CN1232501A - 修饰的tie－2受体配体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种修饰的TIE－2配体,该配体已通过一个或多个氨基酸的插入、缺失或替代,或者通过标记法,比如用人IgG－1的Fc片段标记而被改变,但是该配体保留了与TIE－2受体的结合能力。本发明进一步提供了包含至少一部分第一TIE－2配体和一部分与第一配体不同的第二TIE－2配体的嵌合TIE－2配体的修饰TIE－2配体。在特定的实施方案中,本发明进一步提供了包含至少一部分TIE－2配体－1和一部分TIE－2配体－2的嵌合TIE配体。另外本发明提供了已分离的编码所述修饰TIE－2配体的核酸分子。本发明也提供了治疗组合物以及阻断血管生长的方法,促进新血管生成的方法,促进表达TIE受体的细胞生长或分化的方法,阻断表达TIE受体的细胞生长或分化的方法以及减缓或阻止人肿瘤生长的方法。

Description

修饰的TIE-2受体配体
本申请要求1996年10月25日提交的美国编号08/740,223和1996年8月2日提交的美国临时申请60/022,999的优先权。在整个申请中参考了各种出版物。这些出版物的公开内容在此以全文引入本申请作为参考。
           前言
从总体上本发明与基因工程这个领域有关，并且尤其是与编码酪氨酸酶受体以及它们的同族配体的基因，它们插入到重组DNA载体中，以及在受者微生物株和真核细胞中制备编码的蛋白质有关。更具体地说，本发明涉及一种与TIE-2受体结合的新的修饰TIE-2配体，以及制备和应用该修饰配体的方法。本发明进一步提供了编码修饰配体的核酸序列，以及制备编码修饰配体的核酸和基因产物的方法。该修饰的TIE-2配体以及编码它的核酸可有助于诊断和治疗某些包括内皮细胞和有关TIE受体的疾病，例如包括肿瘤血管生成的瘤性疾病，伤口愈合，血栓栓塞病、动脉粥样硬化和炎症。另外，该修饰的配体可用于促进造血干细胞的增殖和/或分化。更广义上说，激活此处所述的修饰TIE-2配体的受体可用于促进TIE受体表达细胞的生长，存活，迁移，和/或分化和/或稳定或去稳定。生物活化的修饰TIE-2配体可用于维持表达TIE受体的细胞的体外培养。例如，表达TIE受体的细胞和组织包括心脏和血管内皮细胞，晶状体上皮细胞和心外膜以及早期造血细胞。另外，这样的人配体可用于支持工程改造的能表达TIE受体的细胞。再者，修饰的TIE-2配体和它的同族受体可应用于进一步鉴定受体的激动剂和拮抗剂的实验系统。
        发明背景
在很大程度上，分化细胞和组织有关的发育、维持和修复的细胞行为由生长因子和相似的配体以及它们的受体所传递的细胞间的信号来调节。这些受体位于应答细胞的表面并且结合称为生长因子的肽或多肽以及激素类的其它配体。该相互作用的结果是应答细胞中的快速生化改变，以及细胞基因表达的快速和长期的再调节。各种细胞表面的几种受体可结合特异的生长因子。
酪氨酸激酶对蛋白质中酪氨酸残基的磷酸化是信号跨细胞膜转导的关键模式之一。几种目前已知的蛋白质酪氨酸激酶编码诸如上皮生长因子(EGF)，胰岛素，胰岛素类生长因子-1(IGF-1)，血小板衍生生长因子(PDGF-A和B)，和成纤维细胞生长因子(FGFs)等的多肽生长因子和激素的跨膜受体。(Heldin等，《细胞调控》(CellRegulation),1:555-566(1990)；Ullrich等，《细胞》(Cell)61:243-54(1990))。在每一个例子中，这些生长因子通过结合它们同族受体的细胞外区来发挥功能，该结合可激活位于受体胞浆区的内在酪氨酸激酶。由于生长因子可能参与几个重要的生理和病理过程，如血管发生，血管生成，动脉粥样硬化，和炎症，所以内皮细胞的生长因子受体特别令人感兴趣。(Folkman等，《科学》(Science),235:442-447(1987))。再者，几种造血生长因子的受体是酪氨酸激酶；这些受体包括c-fms，它是集落刺激因子1受体，Sherr等，《细胞》(Cell),41:665-676(1985)；以及c-kit，一种原始造血生长因子受体，报道于Huang等，《细胞》(Cell),63:225-33(1990)。
根据酪氨酸激酶受体外区的特征性结构将其分成数个进化亚族。(Ullrich等，《细胞》(Cell),61:243-54(1990))。这些亚族包括，EGF受体类激酶(亚类Ⅰ)和胰岛素受体类激酶(亚类Ⅱ)，每一亚族在其细胞外区均包含重复的富含半胱氨酸的同源序列。富含半胱氨酸的单区也见于eph类激酶的细胞外区。Hirai等，《科学》(Science),238:1717-1720(1987)；Lindberg等，《分子细胞生物学)》(Mol Cell.Biol.),10:6316-24(1990)；Chotak等，《分子细胞生物学》(Mol.Cell.Biol.),11:2496-2502(1991)。PDGF受体以及c-fms和c-kit酪氨酸激酶受体可划入亚类Ⅲ；而FGF受体组成亚类Ⅳ。由链内二硫键所稳定的细胞外折叠单位是这两个亚类成员的典型情况。这些类免疫球蛋白(Ig)的折叠区见于免疫球蛋白超家族的蛋白分子，该家族包括众多有细胞结合配体或可溶性配体的其它细胞表面受体。(Williams等，《免疫学综述年鉴》(Ann.Rev.Immunol.),6:381-405(1988))。
酪氨酸激酶受体在其特异性和亲和性方面各不相同。总体上，酪氨酸激酶受体是糖蛋白，它包括(1)能结合特定生长因子的细胞外区；(2)通常为蛋白质α-螺旋区的跨膜区；(3)近膜(juxtamembrane)区，在此受体可被调节，如通过蛋白质磷酸化调节；(4)为受体酶活性所在的酪氨酸激酶区；以及(5)在许多受体中涉及酪氨酸激酶底物的识别和结合的羧基端尾。
已经报道，诸如可变外显子剪接和基因启动子或多聚腺苷酸位点的可选择性等过程能够从同一基因上翻译出几种不同的多肽。这些多肽可包含也可不包含上述所列的各种结构域。因此，一些细胞外区可表达为游离的分泌性蛋白质并且受体的一些形式可缺乏酪氨酸激酶区以及只包含通过跨膜区加短的羧基末端尾而插入到细胞膜的细胞外区。
编码内皮细胞跨膜酪氨酸激酶的基因，最初从人白血病细胞中由RT-PCR鉴定为未知酪氨酸激酶的同源cDNA片断，见述于Partanen等，《美国国家科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),87:8913-8917(1990)。该基因和其编码的蛋白质被称为TIE，它是“具有Ig和EGF同源区的酪氨酸激酶”的缩写。Partanen等，《分子细胞生物学》(Mol.Cell.Biol.)12:1698-1707(1992)。
已经报道在所有的人胎儿和小鼠胚胎组织中均含有tie mRNA。经测定，tie信息已定位于心脏和血管内皮细胞中。更具体地说，tiemRNA已定位于9.5～18.5天小鼠胚胎的血管内皮和心内膜。在与发育中的卵巢滤泡和皮肤伤口中肉芽组织有关的新血管生成中可见到增强的tie表达。Korhonen等，《血液》(Blood)80:2548-2555(1992)。这样，可提示TIEs在血管再生中起作用，对于实体肿瘤和其它几种依赖血管再生的疾病(如糖尿病视网膜病，银屑病，动脉粥样硬化和关节炎)的许多正开发的治疗办法来说，血管再生是重要的。
已经报道两种结构上相关的大鼠TIE受体蛋白能被具有相关表达过程的不同基因编码。一个基因，称为tie-1，是人tie的大鼠同源序列。Maisonpierre等，《癌基因》(Oncogene)8:1631-1637(1993)。另一基因，tie-2，可能是小鼠tek基因的大鼠同源序列，tek基因象tie一样，已经报道它在小鼠中只表达于内皮细胞和它们的预期祖先细胞中(presumptive progenitors)。Dumont等，《癌基因》(Oncogene)8:1293-1301(1993)。tie-2的人同源序列见述于Ziegler,1995年9月5日授权的美国专利5,447,860号(在此该序列被称为“ork”)，在此该专利全文引用。
两个基因均在胚胎和出生后组织的内皮细胞中广泛表达。显著水平的tie-2转录也见于其它的胚胎细胞群，包括晶状体上皮细胞，心外膜和间质区。Maisonpierre等，《癌基因》(Oncogene)8:1631-1637(1993)。
TIE受体在血管内皮中的优势表达提示TIE在血管系统的发育和维持中起作用。这包括在内皮细胞决定，增殖，分化和细胞迁移以及形成血管中的作用。缺乏TIE-2的小鼠胚胎的分析说明了它在血管再生中的重要性，尤其是对内皮细胞中形成血管网络的重要性。Sato,T.N.等，《自然》(Nature)376:70-74(1995)。在成熟的血管系统中，TIEs在内皮细胞存活，维持和对病原因素的应答中发挥功能。
TIE受体也表达了原始造血干细胞。B细胞和巨核细胞亚群中，这提示与这些受体结合的配体在早期造血过程中，在B细胞的分化和/或增殖，以及巨核细胞分化的通路中发挥作用。Iwama等Biochem.Biophys.Research Communications 195:301-309(1993)；Hashiyama等，《血液》(Blood)87:93-101(1996),Batard等，《血液》(Blood)87:2212-2220(1996)。
       发明概要
本发明提供了包含修饰的TIE-2配体，基本上不含其它蛋白的组合物。如此处所用，修饰的TIE-2配体指配体TIE家族中的一种配体，其代表配体包括此处所述的配体TL1,TL2,TL3和TL4，该配体已通过一个或多个氨基酸的插入，缺失或替代，或通过标记，比如用人IgG-1 Fc段标记，而被改变，但仍保持其与TIE-2受体结合的能力。修饰的TIE-2配体也包括TIE-2嵌合配体，该配体包括至少一部分第一TIE-2配体和一部分与第一配体不相同的第二TIE-2配体。在非限定性的实施例中，第一TIE-2配体是TL1而第二TIE-2配体是TL2。本发明预见了采用其它TIE-2配体家族成员的其它组合。例如，制备TIE-2嵌合配体的其它组合是可能的，包括但不限于这些组合，其中第一配体选自TL1,TL2,TL3和TL4，第二配体，不同于第一配体，选自TL1,TL2,TL3和TL4。
本发明也提供了已分离的编码修饰的TIE-2配体的核酸分子。在一个实施方案中，该分离的核酸分子编码配体TIE家族中的TIE-2配体，其代表配体包括此处所述的配体TL1,TL2,TL3和TL4，该配体通过一个或多个氨基酸的插入，缺失或替代，或通过标记，例如，用人IgG-1 Fc段标记，而被改变，但仍保持其与TIE-2受体结合的能力。在另一实施方案中，该分离的核酸分子编码为TIE-2嵌合配体的修饰TIE-2配体，该嵌合配体包括至少一部分第一TIE-2配体和一部分不同于第一配体的第二TIE-2配体。在非限定性实施例中，第一TIE-2配体是TL1而第二TIE-2配体是TL2。本发明预见了采用其它TIE-2配体家族成员的其它组合。例如，其它的组合是可能的，包括但不限于这些组合，其中已分离的核酸分子编码为TIE-2嵌合配体的修饰TIE-2配体，该嵌合配体包括一部分选自TL1,TL2,TL3和TL4的第一配体，和一部分第二配体，第二配体不同于第一配体，选自TL1,TL2,TL3和TL4。
分离的核酸可为DNA,cDNA或RNA。本发明也提供了包含编码修饰TIE-2配体的已分离核酸分子的载体。本发明进一步提供了在适当的宿主细胞中制备具有修饰TIE-2配体生物活性的多肽。适当的宿主细胞可为细菌，酵母，昆虫或哺乳动物。本发明也提供了制备具有修饰TIE-2配体生物活性的多肽的方法，该方法包括在允许合成多肽并且能回收所合成多肽的条件下培养宿主-载体系统的细胞。
本发明此处关于编码修饰TIE-2配体的已分离的核酸分子的描述进一步提供了配体作为一种治疗方法的发展，该疗法用于治疗患涉及表达TIE-2受体的细胞，组织或器官的疾病的病人。本发明也提供了与这种治疗分子特异性结合的抗体。抗体可为单克隆抗体也可为多克隆抗体。本发明也提供了在采自病人的样品中用这种单克隆或多克隆抗体测定治疗性分子的数量的方法，以达到监控治疗过程的目的。
本发明也提供了与此处所述的TIE-2配体特异结合的抗体。该抗体可为单克隆抗体也可为多克隆抗体。这样本发明进一步提供了包含装载于制药上可接受的载体中的与修饰TIE-2配体特异结合的抗体的治疗组合物。本发明也提供了通过施用有效量的治疗组合物阻断哺乳动物血管生长的方法，该组合物包括与激活此处所述的修饰TIE-2配体的受体能特异结合的抗体，所述抗体装载于制药上可接受的载体中。
本发明进一步提供了包含此处所述的修饰TIE-2配体的治疗组合物，所述配体装载于制药上可接受的载体中。本发明也提供了通过施用有效量的治疗组合物促进患者新血管生成的方法。所说组合物包含此处所述的激活修饰TIE-2配体的受体，其装载于制药上可接受的载体中。在一个实施方案中，该方法可用于促进伤口愈合。在另一实施方案中，该方法用于治疗局部缺血。再一实施方案中，单独或与其它的造血因子联合使用激活此处所述的修饰TIE-2配体的受体，以促进造血干细胞，B细胞或巨核细胞的增殖或分化。
另外，本发明也提出修饰的TIE-2配体可偶联于细胞毒性试剂和用其制备治疗组合物。本发明也提供了与修饰TIE-2配体特异结合的融合受体。本发明进一步提供了包含与修饰TIE-2配体特异结合的融合受体的治疗组合物，所述融合受体装载于制药上可接受的载体中。本发明也提供了通过施用有效量的治疗组合物阻断哺乳动物血管生长的方法，所述组合物含有与修饰TIE-2配体特异结合的融合受体，其装载于制药上可接受的载体中。
本发明也提供了TIE-2受体拮抗剂以及抑制哺乳动物体内TIE-2生物活性的方法，该方法包括给哺乳动物施用有效量的TIE-2拮抗剂。根据本发明，该拮抗剂可为此处所述的结合但不激活TIE-2受体的修饰TIE-2配体。
         附图简述
图1A和1B-TIE-2融合受体(TIE-2 RB)抑制鸡胚尿囊绒膜(CAM)中的血管发育。用6μg RB浸泡的一块可吸收的明胶泡沫(Gelfoam)迅速插入到1天龄鸡胚的CAM之下。再孵化3天之后，取出4天龄的胚胎和包绕的CAM并进行检测。图1A：用EHK-1 RB(rEHK-1 ecto/hIgG1 Fc)处理的胚胎是可存活的并在其周围的CAM中具有正常发育的血管。图1B：用TIE-2 RB(rTIE-2ecto/hIgG1 Fc)处理的所有胚胎是死亡的，体积缩小并且几乎完全缺乏周围的血管。
图2-载体pJFE14。
图3-λgt10的限制性图谱。
图4-从编码htie-2配体1的λgt10克隆中所获得的人TIE-2配体1的核酸和推导的氨基酸序列(单字符)。
图5-从T98G克隆中所获得的人TIE-2配体1的核酸和推导的氨基酸(单字符)序列。
图6-从编码人TIE-2配体2的pBluescript KS克隆中所获得的人TIE-2配体2的核酸和推导的氨基酸(单字符)序列。
图7-表明TIE-2受体被TIE-2配体1激活(泳道L1)而不被TIE-2配体2(泳道L2)或对照(Mock)激活的Western杂交。
图8-Western杂交，它表明用过量TIE-2配体2(泳道2)预先处理HAEC细胞与用MOCK培养基(泳道1)预先处理HAEC细胞相比，它能拮抗稀释的TIE-2配体1随后激活TIE-2受体(TIE2-R)的能力。
图9-Western杂交，它用人细胞杂交细胞系EA.hy926证实了TL2竞争性抑制TL1激活TIE-2受体的能力。
图10-在C2C12 ras,Rat2ras,SHEP，和T98G浓缩(10×)的条件培养基中，TIE-2配体与大鼠TIE-2 IgG固化的表面相结合的直方图。存在25μg/ml可溶性大鼠TIE-2 RB时，大鼠TIE-2(rTIE-2)结合活性的明显降低与存在可溶性trkB RB时的略微降低相比较，可证实大鼠TIE-2(rTIE2)特异性结合。
图11-在COS细胞上清液中的重组人TIE-2配体1(hTL1)和人TIE-2配体2(hTL2)与人TIE-2受体(RB)固化表面的结合。人TIE-2的特异性结合通过25μg/ml的可溶性人TIE-2 RB或者trkB RB孵育样本测定；结合活性的明显降低仅见于用人TIE-2 RB所孵育的样本。
图12-Western杂交，它表明TIE-2融合受体(表示为TIE-2 RB或者，如此处，表示为TIE2-Fc)阻断TIE-2配体1(TL1)对HUVEC细胞中TIE-2受体的激活，然而不相关的受体(TRKB-Fc)不能阻断该激活。
图13-琼脂糖凝胶，它表明从E14.5小鼠胎肝(泳道1-全部组织，泳道3-富含基质，和泳道-4c-kit+TER119造血祖细胞)和E14.5小鼠胎儿胸(泳道2-全部组织)中所获得的TL1和TL2 RT-PCR产物的倍比稀释〔未稀释(1)到10-4〕。
图14-琼脂糖凝胶，它表明从E17.5小鼠胎儿胸腺皮质基质细胞(泳道1-CDR1+/A2B5-)和髓质基质细胞(泳道CDR1-/A2B5+)中所获得的TL1和TL2 RT-PCR产物的倍比稀释〔未稀释(1)到10-3〕。
图15-TIE-2/TIE配体在血管生成中的假定作用的说明图。TL1由(·)表示，TL2由(*)表示，TIE-2由(T)表示，VEGF由(〔〕)表示，flk-1(VEGF受体)由(Y)表示。
图16-原位杂交载玻片，它表明在血管生成过程中与已用受孕母马血清处理的大鼠卵巢中的卵泡发育和黄体形成有关的TIE-2,TL1,TL2和VEGF的暂时的表达模式。栏1：排卵前早期卵泡；栏2：排卵前卵泡；栏3：早期黄体；栏4：闭锁卵泡；A行：亮区(bright field)；B行：VEGF；C行：TL2；D行：TL1；E行：TIE-2受体。
图17-成熟TL1蛋白质和成熟TL2蛋白质的氨基酸序列比较。除了切除了公认的前导序列之外，TL1序列与图4中的序列相同。同理，除了切除了公认的前导序列之外，TL2序列与图6中的序列相同。箭头表示TL1中的Arg49,Cys245和Arg264残基，这些残基分别与图4中TL1的69,265和284氨基酸位置的残基相对应。
图18-TL1和TL2(A组)的共价多聚体结构以及由1个半胱氨酸突变所致的TL1和TL2的互相转换的Western杂交。
图19-在无细胞的定量结合试验中TIE-2-IgG与固化TL1结合的典型曲线。
图20-在无细胞的定量结合试验中，含有与IgG Fc段结合的配体的类纤维蛋白原区(TL1-fFc)的TIE-2配体1融合配体与固化的TIE-2胞外区结合的典型曲线。
图21-TIE配体-3的核苷酸和推导的氨基酸(单字符)序列。编码序列起始于位置47。类纤维蛋白原的区域起始于位置929。
图22-TIE配体家族成员的氨基酸序列比较。mTL3=小鼠TIE配体-3；hTL1=人TIE-2配体1；chTL1=小鸡TIE-2配体1；mTL1=小鼠TIE-2配体1；mTL2=小鼠TIE-2配体2；hTL2=人TIE-2配体2。画框的区域表示家族成员之间同源的保守区域。
图23-TIE配体-4的核苷酸和推导的氨基酸(单字符)序列。箭头表示569位核苷酸。
图24-称为1N1C2F的嵌合TIE配体(嵌合体1)的核苷酸和推导的氨基酸(单字符)序列。推测的前导序列由核苷酸1-60所编码。
图25-称为2N2C1F(嵌合体2)的嵌合TIE配体的核苷酸和推导的氨基酸(单字符)序列。推测的前导序列由核苷酸1-48所编码。
图26-称为1N2C2F(嵌合体3)的嵌合TIE配体的核苷酸和推导的氨基酸(单字符)序列。推测的前导序列由核苷酸1-60所编码。
图27-称为2N1C1F(嵌合体4)的嵌合TIE配体的核苷酸和推导的氨基酸(单字符)序列。推测的前导序列由核苷酸1-48所编码。
          发明详述
正如以下更详细的描述，申请人已经制备了与TIE-2受体结合的新型修饰TIE-2配体。本发明提供包含修饰TIE-2配体的，基本上不含其它蛋白的组合物。如此处所用，修饰的TIE-2配体是指配体TIE家族中的一种配体，其代表配体包括此处所述的配体TL1,TL2,TL3和TL4，该配体通过一个或多个氨基酸的插入，缺失或替代，或通过标记，例如用人IgG-1 Fc段标记，而已经改变，但仍保持其与TIE-2受体结合的能力。修饰的TIE-2配体与包括包含至少一部分第一TIE-2配体和一部分不同于第一配体的第二TIE-2配体的嵌合TIE-2配体。在非限定性实施例中，第一TIE-2配体是TL1，第二TIE-2配体是TL2。本发明预见了用其它TIE-2配体家族成员的组合。例如，制备嵌合TIE-2配体的其它组合是可能的，包括但不限于这些组合，其中第一配体选自TL1,TL2,TL3和TL4，而第二配体不同于第一配体，选自TL1,TL2,TL3和TL4。
本发明也提供了已分离的编码修饰的TIE-2配体的核酸分子。在一个实施方案中，该分离的核酸分子编码配体TIE家族中的TIE-2配体，其代表配体包括此处所述的配体TL1,TL2,TL3和TL4，该配体通过一个或多个氨基酸的插入，缺失或替代，或通过标记，例如，用人IgG-1 Fc段标记，而被改变，但仍保持其与TIE-2受体结合的能力。在另一实施方案中，该分离的核酸分子编码为TIE-2嵌合配体的修饰TIE-2配体，该嵌合配体包括至少一部分第一TIE-2配体和一部分不同于第一配体的第二TIE-2配体。在非限定性实施例中，第一TIE-2配体是TL1而第二TIE-2配体是TL2。本发明预见了采用其它TIE-2配体家族成员的其它组合。例如，其它的组合是可能的，包括但不限于这些组合，其中已分离的核酸分子编码为TIE-2嵌合配体的修饰TIE-2配体，该嵌合配体包括一部分选自TL1,TL2,TL3和TL4的第一配体，和一部分第二配体，第二配体不同于第一配体，选自TL1,TL2,TL3和TL4。
本发明包括修饰的TIE-2配体和它的氨基酸序列，以及它的功能性等价变体，和含有所述序列的替代，缺失或插入突变的蛋白质或多肽，它们能与TIE-2受体结合并做为它的激动剂或拮抗剂。这些变体包括那些氨基酸残基被替代成序列内的残基而致沉默改变的变化。例如，序列内的一个或多个氨基酸残基可被具有相似极性作为其功能性等价物的另外氨基酸替代，引起沉默改变。序列内一个氨基酸的替代可选自该氨基酸所属类别的其它成员。例如，非极性(疏水性)氨基酸类包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和蛋氨酸。中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天门冬酰胺和谷氨酰胺。带正电荷(碱性)的氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带负电荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。
本发明也包括蛋白质或其发挥与此处所述的修饰TIE-2配体相同或相似生物活性的片断或衍生物，以及在翻译过程中或之后有不同修饰的衍生物，例如，通过糖基化，蛋白质水解，与抗体分子或其它细胞配体连接等。功能上等价的分子也包括含有修饰，包括N末端修饰，的分子，这些分子表达于特定的重组宿主，例如，在某些细菌(如大肠杆菌)表达系统中存在的N末端甲基化。
本发明也包括编码本发明所述修饰TIE-2配体蛋白的核苷酸序列，以及宿主细胞，包括酵母，细菌，病毒，和哺乳动物细胞，这些细胞被基因工程改造以合成蛋白质，这些改造例如转染，转导，感染，电穿孔，或微注射装载于适当表达载体中的编码本发明所述的修饰TIE-2配体的核酸。本发明也包括通过基因治疗技术引入编码修饰TIE-2配体的核酸，基因治疗技术见，例如，Finkel和Epstein FASEB J.9:843-851(1995)；Guzman等，PNAS(USA)91:10732-10736(1994)。
本领域的技术人员也将认识到本发明包括在适度严紧的条件下与编码TIE-2配体的核苷酸序列杂交的DNA和RNA序列，这些条件如Sambrook等，《分子克隆：实验室手册)》(Molecular Choning:ALaboratory Manual),2版，卷1,101-104页，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)(1989)所确定的条件。这样本发明所考虑的核酸分子包括具有此处所述的从已制备的修饰TIE-2配体的氨基酸序列推导出来的核苷酸序列的分子，以及具有能与这段核苷酸序列杂交的核苷酸序列的分子，也包括由于遗传密码所致的为上述序列简并序列的核苷酸序列，该序列编码与TIE-2受体结合的配体，并且具有足以模拟此处所述的修饰TIE-2配体的氨基酸序列和其它一级，二级和三级结构特征，以致于在该分子上赋予了此处所述的修饰TIE-2配体的相同生物活性。
本发明提供了已分离的编码结合并激活TIE-2受体的修饰TIE-2配体的核酸分子，该分子包括编码TIE-2配体1的核苷酸序列，其中编码TIE-2配体1的N末端区域的部分核苷酸序列由编码TIE-2配体2的N末端区域的核苷酸序列所替换。该发明也提供了这样一种核酸分子，该分子进一步得到修饰以致于编码TIE-2配体1的卷曲螺旋区的部分核苷酸序列由编码TIE-2配体2的卷曲螺旋区的核苷酸序列所替换。
本发明也提供了已分离的编码结合并激活TIE-2受体的修饰TIE-2配体的核酸分子，该分子包括编码TIE-2配体1的核苷酸序列，其中编码TIE-2配体1的N末端区域的部分核苷酸序列由编码TIE-2配体2的N末端区域的核苷酸序列所替换，并且该分子进一步被修饰以编码不同的氨基酸而不是图27中所示的核苷酸784-787所编码的半胱氨酸残基。优选丝氨酸残基替代半胱氨酸残基。在另一实施方案中，核酸分子进一步被修饰以编码不同的氨基酸而不是图27所示的核苷酸199-201所编码的精氨酸。优选丝氨酸残基替代精氨酸残基。
本发明也提供了已分离的编码结合并激活TIE-2受体的修饰TIE-2配体的核酸分子，该分子包括编码TIE-2配体1的核苷酸序列，其中TIE-2配体被修饰以编码不同的氨基酸而不是在氨基酸位置245的半胱氨酸残基。优选丝氨酸残基替代半胱氨酸残基。
本发明进一步提供了已分离的编码结合但不激活TIE-2受体的修饰TIE-2配体的核酸分子，该分子包括编码TIE-2配体1的核苷酸序列，其中缺失了编码TIE-2配体1的N末端区域的部分核苷酸序列。本发明也提供了进一步被修饰的这样一种核酸分子，其中缺失了编码TIE-2配体1的卷曲螺旋区的部分核苷酸序列并且将编码类纤维蛋白原区的部分序列与编码人免疫球蛋白γ-1恒定区(IgG1 Fc)的核苷酸序列符合读框地融合。
本发明进一步提供了已分离的编码结合但不激活TIE-2受体的修饰TIE-2配体的核酸分子，该分子包括编码TIE-2配体2的核苷酸序列，其中该序列中缺失了编码TIE-2配体2的N末端区域的部分核苷酸序列。本发明也提供了这样一种进一步被修饰的核酸分子，其中缺失了编码TIE-2配体2的卷曲螺旋区的部分核苷酸序列，并且将编码类纤维蛋白原区的部分序列与编码人免疫球蛋白γ-1恒定区(IgG1Fc)的核苷酸序列符合读框地融合。
本发明进一步提供了已分离的编码结合但不激活TIE-2受体的修饰TIE-2配体的核酸分子，该分子包括编码TIE-2配体1的核苷酸序列，其中编码TIE-2配体1的类纤维蛋白原区的部分核苷酸序列由编码TIE-2配体2的类纤维蛋白原区的核苷酸序列替换。本发明也提供了进一步被修饰的这样一种核酸分子，其中编码TIE-2配体1的卷曲螺旋区的部分核苷酸序列由编码TIE-2配体2的卷曲螺旋区的核苷酸序列所替换。
本发明进一步提供了由本发明中任一核酸分子所编码的修饰TIE-2配体。
本发明也提供了包含至少一部分第一TIE-2配体和一部分不同于第一TIE-2配体的第二TIE-2配体的嵌合TIE-2配体，其中第一和第二TIE-2配体选自TIE-2配体1,TIE-2配体2,TIE-2配体3和TIE-2配体4。优选，嵌合TIE配体包含至少一部分TIE-2配体和一部分TIE-2配体2。
本发明也提供了编码图24、25、26或27所示的嵌合TIE配体的核酸分子。本发明也提供了图24、25、26或27所示的嵌合TIE配体。本发明进一步提供了图27所示的嵌合TIE配体，该配体被修饰以具有不同的氨基酸而不是核苷酸784-787所编码的半胱氨酸残基。
采用适当的转录/翻译调控信号和蛋白质编码序列，本领域中的技术人员所熟悉的任何一种将DNA片断插入载体的方法可用于构建编码修饰TIE-2配体的表达载体。这些方法可包括体外重组和合成技术以及体内重组(遗传重组)。编码修饰TIE-2配体或其多肽片断的核酸序列的表达可由与修饰TIE-2配体编码序列有效连接的第二核酸序列进行调控，这样修饰的TIE-2配体蛋白质或多肽表达于用重组DNA分离转化的宿主中。例如，此处所述的修饰TIE-2配体的表达可由本领域中已知的任一启动子/增强子进行调控。可用于调控配体表达的启动子包括，但不限于Squinto等所述的长末端重复序列，(《细胞》(Cell)65:1-20(1991))；SV40早期启动子区(Bernoist和Chambon，《自然》(Nature)290:304-310),CMV启动子，M-MuLV5′端重复序列，位于Rous肉瘤病毒的3′长末端重复序列中的启动子(Yamamoto等，《细胞》(Cell)22:787-797(1980))，疱疹病毒胸苷激酶启动子(Wagner等，《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A)78:144-1445(1981)。腺病毒启动子，金属硫蛋白基因的调控序列(Brinster等，《自然》(Nature)296:39-42(1982))；β-内酰胺酶启动子等原核生物表达载体(Villa-Kamaroff等，《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A)75:3727-3731(1978)，或者tac启动子(DeBoer等，《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A)80:2l-25(1983))，也参见《科学美国人》(Scientific American)242:74-94(1980)中的“来源于重组细菌的有用蛋白质”(“Useful proteinsfrom recombirant bacteria”)；Gal4启动子等来自酵母或其它真菌的启动子元件，ADH(醇脱氢酶)启动子，PGK(磷酸甘油激酶)启动子，碱性磷酸酶启动子，和以下的动物转录调控区，这些区有组织特异性并且已被应用于转基因动物中；在胰腺腺泡状细胞中有活性的弹性蛋白酶Ⅰ基因调控区(Swift等《细胞》(Cell)38:639-646(1984)；Ornitz等，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.50:399-409(1986)；MacDonwd，《肝病学》(Hepatology)7:425-515(1987)；在胰腺β细胞中有活性的胰岛素基因调控区〔Hanaban，《自然》(Nature)315:115-122(1985)〕；在淋巴细胞中有活性的免疫球蛋白基因调控区(Grosschedl等，1984，《细胞》38:647-658；Adames等，1985，《自然》(Nature)318:533-538；Alexander等，1987，《分子细胞生物学》(Mol.Cell.Biol.)7:1436-1444，在睾丸、乳腺、淋巴和肥大细胞中有活性的小鼠乳腺肿瘤病毒调控区(Leder等，1986，《细胞》(Cell)45:485-495)，在肝脏中有活性的白蛋白基因调控区(Pinkert等，1987,Genes andDevel,1:268-276)，在肝脏中有活性的α-胎儿球蛋白基因调控区(Krumlauf等，1985，《分子细胞生物学》(Mol.Cell.Biol.)5:1639-1648；Hammer等，1987，《科学》(Science)235:53-58)；在肝脏中有活性的α1-抗胰蛋白酶基因调控区(Kelsey等，1987,Genes and Devel,1:161-171)，在骨髓细胞中有活性的β-珠蛋白基因调控区(Mogram等，1985，《自然》(Nature)315:338-340；Kollias等，1986，《细胞》(Cell)46:89-94)；在大脑的少突神经胶质细胞中有活性的髓鞘基底蛋白基因调控区(Readhead等，1987，《细胞》(Cell)48:703-712)；在骨骼肌中活性的肌球蛋白轻链-2基因调控区(Shani,1985，《自然》(Nature)314:283-286)，和在下丘脑中有活性的促性腺细胞释放激素基因调控区(Mason等，1986，《科学》(Science)234:1372-1378)。本发明进一步包括制备能够特异地与编码修饰TIE-2配体的RNA序列杂交而调节其表达的反义复合物。Ecker，美国专利号5,166,195,1992年11月24日授权。
这样，根据本发明，包含此处所述的编码修饰TIE-2配体的核酸，能够在细菌或真核细胞宿主中复制的表达载体被用于转染宿主细胞从而指导该核酸的表达以制备修饰的TIE-2配体，然后以生物活性的形式回收配体。如此处所用，生物活性形式包括能够与TIE受体结合并导致分化功能或者影响受体表达细胞表型等生物反应的形式。例如，这种生物活性形式可能诱导TIE受体中酪氨酸激酶区的磷酸化。另一种情况，生物活性可以是作为TIE受体的拮抗剂。在另外的实施方案中，修饰TIE-2配体的活性形式是能够识别TIE受体从而作为受体的靶试剂而用于诊断和治疗。根据这些实施方案，活性形式不必赋予TIE表达细胞任何表型的改变。
含有基因插入片断的表达载体可通过四种普通方法加以鉴定：(a)DNA-DNA杂交，(b)“标记”基因功能的存在或缺乏，(c)插入序列的表达和(d)PCR测定。在第一种方法中，采用含有与插入的修饰TIE-2配体编码基因同源的序列的探针，通过DNA-DNA杂交可检测插入到表达载体中的外源基因是否存在。在第二种方法中，根据载体中由外源基因的插入所致的某些“标记”基因功能(如，胸苷激酶活性，抗生素抗性，转化表型，杆状病毒中包涵体的形成等)的存在或缺乏，可以鉴定或筛选重组载体/宿主系统。例如，如果编码修饰TIE-2配体的核酸插入到载体的标记基因序列中，那么含有该插入的重组体可以通过缺乏标记基因功能而鉴定出来。在第三种方法中，重组表达载体可以通过测定重组体所表达的外源基因产物而鉴定出来。例如，这些测定可基于修饰TIE-2配体基因产物的物理或功能特性，如，配体与TIE受体的结合或者与受体已标记的部分结合，如用可检测的抗体或其部分片断进行标记，或者与抗修饰TIE-2配体蛋白或其一部分的抗体相结合。本发明的细胞可短暂地或者，优选，组成性并永久地表达此处所述的修饰TIE-2配体。在第四种方法中，可制备与tie特异的DNA序列相对应的DNA核苷酸引物。然后将这些引物用于PCR扩增tie基因片断。(PCR Protocols A Guide To Methods andApplication,Michael A、Innis等编，Academic Press(1990))。
重组配体可通过允许随后形成稳定的有生物活性的蛋白质的任一技术来进行纯化。优选，配体被分泌到它将被回收的培养基中。另一方法，配体可作为可溶性蛋白质或作为包涵体从细胞中回收，根据众所周知的方法，它可以通过8M盐酸胍或透析从细胞中定量提取。为了进一步纯化配体，可以采用亲和层析，常规离子交换层析，疏水相互作用层析，反相层析或者凝胶过滤。
在本发明的另外的实施例中，正如实施例更详细的描述，修饰TIE-2配体的编码基因可用于灭活或通过同源重组“敲除”外源基因，从而产生TIE配体缺陷的细胞，组织，或动物。例如(举例不具有限制性)重组TIE配体-4的编码基因可工程改造使之含有插入突变，例如插入neo基因，该基因插入能灭活原来的TIE配体-4编码基因。在适当启动子的调控下，这种构建基因可通过转染，转导，或注射法而引入到细胞中，如胚胎干细胞。然后含有该构建基因的细胞可用G418抗性进行筛选。随后缺乏完整的TIE配体-4编码基因的细胞可被鉴定出，例如，通过Southern杂交，PCR检测，Northern杂交或者表达试验。缺乏完整的TIE配体-4编码基因的细胞再与早期胚胎细胞融合以制备缺乏该配体的转基因动物。这种动物可用于确定特定的体内过程，该过程在正常情况下是依赖该配体的。
本发明也提供了抗此处所述的修饰TIE-2配体的抗体，该抗体可用于检测配体，如在诊断应用中检测配体。为了制备抗修饰TIE-2配体的单克隆抗体，可采用任何通过连续细胞系培养而能提供抗体分子制品的技术。例如，最初由Kohler和Milstein开发的杂交瘤技术(1975,Nature,256:495-497)，以及三瘤(trioma)技术，人B细胞杂交瘤技术(Kozbor等，1983，《今日免疫学》(Immunology Today)4:72)，和制备人单克隆抗体的EBV杂交瘤技术(Cole等，1985，见“单克隆抗体和癌症治疗(Monoclonal Antibodies and CancerTherapy)”Alan R.Liss,Inc.77-96页)等均在本发明的范围之内。
单克隆抗体可为人单克隆抗体或人鼠(或其它物种)嵌合单克隆抗体。本领域已知的大量技术中的任一技术均可制备人单克隆抗体(如，Teng等，1983，《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)80:7308-7312；Kozbor等，1983，，《今日免疫学》(Immunology Today)4:72-79；Olsson等，1982,Meth.Enzymol.92:3-16)。含有小鼠抗原结合区并具有人恒定区的嵌合抗体分子也可制备出来(Morrison等，1984，《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)81∶6851,Takeda等，1985，《自然》(Nature)314:452)。
本领域中已知的各种程序步骤均可用于制备抗此处所述的修饰TIE-2配体各表位的多克隆抗体。为了制备抗体，各种宿主动物，包括但不限于兔、小鼠和大鼠均可通过修饰TIE-2配体，或其片断或其衍生物的注射来进行免疫。根据宿主的种类，各种佐剂均可用于增强免疫反应，佐剂包括但不限于弗氏佐剂(完全和不完全)，氢氧化铝等矿物胶(mineral gels)，溶血卵磷脂等表面活性物质，多聚醇，聚阴离子，多肽，油乳剂，钥孔血蓝质，二硝基酚，以及BCG(卡介苗)和小棒杆菌等可能有用的人佐剂。
抗已选定的修饰TIE-2配体表位的抗体的分子克隆可用已知的技术进行制备。重组DNA法(见如，Maniatis等，1982，《分子克隆》(Molecular Cloning)实验室手册，冷泉港实验室，冷泉港，纽约)可用于构建编码单克隆抗体分子，或其抗原结合区的核酸序列。
本发明提供了抗体分子以及该抗体分子的片断。含有该分子独特型的抗体片断可用已知的技术进行制备。例如，这些片断包括但不限于：胃蛋白酶消化抗体分子所产生的F(ab′)2片断；还原F(ab′)2片断的二硫键所制备的Fab′片断，以及用番木瓜酶和还原剂处理抗体分子所制备的Fab片断。抗体分子可用已知的技术进行纯化，如，免疫吸附或免疫亲和层析，HPLC(高效液相层析)等层析法，或者这些方法的组合。
本发明进一步包括测定生物样品中修饰TIE-2配体量的免疫试验，步骤包括：
a)将生物样品与至少一种特异地结合修饰TIE-2配体的抗体接触，这样抗体与样品中存在的任一种修饰TIE-2配体结合而形成复合物；
b)测定复合物的量，从而测定生物样品中修饰TIE-2配体的量。
本发明进一步包括测定生物样品中TIE受体量的试验，步骤包括
a)将生物样品与至少一种本发明的配体接触，这样配体与TIE受体形成复合物；和
b)测定复合物的量从而测定生物样品中TIE受体的量。
本发明也应用激活本文所述的TIE-2受体的修饰TIE-2配体以支持TIE-2受体表达细胞的存活和/或生长和/或迁移和/或分化。这样配体可作为补充因子以支持内皮细胞培养等。
再者，申请人对TIE-2受体相应的修饰TIE-2配体的制备使有助于鉴定TIE-2受体的激动剂或拮抗剂的试验系统得以应用。这些实验系统有助于鉴定那些能够促进或抑制血管生成的分子。例如，在一个实施方案中，TIE-2受体的拮抗剂可被鉴定为能够干扰TIE-2受体与结合TIE-2受体的修饰TIE-2配体相结合的测定分子。这些拮抗剂根据它们的以下能力而被鉴定：1)阻断有生物活性的修饰TIE-2配体与所测定的受体的结合，如，利用BIAcore生物传感器技术(BIAcore；Pharmacia Biosensor,Piscataway,NJ)；或者2)阻断有生物活性的修饰TIE-2配体导致生物反应的能力。这些生物反应包括，但不限于，TIE受体或者TIE信号转导通路中下游成员的磷酸化，或者TIE受体表达细胞的存活，生长或分化。
在一个实施方案中，工程改造使之表达TIE受体的细胞的生长可依赖于修饰TIE-2配体的添加。这些细胞为鉴定TIE受体的其它激动剂，或者能够干扰修饰TIE-2配体对这些细胞的活性的拮抗剂提供了有用的试验系统。另外，自分泌细胞，已工程改造使之能够共表达修饰TIE-2配体和受体，可为测定可能的激动剂或拮抗剂提供有用的系统。
因此，本发明将TIE-2受体引入正常情况下不表达该受体的细胞，这样允许这些细胞对结合该受体的配体表现出复杂的交易于鉴别的反应。所引发的反应类型依赖于所用的细胞，而不依赖于引入细胞的特异受体。可选择适当的细胞系为测定以及发现对酪氨酸激酶受体发挥作用的分子而产生最大用处的反应。这些分子可为任何类型的分子，包括但不限于多肽和非多肽分子，该分子在以受体特异的方式而描述的系统中发挥作用。
已被开发的更加有用的系统之一包括将TIE受体(或嵌合受体，其包括另一酪氨酸激酶受体，如trkC，的细胞外区和TIE受体的细胞内区)引入成纤维细胞系(如NIH 3T3细胞)，这样在正常情况下不介导增殖或其它反应的这种受体随着引入到成纤维细胞中而可用众多成熟的方法来进行测定，以定量成纤维细胞生长因子的效应(如胸苷摄入或其它类型的增殖试验；见Van Zoelen,1990《因子研究的进展》中“生物试验用于检测多肽生长因子”(“The Use of Biological AssaysFor Detection of Polypeptide Growth Factors”in ProgressFactor Research),2卷131-152页；Zhan和M.Goldfarb,1986《分子细胞生物学》(Mol.Cell.Biol.)6卷，3541-3544页)。这些试验具有额外的优点，即任何制品均可对具有引入的受体的细胞系和缺乏受体的亲本细胞系进行试验；只有对具有受体的细胞系所产生的特定效应才被判定为是通过引入的受体所介导的。这些细胞可进一步被工程改造以表达修饰的TIE-2配体，这样可创造自分泌系统，有助于测定在该相互作用中作为拮抗剂/激动剂来发挥作用的分子。这样，本发明提供了包含编码修饰TIE-2配体的核酸和编码TIE受体的核酸的宿主细胞。
TIE受体/修饰的TIE-2配体之间的相互作用也提供了鉴定TIE受体的小分子激动剂或拮抗剂的有用系统。例如，可鉴定出结合TIE受体但不能诱导任何其它生物活性的修饰TIE-2配体的片断，突变体或衍生物。另外，鉴定修饰TIE-2配体的特征使得能够鉴定该分子活性部分的特征。再者，配体的鉴定使得能够测定受体/配体复合物的X光晶体结构，从而使得能够鉴定受体上的结合位点。有关结合位点的知识将对新型激动剂和拮抗剂的合理设计提供有用的见解。
TIE受体相应的检测分子的特异性结合可以几种方式进行测定。例如，检测分子对TIE表达细胞的实际结合可被检测或测定，其方法是检测或测定(ⅰ)与完整细胞的表面相结合的检测分子；(ⅱ)与细胞裂解物中TIE蛋白交联的检测分子；或(ⅲ)体外与TIE结合的检测分子。检测分子与TIE之间的特异性相互作用可用证实该相互作用独特性的试剂加以评估。
作为特定的、非限制性的举例，本发明的方法可以如下使用。考虑一种样本中修饰TIE-2配体将被测定的情况。在存在已可检测地被标记了的修饰TIE-2配体(在该实例中为放射性碘标记的配体)的情况下，各种稀释度的样品(检测分子)，同时与不含修饰TIE-2配体活性的阴性对照(NC)和含已知量的修饰TIE-2配体的阳性对照(PC)一起暴露于表达TIE的细胞。评估检测样品中修饰TIE-2配体量的方法包括测定与对照结合和在各种稀释度下所结合的125I标记的修饰TIE-2配体的量，然后将样品中的数值与标准曲线相比较。样品中含越多的修饰TIE-2配体，则与TIE结合的125I-配体越少。
检测所结合的125I配体的量的方法包括测定每个细胞的放射性活性量，或者用DSS将修饰的TIE-2配体交联到细胞表面的蛋白上，见述于Meakin和Shooter,1991，《神经元》(Neuron)6:153-163，以及测定细胞提取物中标记蛋白的量，例如采用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法，它可以显示大小与TIE受体/修饰的TIE-2配体相对应的标记蛋白。检测分子/TIE之间特异性相互作用的检测方法包括将各种稀释度的不能与TIE受体结合因而对标记的修饰TIE-2配体和检测分子与TIE的竞争性结合基本上无影响的未标记对照配体加入到试验系统中。另外，已知能够破坏TIE受体/修饰TIE-2配体相结合的分子，例如，但不限于抗TIE抗体，或者本发明所述的TIE融合受体(receptorbody)，可期望能够干扰125I标记的修饰TIE-2配体和检测分子对TIE受体的竞争性结合。
已被可检测地标记了的修饰TIE-2配体包括，但不限于，与放射活性物质，荧光物质，具有酶活性的物质，可作为酶底物的物质(优选与比色法检测反应有关的酶和底物)或者与能够被抗体分子，优选为可检测地标记了的抗体分子，识别的物质共价或非共价交联的修饰TIE-2配体。
另一种方法，测定检测分子与TIE特异性结合的方法包括评估修饰TIE-2配体/TIE受体相结合的继发生物效应，包括，但不限于细胞生长和/或分化或即时早期基因表达或TIE的磷酸化。例如，检测分子诱导分化的能力可在缺乏tie以及在表达tie的相当细胞中进行检测；在tie表达细胞中的分化而不是在缺乏tie的相当细胞中的分化可以表示检测分子/TIE之间特异性相互作用。相似的分析包括检测缺乏tie和表达tie的细胞中即时早期基因的诱导(如fos和jun)，或者用本领域中已知的标准磷酸化试验检测TIE的磷酸化。该分析有助于鉴定非竞争性结合TIE的激动剂或拮抗剂。
同样，本发明提供了鉴定具有修饰TIE-2配体生物活性的分子的方法，包括(ⅰ)表达tie的细胞暴露于检测分子和(ⅱ)检测检测分子与TIE受体的特异性相互作用，其中与TIE的特异性结合与类TIE的活性呈正相关。特异性结合可通过测定直接的结合或者结合的继发生物效应来加以检测，如以上所述。该方法尤其有助于鉴定TIE配体家族中的新成员，或在制药工业中，有助于筛选大量肽或非肽分子(如，peptidomimetics)是否具有TIE相关生物活性。在本发明中优选的、特定的、非限制性实施方案中，按相间排列的方式，准备了大量含有缺乏tie或者工程改造使之表达tie的PC12(或成纤维细胞，见下)细胞的培养孔。然后加入各种检测分子，这样使每一栏，或其中一部分，含有不同的检测分子。随后对存在或缺乏生长和/或分化的每一培养孔进行计数。以这种方式可以筛选极大量的检测分子是否具有这种活性。
在另外的实施方案中，本发明提供了检测或测定类TIE配体活性或者鉴定具有该活性的分子的方法，包括(ⅰ)在允许发生结合的条件下，检测分子体外暴躁于TIE受体蛋白，以及(ⅱ)检测检测分子与TIE受体蛋白的结合，其中检测分子与TIE受体的结合与类TIE受体的活性有关。根据这些方法，TIE受体可以基本上纯化也可以没有基本上纯化，可以固定到固体支持物上(如，作为亲和柱或者作为ELISA试验)，或结合到人工膜上。检测分子与TIE受体的结合可通过本领域中任何已知的方法来进行评估。在优选实施方案中，检测分子的结合通过评估它与可检测地标记了的已知TIE配体竞争性地结合TIE受体的能力来加以检测或测定。
本发明也提供了检测检测分子作为类TIE配体活性的拮抗剂而发挥功能的能力的方法，包括检测该分子抑制TIE配体与表达TIE受体的细胞上的TIE受体相结合的能力。这种拮抗剂可以也可以不干扰TIE受体/修饰TIE-2配体之间的结合。优选修饰TIE-2配体与TIE受体结合的效应是生物或生化效应，包括，但不限于细胞存活或增殖，细胞转化，即时早期基因的诱导，或TIE磷酸化。
本发明进一步提供了鉴定抗体或能够中和或阻断配体与受体结合的其它分子的方法，以及用该方法所鉴定的分子。在非限制性的实例，该方法可通过原理与ELISA试验相似的试验来进行。例如，可使TIE融合受体结合到固体支持物上，如塑料多孔培养板。作为对照，将已知量的已被Myc-标记了的修饰TIE-2配体加入到孔中，然后能与受体结合的任何已标记的修饰TIE-2配体均可通过抗Myc-标记的报告抗体来进行鉴定。该试验系统随后用于筛选受检样本以获得这样的分子ⅰ)能够与标记配体结合的分子或者ⅱ)能够与受体结合因而阻断标记配体与受体结合的分子。例如，可将含有推定目标分子的受检样本与已知量的标记配体一起加入到孔中，然后测定与受体结合的标记配体的量。通过将受检样本中已结合的标记配体的量与对照中的量相比较，可鉴定出含有能够阻断配体与受体结合的分子的样本。这样鉴定的目标分子可用本领域中的技术人员熟知的方法加以分离。
一旦发现了配体结合的阻断者，本领域中的技术人员会知道进行二期试验以决定该阻断分子是与受体结合还是与配体结合，以及进行试验以决定阻断分子是否能中和配体的生物活性。例如，采用利用BIAcore生物传感器技术(或者等价技术)的结合试验，其中TIE融合受体或修饰TIE-2配体共价结合到固体支持物上(如金表面的羧甲基葡聚糖)，本领域的技术人员将能够决定阻断分子是与配体还是与受体特异地结合。为了决定阻断分子是否能中和配体的生物活性，本领域的技术人员利用原代培养，如内皮细胞的原代培养，可进行磷酸化试验(见实施例5)或另一种方法，功能性生物试验，如存活试验。另外，与受体结合的阻断分子可为激动剂，并且本领域的技术人员知道通过进行鉴定TIE受体其它激动剂的适当试验如何去测定它。
另外，本发明进一步包括以下组合物，其中TIE配体是本发明所述的TIE-2配体的受体结合区。例如，TIE-2配体1包含“卷曲螺旋”区(起始于5′端并延伸到图4中大约位置为1160的核苷酸和图5中大约位置为1157的核苷酸)和类纤维蛋白原的区域(由起始于图4中大约位置为1161和图5中大约位置为1158的核苷酸序列所编码)。TIE-2配体2的类纤维蛋白原的区域被认为起始于或大约起始于配体1(FRDCA)中由图6中大约从1197开始的核苷酸所编码的相同氨基酸序列。TIE配体3中类纤维蛋白原的区域起始于或大约起始于由图21所示的大约从位置929开始的核苷酸所编码的氨基酸序列。在配体的制备过程中其卷曲螺旋区的多聚体化(multimerization)阻碍纯化。然而，如实施例19所述，申请人已经发现类纤维蛋白原的区域包括TIE-2受体的结合区。但是类纤维蛋白原区域的单体形式似乎不能结合受体。利用myc标记的类纤维蛋白原区域，该区域已用抗myc抗体加以聚集，的研究表明它确实能结合TIE-2受体。〔《“聚集的”配体和融合配体(Ligandbody)的制备方法)》(Methods of production of“Clustered”Ligands and Ligandbodies)见述于Davis等，《科学)》(Science)266:816-819(1994)〕。根据这些发现，申请人制备了与IgG的Fc区偶联的包含TIE-2配体的类纤维蛋白原区域的“融合配体”(“fFc′s”)。这些融合配体形成多聚体，能有效地结合TIE-2受体。因此，本发明包括制备在诊断或治疗应用中能用作靶试剂(targeting agents)的修饰TIE融合配体，靶试剂如用于已指定了TIE拮抗剂的肿瘤和/或有关的脉管系统的靶试剂。
在此本发明进一步开发了配体，其片断或衍生物，或者为受体激动剂或拮抗剂的其它分子，以作为一种疗法治疗那些患涉及表达TIE受体的细胞、组织或器官的疾病的病人。这些分子可用于治疗人或者动物，或用于诊断。
因为与内皮细胞有关的TIE受体已经鉴定出，并且正如本发明所证实的，TIE-2配体1的阻断似乎能阻止血管发生，所以申请人预期本发明所述的修饰TIE-2配体在需要血管发生的疾病或紊乱中有助于诱导血管发生。这些疾病或紊乱包括伤口愈合，局部缺血和糖尿病。配体可在动物模型中进行检测并且应用于治疗，这正如对其它试剂的描述，如血管内皮生长因子(VEGF)，有助于血管生成的其它内皮细胞特异的因子。Ferrara等，1994年7月26日授权的美国专利号5,332,671。Ferrara参考文献，以及其它的研究，描述了体内外的研究，这些研究用于证实血管生成因子在增加局部缺血的心肌层的血流，促进伤口愈合，以及在其它需要新血管生成的治疗情况中的效果。〔见Sudo等，1993年7月7日出版的欧洲专利申请0550296A2；Banai等，Circulation89:2183-2189(1994)；Unger等，Am.J.Physiol.266:H1588-H1595(1994)；Lazarous等，Cirulation 91:145-153(1995)〕。根据本发明，修饰的TIE-2配体可单独或与一种或多种制药上有活性的其它化合物联合使用，如联合VEGF或碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，以及细胞因子，神经营养蛋白等。
相反，TIE受体的拮抗剂，例如结合但不激活本发明所述的受体的修饰TIE-2配体，实施例2和3中所述的融合受体，以及实施例9中所述的TIE-2配体2，将会有助于阻止或减弱血管发生，例如，这样可阻止或减缓肿瘤的生长。这些试剂可单独或与其它组合物联合使用，例如与抗VEGF抗体联合，该抗体已被证实有助于治疗那些治疗意图是阻断血管生成的疾病。申请人预期本发明所述的修饰TIE-2配体也可与其它试剂联用，例如联合IL-6拮抗剂等细胞因子拮抗剂，已知这些拮抗剂能阻止炎症。
例如，申请人已证实TIE配体被表达于肿瘤内或与肿瘤密切相关的细胞上。例如，TIE-2配体2似乎与肿瘤内皮细胞密切相关。因此，它和其它的TIE拮抗剂也有助于阻止或减缓肿瘤生长等。另外，TIE配体或偶联配体有助于将毒素传递到表达受体的细胞上。再者，通过TIE配体或偶联配体可将其它分子，如生长因子，细胞因子或营养素，传递到表达TIE受体的细胞上。本发明所述的修饰TIE-2配体等TIE配体或偶联配体也可用作TIE受体的诊断试剂，以在体内外检测受体。在TIE受体与疾病相关的情况下，修饰的TIE-2配体等TIE配体或偶联配体被用作诊断试剂可通过组织染色或整体成像等而有助于检测疾病。这些试剂包括放射性同位素，荧光染料，染料，酶和生物素。这些诊断剂或靶试剂可按照如下所述进行制备，Alitalo等，1995年10月5日出版的WO95/26364和在此全文引入的Burrows,F.和P.Thorpe,PNAS(USA)90:8996-9000(1993)。
在其它实施方案中，TIE配体，激活本发明所述的修饰TIE-2配体的受体被用作造血因子。许多造血因子和它们的受体都与血液中所含的各种细胞的增殖和/或分化和/或迁移有关。因为TIE受体表达于早期的造血细胞上，所以预期TIE配体在这些细胞的增殖或分化或迁移中发挥类似的作用。因而，例如，含TIE的组合物可在体内外的生物系统中进行制备，试验，检测并且应用于治疗，正如以下任何之一所述：Sousa，美国专利号4,810,643,Lee等，《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)82:4360-4364(1985),Wong等，《科学》(Science),228:810-814(1985)；Yokota等《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)81:1070(1984)；Bosselman等，WO9105795,1991年5月2日出版，题目为“干细胞因子(StemCell Factor)”以及Kirkness等，WO95/19985,1995年7月27日出版，题目为“造血成熟因子(Haemopoietic Maturation Factor)”。因此，激活修饰TIE-2配体的受体可用于诊断或治疗抑制了正常造血功能的疾病，包括，但不限于贫血，血小板减少症，白细胞减少症和粒细胞减少症。在优选的实施方案中，激活修饰TIE-2配体的受体可用于刺激血细胞祖细胞的分化，适合的情况包括病人患病的情况，如患导致血细胞减少的获得性免疫缺陷综合征(AIDS)，或者需要增加造血细胞群的临床情况，例如与骨髓移植相关的临床情况，或者治疗发育不全或放射，化学治疗或化疗所致的骨髓抑制的情况。
激活本发明的修饰TIE-2配体的受体可单独使用，或联合其它的制药活性剂，例如细胞因子，神经营养蛋白，白细胞介素等。在优选实施方案中，配体可联合使用以上提及的任何已知能诱导干细胞或其它造血祖细胞增殖的因子，或对造血通路中较晚期的细胞发挥作用的因子，这些因子包括，但不限于，造血成熟因子，血小板生成素，干细胞因子，红细胞生成素，G-CSF,GM-CSF等。
在另外的实施方案中，TIE受体拮抗剂被用于诊断或治疗需要抑制造血通路的病人，例如用于治疗骨髓的增殖性疾病或血形成器官的其它增殖性疾病，例如血小板增多症，红细胞增多症和白血病。在这些实施方案中，治疗包括使用治疗上有效量的修饰TIE-2配体，TIE抗体，TIE偶联受体，修饰TIE-2配体的偶联物，或偶联配体或fFC，正如本发明所述。
本发明也提供了制药组合物，包括本发明所述的修饰TIE-2配体或偶联配体，其肽片断，或在制药上可接受的载体中的衍生物。修饰的TIE-2配体蛋白，肽片断，或衍生物可全身或局部使用。本领域中已知的任何适当的使用方式均可被采用，包括，但不限于，静脉内、鞘内、动脉内、鼻内、口服、皮下、腹腔内，或局部注射或手术移植。也提供了持久释放制剂。
本发明也提供了与这种治疗分子特异性结合的抗体。抗体可为单克隆也可为多克隆。本发明也提供了使用这种单克隆或多克隆抗体的方法以测定采自病人的样本中所含的治疗分子的量来达到监测治疗过程的目的。
本发明进一步提供了包含修饰的TIE-2配体或偶联配体以及与它们相偶联的细胞毒性剂的治疗组合物。在一个实施方案中，细胞毒性剂可为放射性同位素或毒素。
本发明也提供了与修饰的TIE-2配体特异性结合的抗体。抗体可为单克隆抗体或多克隆抗体。
本发明进一步提供了纯化修饰TIE-2配体的方法，包括：
a)至少将一种TIE结合底物偶联到固体基质上；
b)a)中的底物与细胞裂解物一起孵育，这样底物与细胞裂解
物中的任何修饰TIE-2配体形成复合物；
c)冲洗固体基质；和
d)从偶联的底物上洗脱修饰的TIE-2配体。
底物可为特异性地结合修饰TIE-2配体的任何物质。在一个实施方案中，底物选自抗修饰TIE-2配体的抗体，TIE受体和TIE偶联受体。本发明进一步提供了与修饰TIE-2配体特异性结合的偶联受体，以及含有制药上可接受的载体中的偶联受体的治疗组合物，和阻断人血管生长的方法，其包括使用有效量的治疗组合物。
本发明也提供了如下治疗组合物，其包括制药上可接受的载体中的修饰的TIE-2配体或偶联配体所激活的受体，也提供了促进病人新血管生成的方法，其包括给病人使用有效量的治疗组合物。
另外，本发明提供了鉴定表达TIE受体的细胞的方法，其包括在允许已被可检测地标记了的配体与TIE受体相结合的条件下，将细胞与已被可检测地标记了的修饰TIE-2配体或偶联配体相接触，然后测定已被可检测地标记了的配体是否能与TIE受体结合，从而鉴定细胞是否为表达TIE受体的细胞。本发明也提供了包含修饰TIE-2配体或偶联配体以及与它们偶联的细胞毒性剂的治疗组合物。细胞毒性剂可为放射性同位素或毒素。
本发明也提供了检测修饰的TIE-2配体被细胞表达的方法，其包括从细胞中获取mRNA，在杂交条件下，这样获取的mRNA与已标记的编码修饰TIE-2配体的核酸分子接触，测定与标记分子杂交的mRNA，从而检测修饰的TIE-2配体在细胞中的表达。
本发明进一步提供了检测修饰TIE-2配体在组织切片中表达的方法，其包括在杂交条件下，将组织切片与编码修饰TIE-2配体的标记核酸分子接触，测定与标记分子杂交的mRNA，从而检测修饰TIE-2配体在组织切片中的表达。
实施例1鉴定ABAE细胞为TIE-2受体的报告细胞
Adultu BAE细胞以ECACC#92010601登记于欧洲细胞培养库(European Cell Culture Repository)中。(见PNAS 75:2621(1978))。Northern(RNA)分析表明在ABAE(成年牛动脉内皮细胞)细胞系中存在中等量的tie-2转录本，这与证实了tie-2RNAs几乎全部定位于血管内皮细胞的原位杂交结果一致。因此我们检测ABAE细胞裂解物以测定TIE-2蛋白的存在，并检测了正常条件和血清来源的生长条件下该TIE-2蛋白的酪氨酸被磷酸化的程度。收获ABAE细胞裂解物并进行免疫沉淀，随后用TIE-2特异的和磷酸酪氨酸特异的抗血清对免疫沉淀的蛋白进行Western杂交分析。在TIE-2的免疫沉淀过程中，作为特异性阻断分子的TIE-2肽的去除和包含可以明确鉴定出TIE-2为～150kD的中度可检测的蛋白，在细胞血清饥饿之前，其稳定状态的磷酸酪氨酸水平降低到几乎不可检测的水平。
ABAE细胞的培养和细胞裂解物的收获按如下所述进行。低代数的ABAE细胞以2×106个细胞/150mm塑料佩特里平皿(Falcon)的密度被铺成单层，并在5％CO2中培养于含10％小牛血清(10％BCS),2mM L-谷氨酰胺和青霉素与链霉素(P-S)各10％的Dulbecco’smodified Eagle’s培养基(DMEM)中。收获细胞裂解物之前，细胞在DMEM/Q/P-S中无血清饥饿24小时，然后吸出培养基并用补加了原钒酸钠、氟化钠和苯甲脒钠的冰预冷的磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)冲洗平皿。细胞在小体积的已补充了1％NP40去污剂和蛋白酶抑制剂PMSF与抑酶肽的该冲洗缓冲液中裂解。在4℃ 14,000G下离心10分钟从细胞裂解物中去除不溶性碎片，然后上清液用TIE-2受体特异的抗血清进行免疫沉淀，含或不含以-20μg/ml加入到裂解液中的阻断肽。免疫沉淀的蛋白质用PAGE(7.5％Laemmli凝胶)进行分散，然后电转移到PVDF膜上并与各种TIE-2抗血清或磷酸酪氨酸特异的抗血清一起孵育。将膜与HRP交联的二级抗血清一起孵育，随后用ECL试剂(Amersham)处理可以显现出TIE-2蛋白。实施例2 克隆和表达TIE-2融合受体以进行TIE-2配体相互作用
    的亲和性研究
建立将产生分泌性蛋白的表达构建物，该蛋白包含与人免疫球蛋白γ-1恒定区(IgG1 Fc)相融合的大鼠TIE-2受体的整个细胞外区。该融合蛋白被称作TIE-2“融合受体”(RB)，并且根据单体IgG1Fc尾之间二硫键的形成，在一般情况下可以预期该蛋白在溶液中以二聚体的形式存在。TIE-2 RB的Fc段制备如下。编码人IgG1从铰链区到蛋白质羧基端的Fc段的DNA片断，用相应于人IgG1的公开序列的寡核苷酸通过PCR从人胎盘cDNA中扩增，所获得的DNA片断在质粒载体中进行克隆。来自编码全长TIE-2受体的质粒和来自人IgG1Fc质粒的适当DNA限制性片断被连接于已设计用来符合读框地融合TIE-2和人IgG1 Fc蛋白编码序列的源于PCR的短序列的一端。这样，所得到的TIE-2外区-Fc融合蛋白准确的用IgG1 Fc替换了包括TIE-2跨膜和细胞浆区的区域。制备RBs的另一种方法见述于Goodwin等，《细胞》(Cell)73:447-456(1993)。
获得毫克量TIE-2 RB的方法包括将TIE-2 RB DNA克隆进pVL1393杆状病毒载体中，随后感染Spodoptera frugiperda SF-21AE昆虫细胞系。另外，也可用细胞系SF-9(ATCC登记号CRL-1711)或者细胞系BTI-TN-5b1-4。编码TIE-2 RB的DNA以EcoRⅠ-NotⅠ片断克隆进杆状病毒转移质粒pVL1393中。3μg的质粒DNA与0.5μg的Baculo-Gold DNA(Pharminigen)混合，随后用30μg Lipofectin(GIBCO-BRL)将其包入脂质体中，从而将氯化铯密度梯度离心纯化的质粒DNA重组到病毒DNA中。DNA-脂质体混合物加入到TMN-FH培养基(改良的Grace’s昆虫细胞培养基GIBCO-BRL))中的SF-21AE细胞上(2×106个细胞/60mm平皿)于27℃孵育5小时，随后在补充了5％胎牛血清的TMN-FH培养基中于27℃孵育5天。收集组织培养基以进行重组病毒的噬斑纯化，该操作用以前所述的方法进行(O’Reilly D.R.,L.K.Miller和V.A.Luckow，《杆状病毒表达载体-实验室手册》(Baculovirns ExpressionVectors-A Laboratory Manual)1992，纽约：W.H.Freeman)，不同之处在于琼脂糖层(argarose overlay)含有125μg/ml X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D吡喃半乳糖苷；GIBCO-BRL)。于27℃孵育5天后，通过对X-gal底物的阳性产色反应计数非重组的噬菌，并标记它们的位置。然后通过加入含100μg/ml MTT(3-〔4,5-二甲基噻唑-2-基〕2,5二苯基四唑氢溴酸盐；Sigma)的第二层来显示重组噬斑。用栓塞抽吸(Plug aspiration)挑出认定的重组病毒噬斑，并进行多轮噬斑分离来纯化它以确保均一性。病毒贮备物用噬斑纯化病毒的一系列低复数传代来制备。制备一个病毒克隆(vTIE-2融合受体)的低代贮备物。
SF-21AE细胞培养于含1×抗生素/抗霉菌素溶液(GibcoBRL)和25mg/L庆大霉素(Gibco BRL)的无血清培养基(SF-900ⅡGibco BRL)。Pluronic F-68作为表面活性剂以1g/L的终浓度加入。感染之前细胞在生物反应器(Artisan Ceu StationSystem)中至少培养3天。细胞生长于27℃，充入50％的溶解氧，气流率为80ml/min(在喷雾圈(sparge ring)处充气)。用海洋推进器(marine impeller)以100rpm的速率进行振荡。对数中期时收获细胞(～2×106个细胞/ml)，离心浓缩，并且每个细胞用5个噬斑形成单位的vTIE-2融合受体进行感染。细胞和接种物中加入新鲜培养基至400ml，然后在旋转瓶(spinner flask)中于27℃吸附病毒2小时。随后用新鲜的无血清培养基将细胞重悬于8L的终体积中，再按以前所述的条件将细胞孵育于生物反应器中。
感染后72小时离心收集vTIE-2融合受体感染的SF 21AE细胞的培养基(500×g,10分钟)。细胞上清用NaOH调pH至8。加入EDTA至终浓度10mM并将上清pH再调到8。过滤上清(0.45μm,Millipore)并上样于蛋白A柱(protein A sepharose 4 fast flow或者HiTrap protein A，均构自Pharmacia)上。该柱用含0.5M NaCl的PBS冲洗直至280nm的吸收值降至基线。用PBS冲洗柱子并用0.5M乙酸洗脱。柱子的洗脱样品由于洗脱入含1M Tris pH9的试管中而迅速被中和。收集含TIE-2融合受体的峰值样品并用PBS进行透析。实施例3证实TIE-2在脉管系统的发育中发挥关键作用
将“过量”可溶性TIE-2融合受体(TIE-2 RB)引入发育系统中可获得有关TIE-2功能的理解。TIE-2 RB与TIE-2配体结合，因而中和它的潜在能力会使得能够观察到正常血管发育的破坏并能够鉴定配体的特征。为了检测TIE-2 RB是否能用于破坏早期鸡胚胎的血管发育，生物吸附性泡沫的小块用TIE-2 RB浸泡并迅速插入到尿囊绒膜的下面，位置正好在原始胚(primitive embryo)的旁侧。
早期鸡胚在卵黄之上从尿囊绒膜(CAM)覆盖的细胞小盘(disk)上发育。在胚胎中将排成脉管系统的内皮细胞起源于外和内胚层细胞。外胚层起源的内皮细胞，提供了胚胎中内皮细胞的主要来源，起源于位于胚胎周围的间质的增加部分(accretions)，它正好位于CAM之下。当这些间质细胞成熟时，它们逐渐变成内皮细胞和造血细胞系的共同祖细胞，称为成血管细胞。随后，成血管细胞(hemangioblast)变成成血管细胞(angioblast)(内皮细胞祖细胞)和成血细胞(多能造血祖细胞)的混合细胞群。当内皮细胞的子细胞分离而形成包绕原始血细胞的一个细胞厚的囊泡时，就开始形成循环系统的原基。这些细胞成分的增殖和迁移最终在CAM之下形成血液填充的微血管的巨大网络，该网络将最终深入到胚胎中与有限的内胚起源的血管成分连接。
购自Spafas Inc(Boston,MA)的新受精鸡蛋于99.5°F,55％相对湿度下孵育。发育大约24小时时，用70％酒精擦拭蛋壳并用牙医钻在每个鸡蛋的钝头顶端钻1.5cm的孔。去除壳膜以暴露在胚胎正上方的气室。用手术刀将无菌Gelfoam(Upjohn)切成小长方形并浸入等浓度的TIE-2或EHK-1融合受体中。EHK-1融合受体按照实施例2中所示用EHK-1细胞外区而不是TIE-2细胞外区来制备(Maisonpierre等，《癌基因》)(Oncogene)8:3277-3288(1993)。每块Gelfoam大约吸收Boul中的6μg蛋白质。在原始胚胎旁侧数毫米的位置用制表镊(watchmaker forceps)在CAM上划一小裂口。大部分RB浸泡在Gelfoam小块被插入到CAM之下，然后用粘胶带密封鸡蛋壳。其它处于相似发育期的蛋用不相关的神经元表达的酪氨酸激酶受体，EHK-1的RB以同样方式处理(Maisonpierre等，《癌基因》(Oncogene)8:3277-3288(1993))。让蛋发育4天然后观察胚胎。在含温PBS的平皿中打破蛋壳并仔细切下CAM包裹的胚胎而将胚胎取出。在用每种RB处理的12个蛋中，6个用TIE-2 RB处理的胚胎和5个用EHK-1处理的胚胎已发育超过实验开始时所观察到的发育期。在这些发育的胚胎之间可见到明显的差异，如图1A和1B所示。那些用EHK-1 RB处理的胚胎似乎相对正常地发育。根据跳动的心脏来判断，5个EHK-1胚胎中有4个是可存活的。再者，外胚脉管系统，由于存在红色的血细胞所以明显可见，在CAM之下大量丰富而且向旁侧延伸了数厘米。相比之下，那些用TIE-2 RB处理的胚胎的发育严重受阻，直径2-5mm，与直径10mm以上的EHK-1 RB的胚胎形成对比。所有TIE-2 RB处理的胚胎均是死亡的并且它们的CAMs缺乏血管。在鸡中TIE-2 RB阻断血管发育的能力证实了TIE-2配体对脉管系统的发育是必要的。实施例4从ras癌基因转化的C2C12小鼠成肌细胞系的条件培养基中
鉴定TIE-2特异的结合活性
在各种细胞系的10倍浓缩的细胞条件培养基(10×CCM)中对是否存在可溶性的TIE-2特异性结合活性的筛选(BIAcore；Pharmacia Biosensor,Piscataway,NJ)表明癌基因ras转化的C2C12细胞(C2C12-ras),RAT2-ras(它是ras转化的成纤维细胞系)，人成胶质细胞瘤T98G和称为SHEP-1的人神经母细胞癌细胞系的无血清培养基中有结合活性。
C2C12-ras 10×CCM来源于C2C12成肌细胞稳定转染的细胞系，该细胞系是通过标准的磷酸钙为基础的方法用H-ras的T24突变体转染而癌性转化了的细胞系。SV40为基础的新霉素抗性表达质粒与ras表达质粒连接以允许转染克隆的筛选。所获得的G418抗性的ras-C2C12细胞在塑料平皿中以单层常规保持于补充了10％胎牛血清(FCS)的DMEM/谷氨酰胺/青霉素-链霉素中。无血清的C2C12-ras 10×CCM通过将汇合60％的细胞在无血清的指定培养基中培养12小时而加以制备。〔Zhan和Galdforb，《分子细胞生物学》(Mol.Cell.Biol.)6:3541-3544(1986)；Zhan等，《癌基因》(Oncogene)1:369-376(1987)〕。弃去培养基并用新鲜DMEM/Q/P-S替换，培养24小时，收集该培养基，再对细胞补充新鲜的DMEM/Q/P-S，继续培养24小时后也收集该培养基。对这些CCM补充蛋白酶抑制剂PMSF(1mM)和抑肽酶(10μg/ml)，并在无菌的大小排阻膜(Amicon)上进行10倍的浓缩。在BIAcore分析之前，TIE-2的结合活性可通过过量TIE-2RB同培养基的孵育而加以中和，而不能通过EHK-1 RB同培养基孵育而加以中和。
10×CCM的结合活性用生物传感器技术进行测定(BIAcore；Pharmacia Biosensor,Piscataway,NJ)，该技术通过表面胞质基因组共振(Surface plasmon resonance)来实时监测生物分子之间的相互作用。纯化的TIE-2 RB通过伯胺共价偶联于CM5研究级传感器芯片的羧甲基葡聚糖层(Pharmacia Biosensor；Piscataway,NJ)。传感器芯的表面用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和N-乙基-N′-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)的混合物进行活化，随后用TIE-2 RB(25μg/ml,pH4.5)进行固化并用1.0M乙醇胺(pH8.5)对未反应的部位去激活。以相似的方法制备EHK-1融合受体的阴性对照表面。
该系统中所用的循环(running)缓冲液是HBS(10mM Hepes,3.4mM EDTA,150mM NaCl,0.005％P20表面活性剂，pH7.4)。10×CCM的样品在4℃离心15分钟并用无菌低蛋白结合的0.45μm滤膜(Millipore；Bedford,MA)进一步净化。将葡聚糖(2mg/ml)和P20表面活性剂(0.005％)加到每份CCM样品中。40μl的等分试样以5μl/min的流速注射通过固化表面(TIE-2或EHK-1)，并监测受体结合8分钟。结合活性(共振单位，RU)被测定为样品注射前30秒所测的基线值与注射后30秒所测值之间的差。用3MMgCl2的一个12μl的脉冲(pulse)完成表面的再生。
仪器的噪音水平是20RU；因此，任何具有20RU以上的信号的结合活性均可被解释成与受体的真正相互作用。C2C12-ras条件培养基对TIE-2 RB固化的表面来说，其结合活性是60～90RU。对于在EHK-1 RB固化的表面上进行测定的同一样品来说，所测定的活性低于35RU。与TIE-2融合受体的特异性结合通过在测定结合活性之前将样品与过量的可溶性TIE-2或EHK-1 RB共同孵育来进行评估。加入可溶性EHK-1 RB对任何样品的TIE-2结合活性均无影响，而当可溶性TIE-2与表面结合时所测的值比无TIE-2时所测的值少三分之二。用＞50×浓缩的C2C12-ras CCM进行的重复试验得到比TIE-2特异性结合信号的背景增强4倍的结果。实施例5 C2C12-ras CCM含有诱导TIE-2受体
酪氨酸磷酸化的活性
检测C2C12-ras 10×CCM诱导ABAE细胞中TIE-2酪氨酸磷酸化的能力。按以上所述，血清饥饿的ABAE细胞与C2C12-rasCCM短暂共育，裂解并进行免疫沉淀和Western分析。无血清的C2C12-ras10×CCM对血清饥饿的ABAE细胞的刺激按以下步骤进行。吸去按以上所述进行饥饿的ABAE细胞的培养基并用预温到37℃的指定培养基或10×CCM替换。10分钟后，吸去培养基并用补充了原钒酸/NaF/苄脒的过量冷PBS在冰上冲洗细胞两次。细胞裂解和TIE-2特异的沉淀按以上所述进行。
ABAE细胞与指定培养基共育10分钟未表现出TIE-2酪氨酸磷酸化的诱导，然而在TIE-2的磷酸化方面，与C2C12-ras CCM其育至少刺激了100倍的增加。室温下C2C12-ras 10×CCM与13μg偶联于蛋白G-Sepharose珠子的TIE-2 RB预先孵育90分钟则几乎全部丧失该活性。单独与蛋白G Sepharose孵育则不能去除该磷酸化活性。实施例6 TIE-2配体的表达克隆
在5％的CO2中COS-7细胞培养于含10％胎牛血清(FBS)，青霉素和链霉素(P/S)各1％和2mM谷氨酰胺的Dulbecco’s modifiedEagle’s培养基(DMEM)中。小鼠成肌细胞C2C12 ras细胞系培养于含10％FBS,(P/S)和2mM谷氨酰胺的Eagle’s极限必需培养(EMEM)中。在表达于COS最基本细胞的pJFE14载体中筛选C2C12ras cDNA文库来获得小鼠TIE-2配体全长cDNA的克隆。该载体，示于图2，是载体pSRα的改良载体(Takebe等，1988，《分子细胞生物学》(Mol.Cell.Biol.)8:466-472)。用pJFE14载体中的两个BST×1限制性酶切位点来制备文库。
根据DEAE-葡聚糖转染方案，用pJFE14文库或对照载体短暂转染COS-7细胞。简而言之，转染前24小时COS-7细胞培养至1.0×106个细胞/100mm平皿的密度。为了转染，在5％CO2 37℃的条件下细胞培养于含400μg/ml DEAE-葡聚糖，1μM氯奎，2μM谷氨酰胺和1μg适当DNA的无血清DMEM中，培养3-4小时。吸去转染培养基并用含10％DMSO的PBS替换后保持2-3分钟。该DMSO“休克”之后，COS-7细胞被放入含10％FBS，青霉素和链霉素各1％，和2mM谷氨酰胺的DMEM中，培养48小时。
因为TIE-2配体被分泌出，所以有必要使细胞通透以检测融合受体探针与配体的结合。转染2天后细胞用PBS冲洗，然后与含1.8％甲醛的PBS室温下共育15-30分钟。随后细胞用PBS冲洗并与含0.1％Triton X-100和10％小牛血清的PBS共育15分钟以使细胞通透并阻断非特异性结合位点。
利用TIE-2融合受体(RB)，其包括与IgG1恒定区融合的TIE-2的细胞外区，通过直接的染色定位来进行筛选。该融合受体按实施例2进行制备。100mm平皿中已转染的、固定的并已通透的COS细胞与TIE-2 RB共育30分钟来进行探测。然后用PBS冲洗两次并与PBS/10％小牛血清/抗人IgG碱性磷酸酶偶联物再共育30分钟。PBS冲洗3次后，细胞在碱性磷酸酶底物中孵育30-60分钟。然后在显微镜下看平皿中是否存在染色的细胞。对每个染色的细胞，用塑料吸头将包含染色细胞的小区域内的细胞从平皿上刮下，然后回收质粒DNA并用其电转化细菌细胞。从电转化中所获得的单个细菌菌落被挑出并且从这些菌落中制备的质粒DNA被用来转染已被探测了TIE-2配体表达的COS-7细胞，该探测通过与TIE-2融合受体的结合来证实。以上操作允许鉴定出编码TIE-2配体的单个克隆。采用实施例5中的方法通过TIE-2受体的磷酸化来证实TIE-2配体的表达。编码TIE-2配体的质粒克隆于1994年10月7日保藏在ATCC并称为“编码TIE-2配体的pJFE14”,ATCC登记号为75910。实施例7编码人TIE-2配体的全长cDNA克隆的分离和测序
在λgt-10中的人胎儿肺cDNA文库(见图3)获自ClontehLaboratories,Inc.(Palo Alto,CA)。以1.25×106/20×20cm平皿的密度在平皿中铺开噬斑，并按标准步骤使用复印膜(replicafilters)(Sambrook等，《分子克隆：实验室手册》(MolecularCloning:A Laboratory Manual)，第2版，8.46页，冷泉港实验室，冷泉港，纽约)。
人tie-2配体克隆的分离如下。来源于保藏的tie-2配体克隆(ATCC登记号75910-见以上实施例6)的2.2kb Xho1片断用随机引物法进行标记以达到特异性活性大约为5×108cpm/ng。在65℃于含0.5mg/ml鲑精DNA的杂交液中进行杂交。滤膜在65℃于2×SSC,0.1％SDS中进行冲洗并在-70℃对Kodak XAR-5胶片曝光过夜。阳性噬菌体是噬斑纯化的。用标准技术通过Qiagen柱(Qiagen,Inc.,Chatsworth,CA,1995目录，36页)从纯噬菌体的高滴度噬菌体裂解物中分离DNA。用EcoRⅠ酶切噬菌体DNA释放出克隆的cDNA片断以进行随后的亚克隆。含人tie-2配体DNA的λ噬菌体载体于1994,10,26以编码htie-2配体1的λgt10的名称保藏于ATCC(ATCC登记号75928)。噬菌体DNA通过双脱氧链终止法(Sanger等，1977,《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)74:5463-5467)可直接进行DNA测序分析。
人tie-2配体DNA亚克隆进哺乳动物表达载体中可如下进行。编码htie-2配体1的克隆λgt10含有EcoRⅠ位点，其位于人TIE-2配体编码序列起始位置下游的490个碱基对。分别用起始和终止密码子上游和下游的唯一限制性位点来切下编码区。如，Spe1位点，位于起始密码子5′的70bp处，和Bpullozi(也称为BlpⅠ)位点，位于终止密码子3′的265pb处，可用于切下完整的编码区。然后将其亚克隆进pJFE14克隆载体中，使用的是Xba1(与SpeⅠ位点相应)和PstⅠ位点(PstⅠ和Bpullozi位点均是平末端)。
来自编码htie-2配体1的克隆λgt10的编码区用ABI373A DNA测序仪和Taq双脱氧终止循环测序试剂盒来测序(AppliedBiosystems,Inc.,Foster.City,CA)。编码htie-2配体1的克隆λgt10中的人TIE-2配体的核苷酸和推导的氨基酸序列示于图4。
另外人tie-2配体全长cDNA的克隆通过在pJFE14载体中筛选人成胶质细胞瘤T98G的cDNA文库来获得。用来源于保藏的tie-2配体克隆(ATCC登记号75910)的2.2kb XhoⅠ片断作为探针，通过DNA杂交来鉴定编码人TIE-2配体的克隆(见上述实施例6)。编码区用ABI 373A DNA测序仪和Taq双脱氧终止循环测序试剂盒(AppliedBiosystems,Inc.,Foster.City,CA)来进行测序。该序列几乎等同于编码htie-2配体1的克隆λgt10的相应序列。如图4所示。编码htie-2配体1的克隆λgt10含有由核苷酸1114-1116所编码的另一个甘氨酸残基。T98G克隆的编码序列不含该甘氨酸残基，但却等同于编码htie-2配体1的克隆λgt10的编码序列。图5表示来源于T98G克隆的人TIE-2配体的核苷酸和推导的氨基酸序列。实施例8第二个编码人TIE-2配体的全长cDNA克隆的分离和测序
λgt-10(见图3)中的人胎儿肺cDNA文库获自ClontechLaboratories,Inc.(Palo Alto,CA)。以1.25×106/20×20cm平皿的密度在平皿中铺开噬斑，并按标准步骤使用复印膜(Sambrook等，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning:A LaboratoryManual)第2版，8.46页，冷泉港实验室，冷泉港，纽约)。复印的膜在低严紧条件(2×SSC,55℃)下用针对于人TIE-2配体1序列的探针来进行筛选。复印膜之一用5′探针探测，该探针编码人TIE-2配体1的氨基酸25-265，如图4所示。第二张复印膜用3′探针探测，该探针编码人TIE-2配体1序列的氨基酸282-498(见图4)。两种探针均在55℃下于含0.5mg/ml鲑精DNA的杂交液中杂交。滤膜在55℃于2×SSC中冲洗并对X-光胶片过夜曝光。另外，复印膜也在正常严紧条件(2×SSC,65℃)下与小鼠TIE-2配体1的全长编码探针(F3-15,XhoⅠ插入)进行杂交。符合以下标准的三个阳性克隆被挑出：ⅰ．在正常严紧条件下对全长(小鼠)探针未见到杂交，和ⅱ．在低严紧条件下对5′和3′探针均见到杂交。从这些克隆中获得的噬菌体DNA EcoRⅠ的酶切表明是具有插入片断大约2.2kb和大约1.8kb的两个独立克隆。2.2kb的EcoRⅠ插入片断被亚克隆进pBluescriptKS(Stratagene)和适合用于COS细胞的哺乳动物表达载体的EcoRⅠ位点。哺乳动物的表达载体鉴定出两种定向。pBluescript KS中的2.2kb插入片断于1994.12.9保藏在ATCC并称为编码人TIE-2配体2的pBluescript KS。TIE-2配体2编码序列的起始位点位于pBluescriptEcoRⅠ位点下游的大约355碱基对处。
按照DEAE-dextran转染方案用表达载体或对照载体短暂转染COS-7细胞。简而言之，转染前24小时，COS-7细胞以1.0×106个细胞/100mm平皿的密度铺在平皿中。为了转染，细胞在5％CO237℃培养于含400μg/ml DEAE-葡聚糖，1μM氯奎，和2mM谷氨酰胺以及1μg适当DNA的无血清DMEM中，培养3-4小时。吸出转染培养基并用含10％DMSO的磷酸缓冲盐溶液替换，培养2-3分钟。该DMSO“休克”后，COS-7细胞被放入含10％FBS，青霉素和链霉素各1％，和2mM谷氨酰胺的DMEM中。
因为TIE-2配体被分泌出所以有必要使细胞通透以检测融合受体探针与配体的结合。转染的COS-7细胞以1.0×106个细胞/100mm平皿的密度铺在平皿上。细胞用PBS冲洗，然后与含1.8％甲醛的PBS于室温下共育15-30分钟。随后用PBS冲洗细胞并与含0.1％的TritonX-100和10％小牛血清的PBS共育15分钟以使细胞通透并阻断非特异的结合位点。利用TIE-2融合受体，其包括与IgG1恒定区相融合的TIE-2的细胞外区，通过直接的染色定位来进行筛选。该融合受体按实施例2所示进行制备。转染的COS细胞与TIE-2融合受体共育30分钟来进行探测。然后用PBS冲洗细胞两次，用甲醇固定，并与PBS/10％小牛血清/抗人IgG碱性磷酸酶偶联物再共育30分钟。PBS冲洗3次后，细胞在碱性磷酸酶底物中孵育30-60分钟。然后在显微镜下观察平皿中是否存在染色的细胞。可以观察到表达一种定向的克隆而不表达另一种定向的克隆的细胞能够与TIE-2融合受体结合。
本领域中的技术人员易于明白所述的方法可用于进一步鉴定TIE配体家族中的其它相关成员。
来源于编码人TIE-2配体2的克隆pBluescript KS中编码区用ABI373A DNA测序仪和Taq双脱氧终止循环测序试剂盒(AppliedBiosystems,Inc.,Foster.City,CA)来进行测序。来源于编码人TIE-2配体2的克隆pBluescript KS中的人TIE-2配体的核苷酸和推导的氨基酸序列如图6所示。实施例9 TIE-2配体2是受体拮抗剂
比较表达TIE-2配体2(TL2)或TIE-2配体1(TL1)的COS细胞的条件培养基激活天然存在于人内皮细胞系上的TIE-2受体的能力。
Lipofectamine试剂(GIBCO-BRL,Inc.)和推荐的方法被用于转染COS-7细胞，转入的载体包括pJFE14表达载体，含人TIE-2配体1 cDNA的pJFE14载体，或者含人TIE-2配体2 cDNA的pMT21表达载体(Kaufman,R.J.,1985，《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)82:689-693。3天后收集含已分泌的配体的COS培养基并通过渗滤(DIAFLO超滤膜，Amicon,Inc.)浓缩20倍。测定这些培养基中存在的TIE-2配体1和TIE-2配体2的量并表示为TIE-2受体通过BIAcore结合试验所测定的特异性结合活性的量(以共振单位表示，R.U.)。
Northern(RNA)分析表明在HAEC(人主动脉内皮细胞)人原代内皮细胞(Clonetics,Inc.)中存在大量的TIE-2转录本。因此，这些细胞被用于测定当与含TIE-2配体的COS培养基共育时TIE-2受体是否进行了酪氨酸磷酸化。将HAEC细胞保持在完全内皮细胞生长培养基中(Clonetics,Inc)，该培养基包括5％胎牛血清，可溶性牛脑提取物，10ng/ml人EGF,1mg/ml氢化可的松，50mg/ml庆大霉素和50ng/ml二性霉素B。按以下步骤进行TL1和TL2是否能激活HAEC细胞中TIE-2受体的评估。半汇合的HAEC细胞在已添加了L-谷氨酰胺和青霉素-链霉素的高糖Dulbecco’s MEM中于37℃进行血清饥饿2小时，随后用含配体的COS条件培养基替换饥饿培养基，于37℃在5％CO2孵箱中孵育7分钟。然后裂解细胞并用TIE-2肽抗血清对裂解物免疫沉淀来回收TIE-2受体蛋白，其后用如实施例1中所述的抗磷酸酪氨酸抗血清进行Western杂交。结果见图7所示。TIE-2配体1(泳道L1)而不是含TIE-2配体2(泳道L2)的COS条件培养基对HEAC细胞进行处理诱导TIE-2受体(TIE-2-R)上的磷酸酪氨酸水平。MOCK是来自JFE14空载体转染的COS的条件培养基。
TL1和TL2特异地与TIE-2受体结合的证实方法包括用BIAcore测定转染的COS培养基中TIE-2受体的特异性结合活性以及用TIE-2融合受体对表达TL1和TL2的COS细胞进行免疫标记。
因为TL2不能激活TIE-2受体，所以申请人开始测定TL2是否能够作为TL1活性的拮抗剂。于是进行HAEC磷酸化试验，在该试验中细胞首先与过量的TL2共育，随后加入稀释的TL1。可以推测，由于大量TL2存在，所以当暴露于以有限浓度存在的TL1时，TIE-2受体被TL2的预先占据会阻止受体被TL1的随后激活。
半汇合的HAEC细胞按以上所述进行血清饥饿，然后于37℃与1-2ml 20×COS/JFE14-TL2条件培养基共育3分钟。对照平皿用20×COS/JFE14-only培养基(MOCK)进行处理。从孵箱中取出平皿并加入各种稀释度的COS/JFE14-TL1血清，然后于37℃进一步孵育5-7分钟。其后按以上所述冲洗，裂解细胞并且用受体进行免疫沉淀和Western杂交来测定裂解物中TIE-2特异的酪氨酸磷酸化。TL1稀释液用通过加入20×COS/JFE14-alone培养基而被稀释到2×,0.5×,0.1×，或0.02×的20×COS/JFE14-TL1的培养基来制备。用BIAcore生物传感器技术对初始20×TL1和20×TL2 COS培养基进行的试验表明它们含有相似量的TIE-2特异性结合活性，即，对TL1和TL2分别是445R.U.和511R.U.。抗磷酸酪氨酸Western杂交的结果示于图8，它表明当与HAEC细胞预先用MOCK培养基处理相比(泳道1)，用过量的TIE-2配体2对HAEC细胞预先处理(泳道2)能拮抗稀释的TIE-2配体1随后激活TIE-2受体(TIE-2-R)的能力。
TL2竞争性地抑制TL1激活TIE-2-R的能力可用人细胞杂交系，EA.hy926(见实施例21有关该细胞系和其维持培养的详细描述)进一步进行证实。所做的实验包括含TL1的未浓缩COS细胞培养基以各种稀释度与MOCK-或TL2-条件培养基混合并于37℃与血清饥饿的EA.hy926单层细胞共育5分钟。然后吸去培养基，通过裂解收获细胞并进行Western杂交来检测TIE-2特异的酪氨酸磷酸化，均按以上所述进行操作。图9表示包含三种处理组的实验，从左到右。正如左边的四个泳道所示，单独用1×COS-TL1处理EA.hy926细胞明显激活这些细胞内的内源性TIE-2-R，而1×TL2 COS培养基却是灭活的。然而，TL1与MOCK或TL2的混合物证实TL2能以剂量依赖的方式阻断TL1的活性。在中间的三对泳道中TL2(或MOCK)的比率是降低的，而TL1在混合物中的量却是从0.1×到0.3×相应地增加的。在这些混合物的任何比率下，TL1:TL2泳道与相应的TL1:MOCK泳道相比，TL1:TL2泳道表现出TIE-2-R磷酸化水平的降低。然而，当TL1的量保持稳定并且TL2(或MOCK)的量降低时(示于右侧的三对泳道)，可出现一个点，即样品中的TL2太稀而不能有效抑制TL1的活性。在这些条件COS培养基中所存在的每种配体的相对量能从BIAcore试验所测定的配体结合单位和用配体特异的抗体进行的COS培养基的Western杂交中估计出。因此，我们推测在体外仅需要几倍摩尔数过量的TL2便能有效阻断TL1的活性。该结果是有意义的，因为我们已观察到TL2 mRNAs与TL1 mRNAs相比较有更丰富的表达的体内不同样本(见实施例17和图16)。因此，在这些部位TL2在有效阻断TIE-2-R信号传递方面发挥重要的生理功能。
这些数据总和起来证实了，不象TL1,TL2不能够激活内皮细胞上内源性表达的TIE-2-R。再者，几倍摩尔数过量的TL2能阻断TL1激活TIE-2受体，这表明TL2是自然存在的TIE-2受体拮抗剂。实施例10在条件培养基和COS细胞上清液中鉴定TIE-2特异的结
    合活性
用人TIE-2配体1(hTL1)或人TIE-2配体2(hTL2)转染之后，来自细胞系C2C12-ras,Rat2ras.SHEP，和T98G的10×CCM或COS细胞上清液的结合活性用生物传感器技术(BIAcore；Pharmacia Biosensor,Piscataway,NJ)来测定，该技术通过表面胞质基因组共振(SPR)实时监测生物分子之间的相互作用。纯化的大鼠或人TIE-2 RB通过伯胺共价交联于CM5研究级传感器芯片的羟甲基葡聚糖层(Pharmacia Biosensor,Piscatway,NJ)。传感器芯片的表面用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和N-乙基-N′-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)的混合物进行激活，用TIE-2 RB(25μg/ml,pH4.5)固化并且用1.0M乙醇胺(pH8.5)使未反应的部位去激活。总体上，每种融合受体9000-10000RU被偶联到传感器芯片上。
该系统中用的循环缓冲液是HBS(10mM Hepes,150mMNaCl,0.005％P20表面活性剂，pH7.4)。样品于4℃离心15分钟并用无菌的低蛋白结合的0.45μm滤膜净化(Millipore；Bedford,MA)。将葡聚糖(2mg/ml)和P20表面活性剂(0.005％)加入到每个样品中。40μl的等分试样以5μl/min的流速注射到固化的表面(大鼠或人TIE-2)上并且监测受体结合8分钟。结合活性(共振单位，RU)被测定为样品注射前30秒所测定的基线值与样品注射后30秒所测数值的差。表面的再生用3M MgCl2一次15μl的脉冲来完成。
CCM样品(C2C12- ras,Rat2- ras,SHEP,T98G)在大鼠TIE-2 RB固化的表面上进行检测，而重组hTL1和hTL2在人TIE-2 RB固化的表面上进行检测。在每一种情况下，与TIE-2融合受体的特异性结合通过在测定结合活性之前样品与25μg/ml的可溶性TIE-2(大鼠或人)RB或trkB RB共育来进行评估。如图10和11所示，与缺乏TIE-2 RB时所测定的值相比较，加入可溶性trkB RB引起TIE-2结合活性的略微降低，而加入可溶性TIE-2 RB明显降低结合活性。实施例11 TIE-2 RB特异地阻断TIE-2配体1对TIE-2融合
     受体的激活
申请人想弄清楚可溶性TIE-2 RB能否作为竞争性的抑制剂来阻断TIE-2配体1(TL1)对TIE-2受体的激活。为了达到该目的，含TL1的COS培养基与TIE-2或TrkB-RB预先孵育，然后比较它们激活自然存在于人内皮细胞系上的TIE-2受体的能力。
按实施例9所述，条件COS培养基取自单独用pJFE14表达载体(MOCK)，或含有人TIE-2配体1cDNA(TL1)的pJFE14载体转染的COS-7细胞，不同之处在于培养基被过滤除菌但未浓缩。测定TL1的量并表示为BIAcore结合试验所测定的TIE-2受体特异的结合活性的量(以共振单位，R.U.，表示)。
Northern(RNA)分析表明在HUVEC(人脐静脉内皮细胞)人原代内皮细胞(Clonetics,Inc.)中存在大量的tie-2转录本。因此，这些细胞被用来测定在TIE-2或TrkB-RBs存在下当TIE-2受体暴露于含TL1的COS培养基时，TIE-2受体是否能被酪氨酸磷酸化。HUVEC于37℃5％CO2下保持在完全内皮细胞生长培养基(Clonetics,Inc.)中，该培养基含5％胎牛血清，含10μg/ml肝素的可溶性牛脑提取物，10ng/ml人EGF,1μg/ml氢化可的松，50μg/ml庆大霉素和50ng/ml两性霉素B。TL1能否激活HUVEC细胞中的TIE-2受体按如下步骤进行评估。平皿中汇合的HUVEC细胞在低糖的Dulbecco’s MEM中于37℃,5％CO2下血清饥饿2-4小时，然后在含0.1mM原钒酸钠(一种磷酸酪氨酸磷酸酶的强抑制剂)的饥饿培养基中孵育10分钟。同时，室温下将条件COS培养基与50μg/ml TIE-2或TrkB RB预先孵育30分钟。其后从HUVEC平皿中去除饥饿培养基并与含RB的COS培养基于37℃共育7分钟。随后裂解HUVEC细胞并用TIE-2肽抗血清进行免疫沉淀来回收TIE-2受体蛋白，接着用抗磷酸酪氨酸抗体进行Western杂交，如同实施例1中所述。结果见图12。与用对照培养基(MOCK)所得出的结果相比，用TIE-2配体1(TL1)处理HUVEC细胞诱导TIE-2受体上的磷酸酪氨酸水平，并且用TIE-2-RB(TIE-2-Fc)预先孵育可以特异性地阻断该诱导，而TrkB-RB(TrkB-Fc)预先孵育不能。这些数据表明可溶性TIE-2 RB可作为选择性抑制剂来阻断TIE-2配体1对TIE-2受体的激活。实施例12构建TIE-2融合配体
建立能合成成分泌性蛋白的表达构建体，该蛋白包含与人免疫球蛋白γ-1恒定区(IgG1 Fc)相融合的人TIE-2配体1(TL1)或TIE-2配体2(TL2)的全部编码序列。这些融合蛋白被称为TIE-2“融合配体”(TL1-Fc或TL2-Fc)。TL1-Fc和TL2-Fc的Fc段制备如下。编码人IgG1中从蛋白质铰链区到羧基端的Fc段的DNA片断，用相应于人IgG1已公开的序列的寡核苷酸通过PCR从人胎盘cDNA中扩增；所获得的DNA片断克隆于质粒载体中。来自编码全长TL1或TL2的质粒或来自人IgG1 Fc质粒的适当DNA限制性片断被连接到源于PCR的短片断的一端，该短片断被设计以将TL1或TL2与人IgG1 Fc蛋白的编码序列符合读框地融合。
毫克量TL2-Fc的获得方法包括将TL2-Fc DNA片断克隆进pVL1393杆状病毒载体中并随后感染Spodoptera frugiperda SF-21AE昆虫细胞系。另外，也可用细胞系SF-9(ATCC登记号CRL-1711)或细胞系BTI-TN-5b1-4。编码TL2-Fc的DNA以EcoRⅠ-NotⅠ片断克隆进杆状病毒转运质粒pVL1393中。通过3μg质粒DNA与0.5μg Baculo-Gold DNA(Pharminigen)混合将质粒DNA重组进病毒DNA中，随后用30μg Lipofectin(GIBCO-BRL)将其引入脂质体中。DNA-脂质体混合物加入到TMN-FH培养基(改良的Grace’s昆虫细胞培养基)(GIBCO-BRL)中的SF-21AE细胞中，于27℃孵育5小时，随后在补充了5％胎牛血清的TMN-FH培养基中于27℃孵育5天。回收组织培养基以进行重组病毒的噬斑纯化，该步骤用以前所述的方法进行(O’Reilly,D.R.,L.K.Miller和V.A.Luckow，《杆状病毒表达载体-实验室手册》(Baculovirus ExpressionVectors-A Laboratory Manual)。1992，纽约：W.H.Freeman)，但琼脂糖层(overlay)含125mg/ml X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-6-D-吡喃半乳糖苷；GIBCO-BRL)。于27℃孵育5天后，通过对X-gal底物的阳性产色反应计数出非重组的噬斑，并标记其位置。然后加入含100mg/ml MTT(3-〔4,5-二甲基噻唑-2-基〕2,5，二苯基四唑氢溴酸盐；Sigma)的第二层来显现重组噬斑。通过栓塞抽吸挑出认定的重组病毒噬斑，并经多轮噬斑分离来加以纯化以确保均一性。贮备病毒由噬斑纯化病毒的一系列低复数传代来制备。制备了一个病毒克隆(vTL2-Fc克隆#7)的低代贮备物。
SF-21AE细胞培养于含1×抗生素/抗霉菌素溶液(GibcoBRL)和25mg/l庆大霉素(Gibco BRL)的无血清培养基(SF-900Ⅱ,Gibco BRL)中。Pluronic F-68作为表面活性剂被加入至终浓度1g/l。感染之前细胞在生物反应器(Artisan Cell StationSystem)中至少培养3天。细胞在27℃生长，以80ml/min的气流率充气至50％的溶解氧(在喷雾圈(sparge ring)处冲气)。用海洋推进器(marine impeller)以100rpm的速率不断振荡。在中对数生长期收集细胞(～2×106个细胞/ml)，离心浓缩，并且每个细胞用5个噬斑形成单位的vTL2-Fc感染。细胞和接种病毒用新鲜培养基补加到400ml，并在旋转培养瓶(spinner flask)中于27℃吸附病毒2小时。然后细胞用新鲜的无血清培养基重悬于8L的终体积中，并按前述条件将细胞孵育于生物反应器中。
感染后72小时离心(500×g,10分钟)收集vTL2-Fc感染的SF21AE细胞的培养基。细胞上清液用NaOH调pH至8。加入EDTA至终浓度10mM并将上清液pH再调到8。过滤(0.45μm,Millipore)上清液并上样到蛋白A柱(蛋白A Sepharose 4 fast flow或Hi Trap蛋白A，均来自Pharmacia)上。柱子用含0.5M NaCl的PBS冲洗直至在280nm的吸收降低到基线。柱子用PBS冲洗并用0.5M乙酸洗脱。通过洗脱进含1M Tris pH 9的试管来迅速中和从柱子中收集的样品。收集含TL2-Fc的峰值样品并用PBS透析。实施例13 TIE-1,TIE-2,TL1和TL2在肾细胞癌中的表达
对人肾细胞癌肿瘤组织用TIE-1,TIE-2,TL1和TL2 cDNA探针进行原位杂交实验。TIE-2,TIE-1,TL1，和TL2的表达在所有的肿瘤血管系统中均是上调的。配体的表达似乎定位于间质中的血管内皮细胞(TL2)或非常接近血管内皮细胞(TL1)，已经证实VEGF在肿瘤组织中大大上调。Brown等Am.J.Patbol.143:1255-1262(1993)。实施例14 TIE-1,TIE-2,TL1和TL2在伤口愈合中的表达
用TIE-1,TIE-2,TL1，和TL2 cDNA探针对获自大鼠皮下伤口模型中的横切组织切片进行原位杂交实验。伤口愈合模型包括向大鼠的皮肤压进小软木塞以及移去皮肤的小圆柱塞。当愈合在伤口的底部开始时，制备组织的垂直切片并用于原位杂交。在受检的组织样本中，损伤后4天时TL1和TL2似乎被略微上调。与该组织中TL1和TL2略微上调的表达相比，VEGF的表达，其可能在TL1和TL2的表达之前，大大上调。实施例15 TIE配体在胎儿肝脏和胸腺中的表达
对小鼠E14.5胎儿肝脏和小鼠E17.5胎儿胸腺进行逆转录PCR(RT-PCR)。RT-PCR产物的琼脂糖凝胶电泳表明在小鼠胎儿肝脏中，基质区富含TIE-2配体1(TL1)RNA，而在c-kit+TER119造血祖细胞中却缺乏该RNA。在该组织中，基质细胞中富含TIE-2配体2(TL2)RNA，而在造血祖细胞中却缺乏该RNA(图13)。在小鼠胎儿胸腺中，基质细胞中富含TL2(图14)。实施例16血管生成中的TIE受体/配体系统
尽管TIE-2/TIE配体系统在内皮细胞生物学中似乎发挥重要作用，但还没有证实它在血管发生的早期到中期中发挥重要的积极作用(如，成血管细胞或内皮细胞的增殖和迁移，小管形成，和血管成形(modeling)中的其它早期事件)。当已知介导血管发育中这些方面的受体和因子相比，TIE-2和TL1在血管发生过程中较晚表达的模式表明该系统在血管发育的较晚期发挥独特的作用，包括新血管结构与功能的分化和稳定。TIE-2/TL1的表达模式也与它在维持已生成的血管的结构完整和/或生理特征中持续发挥的作用相一致。
TIE配体2(TL2)似乎是TL1的竞争性抑制剂。TL2表达的时空特征表明这一个抑制分子对正确的血管发育或再建(remodeling)发挥着多向的环境依赖的重要功能(如允许从存在的血管系统形成新血管的成熟内皮细胞的去稳定/去分化，抑制不正确的血管形成，以及成熟血管的退化/衰退)。图15是TIE-2/TIE配体在血管生成中假设的作用的图解说明。在该图中TL1用(·)表示，TL2用(*)表示，TIE-2用(T)表示，VEGF用(〔〕)表示，flk-1(VEGF受体)用(Y)表示。实施例17配体在雌性生殖系统中的表达：在卵巢中的表达
从检测TIE受体和配体在雌性生殖系统中进行表达的实验中所得到的初步观察结果与该假设相符，即TL1在新血管生成中发挥作用，其作用在时间上是VEGF之后，TL2表达的模式也与TL1功能的拮抗以及在血管退化中所发挥的特异作用相一致。为进行证实，实验性诱导卵泡和黄体的发育之后可以检测相应mRNAs的表达，这样可以更清楚地证明它们与新血管生成/血管退化中各种事件的时间关系(如与内皮细胞染色，血管填充(fills)相结合)。用原位杂交分析与成熟雌性大鼠各期卵巢中卵泡发育和黄体形成有关的血管生成或分析在青春期前的动物中诱导排卵后的血管生成。图16包括原位杂交玻片的照片，它表明了TIE-2,TL1,TL2，和VEGF在卵巢周期中的时间表达模式〔栏1：排卵前的早期卵泡；栏2：排卵前卵泡；栏3：早期黄体；和栏4：闭锁卵泡；A行：亮区(bright fleld)；B行：VEGF；C行：TL2；D行：TL1和E行：TIE-2受体〕、这些研究表明VEGF,TL1和TL2以时间和空间相协调的方式进行表达，该表达方式与卵巢中血管系统的发育和退化有关，尤其与卵泡到黄体(CL)转换的过程中所形成的血管系统的建立有关。
简而言之，在黄体化过程中于血管化之前VEGF在卵泡颗粒层中的表达增加。在黄体形成的过程中，邻近尚未血管化的黄体化细胞的正发育中的CL的中央，VEGF的高水平表达是明显的。VEGF保持中等程度的表达水平并且弥散地分布于已发育的CL中。相比之下，TIE-2配体1明显增强的表达只发生于CL形成过程的晚期，主要血管丛已经形成之后。其后TL1的表达在整个CL中是明显的，此时CL发育完全的毛细管网络已经形成。
TL2比VEGF或TL1表现出更复杂的表达模式。在正发育的CL中，TL2在正发育的毛细血管丛的前部，即CL中VEGF有最高表达的中央无血管区，与CL中TL1占优势表达并且黄体化过程已完成同时血管系统最成熟的最外缘区之间，以最高水平进行表达。TL2也似乎以高水平表达于正进行闭锁的大卵泡中的卵泡层。尽管TL1也在闭锁卵泡中明显表达，但VEGF是不表达的。
以上所述的表达模式非常符合VEGF在血管生成的起始阶段而TL1在该过程的晚期阶段发挥作用，例如在已发育完全的血管网络的成形(modeling)和/或稳定过程中。相比之下，TL2存在于新形成的血管网络的活跃扩展区(在CL形成过程中)，以及不能建立新血管系统和血管退化正在进行的区域(闭锁卵泡)。这表明TL2发挥更动态和更复杂的作用，它可能参与已形成的血管系统的去稳定(对退化是必要的)或正发育中的血管系统的去稳定(对新形成血管的动态塑造成形是必要的)。实施例18融合受体结合试验和配体结合和竞争试验
已经建立了用以检测TIE-2融合受体结合或配体结合和竞争的采用两种交替形式的定量无细胞结合试验。在试验的融合受体结合方案中，TIE-2配体(纯化的或部分纯化的；TL1或TL2)被包被到ELISA板上。然后加入各种浓度的融合受体，它以剂量依赖的方式与固化的配体结合。2小时时，洗去过量的融合受体，然后用碱性磷酸酶标记的特异性抗人Fc抗体检测它与培养板结合的数量。洗去过量的报告抗体，然后用有色底物对AP反应显色。该实验用分光光度计进行定量。图19是典型的TIE-2-IgG结合曲线。该实验已用于评估TIE-2-IgG注射到大鼠和小鼠中之后它的完整性。该实验也以这种形式用作配体竞争试验，其中纯化的或部分纯化的TIE配体与固化的配体竞争融合受体。在结合试验的配体结合和竞争方案中，TIE-2外区被包被到ELISA板上。随后TIE配体的Fc标记的类纤维蛋白原区片断与细胞外区结合，并按以上所述用相同的抗人Fc抗体进行检测。图20是TL1-fFc与TIE-2细胞外区结合的一个实例。该试验方案也可用于血清或其它样品中TL1-fFc的定量。如果未标记的配体(也是纯化的或部分纯化的)与TL1-fFc同时加入，那么在标记的配体片断和全长配体之间就建立了竞争。全长配体可以取代Fc标记的片断，并且获得了竞争曲线。实施例19 EA.hy926细胞系能被用作TIE配体活性的报告细胞系
EA.hy926是HUVEC同人肺癌来源的细胞系A549相融合所建立的杂交细胞系〔Edgell等，《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)80,3734-3737(1983))。已经发现EA.hy926细胞大量表达具有低的基础磷酸酪氨酸水平的TIE-2受体蛋白。EA.hy926在用于受体试验之前其被传代的密度，以及它们在试验时汇合的程度都会影响TIE-2受体的丰度以及对配体处理时发生反应的相对可诱导性。通过采用以下培养这些细胞的策略，EA.hy926细胞系可用作测定TIE-2配体活性的可靠系统。
EA.hy926以1.5×106个细胞接种于T-75培养瓶(Falconware)中并每隔一天补充高糖Dulbecco′s MEM,10％胎牛血清，L-谷氨酰胺，青霉素-链霉素，和1×次黄嘌呤-氨基喋呤-胸苷(HAT,Gibco/BRL)。培养3～4天后，细胞再以1.5×106个细胞/T-75培养瓶传代一次并再培养3～4天。在磷酸化试验中，如上制备的细胞用高糖DMEM替换培养基来进行血清饥饿并于37℃孵育2-3小时。该培养基从培养瓶中吸出并将条件培养基或纯化配体的样品以1.5ml的总体积加入到培养瓶中，随后于37℃孵育5分钟。培养瓶从孵箱中取出并放在冰上。去除培养基并用1.25ml裂解缓冲液替换，该缓冲液含1％nonidet P-40,0.5％脱氧胆酸钠，在20mM Tris,pH7.6中的0.1％SDS,150mM NaCl,50mM NaF,1mM原钒酸钠，5mM苄脒，和1mM含蛋白酶抑制剂PMSF，抑酶肽和亮抑酶肽的EDTA。冰浴10分钟使细胞膜溶解后，从培养皿中刮下并于4℃以高速微离心来澄清细胞裂解物。通过与抗TIE-2多克隆抗血清和蛋白G偶联的Sepharose珠在低温下孵育将TIE-2受体从澄清的上清中免疫沉淀出来。珠子用冷细胞裂解缓冲液冲洗3次并在Laemmli样品缓冲液中煮沸5分钟，然后将其上样到7.5％SDS聚丙烯酰胺凝胶上。分离的蛋白电转移到PVDF(Lamblia-P)膜上，然后用抗磷酸酪氨酸抗体和ECL试剂进行Western杂交分析。在相同的杂交中随后对TIE-2蛋白总量的比较方法包括去除抗磷酸酪氨酸抗体并与TIE-2细胞外区特异的多克隆抗血清共育。实施例20分离和测序编码哺乳动物TIE配体3的全长cDNA克隆
TIE配体3(TL3)克隆自小鼠BAC基因组文库(研究遗传学)，克隆方法包括用相应于整个基因编码序列的小鼠TL1或小鼠TL2探针与文库杂交。编码序列的小鼠TL1或小鼠TL2探针与文库杂交。每份拷贝的文库用磷酸缓冲液于55℃杂交过夜。杂交后，滤膜用2×SSC,0.1％SDS于60℃冲洗，随后X光胶片对滤膜曝光。相应于小鼠TL1和小鼠TL2的强杂交信号被鉴定出。另外，也鉴定出与小鼠TL1和小鼠TL2弱杂交的信号。相应于这些克隆的DNA被纯化，然后用限制性酶酶切，并将与原始探针杂交的两个片断亚克隆进细菌质粒中并测序。片断的序列中含有两个与小鼠TL1和小鼠TL2同源的外显子。对这些序列特异的引物被用作PCR引物以鉴定含有TL3相应转录本的组织。在λgt-11中的小鼠子宫cDNA文库中鉴定出相应于TL3的PCR带。(Clontech Laboratories Inc.,Palo Alto,CA)。
噬斑以1.25×106/20×20cm平皿的密度铺平皿并按标准步骤使用复制膜(Sambrook等，《分子克隆：实验室手册》(MolecularCloning:A Laboratories Manual)第二版，8.46页，冷泉港实验室，冷泉港，纽约)。在“正常”严紧条件(2×SSC,65℃)下用针对小鼠TL3序列所制备的200bp的PCR放射活性探针对复制膜进行筛选。杂交是在含0.5mg/ml鲑精DNA的溶液中于65℃下进行。滤膜在2×SSC中于65℃冲洗并对X光胶片曝光6小时。挑出两次杂交均为阳性的克隆。EcoRⅠ酶切从这些克隆中获得的噬菌体DNA的结果表明这是两个具有插入大小大约1.2kb和大约2.2kb的独立克隆。2.2kb的EcoRⅠ插入片断被亚克隆进pBluescript KS(Stratagene)的EcoRⅠ位点。测序分析表明较长片断的克隆缺乏起始蛋氨酸和信号肽，但却编码与小鼠TL1和小鼠TL2均同源的探针。
两个TL3特异的PCR引物合成如下：
US2:cctctgggctcgccagtttgttagg
US1:ccagctggcagatatcagg
以下的PCR反应用来源于小鼠细胞系C2C12ras和MG87的表达文库进行。在初级PCR反应中，特异引物US2与载体特异的寡核苷酸片断(Oligos)联用以从两个方向扩增。PCR在100ml的总体积中进行，采用94℃1分钟；42℃或48℃1分钟；72℃1分钟的35个循环。二级PCR反应包括第二个特异引物，US1，它包含于初级PCR产物之中，与同一载体寡核苷酸片断联用。二级反应是30个循环，温度和时间与以前相同。凝胶分离PCR产物并对其进行测序分析。根据采用两个不同的cDNA文库从总共四次独立PCR反应中获得的序列，推导出TL3序列的5′端。Northern分析表明在小鼠胎盘中存在中到低水平的小鼠TL3转录本。小鼠TL3的表达由大约3kb的转录本组成。TL3的全长编码序列见图21所示。
然后将小鼠TL3序列用于获得含有人TL3编码序列的人克隆，其方法是用以上所述的，如以上实施例8所述的，相应于小鼠TL3的探针与人基因组成cDNA文库进行杂交。实施例21分离编码人TIE配体4的全长基因组克隆
TIE配体-4(TL4)克隆自小鼠BAC基因组文库(BAC人(Ⅱ),Genome Systems Inc.)，其方法包括用相应于TL1的全长纤维蛋白原编码序列的人TL1放射性探针(图4中的核苷酸1153-1806)或者相应于小鼠TL3中纤维蛋白原区的186个核苷酸的片断的小鼠TL3放射性探针(图21中的核苷酸1307-1492)与文库杂交。每个探针均用准确的寡核苷酸片断和标准的PCR条件通过PCR进行标记，不同之处在于dCTP用P32dCTP置换。然后将PCR混合物通过凝胶过滤柱以分离游离P32dCTP与探针。按标准的杂交条件每拷贝的文库于于55℃用磷酸缓冲液和放射性探针进行过夜杂交。杂交后，滤膜用2×SSC,0.1％SDS于55℃冲洗，随后对X光胶片曝光。可观察到与人TL1相应的强杂交信号。另外，也鉴定出与人TL1和小鼠TL3均为弱杂交的信号。这些克隆相应的DNA用标准步骤纯化，然后进行限制性酶切，并且将与原探针杂交的一片断亚克隆进细菌质粒中并测序。片断的序列包含与人TL1和小鼠TL3以及TIE配体家族其它成员同源的外显子。这些序列特异的引物被用作PCR引物以鉴定含TL4相应转录本的组织。
通过对包含于保藏的细菌细胞中的BAC全部克隆进行测序可以获得人TL4的完整序列。根据与TL1,TL2和TL3等TIE配体家族中已知成员的同源性可鉴定出外显子。然后TL4的完整编码序列可通过剪接来源于可用于合成TL4蛋白的TL4基因组克隆的外显子来加以测定。另一种方法，外显子可用作探针以获得全长cDNA克隆，然后该克隆可用于合成TL4蛋白质。外显子也可以根据与纤维蛋白原区，卷曲螺旋区等蛋白质区域或者信号肽序列等蛋白质信号的同源性从BAC克隆序列中鉴定出。从BAC克隆中获得缺失的外显子的方法包括相近的BAC克隆的鉴定，例如，用保藏的BAC克隆的末端作为探针来筛选人基因组文库，如本发明所用的文库，用包含于BAC克隆中的外显子序列来筛选cDNA文库，或者用根据TL4外显子序列设计的寡核苷酸引物来进行5′或3′RACE步骤。其它TIE配体家族成员的鉴定
采用一种利用已知的家族成员之间存在高度同源的保守片断的方法，将新的TIE配体4序列用来推理式寻找TIE配体家族中的其它成员。例如，TIE配体中氨基酸序列的对比表明存在几个保守序列区(见图22中的画框区)。与以前已知的或新的TIE配体同源片断联合应用，将基本上根据这些序列的简并寡核苷酸片断用于鉴定新的TIE配体。
在TL1,TL2和TL3之间的高保守区可用于设计简并寡核苷酸引物，用其引导对cDNAs的PCR反应。用寡聚d(T)或其它的适当引物通过组织RNAs的逆转录可以制备cDNA模板。然后PCR反应的等分试样可在琼脂糖上进行电泳。所获得的DNA扩增片断通过插入质粒中来进行克隆，测序并将DNA序列与所有已知的TIE配体的序列进行比较。
这些PCR反应中长度有选择的DNA扩增片断可克隆进质粒中，通过电穿孔导入大肠杆菌，并将转化体铺在选择性琼脂上。来自PCR转化的细菌克隆可通过对已经经过标准质粒纯化步骤纯化的质粒DNAs进行测序来进行分析。
含有新TIE配体片断的克隆片断可用作杂交探针以从cDNA文库中获得全长cDNA克隆。例如，人TL4基因组序列可用于获得含人TL4完整编码序列的人cDNA克隆，其方法包括用相应于人TL4的探针对人cDNA文库进行杂交，正如以上所述。实施例22 hTL4全长编码序列的克隆
来自编码人TIE配体4的基因组人TL-4克隆(hTL-4,ATCC登记号98095)的5′和3′编码序列的获得方法均包括限制性酶切，Southern杂交和hTL-4克隆与小鼠TL3编码序列进行杂交，随后将杂交片断亚克隆和测序。与hTL4 N末端和C末端氨基酸相应的编码序列被用于设计PCR引物(表示如下)，该引物又用于从人卵巢cDNA中PCR扩增TL4。用ABI 373A DNA测序仪和Taq双脱氧终止循环测序试剂盒(Applied Biosystems,Inc.,Foster City,CA)进行DNA测序，一条PCR带被鉴定为与人TL4相应。然后将PCR带亚克隆进载体pCR-script中并用测序来分析几个质粒克隆。整理人TL4完整的编码序列并示于图23中。在本发明的另一实施方案中，位置569的核苷酸从A变成G，使氨基酸从Q变成R。
如上所述使用的PCR引物设计如下：hTL4atg5′-gcatgctatctcgagccaccATGCTCTCCCAGCTAGCCATGCTGCAG-3′hTL4not 5′gtgtcgacgcggccgctctagatcagacTTAGATGTCCAAAGGCCGTATCATCAT-3′小写字母表示加入到PCR引物上的“尾”序列以有利于PCR扩增片断的克隆。实施例23修饰TIE配体的构建和特征鉴定
对TIE-2配体1和TIE-2配体2(TL1和TL2)进行遗传分析以理解它们的许多已观察到的特性。尽管TL1和TL2具有相似的结构同源性，但它们展现不同的物理和生物学特性。区别这两种配体的最突出的特性是尽管它们均与TIE-2受体结合，但TL1是激动剂而TL2是拮抗剂。在非还原的(non-reducing)电泳条件下两种蛋白均表现为共价的多聚体结构。TL1被表达为二硫键交联的多聚体的混合物，主要是三聚体并且在更高等的种类中，没有任何的二聚体。但是TL2几乎被无一例外地表达为二聚体。再者，尽管TL2在大多数表达系统中表达的好，但是TL1表达差并难以大量表达。最后，制备和纯化条件也似乎是倾向于TL1被接近氨基端的蛋白质裂解所灭活。
为了研究这些差异，几种修饰配体构建如下。23.1半胱氨酸替换关于何种因子可能有助于这两种分子的物理和生物学特性的研究表明在TL1的类纤维蛋白原之前存在一个半胱氨酸残基(图4中的CYS265；图17中的CYS245)，而在TL2中却是缺乏的-即，在TL2中没有相应的半胱氨酸残基。TL1中的CYS265残基由TGC编码并且大约位于卷曲螺旋和类纤维蛋白原区之间的连接部位中大约核苷酸1102-1104处(见图4)。因为在一般情况下半胱氨酸残基总是参与二硫键的形成，它的存在有助于分子的三级结构和生物学特性，所以人们认为在TL1中存在CYS265残基可能至少部分地与两种分子的不同特性有关。
为了验证该假设，构建一个含有TL1突变的表达质粒，在该突变中CYS(图4中的残基265；图17中的残基245)被不能形成二硫键的一个氨基酸(丝氨酸)替换。除了这个TL1/CYS突变体外，构建了第二个表达质粒，其突变大约是在TL2中的相应位置(图17中的蛋氨酸247)，这样该残基现在为半胱氨酸。TL1和TL2的非突变和突变的表达载体被瞬时转染进入COS7细胞中。收集含重组蛋白的细胞上清，然后将样品进行还原的和非还原的SDS/PAGE电泳并随后进行Western杂交。
图18表示在非还原条件下对非突变的和突变的TL1和TL2蛋白所进行的Western杂交，结果表明TL1/CYS-突变体表现为二聚体，更类似于TL2，而TL2/CYS+突变体能形成三聚体以及更高级的多聚体，更类似于TL1。当检测两种突变蛋白在TIE-2表达细胞中诱导磷酸化的能力时，TL1/CYS-突变体能激活TIE-2受体，而TL2/CYS+突变体却不能。
这样，当TL1的半胱氨酸残基(图4中的残基265；图17中的残基245)从基因水平上被变换成丝氨酸时，人们发现TL1的共价结构变得类似于TL2的共价结构，即，主要是二聚体。修饰的TL1分子仍旧表现为激动剂，因此三聚体和/或更高级的多聚体结构不是赋予TL1的激活能力的决定因子。尽管去除半胱氨酸使分子具有更可取的特性，但是它不能提高TL1的产量。23.2区域缺失根据成熟蛋白的氨基酸序列，编码TL1和TL2的核苷酸序列具有共同的可分成三个区域的遗传结构。每一成熟蛋白的后面大约215个氨基酸包含6个半胱氨酸并与纤维蛋白原区非常类似。因此该区域被称为“类纤维蛋白原”区或“F区”。成熟蛋白的中央含大约205个残基的区域很可能形成“卷曲螺旋”结构而被称为“卷曲螺旋”区或“C区”。成熟蛋白氨基端的大约55个残基中含有两个半胱氨酸并且很少可能形成卷曲螺旋结构。该区域被称为“N端”区或“N区”。本发明所述的修饰配体采用以下术语系统命名，其中N=N端区，C=卷曲螺旋区，F=类纤维蛋白原区，数字1和2分别指TL1和TL2。因此1N表示TL1的N端区，2F表示TL2的类纤维蛋白原区，等等。
为了检验TIE-2配体的类纤维蛋白原区(F区)是否含有TIE-2激活活性，因此构建表达载体，该载体缺失了卷曲螺旋和N端区，只剩下编码F区的DNA序列部分(对TL1来说，在图4中起始于大约核苷酸1159，氨基酸残基ARG284处；对TL2来说，相应于图6中大约核苷酸1200，氨基酸残基282处)。然将该突变构建载体瞬时转染进入COS细胞中。收集含重组蛋白的上清。检测TL1/F区突变体与TIE-2受体结合的能力。该结果表明，作为单聚体，TL1/F区突变体不能够在可检测的水平与TIE-2结合。
可是，当对TL1/F区单聚体进行myc标记并随后用抗myc标记物的抗体聚集时，它表现出可检测的与TIE-2的结合。然而，抗体聚集的TL1/F区突变体不能在TIE-2表达细胞系中诱导磷酸化。
这样可以判定TIE-2配体的F区参与结合受体，但只包含F区的截短体则不足以进行受体结合。这增加了卷曲螺旋区负责将几个类纤维蛋白原区聚集的可能性，这可能对受体结合来说是必要的。为了证实这个假设，F区与人抗体IgG1的Fc段融合。因为Fc段在哺乳动物表达时发生二聚体化，所以模拟F区理论构象的这些重组蛋白是二聚体化的天然(native)配体。这个F-区-Fc构建体结合但不能激活受体。很明显，配体的其区域所导致的多聚体化是使配体能与TIE-2受体结合所必需的。另外，F区之外的其它因素必定有助于受体的磷酸化。
于是构建突变体，它缺失了类纤维蛋白原区，因此只含有N端和卷曲螺旋区。这些突变体不能够与受体结合。为了评估N末端区在受体结合和激活中的作用，配体被截短以至于只剩C和F区并且在N末端用FIAG标记，制备出称为FIAG-1C1F和FLAG-2C2F的构建体。尽管这些分子在已瞬时转染使之表达TIE-2受体的COS7细胞中呈现强染色，但它们在磷酸化试验中不发生反应。这样，尽管N区确实包含受体激活所必需的成分，但是正如以下所述，嵌合分子2N2C1F激活受体的能力表明即使灭活配体的N区也能发挥该作用。
以上所述的myc标记的F区截短体和Fc标记的F区截短体之间在行为上的差异表明TIE配体仅以二聚体或更高级的多聚体形式进行结合。事实上，非还原SDS-PAGE表明在自然情况下TIE配体以二聚体，三聚体，和多聚体的形式存在。FLAG-1C1F和FLAG-2C2F截短体通过合成的标记物(如Fc)不用二聚体化就能与TIE-2受体结合，而F截短体却不能，这表明C区至少部分地负责F区的聚集。23.3交换构建体(嵌合体)
申请人已经注意到在COS7细胞中TL1的产量比TL2的产量低大约10倍。因此，构建TL1和TL2的嵌合体试图解释该差异并进一步鉴定TL1的激动剂活性，该活性与TL2的拮抗剂活性相反。
构建四种嵌合体，其中TL1和TL2之间交换了N末端区或者纤维蛋白原区并且指定采用以上所述的术语系统，例如，1N1C2F指嵌合体具有TL1的N末端和卷曲螺旋区，以及TL2的类纤维蛋白原区。这四种嵌合体构建如下：
嵌合体1-    1N1C2F
嵌合体2-    2N2C1F
嵌合体3-    1N2C2F
嵌合体4-    2N1C1F嵌合体1-4的核苷酸和氨基酸序列分别示于图24-27中。
将每种嵌合体分别插入到表达载体pJFE14中。然后将嵌合体转入COS7细胞，用pJFE14空载体，天然TL1，和天然TL2作为对照，随后收集培养上清。
为了判定交换是否影响配体的表达量，1∶5稀释和1∶50稀释的COS7上清斑点印迹到硝酸纤维素膜上。然后用TL1 N末端特异的兔抗体探测含有TL1 N区的三种配体(即，天然TL1,1N2C2F和1N1C2F)。含有TL2 N区的三种配体(即天然TL2,2N1C1F和2N2C1F)用TL2 N末端特异的兔抗体进行探测。结果证实COS7细胞表达含有TL2 N区的任一分子，其量大约是含有TL1 N区的任一分子的10倍，无论蛋白质的其它组成如何。结论是N区必定是主要调控配体的表达量。
提出的另一问题是嵌合体能否激活TIE-2受体。EAhy926细胞用四种嵌合体处理，并以TL1作为磷酸化的阳性对照，而TL2或空pJFE14转染的COS7细胞上清作为磷酸化的阴性对照。裂解细胞，并从细胞裂解物中免疫沉淀出TIE-2受体，然后在SDS-PAGE上电泳。样品进行Western杂交并用抗磷酸酪氨酸抗体探测以测定已被磷酸化的受体。令人惊讶的是，只有含TL1类纤维蛋白原区的构建体(2N1C1F和2N2C1F)能够磷酸化TIE-2受体。这样，尽管TL1的N末端区是激活所必需的，但是它能被TL2的N末端区替换，即，决定配体是激动剂还是拮抗剂的信息实际上包含于类纤维蛋白原区。
因此可以判定F区除了结合TIE-2受体之外，它还负责TL1的磷酸化活性。再者，当TL2，另一无活性的分子，用TL1 F区替换它的F区而被改变时，改变的TL2以激动剂发挥作用。
然而在某种程度上2N1C1F构建体作用更强。嵌合体2N1C1F所产生的信号似乎略强于嵌合体2N2C1F所产生的信号，可以推测TL1的C区，尽管对磷酸化不是关键的，但是能增强TL1的活性。然而，因为用于磷酸化试验的样品没有按照配体的浓度标准化，所以有可能更强的磷酸化信号只表明存在更多的配体。因此磷酸化试验用各种数量的配体进行重复以判定活性嵌合体是否展现出不同的能力。根据以前所述的方法用BIAcore生物传感器技术来测定配体转染细胞中COS7上清的配体浓度(Stitt,T.N.等(1995)《细胞》80:661-670)。BIAcore以称为共振单位(RU)的绝对单位来测定上清与TIE-2受体的结合活性。从总体上可以观察到RU’s和配体浓度之间相当明确的关系，400RU的活性相当于每ml上清大约1μg的蛋白质。稀释样品至浓度100RU,20RU，和5RU并重复磷酸化试验。结果证实了在同一浓度下嵌合体2N2C1F明显地强于天然TL1或嵌合体1N1C2F。
这些交换构建体的另一有趣方面是在于它们的表达量。检测四种嵌合体的每一种以观察它在COS细胞中的产量，与TIE2结合的能力，以及磷酸化TIE2的能力。这些实验结果表明嵌合体1和3以与TL1相当的水平被合成，而嵌合体2和4以与TL2相当的水平被合成。因此蛋白的高产量与TL2的N末端区相关。另外，当对EAhy926内皮细胞检测时，嵌合体2和4是有活性的，而1和3是无活性的。这样活性(受体的磷酸化)与TL1类纤维蛋白原区相关。因此嵌合体2和4每一个都具有高产量的所需特性以及激动剂活性。23.4抵抗蛋白裂解的构建体-根据大部分TL1制品常常在接近N末端处被裂解的现象，推测位于成熟蛋白质位置49的精氨酸残基(见图17)可能是参与调节蛋白质在体内的活性的候选裂解位点，用丝氨酸替代精氨酸(R49→S)可能会增加蛋白质的稳定性而不会影响其活性。构建这种突变体TL1并发现它与天然TL1具有类似的活性但未表现出蛋白质裂解的抗性。23.5组合突变体-嵌合构建体中最强有力者，2N1C1F，被进行另外的改变以使图27中所示的核苷酸784-787编码的半胱氨酸转变成丝氨酸。该分子(称为2N1C1F(C246S))被很好表达，它强有力地激活受体，抵抗蛋白质裂解并主要是二聚体，而不是更高级的多聚体。因此2N区似乎将蛋白酶抗性赋予该分子。最后，该分子被进一步改变以删除图27中所示的核苷酸199-201所编码的潜在蛋白酶敏感位点，以获得预期可激活，很好地表达的，二聚体并且抗蛋白酶的分子(称为2N1C1F(R51→S,C246→S))。
表1概述了已制备的修饰TIE-2配体的构建物并描述了它们每一个的特征，描述方面包括与TIE-2受体结合的能力，激活TIE-2受体的能力，所形成的结构类型(单体，二聚体等)以及它们的相对产量。具有三个区域的未修饰TL1(空白)和TL2(条纹)以长方框表示。条纹框表示来自TL2的区域。位于成熟TL1蛋白质中位置245的半胱氨酸用“C”表示。“X”画在“C”上表示半胱氨酸被另外的氨基酸替代，例如，正如TL1 CYS-突变体中的替代。同理，在最后的一个构建物中“X”画在“R”上表示成熟TL1蛋白中位置49的精氨酸残基被替代。“C”包含于一个修饰TL2构建物中，表示TL2 CYS+突变体。具有Fc尾或flag标记的构建体也被指明。
根据本发明所述，本领域中的技术人员易于理解可以制备另外的构建体以制备已改变了特性的其它修饰和嵌合的TIE-2配体。例如，可以制备包含TL2的N末端区和与人抗体IgG1的Fc段融合的TL1的F区的构建物。预期该构建物能够结合并激活TIE-2受体。同理，根据本文所述可以制备其它的构建物，因此它们也被视为在本发明的范围之内。23.6材料与方法嵌合体的构建
将交换构建体插入到XboⅠ位点已被改成AscⅠ位点的pJFE14载体中。然后用AscⅠ和NotⅠ酶切该载体；制备AscⅠ-NotⅠ骨架。用适当的寡核苷酸片断通过PCR制备这些嵌合体的DNA片断。
将FLAG-1C1F和FLAG-2C2F插入片断亚克隆进已用EcoRⅠ和NotⅠ酶切的pMT21载体骨架中。通过PCR获得“CF”截短片断，并通过使合成的寡核苷酸片断退火来构建FLAG标记物和前端的酪氨酸信号序列。转染
根据标准方法用DEAE-Dextran或LipofectAMINE将所有的构建体瞬时转染入COS7细胞中。转染3天后收集细胞并以1000rpm离心1分钟，随后将上清转移到干净试管中将贮存在-20℃。FLAG-1C1F-转染的和FLAG-2C2F-转染的细胞的染色
6孔培养板中的COS7细胞用TIE-2受体瞬时转染。各种配体转染细胞的COS7上清对细胞孵育30分钟，随后用不含镁和钙的磷酸缓冲盐溶液(PBS)冲洗两次。细胞在-20℃甲醇中固定3分钟，PBS冲洗1次，并在PBS/10％小牛血清(BCS)中与抗-FLAG M2抗体(IBI；1∶3000稀释度)共育30分钟。细胞用PBS冲洗1次，然后在PBS/10％BCS中与羊抗鼠IgG碱性磷酸酶(AP)偶联的抗体共育。细胞用PBS冲洗两次并与含1mM左旋咪唑的磷酸底物，BCIP/NBT，共育。磷酸化试验
为了进行剂量反应研究，COS7上清稀释于空载体pJFE14转染的COS7细胞的上清中。天然表达TIE-2受体的EA细胞在无血清培养基中饥饿2小时以上，随后在5％CO2 37℃下用适当的COS7上清处理10分钟。然后细胞在冰预冷的PBS中冲洗并用含蛋白酶抑制剂(10μg/ml亮抑肽酶，10μg/ml抑酶肽，1mM PMSF)的1％NP40裂解缓冲液裂解，接着用TIE-2受体特异的抗体进行免疫沉淀。然后用抗pTyr抗体对样品进行免疫印迹分析。斑点杂交
样品转移到已封闭的硝酸纤维素膜上，并用适当抗体进行探测。23.7从CHO和杆状病毒感染的昆虫细胞中制备嵌合Tie-2配体病毒制备
将嵌合配体(称为2N1C1F(C246S))的基因插到杆状病毒表达质粒中并与病毒DNA重组以制备重组杆状病毒，用以前所述的方法扩增和收获(O’Reilly,D.R.,L.K.Miller，和V.A.Luckow，《杆状病毒表达载体-实验室手册》(Baculovirus Expression Vectors-ALaboratory Manual)1992，纽约：W.H.Freeman)。获自Invitrogen的SF21昆虫细胞(Spodoptera frugiperda)在Gibco SF900Ⅱ无血清培养基中于27℃进行适应和扩增。未感染的细胞长到1×106个细胞/ml的密度。用血细胞计数器计数活细胞来测定细胞密度。配体的贮备病毒以0.01-0.1PFU/细胞的低复数加入到生物反应器中以开始感染。让感染过程持续3-4天使病毒最大程度地复制而不导致大量的细胞裂解。细胞悬液无菌等分到无菌离心瓶中，离心(1600RPM,30分钟)去除细胞。将无细胞上清收集到无菌瓶中并遮光4℃贮存直至进一步的应用。
按O’Reilly,Miller和Luckow所述用噬斑试验测定病毒滴度。方法是在已接种了1.5×106个细胞的60mm组织培养皿中进行。倍比稀释的贮备病毒加到贴壁细胞上并孵育混合物，同时不断摇晃以使病毒吸附到单个细胞上。加入琼脂层并将培养皿于27℃孵育5天。活细胞用中性红染色，显示圆噬斑，对其计数以得出表示为每毫升噬斑形成单位(PFU/ml)的病毒滴度。感染细胞以制备蛋白质
未感染的SF21细胞培养于组织培养皿中，并将含嵌合配体基因的病毒以1-10pfu/细胞的量加入。不断轻轻摇晃，允许病毒在27℃吸附90分钟，其后细胞中补充大量新鲜sf900Ⅱ无血清培养基。在27℃培养3天后，收集组织培养液，并用免疫印迹检测配体。Tie-2嵌合配体在CHO中的表达
Tie-2嵌合配体克隆进几种哺乳动物细胞表达载体的任一种中，包括(但不限于)pJFE,pcDNA3,pMT21,pED等。用磷酸钙沉淀或阳离子脂质体将质粒转入CHO DG44细胞(Urlaub,G.和Chasin,L.A.1980《分离缺乏二氢叶酸还原酶活性的中国仓鼠细胞突变体》《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)77:4216-4220；Urlaub,G.Kas,E.,CarotherS,A.M.，和Chasin,L.A.1983《培养的哺乳动物细胞中二倍体二氢叶酸位点的缺失》《细胞》(Cell)33:405-412)。在缺乏dhfr选择标记的载体情况下，质粒pSV2.dhfr以20％的摩尔比率与含TIE嵌合配体的质粒共转染。DHFR+细胞在选择培养基中生长来进行筛选(缺乏核苷和核苷酸并含10％已透析的胎牛血清的培养基)，并用TIE2融合受体进行免疫印迹来对克隆进行筛选以制备嵌合TIE配体。在选择培养基中用梯度浓度的氨甲喋呤对表达所需蛋白质的克隆进几轮基因扩增。经基因扩增后通过相似的免疫印迹技术将高表达克隆鉴定出。
表达嵌合TIE配体的细胞系在选择培养基或缺乏选择的培养基中被培养成单层，培养于悬浮培养瓶，旋转(roller)培养瓶，和生物反应器中，并且能在无血清培养基中生长。
                      表1TIE配体的突变分析N卷曲    类纤维                      TIE2       TIE2       多聚体       产量螺旋区蛋白原区                       结合       激活       结构
Figure A9719853100642
           +         +         更高级         低
Figure A9719853100643
           +         -         二聚体         高
Figure A9719853100644
              +         +         二聚体         低
Figure A9719853100645
              +         -         更高级         高
Figure A9719853100646
                       -         N.D.       N.D.          低
Figure A9719853100647
                       -         N.D.       N.D.          高                           -         -          单体          高
Figure A9719853100649
                           -         -          单体          高
Figure A97198531006410
                  +         -          二聚体        高     *    RU最大量                  +         -          二聚体        高     **   激活最强的     +         +          更高级        低       N.D.=未测定
Figure A97198531006413
     +         -          更高级        低
Figure A97198531006414
          +         +           N.D.         低
Figure A97198531006415
          +         -           N.D.         高
Figure A97198531006416
         +         -           N.D.          高         +         -           N.D.          高
Figure A97198531006418
             +         -           N.D.          低             +         +           N.D.          高*              +         -           N.D.          低
Figure A97198531006421
             +         +**        N.D.          高             +         +**        二聚体        高
Figure A97198531006423
             +         +           N.D.          低
保藏
根据布达佩斯条约以下制品已保藏于美国典型培养物保藏中心，12301 Panrklawn Drine,Rockville,Maryland 20852。编码TIE-2配体的质粒克隆于1994,10,7保藏于ATCC并称为“编码TIE-2配体的pJFE14”,ATCC登记号为75910。编码TIE-2融合受体的重组Autographa california杆状病毒于1994,10,7保藏于ATCC并称为“vTIE-2融合受体”，ATCC登记号为VR2484。含有人tie-2配体DNA的λ噬菌体载体于1994,10,26保藏于ATCC并称为“编码htie-2配体的lgt10”,ATCC登记号为75928。编码另一个TIE-2配体的质粒克隆于1994,12,9保藏于ATCC并称为“编码人TIE2配体2的pBluescript KS”,ATCC登记号为75963。质粒pBeloBacⅡ携带编码人TIE配体4的人TL-4基因插入片断，含有该质粒的大肠杆菌菌株DH10B于1996,7,2保藏于ATCC并称为“hTL-4”,ATCC登记号为98095。
本发明在范围上不受本文所述的具体实施方案限制。事实上，根据以上所述和附图，除了本发明所述的修饰改变之外，本发明的各种修饰改变对本领域的技术人员来说都是明白易懂的。这些修饰改变包括在所附的权利要求的范围之内。
      序列表(1)一般信息：
(ⅰ)申请人：REGENERON PHARMACEUTICAIS,INC.
(ⅱ)发明名称：新型修饰配体
(ⅲ)序列数：28
(ⅳ)通讯地址：
  (A)联系人：Regeneron Pharmaceuticals,Inc.
  (B)街道：777 Old Saw Mill Road
  (C)城市：Tarrytown
  (D)州：NY
  (E)国家：USA
  (F)邮政邮编：10591
(ⅴ)计算机可读形式：
  (A)介质类型：软盘
  (B)计算机：IBM兼容
  (C)操作系统：DOS
  (D)软件：FastSEQ版本2.0
(ⅵ)当前申请资料：
  (A)申请号：未知
  (B)申请日：同此
  (C)分类：
(ⅶ)在先申请资料：
  (A)申请号：USSN 08/740,223
  (B)申请日：25-OCT-1996
  (C)分类：
(ⅶ)在先申请资料：
  (A)申请号：USSN 60/022/999
  (B)申请日：02-AUG-1996
(ⅷ)律师/代理人信息：
  (A)姓名：Cobert,Robert J
  (B)注册号：36,108
  (C)参考/文档号：REG 333
(ⅸ)电讯信息：
  (A)电话：914-345-7400
  (B)电传：914-345-7721(2)SEQ ID NO:1信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：2149bp
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线型
(ⅱ)分子类型：DNA
(ⅸ)特性：
  (A)名称/关键词：编码序列
  (B)位置：310…1803
  (D)其它信息：
  (A)名称/关键词：人TIE-2配体1
  (B)位置：1…2149
  (D)其它信息：来自编码htie-2配体1的λgt10克隆
(ⅹⅰ)序列表述：SEQ ID NO:1:CAGCTGACTC AGGCAGGCTC CATGCTGAAC GGTCACACAG AGAGGAAACA ATAAATCTCA       60GCTACTATGC AATAAATATC TCAAGTTTTA ACGAAGAAAA ACATCATTGC AGTGAAATAA      120AAAATTTTAA AATTTTAGAA CAAAGCTAAC AAATGGCTAG TTTTCTATGA TTCTTCTTCA      180AACGCTTTCT TTGAGGGGGA AAGAGTCAAA CAAACAAGCA GTTTTACCTG AAATAAAGAA      240CTAGTTTTAG AGGTCAGAAG AAAGGAGCAA GTTTTGCGAG AGGCACGGAA GGAGTGTGCT      300GGCAGTACA ATG ACA GTT TTC CTT TCC TTT GCT TTC CTC GCT GCC ATT CTG    351
      Met Thr Val Phe Leu Ser Phe Ala Phe Leu Ala Ala Ile Leu
       1               5                  10ACT CAC ATA GGG TGC AGC AAT CAG CGC CGA AGT CCA GAA AAC AGT GGG      399Thr His Ile Gly Cys Ser Asn Gln Arg Arg Ser Pro Glu Asn Ser Gly15                  20                  25                  30AGA AGA TAT AAC CGG ATT CAA CAT GGG CAA TGT GCC TAC ACT TTC ATT      447Arg Arg Tyr Asn Arg Ile Gln His Gly Gln Cys Ala Tyr Thr Phe Ile
            35                  40                  45CTT CCA GAA CAC GAT GGC AAC TGT CGT GAG AGT ACG ACA GAC CAG TAC      495Leu Pro Glu His Asp Gly Asn Cys Arg Glu Ser Thr Thr Asp Gln Tyr
        50                  55                  60AAC ACA AAC GCT CTG CAG AGA GAT GCT CCA CAC GTG GAA CCG GAT TTC      543Asn Thr Asn Ala Leu Gln Arg Asp Ala Pro His Val Glu Pro Asp Phe
    65                  70                  75TCT TCC CAG AAA CTT CAA CAT CTG GAA CAT GTG ATG GAA AAT TAT ACT      591Ser Ser Gln Lys Leu Gln His Leu Glu His Val Met Glu Asn Tyr Thr
80                  85                  90CAG TGG CTG CAA AAA CTT GAG AAT TAC ATT GTG GAA AAC ATG AAG TCG      639Gln Trp Leu Gln Lys Leu Glu Asn Tyr Ile Val glu Asn Met Lys Ser95                  100                 105                 110GAG ATG GCC CAG ATA CAG CAG AAT GCA GTT CAG AAC CAC ACG GCT ACC      687Glu Met Ala Gln Ile Gln Gln Asn Ala Val Gln Asn His Thr Ala Thr
            115                 120                 125ATG CTG GAG ATA GGA ACC AGC CTC CTC TCT CAG ACT GCA GAG CAG ACC      735Met Leu Glu Ile Gly Thr Ser Leu Leu Ser Gln Thr Ala Glu Gln Thr
        130             135                     140AGA AAG CTG ACA GAT GTT GAG ACC CAG GTA CTA AAT CAA ACT TCT CGA      783Arg Lys Leu Thr Asp Val Glu Thr Gln Val Leu Asn Gln Thr Ser Arg
    145                 150                 155CTT GAG ATA CAG CTG CTG GAG AAT TCA TTA TCC ACC TAC AAG CTA GAG      831Leu Glu Ile Gln Leu Leu Glu Asn Ser Leu Ser Thr Tyr Lys Leu Glu
160                 165                 170AAG CAA CTT CTT CAA CAG ACA AAT GAA ATC TTG AAG ATC CAT GAA AAA      879Lys Gln Leu Leu Gln Gln Thr Asn Glu Ile Leu Lys Ile His Glu Lys175                 180                 185                 190AAC AGT TTA TTA GAA CAT AAA ATC TTA GAA ATG GAA GGA AAA CAC AAG      927Asn Ser Leu Leu Glu His Lys Ile Leu Glu Met Glu Gly Lys His Lys
            195                 200                 205GAA GAG TTG GAC ACC TTA AAG GAA GAG AAA GAG AAC CTT CAA GGC TTG      975Glu Glu Leu Asp Thr Leu Lys Glu Glu Lys Glu Asn Leu Gln Gly Leu
        210                 215                 220GTT ACT CGT CAA ACA TAT ATA ATC CAG GAG CTG GAA AAG CAA TTA AAC     1023Val Thr Arg Gln Thr Tyr Ile Ile Gln Glu Leu Glu Lys Gln Leu Asn
    225                 230                 235AGA GCT ACC ACC AAC AAC AGT GTC CTT CAG AAG CAG CAA CTG GAG CTG     1071Arg Ala Thr Thr Asn Asn Ser Val Leu Gln Lys Gln Gln Leu Glu Leu
240                 245                 250ATG GAC ACA GTC CAC AAC CTT GTC AAT CTT TGC ACT AAA GAA GGT GTT     1119Met Asp Thr Val His Asn Leu Val Asn Leu Cys Thr Lys Glu Gly Val255                 260                 265                 270TTA CTA AAG GGA GGA AAA AGA GAG GAA GAG AAA CCA TTT AGA GAC TGT     1167Leu Leu Lys Gly Gly Lys Arg Glu Glu Glu Lys Pro Phe Arg Asp Cys
            275                 280                 285GCA GAT GTA TAT CAA GCT GGT TTT AAT AAA AGT GGA ATC TAC ACT ATT     1215Ala Asp Val Tyr Gln Ala GIy Phe Asn Lys Ser Gly Ile Tyr Thr Ile
        290                 295                 300TAT ATT AAT AAT ATG CCA GAA CCC AAA AAG GTG TTT TGC AAT ATG GAT     1263Tyr Ile Asn Asn Met Pro Glu Pro Lys Lys Val Phe Cys Asn Met Asp
    305                 310                 315GTC AAT GGG GGA GGT TGG ACT GTA ATA CAA CAT CGT GAA GAT GGA AGT     1311Val Asn Gly Gly Gly Trp Thr Val Ile Gln His Arg Glu Asp Gly Ser
320             325                     330CTA GAT TTC CAA AGA GGC TGG AAG GAA TAT AAA ATG GGT TTT GGA AAT     1359Leu Asp Phe Gln Arg Gly Trp Lys Glu Tyr Lys Met Gly Phe Gly Asn335                 340                 345                 350CCC TCC GGT GAA TAT TGG CTC GGG AAT GAG TTT ATT TTT GCC ATT ACC     1407Pro Ser Gly Glu Tyr Trp Leu Gly Asn Glu Phe Ile Phe Ala Ile Thr
            355                 360                 365AGT CAG AGG CAG TAC ATG CTA AGA ATT GAG TTA ATG GAC TGG GAA GGG     1455Ser Gln Arg Gln Tyr Met Leu Arg Ile Glu Leu Met Asp Trp Glu Gly
        370                 375                 380AAC CGA GCC TAT TCA CAG TAT GAC AGA TTC CAC ATA GGA AAT GAA AAG     1503Asn Arg Ala Tyr Ser Gln Tyr Asp Arg Phe His Ile Gly Asn Glu Lys
    385                 390                 395CAA AAC TAT AGG TTG TAT TTA AAA GGT CAC ACT GGG ACA GCA GGA AAA     1551Gln Asn Tyr Arg Leu Tyr Leu Lys Gly His Thr Gly Thr Ala Gly Lys
400                 405                 410CAG AGC AGC CTG ATC TTA CAC GGT GCT GAT TTC AGC ACT AAA GAT GCT     1599Gln Ser Ser Leu Ile Leu His Gly Ala Asp Phe Ser Thr Lys Asp Ala415                 420                 425                 430GAT AAT GAC AAC TGT ATG TGC AAA TGT GCC CTC ATG TTA ACA GGA GGA     1647Asp Asn Asp Asn Cys Met Cys Lys Cys Ala Leu Met Leu Thr Gly Gly
            435                 440                 445TGG TGG TTT GAT GCT TGT GGC CCC TCC AAT CTA AAT GGA ATG TTC TAT     1695Trp Trp Phe Asp Ala Cys Gly Pro Ser Asn Leu Asn Gly Met Phe Tyr
        450                 455                 460ACT GCG GGA CAA AAC CAT GGA AAA CTG AAT GGG ATA AAG TGG CAC TAC     1743Thr Ala Gly Gln Asn His Gly Lys Leu Asn Gly Ile Lys Trp His Tyr
    465                 470                 475TTC AAA GGG CCC AGT TAC TCC TTA CGT TCC ACA ACT ATG ATG ATT CGA     1791Phe Lys Gly Pro Ser Tyr Ser Leu Arg Ser Thr Thr Met Met Ile Arg
480                 485                  490CCT TTA GAT TTT TGA AAG CGCA ATGTCAGAAG CGATTATGAA AGCAACAAAG AAATC 1848Pro Leu Asp Phe495CGGAGAAGCT GCCAGGTGAG AAACTGTTTG AAAACTTCAG AAGCAAACAA TATTGTCTCC   1908CTTCCAGCAA TAAGTGGTAG TTATGTGAAG TCACCAAGGT TCTTGACCGT GAATCTGGAG   1968CCGTTTGAGT TCACAAGAGT CTCTACTTGG GGTGACAGTG CTCACGTGGC TCGACTATAG   2028AAAACTCCAC TGACTGTCGG GCTTTAAAAA GGGAAGAAAC TGCTGAGCTT GCTGTGCTTC   2088AAACTACTAC TGGACCTTAT TTTGGAACTA TGGTAGCCAG ATGATAAATA TGGTTAATTT   2148C                                                                    2149(2)SEQ ID NO:2信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：498 a.a.
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线型
(ⅱ)分子类型：蛋白质
(ⅴ)片段类型：内在
(ⅸ)特性：
  (A)名称/关键词：人TIE-2配体1
  (B)位置：1…498
  (D)其它信息：来自编码htie-2配体1的λgt10克隆(ⅹⅰ)序列表述：SEQ ID NO:2:Met Thr Val Phe Leu Ser Phe Ala Phe Leu Ala Ala Ile Leu Thr His1               5                  10                  15Ile Gly Cys Ser Asn Gln Arg Arg Ser Pro Glu Asn Ser Gly Arg Arg
        20                  25                  30Tyr Asn Arg Ile Gln His Gly Gln Cys Ala Tyr Thr Phe Ile Leu Pro
    35                  40                  45Glu His Asp Gly Asn Cys Arg Glu Ser Thr Thr Asp Gln Tyr Asn Thr
50                  55                  60Asn Ala Leu Gln Arg Asp Ala Pro His Val Glu Pro Asp Phe Ser Ser65                  70                  75                  80Gln Lys Leu Gln His Leu Glu His Val Met Glu Asn Tyr Thr Gln Trp
            85                  90                  95Leu Gln Lys Leu Glu Asn Tyr Ile Val Glu Asn Met Lys Ser Glu Met
        100                 105                 110Ala Gln Ile Gln Gln Asn Ala Val Gln Asn His Thr Ala Thr Met Leu
    115                 120                 125Glu Ile Gly Thr Ser Leu Leu Ser Gln Thr Ala Glu Gln Thr Arg Lys
130                 135                 140Leu Thr Asp Val Glu Thr Gln Val Leu Asn Gln Thr Ser Arg Leu Glu145                 150                 155                 160Ile Gln Leu Leu Glu Asn Ser Leu Ser Thr Tyr Lys Leu Glu Lys Gln
            165                 170                 175Leu Leu Gln Gln Thr Asn Glu Ile Leu Lys Ile His Glu Lys Asn Ser
        180                 185                 190Leu Leu Glu His Lys Ile Leu Glu Met Glu Gly Lys His Lys Glu Glu
    195                 200                 205Leu Asp Thr Leu Lys Glu Glu Lys Glu Asn Leu Gln Gly Leu Val Thr
210                 215                 220Arg Gln Thr Tyr Ile Ile Gln Glu Leu Glu Lys Gln Leu Asn Arg Ala225                 230                 235                 240Thr Thr Asn Asn Ser Val Leu Gln Lys Gln Gln Leu Glu Leu Met Asp
            245                 250                 255Thr Val His Asn Leu Val Asn Leu Cys Thr Lys Glu Gly Val Leu Leu
        260                 265                 270Lye Gly Gly Lys Arg Glu Glu Glu Lys Pro Phe Arg Asp Cys Ala Asp
    275                 280                 285Val Tyr Gln Ala Gly Phe Asn Lys Ser Gly Ile Tyr Thr Ile Tyr Ile
290                 295                 300Asn Asn Met Pro Glu Pro Lys Lys Val Phe Cys Asn Met Asp Val Asn305                 310                 315                 320Gly Gly Gly Trp Thr Val Ile Gln His Arg Glu Asp Gly Ser Leu Asp
            325                 330                 335Phe Gln Arg Gly Trp Lys Glu Tyr Lys Met Gly Phe Gly Asn Pro Ser
        340                 345                 350Gly Glu Tyr Trp Leu Gly Asn Glu Phe Ile Phe Ala Ile Thr Ser Gln
    355                 360                 365Arg Gln Tyr Met Leu Arg Ile Glu Leu Met Asp Trp Glu Gly Asn Arg
370                 375                 380Ala Tyr Ser Gln Tyr Asp Arg Phe His Ile Gly Asn Glu Lys Gln Asn385                 390                 395                 400Tyr Arg Leu Tyr Leu Lys Gly His Thr Gly Thr Ala Gly Lys Gln Ser
            405                 410                 415Ser Leu Ile Leu His Gly Ala Asp Phe Ser Thr Lys Asp Ala Asp Asn
        420                 425                 430Asp Asn Cys Met Cys Lys Cys Ala Leu Met Leu Thr Gly Gly Trp Trp
    435                 440                 445Phe Asp Ala Cys Gly Pro Ser Asn Leu Asn Gly Met Phe Tyr Thr Ala
450                 455                 460Gly Gln Asn His Gly Lys Leu Asn Gly Ile Lye Trp His Tyr Phe Lys465                 470                 475                 480Gly Pro Ser Tyr Ser Leu Arg Ser Thr Thr Met Met Ile Arg Pro Leu
            485                 490                 495Asp Phe(2)SEQ ID NO:3信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：2146bp
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线型
(ⅱ)分子类型：DNA
(ⅸ)特性：
  (A)名称/关键词：编码序列
  (B)位置：310…1800
  (D)其它信息：
  (A)名称/关键词：人TIE-2配体1
  (B)位置：1…2146
  (D)其它信息：来自T98G克隆
(ⅹⅰ)序列表述：SEQ ID NO:3:CAGCTGACTC AGGCAGGCTC CATGCTGAAC GGTCACACAG AGAGGAAACA ATAAATCTCA     60GCTACTATGC AATAAATATC TCAAGTTTTA ACGAAGAAAA ACATCATTGC AGTGAAATAA    120AAAATTTTAA AATTTTAGAA CAAAGCTAAC AAATGGCTAG TTTTCTATGA TTCTTCTTCA    180AACGCTTTCT TTGAGGGGGA AAGAGTCAAA CAAACAAGCA GTTTTACCTG AAATAAAGAA    240CTAGTTTTAG AGGTCAGAAG AAAGGAGCAA GTTTTGCGAG AGGCACGGAA GGAGTGTGCT    300GGCAGTACA ATG ACA GTT TTC CTT TCC TTT GCT TTC CTC GCT GCC ATT CTG    351
      Met Thr Val Phe Leu Ser Phe Ala Phe Leu Ala Ala Ile Leu
       1               5                  10ACT CAC ATA GGG TGC AGC AAT CAG CGC CGA AGT CCA GAA AAC AGT GGG      399Thr His Ile Gly Cys Ser Asn Gln Arg Arg Ser Pro Glu Asn Ser Gly15                  20                  25              30AGA AGA TAT AAC CGG ATT CAA CAT GGG CAA TGT GCC TAC ACT TTC ATT      447Arg Arg Tyr Asn Arg Ile Gln His Gly Gln Cys Ala Tyr Thr Phe Ile
            35                  40                  45CTT CCA GAA CAC GAT GGC AAC TGT CGT GAG AGT ACG ACA GAC CAG TAC      495Leu Pro Glu His Asp Gly Asn Cys Arg Glu Ser Thr Thr Asp Gln Tyr
        50                  55                  60AAC ACA AAC GCT CTG CAG AGA GAT GCT CCA CAC GTG GAA CCG GAT TTC      543Asn Thr Asn Ala Leu Gln Arg Asp Ala Pro His Val Glu Pro Asp Phe
    65                  70                  75TCT TCC CAG AAA CTT CAA CAT CTG GAA CAT GTG ATG GAA AAT TAT ACT      591Ser Ser Gln Lys Leu Gln His Leu Glu His Val Met Glu Asn Tyr Thr
80                  85                  90CAG TGG CTG CAA AAA CTT GAG AAT TAC ATT GTG GAA AAC ATG AAG TCG      639Gln Trp Leu Gln Lys Leu Glu Asn Tyr Ile Val Glu Asn Met Lys Ser95                  100                 105                 110GAG ATG GCC CAG ATA CAG CAG AAT GCA GTT CAG AAC CAC ACG GCT ACC      687Glu Met Ala Gln Ile Gln Gln Asn Ala Val Gln Asn His Thr Ala Thr
            115                 120                 125ATG CTG GAG ATA GGA ACC AGC CTC CTC TCT CAG ACT GCA GAG CAG ACC      735Met Leu Glu Ile Gly Thr Ser Leu Leu Ser Gln Thr Ala Glu Gln Thr
        130                 135                 140AGA AAG CTG ACA GAT GTT GAG ACC CAG GTA CTA AAT CAA ACT TCT CGA      783Arg Lys Leu Thr Asp Val Glu Thr Gln Val Leu Asn Gln Thr Ser Arg
    145                 150                 155CTT GAG ATA CAG CTG CTG GAG AAT TCA TTA TCC ACC TAC AAG CTA GAG      831Leu Glu Ile Gln Leu Leu Glu Asn Ser Leu Ser Thr Tyr Lys Leu Glu
160                 165                 170AAG CAA CTT CTT CAA CAG ACA AAT GAA ATC TTG AAG ATC CAT GAA AAA      879Lys Gln Leu Leu Gln Gln Thr Asn Glu Ile Leu Lys Ile His Glu Lys175                 180                 185                 190AAC AGT TTA TTA GAA CAT AAA ATC TTA GAA ATG GAA GGA AAA CAC AAG      927Asn Ser Leu Leu Glu His Lys Ile Leu Glu Met Glu Gly Lys His Lys
            195                 200                 205GAA GAG TTG GAC ACC TTA AAG GAA GAG AAA GAG AAC CTT CAA GGC TTG      975Glu Glu Leu Asp Thr Leu Lys Glu Glu Lys Glu Asn Leu Gln Gly Leu
        210             215                     220GTT ACT CGT CAA ACA TAT ATA ATC CAG GAG CTG GAA AAG CAA TTA AAC     1023Val Thr Arg Gln Thr Tyr Ile Ile Gln Glu Leu Glu Lys Gln Leu Asn
    225                 230                 235AGA GCT ACC ACC AAC AAC AGT GTC CTT CAG AAG CAG CAA CTG GAG CTG     1071Arg Ala Thr Thr Asn Asn Ser Val Leu Gln Lys Gln Gln Leu Glu Leu
240                 245                 250ATG GAC ACA GTC CAC AAC CTT GTC AAT CTT TGC ACT AAA GAA GTT TTA     1119Met Asp Thr Val His Asn Leu Val Asn Leu Cys Thr Lys Glu Val Leu255                 260                 265                 270CTA AAG GGA GGA AAA AGA GAG GAA GAG AAA CCA TTT AGA GAC TGT GCA     1167Leu Lys Gly Gly Lys Arg Glu Glu Glu Lys Pro Phe Arg Asp Cys ALa
            275                 280                 285GAT GTA TAT CAA GCT GGT TTT AAT AAA AGT GGA ATC TAC ACT ATT TAT     1215Asp Val Tyr Gln Ala Gly Phe Asn Lys Ser Gly Ile Tyr Thr Ile Tyr
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320                 325                 330GAT TTC CAA AGA GGC TGG AAG GAA TAT AAA ATG GGT TTT GGA AAT CCC     1359Asp Phe Gln Arg Gly Trp Lys Glu Tyr Lys Met Gly Phe Gly Asn Pro335                 340                 345                 350TCC GGT GAA TAT TGG CTG GGG AAT GAG TTT ATT TTT GCC ATT ACC AGT     1407Ser Gly Glu Tyr Trp Leu Gly Asn Glu Phe Ile Phe Ala Ile Thr Ser
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        370                 375                 380CGA GCC TAT TCA CAG TAT GAC AGA TTC CAC ATA GGA AAT GAA AAG CAA     1503Arg Ala Tyr Ser Gln Tyr Asp Arg Phe His Ile Gly Asn Glu Lys Gln
    385                 390                 395AAC TAT AGG TTG TAT TTA AAA GGT CAC ACT GGG ACA GCA GGA AAA CAG     1551Asn Tyr Arg Leu Tyr Leu Lys Gly His Thr Gly Thr Ala Gly Lys Gln
400                 405                 410AGC AGC CTG ATC TTA CAC GGT GCT GAT TTC AGC ACT AAA GAT GCT GAT     1599Ser Ser Leu Ile Leu His Gly Ala Asp Phe Ser Thr Lys Asp Ala Asp415                 420                 425                 430AAT GAC AAC TGT ATG TGC AAA TGT GCC CTC ATG TTA ACA GGA GGA TGG     1647Asn Asp Asn Cys Met Cys Lys Cys Ala Leu Met Leu Thr Gly Gly Trp
            435                 440             445TGG TTT GAT GCT TGT GGC CCC TCC AAT CTA AAT GGA ATG TTC TAT ACT     1695Trp Phe Asp Ala Cys Gly Pro Ser Asn Leu Asn Gly Met Phe Tyr Thr
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480                 485                 490TTA GAT TTT TGA AAGCGCA ATGTCAGAAG CGATTATGAA AGCAACAAAG AAATCCGGA  1849Leu Asp Phe495GAAGCTGCCA GGTGAGAAAC TGTTTGAAAA CTTCAGAAGC AAACAATATT GTCTCCCTTC   1909CACCAATAAG TGGTAGTTAT GTGAAGTCAC CAAGGTTCTT GACCGTGAAT CTGGAGCCGT   1969TTGAGTTCAC AAGAGTCTCT ACTTGGGGTG ACAGTGCTCA CGTGGCTCGA CTATAGAAAA   2029CTCCACTGAC TGTCGGGCTT TAAAAAGGGA AGAAACTGCT GAGCTTGCTG TGCTTCAAAC   2089TACTACTGGA CCTTATTTTG GAACTATGGT AGCCAGATGA TAAATATGGT TAATTTC      2146(2)SEQ ID NO:4信息：
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  (D)其它信息：来自T98G克隆(ⅹⅰ)序列表述：SEQ ID NO:4:Met Thr Val Phe Leu Ser Phe Ala Phe Leu Ala Ala Ile Leu Thr His1               5                  10                  15Ile Gly Cys Ser ASn Gln Arg Arg Ser Pro Glu Asn Ser Gly Arg Arg
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290                 295                 300Asn Met Pro Glu Pro Lys Lys Val Phe Cys Asn Met Asp Val Asn Gly305                 310                 315                 320Gly Gly Trp Thr Val Ile Gln His Arg Glu Asp Gly Ser Leu Asp Phe
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    355                 360                 365Gln Tyr Met Leu Arg Ile Glu Leu Met Asp Trp Glu Gly Asn Arg Ala
370                 375                 380Tyr Ser Gln Tyr Asp Arg Phe His Ile Gly Asn Glu Lys Gln Asn Tyr385                 390                 395                 400Arg Leu Tyr Leu Lys Gly His Thr Gly Thr Ala Gly Lys Gln Ser Ser
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450                 455                 460Gln Asn His Arg Lys Leu Asn Gly Ile Lys Trp His Tyr Phe Lys Gly465                 470                  475                480Pro Ser Tyr Ser Leu Arg Ser Thr Thr Met Met Ile Arg Pro Leu Asp
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(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：2282bp
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(ⅸ)特性：
  (A)名称/关键词：编码序列
  (B)位置：357…1844
  (D)其它信息：
  (A)名称/关键词：人TIE-2配体2
  (B)位置：1…2282
  (D)其它信息：来自编码人TIE-2配体2的pBluescript KS
               克隆
(ⅹⅰ)序列表述：SEQ ID NO:5:GAATTCCTGG GTTGGTGTTT ATCTCCTCCC AGCCTTGAGG GAGGGAACAA CACTGTAGGA      60TCTGGGGAGA GAGGAACAAA GGACCGTGAA AGCTGCTCTG TAAAAGCTGA CACAGCCCTC     120CCAAGTGAGC AGGACTGTTC TTCCCACTGC AATCTGACAG TTTACTGCAT GCGTGGAGAG     180AACACAGCAG TAAAAACCAG GTTTGCTACT GGAAAAAGAG GAAAGAGAAG AGTTTCATTG     240ACGGACCCAG CCATGGCAGC GTAGCAGCCC TGCGTTTCAG ACGGCAGCAG CTCGGGACTC     300TGGACGTGTG TTTGCCCTCA AGTTTGCTAA GCTGCTGGTT TATTACTGAA GAAAGA ATG     359
                                                          Met
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    20                  25                  30TAT CAG GTC CAG CAT GGG TCC TGC AGC TAC ACT TTC CTC CTG CCA GAG      503Tyr Gln Val Gln His Gly Ser Cys Ser Tyr Thr Phe Leu Leu Pro Glu
35                  40                  45ATG GAC AAC TGC CGC TCT TCC TCC AGC CCC TAC GTG TCC AAT GCT GTG      551Met Asp Asn Cys Arg Ser Ser Ser Ser Pro Tyr Val Ser Asn Ala Val50                  55                  60                  65CAG AGG GAC GCG CCG CTC GAA TAC GAT GAC TCG GTG CAG AGG CTG CAA      599Gln Arg Asp Ala Pro Leu Glu Tyr Asp Asp Ser Val Gln Arg Leu Gln
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ll5                 120                 125AAC CTG TTG AAC CAA ACA GCT GAG CAA ACG CGG AAG TTA ACT GAT GTG      791Asn Leu Leu Asn Gln Thr Ala Glu Gln Thr Arg Lys Leu Thr Asp Val130                 135                 140                 145GAA GCC CAA GTA TTA AAT CAG ACC ACG AGA CTT GAA CTT CAG CTC TTG      839Glu Ala Gln Val Leu Asn Gln Thr Thr Arg Leu Glu Leu Gln Leu Leu
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        245                 250                 255TTA CTG ACT ATG ATG TCC ACA TCA AAC TCA GCT AAG GAC CCC ACT GTT     1175Leu Leu Thr Met Met Ser Thr Ser Asn Ser Ala Lys Asp Pro Thr Val
    260                 265                 270GCT AAA GAA GAA CAA ATC AGC TTC AGA GAC TGT GCT GAA GTA TTC AAA     1223Ala Lys Glu Glu Gln Ile Ser Phe Arg Asp Cys Ala Glu Val Phe Lys
275                 280                 285TCA GGA CAC ACC ACA AAT GGC ATC TAC ACG TTA ACA TTC CCT AAT TCT     1271Ser Gly His Thr Thr Asn Gly Ile Tyr Thr Leu Thr Phe Pro Asn Ser290                 295                 300                 305ACA GAA GAG ATC AAG GCC TAC TGT GAC ATG GAA GCT GGA GGA GGC GGG     1319Thr Glu Glu Ile Lys Ala Tyr Cys Asp Met Glu Ala Gly Gly Gly Gly
            310                 315                 320TGG ACA ATT ATT CAG CGA CGT GAG GAT GGC AGC GTT GAT TTT CAG AGG     1367Trp Thr Ile Ile Gln Arg Arg Glu Asp Gly Ser Val Asp Phe Gln Arg
        325                 330                 335ACT TGG AAA GAA TAT AAA GTG GGA TTT GGT AAC CCT TCA GGA GAA TAT     1415Thr Trp Lys Glu Tyr Lys Val Gly Phe Gly Asn Pro Ser Gly Glu Tyr
    340                 345                 350TGG CTG GGA AAT GAG TTT GTT TCG CAA CTG ACT AAT CAG CAA CGC TAT     1463Trp Leu Gly Asn Glu Phe Val Ser Gln Leu Thr Asn Gln Gln Arg Tyr
355                 360                 365GTG CTT AAA ATA CAC CTT AAA GAC TGG GAA GGG AAT GAG GCT TAC TCA     1511Val Leu Lys Ile His Leu Lys Asp Trp Glu Gly Asn Glu Ala Tyr Ser370                  375                 380                 385TTG TAT GAA CAT TTC TAT CTC TCA AGT GAA GAA CTC AAT TAT AGG ATT     1559Leu Tyr Glu His Phe Tyr Leu Ser Ser Glu Glu Leu Asn Tyr Arg Ile
            390                 395                 400CAC CTT AAA GGA CTT ACA GGG ACA GCC GGC AAA ATA AGC AGC ATC AGC     1607His Leu Lys Gly Leu Thr Gly Thr Ala Gly Lys Ile Ser Ser Ile Ser
        405                 410                 415CAA CCA GGA AAT GAT TTT AGC ACA AAG GAT GGA GAC AAC GAC AAA TGT     1655Gln Pro Gly Asn Asp Phe Ser Thr Lys Asp Gly Asp Asn Asp Lys Cys
    420                 425                 430ATT TGC AAA TGT TCA CAA ATG CTA ACA GGA GGC TGG TGG TTT GAT GCA     1703Ile Cys Lys Cys Ser Gln Met Leu Thr Gly Gly Trp Trp Phe Asp Ala
435                 440                 445TGT GGT CCT TCC AAC TTG AAG GGA ATG TAC TAT CCA CAG AGG CAG AAC     1751Cys Gly Pro Ser Asn Leu Asn Gly Met Tyr Tyr Pro Gln Arg Gln Asn450                 455                 460                 465ACA AAT AAG TTC AAC GGC ATT AAA TGG TAC TAC TGG AAA GGC TCA GGC     1799Thr Asn Lys Phe Asn Gly Ile Lys Trp Tyr Tyr Trp Lye Gly Ser Gly
            470                 475                 480TAT TCG CTC AAG GCC ACA ACC ATG ATG ATC CGA CCA GCA GAT TTC TAAAC   1849Tyr Ser Leu Lys Ala Thr Thr Met Met Ile Arg Pro Ala Aap Phe
        485                 490                 495ATCCCAGTCC ACCTGAGGAA CTGTCTCGAA CTATTTTCAA AGACTTAAGC CCAGTGCACT    1909GAAAGTCACG GCTGCGCACT GTGTCCTCTT CCACCACAGA GGGCGTGTGC TCGGTGCTGA    1969CGGGACCCAC ATGCTCCAGA TTAGAGCCTG TAAACTTTAT CACTTAAACT TGCATCACTT    2029AACGGACCAA AGCAAGACCC TAAACATCCA TAATTGTGAT TAGACAGAAC ACCTATGCAA    2089AGATGAACCC GAGGCTGAGA ATCAGACTGA CAGTTTACAG ACGCTGCTGT CACAACCAAG    2149AATGTTATGT GCAAGTTTAT CAGTAAATAA CTGGAAAACA GAACACTTAT GTTATACAAT    2209ACAGATCATC TTGGAACTGC ATTCTTCTGA GCACTGTTTA TACACTGTGT AAATACCCAT    2269ATGTGCTGAA TTC                                                                                                                                                             2282(2)SEQ ID NO:6信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：496a.a.
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线型
(ⅱ)分子类型：蛋白质
(ⅴ)片段类型：内在
(ⅸ)特性：
  (A)名称/关键词：人TIE-2配体2
  (B)位置：1…496
  (D)其它信息：来自编码人TIE-2配体2的pBluescript KS
            克隆
(ⅹⅰ)序列表述：SEQ ID NO:6:Met Trp Gln Ile Val Phe Phe Thr Leu Ser Cys Asp Leu Val Leu Ala1               5                  10                  15Ala Ala Tyr Asn Asn Phe Arg Lys Ser Met Asp Ser Ile Gly Lys Lys
        20                  25                  30Gln Tyr Gln Val Gln His Gly Ser Cys Ser Tyr Thr Phe Leu Leu Pro
    35                  40                  45Glu Met Asp Asn Cys Arg Ser Ser Ser Ser Pro Tyr Val Ser Asn Ala
50                  55                  60Val Gln Arg Asp Ala Pro Leu Glu Tyr Asp Asp Ser Val Gln Arg Leu65                  70                  75                  80Gln Val Leu Glu Asn Ile Met Glu Asn Asn Thr Gln Trp Leu Met LyE
            85                  90                  95Leu Glu Asn Tyr Ile Gln Asp Asn Met Lys Lys Glu Met Val Glu Ile
        100                105                  110Gln Gln Asn Ala Val Gln Asn Gln Thr Ala Val Met Ile Glu Ile Gly
    115                     120                     125Thr Asn Leu Leu Asn Gln Thr Ala Glu Gln Thr Arg Lys Leu Thr Asp
130                 135                 140Val Glu Ala Gln Val Leu Asn Gln Thr Thr Arg Leu Glu Leu Gln Leu145                 150                 155                 160Leu Glu His Ser Leu Ser Thr Asn Lys Leu Glu Lys Gln Ile Leu Asp
            165                 170                 175Gln Thr Ser Glu Ile Asn Lys Leu Gln Asp Lys Asn Ser Phe Leu Glu
        180                 185                 190Lys Lys Val Leu Ala Met Glu ABp Lys His Ile Ile Gln Leu Gln Ser
    195                 200                 205Ile Lys Glu Glu Lys Asp Gln Leu Gln Val Leu Val Ser Lys Gln Asn
210                 215                 220Ser Ile Ile Glu Glu Leu Glu Lys Lys Ile Val Thr Ala Thr Val Asn225                 230                 235                 240Asn Ser Val Leu Gln Lys Gln Gln His Asp Leu Met Glu Thr Val Asn
            245                 250                 255Asn Leu Leu Thr Met Met Ser Thr Ser Asn Ser Ala Lys Asp Pro Thr
        260                 265                 270Val Ala Lys Glu Glu Gln Ile Ser Phe Arg Asp Cys Ala Glu Val Phe
    275                 280                 285Lys Ser Gly His Thr Thr Asn Gly Ile Tyr Thr Leu Thr Phe Pro Asn
290                 295                 300Ser Thr Glu Glu Ile Lys Ala Tyr cys Asp Met Glu Ala Gly Gly Gly305                 310                 315                 320Gly Trp Thr Ile Ile Gln Arg Arg Glu Asp Gly Ser Val Asp Phe Gln
            325                 330                 335Arg Thr Trp Lys Glu Tyr Lys Val Gly Phe Gly Asn Pro Ser Gly Glu
        340                 345                 350Tyr Trp Leu Gly Asn Glu Phe Val Ser Gln Leu Thr Asn Gln Gln Arg
    355                 360                 365Tyr Val Leu Lys Ile His Leu Lys Asp Trp Glu Gly Asn Glu Ala Tyr
370                 375                 380Ser Leu Tyr Glu His Phe Tyr Leu Ser Ser Glu Glu Leu Asn Tyr Arg385                 390                 395                 400Ile His Leu Lys Gly Leu Thr Gly Thr Ala Gly Lys Ile Ser Ser Ile
            405                 410                 415Ser Gln Pro Gly Asn Asp Phe Ser Thr Lys Asp Gly Asp Asn Asp Lys
        420                 425                 430Cys Ile Cys Lys Cys Ser Gln Met Leu Thr Gly Gly Trp Trp Phe Asp
    435                 440                 445Ala Cys Gly Pro Ser Asn Leu Asn Gly Met Tyr Tyr Pro Gln Arg Gln
450                 455                 460Asn Thr Asn Lys Phe Asn Gly Ile Lys Trp Tyr Tyr Trp Lys Gly Ser465                 470                 475                 480Gly Tyr Ser Leu Lys Ala Thr Thr Met Met Ile Arg Pro Ala Asp Phe
            485                490                  495(2)SEQ ID NO:7信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：478a.a.
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线型
(ⅱ)分子类型：蛋白质
(ⅸ)特性：
  (A)名称/关键词：成熟TL1蛋白
  (B)位置：1…478
  (D)其它信息：
(ⅹⅰ)序列表述：SEQ ID NO:7:Asn Gln Arg Arg Ser Pro Glu Asn Ser Gly Arg Arg Tyr Asn Arg Ile1               5                  10                  15Gln His Gly Gln Cys Ala Tyr Thr Phe Ile Leu Pro Glu His Asp Gly
        20                  25                  30Asn Cys Arg Glu Ser Thr Thr Asp Gln Tyr Asn Thr Asn Ala Leu Gln
    35                  40                  45Arg Asp Ala Pro His Val Glu Pro Asp Phe Ser Ser Gln Lys Leu Gln
50                  55                  60His Leu Glu His Val Met Glu Asn Tyr Thr Gln Trp Leu Gln Lys Leu65                  70                  75                  80Glu Asn Tyr Ile Val Glu Asn Met Lys Ser Glu Met Ala Gln Ile Gln
            85                  90                  95Gln Asn Ala Val Gln Asn His Thr Ala Thr Met Leu Glu Ile Gly Thr
        100                 105                 110Ser Leu Leu Ser Gln Thr Ala Glu Gln Thr Arg Lys Leu Thr Asp Val
    115                 120                 125Glu Thr Gln Val Leu Asn Gln Thr Ser Arg Leu Glu Ile Gln Leu Leu
130                 135                 140Glu Asn Ser Leu Ser Thr Tyr Lys Leu Glu Lys Gln Leu Leu Gln Gln145                 150                 155                 160Thr Asn Glu Ile Leu Lys Ile His Glu Lys Asn Ser Leu Leu Glu His
            165                 170                 175Lys Ile Leu Glu Met Glu Gly Lys His Lys Glu Glu Leu Asp Thr Leu
        180                 185                 190Lys Glu Glu Lys Glu Asn Leu Gln Gly Leu Val Thr Arg Gln Thr Tyr
    195                 200                 205Ile Ile Gln Glu Leu Glu Lys Gln Leu Asn Arg Ala Thr Thr Asn Asn
210                 215                 220Ser Val Leu Gln Lys Gln Gln Leu Glu Leu Met Asp Thr Val His Asn225                 230                 235                 240Leu Val Asn Leu Cys Thr Lys Glu Gly Val Leu Leu Lys Gly Gly Lys
            245                 250                 255Arg Glu Glu Glu Lys Pro Phe Arg Asp cys Ala Asp Val Tyr Gln Ala
        260                 265                 270Gly Phe Asn Lys Ser Gly Ile Tyr Thr Ile Tyr Ile Asn Asn Met Pro
    275                 280                 285Glu Pro Lys Lys Val Phe Cys Asn Met Asp Val Asn Gly Gly Gly Trp
290                 295                 300Thr Val Ile Gln His Arg Glu Asp Gly Ser Leu Asp Phe Gln Arg Gly305                 310                 315                 320Trp Lys Glu Tyr Lys Met Gly Phe Gly Asn Pro Ser Gly Glu Tyr Trp
            325                330                  335Leu Gly Asn Glu Phe Ile Phe Ala Ile Thr Ser Gln Arg Gln Tyr Met
        340                 345                 350Leu Arg Ile Glu Leu Met Asp Trp Glu Gly Asn Arg Ala Tyr Ser Gln
    355                 360                 365Tyr Asp Arg Phe His Ile Gly Asn Glu Lys Gln Asn Tyr Arg Leu Tyr
370                 375                 380Leu Lys Gly His Thr Gly Thr Ala Gly Lys Gln Ser Ser Leu Ile Leu385                 390                 395                 400His Gly Ala Asp Phe Ser Thr Lys Asp Ala Asp Asn Asp Asn Cys Met
            405                 410                 415
Cys Lys Cys Ala Leu Met Leu Thr Gly Gly Trp Trp Phe Asp Ala Cys
       420                  425                 430Gly Pro Ser Asn Leu Asn Gly Met Phe Tyr Thr Ala Gly Gln Asn His
   435                  440                 445Gly Lys Leu Asn Gly Ile Lys Trp His Tyr Phe Lys Gly Pro Ser Tyr450                  455                 460Ser Leu Arg Ser Thr Thr Met Met Ile Arg Pro Leu Asp Phe465                 470                 475(2)SEQ ID NO:8信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：480a.a.
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线型
(ⅱ)分子类型：蛋白质
(ⅸ)特性：
  (A)名称/关键词：成熟TL2蛋白
  (B)位置：1…480
  (D)其它信息：
(ⅹⅰ)序列表述：SEQ ID NO:8:Ala Ala Tyr Asn Asn Phe Arg Lys Ser Met Asp Ser Ile Gly Lys Lys1               5                  10                  15Gln Tyr Gln Val Gln His Gly Ser Cys Ser Tyr Thr Phe Leu Leu Pro
        20                  25                  30Glu Met Asp Asn Cys Arg Ser Ser Ser Ser Pro Tyr Val Ser Asn Ala
    35                  40                  45Val Gln Arg Asp Ala Pro Leu Glu Tyr Asp Asp Ser Val Gln Arg Leu
50                  55                  60Gln Val Leu Glu Asn Ile Met Glu Asn Asn Thr Gln Trp Leu Met Lys65                  70                  75                  80Leu Glu Asn Tyr Ile Gln Asp Asn Met Lys Lys Glu Met Val Glu Ile
            85                  90                  95Gln Gln Asn Ala Val Gln Asn Gln Thr Ala Val Met Ile Glu Ile Gly
        100                 105                 110Thr Asn Leu Leu Asn Gln Thr Ala Glu Gln Thr Arg Lys Leu Thr Asp
    115                 120                 125Val Glu Ala Gln Val Leu Asn Gln Thr Thr Arg Leu Glu Leu Gln Leu
130                 135                 140Leu Glu His Ser Leu Ser Thr Asn Lys Leu Glu Lys Gln Ile Leu Asp145                 150                 155                 160Gln Thr Ser Glu Ile Asn Lys Leu Gln Asp Lys Asn Ser Phe Leu Glu
            165                 170                 175Lys Lys Val Leu Ala Met Glu Asp Lys His Ile Ile Gln Leu Gln Ser
        180                 185                 190Ile Lys Glu Glu Lys Asp Gln Leu Gln Val Leu Val Ser Lys Gln Asn
    195                 200                 205Ser Ile Ile Glu Glu Leu Glu Lys Lys Ile Val Thr Ala Thr Val Asn
210                 215                 220Asn Ser Val Leu Gln Lys Gln Gln His Asp Leu Met Glu Thr Val Asn225                 230                 235                 240Asn Leu Leu Thr Met Met Ser Thr Ser Asn Ser Ala Lys Asp Pro Thr
           245                  250                 255Val Ala Lys Glu Glu Gln Ile Ser Phe Arg Asp Cys Ala Glu Val Phe
       260                  265                 270Lys Ser Gly His Thr Thr Asn Gly Ile Tyr Thr Leu Thr Phe Pro Asn
    275                 280                 285Ser Thr Glu Glu Ile Lys Ala Tyr Cys Asp Met Glu Ala Gly Gly Gly
290                 295                 300Gly Trp Thr Ile Ile Gln Arg Arg Glu Asp Gly Ser Val Asp Phe Gln305                 310                 315                 320Arg Thr Trp Lys Glu Tyr Lys Val Gly Phe Gly Asn Pro Ser Gly Glu
           325                  330                 335Tyr Trp Leu Gly Asn Glu Phe Val Ser Gln Leu Thr Asn Gln Gln Arg
       340                  345                 350Tyr Val Leu Lys Ile His Leu Lys Asp Trp Glu Gly Asn Glu Ala Tyr
    355                 360                 365Ser Leu Tyr Glu His Phe Tyr Leu Ser Ser Glu Glu Leu Asn Tyr Arg
370                 375                 380Ile His Leu Lys Gly Leu Thr Gly Thr Ala Gly Lys Ile Ser Ser Ile385                 390                 395                 400Ser Gln Pro Gly Asn Asp Phe Ser Thr Lys Asp Gly Asp Asn Asp Lys
            405                 410                 415Cys Ile Cys Lys Cys Ser Gln Met Leu Thr Gly Gly Trp Trp Phe Asp
        420                 425                 430Ala Cys Gly Pro Ser Asn Leu Asn Gly Met Tyr Tyr Pro Gln Arg Gln
    435                 440                 445Asn Thr Asn Lys Phe Asn Gly Ile Lys Trp Tyr Tyr Trp Lys Gly ser
450                 455                 460Gly Tyr Ser Leu Lys Ala Thr Thr Met Met Ile Arg Pro Ala Asp Phe465                 470                 475                 480(2)SEQ ID NO:9信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：1849bp
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线型
(ⅱ)分子类型：DNA
(ⅸ)特性：
  (A)名称/关键词：编码序列
  (B)位置：47…1573
  (D)其它信息：
  (A)名称/关键词：TIE配体3
  (B)位置：1…1849
  (D)其它信息：类纤维蛋白原区始于929位(ⅹⅰ)序列表述：SEQ ID NO:9:CTGTCCTGGT ACCTGACAAG ACCACCTCAC CACCACTTGG TCTCAG ATG CTC TGC         55
                                                Met Leu Cys
                                                 1CAG CCA GCT ATG CTA CTA GAT GGC CTC CTC CTG CTG GCC ACC ATG GCT       103Gln Pro Ala Met Leu Leu Asp Gly Leu Leu Leu Leu Ala Thr Met Ala
 5                  10                  15CCA GCC CAG CAC AGA GGG CCA GAA GCC GGT GGG CAC CGC CAG ATT CAC       151Ala Ala Gln His Arg Gly Pro Glu Ala Gly Gly His Arg Gln Ile His20                  25                  30                  35CAG GTC CGG CGT GGC CAG TGC AGC TAC ACC TTT GTG GTG CCG GAG CCT       199Gln Val Arg Arg Gly Gln Cys Ser Tyr Thr Phe Val Val Pro Glu Pro
            40                  45                  50GAT ATC TGC CAG CTG GCG CCG ACA GCG GCG CCT GAG GCT TTG GGG GGC       247Asp Ile Cys Gln Leu Ala Pro Thr Ala Ala Pro Glu Ala Leu Gly Gly
        55                  60                  65TCC AAT AGC CTC CAG AGG GAC TTG CCT GCC TCG AGG CTG CAC CTA ACA       295Ser Asn Ser Leu Gln Arg Asp Leu Pro Ala Ser Arg Leu His Leu Thr
    70                  75                  80GAC TGG CGA GCC CAG AGG GCC CAG CGG GCC CAG CGT GTG AGC CAG CTG       343Asp Trp Arg Ala Gln Arg Ala Gln Arg Ala Gln Arg Val Ser Gln Leu
85                  90                  95GAG AAG ATA CTA GAG AAT AAC ACT CAG TGG CTG CTG AAG CTG GAG CAG       391Glu Lys Ile Leu Glu Asn Asn Thr Gln Trp Leu Leu Lys Leu Glu Gln100                105                  110                 115TCC ATC AAG GTG AAC TTG AGG TCA CAC CTG GTG CAG GCC CAG CAG GAC       439Ser Ile Lys Val Asn Leu Arg Ser His Leu Val Gln Ala Gln Gln Asp
            120                 125                 130ACA ATC CAG AAC CAG ACA ACT ACC ATG CTG GCA CTG GGT GCC AAC CTC       487Thr Ile Gln Asn Gln Thr Thr Thr Met Leu Ala Leu Gly Ala Asn Leu
        135                 140                 145ATG AAC CAG ACC AAA GCT CAG ACC CAC AAG CTG ACT GCT GTG GAG GCA       535Met Asn Gln Thr Lys Ala Gln Thr His Lys Leu Thr Ala Val Glu Ala
    150                 155                 160CAG GTC CTA AAC CAG ACA TTG CAC ATG AAG ACC CAA ATG CTG GAG AAC       583Gln Val Leu Asn Gln Thr Leu His Met Lys Thr Gln Met Leu Glu Asn165                  170                 175TCA CTG TCC ACC AAC AAG CTG GAG CGG CAG ATG CTG ATG CAG AGC CGA       631Ser Leu Ser Thr Asn Lys Leu Glu Arg Gln Met Leu Met Gln Ser Arg180                 185                 190                 195GAG CTG CAG CGG CTG CAG GGT CGC AAC AGG GCC CTG GAG ACC AGG CTG       679Glu Leu Gln Arg Leu Gln Gly Arg Asn Arg Ala Leu Glu Thr Arg Leu
            200                 205                 210CAG GCA CTG GAA GCA CAA CAT CAG GCC CAG CTT AAC AGC CTC CAA GAG       727Gln Ala Leu Glu Ala Gln His Gln Ala Gln Leu Asn Ser Leu Gln Glu
        215                 220                 225AAG AGG GAA CAA CTG CAC AGT CTC CTG GGC CAT CAG ACC GGG ACC CTG       775Lys Arg Glu Gln Leu His Ser Leu Leu Gly His Gln Thr Gly Thr Leu
    230                 235                 240GCT AAc CTG AAG CAC AAT CTG CAC GCT CTC AGC AGC AAT TCC AGC TCC       823Ala Asn Leu Lys His Asn Leu His Ala Leu Ser Ser Asn Ser Ser Ser
245                 250                 255CTG CAG CAG CAG CAG CAG CAA CTG ACG GAG TTT GTA CAG CGC CTG GTA       871Leu Gln Gln Gln Gln Gln Gln Leu Thr Glu Phe Val Gln Arg Leu Val260                 265                 270                 275CGG ATT GTA GCC CAG GAC CAG CAT CCG GTT TCC TTA AAG ACA CCT AAG       919Arg Ile Val Ala Gln Asp Gln His Pro Val Ser Leu Lys Thr Pro Lys
           280                  285                 290CCA GTG TTC CAG GAC TGT GCA GAG ATC AAG CGC TCC GGG GTT AAT ACC       967Pro Val Phe Gln Asp Cys Ala Glu Ile Lys Arg Ser Gly Val Asn Thr
       295                  300                 305AGC GGT GTC TAT ACC ATC TAT GAG ACC AAC ATG ACA AAG CCT CTC AAG      1015Ser Gly Val Tyr Thr Ile Tyr Glu Thr Asn Met Thr Lys Pro Leu Lys
    310                 315                 320GTG TTC TGT GAC ATG GAG ACT GAT GGA GGT GGC TGG ACC CTC ATC CAG      1063Val Phe Cys Asp Met Glu Thr Asp Gly Gly Gly Trp Thr Leu Ile Gln
325                 330                 335CAC CGG GAG GAT GGA AGC GTA AAT TTC CAG AGG ACC TGG GAA GAA TAC      1111His Arg Glu Asp Gly Ser Val Asn Phe Gln Arg Thr Trp Glu Glu Tyr340                 345                 350                 355AAA GAG GGT TTT GGT AAT GTG GCC AGA GAG CAC TGG CTG GGC AAT GAG      1159Lys Glu Gly Phe Gly Asn Val Ala Arg Glu His Trp Leu Gly Asn Glu
            360                 365                 370GCT GTG CAC CGC CTC ACC AGC AGA ACG GCC TAC TTG CTA CGC GTG GAA      1207Ala Val His Arg Leu Thr Ser Arg Thr Ala Tyr Leu Leu Arg Val Glu
        375                 380                 385CTG CAT GAC TGG GAA GGC CGC CAG ACC TCC ATC CAG TAT GAG AAC TTC      1255Leu His Asp Trp Glu Gly Arg Gln Thr Ser Ile Gln Tyr Glu Asn Phe
    390                 395                 400CAG CTG GGC AGC GAG AGG CAG CGG TAC AGC CTC TCT GTG AAT GAC AGC      1303Gln Leu Gly Ser Glu Arg Gln Arg Tyr Ser Leu Ser Val Asn Asp Ser
405                 410                 415AGC AGT TCA GCA GGG CGC AAG AAC AGC CTG GCT CCT CAG GGC ACC AAG      1351Ser Ser Ser Ala Gly Arg Lys Asn Ser Leu Ala Pro Gln Gly Thr Lys420                 425                 430                 435TTC AGC ACC AAA GAC ATG GAC AAT GAT AAC TGC ATG TGT AAA TGT GCT      1399Phe Ser Thr Lys Asp Met Asp Asn Asp Asn Cys Met Cys Lys Cys Ala
            440                 445                 450CAG ATG CTG TCT GGA GGG TGG TGG TTT GAT GCC TGT GGC CTC TCC AAC      1447Gln Met Leu Ser Gly Gly Trp Trp Phe Asp Ala Cys Gly Leu Ser Asn
        455                 460                 465CTC AAT GGC ATC TAC TAT TCA GTT CAT CAG CAC TTG CAC AAG ATC AAT      1495Leu Asn Gly Ile Tyr Tyr Ser Val His Gln His Leu His Lys Ile Asn
    470                 475                 480GGC ATC CGC TGG CAC TAC TTC CGA GGC CCC AGC TAC TCA CTG CAC GGC      1543Gly Ile Arg Trp His Tyr Phe Arg Gly Pro Ser Tyr Ser Leu His Gly
485                 490                 495ACA CGC ATG ATG CTG AGG CCA ATG GGT GCC TGA CACACAG CCCTGCAGAG ACT    1596Thr Arg Met Met Leu Arg Pro Met Gly Ala500                 505GATGCCGTAG GAGGATTCTC AACCCAGGTG ACTCTGTGCA CGCTGGGCCC TGCCCAGAAA     1656TCAGTGCCCA GGGCTCATCT TGACATTCTG GAACATCGGA ACCAGCTTAC CTTGCCCCTG     1716AATTACAAGA ATTCACCTGC CTCCCTGTTG CCCTCTAATT GTGAAATTGC TGGGTGCTTG     1776AAGGCACCTG CCTCTGTTGG AACCATACTC TTTCCCCCTC CTGCTGCATG CCCGGGAATC     1836CCTGCCATGA ACT                                                        1849(2)SEQ ID NO:10信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：509a.a.
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线型
(ⅱ)分子类型：蛋白质
(ⅴ)片段类型：内在
(ⅸ)特性：
  (A)名称/关键词：TIE配体-3
  (B)位置：1…509
  (D)其它信息：
(ⅹⅰ)序列表述：SEQ ID NO:10:Met Leu Cys Gln Pro Ala Met Leu Leu Asp Gly Leu Leu Leu Leu Ala1               5                  10                  15Thr Met Ala Ala Ala Gln His Arg Gly Pro Glu Ala Gly Gly His Arg
        20                  25                  30Gln Ile His Gln Val Arg Arg Gly Gln Cys Ser Tyr Thr Phe Val Val
    35                  40                  45Pro Glu Pro Asp Ile Cys Gln Leu Ala Pro Thr Ala Ala Pro Glu Ala
50                  55                  60Leu Gly Gly Ser Asn Ser Leu Gln Arg Asp Leu Pro Ala Ser Arg Leu65                  70                  75                  80His Leu Thr Asp Trp Arg Ala Gln Arg Ala Gln Arg Ala Gln Arg Val
            85                  90                  95Ser Gln Leu Glu Lys Ile Leu Glu Asn Asn Thr Gln Trp Leu Leu Lys
        100                 105                 110Leu Glu Gln Ser Ile Lys Val Asn Leu Arg Ser His Leu Val Gln Ala
    115                 120                 125Gln Gln Asp Thr Ile Gln Asn Gln Thr Thr Thr Met Leu Ala Leu Gly
130                 135                 140Ala Asn Leu Met Asn Gln Thr Lys Ala Gln Thr His Lys Leu Thr Ala145                 150                 155                 160Val Glu Ala Gln Val Leu Asn Gln Thr Leu His Met Lys Thr Gln Met
            165                 170                 175Leu Glu Asn Ser Leu Ser Thr Asn Lys Leu Glu Arg Gln Met Leu Met
        180                 185                 190Gln Ser Arg Glu Leu Gln Arg Leu Gln Gly Arg Asn Arg Ala Leu Glu
    195                 200                 205Thr Arg Leu Gln Ala Leu Glu Ala Gln His Gln Ala Gln Leu Asn Ser
210                 215                 220Leu Gln Glu Lys Arg Glu Gln Leu His Ser Leu Leu Gly His Gln Thr225                 230                 235                 240Gly Thr Leu Ala Asn Leu Lys His Asn Leu His Ala Leu Ser Ser Asn
            245                 250                 255Ser Ser Ser Leu Gln Gln Gln Gln Gln Gln Leu Thr Glu Phe Val Gln
        260                 265                270Arg Leu Val Arg Ile Val Ala Gln Asp Gln His Pro Val Ser Leu Lys
    275                 280                 285Thr Pro Lys Pro Val Phe Gln Asp Cys Ala Glu Ile Lys Arg Ser Gly
290                 295                 300Val Asn Thr Ser Gly Val Tyr Thr Ile Tyr Glu Thr Asn Met Thr Lys305                 310                 315                 320Pro Leu Lys Val Phe Cys Asp Met Glu Thr Asp Gly Gly Gly Trp Thr
            325                 330                 335Leu Ile Gln His Arg Glu Asp Gly Ser Val Asn Phe Gln Arg Thr Trp
        340                 345                 350Glu Glu Tyr Lys Glu Gly Phe Gly Asn Val Ala Arg Glu His Trp Leu
    355                 360                 365Gly Asn Glu Ala Val His Arg Leu Thr Ser Arg Thr Ala Tyr Leu Leu
370                 375                 380Arg Val Glu Leu His Asp Trp Glu Gly Arg Gln Thr Ser Ile Gln Tyr385                 390                 395                 400Glu Asn Phe Gln Leu Gly Ser Glu Arg Gln Arg Tyr Ser Leu Ser Val
            405                 410                 415Asn Asp Ser Ser Ser Ser Ala Gly Arg Lys Asn Ser Leu Ala Pro Gln
        420                 425                 430Gly Thr Lys Phe Ser Thr Lys Asp Met Asp Asn Asp Asn Cys Met Cys
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450                 455                 460Leu Ser Asn Leu Asn Gly Ile Tyr Tyr Ser Val His Gln His Leu His465                 470                 475                 480Lys Ile Asn Gly Ile Arg Trp His Tyr Phe Arg Gly Pro Ser Tyr Ser
            485                 490                 495Leu His Gly Thr Arg Met Met Leu Arg Pro Met Gly Ala
        500                 505(2)SEQ ID NO:11信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：503a.a.
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线型
(ⅱ)分子类型：蛋白质
(ⅸ)特性：
  (A)名称/关键词：mTL3
  (B)位置：1…503
  (D)其它信息：小鼠TIE配体-3(ⅹⅰ)序列表述：SEQ ID NO:11:Met Leu Leu Asp Gly Leu Leu Leu Leu Ala Thr Met Ala Ala Ala Gln1               5                  10                  15His Arg Gly Pro Glu Ala Gly Gly His Arg Gln Ile His Gln Val Arg
        20                  25                  30Arg Gly Gln Cys Ser Tyr Thr Phe Val Val Pro Glu Pro Asp Ile Cys
    35                  40                  45Gln Leu Ala Pro Thr Ala Ala Pro Glu Ala Leu Gly Gly Ser Asn Ser
50                  55                  60Leu Gln Arg Asp Leu Pro Ala Ser Arg Leu His Leu Thr Asp Trp Arg65                  70                  75                  80Ala Gln Arg Ala Gln Arg Ala Gln Arg Val Ser Gln Leu Glu Lys Ile
            85                  90                  95Leu Glu Asn Asn Thr Gln Trp Leu Leu Lys Leu Glu Gln Ser Ile Lys
       100                  105                 110Val Asn Leu Arg Ser His Leu Val Gln Ala Gln Gln Asp Thr Ile Gln
    115                 120                 125Asn Gln Thr Thr Thr Met Leu Ala Leu Gly Ala Asn Leu Met Asn Gln
130                 135                 140Thr Lys Ala Gln Thr His Lys Leu Thr Ala Val Glu Ala Gln Val Leu145                 150                 155                 160Asn Gln Thr Leu His Met Lys Thr Gln Met Leu Glu Asn Ser Leu Ser
            165                 170                 175Thr Asn Lys Leu Glu Arg Gln Met Leu Met Gln Ser Arg Glu Leu Gln
        180                 185                 190Arg Leu Gln Gly Arg Asn Arg Ala Leu Glu Thr Arg Leu Gln Ala Leu
    195                 200                 205Glu Ala Gln His Gln Ala Gln Leu Asn Ser Leu Gln Glu Lys Arg Glu
210                 215                 220Gln Leu His Ser Leu Leu Gly His Gln Thr Gly Thr Leu Ala Asn Leu225                 230                 235                 240Lys His Asn Leu His Ala Leu Ser Ser Asn Ser Ser Ser Leu Gln Gln
            245                 250                 255Gln Gln Gln Gln Leu Thr Glu Phe Val Gln Arg Leu Val Arg Ile Val
        260                 265                 270Ala Gln Asp Gln His Pro Val Ser Leu Lys Thr Pro Lys Pro Val Phe
    275                 280                 285Gln Asp Cys Ala Glu Ile Lys Arg Ser Gly Val Asn Thr Ser Gly Val
290                 295                 300Tyr Thr Ile Tyr Glu Thr Asn Met Thr Lys Pro Leu Lys Val Phe Cys305                 310                 315                 320Asp Met Glu Thr Asp Gly Gly Gly Trp Thr Leu Ile Gln His Arg Glu
            325                 330                 335Asp Gly Ser Val Asn Phe Gln Arg Thr Trp Glu Glu Tyr Lys Glu Gly
        340                 345                 350Phe Gly Asn Val Ala Arg Glu His Trp Leu Gly Asn Glu Ala Val His
    355                 360                 365Arg Leu Thr Ser Arg Thr Ala Tyr Leu Leu Arg Val Glu Leu His Asp
370                 375                 380Trp Glu Gly Arg Gln Thr Ser Ile Gln Tyr Glu Asn Phe Gln Leu Gly385                 390                 395                 400Ser Glu Arg Gln Arg Tyr Ser Leu Ser Val Asn Asp Ser Ser Ser Ser
            405                 410                 415Ala Gly Arg Lys Asn Ser Leu Ala Pro Gln Gly Thr Lys Phe Ser Thr
        420                 425                 430Lys Asp Met Asp Asn Asp Asn Cys Met Cys Lys Cys Ala Gln Met Leu
    435                 440                 445Ser Gly Gly Trp Trp Phe Asp Ala Cys Gly Leu Ser Asn Leu Asn Gly
450                 455                 460Ile Tyr Tyr Ser Val His Gln His Leu His Lys Ile Asn Gly Ile Arg465                 470                 475                 480Trp His Tyr Phe Arg Gly Pro Ser Tyr Ser Ile His Gly Thr Arg Met
            485                 490                 495Met Leu Arg Pro Met Gly Ala
        500(2)SEQ ID NO:12信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：490a.a.
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线型
(ⅱ)分子类型：蛋白质
(ⅸ)特性：
  (A)名称/关键词：hTL1
  (B)位置：1…490
  (D)其它信息：人TIE-2配体1
(ⅹⅰ)序列表述：SEQ ID NO:12:Ala Phe Leu Ala Ala Ile Leu Thr His Ile Gly Cys Ser Asn Gln Arg1               5                  10                  15Arg Ser Pro Glu Asn Ser Gly Arg Arg Tyr Asn Arg Ile Gln His Gly
        20                  25                  30Gln Cys Ala Tyr Thr Phe Ile Leu Pro Glu His Asp Gly Asn Cys Arg
    35                  40                  45Glu Ser Thr Thr Asp Gln Tyr Asn Thr Asn Ala Leu Gln Arg Asp Ala
50                  55                  60Pro His Val Glu Pro Asp Phe Ser Ser Gln Lys Leu Gln His Leu Glu65                  70                  75                  80His Val Met Glu Asn Tyr Thr Gln Trp Leu Gln Lys Leu Glu Asn Tyr
            85                  90                  95Ile Val Glu Asn Met Lys Ser Glu Met Ala Gln Ile Gln Gln Asn Ala
       100                  105                 110Val Gln Asn His Thr Ala Thr Met Leu Glu Ile Gly Thr Ser Leu Leu
   115                  120                 125Ser Gln Thr Ala Glu Gln Thr Arg Lys Leu Thr Asp Val Glu Thr Gln
130                 135                 140Val Leu Asn Gln Thr Ser Arg Leu Glu Ile Gln Leu Leu Glu Asn Ser145                 150                 155                 160Leu Ser Tnr Tyr Lys Leu Glu Lys Gln Leu Leu Gln Gln Thr Asn Glu
            165                 170                 175Ile Leu Lys Ile His Glu Lys Asn Ser Leu Leu Glu His Lys Ile Leu
        180                 185                190Glu Met Glu Gly Lys His Lys Glu Glu Leu Asp Thr Leu Lys Glu Glu
    195                 200                 205Lys Glu Asn Leu Gln Gly Leu Val Thr Arg Gln Thr Tyr Ile Ile Gln
210                 215                 220Glu Leu Glu Lys Gln Leu Asn Arg Ala Thr Thr Asn Asn Ser Val Leu225                 230                 235                 240Gln Lys Gln Gln Leu Glu Leu Met Asp Thr Val His Asn Leu Val Asn
            245                 250                 255Leu Cys Thr Lys Glu Val Leu Leu Lys Gly Gly Lys Arg Glu Glu Glu
        260                 265                 270Lys Pro Phe Arg Asp Cys Ala Asp Val Tyr Gln Ala Gly Phe Asn Lys
    275                 280                 285Ser Gly Ile Tyr Thr Ile Tyr Ile Asn Asn Met Pro Glu Pro Lys Lys
290                 295                 300Val Phe Cys Asn Met Asp Val Asn Gly Gly Gly Trp Thr Val Ile Gln305                 310                 315                 320His Arg Glu Asp Gly Ser Leu Asp Phe Gln Arg Gly Trp Lys Glu Tyr
            325                 330                 335Lys Met Gly Phe Gly Asn Pro Ser Gly Glu Tyr Trp Leu Gly Asn Glu
        340                 345                 350Phe Ile Phe Ala Ile Thr Ser Gln Arg Gln Tyr Met Leu Arg Ile Glu
    355                 360                 365Leu Met Asp Trp Glu Gly Asn Arg Ala Tyr Ser Gln Tyr Asp Arg Phe
370                 375                 380His Ile Gly Asn GLu Lys Gln Asn Tyr Arg Leu Tyr Leu Lys Gly His385                 390                 395                 400Thr Gly Thr Ala Gly Lys Gln Ser Ser Leu Ile Leu His Gly Ala Asp
           405                  410                 415Phe Ser Thr Lys Asp Ala Asp Asn Asp Asn Cys Met cys Lys Cys Ala
       420                  425                430Leu Met Leu Thr Gly Gly Trp Trp Phe Asp Ala Cys Gly Pro Ser Asn
    435                 440                 445Leu Asn Gly Met Phe Tyr Thr Ala Gly Gln Asn His Gly Lys Leu Asn
450                 455                 460Gly Ile Lys Trp His Tyr Phe Lys Gly Pro Ser Tyr Ser Ile Arg Ser465                 470                 475                 480Thr Thr Met Met Ile Arg Pro Leu Asp Phe
            485                 490(2)SEQ ID NO:13信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：491a.a.
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线型
(ⅱ)分子类型：蛋白质
(ⅸ)特性：
  (A)名称/关键词：chTL1
  (B)位置：1…491
  (D)其它信息：鸡TIE-2配体1
(ⅹⅰ)序列表述：SEQ ID NO:13:Ala Phe Leu Ala Ala Ile Leu Ala His Ile Gly Cys Thr Thr Gln Argl               5                  10                  15Arg Ser Pro Glu Asn Ser Gly Arg Arg Phe Asn Arg Ile Gln His Gly
        20                  25                  30Gln Cys Thr Tyr Thr Phe Ile Leu Pro Glu Gln Asp Gly Asn Cys Arg
    35                  40                  45Glu Ser Thr Thr Asp Gln Tyr Asn Thr Asn Ala Leu Gln Arg Asp Ala
50                  55                  60Pro His Val Glu Gln Asp Phe Ser Phe Gln Lys Leu Gln His Leu Glu65                  70                  75                  80His Val Met Glu Asn Tyr Thr Gln Trp Leu Gln Lys Leu Glu Ser Tyr
            85                  90                  95Ile Val Glu Asn Met Lys Ser Glu Met Ala Gln Leu Gln Gln Asn Ala
        100                 105                 110Val Gln Asn His Thr Ala Thr Met Leu Glu Ile Gly Thr Ser Leu Leu
    115                 120                 125Ser Gln Thr Ala Glu Gln Thr Arg Lys Leu Thr Asp Val Glu Thr Gln
130                 135                 140Val Leu Asn Gln Thr Ser Arg Leu Glu Ile Gln Leu Leu Glu Asn Ser145                 150                 155                 160Leu Ser Thr Tyr Lys Leu Glu Lys Gln Leu Leu Gln Gln Thr Asn Glu
            165                 170                 175Ile Leu Lys Ile His Glu Lys Asn Ser Leu Leu Glu His Lys Ile Leu
        180                 185                 190Glu Met Glu Glu Arg His Lys Glu Glu Met Asp Thr Leu Lys Glu Glu
    195                 200                 205Lys Glu Asn Leu Gln Gly Leu Val Thr Arg Gln Ser Tyr Ile Ile Gln
210                 215                 220Glu Leu Glu Lys Gln Leu Asn Lys Ala Thr Thr Asn Asn Ser Val Leu225                 230                 235                 240Gln Lys Gln Gln Leu Glu Leu Met Asp Thr Val His Thr Leu Ile Thr
            245                 250                 255Leu Cys Ser Lys Glu Gly Val Leu Leu Lys Asn Ala Lys Arg Glu Glu
        260                 265                 270Glu Lys Pro Phe Arg Asp Cys Ala Asp Val Tyr Gln Ala Gly Phe Asn
    275                 280                 285Lys Ser Gly Ile Tyr Thr Ile Tyr Ile Asn Asn Val Ser Asp Pro Lys
290                 295                 300Lys Val Phe Cys Asn Met Asp Val Asn Gly Gly Gly Trp Thr Val Ile305                 310                 315                 320Gln His Arg Glu Asp Gly Ser Leu Asp Phe Gln Lys Gly Trp Lys Glu
            325                 330                 335Tyr Lys Met Gly Phe Gly Ser Pro Ser Gly Glu Tyr Trp Leu Gly Asn
       340                  345                 350Glu Phe Ile Phe Ala Ile Thr Ser Gln Arg Gln Tyr Ser Leu Arg Ile
    355                 360                 365Glu Leu Met Asp Trp Glu Gly Asn Arg Ala Tyr Ser Gln Tyr Asp Arg
370                 375                 380Phe His Ile Gly Asn Glu Lys Gln Asn Tyr Arg Leu Tyr Leu Lys Gly385                 390                 395                 400His Ser Gly Thr Ala Gly Lys Gln Ser Ser Leu Ile Leu His Gly Ala
            405                 410                 415Glu Phe Ser Thr Lys Asp Ala Asp Asn Asp Asn Cys Met Cys Lys Cys
        420                 425                 430Ala Leu Met Leu Thr Gly Gly Trp Trp Phe Asp Ala Cys Gly Pro Ser
    435                 440                 445Asn Leu Asn Gly Met Phe Tyr Thr Ala Gly Gln Asn His Gly Lys Leu
450                 455                 460Asn Gly Ile Lys Trp His Tyr Phe Lys Gly Pro Arg Tyr Ser Ile Arg465                 470                 475                 480Ser Thr Thr Met Met Ile Arg Pro Leu Asp Phe
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(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：497a.a.
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  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线型
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(ⅸ)特性：
  (A)名称/关键词：mTL1
  (B)位置：1…497
  (D)其它信息：小鼠TIE-2配体1
(ⅹⅰ)序列表述：SEQ ID NO:14:Met Thr Val Phe Leu Ser Phe Ala Phe Phe Ala Ala Ile Leu Thr His1               5                  10                  15Ile Gly Cys Ser Asn Gln Arg Arg Asn Pro Glu Asn Ser Gly Arg Arg
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130                 135                 140Leu Thr Asp Val Glu Thr Gln Val Leu Asn Gln Thr Ser Arg Leu Glu145                 150                 155                 160Ile Gln Leu Leu Glu Asn Ser Leu Ser Thr Tyr Lys Leu Glu Lys Gln
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450                 455                 460Gln Asn His Gly Lys Leu Asn Gly Ile Lys Trp His Tyr Phe Lys Gly465                 470                 475                 480Pro Arg Tyr Ser Ile Arg Ser Thr Thr Met Met Ile Arg Pro Leu Asp
            485                 490                 495Phe(2)SEQ ID NO:15信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：496a.a.
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线型
(ⅱ)分子类型：蛋白质
(ⅸ)特性：
  (A)名称/关键词：mTL2
  (B)位置：1…496
  (D)其它信息：小鼠TIE-2配体2(ⅹⅰ)序列表述：SEQ ID NO:15:Met Trp Gln Ile Ile Phe Leu Thr Phe Gly Trp Asp Ala Val Leu Thr1               5                  10                  15Ser Ala Tyr Ser Asn Phe Arg Lys Ser Val Asp Ser Thr Gly Arg Arg
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50                  55                  60Val Gln Arg Asp Ala Pro Pro Asp Tyr Glu Asp Ser Val Gln Ser Leu65                  70                  75                  80Gln Leu Leu Glu Asn Val Met Glu Asn Tyr Thr Gln Trp Leu Met Lys
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130                 135                 140Val Glu Thr Gln Val Leu Ash Gln Thr Thr Arg Leu Glu Leu Gln Leu145                 150                 155                 160Leu Gln His Ser Ile Ser Thr Tyr Lys Leu Glu Lys Gln Ile Leu Asp
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    195                 200                 205Met Lys Glu Gln Lys Asp Glu Leu Gln Val Leu Val Ser Lys Gln Ser
210                 215                 220Ser Val Ile Asp Glu Leu Glu Lys Lys Leu Val Thr Ala Thr Val Asn225                 230                 235                 240Asn Ser Leu Leu Gln Lys Gln Gln His Asp Leu Met Asp Thr Val Asn
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            325                 330                 335Lys Gly Trp Lys Glu Tyr Lys Met Gly Phe Gly Asn Pro Leu Gly Glu
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370                 375                 380Ser Leu Tyr Asp His Phe Tyr Ile Ala Gly Glu Glu Ser Asn Tyr Arg385                 390                 395                 400Ile His Leu Thr Gly Leu Thr Gly Thr Ala Ala Lys Ile Ser Ser Ile
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           485                  490                 495(2)SEQ ID NO:16信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：496a.a.
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线型
(ⅱ)分子类型：蛋白质
(ⅸ)特性：
  (A)名称/关键词：hTL2
  (B)位置：1…496
  (D)其它信息：人TIE-2配体2
(ⅹⅰ)序列表述：SEQ ID NO:16:Met Trp Gln Ile Val Phe Phe Thr Leu Ser Cys Asp Ala Val Leu Thr1               5                  10                  15Ala Ala Tyr Asn Asn Phe Arg Lys Ser Met Asp Ser Ile Gly Lys Lys
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            85                  90                  95Leu Glu Asn Tyr Ile Gln Asp Asn Met Lys Lys Glu Met Ala Glu Ile
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    115                 120                 125Thr Ser Leu Leu Ser Gln Thr Ala Glu Gln Thr Arg Lys Leu Thr Asp
130                 135                 140Val Glu Thr Gln Val Leu Asn Gln Thr Thr Arg Leu Glu Leu Gln Leu145                 150                 155                 l60Leu Gln His Ser Ile Ser Thr Tyr Lys Leu Glu Lys Gln Ile Leu Asp
            165                 170                 175Gln Thr Ser Glu Ile Asn Lys Ile His Asp Lys Asn Ser Phe Leu Glu
        180                 185                 190Lys Lys Val Leu Asp Met Glu Asp Lys His Ile Ile Glu Met Gln Thr
    195                 200                 205Ile Lys Glu Glu Lys Asp Glu Leu Gln Val Leu Val Ser Lys Gln Asn
210                 215                 220Ser Ile Ile Glu Glu Leu Glu Lys Lys Ile Val Thr Ala Thr Val Asn225                 230                 235                 240Asn Ser Val Leu Gln Lys Gln Gln His Asp Leu Met Asp Thr Val Asn
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        340                 345                 350Tyr Trp Leu Gly Aan Glu Phe Ile Ser Gln Ile Thr Asn Gln Gln Arg
    355                 360                 365Tyr Val Leu Lys Ile His Leu Lys Asp Trp Glu Gly Asn Glu Ala Tyr
370                 375                 380Ser Leu Tyr Asp His Phe Tyr Ile Ser Gly Glu Glu Leu Asn Tyr Arg385                 390                 395                 400Ile His Leu Lys Gly Leu Thr Gly Thr Ala Ala Lys Ile Ser Ser Ile
            405                 410                 415Ser Gln Pro Gly Asn Asp Phe Ser Thr Lys Asp Gly Asp Asn Asp Lys
        420                 425                 430Cys Ile Cys Lys Cys Ser Leu Met Leu Thr Gly Gly Trp Trp Phe Asp
    435                 440                 445Ala Cys Gly Pro Ser Asn Leu Asn Gly Met Phe Tyr Pro Gln Arg Gln
450                 455                 460Asn Thr Asn Lys Phe Asn Gly Ile Lys Trp Tyr Tyr Trp Lys Gly Ser465                 470                 475                 480Gly Tyr Ser Ile Lys Ala Thr Thr Met Met Ile Arg Pro Ala Asp Phe
            485                 490                 495(2)SEQ ID NO:17信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：1512bp
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线型
(ⅱ)分子类型：DNA
(ⅸ)特性：
  (A)名称/关键词：编码序列
  (B)位置：1…1509
  (D)其它信息：
  (A)名称/关键词：TIE配体-4
  (B)位置：1…1512
  (D)其它信息：
(ⅹⅰ)序列表述：SEQ ID NO:17:ATG CTC TCC CAG CTA GCC ATG CTG CAG GGC AGC CTC CTC CTT GTG GTT        48Met Leu Ser Gln Leu Ala Met Leu Gln Gly Ser Leu Leu Leu Val Val1               5                  10                  15GCC ACC ATG TCT GTG GCT CAA CAG ACA AGG CAG GAG GCG GAT AGG GGC         96Ala Thr Met Ser Val Ala Gln Gln Thr Arg Gln Glu Ala Asp Arg Gly
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50                  55                  60TCC AAC ACC CTC CAG AGA GAA TCA CTG GCC AAC CCA CTG CAC CTG GGG       240Ser Asn Thr Leu Gln Arg Glu Ser Leu Ala Asn Pro Leu His Leu Gly65                  70                  75                  80AAG TTG CCC ACC CAG CAG GTG AAA CAG CTG GAG CAG GCA CTG CAG AAC       288Lys Leu Pro Thr Gln Gln Val Lys Gln Leu Glu Gln Ala Leu Gln Asn
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    115                 120                 125GCC CCC ATG CTA GAG CTG GGC ACC AGC CTC CTG AAC CAG ACC ACT GCC       432Ala Pro Met Leu Glu Leu Gly Thr Ser Leu Leu Asn Gln Thr Thr Ala
130                 135                 140CAG ATC CGC AAG CTG ACC GAC ATG GAG GCT CAG CTC CTG AAC CAG ACA       480Gln Ile Arg Lys Leu Thr Asp Met Glu Ala Gln Leu Leu Asn Gln Thr145                 150                 155                 160TCA AGA ATG GAT GCC CAG ATG CCA GAG ACC TTT CTG TCC ACC AAC AAG       528Ser Arg Met Asp Ala Gln Met Pro Glu Thr Phe Leu Ser Thr Asn Lys
            165                 170                 175CTG GAG AAC CAG CTG CTG CTA CAG AGG CAG AAG CTC CAG CAG CTT CAG       576Leu Glu Asn Gln Leu Leu Leu Gln Arg Gln Lys Leu Gln Gln Leu Gln
        180                 185                 190GGC CAA AAC AGC GCG CTC GAG AAG CGG TTG CAG GCC CTG GAG ACC AAG       624Gly Gln Asn Ser Ala Leu Glu Lys Arg Leu Gln Ala Leu Glu Thr Lys
    l95                 200                 205CAG CAG GAG GAG CTG GCC AGC ATC CTC AGC AAG AAG GCG AAG CTG CTG       672Gln Gln Glu Glu Leu Ala Ser Ile Leu Ser Lys Lys Ala Lys Leu Leu
210                 215                 220AAC ACG CTG AGC CGC CAG AGC GCC GCC CTC ACC AAC ATC GAG CGC GGC       720Asn Thr Leu Ser Arg Gln Ser Ala Ala Leu Thr Asn Ile Glu Arg Gly225                 230                 235                 240CTG CGC GGT GTC AGG CAC AAC TCC AGC CTC CTG CAG GAC CAG CAG CAC        768Leu Arg Gly Val Arg His Asn Ser Ser Leu Leu Gln Asp Gln Gln His
            245                 250                 255AGC CTG CGC CAG CTG CTG GTG TTG TTG CGG CAC CTG GTG CAA GAA AGG        816Ser Leu Arg Gln Leu Leu Val Leu Leu Arg His Leu Val Gln Glu Arg
        260                 265                 270GCT AAC GCC TCG GCC CCG GCC TTC ATA ATG GCA GGT GAG CAG GTG TTC        864Ala Asn Ala Ser Ala Pro Ala Phe Ile Met Ala Gly Glu Gln Val Phe
    275                 280                 285CAG GAC TGT GCA GAG ATC CAG CGC TCT GGG GCC AGT GCC AGT GGT GTC       912Gln Asp Cys Ala Glu Ile Gln Arg Ser Gly Ala Ser Ala Ser Gly Val
290                 295                 300TAC ACC ATC CAG GTG TCC AAT GCA ACG AAG CCC AGG AAG GTG TTC TGT        960Tyr Thr Ile Gln Val Ser Asn Ala Thr Lys Pro Arg Lys Val Phe Cys305                 310                 315                 320GAC CTG CAG AGC AGT GGA GGC AGG TGG ACC CTC ATC CAG CGC CGT GAG       1008Asp Leu Gln Ser Ser Gly Gly Arg Trp Thr Leu Ile Gln Arg Arg Glu
            325                 230                 335AAT GGC ACC GTG AAT TTT CAG CGG AAC TGG AAG GAT TAC AAA CAG GGC       1056Asn Gly Thr Val Asn Phe Gln Arg Asn Trp Lys Asp Tyr Lys Gln Gly
        340                 345                 350TTC GGA GAC CCA GCT GGG GAG CAC TGG CTG GGC AAT GAA GTG GTG CAC       1104Phe Gly Asp Pro Ala Gly Glu Mis Trp Leu Gly Asn Glu Val Val His
    355                 360                 365CAG CTC ACC AGA AGG GCA GCC TAC TCT CTG CGT GTG GAG CTG CAA GAC       1152Gln Leu Thr Arg Arg Ala Ala Tyr Ser Leu Arg Val Glu Leu Gln Asp
370                 375                 380TGG GAA GGC CAC GAG GCC TAT GCC CAG TAC GAA CAT TTC CAC CTG GGC       1200Trp Glu Gly His Glu Ala Tyr Ala Gln Tyr Glu His Phe His Leu Gly385                 390                 395                 400AGT GAG AAC CAG CTA TAC AGG CTT TCT GTG GTC GGG TAC AGC GGC TCA       1248Ser Glu Asn Gln Leu Tyr Arg Leu Ser Val Val Gly Tyr Ser Gly Ser
            405                 410                     415GCA GGG CGC CAG AGC AGC CTG GTC CTG CAG AAC ACC AGC TTT AGC ACC       1296Ala Gly Arg Gln Ser Ser Leu Val Leu Gln Asn Thr Ser Phe Ser Thr
        420                 425                     430CTT GAC TCA GAC AAC GAC CAC TGT CTC TGC AAG TGT GCC CAG GTG ATG       1344Leu Asp Ser Asp Asn Asp His Cys Leu Cys Lys Cys Ala Gln Val Met
    435                 440                 445TCT GGA GGG TGG TGG TTT GAC GCC TGT GGC CTG TCA AAC CTC AAC GGC       1392Ser Gly Gly Trp Trp Phe Asp Ala Cys Gly Leu Ser Asn Leu Asn Gly
450                 455                 460GTC TAC TAC CAC GCT CCC GAC AAC AAG TAC AAG ATG GAC GGC ATC CGC       1440Val Tyr Tyr His Ala Pro Asp Asn Lys Tyr Lys Met Asp Gly Ile Arg465                 470                 475                 480TGG CAC TAC TTC AAG GGC CCC AGC TAC TCA CTG CGT GCC TCT CGC ATG       1488Trp His Tyr Phe Lys Gly Pro Ser Tyr Ser Leu Arg Ala Ser Arg Met
            485                 490                 495ATG ATA CGG CCT TTG GAC ATC TAA                                       1512Met Ile Arg Pro Leu Asp Ile
        500(2)SEQ ID NO:18信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：503a.a.
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线型
(ⅱ)分子类型：蛋白质
(ⅴ)片段类型：内在
(ⅸ)特性：
  (A)名称/关键词：TIE配体-4
  (B)位置：1…503
  (D)其它信息：
(ⅹⅰ)序列表述：SEQ ID NO:18:Met Leu Ser Gln Leu Ala Met Leu Gln Gly Ser Leu Leu Leu Val Val1               5                  10                  15Ala Thr Met Ser Val Ala Gln Gln Thr Arg Gln Glu Ala Asp Arg Gly
        20                  25                  30Cys Glu Thr Leu Val Val Gln His Gly His Cys Ser Tyr Thr Phe Leu
    35                  40                  45Leu Pro Lys Ser Glu Pro Cys Pro Pro Gly Pro Glu Val Ser Arg Asp
50                  55                  60Ser Asn Thr Leu Gln Arg Glu Ser Leu Ala Asn Pro Leu His Leu Gly65                  70                  75                  80Lys Leu Pro Thr Gln Gln Val Lys Gln Leu Glu Gln Ala Leu Gln Asn
            85                  90                  95Asn Thr Gln Trp Leu Lys Lys Leu Glu Arg Ala Ile Lys Thr Ile Leu
        100                 105                 110Arg Ser Lys Leu Glu Gln Val Gln Gln Gln Met ALa Gln Asn Gln Thr
    115                 120                 125Ala Pro Met Leu Glu Leu Gly Thr Ser Leu Leu Asn Gln Thr Thr Ala
130                 135                 140Gln Ile Arg Lys Leu Thr Asp Met Glu Ala Gln Leu Leu Asn Gln Thr145                 150                 155                 160Ser Arg Met Asp Ala Gln Met Pro Glu Thr Phe Leu Ser Thr Asn Lys
            165                 170                 175Leu Glu Asn Gln Leu Leu Leu Gln Arg Gln Lys Leu Gln Gln Leu Gln
        180                 185                 190Gly Gln Asn Ser Ala Leu Glu Lys Arg Leu Gln Ala Leu Glu Thr Lys
    195                 200                 205Gln Gln Glu Glu Leu Ala Ser Ile Leu Ser Lys Lys Ala Lys Leu Leu
210                 215                 220Asn Thr Leu Ser Arg Gln Ser Ala Ala Leu Thr Asn Ile Glu Arg Gly225                 215                 235                 240Leu Arg Gly Val Arg His Asn Ser Ser Leu Leu Gln Asp Gln Gln His
            245                 250                 255Ser Leu Arg Gln Leu Leu Val Leu Leu Arg His Leu Val Gln Glu Arg
        260                 265                 270Ala Asn Ala Ser Ala Pro Ala Phe Ile Met Ala Gly Glu Gln Val Phe
    275                 280                 285Gln Asp Cys Ala Glu Ile Gln Arg Ser Gly Ala Ser Ala Ser Gly Val
290                 295                 300Tyr Thr Ile Gln Val Ser Asn Ala Thr Lys Pro Arg Lys Val Phe Cys305                 310                 315                 320Asp Leu Gln Ser Ser Gly Gly Arg Trp Thr Leu Ile Gln Arg Arg Glu
            325                 330                 335Asn Gly Thr Val Asn Phe Gln Arg Asn Trp Lys Asp Tyr Lys Gln Gly
        340                 345                 350Phe Gly Asp Pro Ala Gly Glu His Trp Leu Gly Asn Glu Val Val His
    355                 360                 365Gln Leu Thr Arg Arg Ala Ala Tyr Ser Leu Arg Val Glu Leu Gln Asp
370                 375                 380Trp Glu Gly His Glu Ala Tyr Ala Gln Tyr Glu His Phe His Leu Gly385                 390                 395                 400Ser Glu Asn Gln Leu Tyr Arg Leu Ser Val Val Gly Tyr Ser Gly Ser
            405                 410                 415Ala Gly Arg Gln Ser Ser Leu Val Leu Gln Asn Thr Ser Phe Ser Thr
        420                 425                 430Leu Asp Ser Asp Asn Asp His Cys Leu Cys Lys Cys Ala Gln Val Met
    435                 440                 445Ser Gly Gly Trp Trp Phe Asp Ala Cys Gly Leu Ser Asn Leu Asn Gly
450                 455                 460Val Tyr Tyr His Ala Pro Asp Asn Lys Tyr Lys Met Asp Gly Ile Arg465                 470                 475                 480Trp His Tyr Phe Lys Gly Pro Ser Tyr Ser Leu Arg Ala Ser Arg Met
            485                 490                 495Met Ile Arg Pro Leu Asp Ile
        500(2)SEQ ID NO:19信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：1497bp
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线型
(ⅱ)分子类型：DNA
(ⅸ)特性：
  (A)名称/关键词：编码序列
  (B)位置：1…1494
  (D)其它信息：
  (A)名称/关键词：(嵌合体1)
  (B)位置：1…1497
  (D)其它信息：
  (A)名称/关键词：其它
  (B)位置：1…60
  (D)其它信息：推测的先导序列由核苷酸1-60编码
(ⅹⅰ)序列表述：SEQ ID NO:19:ATG ACA GTT TTC CTT TCC TTT GCT TTC CTC GCT GCC ATT GTG ACT CAC       48Met Thr Val Phe Leu Ser Phe Ala Phe Leu Ala Ala Ile Leu Thr His1               5                  10                   15ATA GGG TGC AGC AAT CAG CGC CGA AGT CCA GAA AAC AGT GGG AGA AGA        96Ile Gly Cys Ser Asn Gln Arg Arg Ser Pro Glu Asn Ser Gly Arg Arg
        20                  25                  30TAT AAC CGG ATT CAA CAT GGG CAA TGT GCC TAC ACT TTC ATT CTT CCA       144Tyr Asn Arg Ile Gln His Gly Gln Cys Ala Tyr Thr Phe Ile Leu Pro
    35                  40                  45GAA CAC GAT GGC AAC TGT CGT GAG AGT ACG ACA GAC CAG TAC AAC ACA       192Glu His Asp Gly Asn Cys Arg Glu Ser Thr Thr Asp Gln Tyr Asn Thr
50                  55                  60AAC GCT CTG CAG AGA GAT GCT CCA CAC GTG GAA CCG GAT TTC TCT TCC        240Asn Ala Leu Gln Arg Asp Ala Pro His Val Glu Pro Asp Phe Ser Ser65                  70                  75                  80CAG AAA CTT CAA CAT CTG GAA CAT GTG ATG GAA AAT TAT ACT CAG TGG        288Gln Lys Leu Gln His Leu Glu His Val Met Glu Asn Tyr Thr Gln Trp
            85                  90                  95CTG CAA AAA CTT GAG AAT TAC ATT GTG GAA AAC ATG AAG TCG GAG ATG        336Leu Gln Lys Leu Glu Asn Tyr Ile Val Glu Asn Met Lys Ser Glu Met
        100                 105                 110GCC CAG ATA CAG CAG AAT GCA GTT CAG AAC CAC ACG GCT ACC ATG CTG        384Ala Gln Ile Gln Gln Asn Ala Val Gln Asn His Thr Ala Thr Met Leu
    115                 120                 125GAG ATA GGA ACC AGC CTC CTC TCT CAG ACT GCA GAG CAG ACC AGA AAG        432GLu Ile Gly Thr Ser Leu Leu Ser Gln Thr Ala Glu Gln Thr Arg Lys
130                 135                 140CTG ACA GAT GTT GAG ACC CAG GTA CTA AAT CAA ACT TCT CGA CTT GAG        480Leu Thr Asp Val Glu Thr Gln Val Leu Asn Gln Thr Ser Arg Leu Glu145                 150                 155                 160ATA CAG CTG CTG GAG AAT TCA TTA TCC ACC TAC AAG CTA GAG AAG CAA        528Ile Gln Leu Leu Glu Asn Ser Leu Ser Thr Tyr Lys Leu Glu Lys Gln
            165                 170                 175CTT CTT CAA CAG ACA AAT GAA ATC TTG AAG ATC CAT GAA AAA AAC AGT        576Leu Leu Gln Gln Thr Asn Glu Ile Leu Lys Ile His Glu Lys Asn Ser
        180                 185                 190TTA TTA GAA CAT AAA ATC TTA GAA ATG GAA GGA AAA CAC AAG GAA GAG        624Leu Leu Glu His Lys Ile Leu Glu Met Glu Gly Lys His Lys Glu Glu
    195                 200                 205TTG GAC ACC TTA AAG GAA GAG AAA GAG AAC CTT CAA GGC TTG GTT ACT        672Leu Asp Thr Leu Lys Glu Glu Lys Glu Asn Leu Gln Gly Leu Val Thr
210                 215                 220CGT CAA ACA TAT ATA ATC CAG GAG CTG GAA AAG CAA TTA AAC AGA GCT        720Arg Gln Thr Tyr Ile Ile Gln Glu Leu Glu Lys Gln Leu Asn Arg Ala225                 230                 235                 240ACC ACC AAC AAC AGT GTC CTT CAG AAG CAG CAA CTG GAG CTG ATG GAC        768Thr Thr Asn Asn Ser Val Leu Gln Lys Gln Gln Leu Glu Leu Met Asp
            245                 250                 255ACA GTC CAC AAC CTT GTC AAT CTT TGC ACT AAA GAA GGT GTT TTA CTA        816Thr Val His Asn Leu Val Asn Leu Cys Thr Lys Glu Gly Val Leu Leu
        260                 265                 270AAG GGA GGA AAA AGA GAG GAA GAG AAA CCA TTT AGA GAC TGT GCT GAA       864Lys Gly Gly Lys Arg Glu Glu Glu Lys Pro Phe Arg Asp Cys Ala Glu
    275                 280                 285GTA TTC AAA TCA GGA CAC ACC ACA AAT GGC ATC TAC ACG TTA ACA TTC       912Val Phe Lys Ser Gly His Thr Thr Asn Gly Ile Tyr Thr Leu Thr Phe
290                 295                 300CCT AAT TCT ACA GAA GAG ATC AAG GCC TAC TGT GAC ATG GAA GCT GGA       960Pro Asn Ser Thr Glu Glu Ile Lys Ala Tyr Cys Asp Met Glu Ala Gly305                 310                 315                 320GGA GGC GGG TGG ACA ATT ATT CAG CGA CGT GAG GAT GGC AGC GTT GAT      1008Gly Gly Gly Trp Thr Ile Ile Gln Arg Arg Glu Asp Gly Ser Val Asp
            325                 330                 335TTT CAG AGG ACT TGG AAA GAA TAT AAA GTG GGA TTT GGT AAC CCT TCA      1056Phe Gln Arg Thr Trp Lys Glu Tyr Lys Val Gly Phe Gly Asn Pro Ser
        340                345                  350GGA GAA TAT TGG CTG GGA AAT GAG TTT GTT TCG CAA CTG ACT AAT CAG      1104Gly Glu Tyr Trp Leu Gly Asn Glu Phe Val Ser Gln Leu Thr Asn Gln
    355                 360                 365CAA CGC TAT GTG CTT AAA ATA CAC CTT AAA GAC TGG GAA GGG AAT GAG      1152Gln Arg Tyr Val Leu Lys Ile His Leu Lys Asp Trp Glu Gly Asn Glu
370                 375                 380GCT TAC TCA TTG TAT GAA CAT TTC TAT CTC TCA AGT GAA GAA CTC AAT      1200Ala Tyr Ser Leu Tyr Glu His Phe Tyr Leu Ser Ser Glu Glu Leu Asn385                 390                 395                 400TAT AGG ATT CAC CTT AAA GGA CTT ACA GGG ACA GCC GGC AAA ATA AGC      1248Tyr Arg Ile His Leu Lys Gly Leu Thr Gly Thr Ala Gly Lys Ile Ser
            405                 410                 415AGC ATC AGC CAA CCA GGA AAT GAT TTT AGC ACA AAG GAT GGA GAC AAC      1296Ser Ile Ser Gln Pro Gly Asn Asp Phe Ser Thr Lys Asp Gly Asp Asn
        420                 425                 430GAC AAA TGT ATT TGC AAA TGT TCA CAA ATG CTA ACA GGA GGC TGG TGG      1344Asp Lys Cys Ile Cys Lys Cys Ser Gln Met Leu Thr Gly Gly Trp Trp
    435                 440                 445TTT GAT GCA TGT GGT CCT TCC AAC TTG AAC GGA ATG TAC TAT CCA CAG      1392Phe Asp Ala Cys Gly Pro Ser Asn Leu Asn Gly Met Tyr Tyr Pro Gln
450                 455                 460AGG CAG AAC ACA AAT AAG TTC AAC GGC ATT AAA TGG TAC TAC TGG AAA      1440Arg Gln Asn Thr Asn Lys Phe Asn Gly Ile Lys Trp Tyr Tyr Trp Lys465                 470                 475                 480GGC TCA GGC TAT TCG CTC AAG GCC ACA ACC ATG ATG ATC CGA CCA GCA      1488Gly Ser Gly Tyr Ser Leu Lys Ala Thr Thr Met Met Ile Arg Pro Ala
            485                 490                 495GAT TTC TAA                                                          1497Asp Phe(2)SEQ ID NO:20信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：498a.a.
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线型
(ⅱ)分子类型：蛋白质
(ⅴ)片段类型：内在
(ⅸ)特性：
  (A)名称/关键词：1N1C2F(嵌合体1)
  (B)位置：1…498
  (D)其它信息：(ⅹⅰ)序列表述：SEQ ID NO:20:Met Thr Val Phe Leu Ser Phe Ala Phe Leu Ala Ala Ile Leu Thr His1               5                  10                  15Ile Gly cys Ser Asn Gln Arg Arg Ser Pro Glu Asn Ser Gly Arg Arg
        20                  25                  30Tyr Asn Arg Ile Gln His Gly Gln Cys Ala Tyr Thr Phe Ile Leu Pro
    35                  40                  45Glu His Asp Gly Asn Cys Arg Glu Ser Thr Thr Asp Gln Tyr Asn Thr
50                  55                  60Asn Ala Leu Gln Arg Asp Ala Pro His Val Glu Pro Asp Phe Ser Ser65                  70                  75                  80Gln Lys Leu Gln His Leu Glu His Val Met Glu Asn Tyr Thr Gln Trp
            85                  90                  95Leu Gln Lys Leu Glu Asn Tyr Ile Val Glu Asn Met Lys Ser Glu Met
        100                 105                 110Ala Gln Ile Gln Gln Asn Ala Val Gln Asn His Thr Ala Thr Met Leu
    115                 120                 125Glu Ile Gly Thr Ser Leu Leu Ser Gln TAr Ala Glu Gln Thr Arg Lys
130                 135                 140Leu Thr Asp Val Glu Thr Gln Val Leu Asn Gln Thr Ser Arg Leu Glu145                 150                 155                 160Ile Gln Leu Leu Glu Asn Ser Leu Ser Thr Tyr Lys Leu Glu Lys Gln
            165                 170                 175Leu Leu Gln Gln Thr Asn Glu Ile Leu Lys Ile His Glu Lys Asn Ser
        180                 185                 190Leu Leu Glu His Lys Ile Leu Glu Met Glu Gly Lys His Lys Glu Glu
    195                 200                 205Leu Asp Thr Leu Lys Glu Glu Lys Glu Asn Leu Gln Gly Leu Val Thr
210                 215                 220Arg Gln Thr Tyr Ile Ile Gln Glu Leu Glu Lys Gln Leu Asn Arg Ala225                 230                 235                 240Thr Thr Asn Asn Ser Val Leu Gln Lys Gln Gln Leu Glu Leu Met Asp
            245                 250                 255Thr Val His Asn Leu Val Asn Leu Cys Thr Lys Glu Gly Val Leu Leu
        260                 265                 270Lys Gly Gly Lys Arg Glu Glu Glu Lys Pro Phe Arg Asp Cys Ala Glu
    275                 280                 285Val Phe Lys Ser Gly His Thr Thr Asn Gly Ile Tyr Thr Leu Thr Phe
290                 295                 300Pro Asn Ser Thr Glu Glu Ile Lys Ala Tyr Cys Asp Met Glu Ala Gly305                 310                 315                 320Gly Gly Gly Trp Thr Ile Ile Gln Arg Arg Glu Asp Gly Ser Val Asp
           325                  330                 335Phe Gln Arg Thr Trp Lys Glu Tyr Lys Val Gly Phe Gly Asn Pro Ser
        340                 345                 350Gly Glu Tyr Trp Leu Gly Asn Glu Phe Val Ser Gln Leu Thr Asn Gln
    355                 360                 365Gln Arg Tyr Val Leu Lys Ile His Leu Lys Asp Trp Glu Gly Asn Glu
370                 375                 380Ala Tyr Ser Leu Tyr Glu His Phe Tyr Leu Ser Ser Glu Glu Leu Asn385                 390                 395                 400Tyr Arg Ile His Leu Lys Gly Leu Thr Gly Thr Ala Gly Lys Ile Ser
            405                 410                 415Ser Ile Ser Gln Pro Gly Asn Asp Phe Ser Thr Lys Asp Gly Asp Asn
        420                 425                 430Asp Lys Cys Ile Cys Lys Cys Ser Gln Met Leu Thr Gly Gly Trp Trp
    435                 440                 445Phe Asp Ala Cys Gly Pro Ser Asn Leu Asn Gly Met Tyr Tyr Pro Gln
450                 455                 460Arg Gln Asn Thr Asn Lys Phe Asn Gly Ile Lys Trp Tyr Tyr Trp Lys465                 470                 475                 480Gly Ser Gly Tyr Ser Leu Lys Ala Thr Thr Met Met Ile Arg Pro Ala
            485                 490                 495Asp Phe(2)SEQ ID NO:21信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：1491bp
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线型
(ⅱ)分子类型：DNA
(ⅸ)特性：
  (A)名称/关键词：编码序列
  (B)位置：1…1488
  (D)其它信息：
  (A)名称/关键词：2N2C1F(嵌合体2)
  (B)位置：1…1491
  (D)其它信息：
  (A)名称/关键词：其它
  (B)位置：1…48
  (D)其它信息：推测的先导序列由核苷酸1-48编码
(ⅹⅰ)序列表述：SEQ ID NO:21:ATG TGG CAG ATT GTT TTC TTT ACT CTG AGC TGT GAT CTT GTC TTG GCC         48Met Trp Gln Ile Val Phe Phe Thr Leu Ser Cys Asp Leu Val Leu Ala1               5                  10                  15GCA GCC TAT AAC AAC TTT CGG AAG AGC ATG GAC AGC ATA GGA AAG AAG         96Ala Ala Tyr Asn Asn Phe Arg Lys Ser Met Asp Ser Ile Gly Lys Lys
        20                  25                  30CAA TAT CAG GTC CAG CAT GGG TCC TGC AGC TAC ACT TTC CTC CTG CCA       144Gln Tyr Gln Val Gln His Gly Ser Cys Ser Tyr Thr Phe Leu Leu Pro
    35                  40                  45GAG ATG GAC AAC TGC CGC TCT TCC TCC AGC CCC TAC GTG TCC AAT GCT       192Glu Met Asp Asn Cys Arg Ser Ser Ser Ser Pro Tyr Val Ser Asn Ala
50                  55                  60GTG CAG AGG GAC GCG CCG CTC GAA TAC GAT GAC TCG GTG CAG AGG CTG       240Val Gln Arg Asp Ala Pro Leu Glu Tyr Asp Asp Ser Val Gln Arg Leu65                  70                  75                  80CAA GTG CTG GAG AAC ATC ATG GAA AAC AAC ACT CAG TGG CTA ATG AAG       288Gln Val Leu Glu Asn Ile Met Glu Asn Asn Thr Gln Trp Leu Met Lys
            85                  90                  95CTT GAG AAT TAT ATC CAG GAC AAC ATG AAG AAA GAA ATG GTA GAG ATA       336Leu Glu Asn Tyr Ile Gln Asp Asn Met Lys Lys Glu Met Val Glu Ile
       100                  105                 110CAG CAG AAT GCA GTA CAG AAC CAG ACG GCT GTG ATG ATA GAA ATA GGG       384Gln Gln Asn Ala Val Gln Asn Gln Thr Ala Val Met Ile Glu Ile Gly
    115                 120                 125ACA AAC CTG TTG AAC CAA ACA GCT GAG CAA ACG CGG AAG TTA ACT GAT       432Thr Asn Leu Leu Asn Gln Thr Ala Glu Gln Thr Arg Lys Leu Thr Asp
130                 135                 140GTG GAA GCC CAA GTA TTA AAT CAG ACC ACG AGA CTT GAA CTT CAG CTC       480Val Glu Ala Gln Val Leu Asn Gln Thr Thr Arg Leu Glu Leu Gln Leu145                 150                 155                 160TTG GAA CAC TCC CTC TCG ACA AAC AAA TTG GAA AAA CAG ATT TTG GAC       528Leu Glu His Ser Leu Ser Thr Asn Lys Leu Glu Lys Gln Ile Leu Asp
            165                 170                 175CAG ACC AGT GAA ATA AAC AAA TTG CAA GAT AAG AAC AGT TTC CTA GAA       576Gln Thr Ser Glu Ile Asn Lys Leu Gln Asp Lys Asn Ser Phe Leu Glu
        180                 185                 190AAG AAG GTG CTA GCT ATG GAA GAC AAG CAC ATC ATC CAA CTA CAG TCA       624Lys Lys Val Leu Ala Met Glu Asp Lys His Ile Ile Gln Leu Gln Ser
    195                 200                 205ATA AAA GAA GAG AAA GAT CAG CTA CAG GTG TTA GTA TCC AAG CAA AAT       672Ile Lys Glu Glu Lys Asp Gln Leu Gln Val Leu Val Ser Lys Gln Asn
210                 215                 220TCC ATC ATT GAA GAA CTA GAA AAA AAA ATA GTG ACT GCC ACG GTG AAT       720Ser Ile Ile Glu Glu Leu Glu Lys Lys Ile Val Thr Ala Thr Val Asn225                 230                 235                 240AAT TCA GTT CTT CAA AAG CAG CAA CAT GAT CTC ATG GAG ACA GTT AAT       768Asn Ser Val Leu Gln Lys Gln Gln His Asp Leu Met Glu Thr Val Asn
            245                 250                 255AAC TTA CTG ACT ATG ATG TCC ACA TCA AAC TCA GCT AAG GAC CCC ACT       816Asn Leu Leu Thr Met Met Ser Thr Ser Asn Ser Ala Lys Asp Pro Thr
        260                 265                 270GTT GCT AAA GAA GAA CAA ATC AGC TTC AGA GAC TGT GCA GAT GTA TAT       864Val Ala Lys Glu Glu Gln Ile Ser Phe Arg Asp Cys Ala Asp Val Tyr
    275                 280                 285CAA GCT GGT TTT AAT AAA AGT GGA ATC TAC ACT ATT TAT ATT AAT AAT       912Gln Ala Gly Phe Asn Lys Ser Gly Ile Tyr Thr Ile Tyr Ile Asn Asn
290                 295                 300ATG CCA GAA CCC AAA AAG GTG TTT TGC AAT ATG GAT GTC AAT GGG GGA      960Met Pro Glu Pro Lys Lys Val Phe Cys Asn Met Asp Val Asn Gly Gly305                 310                 315                 320GGT TGG ACT GTA ATA CAA CAT CGT GAA GAT GGA AGT CTA GAT TTC CAA     1008Gly Trp Thr Val Ile Gln His Arg Glu Asp Gly Ser Leu Asp Phe Gln
            325                 330                 335AGA GGC TGG AAG GAA TAT AAA ATG GGT TTT GGA AAT CCC TCC GGT GAA     1056Arg Gly Trp Lys Glu Tyr Lys Met Gly Phe Gly Asn Pro Ser Gly Glu
        340                 345                 350TAT TGG CTG GGG AAT GAG TTT ATT TTT GCC ATT ACC AGT CAG AGG CAG     1104Tyr Trp Leu Gly Asn Glu Phe Ile Phe Ala Ile Thr Ser Gln Arg Gln
    355                 360                 365TAC ATG CTA AGA ATT GAG TTA ATG GAC TGG GAA GGG AAC CGA GCC TAT     1152Tyr Met Leu Arg Ile Glu Leu Met Asp Trp Glu Gly Asn Arg Ala Tyr
370                 375                 380TCA CAG TAT GAC AGA TTC CAC ATA GGA AAT GAA AAG CAA AAC TAT AGG     1200Ser Gln Tyr Asp Arg Phe His Ile Gly Asn Glu Lys Gln Asn Tyr Arg385                 390                 395                 400TTG TAT TTA AAA GGT CAC ACT GGG ACA GCA GGA AAA CAG AGC AGC CTG     1248Leu Tyr Leu Lys Gly His Thr Gly Thr Ala Gly Lys Gln Ser Ser Leu
            405                 410                 415ATC TTA CAC GGT GCT GAT TTC AGC ACT AAA GAT GCT GAT AAT GAC AAC     1296Ile Leu His Gly Ala Asp Phe Ser Thr Lys Asp Ala Asp Asn Asp Asn
        420                 425                 430TGT ATG TGC AAA TGT GCC CTC ATG TTA ACA GGA GGA TGG TGG TTT GAT     1344Cys Met Cys Lys Cys Ala Leu Met Leu Thr Gly Gly Trp Trp Phe Asp
    435                 440                 445GCT TGT GGC CCC TCC AAT CTA AAT GGA ATG TTC TAT ACT GCG GGA CAA     1392Ala Cys Gly Pro Ser Asn Leu Asn Gly Met Phe Tyr Thr Ala Gly Gln
450                 455                 460AAC CAT GGA AAA CTG AAT GGG ATA AAG TGG CAC TAC TTC AAA GGG CCC     1440Asn His Gly Lys Leu Asn Gly Ile Lys Trp His Tyr Phe Lys Gly Pro465                 470                 475                 480AGT TAC TCC TTA CGT TCC ACA ACT ATG ATG ATT CGA CCT TTA GAT TTT     1489Ser Tyr Ser Leu Arg Ser Thr Thr Met Met Ile Arg Pro Leu Asp Phe
            485                 490                 495GA                                                                  1491(2)SEQ ID NO:22信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：496a.a.
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线型
(ⅱ)分子类型：蛋白质
(ⅴ)片段类型：内在
(ⅸ)特性：
  (A)名称/关键词：2N2C1F(嵌合体2)
  (B)位置：1…496
  (D)其它信息：
(ⅹⅰ)序列表述：SEQ ID NO:22:Met Trp Gln Ile Val Phe Phe Thr Leu Ser Cys Asp Leu Val Leu Ala1               5                  10                  15Ala Ala Tyr Asn Asn Phe Arg Lys Ser Met Asp Ser Ile Gly Lys Lys
        20                  25                  30Gln Tyr Gln Val Gln His Gly Ser Cys Ser Tyr Thr Phe Leu Leu Pro
    35                  40                  45Glu Met Asp Asn Cys Arg Ser Ser Ser Ser Pro Tyr Val Ser Asn Ala
50                  55                  60Val Gln Arg Asp Ala Pro Leu Glu Tyr Asp Asp Ser Val Gln Arg Leu65                  70                  75                  80Gln Val Leu Glu Asn Ile Met Glu Asn Asn Thr Gln Trp Leu Met Lys
            85                  90                  95Leu Glu Asn Tyr Ile Gln Asp Asn Met Lys Lys Glu Met Val Glu Ile
        100                 105                 110Gln Gln Asn Ala Val Gln Asn Gln Thr Ala Val Met Ile Glu Ile Gly
    115                 120                 125Thr Asn Leu Leu Asn Gln Thr Ala Glu Gln Thr Arg Lys Leu Thr Asp
130                 135                 140Val Glu Ala Gln Val Leu Asn Gln Thr Thr Arg Leu Glu Leu Gln Leu145                 150                 155                 160Leu Glu His Ser Leu Ser Thr Asn Lys Leu Glu Lys Gln Ile Leu Asp
            165                 170                 175Gln Thr Ser Glu Ile Asn Lys Leu Gln Asp Lys Asn Ser Phe Leu Glu
        180                 185                 190Lys Lys Val Leu Ala Met Glu Asp Lys His Ile Ile Gln Leu Gln Ser
    195                 200                 205Ile Lys Glu Glu Lys Asp Gln Leu Gln Val Leu Val Ser Lys Gln Asn
210                 215                 220Ser Ile Ile Glu Glu Leu Glu Lys Lys Ile Val Thr Ala Thr Val Asn225                 230                 235                 240Asn Ser Val Leu Gln Lys Gln Gln His Asp Leu Met Glu Thr Val Asn
            245                 250                 255Asn Leu Leu Thr Met Met Ser Thr Ser Asn Ser Ala Lys Asp Pro Thr
        260                 265                 270Val Ala Lys Glu Glu Gln Ile Ser Phe Arg Asp Cys Ala Asp Val Tyr
    275                 280                 285Gln Ala Gly Phe Asn Lys Ser Gly Ile Tyr Thr Ile Tyr Ile Asn Asn
290                 295                 300Met Pro Glu Pro Lys Lys Val Phe Cys Asn Met Asp Val Asn Gly Gly305                 310                 315                 320Gly Trp Thr Val Ile Gln His Arg Glu Asp Gly Ser Leu Asp Phe Gln
            325                 330                 335Arg Gly Trp Lys Glu Tyr Lys Met Gly Phe Gly Asn Pro Ser Gly Glu
        340                 345                 350Tyr Trp Leu Gly Asn Glu Phe Ile Phe Ala Ile Thr Ser Gln Arg Gln
    355                 360                 365Tyr Met Leu Arg Ile Glu Leu Met Asp Trp Glu Gly Asn Arg Ala Tyr
370                 375                 380Ser Gln Tyr Asp Arg Phe His Ile Gly Asn Glu Lys Gln Asn Tyr Arg385                 390                 395                 400Leu Tyr Leu Lys Gly His Thr Gly Thr Ala Gly Lys Gln Ser Ser Leu
            405                 410                 415Ile Leu His Gly Ala Asp Phe Ser Thr Lys Asp Ala Asp Asn Asp Asn
        420                 425                 430Cys Met Cys Lys Cys Ala Leu Met Leu Thr Gly Gly Trp Trp Phe Asp
    435                 440                 445Ala Cys Gly Pro Ser Asn Leu Asn Gly Met Phe Tyr Thr Ala Gly Gln
450                 455                 460Asn His Gly Lys Leu Asn Gly Ile Lys Trp His Tyr Phe Lys Gly Pro465                 470                 475                 480Ser Tyr Ser Leu Arg Ser Thr Thr Met Met Ile Arg Pro Leu Asp Phe
            485                 490                 495(2)SEQ ID NO:23信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：1500bp
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线型
(ⅱ)分子类型：DNA
(ⅸ)特性：
  (A)名称/关键词：编码序列
  (B)位置：l…1497
  (D)其它信息：
  (A)名称/关键词：1N2C2F(嵌合体3)
  (B)位置：1…1500
  (D)其它信息：
  (A)名称/关键词：其它
  (B)位置：1…60
  (D)其它信息：推测的先导序列由核苷酸1-60编码
(ⅹⅰ)序列表述：SEQ ID NO:23:ATG ACA GTT TTC CTT TCC TTT GCT TTC CTC GCT GCC ATT CTG ACT CAC        48Met Thr Val Phe Leu Ser Phe Ala Phe Leu Ala Ala Ile Leu Thr His1               5                  10                  15ATA GGG TGC AGC AAT CAG CGC CGA AGT CCA GAA AAC AGT GGG AGA AGA        96Ile Gly Cys Ser Asn Gln Arg Arg Ser Pro Glu Asn Ser Gly Arg Arg
        20                  25                  30TAT AAC CGG ATT CAA CAT GGG CAA TGT GCC TAC ACT TTc ATT CTT CCA       144Tyr Asn Arg Ile Gln Hls Gly Gln Cys Ala Tyr Thr Phe Ile Leu Pro
     35                 40                  45GAA CAC GAT GGC AAC TGT CGT GAG AGT ACG ACA GAC CAG TAC AAC ACA       192Glu His Asp Gly Asn Cys Arg Glu Ser Thr Thr Asp Gln Tyr Asn Thr
50                  55                  60AAC GCT CTG CAG AGA GAT GCT CCA CAC GTG GAA CCG GAT GAC TCG GTG       240Asn Ala Leu Gln Arg Asp Ala Pro His Val Glu Pro Asp Asp Ser Val65                  70                  75                  80CAG AGG CTG CAA GTG CTG GAG AAC ATC ATG GAA AAC AAC ACT CAG TGG       288Gln Arg Leu Gln Val Leu Glu Asn Ile Met Glu Asn Asn Thr Gln Trp
            85                  90                  95CTA ATG AAG CTT GAG AAT TAT ATC CAG GAC AAC ATG AAG AAA GAA ATG       336Leu Met Lys Leu Glu Asn Tyr Ile Gln Asp Asn Met Lys Lys Glu Met
        100                 105                 110GTA GAG ATA CAG CAG AAT GCA GTA CAG AAC CAG ACG GCT GTG ATG ATA       384Val Glu Ile Gln Gln Asn Ala Val Gln Asn Gln Thr Ala Val Met Ile
    115                120                  125GAA ATA GGG ACA AAC CTG TTG AAC CAA ACA GCT GAG CAA ACG CGG AAG       432Glu Ile Gly Thr Asn Leu Leu Asn Gln Thr Ala Glu Gln Thr Arg Lys
130                 135                 140TTA ACT GAT GTG GAA GCC CAA GTA TTA AAT CAG ACC ACG AGA CTT GAA       480Leu Thr Asp Val Glu Ala Gln Val Leu Asn Gln Thr Thr Arg Leu Glu145                 150                 155                 160CTT CAG CTC TTG GAA CAC TCC CTC TCG ACA AAC AAA TTG GAA AAA CAG       528Leu Gln Leu Leu Glu His Ser Leu Ser Thr Asn Lys Leu Glu Lys Gln
            165                 170                 175ATT TTG GAC CAG ACC AGT GAA ATA AAC AAA TTG CAA GAT AAG AAC AGT       576Ile Leu Asp Gln Thr Ser Glu Ile Asn Lys Leu Gln Asp Lys Asn Ser
        180                 185                190TTC CTA GAA AAG AAG GTG CTA GCT ATG GAA GAC AAG CAC ATC ATC CAA       624Phe Leu Glu Lys Lys Val Leu Ala Met Glu Asp Lys His Ile Ile Gln
    195                 200                 205CTA CAG TCA ATA AAA GAA GAG AAA GAT CAG CTA CAG GTG TTA GTA TCC       672Leu Gln Ser Ile Lys Glu Glu Lys Asp Gln Leu Gln Val Leu Val Ser
210                 215                 220AAG CAA AAT TCC ATC ATT GAA GAA CTA GAA AAA AAA ATA GTG ACT GCC       720Lys Gln Asn Ser Ile Ile Glu Glu Leu Glu Lys Lys Ile Val Thr Ala225                 230                 235                240ACG GTG AAT AAT TCA GTT CTT CAA AAG CAG CAA CAT GAT CTC ATG GAG       768Thr Val Asn Asn Ser Val Leu Gln Lys Gln Gln His Asp Leu Met Glu
            245                 250                 255ACA GTT AAT AAC TTA CTG ACT ATG ATG TCC ACA TCA AAC TCA GCT AAG       816Thr Val Asn Asn Leu Leu Thr Met Met Ser Thr Ser Asn Ser Ala Lys
        260                 265                 270GAC CCC ACT GTT GCT AAA GAA GAA CAA ATC AGC TTC AGA GAC TGT GCT       864Asp Pro Thr Val Ala Lys Glu Glu Gln Ile Ser Phe Arg Asp Cys Ala
    275                 280                 285GAA GTA TTC AAA TCA GGA CAC ACC ACA AAT GGC ATC TAC ACG TTA ACA       912Glu Val Phe Lys Ser Gly His Thr Thr Asn Gly Ile Tyr Thr Leu Thr
290                 295                 300TTC CCT AAT TCT ACA GAA GAG ATC AAG GCC TAC TGT GAC ATG GAA GCT       960Phe Pro Asn Ser Thr Glu Glu Ile Lys Ala Tyr Cys Asp Met Glu Ala305                 310                 315                 320GGA GGA GGC GGG TGG ACA ATT ATT CAG CGA CGT GAG GAT GGC AGC GTT      1008Gly Gly Gly Gly Trp Thr Ile Ile Gln Arg Arg Glu Asp Gly Ser Val
            325                 330                 335GAT TTT CAG AGG ACT TGG AAA GAA TAT AAA GTG GGA TTT GGT AAC CCT      1056Asp Phe Gln Arg Thr Trp Lys Glu Tyr Lys Val Gly Phe Gly Asn Pro
        340                 345                 350TCA GGA GAA TAT TGG CTG GGA AAT GAG TTT GTT TCG CAA CTG ACT AAT      1104Ser Gly Glu Tyr Trp Leu Gly Asn Glu Phe Val Ser Gln Leu Thr Asn
    355                 360                 365CAG CAA CGC TAT GTG CTT AAA ATA CAC CTT AAA GAC TGG GAA GGG AAT      1152Gln Gln Arg Tyr Val Leu Lys Ile His Leu Lys Asp Trp Glu Gly Asn
370                 375                 380GAG GCT TAC TCA TTG TAT GAA CAT TTC TAT CTC TCA AGT GAA GAA CTC      1200Glu Ala Tyr Ser Leu Tyr Glu His Phe Tyr Leu Ser Ser Glu Glu Leu385                 390                 395                 400AAT TAT AGG ATT CAC CTT AAA GGA CTT ACA GGG ACA GCC GGC AAA ATA      1248Asn Tyr Arg Ile His Leu Lys Gly Leu Thr Gly Thr Ala Gly Lys Ile
            405                 410                 415AGC AGC ATC AGC CAA CCA GGA AAT GAT TTT AGC ACA AAG GAT GGA GAC      1296Ser Ser Ile Ser Gln Pro Gly Asn Asp Phe Ser Thr Lys Asp Gly Asp
        420                 425                 430AAC GAC AAA TGT ATT TGC AAA TGT TCA CAA ATG CTA ACA GGA GGC TGG      1344Asn Asp Lys Cys Ile Cys Lys Cys Ser Gln Met Leu Thr Gly Gly Trp
    435                 440                 445TGG TTT GAT GCA TGT GGT CCT TCC AAC TTG AAc GGA ATG TAC TAT CCA      1392Trp Phe Asp Ala Cys Gly Pro Ser Asn Leu Asn Gly Met Tyr Tyr Pro
450                 455                 460CAG AGG CAG AAC ACA AAT AAG TTC AAC GGC ATT AAA TGG TAC TAC TGG      1440Gln Arg Gln Asn Thr Asn Lys Phe Asn Gly Ile Lys Trp Tyr Tyr Trp465                 470                 475                 480AAA GGC TCA GGC TAT TCG CTC AAG GCC ACA ACC ATG ATG ATC CGA CCA      1488Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Leu Lys Ala Thr Thr Met Met Ile Arg Pro
            485                 490                 495GCA GAT TTC TAA                                                      1500Ala Asp Phe(2)SEQ ID NO:24信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：499a.a.
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线型
(ⅱ)分子类型：蛋白质
(ⅴ)片段类型：内在
(ⅸ)特性：
  (A)名称/关键词：1N2C2F(嵌合体3)
(ⅹⅰ)序列表述：SEQ ID NO:24:Met Thr Val Phe Leu Ser Phe Ala phe Leu Ala Ala Ile Leu Thr His1               5                  10                  15Ile Gly Cys Ser Asn Gln Arg Arg Ser Pro Glu Asn Ser Gly Arg Arg
        20                  25                  30Tyr Asn Arg Ile Gln His Gly Gln Cys Ala Tyr Thr Phe Ile Leu Pro
    35                  40                  45Glu His Asp Gly Asn Cys Arg Glu Ser Thr Thr Asp Gln Tyr Asn Thr
50                  55                  60Asn Ala Leu Gln Arg Asp Ala Pro His Val Glu Pro Asp Asp Ser Val65                  70                  75                  80Gln Arg Leu Gln Val Leu Glu Asn Ile Met Glu Asn Asn Thr Gln Trp
            85                  90                  95Leu Met Lys Leu Glu Asn Tyr Ile Gln Asp Asn Met Lys Lys Glu Met
        100                 105                 110Val Glu Ile Gln Gln Asn Ala Val Gln Asn Gln Thr Ala Val Met Ile
    115                 120                 125Glu Ile Gly Thr Asn Leu Leu Asn Gln Thr Ala Glu Gln Thr Arg Lys
130                 135                 140Leu Thr Asp Val Glu Ala Gln Val Leu Asn Gln Thr Thr Arg Leu Glu145                 150                 155                 160Leu Gln Leu Leu Glu His Ser Leu Ser Thr Asn Lys Leu Glu Lys Gln
            165                 170                 175Ile Leu Asp Gln Thr Ser Glu Ile Asn Lys Leu Gln Asp Lys Asn Ser
        180                 185                 190Phe Leu Glu Lys Lys Val Leu Ala Met Glu Asp Lys His Ile Ile Gln
    195                 200                 205Leu Gln Ser Ile Lys Glu Glu Lys Asp Gln Leu Gln Val Leu Val Ser
210                 215                 220Lys Gln Asn Ser Ile Ile Glu Glu Leu Glu Lys Lys Ile Val Thr Ala225                 230                 235                 240Thr Val Asn Asn Ser Val Leu Gln Lys Gln Gln His Asp Leu Met Glu
            245                 250                 255Thr Val Asn Asn Leu Leu Thr Met Met ser Thr Ser Asn Ser Ala Lys
        260                 265                 270Asp Pro Thr Val Ala Lys Glu Glu Gln Ile Ser Phe Arg Asp Cys Ala
    275                 280                 285Glu Val Phe Lys Ser Gly His Thr Thr Asn Gly Ile Tyr Thr Leu Thr
290                 295                 300Phe Pro Asn Ser Thr Glu Glu Ile Lys Ala Tyr Cys Asp Met Glu Ala305                 310                 315                 320Gly Gly Gly Gly Trp Thr Ile Ile Gln Arg Arg Glu Asp Gly Ser Val
            325                 330                 335Asp Phe Gln Arg Thr Trp Lys Glu Tyr Lys Val Gly Phe Gly Asn Pro
        340                 345                 350Ser Gly Glu Tyr Trp Leu Gly Asn Glu Phe Val Ser Gln Leu Thr Asn
    355                 360                 365Gln Gln Arg Tyr Val Leu Lys Ile His Leu Lys Asp Trp Glu Gly Asn
370                 375                 380Glu Ala Tyr Ser Leu Tyr Glu His Phe Tyr Leu Ser Ser Glu Glu Leu385                 390                 395                 400Asn Tyr Arg Ile His Leu Lys Gly Leu Thr Gly Thr Ala Gly Lys Ile
            405                 410                 415Ser Ser Ile Ser Gln Pro Gly Asn Asp Phe Ser Thr Lys Asp Gly Asp
        420                 425                 430Asn Asp Lys Cys Ile Cys Lys Cys Ser Gln Met Leu Thr Gly Gly Trp
    435                 440                  445Trp Phe Asp Ala Cys Gly Pro Ser Asn Leu Asn Gly Met Tyr Tyr Pro
450                 455                 460Gln Arg Gln Asn Thr Asn Lys Phe Asn Gly Ile Lys Trp Tyr Tyr Trp465                 470                 475                 480Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Leu Lys Ala Thr Thr Met Met Ile Arg Pro
            485                 490                 495Ala Asp Phe(2)SEQ ID NO:25信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：1488bp
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线型
(ⅱ)分子类型：DNA
(ⅸ)特性：
  (A)名称/关键词：编码序列
  (B)位置：1…1485
  (D)其它信息：
  (A)名称/关键词：2N1C1F(嵌合体4)
  (B)位置：1…1488
  (D)其它信息：
  (A)名称/关键词：其它
  (B)位置：1…48
  (D)其它信息：推测的先导序列
(ⅹⅰ)序列表述：SEQ ID NO:25:ATG TGG CAG ATT GTT TTC TTT ACT CTG AGC TGT GAT CTT GTC TTG GCC        48Met Trp Gln Ile Val Phe Phe Thr Leu Ser Cys Asp Leu Val Leu Ala1               5                  10                  15GCA GCC TAT AAC AAC TTT CGG AAG AGC ATG GAC AGC ATA GGA AAG AAG        96Ala Ala Tyr Asn Asn Phe Arg Lys Ser Met Asp Ser Ile Gly Lys Lys
        20                  25                  30CAA TAT CAG GTC CAG CAT GGG TCC TGC AGC TAC ACT TTC CTC CTG CCA       144Gln Tyr Gln Val Gln His Gly Ser Cys Ser Tyr Thr Phe Leu Leu Pro
    35                  40                  45GAG ATG GAC AAC TGC CGC TCT TCC TCC AGC CCC TAC GTG TCC AAT GCT       192Glu Met Asp Asn Cys Arg Ser Ser Ser Ser Pro Tyr Val Ser Asn Ala
50                  55                  60GTG CAG AGG GAC GCG CCG CTC GAA TAC GAT TTC TCT TCC CAG AAA CTT       240Val Gln Arg Asp Ala Pro Leu Glu Tyr Asp Phe Ser Ser Gln Lys Leu65                  70                  75                  80CAA CAT CTG GAA CAT GTG ATG GAA AAT TAT ACT CAG TGG CTG CAA AAA       288Gln His Leu Glu His Val Met Glu Asn Tyr Thr Gln Trp Leu Gln Lys
            85                  90                  95CTT GAG AAT TAC ATT GTG GAA AAC ATG AAG TCG GAG ATG GCC CAG ATA       336Leu Glu Asn Tyr Ile Val Glu Asn Met Lys Ser Glu Met Ala Gln Ile
        100                 105                 110CAG CAG AAT GCA GTT CAG AAC CAC ACG GCT ACC ATG CTG GAG ATA GGA       384Gln Gln Asn Ala Val Gln Asn His Thr Ala Thr Met Leu Glu Ile Gly
    115                 120                 125ACC AGC CTC CTC TCT CAG ACT GCA GAG CAG ACC AGA AAG CTG ACA GAT       432Thr Ser Leu Leu Ser Gln Thr Ala Glu Gln Thr Arg Lys Leu Thr Asp
130                 135                 140GTT GAG ACC CAG GTA CTA AAT CAA ACT TCT CGA CTT GAG ATA CAG CTG       480Val Glu Thr Gln Val Leu Asn Gln Thr Ser Arg Leu Glu Ile Gln Leu145                 150                 155                 160CTG GAG AAT TCA TTA TCC ACC TAC AAG CTA GAG AAG CAA CTT CTT CAA       528Leu Glu Asn Ser Leu Ser Thr Tyr Lys Leu Glu Lys Gln Leu Leu Gln
            165                 170                 175CAG ACA AAT GAA ATC TTG AAG ATC CAT GAA AAA AAC AGT TTA TTA GAA       576Gln Thr Asn Glu Ile Leu Lys Ile His Glu Lys Asn Ser Leu Leu Glu
        180                 185                 190CAT AAA ATC TTA GAA ATG GAA GGA AAA CAC AAG GAA GAG TTG GAC ACC       624His Lys Ile Leu Glu Met Glu Gly Lys His Lys Glu Glu Leu Asp Thr
    195                 200                 205TTA AAG GAA GAG AAA GAG AAC CTT CAA GGC TTG GTT ACT CGT CAA ACA       672Leu Lys Glu Glu Lys Glu Asn Leu Gln Gly Leu Val Thr Arg Gln Thr
210                 215                 220TAT ATA ATC CAG GAG CTG GAA AAG CAA TTA AAC AGA GCT ACC ACC AAC      720Tyr Ile Ile Gln Glu Leu Glu Lys Gln Leu Asn Arg Ala Thr Thr Asn225                 230                 235                 240AAC AGT GTC CTT CAG AAG CAG CAA CTG GAG CTG ATG GAC ACA GTC CAC      768Asn Ser Val Leu Gln Lys Gln Gln Leu Glu Leu Met Asp Thr Val His
            245                 250                 255AAC CTT GTC AAT CTT TGC ACT AAA GAA GGT GTT TTA CTA AAG GGA GGA      816Asn Leu Val Asn Leu Cys Thr Lys Glu Gly Val Leu Leu Lys Gly Gly
        260                 265                 270AAA AGA GAG GAA GAG AAA CCA TTT AGA GAC TGT GCA GAT GTA TAT CAA       864Lys Arg Glu Glu Glu Lys Pro Phe Arg Asp Cys Ala Asp Val Tyr Gln
    275                 280                 285GCT GGT TTT AAT AAA AGT GGA ATC TAC ACT ATT TAT ATT AAT AAT ATG       912Ala Gly Phe Asn Lys Ser Gly Ile Tyr Thr Ile Tyr Ile Asn Asn Met
290                 295                 300CCA GAA CCC AAA AAG GTG TTT TGC AAT ATG GAT GTC AAT GGG GGA GGT       960Pro Glu Pro Lys Lys Val Phe Cys Asn Met Asp Val Asn Gly Gly Gly305                 310                 315                 320TGG ACT GTA ATA CAA CAT CGT GAA GAT GGA AGT CTA GAT TTC CAA AGA      1008Trp Thr Val Ile Gln His Arg Glu Asp Gly Ser Leu Asp Phe Gln Arg
            325                 330                 335GGC TGG AAG GAA TAT AAA ATG GGT TTT GGA AAT CCC TCC GGT GAA TAT      1056Gly Trp Lys Glu Tyr Lys Met Gly Phe Gly Asn Pro Ser Gly Glu Tyr
        340                 345                 350TGG CTG GGG AAT GAG TTT ATT TTT GCC ATT ACC AGT CAG AGG CAG TAC      1104Trp Leu Gly Asn Glu Phe Ile Phe Ala Ile Thr Ser Gln Arg Gln Tyr
    355                 360                 365ATG CTA AGA ATT GAG TTA ATG GAC TGG GAA GGG AAC CGA GCC TAT TCA      1152Met Leu Arg Ile Glu Leu Met Asp Trp Glu Gly Asn Arg Ala Tyr Ser
370                 375                 380CAG TAT GAC AGA TTC CAC ATA GGA AAT GAA AAG CAA AAC TAT AGG TTG      1200Gln Tyr Asp Arg Phe His Ile Gly Asn Glu Lys Gln Asn Tyr Arg Leu385                 390                 395                400TAT TTA AAA GGT CAC ACT GGG ACA GCA GGA AAA CAG AGC AGC CTG ATC      1248Tyr Leu Lys Gly His Thr Gly Thr Ala Gly Lys Gln Ser Ser Leu Ile
            405                 410                 415TTA CAC GGT GCT GAT TTC AGC ACT AAA GAT GCT GAT AAT GAC AAC TGT      1296Leu His Gly Ala Asp Phe Ser Thr Lys Asp Ala Asp Asn Asp Asn Cys
        420                425                  430ATG TGC AAA TGT GCC CTC ATG TTA ACA GGA GGA TGG TGG TTT GAT GCT      1344Met Cys Lys Cys Ala Leu Met Leu Thr Gly Gly Trp Trp Phe Asp Ala
    435                 440                 445TGT GGC CCC TCC AAT CTA AAT GGA ATG TTC TAT ACT GCG GGA CAA AAC      1392Cys Gly Pro Ser Asn Leu Asn Gly Met Phe Tyr Thr Ala Gly Gln Asn
450                 455                 460CAT GGA AAA CTG AAT GGG ATA AAG TGG CAC TAC TTC AAA GGG CCC AGT      1440His Gly Lys Leu Asn Gly Ile Lys Trp His Tyr Phe Lys Gly Pro Ser465                 470                 475                 480TAC TCC TTA CGT TCC ACA ACT ATG ATG ATT CGA CCT TTA GAT TTT TGA      1488Tyr Ser Leu Arg Ser Thr Thr Met Met Ile Arg Pro Leu Asp Phe
            485                 490                 495(2)SEQ ID NO:26信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：495a.a.
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线型
(ⅱ)分子类型：蛋白质
(ⅴ)片段类型：内在
(ⅸ)特性：
  (A)名称/关键词：2N1C1F(嵌合体4)
  (B)位置：1…495
  (D)其它信息：
(ⅹⅰ)序列表述：SEQ ID NO:26:Met Trp Gln Ile Val Phe Phe Thr Leu Ser Cys Asp Leu Val Leu Ala1               5                  10                  15Ala Ala Tyr Asn Asn Phe Arg Lys Ser Met Asp Ser Ile G1y Lys Lys
        20                  25                  30Gln Tyr Gln Val Gln His Gly Ser Cys Ser Tyr Thr Phe Leu Leu Pro
    35                  40                  45Glu Met Asp Asn Cys Arg Ser Ser Ser Ser Pro Tyr Val Ser Asn Ala
50                  55                  60Val Gln Arg Asp Ala Pro Leu Glu Tyr Asp Phe Ser Ser Gln Lys Leu65                  70                  75                  80Gln His Leu Glu His Val Met Glu Asn Tyr Thr Gln Trp Leu Gln Lys
            85                  90                  95Leu Glu Asn Tyr Ile Val Glu Asn Met Lys Ser Glu Met Ala Gln Ile
        100                 105                110Gln Gln Asn Ala Val Gln Asn His Thr Ala Thr Met Leu Glu Ile Gly
    115                 120                 125Thr Ser Leu Leu Ser Gln Thr Ala Glu Gln Thr Arg Lys Leu Thr Asp
130                 135                 140Val Glu Thr Gln Val Leu Asn Gln Thr Ser Arg Leu Glu lle Gln Leu145                 150                 155                 160Leu Glu Asn Ser Leu Ser Thr Tyr Lys Leu Glu Lys Gln Leu Leu Gln
            165                 170                 175Gln Thr Asn Glu Ile Leu Lys Ile His Glu Lys Asn Ser Leu Leu Glu
        180                 185                190His Lys Ile Leu Glu Met Glu Gly Lys His Lys Glu Glu Leu Asp Thr
    195                 200                 205Leu Lys Glu Glu Lys Glu Asn Leu Gln Gly Leu Val Thr Arg Gln Thr
210                 215                 220Tyr Ile Ile Gln Glu Leu Glu Lys Gln Leu Asn Arg Ala Thr Thr Asn225                 230                 235                 240Asn Ser Val Leu Gln Lys Gln Gln Leu Glu Leu Met Asp Thr Val His
            245                 250                 255Asn Leu Val Asn Leu Cys Thr Lys Glu Gly Val Leu Leu Lys Gly Gly
        260                 265                270Lys Arg Glu Glu Glu Lys Pro Phe Arg Asp Cys Ala Asp Val Tyr Gln
    275                 280                 285Ala Gly Phe Asn Lys Ser Gly Ile Tyr Thr Ile Tyr Ile Asn Asn Met
290                 295                 300Pro Glu Pro Lys Lys Val Phe Cys Asn Met Asp Val Asn Gly Gly Gly305                 310                 315                 320Trp Thr Val Ile Gln His Arg Glu Asp Gly Ser Leu Asp Phe Gln Arg
            325                 330                 335Gly Trp Lys Glu Tyr Lys Met Gly Phe Gly Asn Pro Ser Gly Glu Tyr
        340                 345                 350Trp Leu Gly Asn Glu Phe Ile Phe Ala Ile Thr Ser Gln Arg Gln Tyr
    355                 360                 365Met Leu Arg Ile Glu Leu Met Asp Trp Glu Gly Asn Arg Ala Tyr Ser
370                 375                 380Gln Tyr Asp Arg Phe His Ile Gly Asn Glu Lys Gln Asn Tyr Arg Leu385                 390                 395                 400Tyr Leu Lys Gly His Thr Gly Thr Ala Gly Lys Gln Ser Ser Leu Ile
            405                 410                 415Leu His Gly Ala Asp Phe Ser Thr Lys Asp Ala Asp Asn Asp Asn Cys
        420                 425                 430Met Cys Lys Cys Ala Leu Met Leu Thr Gly Gly Trp Trp Phe Asp Ala
    435                 440                 445Cys Gly Pro Ser Asn Leu Asn Gly Met Phe Tyr Thr Ala Gly Gln Asn
450                 455                 460His Gly Lys Leu Asn Gly Ile Lys Trp Mis Tyr Phe Lys Gly Pro Ser465                 470                 475                 480Tyr Ser Leu Arg Ser Thr Thr Met Met Ile Arg Pro Leu Asp Phe
            485                 490                 495(2)SEQ ID NO:27信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：47bp
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线型
(ⅱ)分子类型：DNA
(ⅸ)特性：
  (A)名称/关键词：hTL4atg
  (B)位置：1…47
  (D)其它信息：PCR引物
  (A)名称/关键词：其它
  (B)位置：1…20
  (D)其它信息：“尾”序列被附加到PCR引物上以方便扩
              增PCR片段的克隆
(ⅹⅰ)序列表述：SEQ ID NO:27:GCATGCTATC TCGAGCCACC ATGCTCTCCC AGCTAGCCAT GCTGCAG    47(2)SEQ ID NO:28信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：55bp
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线型
(ⅱ)分子类型：cDNA
(ⅸ)特性：
  (A)名称/关键词：hTL4not
  (B)位置：1…55
  (D)其它信息：PCR引物
  (A)名称/关键词：其它
  (B)位置：1…208
  (D)其它信息：“尾”序列被附加到PCR引物上以方便扩
           增PCR片段的克隆
(ⅹⅰ)序列表述：SEQ ID NO:28:GTGTCGACGC GGCCGCTCTA GATCAGACTT AGATGTCCAA AGGCCGTATC ATCAT    55

Claims (50)

1．已分离的编码嵌合TIE-2配体的核酸分子，该配体至少包括一部分第一TIE-2配体和一部分不同于第一配体的第二TIE-2配体，其中第一和第二TIE-2配体选自TIE-2配体1,TIE-2配体2,TIE配体3和TIE配体4。
2．权利要求1的核酸分子，其编码至少包括一部分TIE-2配体1和一部分TIE-2配体2的嵌合TIE-2配体。
3．根据权利要求2的核酸分子，其编码结合并激活TIE-2受体的嵌合TIE-2配体，该分子包括编码TIE-2配体1的核苷酸序列，其中编码TIE-2配体1中N末端区的核苷酸序列由编码TIE-2配体2中N末端区的核苷酸序列所替换。
4．权利要求3的核酸分子，其中编码TIE-2配体1中卷曲螺旋区的核苷酸序列由编码TIE-2配体2中卷曲螺旋区的核苷酸序列替换。
5．权利要求3或4的核酸分子，它被修饰以编码另一不同的氨基酸而不是图27中核苷酸784-787所编码的半胱氨酸残基。
6．权利要求5的核酸分子，它被修饰以编码丝氨酸残基而不是半胱氨酸残基。
7．权利要求5或6的核酸分子，它被进一步修饰以编码另一不同的氨基酸而不是图27中核苷酸199-201所编码的精氨酸残基。
8．权利要求7中的核酸分子，它被修饰以编码丝氨酸残基而不是精氨酸残基。
9．已分离的编码结合并激活TIE-2受体的修饰TIE-2配体的核酸分子，它包括编码TIE-2配体1的核苷酸序列，其中该核苷酸序列被修饰以编码另一不同的氨基酸而不是氨基酸位置245的半胱氨酸残基。
10．权利要求9的核酸分子，它被修饰以编码丝氨酸残基而不是半胱氨酸残基。
11．权利要求3的核酸分子，该分子具有图27中所示的序列。
12．权利要求4的核酸分子，该分子具有图25中所示的序列。
13．已分离的编码结合但不激活TIE-2受体的修饰TIE-2配体的核酸分子，该分子包含编码TIE-2配体1或TIE-2配体2的核苷酸序列，其中编码TIE-2配体1或TIE-2配体2N末端区的核苷酸序列缺失。
14．权利要求13的核酸分子，其中编码TIE-2配体1或TIE-2配体2卷曲螺旋区的核苷酸序列缺失，并且编码类纤维蛋白原区的序列与编码人免疫球蛋白γ-1恒定区(IgG1 Fc)的核苷酸序列符合读框地融合。
15．已分离的编码结合但不激活TIE-2受体的修饰TIE-2配体的核酸分子，该分子包括编码TIE-2配体1的核苷酸序列，其中编码TIE-2配体1中类纤维蛋白原区的核苷酸序列由编码TIE-2配体2中类纤维蛋白原区的核苷酸序列替换。
16．权利要求15的核酸分子，其中编码TIE-2配体1中卷曲螺旋区的核苷酸序列由编码TIE-2配体2中卷曲螺旋区的核苷酸序列替换。
17．权利要求15的核酸分子，该分子具有图24所示的序列。
18．权利要求16的核酸分子，该分子具有图26所示的序列。
19．由以上任一权利要求中的核酸分子所编码的嵌合或修饰TIE-2配体。
20．根据权利要求19的嵌合TIE配体，该配体具有图24,25,26或27中所示的序列。
21．根据权利要求19的嵌合TIE配体，该配体具有图27所示的序列，但已被修饰以编码另一不同的氨基酸而不是核苷酸784-787所编码的半胱氨酸残基。
22．包含以上权利要求1～18任一项中的核酸分子的载体。
23．根据权利要求22的载体，其中，核酸分子有效连接于能够指导它在宿主细胞中表达的表达调控序列。
24．根据权利要求22或23的载体，它是一种质粒。
25．制备根据权利要求19,20或21中任一项的嵌合或修饰配体的宿主-载体系统，它包括根据权利要求22,23或24中任一项的载体。
26．根据权利要求25的宿主-载体系统，其中宿主细胞是细菌，酵母，昆虫或哺乳动物细胞。
27．制备权利要求19,20或21中任一项所述配体的方法，它包括在允许产生配体的条件下，培养根据权利要求25或26的宿主-载体系统的细胞，然后回收所产生的配体。
28．特异地结合权利要求19,20或21中任一项的配体的抗体。
29．根据权利要求28的抗体，其为单克隆抗体。
30．特异地结合权利要求19,20或21中配体的融合受体。
31．已分离的编码根据权利要求30的融合受体的核酸分子。
32．包含根据权利要求31的核酸分子的载体。
33．根据权利要求32的载体，它是一种质粒。
34．包含根据权利要求19,20或21中任一项的配体和与其偶联的细胞毒性试剂的偶联物。
35．根据权利要求34的偶联物，其中细胞毒性试剂是放射性同位素或毒素。
36．包含根据权利要求19,20或21中任一项的嵌合或修饰配体以及制药上可接受的载体的药用组合物。
37．包含根据权利要求28或29的抗体和制药上可接受的载体的药用组合物。
38．包含根据权利要求30的融合受体以及制药上可接受的载体的药用组合物。
39．包含根据权利要求34或35的偶联物以及制药上可接受的载体的药用组合物。
40．根据权利要求19,20或21中任一项的配体，根据权利要求28或29的抗体，根据权利要求30的融合受体或根据权利要求34或35的偶联物在人或动物治疗方法或诊断方法中的应用。
41．用权利要求27的方法制备的配体。
42．基本上如上所述的已分离的权利要求1,9,13，或15的核酸分子。
43．基本上如上所述的权利要求19的嵌合或修饰TIE-2配体。
44．基本上如上所述的权利要求22或32的载体。
45．基本上如上所述的权利要求25的宿主-载体系统。
46．基本如上所述的权利要求27的方法。
47．基本如上所述的权利要求28的抗体。
48．基本上如上所述的权利要求30的融合受体。
49．基本上如上所述的权利要求36,37,38或39的药用组合物。
50．基本上如上所述的权利要求40的配体，抗体，融合受体或偶联物。
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