 의한, 래트 TIE-2 IgG 고정화 표면에의 결합의 도수분포표 표시. 래트 TIE-2 (rTIE2) 특이적 결합은 가용성 trkB RB의 존재하에서 사소한 감소와 비교했을때 25 μg/ml 가용성 래트의 TIE-2 RB의 존재하에서 결합활성의 유의한 감소에 의해 나타내어진다.
도 11은 COS 세포상청액에서 인간 TIE-2 수용체본체 (RB) 고정화된 표면에의 재조합 인간 TIE-2 리간드 1 (hTL1) 및 인간 TIE-2 리간드 2 (hTL2)의 결합. 인간 TIE-2 특이적 결합은 가용성 인간 TIE-2 RB 또는 trkB RB 중의 25 μg/ml의 시료를 배양함에 의하여 결정되었다; 결합활성에서 유의한 감소는 인간 TIE-2 RB와 함께 배양된 시료에 대하여만 관측된다.
도 12는 TIE-2 수용체본체 (TIE-2 RB를 의미 또는 여기서는 TIE2-Fc)가 HUVEC 세포에서 TIE-2 리간드 1 (TL1)에 의한 TIE-2 수용체의 활성을 차단하는 반면에 비관련 수용체본체 (TRKB-Fc)는 이 활성을 차단하지 않는 것을 보여주는 웨스턴 블랏.
도 13은 E14.5 마우스 태아 간 (레인 1 - 전체, 레인 3- 수질 집적됨, 그리고 레인 4- c-kit+ TER119 조혈전구세포) 그리고 E14.5 마우스 태아 흉선 (레인 2- 전체)으로 부터 얻어진 TL1과 TL2 RT-PCR 산물의 일련의 [비희석부터 10-4까지의]희석물을 보여주는 한천겔.
도 14는 E17.5 마우스 태아 흉선 피질 수질 세포 (레인 1-CDR1+/A2B5-) 및 수질 피질세포 (레인 CDR1-/A2B5+)로 부터 얻어진 TL1과 TL2 RT-PCR 산물의 일련의 [비희석부터 10-3까지의]희석물을 보여주는 한천겔.
도 15는 맥관형성에서 TIE-2/TIE 리간드의 가정된 역할의 도식. TL1은 (.)에 의해 나타내어지고, TL2는 (*)에 의해 나타내어지고, TIE-2는 (T)에의해 나타내어지며, VEGF는 ([])에 의해 나타내어지며, 그리고 flk-1 (VEGF 수용체)는 (Y)에의해 나타내어진다.
도 16은 임신한 암말혈청으로 처리한 래트의 난자에서 황체형성 및 소포발달과 관련된 맥관형성 동안에 TIE-2, TL1, TL2, 그리고 VEGF의 일시적 발현패턴을 보여주는 제자리 혼성화 슬라이드. 컬럼 1: 초기 예비 난포; 컬럼 2: 예비난포; 컬럼 3: 초기 황체; 그리고 컬럼 4: 폐쇄난포; A열: 밝은지역; B열: VEGF; C열: TL2; D열: TL1 및 E열: TIE-2 수용체.
도 17은 성숙 TL1 단백질 및 성숙 TL2 단백질의 아미노산 서열비교. TL1 서열은 추정 리더서열이 제거된 것을 제외하고는 도 4 에서 시행된 것과 동일하다. 유사하게, TL2 서열은 추정 리더서열이 제거된 것을 제외하고는 도 6 에서 시행된 것과 동일하다. 화살표는 도 4 에 보여진 대로 TL1의 각각, 아미노산 위치 69, 265 및 284의 잔기에 상응하는 TL1의 잔기 Arg49, Cys245 및 Arg264를 나타낸다.
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도 18은 TL1 및 TL2 (패널 A)의 공유 다량체 구조 및 시스테인 (패널 B) 하나의 돌연변이에 의한 TL1 및 TL2의 상호전환의 웨스턴 블랏.
도 19는 정량적인 무세포 결합분석에서 고정화된 TL1에 대한 TIE-2-IgG 결합의 전형적 곡선.
도 20은 정량적인 무세포 결합분석에서 고정된 TIE-2 외도메인에 IgG (TL1-fFc)의 Fc 도메인에 결합된 리간드의 피브리노겐-유사 도메인을 포함하는 TIE-2 리간드 1 리간드본체를 보여주는 전형적 곡선.
도 21은 TIE 리간드-3의 뉴클레오티드 및 추정된 아미노산 (단문자 코드) 서열. 암호화 서열은 위치 47에서 개시된다. 피브리노겐-유사 도메인은 위치 929에서 개시된다.
도 22는 TIE 리간드 패밀리 구성원의 아미노산 서열비교. mTL3 = 마우스 TIE 리간드-3; hTL1 = 인간 TIE-2 리간드 1; chTL1 = 닭 TIE-2 리간드1; mTL1 = 마우스 TIE-2 리간드 1; mTL2 = 마우스 TIE-2 리간드 2; hTL2 = 인간 TIE-2 리간드2. 네모상자로된 지역은 패밀리 구성원 사이에 상동불변 지역을 보여준다.
도 23은 TIE 리간드-4의 뉴클레오티드 및 유추된 아미노산 (단문자 코드) 서열. 화살표는 뉴클레오티드 위치 569를 나타낸다.
도 24는 1N1C2F (키메라 1)로 지칭된 키메라 TIE 리간드의 뉴클레오티드 및 유추 아미노산 (단문자 코드) 서열. 추정 리더서열은 뉴클레오티드 1-60에 의해 암호화된다.
도 25는 2N2C1F (키메라 2)로 지칭된 키메라 TIE 리간드의 뉴클레오티드 및 유추 아미노산 (단문자 코드) 서열. 추정 리더서열은 뉴클레오티드 1-48에 의해 암호화된다.
도 26는 1N2C2F (키메라 3)로 지칭된 키메라 TIE 리간드의 뉴클레오티드 및 유추 아미노산 (단문자 코드) 서열. 추정 리더서열은 뉴클레오티드 1-60에 의해 암호화된다.
도 27는 2N1C1F (키메라 4)로 지칭된 키메라 TIE 리간드의 뉴클레오티드 및 유추 아미노산 (단문자 코드) 서열. 추정 리더서열은 뉴클레오티드 1-48에 의해 암호화된다.
발명의 개요
본 발명은 실질적으로 다른 단백질이 없는 변형된 TIE-2 리간드를 구성하는 조성물을 제공한다. 여기서 사용될때, 변형된 TIE-2 리간드는 TIE 리간드 패밀리의 리간드에 관련이 있고, 그것의 대표적인 것은 여기서 기술된 대로 리간드 TL1, TL2, TL3 및 TL4를 포함하는데, TIE-2 리간드는, 예를들어, 인간 IgG-1의 Fc 부분과 함께 표지(tagging)에 의해 또는 하나 이상의 아미노산의 부가, 결실 또는 치환에 의해 변경되었으나 TIE-2 리간드에 결합하는 능력은 간직한다. 변형된 TIE-2 리간드는 적어도 제 1의 TIE-2 리간드의 일부 그리고 제 1의 것과는 상이한 제 2의 TIE-2 리간드의 일부를 포함하는 키메라 TIE-2 리간드를 또한 함유한다. 비한정적인 예로서 제 1의 TIE-2 리간드는 TL1이고 제 2의 TIE-2 리간드는 TL2이다. 본 발명은 부수적으로 TIE-2 리간드 패밀리의 구성원을 사용하는 다른 조합을 생각할 수도 있다. 예를 들면, 제 1의 리간드는 TL1,TL2,TL3 그리고 TL4로 구성되는 군으로부터 선택되고 그리고 제 1의 리간드와 상이한 제 2의 리간드는 TL1, TL2, TL3 및 TL4로 구성되는 군으로부터 선택되는 이들 조합을 포함하지만 이에 한정되지는 않는, 키메라 TIE-2 리간드를 생성하는 다른 조합이 가능하다.
본 발명은 변형된 TIE-2 리간드를 암호화하는 분리된 핵산분자를 또한 제공한다. 하나의 구체예에서, 분리된 핵산분자는 TIE 리간드 패밀리의 TIE-2 리간드를 암호화하는데, 그것의 대표적인 것은 여기서 기술한대로 리간드 TL1, TL2, TL3 및 TL4를 포함하며, TIE-2 리간드는 예를 들어, 인간 IgG-1의 Fc 부분과 함께 표지에 의해 또는 하나 이상의 아미노산을 부가, 결실 또는 치환에 의해 변경되었으나 그것은 TIE-2 수용체에 결합하는 능력을 간직한다. 다른 구체예에서, 분리된 핵산분자는 적어도 제 1의 TIE-2 리간드의 부분 그리고 제 1의 것과 상이한 제 2의 TIE-2 리간드의 부분을 포함하는 키메라 TIE-2 리간드인 변형된 TIE-2 리간드를 암호화한다. 비한정적인 예로서 제 1의 TIE-2 리간드는 TL1이고 제 2의 TIE-2 리간드는 TL2이다. 본 발명은 부수적인 TIE-2 리간드 패밀리의 구성원을 사용한 다른 조합을 생각할 수도 있다. 예를들면, 분리된 핵산분자는 TL1, TL2, TL3 및 TL4로 구성되는 군으로부터 선택된 제 1의 리간드의 부분 그리고 제 1의 리간드와는 다른 TL1, TL2, TL3 및 TL4로 구성되는 군으로부터 선택된 제 2의 리간드의 부분으로 구성되는 키메라 TIE-2 리간드인 변형된 TIE-2 리간드를 암호화하는 이들 조합을 포함하나 이에 한정되지는 않는 다른조합이 가능하다.
분리된 핵산은 DNA, cDNA 또는 RNA이다. 본 발명은 변형된 TIE-2 리간드를 암호화하는 분리된 핵산분자로 구성되는 벡터를 또한 제공한다. 본 발명은 변형된 TIE-2 리간드의 생물활성을 갖는 폴리펩티드를 적당한 숙주세포에서 제조하는 숙주-벡터 시스템을 더 제공한다. 적당한 숙주세포는 세균, 효모, 곤충 또는 포유류이다. 본 발명은 폴리펩티드를 제조하고 그렇게 제조된 폴리펩티드를 회수하게 하는 조건하에서 숙주-벡터 시스템의 세포를 성장시키는 것을 포함하는, 변형된 TIE-2 리간드의 생물활성을 갖는 폴리펩티드를 제조하는 방법을 또한 제공한다.
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여기서 기술된 변형된 TIE-2 리간드를 암호화하는 분리된 핵산분자에 관한 본 발명은 TIE-2 수용체를 발현하는 기관, 조직 또는 세포와 관련된 질환을 앓는 환자를 치료하는 치료제로서 리간드의 개발을 더 제공한다. 본 발명은 그와 같은 치료학적 분자에 특이하게 결합하는 항체를 또한 제공한다. 항체는 단일클론 또는 다중클론이다. 본 발명은 치료경과를 모니터링할 목적으로 환자로부터 채취한 시료에 있는 치료분자의 양을 측정하기 위해 그와 같은 단일클론 또는 다중클론 항체를 사용하는 방법을 또한 제공한다.
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본 발명은 여기 기술한 바와같이, 변형된 TIE-2 리간드에 특이적으로 결합하는 항체를 또한 제공한다. 항체는 단일클론 또는 다중클론이다. 또한 본 발명은 약제학적으로 허용가능한 부형제에서, 변형된 TIE-2 리간드에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 치료조성물을 더 제공한다. 본 발명은 약제학적으로 허용가능한 부형제에서, 여기서 기술한 바와같이, 변형된 TIE-2 리간드를 활성화시키는 수용체를 특이적으로 결합시키는 항체를 포함하는 치료조성물의 유효량을 투여함으로써 포유류에서 혈관성장을 차단하는 방법을 또한 제공한다.
본 발명은 약제학적으로 허용가능한 담체에서, 여기 기술한 바와 같이, 변형된 TIE-2 리간드를 포함하는 치료조성물을 더 제공한다. 본 발명은 약제학적으로 허용가능한 담체에서, 여기 기술한 바와 같이, 변형된 TIE-2 리간드를 활성화시키는 수용체를 포함하는 치료조성물의 유효량을 투여함으로써 환자에 맥관형성을 촉진하는 방법을 또한 제공한다. 하나의 구체예에서, 그 방법은 창상치유를 촉진하는데 사용된다. 다른 구체예에서, 그 방법은 허혈을 치료하는데 사용된다. 또 다른 구체예에서, 여기서 기술한 바와 같이, 변형된 TIE-2 리간드를 활성화시키는 수용체는 조혈간세포, B 세포 또는 거핵세포의 증식 또는 분화를 촉진하기 위해 단독으로 또는 다른 조혈인자와 조합해서 사용된다.
대안으로, 본 발명은 변형된 TIE-2 리간드는 세포독성제 및 그들로부터 제조된 치료조성물에 접합된다. 본 발명은 변형된 TIE-2 리간드에 특이적으로 결합하는 수용체본체를 더 제공한다. 본 발명은 약제학적으로 허용가능한 담체에 변형된 TIE-2 리간드를 특이적으로 결합시키는 수용체본체를 포함하는 치료조성물을 더 제공한다. 본 발명은 또한 약제학적으로 허용가능한 담체에서 변형된 TIE-2 리간드에 특이적으로 결합하는 수용체본체를 포함하는 치료조성물의 유효량을 투여함으로써 포유류에 혈관성장을 차단하는 방법을 또한 제공한다.
본 발명은 TIE-2 길항제의 유효량을 포유류에게 투여하는 단계를 포함하는 포유동물에서 TIE-2 생물활성을 억제하는 방법은 물론 TIE-2 수용체 길항제를 또한 제공한다. 본 발명에 따르면, 길항제는 여기서 기술한 바와 같이, TIE-2 수용체에 결합은 하지만 이를 활성화시키지는 못하는 변형된 TIE-2 리간드이다.
발명의 상세한 설명
하기에서 상세히 기술한대로, 출원인은 TIE-2 수용체에 결합하는 신규한 변형된 TIE-2 리간드를 만들었다. 본 발명은 실질적으로 다른 단백질이 없는, 변형된 TIE-2 리간드로 구성되는 조성물을 제공한다. 여기서 사용될 때, 변형된 TIE-2 리간드는 TIE 리간드 계통군의 리간드에 관한것인데, 그것의 대표적인 것은 여기서 기술한대로 리간드 TL1, TL2, TL3 및 TL4를 포함하며, TIE-2 리간드는, 예를 들어, 인간 IgG-1의 Fc 부분으로의 표지에 의해 또는 하나 이상의 아미노산의 부가, 결실 또는 치환에 의해 변경되었으나 TIE-2 수용체에 결합하는 능력은 간직한다. 변형된 TIE-2 리간드는 적어도 제 1의 TIE-2 리간드의 부분 그리고 제 1의 것과 상이한 제 2의 TIE-2 리간드의 일부를 포함하는 키메라 TIE-2 리간드를 함유한다. 비한정 예로서 제 1의 TIE-2 리간드는 TL1이고 제 2의 TIE-2 리간드는 TL2 이다. 본 발명은 부수적으로 TIE-2 리간드 계통군 구성원을 사용한 다른 조합을 생각할 수도 있다. 예를 들면, 제 1의 리간드가 TL1, TL2, TL3 및 TL4로 구성되는 군으로부터 선택되고 제 1의 리간드와 상이한 제 2의 리간드는 TL1, TL2, TL3 및 TL4로 구성되는 군으로부터 선택되는 이들 조합을 포함하지만 이에 한정되지는 않는, 키메라 TIE-2 리간드를 생성하는 다른 조합이 가능하다.
본 발명은 변형된 TIE-2 리간드를 암호화하는 분리된 핵산분자를 또한 제공한다. 하나의 구체예에서, 분리된 핵산분자는 TIE 리간드 패밀리의 TIE-2 리간드를 암호화하는데, 그것의 대표적인 것은 여기서 기술한대로 리간드 TL1, TL2, TL3 및 TL4를 포함하고, TIE-2 리간드는, 예를 들어, 인간 IgG-1의 Fc 부분으로 표지되고, 또는 하나 이상의 아미노산의 부가, 결실 또는 치환에 의해 변경되었으나 TIE-2 수용체에 결합하는 능력은 간직한다. 다른 구체예에서, 분리된 핵산분자는 적어도 제 1의 TIE-2 리간드 및 제 1의 것과는 상이한 제 2의 TIE-2 리간드의 부분을 포함하는 키메라 TIE-2 리간드인 변형된 TIE-2 리간드를 암호화한다. 비한정 예에 의해, 제 1의 TIE-2 리간드는 TL1 이고 제 2의 TIE-2 리간드는 TL2 이다. 본 발명은 부수적인 TIE-2 리간드 패밀리 구성원을 사용한 다른 조합을 생각할 수 있다. 예를 들면, 분리된 핵산분자는 TL1, TL2, TL3 및 TL4로 구성되는 군으로부터 선택된 제 1의 리간드의 부분, 그리고 제 1의 리간드와는 상이한 TL1, TL2, TL3 및 TL4로 구성되는 군으로부터 선택된 제 2의 리간드의 부분으로 구성되는 키메라 TIE-2 리간드인 변형된 TIE-2 리간드를 암호화하는 이들 조합을 포함하나 이에 한정되지는 않는 다른 조합이 가능하다.
본 발명은 그것의 아고니스트 또는 길항제로 작용하고 TIE-2 수용체를 결합하는, 변형된 TIE-2 리간드 및 그들의 아미노산 서열뿐아니라 기재된 서열의 치환, 결실 또는 삽입 돌연변이체를 포함하는 단백질 또는 펩티드는 물론 기능상으로 대등한 그것의 변이체를 포함한다. 그와같은 변이체는 아미노산잔기가 침묵변이를 초래하는 서열내의 잔기로 치환되는 것들을 포함한다. 예를들면, 서열내에 하나 이상의 아미노산 잔기는 침묵변이를 초래하는 기능상 대등체로서 작용하는 유사한 극성을 가진 다른 아미노산에 의해 치환될 수 있다. 서열내의 아미노산에 대한 치환은 아미노산이 속하는 부류의 다른 구성원으로부터 선택된다. 예를들면, 비극성 (소수성) 아미노산 부류는 알라닌, 루신, 이소루신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌을 포함한다. 극성 중성 아미노산은 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴, 그리고 글루타민을 포함한다. 양성하전 (염기성)의 아미노산은 알기닌, 리신 및 히스티딘을 포함한다. 음성하전 (산성)의 아미노산은 아스파라긴산 및 글루탐산을 포함한다.
또한 본 발명의 범주안에 포함되는 것은 여기서 기술된 변형된 TIE-2 리간드와 동일 또는 유사한 생물활성을 나타내는 그것의 단백질 또는 그것의 단편 또는 유도체, 및 예를들면, 당분해, 단백분해적 절단, 항체분자 또는 다른 세포 리간드 등에의 결합에 의해 번역시 또는 번역후에 다르게 변형되는 유도체이다. 기능적으로 대등한 분자는 예를들면, 어느 세균(예. E. coli) 발현시스템에서 발생하는 N-말단 메틸화같은 특정 재조합숙주에서의 발현으로부터 파생되는 N-말단 변형을 포함하는 변형을 함유하는 분자를 또한 포함한다.
본 발명은 예를들면, 적당한 발현벡터에서 여기서 기술된 변형된 TIE-2 리간드를 암호화하는 핵산의 트랜스펙션, 형질도입, 감염, 일렉트로포레이션, 또는 미세주입에 의해 단백질을 생성하도록 유전자를 조작한, 효모, 세균, 바이러스, 그리고 포유류 세포를 포함하는 숙주세포는 물론 여기서 변형된 TIE-2 리간드로 기술된 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 또한 망라한다. 본 발명은 예를들면, Finkel 및 Epstein FASEB J. 9:843-851 (1995); Guzman, et al. PNAS (USA) 91:10732-10736 (1994)에서 기술된것 처럼 유전자 요법 기술을 통한 변형된 TIE-2 리간드를 암호화하는 핵산의 도입을 또한 포괄한다. 당업자는 본 발명이 예를들면, Sambrook, et al. Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 2 ed. Vol. 1, pp. 101-104, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) 에서 정의된대로 적당한 긴축조건 하에서 뉴클레오티드 서열을 암호화하는 변형된 TIE-2 리간드에 혼성화되는 DNA 및 RNA를 포괄한다는 것을 인식할 것이다. 그러므로, 본 발명에 의해 고려된 핵산분자는 여기서 기술된대로 제조된 변형된 TIE-2 리간드의 아미노산 서열로부터 유추된 뉴클레오티드 서열을 갖는것뿐 아니라, 그와같은 뉴클레오티드 서열, 및 유전암호의 결과로 상기 서열의 축퇴이지만, 여기서 기술된 변형된 TIE-2 리간드와 동일한 생물활성을 분자상에 부여하도록 여기서 기술된 변형된 TIE-2 리간드와 충분히 유사한 아미노산 서열, 및 일차, 이차 그리고 삼차 특성물을 갖는 TIE-2 수용체를 결합하는 리간드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 혼성화하는 서열을 포함한다.
본 발명은 TIE-2 리간드 1의 N-말단 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 일부가 TIE-2 리간드 2의 N-말단 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 대체되는 TIE-2 리간드 1을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, TIE-2 수용체를 결합시키고 활성화시키는, 변형된 TIE-2 리간드를 암호화하는 분리된 핵산분자를 제공한다. 본 발명은 TIE-2 리간드 1의 감겨진 코일도메인을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 일부는 TIE-2 리간드 2의 감겨진 코일도메인을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 의해 대체되도록 더 변형된 그와같은 핵산분자를 또한 제공한다.
본 발명은 TIE-2 리간드 1의 N-말단 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 일부가 TIE-2 리간드 2의 N-말단 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 교체되고 도 27에 나타낸대로 뉴클레오티드 784-787에 의해 암호화된 시스테인 잔기 대신에 다른 아미노산을 암호화 하도록 더 변형된 TIE-2 리간드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 TIE-2 수용체를 결합시키고 활성화시키는, 변형된 TIE-2 리간드를 암호화하는 분리된 핵산분자를 또한 제공한다. 세린 잔기는 바람직하게 시스테인 잔기로 치환된다. 다른 구체예에서, 핵산분자는 도 27에 나타낸대로 뉴클레오티드 199-201에 의해 암호화된 아르기닌 잔기 대신에 다른 아미노산을 암호화하도록 더 변형된다. 세린잔기는 바람직하게 아르기닌 잔기로 치환된다.
본 발명은 아미노산 위치 245에서 시스테인 잔기 대신에 다른 아미노산을 암호화 하도록 변형된 TIE-2 리간드 1을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 TIE-2 수용체를 결합시키고 활성화시키는 변형된 TIE-2 리간드를 암호화하는 분리된 핵산분자를 또한 제공한다. 세린 잔기는 바람직하게 시스테인 잔기로 치환된다.
본 발명은 TIE-2 리간드 1 의 N-말단 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 일부가 결실된 TIE-2 리간드 1 을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 TIE-2 수용체를 결합시키지만 활성화 시키지는 못하는 변형된 TIE-2 리간드를 암호화하는 분리된 핵산분자를 더 제공한다. 본 발명은 TIE-2 리간드 1의 감겨진 코일 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 일부가 결실되고 피브리노겐 유사 도메인을 암호화하는 부분이 인간 면역글로블린 감마-1 불변영역 (IgG1-Fc)을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 프레임에 맞도록 융합되는 식으로 더 변형된 그와 같은 핵산분자를 또한 제공한다.
본 발명은 TIE-2 리간드 2의 N-말단 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 일부가 결실된 TIE-2 리간드 2를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 TIE-2 수용체를 결합시키지만 활성화 시키지는 못하는 변형된 TIE-2 리간드를 암호화하는 분리된 핵산분자를 더 제공한다. 본 발명은 TIE-2 리간드 2의 감겨진 코일도메인을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 일부가 결실되고 그리고 피브리노겐 유사 도메인을 암호화하는 일부는 인간 면역글로블린 감마-1 불변영역 (IgG1 Fc)을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 프레임에 맞도록 융합되는 식으로 더 변형된 그와 같은 핵산분자를 또한 제공한다.
본 발명은 TIE-2 리간드 1의 피브리노겐 유사 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 일부가 TIE-2 리간드 2의 피브리노겐 유사 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 의해 치환된 TIE-2 리간드 1을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 TIE-2 수용체를 결합시키지만 활성화 시키지는 못하는 변형된 TIE-2 리간드를 암호화하는 분리된 핵산분자를 더 제공한다.
본 발명은 TIE-2 리간드 1의 감겨진 코일 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 일부가 TIE-2 리간드 2의 감겨진 코일 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 의해 치환되는 식으로 더 변형된 그와 같은 핵산분자를 또한 제공한다.
본 발명은 발명의 핵산분자 중 어느것에 의해 암호화된 변형된 TIE-2 리간드를 더 제공한다.
본 발명은 적어도 제 1의 TIE-2 리간드의 일부 및 제 1의 것과는 상이한 제 2의 TIE-2 리간드의 일부를 포함하는 키메라 TIE-2 리간드를 또한 제공하는데, 그중에서 제 1의 및 제 2의 TIE-2 리간드는 TIE-2 리간드-1, TIE-2 리간드-2, TIE-2 리간드-3 그리고 TIE-2 리간드-4로 구성된 군으로부터 선택된다. 바람직하게, 키메라 TIE 리간드는 적어도 TIE-2 리간드-1의 일부 그리고 TIE-2 리간드-2의 일부를 포함한다.
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본 발명은 도 24, 25, 26, 또는 27에 보여진 대로 키메라 TIE 리간드를 암호화하는 핵산분자를 또한 제공한다. 본 발명은 도 24, 25, 26, 또는 27에 보여진 대로 키메라 TIE 리간드를 또한 제공한다. 본 발명은 뉴클레오티드 784-787에 의해 암호화된 시스테인 잔기 대신에 다른 아미노산을 갖도록 변형된 도 27에 보여진 대로의 키메라 TIE 리간드를 더 제공한다.
벡터안으로의 DNA 단편의 삽입에 대해 당업자에게 알려진 방법중의 어느것은 적당한 전사/번역 제어 시그널(signal) 및 단백질 암호화서열을 이용해 변형된 TIE-2 리간드를 암호화하는 발현벡터를 구성하는데 사용된다. 이들 방법은 시험관내 재조합 DNA 및 합성기술 그리고 생체내 재조합 (유전자 재조합)을 포함한다. 변형된 TIE-2 리간드 또는 그것의 펩티드 단편을 암호화하는 핵산서열의 발현은, 변형된 TIE-2 리간드 단백질 또는 펩티드가 재조합 DNA 분자로 형질전환된 숙주에서 발현되도록, 변형된 TIE-2 리간드를 암호화하는 서열에 작동가능하게 결합되는 제 2의 핵산서열에 의해 제어된다. 예를들면, 여기서 기술된 변형된 TIE-2 리간드의 발현은 당업자에게 알려진 어느 프로모터/인핸서(enhancer)에 의해 제어된다. 리간드의 발현을 제어하는데 사용되는 프로모터는 Squinto et al., (Cell 65:1-20 (1990))에 기술한 바와 같은 긴 말단 반복; SV40 초기 프로모터 영역 (Bernoist 및 Chambon, Nature 290:304-310), CMV 프로모터, M-MuLV 5' 말단반복, 루스 사코마 (Rous sarcoma) 바이러스의 3' 긴 말단반복에 포함된 프로모터 (Yamamoto, et al., Cell 22:787-797 (1980), 헤르피스 티미딘 키나제 프로모터 (Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:144-1445 (1981), 아데노바이러스 프로모터, 메탈로티오네인(metallothionein) 유전자 (Brinster et al., Nature 296:39-42 (1982); β-락타마제 프로모터 같은 원핵생물 발현벡터 (Villa-Kamaroff, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:21-25 (1983)을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. Scientific American, 242:74-94 (1980)에 "재조합 세균으로부터 유용한 단백질"; Gal 4 프로모터, ADH (알콜 디히드로게나제) 프로모터, PGK (포스포글리세롤 키나제) 프로모터, 알카라인 포스파타제 프로모터 같은 효모 또는 다른 곰팡이의 프로모터 요소, 그리고 조직 특이성을 나타내고 트랜스제닉(transgenic) 동물에 이용된 다음의 동물 전사제어 영역; 췌장 포상세포에서 활성인 일라스타제 I 유전자 제어영역 (Swift et al., Cell 38:639-646 (1984); Ornitz et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409 (1986); MacDonald, Hepatology 7:425-515 (1987); 췌장 베타세포 에서 활성인 인슐린 유전자 제어영역 (Hanahan, Nature 315:115-122 (1985)); 림프구 세포에서 활성인 면역글로블린 유전자 제어영역 (Grosschedl et al., 1984, Cell 38:647-658; Adames et al., 1985, Nature 318:533-538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:1436-1444), 고환, 가슴, 림프구 및 비만세포에서 활성인 마우스 유선 종양 바이러스 제어영역 (Leder et al., 1986, Cell 45:485-495), 간에서 활성인 알부민 유전자 제어영역 (Pinkert et al., 1987, Genes 및 Devel. 1:268-276), 간에서 활성인 알파-페토(feto)단백질 유전자 제어영역 (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648; Hammer et al., 1987, Science 235:53-58); 간에서 활성인 알파 1-항트립신 유전자 제어영역 (Kelsey et al, 1987, Genes 및 Devel. 1:161-171), 골수세포에서 활성인 베타-글로빈 유전자 제어영역 (Mogram et al., 1985, Nature 315:338-340; Kollias et al., 1986, Cell 46:89-94); 뇌에있는 핍지세포(oligodendrocytes)에서 활성인 수초 염기성 단백질 유전자 제어영역 (Readhead et al., 1987, Cell 48:703-712); 골격근에서 활성인 미오신(myosin) 경량 사슬-2 유전자 제어영역 (Shani, 1985, Nature 314:283-286), 그리고 시상하부에서 활성인 성선자극 배출호르몬 유전자 제어영역 (Mason et al., 1986, Science 234:1372-1378)을 또한 참조. 본 발명은 그것의 발현을 변경시키기 위해 변형된 TIE-2 리간드를 암호화하는 RNA 서열에 특이적으로 혼성화 될 수 있는 안티센스(antisense) 화합물의 제조를 더 망라한다. 1992년 11월 24일에 발행된 Ecker, U.S. 특허번호 5,166,195.
본 발명에 따르면, 또한 여기 기술된대로 변형된 TIE-2 리간드를 암호화하는 핵산으로 구성되는 세균 또는 진핵생물 숙주에서 복제될 수 있는 발현벡터는 숙주를 트렌스펙션시키는데 사용되고, 그것에 의하여 그 같은 핵산의 발현을 유도하여, 그다음 생물활성 형태로 회수되는 변형된 TIE-2 리간드를 제조한다. 여기서 사용된대로, 생물활성 형태는 TIE 수용체에 결합할수 있고, 분화된 기능 또는 수용체를 발현하는 세포의 표현형에 영향을 미치는 것과 같은 생물학적 반응을 유발할 수 있는 형태를 포함한다. 그와같은 생물활성형태는 예를 들어, TIE 수용체의 티로신 키나제 도메인의 인산화(phosphorylation)를 유도할 수 있다. 대안으로, 생물활성은 TIE 수용체에 길항제로서 영향을 미친다. 대안적 구체예에서, 변형된 TIE-2 리간드의 활성형태는 TIE 수용체를 인식할수 있고 진단 및 치료 둘다에 사용되는 수용체에 대한 표적화제로 작용하는 것이다. 그와같은 구체예에 따라, 활성형태는 어느 TIE를 발현하는 세포상에 표현형에서의 어떤 변화도 부여할 필요가 없다.
유전자 삽입체를 함유하는 발현벡터는 4가지 일반적 접근인 (a) DNA-DNA 혼성화, (b) "마커" 유전자 기능의 존재 또는 부재, (c) 삽입된 서열의 발현 그리고 (d) PCR 검출에 의해 확인될수 있다. 첫번째 접근에서, 발현벡터안에 삽입된 외래유전자의 존재는 삽입된 변형된 TIE-2 리간드를 암호화하는 유전자에 상동인 서열로 구성되는 프로브를 이용한 DNA-DNA 혼성화에 의해 검출될 수 있다. 두번째 접근에서, 재조합 벡터/숙주 시스템은 벡터에 외래유전자를 삽입함으로써 야기된 어떤 "마커" 유전자 기능 (예. 티미딘 키나제 활성, 항생물질에 내성, 형질전환 표현형, 베큘로바이러스에서 폐색체 형성, 기타등등.)의 존재 또는 부재에 기초해 확인 및 선택될수 있다. 예를들면, 만약에 변형된 TIE-2 리간드를 암호화하는 핵산이 벡터의 마커 유전자서열 안에 삽입된다면, 삽입체를 함유하는 재조합체는 마커 유전자 기능의 부재에 의해 확인될수있다. 세번째 접근에서, 재조합 발현벡터는 재조합체에 의해 발현된 외래유전자 산물을 분석해서 확인할 수 있다. 그와 같은 분석은 예를 들어, 검출가능한 항체 또는 그것의 일부로 꼬리표지화된 TIE 수용체 또는 그것의 일부에 리간드를 결합시킴으로써 또는 변형된 TIE-2 리간드 단백질 또는 그것의 일부에 대해 생성된 항체에 결합시킴으로써 변형된 TIE-2 리간드 유전자 산물의 물리적 또는 기능적 성질에 기초할 수 있다. 본 발명의 세포는 일시적으로 또는, 바람직하게, 계속해서 그리고 영구적으로, 여기서 기술된대로 변형된 TIE-2 리간드를 발현한다. 네번째 접근에서, DNA 뉴클레오티드 프라이머는 tie 특이적인 DNA 서열에 대응되게 제조될 수 있다. 이들 프라이머는 그때 tie 유전자 단편을 PCR 하는데 사용될 수 있다. (PCR 프로토콜: A Guide To Methods 및 Applications, Edited by Michael A. Innis et al., Academic Press (1990)).
재조합 리간드는 안정한, 생물학적으로 활성인 단백질의 후속적 생산을 허용하는 어느 기술에 의해 정제된다. 바람직하게, 리간드는 회수되는 배양배지 안으로 분비된다. 대안으로, 리간드는 주지의 방법에 따라 8M 염화구아니듐에 의해 정량적으로 추출되는 가용성 단백질 또는 봉입체로서 세포로부터 회수된다.
리간드를 더 정제하기 위해, 친화 크로마토그라피, 종래의 이온교환 크로마토그라피, 소수성 상호작용 크로마토그라피, 역상 크로마토그라피 또는 겔여과가 사용된다.
본 발명의 추가적 구체예에서, 실시예에서 더 상세히 기술한대로, 변형된 TIE-2 리간드를 암호화하는 유전자는 상동 재조합에 의해 내인성 유전자를 불활성화 또는 "넉아웃(knock-out)" 시키는데 사용되고, 그리고 그렇게 함으로써 TIE 리간드 결핍 세포, 조직, 또는 동물을 창조한다. 예를들면, 한정시키지 않고, 재조합 TIE 리간드-4를 암호화하는 유전자는 천연 TIE 리간드-4를 암호화하는 유전자를 불활성화 하는 삽입 돌연변이, 예로 neo 유전자를 함유하도록 유전자 조작된다. 적당한 프로모터의 제어하에서는 그와같은 구성체는 트랜스펙션, 형질도입, 또는 주입같은 기술에 의해 세포안으로 도입된다. 구성체를 함유하는 세포는 그다음 G418 내성에의해 선택된다. 손상되지 않은 TIE 리간드-4를 암호화하는 유전자가 없는 세포는 예로, 서든 블랏팅, PCR 검출, 노던 블랏팅 또는 발현분석에 의해 그다음 확인된다. 손상되지 않은 TIE 리간드-4를 암호화하는 유전자를 결핍한 세포는 그와같은 리간드가 없는 트랜스제닉(transgenic) 동물을 만들기 위해 초기 배 세포에 융합된다. 그와같은 동물은 정상적으로 리간드에 의존하는 특이적인 생체내 과정을 규명하는데 사용된다.
본 발명은 예로, 진단에 응용하는데 있어 리간드 검출에 유용한, 여기서 기술된 변형된 TIE-2 리간드에 대한 항체를 또한 제공한다. 변형된 TIE-2 리간드에 대해 유도된 단일클론 항체를 제조하는데 있어, 배양액에 있는 연속세포주에 의해 항체제조를 제공하는 어느 기술이 사용된다. 예를들면, 인간 B-세포 히브리도마 기술 (Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72) 인 트리오마(trioma) 기술은 물론 Kohler 및 Milstein (1975, Nature 256:495-497)에 의해 처음 개발된 히브리도마 기술 그리고 인간 단일클론 항체 ("단일클론 항체 및 암치료", Alan R. Liss, Inc. pp. 77-96 에 Cole et al., 1985) 그리고 유사체는 본 발명의 범주 안에 있다.
단일클론 항체는 인간 단일클론 항체 또는 키메라 인간-마우스 (또는 다른 종) 단일클론 항체이다.
인간 단일클론 항체는 당업계에 알려진 수많은 기술중의 어느것에 의해 만들어진다 (예를 들어, Teng et al., 1983, Immunology Today 4:72-79; Olsson et al., 1982, Meth. Enzymol. 92:3-16). 인간 불변부와 함께 마우스 항원-결합 도메인을 함유하는 키메라 항체분자가 제조된다 (Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:6851, Takeda et al., 1985, Nature 314:452).
당업계에 알려진 다양한 절차가 여기서 기술된 변형된 TIE-2 리간드의 에피토프에 대한 다중클론 항체를 제조하는데 사용된다. 항체 제조에 있어, 토끼, 마우스 및 래트를 포함하나 한정되지는 않는 다양한 숙주동물이 변형된 TIE-2 리간드, 또는 그것의 단편 또는 유도체와 함께 주사해 면역화될 수 있다. 다양한 증강제가 프론드(Freund's)(완전 및 불완전), 알루미늄 히드록시드 같은 미네랄 겔, 리소레시틴, 플루로닉 폴리올, 폴리안이온, 펩티드, 오일유화, 키홀 림펫 헤모시아닌, 디니트로페놀 같은 표면 활성물질, 그리고 BCG (Bacille Calmette-Guerin) 및 Corynebacterium parvum 같은 잠재적으로 유용한 인간 증강제를 포함하나 한정되지는 않고 숙주종에 따라, 면역반응을 증대시키는데 사용된다.
선택된 변형된 TIE-2 리간드 에피토프에 대한 항체의 분자클론이 알려진 기술에 의해 제조될 수 있다. 재조합 DNA 방법 (예로, Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New Tork)은 단일클론 항체분자, 또는 그것의 항원 결합영역을 암호화하는 핵산서열을 구성하는데 사용된다.
본 발명은 그와같은 항체분자의 단편은 물론 항체분자를 제공한다. 분자의 개체특이항원을 함유하는 항체단편은 알려진 기술에 의해 생성될 수 있다. 예를 들면, 그와 같은 단편은 항체분자를 펩신으로 절단해 제조될 수 있는 F(ab')2 단편; F(ab')2 단편의 이황화 결합을 환원시켜 생성될 수 있는 Fab' 단편; 그리고 파파인 및 환원제로 항체분자를 처리해 생성될 수 있는 Fab 단편을 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 항체분자는 알려진 기술, 예로, 면역흡착 또는 면역친화 크로마토그라피, HPLC (고성능 액체 크로마토그라피)같은 크로마토그라피 방법, 또는 그것의 조합에의해 정제된다.
본 발명은
a) 항체가 시료에 존재하는 어느 변형된 TIE-2 리간드와 함께 복합체를 형성하도록 변형된 TIE-2 리간드에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 항체를 생물시료와 접촉시키고; 그리고
b) 복합체의 양을 측정하고, 그렇게 함으로써 생물시료에 있는 변형된 TIE-2 리간드의 양을 측정함으로써, 생물시료에 있는 변형된 TIE-2 리간드의 양을 측정하는 면역분석을 더 망라한다.
본 발명은
a) 리간드가 TIE 수용체와 복합체를 형성하도록 본 발명의 적어도 하나의 리간드와 생물시료를 접촉시키고; 그리고
b) 복합체의 양을 측정하고 그렇게 함으로서 생물시료에 있는 TIE 수용체의 양을 측정함으로써, 생물시료에 있는 TIE 수용체의 양을 측정하는 분석을 더 망라한다.
본 발명은 TIE-2 수용체를 발현하는 세포의 분화 및/또는 이동 및/또는 성장 및/또는 생존을 지원하기 위해 여기 기술된대로 TIE-2 수용체를 활성화시키는 변형된 TIE-2 리간드의 이용을 제공한다. 그러므로, 리간드는 예로, 배양액에 있는 내피세포를 지원하는 보충체로 사용된다.
더욱이, 출원인에 의해 TIE-2 수용체에 대한 변형된 TIE-2 리간드의 창조는 TIE-2 수용체의 아고니스트 또는 길항제를 동정하는데 유용한 분석시스템을 이용가능하게 해준다.
그와같은 분석 시스템은 맥관형성을 촉진 또는 억제할 수 있는 분자를 동정하는데 유용하다. 예를 들면, 하나의 구체예에서, TIE-2 수용체의 길항제는 TIE-2 수용체에 결합하는 변형된 TIE-2 리간드와 TIE-2 수용체 사이의 상호작용을 방해할수 있는 시험분자로 동정된다. 그와같은 길항제는 1) 예를 들어, BIAcore 바이오센서 기술 (BIAcore; Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ) 을 이용해 측정한 생물활성 변형된 TIE-2 리간드와 수용체 사이의 결합을 차단하는; 또는 2) 생물활성 변형된 TIE-2 리간드가 생물반응을 일으키는 능력을 차단하는, 그들의 능력에 의해 동정된다. 그와같은 생물반응은 TIE 수용체의 인산화, 또는 TIE 신호 전달 경로의 하류성분, 또는 TIE 수용체 함유 세포의 생존, 성장 또는 분화를 포함하나 한정되지는 않는다.
하나의 구체예에서, TIE 수용체를 발현하도록 조작된 세포의 성장은 변형된 TIE-2 리간드의 부가에 의존적이다. 그와 같은 세포는 TIE-2 수용체의 추가적 아고니스트, 또는 그와 같은 세포상의 변형된 TIE-2 리간드의 활성을 방해할 수 있는 길항제를 동정하는데 유용한 분석 시스템을 제공한다. 대안으로, 변형된 TIE-2 리간드 및 수용체 둘다를 공발현할수 있도록 조작된 자가분비 세포는 잠재적 아고니스트 또는 길항제를 분석하는 유용한 시스템을 제공한다.
그러므로, 본 발명은 정상적으로 이 수용체를 발현하지 않는 세포안으로의 TIE-2 수용체의 도입을 제공하고, 따라서, 이들 세포가 이 수용체에 결합하는 리간드에 심도있고 쉽게 구별할 수 있는 반응을 나타나게 해준다. 유발된 반응의 유형은 이용된 세포에 의존하고, 세포안으로 도입된 특정 수용체에 의존하지 않는다. 적당한 세포주는, 티로신 키나제 수용체상에 작용할 수 있는 분자를 발견함은 물론 분석하는 대단히 유용한 반응을 만들도록 선택될 수 있다. 그 분자는 수용체 특이적인 방식으로 기술되는 시스템에서 작용하는 펩티드 및 비펩티드 분자를 포함하나 한정되지는 않는 어느 분자 유형이다.
이용되는 더 유용한 시스템중의 하나는 섬유아세포주 (예. NIH3T3 세포) 안으로 TIE 수용체 (또는 예로, trkC 및 TIE 수용체의 세포내도메인 같은 다른 수용체 티로신 키나제의 세포외 도메인을 구성하는 키메라 수용체)의 도입과 관련되고, 따라서 정상적으로는 증식 또는 다른 반응을 매개하지 못하는 그와같은 수용체가, 그럼에도 불구하고, 섬유아세포내로 도입후에는 섬유아세포 성장인자 (예. 티미딘 도입 또는 다른 형태의 증식분석; Progress Factor Research, Vol. 2, pp. 131-152; Zhan 및 M. Goldfarb, 1986, Mol. Cell. Biol., Vol. 6, pp. 3541-3544 에서 van Zoelen, 1990, "폴리펩티드 성장인자를 검출하는데 생물분석의 사용"을 참조)의 효과를 정량화하는 다양하게 잘 확립된 방법에 의해 분석될 수 있다. 이들 분석은 어떤 제조물도 수용체가 결여된 양친 세포주는 물론 도입된 수용체를 갖는 세포주상 둘다에서 분석할수있다는 추가적 장점을 가진다; 수용체를 가진 세포주상의 유일한 특이효과는 도입된 수용체를 통해 매개되는 것으로 판단된다. 그와 같은 세포는 변형된 TIE-2 리간드를 발현하도록 더 조작되고, 그래서 본 상호작용의 길항제/아고니스트로 작용하는 분자를 분석하는 유용한 자가분비 시스템을 창조한다. 그러므로, 본 발명은 변형된 TIE-2 리간드를 암호화하는 핵산 및 TIE 수용체를 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주세포를 제공한다.
TIE 수용체/변형된 TIE-2 리간드 상호작용은 TIE 수용체의 작은분자 아고니스트 또는 길항제를 동정하는 유용한 시스템을 또한 제공한다. 예를들면, TIE 수용체에 결합하지만 어느 다른 생물학적 활성을 유도하지 못하는 변형된 TIE-2 리간드의 단편, 돌연변이체 또는 유도체가 동정된다. 대안으로, 변형된 TIE-2 리간드의 성질결정은 분자의 활성부분의 더 나아간 성질결정을 가능하게 한다. 더욱이, 리간드의 동정은 수용체/리간드 복합체의 X-선 결정구조를 결정할 수 있게 하고, 따라서 수용체상의 결합부위를 확인하게 해준다. 결합부위에 관한 지식은 신규한 아고니스트 및 길항제의 합리적인 설계를 하기에 유용한 통찰력을 제공한다.
TIE 수용체에 대한 시험분자의 특이적인 결합은 다양한 방법으로 측정된다. 예를들면, TIE를 발현하는 세포에 대한 시험분자의 실제결합은 (i) 손상되지 않은 세포표면에 결합된 시험분자; (ii) 세포용해물에서 TIE 단백질에 가교결합된 시험분자; 또는 (iii) 시험관내 TIE에 결합된 시험분자를 검출 또는 측정함으로써 검출 또는 측정된다. 시험분자와 TIE 사이의 특이적인 상호작용은 그 상호작용의 유일한 성질을 나타내는 시약을 사용해 측정된다.
특수하고, 무제한적인 실시예로서, 본 발명의 방법은 다음과 같이 사용된다. 시료에 있는 변형된 TIE-2 리간드가 측정되는 경우를 고려해보자. 변형되지 않은 TIE-2 리간드 활성을 함유하는 음성 대조군 (NC), 그리고 변형된 TIE-2 리간드의 알려진 양을 함유하는 양성 대조군 (PC)과 평행하게 시료의 다양한 희석 (시험분자)은 검출 가능하게 표지된 변형된 TIE-2 리간드(본 실시예에서, 방사성 요드화된 리간드)의 존재하에서 TIE를 발현하는 세포에 노출된다. 시험시료에 있는 변형된 TIE-2 리간드 양은 대조군 및 각각의 희석물에 결합하는 125I-표지된 변형된 TIE-2 리간드양을 결정함으로써 측정되고, 그다음 시료값을 표준곡선에 비교한다. 시료에 변형된 TIE-2 리간드가 많으면 많을수록, TIE에 결합하는 125I-리간드는 더 적어진다.
결합된 125I-리간드 양은 세포당 방사활성량을 측정하거나, 또는 Meakin 및 Shooter, 1991, Neuron 6:153-163에 기술된대로 DSS를 이용해 세포표면 단백질에 변형된 TIE-2 리간드를 가교결합시키고 TIE 수용체/변형된 TIE-2 리간드에 상응하는 크기를 가진 표지된 단백질을 나타내는 예로, SDS 폴리아크릴 겔 전기영동을 이용해 세포추출액에 있는 표지된 단백질의 양을 검출함으로써 결정된다. 특이적인 시험분자/TIE 상호작용은 TIE 수용체에 결합하지 않는 표지되지 않은 대조군 리간드의 다양한 희석물을 분석물에 첨가해 더 시험되고, 그러므로 TIE 결합에 대해 표지된 변형된 TIE-2 리간드 및 시험분자 사이의 경쟁상에 실질적인 효과는 없다. 대안으로, 여기서 기술된 항-TIE 항체, 또는 TIE 수용체본체 같은, 여기에 한정되지는 않는, TIE 수용체/변형된 TIE-2 리간드 결합을 깨뜨릴수 있는 것으로 알려진 분자는 TIE 수용체 결합에 대해 125I-변형된 TIE-2 리간드 및 시험분자 사이의 경쟁을 방해할 것으로 예상된다.
검출가능하게 표지되고 변형된 TIE-2 리간드는 방사성 물질에 공유적 또는 비공유적으로 결합된 변형된 TIE-2 리간드, 형광물질, 효소활성을 가진 물질, 효소에 대한 기질로서 작용하는 물질 (정색검출 반응과 관련된 효소 및 기질이 바람직함), 또는 바람직하게는 검출 가능하게 표지된 항체분자인 항체분자에 의해 인식될수 있는 물질을 포함하나 이에 한정되지는 않는다.
대안으로, TIE에 대한 시험분자의 특이적인 결합은, 세포성장 및/또는 분화 또는 즉각적인 초기 유전자 발현 또는 TIE 인산화를 포함하나 한정되지는 않는, 변형된 TIE-2 리간드/TIE 수용체 결합의 이차적인 생물효과를 평가함으로써 측정된다. 예를들면, 분화를 유도하는 시험분자의 능력은 tie가 결핍된 세포 그리고 tie를 발현하는 비교가능한 세포에서 시험될수 있고; tie를 발현하는 세포에서는 분화하지만 tie가 없는 비교가능한 세포에서는 분화되지 않는 것은 특이적인 시험분자/TIE 상호작용의 표시이다. 유사한 분석이 당업계에서 알려진 표준 인산화분석을 이용한 TIE의 인산화를 검출 또는 tie-(-) 및 tie-(+) 세포에서 즉각적인 초기유전자 (예. fos 및 jun)를 검출함으로써 수행될 수 있다. 그와 같은 분석은 TIE에 경쟁적으로 결합하지 않는 아고니스트 또는 길항제를 동정하는데 유용하다.
유사하게, 본 발명은 (i) tie를 발현하는 세포를 시험분자에 노출시키는 단계, 및 (ii) TIE 수용체와 시험분자의 특이적인 결합을 검출하는 단계를 포함하는, 변형된 TIE-2 리간드의 생물활성을 갖는 분자를 동정하는 방법을 제공하는데, TIE에 대한 특이결합은 TIE-유사 활성과 양성의 관계가 있다. 특이 결합은 상기 기술한대로, 직접결합 또는 결합의 이차적인 생물효과에 의해 검출된다. 그와같은 방법은 TIE 리간드 패밀리의 새로운 구성원을 동정하는데 또는 제약산업에서, TIE 관련된 생물활성에 대한 펩티드 및 비펩티드 분자 (예. 펩티도미메틱스) 의 거대한 배열을 스크리닝 하는데 특히 유용하다. 바람직하고, 특정의, 본 발명의 무제한적인 구체예에서, 줄이 교차되어있는, tie-(-) 또는 tie-(+)로 조작된 PC12 (또는 결합조직형성세포, 하기참조) 세포를 함유하는 커다란 배양웰의 격자가 제조된다. 다양한 시험분자는 그때 격자의 각 컬럼, 또는 그것의 일부가 다양한 시험분자를 함유하는 방식으로 첨가된다. 각 웰은 그다음 성장 및/또는 분화의 존재 또는 부재가 기록될수 있다. 대단히 커다란 수의 시험분자는 이 방식으로 그와같은 활성에 대하여 스크리닝 될수있다.
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추가적인 구체예에서, 본 발명은 (i) 결합을 발생하게 하는 조건하에서 시험분자를 시험관내 TIE 수용체에 노출시키는 단계, 및 (ii) TIE 수용체 단백질에 시험분자의 결합을 검출하는 단계를 포함하는 TIE-유사 활성을 검출 또는 측정하는 방법 또는 그와 같은 활성을 갖는 분자를 동정하는 방법을 제공하는데, TIE 수용체에 대한 시험분자의 결합은 TIE 리간드-유사 활성과 관련이있다. 그와 같은 방법에 따르면, TIE 수용체는 실질적으로 정제되거나 또는 정제되지 않고, 고체 지지체 (예. 친화컬럼 또는 ELISA 분석)에 고정화되거나 또는 인공막 안으로 도입된다.
TIE 수용체에 대한 시험분자의 결합은 당업계에 알려진 어느 방법에 의해 측정된다. 바람직한 구체예에서, 시험분자의 결합은 TIE 수용체 결합에 대한 검출가능하게 표지된 알려진 TIE 리간드와 경쟁하는 능력을 측정함으로써 검출 또는 측정된다.
본 발명은 수용체를 발현하는 세포상에 TIE 수용체에 대한 TIE 리간드 결합의 효과를 억제하기 위한 분자의 능력을 검출하는 것을 포함하는, TIE 리간드-유사 활성의 길항제로서 작용하는 시험분자의 능력을 검출하는 방법을 또한 제공한다. 그와같은 길항제는 TIE 수용체/변형된 TIE-2 리간드 결합을 방해하거나 또는 방해하지 않는다. TIE 수용체에 대한 변형된 TIE-2 리간드 결합의 효과는 세포생존 또는 증식, 세포 형질변환, 즉각적인 초기 유전자 유도, 또는 TIE 인산화를 포함하나 이에 한정되지는 않는, 바람직하게 생물학적 또는 생화학적 효과이다.
본 발명은 리간드를 중화시키거나 수용체에 대한 결합을 차단시킬 수 있는 항체 또는 다른 분자를 동정하는 방법은 물론 그 방법에 의해 동정된 분자 둘다를 더 제공한다. 무제한적인 예로서, 그 방법은 ELISA 방법과 개념적으로 유사한 분석을 통해 수행된다. 예를들면, TIE 수용체본체는 플라스틱 다중웰 플레이트 같은 고체지지체에 결합된다. 대조군으로서, 기지 양의 Myc-꼬리표지된 변형된 TIE-2 리간드가 그 다음 웰에 도입되고 수용체본체를 결합시키는 어떤 표지된 변형된 TIE-2 리간드는 그다음 Myc-꼬리표지에 대해 유도된 리포터 항체에의해 동정된다. 이 분석 시스템은 그다음 i) 꼬리표지된 리간드에 결합 또는 ii) 수용체본체에 결합할 수 있고 그리고 그렇게 함으로써 꼬리표지된 리간드에 의한 수용체본체에 대한 결합을 차단할 수 있는 분자에 대한 시험 시료를 스크리닝하는데 사용된다. 예를들면, 기지의 양의 표지된 리간드와 함께 관심의 추정 분자를 함유하는 시험 시료가 웰에 도입되고 수용체본체에 결합하는 표지된 리간드의 양이 측정된다. 시험 시료에 있는 결합되고 꼬리표지된 리간드의 양과 대조군에 있는 양을 비교함으로써, 수용체에 대한 리간드의 결합을 차단할 수 있는 분자를 함유하는 시료가 동정된다. 그렇게 동정된 관심의 분자는 당업자에게 주지인 방법을 사용해 분리된다.
리간드 결합의 차단체가 발견되었을 때, 당업자는 차단체가 수용체 또는 리간드에 결합하는지를 결정하기 위한 이차분석, 및 차단체 분자가 리간드의 생물활성을 중화할수 있는지를 결정하기 위한 분석을 수행할 것이다. 예를들면, TIE 수용체본체 또는 변형된 TIE-2 리간드 또는 리간드본체가 고체 지지체 (예. 골드(Gold) 표면상에 카르보시메틸 덱스트란)에 공유적으로 부착되는 BIAcore 바이오센서 기술(또는 대등체)을 이용하는 결합분석을 이용해, 당업자는 차단체 분자가 리간드, 리간드본체 또는 수용체본체에 특이적으로 결합하는지 여부를 결정할 수 있을 것이다. 차단체 분자가 리간드의 생물활성을 중화할 수 있는지를 결정하기 위해, 당업자는 인산화분석 (실시예 5 참조), 또는 대안으로, 예로, 내피세포의 일차배양액을 이용한 생존분석 같은 기능분석을 수행할 수 있다. 대안으로, 수용체본체에 결합하는 차단체 분자는 아고니스트 일 수 있고 당업자는 TIE 수용체의 추가적 아고니스트를 동정하는 적당한 분석을 수행함으로써 이것을 결정하는 방법을 알 것이다.
이외에도, 본 발명은 TIE 리간드가 여기서 기술된 TIE-2 리간드의 수용체 결합 도메인인 조성물을 더 고려한다. 예를들면, TIE-2 리간드 1은(5' 끝에서 개시되고 도 4의 약 위치 1160 그리고 도 5의 약 위치 1157에 있는 뉴클레오티드 까지 신장되는) "감겨진 코일" 도메인 및 (약 위치 1161 에서 개시되는 도 4의 뉴클레오티드 서열 그리고 약 위치 1158 에서 개시되는 도 5의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는)피브리노겐-유사도메인을 암호화한다. TIE-2 리간드 2의 피브리노겐-유사 도메인은 도 6의 1197 주위에서 개시되는 뉴클레오티드에 의해 암호화되는 리간드 1 (FRDCA) 과 동일한 아미노산 서열 주위 또는 상에서 개시되는 것으로 믿어진다. TIE 리간드-3 의 피브리노겐-유사 도메인은 도 21에 나타난대로 위치 929 주위에서 개시되는 뉴클레오티드에 의해 암호화되는 아미노산 상에서 또는 주위에서 개시되는 것으로 믿어진다. 리간드를 제조하는 동안에 감겨진 코일도메인의 다량체화는 정제를 방해한다. 그러나, 실시예 19에서 기술한대로, 출원인은 피브리노겐-유사도메인은 TIE-2 수용체 결합 도메인을 포함한다는 사실을 발견하였다. 그러나, 피브리노겐 유사도메인의 단량체 형태는 수용체에 결합하는 것으로 보이지는 않는다. 항-myc 항체를 이용해 "집락화" 된 myc-꼬리표지된 피브리노겐 -유사 도메인을 이용하는 연구는, TIE-2 수용체를 결합시킨다. (집락된 리간드 및 리간드본체의 제조방법은 Davis, et al. Science 266:816-819 (1994)에 기술된다. 이러한 발견에 기초해, 출원인은 IgG ("fFc's")의 Fc 도메인에 커플링된 TIE-2 리간드의 피브리노겐-유사 도메인을 포함하는 "리간드본체"를 제조했다. 이량체를 형성하는 이들 리간드본체는 효과적으로 TIE-2 수용체에 결합한다. 따라서, 본 발명은 TIE 길항제를 필요로 하는 종양 및/또는 관련된 맥관계에 대한 표적화제 같은 진단 또는 치료 응용에 표적화제로 사용되는, 변형된 TIE 리간드본체의 제조를 고려한다. 여기서 본 발명은 TIE 수용체를 발현하는 기관 또는 조직, 세포가 관련된 질환을 앓는 환자를 치료하는 치료제로서 수용체 아고니스트 또는 길항제인 리간드, 단편 또는 그것의 유도체 또는 다른 분자의 개발을 더 제공한다. 그와 같은 분자는 인간 또는 동물신체를 치료하는 방법, 또는 진단하는 방법에 사용된다.
TIE 수용체는 여기 기술한대로, 내피세포와 관련해 동정되었고, TIE-2 리간드 1은 맥관화를 방지하는 것으로 보이기 때문에, 출원인은 여기서 기술된 변형된 TIE-2 리간드는 그와같은 맥관화를 필요로 하는 질병 또는 질환에서 맥관화의 유도에 유용하다고 예상한다. 그와 같은 질병 및 질환은 창상치유, 허혈 및 당뇨병을 포함할 것이다. 리간드는 모델 동물에서 시험되고 맥관을 형성하는 다른 내피세포-특이적인 인자, 혈관 내피 성장인자 (VEGF) 같은 다른 약제에 대해 기술한대로 치료제로 사용된다. 1994년 7월 26일에 발행된 Ferrara, et al. 미국특허 번호 5,332,671. 다른연구 및 Ferrara 참고문헌은 국소빈혈 심근층에 혈류를 증대시키고, 창상치유를 증대시키고, 그리고 신혈관신생이 바람직한 다른 치료 환경에서 맥관형성 인자효과를 기술하는데 사용되는 시험관내 및 생체내 연구를 기술한다 (1993년 7월 7일에 공개된 Sudo, et al. 유럽특허 출원 0 550 296 A2 참조; Babai, et al. Circulation 89:2183-2189 (1994); Unger, et al. Am. J. Physiol. 266:H1588-H1595 (1994); Lazarous, et al. Circulation 91:145-153 (1995). 본 발명에 따르면, 변형된 TIE-2 리간드는 단독으로 또는 예로, 시토킨, 신경영향제, 등은 물론 VEGF 또는 염기성 섬유아세포 성장인자 (bFGF) 같은 하나이상의 추가적인 약제학적으로 활성인 화합물과 조합해서 사용된다.
바꾸어 말하면, 실시예 2 및 3에서 기술한 수용체본체, 여기서 기술한 수용체, 그리고 실시예 9 에서 기술한 TIE-2 리간드 2를 결합하시키지만 활성화시키지는 못하는 변형된 TIE-2 리간드같은 TIE 수용체의 길항제는 맥관형성을 방지 또는 약화시키는데 사용되며, 따라서 예로, 종양증식을 방지 또는 약화시키는데 사용된다. 이러한 약제들은 단독으로, 또는 치료목적이 맥관형성을 차단하도록 의도되는 치료상태에 유용한 것으로 보여지는 항-VEGF 항체같은 다른 조성물과 조합해서 사용된다. 출원인은 여기서 기술된 변형된 TIE 리간드는 염증을 차단하는 것으로 알려진 IL-6 길항제 같은 시토킨 길항제와 조합해서 사용된다.
예를들면, 출원인은 TIE 리간드가 종양내에 또는 종양과 밀접하게 관련된 세포에서 발현된다. 예를들면, TIE-2 리간드 2는 종양내피 세포와 밀접하게 관련되어 있는 것으로 나타난다. 따라서, 그것 및 다른 TIE 길항제는 예로, 종양증식을 방지 또는 약화시키는데 또한 유용하다. 이외에도, TIE 리간드 또는 리간드본체는 수용체를 만드는 세포에 독소를 송달하는데 유용하다. 대안으로, 성장인자, 사이토카인 또는 영양소같은 다른 분자는 TIE 리간드 또는 리간드본체를 통해 TIE 수용체 함유 세포에 전달된다. 여기서 기술된 변형된 TIE-2 리간드 같은 TIE 리간드 또는 리간드본체는 시험관내 또는 생체내 수용체를 검출하기 위해 TIE 수용체에 대한 진단시약으로 또한 사용된다. TIE 수용체가 질환상태와 관련될 경우, 변형된 TIE-2 리간드 같은 TIE 리간드 또는 리간드본체는 예로, 조직염색 또는 전신영상에 의해 질병을 탐지하는 진단시약으로 유용하다. 그와 같은 시약은 방사능 동위원소, 형광색소, 염료, 효소 및 비오틴(biotin)을 포함한다. 그와 같은 진단 또는 표적화제는 전부가 여기에 포함된 1995년 10월 5일에 공개된 Alitalo, et al. WO 95/26364 그리고 Burrows, F. 및 P. Thorpe, PNAS (USA) 90:8996-9000 (1993)에 기술된 대로 제조된다.
다른 구체예에서, TIE 리간드, 여기서 기술된 수용체를 활성화시키는 변형된 TIE-2 리간드는 조혈인자로 사용된다. 다양한 조혈인자 및 그들의 수용체는 혈액내에 함유된 다양한 세포형태의 증식 및/또는 분화 및/또는 이동에 관련된다. TIE 수용체는 초기 조혈세포에서 발현되기 때문에, TIE 리간드는 이들 세포의 증식 또는 분화 또는 이동에 비교될만한 역할을 할 것으로 예상된다. 또한, 예를 들면, 조성물을 함유하는 TIE는 시험관내 및 생체내 생물시스템에서 검사, 분석, 제조되고 그리고 다음: Sousa, 미국 특허번호 4,810,643, Lee, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:4360-4364 (1985) Wong, et al. Science, 228:810-814 (1985); Yokota, et al. Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 81:1070 (1984); "간세포 인자"로 제목이 붙여진 1991년 5월 2일에 공개된 Bosselman, et al. WO 9105795 그리고 "조혈 성숙인자"로 제목이 붙여진 1995년 7월 27일에 공개된 Kirkness, et al. WO 95/19985중의 어느것에서 기술된대로 치료에 사용된다.
따라서, 수용체를 활성화시키는 변형된 TIE-2 리간드는 빈혈, 혈소판 감소증, 백혈구 감소증 및 과립백혈구 감소증에 한정되지는 않고 포함해서, 정상적인 조혈화가 억제된 상태를 치료 또는 진단하는데 사용된다. 바람직한 구체예에서, 수용체를 활성화시키는 변형된 TIE-2 리간드는, 정상적인 혈액세포 수치(level)의 감소를 야기하는 후천성 면역결핍증 (AIDS) 같은 질환을 갖는 환자에서, 또는 골수이식과 연관된것 또는 방사능조사, 화학치료, 화학요법에 의해 야기된 발육부전증 또는 골수억제의 치료에서와 같은 조혈군의 증대가 바람직한 임상환경에서, 혈액세포 전구체의 분화를 촉진하는데 사용된다.
본 발명의 수용체를 활성화 시키는 변형된 TIE-2 리간드는 예로, 사이토카인, 신경영향제, 인터루킨, 기타등등 같은 다른 약제학적으로 활성인 약제와 조합해서 또는 단독으로 사용된다. 바람직한 구체예에서, 리간드는 간세포 또는 다른 조혈 전구체 증식을 유도하는 것으로 알려진 수많은 상기 참고인자 중 어느것 또는 조혈성숙인자, 혈소판 조혈인자, 간세포인자, 적혈구 조혈인자, G-CSF, GM-CSF, 등에 한정되지는 않고 포함하는, 조혈경로에 있는 후기 세포상에 작용하는 인자과 결합하여 사용된다. 다른 구체예에서, TIE 수용체 길항제는 혈소판혈병, 적혈구 증가증 및 백혈병 같은 혈액 형성기관의 다른 증식장애 또는 골수증식을 치료하는 것 같은 조혈경로를 억제해서 환자를 진단 또는 치료하는데 바람직하게 사용된다. 그와같은 구체예에서, 치료는 변형된 TIE-2 리간드, TIE 항체, TIE 수용체본체, 변형된 TIE-2 리간드의 접합체, 또는 여기서 기술된 fFC의 리간드본체의 치료 유효량의 사용을 포함한다.
본 발명은 변형된 TIE-2 리간드 또는 여기서 기술된 리간드본체, 그것의 펩티드 단편, 또는 약제학적으로 허용가능한 부형제에 있는 유도체를 포함하는 약제학적 조성물을 또한 제공한다. 변형된 TIE-2 리간드 단백질, 펩티드 단편, 또는 유도체가 전신적 또는 국소적으로 투여된다. 당업계에 알려진 적당한 투여방식은 정맥내, 동맥내, 비강내, 경구, 피하, 복강내, 또는 국소주사 또는 외과이식에 한정되지 않고, 포함해 사용된다. 지속적인 배출제제가 또한 제공된다.
본 발명은 그와같은 치료 분자에 특이적으로 결합하는 항체를 또한 제공한다. 항체는 단일클론 또는 다중클론이다. 본 발명은 치료경로를 모니터링할 목적으로 환자로부터 채취한 시료에 있는 치료 분자의 양을 측정하기 위해 그와 같은 단일클론 또는 다중클론 항체를 이용하는 방법을 또한 제공한다.
본 발명은 변형된 TIE-2 리간드 또는 리간드본체 및 거기에 접합된 세포독성제로 구성되는 치료 조성물을 더 제공한다. 하나의 구체예에서, 세포독성제는 방사성 동위원소 또는 독소이다.
본 발명은 변형된 TIE-2 리간드에 특이적으로 결합하는 항체를 또한 제공한다. 항체는 단일클론 또는 다중클론이다.
본 발명은
a) 고체 매트릭스(matrix)에 적어도 하나의 TIE 결합기질을 결합시키는 단계;
b) 기질이 세포용해물에서 어느 변형된 TIE-2 리간드와 함께 복합체를 형성하도록 세포용해물과 함께 a)의 기질을 배양하는 단계;
c) 고체 매트릭스를 세척하는 단계; 및
d) 결합기질로부터 변형된 TIE-2 리간드를 용출하는 단계를 포함하는, 변형된 TIE-2 리간드를 정제하는 방법을 더 제공한다.
기질은 변형된 TIE-2 리간드에 특이적으로 결합하는 어느 물질이다. 하나의 구체예에서, 기질은 항-변형된 TIE-2 리간드 항체, TIE 수용체 및 TIE 수용체본체로 구성되는 군으로부터 선택된다. 본 발명은 약제학적으로 허용가능한 담체에 수용체본체를 구성하는 치료 조성물, 그리고 치료 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 인간에 있어 혈관성장을 차단하는 방법은 물론 변형된 TIE-2 리간드에 특이적으로 결합하는 수용체본체를 더 제공한다.
본 발명은 치료조성물의 유효량을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 환자에 신혈관신생을 촉진하는 방법은 물론 약제학적으로 허용가능한 담체에 리간드본체 또는 수용체를 활성화시키는 변형된 TIE-2 리간드를 포함하는 치료 조성물을 또한 제공한다.
이외에도, 본 발명은 탐지 가능하게 표지된 리간드의 TIE 수용체에 대한 결합을 허용하는 조건하에서 세포를 탐지 가능하게 표지되고 변형된 TIE-2 리간드 또는 리간드본체와 접촉시키는 단계, 및 TIE 수용체에 탐지 가능하게 표지된 리간드가 결합하는지 측정하는 단계 및 그것에 의하여 TIE 수용체를 발현하는 세포로서 세포를 동정하는 단계를 포함하는, TIE 수용체를 발현하는 세포를 동정하는 방법을 제공한다. 본 발명은 변형된 TIE-2 리간드 또는 리간드본체 및 그것에 접합된 세포독성제를 포함하는 치료조성물을 또한 제공한다. 세포독성제는 방사능 동위원소 또는 독소일 수 있다.
본 발명은 세포로부터 mRNA를 얻는 단계, 혼성화 조건하에서, 그렇게 얻어진 mRNA를 변형된 TIE-2 리간드를 암호화하는 표지된 핵산분자와 함께 접촉시키는 단계, 표지된 분자에 혼성화된 mRNA의 존재를 결정하는 단계, 및 그렇게 함으로써 세포에서 변형된 TIE-2 리간드의 발현을 탐지하는 단계를 포함하는, 세포에 의한 변형된 TIE-2 리간드의 발현을 탐지하는 방법을 또한 제공한다.
본 발명은 혼성화 조건하에서, 조직절편을 변형된 TIE-2 리간드를 암호화하는 표지된 핵산분자와 함께 접촉시키는 단계, 표지된 분자에 혼성화된 mRNA의 존재를 결정하는 단계, 및 그렇게 함으로써 조직절편에서 변형된 TIE-2 리간드의 발현을 탐지하는 단계를 포함하는, 조직절편에 있는 변형된 TIE-2 리간드의 발현을 탐지하는 방법을 더 제공한다.
실시예 1 - TIE-2 수용체에 대한 리포터(reporter) 세포로서 ABAE 세포주의 동정.
성인 BAE 세포는 ECACC#92010601 로 유로피언 셀 컬쳐 레포지터리에 기탁되었다. (PNAS 75:2621 (1978) 참조).
노던 (RNA) 분석은 중간 수준의 tie-2 전사체가 ABAE (성인 소 동맥내피)에 있는 것으로 나타났는데, 이는 tie-2 RNAs가 맥관 내피세포에 거의 배타적으로 편재됨을 나타낸 원위치 혼성화 결과와 일치하는 것이었다. 그러므로 우리는 이 TIE-2 단백질이 정상조건 대 혈청이 고갈된 성장조건 하에서 티로신-인산화되는 정도는 물론, TIE-2 단백질의 존재 여부에 대하여 ABAE 세포여액을 시험하였다. ABAE 세포여액을 수거하였고 그리고 면역침전 시켰고, 그 다음에 TIE-2 특이적이고 포스포티로신-특이적인 항혈청과 함께 면역침전된 단백질을 웨스턴 블랏분석을 수행하였다. TIE-2 면역침전 동안에 특이적인 차단분자로서 TIE-2 펩티드의 생략 또는 포함은, 정상상태의 포스포티로신 양이 세포의 사전 혈청고갈에 의하여 거의 탐지불능한 수준까지 감소하는, 중간 정도로 탐지가능한 약 150 KD 단백질로서 분명한 동정을 허용하였다. ABAE 세포의 배양물 및 세포여액의 수거는 다음처럼 수행하였다. 저-계대-수 ABAE 세포는 150 mm 플라스틱 페트리 플레이트 (Falcon) 당 2 X 106 세포의 밀도에서 단일층으로 깔았고 5% CO2의 환경에서 페니실린 및 스트렙토마이신 (P-S) 각각 1% 씩, 및 10% 소 태아혈청 (10% BCS), 2mL L-글루타민 (Q)을 함유하는 Dulbecco's 변형된 Eagle's 배지 (DMEM) 에서 배양하였다. 세포여액을 수거하기 전에, DMEM/Q/P-S 에서 24시간동안 세포를 혈청 결핍시켰고, 그 다음 배지를 흡인해 내었고 소디움 올소바나데이트, 소디움 플루오라이드 및 소디움 벤즈아미딘이 보충된 냉 PBS(phosphate buffered saline)로 플레이트를 헹구었다. 1% NP40 세제 및 단백분해 억제제 PMSF 그리고 아프로티닌이 보충된 작은 부피의 세척 완충액에서 세포를 용해시켰다. 불용성 찌꺼기는 10분동안 14,000 X G에서 원심분리에 의해 세포여액으로부터 제거하였고 상청액은, 약 20 μg/ml 여액에 첨가된 펩티드 차단제의 존재 또는 부재 하에서 TIE-2 수용체에 특이적인 항혈청으로 면역침전 시켰다. 면역침전된 단백질은 PAGE (7.5% Laemmli 겔)로 분리하였고, 그 다음 PVDF 멤브레인에 전기에 의해 옮겼고 다양한 TIE-2 또는 포스포티로신-특이적인 항혈청과 함께 인큐베이션하였다. TIE-2 단백질은 HRP-결합된 이차 항혈청과 함께 멤브레인을 인큐베이션시켜 그다음 ECL 시약 (Amersham)으로 처리하여 현시하였다.
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실시예 2 - TIE-2 리간드의 친화성-기초 연구를 위한 TIE-2 수용체의 클로닝 및 발현.
발현 구성물은, 인간 면역글로블린 감마-1 불변부 (IgG1 Fc)에 융합된 래트 TIE-2 수용체의 전체 세포외 부분으로 구성되는 분비단백질을 생성하도록 만들었다. 이 융합단백질은 TIE-2 "수용체본체" (RB)로 불리우고 IgG1 Fc 꼬리부의 각각 사이에 이황화 결합의 형성에 기초한 용액에서 정상적으로는 이량체로 존재하는 것으로 예상된다. TIE-2 RB의 Fc 부분은 다음처럼 제조하였다. 단백질의 경첩지역 으로부터 카르복시 말단까지 펼쳐지는 인간 IgG1의 Fc 부분을 암호화하는 DNA 단편을 인간 IgG1의 공표서열에 대응하는 올리고뉴클레오티드와 함께 PCR에 의해 인간 태반 cDNA로부터 증폭시켰는데; 결과의 DNA 단편을 플라스미드 벡터에 클로닝 시켜 넣었다. 전장 TIE-2 수용체를 암호화하는 플라스미드로부터 및 인간 IgG1 Fc 플라스미드로 부터의 적당한 DNA 제한 단편을, TIE-2 및 인간 IgG1 Fc 단백질-암호화 서열을 프레임에 맞게 융합하도록 설계된 짧은 PCR-유래 단편의 양쪽 면에 라이게이션시켰다. 따라서, 결과의 TIE-2 외도메인-Fc 융합 단백질은, TIE-2 막횡단 및 세포질 도메인에 걸친 영역대신에 정확하게 IgG1 Fc로 치환하였다. RBs를 제조하는 다른 대안의 방법은 Goodwin, et al. Cell 73:447-456 (1993)에 기술된다.
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pVL1393 베큘로바이러스 벡터안으로 TIE-2 RB DNA 단편을 클로닝하고 연속해서 Spodoptera frugiperda SF-21AX 곤충세포를 감염시켜 밀리그램 양의 TIE-2 RB를 얻었다. 다른 대안으로, 세포주 SF-9 (ATCC 수탁번호 CRL-1711) 또는 세포주 BT1-TN-5b1-4가 사용된다. TIE-2 RB를 암호화하는 DNA를 베큘로바이러스 전이 플라스미드 pVL1393 안으로 EcoRI-NotI 로서 클로닝하였다. 염화세슘 밀도변화 원심분리에 의해 정제된 플라스미드 DNA를 플라스미드 DNA 3㎍을 Baculo-Gold DNA (Pharminigen) 0.5㎍과 혼합함으로써 바이러스 DNA 안으로 재조합시킨 후, 30㎍리포펙틴(GIBCO-BRL)을 사용하여 리포좀 내로 도입시켰다. DNA-리포좀 혼합물을 27℃에서 5시간동안 TMN-FH 배지 (변형된 Grace's 곤충세포 배지 (GIBCO-BRL)) 에 있는 SF-21AE 세포 (2 X 106 세포/60mm 디쉬)에 첨가하였고 그 다음 5% 송아지 태아혈청이 보충된 TMN-FH 배지에서 5일동안 27℃에서 배양하였다. 조직배양 배지를 재조합 바이러스의 플라크 정제를 위해 수거하였고, 그것은 125 μg/mL X-gal (5-브로모-4-클로로-3-인돌일-β-D-갈락토피라노시드; GIBCO-BRL)을 함유하는 아가로스 오버레이를 제외하고는 종전에 기술된 방법 (O'Reilly, D.R., L.K. Miller, 및 V.A. Luckow, 베큘로바이러스 벡터 - 실험 지침. 1992, New York: W.H. Freeman)을 사용해 수행하였다. 27℃에서 5일동안 배양한 후에, 비재조합 플라크를 X-gal 기질에 양성 정색반응에 의해 기록하였고, 그리고 그들의 위치를 표시하였다. 그 후, 재조합 플라크를 100 μg/mL MTT (3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)2,5, 디페닐테트라졸리움 브로미드; Sigma)을 함유하는 제 2의 오버레이를 첨가해 현시하였다. 추정의 재조합 바이러스 플라크를 플러그(plug) 흡인으로 골라냈고, 그리고 동질성을 확인하기 위해 수회에 걸쳐 플라크를 분리해 정제하였다.
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바이러스 저장물을 플라크-정제된 바이러스의 일련의, 저-다중 계대에 의해 생성하였다. 바이러스 클론 하나 (vTIE-2 수용체본체)의 저계대 저장물을 제조하였다.
SF-21AE 세포를 1X 항생성/항진균성 용액 (Gibco BRL) 및 25 mg/L 젠타마이신 (Gibco BRL)을 함유하는 무혈청 배지 (SF-900 II, Gibco BRL)에서 배양하였다. 플루로닉 (Pluronic) F-68을 최종농도 1g/L가 되도록 계면활성제로서 첨가하였다. 배양액 (4L)을 감염전에 적어도 3일동안 생물반응조 (bioreactor) (Artisan Cell Station System)에서 길렀다. 세포는 가스유속 80 mL/min (스파르지 링에서 환기)로 50% 용존산소로 가스를 불어주며 27℃에서 성장시켰다. 100 rpm의 속도로 마린 임펠러 (marine impeller)에 의해 교반을 수행하였다. 세포를 중간대수 증식기 (-2 X 106 세포/mL) 에서 수거하였고, 원심분리로 농축하였으며, 그리고 세포당 vTIE-2 수용체본체의 5 플라크 형성유니트로 감염시켰다. 세포 및 접종액을 신선한 배지로 400mL이 되게 하였고, 그리고 바이러스를 교반 플라스크 (spinner flask) 에서 2시간동안 27℃에서 흡착시켰다. 그 후 배양액을 신선한 무혈청 배지와 함께 최종부피 8L로 재현탁시켰고, 그리고 전에 기술된 조건을 이용해 세포를 생물반응기에 배양하였다.
vTIE-2 수용체본체-감염된 SF21AE 세포로부터 배양배지를 감염 후 72시간에서 원심분리 (500X g, 10분)로 수거하였다. 세포 상청액을 NaOH 첨가로 pH 8이 되게 하였다. 최종농도 10 mM로 EDTA를 첨가하였고 상청액 pH를 8로 재조정하였다. 상청액을 여과시켰고 (0.45 μm, millipore) 단백질 A 컬럼 (단백질 A 세파로스 4 빠른유속 또는 HiTrap 단백질 A, 둘다 Pharmacia로부터 구입)상에 적하하였다. 280 nm에서 흡광도가 기저선까지 감소될 때까지 0.5 M NaCl을 함유하는 PBS로 컬럼을 세척하였다. PBS로 컬럼을 세척하였고 0.5 M 아세트산으로 용리하였다. 1M Tris pH 9를 함유하는 튜브안으로 용출시켜 컬럼분획을 즉시 중화시켰다. TIE-2 수용체본체를 함유하는 피크분획을 합하였고 PBS에 대해 투석시켰다.
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실시예 3 - TIE-2가 맥관의 발달에 중요한 역할을 갖는다는 사실의 입증
"과도의" 가용성 TIE-2 수용체본체를 발달계 안으로 도입함으로써 TIE-2 기능에 관한 중요한 식견을 얻었다. 이용가능한 TIE-2 리간드에 결합하고, 그럼으로써 중화할 수 있는 TIE-2 RB의 잠재능력은 정상적인 맥관발달 및 리간드의 특성화의 관찰가능한 파괴를 초래할 수 있다. TIE-2 RB가 닭의 초기 배에서 맥관발달을 파괴하는데 사용할 수 있는지를 조사하기 위해, 생물학적으로 재흡수 가능한 포말의 작은조각을 TIE-2 RB 와함께 침지시켰고 초기 배의 바로 측면위치에 있는 융모막요막 밑에 즉시 삽입하였다.
닭의 초기배는 융모막요막 멤브레인 (CAM)에 의해 덮여 있는 작은 디스크의 세포로부터 난황의 정점에서 발달한다. 배아에 맥관형성선 까지 오는 내피세포는 외배아 및 내배아 세포원 둘다로부터 발생한다. 배에 있는 내피세포의 주요원을 제공하는 외배에서 유도된 내피세포는 CAM의 바로 밑에서, 고유배 주변 측면에 위치된 간엽의 유착물로 부터 유래된다. 이들 간엽세포가 성숙함에 따라, 그들은 혈관모세포로 지칭된 내피 및 조혈세포 계통 둘다의 공통 선조를 낳는다. 차례로, 혈관모세포는 혈관모세포 (내피세포 선조) 및 적아구 (다수잠재성 조혈 전구체)의 혼합군을 야기한다. 순환계의 잔유물 형성은 내피세포 선조가 초기 혈액세포를 둘러쌓는 세포하나 두께의 소포를 형성하기위해 분리될때 개시된다. 이들 세포성분의 증식 및 이동은 결국 한정되고, 내배-유도된 맥관성분과 함께 결합하기위해 배를 궁국적으로 침투하는 CAM 하의 혈액이 채워진 미세혈관의 거대한 그물망을 제조한다.
Spafas, Inc. (보스톤, MA) 로 부터 얻은 새로 수정된 닭의 난을 99.5F, 55 % 상대습도에서 배양하였다. 약 24시간의 발달에서, 난각은 70% 에탄올로 닦았고 각 난의 무딘정점에 1.5cm 구멍을 만드는데 치과용 드릴을 사용하였다. 배위에 직접 공기공간을 노출시키기위해 난각 멤브레인을 제거하였다. 멸균 겔폼 (Upjohn)의 작은 직사각형 조각을 칼로 절단했고 TIE-2 또는 EHK-1 수용체본체의 동등한 농도에 침지하였다. EHK-1 수용체본체는 TIE-2 세포외영역 (Maisonpierre et al., Oncogene 8:3277-3288 (1993) 대신에 EHK-1 세포외영역을 이용해 실시예 2에 나타낸 바와 같이 만들었다. 각 겔폼 단편은 30 μl에 대략 6μg 의 단백질을 흡착하였다. 멸균된 기계제조용 겸자를 사용하여 초기배에 측면으로 몇 mm 위치에있는 CAM에 작은균열을 만들었다. RB-침지된 겔폼단편의 대부분은 CAM 밑에 삽입하였고 접착테이프 단편으로 난각의 위를 봉하였다. 다른 유사한 단계의 난을, 비관련, 신경원의 발현된 수용체 티로신 키나제인 EHK-1 (Maisonpierre et al., Oncogene 8:3277-3288 (1993)의 RB와 병행하여 처리하였다. 4일동안 발달을 진행시켰고, 그 후 배는 육안검사로 조사하였다. 따뜻한 PBS 의 디쉬에서 난각을 주의깊게 깨뜨려 배를 둘러싼 CAM 으로부터 배를 주의깊게 잘라 분리하였다. RB, 6개의 TIE-2 RB 및 5개의 EHK-1 RB 각각으로 처리한 12개의 난중에서, RB 처리한 배는 실험초기에 관찰된 단계를 넘어 발달하였다. 도 1A 및 도 1B 에서 보여진대로, 이들 발달된 배사이에 극적인 차이가 발견되었다.
EHK-1 RB 로 처리한 배는 비교적 정상적으로 발달하는 것으로 나타났다. 5개의 EHK-1 배중에서 4개는 심장박동에 의해 판단할 때 생존하는 것으로 나타났다. 더우기, 적혈구 세포의 존재에 때문에 육안으로도 명백한 외-배 맥관형성은 풍부하였고 그리고 CAM 밑에 측면 몇 cm 로 확장되었다. 반면, TIE-2 RB 로 처리한 배는 EHK-1 RB 배가 직경 10 mm 이상인 것과 비교했을 때, 직경 2-5 mm 의 범위로 심하게 발육이 저지되었다. TIE-2 RB 로 처리한 배 전부는 죽었고 그리고 그들의 CAMs는 혈관이 없었다. 닭에서 맥관형성 발달을 차단하는 TIE-2 RB 의 능력은 TIE-2 리간드는 맥관형성 발달에 필수적이라는 사실을 입증한다.
실시예 4 - ras 종양유전자-형질전환된 C2C12 마우스 근모세포주로부터 조건배지에서 TIE-2 특이적 결합 활성의 확인.
가용성, TIE-2 특이결합 활성 (BIAcore; Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ)의 존재에 대해 다양한 세포주로부터 10배 농축한 세포-조건배지 (10 X CCM)fmf 스크리닝한 결과는, 종양원성-ras-형질전환된 C2C12 세포 (C2C12-ras), RAT 2-ras (그것은 ras 형질전환된 결합조직 세포주), 인간 교모세포종 T98G 및 SHEP-1로 알려진 인간 신경모세포종 세포주로부터 무혈청 배지에서 결합활성이 있음을 나타냈다.
C2C12-ras 10 X CCM 은 표준 칼슘-포스페이트-기초한 방법에의해 H-ras T-24 돌연변이체와 함께 트랜스펙션에 의해 종양원적으로 형질전환된 C2C12 근모세포 의 안정하게 트랜스펙션된 세포주로부터 유래한다. SV40에 기초한 니오마이신-저항 발현 플라스미드는 트랜스펙션된 클론의 선택을 허용하기 위해 ras 발현 플라스미드와 함께 물리적으로 결합되었다. 결과의 G418-저항 ras-C2C12 세포는 10% 송아지 태아 혈청 (FCS)이 보충된 DMEM/글루타민/페니실린-스트렙토마이신에 플라스틱 디쉬상에 단일층으로 일상적으로 유지시켰다. 혈청없는 C2C12-ras 10 X CCM을 12 시간동안 혈청없는 특정 배지에서 60% 전면에서 세포를 깔아서 만들었다. (Zhan 및 Goldfarb, Mol. Cell. Biol. 6:3541-3544 (1986)); Zhan, et al. Oncogene 1: 369-376 (1987). 배지를 버렸고 24 시간동안 신선한 DMEM/Q/P-S 로 대체하였다. 이 배지를 수거하였고 신선한 DMEM/Q/P-S 를 재충진한 후, 세포를 24 시간 더 경과한 후에 수거하였다. 이들 CCM을 단백분해효소 억제제 PMSF (1mM) 및 아프로티닌 (10μg/ml)을 보충하였고, 그리고 멸균 크기배제 멤브레인 (Amicon) 상에 10배 농축하였다. TIE-2-결합 활성은 BIAcore 분석전에 과량의 TIE-2 RB로 배지를 배양해 중화될수 있으나, 그러나 EHK-1 RB와 배양해서는 중화될 수 없다.
10 X CCM 의 결합활성을 표면 플라스몬 공명을 통해 실제시간에서 생분자 상호작용을 모니터하는 생물학적감지기 기술 (BIAcore; Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ)을 이용해 측정하였다. 정제한 TIE-2 RB는 CM5 연구등급 감지칩 (Pharmacia Biosensor; Piscataway, NJ)의 카르복시메틸 덱스트란 층에 일차 아민을 통해 공유결합 시켰다. 감지칩 표면은 N-히드록시숙신이미드 (NHS) 및 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 (EDC)의 혼합물을 이용해 활성화 시켰고, 그 다음 TIE-2 RB (25 μg/mL)을 고정시켰으며 그리고 1.0 M 에탄올아민 (pH 8.5) 으로 비반응 부위의 활성을 제거하였다. EHK-1 수용체본체의 네거티브 대조군 표면을 유사 방법으로 제조하였다.
본 시스템에 사용된 전개 완충액은 HBS (10 mM Hepes, 3.4 mM EDTA, 150 NaCl, 0.005% P20 계면활성제, pH 7.4)였다. 10 X CCM 시료를 4℃에서 15분간 원심분리 하였고, 멸균된 저 단백질-결합 0.45 μm 필터 (Millipore; Bedford, MA)를 이용해 더 투명화 시켰다. 덱스트란 (2 mg/ml) 및 P20 계면활성제 (0.005%)를 각 CCM 시료에 첨가하였다. 분취량 40 μL를 유속 5 μl/min 에서 고정된 표면(TIE-2 또는 EHK-1)을 가로질러 주사하였고 그리고 수용체 결합을 8분동안 모니터하였다. 결합활성 (공명 유니트, RU)을 시료 주사전 30초에서 측정된 기저값 및 주사 후 30초에서 취한 측정값 사이의 차이로서 측정하였다. 표면dml 재생성은 3 M MgCl2 의 하나의 12-μl 펄스(pulse)로 수행하였다.
기기 잡음수준은 20 RU 이다; 그러므로, 20 RU 이상의 시그널을 가진 어느 결합활성도 수용체와 실제의 상호작용으로서 해석된다. C2C12-ras 조건배지에 대해, 결합활성은 TIE-2 RB 에 대해 60-90 RU 의 범위에 있었다. EHK-1 RB 상에 분석된 동일시료에 대해, 측정활성은 35 RU 보다 적었다.
결합활성을 분석하기 전에 가용성 TIE-2 또는 EHK-1 RB 의 과량과 함께 시료를 인큐베이션해서 TIE-2 수용체본체에 특이결합을 측정하였다. 가용성 EHK-1 RB 의 첨가는 시료중 어느것의 TIE-2 결합활성상에도 효과가 없는 반면에, 표면에 가용성 TIE-2 결합의 존재에서는 TIE-2 의 부재에서 측정한 값보다 2/3가 적었다. 50X 이상 농축된 C2C12-ras CCM 을 이용한 반복분석은 TIE-2 특이적인 결합 시그널의 바탕값보다 4배가 증대되었다.
실시예 5 - C2C12-ras CCM 은 TIE-2 수용체의 티로신 인산화를 유도하는 활성을 함유한다
ABAE 세포에서 TIE-2 의 티로신 인산화를 유도하는 C2C12-ras 10 X CCM 의 능력을 조사하였다. 혈청결핍 ABAE 세포를 단기간 C2C12-ras CCM 과 함께 배양하였고, 융해하였으며 그리고 상기 기술된대로 면역침전 및 웨스턴 블랏 분석을 하였다. 혈청 결핍 ABAE 세포에 대한 무혈청 C2C12-ras 10 X CCM 으로의 자극을 다음처럼 수행하였다. 상기 기술한대로 결핍 ABAE 세포의 배지를 제거하였고 37℃로 예열된 특정배지 또는 10 X CCM 으로 대체하였다. 10분 후에, 배지를 제거하였고 세포를 올소바나데이트/NaF/벤즈아미딘이 보충된 과량의 냉 PBS 로 얼음상에서 두번 헹구었다. 세포융해 및 TIE-2 특이적인 면역침전을 상기 기술한대로 수행하였다.
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특정배지와 함께 10분동안 인큐베이션된 ABAE 세포는 TIE-2 티로신 인산화의 유도를 보이지 않는반면에, C2C12-ras CCM 과 함께 인큐베이션한 것은 TIE-2 인산화에서 적어도 100배 더 증가된 자극을 보였다. 이 활성은, 단백질 G-세파로스 비드에 결합한 TIE-2 RB 13μg 과 함께 실온에서 90분동안 C2C12-ras 10 X CCM 의 예비인큐베이션에 의해 거의 완전히 고갈되었다. 단독의 단백질 G 세파로스와 함께 인큐베이션한 배지는 이 인산화 활성이 고갈되지 않았다.
실시예 6 - TIE-2 리간드의 발현 클로닝
COS-7 세포를 10% 소의 태아혈청 (FBS), 페니실린 및 스트렙토마이신 (P/S) 각각 1% 그리고 5% CO2 환경에있는 2 mM 글루타민을 함유하는 Dulbecco's 변형된 Eagle's 배지 (DMEM) 에서 배양하였다. 마우스 근모세포 C2C12ras 세포주를 10% FBS, (P/S) 그리고 2 mM 글루타민과 함께 Eagle's 최소 필수배지 (EMEM)에서 배양하였다. 전장 마우스 TIE-2 리간드 cDNA 클론을 COS 세포에서 발현되는 pJFE14 벡터내 C2C12 ras cDNA 라이브러리를 스크리닝해서 얻었다. 도 2에서 보여진대로, 이 벡터는 벡터 pSRα(Takebe, et al. 1988, Mol. Cell. Biol. 8:466-472) 의 변형된 버젼이다. pJFE14 벡터에서 두개의 BSTX1 제한부위를 이용해 라이브러리를 만들었다.
COS-7 세포를 DEAE-덱스트란 트랜스펙션절차에 의해 pJFE14 라이브러리 또는 대조군 벡터와 함께 일시적으로 트랜스펙션시켰다. 요약하면, COS-7 세포를 트랜스펙션전에 24시간 100 mm 플레이트당 1.0 X 106 세포의 밀도로 플레이팅했다. 트랜스펙션을 위해, 세포를 DEAE-덱스트란, 15M 클로로퀸, 그리고 2 mM 글루타민, 그리고 5% CO2의 환경에서 37℃에서 3-4 시간동안 적당한 DNA 1μg을 함유하는 무혈청 DMEM 에서 배양하였다. 트랜스펙션배지를 흡인해 내었고 그리고 2-3분동안 10% DMSO를 함유하는 PBS로 대체하였다. 이 DMSO "충격" 다음에, COS-7 세포를 10% FBS, 페니실린 및 스트렙토마이신 각각 1%, 그리고 48 시간동안 2 mM 글루타민 함유 DMEM 안에 놓았다.
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TIE-2 리간드가 분비되기 때문에, 리간드에 수용체본체 프로브의 결합을 탐지하기 위해 세포를 투과성부여 하는 것이 필요하였다. 트랜스펙션후 이틀에 세포를 PBS로 세척하였고 그 후 실온에서 15-30 분동안 1.8% 포름알데히드를 함유하는 PBS와 함께 인큐베이션하였다. 그후, 세포를 PBS로 세척하였고, 세포를 투과성부여하고 비특이적인 결합부위를 차단하기 위해 0.1% Triton X-100 및 10% 송아지 혈청을 함유하는 PBS로 15분 동안 인큐베이션하였다.
IgG1 불변부에 융합된 TIE-2 의 세포외영역으로 구성되는 TIE-2 수용체본체 (RB) 를 이용한 염색의 직접 편재에 의해 스크리닝을 수행하였다. 이 수용체본체를 실시예 2에 나타낸대로 제조하였다. 트랜스펙션되고, 고정되고 투과성부여된 COS 세포의 100 mm 디쉬를 TIE-2 RB와 함께 30분 동안 인큐베이션해 프로빙하였다. 그후, 세포를 고 PBS로 두번 세척하였고 PBS/10% 송아지 혈청/항-인간 IgG-알카라인 포스파타제 접합체로 추가 30분동안 더 인큐베이션하였다. PBS로 세번 세척한후에, 세포를 30-60분 동안 알카라인-포스파타제 기질에서 인큐베이션하였다. 그후 염색한 세포의 존재여부를 알아보기 위해 현미경으로 디쉬를 검사하였다. 각 염색된 세포에 대해, 염색세포를 포함하는 작은영역을 플라스틱 피펫 팁을 이용해서 디쉬(dish)로부터 긁어냈고 플라스미드 DNA를 회수해냈고 그리고 세균세포를 일렉트로포레이션하는데 사용했다. 일렉트로포레이션으로부터 파생되는 단일 세균 콜로니를 골라냈고 이들 콜로니로부터 제조된 플라스미드 DNA를 TIE-2 수용체본체에 결합해서 입증된 것처럼 TIE-2 리간드 발현을 위해 프로빙한 COS-7 세포를 트랜스펙션하는데 사용하였다. 이것은 TIE-2 리간드를 암호화하는 단일클론의 동정을 허용하였다. TIE-2 리간드 발현의 확인은 실시예 5 에 나타낸 방법을 이용해 TIE-2 수용체의 인산화에 의해 얻었다. TIE-2 리간드를 암호화하는 플라스미드 클론을 1994년 10월 7일에 ATCC에 기탁하였고 ATCC 수탁번호 75910 하에서 "TIE-2 리간드를 암호화하는 pJFE14"로 지칭되었다.
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실시예 7 - 인간 TIE-2 리간드를 암호화하는 전장 cDNA의 분리 및 서열화
람다 gt-10 (도 3 참조)에 있는 인간태아 폐 cDNA 라이브러리(library)를 Clontech Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA)으로부터 얻었다. 플라크를 20 X 20 cm 플레이트당 1.25 X 106 의 밀도로 깔았고, 그리고 다음의 표준절차 (Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., page 8.46, Cold Spring Harbor, New York)에 따라 페플리카 필터를 취했다.
인간 tie-2 리간드 클론의 분리를 다음처럼 수행하였다. 기탁된 tie-2 리간드 클론 (ATCC 번호 75910 - 상기 실시예 6 참조)으로부터 2.2 kb XhoI 단편을 적당한 5 X 108 cpm/ng 의 특이활성이 되도록 랜덤 프라이밍에 의해 표지하였다. 혼성화를 0.5 mg/ml 연어정자 DNA를 함유하는 혼성화용액에서 65℃에서 수행하였다. 65℃에서 2 X SSC, 0.1% SDS 에서 필터를 세척하였고 밤새 -70℃에서 코닥 XAR-5 필픔에 노출시켰다. 양성 파지를 플라크 정제하였다. 순수파지의 높은역가 파지 세포여액을 표준절차 (Qiagen, Inc., Chatsworth, CA, 1995 catalog, page 36)를 이용해 Qiagen 컬럼을 통해 DNA를 분리하는데 사용하였다. 파지 DNA를 연속 서브클로닝 하기위해 클론된 cDNA 단편을 방출하기 위해 EcoRI으로 절단하였다. 인간 tie-2 리간드 DNA를 함유하는 람다 파지 벡터를 htie-2 리간드 1 (ATCC 수탁번호 75928)을 암호화하는 명칭 λgt10 라는 명칭으로 1994년 10월 26일에 ATCC에 기탁하였다. 파지 DNA를 디디옥시 사슬 종료 방법 (Sanger, et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74:5463-5467)에 의해 직접적으로 DNA 서열결정을 하였다.
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포유류 발현벡터 안으로 인간 tie-2 리간드 DNA의 서브클로닝을 다음과 같이 수행하였다. htie-2 리간드 1을 암호화하는 클론 λgt10은 인간 TIE-2 리간드에 대한 암호화 서열의 개시로부터 하류에 490 염기쌍이 위치한 EcoRI 부위를 함유한다. 상류 및 개시체 및 정지코돈 각각의 상류 및 하류의 유일한 제한부위를 사용하여 암호화 영역을 잘라낸다. 예를들면, 개시코돈으로부터 70 염기쌍 5'에 위치한 SpeI 부위, 그리고 정지코돈으로부터 265 염기쌍 3'에 위치한 Bpu1102i (또한 BIpI로 알려짐) 부위는 완전한 암호화 영역을 잘라내는데 사용된다. 그후, 이것은 XbaI (SpeI 돌출에 적합함) 및 PstI 부위 (PstI 및 Bpu1102i 부위 둘다는 평활말단으로 만든다)를 이용해 pJFE14 클로닝벡터 안으로 서브클로닝한다.
htie-2 리간드 1을 암호화하는 클론 λgt10 으로부터 암호화 영역을 ABI 373A DNA 서열기 및 Taq Dideoxy Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystem, Inc., Foster City, CA)를 이용해 서열화 하였다. htie-2 리간드 1을 암호화하는 클론 λgt10 으로부터 인간 TIE-2 리간드의 뉴클레오티드 및 추정된 아미노산 서열은 도4에 보여진다.
이외에도, 전장 인간 tie-2 리간드 cDNA 클론을 pJFE14 벡터에서 인간 교모세포종 T98G cDNA 라이브러리를 스크리닝해서 얻었다. 인간 TIE-2 리간드를 암호화하는 클론을 프로브 (상기 실시예 6 참조)로서 기탁된 tie-2 리간드 클론 (ATCC 번호 75910)으로부터 2.2 kb XhoI 단편을 이용해 DNA 혼성화해서 동정하였다. 암호화 영역을 ABI 373A DNA 서열결정 및 Taq Dideoxy Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA)를 이용해 서열결정하였다. 이 서열은 htie-2 리간드 1을 암호화하는 클론 λgt10의 서열과 거의 동일하였다. 도 4에 보여진대로, htie-2 리간드 1을 암호화하는 클론 λgt10은 뉴클레오티드 1114-1116 에 의해 암호화되는 추가적인 글리신 잔기를 함유한다. T98G 클론의 암호화 서열은 이 글리신 잔기를 함유하지 않으나 다른것은 htie-2 리간드 1을 암호화하는 클론 λgt10의 암호화 서열에 동일하다. 도 5는 T98G 클론 으로부터 인간 TIE-2 리간드의 뉴클레오티드 및 추정된 아미노산 서열을 나타낸다.
실시예 8 - 인간 TIE-2 리간드를 암호화하는 제2의 전장 cDNA 클론의 서열화 및 분리
람다 gt-10의 사람 태아의 폐 cDNA 라이브러리(도 3 참조)는 Clontech Laboratories, Inc.(Palo Alto, CA)로부터 구입하였다. 플라크를 1.25×106/20× 20cm 플레이트의 밀도에서 플레이팅하고, 레플리카(replica) 필터는 다음 표준 방법에 따라 취하였다(Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., page 8.46, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York). 듀플리케이트(duplicate) 필터를 인간 TIE-2 리간드 1 서열에 대해 작성한 프로브로(probe) 낮은 긴축 조건(2×SSC, 55℃)에서 스크리닝하였다. 듀플리케이트 필터중 한 개를 도 4에 기재된 바와 같은 사람 TIE-2 리간드 1의 아미노산 25-265를 암호화하는 5' 프로브로 브로빙하였다. 제2의 듀플리케이트 필터를 인간 TIE-2 리간드 1 서열(도 4 참조)의 아미노산 282-498을 암호화하는 3' 프로브로 프로브화하였다. 두 프로브를 0.5mg/ml 연어 정자 DNA를 함유하는 혼성화 용액에서 55℃에서 혼성화시켰다. 필터를 55℃에서 2×SSC로 세척하고 하룻밤 X선 필름에 노출시켰다. 또한, 듀플리케이트 필터를 마우스 TIE-2 리간드 1(F3-15, Xhol 삽입물)의 전장 코딩 프로브로 정상 긴축도(2×SSC, 65℃)에서 분자잡종시켰다. 3개의 양성 클론을 다음 기준을 만족하도록 선택하였다: i) 혼성화는 정상 긴축도에서 전장 (마우스) 프로브로 나타나지 않고, ii) 혼성화는 5' 및 3' 프로브 둘다에 대하여 저 긴축도에서 나타났다. 이들 클론으로부터 얻어진 파지 DNA의 EcoRI 분해는 약 2.2kb 및 약 1.8kb의 삽입체 크기를 갖는 2개의 독립된 클론을 나타냈다. 2.2kb EcoRI 삽입물을 COS 세포에 사용하는데 적당한 두 pBluescript KS (Stratagene) 및 포유류 발현 벡터의 EcoRI 부위로 서브클로닝하였다. 두 배향을 포유류 발현 벡터에 대해 확인하였다. pBluescript KS중의 2.2kb 삽입체을 1994년 12월 9일 ATCC에 기탁하고 사람 TIE-2 리간드 2를 코딩하는 pBluescript KS로서 지칭되었다. TIE-2 리간드 2 코딩 서열의 개시 부위는 pBluescript EcoRI 부위로부터 하류 약 355 염기쌍에 있다.
COS-7 세포를 DEAE-덱스트란 트랜스펙션(transfection) 프로토콜에 의해 발현 벡터 또는 대조군 벡터로 일시적으로 트랜스펙션시켰다. 요약하면, COS-7 세포를 트랜스펙션하기 24시간 전에 1.0×106세포/100mm 플레이트의 밀도로 플레이팅하였다. 트랜스펙션을 위해, 세포를 5% CO2의 분위기하에서 37℃에서 3-4시간동안 400μg/ml DEAE-덱스트란, 1μM 클로로퀸과 2mM 글루타민 및 적당한 DNA 1μg을 함유하는 혈청 없는 DMEM에서 배양하였다. 트랜스펙션 배지를 흡인하고 2-3분동안 인산완충 식염수를 10% DMSO로 교체하였다. 이 DMSO "충격"을 수행하고, COS-7 세포를 48시간동안 10% FBS, 1% 각각의 페니실린 및 스트렙토마이신 및 2mM 글루타민이 함유된 DMEM에 놓았다.
TIE-2 리간드가 분비되기 때문에 수용체본체 프로브의 리간드에의 결합을 검출하기 위해 세포를 투과성 부여하는 것이 필요하였다. 트랜스펙션 COS-7 세포를 1.0×106세포/100mm 플레이트의 밀도로 플레이팅하였다. 세포를 PBS로 세정하고 나서 실온에서 15 내지 30분동안 1.8% 포름알데히드 함유 PBS로 인큐베이션하였다. 다음에 세포를 PBS로 세척하고, 세포를 투과성부여하고 비특이적 결합부위를 차단하기 위해 0.1% 트리톤 X-100 및 10% 소과의 송아지 혈청을 함유하는 PBS로 15분동안 인큐베이션하였다. 스크리닝을 IgG1 불변부로 융합된 TIE-2의 세포외 도메인으로 구성된 TIE-2 수용체본체를 사용하는 염색의 직접 편재에 의해 수행하였다. 이 수용체본체를 실시예 2에 기재된 바와 같이 제조하였다. 트랜스펙션 COS 세포를 TIE-2 수용체본체로 30분동안 인큐베이션함으로써 프로브화하였다. 다음에 세포를 PBS로 2회 세척하고, 메탄올로 고정하고 그 다음에 PBS/10% 소과의 송아지 혈청/항-인간 IgG-알칼리성 포스파타제 접합체로 30분 더 인큐베이션하였다. PBS로 3회 세척한 후에, 세포를 30-60분동안 알칼리성-포스파타제 기질에서 인큐베이션하였다. 다음에 디쉬를 착색된 세포의 존재에 대해 현미경으로 검사하였다. 클론의 한 쪽 배향를 발현하는 세포는 TIE-2 수용체본체를 결합하는 것으로 보였고 다른 쪽은 그렇지 않았다.
당업자는 여기 기재된 방법이 TIE 리간드 부류의 다른 관련 구성원을 더 동정하는데 사용될 수 있다는 것을 쉽게 알 것이다.
사람 TIE-2 리간드 2를 암호화하는 클론 pBluescript KS로부터의 암호화 영역을 ABI 373A DNA 서열기 및 Taq Dideoxy Terminator Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA)를 사용하여 서열화하였다. 사람 TIE-2 리간드 2를 암호화하는 클론 pBluescript KS로부터 인간 TIE-2 리간드의 뉴클레오티드 및 추론된 아미노산 서열을 도 6에 나타낸다.
실시예 9 - TIE-2 리간드 2는 수용체 길항제이다
TIE-2 리간드 2(TL2) 또는 TIE-2 리간드 1(TL1)을 발현하는 COS 세포로부터의 조절된 배지를 인간 내피세포주에 자연적으로 존재하는 TIE-2 수용체를 활성화하는 능력에 대해 비교하였다.
리포트아민 시약(GIBCO-BRL, Inc.) 및 추천된 프로토콜을, pJFE14 발현벡터 단독, 인간 TIE-2 리간드 1 cDNA 함유 pJFE14 발현벡터, 또는 인간 TIE-2 리간드 2 cDNA 함유 pMT21 발현벡터(Kaufman, R.J., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 689-693)로 COS-7 세포를 트랜스펙션하는데 사용하였다. 분비된 리간드를 함유하는 COS 배지를 3일 후에 수확하고 이여과(DIAFLO ultrafiltration membranes, Amicon, Inc.)로 20배 농축하였다. 이들 배지에 존재하는 활성 TIE-2 리간드 1 및 TIE-2 리간드 2의 양을 측정하고 BIAcore 결합 분석으로 측정된 TIE-2 수용체 특이적 결합 활성량(공명 단위, R.U.)으로 나타내었다.
노던 (RNA) 분석은, HAEC(인간 대동맥 내피세포) 사람 1차 내피세포(Clonetics, Inc.)에서 TIE-2 전사물의 현저한 수준임을 나타내었다. 따라서, 이들 세포를 TIE-2 수용체가 TIE-2 리간드 함유 COS 배지에 노출되었을 때 티로신-인산화되는지를 검사하는데 사용하였다. HAEC 세포를, 5% 태아단계의 소 혈청, 가용성 소 뇌 추출물, 10ng/ml 사람 EGF, 1mg/ml 히드로코르티손, 50mg/ml 젠타마이신 및 50ng/ml 암포테리신-B를 함유한 완전한 내피세포 성장 배지(Clonetics, Inc.)에서 유지하였다. TL1 및 TL2가 HAEC 세포에서 TIE-2 수용체를 활성화할 수 있는지의 평가는 다음과 같이 하였다. 반-컨플루언시를 나타내는 HAEC 세포를 37℃에서 L-글루타민 및 페니실린-스트렙토마이신을 가하면서 고 포도당 Dulbecco's MEM에서 2시간동안 혈청 결핍시킨 후에 이 결핍 배지를 5% CO2 배양기에서 37℃에서 7분동안 리간드 함유 조절된 COS 배지로 교체하였다. 세포를 이어서 용해하고 TIE-2 펩티드 항혈청으로 용해물을 면역침전한 다음에 실시예 1에 정확하게 기재된 대로 안티포스포티로신 항혈청으로 웨스턴 블롯팅함으로써 TIE-2 수용체 단백질을 회수하였다. 결과를 도 7에 나타낸다. TIE-2 리간드 1(L1 레인)으로 HEAC 세포를 처리하면 TIE-2 수용체(TIE-2-R)에서의 포스포티로신 수준을 유발시켰지만 TIE-2 리간드 2(L2 레인) 조절된 COS 배지로의 처리는 그러하지 않았다. MOCK는 JFE14가 없는 벡터로 트랜스펙션된 COS로부터 조절된 배지이다.
TL1 및 TL2 둘다가 TIE-2 수용체에 특이적으로 결합한다는 증거는 트랜스펙션된 COS 배지에서 TIE-2 수용체 특이적 결합 활성을 분석하기 위해 BIAcore를 사용함으로써 그리고 TL1- 및 TL2-발현 COS 세포를 TIE-2 수용체본체로 면역착색함으로써 입증하였다.
TL2는 TIE-2 수용체를 활성화하지 않기 때문에, 출원인은 TL2를 TL1 활성의 길항제로서 사용할 수 있는지의 여부를 결정하기에 이르렀다. HAEC 인산화 분석을 수행하고 여기서 세포는 "과잉량"의 TL2로 먼저 인큐베이션한 다음에 묽은 TL1을 가하여 인큐베이션하였다. 높은 수준의 TL2로 인한 TIE-2 수용체의 사전 점유가, 제한된 농도로 존재하는 TL1에 노출시킨 후 수용체의 뒤이은 자극을 방해할 수 있다고 판단하였다.
반-컨플루언시를 나타내는 HAEC 세포를 상기한 바와 같이 혈청 결핍시키고 그 다음에 20X COS/JFE14-TL2 조절된 배지 1 내지 2ml로 37℃에서 3분동안 인큐베이션하였다. 대조군 플레이트를 20X COS/JFE14 만의 단독 배지(MOCK)로 처리하였다. 플레이트를 배양기에서 꺼내고 그 다음에 다양하게 희석한 COS/JFE14-TL1 배지를 가하고 나서 37℃에서 5-7분동안 더 인큐베이션하였다. 세포를 후속적으로 세정하고, 용해하고, 용해물 중의 TIE-2 특이적 티로신 인산화를 상기한 바와 같은 수용체 면역침전 및 웨스턴 블롯팅으로 검사하였다. TL1 희석액은 20X COS/JFE14 단독의 배지를 첨가하여 2×, 0.5×, 0.1× 또는 0.02×로 희석한 20X COS/JFE14-TL1 배지를 사용하여 제조하였다. BIAcore 바이오센서 기술을 사용하여 초기 20X TL1 및 20X TL2 COS 배지의 분석은 이들이 TIE-2 특이적 결합 활성의 유사한 양, 즉 TL1 및 TL2 각각에 대해 445 R.U. 및 511 R.U.를 함유한다는 것을 나타내었다. 도 8에 나타낸 안티포스포티로신 웨스턴 블롯의 결과는 HAEC 세포를 MOCK 배지(1 레인)로 사전 처리하였을 때와 비교하여 HAEC세포를 과잉량의 TIE-2 리간드 2(2 레인)로 사전 처리하는 것은 TIE-2 수용체(TIE-2-R)를 활성화하는 묽은 TIE-2 리간드 1의 후속적 능력을 길항한다는 것을 나타낸다.
TIE-2-R의 TL1 활성을 경쟁적으로 저해하는 TL2의 능력은 사람 세포 하이브리드 주 EA.hy926 (이 세포주 및 그 유지는 상세한 설명의 실시예 21 참조)을 사용하여 더 입증되었다. TL1 함유 비농축 COS 세포 배지를 MOCK- 또는 TL2-조절된 배지와 다양한 희석도로 혼합하고 37℃에서 5분동안 혈청 결핍된 EA.hy926 세포 단일층 위에 놓는 실험을 수행하였다. 다음에 배지를 제거하고 세포를 용해하여 수확하고 TIE-2-특이적 티로신 인산화를 상기한 대로 웨스턴 블롯으로 검사하였다. 도 9는 좌로부터 우 방향으로 보여지는 바와 같이 3개 군의 처리를 함유하는 실험을 나타낸다. 좌측 4개의 레인에 나타낸 바와 같이, EA.hy926 세포를 1×COS-TL1 단독으로 처리하는 것은 이들 세포에 내재적 TIE-2-R을 매우 활성화시키는 반면, 1×TL2 COS 배지는 불활성이었다. 그러나, TL1과, MOCK 또는 TL2 중 어느 하나와의 혼합물은 TL2가 투여량 의존 형식으로 TL1의 활성을 차단할 수 있다는 것을 입증하였다. 레인의 중간 3쌍에서는 TL2(또는 MOCK)의 비가 감소되는 반면, 혼합물중 TL1의 양은 0.1×로부터 0.3×으로 대응하게 증가되었다. 어떤 이들 혼합물 비에서도 TL1:TL2 레인은 대응하는 TL1:MOCK 레인의 것과 비교하여 TIE-2-R 인산화의 감소된 수준을 나타냈다. 그러나, TL1 양은 일정하게 유지하고 TL2(또는 MOCK) 양이 감소되었을 때, (우측 3쌍의 레인에 나타난) 지점은 시료중의 TL2가 너무 묽어 효과적으로 TL1 활성을 저해하지 못한다는 것에 이르렀다. 이들 조절된 COS 배지에 존재하는 각 리간드의 상대 양은 리간드-특이적 항체로 COS 배지의 웨스턴 블롯으로부터 그리고 BIAcore 분석에 의해 측정된 바와 같이 그것의 결합단위로부터 측정될 수 있었다. 결론적으로, 본 발명자들은 TL2의 단지 몇 배 몰 과잉량이 시험관내에서 TL1의 활성을 효과적으로 차단하는데 필요하다는 것을 추찰할 수 있다. 본 발명자들은 TL2 mRNA가 TL1의 것보다 상당히 풍부하게 이룰 수 있는 생체내에서 분명한 실례를 관찰할 수 있기 때문에 (실시예 17 및 도 16 참조) 이것은 유의하다. 따라서, TL2가 이들 부위에서 TIE-2-R에 의한 신호화를 효과적으로 차단하는데 중요한 생리적 역할을 할 수 있다.
이들 데이터를 종합하면, TL1과는 달리 TL2는 내피세포상에서 내생적으로 발현된 TIE-2-R을 자극할 수 없다는 것을 확인하였다. 더욱이, 몇 배 몰 과잉량에서 TL2는 TIE-2 수용체의 TL1 자극을 차단할 수 있고, 이는 TL2가 자연발생 TIE-2 수용체 길항제라는 것을 나타낸다.
실시예 10 - 조절 배지 및 COS 세포 상청액에서의 TIE-2-특이적 결합 활성의 동정
세포주 C2C12-ras, Rat2ras, SHEP 및 T98G로부터의 10× CCM, 또는 사람 TIE-2 리간드 1(hTL1) 또는 인간 TIE-2 리간드 2(hTL2)로 트랜스펙션후의 COS 세포 상청액의 결합 활성을, 표면 플라스몬 공명(SPR)을 통해 실제 시간동안 생체분자 상호작용을 모니터하는 바이오센서 기술(BIAcore; Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ)을 사용하여 측정하였다. 정제된 래트 또는 인간 TIE-2 RB를 CM5 리서치 등급 센서 칩(Pharmacia Biosensor; Piscataway, NJ)의 카르복시메틸 덱스트란층에 1차 아민을 통해 공유적으로 결합시켰다. 센서 칩 표면을 N-히드록시숙신이미드(NHS) 및 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC)의 혼합물을 사용하여 활성화하고, 다음에 TIE-2 RB(25μg/ml, pH 4.5)를 고정화하고 1.0M 에탄올아민(pH 8.5)에 의해 미반응 부위를 불활성화하였다. 일반적으로, 각 수용체본체의 9000-10000 RU를 센서 칩에 결합시켰다.
시스템에 사용된 작동 완충액은 HBS(10mM Hepes, 150mM NaCl, 0.005% P20 계면활성제, pH 7.4)였다. 시료를 4℃에서 15분동안 원심분리하고 살균한 저 단백질-결합 0.45μm 필터(Millipore; Bedford, MA)를 사용하여 더 정화하였다. 덱스트란(2mg/ml) 및 P20 계면활성제(0.005%)를 각 시료에 가하였다. 40μL의 분액을 5μL/분의 유속으로 고정된 표면(래트 또는 사람 TIE-2)에 주사하고, 수용체 결합을 8분동안 모니터하였다. 결합 활성(공명단위, RU)을 시료주사 30초전에 측정한 기준선 값과 주사 30초 후에 취한 측정값 사이의 차이로서 측정하였다. 표면 재생은 3M MgCl2 15μL 펄스 하나로 달성하였다.
CCM 시료(C2C12-ras, Rat2-ras, SHEP, T98G)를 래트 TIE-2 RB 고정 표면위에서 시험하는 한편, 재조합 hTL1 및 hTL2를 사람 TIE-2 RB 고정 표면위에서 시험하였다. 각각의 경우에, TIE-2 수용체본체의 특이적 결합은 결합 활성을 분석하기 전에 25μg/ml의 가용성 TIE-2 (래트 또는 사람) RB 또는 trkB RB중 어느 한가지로 시료를 인큐베이션함으로써 평가하였다. 도 10 및 도 11에 나타낸 바와 같이, 가용성 trkB RB의 첨가는 TIE-2 결합 활성의 약간의 감소를 일으키는 한편, 가용성 TIE-2 RB는, TIE-2 RB의 부재시에 측정한 것과 비교하여 결합 활성을 유의하게 감소시킨다.
실시예 11 - TIE-2 RB는 TIE-2 리간드 1에 의해 TIE-2 수용체의 활성을 특이적으로 차단한다
출원인은 가용성 TIE-2 RB가 TIE-2 리간드 1(TL1)에 의해 TIE-2 수용체의 활성을 차단하는 경쟁적 저해제로서 사용할 수 있는지의 여부를 결정하려고 하였다. 이것을 하기 위해, TL1 함유 COS 배지를 TIE-2 또는 TrkB-RB중 어느 한가지로 사전인큐베이션하고 그 다음에 인간 내피세포주에 자연적으로 존재하는 TIE-2 수용체를 활성화하는 그 능력에 대해 비교하였다.
조절된 COS 배지를 배지를 멸균여과하나 농축하지 않은 것만 제외하고 상기 실시예 9에 기재된 바와 같이, pJFE14 발현벡터 단독(MOCK) 또는 인간 TIE-2 리간드 1 cDNA(TL1) 함유 pJFE14 벡터로 트랜스펙션된 COS-7 세포로부터 생성하고 수확하였다. TL1의 양을 측정하고 BIAcore 결합 분석에 의해 측정한 TIE-2 수용체-특이적 결합 활성의 양(공명 단위, R.U.)으로 나타내었다.
노던 (RNA) 분석으로 HUVEC (인간 배꼽 정맥 내피세포) 인간 1차 내피세포(Clonetics, Inc.)에서의 TIE-2 전사물이 유의한 수준임이 밝혀졌다. 따라서, 이들 세포를 TIE-2 수용체는 TIE-2- 또는 TrkB-RB의 존재하에서 TL1 함유 COS 배지에 노출되었을 때 티로신 인산화될 수 있는지의 여부를 결정하는데 사용하였다. HUVEC 세포를 5% 태아단계의 소 혈청, 10μg/ml 헤파린을 함유하는 가용성 소 뇌 추출물, 10ng/ml 사람 EGF, 1ug/ml 히드로코르티손, 50μg/ml 젠타마이신 및 50ng/ml 암포테리신-B를 함유한 완전한 내피세포 성장배지(Clonetics, Inc.)에서 37℃, 5% CO2에서 유지하였다. TL1이 HUVEC 세포에서 TIE-2 수용체를 활성화할 수 있는지의 평가는 다음과 같이 하였다. HUVEC 세포의 컨플루언트 디쉬를 37℃, 5% CO2에서 저 글루코스 Dulbecco's MEM에서 2 내지 4시간동안 혈청 결핍시킨 후에 포스포티로신 포스파타제의 강력한 저해제인 0.1mM 나트륨 오르토바나데이트를 포함한 결핍 배지에서 10분동안 인큐베이션하였다. 한편, 조절된 COS 배지를 50μg/ml으로 가한 TIE-2- 또는 TrkB-RB로 실온에서 30분동안 사전인큐베이션하였다. 다음에 결핍 배지를 HUVEC 디쉬에서 제거하고 37℃에서 7분동안 RB 함유 COS 배지로 인큐베이션하였다. HUVEC 세포를 이어서 용해하고 TIE-2 수용체 단백질을 실시예 1에 기재된 바와 같이 TIE-2 펩티드 항혈청에 의한 면역침전 후에 안티-포스포티로신 항체에 의한 웨스턴 블롯팅에 의해 회수하였다. 결과는 도 12에 나타낸다. TIE-2 수용체에 대한 포스포티로신 수준은, 대조군 배지(MOCK)로 나타난 것에 비해 TIE-2 리간드 1(TL1)로 HUVEC 세포를 처리함으로써 유도되고 이 유도는 TIE-2-RB(TIE-2-Fc)에 의한 사전인큐베이션으로 특이적으로 차단되지만 TrkB-RB(TrkB-Fc)에 의한 인큐베이션으로는 차단되지 않는다. 이들 데이터는 가용성 TIE-2 RB가 TIE-2 리간드 1에 의한 TIE-2 수용체의 활성화를 차단하는 선택적 저해제로서 사용할 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 12 - TIE-2 리간드 본체의 구성
인간 면역글로불린 감마-1 불변부(IgG1 Fc)에 융합된 인간 TIE-2 리간드 1(TL1) 또는 TIE-2 리간드 2(TL2)의 전체 코딩 서열로 구성된 분비 단백질을 얻는 발현 구성체를 제작하였다. 이들 융합 단백질은 TIE-2 "리간드본체"(TL1-Fc 또는 TL2-Fc)로 불리워진다. TL1-Fc 및 TL2-Fc의 Fc 부분은 다음과 같이 제조하였다. 단백질의 경첩 영역으로부터 카르복시 말단까지 걸쳐 있는 인간 IgG1의 Fc 부분을 코딩하는 DNA 단편을 인간 IgG1의 공표된 서열에 대응하는 올리고뉴클레오티드로 PCR에 의해 인간 태반 cDNA로부터 증폭시키고; 결과의 DNA 단편을 플라스미드 벡터 내로 클로닝하였다. 전장 TL1 또는 TL2를 암호화하는 플라스미드로부터 및 인간 IgG1 Fc 플라스미드로부터의, 적당한 DNA 제한 단편을, 인간 IgG1 Fc 단백질 암호화 서열에 TL1 또는 TL2를 프레임이 맞게 융합하도록 설계된 짧은 PCR-유래 단편의 어느 한 쪽에서 라이게이션(ligation)하였다.
TL2-Fc DNA 단편을 pVL1393 바큘로바이러스 벡터로 클로닝하고 이어서 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) SF-21AE 곤충 세포주를 감염시킴으로써 TL2-Fc의 밀리그램양을 얻었다. 대안으로, 세포주 SF-9(ATCC 수탁번호 CRL-1711) 또는 세포주 BTI-TN-5b1-4를 사용할 수 있다. TL2-Fc를 암호화하는 DNA를 EcoRI-Notl 단편으로서 바큘로바이러스 전이 플라스미드 pVL1393으로 클로닝하였다. 플라스미드 DNA 3μg과 바큘로-골드 DNA(Pharminigen) 0.5μg을 혼합하고 그 다음에 리포펙틴(GIBCO-BRL) 30μg을 사용하여 리포좀으로 도입함으로써 플라스미드 DNA를 바이러스 DNA 내로 재조합하였다. DNA-리포솜 혼합물을 27℃에서 5시간동안 TMN-FH 배지(변형된 Grace's 곤충 세포배지(GIBCO-BRL))에서의 SF-21AE 세포(2×106세포/60mm 디쉬)에 가하고, 그 다음에 5% 태아 송아지 혈청으로 보충된 TMN-FH 배지에서 5일동안 27℃에서 배양하였다. 조직 배양물을 재조합 바이러스의 플라크 정제를 위해 수확하고, 이것은 아가로스 오버레이(overlay)가 X-gal(5-브로모-4-클로로-3-인돌일-β- D-갈락토피라노시드; GIBCO-BRL) 125 mg/ml를 함유한 것만 제외하고 상기된 방법을 사용하여 수행하였다(O'Reilly, D.R., L.K. Miller, 및 V.A. Luckow, Baculovirus Expression Vectors - A Laboratory Manual. 1992, New York: W.H. Freeman). 27℃에서 배양한 지 5일 후에, 비재조합 플라크를 X-gal 기질에 대한 포지티브 정색 반응에 의해 스코어링하고 그 위치를 표시하였다. 다음에 재조합 플라크를 100 mg/ml MTT(3-[4,5-디메틸티아졸-2-일]2,5,디페닐테트라졸륨 브로마이드; Sigma)를 함유하는 제 2의 오버레이를 가하여 현시하였다. 추정의 재조합 바이러스 플라크를 플러그 흡인에 의해 선택하고 동질성을 확보하기 위해 많은 횟수의 플라크 분리에 의해 정제하였다. 바이러스 스톡을 일련의 저 다중 계대 플라크 정제된 바이러스에 의해 생성하였다. 한 바이러스 클론(vTL2-Fc 클론 #7)의 저 계대 스톡을 생산하였다.
SF-21AE 세포를 1× 항생성/항진균성 용액(Gibco BRL) 및 25mg/L 젠타마이신(Gibco BRL)을 함유하는 혈청 없는 배지(SF-900 II, Gibco BRL)에서 배양하였다. 플루로닉 F-68을 1g/L의 최종 농도로 계면활성제에 가하였다. 배양액(4L)을 감염되기 적어도 3일 전에 생물반응조(Artisan Cell Station System)에서 성장시켰다. 세포를 80mL/분의 기체 유속으로 50% 용존 산소로 기화(스파지 고리에서의 공기화)하면서 27℃에서 성장시켰다. 교반은 100rpm의 속도에서 마린 임펠러에 의해 하였다. 세포를 대수기 중간 성장 상에서 수확하고(∼2×106세포/mL) 원심분리로 농축하고 세포당 vTL2-Fc의 5 플라크형성유니트로 감염시켰다. 세포 및 접종물을 새로운 배지 400mL로 성장시키고 바이러스를 27℃ 교반 플라스크에서 2시간동안 흡착시켰다. 다음에 배양액을 새로운 무혈청 배지 8L의 최종 부피에 재현탁하고 세포를 상기한 조건을 사용하여 생물반응조에서 배양하였다.
vTL2-Fc 감염된 SF21AE 세포로부터의 배양 배지를 감염 후 72시간에서 원심분리(500× g, 10분)로 수집하였다. 세포 상청액을 NaOH로 pH 8이 되도록 하였다. EDTA를 10mM의 최종 농도가 되도록 가하고 상청액 pH를 8로 재조정하였다. 상청액을 여과하고(0.45μm, 밀리포어) 단백질 A 칼럼(단백질 A 세파로스 4 빠른 유속 또는 HiTrap 단백질 A, 둘다 Pharmacia)상에 적하하였다. 칼럼을 280nm에서의 흡광도가 기저선으로 감소될 때까지 0.5M NaCl 함유 PBS로 세척하였다. 칼럼을 PBS로 세척하고 0.5M 아세트산으로 용리하였다. 칼럼 분획을 1M 트리스 pH 9를 함유하는 튜브으로 용리함으로써 즉시 중화시켰다. TL2-Fc 함유 피크 분획을 합하고 PBS에 대해 투석하였다.
실시예 13 - 신장세포 암종에서의 TIE-1, TIE-2, TL1 및 TL2의 발현
원위치 혼성화 실험을 TIE-1, TIE-2, TL1 및 TL2 cDNA 프로브를 사용하여 사람 신장세포 암종 종양 조직상에서 수행하였다. TIE-1, TIE-2, TL1 및 TL2 발현은 종양 맥관조직에서 모두 상향조절되었다. 리간드 발현은 혈관 내피세포층 세포(TL2) 또는 중간엽에 매우 근접한 혈관 내피세포층 세포(TL1)중 어느 한가지로 편재되는 것으로 보인다. VEGF는 이 종양 조직에서 극적으로 상향조절되었음을 나타냈다. Brown, et al. Am. J. Pathol. 143:1255-1262(1993).
실시예 14 - 상처 치료에서의 TIE-1, TIE-2, TL1 및 TL2의 발현
원위치 혼성화 실험을 TIE-1, TIE-2, TL1 및 TL2 cDNA 프로브를 사용하여 래트 피부 상처 모델로부터 얻어진 단면조직 슬라이스에서 수행하였다. 상처 치료 모델은 래트의 피부에 대한 작은 코르크 구멍을 가압하고 피부의 작은 원통형 플러그를 제거하는 것을 포함한다. 치유가 상처의 기부에서 시작할 때 조직의 수직 슬라이스를 취하여 원위치 혼성화하는데 사용하였다. 시험한 조직 시료에서, TL1 및 TL2는 후 상해 4일까지 약간 상향조절되는 것으로 보였다. 이 조직에서 TL1 및 TL2의 발현이 약간 상향조절된 반면, TL1 및 TL2 발현에 선행되는 VEGF 발현은 극적으로 상향조절된다.
실시예 15 - 태아 간 및 흉선에서의 TIE 리간드의 발현
역전사-PCR(RT-PCR)을 마우스 E14.5 태아단계의 간 및 마우스 E17.5 태아단계의 흉선 상에서 수행하였다. RT-PCR 생성물의 아가로스 겔 전기영동으로, 마우스 태아단계의 간에서 TIE-2 리간드 1(TL1) RNA가 스트로마 영역에는 풍부하나 c-kit+TER119 조혈 전구체 세포에는 없다는 것이 밝혀졌다. 이 동일한 조직에서, TIE-2 리간드 2(TL2) RNA가 스트로마 세포에는 풍부하나 조혈 전구체 세포에 없다는 것이 밝혀졌다(도 13). 마우스 태아단계의 흉선에서, TL2는 스트로마 세포에 풍부하다(도 14).
실시예 16 - 맥관형성에서의 TIE 수용체/리간드 시스템
TIE-2/TIE 리간드 시스템이 내피세포층 세포 생물학에서 중요한 역할을 하는 것으로 보이지만, 혈관신생의 초기 내지 중간 단계 (예를 들면, 혈관 모델링에서 혈관모세포 또는 내피세포층 세포 증식 및 이식, 세관 형성 및 다른 초기 단계 이벤트)에서 유의한, 유효한 역할을 하는 것으로는 보이지 않았다. 혈관 발생의 이들 양태를 매개하는 것으로 알려진 수용체 및 인자와 대조적으로, 혈관신생의 과정에서 TIE-2 및 TL1의 발현의 시간적으로 후기 패턴은, 이 시스템이 새로운 혈관의 구조적 및 기능적 분화 및 안정화를 포함하는 후기 단계의 혈관 발생에서 분명한 역할을 한다는 것을 시사한다. 또한 TIE-2/TL1의 발현 패턴은 확립된 혈관조직의 구조적 완전성 및/또는 생리적 특정의 유지에서의 연속인 역할과 일치한다.
TIE 리간드 2(TL2)는 TL1의 경쟁적 저해제로 생각된다. TL2 발현의 시공적 특성은 이 단일 저해분자가 적절한 혈관 발생 또는 재모델링에 필수적인 다양한 환경 의존 역할을 할 수 있다는 것을 시사한다(존재하는 혈관조직으로부터 새로운 혈관의 형성을 허용하는 성숙한 내피세포층 세포의 탈안정화 및 탈분화, 부적절한 혈관 형성의 저해 및 성숙한 혈관의 복귀/퇴화). 도 15는 맥관형성에서의 TIE-2/TIE 리간드의 가설적 역할의 개략적인 표시이다. 이 도면에서 TL1은 (·)으로 나타내고, TL2는 (*)으로 나타내고, TIE-2는 (T)로 나타내고, VEGF는 ([])로 나타내고, flk-1(VEGF 수용체)은 (Y)로 나타낸다.
실시예 17 - 여성 생식계에서의 TIE 리간드의 발현: 난소에서의 발현
여성 생식계에서의 TIE 수용체 및 리간드의 발현을 검사하는 실험에서 수행된 예비 관찰은, TL1이 VEGF의 것에 시간적으로 후속되는 신혈관신생에서 역할을 한다는 가설과 일치한다. 또한 TL2 발현 패턴은 TL1 작용의 길항작용 및 혈관 복귀에서의 특정한 역할과 일치한다. 이것을 입증하기 위해, 관련 mRNA의 발현을 다음 실험의 여포 및 황체 발생으로 조사할 수 있어, 신혈관신생/혈관 복귀의 다양한 양태에 대한 이들의 시간관계를 보다 분명하게 규정할 수 있다(예를 들면, 내피세포층 세포 착색화, 혈관 충전과 관련). 성숙한 암컷 래트의 단계적으로 생기는 난소에서의, 또는 전 사춘기 동물에서 유발된 배란에 따른 여포 발생 및 신체 황체 형성과 관련된 맥관형성은 원위치의 혼성화를 사용하여 수행하였다. 도 16은 난소 주기 동안[컬럼 1: 초기 전 배란 여포; 칼럼 2: 전 배란 여포; 칼럼 3: 초기 신체 황체; 및 칼럼 4: 폐쇠 여포; 열 A: 밝은 장; 열 B: VEGF; 열 C: TL2; 열 D: TL1 및 열 E: TIE-2 수용체] TIE-2, TL1, TL2 및 VEGF의 시간경과에 따른 발현패턴을 나타내는 원위치의 혼성화 슬라이드의 사진을 포함한다. 이들 연구로 VEGF, TL1 및 TL2가 난소에서의 혈관조직의 발생 및 복귀에 대해, 특히 배란 여포의 신체 황체(CL)로의 전환의 과정에서 발생되는 혈관 시스템의 확립에 대해, 시간적으로 그리고 공간적으로 조화되는 형식으로 발현된다는 것이 밝혀졌다.
요약하면, VEGF 발현은 황체형성의 과정 동안에 혈관신생 전의 여포 입자층에서 증가한다. CL 형성의 과정 동안, 아직 혈관형성이 되지 않은 황체형성 세포 근방에서 최고 수준의 VEGF 발현이 발생 CL의 중심에 나타난다. VEGF 수준은 보통 높게 유지되고 발생된 CL에서 넓게 분포되어 있다. 반면, TIE-2 리간드 1의 두드러지게 증강된 발현은 1차 혈관 망상조직이 확립된 후에 CL 형성의 프로세스의 단지 후반에서만 발생한다. 나중에, TL1 발현은 CL의 완전 모세관 조직이 확립되었을 때 CL을 통해 나타난다.
TL2는 VEGF 또는 TL1 보다 훨씬 복잡한 발현 패턴을 나타낸다. 발생하는 CL에서, TL2는 VEGF 발현이 최고인 CL의 중심 혈관 영역과, TL1 발현이 우세하고 황체형성 광정이 완전하고 혈관계가 가장 성숙한 CL의 가장 말단부 사이의, 발생 중인 모세관 망상조직의 앞에서 최고수준으로 발현된다. 또한 TL2는 폐쇄를 진행시키고 있는 많은 여포의 여포층에서 고 수준으로 발현되는 것으로 보인다. TL1은 폐쇄 여포에서 나타나는 한편, VEGF는 발현되지 않는다.
상기한 발현 패턴은 맥관형성의 초기에서 VEGF에 대한 역할과 가장 일치하는데, 여기서 TL1은 이 과정 중 나중에, 예를 들어 모델링 및/또는 완전 혈관조직의 안정화에서 작용한다. 반대로, TL2는 새로 형성하는 혈관조직의 활성 팽창영역(CL 형성동안) 및 새로운 혈관조직을 확립하는데 실패하고 혈관 퇴행이 진행중인 영역 둘다에서 존재한다(폐쇠 여포). 이것은, 아마도 (퇴행에 필요한) 존재하는 혈관조직 또는 (새로 형성하는 혈관의 기능적인 모델링에 필요한) 발생하고 있는 혈관조직의 탈안정화에 관련되는, 보다 기능적이고 복잡한 TL2의 역할을 시사한다.
실시예 18 - 수용체본체 결합 분석 및 리간드 결합 및 경쟁 분석
2개의 다른 형태의 정량적인 무세포 결합 분석이 TIE-2 수용체본체 결합 또는 리간드 결합 및 경쟁중 어느 한가지를 검출하는데 개발되었다. 분석 중 수용체본체 결합 버전에서는, (정제된 또는 부분 정제된; TL1 또는 TL2) TIE-2 리간드를 ELISA 플레이트위에서 코팅한다. 다음에 다양한 농도의 수용체본체를 가하는데, 이것은 투여량 의존 방식으로 고정된 리간드에 결합한다. 2 시간이 경과한 때, 과잉량의 수용체본체를 세척해 버리고 나서 플레이트에 결합된 양을 표지된 알칼리성 포스파타제인 특이적 항-사람 Fc 항체를 사용하여 기록하였다. 과잉량의 리포터 항체를 세척해 버리고 나서 AP 반응을 착색된 기질을 사용하여 현상시킨다. 분석물을 분광광도계를 사용하여 정량한다. 도 19는 전형적인 TIE-2-IgG 결합 곡선을 나타낸다. 이 분석은 래트 및 마우스 내로의 주사후 TIE-2-IgG의 완전성을 평가하는데 사용하였다. 또한 분석은 이 형태로 리간드 경쟁 분석으로서 사용될 수 있는데, 여기서 정제된 또는 부분 정제된 TIE 리간드는 수용체본체에 대한 고정화된 리간드와 경쟁한다. 결합 분석중 리간드 결합 및 경쟁 버전에서는, TIE-2 엑토도메인을 ELISA 플레이트 상에 코팅한다. 다음에 TIE 리간드(TL1-fFc 및 TL2-fFc)의 Fc 태그된 피브리노겐 유사 도메인 단편이 엑토도메인에 결합하고 상기한 바와 같은 동일한 항-사람 Fc 항체를 사용하여 검출할 수 있다. 도 20은 TIE-2 엑토영역에 결합하는 TL1-fFc의 예를 나타낸다. 또한 분석의 이 버전은 혈청 또는 다른 시료중 TL1-fFc의 정량적 수준에 사용될 수 있다. 태그되지 않은 (여기에서도 역시, 정제된 또는 비정제된) 리간드를 TL1-fFc와 동시에 가하면, 표지된 리간드 단편 및 전장 리간드 사이에서 경쟁이 시작된다. 전장 리간드를 Fc-태그된 단편으로 치환할 수 있고, 경쟁 곡선이 생긴다.
실시예 19 - EA.hy926 세포주는 TIE 리간드 활성에 대한 리포터 세포주로서 사용될 수 있다
EA.hy926은 인간 폐 암종-유래 세포주인 A549와 HUVEC의 융합에 의해 확립된 세포혼성주이다[Edgell, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 80, 3734-3737(1983)]. EA.hy926 세포가 낮은 수준의 기저 포스포티로신을 갖는 TIE-2 수용체 단백질의 유의한 수준을 발현한다는 것을 알았다. EA.hy926 세포가 리포터분석에 사용되기 전에 계대된 밀도 뿐만 아니라 분석할 때 컨플루언시의 정도가, 리간드에 의한 처리에 반응하는 TIE-2 수용체의 양 및 상대 유도도에 영향을 끼칠 수 있다. 이들 세포를 성장시키기 위해 다음 섭생법을 채택함으로써 EA.hy926 세포주는 TIE-2 리간드 활성의 분석을 위한 신뢰할 수 있는 시스템으로서 사용될 수 있다.
EA.hy926 세포를 T-75 플라스크(Falconware)에서 1.5×106 세포에서 접종하고 고 글루코스 Dulbecco's MEM, 10% 태아 소혈청, L-글루타민, 페니실린-스트렙토마이신 및 1× 하이포크산틴-아미놉테린-티미딘(HAT, Gibco/BRL)로 하루 걸러 재공급한다. 성장한지 3 내지 4일 후에, 세포를 다시 T-75 플라스크당 1.5×106 세포에서 1회 계대하고 3 내지 4일을 더 배양한다. 포스포릴화 분석을 위해, 상기한 대로 제조된 세포는 배양 배지를 고 글루코스 DMEM으로 치환하여 혈청 결핍시키고 37℃에서 2-3시간동안 인큐베이션하였다. 이 배지를 플라스크로부터 흡인하고 조절된 배지 또는 정제된 리간드의 시료를 전체 부피 1.5ml로 플라스크에 가하고 그 다음에 5분동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 플라스크를 배양기로부터 꺼내어 얼음층위에 놓았다. 배지를 제거하고 프로테아제 저해제 PMSF, 아프로티닌 및 류펩틴을 함유하는 1% 논이데트 P-40, 0.5% 나트륨데옥시콜레이트, 20mM 트리스, pH 7.6중 0.1% SDS, 150mM NaCl, 50mM NaF, 1mM 나트륨 오르토바나데이트, 5mM 벤즈아미딘 및 1mM EDTA를 포함하는 세포용해 완충액 1.25ml로 치환하였다. 막 가용화를 허용하기 위해 얼음위에서 10분이 지난 후에, 플레이트를 긁어내고 세포 용해물을 4℃에서 10분동안 최고 속도에서 미세원심분리로 정제하였다. TIE-2 수용체를 항-TIE-2 다클론성 항혈청 및 단백질 G-접합된 세파로스 비드로 냉각물에서 인큐베이션하여 정제된 상청액으로부터 면역침전시켰다. 비드를 냉 세포용해 완충액으로 3회 세척하고 램리(Laemmli) 시료 완충액에서 5분 비등시키고, 다음에 이것을 7.5% SDS-폴리아크릴아미드 겔상에 로딩하였다. 용해된 단백질을 PVDF(Lamblia-P) 막으로 전기이동시키고 나서 항-포스포티로신 항체 및 ECL 시약을 사용하여 웨스턴 블롯 분석을 하였다. 동일 블롯에 대한 전체 TIE-2 단백질 수준의 후속된 비교는 항-포스포티로신 항체를 스트리핑하고 TIE-2의 엑토영역에 특이적인 다클론성 항혈청으로 재인큐베이션함으로써 행하였다.
실시예 20 - 포유 동물 TIE 리간드-3을 코딩하는 전장 cDNA 클론의 분리 및 서열결정
유전자의 전체 암호화 서열에 대응하는 마우스 TL1 또는 마우스 TL2 프로브로 라이브러리 복제물을 혼성화함으로써 마우스 BAC 게놈 라이브러리(Research Genetics)로부터 TIE 리간드-3(TL3)을 클로닝하였다. 라이브러리의 각 복제물을 하룻밤 55℃에서 인산완충액을 사용하여 혼성화시켰다. 혼성화 후에, 필터를 60℃에서 2×SSC, 0.1% SDS를 사용하여 세척하고 나서 X선 필름을 필터에 노출시켰다. 마우스 TL1 및 마우스 TL2에 대응하는 강한 혼성화 신호를 확인하였다. 또한, 마우스 TL1 및 마우스 TL2 둘다에 대하여 약하게 혼성화하는 신호들을 확인하였다. 이들 클론에 대응하는 DNA를 정제하고 그 다음에 제한 효소로 분해한 후 원래의 프로브로 혼성화된 2개의 단편을 세균 플라스미드 내로 서브클로닝하고 서열결정하였다. 단편의 서열은 마우스 TL1 및 마우스 TL2 둘다에 대해 상동성을 갖는 2개의 엑손을 함유하였다. 이들 서열에 특이적인 프라이머를, TL3에 대응하는 전사물을 함유하는 조직을 동정하기 위한 PCR 프라이머로서 사용하였다. TL3에 대응하는 PCR 밴드를 람다 gt-11(Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA)에서의 마우스 자궁 cDNA 라이브러리에서 동정하였다.
플라크를 1.25×106/20×20cm 플레이트의 밀도에서 플레이팅하고 복제 필터를 다음 표준 방법으로 선택하였다(Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., page 8.46, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York). 한쌍의 복제 필터를 마우스 TL3 서열에 대해 작성한 200 bp PCR 방사성이 있는 프로브로 "정상" 긴축도(2×SSC, 65℃)에서 스크리닝하였다. 혼성화를 0.5mg/ml 연어정액 DNA 함유 용액에서 65℃에서 하였다. 필터를 65℃에서 2×SSC로 세척하고 X선 필름에 6시간동안 노출시켰다. 복제물로 혼성화된 2개의 양성의 클론을 선택하였다. 이들 클론으로부터 얻어진 파지 DNA의 EcoRI 분해는 약 1.2kb 및 약 2.2kb의 삽입물 크기를 갖는 2개의 독립된 클론을 나타내었다. 2.2kb EcoRI 삽입체를 pBluescript KS(Stratagene)의 EcoRI 부위로 서브클로닝하였다. 서열 분석은, 보다 긴 클론은 개시 메티오닌 및 신호 펩티드를 결핍하였지만 그외에는 마우스 TL1 및 마우스 TL2 둘다에 대해 상동성인 프로브를 코딩함을 나타내었다.
다음에 2개의 TL3-특이적 PCR 프라이머를 다음과 같이 합성하였다:
US2: cctctgggctcgccagtttgttagg
US1: ccagctggcagatatcagg
다음의 PCR 반응을 마우스 세포주 C2C12ras 및 MG87로부터 유래된 발현 라이브러리를 사용하여 수행하였다. 1차 PCR 반응에서, 특이적 프라이머 US2를 둘 중 어느 쪽 배향으로 증폭을 허용하기 위하여 벡터 특이적 올리고와 연결하여 사용하였다. PCR은 94℃, 1분; 42℃ 또는 48℃ 1분; 72℃, 1분의 35사이클을 사용하여 전체 부피 100ml로 하였다. 2차 PCR 반응은 제2의 특이적 프라이머인 US1를 포함하고, 이것은 동일한 벡터 올리고와 연결하여 1차 PCR 생성물내에 함유되어 있다. 2차 반응은 동일한 온도 및 상기한 시간을 사용하여 30 순환동안 하였다. PCR 생성물을 겔분리하고 서열 분석에 사용하였다. 2개의 상이한 cDNA 라이브러리를 사용하여 전체 4개의 독립적 PCR 반응으로부터 얻어진 서열에 기초하여 TL3 서열의 5' 말단을 추론해 내었다. 노던 분석으로 마우스 태반에서는 중간 내지 낮은 수준의 마우스 TL3 전사물이 존재함이 밝혀졌다. 마우스 TL3의 발현은 약 3kb의 전사물로 구성되었다. 전장 TL3 암호화 서열을 도 21에 기재한다.
다음에 마우스 TL3 서열을, 예를 들면 실시예 8(상기 참조)에 상기된 대로 마우스 TL3에 대응하는 프로브로 인간 게놈 또는 cDNA 라이브러리중 어느 한가지를 혼성화함으로써 인간 TL3의 암호화 서열을 함유하는 인간 클론을 얻는데 사용할 수 있다.
실시예 21 - 인간 TIE 리간드-4를 코딩하는 전장 게놈 클론의 분리
TL1의 전체 피브리노겐 암호화 서열에 대응하는 인간 TL1 방사성 프로브(도 4의 누클레오티드 1153 내지 1806) 또는 마우스 TL3의 피브리노겐 영역으로부터 186 누클레오티드의 절편에 대응하는 마우스 방사성 프로브(도 21의 뉴클레오티드 1307 내지 1492)중 어느 한가지로 라이브러리 복제물을 혼성화함으로써 마우스 BAC 게놈 라이브러리(BAC HUMAN(II)), Genome Systems Inc.)로부터 TIE 리간드-4(TL4)를 클로닝하였다. 각 프로브를 정확한 올리고뉴클레오티드 및 표준 PCR 조건을 사용하여 PCR에 의해 표지화하는데, 단 dCTP를 P32dCTP로 치환한 것만 다르게 하였다. 다음에 PCR 혼합물을 유리 P32dCTP로부터 프로브를 분리하기 위해 겔 여과 칼럼을 통과시켰다. 라이브러리의 각 복제물을 인산 완충액, 및 표준 혼성화 조건을 사용하여 하룻밤 55℃에서 방사성 프로브를 사용하여 혼성화하였다. 혼성화 후에, 필터를 55℃에서 2×SSC, 0.1% SDS를 사용하여 세척하고 나서 X선 필름에 노출시켰다. 인간 TL1에 대응하는 강한 혼성화 신호를 관찰하였다. 또한, 인간 TL1 및 마우스 TL3 둘다에 대해 약하게 혼성화하는 신호를 동정하였다. 이들 클론에 대응하는 DNA를 표준 방법을 사용하여 정제하고 그 다음에 제한 효소로 가수분해하고 원래의 프로브에 혼성화한 1개의 단편을 세균 플라스미드 내로 서브클로닝하고 서열결정하였다. 단편의 서열은 인간 TL1 및 마우스 TL3 둘다, 및 TIE 리간드 패밀리의 다른 구성원에 대해 상동성이 있는 1개의 엑손을 함유하였다. 이들 서열에 특이적인 프라이머를 TL4에 대응하는 전사물을 함유하는 조직을 동정하기 위하여 PCR 프라이머로서 사용할 수 있다. 인간 TL4의 완전한 서열은 기탁된 세균 세포에 포함된 완전한 BAC 클론을 서열결정함으로써 얻을 수 있다. 엑손은 TL1, TL2 및 TL3과 같은 TIE 리간드 패밀리의 공지된 구성원에 대한 상동성에 의해 확인할 수 있다. 다음에 TL4의 완전한 암호화 서열은, 이번에는 TL4 단백질을 제조하는데 사용될 수 있는 TL4 게놈 클론으로부터 엑손과 함께 접목시킴으로써 측정될 수 있다. 대안으로, 엑손은 완전한 길이의 cDNA 클론을 얻기 위한 프로브로서 사용될 수 있고, 다음에 이것은 TL4 단백질을 제조하는데 사용될 수 있다. 또한 엑손은 피브리노겐 영역, 감겨진 코일 영역, 또는 신호 펩티드 서열과 같은 단백질 신호와 같은 단백질 영역과 상동성인 BAC 클론 서열로부터 확인될 수 있다. BAC 클론으로부터의 누락된 엑손은, 인접하는 BAC 클론의 동정, 예를 들면 여기에 사용된 것과 같은 인간 게놈 라이브러리를 스크리닝하기 위한 프로브로서 기탁된 BAC 클론의 말단을 사용함으로써, cDNA 라이브러리를 스크리닝하기 위한 BAC 클론에 함유된 엑손 서열을 사용함으로써, 또는 TL4 엑손 서열에 의거한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하는 5' 또는 3' RACE 방법을 수행함으로써 얻을 수 있다.
추가의 TIE 리간드 패밀리 구성원의 동정
신규한 TIE 리간드-4 서열은, 공지된 패밀리 구성원 사이의 강한 상동성의 보존된 절편의 존재를 이용하는 접근을 사용하는 TIE 리간드 패밀리의 추가의 구성원에 대한 논리적인 조사에 사용될 수 있다. 예를 들면, TIE 리간드의 아미노산 서열의 얼라인먼트는 보존 서열의 몇 개의 영역(도 22의 박스 영역)을 나타낸다. 공지된 또는 신규한 TIE 리간드 상동성 절편과 조합하여 본질적으로 이들 박스에 기초한 축퇴성 올리고뉴클레오티드는 새로운 TIE 리간드를 동정하는데 사용될 수 있다.
TL1, TL2 및 TL3 중에서 고도로 보존된 영역은 cDNA를 사용하는 PCR 반응을 프라이밍하는 축퇴성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 설계하는데 사용될 수 있다. cDNA 주형은 올리고 d(T) 또는 다른 적당한 프라이머를 사용하여 조직 RNA의 역전사에 의해 생성될 수 있다. 다음에 PCR 반응물의 분취액을 아가로스 겔상에서 전기영동시킬 수 있다. 얻어진 증폭된 DNA 단편을 플라스미드로 삽입하고 서열결정하여 클로닝하고, DNA 서열을 모든 공지된 TIE 리간드의 것과 비교하였다.
이들 PCR 반응으로부터 크기에 따라 선택된, 증폭된 DNA 단편을 플라스미드 내로 클로닝하고, 일렉트로포레이션으로 대장균에 도입하고, 형질전환체를 선택 배지 한천상에 플레이팅한다. PCR 형질전환으로부터 세균 콜로니를 표준 플라스미드 방법에 의해 정제되는 플라스미드 DNA를 서열결정함으로써 분석할 수 있다.
신규한 TIE 리간드의 절편을 함유하는 클로닝된 단편을 cDNA 라이브러리로부터 전장 cDNA 클론을 얻기 위한 혼성화 프로브로서 사용할 수 있다. 예를 들면, 인간 TL4 게놈 서열을 상기한 바와 같은 인간 TL4에 대응하는 프로브로 인간 cDNA 라이브러리를 혼성화함으로써 사람 TL4의 완전한 암호화 서열을 함유하는 인간 cDNA 클론을 얻는데 사용할 수 있다.
실시예 22 - hTL4의 전체 암호화 서열의 클로닝
인간 TIE 리간드-4를 암호화하는 게놈 인간 TL-4 클론(hTL-4 ATCC 수탁번호 98095)으로부터의 5' 및 3' 둘다의 암호화 서열을 제한효소 분해, 서던 블롯팅 및 마우스 TL3으로부터 암호화 서열로의 hTL-4의 혼성화, 혼성화 단편을 서브클로닝하고 서열결정하여 얻었다. hTL4의 N-말단 및 C-말단 아미노산에 대응하는 암호화 서열을 차례로 인간 난소 cDNA로부터의 TL4의 PCR 증폭에 사용된 PCR 프라이머(하기 나타냄)를 설계하는데 사용하였다. PCR 밴드를 ABI 373A DNA 시퀀서 및 태크 Dideoxy Terminator Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA)를 사용하여 DNA 서열화함으로써 인간 TL4에 대응하는 것으로 확인하였다. 다음에 PCR 밴드를 벡터 pCR-스크립트로 서브클로닝하고 몇 개의 플라스미드 클론을 서열결정함으로써 분석하였다. 다음에 완전한 인간 TL4 암호화 서열을 컴파일링하고 도 23에 나타낸다. 본 발명의 다른 구체예에서, 위치 569에서의 누클레오티드는 A에서 G로 변경하여 Q에서 R로 변경된 아미노산을 얻는다.
상기한 바와 같이 사용된 PCR 프라이머를 다음과 같이 설계하였다:
hTL4atg 5'-gcatgctatctcgagccaccATGCTCTCCCAGCTAGCCATGCTGCAG-3'
hTL4not 5'-gtgtcgacgcggccgctctagatcagacTTAGATGTCCAAAGGCCGTATCATCAT-3'
소문자는 증폭된 PCR 단편의 클로닝을 용이하게 하기 위해 PCR 프라이머에 가해진 "꼬리" 서열을 나타낸다.
실시예 23 - 변형된 TIE 리간드의 구조 및 특성
TIE-2 리간드-1 및 TIE-2 리간드-2(TL1 및 TL2)의 유전적 분석을, 다수의 관찰된 특성을 알기 위해 수행하였다. 비록 TL1 및 TL2가 유사한 구조적 상동성을 갖지만, 이들은 상이한 물리적 및 생물학적 특성을 나타낸다. 두 리간드를 구별시키는 가장 두드러진 특징은, 이들이 둘 다 TIE-2 수용체에 결합하지만 TL1은 아고니스트인 반면 TL2는 길항제라는 것이다. 비환원 전기영동 조건하에서 두 단백질은 공유적 다량체 구조를 나타낸다. TL1은 디술피드 가교된 다량체, 1차 삼량체 및 어떤 이량체 종이 없는 더 고차의 종과의 혼합물로서 제조된다. 그러나, TL2는 거의 전적으로 이량체 종으로 제조된다. 또한 TL2가 대부분 발현 시스템에서 잘 제조되는 반면, TL1은 불량하게 발현되고 다량으로 제조하는 것이 어렵다. 마지막으로, 제조 및 정제 조건은 TL1을 아미노 말단 근처의 부위에서 단백질 분해성 절단에 의해 불활성화되게 하는 것으로 보인다. 이들 차이를 연구하기 위해, 몇가지 변형된 리간드를 다음과 같이 구성하였다.
23.1. 시스테인 치환 - 2개의 분자의 상이한 물리적 및 생물학적 특성에 기여할 수 있는 인자에 대한 조사에서 TL1의 피브리노겐 유사 영역에 선행하는 시스테인 잔기가 TL1에는 존재하지만 (도 4에서 CYS 265; 도 17에서 CYS 245) TL2에는 없다는, 즉 TL2에는 대응하는 시스테인 잔기가 없다는 것를 밝혔다. TL1의 CYS265 잔기는 TGC로 코딩되고 감겨진 코일과 피브리노겐 유사 영역 사이의 대략적인 접합부에서 약 뉴클레오티드 1102-1104(도 4 참조)에 위치해 있다. 시스테인 잔기가 일반적으로 디술피드 결합 형성에 관련되기 때문에, 그 존재는 분자의 3차 구조 및 생물학적 특성 둘다에 기여할 수 있고, TL1의 CYS265 잔기의 존재는 2개의 분자의 상이한 특성에 적어도 부분적으로 기여한다고 생각되었다.
이 가설을 시험하기 위해, CYS(도 4에서 잔기 265; 도 17에서 잔기 245)를 디술피드 결합을 형성하지 않는 아미노산(세린)으로 치환한 TL1의 돌연변이를 함유하는 발현 플라스미드를 구성하였다. 이 TL1/CYS-돌연변이체 이외에, TL2의 대략적으로 대응하는 위치(도 17에서 Met247)의 잔기를 시스테인이 되도록 돌연변이시키는 제2의 발현 플라스미드를 구성하였다. TL1 및 TL2의 돌연변이되지 않은 및 돌연변이된 발현 플라스미드 둘다를 COS7 세포로 일시적으로 트랜스펙션시키고, 재조합 단백질을 함유하는 세포 상청액을 수확하고 시료를 환원 및 비환원 둘다의 SDS/PAGE 전기영동시킨 후 웨스턴 블롯팅시켰다.
도 18은 돌연변이되지 않은 및 돌연변이된 TL1 및 TL2 단백질 둘다의 비환원 조건하에서의 웨스턴 블롯을 나타내고, 이것은 TL1/CYS-돌연변이체는 다분히 TL2 같이 이량체로서 전개되고 TL2/CYS+돌연변이체는 더 TL1에 유사하게, 삼량체 뿐만 아니라 고차순의 멀티머를 형성할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 두 돌연변이체 단백질을 TIE-2 발현 세포에서의 인산화를 유발하는 그 능력에 대해 시험하였을 때, TL1/CYS-돌연변이체는 TIE-2 수용체를 활성화할 수 있었던 반면, TL2/CYS+ 돌연변이체는 할 수 없었다.
따라서, TL1의 시스테인 잔기(도 4에서 잔기 265; 도 17에서 잔기 245)가 유전학적으로 세린으로 변경되었을 때, TL1의 공유구조가 TL2의 것, 즉 1차 이량체와 유사해진다는 것을 알았다. 변형된 TL1 분자는 여전히 아고니스트로서 행동하므로, 삼량체 및/또는 고차순의 멀티머 구조는 TL1에 활성화 능력을 주는 결정 인자는 아니었다. 시스테인의 제거로 많은 원하는 특성을 갖는 분자를 제조할 수 있었지만, TL1의 생산 수준은 개선되지 않았다.
23.2. 영역 결실 - TL1 및 TL2를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 성숙한 단백질의 아미노산 서열에 의거하여 3개의 도메인으로 나누어질 수 있는 발생 구조를 공유한다. 각 성숙한 단백질의 마지막의 대략 215 아미노산은 6개의 시스테인을 함유하고 피브리노겐의 도메인에 대한 강한 유사성을 갖는다. 따라서 이 도메인을 "피브리노겐 유사" 도메인 또는 "F-도메인"이라고 나타내었다. 대략 205 잔기를 함유하는 성숙한 단백질의 중심 도메인은 "감겨진 코일" 구조를 가질 수 있는 높은 가능성을 갖고 "감겨진 코일" 도메인 또는 "C-도메인"이라고 나타내었다. 성숙한 단백질의 아미노 말단 약 55 잔기는 2개의 시스테인을 함유하고 감겨진 코일 구조를 갖을 낮은 가능성을 가졌다. 이 도메인은 "N-말단" 도메인 또는 "N-도메인"이라고 나타내었다. 여기에 기재된 변형된 리간드는 약자를 사용하여 나타내는데, N=N-말단 영역, C=감겨진 코일 영역, F=피브리노겐 유사 도메인 및 숫자 1 및 2는 각각 TL1 및 TL2로 언급한다. 따라서 1N은 TL1로부터의 N-말단 도메인을 나타내고, 2F는 TL2 의 피브리노겐 유사 도메인을 나타내는 등이다.
TIE-2 리간드의 피브리노겐 유사 영역(F-도메인)이 TIE-2 활성화 활성을 함유했는지의 여부를 시험하기 위해, 감겨진 코일 및 N-말단 영역을 결실하고 단지 F-도메인을 코딩하는 DNA 서열 부분만을 남긴 발현 플라스미드를 구성하였다(TL1에 대해, 도 4의 약 뉴클레오티드 1159, 아미노산 잔기 ARG284에서 시작하여; TL2에 대해, 도 6의 약 뉴클레오티드 1200, 아미노산 잔기 282에 대응하여). 그 후 이 돌연변이체 구조를 일시적으로 COS 세포로 트랜스펙션 시켰다. 재조합 단백질을 함유하는 상청액을 수확하였다. TL1/F-도메인 돌연변이체를 TIE-2 수용체를 결합하는 그 능력에 대해 시험하였다. 결과는 단량체로서, TL1/F-도메인 돌연변이체가 검출가능한 수준으로 TIE-2를 결합할 수 없다는 것을 나타냈다.
그러나, TL1/F-도메인 모노머가 myc-태그되고 이어서 myc 표지에 대해 조절된 항체로 밀집되었을 때, TIE-2에의 검출가능한 결합을 나타내었다. 그러나, 항체-밀집된 TL1/F-도메인 돌연변이체는 TIE-2 발현 세포주에서 인산화를 유발할 수 없었다.
따라서, TIE-2 리간드의 F-도메인은 수용체를 결합하는데 관련되나 F-도메인만으로 이루어진 절단물은 수용체 결합에 충분하지 않다는 것을 측정하였다. 이것은 감겨진 코일이 수용체 결합에 필수적일 수 있는 몇몇 피브리노겐 유사 영역과 함께 유지하는데 가여하는 가능성을 증가시켰다. 이 가설을 확인하기 위한 시도로서, F-도메인을 인간 항체 IgG1의 Fc 섹션과 융합하였다. Fc 섹션은 포유류 세포에 의한 발현시에 이량체화하기 때문에, F-도메인의 이론적 배치를 모방한 이들 재조합 단백질은 이량체화하기 위한 천연 리간드였다. 이 F-도메인-Fc 구조는 결합하였으나 수용체를 활성화하는데는 실패하였다. 명백하게, 리간드의 다른 도메인에 의해 초래된 다량체화는 리간드를 TIE-2 수용체에 결합시키는데 필수적이다. 또한, F-도메인 이외의 몇몇 다른 인자가 수용체의 인산화에 기여해야 한다.
다음에, 피브리노겐 유사 영역을 결실하여 단지 N-말단 및 감겨진 코일 영역만 함유하는 돌연변이체를 구성하였다. 이들은 수용체에 결합할 수 없었다. 수용체 결합 및 활성화에서의 N-말단 도메인의 역할을 평가하기 위해, 리간드를 이들의 C- 및 F-도메인으로 절단하고 N-말단에서 FLAG 태그로 태그하여 FLAG-1C1F 및 FLAG-2C2F로 불리는 구성체를 제조하였다. 이들 분자가 TIE-2 수용체를 발현하기 위해 일시적으로 트랜스펙션된 COS7 세포에서 강하게 착색되었지만, 이들은 인산화 분석에 반응하는데 실패하였다. 따라서, N-도메인은 비록 수용체 활성화를 위한 필수 인자를 함유하지만, 하기하는 바와 같이, 수용체를 활성화하는 키메릭 분자 2N2C1F의 능력은, 불활성 리간드의 N-도메인 조차 그 역할을 만족할 수 있다는 것을 나타낸다.
상기한 myc-태그된 F-도메인 절단 및 Fc-태그된 F-도메인 절단 사이의 행동 차이는 TIE 리간드가 이량체 또는 고차수의 멀티머 형태로만 단지 결합할 수 있다는 것을 시사한다. 실제로, 비환원 SDS-PAGE는 TIE 리간드가 이량체, 삼량체 및 멀티머 형태로 자연적으로 존재한다는 것을 나타내었다. FLAG-1C1F 및 FLAG-2C2F 절단은 합성 태그에 의한 이량체화 없이 TIE-2 수용체에 결합할 수 있는 반면, F 절단은 할 수 없다는 것은, C-도메인이 F-도메인의 결합에 적어도 부분적으로 책임이 있다는 것을 시사한다.
23.3. 스와핑 구성체(키메라):
출원인은 COS7 세포의 TL1 제조수준이 TL2의 제조보다 약 10배가 낮다는 것을 주목하였다. 따라서, 이 차이를 설명하고 또한 TL2의 길항제 활성과 비교한 TL1의 아고니스트 활성을 더 특성화결정는 시도로 TL1 및 TL2의 키메라를 구성하였다.
N-말단 영역 또는 피브리노겐 영역을 TL1과 TL2 사이에서 교환한 4개의 키메라를 구성하고, 상기한 용어를 사용하여 나타내는데, 예를 들면 1N1C2F는 TL2로부터의 피브리노겐 유사 영역과 함께 TL1로부터의 N-말단 및 감겨진 코일 영역을 갖는 키메라를 지칭한다. 4개의 키메라는 다음과 같이 구성되었다:
키메라 1 - 1N1C2F
키메라 2 - 2N2C1F
키메라 3 - 1N2C2F
키메라 4 - 2N1C1F
키메라 1-4의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 각각 도 24-27에 나타낸다.
각 키메라를 별개의 발현 벡터 pJFE14로 삽입하였다.
다음에, 콘트롤로서 빈 pJFE14 벡터, 천연 TL1 및 천연 TL2로 키메라를COS7 세포로 트랜스펙션 시키고, 배양 상청액을 수집하였다.
스와핑이 리간드의 발현수준에 어떤 영향을 끼치는지를 측정하기 위해, COS7 상청액의 1:5 희석 및 1:50 희석을 니트로셀룰로스에 도트-블롯팅하였다. TL1 N-도메인(즉, 천연 TL1, 1N2C2F 및 1N1C2F)을 함유한 3개의 리간드를 TL1의 N-말단에 특이적인 토끼 항체로 프로브화하였다. TL2 N-도메인(즉, 천연 TL2, 2N1C1F 및 2N2C1F)을 함유하는 3개의 리간드를 TL2의 N-말단에 특이적인 토끼 항체로 프로브화하였다. 결과는 COS7 세포는, 나머지 단백질의 구성과 무관하게 TL1 N-도메인을 함유하는 어떤 분자 수준보다 약 10배로 TL2의 N-도메인을 함유하는 어떤 분자를 발현한다는 것을 입증하였다. 결론은 N-도메인이 리간드의 발현수준을 주로 제어해야 한다는 것이었다.
연구된 다음 문제는 키메라의 TIE-2 수용체를 활성화하는 능력 또는 무능력이었다. EAhy926 세포를 4개의 키메라 뿐만 아니라 인산화에 대한 양성 대조군으로서 TL1 및 인산화를 위한 음성 대조군으로서 TL2 또는 빈 pJFE14-트랜스펙션된 COS7 세포 상청액으로 처리하였다. 세포를 용해하고, TIE-2 수용체를 세포 용해물로부터 면역침전시키고 SDS-PAGE 상에서 전개하였다. 시료를 웨스턴 블롯팅하고 인산화된 어떤 수용체를 검출하기 위한 안티-포스포티로신 항체로 프로브화하였다. 놀랍게도, TL1 피브리노겐 유사 영역을 함유하는 구조(2N1C1F 및 2N2C1F)만이 TIE-2 수용체를 인산화화할 수 있었다. 따라서, TL1의 N-말단 영역이 활성에 본질적이더라도, TL2의 N-말단 영역으로 치환될 수 있고, 즉 리간드가 아고니스트 또는 길항제인지를 결정하는 정보는 실제 피브리노겐 유사 도메인에 포함되는 것이다.
따라서 TIE-2 수용체의 결합 이외에 F-도메인은 TL1의 인산화 활성에 책임이 있다는 것을 측정하였다. 더욱이, 변경하지 않으면 불활성 분자인 TL2를, 그 F-도메인을 TL1 F-도메인으로 치환함으로써 변경하였을 때, 변경된 TL2는 아고니스트로 작용하였다.
그러나, 2N1C1F 구조는 어느정도 보다 강력하였다. 키메라 2N1C1F로 인한 신호는 키메라 2N2C1F의 것보다 약간 강하게 나타나 TL1의 C-도메인은 인산화에 결정적이지는 않지만 TL1의 효능을 증강시킬 수 있다고 생각되었다. 그러나, 인산화 분석에 사용된 시료가 리간드의 농도면에서 표준화되지 않았기 때문에 보다 강한 인산화 신호가 단지 많은 리간드의 존재를 나타내었을 수도 있었다. 따라서 인산화 분석을 활성 키메라가 상이한 효능을 표시하는지의 여부를 결정하기 위해 리간드의 다양한 양으로 반복하였다. 리간드 트랜스펙션의 COS7 상청액 중의 리간드 농도를 상기한 방법(Stitt, T.N., et al. (1995) Cell 80: 661-670)에 따라 BIAcore 바이오센서 기술을 통해 측정하였다. BIAcore는 공명단위(RU)로 불리워지는 임의의 단위로 TIE-2 수용체에의 상청액의 결합활성을 측정하였다. RU와 리간드 농도 사이의 매우 양호한 상관관계가 일반적으로 관찰되었는데, 상청액 mL당 단백질 약 1μg에 대응하는 400 RU의 활성이었다. 시료를 각각 100 RU, 20 RU 및 5 RU의 농도로 희석하고 인산화 분석을 반복하였다. 결과는 키메라 2N2C1F가 동일한 농도에서 천연 TL1 또는 키메라 1N1C2F중 어느 한가지 보다 더 확실하게 강력하다는 것을 입증하였다.
이들 교환 구성체의 다른 관심의 양태는 그 발현수준에 있다. 4개의 키메라 각각을 COS 세포에서의 그 생산수준, TIE-2에 결합하는 그 능력 및 TIE-2를 포스포릴화하는 그 능력에 대해 시험하였다. 이들 실험 결과는, 키메라 1 및 3이 TL1와 유사한 수준으로 제조되고, 반면 키메라 2 및 4가 TL2와 유사한 수준으로 제조되었음을 나타냈다. 따라서 단백질 제조의 고수준은 TL2 N-말단 도메인과 상관관계가 있었다. 또한, 내피세포층 EAhy926 세포 상에서 시험하였을 때, 키메라 2 및 4는 활성이고, 반면 1 및 3은 활성이 아니었다. 따라서 활성(수용체의 인산화)은 TL1 피브리노겐 유사 도메인과 상관관계가 있다. 키메라 2 및 4 각각은 고 생산수준 뿐만 아니라 아고니스트 활성의 원하는 특성을 가졌다.
23.4. 단백질 분해 내성의 구성체 - TL1 제조의 다량 분획은 종종 N-말단 근처에서 단백질 분해로 절단된다는 관찰에 기초하여, 성숙한 단백질의 위치 49에 위치한 아르기닌 잔기(도 17 참조)가 생체내에서의 단백질 활성의 조절에 관련될 수 있는 후보 절단부위이고 이 아르기닌의 세린(R49-->S)으로의 치환은 그 활성에 영향을 끼치지 않고 단백질 안정성을 증가시킬 수 있을 것으로 제안하였다. 그러한 TL1의 돌연변이체를 구성하여 천연 TL1만큼 활성이라는 것으로 밝혀졌지만, 단백질 분해 절단에 대한 내성은 나타내지 않았다.
23.5. 조합 돌연변이체 - 키메라 구조 중 가장 강력한 2N1C1F를 도 27에 나타낸 뉴클레오티드 784-787에 의해 암호화된 시스테인을 세린으로 전환되도록 추가적으로 변경시켰다. 이 분자(2N1C1F(C246S))는 양호하게 발현되었고 수용체를 강력하게 활성화하고 단백질 분해절단에 대한 내성이 있고 고차수의 멀티머 보다 주로 이량체였다. 따라서 2N 도메인은 분자에 프로테아제 내성을 주는 것으로 보인다. 최종적으로, 이 분자는 도 27에 나타낸 뉴클레오티드 199-201에 의해 암호화된 잠재적인 프로테아제 민감 부위를 제거하기 위해 더 변경되어, 활성화되고 양호하게 발현되고 이량체이고 프로테아제 내성이 있다고 기대되는 분자(2N1C1F(R51->S, C246->S))를 얻었다.
표 1은 TIE-2 수용체에 결합하는 능력, TIE-2 수용체를 활성화하는 능력, 형성된 구조 유형(단량체, 이량체 등) 및 그 관련 생산수준 면에서 변형된 TIE-2 리간드 구성체의 각각을 제조하고 특성결정한 것을 요약하고 있다. 비변형된 TL1(무늬 없음) 및 TL2(줄무늬)가 박스로서 나타낸 3개의 도메인으로 나타낸다. 따라서 줄무늬 박스는 TL2로부터의 도메인을 나타낸다. 성숙한 TL1 단백질의 위치 245에 위치한 시스테인은 "C"로 나타낸다. "C"를 지나는 "X"는 시스테인 잔기가 어떤 아미노산으로 치환된 것을 나타내고, 예를 들면 TL1 CYS-돌연변이체를 나타낸다. 유사하게, 마지막 구조에서의 "R"을 지나는 "X"는 성숙한 TL1 단백질의 위치 49에서의 Arg 잔기의 치환을 나타낸다. "C"는 TL2 CYS+ 돌연변이체를 나타내는 한 변형된 TL2 구조에 존재한다. 또한 Fc 꼬리 또는 플래그 태그를 갖는 구조도 나타낸다.
여기에서의 교시에 의거하여, 당업자는 변경된 특성을 갖는, 추가의 변형된 그리고 키메릭 TIE-2 리간드를 얻기 위해 다른 구성체가 제조될 수 있다는 것을 쉽게 알 수 있다. 예를 들면, 인간 항체 IgG1의 Fc 섹션과 융합한 TL1의 F-도메인 및 TL2의 N-말단 도메인을 포함하는 구성체를 제조할 수 있다. 이 구성체는 TIE-2 수용체를 결합하고 활성화할 것으로 기대된다. 유사하게, 다른 구성체는 본문에서의 교시를 사용하여 생산할 수 있고 본 발명의 범위내에 있는 것으로 생각된다.
23.6. 재료 및 방법
키메라의 구성
Xbal 부위가 Ascl 부위로 변경된 pJFE14 벡터로 스와핑 구조를 삽입하였다. 다음에 이 벡터를 Ascl 및 Notl로 가수분해하여 Ascl-Notl 골격을 얻었다. 적당한 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PCR에 의해 키메라에 대한 DNA 단편을 생성하였다.
FLAG-1C1F 및 FLAG-2C2F 삽입체를 EcoRI 및 Notl로 분해된 pMT21 벡터 골격 내로 서브클로닝하였다. "CF" 절단물을 PCR을 통해 얻고 FLAG 태그 및 선행 트립신 신호화 서열을 합성 올리고뉴클레오티드를 어닐링함으로써 구성하였다.
트랜스펙션
모든 구성체를 표준 프로토콜에 따라 DEAE-덱스트란 또는 리포펙트아민중 어느 한가지를 사용하여 COS7 세포로 일시적으로 트랜스펙션시켰다. 세포 배양액을 트랜스펙션 한지 3일 후에 수확하고 1분동안 1000rpm에서 원심분리하고, 상청액을 새로운 튜브로 옮기고 -20℃에서 보관하였다.
FLAG-1C1F-트랜스펙션 및 FLAG-2C2F-트랜스펙션된 세포의 염색
6-웰 디쉬의 COS7 세포를 TIE-2 수용체로 일시적으로 트랜스펙션 시켰다. 다양한 리간드 트랜스펙션 으로부터 COS7 상청액을 30분동안 세포에서 인큐베이션하고 난 후, 마그네슘 또는 칼슘이 없는 인산 완충액 식염수(PBS)로 2회 세척하였다. 세포를 3분동안 -20℃에서 메탄올에서 고정하고 PBS로 1회 세척하고 30분동안 PBS/10% 소 송아지 혈청(BCS)중의 항-FLAG M2 항체(IBI;1:3000 희석)로 인큐베이션하였다. 세포를 PBS로 1회 세척하고 PBS/10% BCS중의 염소 항-마우스 IgG 알칼리성 포스파타제(AP) 접합된 항체(Promega; 1:1000)로 인큐베이션하였다. 세포를 PBS로 2회 세척하고 인산염 기질, BCIP/NBT, 1mM 레바미솔로 인큐베이션하였다.
인산화 분석
투여량 반응 연구를 위한 COS7 상청액의 희석을 빈 벡터 pJFE14로 트랜스펙션된 COS7 세포의 상청액으로 수행하였다. TIE-2 수용체를 자연적으로 발현하는 EA 세포를 혈청없는 배지에서 >2시간동안 결핍시킨 후 5% CO2의 분위기하에서 37℃에서 10분동안 적당한 COS7 상청액으로 처리하였다. 다음에 세포를 얼음 냉각된 PBS로 세정하고 프로테아제 저해제(10μg/ml 류펩틴, 10μg/ml 아프로티닌, 1mM PMSF)를 함유하는 1% NP40 세포용해 완충액으로 세포용해한 후, TIE-2 수용체에 특이적인 항체로 면역침전시켰다. 다음에 시료를 항 pTyr 항체를 사용하여 면역블롯 분석을 행하였다.
도트 블롯
시료를 니트로셀룰로스 막에 도포하고 이것을 적당한 항체로 차단하고 프로브화하였다.
23.7. CHO 및 바큘로바이러스 감염된 곤충 세포로부터 키메라 TIE-2 리간드의 제조
바이러스 제조
상기한 방법(O'Reilly, D.R., L.K. Miller, and V.A. Luckow, Baculovirus Expression Vectors - A Laboratory Manual 1992, New York: W.H. Freeman)을 사용하여, (2NAC1F (C246S)로 표시되는) 키메라 리간드에 대한 유전자를 바큘로바이러스 발현 플라스미드 내로 조작하고 바이러스 DNA로 재조합하여 재조합 바큘로바이러스를 생성하고 증폭하고 수확하였다. Invitrogen으로부터 얻어진 SF21 곤충세포(Spodoptera frugiperda)를 Gibco SF900 II 혈청없는 배지에서 27℃에서 적응시키고 확장시켰다. 감염되지 않는 세포를 1×106세포/mL의 밀도로 성장시켰다. 세포 밀도를 헤마시토미터를 사용하여 생존가능한 세포를 계수함으로써 측정하였다. 리간드에 대한 바이러스 스톡을 저 다중성 0.01-0.1PFU/세포에서 생물반응조에 가하여 감염을 개시시켰다. 감염 공정을 실질적 세포용해를 초래하지 않고 최대 바이러스 복제를 허용하는 3-4일동안 계속하였다. 세포 현탁액을 멸균한 원심분리기 병으로 무균으로 분액화하고 세포를 원심분리(1600 RPM, 30분)로 제거하였다. 세포없는 상청액을 멸균한 병에 수집하고 나중에 사용할 때까지 4℃ 암소에서 보관하였다.
바이러스 역가를 O'Reilly, Miller and Luckow에 기재된 대로 플라크 분석으로 측정하였다. 방법을 1.5×106 세포로 시딩한 60mm 조직-배양 디쉬에서 수행한다. 바이러스 스톡의 일련의 희석을 부착된 세포에 가하고 혼합물을 흔들면서 인큐베이션하여 바이러스를 개개의 세포로 흡착시킨다. 한천 오버레이를 가하고 플레이트를 27℃에서 5일동안 배양한다. 생존가능한 세포를 계수한 원형 플라크를 나타내는 중성 레드로 착색화하여 밀리리터당 플라크 형성단위로 발현된 바이러스 역가(titer) (PFU/mL)를 얻었다.
단백질 제조를 위한 세포의 감염
비감염 SF21 세포를 조직배양 플레이트에서 성장시키고 키메릭 리간드 유전자를 함유하는 바이러스를 1-10pfu/세포로 가하였다. 바이러스를 온화하게 흔들면서 27℃에서 90분동안 흡착시키고 그 후에 세포를 Sf-900 II 혈청 없는 배지의 새로운 양으로 재공급하였다. 27℃에서의 성장을 한지 3일 후에, 조직 배양 유액을 수확하고 리간드를 면역블롯팅으로 검출하였다.
TIE-2 리간드 키메라의 CH0 발현
TIE-2 리간드 키메라를 pJFE, pcDNA3, pMT21, pED 또는 다른 것을 포함하는(그러나 이에 제한되지 않는) 몇몇 포유류 세포 발현벡터중 어떤 것으로 클로닝하였다. 플라스미드를 인산칼슘 침전 또는 양이온성 리포솜에 의해 CHO DG44 세포로 트랜스펙션 시켰다(Urlaub, G. and Chasin, L.A. 1980.. Isolation of Chinese hamster cell mutants deficient in dihydrofolate reductase activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77:4216-4220; Urlaub, G., Kas, E., Carethers, A.M., and Chasin, L.A. 1983. Deletion of the diploid dihydrofolate locus from cultured mammalian cells. Cell 33: 404-412). dhfr 선택가능한 마커가 결핍된 벡터의 경우에, 플라스미드 pSV2.dhfr을 TIE 리간드 키메라를 함유하는 플라스미드로 20% 몰비에서 공동 트랜스펙션 시켰다. DHFR+ 세포를 선택 배지(누클레오시드 및 누클레오티드가 결핍되고, 10% 투석된 태아 소혈청을 함유한 배지)에서 성장시켜 선택하고 클론을 TIE-2 수용체본체로 면역블롯팅함으로써 키메릭 TIE-2 리간드의 제조에 대하여 스크리닝하였다. 원하는 단백질을 발현하는 클론을 선택 배지에서 메토트렉세이트의 등급화된 농도를 사용하여 여러 횟수의 유전자 증폭을 하였고 발현 클론을 유사한 면역블롯팅 기술에 의해 유전자 증폭한 후에 동정하였다.
키메릭 TIE 리간드를 발현하는 세포주를 선택 배지 또는 선택물이 결핍된 배지에서 단층, 현탁액 플라스크, 롤러병 및 생물반응로에서 배양하였고 혈청없는 배지 조제물에서 성장시킬 수 있다.
기탁
다음은 부다페스트 조약에 따라, 아메리칸 타입 컬춰 콜렉션(ATCC), 12301 파크로운 드라이브, 록빌, 메릴랜드 20852에 기탁되었다. TIE-2 리간드를 암호화하는 플라스미드 클론은 1994년 10월 7일에 ATCC와 함께 기탁되었고 그리고 ATCC 수탁번호 75910 하에 "TIE-2 리간드를 암호화하는 pJFE14"로 지칭되었다. TIE-2 수용체본체를 암호화하는 재조합형 Autographa californica 베콜로바이러스는 1994년 10월 7일에 ATCC와 함께 기탁되었고 ATCC 수탁번호 VR2484 하에 "vTIE-2 수용체본체"로 지칭되었다. 인간 tie-2 리간드 DNA를 함유하는 람다 파지 벡터는 1994년 10월 26일에 ATCC와 함께 기탁되었고 ATCC 수탁번호 75928 하에 "htie-2 리간드 1을 암호화하는 Igt10"으로 지칭되었다. 두번째 TIE-2 리간드를 암호화하는 플라스미드 클론은 1994년 12월 9일에 ATCC와 함께 기탁되었고 ATCC 수탁번호 75963 하에 "인간 TIE 2 리간드 2를 암호화하는 pBluescript KS"로 지칭되었다. 인간 TIE 리간드-4를 암호화하는 인간 TL-4 유전자 삽입체와 함께 플라스미드 pBeLoBac11을 함유하는 대장균 균주 DH10B는 1996년 7월 2일에 ATCC와 함께 기탁되었고 ATCC 수탁번호 98095 하에 "hTL-4"로 지칭되었다.
본 발명은 여기서 기술된 특정 구체예에 의해 한정되지는 않는다. 실제로, 여기서 기술된 것들 이외에 본 발명의 다양한 변형이 전술 및 동반도면으로부터 당업자에게 자명해질 것이다. 그와 같은 변형은 첨부된 청구범위의 범주안에 들어가게 할 의도이다.
<110> REGENERON PHARMACEUTICALS, INC. <120> MODIFIED TIE-2-RECEPTOR LIGANDS <130> 1 <150> US 60/022,999 <151> 1996-08-02 <150> US 08/740,223 <151> 1996-10-25 <160> 19 <170> KOPATIN 1.0 <210> 1 <211> 2149 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (310)..(1803) <400> 1 cagctgactc aggcaggctc catgctgaac ggtcacacag agaggaaaca ataaatctca 60 gctactatgc aataaatatc tcaagtttta acgaagaaaa acatcattgc agtgaaataa 120 aaaattttaa aattttagaa caaagctaac aaatggctag ttttctatga ttcttcttca 180 aacgctttct ttgaggggga aagagtcaaa caaacaagca gttttacctg aaataaagaa 240 ctagttttag aggtcagaag aaaggagcaa gttttgcgag aggcacggaa ggagtgtgct 300 ggcagtaca atg aca gtt ttc ctt tcc ttt gct ttc ctc gct gcc att ctg 351 Met Thr Val Phe Leu Ser Phe Ala Phe Leu Ala Ala Ile Leu 1 5 10 act cac ata ggg tgc agc aat cag cgc cga agt cca gaa aac agt ggg 399 Thr His Ile Gly Cys Ser Asn Gln Arg Arg Ser Pro Glu Asn Ser Gly 15 20 25 30 aga aga tat aac cgg att caa cat ggg caa tgt gcc tac act ttc att 447 Arg Arg Tyr Asn Arg Ile Gln 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Gly Asn Glu Lys Gln 385 390 395 aac tat agg ttg tat tta aaa ggt cac act ggg aca gca gga aaa cag 1551 Asn Tyr Arg Leu Tyr Leu Lys Gly His Thr Gly Thr Ala Gly Lys Gln 400 405 410 agc agc ctg atc tta cac ggt gct gat ttc agc act aaa gat gct gat 1599 Ser Ser Leu Ile Leu His Gly Ala Asp Phe Ser Thr Lys Asp Ala Asp 415 420 425 430 aat gac aac tgt atg tgc aaa tgt gcc ctc atg tta aca gga gga tgg 1647 Asn Asp Asn Cys Met Cys Lys Cys Ala Leu Met Leu Thr Gly Gly Trp 435 440 445 tgg ttt gat gct tgt ggc ccc tcc aat cta aat gga atg ttc tat act 1695 Trp Phe Asp Ala Cys Gly Pro Ser Asn Leu Asn Gly Met Phe Tyr Thr 450 455 460 gcg gga caa aac cat cga aaa ctg aat ggg ata aag tgg cac tac ttc 1743 Ala Gly Gln Asn His Arg Lys Leu Asn Gly Ile Lys Trp His Tyr Phe 465 470 475 aaa ggg ccc agt tac tcc tta cgt tcc aca act atg atg att cga cct 1791 Lys Gly Pro Ser Tyr Ser Leu Arg Ser Thr Thr Met Met Ile Arg Pro 480 485 490 tta gat ttt tgaaagcgca atgtcagaag cgattatgaa agcaacaaag 1840 Leu Asp Phe 495 aaatccggag aagctgccag gtgagaaact gtttgaaaac ttcagaagca aacaatattg 1900 tctcccttcc accaataagt ggtagttatg tgaagtcacc aaggttcttg accgtgaatc 1960 tggagccgtt tgagttcaca agagtctcta cttggggtga cagtgctcac gtggctcgac 2020 tatagaaaac tccactgact gtcgggcttt aaaaagggaa gaaactgctg agcttgctgt 2080 gcttcaaact actactggac cttattttgg aactatggta gccagatgat aaatatggtt 2140 aatttc 2146 <210> 4 <211> 497 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Thr Val Phe Leu Ser Phe Ala Phe Leu Ala Ala Ile Leu Thr His 1 5 10 15 Ile Gly Cys Ser Asn Gln Arg Arg Ser Pro Glu Asn Ser Gly Arg Arg 20 25 30 Tyr Asn Arg Ile Gln His Gly Gln Cys Ala Tyr Thr Phe Ile Leu Pro 35 40 45 Glu His Asp Gly Asn Cys Arg Glu Ser Thr Thr Asp Gln Tyr Asn Thr 50 55 60 Asn Ala Leu Gln Arg Asp Ala Pro His Val Glu Pro Asp Phe Ser Ser 65 70 75 80 Gln Lys Leu Gln His Leu Glu His Val Met Glu Asn Tyr Thr Gln Trp 85 90 95 Leu Gln Lys Leu Glu Asn Tyr Ile Val Glu Asn Met Lys Ser Glu Met 100 105 110 Ala Gln Ile Gln Gln Asn Ala Val Gln Asn His Thr Ala Thr Met Leu 115 120 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cacagccctc 120 ccaagtgagc aggactgttc ttcccactgc aatctgacag tttactgcat gcctggagag 180 aacacagcag taaaaaccag gtttgctact ggaaaaagag gaaagagaag actttcattg 240 acggacccag ccatggcagc gtagcagccc tgcgtttcag acggcagcag ctcgggactc 300 tggacgtgtg tttgccctca agtttgctaa gctgctggtt tattactgaa gaaaga 356 atg tgg cag att gtt ttc ttt act ctg agc tgt gat ctt gtc ttg gcc 404 Met Trp Gln Ile Val Phe Phe Thr Leu Ser Cys Asp Leu Val Leu Ala 1 5 10 15 gca gcc tat aac aac ttt cgg aag agc atg gac agc ata gga aag aag 452 Ala Ala Tyr Asn Asn Phe Arg Lys Ser Met Asp Ser Ile Gly Lys Lys 20 25 30 caa tat cag gtc cag cat ggg tcc tgc agc tac act ttc ctc ctg cca 500 Gln Tyr Gln Val Gln His Gly Ser Cys Ser Tyr Thr Phe Leu Leu Pro 35 40 45 gag atg gac aac tgc cgc tct tcc tcc agc ccc tac gtg tcc aat gct 548 Glu Met Asp Asn Cys Arg Ser Ser Ser Ser Pro Tyr Val Ser Asn Ala 50 55 60 gtg cag agg gac gcg ccg ctc gaa tac gat gac tcg gtg cag agg ctg 596 Val Gln Arg Asp Ala Pro Leu Glu Tyr Asp Asp Ser Val Gln Arg Leu 65 70 75 80 caa gtg ctg gag aac atc atg gaa aac aac act cag tgg cta atg aag 644 Gln Val Leu Glu Asn Ile Met Glu Asn Asn Thr Gln Trp Leu Met Lys 85 90 95 ctt gag aat tat atc cag gac aac atg aag aaa gaa atg gta gag ata 692 Leu Glu Asn Tyr Ile Gln Asp Asn Met Lys Lys Glu Met Val Glu Ile 100 105 110 cag cag aat gca gta cag aac cag acg gct gtg atg ata gaa ata ggg 740 Gln Gln Asn Ala Val Gln Asn Gln Thr Ala Val Met Ile Glu Ile Gly 115 120 125 aca aac ctg ttg aac caa aca gct gag caa acg cgg aag tta act gat 788 Thr Asn Leu Leu Asn Gln Thr Ala Glu Gln Thr Arg Lys Leu Thr Asp 130 135 140 gtg gaa gcc caa gta tta aat cag acc acg aga ctt gaa ctt cag ctc 836 Val Glu Ala Gln Val Leu Asn Gln Thr Thr Arg Leu Glu Leu Gln Leu 145 150 155 160 ttg gaa cac tcc ctc tcg aca aac aaa ttg gaa aaa cag att ttg gac 884 Leu Glu His Ser Leu Ser Thr Asn Lys Leu Glu Lys Gln Ile Leu Asp 165 170 175 cag acc agt gaa ata aac aaa ttg caa gat aag aac agt ttc cta gaa 932 Gln Thr Ser Glu Ile Asn Lys Leu Gln Asp Lys Asn Ser Phe Leu Glu 180 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acggaccaaa gcaagaccct aaacatccat aattgtgatt agacagaaca 2080 cctatgcaaa gatgaacccg aggctgagaa tcagactgac agtttacaga cgctgctgtc 2140 acaaccaaga atgttatgtg caagtttatc agtaaataac tggaaaacag aacacttatg 2200 ttatacaata cagatcatct tggaactgca ttcttctgag cactgtttat acactgtgta 2260 aatacccata tgtcctgaat tc 2282 <210> 6 <211> 496 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Trp Gln Ile Val Phe Phe Thr Leu Ser Cys Asp Leu Val Leu Ala 1 5 10 15 Ala Ala Tyr Asn Asn Phe Arg Lys Ser Met Asp Ser Ile Gly Lys Lys 20 25 30 Gln Tyr Gln Val Gln His Gly Ser Cys Ser Tyr Thr Phe Leu Leu Pro 35 40 45 Glu Met Asp Asn Cys Arg Ser Ser Ser Ser Pro Tyr Val Ser Asn Ala 50 55 60 Val Gln Arg Asp Ala Pro Leu Glu Tyr Asp Asp Ser Val Gln Arg Leu 65 70 75 80 Gln Val Leu Glu Asn Ile Met Glu Asn Asn Thr Gln Trp Leu Met Lys 85 90 95 Leu Glu Asn Tyr Ile Gln Asp Asn Met Lys Lys Glu Met Val Glu Ile 100 105 110 Gln Gln Asn Ala Val Gln Asn Gln Thr Ala Val Met Ile Glu Ile Gly 115 120 125 Thr Asn Leu Leu Asn Gln Thr Ala Glu Gln Thr Arg 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cag ctg gcg ccg aca gcg gcg cct gag gct ttg ggg ggc 247 Asp Ile Cys Gln Leu Ala Pro Thr Ala Ala Pro Glu Ala Leu Gly Gly 55 60 65 tcc aat agc ctc cag agg gac ttg cct gcc tcg agg ctg cac cta aca 295 Ser Asn Ser Leu Gln Arg Asp Leu Pro Ala Ser Arg Leu His Leu Thr 70 75 80 gac tgg cga gcc cag agg gcc cag cgg gcc cag cgt gtg agc cag ctg 343 Asp Trp Arg Ala Gln Arg Ala Gln Arg Ala Gln Arg Val Ser Gln Leu 85 90 95 gag aag ata cta gag aat aac act cag tgg ctg ctg aag ctg gag cag 391 Glu Lys Ile Leu Glu Asn Asn Thr Gln Trp Leu Leu Lys Leu Glu Gln 100 105 110 115 tcc atc aag gtg aac ttg agg tca cac ctg gtg cag gcc cag cag gac 439 Ser Ile Lys Val Asn Leu Arg Ser His Leu Val Gln Ala Gln Gln Asp 120 125 130 aca atc cag aac cag aca act acc atg ctg gca ctg ggt gcc aac ctc 487 Thr Ile Gln Asn Gln Thr Thr Thr Met Leu Ala Leu Gly Ala Asn Leu 135 140 145 atg aac cag acc aaa gct cag acc cac aag ctg act gct gtg gag gca 535 Met Asn Gln Thr Lys Ala Gln Thr His Lys Leu Thr Ala Val Glu Ala 150 155 160 cag gtc cta aac cag aca ttg cac atg aag acc caa atg ctg gag aac 583 Gln Val Leu Asn Gln Thr Leu His Met Lys Thr Gln Met Leu Glu Asn 165 170 175 tca ctg tcc acc aac aag ctg gag cgg cag atg ctg atg cag agc cga 631 Ser Leu Ser Thr Asn Lys Leu Glu Arg Gln Met Leu Met Gln Ser Arg 180 185 190 195 gag ctg cag cgg ctg cag ggt cgc aac agg gcc ctg gag acc agg ctg 679 Glu Leu Gln Arg Leu Gln Gly Arg Asn Arg Ala Leu Glu Thr Arg Leu 200 205 210 cag gca ctg gaa gca caa cat cag gcc cag ctt aac agc ctc caa gag 727 Gln Ala Leu Glu Ala Gln His Gln Ala Gln Leu Asn Ser Leu Gln Glu 215 220 225 aag agg gaa caa ctg cac agt ctc ctg ggc cat cag acc ggg acc ctg 775 Lys Arg Glu Gln Leu His Ser Leu Leu Gly His Gln Thr Gly Thr Leu 230 235 240 gct aac ctg aag cac aat ctg cac gct ctc agc agc aat tcc agc tcc 823 Ala Asn Leu Lys His Asn Leu His Ala Leu Ser Ser Asn Ser Ser Ser 245 250 255 ctg cag cag cag cag cag caa ctg acg gag ttt gta cag cgc ctg gta 871 Leu Gln Gln Gln Gln Gln Gln Leu Thr Glu Phe Val Gln Arg Leu Val 260 265 270 275 cgg att gta gcc cag gac cag cat ccg gtt tcc tta aag aca cct aag 919 Arg Ile Val Ala Gln Asp Gln His Pro Val Ser Leu Lys Thr Pro Lys 280 285 290 cca gtg ttc cag gac tgt gca gag atc aag cgc tcc ggg gtt aat acc 967 Pro Val Phe Gln Asp Cys Ala Glu Ile Lys Arg Ser Gly Val Asn Thr 295 300 305 agc ggt gtc tat acc atc tat gag acc aac atg aca aag cct ctc aag 1015 Ser Gly Val Tyr Thr Ile Tyr Glu Thr Asn Met Thr Lys Pro Leu Lys 310 315 320 gtg ttc tgt gac atg gag act gat gga ggt ggc tgg acc ctc atc cag 1063 Val Phe Cys Asp Met Glu Thr Asp Gly Gly Gly Trp Thr Leu Ile Gln 325 330 335 cac cgg gag gat gga agc gta aat ttc cag agg acc tgg gaa gaa tac 1111 His Arg Glu Asp Gly Ser Val Asn Phe Gln Arg Thr Trp Glu Glu Tyr 340 345 350 355 aaa gag ggt ttt ggt aat gtg gcc aga gag cac tgg ctg ggc aat gag 1159 Lys Glu Gly Phe Gly Asn Val Ala Arg Glu His Trp Leu Gly Asn Glu 360 365 370 gct gtg cac cgc ctc acc agc aga acg gcc tac ttg cta cgc gtg gaa 1207 Ala Val His Arg Leu Thr Ser Arg Thr Ala Tyr Leu Leu 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Gly Pro Ser Tyr Ser Leu His Gly 485 490 495 aca cgc atg atg ctg agg cca atg ggt gcc tgacaca cagccctgca 1590 Thr Arg Met Met Leu Arg Pro Met Gly Ala 500 505 gagactgatg ccgtaggagg attctcaacc caggtgactc tgtgcacgct gggccctgcc 1650 cagaaatcag tgcccagggc tcatcttgac attctggaac atcggaacca gcttaccttg 1710 cccctgaatt acaagaattc acctgcctcc ctgttgccct ctaattgtga aattgctggg 1770 tgcttgaagg cacctgcctc tgttggaacc atactctttc cccctcctgc tgcatgcccg 1830 ggaatccctg ccatgaact 1849 <210> 10 <211> 509 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Met Leu Cys Gln Pro Ala Met Leu Leu Asp Gly Leu Leu Leu Leu Ala 1 5 10 15 Thr Met Ala Ala Ala Gln His Arg Gly Pro Glu Ala Gly Gly His Arg 20 25 30 Gln Ile His Gln Val Arg Arg Gly Gln Cys Ser Tyr Thr Phe Val Val 35 40 45 Pro Glu Pro Asp Ile Cys Gln Leu Ala Pro Thr Ala Ala Pro Glu Ala 50 55 60 Leu Gly Gly Ser Asn Ser Leu Gln Arg Asp Leu Pro Ala Ser Arg Leu 65 70 75 80 His Leu Thr Asp Trp Arg Ala Gln Arg Ala Gln Arg Ala Gln Arg Val 85 90 95 Ser Gln Leu Glu Lys Ile Leu Glu Asn 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ggg cct gag gtc tcc agg gac 192 Leu Pro Lys Ser Glu Pro Cys Pro Pro Gly Pro Glu Val Ser Arg Asp 50 55 60 tcc aac acc ctc cag aga gaa tca ctg gcc aac cca ctg cac ctg ggg 240 Ser Asn Thr Leu Gln Arg Glu Ser Leu Ala Asn Pro Leu His Leu Gly 65 70 75 80 aag ttg ccc acc cag cag gtg aaa cag ctg gag cag gca ctg cag aac 288 Lys Leu Pro Thr Gln Gln Val Lys Gln Leu Glu Gln Ala Leu Gln Asn 85 90 95 aac acg cag tgg ctg aag aag cta gag agg gcc atc aag acg atc ttg 336 Asn Thr Gln Trp Leu Lys Lys Leu Glu Arg Ala Ile Lys Thr Ile Leu 100 105 110 agg tcg aag ctg gag cag gtc cag cag caa atg gcc cag aat cag acg 384 Arg Ser Lys Leu Glu Gln Val Gln Gln Gln Met Ala Gln Asn Gln Thr 115 120 125 gcc ccc atg cta gag ctg ggc acc agc ctc ctg aac cag acc act gcc 432 Ala Pro Met Leu Glu Leu Gly Thr Ser Leu Leu Asn Gln Thr Thr Ala 130 135 140 cag atc cgc aag ctg acc gac atg gag gct cag ctc ctg aac cag aca 480 Gln Ile Arg Lys Leu Thr Asp Met Glu Ala Gln Leu Leu Asn Gln Thr 145 150 155 160 tca aga atg gat gcc cag atg cca gag acc ttt ctg tcc acc aac aag 528 Ser Arg Met Asp Ala Gln Met Pro Glu Thr Phe Leu Ser Thr Asn Lys 165 170 175 ctg gag aac cag ctg ctg cta cag agg cag aag ctc cag cag ctt cag 576 Leu Glu Asn Gln Leu Leu Leu Gln Arg Gln Lys Leu Gln Gln Leu Gln 180 185 190 ggc caa aac agc gcg ctc gag aag cgg ttg cag gcc ctg gag acc aag 624 Gly Gln Asn Ser Ala Leu Glu Lys Arg Leu Gln Ala Leu Glu Thr Lys 195 200 205 cag cag gag gag ctg gcc agc atc ctc agc aag aag gcg aag ctg ctg 672 Gln Gln Glu Glu Leu Ala Ser Ile Leu Ser Lys Lys Ala Lys Leu Leu 210 215 220 aac acg ctg agc cgc cag agc gcc gcc ctc acc aac atc gag cgc ggc 720 Asn Thr Leu Ser Arg Gln Ser Ala Ala Leu Thr Asn Ile Glu Arg Gly 225 230 235 240 ctg cgc ggt gtc agg cac aac tcc agc ctc ctg cag gac cag cag cac 768 Leu Arg Gly Val Arg His Asn Ser Ser Leu Leu Gln Asp Gln Gln His 245 250 255 agc ctg cgc cag ctg ctg gtg ttg ttg cgg cac ctg gtg caa gaa agg 816 Ser Leu Arg Gln Leu Leu Val Leu Leu Arg His Leu Val Gln Glu Arg 260 265 270 gct aac gcc tcg gcc ccg gcc ttc ata atg gca ggt gag cag gtg ttc 864 Ala Asn Ala Ser Ala Pro Ala Phe Ile Met Ala Gly Glu Gln Val Phe 275 280 285 cag gac tgt gca gag atc cag cgc tct ggg gcc agt gcc agt ggt gtc 912 Gln Asp Cys Ala Glu Ile Gln Arg Ser Gly Ala Ser Ala Ser Gly Val 290 295 300 tac acc atc cag gtg tcc aat gca acg aag ccc agg aag gtg ttc tgt 960 Tyr Thr Ile Gln Val Ser Asn Ala Thr Lys Pro Arg Lys Val Phe Cys 305 310 315 320 gac ctg cag agc agt gga ggc agg tgg acc ctc atc cag cgc cgt gag 1008 Asp Leu Gln Ser Ser Gly Gly Arg Trp Thr Leu Ile Gln Arg Arg Glu 325 330 335 aat ggc acc gtg aat ttt cag cgg aac tgg aag gat tac aaa cag ggc 1056 Asn Gly Thr Val Asn Phe Gln Arg Asn Trp Lys Asp Tyr Lys Gln Gly 340 345 350 ttc gga gac cca gct ggg gag cac tgg ctg ggc aat gaa gtg gtg cac 1104 Phe Gly Asp Pro Ala Gly Glu His Trp Leu Gly Asn Glu Val Val His 355 360 365 cag ctc acc aga agg gca gcc tac tct ctg cgt gtg gag ctg caa gac 1152 Gln Leu Thr Arg Arg Ala Ala Tyr Ser Leu Arg Val Glu Leu Gln Asp 370 375 380 tgg gaa ggc cac gag gcc tat gcc cag tac gaa cat ttc cac ctg ggc 1200 Trp Glu Gly His Glu Ala Tyr Ala Gln Tyr Glu His Phe His Leu Gly 385 390 395 400 agt gag aac cag cta tac agg ctt tct gtg gtc ggg tac agc ggc tca 1248 Ser Glu Asn Gln Leu Tyr Arg Leu Ser Val Val Gly Tyr Ser Gly Ser 405 410 415 gca ggg cgc cag agc agc ctg gtc ctg cag aac acc agc ttt agc acc 1296 Ala Gly Arg Gln Ser Ser Leu Val Leu Gln Asn Thr Ser Phe Ser Thr 420 425 430 ctt gac tca gac aac gac cac tgt ctc tgc aag tgt gcc cag gtg atg 1344 Leu Asp Ser Asp Asn Asp His Cys Leu Cys Lys Cys Ala Gln Val Met 435 440 445 tct gga ggg tgg tgg ttt gac gcc tgt ggc ctg tca aac ctc aac ggc 1392 Ser Gly Gly Trp Trp Phe Asp Ala Cys Gly Leu Ser Asn Leu Asn Gly 450 455 460 gtc tac tac cac gct ccc gac aac aag tac aag atg gac ggc atc cgc 1440 Val Tyr Tyr His Ala Pro Asp Asn Lys Tyr Lys Met Asp Gly Ile Arg 465 470 475 480 tgg cac tac ttc aag ggc ccc agc tac tca ctg cgt gcc tct cgc atg 1488 Trp His Tyr Phe Lys Gly Pro Ser Tyr Ser Leu Arg Ala 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Leu Leu Ser Gln Thr Ala Glu Gln Thr Arg Lys 130 135 140 ctg aca gat gtt gag acc cag gta cta aat caa act tct cga ctt gag 480 Leu Thr Asp Val Glu Thr Gln Val Leu Asn Gln Thr Ser Arg Leu Glu 145 150 155 160 ata cag ctg ctg gag aat tca tta tcc acc tac aag cta gag aag caa 528 Ile Gln Leu Leu Glu Asn Ser Leu Ser Thr Tyr Lys Leu Glu Lys Gln 165 170 175 ctt ctt caa cag aca aat gaa atc ttg aag atc cat gaa aaa aac agt 576 Leu Leu Gln Gln Thr Asn Glu Ile Leu Lys Ile His Glu Lys Asn Ser 180 185 190 tta tta gaa cat aaa atc tta gaa atg gaa gga aaa cac aag gaa gag 624 Leu Leu Glu His Lys Ile Leu Glu Met Glu Gly Lys His Lys Glu Glu 195 200 205 ttg gac acc tta aag gaa gag aaa gag aac ctt caa ggc ttg gtt act 672 Leu Asp Thr Leu Lys Glu Glu Lys Glu Asn Leu Gln Gly Leu Val Thr 210 215 220 cgt caa aca tat ata atc cag gag ctg gaa aag caa tta aac aga gct 720 Arg Gln Thr Tyr Ile Ile Gln Glu Leu Glu Lys Gln Leu Asn Arg Ala 225 230 235 240 acc acc aac aac agt gtc ctt cag aag cag caa ctg gag ctg atg gac 768 Thr 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aat cag 1104 Gly Glu Tyr Trp Leu Gly Asn Glu Phe Val Ser Gln Leu Thr Asn Gln 355 360 365 caa cgc tat gtg ctt aaa ata cac ctt aaa gac tgg gaa ggg aat gag 1152 Gln Arg Tyr Val Leu Lys Ile His Leu Lys Asp Trp Glu Gly Asn Glu 370 375 380 gct tac tca ttg tat gaa cat ttc tat ctc tca agt gaa gaa ctc aat 1200 Ala Tyr Ser Leu Tyr Glu His Phe Tyr Leu Ser Ser Glu Glu Leu Asn 385 390 395 400 tat agg att cac ctt aaa gga ctt aca ggg aca gcc ggc aaa ata agc 1248 Tyr Arg Ile His Leu Lys Gly Leu Thr Gly Thr Ala Gly Lys Ile Ser 405 410 415 agc atc agc caa cca gga aat gat ttt agc aca aag gat gga gac aac 1296 Ser Ile Ser Gln Pro Gly Asn Asp Phe Ser Thr Lys Asp Gly Asp Asn 420 425 430 gac aaa tgt att tgc aaa tgt tca caa atg cta aca gga ggc tgg tgg 1344 Asp Lys Cys Ile Cys Lys Cys Ser Gln Met Leu Thr Gly Gly Trp Trp 435 440 445 ttt gat gca tgt ggt cct tcc aac ttg aac gga atg tac tat cca cag 1392 Phe Asp Ala Cys Gly Pro Ser Asn Leu Asn Gly Met Tyr Tyr Pro Gln 450 455 460 agg cag aac aca aat aag ttc aac ggc att aaa tgg tac tac tgg aaa 1440 Arg Gln Asn Thr Asn Lys Phe Asn Gly Ile Lys Trp Tyr Tyr Trp Lys 465 470 475 480 ggc tca ggc tat tcg ctc aag gcc aca acc atg atg atc cga cca gca 1488 Gly Ser Gly Tyr Ser Leu Lys Ala Thr Thr Met Met Ile Arg Pro Ala 485 490 495 gat ttc taa 1497 Asp Phe <210> 20 <211> 498 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 20 Met Thr Val Phe Leu Ser Phe Ala Phe Leu Ala Ala Ile Leu Thr His 1 5 10 15 Ile Gly Cys Ser Asn Gln Arg Arg Ser Pro Glu Asn Ser Gly Arg Arg 20 25 30 Tyr Asn Arg Ile Gln His Gly Gln Cys Ala Tyr Thr Phe Ile Leu Pro 35 40 45 Glu His Asp Gly Asn Cys Arg Glu Ser Thr Thr Asp Gln Tyr Asn Thr 50 55 60 Asn Ala Leu Gln Arg Asp Ala Pro His Val Glu Pro Asp Phe Ser Ser 65 70 75 80 Gln Lys Leu Gln His Leu Glu His Val Met Glu Asn Tyr Thr Gln Trp 85 90 95 Leu Gln Lys Leu Glu Asn Tyr Ile Val Glu Asn Met Lys Ser Glu Met 100 105 110 Ala Gln Ile Gln Gln Asn Ala Val Gln Asn His Thr Ala Thr Met Leu 115 120 125 Glu Ile Gly Thr Ser Leu Leu Ser Gln Thr Ala Glu Gln Thr Arg 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gtc ttg gcc 48 Met Trp Gln Ile Val Phe Phe Thr Leu Ser Cys Asp Leu Val Leu Ala 1 5 10 15 gca gcc tat aac aac ttt cgg aag agc atg gac agc ata gga aag aag 96 Ala Ala Tyr Asn Asn Phe Arg Lys Ser Met Asp Ser Ile Gly Lys Lys 20 25 30 caa tat cag gtc cag cat ggg tcc tgc agc tac act ttc ctc ctg cca 144 Gln Tyr Gln Val Gln His Gly Ser Cys Ser Tyr Thr Phe Leu Leu Pro 35 40 45 gag atg gac aac tgc cgc tct tcc tcc agc ccc tac gtg tcc aat gct 192 Glu Met Asp Asn Cys Arg Ser Ser Ser Ser Pro Tyr Val Ser Asn Ala 50 55 60 gtg cag agg gac gcg ccg ctc gaa tac gat gac tcg gtg cag agg ctg 240 Val Gln Arg Asp Ala Pro Leu Glu Tyr Asp Asp Ser Val Gln Arg Leu 65 70 75 80 caa gtg ctg gag aac atc atg gaa aac aac act cag tgg cta atg aag 288 Gln Val Leu Glu Asn Ile Met Glu Asn Asn Thr Gln Trp Leu Met Lys 85 90 95 ctt gag aat tat atc cag gac aac atg aag aaa gaa atg gta gag ata 336 Leu Glu Asn Tyr Ile Gln Asp Asn Met Lys Lys Glu Met Val Glu Ile 100 105 110 cag cag aat gca gta cag aac cag acg gct gtg atg ata gaa ata ggg 384 Gln Gln Asn Ala Val Gln Asn Gln Thr Ala Val Met Ile Glu Ile Gly 115 120 125 aca aac ctg ttg aac caa aca gct gag caa acg cgg aag tta act gat 432 Thr Asn Leu Leu Asn Gln Thr Ala Glu Gln Thr Arg Lys Leu Thr Asp 130 135 140 gtg gaa gcc caa gta tta aat cag acc acg aga ctt gaa ctt cag ctc 480 Val Glu Ala Gln Val Leu Asn Gln Thr Thr Arg Leu Glu Leu Gln Leu 145 150 155 160 ttg gaa cac tcc ctc tcg aca aac aaa ttg gaa aaa cag att ttg gac 528 Leu Glu His Ser Leu Ser Thr Asn Lys Leu Glu Lys Gln Ile Leu Asp 165 170 175 cag acc agt gaa ata aac aaa ttg caa gat aag aac agt ttc cta gaa 576 Gln Thr Ser Glu Ile Asn Lys Leu Gln Asp Lys Asn Ser Phe Leu Glu 180 185 190 aag aag gtg cta gct atg gaa gac aag cac atc atc caa cta cag tca 624 Lys Lys Val Leu Ala Met Glu Asp Lys His Ile Ile Gln Leu Gln Ser 195 200 205 ata aaa gaa gag aaa gat cag cta cag gtg tta gta tcc aag caa aat 672 Ile Lys Glu Glu Lys Asp Gln Leu Gln Val Leu Val Ser Lys Gln Asn 210 215 220 tcc atc att gaa gaa cta gaa aaa aaa ata gtg act gcc acg gtg aat 720 Ser Ile Ile Glu Glu Leu Glu Lys Lys Ile Val Thr Ala Thr Val Asn 225 230 235 240 aat tca gtt ctt caa aag cag caa cat gat ctc atg gag aca gtt aat 768 Asn Ser Val Leu Gln Lys Gln Gln His Asp Leu Met Glu Thr Val Asn 245 250 255 aac tta ctg act atg atg tcc aca tca aac tca gct aag gac ccc act 816 Asn Leu Leu Thr Met Met Ser Thr Ser Asn Ser Ala Lys Asp Pro Thr 260 265 270 gtt gct aaa gaa gaa caa atc agc ttc aga gac tgt gca gat gta tat 864 Val Ala Lys Glu Glu Gln Ile Ser Phe Arg Asp Cys Ala Asp Val Tyr 275 280 285 caa gct ggt ttt aat aaa agt gga atc tac act att tat att aat aat 912 Gln Ala Gly Phe Asn Lys Ser Gly Ile Tyr Thr Ile Tyr Ile Asn Asn 290 295 300 atg cca gaa ccc aaa aag gtg ttt tgc aat atg gat gtc aat ggg gga 960 Met Pro Glu Pro Lys Lys Val Phe Cys Asn Met Asp Val Asn Gly Gly 305 310 315 320 ggt tgg act gta ata caa cat cgt gaa gat gga agt cta gat ttc caa 1008 Gly Trp Thr Val Ile Gln His Arg Glu Asp Gly Ser Leu Asp Phe Gln 325 330 335 aga ggc tgg aag gaa tat aaa atg ggt ttt gga aat ccc tcc ggt gaa 1056 Arg Gly Trp Lys Glu Tyr Lys Met Gly Phe Gly Asn Pro Ser Gly Glu 340 345 350 tat tgg ctg ggg aat gag ttt att ttt gcc att acc agt cag agg cag 1104 Tyr Trp Leu Gly Asn Glu Phe Ile Phe Ala Ile Thr Ser Gln Arg Gln 355 360 365 tac atg cta aga att gag tta atg gac tgg gaa ggg aac cga gcc tat 1152 Tyr Met Leu Arg Ile Glu Leu Met Asp Trp Glu Gly Asn Arg Ala Tyr 370 375 380 tca cag tat gac aga ttc cac ata gga aat gaa aag caa aac tat agg 1200 Ser Gln Tyr Asp Arg Phe His Ile Gly Asn Glu Lys Gln Asn Tyr Arg 385 390 395 400 ttg tat tta aaa ggt cac act ggg aca gca gga aaa cag agc agc ctg 1248 Leu Tyr Leu Lys Gly His Thr Gly Thr Ala Gly Lys Gln Ser Ser Leu 405 410 415 atc tta cac ggt gct gat ttc agc act aaa gat gct gat aat gac aac 1296 Ile Leu His Gly Ala Asp Phe Ser Thr Lys Asp Ala Asp Asn Asp Asn 420 425 430 tgt atg tgc aaa tgt gcc ctc atg tta aca gga gga tgg tgg ttt gat 1344 Cys Met Cys Lys Cys Ala Leu Met Leu Thr Gly Gly Trp Trp Phe Asp 435 440 445 gct tgt ggc ccc tcc aat cta aat gga atg ttc tat act gcg gga caa 1392 Ala Cys Gly Pro Ser Asn Leu Asn Gly Met Phe Tyr Thr Ala Gly Gln 450 455 460 aac cat gga aaa ctg aat ggg ata aag tgg cac tac ttc aaa ggg ccc 1440 Asn His Gly Lys Leu Asn Gly Ile Lys Trp His Tyr Phe Lys Gly Pro 465 470 475 480 agt tac tcc tta cgt tcc aca act atg atg att cga cct tta gat ttt 1488 Ser Tyr Ser Leu Arg Ser Thr Thr Met Met Ile Arg Pro Leu Asp Phe 485 490 495 tg a 1491 <210> 22 <211> 496 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 22 Met Trp Gln Ile Val Phe Phe Thr Leu Ser Cys Asp Leu Val Leu Ala 1 5 10 15 Ala Ala Tyr Asn Asn Phe Arg Lys Ser Met Asp Ser Ile Gly Lys Lys 20 25 30 Gln Tyr Gln Val Gln His Gly Ser Cys Ser Tyr Thr Phe Leu Leu Pro 35 40 45 Glu Met Asp Asn Cys Arg Ser Ser Ser Ser Pro Tyr Val Ser Asn Ala 50 55 60 Val Gln Arg Asp Ala Pro Leu Glu Tyr Asp Asp Ser Val Gln Arg Leu 65 70 75 80 Gln Val Leu Glu Asn Ile Met Glu Asn Asn Thr Gln Trp Leu Met Lys 85 90 95 Leu Glu Asn Tyr Ile Gln Asp Asn Met Lys Lys Glu Met Val Glu Ile 100 105 110 Gln Gln Asn Ala Val Gln Asn Gln Thr Ala Val Met Ile Glu Ile Gly 115 120 125 Thr Asn Leu Leu Asn Gln Thr Ala Glu Gln Thr Arg Lys Leu Thr Asp 130 135 140 Val Glu Ala Gln Val Leu Asn Gln Thr Thr Arg Leu Glu Leu Gln Leu 145 150 155 160 Leu Glu His Ser Leu Ser Thr Asn Lys Leu Glu Lys Gln Ile Leu Asp 165 170 175 Gln Thr Ser Glu Ile Asn Lys Leu Gln Asp Lys Asn Ser Phe Leu Glu 180 185 190 Lys Lys Val Leu Ala Met Glu Asp Lys His Ile Ile Gln Leu Gln Ser 195 200 205 Ile Lys Glu Glu Lys Asp Gln Leu Gln Val Leu Val Ser Lys Gln Asn 210 215 220 Ser Ile Ile Glu Glu Leu Glu Lys Lys Ile Val Thr Ala Thr Val Asn 225 230 235 240 Asn Ser Val Leu Gln Lys Gln Gln His Asp Leu Met Glu Thr Val Asn 245 250 255 Asn Leu Leu Thr Met Met Ser Thr Ser Asn Ser Ala Lys Asp Pro Thr 260 265 270 Val Ala Lys Glu Glu Gln Ile Ser Phe Arg Asp Cys Ala Asp Val Tyr 275 280 285 Gln Ala Gly Phe Asn Lys Ser Gly Ile Tyr Thr Ile Tyr Ile Asn Asn 290 295 300 Met Pro Glu Pro Lys Lys Val Phe Cys Asn Met Asp Val Asn Gly Gly 305 310 315 320 Gly Trp Thr Val Ile Gln His Arg Glu Asp Gly Ser Leu Asp Phe Gln 325 330 335 Arg Gly Trp Lys Glu Tyr Lys Met Gly Phe Gly Asn Pro Ser Gly Glu 340 345 350 Tyr Trp Leu Gly Asn Glu Phe Ile Phe Ala Ile Thr Ser Gln Arg Gln 355 360 365 Tyr Met Leu Arg Ile Glu Leu Met Asp Trp Glu Gly Asn Arg Ala Tyr 370 375 380 Ser Gln Tyr Asp Arg Phe His Ile Gly Asn Glu Lys Gln Asn Tyr Arg 385 390 395 400 Leu Tyr Leu Lys Gly His Thr Gly Thr Ala Gly Lys Gln Ser Ser Leu 405 410 415 Ile Leu His Gly Ala Asp Phe Ser Thr Lys Asp Ala Asp Asn Asp Asn 420 425 430 Cys Met Cys Lys Cys Ala Leu Met Leu Thr Gly Gly Trp Trp Phe Asp 435 440 445 Ala Cys Gly Pro Ser Asn Leu Asn Gly Met Phe Tyr Thr Ala Gly Gln 450 455 460 Asn His Gly Lys Leu Asn Gly Ile Lys Trp His Tyr Phe Lys Gly Pro 465 470 475 480 Ser Tyr Ser Leu Arg Ser Thr Thr Met Met Ile Arg Pro Leu Asp Phe 485 490 495 <210> 23 <211> 1500 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1N2C2F (chimera 3) <220> <221> CDS <222> (1)..(1497) <220> <221> sig_peptide <222> (1)..(60) <223> Putative leader sequence is encoded by nucleotides 1-60 <400> 23 atg aca gtt ttc ctt tcc ttt gct ttc ctc gct gcc att ctg act cac 48 Met Thr Val Phe Leu Ser Phe Ala Phe Leu Ala Ala Ile Leu Thr His 1 5 10 15 ata ggg tgc agc aat cag cgc cga agt cca gaa aac agt ggg aga aga 96 Ile Gly Cys Ser Asn Gln Arg Arg Ser Pro Glu Asn Ser Gly Arg Arg 20 25 30 tat aac cgg att caa cat ggg caa tgt gcc tac act ttc att ctt cca 144 Tyr Asn Arg Ile Gln His Gly Gln Cys Ala Tyr Thr Phe Ile Leu Pro 35 40 45 gaa cac gat ggc aac tgt cgt gag agt acg aca gac cag tac aac aca 192 Glu His Asp Gly Asn Cys Arg Glu Ser Thr Thr Asp Gln Tyr Asn Thr 50 55 60 aac gct ctg cag aga gat gct cca cac gtg gaa ccg gat gac tcg gtg 240 Asn Ala Leu Gln Arg Asp Ala Pro His Val Glu Pro Asp Asp Ser Val 65 70 75 80 cag agg ctg caa gtg ctg gag aac atc atg gaa aac aac act cag tgg 288 Gln Arg Leu Gln Val Leu Glu Asn Ile Met Glu Asn Asn Thr Gln Trp 85 90 95 cta atg aag ctt gag aat tat atc cag gac aac atg aag aaa gaa atg 336 Leu Met Lys Leu Glu Asn Tyr Ile Gln Asp Asn Met Lys Lys Glu Met 100 105 110 gta gag ata cag cag aat gca gta cag aac cag acg gct gtg atg ata 384 Val Glu Ile Gln Gln Asn Ala Val Gln Asn Gln Thr Ala Val Met Ile 115 120 125 gaa ata ggg aca aac ctg ttg aac caa aca gct gag caa acg cgg aag 432 Glu Ile Gly Thr Asn Leu Leu Asn Gln Thr Ala Glu Gln Thr Arg Lys 130 135 140 tta act gat gtg gaa gcc caa gta tta aat cag acc acg aga ctt gaa 480 Leu Thr Asp Val Glu Ala Gln Val Leu Asn Gln Thr Thr Arg Leu Glu 145 150 155 160 ctt cag ctc ttg gaa cac tcc ctc tcg aca aac aaa ttg gaa aaa cag 528 Leu Gln Leu Leu Glu His Ser Leu Ser Thr Asn Lys Leu Glu Lys Gln 165 170 175 att ttg gac cag acc agt gaa ata aac aaa ttg caa gat aag aac agt 576 Ile Leu Asp Gln Thr Ser Glu Ile Asn Lys Leu Gln Asp Lys Asn Ser 180 185 190 ttc cta gaa aag aag gtg cta gct atg gaa gac aag cac atc atc caa 624 Phe Leu Glu Lys Lys Val Leu Ala Met Glu Asp Lys His Ile Ile Gln 195 200 205 cta cag tca ata aaa gaa gag aaa gat cag cta cag gtg tta gta tcc 672 Leu Gln Ser Ile Lys Glu Glu Lys Asp Gln Leu Gln Val Leu Val Ser 210 215 220 aag caa aat tcc atc att gaa gaa cta gaa aaa aaa ata gtg act gcc 720 Lys Gln Asn Ser Ile Ile Glu Glu Leu Glu Lys Lys Ile Val Thr Ala 225 230 235 240 acg gtg aat aat tca gtt ctt caa aag cag caa cat gat ctc atg gag 768 Thr Val Asn Asn Ser Val Leu Gln Lys Gln Gln His Asp Leu Met Glu 245 250 255 aca gtt aat aac tta ctg act atg atg tcc aca tca aac tca gct aag 816 Thr Val Asn Asn Leu Leu Thr Met Met Ser Thr Ser Asn Ser Ala Lys 260 265 270 gac ccc act gtt gct aaa gaa gaa caa atc agc ttc aga gac tgt gct 864 Asp Pro Thr Val Ala Lys Glu Glu Gln Ile Ser Phe Arg Asp Cys Ala 275 280 285 gaa gta ttc aaa tca gga cac acc aca aat ggc atc tac acg tta aca 912 Glu Val Phe Lys Ser Gly His Thr Thr Asn Gly Ile Tyr Thr Leu Thr 290 295 300 ttc cct aat tct aca gaa gag atc aag gcc tac tgt gac atg gaa gct 960 Phe Pro Asn Ser Thr Glu Glu Ile Lys Ala Tyr Cys Asp Met Glu Ala 305 310 315 320 gga gga ggc ggg tgg aca att att cag cga cgt gag gat ggc agc gtt 1008 Gly Gly Gly Gly Trp Thr Ile Ile Gln Arg Arg Glu Asp Gly Ser Val 325 330 335 gat ttt cag agg act tgg aaa gaa tat aaa gtg gga ttt ggt aac cct 1056 Asp Phe Gln Arg Thr Trp Lys Glu Tyr Lys Val Gly Phe Gly Asn Pro 340 345 350 tca gga gaa tat tgg ctg gga aat gag ttt gtt tcg caa ctg act aat 1104 Ser Gly Glu Tyr Trp Leu Gly Asn Glu Phe Val Ser Gln Leu Thr Asn 355 360 365 cag caa cgc tat gtg ctt aaa ata cac ctt aaa gac tgg gaa ggg aat 1152 Gln Gln Arg Tyr Val Leu Lys Ile His Leu Lys Asp Trp Glu Gly Asn 370 375 380 gag gct tac tca ttg tat gaa cat ttc tat ctc tca agt gaa gaa ctc 1200 Glu Ala Tyr Ser Leu Tyr Glu His Phe Tyr Leu Ser Ser Glu Glu Leu 385 390 395 400 aat tat agg att cac ctt aaa gga ctt aca ggg aca gcc ggc aaa ata 1248 Asn Tyr Arg Ile His Leu Lys Gly Leu Thr Gly Thr Ala Gly Lys Ile 405 410 415 agc agc atc agc caa cca gga aat gat ttt agc aca aag gat gga gac 1296 Ser Ser Ile Ser Gln Pro Gly Asn Asp Phe Ser Thr Lys Asp Gly Asp 420 425 430 aac gac aaa tgt att tgc aaa tgt tca caa atg cta aca gga ggc tgg 1344 Asn Asp Lys Cys Ile Cys Lys Cys Ser Gln Met Leu Thr Gly Gly Trp 435 440 445 tgg ttt gat gca tgt ggt cct tcc aac ttg aac gga atg tac tat cca 1392 Trp Phe Asp Ala Cys Gly Pro Ser Asn Leu Asn Gly Met Tyr Tyr Pro 450 455 460 cag agg cag aac aca aat aag ttc aac ggc att aaa tgg tac tac tgg 1440 Gln Arg Gln Asn Thr Asn Lys Phe Asn Gly Ile Lys Trp Tyr Tyr Trp 465 470 475 480 aaa ggc tca ggc tat tcg ctc aag gcc aca acc atg atg atc cga cca 1488 Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Leu Lys Ala Thr Thr Met Met Ile Arg Pro 485 490 495 gca gat ttc taa 1500 Ala Asp Phe <210> 24 <211> 499 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 24 Met Thr Val Phe Leu Ser Phe Ala Phe Leu Ala Ala Ile Leu Thr His 1 5 10 15 Ile Gly Cys Ser Asn Gln Arg Arg Ser Pro Glu Asn Ser Gly Arg Arg 20 25 30 Tyr Asn Arg Ile Gln His Gly Gln Cys Ala Tyr Thr Phe Ile Leu Pro 35 40 45 Glu His Asp Gly Asn Cys Arg Glu Ser Thr Thr Asp Gln Tyr Asn Thr 50 55 60 Asn Ala Leu Gln Arg Asp Ala 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ctg gaa cat gtg atg gaa aat tat act cag tgg ctg caa aaa 288 Gln His Leu Glu His Val Met Glu Asn Tyr Thr Gln Trp Leu Gln Lys 85 90 95 ctt gag aat tac att gtg gaa aac atg aag tcg gag atg gcc cag ata 336 Leu Glu Asn Tyr Ile Val Glu Asn Met Lys Ser Glu Met Ala Gln Ile 100 105 110 cag cag aat gca gtt cag aac cac acg gct acc atg ctg gag ata gga 384 Gln Gln Asn Ala Val Gln Asn His Thr Ala Thr Met Leu Glu Ile Gly 115 120 125 acc agc ctc ctc tct cag act gca gag cag acc aga aag ctg aca gat 432 Thr Ser Leu Leu Ser Gln Thr Ala Glu Gln Thr Arg Lys Leu Thr Asp 130 135 140 gtt gag acc cag gta cta aat caa act tct cga ctt gag ata cag ctg 480 Val Glu Thr Gln Val Leu Asn Gln Thr Ser Arg Leu Glu Ile Gln Leu 145 150 155 160 ctg gag aat tca tta tcc acc tac aag cta gag aag caa ctt ctt caa 528 Leu Glu Asn Ser Leu Ser Thr Tyr Lys Leu Glu Lys Gln Leu Leu Gln 165 170 175 cag aca aat gaa atc ttg aag atc cat gaa aaa aac agt tta tta gaa 576 Gln Thr Asn Glu Ile Leu Lys Ile His Glu Lys Asn Ser Leu Leu Glu 180 185 190 cat aaa atc tta gaa atg gaa gga aaa cac aag gaa gag ttg gac acc 624 His Lys Ile Leu Glu Met Glu Gly Lys His Lys Glu Glu Leu Asp Thr 195 200 205 tta aag gaa gag aaa gag aac ctt caa ggc ttg gtt act cgt caa aca 672 Leu Lys Glu Glu Lys Glu Asn Leu Gln Gly Leu Val Thr Arg Gln Thr 210 215 220 tat ata atc cag gag ctg gaa aag caa tta aac aga gct acc acc aac 720 Tyr Ile Ile Gln Glu Leu Glu Lys Gln Leu Asn Arg Ala Thr Thr Asn 225 230 235 240 aac agt gtc ctt cag aag cag caa ctg gag ctg atg gac aca gtc cac 768 Asn Ser Val Leu Gln Lys Gln Gln Leu Glu Leu Met Asp Thr Val His 245 250 255 aac ctt gtc aat ctt tgc act aaa gaa ggt gtt tta cta aag gga gga 816 Asn Leu Val Asn Leu Cys Thr Lys Glu Gly Val Leu Leu Lys Gly Gly 260 265 270 aaa aga gag gaa gag aaa cca ttt aga gac tgt gca gat gta tat caa 864 Lys Arg Glu Glu Glu Lys Pro Phe Arg Asp Cys Ala Asp Val Tyr Gln 275 280 285 gct ggt ttt aat aaa agt gga atc tac act att tat att aat aat atg 912 Ala Gly Phe Asn Lys Ser Gly Ile Tyr Thr Ile Tyr Ile Asn Asn Met 290 295 300 cca gaa ccc aaa aag gtg ttt tgc aat atg gat gtc aat ggg gga ggt 960 Pro Glu Pro Lys Lys Val Phe Cys Asn Met Asp Val Asn Gly Gly Gly 305 310 315 320 tgg act gta ata caa cat cgt gaa gat gga agt cta gat ttc caa aga 1008 Trp Thr Val Ile Gln His Arg Glu Asp Gly Ser Leu Asp Phe Gln Arg 325 330 335 ggc tgg aag gaa tat aaa atg ggt ttt gga aat ccc tcc ggt gaa tat 1056 Gly Trp Lys Glu Tyr Lys Met Gly Phe Gly Asn Pro Ser Gly Glu Tyr 340 345 350 tgg ctg ggg aat gag ttt att ttt gcc att acc agt cag agg cag tac 1104 Trp Leu Gly Asn Glu Phe Ile Phe Ala Ile Thr Ser Gln Arg Gln Tyr 355 360 365 atg cta aga att gag tta atg gac tgg gaa ggg aac cga gcc tat tca 1152 Met Leu Arg Ile Glu Leu Met Asp Trp Glu Gly Asn Arg Ala Tyr Ser 370 375 380 cag tat gac aga ttc cac ata gga aat gaa aag caa aac tat agg ttg 1200 Gln Tyr Asp Arg Phe His Ile Gly Asn Glu Lys Gln Asn Tyr Arg Leu 385 390 395 400 tat tta aaa ggt cac act ggg aca gca gga aaa cag agc agc ctg atc 1248 Tyr Leu Lys Gly His Thr Gly Thr Ala Gly Lys Gln Ser Ser Leu Ile 405 410 415 tta cac ggt gct gat ttc agc act aaa gat gct gat aat gac aac tgt 1296 Leu His Gly Ala Asp Phe Ser Thr Lys Asp Ala Asp Asn Asp Asn Cys 420 425 430 atg tgc aaa tgt gcc ctc atg tta aca gga gga tgg tgg ttt gat gct 1344 Met Cys Lys Cys Ala Leu Met Leu Thr Gly Gly Trp Trp Phe Asp Ala 435 440 445 tgt ggc ccc tcc aat cta aat gga atg ttc tat act gcg gga caa aac 1392 Cys Gly Pro Ser Asn Leu Asn Gly Met Phe Tyr Thr Ala Gly Gln Asn 450 455 460 cat gga aaa ctg aat ggg ata aag tgg cac tac ttc aaa ggg ccc agt 1440 His Gly Lys Leu Asn Gly Ile Lys Trp His Tyr Phe Lys Gly Pro Ser 465 470 475 480 tac tcc tta cgt tcc aca act atg atg att cga cct tta gat ttt tga 1488 Tyr Ser Leu Arg Ser Thr Thr Met Met Ile Arg Pro Leu Asp Phe 485 490 495 <210> 26 <211> 495 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 26 Met Trp Gln Ile Val Phe Phe Thr Leu Ser Cys Asp Leu Val Leu Ala 1 5 10 15 Ala Ala Tyr Asn Asn Phe Arg Lys Ser Met Asp Ser Ile Gly Lys Lys 20 25 30 Gln Tyr Gln Val Gln His Gly Ser Cys Ser Tyr Thr Phe Leu Leu Pro 35 40 45 Glu Met Asp Asn Cys Arg Ser Ser Ser Ser Pro Tyr Val Ser Asn Ala 50 55 60 Val Gln Arg Asp Ala Pro Leu Glu Tyr Asp Phe Ser Ser Gln Lys Leu 65 70 75 80 Gln His Leu Glu His Val Met Glu Asn Tyr Thr Gln Trp Leu Gln Lys 85 90 95 Leu Glu Asn Tyr Ile Val Glu Asn Met Lys Ser Glu Met Ala Gln Ile 100 105 110 Gln Gln Asn Ala Val Gln Asn His Thr Ala Thr Met Leu Glu Ile Gly 115 120 125 Thr Ser Leu Leu Ser Gln Thr Ala Glu Gln Thr Arg Lys Leu Thr Asp 130 135 140 Val Glu Thr Gln Val Leu Asn Gln Thr Ser Arg Leu Glu Ile Gln Leu 145 150 155 160 Leu Glu Asn Ser Leu Ser Thr Tyr Lys Leu Glu Lys Gln Leu Leu Gln 165 170 175 Gln Thr Asn Glu Ile Leu Lys Ile His Glu Lys Asn Ser Leu Leu Glu 180 185 190 His Lys Ile Leu Glu Met Glu Gly Lys His Lys Glu Glu Leu Asp Thr 195 200 205 Leu Lys Glu Glu Lys Glu Asn Leu Gln Gly Leu Val Thr Arg Gln Thr 210 215 220 Tyr Ile Ile Gln Glu Leu Glu Lys Gln Leu Asn Arg Ala Thr Thr Asn 225 230 235 240 Asn Ser Val Leu Gln Lys Gln Gln Leu Glu Leu Met Asp Thr Val His 245 250 255 Asn Leu Val Asn Leu Cys Thr Lys Glu Gly Val Leu Leu Lys Gly Gly 260 265 270 Lys Arg Glu Glu Glu Lys Pro Phe Arg Asp Cys Ala Asp Val Tyr Gln 275 280 285 Ala Gly Phe Asn Lys Ser Gly Ile Tyr Thr Ile Tyr Ile Asn Asn Met 290 295 300 Pro Glu Pro Lys Lys Val Phe Cys Asn Met Asp Val Asn Gly Gly Gly 305 310 315 320 Trp Thr Val Ile Gln His Arg Glu Asp Gly Ser Leu Asp Phe Gln Arg 325 330 335 Gly Trp Lys Glu Tyr Lys Met Gly Phe Gly Asn Pro Ser Gly Glu Tyr 340 345 350 Trp Leu Gly Asn Glu Phe Ile Phe Ala Ile Thr Ser Gln Arg Gln Tyr 355 360 365 Met Leu Arg Ile Glu Leu Met Asp Trp Glu Gly Asn Arg Ala Tyr Ser 370 375 380 Gln Tyr Asp Arg Phe His Ile Gly Asn Glu Lys Gln Asn Tyr Arg Leu 385 390 395 400 Tyr Leu Lys Gly His Thr Gly Thr Ala Gly Lys Gln Ser Ser Leu Ile 405 410 415 Leu His Gly Ala Asp Phe Ser Thr Lys Asp Ala Asp Asn Asp Asn Cys 420 425 430 Met Cys Lys Cys Ala Leu Met Leu Thr Gly Gly Trp Trp Phe Asp Ala 435 440 445 Cys Gly Pro Ser Asn Leu Asn Gly Met Phe Tyr Thr Ala Gly Gln Asn 450 455 460 His Gly Lys Leu Asn Gly Ile Lys Trp His Tyr Phe Lys Gly Pro Ser 465 470 475 480 Tyr Ser Leu Arg Ser Thr Thr Met Met Ile Arg Pro Leu Asp Phe 485 490 495 <210> 27 <211> 47 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> primer_bind <222> (1)..(47) <223> PCR primer <220> <221> primer_bind <222> (1)..(20) <223> "tail" sequences added to PCR primer to facilitate cloning of the amplified PCR fragments <400> 27 gcatgctatc tcgagccacc atgctctccc agctagccat gctgcag 47 <210> 28 <211> 55 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> primer_bind <222> (1)..(55) <223> PCR primer <220> <221> primer_bind <222> (1)..(28) <223> "tail" sequences added to PCR primers to facilitate cloning of the amplified PCR fragments <400> 28 gtgtcgacgc ggccgctcta gatcagactt agatgtccaa aggccgtatc atcat 55

Claims (50)

  1. N-말단 도메인, 감겨진 코일 도메인 및 피브리노겐-유사 도메인을 포함하는 키메라 TIE-2 리간드를 암호화하는 분리된 핵산분자로서, 상기 도메인의 적어도 둘은, SEQ ID NO:2에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 TIE-2 리간드 1, SEQ ID NO:6에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 TIE-2 리간드 2, SEQ ID NO:10에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 TIE-2 리간드 3 및 SEQ ID NO:18에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 TIE 리간드 4로부터 선택되는 상이한 TIE-2 리간드로부터 유래하는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산분자.
  2. 제 1 항에 있어서, N-말단 도메인, 감겨진 코일 도메인 및 피브리노겐-유사 도메인은 TIE-2 리간드 1 또는 TIE-2 리간드 2로부터 유래하는 키메라 TIE-2 리간드를 암호화하는 것을 특징으로 하는 핵산분자.
  3. 제 2 항에 있어서, TIE-2 리간드 1의 N-말단 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 일부가 TIE-2 리간드 2의 N-말단 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 치환되어 있는 TIE-2 리간드 1 을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, TIE-2 수용체를 결합시키고 활성화시키는 키메라 TIE-2 리간드를 암호화하는 것을 특징으로 하는 핵산분자.
  4. 제 3 항에 있어서, TIE-2 리간드 1의 감겨진 코일 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 일부가 TIE-2 리간드 2의 감겨진 코일 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 치환되어 있는 것을 특징으로 하는 핵산분자.
  5. 제 3 항 또는 제 4 항에 있어서, SEQ ID NO:25에 기재된 뉴클레오티드 784-786에 의해 암호화된 시스테인 잔기 대신에 다른 아미노산을 암호화하도록 변형되어 있는 것을 특징으로 하는 핵산분자.
  6. 제 5 항에 있어서, 시스테인 잔기 대신에 세린 잔기를 암호화하도록 변형되어 있는 것을 특징으로 하는 핵산분자.
  7. 제 5 항에 있어서, SEQ ID NO:25에 기재된 뉴클레오티드 199-201에 의해 암호화된 아르기닌 잔기 대신에 다른 아미노산을 암호화하도록 더 변형되어 있는 것을 특징으로 하는 핵산분자.
  8. 제 7 항에 있어서, 아르기닌 잔기 대신에 세린 잔기를 암호화하도록 변형되어있는 것을 특징으로 하는 핵산분자.
  9. 제 3 항에 있어서, SEQ ID NO:26에 기재된 아미노산 서열을 갖는 키메라 TIE-2 리간드를 암호화하는 것을 특징으로 하는 핵산분자.
  10. 제 4 항에 있어서, SEQ ID NO:22에 기재된 아미노산 서열을 갖는 키메라 TIE-2 리간드를 암호화하는 것을 특징으로 하는 핵산분자.
  11. 제 2 항에 있어서, TIE-2 리간드 1 의 피브리노겐-유사 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 일부가 TIE-2 리간드 2 의 피브리노겐-유사 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 치환된 TIE-2 리간드 1을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, TIE-2 수용체를 결합시키지만 활성화시키지는 않는 변형된 TIE-2 리간드를 암호화하는 분리된 핵산분자.
  12. 제 11 항에 있어서, TIE-2 리간드 1 의 감겨진 코일 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 일부가 TIE-2 리간드 2 의 감겨진 코일 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 치환되어 있는 것을 특징으로 하는 핵산분자.
  13. 제 11 항에 있어서, SEQ ID NO:20에 기재된 아미노산 서열을 갖는 키메라 TIE-2 리간드를 암호화하는 것을 특징으로 하는 핵산분자.
  14. 제 12 항에 있어서, SEQ ID NO:24에 기재된 아미노산 서열을 갖는 키메라 TIE-2 리간드를 암호화하는 것을 특징으로 하는 핵산분자.
  15. 제 1 항 내지 제 4 항 중의 어느 한 항의 핵산분자에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는 키메라 TIE-2 리간드.
  16. 제 15 항에 있어서, SEQ ID NO:20, 22, 24 또는 26에 기재된 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 키메라 TIE 리간드.
  17. 제 15 항에 있어서, SEQ ID NO:26에 기재된 서열을 갖으나, 뉴클레오티드 784-786 에 의해 암호화된 시스테인 잔기 대신에 다른 아미노산을 갖도록 변형되어 있는 것을 특징으로 하는 키메라 TIE 리간드.
  18. 제 1 항 내지 제 4 항 중의 어느 한 항의 핵산 분자를 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  19. 제 18 항에 있어서, 핵산 분자는 숙주세포에서 핵산 분자의 발현을 유도할 수 있는 발현 조절 서열에 작동 가능하게 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 벡터.
  20. 제 18 항에 있어서, 플라스미드인 것을 특징으로 하는 벡터.
  21. 제 15 항에 따른 키메라 리간드를 제조하기 위한 숙주-벡터 시스템으로서, 숙주세포 및 키메라 리간드를 암호화하는 핵산분자를 포함하는 벡터를 포함하는 것을 특징으로 하는 숙주-벡터 시스템.
  22. 제 21 항에 있어서, 숙주세포는 박테리아, 효모, 곤충 또는 포유동물 세포인 것을 특징으로 하는 숙주-벡터 시스템.
  23. 제 16 항에 따른 키메라 리간드를 제조하기 위한 숙주-벡터 시스템으로서, 숙주세포 및 키메라 리간드를 암호화하는 핵산분자를 포함하는 벡터를 포함하는 것을 특징으로 하는 숙주-벡터 시스템.
  24. 제 23 항에 있어서, 숙주세포는 박테리아, 효모, 곤충 또는 포유동물 세포인 것을 특징으로 하는 숙주-벡터 시스템.
  25. 제 15 항에 정의된 리간드를 제조하는 방법으로서, 리간드의 제조를 허용하는 조건하에서 숙주 세포 및 키메라 리간드를 암호화하는 핵산분자를 포함하는 벡터를 포함하는 숙주-벡터 시스템의 세포들을 성장시키는 단계와 그렇게 제조된 리간드를 회수하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 16 항에 정의된 리간드를 제조하는 방법으로서, 리간드의 제조를 허용하는 조건하에서 숙주 세포 및 키메라 리간드를 암호화하는 핵산분자를 포함하는 벡터를 포함하는 숙주-벡터 시스템의 세포들을 성장시키는 단계와 그렇게 제조된 리간드를 회수하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 15 항의 리간드에 특이적으로 결합하지만 천연 TIE-2 리간드에는 결합하지 않는 것을 특징으로 하는 항체.
  28. 제 27 항에 있어서, 단일클론 항체인 것을 특징으로 하는 항체.
  29. 제 16 항의 리간드에 특이적으로 결합하지만 천연 TIE-2 리간드에는 결합하지 않는 것을 특징으로 하는 항체.
  30. 제 29 항에 있어서, 단일클론 항체인 것을 특징으로 하는 항체.
  31. 제 15 항에 따르는 리간드 및 그것에 접합된 세포독성제를 포함하는 것을 특징으로 하는 접합체.
  32. 제 31 항에 있어서, 세포독성제는 방사성 동위원소 또는 독소인 것을 특징으로 하는 접합체.
  33. 제 16 항에 따르는 리간드 및 그것에 접합된 세포독성제를 포함하는 것을 특징으로 하는 접합체.
  34. 제 33 항에 있어서, 세포독성제는 방사성 동위원소 또는 독소인 것을 특징으로 하는 접합체.
  35. 제 15 항에 따르는 키메라 리간드 그리고 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  36. 제 16 항에 따르는 키메라 리간드 그리고 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  37. 제 27 항에 따르는 항체 그리고 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  38. 제 29 항에 따르는 항체 그리고 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  39. 제 31 항에 따르는 접합체 그리고 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  40. 제 33 항에 따르는 접합체 그리고 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
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Families Citing this family (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6265564B1 (en) 1996-08-02 2001-07-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Expressed ligand-vascular intercellular signalling molecule
US6030831A (en) 1997-09-19 2000-02-29 Genetech, Inc. Tie ligand homologues
US6348350B1 (en) 1997-09-19 2002-02-19 Genentech, Inc. Ligand homologues
AU4643699A (en) * 1998-06-24 2000-01-10 Compugen Ltd. Angiopoietin-like growth factor sequences
EP1141294B1 (en) * 1998-12-23 2005-03-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Method of enhancing the biological activity of ligands
US6455035B1 (en) 1999-03-26 2002-09-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Angiopoietins and methods of use thereof
CA2397833A1 (en) * 2000-01-20 2001-07-26 Hadasit Medical Research Services & Development Company Ltd. Novel haptotactic peptides
MXPA03001535A (es) 2000-08-21 2004-12-13 Pacific Corp Derivados de tiourea novedosos y las composiciones farmaceuticas que contienen los mismos.
US6753321B2 (en) 2000-09-15 2004-06-22 Genvec, Inc. Method of modulating neovascularization
US7658924B2 (en) 2001-10-11 2010-02-09 Amgen Inc. Angiopoietin-2 specific binding agents
US7138370B2 (en) 2001-10-11 2006-11-21 Amgen Inc. Specific binding agents of human angiopoietin-2
US7521053B2 (en) 2001-10-11 2009-04-21 Amgen Inc. Angiopoietin-2 specific binding agents
US7205275B2 (en) 2001-10-11 2007-04-17 Amgen Inc. Methods of treatment using specific binding agents of human angiopoietin-2
US7052695B2 (en) 2001-10-25 2006-05-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Angiopoietins and methods of treating hypertension
AU2002359464A1 (en) * 2001-11-30 2003-06-17 Genvec, Inc. Angiopioetin related factors
US7081443B2 (en) 2002-05-21 2006-07-25 Korea Advanced Institutes Of Science And Technology (Kaist) Chimeric comp-ang1 molecule
WO2004076650A2 (en) * 2003-02-27 2004-09-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Angiopoietin and fragments, mutants, and analogs thereof and uses of the same
US8232247B2 (en) * 2003-05-29 2012-07-31 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods of treating cancer, arthritis and/or diabetes with angiopoietins
US7485297B2 (en) * 2003-08-12 2009-02-03 Dyax Corp. Method of inhibition of vascular development using an antibody
WO2005019267A2 (en) * 2003-08-12 2005-03-03 Dyax Corp. Tie1-binding ligands
US7871610B2 (en) * 2003-08-12 2011-01-18 Dyax Corp. Antibodies to Tie1 ectodomain
CN1323723C (zh) * 2003-12-26 2007-07-04 上海新世界基因技术开发有限公司 Tie2受体介导的靶向性肿瘤基因治疗的基因转移系统
US8298532B2 (en) 2004-01-16 2012-10-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Fusion polypeptides capable of activating receptors
CN105085678B (zh) 2004-12-21 2019-05-07 阿斯利康公司 血管生成素-2的抗体及其应用
US20080213253A1 (en) * 2007-01-12 2008-09-04 Dyax Corp. Combination therapy for the treatment of cancer
JO2913B1 (en) 2008-02-20 2015-09-15 امجين إنك, Antibodies directed towards angiopoietin-1 and angiopoietin-2 proteins and their uses
WO2009158432A2 (en) 2008-06-27 2009-12-30 Amgen Inc. Ang-2 inhibition to treat multiple sclerosis
CA2758120C (en) * 2009-04-13 2014-08-19 Apceth Gmbh & Co. Kg Engineered mesenchymal stem cells and method of using same to treat tumors
CA2837169C (en) 2011-05-24 2021-11-09 Zyngenia, Inc. Multispecific complexes comprising angiopoietin-2-binding peptide and their uses
KR101967345B1 (ko) * 2012-10-18 2019-04-09 삼성전자주식회사 안지오포이에틴-2와 인테그린 간의 결합을 저해하는 펩타이드 및 그 용도
BR112015023752B1 (pt) 2013-03-15 2023-11-14 Zyngenia, Inc. Domínio de reconhecimento modular (mrd), complexo compreendendo mrd e cetuximabe, usos do complexo para inibir a angiogênese e tratar câncer e composição farmacêutica compreendendo o dito complexo
RU2538701C1 (ru) * 2013-07-11 2015-01-10 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки "Тюменский научный центр Сибирского отделения РАН" (ТюмНЦ СО РАН) Способ извлечения куриного эмбриона из яйца для дальнейшего получения клеточных трансплантатов из фетальных тканей
US10670611B2 (en) 2014-09-26 2020-06-02 Somalogic, Inc. Cardiovascular risk event prediction and uses thereof
US10588940B2 (en) 2015-11-06 2020-03-17 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Use of angiopoietins in promoting blood coagulation and in the treatment of blood coagulation disorders

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5070192A (en) * 1988-03-23 1991-12-03 The Johns Hopkins University Cloned human topoisomerase i: cdna expression, and use for autoantibody detection
US5814464A (en) * 1994-10-07 1998-09-29 Regeneron Pharma Nucleic acids encoding TIE-2 ligand-2
WO1996031598A1 (en) * 1995-04-06 1996-10-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Tie-2 ligands, methods of making and uses thereof
US6265564B1 (en) * 1996-08-02 2001-07-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Expressed ligand-vascular intercellular signalling molecule

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Publication number Publication date
EP0915974A1 (en) 1999-05-19
KR20000029778A (ko) 2000-05-25
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JP3977434B2 (ja) 2007-09-19
CZ31099A3 (cs) 2000-03-15
DK0915974T3 (da) 2004-07-12
PT915974E (pt) 2004-05-31
PL189639B1 (pl) 2005-09-30
US7045302B2 (en) 2006-05-16
US6265564B1 (en) 2001-07-24
NO990470L (no) 1999-04-06
US20030092891A1 (en) 2003-05-15
CZ295371B6 (cs) 2005-07-13
WO1998005779A1 (en) 1998-02-12
HU227995B1 (en) 2012-08-28
DE69728149D1 (de) 2004-04-22
IL128311A0 (en) 2000-01-31
NZ333994A (en) 2000-09-29
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