CZ295371B6 - Izolovaná molekula nukleové kyseliny kódující chimerní TIE-2 ligand, chimerní TIE-2 ligand kódující molekulu nukleové kyseliny, vektor zahrnující molekulu nukleové kyseliny, způsob produkce ligandu, konjugát obsahující ligand a farmaceutický prostředek, obsahující ligand - Google Patents

Izolovaná molekula nukleové kyseliny kódující chimerní TIE-2 ligand, chimerní TIE-2 ligand kódující molekulu nukleové kyseliny, vektor zahrnující molekulu nukleové kyseliny, způsob produkce ligandu, konjugát obsahující ligand a farmaceutický prostředek, obsahující ligand Download PDF

Info

Publication number
CZ295371B6
CZ295371B6 CZ1999310A CZ31099A CZ295371B6 CZ 295371 B6 CZ295371 B6 CZ 295371B6 CZ 1999310 A CZ1999310 A CZ 1999310A CZ 31099 A CZ31099 A CZ 31099A CZ 295371 B6 CZ295371 B6 CZ 295371B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
tie
ligand
nucleic acid
receptor
cells
Prior art date
Application number
CZ1999310A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ31099A3 (cs
Inventor
Samuel Davis
George D. Yancopoulos
Original Assignee
Regeneron Pharmaceuticals, Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Regeneron Pharmaceuticals, Inc. filed Critical Regeneron Pharmaceuticals, Inc.
Publication of CZ31099A3 publication Critical patent/CZ31099A3/cs
Publication of CZ295371B6 publication Critical patent/CZ295371B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/515—Angiogenesic factors; Angiogenin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/15—Humanized animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/30—Bird
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/01—Animal expressing industrially exogenous proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/0331—Animal model for proliferative diseases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/035—Animal model for multifactorial diseases
    • A01K2267/0375—Animal model for cardiovascular diseases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/035—Animal model for multifactorial diseases
    • A01K2267/0381—Animal model for diseases of the hematopoietic system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Dermatology (AREA)

Abstract

Izolovaná molekula nukleové kyseliny, kódující chimerní TIE-2 ligand obsahující alespoň podíl prvního TIE-2 ligandu a podíl druhého TIE-2 ligandu, který je odlišný od prvního TIE-2 ligandu, přičemž první a druhý TIE-2 ligand je volen ze souboru zahrnujícího TIE-2 ligand 1, TIE-2 ligand 2, TIE-2 ligand 3 a TIE-2 ligand 4, je vhodná pro výrobu farmaceutických prostředků pro ošetřování jedinců trpících poruchami buněk, tkání nebo orgánů, které expresují TIE-2 receptor a pro diagnostické účely.ŕ

Description

Izolovaná molekula nukleové kyseliny kódující chimerní TIE-2 ligand, chimerní ΊΊΕ-2 ligand kódující molekulu nukleové kyseliny, vektor zahrnující molekulu nukleové kyseliny, způsob produkce ligandů, konjugát obsahující ligand a farmaceutický prostředek, obsahující ligand
Oblast techniky
Vynález se obecně týká oboru genetického inženýrství a především gelu pro receptorové tyrozinkinázy a jejich příbuzné ligandy, jejich inzerce do rekombinantních DNA vektorů a produkce zakódovaných proteinů v hostitelských kmenech mikroorganizmů a v hostitelských eukaryotických buňkách. Zvláště se vynález týká nového modifikovaného ΊΊΕ-2 ligandů, který váže TIE-2 receptor, jakož také způsobu výroby a použití modifikovaného ligandů. Vynález se dále týká sekvence nukleové kyseliny kódující modifikovaný ligand a způsobu kódování modifikovaného ligandů a genového produktu nukleovou kyselinou.
Dosavadní stav techniky
Modifikovaný TIE-2-receptorový ligand, jakož také nukleová kyselina, která ho kóduje, mohou být užitečné při diagnóze a ošetřování určitých nemocí zahrnující endoteliální buňky a asociované TIE receptory, jako jsou neoplastická onemocnění, zahrnující nádorovou angiogenezi, hojení ran, tromboembolická onemocnění, ateroskleróza a zánětlivá onemocnění. Kromě toho se modifikovaného ligandů může používat k podpoře proliferace a/nebo diferenciace hematopoietických kmenových buněk. Obecně se receptor aktivující modifikované TIE-2 ligandy, zde popisované, může používat v podpoře růstu, přežití, migrace a/nebo diferenciace a/nebo stabilizace nebo destabilizace buněk exprimujících TIE receptor. Biologicky aktivní modifikovaný TIE-2 ligand se může použít pro TIE receptor exprimující TIE receptor, zahrnující například kardiatické a vaskulámí endoteliální buňky čočkové epitelium a srdeční epikardium a čerstvé hematopoietické buňky. Alternativně se takové lidské ligandy mohou používat pro podporu buněk, které jsou určeny k expresi receptoru TIE. Kromě toho modifikovaný ligand TIE-2 a jeho příbuzný receptor se může používat ve zkušebních systémech k identifikaci dalších agonistů nebo antagonistů receptoru.
Buněčné chování, zodpovědné za vývoj, udržování a opravu různých buněk a tkání, se řídí ve velké míře vnitřními buněčnými signály vedenými cesty růstových faktorů a podobných ligandů a jejich receptorů. Receptory jsou umístěny na buněčném povrchu a váží peptidy nebo polypeptidy, známé jako růstové faktory a jako jiné hormonu podobné ligandy. Výsledky interakce jsou rychlé biologické změny v odezvových buňkách jakož také rychlé a dlouhodobé úpravy buněčné genové exprese. Některé receptory, spojené s různými povrchy buněk, mohou vázat specifické růstové faktory.
Fosforylace tyrozinových zbytků v proteinech tyrozinkinázami je jedním klíčovým způsobem, kterým se signály napříč plazmové membrány. Některé současně známé proteinové tyrozinkinázové geny kódují transmembránové receptory polypeptidových růstových faktorů a hormonů, jako jsou epidermální růstový faktor (EGF), inzulín, inzulínu podobný růstový faktor-1 (IGF-I), růstové faktory odvozené od destiček (PDGF-A a B) a fibroblastové růstové faktory (FGF) (Heldin a kol., Cell Regulation, 1: str. 555 až 566, 1990; Ullrich a kol., Cell 61, str. 243 až 254, 1990). V každém případě tyto růstové faktory vykonávají své působení vázáním na mimobuněčný podíl svých příbuzných receptorů, což vede k aktivaci vnitřní tyrozinkinázy obsažené v cytoplazmovém podílu receptoru. Receptory růstového faktoru endoteliových buněk mají zvláštní význam pro možné zahrnutí růstových faktorů do některých důležitých fyziologických a patologických procesů, jako jsou vaskulogeneze, angiogeneze, ateroskleróza a zánětlivá onemocnění (Folkman a kol., Science, 235, str. 442 až 447, 1987). Receptory některých hematopoietických růstových faktorů jsou tyrozinkinázy; zahrnují c-fms, což je stimulační faktor 1
-1 CZ 295371 B6 receptorů kolonu (Sherr a kol., Cell, 41, str. 665 až 676, 1985) a c-kit, faktor receptorů primitivního hematopoietického růstu, který popsal Hung a kol. (Cell, 63, str. 225 až 233, 1990).
Receptorové tyrozinkinázy se dělí na evoluční podčeledi na bázi charakteristické struktury svých ektodomén (Ullrich a kol., Cell 61, str. 243 až 254, 1990). Takové podčeledi zahrnují EGF receptorů podobnou kinázu (subtřída I) a inzulínovou receptorů podobnou kinázu (subtřída II), přičemž každá tato podčeled’ obsahuje opakující se homologické cysteinem bohaté sekvence ve svých mimobuněčných doménách. Jediný cystein bohatý region se také zjistil v mimobuněčných doménách podobných kinázám eph (Hirai a kol., Science 238, str. 1717 až 1720, 1987; Lindberg a kol., Mol. Cell. Biol. 10, str. 6316 až 6324, 1990; Lhotak a kol., Mol Cell. Biol. 11, str. 2496 až 2502, 1991). PDGF receptory stejně jako c-fms a c-kit receptorové tyrozinokinázy se mohou seskupovat v podčeledi III; zatímco FGF receptory tvoří podčeled’ IV. Typické pro členy obou těchto podčeledi jsou mimobuněčné vinuté jednotky stabilizované meziřetězcovými disulfidickými vazbami. Tato tak zvaná imunoglobulinu Ig-podobná vinutí jsou zjištěna v proteinech imunoglobulinové nadčeledi, která obsahuje četné různé jiné buněčné povrchové receptory mající buď na buňku vázané, nebo rozpustné ligandy (Williams a kol., Ann. Rev. Immunol., 6, str. 381 až 405, 1988).
Receptorové tyrozinkinázy se liší svou specifícitou a afinitou. Obecně jsou receptorové tyrozinkinázy glykoproteiny, které sestávají (1) z mimobuněčné domény schopné vázat specifický růstový faktor nebo specifické růstové faktory; (2) z transmembránové domény, kterou je obvykle α-dvoušroubovicový podíl proteinu; (3) zjuxtamembránové domény, kde se receptor může regulovat například proteinovou fosfoiylací; (4) z tyrozinkinázové domény, která je enzymatickou složkou receptorů; a (5) z karboxylového zakončení, které je zahrnuto v mnoha receptorech v rozpoznávacím místu a ve vazbě substrátů pro tyrozinkinázu.
Procesy, jako jsou alternativní exonový sestřih a alternativní volba genového promotoru nebo polyadenylačního místa, se označují jako schopné produkovat některé polypeptidy ze stejného genu. Tyto polypeptidy mohou, avšak nemusí obsahovat různé shora uvedené domény. Následkem toho některé mimobuněčné domény mohou být exprimovány jako oddělené sekretované proteiny a některé formy receptorů mohou postrádat tyrozinkinázovou doménu a obsahují toliko mimobuněčnou doménu včleněnou do plazmové membrány prostřednictvím transmembránové domény plus krátké karboxylové zakončení.
Gen, kódující endoteliální buněčnou transmembránovou tyrozinkinázu, označenou původně jako RT-PCR jakožto neznámý tyrozinkinázový homologový cDNA fragment z lidských leukemických buněk, popsal Partanen a kol. (Proč. Nati. Acad. Sci. USA 87, str. 8913 až 8917, 1990). Tento gen a jeho zakódovaný protein se označují jako „TIE“ což je zkratka pro „tyrozinkinázu s Ig a EGF homologovými doménami“ (Partanen a kol., Mol. Cell. Biol. 12, str. 1698 až 1707, 1992).
Je známo, že vinutá mRNA je obsažena ve všech lidských zárodečných a ve všech myších zárodečných tkání. Na základě inspekcí je mediátor tie lokalizován do kardiatických a vaskulárních endoteliových buněk. Tedy tie mRNA je lokalizovaná do endotelu krevních cév a do endokardia 9,5 až 18,5 dní stalých myších zárodků. Podporovaná tie exprese je doložená v průběhu neovaskularizace spojené s vývojem vaječníkových folikulů a granulace tkáně v ranách pokožky (Korhonon a kol., Blood 80, str. 2548 až 2555, 1992). Proto se usuzuje, že TIE má úkol při angiogenezi, která je důležitá pro vývoj ošetřování pevných nádorů a některých jiných na angiogenezi závislých onemocnění, jako jsou diabetická retinopathie, lupénka, ateroskleróza a artritida.
Je známo, že dva strukturálně příbuzné krysí TIE receptorové proteiny kódují odlišné geny s příbuznými profily exprese. Jeden gen, označovaný tie-1 je krysí homolog lidského tie (Maisonpierre a kol., Oncogene 8, str. 1631 až 1637, 1993). Druhý gen tie-2 může být krysí homolog myšího tek genu, o kterém se podobně jako o tie uvádí, že se exprese u myší výhradně
-2CZ 295371 B6 v endoteliových buňkách a v jejich předpokládaných předgenitorech (Dumont a kol., Oncogene 8, str. 1293 až 1301, 1993). Lidský homolog tie-2, který je zde zcela začleněn, popsal Ziegler (americký patentový spis US 5 447 860, 5. září 1995) (přičemž se označuje jako „ork“).
Zjistilo se, že oba geny jsou ve velké míře exprimovány v endoteliových buňkách embryí a v postnatálních tkáních. Významné hladiny tie-2 transkriptů jsou obsaženy také v jiných populacích zárodečných buněk, včetně epitelia čočky, srdečního epikardia a regionů mesenchymu (Maisonpierre a kol., Oncogene 8, str. 1631 až 1637,1993).
Z převážné exprese TIE receptoru ve vaskulámím endoteliu vyplývá, že TIE má význam ve vývoji a v udržování vaskulámího systému. To může mít význam při determinaci endoteliové buňky, při proliferaci, diferenciaci a migraci buněk a při začleňování do vaskulámích prvků. Analýza myších embryí s deficitem TIE-2 objasňuje význam angiogeneze, zvláště pro vytváření vaskulámího síťoví v endoteliových buňkách (T.N. Sáto a kol., Nátuře 376, str. 70 až 74, 1995). Ve zralém vaskulámím systému může mít TIE funkci v přežívání endoteliových buněk v udržování a v odezvě na patogenní vlivy.
Receptory TIE jsou tedy exprimovány v primitivních hematopoietických kmenových buňkách, B buňkách a v podskupině megakaryotických buněk, mají roli ligandů, které váží tyto receptory v časné hematopoiezi, v diferenciaci a/nebo v proliferaci B buněk a v megakaryocytické diferenciační dráze (Iwama a kol., Biochem. Biphys. Research Communications 195, str. 301 až 309, 1993; Hashiyama a kol., Bllod 87, str. 93 až 101, 1996; Batard a kol., Blood 87, str. 2212 až 2220, 1996).
Podstata vynálezu
Podstatou vynálezu je izolovaná molekula nukleové kyseliny kódující chimemí TIE-2 ligand obsahující jednu N-koncovou doménu, jednu smyčkově stočenou doménu a jednu fibrinogenu podobnou doménu, přičemž alespoň dvě domény jsou odvozeny od odlišných TIE-2 ligandů ze souboru zahrnujícího TIE-2 ligand 1, TIE-2 ligand 2, TIE-2 ligand 3 a TIE-2 ligand 4.
Podstatou vynálezu je také kompozice obsahující modifikovaný TIE-2 ligand v podstatě prostý jiných proteinů. Modifikovaný TIE-2 ligand se týká ligandů čeledi TIE ligandů, které reprezentativně obsahují popsané ligandy TLI, TL2, TL3 a TL4, které jsou pozměněné adicí, delecí nebo substitucí jedné nebo několika aminokyselin nebo způsobem značení například podílu Fc lidského IgG-1, přičemž jim však zůstává schopnost vázat TIE-2 receptor. Modifikovaný TIE-2 ligand zahrnuje také chimemí TIE-2 ligand obsahující alespoň podíl prvního TIE-2 ligandů a podíl druhého TIE-2 ligandů, který je od prvního odlišný. Například, tedy bez záměru na jakémkoliv omezení, prvním TIE-2 ligandem je TLI a druhým TIE-2 ligandem je TL2. Vynález předpokládá jiné kombinace za použití dalších členů TIE-2 ligandové čeledi. Například jiné kombinace pro vytvoření chimemího TIE-2 ligandů jsou možné včetně, avšak bez záměru na jakémkoliv omezení, kombinací, kde první ligand je volen ze souboru zahrnujícího TLI, TL2, TL3 a TL4, a druhý ligand, odlišný od prvního ligandů, je volen ze souboru zahrnujícího TLI, TL2, TL3 a TL4.
Podstatou vynálezu je izolovaná molekula nukleové kyseliny kódující modifikovaný TIE-2 ligand. Podle jednoho provedení izolovaná molekula nukleové kyseliny kóduje TIE-2 ligand z čeledi ligandů TIE, jejímiž reprimentativními ligandy jsou TLI, TL2, TL3 a TL4, jak shora uvedeno, které jsou obměněny adicí, delecí nebo substitucí jedné nebo několika aminokyselin nebo způsobem značení například podílem Fc lidského IgG-1, přičemž jim však zůstává schopnost vázat TIE-2 receptor. Podle jiného provedení izolovaná molekula nukleové kyseliny kóduje TIE-2 ligand, který je chimerním ligandem, obsahujícím alespoň část prvního TIE-2 ligandů a alespoň část druhého TIE-2 ligandů, který je odlišný od prvního TIE-2 ligandů. Například, avšak bez záměru na jakémkoliv omezení, prvním TIE-2 ligandem je TLI a druhým
-3 CZ 295371 B6
TIE-2 ligandem je TL2. Vynález předpokládá jiné kombinace za použití dalších členů TIE-2 ligandové čeledi. Například jiné kombinace jsou možné včetně, avšak bez záměru na jakémkoliv omezení, kombinace, kdy izolovaná molekula nukleové kyseliny kóduje modifikovaný TIE-2 ligand, který je chimerní TIE-2 ligand obsahující část prvního ligandu volenou ze souboru zahrnujícího TLI, TL2, TL3 a TL4, a část druhého ligandu, odlišného od prvního ligandu, voleného ze souboru zahrnujícího TLI, TL2, TL3 a TL4.
Izolovanou nukleovou kyselinou může být ENA, cDNA nebo RNA. Vynález se také týká vektoru obsahujícího izolovanou molekulu nukleové kyseliny kódující modifikovaný TIE-2 ligand. Vynález se také týká hostitelského vektorového systému pro produkci vhodné hostitelské buňky polypeptidu majícího biologickou aktivitu modifikovaného TIE-2 ligandu. Vhodná hostitelská buňka může být bakteriální, kvasinková, hmyzí nebo savčí. Vynález se také týká způsobu produkce polypeptidu majícího biologickou aktivitu modifikovaného TIE-2 ligandu, který obsahuje rostoucí buňky hostitelského vektorového systému za podmínek umožňujících produkci polypeptidu a získání takto produkovaného polypeptidu.
Podle vynálezu popsaná izolovaná buňka nukleové kyseliny, kódující modifikovaný TIE-2 ligand, umožňuje vývoj ligandu jako terapeutického činidla pro ošetřování jedinců trpících poruchami buněk, tkání nebo orgánů, které exprimují TIE-2 receptor. Vynález se také týká protilátky, která specificky váže takovou terapeutickou molekulu. Protilátka může být monoklonální nebo polyklonální. Vynález se také týká způsobu použití takové monoklonální nebo polyklonální protilátky k měření množství terapeutické molekuly ve vzorku, odebraném pacientovi pro účely monitorování průběhu terapie.
Vynález se také týká protilátky, které specificky váže shora popsaný modifikovaný TIE-2 ligand. Protilátka může být monoklonální nebo polyklonální. Vynález se také týká farmaceutických prostředků, které obsahují protilátku, která specificky váže shora popsaný modifikovaný TIE-2 ligand, ve farmaceuticky vhodném nosiči. Vynález se také týká způsobu blokování růstu krevních cév v případě savců podáváním účinného množství terapeutického prostředku obsahujícího protilátku, která specificky váže receptor aktivující shora opsaný modifikovaný TIE-2 ligand ve farmaceuticky vhodném nosiči.
Vynález se také týká farmaceutických prostředků, které obsahují shora popsaný modifikovaný TIE-2 ligand, ve farmaceuticky vhodném nosič. Vynález se také týká způsobu podpory neovaskularizace podáváním účinného množství terapeutického prostředku obsahujícího receptor aktivující shora popsaný modifikovaný TIE-2 ligand ve farmaceuticky vhodném nosiči. Podle jednoho provedení se vynález využívá pro ošetřování ischemie. Podle ještě dalšího provedení se receptoru, aktivujícího shora popsaný modifikovaný TIE-2 ligand, využívá samotného nebo v kombinaci s jinými hematopoietickými faktory k podpoře proliferace nebo diferenciace hematopoietických kmenových buněk, B buněk nebo megakaryotických buněk.
Modifikované TIE-2 ligandy se podle vynálezu mohou konjugovat na cytotoxická činidla a na terapeutické kompozice z nich připravené. Vynález se proto dále týká receptorů, které specificky váží modifikované TIE-2 ligandy. Vynález se dále týká farmaceutických prostředků, které obsahují receptory, které specificky váží shora popsaný modifikovaný TIE-2 ligand ve farmaceuticky vhodném nosiči. Vynález se také týká způsobu blokování růstu krevních cév savců podáváním účinného množství terapeutického prostředku obsahujícího receptor, který specificky váže popsaný modifikovaný TIE-2 ligand ve farmaceuticky vhodném nosiči.
Vynález se také týká TIE-2 receptorového antagonistu a způsobu inhibice TIE-2 biologické aktivity savců, při kterém se podává savcům účinné množství TIE-2 antagonistu. Podle vynálezu může být antagonistem shora popsaný modifikovaný TIE-2 ligand, který váže, nikoliv však aktivuje TIE-2 receptor.
-4CZ 295371 B6
Vynález blíže objasňuje další podrobný popis s připojenými obrázky.
Přehled obrázků na výkresech
Obr. IA a 1B: TIE-2 receptor (TIE-2 BR) inhibuje vývoj krevních cév v kuřecí zárodečné chorioallantoické membráně (CAM). Jeden kousek resorbovatelné želatinové pěny (galforma) napuštěný 6 pg RB se vloží bezprostředně pod CAM 1 den starého kuřecího embrya. Po dalších třech dnech inkubace se 4 dny staré embryo a obklopující CAM izoluje a zkouší. Na obr. 1A je embryo ošetřené EHK-1 RB (rEHK-1 ecto/hlgGl Fc) a má normálně vinuté krevní cévy v obklopujícím CAM. Na obr. 1B jsou všechna embrya, ošetřená TIE-2 RB (r TIE-2 ecto/h IgGl Fc), mrtvá, mají zmenšenou velikost a většinou zcela bez obklopujících krevních cév.
Obr. 2: Vektor pJF 14.
Obr. 3: Restrikční mapa lambdagtlO.
Obr. 4: Nukleová kyselina a odvozená nukleová kyselina (jednopísmenový kód) sekvence lidského TIE-2 ligandu-1 z klonu lambdagtlO kódující htie-2-ligand-l.
Obr. 5: Nukleová kyselina a odvozená nukleová kyselina (jednopísmenový kód) sekvence lidského TIE-2 ligandu-1 z klonu T98G.
Obr. 6: Nukleová kyselina a odvozená nukleová kyselina (jednopísmenový kód) sekvence lidského TIE-2 ligandu-2 z klonu pBluescript KS kódující lidský TIE-2 ligand 2.
Obr. 7: Western blot ukazující aktivaci TIE-2 receptoru TIE-2 ligandem 1 (pas LI) nikoliv však TIE-2 ligandem 2 (pas L2) nebo kontrola (Mock).
Obr. 8: Western blot ukazující prioritní ošetření HAEC buněk s nadbytkem TIE-2 ligandu 2 (pás L2) antagonizuje následující schopnost ředit TIE-2 ligand 1 k aktivaci TIE-2 receptoru (TIE2-R) ve srovnání s prioritním ošetřením HAEC buněk prostředím Mock (Mock).
Obr. 9: Western blot ukazující schopnost TL2 konkurenčně inhibovat TL-1 aktivaci TIE-2 receptoru za použití lidské buněčné hybridní linie EA.hy926.
Obr. 10: Histogram ukazující vázání na krysí TIE-2 IgG imobilizovaný povrch TIE-2 ligandu vC2C12 ras, Rat2 ras, Shep a T98G koncentrovaných (10 X) kondicionovaným prostředím. Krysí TIE-2 (rTIE2) specifické vázání je doloženo významnou redukcí aktivity vázání v přítomnosti 25 pg/ml rozpustného kiysího TIE-2 RB ve srovnání s menší redukcí v přítomnosti rozpustného trkB RB.
Obr. 11: Vázání rekombinantního lidského TIE-2 ligandu 1 (hTLl) a lidského TIE-2 ligandu 2 (hTL2) v COS buněčných supernatantech na lidský TIE 2 receptorový (RB) imobilizovaný povrch. Lidské TIE-2-specifícké vázání se stanovuje inkubací vzorků s 25 pg/ml buď rozpustného lidského TIE-2 RB, nebo trkB RB; významné snížení aktivity vázání se pozoruje toliko pro vzorky inkubované s lidským TIE-2 RB.
Obr. 12: Western blot ukazující, že TIE-2 receptor (označovaný jako TIE-2 RB nebo jako zde TIE-2-FC) blokuje aktivaci TIE-2 receptorů TIE-2 ligandem 1 (TLI) vHUVEC buňkách, zatímco nepříbuzný receptor (TRKB-Fc) neblokuje tuto aktivaci.
Obr. 13: Agarové gely ukazují sériové ředění [nezředěno (1) až 10'4] TLI a TL2 RT-PCR produktů získaných z El4.5 myších fatálních jater (pásy 1 -totál, pásy 3 - stromálně obohaceno
-5CZ 295371 B6 a pásy 4 c-kit+TERl 19 hematopoietické prekurzorové buňky) a E14.5 myší fetální thymus (pásy 2 - totál).
Obr. 14: Agarové gely ukazují sériové ředění [nezředěné (1) až 10'3] TLI a TL2 RT-PCR produktů získaných z kortikálních trámčinových buněk E14.5 myšího fetálního thymu (pásy 1 - CDR1 + /A2B5-) a z medulámích trámčinových buněk (pásy CDR1 + /A2B5+).
Obr. 15: Schéma hypotetické úlohy TIE-2/TIE ligandů v angiogenezi. TLI je představované (o), TL2 je představované (x), TIE-2 je představované (T), VEGF je přestavované ([]) a fikl (VEGF receptor) je představované (Y).
Obr. 16: In šitu hybridizační sklíčka ukazující dočasné expresní vzorce TIE-2, TLI, TL2 a VEGF v průběhu angiogeneze, spojené s folikulámím vývojem a tvořením corpus luteum ve vaječníku krys ošetřených sérem březí klisny. Sloupec 1: časný předovulační folikul; sloupec 2: předovulační folikul; sloupec 3: časný corpus luteum; a sloupec 4: atretický folikul; řádek A: široké pole; řádek B: VEGF; řádek C: TL2; řádek D: TLI; a řádek E: TIE-2 receptor.
Obr. 17: Srovnání aminokyselinových sekvencí zralého TLI proteinu a zralého TL2 proteinu. TLI sekvence je stejná jako obr. 4 stou výjimkou, že zdánlivá vedoucí sekvence se odstranila. Podobně TL2 sekvence je stejná jako sled podle obr. 6 s tou výjimkou, že zdánlivá vedoucí sekvence se odstranila. Šipky naznačují zbytky Arg49, Cys245 a Arg264 z TLI, což odpovídá zbytkům aminokyselin v poloze 69,265 a 284 nebo TLI podle obr. 4.
Obr. 18: Western blot kovalentní multimemí struktury TLI a TL2 (panel A) a interkonverze TLI a TL2 mutací jednoho cysteinu (panel B).
Obr. 19: Typická křivka TIE-2-IgG vázání k ímobilizovanému TLI ve kvantitativním testu vázání v nepřítomnosti buněk.
Obr. 20: Typická křivka ukazující TIE-2 ligand 1 ligandové části obsahující fibrinogenu podobnou doménu ligandu vázaného na Fc doménu IgG (TLl-fFc) vázání k imobilizované TIE-2 ectodoméně ve kvantitativním testu vázání v nepřítomnosti buněk.
Obr. 21: Nukleotid a odvozená aminokyselina (jednopísmenový kód) sekvence TIE ligand 3. Kódující sekvence startuje v poloze 47. Fibrinogenu podobná doména startuje v poloze 929.
Obr. 22: Srovnání aminokyselinových sekvencí TIE ligandových členů čeledi. mTL3 je myší TIE ligand-3; hTLl je lidský TIE-2 ligand-1; chTLl je kuřecí TIE-2 ligand-1; mTLl je myší TIE-2 ligand-1; mTL2 je myší TIE-2 ligand-2; hTL2 je lidský TIE-2 ligand-2. Orámované oblasti indikují konzervované regiony homologu mezi členy čeledi.
Obr. 23: Nukleotid a odvozená aminokyselina (jednopísmenový kód) sekvence TIE ligand 4. Šipka indikuje nukleotidovou pozici 569.
Obr. 24: Nukleotid a odvozená aminokyselina (jednopísmenový kód) chimemího TIE ligandu označeného 1N1C2F (chiméra 1). Údajná vedoucí sekvence se kóduje nukleotidy 1-60.
Obr. 25: Nukleotid a odvozená aminokyselina (jednopísmenový kód) chimemího TIE ligandu označeného 2N2C1F (chiméra 2).Údajná vedoucí sekvence se kóduje nukleotidy 1-48.
Obr. 26: Nukleotid a odvozená aminokyselina (jednopísmenový kód) chimemího TIE ligandu označeného 1N2C2F (chiméra 3). Údajná vedoucí sekvence se kóduje nukleotidy 1-60.
Obr. 27: Nukleotid a odvozená aminokyselina (jednopísmenový kód) chimemího TIE ligandu označeného 2N1C1F (chiméra 4). Údajná vedoucí sekvence se kóduje nukleotidy 1-48.
-6CZ 295371 B6
Další podrobný popis je zaměřen na vytvořené nové modifikované TIE-2 ligandy, které váží TIE-2 receptor. Vynález se týká kompozice obsahující modifikovaný TIE-2 ligand v podstatě prostý jiných proteinů. Modifikovaným TIE-2 ligandem se míní ligand TIE čeledi ligandů, jejíž 5 reprezentanty obsahují ligandy TLI, TL2, TL3 a TL4, který je obměněn adicí, delecí nebo substitucí jedné nebo několika aminokyselin nebo značením například PC podílu lidského IgG, který si však ponechává schopnost vázat TIE-2 receptor. Modifikovaný TIE-2 ligand zahrnuje také chimemí TIE-2 ligand, obsahující alespoň podíl prvního TIE-2 ligandu a podíl druhého TIE-2 ligandu, který je odlišný od prvního podílu TIE-2 ligandu. Příkladně, bez záměru na 10 jakémkoliv omezení, je prvním TIE-2 ligandem TLI a druhým TIE-2 ligandem je TL2. Vynález předpokládá možnost jiné kombinace pro vytváření TIE-2 ligandu členů čeledi. Například jiné kombinace pro vytváření chimerního TIE-2 ligandu jsou možné včetně, bez záměru na jakémkoliv omezení, kombinací, kdy první ligand je volen ze souboru zahrnujícího TLI, TL2, TL3 a TL4 a druhý ligand, odlišný od prvního ligandu, je volen ze souboru zahrnujícího TLI, 15 TL2, TL3aTL4.
Vynález se rovněž týká izolované molekuly nukleové kyseliny kódující modifikovaný TIE-2 ligand. Podle jednoho provedení izolovaná molekula nukleové kyseliny kóduje TIE-2 ligand rodiny TIE ligandů, jehož reprezentanty zahrnují shora popsané ligandy TLI, TL2, TL3 a TL4, 20 které jsou obměněny adicí, delecí nebo substitucí jedné nebo několika aminokyselin nebo značením například PC podílu lidského IgG-1, který si však ponechává schopnost vázat TIE-2 receptor. Podle jiného provedení izolovaná molekula nukleové kyseliny kóduje modifikovaný TIE-2 ligand, který je chimemím TIE-2 ligandem, obsahujícím alespoň podíl prvního TIE-2 ligandu a podíl druhého TIE-2 ligandu, který je odlišný od prvního podílu. Příkladně, bez záměru 25 na jakémkoliv omezení, je prvním TIE-2 ligandem TLI a druhým TIE-2 ligandem TL2. Vynález předpokládá jiné kombinace za použití přídavných členů TIE-2 ligandové čeledi. Například jsou možné další kombinace zahrnující příkladně, bez záměru na jakémkoliv omezení, kombinace, ve kterých izolovaná molekula nukleové kyseliny kóduje modifikovaný TIE-2 ligand, který je chimemím TIE-2 ligandem obsahujícím podíl prvního ligandu voleného ze souboru zahrnujícího 30 TLI, TL2, TL3 a TL4 a podíl druhého ligandu, odlišného od prvního ligandu, voleného ze souboru zahrnujícího TLI, TL2, TL3 a TL4.
Vynález zahrnuje modifikované TIE-2 ligandy a jejich aminokyselinové sekvence jakož také jejich funkční ekvivalentní varianty, jakož také proteiny nebo peptidy zahrnující substituci, delecí 35 nebo inserci mutantů popsaných sekvencí, které váží TIE-2 receptor a působí jako jejich agonisty nebo antagonisty. Takové varianty zahrnují přísady, kdy jsou aminokyselinové zbytky nahrazeny zbytky v sekvenci vedoucí ke změně bez zřejmých příznaků. Například jeden nebo několik aminokyselinových zbytků v sekvenci mohou být nahrazeny alespoň jednou jinou aminokyselinou s podobnou polaritou, která působí jako funkční ekvivalent vedoucí ke obměně bez zřejmých 40 příznaků. Substituenty pro aminokyselinu v rámci sekvence mohou být voleny z jiných členů třídy, do které aminokyselina patří. Například třída nepolárních (hydrofobních) aminokyselin zahrnuje alanin, leucin, isoleucin, valin, prolin, fenylalanin, tryptofan a methionin. Polární neutrální aminokyseliny zahrnují glycin, serin, threonin, cystein, tyrozin, asparagin a glutamin. Aminokyseliny s pozitivním nábojem (zásadité) zahrnují arginin, lysin a histidin. Aminokyseliny 45 s negativním nábojem (kyselé) zahrnují asparagovou a glutamovou kyselinu.
Vynález zahrnuje také proteiny nebo fragmenty jejich derivátů, které mají stejnou nebo podobnou aktivitu jako shora popsané definované TIE-2 ligandy a deriváty, které jsou odlišně modifikovány v průběhu translace nebo po ní, například glykosylací, proteolytickým štěpením, 50 vázáním na protilátkovou molekulu nebo na jiný buněčný ligand. Funkčně ekvivalentní molekuly také zahrnují molekuly, které obsahují modifikace, N-koncové modifikace, které jsou výsledkem exprese v určitém rekombinantním hostiteli, jako jsou například N-koncová modifikace, ke kterým dochází v určitých bakteriálních (například E. coli) expresních systémech.
Vynález zahrnuje také nukleotidové sekvence, které kódují shora popsané proteiny jako modifikované TIE-2 ligandy, jakož také hostitelské buňky, včetně kvasinek, bakterií, virů a savčích buněk, které jsou geneticky upraveny k produkci proteinů, například transfekci, transdukcí, infekcí, elektroporací nebo mikroinjekcí nukleové kyseliny, kódující shora popsané modifikované TIE-2 ligandy do vhodného expresního vektoru. Vynález také zahrnuje zavádění nukleové kyseliny kódující modifikované TIE-2 ligandy technikou genové terapie, popsanou v literatuře (například Finkel a Epstein FASEB J. 9, str. 843 až 851, 1995; Guzman a kol. PNAS (USA) 91, str. 10732 až 10736, 1994).
Pracovníkům v oboru je zřejmé, že vynález zahrnuje DNA a RNA sekvence, které hybridizují na modifikovaném TIE-2 ligandu kódující nukleotidové sekvence za podmínek mírné tvrdosti, jak je objasněno v literatuře (například Sambrook a kol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. vydání, svazek 1, str. 101 až 104, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Proto molekula nukleové kyseliny, uvažovaná podle vynálezu, zahrnuje molekulu mající nukleotidovou sekvenci odvozenou z aminokyselinové sekvence modifikovaného TIE-2 ligandu, jak shora popsáno, stejně jako molekulu mající sekvenci nukleotidů, které hybridizují na takové nukleotidové sekvenci a také nukleotidovou sekvenci, která je produktem odbourání shora popsané sekvence jakož výsledek genetického kódu, která však kóduje ligand, který váže TIE-2 receptor a která má aminokyselinovou sekvenci a jiné primární, sekundární a terciární charakteristiky, které jsou dostatečně duplikační shora popsaného modifikovaného TIE-2 ligandu, takže dodávají molekule stejnou biologicky aktivitu jako je shora popsaný modifikovaný TIE-2 ligand.
Vynález se týká izolované molekuly nukleové kyseliny kódující modifikovaný TIE-2 ligand, který váže a aktivuje TIE-2 receptor obsahující nukleotidovou sekvenci kódující TIE-2 ligand 1, přičemž podíl nukleotidové sekvence, který kóduje N-koncovou doménu TIE-2 ligandu 1, je nahrazen nukleotidovou sekvencí, která kóduje N-koncovou doménu TIE-2 ligandu 2. Vynález se také týká takové molekuly nukleové kyseliny s další modifikací, přičemž podíl nukleotidové sekvence, který kóduje smyčkově stočenou doménu TIE-2 ligandu 1 je nahrazen nukleotidovou sekvencí, která kóduje smyčkově stočenou doménu TIE-2 ligandu 2.
Vynález se také týká izolované molekuly nukleové kyseliny kódující modifikovaný TIE-2 ligand, který váže a aktivuje TIE-2 receptor obsahující nukleotidovou sekvenci kódující TIE-2 ligand 1, přičemž podíl nukleotidové sekvence, který kóduje N-koncovou doménu TIE-2 ligandu 1, je nahrazen nukleotidovou sekvencí, která kóduje N-koncovou doménu TIE-2 ligandu 2 a který je dále modifikován ke kódování odlišné aminokyseliny místo cysteinového zbytku kódovaného nukleotidu 784-787, jak je objasněno na obr. 27. Serinový zbytek je s výhodou nahrazen za cysteinový zbytek. Podle jiného provedení je molekula nukleové kyseliny modifikována ke kódování odlišné aminokyseliny místo argininového zbytku kódovaného nukleotidy 199-201, jak je objasněno na obr. 27. Serinový zbytek je s výhodou nahrazen za argininový zbytek.
Vynález se také týká izolované molekuly nukleové kyseliny kódující modifikovaný TIE-2 ligand, který váže a aktivuje TIE-2 receptor obsahující nukleotidovou sekvenci kódující TIE-2 ligand 1, který je modifikován ke kódování odlišné aminokyseliny místo cysteinového zbytku aminokyseliny v pozici 245. Serinový zbytek je s výhodou nahrazen za cysteinový zbytek.
Vynález se dále týká izolované molekuly nukleové kyseliny kódující modifikovaný TIE-2 ligand, který váže avšak neaktivuje TIE-2 receptor obsahující nukleotidovou sekvenci kódující TIE-2 ligand 1, přičemž podíl nukleotidové sekvence, který kóduje N-koncovou doménu TIE-2 ligandu 1, je vypuštěn. Vynález se dále týká molekuly nukleové kyseliny dále modifikované tak, že podíl nukleotidové sekvence, který kóduje smyčkově stočenou doménu TIE-2 ligandu 1, je vypuštěn a podíl, který kóduje fibrinogenovou doménu je fúzován ve struktuře do nukleotidové sekvence kódující lidský imunoglobulinový gamma-1 konstantní region (IgG Fc).
Vynález se dále týká izolované molekuly nukleové kyseliny kódující modifikovaný TIE-2 ligand, který váže avšak neaktivuje TIE-2 receptor obsahující nukleotidovou sekvenci kódující
-8CZ 295371 B6
TIE-2 ligand 2, přičemž podíl niikleotidové sekvence, který kóduje N-koncovou doménu TIE-2 ligandů 2, je vypuštěn. Vynález se dále týká molekuly nukleové kyseliny dále modifikované tak, že podíl nukleotidové sekvence, který kóduje smyčkově stočenou doménu TIE-2 ligandů 2, je vypuštěn a podíl, který kóduje fíbrinogenovou doménu je fúzován ve struktuře do nukleotidové sekvence kódující lidský imunoglobulinový gamma-1 konstantní region (IgG Fc).
Vynález se dále týká izolované molekuly nukleové kyseliny kódující modifikovaný TIE-2 ligand, který váže avšak neaktivuje TIE-2 receptor obsahující nukleotidovou sekvenci kódující TIE-ligand 1, přičemž podíl nukleotidové sekvence, který kóduje N-koncovou doménu TIE-2 ligandů 1, je nahrazen nukleotidovou sekvencí, která kóduje fíbrinogenovou doménu TIE-2 ligandů 2. Vynález se dále týká molekuly nukleové kyseliny dále modifikované tak, že podíl nukleotidové sekvence, který kóduje smyčkově stočenou doménu TIE-2 ligandů 1, je nahrazen nukleotidovou sekvencí, které kóduje smyčkově stočenou doménu TIE-2 ligandů 2.
Vynález se dále týká modifikovaného TIE-2 ligandů zakódovaného jakýmikoliv molekulami nukleové kyseliny podle vynálezu.
Vynález se také týká chimemího TIE-2 ligandů obsahujícího alespoň část prvního TIE-2 ligandů a alespoň část druhého TIE-2 ligandů, který je odlišný od prvního TIE-2 ligandů, přičemž jsou první a druhé TIE-2 ligandy voleny ze souboru zahrnujícího TIE-2 ligand 1, TIE-2 ligand 2, TIE ligand 3 a TIE ligand 4. Výhody chimemí TIE-2 ligand obsahující alespoň část TIE-2 ligandů 1 a alespoň část TIE-2 ligandů 2.
Vynález se týká molekuly nukleové kyseliny, která kóduje chimemí TIE ligand, jak je uvedeno na obr. 24, 25, 26 nebo 27. Vynález se také týká chimemího ligandů podle obr. 24, 25, 26 nebo 27. Vynález se také týká chimemího ligandů podle obr. 27, modifikovaného tak, aby měl odlišnou aminokyselinu místo cysteinového zbytku kódovaného nukleotidy 784-787.
Jakéhokoliv způsobu, známého pracovníkům v oboru pro inserci DNA fragmentů do vektoru, se může používat pro konstrukci expresního vektoru kódujícího modifikovaný TIE-2 ligand za použití vhodných transkripčních/translačních kontrolních signálů a proteinových kódujících sekvencí. Tyto způsoby mohou zahrnovat in vitro rekombinantní DNA a syntetické technicky a in vivo rekombinaci (genetická rekombinace). Exprese sekvence nukleové kyseliny kódující modifikovaný TIE-2 ligand nebo jejich peptidové fragmenty se může regulovat druhou sekvencí nukleové kyseliny, která je operativně vázána na modifikovaný TIE-2 ligand kódováním sekvence tak, že je modifikovaný TIE-2 ligandový protein nebo peptid expresován v hostiteli transformovaném rekombinantní DNA molekulou. Například exprese modifikovaného TIE-2 ligandů, zde popsaná, se může řídit jakýmkoliv systémem promotor/podporovač, známým v oboru. Promotory, kteiých se může používat k řízení exprese ligandů zahrnují, bez záměru na jakémkoliv omezení, dlouhou koncovou repetici, popsanou v literatuře (Squinto a kol., Cell 65, str. 1 až 20, 1991); SV40 časný promotorový region (Bemoist a Chambon, Nátuře 290, str. 304 až 310), CMV promotor, M-MuLV 5' koncovou repetici, promotor obsažený ve 3' dlouhé koncové repetici viru Rous sercoma (Yamamoto a kol., Cell 22, str. 787 až 797, 1980), oparový thimidinkinázový promotor (Wagner a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 78, str. 144 až 145, 1981), adenovirový promotor, regulační sekvence metallothioneinového genu (Brinster a kol., Nátuře 296, str. 39 až 42, 1982), prokaryotické expresní vektory, například β-laktamázový promotor (Villa-Kamaroff a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 75, str. 3727 až 3731, 1978) nebo tac promotor (DeVoer a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 80, str. 21 až 25, 1983), viz také „Useful proteins from recombinant bacteria“ (Scientific Američan 242, str. 74 až 94, 1980); promotorové prvky z kvasinek nebo z jiných hub, například GAL 4 promotor, ADH (alkoholdehydrogenázový) promotor, PGK (fosfoglycerolkinázový) promotor, alkalický fosfatázový promotor a následující živočišné transkripční řídicí regiony, které specificky exhibují tkáň a použily se v transgenních živočiších; elastázový I genový řídicí region, který je aktivní v pankreatických acinárních buňkách (Swift a kol., Cell 38, str. 639 až 646, 1984; Ornitz a kol., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50, str. 399 až 409, 1986; Mac Donald, Hepatology 7, str. 425 až 515,
-9CZ 295371 B6
1987); inzulínový gen řídící region, který je aktivní v pankreatických β buňkách (Hanahan, Nátuře 315, str. 115 až 122, 1985); imunoglobulinový gen řídící region, který je aktivní v lymfoidních buňkách (Grosscheld a kol., Cell 38, str. 647 až 658, 1984; Adames a kol., Nátuře 318, str. 533 až 538, 1985; Alexander a kol., Mol. Cell. Biol. 7, str. 1436 až 1444, 1987) myší prsní nádorový virový řídící region, který je aktivní v testikulámích, v prsních a vžírných buňkách (Leder a kol., Cell 45, str. 485 až 495, 1986), albuminový gen řídící region, který je aktivní v játrech (Pinkert a kol., Genes and Devel 1, str. 268 až 276, 1987), α-fotoproteinový gen řídící region, který je aktivní v játrech (Krumlauf a kol., Mol. Cell. Biol. 5, str. 1639 až 1648, 1985; Hammer a kol., Science 235, str. 53 až 58, 1987); a 1-antitrypsinový gen řídící region, který je aktivní v játrech (Kelsey a kol., Genes and Devel. 1, str. 161 až 171, 1987), β-globinový gen řídící region, který je aktivní v myeloidních buňkách (Morgan, a kol., Nátuře 315, str. 338 až 340, 1985; Kollias a kol., Cell 46, str. 89 až 94, 1986); myelinový bazický proteinový gen řídící region, který je aktivní v oligodendrocytech v mozku (Readhead a kol., Cell 48, str. 703 až 712, 1987); myosinový lehký řetězcový-2 gen řídící region, který je aktivní ve skeletálních svalech (Shání, Nátuře 314, str. 283 až 286, 1985) a genadotropní hormon uvolňující gen řídící region, který je aktivní v hypothalamu (Mason a kol., Nátuře 234, str. 1372 až 1378, 1986). Vynález dále zahrnuje produkci antimediátorových sloučenin, které jsou schopny specifické hybridizace se sekvencí RNA kódující modifikovaný TIE-2 ligand k modulaci jeho exprese (Ecker, americký patentový spis US 5 166 195, 24. listopadu 1992).
Podle vynálezu se expresní vektory, schopné replikace v bakteriálním nebo v eukaryotickém hostiteli obsahujícím nukleovou kyselinu kódující modifikovaný TIE-2 ligand, jak shora popsáno, používají pro transfektování hostitele a tím k přímé expresi takové nukleové kyseliny k produkci modifikovaného TIE-2 ligandu, který se může získat v biologicky aktivní formě. Biologicky aktivní forma zde zahrnuje formu schopnou vázat TIE receptor a vyvolávat biologickou odezvu, jako diferenciovanou funkci nebo ovlivňovat fenotyp buňky exprimující receptor. Takové biologicky aktivní formy mohou například navozovat fosfory láci tyrozinkinázové domény TIE receptoru. Nebo biologická aktivita může být jevem, jako je antagonist k TIE receptoru. V alternativním provedení je aktivní formou modifikovaného TIE-2 ligandu forma, která může rozeznávat TIE receptor a tím působit jako terčové činidlo pro receptor pro použití k diagnostickým i k terapeutickým účelům. Podle tohoto provedení vynálezu aktivní forma nemusí dodávat žádné TIE expresní buňce žádnou změnu fenotypu.
Expresní vektory obsahující genové inserty mohou být identifikovány prostřednictvím čtyř obecných přístupů: (a) DNA-DNA hybridizace, (b) přítomnost nebo nepřítomnost funkcí „markerového“ genu, (c) exprese včleněných sekvencí a (d) PCR detekce. Podle prvního přístupu se může zjišťovat přítomnost cizího genu, včleněného do expresního vektoru DNA-DNA hybridizací za použití nukleotidových sond obsahujících sekvence, které jsou homologické se zřetelem na včleněný modifikovaný TIE-2 ligand kódující gen. Podle druhého přístupu se může identifikovat rekombinantní systém vektor/hostitel a selektovat na základě přítomnosti nebo nepřítomnosti funkcí „markerového“ genu (například thimidinkinázové aktivity, odolnosti proti antibiotikům, transformačního fenotypu, vytváření okluzní látky vbaculoviru) způsobujících inserci cizích genů do vektoru. Například jestliže se včlení nukleová kyselina kódující modifikovaný TIE-2 ligand v markerové genové sekvenci vektoru, mohou se identifikovat rekombinanty nepřítomností markerové genové funkce. Podle třetího přístupu se mohou identifikovat rekombinantní expresní vektory zjištěním cizího genového produktu exprimovaného rekombinantem. Taková zjištění mohou být založena například na fyzikálních nebo na funkčních vlastnostech modifikovaného TIE-2 ligandového genového produktu, například vázáním ligandu na TIE receptor nebo na jeho část, která se může značit například zjistitelnou protilátkou nebo její částí nebo vázáním protilátek, produkovaných proti modifikovanému TIE-2 ligandovému proteinu nebo jeho části. Buňky podle vynálezu mohou přechodně, konstitučně nebo trvale exprimovat modifikovaný TIE-2 ligand, jak shora uvedeno. Podle čtvrtého přístupu se mohou připravovat DNA nukleotidové primery odpovídající smyčkové specifické DNA sekvenci. Tyto primery se mohou používat pro PCR smyčkový fragment (PCR Protocols: A Guide To Methods and Applications, vydavatel Michael A. Innis a kol., Academie Press, 1990).
-10CZ 295371 Β6
Rekombinantní ligand se může čistit jakýmkoliv způsobem, kteiý umožňuje následující vytvoření stabilního, biologicky aktivního proteinu. S výhodou se ligand vylučuje do kultivačního prostředí, ze kterého se získal. Nebo se ligand může získat z buněk buď ve formě rozpustných proteinů, nebo jako inkluzní látky, ze kterých se může kvantitativně extrahovat 8M guanidiniumhydrochloridem a dialýzou o sobě dobře známými způsoby. Pro další čištění ligandu se může používat afínitní chromatografie, konvenční ionexové chromatografíe, hydrofobní interakční chromatografie, reverzní fázové chromatografíe nebo gelové filtrace.
Podle přídavného provedení vynálezu, podrobněji popsaného v příkladech, se může modifikovaný TIE-2 ligand kódující gen používat pro inaktivaci nebo „knock out“ endogenního genu homologovou rekombinací a tím k vyváření TIE ligandu postrádajícího buňky, tkáně nebo živočichy. Například, bez záměru na jakémkoliv omezení, se může konstruovat rekombinantní TIE ligand-4 kódující gen obsahující insercionální mutaci, například neo gen. Takový konstrukt za řízení vhodného promotoru, se může zavádět do buňky, jako je zárodečná kmenová buňka, způsobem například transfekce, transdukce nebo injekce. Buňky, obsahující konstrukt, se pak mohou selektovat G418 odolností. Buňky prosté intaktní TIE ligand-4 kódujícího genu se pak mohou identifikovat například způsobem Southern blotting, PCR detekce, Northem blotiing nebo zkouškou exprese. Buňky prosté intaktní TIE ligand-4 kódujícího genu se pak mohou fúzovat na časné zárodečné buňky pro generaci transgenických živočichů prostých takového ligandu. Takoví živočichové se mohou používat k definici zvláště ve in vivo procesech, normálně závislých na ligandech.
Vynález se také týká protilátek k modifikaci popsaného TIE-2 ligandu, který je užitečný pro detekci ligandu například pro diagnostické účely. Pro přípravu monoklonálních protilátek, zaměřených na modifikovaný TIE-2 ligand, se může používat jakéhokoliv způsobu pro produkci protilátkových molekul kontinuálními buněčnými liniemi v kultuře. Například do rozsahu vynálezu patří technika hybridomu, kterou vyvinul Kohled a Milstein (Nátuře 256, str. 495 až 497, 1975), jakož také technika triomu, technika lidského B-buňky hybridomu (Kozbor a kol., Immunology Today 4, str. 72, 1983) a technika EBV-hybridomu pro produkci lidských monoklonálních protilátek (Cole a kol., „Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy“ Alan R. Liss, lne., str. 77 až 96, 1985).
Monoklonálními protilátkami mohou být lidské monoklonální protilátky nebo chimemí lidskomyší (nebo jiného typu) monoklonální protilátky. Lidské monoklonální protilátky se mohou vyrábět četnými způsoby, známými ze stavu techniky (například Tang a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 80, str. 7308 až 7312, 1983; Kozbor a kol., Immunology Today 4, str. 72 až 79, 1982; Olsson a kol. Meth. Enzymol 92, str. 3 až 16, 1982). Mohou se připravovat molekuly chimemí protilátky obsahující myší antigen vázající doménu s lidskými konstantními regiony (Morrison a kol., Proč. Nati. Acad. Sci U.S.A. 81, str. 6851, 1984; Takeda a kol., Nátuře 314, str. 452, 1985).
Mohou se použít různé způsoby, známé ze stavu techniky pro produkci polyklonálních protilátek na epitopy modifikovaného shora popsaného TIE-2 ligandu. Pro výrobu protilátky se mohou imunizovat různí hostitelé, přičemž se příkladně, tedy bez záměru na jakémkoli omezení, uvádějí králíci, myši a krysy, vstřikováním modifikovaného TIE-2 ligandu nebo jeho fragmentu nebo derivátu. Mohou se používat různá pomocná činidla ke zvýšení imunologické odezvy v závislosti na druhu hostitele a včetně, avšak bez záměru na jakémkoliv omezení, Freudova činidla (kompletního a nekompletního), minerálních gelů, jako je hydroxid hlinitý, povrchově aktivních látek, jako jsou lysolecithin, pluronických polyolů, polyaniontů, peptidů, olejových emulzí, hemocyaninů, dinitrofenolu a potenciálně užitečných lidských pomocných činidel, jako je BCG (Bacille Calmette-Guerin) a Corynebacterium parvum.
Molekulární klon protilátky k selektovanému modifikovanému TIE-2 ligandovému epitelu se může připravovat o sobě známým způsobem. Rekombinantní DNA metodika (například Maniatis
-11 CZ 295371 B6 a kol., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1982) se může používat ke konstruování sekvencí nukleové kyseliny, které kódují monoklonální protilátkovou molekulu nebo region vázání její protilátky.
Vynález se týká protilátkových molekul a fragmentů takových protilátkových molekul. Protilátkové fragmenty, které obsahují idiotyp molekuly, se mohou generovat o sobě známými způsoby. Například takové fragmenty zahrnují například, tedy bez záměru na jakémkoliv omezení. F(ab')2 fragment, který se může produkovat pepsinovou digescí protilátkové molekuly; Fab' fragmenty, které se mohou generovat redukcí disulfídických můstků F(ab')2 fragmentu a Fab fragmenty, které se generují zpracováním protilátkové molekuly papainem a redukčním činidlem. Protilátkové molekuly se mohou čistit o sobě známými způsoby, například imunoabsorpční nebo imunoafínitní chromatografíí, chromatografíckými způsoby, jako je HPLC (vysoce účinná kapalinová chromatografie) nebo kombinacemi těchto způsobů.
Vynález zahrnuje imunozkoušku pro měření množství modifikovaného TIE-2 ligandu v biologických vzorcích, při které se
a) uvádí do styku biologický vzorek s alespoň jednou protilátkou, která specificky váže modifikovaný TIE-2 ligand, takže protilátka vytváří komplex s jakýmkoliv TIE-2 ligandem obsaženým ve vzorku a
b) měří se množství komplexu a tím se měří množství modifikovaného ΉΕ-2 ligandu v biologickém vzorku.
Vynález dále zahrnuje zkoušku pro měření množství TIE-2 receptoru v biologických vzorcích, při které se
a) uvádí do styku biologický vzorek s alespoň jedním ligandem podle vynálezu, takže ligand vytváří komplex s jakýmkoliv TIE-2 receptorem a
b) měří se množství komplexu a tím se měří množství modifikovaného TIE-2 receptoru v biologickém vzorku.
Vynález se také týká využití modifikovaného TIE-2 ligandu, který aktivuje TIE-2 receptor, jak shora popsáno k podpoře přežití a/nebo růstu a/nebo migrace a/nebo diferenciace TIE-2 buněk exprimujících receptor. Ligand se tak může využít jako doplněk nosiče, například endoteliových buněk v kultuře.
Kromě toho vytvoření modifikovaného TIE-2 ligandu pro TIE-2 receptor umožňuje využít testovacích systémů užitečných pro identifikaci agonistů nebo antagonistů TIE-2 receptoru. Takové testovací systémy by mohly být užitečné v identifikačních molekulách schopných podpory nebo inhibice angiogeneze. Například podle jednoho provedení se mohou antagonisty TIE-2 receptoru identifikovat jako testovací molekuly, které jsou schopny interference s interakcí TIE-2 receptoru s modifikovaným TIE-2 ligandem, který váže TIE-2 receptor. Takové antagonisty se identifikují svojí schopností 1) blokovat vázání biologicky aktivního modifikovaného TIE-2 ligandu na receptor při měření například za použití technologie BIAcore biosenzor (BIAcore, Pharmacia Biosensor, Piscataway. NJ) nebo 2) blokovat schopnost biologicky aktivního modifikovaného TIE-2 ligandu vyvolávat biologickou odezvu. Takové biologické odezvy zahrnují příkladně, bez záměru na jakémkoliv omezení, fosforylaci TIE receptory nebo složek TIE signálu transdukční cestou nebo přežití, růst nebo diferenciaci TIE receptor nesoucích buněk.
Podle jednoho provedení buňky, směrované k expresi TIE receptoru, mohou být závislé pro růst na přidání modifikované TIE-2 ligandu. Takové buňky poskytují užitečné testovací systémy pro
-12CZ 295371 B6 identifikaci přídavných agonistů TIE receptoru nebo antagonistů schopných rušit aktivitu modifikovaného TIE-2 ligandu na takové buňky. Na autocrinní buňky, upravené ke schopnosti koexprese jak modifikovaného TIE-2 ligandu, tak receptoru, mohou být užitečnými systémy možných agonistů nebo antagonistů.
Vynález proto umožňuje zavedení TIE-2 receptoru do buněk, které by normálně neexprimovaly tento receptor a tak umožňuje těmto buňkám vytvářet výrazné a snadno rozlišitelné odezvy na ligand, který váže tento receptor. Typ vyvolané odezvy závisí na použití buňce a nikoliv na specifickém receptoru, zavedeném do buňky. Mohou se volit vhodné buněčné linie k dosažení odezvy největší užitečnosti pro posouzení i pro objevení molekul, které působí jako receptory tyrozinkinázy. Těmito molekulami může být jakýkoliv typ molekuly včetně, tedy bez záměru na jakémkoliv omezení, peptidových a nepeptidových molekul, které působí v popisovaných systémech receptorově specifickým způsobem.
Jeden z četných použitelných systémů zahrnuje zavedení TIE receptoru (nebo chimemího receptoru obsahujícího mimobuněčnou doménu jiné receptorové tyrozinkinázy, jako například trkC a vnitřní buněčnou doménu TIE receptoru) do fibroblastové buněčné linie (například NIH3T3 buňky), takže receptor, kteiý normálně nezprostředkovává proliferaktivní nebo jiné odezvy, může po zavedení do fibroblastů být nicméně testován různými dobře známými způsoby ke kvantitativnímu stanovení fibroblastových růstových faktorů (například začlenění thymidinu) nebo jiných typů zkoušek proliferace (van Zoelen, „The Use Of Biological Assay For Detection Of Polypeptide Growth Factors“, Progress, Factor Research, svazek 2, str. 131 až 152, 1990; Zhan a M. Goldfarb, Mol. Cell. Biol. svazek 6, st. 3541 až 3544, 1986). Tyto testy mají přídavnou výhodou, že se může zkoušet jakýkoliv preparát jak buněčné linie se zavedeným receptorem, tak mateřské buněčné linie bez receptoru; posuzují se toliko jevy na buněčné linie s receptorem zprostředkovávané zavedením receptoru. Takové buňky mohou být dále upravovány k expresi modifikovaného TIE-2 ligandu za vytváření autokrinního systému užitečného pro zkoušení molekul, které působí jako antagonisty/agonisty pro toto vzájemné působení. Vynález tak umožňuje pro hostitelské buňky, obsahující nukleovou kyselinu, kódovat modifikovaný TIE2 ligand a nukleovou kyselinu zakóduj ící TIE receptor.
Interakce TIE receptor/modifikovaný TIE-2 ligand také poskytuje užitečný systém pro identifikaci malých molekulových agonistů nebo antagonistů TIE receptoru. Například fragmenty, mutanty nebo deriváty modifikovaného TIE-2 ligandu umožňují další charakterizaci aktivních podílů molekuly. Identifikace ligandu umožňuje také stanovení rentgenové krystalové struktury komplexu receptor/ligand, čímž je umožněna identifikace vázajícího míst na receptor. Znalost vázající místa se jeví užitečná pro racionální konstrukci nových agonistů a antagonistů.
Specifické vázání testované molekuly na TIE receptor se může měřit různými způsoby. Například aktuální vázání testované molekuly na buňky exprimující TIE se mohou zjistit nebo měřit detekcí nebo měřením (1) testované molekuly vázané na povrch nedotčené buňky, (ii) testované molekuly příčně vázané na TIE protein v buněčných lyzátech nebo (iii) testované molekuly vázané na TIE in vitro. Specifická interakce mezi testovanou molekulou a TIE se může vyhodnocovat použitím reakčních činidel, která demonstrují jedinečné vlastnosti takové interakce.
Jakožto specifický příklad, bez záměru na jakémkoliv omezení, se způsobu podle vynálezu používá následovně. Uvažuje se případ, při kterém se měří modifikovaný TIE-2 ligand ve vzorku. Obměňující se ředění vzorku (testovaná molekula) paralelně s negativní kontrolou (NC), prostou modifikované TIE-2 aktivity, a s pozitivní kontrolou, obsahující známé množství modifikovaného TIE-2 ligandu, se může vystavovat působení buněk, které exprimují TIE v přítomností zjistitelného značeného modifikovaného TIE-2 ligandu (v tomto případě radiojodovaného ligandu). Množství modifikovaného TIE-2 ligandu v testovaném vzorku se může vyhodnocovat stanovením množství 125J-značeného modifikovaného TIE-2 ligandu, které se
- 13CZ 295371 B6 váže na kontroly a v každém zředění a pak porovnáním hodnot vzorku se standardní křivkou. Čím je více modifikovaný TIE-2 ligand ve vzorku, tím méně se váže 125J-ligand na TIE.
Množství vázaného 125J-ligandu se může stanovit měřením množství radioaktivity na buňku nebo příčně vázaného modifikovaného TIE-2 ligandu na buněčný povrch proteinů za použití DSS způsobem, který popsal Meakin a Shooter (Nátuře 6, str. 153 až 163, 1991) a detekcí množství značeného proteinu v buněčných extraktech za použití například SDS polyakrylamidové genové elektroforézy, která může zjistiti značený protein mající velikost odpovídající systému TIE receptor/modifikovaný TIE-2 ligand. Specifický test interakce molekula/TIE se může dále testovat přidáním do různých ředění neznačeného kontrolního ligandu, který neváže TIE receptor, a proto nemá podstatný vliv na konkurenci mezi značeným modifikovaným TIE-2 ligandem a testovanou molekulou se zřetelem na TIE vázání. Nebo molekula, o které je známo, že ruší vázání systému TIE receptor/modifikovaný TIE-2 ligand, například avšak bez záměru na jakémkoliv omezení, antiTIE protilátka nebo TIE-2 receptor, jak shora uvedeno, podle očekávání bude interferovat s konstrukcí mezi 125J-modifikovaným TIE-2 ligandem a testovanou molekulou pro vázání TIE receptoru.
Stanovitelný značený modifikovaný TIE-2 ligand zahrnuje například, teda bez záměru na jakémkoliv omezení, modifikovaný TIE-2 ligand navázaný kovalentně nebo nekovalentně na radioaktivní látku, na fluorescenční látku, na látku s enzymovou aktivitou, na látku, která může sloužit jako substrát pro enzym (přednost se dává enzymům a látkám s kolorimetricky zjistitelnou reakcí), nebo na látku, která se může zjistit molekulou protilátky, což je s výhodou značená molekula protilátky.
Nebo specifické vázání zkoušené molekuly na TIE se může měřit hodnocením sekundárních biologických vlivů vázání systému modifikovaný TIE-2 ligand/TIE receptor včetně, avšak bez záměru na jakémkoliv omezení, růstu buněk a/nebo diferenciace nebo bezprostřední urychlené exprese genu nebo fosforylace TIE. Například schopnost testované molekuly zahrnovat diferenciaci se může testovat v buňkách, které nemají tie a ve srovnatelných buňkách, které exprimují tie; diferenciace tie exprimujících buněk nikoliv však ve srovnatelných buňkách prostých tie je indikativní pro specifickou interakci testovaná molekula/TIE. Podobná analýza se může provádět detekcí bezprostředně časného genu (například fos a jin) zavedením tie-minus a tie-plus buněk nebo detekcí fosforylace TIE za použití standardního fosforylačního testu v oboru o sobě známého. Takové analýzy mohou být užitečné pro identifikaci agonistů nebo antagonistů, které se konkurenčně neváží na TIE.
Podobně vynález umožňuje způsob identifikace molekuly, která má biologickou aktivitu modifikovaného TIE-2 ligandu, zahrnující (i) expozici buňky, které exprimují tie, testovací molekuly a (ii) detekci specifického vázání testované molekuly na TIE receptor, přičemž specifické vázání na TIE je v pozitivním vztahu s TIE obdobnou aktivitou. Specifické vázání se může zjistit buď testováním přímé vazby, nebo podle sekundárních biologických působení vázání, jak shora uvedeno. Takový způsob je obzvláště užitečný pro identifikaci nových členů čeledi TIE ligandu nebo ve farmaceutickém průmyslu při skrínování velké řady peptidových a nepeptidových molekul (například peptidomimetika) pro biologickou aktivitu spojenou s TIE. Podle výhodného, specifického nikoliv však omezujícího provedení vynálezu se může připravit velká sada kultivačních důlků, které obsahují řady PC12 buněk (nebo fibroblastů, jak shora uvedeno), které jsou buď tie-minus, nebo jsou konstruovány, aby byly tie-plus. Mohou se přidávat četné testované molekuly, aby každá řada nebo její část obsahovala různé testované molekuly. Následně se hodnotí každý důlek se zřetelem na přítomnost nebo nepřítomnost růstu a/nebo diferenciace. Mimořádně velké množství testovaných molekul se mohou tímto způsobem skrínovat se zřetelem na takovou aktivitu.
Přídavně vynález umožňuje detekci nebo měření aktivity podobné TIE ligandové aktivitě nebo identifikaci molekuly mající takovou aktivitu (i) vystavením testované molekuly TIE receptorovému proteinu in vitro za podmínek, které umožňují vázání, (ii) detekci vázání testované
- 14CZ 295371 B6 molekuly na TIE receptorový protein, přičemž je vazba testované molekuly na TIE receptor ve vztahu k aktivitě podobné aktivitě TIE ligandu. Při takovém způsobu se TIE receptor může nebo nemusí v podstatě čistit, může být fixován na pevný nosič (například na afinitní sloupec nebo jako při testu ELISA) nebo může být včleněn do umělé membrány. Vázání testované molekuly na TIE receptor se může hodnotit jakýmkoliv známým způsobem. Podle výhodného provedení se vázání testované molekuly zjišťuje nebo měří hodnocením schopnosti konkurovat se zjistitelně značenými známými TIE ligandy pro TIE receptorové vázání.
Vynález se také týká zjišťování schopnosti testované molekuly působit jako antagonist podobné ligandové aktivity jako ligandové aktivity TIE, přičemž se zjišťuje schopnost molekuly inhibovat vliv TIE ligandového vázání na TIE receptor buňky, která exprimuje receptor. Takový antagonist může ale nemusí interferovat vázání systému TIE receptor/modifikovaný TIE-2 ligand. Vlivy vázání modifikovaného TIE-2 ligandu na TIE receptor jsou přednostně biologické nebo biochemické včetně, avšak bez záměru na jakémkoliv omezení, přežívání nebo proliferace buněk, transformace buněk, bezprostřední časné genové indukce nebo TIE fosfory láce.
Vynález se dále týká jak způsobu identifikace protilátek nebo jiných molekul schopných neutralizace ligandu nebo blokovat vázání na receptor, tak molekul pro tento způsob. Například, avšak bez záměru na jakémkoliv omezení, se může způsobu využít podobně jako testu ELISA. Například se TIE reptorová látka („receptorbody“) může vázat na pevný nosič, jako je plastová mnohodůlková destička. Jako kontrola se do důlku může zavádět známé množství modifikovaného TIE-2 ligandu, který je Myc značený, a jakýkoliv značený modifikovaný TIE-2 ligand, který se váže na receptorovou látku, se pak může identifikovat receptorovou protilátkou směrovanou proti značení Myc-tag. Tento testovací systém se pak může použít ke skrínování vzorků molekul, které jsou schopny i) vazby na značený ligand nebo ii) vazby na receptorovou látku a tak blokovat vazbu na receptorovou látku značeným ligandem. Například testovaný vzorek obsahující zkoumanou molekulu spolu se známým množstvím značeného ligandu, se může zavádět do důlků a měří se množství značeného ligandu, které se váže na receptorovou látku. Porovnáním množství vázaného značeného ligandu v testovaném vzorku se množstvím v kontrole, se mohou identifikovat vzorky obsahující molekuly schopné blokovat vazbu ligandu na receptor. Takto identifikované molekuly se mohou izolovat o sobě známými způsoby pracovníkům v oboru.
Jakmile se zjistí blokátor vazby ligandu, je pracovník v oboru schopen provést sekundární zkoušku ke stanovení, zdali se blokátor váže na receptor nebo na ligand a zjistit, zdali blokátorová molekula je schopna neutralizovat biologickou aktivitu ligandu. Například za použití testu vázání, při kterém se používá BIAcore biosenzorové technologie (nebo zařízení), přičemž se buď TIE receptor, nebo modifikovaný TIE-2 ligand nebo ligandová látka kovalentně váže na pevný nosič (například karboxymethyldextran na zlatém povrchu), je pracovník v oboru schopen stanovit, zdali se blokátorová molekula váže specificky na ligand, na ligandovou látku nebo na receptorovou látku. Ke stanovení, zdali blokátorová molekula může neutralizovat biologickou aktivitu ligandu, může pracovník v oboru provádět fosforylační zkoušku (příklad 5) nebo funkční biotest, jako je test přežívání, za použití primární kultury například endoteliových buněk. Nebo blokátorová molekula, která se váže na receptorovou látku, může být antagonistem a pracovník v oboru to může zjistit, vhodným testem pro identifikaci přídavných agonistů TIE receptoru.
Vynález se také týká kompozic, přičemž TIE ligand je receptorovou vázací doménou TIE-2 ligandu, jak shora popsáno. Například TIE-2 ligand 1 obsahuje smyčkově stočenou („coiled coil“) doménu (začínající na 5' zakončení a táhnoucí se přibližně k poloze 1160 na obr. 4 a přibližně k poloze 1157 na obr. 5) a fibrinogenovou doménu (která je zakódovaná nukleotidovou sekvencí podle obr. 4 začínající přibližně v poloze 1161 a přibližně k poloze 1158 na obr. 5). Fibrinogenová domén TIE-2 ligandu 2 pravděpodobně začíná na aminokyselinové sekvenci nebo ligand 1 nebo okolo této sekvence jako ligand 1 (FRDCA), která je zakódovaná nukleotidy začínajícími přibližně v poloze 1197 na obr. 6. Fibrinogenová doména TIE ligandu 3 pravděpodobně začíná na aminokyselinové sekvenci okolo sekvence, která je zakódovaná nukleotidy
-15CZ 295371 B6 začínajícími okolo polohy 929 na obr. 21. Multimerizace smyčkově stočené domény při produkci ligandu vadí čištění. Jak se popisuje v příkladu 19, zjistilo se podle vynálezu, že fibrinogenová doména obsahuje TIE-2 receptorovou vázací doménu. Monomerní formy fíbrinogenové domény se však nejeví, že by vázaly receptor. Studie, využívající myc-značenou fibrinogenovou doménu, která byla „nahromaděna“ anti-yc protilátkami, váže TIE-2 receptor. (Způsoby produkce „nahromaděných“ ligandů a ligandových látek popsal Davisa a kol., Science 266, str. 818 až 819, 1994). Na základě těchto poznatků byly podle vynálezu připraveny „ligandové látky“, které obsahují fibrinogenovou doménu TIE-2 ligandu kopulovanou na FC doménu IgG („fFc's). Tyto ligandové látky, které vytvářejí dimery, účinněji váží TIE-2 receptor. Podle vynálezu se uvažuje o produkci modifikovaných TIE ligandový protilátek, kterých se může používat jako štítových činidel nebo nádory a/nebo pro asociovanou vaskulaturu, přičemž se indikuje TIE antagonist.
Vynález se dále týká vývoje ligandu, fragmentu nebo jiného derivátu nebo jiné molekuly, která je receptorovým agonistem nebo antagonistem jako terapeutického činidla pro ošetřování jedinců trpících poruchami buněk, tkání nebo orgánů, které exprimují TIE receptor. Takových molekul se může používat pro ošetřování lidí nebo zvířat nebo při diagnostice.
Jelikož TIE receptor byl identifikován v asociaci s endoteliovými buňkami a jak zde doloženo blokování TIE-2 ligandu 1 se jeví jako prevence vaskularizace, očekává se podle vynálezu, že modifikovaný TIE-2 ligand podle vynálezu může být užitečný pro navozování vaskularizace při nemocích nebo poruchách, kde se taková vaskularizace indikuje. Takové nemoci a poruchy zahrnují hojení ran, ischemii a diabetes. Ligandy se mohou zkoušet na zvířecích modelech a používat terapeuticky jako jiné účinné látky, jako například vaskulární endoteliový růstový faktor (VEGF), jiný endoteliový buněčně specifický faktor než angiogenní (Ferrara a kol., americký patentový spis US 5 332 671, 26. července 1994). Ferrara, jakož také jiní autoři, popisují in vitro a in vivo způsoby k doložení vlivu antiogenního faktoru při podpoře toku do ischemického myokardu, k podpoře hojení ran a pro další terapeutické účely, kde je žádoucí neoangiogeneze (Sudo a kol., evropská přihláška vynálezu číslo 0 550296 A2, zveřejněná 7. července 1993; Banai a kol., Circulation 89, str. 2183 až 2189, 1994; Unger a kol., Am.
J. Physiol. 266, str. H1588 až 1595, 1994; Lazarous a kol., Circulation 91, str. 145 až 153, 1995). Podle vynálezu modifikovaný TIE-2 ligand se může používat samotný nebo spolu s jedním nebo s několika přídavnými farmaceuticky účinnými sloučeninami, jako jsou například VEGF nebo bazický fibroblastový růstový faktor (bFGF), stejně jako cytokiny nebo neurotrofiny.
Naproti tomu antagonisty TIE receptoru, jako modifikované TIE-2 ligandy, které váží avšak neaktivují zde popsaný receptor, receptorovou látku, jak popsáno v příkladu 2 a 3 a TIE-2 ligand 2, jak popsáno v příkladu 9, jsou užitečné k předcházení nebo k zeslabení vaskularizace a tak k předcházení nebo k zeslabení nádorového růstu. Tato činidla se mohou používat samotná nebo v kombinaci s jinými činidly, jako jsou například anti-VEGF protilátky, které se jeví jako užitečné při ošetřování stavů, při kterých je terapeutickým záměrem blokovat angiogenezi. Podle vynálezu se očekává, že modifikovaný TIE-2 ligand podle vynálezu může být také užitečný s činidly, jako jsou například cytokinové antagonisty, například IL-6 antagonisty, o kterých je známo, že blokují záněty.
Například se podle vynálezu zjistilo, že se TIE ligandy exprimují v buňkách v nádorech nebo v těsně přilehlých buňkách. Například TIE-2 ligand 2 se jeví jako těsně přiléhající k nádorovým endoteliovým buňkám. Proto také jiné TIE antagonisty mohou být užitečné při prevenci nebo zeslabování například nádorového růstu. Kromě toho TIE ligandy nebo ligandové látky mohou být užitečné pro uvolňování toxinů k buňce nesoucí receptor. Nebo jiné molekuly, například růstové faktory, cytokiny nebo živiny se mohou uvolňovat k TIE receptor nesoucím buňkám prostřednictvím TIE-2 ligandů nebo ligandových látek. TIE-2 ligandy nebo ligandové látky, jako modifikovaný TIE-2 ligand podle vynálezu se také mohou používat jako diagnostické reakční činidlo pro TIE receptor ke zjišťování receptoru in vivo a in vitro. Když souvisí TIE receptor s chorobným stavem, TIE ligandy nebo ligandové látky, například modifikovaný TIE-2 ligand, mohou být užitečný jako diagnostická činidla k detekci nemoci nebo například k zabarvení tkáně
-16CZ 295371 B6 nebo k představě celého tělesa. Taková reakční činidla zahrnují radioizotopy, fluorochromy, barviva, enzymy a biotin. Taková diagnostická a štítová činidla se mohou připravovat způsobem, který popsal Alitalo a kol., (světový patentový spis číslo WO 95/26364, zveřejněno 5. října 1995; a Burrows F a Thorpe P., PNAS (USA) 90, str. 8996 až 9000, 1993).
Podle jiného provedení TIE ligandy, receptorový aktivační modifikovaný TIE-2 ligand podle vynálezu, se používají jako hematopoietické faktory. Různé hematopoietické faktory a jejich receptory jsou zahrnuty v proliferaci a/nebo v diferenciaci a/nebo v migraci různých buněčných typů obsažených v krvi. Jelikož jsou TIE receptory exprimovány časnými hematopoietickými buňkami, očekává se, že TIE ligandy budou mít podobný úkol v proliferaci nebo v diferenciaci nebo v migraci těchto buněk. Proto se například mohou TIE obsahující prostředky připravovat, testovat a zkoušet v biologických systémech in vitro a in vivo a terapeuticky používat, jak je popsáno v literatuře (například Sousa, americký patentový spis číslo 4 810643; Lee a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 82, STR. 4360 až 4364, 1985; Wong a kol., Science, 228, str. 710 až 814, 1985; Yokota a kol., Proč. Nati. Acad. Sci (USA) 81, str. 1070, 1984; Borselman a kol., světový patentový spis číslo WO 91/05795, zveřejněný 2. května 1991 pod názvem „Stem Cell Factor“; aKirkness a kol., světový patentový spis číslo WO 95/1985, zveřejněný 27. června 1995 pod názvem „Haemapoietic Maturation Factor“). Proto se receptorového aktivačního modifikovaného TIE-2 ligandu může používat pro diagnostikování a pro ošetřování stavů, při ktetých je normální omezení, anemie, trombocytopenie, leukopenie a granulocytopenie. Podle výhodného provedení receptorový aktivační modifikovaný TIE-2 ligand se může používat pro stimulaci diferenciace prekurzorů krevních buněk v situacích, kdy jedinec trpí nemocí, jako je získaný syndrom imunitní nedostatečnosti (AIDS), která způsobí snížení normální hladiny krevních buněk nebo v klinických stavech, při kterých je žádoucí podpora hematopoietické populace, jako při transplantaci kostní dřeně nebo při ošetřování aplasie nebo myelopotlačení v důsledku ozáření, chemického ošetřování nebo chemoterapie.
Receptorové aktivační modifikované TIE-2 ligandy podle vynálezu se mohou používat samotné nebo spolu s jinými farmaceuticky aktivními látkami, jako jsou například cytokiny, neurotropiny a interleukiny. Podle výhodného provedení se ligandy mohou používat spolu s jakýmkoliv počtem shora uvedených faktorů, o nichž je známo, že indukují proliferaci kmenové buňky nebo jiného hematopoietického prekurzoru, nebo faktorů působících na další buňky v hematopoietické cestě včetně, avšak bez záměru na jakémkoliv omezení, hematopoietického faktoru zrání, trombopoietinu, faktoru kmenová buňky, erythropoietinu, G-CSF a GM-CSF.
Podle alternativního provedení TIE receptorové antagonisty jsou užitečné k diagnóze nebo k ošetřování jedinců, přičemž je žádoucí inhibice hematopoietické cesty, například při ošetřování myeloproliferativních nebo jiných proliferativních poruch krvetvorných orgánů, jako je trombocytemie, polycytemie a leukemie. Podle takového provedení může ošetřování zahrnovat použití terapeuticky účinného množství modifikovaného TIE-2 ligandu, TIE-protilátky, TIE receptorové látky, konjugátu modifikovaného TIE-2 ligandu nebo ligandové látky fFC, jak shora uvedeno.
Vynález se také týká farmaceutických prostředků, obsahujících modifikovaný TIE-2 ligand nebo ligandovou látku zde popsanou, její peptidové fragmenty nebo deriváty ve farmaceuticky vhodném nosiči. Modifikované TIE-2 ligandové proteiny, peptidové fragmenty nebo deriváty se mohou podávat systemicky nebo místně. Může se použít jakýkoliv vhodný způsob podání včetně, avšak bez záměru na jakémkoliv omezení, intravenózního, intratekálního, intraarteriálního, intranasálního, orálního, subkutánního, intraperitoneálního nebo lokálního vstřikování nebo chirurgického implantátu. Jsou také možné prostředky s pozdrženým uvolňováním.
Vynález se také týká protilátky, která specificky váže takovou terapeutickou molekulu. Protilátka může být monoklonální nebo polyklonální. Vynález se také týká použití takové monoklonální nebo polyklonální protilátky k měření množství terapeutické molekuly ve vzorku odebraném jedinci pro monitorování průběhu terapie.
- 17CZ 295371 B6
Vynález se dále týká terapeutického prostředku obsahujícího modifikovaný TIE-2 ligand nebo ligandovou látku a cytotoxické činidlo sním konjugované. Podle jednoho provedení cytotoxickým činidlem může být radioizotop nebo toxin.
Vynález se také týká protilátky, která specificky váže modifikovaný TIE-2 ligand. Protilátka může být monoklonální nebo polyklonální.
Vynález se dále týká způsobu čištění modifikovaného TIE-2 ligandu, při kterém se
a) kopuluje alespoň jeden TIE vážící substrát na pevnou matrici,
b) substrát podle odstavce a) se inkubuje s buněčným lyzátem, takže substrát vytvoří komplex s jakýmkoliv TIE-2 ligandem v buněčném lyzátu,
c) pevná matrice se omyje a
d) modifikovaný TIE-2 ligand se eluuje z kopulovaného substrátu.
Substrátem může být jakákoliv látka, která specificky váže modifikovaný TIE-2 ligand. Podle jednoho provedení se substrát volí ze souboru zahrnujícího antimodifikovanou TIE-2 ligandovou protilátku, TIE receptor a TIE receptorovou látku. Vynález se dále týká receptorové látky, která specificky váže TIE-2 ligand stejně jako terapeutického prostředku obsahujícího receptorovou látku ve farmaceuticky vhodném nosiči a způsobu blokování růstu krevních cév u lidí, kterým se podá účinné množství terapeutického prostředku.
Vynález se dále týká terapeutického prostředku obsahujícího receptorový aktivační modifikovaný TIE-2 ligand nebo ligandovou látku ve farmaceuticky vhodném nosič, jakož také způsobu podpory neovaskularizace u jedinců, kterým se podává účinné množství terapeutického prostředku.
Kromě toho se vynález týká způsobu identifikace buňky, která exprimuje TIE receptor, při kterém se uvádí do styku buňka s detekovatelným značeným modifikovaným TIE-2 ligandem nebo se ligandovou látkou za podmínek umožňujících vázání detekovatelného značeného ligandu na TIE receptor a stanovuje se, zdali se detekovatelný značený ligand váže na TIE receptor, čímž se identifikuje buňka, která exprimuje TIR receptor. Vynález se taký týká terapeutického prostředku, který obsahuje modifikovaný TIE-2 ligand nebo ligandovou látku a cytotoxické činidlo s ním konjugované. Cytotoxickým činidlem může být radioizotop nebo toxin.
Vynález se také týká způsobu detekce exprese modifikovaného TIE-2 ligandu buňkou, při kterém se získá mRNA z buňky, takto získaná mRNA se uvádí do styku se značenou molekulou nukleové kyseliny kódující modifikovaný TIE-2 ligand za hybridizačních podmínek, stanovuje se obsah mRNA hybridizované na značenou molekulu a tak se zjišťuje exprese modifikovaného TIE-2 ligandu v buňce.
Vynález se také týká způsobu detekce exprese modifikovaného TIE-2 ligandu v sekcích tkáně, při kterém se uvádí do styku sekce tkáně se značenou molekulou nukleové kyseliny kódující modifikovaný TIE-2 ligand za hybridizačních podmínek, stanovuje se obsah mRNA hybridizované na značenou molekulu a tak se zajišťuje exprese modifikovaného TIE-2 ligandu v tkáňové sekci.
Vynález blíže objasňují, nijak však neomezují následující příklady praktického provedení.
-18CZ 295371 B6
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Identifikace buněčných linií ABAE jako reporterských buněk pro vazební TIE-2 receptor
Dospělé buňky BAE jsou zaregistrovány v evropském rejstříku European Cell Culture Repository pod označením ECACC#92010601 (viz PNAS75:2621 (1978)). Northem (RNA) analýzy objevily střední úrovně přepisu tie-2 buněčné linii ABAE (Adult Bovine Arterial Endothelia) konzistentní s výsledky hybridizace in šitu, které ukázaly téměř výhradní lokalizaci TIE-2 RNA na cévních endoteliových buňkách. Proto byly zkoumány lyzáty buněk ABAE z hlediska přítomnosti proteinu TIE-2 stejně jako z hlediska rozsahu, v jakém je protein TIE-2 fosforylován tyrozinem za normálních podmínek růstu oproti podmínkám růstu bez séra. Lyzáty buněk BAE byly shromážděny a podrobeny imunoprecipitaci, po které následovaly analýzy Western blot imunoprecipitovaných proteinů se specifikací TIE-2 a s antiséiy s fosfotyrozinovou specifikací. Vynechání nebo začlenění peptidů TIE-2 jako specifických blokujících molekul během imunoprecipitace TIE-2 umožnilo nepochybnou identifikaci TIE-2 jako středně detekovatelného proteinu přibližně 150 kD, jehož setrvalý stav hladiny fosfotyrozinu se zmenšuje až na nezjistitelnou míru v případě buněk v nepřítomnosti séra.
Kultivace buněk ABAE a shromáždění lyzátů buněk se provádí tímto způsobem: na plastové petrimisce (Falcon) se rozprostřou v jedné vrstvě buňky v hustotě 2x106 buněk/150 mm ABAE s nízkým počtem pasáží a pěstují se v Eaglově médium modifikovaném Dulbecco médiem (DMEM) obsahujícím 10% telecího séra (10% BCS), 2mM L-glutaminu (Q) a po 1 % penicillinu a streptomycinu (P-S) v prostředí s 5 % oxidu uhličitého. Před shromážděním buněčných lyzátů se buňky ponechají 24 hodin v prostředí bez séra v DMEM/Q/P-S, prostředí se odtáhne a destičky se pokropí ledově studenou solankou pufrovanou fosfátem (PBS) doplněnou orthovanadátem sodným, fluoridem sodným a benzamidinem sodným. Buňky se lysují v malém objemu tohoto oplachového pufru, který byl doplněn 1 % detergentu NP40 a inhibitory proteázy PMSF a aprotininem. Nerozpuštěné zlomky se z buněčných lyzátů odstraní odstřeďováním po dobu 10 minut při 14 000 xG při teplotě 4 °C a supematanty se podrobí imunoprecipitaci antisérem specifickým pro receptor TIE-2, přibližně za přítomnosti blokujících peptidů přidaných do přibližně 20 pg/ml lyzátů. Imunoprecipitované proteiny se rozpustí za použití PAGE (7,5% gel Laemmli), provede se a elektrotransfekce na membránu PVDF a inkubují se buď s různými TIE-2 specifickými antiséry, nebo s antiséry specifickými pro fosfotyrozin. Protein TIE-2 se zviditelní inkubací membrány se sekundárním antisérem vázaným na HRP následovanou zpracováním reakčním činidlem ECL (Amersham).
Příklad 2
Klonování a exprese receptorové látky TIE-2 ke studiu založené na afinitě ligandu TIE-2 Interakce
Byla vytvořena expresní sestava, která by měla poskytovat oddělený protein sestávající z úplně mimobuněčné části receptoru TIE-2 fúzované ke konstantní oblasti (lgGl Fc) lidského imunoglobulinu gama-1. Tento fúzní protein se nazývá TIE-2 receptorová látka („receptorbody“) (RB) a normálně se předpokládá, že existuje jako dimer v roztoku založeném na vytváření disulfídických vazeb mezi jednotlivými konci lgGl Fc. Podíl Fc TIE-2 RB se připraví takto: Fragment DNA kódující část Fc lidského lgGl, která zasahuje do patentové oblasti ke karboxylovému konci proteinu, se zesílí z lidské placentní cDNA pomocí PCR s oligonukleotidy odpovídajícími publikované sekvenci lidského lgGl; výsledný fragment DNA se klonuje do plazmidového vektoru. Příslušné restrikční fragmenty DNA od plazmidu, kódujícího receptor TIE-2 v plné
-19CZ 295371 B6 délce a od lidského plazmidu lgGl Fc, se liguje po obou stranách krátkého fragmentu odvozeného od PCR, který byl určen k fúzování v základní struktuře sekvence kódujících TIE-2 a lidský protein lgGl Fc. Výsledný protein TIE-2 oktodoménní-Fc fúze tudíž přesně substituoval lgGl Fc v místě oblasti zasahující do transmembrány TIE-2 a do cytoplazmových domén. Alternativní způsob přípravy RB popsal Goodwin a kol. (Cell 73, str. 447 až 456, 1993).
Klonováním fragmentu DNA TIE-2 RB do vektoru baculoviru pVL1393 se získají miligramová množství TIE-2 RB, načež se infikuje buněčná linie SF-21AE hmyzu Spodoptera frugiperda. Alternativně může být použito buněčné linie SF-9 (ATTC Accession No. CRL-1711) nebo buněčné linie BTI-TN-5bl-4. DNA kódující TIE-2 RB se klonuje jako fragment Eco RI-Notl do transferového baculoviru plazmidu pVL1393. Plazmid DNA, vyčištěný odstředěním gradientu hustoty chloridu česného, se rekombinuje do virové DNA přimíšením 3 pg plazmidu DNA s 0,5 pg Baculo-Gold DNA (Pharminigen) následovaným zavedením do liposomů pomocí 30 pg Lipofektinu (GIBCO-BRL). Do buněk SF-21AE (2xl06 buněk na 60 mm misku) v médiu TMNFH (Modified Grace's Insect Cell Medium (GIBCO-BRL) se přidají směsi DNA-liposomu na pět hodin při teplotě 27 °C, načež následuje inkubace pět dní při teplotě 27 °C v prostředí TMNFH doplněným 5% zárodečným telecím sérem. Médium tkáňové kultury se shromáždí k destičkovému čištění rekombinantních virů, což se provede v literatuře popsanými způsoby (O'Reily, D.R., L.K. Miller a V. A. Luckow, Baculovirus Exprimsion Vectors - A Laboratory Manual 1992, New York: W.H. Freeman), s tou výjimkou, že agarová krycí vrstva obsahuje 125 pg/ml X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-P-D-galaktopyranosidu GIBCO-BRL). Po pětidenní inkubaci při teplotě 27 °C nebyly shledány žádné rekombinantní destičky pozitivní chromogenovou reakcí na X-gal substrát a jejich polohy se vyznačí. Rekombinantní destičky se pak zviditelní přísadou druhé krycí vrstvy obsahující 100 pg/ml MTT (3-[4,5-dimethyIthiazol-2yl]-2,5-difenyltetrazoliumbromid; Sigma). Předpokládaný rekombinantní virový plak se vytře tamponem a vyčistí se několika průběhy izolace k zaručení homogenity. Zásoby viru se vytvoří sérií několikanásobných pasáží plaku s vyčištěným virem. Získají se zásoby klonu viru s nízkou pasáží (v TIE-2 receptorové látce).
Buňky SF-21AE se pěstují v médiu prostém séra (SF-900 II Gibco BERL) obsahujícím roztok systému IX antibiotikum/antimykotikum (GIBCO BRL) a 25 mg/1 gentamycinu (Gibco-BRL). Přidá se Pluronik F-68 jako povrchově aktivní činidlo do konečné koncentrace 1 g/1. Před infikováním se kultury (4 1) ponechají nejméně tři dny v bioreaktoru (Artisan Cell Station Systém). Buňky se nechají růst při teplotě 27 °C v plynu obsahujícím 50 % rozpuštěného kyslíku při proudění plynu rychlostí 80 ml/min (ovzdušnění na kropicím prstenci). K ovzdušnění slouží námořní vektor s počtem otáček 100/min. Buňky se shromáždí ve střední logaritmické růstové fázi (přibližně 2x106 buněk/ml), zkoncentrují se odstředěním a infikují se 5 plak tvořícími jednotkami TIE-2 receptorové látky na buňky. Buňky se inokulum se vnesou do 400 ml čerstvého média a vir se absorbuje po dobu dvou hodin při teplotě 27 °C v odstředivkové baňce. Kultura se resuspenduje na konečný objem 8 1 čerstvým médiem prostým séra a buňky se inkubují v bioreaktoru za shora popsaných podmínek.
Po 72 hodinách od infikování se kultivační médium od buněk SF-21AE, infikovaných TIE-2 receptorovou látkou, shromáždí odstředěním (500x g, 10 minut). Hodnota pH buněčných supernatantů se upraví na 8 hydroxidem sodným. Přidá se EDTA do konečné koncentrace 10 mM a hodnota pH supernatantu se znovu upraví na 8. Supernatanty se zfiltrují (0,45 μπι Milipore) a vnesou se na sloupec proteinu A (rychle tekutý protein A separosy 4 nebo HiTrap protein A, obojí obchodní produkt společnosti Pharmacia). Sloupec se promyje PBS obsahujícím 0,5M chloridu sodného až do klesnutí absorbance při 280 nm na základní linii. Sloupec se promyje PBS a eluuje se 0,5M kyselinou octovou. Frakce kolony se okamžitě neutralizují eluováním do zkumavek obsahujících 1M Tris o hodnotě pH 9. Píkové frakce, obsahující TIE-2 receptorovou látku, se zředí a dialyzují se proti PBS.
-20CZ 295371 B6
Příklad 3
Doklad rozhodující úlohy TIE-2 ve vývoji cév
Pochopení funkce TIE-2 zprostředkovalo zavedení „nadbytku“ rozpustné TIE-2 receptorové látky (TIE-2 RB) do vývojového systému. Potenciální způsobilost TIE-2 RB vázat a tím také neutralizovat dostupný ligand TIE-2 by mohla vést k pozorovatelnému přerušení normálního vývoje cév a ke charakterizování ligandů. K vyzkoušení, zda vy bylo možno použít ligandů TIE-2 RB k přerušení vývoje cév v čerstvých kuřecích embryích, se nasály malé podíly biologicky resorbovatelné pěny s TIE-2 RB a vnesly se těsně za chorioallantoickou membránou v poloze těsně bočně k časnému embryu.
Časná kuřecí embrya se vyvíjejí nad žloutkem z malého kotoučku buněk, který je povlečen chorioallantoickou membránou (CAM). Endoteliové buňky, které přijdou do cévní linie embrya, pocházejí jak z vnějších, tak z vnitřních zdrojů zárodečných buněk. Zvnějšku odvozené zárodečné endoteliové buňky, které tvoří hlavní zdroj endoteliových buněk embrya, pocházejí z přirůstání mesenchymu, který je situován bočně kolem vlastního embrya, těsně pod CAM. Když tyto mesenchymové buňky dospějí, dají vznik společnému progenitoru jak endotelových tak hematopoietických linií buněk, nazývaných hemangioblast. Hemangioblast pak okamžitě umožní vznik smíšené populaci anioblastů (progenitoru endoteliových buněk) a hematoblastům (pluripotenciálnímu hematopoietickému prekurzoru). Tvoření základů oběhového systému začíná, když progeny endoteliových buněk segregují za vytvoření váčku s jednobuněčnou tloušťkou, který obklopuje původní krevní buňky. Proliferace a migrace těchto buněčných složek případně vytvoří rozsáhlé síťoví krví naplněných mikrocév pod CAM, které nakonec přivedou embiyo ke spojení s omezenými, intra-embryonicky odvozenými cévními elementy.
Čerstvě oplozená vajíčka kuřat (obchodní produkt společnosti Spafas, lne. Boston, MA) se inkubují při teplotě 37,5 °C a 55% relativní vlhkosti. Po přibližně 24 hodinách vývoje se vajíčka otřou 70% ethanolem a zubařským vrtáčkem se v nich vytvoří 1,5 cm otvor v tupím konci každého vajíčka. Skořápková membrána se odstraní k odkrytí volného prostoru přímo nad embiyem. Skalpelem se vyříznou čtvercové kousky Gelfoamu (Upjoh) a napustí se ve stejné koncentraci TIE-2 nebo EHK-1 receptorovou látkou. Receptorová látka EHK-1 se získá jako podle příkladu 2 pomocí mimobuněčné domény EHK-1 místo mimobuněčné domény TIE-2 (Maisonpierre a kol. Oncogene 8, str. 3277 až 3288, 1993). Každý kousek Gelfoamu adsorboval přibližně 6 pg Proteinu ve 30 μΐ. K otevření malé dírky v CAM se použije hodinářské pinsety v místě několika milimetrů stranou primitivního embiya. Pod CAM se zasune hlavní část Gelfoamu s napuštěným RB pod CAM a skořápka vajíčka se zalepí lepicí pásku. Ostatní vajíčka v podobném stavu se paralelně ošetří RB neodvozenou, neuronálně exprimovanou receptorovou tyrozinkinázou, EHK-1 (Maisonpierre a kol., Oncogene 8, str. 3277 až 3288, 1993). Vývin se nechá pokračovat čtyři dny a pak se vejce podrobí vizuální prohlídce. Embrya se vyjmou opatrným rozbitím skořápky v miskách zahřáté PBS a opatrně se odřízne embryo s obklopující CAM. Ze 12 vajec, z nichž každé bylo ošetřeno RB, 6 TIE-2 a RB a 5 EHK-1 RB, se vyvinula embrya od stavu pozorovanému na začátku pokusu. Mezi těmito vyvinutými embryi se pozoruje dramatický rozdíl, jak patrno z obr. IA a 1B. Vejce ošetřená EHK-1 RB se vyvinula poměrně normálně. Čtyři z pěti embryí EHK-1 žilo, podle tlukoucího srdce. Kromě toho vnější embiyové cévy, které jsou vizuálně patrné přítomností červených krvinek, jsou hluboké a nacházejí se několik centimetrů pod CAM. Na rozdíl od toho, embrya ošetřená TIE-2 RB jsou silně zakrnělá, mají 2 až 5 mm, oproti průměru 10 mm embryí EHK-1 RB. Všechny embrya ošetřená TIE-2 RB jsou mrtvá a jejich CAM jsou prostá krevních cév. Způsobilost TIE-2 RB blokovat vývoj cév u kuřat ukazuje, že ligand TIE-2 je nutný pro vývoj vaskulatury.
-21 CZ 295371 B6
Příklad 4
Identifikace vazební aktivity specifické pro TIE-2 v kondiciovaném médiu od onkogenně-rastransformované myoblastové buněčné linie myši C2C12
Snímání desetinásobně koncentrovaného média (10 x CCM) od různých buněčných linií pro přítomnost specifické vazební aktivity rozpustného TIE-2 (BIAcore; Pharmacvia Biosensor, Poscataway, NJ) ukázala vazební aktivitu v médiu prostém séra od onkogenně-ras-transformovaných buněk C2C12 (C2C12-ras), RAT 2-ras (což je ras transformovaná fibroblastová buněčná linie), lidské glioblastoma T98G a lidské buněčné linie neuroblastomu známé jako SHEP-1.
C2C12-ras lOx CCM pochází od stabilně transfektované linie C2C12 myoblastů, které byly transformovány onkogenicky transfekci mutantem T-24 H ras standardními metodami na bázi kalciumfosfátu. Plazmid SV40, založený na expresi neomycinové resistance, byl fyzicky vázán splazmidem ras exprese k umožnění selekce transfektovaných klonů. Výsledné buňky G418 resistantní ras-C2C12 byly rutinně udržovány jako monovrstva na plastových miskách v systému DMEM/glutamin/penicillin-streptomycin doplněném 10 % zárodečného telecího séra (FCS). Séra prosté C2C12-ras lOx CCM se připraví překrytím buněk při 60% slití v médium prostém séra v průběhu 12 hodin (Zhan a Goldfarb, Mol. Cell. Biol. 6, str. 3541 až 3544, 1986; Zhan a kol., Oncogene 1, str. 369 až 376,1987). Médium se vyhodí a nahradí čerstvým DMEM/Q/P-S na 24 hodin. Toto médium se shromáždí a buňky se doplní čerstvým DMEM/Q/P-S, které se rovněž vyhodí po dalších 24 hodinách. Tyto CCM byly doplněny inhibitory proteázy PMSF (lmM) a aprotininem (10 pg/ml) a desetinásobně zkoncentrovány na sterilních velikost vylučujících membránách (Amicon). Vazební aktivita TIE-2 by mohla být neutralizována inkubaci média nadbytkem TIE-2 RBC, nikoli však inkubaci s EHK-1 RB, před analýzou BIAcore.
Vazební aktivita lOx CCM se měří pomocí biosenzorové technologie (BIAcore: Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ), která monitoruje biomolekulámí interakce v reálném čase cestou povrchové plazmonové rezonance. Vyčištěný TIE-2 RB se kovalentně kopuluje přes primární aminy na vrstvu karboxymethyldextranu CM5 senzorového čipu pro výzkum (Pharmacia Biosensor; Piscataway, NJ). Povrch senzorového čipu byl aktivován pomocí směsi N-hydroxysukcinimidu (NHS) a N-ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)-karbodiimidu (EDC), s následnou imobilizací TIE-2 RB (25 pg/ml, hodnota pH 4,5) a deaktivací nezreagovaných míst 1,0 M ethanolaminem (hodnota pH 8,5). Negativní kontrolní povrch receptorové látky EHK-1 se připraví podobným způsobem.
Běžným pufrem, použitým v systému, je HBS (10 mM Hepes, 3,4 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0,005 % povrchově aktivního činidla P20, hodnota pH 7,4). Vzorky lOx CCM se odstřeďují 15 minut při teplotě 4 °C a vyčeří se použitím sterilního filtru 0,45 pm, vázajícího nízký protein (Millipore; Bedford, MA). Do každého vzorku CCM se přidá dextran (2 mg/ml) a povrchově aktivní činidlo P20 (0,005 %). Podíly 40 pl se vstřikují přes imobilizovaný povrch (buď TIE-2, nebo EHK-1) při průtočné rychlosti 5 pl/min a vazba receptoru se sleduje po dobu osmi minut. Vazební aktivita (rezonanční jednotky, RU) se měří jako rozdíl mezi základní hodnotou stanovenou 30 sekund před vstřiknutím do vzorku a měření proběhne 30 sekund po vstřiknutí. Regenerace povrchu se provede jedním pulzem 12 pl 3M chloridu hořečnatého.
Šumová úroveň přístroje je 20 RU; proto nemůže být žádná vazební aktivita se signálem nad 20 RU interpretována jako skutečná interakce s receptorem. Pro média kondiciovaná C2C12-ras, jsou vazební aktivity v rozmezí 60 až 90 RU pro imobilizovaný povrch TIE-2 RB. U stejných vzorků zkoumaných na imobilizovaném povrchu EHK-1 RB, jsou naměřené aktivity nižší než 35 RU. Specifická vazba na receptorovou látku se vyhodnocuje inkubací vzorků s nadbytkem buď rozpustného TIE-2, nebo EHK-1 RB před zkoumáním vazební aktivity. Přísada rozpustného TIE-2 RB nemá žádný účinek na vazební aktivitu TIE-2 u kteréhokoli vzorku, zatímco
-22CZ 295371 B6 v přítomnosti rozpustného TIE-2 je vazba k povrchu o dvě třetiny nižší než hodnota naměřená v přítomnosti TIE-2. Opakovaná zkouška s použitím více než 50x koncentrovaného C2C12-ras CCM ukázala čtyřnásobné zlepšení vůči pozadí vazebního signálu specifického pro TIE-2.
Příklad 5
C2C12-ras CCM obsahuje aktivitu, která indukuje tyrozinovou fosforylaci receptorů TIE-2
C2C12-ras lOx CCM se zkoumá z hlediska schopnosti vyvolat tyrozinovou fosforylaci TIE-2 v buňkách ABAE. Sérem vyhladovělé buňky ABAE se krátce inkubují C2C12-ras CCM, lysují se a podrobí se imunoprecipitaci a Western analýze jak shora uvedeno. Stimulace sérem vyhladovělých buněk ABAE C2C12-ras lOx CCM se provede následujícím způsobem: Médium ABAE buněk, vyhladovělých jak uvedeno, se odstraní a nahradí se buď definovaným médiem, nebo lOx CCM předehřátým na 37 °C. Po deseti minutách se média odstraní a buňky se dvakrát na ledu promyjí nadbytkem chladné PBS doplněné systémem orthovanadát/fluorid sodný/benzamidin. Lyse buněk a TIE-2 specifická imunoprecipitace se provedou, jak shora popsáno.
Buňky ABAE, inkubované 10 minut s definovaným médiem, nevykazují žádnou indukci fosforylace TIE-2 tyrozinu, zatímco inkubace C2C12-ras lOx CCM stimuluje nejméně 100 násobný nárůst fosforylace TIE-2. Tato aktivace je téměř úplně vyčerpána předinkubací C2C12-ras ÍOx CCM 90 minut při teplotě místnosti s 13 pg TIE-2 RB kopulované na protein kuliček G-sefarosy. Médium inkubované proteinem G separosy samotné nebylo zbaveno této fosforylační aktivity.
Příklad 6
Expresní klonování ligandu TIE-2
V Dulbeccem modifikovaném Eaglově médiu (DMEM) obsahujícím 10 % zárodečného telecího séra (FBS), po 1 % penicillinu a streptomycinu (P/S) a 2 mM glutaminu v prostředí 5% oxidu uhličitého se kultivují buňky COS-7. V Eaglově minimálně potřebném médiu (EMEM) s 10 % FBS, (P/S) a 2 mM glutaminu se kultivuje linie buněk myšího myoblastu C2C12 ras. Snímáním knihovny C2C12-ras cDNA v buňkách COS exprimovaných vektorem pJFE12 se získají v plné délce myší klony cDNA ligandu TIE-2. Tento vektor, jak vyplývá z obr. 2, je modifikovanou verzí vektoru pSRa (Tabake a kol., Mol. Cell. Biol. 8, str. 466 až 472, 1988). Knihovna se vytvoří pomocí dvou restrikčních míst BSTX1 ve vektoru pJFE14.
Buňky COS-7 se přechodně transfekují buď knihovnou pJFE14, nebo řídicím vektorem podle transfekčního protokolu DEAE-dextran. Přitom se buňky COS-7 24 hodin před transfekcí pokryjí povlakem 1,0 x 106 buněk/lOOmm. K transfekcí se buňky kultivují v DMEM prostém séra, obsahujícím 400 pg/ml DEAE-dextranu, 1 pM chlorochinu a 2mM glutaminu a 1 pg příslušné DNA po dobu 3 až 4 hodin při teplotě 37 °C v prostředí 5% oxidu uhličitého. Transfekční médium se odsaje a nahradí se PBS s 10 % DMSO na 2 až 3 minuty. Po „šoku“ DMSO se buňky COS-7 umístí do DMEM s 10 % FBS, po 1 % penicillinu a streptomycinu a 2 mM glutainu na 48 hodin.
Jelikož se ligand TIE-2 vylučuje, je nutno buňky uschopnit k detekci vazeb receptorové sondy k ligandu. Dva dny po transfekcí se buňky propláchnou PBS a pak se inkubují s PBS obsahujícím 1,8% formaldehydu na 15 až 30 minut při teplotě místnosti. Buňky se pak promyjí PBS a inkubují se na 15 minut s PBS obsahujícím 0,1 % Tritonu x-100 a 10 % zárodečného telecího séra k permeabilizaci buněk a k blokování nespecifických vazebních míst.
-23 CZ 295371 B6
Skríning se provede přímou lokalizací zbarvení pomocí TIE-2 receptorové látky (RB), která sestává z extrabuněčné oblasti TIE-2 fúzovaného do konstantní oblasti lgGl. Tato receptorová látka se připraví podle příkladu 2. Miska o průměru 100 mm transfektovaných, fixovaných a permeabilizovaných buněk COS se sonduje jejich 30 minutovou inkubaci s TIE-2 RB. Buňky se promyjí dvakrát PBS a inkubují se na dalších 30 minut skonjugátem PBS/10% telecího séra/antihumánní lgG-alkalická fosfatáza. Po trojnásobném promytí PBS, se buňky inkubují v alkalicko-fosfatázovém substrátu po dobu 30 až 60 minut. Miska se pak zkoumá mikroskopem z hlediska přítomnosti obarvených buněk. Kolem každé zabarvené buňky se odškrabe koncem plastové pipety má ploška buněk obsahující vybarvenou buňku a plazmid DNA se pak uchová a použije se k elektroporaci bakteriálních buněk. Jednotlivé kolonie bakterií z elektroporace se vyjmou a plazmid DNA, připravený z těchto kolonií, se použije k transfektování buněk COS-7, které byly sondovány na expresi ligandu TIE-2, jak vyplývá z vazby na receptorová tělesa TIE2. To umožňuje identifikaci jednotlivých klonů kódujících ligand TIE-2. Potvrzení exprese ligandu TIE-2 se získá fosforylací receptorů TIE-2 popsanou v příkladu 5. Plazmidový klon, kódující ligand TIE-2, byl uložen v ATCC 7. října 1994 a označen jako „pJFE14 kódující ligand TIE-2“ pod číslem ATCC Accession No. 75910.
Příklad 7
Izolace a sekvencování klonu cDNA v plné délce, kódujícího lidský ligand TIE-2
Z Clontech Laboratories lne. (Palo Alto, CA) se získá čeleď cDNA lidských zárodečných plic v lambda gt-10 (obr. 3). Destičky se povléknou v hustotě 1,25 x 106 povlakem 20x20 cm a odeberou se replika filtry standardními postupy (Sambrook a kol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. vydání, str. 8 až 46, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor New York).
Izolace lidských ligandových klonů tie—2 se provede takto: Fragment 2,2 kb Xhol z uloženého ligandového klonu tie-2 (ATCC No. 75910- viz příklad 6) se označí náhodným znakem pro specifickou aktivitu přibližně 5x108 cpm/ng. Hybridizace se provede při teplotě 65 °C v hybridizačním roztoku obsahujícím 0,5 mg/ml DNA lososového sperma. Filtry se promyjí při teplotě 65 °C ve 2xSSC, 0,1% SDS a exponují se přes noc na filmu Kodak XAR-5 při teplotě -70 °C. Pozitivní fág je vyčištěný plak. K izolaci DNA způsobem sloupce Qiagen se použijí fágové lyzáty čistého fágu s vysokým titrem fágu standardními způsoby (Qiagen, lne., Chatworth, CA, 1995, katalog str. 36). Fág DNA se digeruje EcoRI k uvolnění fragmentu klonované cDNA k následnému subklonování Lambda fágový vektor obsahující lidský ligand tie-2 DNA byl uložen ATCC 26. října 1994 pod označením lambda gtlO, kódující htie-2 ligand 1 (ATCC Accession No 75928). Fág DNA může být podroben přímo analýze sekvencí DNA metodou dideoxy řetězcového ukončení (Aanger a kol., Proč. Nati. Acad. Sci USA 74, str. 5463 až 5467, 1977).
Subklonování lidského ligandu tie-2 DNA do savčího expresního vektoru se může provést takto: Klon lambda gtlO, kódující htie-2 ligand 1, obsahuje místo EcoRI umístěných 490 párů bází ve směru od začátku kódovací sekvence pro lidský ligand TIE-2. Kódovací oblast může být vystřižena pomocí jedinečných restrikčních míst ve směru nahoru a dolů od iniciátoru a koncových kodonů. Například místo Spěl, umístěné 70 bp 5' vůči kodonu iniciátoru a Bpu 1102i (známé též jako B1P1) místo umístěné 265 bp 3' ke konečnému kodonu, může být použito k vystřižení úplné kódovací oblasti. To pak může být subklonováno do klonovacího vektoru pJFE14 pomocí Xbal (kompatibilní s převisem Spěl) a míst Pstl (Pstl a Pbull02i jsou oba s hrubým koncem).
Kódovací oblast od klonu lambda gtlO, kódujícího htie-2 ligand 1 se sekvencují pomocí sekvenceru ABI 373Q DNA a Taq Dideoxy Terminátor Cycle Sequencing Kit (Applied
-24CZ 295371 B6
Biosystems, lne., Foster City, CA). Nukleotidová a odvozená sekvence aminokyselin lidského ligandu TIE-2 od klonu lambda gtlO, kódujícího thie-2 ligand 1, je znázorněna na obr. 4.
Kromě toho se získaly klony lidského tie-2 ligandu cDNA v plné délce snímáním lidské knihovny cDNA glioblastomu T98G ve vektoru pJFE14. Klony, kódující lidský ligand TIE-2, byly identifikovány hybridizací DNA pomocí fragmentu 2,2kbXhol od uloženého klonu ligandu tie-2(ATCC No. 75910) jako sonda (příklad 6). Kódující oblast se sekvencuje použitím sekvenceru ABI 373A DNA a Tag Dideoxy Terminátor Cycle Sequencing Kit (Appliet Biosystems, inc. Foster City, CA). Tato sekvence byla téměř stejná jako klonu lambda gtlO, kódujícího thie 2 ligand 1. Jak vyplývá z obr. 4, obsahuje klon lambda gtlO, kódující thie-2 ligand 1, přídavný glycinový zbytek, který je zakódován nukleotidy 1114 až 1116. Kódovací sekvence klonu T98G neobsahuje tento glycinový zbytek, je však jinak identická s kódovací sekvencí klonu lambda gtlO, kódujícího htie-2 ligand 1. Obr. 5 ukazuje nukleotid a odvozené sekvence aminokyselin lidského ligandu TIE-2 od klonu T98G.
Příklad 8
Izolace a sekvencování druhého klonu A v plné délce cDNA kódující lidský ligand TIE-2
Knihovna cDNA lidských zárodečných plic v lambda gt-10 (obr. 3), se získá od Clontech Laboratoried, Inc. (Palo Alto, CA). Plaky se nanesou v hustotě 1,25 x 106/destičky 20x20 cm a standardními způsoby byly odebrány filtry replik (Sambrook a kol. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. vydání, str. 8 až 46, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor New York). Duplikátní filtry se snímají s nízkým řazením (2xSSC, 55 °C) se sondami provedenými na sekvenci lidského ligandu 1 TIE-2. Jeden z duplikátních filtrů byl opatřen sondou 5', kódující aminokyseliny 25 až 265 lidského ligandu 1 TIE-2, jak patrno z obr. 4. Druhý duplikátní filtr byl opatřen sondou 3', kódující aminokyseliny 286 až 498 lidského ligandu 1 TIE-2, jak patrno z obr. 4. Obě sondy byly hybridizovány při teplotě 55 °C v hybridizačním roztoku obsahujícím 0,5 mg/ml DNA lososového sperma. Filtry se promyjí 2xSSC při teplotě 55 °C a přes noc se exponují na rentgenový film. Kromě toho se také hybridizují duplikátní filtry při normálním řazení (2xSSC při teplotě 65 °C) do plné délky kódující sondy myšího ligandu 1 TIE-2 (F3-15, Xhol insert).Vyberou se tři pozitivní klony, které splňovaly následující kritéria: i) hybridizace nebyla patrná u sondy (myší) v plné délce při normálním řazení a ii) hybridizace byla patrná při nízkém řazení u obou sond 3' a 5'. Digesce EcoRI fágu DNA získaná z těchto klonů indikuje dva nezávislé klony s vloženými rozměry přibližně 2,2kb a přibližně l,8kb. Insert 2,2kb EcoRI se subklonuje do míst EcoRI obou pBluescript KS (Stratagene) a do savčího expresního vektoru vhodného k použití u buněk COS. U savčího expresního vektoru se identifikovaly dvě orientace. Insert 2,2kb v pBluescript KS byl uložen ATCC 9. prosince 1994 s označením pBluescript KS kódující ligand 2 lidského TIE-2. Výchozí bod, kódující sekvence TIE-2 ligandu 2 je přibližně 355 párů bází ve směru místa pBluescript EcoRI.
Buňky COS-7 byly přechodně transfektovány buď expresním vektorem, nebo řídicím vektorem transfekčního protokolu DEAE-dextran. Buňky COS-7 byly naneseny s hustotou 1,0x106 buněk na 100 mm destičku 24 hodin před transfekci. Ke transfekci byly buňky kultivovány v DMEM prostém séra obsahujícím 400 pg/ml DEAE-dextranu, 1 μΜ chlorochinu a 2 mM glutaminu 1 pg příslušné DNA 3 hodiny při teplotě 37 °C v prostředí 5% oxidu uhličitého. Transfekční médium se nasaje a nahradí se fosfátem pufrovanou solankou 10% DMSO po dobu 2 až 3 minuty. Po tomto „šoku“ DMSO se buňky COS-7 umístí do DMEM s 10 % FBS, po 1 % penicillinu a streptomycinu a 2 mM glutaminu na 48 hodin.
Jelikož ligand TIE-2 je sekretován, bylo nutno permeabilizovat buňky k detekci vazby sondy receptorové látky na ligand. Transfektované buňky COS-7 byly naneseny s hustotou 1,0x106 buněk na 100 mm destičku. Buňky se opláchnou PBS a inkubují se s PBS obsahujícím 1,8% formaldehydu po dobu 15 až 30 minut při teplotě místnosti. Buňky se promyjí PBS
-25CZ 295371 B6 ainkubují se na 15 minut PBS obsahujícím 0,1% Tritonu X-100 a 10 % telecího séra k permeabilizaci buněk a k blokování nespecifických vazebních míst. Snímání se provede přímou lokalizací vybarvení za pomocí TIE-2 receptorové látky, která sestává z mimobuněčné domény TIE-2 fúzované ke konstantní oblasti lgGl. Tato receptorová látka se připraví, jak uvedeno v příkladu 2. Transfektované buňky COS se podrobí inkubaci na 30 minut s TIE-2 receptorovou látkou. Buňky se promyjí dvakrát PBS, fixují se methanolem a inkubují se na dalších 30 minut skonjugátem PBS/10% telecího séra/antihumánní lgG-alkalická fosfatáza. Po třech promytích PBS se buňky inkubují v substrátu alkalické fosfatázy po dobu 30 až 60 minut. Miska se zkoumá mikroskopem na přítomnost obarvených buněk. Ukázalo se, že buňky exprimující jednu orientaci klonu, avšak nikoli jinou orientaci, se vážou na TIE-2 receptorovou látku.
Pracovníkům v oboru je zřejmé, že popsané způsoby mohou být použity dále k identifikaci jiných příbuzných látek čeledi ligandů TIE-2.
Kódující oblast od klonu pBluescript KS, kódující lidský ligand 2 TIE-2, se sekvencuje sekvencerem ABI 373A DNA a Taq Dideoxy Terminátor Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems lne., Foster City, CA). Nukleotidová a odvozená sekvence aminokyselin lidského ligandu TIE-2 od klonu pBluescript KS kódující lidský ligand 2 TIE-2 je na obr. 6.
Příklad 9
Ligand 2 TIE-2 je antagonist receptoru
Kondiciovaná média z buněk COS exprimující buď TIE-2 ligand (T12), nebo TIE-2 ligand 1 (TLI) se porovnávají z hlediska schopnosti aktivovat receptory TIE-2 vyskytující se přírodně v liniích lidských endoteliových buněk.
K transfektování buněk COS-7 bylo použito lipofektaminového reakčního činidla (GIBCOBRL, lne.) buď samotným expresním vektorem pJFE14, vektorem pJFE14 obsahujícím TIE-2 ligand 1, nebo expresním vektorem pMT21 (Kaufman R.J., Proč. Nati. Acad. Sci USA 82, str. 689 až 693 1985) obsahujícím lidský TIE-2 ligand 2 cDNA. Média COS, obsahující sekretované ligandy, se shromáždí po třech dnech a zkoncentrují se na 20-násobek diafiltrací (DIAFLO ultrafiltrační membrány, Amicon, lne.). Množství aktivních TIE-2 ligandů la TIE-2 ligandu 2, obsažené v těchto médiích, se zjistí a vyjádří se jako množství (v rezonančních jednotkách R.U.) specifické vazební aktivity receptoru TIE-2 měřené vazebním testem BIAcore.
Analýzy Northem (RNA) ukázaly významné úrovně transkriptů TIE-2 v HAEC (Human Aortic Endothelia Cell) lidských primárních endoteliových buněk (Clonetics, lne.). Proto bylo těchto buněk použito k vyzkoušení, zda receptor TIE-2 je fosforylován tyrozinem, když je vystaven médiu COS obsahujícímu TIE-2 ligandy. Buňky HAEC se udržovaly v úplném růstovém médiu endoteliových buněk (Clonetics, lne.), které obsahovaly 5 % zárodečného telecího séra, rozpustný extrakt hovězího mozku, lOng/ml lidské EGF, 1 mg/ml hydrokortisonu, 50 mg/ml gentamicinu a 50 ng/ml amfotericinu-B. K posouzení, zda může TLI a TL2 aktivovat receptor TIE-2 v buňkách HAEC, se postupovalo takto: Napůl slité buňky HAEC se nechají dvě hodiny vyhladovět sérem v Dulbecově MEM s vysokou glukózou s přidaným L-glutaminem a systémem penicillin-streptomycin při teplotě 37 °C, načež následuje náhrada vyhladovacího média kondicionovaným médiem COS obsahujícím ligand na 7 minut při teplotě 37 °C v inkubátoru s 5 % oxidu uhličitého. Buňky se nato lyžují a TIE-2 receptorový protein se získá imunoprecipitací lyzátu s TIE-2 peptidovým antisérem a následným způsobem Western bloting s antifosfotyrozinovým antisérem způsobem podle příkladu 1. Výsledky jsou na obr. 7. Fosfotyrozinové úrovně TIE-2 receptoru (TIE-2-R) se zavedou zpracováním HEAC buněk TIE-2 ligandem 1 (dráha 1) avšak nikoli TIE-2 ligandem (dráha 2) kondicionovaného média COS. MOCK je kondicionované médium z COS transfektovaného JFE14 vyprázdněným vektorem.
-26CZ 295371 B6
Poznatek, že jak TLI tak TL2 se specificky vážou na receptor TIE-2, byl prokázán použitím BIA-jádra ke zkoumání specifických vazebních aktivit receptorů TIE-2 ve transfektováném médiu COS a imunovybarvením TLI a TL2 exprimováním buněk COS receptorovými hlavními podíly TIE-2. Jelikož TL-2 neaktivoval receptor TIE-2, dospělo se podle vynálezu k úvaze, zda TL2 by mohly být schopné sloužit jako antagonisty aktivity TLI. Byly provedeny zkoušky fosforylace HAEC, ve kterých byly buňky napřed inkubovány s „nadbytkem“ TL2, s následnou přísadou zředěného TLI. Usoudilo se, že přední okupování receptorů TIE-2, způsobené vysokými hladinami TL2, může bránit následné stimulaci receptorů po expozici na TLI existující při mezních koncentracích.
Poloslinuté buňky HAEC byly vyhladověny sérem, jak shora popsáno, a pak inkubovány tři minuty při teplotě 37 °C s 1 až 2 ml kondiciovaného média 20X COS/JFE14-TL2. Kontrolní destičky byly zpracovány pouze médiem 20X COS/JFE14 (MOCK). Destičky se vyjmuly z inkubátoru a přidala se různá zředění média COS/JFE-14-TL1, načež následovala další inkubace destiček na pět až sedm minut při teplotě 37 °C. Buňky se pak opláchly, lyžovaly a tyrozinová fosforylace TIE-2 v lyzátech se zkoumala receptorovou imunoprecipitací a způsobem Western blotting, jak shora popsáno. Zředění TLI byla provedena použitím média 20X COS/JFE14-TL1 zředěného na 2x, 0,5x, 0,lx nebo 0,02x přísadou samotného média 20X COS/JFE14. Zkouška počátečního 20X TLI a 20X TL2 COS pomocí BIAcore biosenzorové technologie naznačila, že měly podobné množství specifických vazebních aktivit TIE-2, tedy 445 R.U. a 511 R.U. pro TLI TL2. Výsledky antifosfotyrozinového Western blotu, znázorněné na obr. 8, ukazují, že v porovnání s předchozím zpracováním buněk HAEC médiem MOCK (linie 1), před zpracováním buněk HAEC nadbytkem TIE-2 ligandů 2 (linie 2) antagonizuje následnou schopnost zředěného TIE-2 ligandů 1 aktivovat TIE-2 receptor (TIE-2-R).
Schopnost TL2 konkurenčně bránit TLI aktivaci TIE-2-R se doložila použitím lidské hybridní buněčné linie EA.hy926 (příklad 21), kde je podrobně popsána tato buněčná linie a její uchovávání). Byly provedeny pokusy, při kterých byla zkoncentrovaná buněčná média COS obsahující TLI směšována s různým zředěním například MOCK kondicionovaného nebo TL2 kondicionovaného prostředí nanášena na monovrstvy sérem vyhladovělých buněk EA.hy926 na 5 minut při teplotě 37 °C. Média se pak odstranila, buňky se shromáždily lyží a specifická tyrozinová fosforylace pro TIE-2 se zkoumala způsoby Western blot, jak shora popsáno. Obr. 9 ukazuje pokus, který zahrnuje tři skupiny zpracování, jak patrno zleva doprava. Jak patrno ve čtyřech řádcích vlevo, zpracování buněk EA.hy926 samotný lx COS-TL1 mocně aktivovalo endogenní TIE-2-R v těchto buňkách, zatímco médium lx TL2 COS bylo neaktivní. Avšak směs TLI je s MOCK, tak s TL2 ukázala, že TL2 může blokovat aktivitu TLI způsobem závislým na dávce. V prostředních třech párech linií byl poměr TL2 (nebo MOCK) snížen, zatímco množství TLI ve směsi bylo příslušně zvýšeno z 0,lx na 0,3x. U každé z těchto poměrů směsí linie TL1:TL2 ukazuje sníženou míru fosforylace ve srovnání s odpovídajícími liniemi TLLMOCK. Když však bylo množství TLI zachováno stejné a množství TL2 (nebo MOCK) se snížilo (znázorněno ve třech párech linií vpravo) bylo dosaženo bodu, ve kterém TL2 ve vzorku bylo příliš zředěno, než aby účinně bránilo aktivitě TLI. Relativní množství každého ligandů, obsaženého v tomto kondiciovaném médiu COS, mohlo být stanoveno z jejich vazebních jednotek, jak změřeno testem BIAcore a způsoby Western blot, média COS s protilátkami specifickými pro ligand. V důsledku toho lze dospět k závěru, že k účinnému blokování aktivity TLI in vitro je potřebný jen málonásobný molámí přebytek TL2. To je významné, jelikož se pozorovalo v jednotlivých příkladech in vivo (příklad 17 a obr. 16), že TL2 mRNA dosahuje značné hojnosti se zřetelem na mRNA TLI. TL2 tak může mít významnou fyziologickou úlohu kúčinnému blokování, signalizací TIE-2-R v těchto místech.
Tak se zjistilo, že na rozdíl od TLI, TL2 je neschopen stimulovat endogenně exprimovaný TIE-2-R na endoteliových buňkách. Nadto může málonásobný molámí přebytek TL2 blokovat stimulaci receptorů TIE-2, což značí, že TL2 je přirozeně se vyskytujícím antagonistem v TIE-2 receptorů.
-27CZ 295371 B6
Příklad 10
Identifikace specifické vazební aktivity TIE-2 v kondicionovaném médiu buňky COS
Vazební aktivita ÍOxCCM z buněčných linií C2C12-ras, Rat2-ras, SHEP a T98G, nebo supernatantů buněk COS po transfekci buď s lidským TIE-2 ligandem 1 (hTLl), nebo lidským TIE-2 ligandem 2 (hTL2) se měří pomocí biosenzorové technologie (BIA-core; Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ), která monitoruje biomolekulámí interakce v reálním čase cestou povrchové plazmové rezonance (SPR). Vyčištěné krysí nebo lidské TIE-2 RB byly kovalentně kopulovány přes primární aminy ke karboxymethyldextranové vrstvě senzorového čipu CM5 výzkumného druhu (Pharmacia Biosensors; Piscatawy, NJ). Povrch senzorového čipu byl aktivován pomocí směsi N-hydroxysukcinimidu (NHS) a N-ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)karbodiimidu (EDC), následnou imobilizací TIE-2 RB (25 pg/ml, pH 4,5) a deaktivací nezreagovaných míst l,0M ethanolaminem (pH 8,5). K senzorovému čipu bylo kopulováno obecně 9000 až 10000 RU každého receptorového tělesa.
Běžným pufrem, použitým v systému, byl HBS (10 mM Hepes, 150 mM chloridu sodného, 0,005 % povrchově aktivního činidla P20, hodnota pH 7,4). Vzorky se odstřeďovaly po dobu 15 minut při teplotě 4 °C a vyčeřily se použitím sterilního 0,45 pm filtru s nízkou vazbou proteinů (Millipore, Bedford, MA). Ke každému vzorku byl přidán Dextran (2 mg/ml) a povrchově aktivní činidlo P20 (0,005 %). Přes imobilizovaný povrch byly injektovány podíly 40 μΐ (krysího nebo lidského TfE-2) nízkou rychlostí 5 μΐ/min a receptorová vazba byla sledována po dobu osmi minut. Vazební aktivita (v rezonančních jednotkách RU) byla měřena jako rozdíl mezi základní hodnotou stanovenou 30 sekund před injekcí vzorku a měřením 30 sekund po injekci. Regenerace povrchu byla provedena jedním pulzem 15—μΐ 3M chloridu hořečnatého.
Vzorky CCM (C2C12-ras, Rat2-ras, SHEP, T98G) byly testovány na krysím imobilizovaném povrchu TIE-2 RB, zatímco rekombinantní HTLl a HTL2 byly testovány na imobilizovaném povrchu lidského TIE-2 RB. V každém případě byla specifická vazba na receptorové těleso TfE-2 vyhodnocena inkubací vzorků s 25 pg/ml buď rozpustným TIE-2 (krysím nebo lidským) RB, nebo trkB RB před zkoumáním vazební aktivity. Jak patrno na obr. 10 a 11, přísada rozpustného trkB RB způsobuje mírný pokles vazební aktivity TIE-2, zatímco přísada rozpustného TIE-2 RB snižuje významně vazební aktivitu ve srovnání s aktivitou měřenou v nepřítomnosti TIE-2 RB.
Příklad 11
TIE-2 RB specificky blokuje aktivaci receptoru TIE-2 ligandem 1 TIE-2
Zkoumá se, zda rozpustný TIE-2 RB může sloužit jako konkurenční inhibitor k blokování aktivace TIE-2 receptoru TIE-2 ligandem 1 (TLI). Ktomu byla média COS, obsahující TLI, předběžně inkubována buď s TIE-2, nebo TrkB-RB a pak pozorována z hlediska schopnosti aktivovat TIE-2 receptory přirozeně obsažené v lidské linii endoteliových buněk.
Kondiciovaná média COS byla vytvořena z buněk COS-7 transfektovaných buď se samotným expresním vektorem pJFE14 (MOCK), nebo s vektorem pLFE14, obsahujícím lidský TIE-2 ligand 1 cDNA (TLI) a shromážděna, jak popsáno shora v příkladu 9, s tou výjimkou, že média byla sterilně zfiltrována, avšak bezkoncentrována. Množství ZLÍ bylo určeno a vyjádřeno jako množství (v rezonančních jednotkách R.U.) vazební aktivity specifické pro receptor TIE-2 měřené vazebním testem BIAcore.
-28CZ 295371 B6
Analýzy Northern (RNA) ukázaly významné úrovně transkriptů TIE2 ve HUVEC (Human Umbilical Vein Endosthelial Cell) lidských primárních endoteliových buňkách (Clonetics, lne.). Proto byly tyto buňky použity ke zjištění, zda může být TIE-2 receptor tyrozinem fosforylován, je-li vystaven v přítomnosti TIE-2 nebo TrkB-RB médiu COS obsahujícímu TLI. Buňky HUVEC byly udržovány při teplotě 37 °C v 5% oxidu uhličitém v úplném růstovém prostředí endoteliových buněk (Clonetics lne.), které obsahovalo 5 % zárodečného telecího séra, rozpustný extrakt hovězího mozku s 10 pg heparinu,10 ng/ml lidské EGF, 1 mg/ml hydrokortisonu, 50 mg/ml gentamicinu a 50 ng/ml amfotericinu-B. Posouzení, zda může TLI aktivovat receptor TL2 v buňkách HUVEC, se provádí tímto způsobem: Slinuté misky buněk HIVEC se nechají dvě až čtyři hodiny vyhladovět sérem v Dulbeco MEM s nízkou glukózou při teplotě 37 °C, načež následuje desetiminutová inkubace ve vyhladovacím médiu, které obsahuje 0,1 mM ortovanadátu sodného, mocného inhibitoru fosfotyrozinových fosfatáz. Mezi tím se předběžně inkubuje 30 minut při teplotě místnosti kondicionované médium COS buď TIE-2, nebo TrkB-RB přidaným do 50 pg/ml uvedeného média. Vyhladovací médium se z misek HUVEC odstraní a inkubuje se s médiem COS obsahujícím RB sedm minut při teplotě 37 °C. Buňky HUVEC se lyžují a protein TIE-2 se získá imunoprecipitací peptidovým antisérem TIE-2, načež následuje Western blotting antifosfotyrozinovým antisérem, přesně jak je popsáno v příkladu 1. Výsledky jsou na obr. 12. Fosfotyrozinové hladiny TIE-2 receptoru se zavedou zpracováním buněk HUVEC TIE-2 ligandem 1 (TLI), podobným s pozorovaným u kontrolního média (MOCK), a tato indukce je specificky blokována předběžnou inkubací TIE-2 RB (TIE-2-FC), nikoli však inkubací TIE-2 RB (TrkB-Fc). To znamená, že rozpustný TIE-2 RB může sloužit jako selektivní inhibitor k blokové aktivaci TIE-2 receptoru TIE-2 ligandem 1.
Příklad 12
Konstrukce ligandových těles TIE-2
Vytvoří se expresní konstrukt, který může poskytovat sekreční protein sestávající z úplné kódovací sekvence lidského TIE-2 ligandu 1 (TLI) nebo TIE-2 ligandu 2 (TL2) fúzovaného na lidskou konstantní oblast imunoglobulinu gama-1 (lgGl Fc). Tyto fúzované proteiny se nazývají „ligandobodies“ TIE-2 (TLl-Fc nebo TL2-Fc). Fc část TL1-FC a TL2-FC se připraví následujícím způsobem: Fragment DNA, kódující Fc část lidského lgGl, který zasahuje od stěžejní oblasti ke karboxylovému konci proteinu, se zesílí z lidské placentální cDNA pomocí PCR s oligonukleotidy odpovídajícími publikované sekvenci lidského lgGl; výsledný fragment DNA se klonuje do plazmidového vektoru. Příslušné restrikční fragmenty DNA od plazmidu kódujícího receptoru TLI a TL2 v plné délce a od lidského plazmidu lgGl Fc se liguje po obou stranách krátkého fragmentu, odvozeného od PCR, který byl určen k fúzování do TLI a TL2 s lidskými sekvencemi kódujícími lgGl Fc.
Klonováním fragmentu DNA TL2-FC do vektoru baculoviru pVL1393 se získají miligramová množství TL2 Fc, načež se infikuje buněčná linie SF-21AE hmyzu Spodoptera frugiperda. Alternativně může být použito buněčné linie SF-9 (ATCC Accession No. CRL-1711) nebo buněčné linie BTI-TN-5bl-4. DNA, kódující TL2-Fc, se klonuje jako fragment Eco Rl-Notl do transfektorového baculorivu plazmidu pVL1393. Plazmid DNA se rekombinuje do virové DNA přimíšením 3 pg plazmidu DNA s 0,5 pg DNA Baculo-Gold (Pharminigen) následovaným zavedením do liposomů pomocí 30 pg Lipofektinu (GIBCO-BRL). Přidávají se DNA-liposomové směsi do buněk SF-21AE (2x106 buněk na 60 mm misku) v médiu TMN-FH (Modifíed Grace's Insect Cell Medium) (GIBCO-BRL) na pět hodin při teplotě 27 °C, načež následuje inkubace pět dní při teplotě 27 °C v prostředí TMN-FH doplněném 5 % zárodečného telecího séra. Médium tkáňové kultury se shromáždí k destičkovému čištění rekombinantních virů, což se provede shora popsanými způsoby (D.R. O'Reily, L.K. Miller a V.A. Luckow, Baculovirus Exprimsion Vectors- A Laboratory Manual 1992, New York: W.H. Freeman) s výjimkou, že agarová vrchní vrstva obsahovala 125 mg/ml X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-|3-D-29CZ 295371 B6 galaktopyranosidu GIBCO-BRL). Po pětidenní inkubaci při teplotě 27 °C byly počítány nerekombinantní destičky pozitivní chromogenickou reakcí na X-gal substrát a jejich polohy se vyznačí. Rekombinantní destičky se pak zviditelní přísadou druhé vrchní vrstvy obsahující 100 pg/ml MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-difenyltetrazoliumbromid; Sigma). Domnělé destičky rekombinantního viru se vyjmou odsátím zátkou a vyčistí se několika průběhy izolace destiček k zaručení homogenity. Zásoby viru se vytvoří sérií několikanásobným průchodem viru vyčištěného destičkami. Získají se zásoby jednoho klonu viru s nízkým průchodem (vTL2-Fc klon #7).
Buňky SF-21AE se pěstují v médiu prostém séra (SF-900II Gibco BRL) obsahujícím roztok IX antibiotika a antimykotika (Gibco BRL) a 25 mg/1 gentamycinu (Gibro-BRL). Přidá se Pluronik F-68 jako povrchově aktivní činidlo do konečné koncentrace 1 g/1. Před infikováním se kultury (4 1) ponechají nejméně tři dny v bioreaktoru (Artisan Cell Station Systém). Buňky se nechají růst při teplotě 27 °C v plynu obsahujícím 50 % rozpuštěného kyslíku při proudění plynu iychlostí 80 ml/min (ovzdušnění na rozprašovacím prstenci). K ovzdušnění sloužil námořní ventilátor s počtem otáček 100/min. Buňky se shromáždí ve střední logaritmické růstové fázi (2xl06 buněk/ml), zkoncentrují se odstředěním a infikují se 5 jednotkami tvořícími destičky receptorových těles vTL2-Fc na buňku. Buňky se inokulum se vnesou do 400 ml čerstvého média a virus se adsorbuje dvě hodiny při teplotě 27 °C v odstředivkové zkumavce. Kultury se resuspenduje na konečný objem 8 1 čerstvým médiem prostým séra a buňky se inkubují v bioreaktoru ze shora popsaných podmínek.
Po 72 hodinách od infikování se kultivační médium od buněk SF-21AE, infikovaných v TL2-FC, shromáždí odstředěním (500x g, 10 minut). Hodnota pH buněčných supematantů se upraví na 8 hydroxidem sodným. Přidá se EDTA do konečné koncentrace 10 mM a hodnota pH supematantu se znovu upraví na 8. Supematanty se zfiltrují (0,45 pm Milipore) a vnesou se na sloupec proteinu A separosy 4 nebo HiTrap proteinu A (rychle tekutý protein A separosy 4 nebo HiTrap protein A, obojí obchodní produkt společnosti Pharmacia). Sloupec se promývá PBS obsahujícím 0,5M chloridu sodného až do klesnutí adsorbance při 280 nm na základní linii. Sloupec se promyje PBS a eluuje při 280 nm na základní linii. Sloupec se promyje PBS a eluuje se 0,5M kyselinou octovou. Frakce kolony se okamžitě neutralizují eluováním do zkumavek obsahujících 1M Tris, hodnota pH 9. Píkové frakce, obsahující TL2-FC se zředí a dialyzují se proti PBS.
Příklad 13
Exprese TIE-1, TIE-2, TLI a TL2 v karcinomu ledvinových buněk
Pokusy hybridizace in šitu byly provedeny na lidské tkáni rakovinových nádorových buněk pomocí sond cDNA TIE-1, TIE-2, TLI a TL2. Exprese TIE-1, TIE-2, TLI a TL2 byly všechny přeregulovány v cévním řečišti nádoru. Ukázalo se, že ligandová exprese je umístěna buď na cévních endoteliových buňkách (TL2), nebo v jejich těsné blízkosti vmesenchymu (TLI). Je patrno, že VEGF je dramaticky přeregulován v této nádorové tkáni (Brown a kol. Am. J. Pathol. 143, str. 1255 až 1262, 1993).
Příklad 14
Exprese TIE-1, TIE-2, TLI a TL2 při hojení ran
Byly provedeny pokusy in šitu na průřezových proužcích tkáně získané z modelu krysích řezných ran pomocí sond cDNA TIE-1,TIE-2, TLI a TL2. Model hojení ran zahrnuje přitisknutí malé korkové vývrtky ke kůži krysy a odejmutí malého válcového vzorku kůže. Když začne hojení na spodině rány, odebere se svislý proužek tkáně a použije se ho k hybridizaci in šitu. V testovaném
-30CZ 295371 B6 vzorku se jeví TLI a TL2 mírně přeregulované čtyři dny po poranění. Na rozdíl k mírně přeregulované expresi TLI a TL2 v této tkáni, je dramaticky přeregulována exprese VEGF, která může předcházet expresi TLI a TL2.
Příklad 15
Exprese ligandů v játrech a v brzlíku myšího zárodku
Provedla se reverzní transkripce PCR (RT-PCR) na játrech E14,5 myšího zárodku a na brzlíku El7,5 myšího zárodku. Elektroforéza agarového gelu produktů RT-PCR ukázala, že v myších zárodečných játrech je TIE-2 ligand 1 (TLI) RNA obohacen v podpůrné vazivové oblasti, chybí však v hematopoietických prekurzorových buňkách c-kiťTERl 19. V téže tkání je TIE-2 ligand 2 (TL2) RNA obohacen ve vazivových buňkách, chybí však v hematopoietických prekurzorových buňkách (obr. 13). V myším zárodečném brzlíku je TL2 obohacen ve vazivových buňkách (obr. 14).
Příklad 16
Systém TIE receptor/ligand v angiogenezi
Ačkoliv se jeví, že ligandový systém TIE-2/TIE má významnou úlohu v biologii endoteliových buněk, nemá významnou aktivní úlohu v počátečních až středních stadiích tvorby cév (například proliferace angioblastových nebo endoteliových buněk a jejich migrace, tvorba kanálků a další počáteční děje ve vytváření cév). Na rozdíl od receptorů a faktorů, o kterých je známo, že zprostředkují tyto děje ve vývoji cév, naznačuje dočasný pozdější obrazec exprese TIE-2 a TLI v průběhu tvoření cév, že tento systém má odlišnou úlohu v pozdějších stadiích vývoje cév, včetně strukturní a funkční odlišnosti a stabilizace krevních cév. Obrazec exprese TIE-2 TLI je také konzistentní s pokračující úlohou v uchování strukturální integrity a/nebo fyziologické charakteristiky ustálené vaskulatury.
Zdá se, že ligand 2 (TL2) je konkurenčním inhibitorem TLI. Prostočasová charakteristika exprese TL2 naznačuje, že tato samotná inhibiční molekula může mít několikanásobnou úlohu závislou na kontextu, potřebnou k příslušnému vývoji nebo přemodelování (například destabilizaci/dediferenciaci zralých endoteliových buněk umožňujících tvoření nových cév ze stávající vaskulatury, inhibici vytváření nevhodných krevních cév a regresi/involuci zralých krevních cév). Na obr. 15 je schematicky znázorněna hypotetická úloha ligandů TIE-2/TIE při angiogenezi. Na tomto obr. je TLI vyznačena tečkou (.), TL2 hvězdou (x), TIE-2 je vyznačena (T), VEGF závorkou ([]) a flk-1 (receptor VEGF) je znázorněna (y).
Příklad 17
Exprese ligandů v ženském reprodukčním systému: exprese ve vaječníku
Předběžné poznatky z pokusů zkoumajících expresi TIE receptorů a ligandů v ženském reprodukčním systému jsou konzistentní s hypotézou o úloze TLI v neovaskularizaci, která časově následuje po VEGF. Obrazec exprese TL2 také souhlasí s antagonismem působení TLI a se specifickou úlohou v cévní regresi. K ověření může být zkoumána exprese relevantních mRNA následující po experimentální indukci vývoje folikula a žlutého tělíska, takže jejich časový poměr k různým aspektům systému neovascularizace/vaskulámí regrese může být jasněji definován (například ve spojení s barvením endoteliových buněk cévních výplní). Angiogeneze, spojená s vývojem folikula a s tvořením žlutého tělíska ve vaječnících dospělých krysích samic nebo sledování indukované ovulace v předpubertálních zvířatech se sledovala pomocí hybridizace in
-31 CZ 295371 B6 šitu. Obr. 16 obsahuje snímky in šitu hybridizačních řezů ukazující časový obrazec exprese TIE2, TLI, TL2 a VEGF během ovariálního cyklu [Sloupec 1: časný předovulační folikul, sloupec 2: předovulační folikul, sloupec 3: časné žluté tělísko a sloupec 4: atretický folikul, řádek A: světlé pole, řádek B: VRGF, řádek C: TL2, řádek D: TLI a řádek E receptor TIE-2], Tyto studie ukázaly, že VEGE, TLI a TL2 jsou exprimovány časově a prostorově koordinovaným způsobem vzhledem k vývoji a regresi vaskulatury ve vaječníku, specificky s ohledem na ustavení cévního systému, který je generován v průběhu konverze vaječníkového folikula na žluté tělísko (CL).
Je možno konstatovat, že exprese VEGF se zvětšuje ve vrstvě folikulámích granulí před vaskularizací během procesu vývoje žlutého tělíska. V průběhu procesu vytváření CL se vyskytují nejvyšší hladiny VEGF uprostřed vyvíjejícího se CL v sousedství vývoje buněk žlutého tělíska, které nebyly dosud vaskularizovány. Hladiny VEGF zůstávají středně vysoké a jsou difuzně rozděleny ve vyvinutém CL. Na rozdíl od toho, vykytuje se patrná zlepšená exprese TIE-2 ligandu pouze později v procesu vytváření CL, po ustavení primárního vaskulámího plexu. Později je v celém CL patrná exprese TLI, kdy bylo ustaveno definitivní kapilární síťoví CL.
TL2 vykazuje značně složitější obrazec exprese než VEGF nebo TLI. Při vývoji CL je TL2 exprimován při nejvyšších úrovních na čele vyvíjejícího se kapilárního plexu mezi centrální vaskulámí oblastí CL, kde je exprese VEGF nejvyšší a nejvíce obvodová část CL, kde exprese TLI převládá a kde proces vývoje žlutého tělíska je ukončena a vaskulámí systém je nejzralejší. Zdá se, že TL2 je také exprimován ve vysokých hladinách ve folikulámí vrstvě velkých folikulů, které prodělávají atresii. Zatímco je TLI také patrná v atretických folikulech, VEGF není exprimována.
Shora popsaný model exprese je nejkonzistnější s úlohou VEGF v iniciaci angiogeneze, s TLI působícím v tomto procesu později - například při modelování a/nebo stabilizaci definitivního cévního síťoví. Na rozdíl od toho je TL2 obsažená jako v oblastech aktivní expanze nově se tvořícího cévního síťoví (během tvoření CL), tak v oblastech, které selhávají ve vytváření nové vaskulatury a vaskulámí regrese převládá (atretické folikuly). To naznačuje dynamičtější a komplexnější úlohu pro TL2, možná zahrnující destabilizaci stávající vaskulatury (nutné pro regresi) nebo vývoj vaskulatury (nutné pro dynamické formování nově se tvořících cév).
Příklad 18
Test vazby receptorového tělesa a test ligandové vazby a kopetice
Byl vyvinut kvantitativní test buněk prosté vazby ve dvou alternativních podobách k detekci buď vazby TIE-2 receptorové látky, nebo ligandové vazby a konkurence. Ve verzi testu vazby receptorové látky se ligandy TIE-2 (vyčištěné nebo částečně vyčištěné; buď TLI, nebo TL2) nanesou na destičku ELISA. Přidá se receptorová látka v různých koncentracích, která se váže na imobilizovaný ligand způsobem závislým na dávce. Po dvou hodinách se receptorová látka odplaví, množství vázané na destičku se reportuje pomocí specifické anti-lidské Fc protilátky, která je značená alkalickou fosfatázou. Přebytek reportérové protilátky se odplaví, načež se vyvolá reakce AP pomocí barevného substrátu. Test se vyhodnocuje spektrofotometrem. Obr. 19 ukazuje typickou křivku vazby TIE-2-lgG. Testu bylo použito k vyhodnocení integrity TIE-2lgG. Testu bylo použito k vyhodnocení integrity TIE-2-lgG po injektování do krys a myší. Testu může být použito v této podobě jako testu ligandové konkurence, při které čištěné nebo částečně vyčištěné TIE ligandy konkurují s imobilizovaným ligandem pro těleso receptoru. Ve verzi ligandové vazby nebo konkurenční verzi vazebního testu se destička ELISA povlékne TIE-2 ektodoménou. Fragmenty Fc-značené domény podobné fibrinogenu TIE ligandů (TLI fFc a TL2-fFc) se vážou na ektodoménu a mohou být detekovány pomocí stejné antihumánní Fc protilátky, jak shora popsáno. Na obr. 20 je příklad vazby Tll-fFc na ektodoménu TIE-2. Této verze testu může být také použito ke kvantitativnímu vyhodnocení hodnot TLl-fFc v séru nebo
-32CZ 295371 B6 v jiných vzorcích. Pokud neznačený ligand (opět buď vyčištěný, nebo nevyčištěný) je přidán současně jako Tll-fFc, pak nastane konkurence mezi značeným ligandovým fragmentem a ligandem v plné délce. Ligand v plné délce může vytěsnit Fc-značený fragment a vytvoří se konkurenční křivka.
Příklad 19
Jako reportéra buněčné linie pro aktivitu TIE ligandu může být použito buněčné linie EA.hy926
EA.hy926 je buněčná hybridní linie, která se ustavila fúzí HUVEC s buněčnou linií odvozenou z karcinomu lidských plic A549 (Edgell a kol., Proč. Nati. Acad. Sci (USA) 80, str. 3734 až 3737, 1983). Zjistilo se, že buď EA.hy926 exprimují významné množství proteinu TIE-2 receptoru s nízkými bazálními úrovněmi fosfotyrozinu. Hustota, při které jsou buňky EA.hy926 pasažovány před svým použitím pro receptorové testy, stejně jako jejich stupeň slinutí v době testu, může ovlivnit receptorovou hojnost a relativní indukovatelnost v odezvě na zpracování ligandem. Přijetím následujících režimů pro růst těchto buněk může být linie buněk EA.hy926 použito jako závislého systému pro test aktivit ligandu TIE-2.
Buňky EA.hy926 se nasadí v množství l,5x 106 buněk do baněk T-75 (Falconware) a každý druhý den se jim přidají živiny Dulbeco MEM obsahující vysoké množství glukózy, 10 % zárodečného hovězího séra, L-glutamin, penicillin-streptomycin a lx hypoxanthin/aminopterin/thymidin (HAT, Gibco/BRL). Po třech až čtyřech dnech růstu se buňky ještě jednou přemístí do baňky T-75 v množství l,5xl06 buněk a kultivují se po dobu dalších tří až čtyř dní. K fosfory lačním testům se buňky upraví, jak shora uvedeno, vyhladoví se na sérum náhradou kultivačního média DMEM s vysokou glukózou a inkubují se dvě až tři hodiny při teplotě 37 °C. Toto médium se z baňky odsaje a do baňky se přidají vzorky kondiciovaného média nebo vyčištěného ligandu v celkovém množství 1,5 ml, načež následuje inkubace 5 minut při teplotě 37 °C. Baňky se z inkubátoru vyjmou a umístí se na vrstvu ledu. Médium se odstraní a nahradí se 1,25 ml lyzového pufru obsahujícího 1 % nonidet P-40, 0,5 % deoxycholátu sodného, 0,1 % SDS ve 20 mM Tris, hodnota pH 7,6, 150 mM chloridu sodného, 50 mM fluoridu sodného, 1 mM orthovanadátu sodného, 5 mM benzamidinu a 1 mM EDTA obsahující inhibitory proteázy PMSF, aprotidin a leupeptin. Po 10 minutách na ledu k rozpuštění membrán, se destičky seškrábou a buněčné lyzáty se vyčeří mikroodstředěním vrcholovou rychlostí 10 minut při teplotě 4 °C. TIE-2 receptor se imunoprecipituje zvyčeřeného supematantu inkubací v chladu s antiTIE-2 polyklonálním antisérem a s protein G-konjugovanými kuličkami sefarosy. Kuličky se promyjí třikrát studeným lyzovým pufrem a vaří se 5 minut v Laemliho vzorkovém pufru, který byl pak vylit na 7,5% SDS-polyakrylamidové gely. Rozpuštěné proteiny se elektrotransferují na membránu PVDF (Lambia-P) a pak se podrobí analýze Western blot za použití anti-fosfotyrozinové protilátky a reakčního činidla ECL. Následující porovnání celkových hladin proteinu TIE-2 na těchže blotech se provede stripováním anti-fosfotyrozinové protilátky a reinkubací s polyklonálním antisérem specifickým pro ektodoménu TIE-2.
Příklad 20
Izolace a sekvencování klonu cDNA o plné délce kódujícího savčí TIE ligand-3
TIE ligand-3 (TL3) se klonuje zgenomické knihovny myšího BAC (Research Genetetics) hybridizací knihovních duplikátů buď myší sondy TLI, nebo myší sondy TL2 odpovídající celé kódovací sekvenci těchto genů. Každá kopie knihovny se hybridizuje pomocí fosfátového pufru přes noc při teplotě 55 °C. Po hybridizací se filtry promyjí pomocí 2xSSC, 0,1% SDS při teplotě 60 °C, načež následuje expozice filtrů na rentgenový film. Identifikují se silné hybridizační signály odpovídající myšímu TLI a myšímu TL2. Kromě toho se identifikují signály, které slabě hybridizují jak myší TLI, tak myší TL2. DNA odpovídající těmto klonům se vyčistí, pak digerují
-33CZ 295371 B6 s restrikčními enzymy a dva fragmenty, které hybridizovaly na původní sondy se subklonují na bakteriální plazmid a sekvencují se. Sekvence plazmidu obsahuje dva exony s homologií jak myšího TLI, tak myšího TL2. Primerů specifických pro tyto sekvence se použije jako primerů PCR k identifikaci tkání obsahujících transkripce odpovídající TL3. Svazek PCR odpovídající TL3 byl identifikován v knihovně cDNA myší dělohy v lambda gt—11 (Clontech Laboratories, lne. Palo Alto, CA).
Destičky se povléknou 1,25x106/20x20 cm a pořídí se replikové filtry standardním způsobem (Sambrook a kol. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. vydání, str. 8 až 46, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York). Duplikátní filtry se sejmou při „normálním“ řádkování (2 x SSC, 65 °C) s 200 bp PCR radioaktivní sondou myší sekvence TL3. Hybridizace se provádí při 65 °C v roztoku obsahujícím 0,5 mg/ml DNA lososího spermatu. Filtry se promyjí 2x SSC při teplotě 65 °C a exponují se 6 hodin na rentgenový film. Zachytí se dva pozitivní klony, které hybridizují v duplikátu. Digesce EcoRI fágu DNA, získaného z těchto klonů, indikuje dva nezávislé klony s vloženými rozměry přibližně 1,2 kb a přibližně 2,2 kb. Vložka
2,2 kb EcoRI se subklonuje do místa EcoRI pBluescriptu KS (Stratagene). Sekvenční analýza ukázala, že delšímu klonu chyběl iniciátor methioninu a signál peptidu ale jinak zakódoval sondu homologicky k jak myšímu TLI, tak k myšímu TL2.
Pak byly syntetizovány dva primery PCR specifické pro TL3
US2: cctctgggctcgccagtttgttagg
US1: ccagctggcagatatcagg
Pomocí expresních knihoven, odvozených z myších buněčných linií C2C12ras a MG87, byly provedeny následující reakce PCR. V primární reakci PCR bylo použito ve spojení s oligy specifickými pro vektor k umožnění zesílení v každé orientaci. PCR byl v celkovém objemu 100 ml používající 35 cyklů 94 °C, 1 min; 42 °C nebo 48 °C na 1 min, 72 °C, 1 min. Sekundární reakce pCR zahrnovaly sekundární specifický primer, US1, který je obsažen v primárním produktu PCR, ve spojení se stejným oligo vektorem. Sekundární reakce činily 30 cyklů pomocí stejných teplot a časů jako shora uvedeno. Produkty PCF byly gelově izolovány a podrobeny sekvenční analýze. Na základě sekvencí získaných z celkem čtyř nezávislých reakcí PCR, používajících dvou různých knihoven cDNA, byl odvozen konec 5' sekvence TL3. Northem analýza ukázala střední až nízké hodnoty myšího transkriptu LT3 a myší placentě. Exprese myšího TL3 sestávala z transkriptu přibližně 3kb. Kódovací sekvence TL3 v plné délce je na obr. 21.
Myší sekvence TL3 je pak možno použít k získání lidského klonu obsahujícího sekvenci lidské TL3 hybridizací buď lidské genomové knihovny, nebo cDNA se sondou odpovídající myšímu TL3, jak bylo shora popsáno například v příkladu 8.
Příklad 21
Izolace genomového klonu v plné délce kódujícího lidský TIE ligand-4
Z myší BAC genomové knihovny (BAC HUMAN (II), Genome Systems lne.) byl klonován ligand-4 (TL4) hybridizací duplikátové knihovny buď s lidskou radioaktivní sondou TLI k úplné sekvenci TLI kódující fibrinogen (nukleotidy 1153 až 1806 z obr. 4), nebo z myší radioaktivní sondou TL3 odpovídající segmentu 186 nukleotidů z fibrinogenní oblasti myšího TL3 (nukleotidy 1307 až 1492 z obr. 21). Každá sonda se značí pomocí přesných oligonukleotidů a standardních podmínek PCR s výjimkou náhrady dCTP P32dCTP. Směs PCR se nechá procházet gelovým filtračním sloupcem k oddělení sondy od volného P32dCTP. Každá kopie knihovny se hybridizuje pomocí fosfátového pufru a radioaktivní sondou přes noc při teplotě 55 °C za použití standardních hybridizačních podmínek. Po hybridizací se filtry promyjí 2x SSC,
-34CZ 295371 B6
0,1 % SDS při teplotě 55 °C následované expozicí na rentgenový film. Pozorují se silné hybridizační signály odpovídající lidské TLI. Kromě toho se identifikují signály, jež slabě hybridizují jak lidský TLI, tak myší TL3. DNA, odpovídající těmto klonům, se čistí pomocí standardních postupů, provádí se digesce s restrikčními enzymy a jeden fragment, který hybridizoval k původním sondám, byl subklonován do bakteriálního plazmidu a sekvencován. Sekvence fragmentů obsahovala jeden exon s homologií jak k lidskému TLI, tak k myšímu TL3 a k dalším členům rodiny ligandů TIE. Primerů specifických pro tyto sekvence může být použito jako primerů PCR k identifikaci tkání obsahujících transkripci odpovídající TL4.
Kompletní sekvence lidského TL4 může být získána sekvencováním plného klonu BAC, obsaženého v uložených bakteriálních buňkách. Exony mohou být identifikovány homologií ke známým členům rodiny ligandů TIE, jak jsou TLI, TL2 a TL3. Úplná kódovací sekvence TL4 může pak být určena spojením dohromady exonů z genomového klonu TL4, což opět může být použito k vytvoření proteinu TL4. Alternativně mohou být exony použity jako sondy k získání plné délky klonu cDNA, kterého může pak být použito k vytvoření proteinu TL4. Exony mohou být také identifikovány ze sekvence klonů BAC homologií k proteinovým doménám, jako jsou fibrinogenní domény, smyčky smyčkových domén, nebo proteinové signály, jako jsou signály peptidových sekvencí. Chybějící exony z klonu BAC mohou být získány identifikací přilehlých klonů BAC, například pomocí konců uloženého klonu BAC jako sondy ke skrínování lidské genomové knihovny, jako je jedna z nich zda použitá pomocí exonové sekvence obsažená v klonu BAC ke snímání knihovny cDNA, nebo provedením buď postupu 5', nebo 3' race za použití oligonukleotidových primerů, založených na sekvencích exonu TL4.
Identifikace dalších členů čeledi ligandu TIE
Nových sekvencí ligandu 4 TIE může být použito k racionálnímu pátrání po dalších členech čeledi ligandů TIE pomocí přístupu, který využívá výhod existence konzervovaných segmentů silné homologie známých členů čeledi. Například seřazení sekvencí aminokyselin ligandů TIE ukazuje několik oblastí konzervované sekvence (viz boxové oblasti na obr. 22). Degenerovaných oligonukleotidů, v podstatě založených na těchto boxech, v kombinaci s buď dříve známými segmenty, nebo novými homologiemi ligandů TIE může být použito k identifikování nových ligandů TIE.
Výše konzervovaných oblastí mezi TLI, TL2 a TL3 může být použito ke konstrukci degenerovaných oligonukleotidových primerů, ve kterých mohou být generovány první rekce pCR použitím cDNA. Matrice cDNA mohou být generovány reverzní transkripcí tkání RNA použitím oligo d(T) nebo jiných příslušných primerů. Podíly reakční směsi PCR mohou pak být podrobeny elektroforéze na agarovém gelu. Výsledné zesílené fragmenty DNA mohou být klonovány začleněním do plazmidů, sekvencovány a sekvence DNA porovnány se sekvencemi všech známých ligandů TIE.
Zesílené fragmenty, vybrané podle velikosti, z těchto reakcí PCR mohou být klonovány do plazmidů, zavedeny do E. coli elektroporací a transformanty mohou být naneseny na selektivní agar. Kolonie bakterií z transformace PCR mohou být analyzovány sekvencováním plazmidových DNA, které jsou vyčištěny standardními plazmidovými postupy.
Klonovaných fragmentů, obsahujících segment nového ligandu TIE, může být použito jako hybridizačních sond k získání klonů cDNA o plné délce z knihovny cDNA. Například může být použito genomové lidské sekvence TL4 k získání lidského klonu cDNA obsahujícího úplnou kódovací sekvenci lidského TL4 hybridizací lidské knihovny cDNA sondou odpovídající lidské TL4, jak bylo shora popsáno.
-35 CZ 295371 B6
Příklad 22
Klonování úplné kódovací sekvence hTL4
Kódovací sekvence 5' a 3' z genomového lidského klonu TL-4, kódující lidský ligand-4 TIE (hTL-4 ATCC Acession No. 98095), byla získána restrikcí enzymové digesce Southem blotting a hybridizací klonu hTL-4 ke kódování sekvencí z myší TL-3 následované subklonováním a sekvencováním hybridizačních fragmentů. Kódovací sekvence, odpovídající N-koncovým a C-koncovým aminokyselinám hTL4, bylo použito ke konstrukci primerů PCR (znázorněno dále), kterým se pak použilo k zesílení PCR TL4 z lidské vaječníkové cDNA. Pásmo PCR se identifikuje jako odpovídající lidské TL4 sekvencováním DNA pomocí sekvenceru ABI 373A DNA a Taq Dideoxy Terminátor Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, lne., Foster City, CA), Pásmo PCR se subklonuje do vektoru pCR-skriptu a několik plazmidových klonů se analyzuje sekvencováním. Úplná kódovací sekvence lidského TL4 se provede jak patrno na obr. 23. Podle jiného provedení vynálezu se zamění nukleotid v poloze 569 z A do G, což vede ke změně aminokyselin z Q na R.
Primery PCR, použité je shora, popsaného se označují takto:
hTL4atg 5- gcatgctattcgagccacc ATGCTCTCCCAGCTAGCCATGCTGCAG-3' hTL4not 5'- gtgtcgacgcggccgctctagatcagacTTAGATGTCCAAAGGCCGTATCATCAT-3'.
Malá písmena vyznačují „tail“ sekvence přidané k usnadnění klonování zesílených fragmentů PCR.
Příklad 23
Konstrukce a charakterizace modifikovaných ligandů TIE
K získání názoru na počet jejich pozorovaných vlastností byla provedena genetická analýza TIE-2 ligandu 1 a TIE-2 ligandu 2 (TLI a TL2). Ačkoli TLI a TL2 mají podobnou strukturální homologii, vykazující rozdílné fyzikální a biologické vlastnosti. Nejprominentnější význak, který rozlišuje oba ligandy, je skutečnost, že ačkoli oba vážou receptor TIE-2, je TLI agonist a TL2 antagonist. Za neredukujících elektroforetických podmínek vykazují oba proteiny kovalentní, multimerní struktury. TLI je produkován jako směs disulfídy zesítěných multimerů, primárních trimerů a druhů vyšších řádu, bez jakýchkoli dimemích druhů. Avšak TL2 se produkuje téměř výhradně jako dimemí druhy. Také, ačkoli TL2 je produkován dobře ve většině expresních systémů. TLI je exprimován zřídka a je obtížné ho vyrobit ve velkých množstvích. Konec výrobní a čisticí podmínky se také jeví jako určující TLI k inaktivaci proteolytického štěpení v místě blízkém aminovému konci.
Ke studiu těchto rozdílů bylo zkonstruováno několik modifikovaných ligandů následujícím způsobem:
23.1 Cysteinová substituce - Výzkum faktorů, které by mohly přispívat k různým fyzikálním a biologickým vlastnostem obou molekul, ukázal přítomnost v TLI cysteinovém zbytku (CYS 265 na obr. 4, CYS 245 na obr. 17) procházející fibrinu podobnou doménu v TLI, nevyskytující se však v TL2 - nebyly tedy odpovídající cysteinové zbytky v TL2. Zbytek cysteinu 265 v TLI je zakódován TGC a je umístěn u nukleotidů 1102 až 1104 (obr. 4) při přibližném spojení mezi stočenou smyčkou a fibrinu podobnou oblastí. Jelikož cysteinové zbytky jsou obvykle zahrnovány do disulfídem vázaných formací, jejichž přítomnost může přispívat jak k terciární struktuře, tak k biologickým vlastnostem molekuly, mělo se zato, že snad přítomnost zbytku CYS265 v TLI může být alespoň částečně zodpovědná za různé vlastnosti obou molekul.
-36CZ 295371 B6
K potvrzení této hypotézy byl zkonstruován expresní plazmid, který obsahoval mutaci v TLI, ve které CYS (zbytek 265 na obr. 4, zbytek 245 na obr. 17) byl nahražen aminokyselinou (serinem), která nevytváří disulfidické vazby. Vedle tohoto TLl/CYS-mutantu byl zkonstruován druhý expresní plazmid, který mutoval přibližně odpovídající polohu v TL2 (Met247 na obr. 17), takže tento zbytek byl nyní cystein. Oba nemutovaný a mutovaný expresní plazmid TLI a TL2 byly přechodně transfektovány do buněk COS7, buněčné supematanty obsahující rekombinantní proteiny se shromáždily a vzorky se podrobily jak redukční, tak neredukční elektroforese SDS/PAGE a následném Western blottingu.
Obr. 18 ukazuje Western bloty za neredukčních podmínek jak mutovaného, tak nemutovaného proteinu TLI a TL2, což ukazuje, že mutant TL1/CYS’ probíhá jako dimer velmi podobně TL2 aTL2/CYS+ je schopen tvořit trimer, stejně jako multimery vyššího řádu podobně TLI. Když byly dva mutantní proteiny testovány z hlediska schopnosti indukovat fosforylaci v expresních buňkách TIE-2, byl mutant TL1/CYS’ schopen aktivovat receptor TIE-2 zatímco mutans TL2/CYS+ nikoli.
Jestliže tedy cysteinový zbytek (zbytek 265 na obr. 4, zbytek 245 na obr. 17). TLI byl geneticky změněn na serin, zjistilo se, že kovalentní struktura TLI se stala podobnou struktuře TL2, tedy primárně dimemí. Modifikovaná molekula TLI se stále chovala jako agonist, tudíž trimemí a/nebo multimerní struktura vyššího řádu nebyla určujícím faktorem dávajícím TLI schopnost aktivace. Ačkoli odstraňování cystainu vytvářelo molekulu s více žádoucími vlastnostmi, nezlepšilo produkční úroveň TLI.
23.2 Dělení domén - Nukleotidové sekvence kódující TLI a TL2 mají genetickou strukturu, která může být rozdělena do tří domén na základě sekvencí aminokyselin zralých proteinů. Posledních přibližně 215 zbytků aminokyselin každého zralého proteinu obsahuje šest cysteinů a tvoří velkou podobnost doméně fíbrinogenu. Tento region byl tedy přejmenován na „fibrinogenu podobná“ doména neboli „F-doména“. Centrální oblast zralého proteinu, obsahující přibližně 205 zbytků, měla velkou pravděpodobnost k předpokladu „smyčkově stočené“ struktury a byla nazvána doména „coiled-coil“ neboli „C-doména“. Aminozakončení přibližně 55 zbytků zralých proteinů obsahovalo dva cysteiny a s nízkou pravděpodobností mělo smyčkově stočenou strukturu. Tato oblast byla pojmenována „N-zakončení“ nebo „N-doména“. Zde popsané modifikované ligandy jsou označovány použitým názvoslovím, kde N = N-koncová doména, C = smyčkově stočená doména, F = fíbrinogenu podobná doména a číslice 1 a 2 se týkají TLI a TL2. Znamená tedy například IN N-koncovou doménu z TLI a 2F fíbrinogenu podobnou doménu TL2.
K vyzkoušení, zda fíbrinogenu podobná doména (F-doména) ligandů TIE-2 obsahuje TIE-2 aktivační aktivitu, se zkonstruovaly expresní plazmidy které vypustily smyčkově stočenou a Nkoncovou doménu a ponechaly pouze část sekvence DNA kódující F-doménu (pro TLI, začínající na obr. 4 přibližně u nukleotidu 1159 zbytku aminokyseliny ARG284; pro TL2 odpovídající přibližně nukleotidu 1200 na obr. 6, zbytku aminokyseliny 282). Tento mutantní konstrukt byl pak transientně transfektován do buněk COS. Získal se supematant, obsahující rekombinantní protein. Mutant TLl/F-domény byl testován z hlediska schopnost vázat receptor TIE-2. Výsledky ukázaly, že jako monomer nebyl mutant TLl/F-domény schopen vázat TIE-2 ve zjistitelné míře.
Jestliže však byl monomer TLl/F-domény značen myc a následně seskupen s protilátkou zaměřenou proti myc tag, vykázal zjistitelnou vazbu TIE-2. Avšak protilátkový seskupený mutant TLl/F-domény nebyl schopen indukovat fosforylaci v buněčné linii exprimující TIE-2.
Zjistilo se tedy, že F-doména ligandů TIE-2 je zapletena do vazby receptoru, ale že zkomolení sestávající ze samotné F-domény není postačující k vazbě receptoru. To vyvolalo možnost, že doména smyčkově stočená zodpovídala za to, že několik domén podobných fíbrinogenu drželo
-37CZ 295371 B6 při sobě, což mohlo být potřebné pro receptorovou vazbu. Ve snaze o potvrzení této domněnky byla F-doména fúzována se sekcí Fc lidské protilátky lgGl. Jelikož Fc sekce dimerizuje na expresi savčími buňkami, napodobovaly tyto rekombinantní proteiny teoretickou konfigurací F-domén, kde nativní ligandy dimenzují. Tento konstrukt F-domény-Fc vázal, avšak nedokázal aktivovat receptor. Multimerace zřejmě způsobená jinými oblastmi ligandu je nutná k uschopnění ligandu vázat receptor TIE-2. Kromě toho musejí některé jiné faktory mimo F-doménu přispívat k fosforylaci receptoru.
Pak byly zkonstruovány mutanty, kterým chyběla fibrinu podobná doména a obsahovaly proto pouze N-koncovou doménu a doménu smyčkově stočenou. Nebyly schopné se vázat na receptor. K odsouzení úlohy N-koncové domény ve vázání receptoru a aktivaci, byly ligandy spleteny až na jejich C- a F-domény a značeny s FLAG tag a se N-zakončením, za vytváření konstruktů, nazývaných FLAG-1C1F a FLAG-2C2F. Ačkoli se tyto molekuly silně vybarvovaly v buňkách COS7 transfektované přechodně kexprimování receptoru TIE-2, selhaly ve výpovědi ve fosforylačním testu. N-Doména tudíž neobsahuje potřebný faktor k aktivaci receptoru, ačkoli, jako uzavřená infra, schopnost chimemích molekul 2N2C1F k aktivování receptoru ukazuje, že dokonce N-doména inaktivního ligandu může splňovat tuto úlohu.
Rozdíly v chování mezi myc-značenou F-doménou a Fc-značenou F-doménou, shora uvedené, naznačily, že ligandy TIE mohou být vázány pouze v dimemích nebo ve vyšších multimemích formách. Ve skutečnosti neredukční SDS-FÁGE ukázala, že ligandy TIE existují přirozeně v dimemích, vtrimemích a v multimemích formách. Skutečnost, že se FLAG-1C1F a FLAG2C2F mohou vázat na receptor TIE-2 bez dimerizace syntetickým zakončením (jako je Fc), zatímco F nemohou, naznačuje, že C-region je alespoň zčásti zodpovědný za agregaci F-domén.
23.3 Záměnné konstrukty (chiméry) - Zjistilo se, že úroveň produkce TLI v buňkách COS7 byla přibližně desetkrát nižší než produkce TL2. Proto se zkonstruovaly chiméry TLI a TL2 ve snaze vysvětlit tento rozdíl a také k dalšímu charakterizování aktivity agonistů TLI ve srovnání s aktivitou agonistů TL2.
Zkonstruovaly se čtyři chiméry, ve kterých jedna z N-koncových domén fibrinogenní domény byla vyměněna mezi TLI a TL2 a byly označeny pomocí shora popsaného názvosloví tak, že například 1N1C2F se týká chiméry mající N-zakončení a smyčkově stočené domény TLI, společně s fibrinogenu podobnou doménou z T2. Čtyři chimeiy byly konstruovány takto:
chiméra 1 - 1N1C2F chiméra 2 - 2N2C1F chiméra 3 - 1N2C2F chiméra 4 - 2N1C1F
Nukleotidy a sekvence aminokyselin chimér 1 až 4 jsou znázorněny na obr. 24 až 27.
Každá chiméra byla začleněna do separátního expresního vektoru pJFE14.
Chiméry byly pak transfektovány do buněk COS7, spolu s prázdným vektorem pJFE14, nativním TLI a nativním TL2 jako kontroly a supematanty kultur se shromáždily.
Ke zjištění, jak změna ovlivní míru exprese ligandů, byly na nitrocelulóze dot-blotována zředění 1:5 a 1:50 supernatantů COS7. Tři ligandy, které obsahovaly TLI N-doménu (tedy nativní TLI, 1N2C2F a 1N1C2F), byly pak sondovány s králičí protilátkou specifickou pro N-zakončení TLI. Tři ligandy, obsahující TL2 N-doménu (tedy nativní TL2, 2N1C1F a 2N2C1F), byly sondovány s králičí protilátkou specifickou pro N-zakončení TL2. Výsledky ukázaly, že buňky COS7 exprimovaly každou molekulu obsahující N-doménu TL2 při přibližně desetinásobku úrovně jakékoliv molekuly obsahující N-doménu TLI, nezávisle na úpravě zbytku proteinu. Dospělo se k závěru, že N-doména musí zásadně řídit úroveň exprese ligandu.
-38CZ 295371 B6
Další otázkou byla schopnost nebo neschopnost chimér aktivovat receptor TIE-2. Buňky EAhy926 byly porovnány se čtyřmi chimérami jakož také sTLl jako pozitivní kontrolou fosforylace a s TL2 nebo s prázdným pJFE14-transfektovaným COS7 buněčným supernatantem jako negativní kontrolou fosforylace. Buňky se lyžují a receptor TIE-2 se imunoprecipituje z buněčného lyzátu a prodělá SDS-PAGE. Vzorky byly Western blotovány a sondovány s antifosfotyrozinovou protilátkou k detekci jakéhokoli receptorů, který byl fosforylován. S překvapením pouze konstrukt obsahující TLI fíbrinu-podobnou doménu (2N1C1F a 2N2C1F) mohl fosforylovat receptor TIE-2.Tudíž, ačkoli N-koncová oblast TLI je potřebná k aktivaci, může být nahražena N-koncovou oblastí TL2, což znamená že informace určující, zda ligand je agonistem nebo antagonistem je aktuálně obsažena ve fíbrinogenu podobné doméně.
Zjistilo se tedy, že F-doména, vedle vázání TIE-2 receptorů je zodpovědná za fosfory lační aktivitu TLI. Dále, když TL2, což je jinak neaktivní molekula, byla změněna náhradou své F-domény F-doménou TLÍ, působila změněná TL2 jako agonist.
Konstrukt 2N1C1F byl však poněkud méně mocný. Signál, způsobený chimérou 2N1C1F, se jevil poněkud silnější než chimérou 2N2C1F, což vedlo k úvahám, že C-doména TLI, ačkoli není rozhodující pro fosforylaci, může zlepšit potenci TLI. Avšak, jelikož vzorky použité k testu fosforylace nebyly normalizovány ve smyslu koncentrace ligandu, bylo možné, že silnější fosforylační signál pouze indikoval přítomnost více ligandu. Fosforylační test se proto opakoval s různým množstvím ligandu ke zjištění, zda aktivní chiméry vyvolávaly rozdílné potence. Koncentrace ligandu v supematantech ligandových transfekcí COS7 byla zjištěna pomocí biosenzorové technologie BIAcore způsoby shora popsanými (T.N. Stitt a kol., Cell 80, str. 661 až 670, 1995). Technologie BIAcore měřila vazbovou aktivitu supematantu k TIE-2 receptorů v dohodnutých jednotkách nazývaných rezonanční jednotky (RU). Obecně byla pozorován velmi dobrý vztah mezi RU a koncentrací ligandu s aktivitou 400 RU, odpovídající přibližně 1 pg proteinu na ml supematantu. Vzorky se zředily na koncentrace 100 RU, 20 RU a5RU a fosforylační test se opakoval. Výsledky ukázaly, že chiméra 2N2C1F byla zřetelně mocnější než jak nativní TLI tak chiméra 1N1C2F při stejných koncentracích.
Jiným zajímavým význakem těchto výměnných konstruktů je jejich úroveň exprese. Každá ze čtyř chimér byla testována z hlediska úrovně produkce buněk COS, schopnost vázat TIE-2 a schopnost fosforylace TIE-2. Výsledky těchto pokusů ukázaly, že chiméry 1 a 3 byly produkovány v množství porovnatelném sTLl, zatímco chiméry 2 a 4 byly produkovány v množství porovnatelném s TL2. Vysoká úroveň produkce proteinu byla tudíž ve vztahu s N-koncovou doménou TL2. Kromě toho při testování na endoteliových buňkách EAhy926, byly chiméry 2 a 4 aktivní, zatímco chiméry 1 a 3 aktivní nebyly. Tato aktivita (fosforylace receptorů) je ve vztahu s fibrinogenu-podobnou doménou TLI. Chiméry 2 a 4 měly obě žádoucí vlastnosti vysoké produkční úrovně stejně jako agonistovou aktivitu.
23.4 Proteolyticky rezistentní konstrukty - Na základě poznatku, že frakce TLI preparátů byla často proteolyticky rozštěpena v blízkosti N-zakončení, se usoudilo, že argininový zbytek v poloze 49 zralého proteinu (obr. 17) byl kandidujícím místem štěpení, které mohlo být účastno na regulaci proteinové aktivity in vivo a náhrada argininu serinem (R49->S) mohl zvyšovat stabilitu proteinu, aniž nutně ovlivnila jeho aktivitu. Takový mutant TIL byl zkonstruován a zjistilo se, že je přibližně stejně aktivní jako nativní TLI, nevykazoval však odolnost proti proteolytickému štěpení.
23.5 Kombinační mutanty - Nejmocnější z chimemích konstruktů 2N1C1F, byl dodatečně změněn tak, že cystein zakódovaný nukleotidy 784 až 787, jak patrno na obr. 27, byl převeden na serin. Tato molekula (označená 2N1C1F (C246S)) byla dobře expresována, případně aktivována receptorem, byla odolná vůči proteolytickému štěpení a byla primárně dimemí, spíše než multimerní vyššího řádu. Zdálo se, že doména 2N udílí proteázovou odolnost molekule. Nakonec byla tato molekula změněna k eliminování potenciálně na proteázu citlivého místa zakódovaného nukleotidy 199 až 201, jak patrno z obr. 27, k získání molekuly (označené 2N1C1F
-39CZ 295371 B6 (R51-»S,C246->S)) u které se očekávalo, že bude aktivující, dobře exprimovaná, dimemí a vůči proteáze odolná.
Tabulka I shrnuje modifikované ligandové konstrukty TIE-2, které byly realizovány, a charakterizuje každý z nich z hlediska schopnosti vázat receptor TIE-2, schopnosti aktivovat receptor TIE-2, typu vytvořené struktury (na příklad monomer, dimer) a relativní produkční úrovně. Nemodifikovaný TLI (plný) a TL2 (čárovaný) jsou znázorněny se třemi doménami jako boxy. Čárkované boxy tedy indikují domény od TL2. Cystein, umístěný v poloze 245 zralého proteinu TLI, je označen „C“. Označení „X“ až „C“ znamená, že cysteinový zbytek byl substituován pro jinou aminokyselinu než například vmutantu TLI CYS~. Podobně „X“ až „R“ v posledním konstruktu znamená substituci pro zbytek Arg v poloze 49 zralého proteinu TLI. „C“ je obsažen v jednom modifikovaném TL2 konstruktu vykazujícím TL2 CYS+ mutant. Konstrukty mají Fc zakončení.
Na základě shora uvedeného je pracovníkům v oboru zřejmé, že další konstrukty jsou možné k vytvoření přídavných modifikovaných a chimemích TIE-2 ligandů s odměněnými vlastnostmi. Například se může vytvořit konstrukt obsahující N-zakončovací doménu a F-doménu TLI fúzovanou se sekcí Fc lidské protilátky IgGl. Tento konstrukt bude vázat a aktivovat TIE-2 receptor. Podobně se mohou vytvořit jiné konstrukty podle shora uvedených skutečností, přičemž tyto konstrukty spadají do rozsahu vynálezu.
23.6 Materiály a způsoby
Konstrukce chimér
Četné konstrukty se včleňují do pJFE14 vektoru, ve kterém je Xbal místo zaměněno za Ascl místo. Tento vektor se digeruje s Ascl a Notl za získání Ascl-NOtl řetězce. Fragmenty DNA pro chiméry se generují PCR za použití vhodných oligonukleotidů.
FLAG-1C1F a FLAG-2C2F inserty se subklonují do pMT21 vektorového řetězce, který se digeruje s ECoRi a NOtl. „CF“ úseky se získají prostřednictvím PCR a FLAG tag a předběžná trypsin signalizující sekvence se konstruuje napojením syntetických oligonukleotidů.
Transfekce
Všechny konstrukty se transfektují přechodně do COS7 buněk za použití buď DEAE-dextranu, nebo LipofectAMINU o sobě známými způsoby. Buněčné kultury se sklidí tři dny po transfekci aodstřeďují se při otáčkách 1000/min po dobu jedné minuty a supematanty se převedou do čistých zkumavek a uloží se při teplotě -20 °C.
Zabarvování FLAG-1C1F transfektovaného a FLAG-2C2F transfektovaných buněk
Šestidůlkové destičky COS7 buněk se transfektují přechodně TIE-2 receptorem. COS7 supernatant z různých ligandových transfekci se inkubuje na buňkách po dobu 30 minut, dvakrát se promyje fosfátem pufrovanou solankou (PBS) bez hořčíku nebo vápníku. Buňky se fixují v methanolu o teplotě -20 °C po dobu tří minut, promyjí se jedno PBS a inkubují se s anti FLAB M2 protilátkou (IBI, zředění 1:3000) v systému PBS/10 % hovězího telecího séra (BCS) po dobu 30 minut. Buňky se promyjí jedno PBS a inkubují se s kozí antimyší IgG alkalickou fosfatázovou (AP) konjugovanou protilátkou (Promega, 1:1000) v systému PBS/10 % BCS. Buňky se promyjí dvakrát PBS a inkubují se s fosfátovým substrátem, BCIP/NBT s lmM levamisolem.
Fosforylační test
Zředí se COS7 supematanty pro studii odezvy na dávku v supematantu COS7 buněk transfektovaných prázdným vektorem pJFE14. EA buňky, které normálně exprimují TIE-2
-40CZ 295371 B6 receptor, se vyhladoví po dobu více než dvou hodin v prostředí prostém séra a následně se působí vhodným COS supematantem po dobu 10 minut při teplotě 37 °C v prostředí 5% oxidu uhličitého. Buňky se propláchnou ledově chladným PBS a lyžují se 1% NP40 lyžovaným pufrem obsahujícím proteázové inhibitory (10pg/ml leupeptinu, 10pg/ml aprotininu, 1 mM PMSF), načež se provede imunoprecipitace s protilátkou specifickou pro TIE-2 receptor. Vzorky se podrobí imunoblot analýze za použití anti pTyr protilátek.
„Dot Blots”
Vzorky se nanášejí na nitrocelulózovou membránu, která se blokuje a sonduje vhodnými protilátkami.
23.7 Produkce chimemího TIE-2 ligandu z CHO a hmyzích buněk infikovaných Bacilovirem
Produkce viru
Gen pro chimemí ligand (označený 2N1C1F (C246S)) se zabuduje do baculovirového expresního plazmidu a rekombinuje se s virovou DNA ke generaci rekombinantního baculoviru, zesíleného a sklízeného způsoby popsanými v literatuře (D.R. O'Reily, L.K. Miller a V.A. Luckow, Baculovirus Exprimsion Vectors - A Laboratory Manual, 1992, New York, W.F. Freeman). SF21 hmyzí buňky (Spodoptera frugiperda) získané z invitrogenu se adaptují a expandují při teplotě 27 °C v séru prostém prostředí Gibco SF900 II. Neinfikované buňky se nechají růst do hustoty 1x600 buněk/ml. Hustota buněk se posuzuje počítáním viditelných buněk za použití hymacytometru. Virový zásobní roztok pro ligand se vnese do bioreaktoru při 0,01 až 0,1 PFU/buňka na začátku infekce. Infekční proces se nechá probíhat podobu tří až čtyř dnů za umožnění maximální virové replikace bez podstatnější lýze buněk. Buněčná suspenze se asepticky rozdělí do sterilních odstředivkových zkumavek a buňky se získají odstředěním (otáčky 1600/min, 30 minut) Supematant, prostý buněk, se shromáždí ve sterilních baňkách a uloží se při teplotě 4 °C za vyloučení světla až do dalšího použití.
Virový titr se stanoví povlakovou zkouškou, kterou popsali D.R. O'Reilly, L.K. Miller a V.A. Luckow. Způsob se provádí v 60 mm tkáňových kultivačních miskách, které se naočkují 1,5x106 buňkami. Přidává se sériové ředění virového zásobního roztoku na zachycení buňky a směs se inkubuje za protřepávání, aby se virus obsahoval na jednotlivých buňkách. Přidá se agarové překrytí a destičky se inkubují po dobu pěti dnů při teplotě 27 °C. Viditelné buňky se zabarvují neutrální červení za zviditelnění okrouhlých povlaků, které se počítají za získání virového titru vyjádřeného počtem povlaků vytvářejících jednotku na ml (PFU/ml).
Infekce buněk pro produkci proteinu
Neinfikované SF21 buňky se nechají růst na tkáňových kultivačních destičkách a přidá se vir obsahující chimemí ligandový gen v množství 1 až 10 pfu/buňka. Vir se nechává absorbovat po dobu 90 minut při teplotě 27 °C za mírného protřepávání a na buňky se nanese čerstvé množství Sf-900 II séra prostého prostředí. Nechá se růst tři dyn při teplotě 27 °C, kapaliny se shromáždí a ligand se stanovuje imunoblotingem.
CHO exprese TIE-2 ligandovými chimérami
TIE-2 ligandové chiméry se klonují do několika savčích buněčných expresních vektorů včetně (avšak bez záměru na jakémkoliv omezení) například pJFE, pcDNA3, pMT21, pED. Plazmidy se transfektují do CHO DG44 buněk (G. Urlaub a L.A. Chasin, Isolation of Chinese hamster cell mutants deficient in hydrofolate reductase activity, Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 77, str. 4216 až 4220, 1980; G. Urlaub, E. Kas, A.M. Carothers a L.S. Chasin, Deletion of diploid dihydrofolate locus from cultured mammalian cells, Cell, 33, str. 405 až 412, 1983) kalciumfosfátovým vysrážením nebo kationtovými liposovými. V případě vektorů postrádajících dhfr selektovatelné
-41 CZ 295371 B6 markéry se plazmid pSV2.dhfr kotransfektuje v 20% molámím poměru do plazmidu obsahujícího TIE ligandové chiméry. DHFR+ buňky se selektují růstem v selekčním prostředí (médium prosté nukleosidů a nukleotidů obsahující 10 % dialyzované zárodečného telecího séra) a klony se skrínují se zřetelem na produkci chimemích TIE ligandů imunoblotingem s TIE-2 receptorovou 5 látkou. Klony, exprimující žádaný protein, se podrobují opakovanému genovému zesílení za použití odstupňovaných koncentrací methotrexátu v selekčním prostředí. Identifikují se vysoce exprimující klony po genovém zesílení podobnými imunoblotingovými způsoby.
Buněčné linie, exprimující chimemí TIE ligandy, se kultivují v mnohovrstvách, v suspenzních ío buňkách, v protřepávaných baňkách a v bioreaktorech v selekčním prostředí nebo v prostředí prostém sekce a mohou se nechávat růst v prostředí prostém séra.
Následující tabulka I se týká mutační analýzy TIE ligandů. Ve sloupci I je vázání TIE-2, ve sloupci II aktivace TIE-2, ve sloupci III multimemí struktura a ve sloupci IV produkční úroveň. 15 „N.D. znamená nestanoveno, „higher order“ vyššího řádu, „LOW“ nízký „HIGH“ vysoký, „HIGH*“ nej vyšší produkce RU a ** nejmocnější aktivace.
-42CZ 295371 B6
Tabulka I
smyekovSfibriI’0' stoCené senové 1 11 111 IV
ml .„I....................±1--------1 + + HGHER ORDER LOW
tu + * CC4ER HGH
ΓΊ 53 1 4· JDOffiR LOW
HGHEA Aercn νΛΙϊΙΛ··»
VA//////7777777A + * HGH
1.....f··— « N.D. N.D, LOW
W//7MM • N.D. N.O. HGH
L_______1 * * MONOMER HGH
tžžžZd * * MONOMER HGH
1 ...................1........ Fc ] + DtMER HGH
F® 1 + * CtMER HGHER OROER HGHER OROER HGH
1 1 «1 1 fis ] + + LOVÍ
777777777X7777/7 F® ] + *· LOW
««s-l 1 cl 1 + + N.D. LOW
f * N.O. HGH
flag -I č] | + * H.D. HGH
^í-W/////777777A •h * N.D. HGH
Π~......~~ ·Χ77777Λ • N.D. LOW
WS/Z/7///L·....... 1 + 4 N.D. HGH*
ΓΤ7////Ζ17////Ζ + 1» N.O. LOW
KT“ 3 1 4. +** N.D. HGH
P/Τ' 5Τ ϊ + + WER HGH
4“ + N.O. LOW
-43CZ 295371 B6
Seznam sekvencí (1) Obecné informace
i) Přihlašovatel: Regeneron Pharmaceuticals, lne.
ii) Název vynálezu: Nové modifikované ligandy iii) Počet sekvencí: 28 iv) Adresy pro korespondenci
A. Adresát: Regeneron Pharmaceuticals, lne.
B. Ulice: 777 Old Saw Milí Road
C. Město: Tarratown
D. Stát: NY
E. Země: Sp. st. a.
F. ZIP: 10591
v) Forma pro počítač
A. Typ média: Disketa
B. Počítač: IBM Compatible
C. Operační systém: DOS
D. Software: FastSEQ Version 2,0 vi) Platné přihlašovací údaje
A. Číslo přihlášky: dosud neznámé
B. Datum podávání:
C. Klasifikace:
vii) Předchozí přihlašovací údaje
A. Číslo přihlášky: USSN 08/740,223
B. Datum dodání: 25. října 1996
C. Klasifikace:
vii) Předchozí přihlašovací údaje
A. Číslo přihlášky: USSN 60/022/999
B. Datum podání: 2. srpna 1996 viii) Informace o zástupci/zmocněnci
A. Jméno: Cobert, Robert J.
B. Registrační číslo: 36,108
C. Referenční/štítkové číslo: REG 333 ix) Telekomunikační informace
A. Telefon: 914-345-7400
B. Telefax: 914-345-7721
-44CZ 295371 B6
2. Informace o sekv. ID. NO. 1:
i) Charakteristiky sekvence
A. Délka: 2149 párů bází
B. Typ: nukleová kyselina
C. Rozvětvení: jeden
D. Topologie: lineární ii) Typ molekuly: DNA ix) Charakteristika
A. jméno/khc: kódující sekvence
B. lokace: 310..1803
D. Jiné informace:
A. jméno/khc: lidský TIE-2 ligand 1
B. lokace: 1....2149
D. Jiné informace: od klonu λ gtlO kódující hite—2 ligand
-45 CZ 295371 B6 xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 1:
CAGCTGACTC GCTACTATGC AAAATTTTAA AACGCTTTCT CTAGTTTTAG GGCAGTACA i
AGGCAGGCTC AATAAATATC AATTTTAGAA TTGAGGGGGA AGGTCAGAAG TG ACA GTT íet Thr Val
CATGCTGAAC TCAAGTTTTA CAAAGCTAAC AAGAGTCAAA AAAGGAGCAA
GGTCACACAG ACGAAGAAAA AAATGGCTAG CAAACAAGCA GTTTTGCGAG
AGAGGAAACA ACATCATTGC TTTTCTATGA GTTTTACCTG AGGCACGGAA
ATAAATCTCA AGTGAAATAA TTCTTCTTCA AAATAAAGAA GGAGTGTGCT
TTC CIT TCC TTT GCT TTC CTC GCT GCC ATT CTG Phe Leu Ser Phe Ala Phe Leu Ala Ala Ile Leu S 10
120
180
240
300
351
ACT CAC ATA GGG Ile Gly TGC AGC Cys Ser 20 AAT CAG CGC CGA AGT CCA Pro GAA AAC AGT GGG 399
Thr 15 His Asn Gin Arg Arg Ser 25 Glu Asn Ser Gly 30
AGA AGA TAT AAC CGG ATT CAA CAT GGG CAA TGT GCC TAC ACT TTC ATT 447
Arg Arg Tyr ASn Arg 35 Ile Gin His Gly Gin 40 Cys Ala Tyr Thr Phe 45 Ile
CTT CCA GAA CAC GAT GGC AAC TGT CGT GAG AGT ACG ACA GAC CAG TAC 495
Leu Pro Glu His 50 Asp Gly Asn Cys Arg 55 Glu Ser Thr Thr Asp 60 Gin Tyr
AAC ACA AAC GCT CTG CAG AGA GAT GCT CCA CAC GTG GAA CCG GAT TTC 543
Asn Thr Asn 65 Ala Leu Gin Arg Asp 70 Ala Pro His Val Glu 75 Pro Asp Phe
TCT TCC CAG AAA CTT CAA CAT CTG GAA CAT GTG ATG GAA AAT TAT ACT 591
Ser Ser 80 Gin Lys Leu Gin His 85 Leu Glu His val Met 90 Glu Asn Tyr Thr
CAG TGG CTG CAA AAA CTT GAG AAT TAC ATT GTG GAA AAC ATG AAG TCG 639
Gin 95 Trp Leu Gin Lys Leu 100 Glu Asn Tyr Ile Val 105 Glu Asn Met Lys Ser 110
GAG ATG GCC CAG ATA CAG CAG AAT GCA GTT CAG AAC CAC ACG GCT ACC 687
Glu Met Ala Gin Ile 115 Gin Gin Asn Ala Val 120 Gin Asn His Thr Ala 125 Thr
ATG CTG GAG ATA GGA ACC AGC CTC CTC TCT CAG ACT GCA GAG CAG ACC 735
Met Leu Glu Ile 130 Gly Thr Ser Leu Leu 135 Ser Gin Thr Ala Glu 140 Gin Thr
AGA AAG CTG ACA GAT GTT GAG ACC CAG GTA CTA AAT CAA ACT TCT CGA 783
Arg Lys Leu 145 Thr Asp val Glu Thr 150 Gin Val Leu Asn Gin 155 Thr Ser Arg
CTT GAG ATA CAG CTG CTG GAG AAT TCA TTA TCC ACC TAC AAG CTA GAG 831
Leu Glu 160 Ile Gin Leu Leu Glu 165 Asn Ser Leu Ser Thr 170 Tyr Lys Leu Glu
AAG CAA CTT CTT CAA CAG ACA AAT GAA ATC TTG AAG ATC CAT GAA AAA 879
Lys 175 Gin Leu Leu Gin Gin 180 Thr Asn Glu Ile Leu 185 Lys Ile His Glu Lys 190
AAC AGT TTA TTA GAA CAT AAA ATC TTA GAA ATG GAA GGA AAA CAC AAG 927
Asn Ser Leu Leu Glu 195 His Lys Ile Leu GlU 200 Met Glu Gly Lys His 205 Lys
GAA Glu GAG TTG GAC ACC TTA AAG GAA GAG AAA GAG AAC CTT CAA GGC Gly TTG Leu 975
Glu Leu Asp 210 Thr Leu Lys Glu Glu 215 Lys Glu Asn Leu Gin 220
GTT ACT CGT CAA ACA TAT ATA ATC CAG GAG CTG GAA AAG CAA TTA AAC 1023
val Thr Arg 225 Gin Thr Tyr Ile Ile 230 Gin Glu Leu Glu Lys 235 Gin Leu Asn
AGA GCT ACC ACC AAC AAC AGT GTC CTT CAG AAG CAG CAA CTG GAG CTG 1071
Arg Ala 240 Thr Thr Asn Asn Ser 245 Val Leu Gin Lys Gin 250 Gin Leu Glu Leu
ATG GAC ACA GTC CAC AAC CTT GTC AAT CTT TGC ACT AAA GAA GGT GTT 1119
Met 2S5 Aap Thr Val His Asn 260 Leu Val Asn Leu Cys 265 Thr Lys Glu Gly Val 270
TTA CTA AAG GGA GGA AAA AGA GAG GAA GAG AAA CCA TTT AGA GAC TGT 1167
Leu Leu Lys Gly Gly 275 Lys Arg Glu Glu Glu 280 Lys Pro Phe Arg Asp 285 Cys
GCA GAT GTA TAT CAA GCT GGT TTT AAT AAA AGT GGA ATC TAC ACT ATT 1215
Ala Asp Val Tyr 290 Gin Ala Gly Phe Asn 295 Lys Ser Gly Ile Tyr 300 Thr Ile
TAT ATT AAT AAT ATG CCA GAA CCC AAA AAG GTG TTT TGC AAT ATG GAT 1263
Tyr Ile Asn 305 Asn Met Pro Glu Pro 310 Lys Lys Val Phe Cys 315 Asn Met Asp
GTC AAT GGG GGA GGT TGG ACT GTA ATA CAA CAT CGT GAA GAT GGA AGT 1311
Val Asn 320 Gly Gly Gly Trp Thr 325 Val Ile Gin His Arg 330 Glu Asp Gly Ser
CTA GAT TTC CAA AGA GGC TGG AAG GAA TAT AAA ATG GGT TTT GGA AAT 1359
Leu 335 Aep Phe Gin Arg Gly 340 Trp Lys Glu Tyr Lys 345 Met Gly Phe Gly Asn 350
CCC TCC GGT GAA TAT TGG CTG GGG AAT GAG TTT ATT TTT GCC ATT ACC 1407
Pro Ser Gly Glu Tyr 3 55 Trp Leu Gly Asn G1U 360 Phe Ile Phe Ala Ile 365 Thr
AGT CAG AGG CAG TAC ATG CTA AGA ATT GAG TTA ATG GAC TGG GAA GGG 145 S
Ser Gin Arg Gin 370 Tyr Met Leu Arg Ile 375 Glu Leu Met Asp Trp 380 Glu Gly
AAC CGA GCC TAT TCA CAG TAT GAC AGA TTC CAC ATA GGA AAT GAA AAG 1503
Asn Arg Ala 385 Tyr Ser Gin Tyr Aep 390 Arg Phe His Ile Gly 395 Asn Glu Lys
CAA AAC TAT AGG TTG TAT TTA AAA GGT CAC ACT GGG ACA GCA GGA AAA 1551
Gin Asn 400 Tyr Arg Leu Tyr Leu 405 Lys Gly His Thr Gly 410 Thr Ala Gly Lys
CAG AGC AGC CTG ATC TTA CAC GGT GCT GAT TTC AGC ACT AAA GAT GCT 1599
Gin 415 Ser Ser Leu Ile Leu 420 His Gly Ala Asp Phe 425 Ser Thr LyB Asp Ala 430
GAT AAT GAC AAC TGT ATG TGC AAA TGT GCC CTC ATG TTA ACA GGA GGA 1647
Asp Aen Asp Asn Cys 435 Met Cys Lys Cys Ala 440 Leu Met Leu Thr Gly 445 Gly
TGG TGG TTT GAT GCT TGT GGC CCC tcc AAT CTA AAT GGA ATG TTC TAT 1695
Trp Trp Phe Asp 450 Ala Cys Gly Pro Ser 455 Asn Leu Asn Gly Met 460 Phe Tyr
ACT GCG GGA CAA AAC CAT GGA AAA CTG AAT GGG ATA AAG TGG CAC TAC 1743
Thr Ala Gly 465 Gin Asn Mis Gly Lys 470 Leu Asn Gly Ile Lye 475 Trp Hie Tyr
-47CZ 295371 B6
TTC AAA GGG CCC AGT TAC TCC TTA CGT TCC ACA ACT ATG ATG ATT CGA 1791
Phe Lye Gly Pro Ser Tyr Ser Leu Arg Ser Thr Thr Met Met Ile Arg
480 485 490
CCT TTA GAT TTT TGA AAG CGCA ATGTCAGAAG CGATTATGAA AGCAACAAAG AAATC 1848 Pro Leu Aep Phe
495
CGGAGAAGCT CTTCCAGCAA CCGTTTGAGT AAAACTCCAC AAACTACTAC
GCCAGGTGAG TAAGTGGTAG TCACAAGAGT TGACTGTCGG TGGACCTTAT
AAACTGTTTG TTATGTGAAG CTCTACTTGG GCTTTAAAAA TTTGGAACTA
AAAACTTCAG TCACCAAGGT GGTGACAGTG GGGAAGAAAC TGGTAGCCAG
AAGCAAACAA TCTTGACCGT CTCACGTGGC TGCTGAGCTT ATGATAAATA
TATTGTCTCC GAATCTGGAG TCGACTATAG GCTGTGCTTC TGGTTAATTT
1908 1968 2028
2088 2148
2149
2. Informace o sekv. ID. NO. 2:
i) Charakteristiky sekvence
A. Délka: 498 aminokyselin
B. Typ: aminokyselina
C. Rozvětvení: jeden
D. Topologie: lineární ii) Typ molekuly: protein
v) Typ fragmentu: interní ix) Charakteristika
A. jméno/klíě: lidský TIE-2 ligand 1
B. lokace: 1....498
D. Jiné informace: od klonu λ gtlO kódující hite-2 ligand
-48CZ 295371 B6
xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 2:
Het Thr Val Phe Leu Ser Phe Ala Phe Leu Ala Ala Ile Leu Thr His
1 5 10 15
Ile Gly Cys Ser Asn Gin Arg Arg Ser Pro Glu Asn Ser Gly Arg Arg
20 25 30
Tyr Asn Arg Ile Gin His Gly Gin Cys Ala Tyr Thr Phe Ile Leu Pro
35 40 45
Glu His Asp Gly Asn Cys Arg Glu Ser Thr Thr Asp Gin Tyr Asn Thr
50 55 60
Asn Ala Leu Gin Arg Asp Ala Pro His Val Glu Pro Asp Phe Ser Ser
65 70 75 80
Gin Lys Leu Gin His Leu Glu His Val Het Glu Asn Tyr Thr Gin Trp
85 90 95
Leu Gin Lys Leu Glu Asn Tyr Ile Val Glu Asn Met Lys Ser Glu Met
100 105 110
Ala Gin Ile Gin Gin Asn Ala Val Gin Asn His Thr Ala Thr Met Leu
115 120 125
Glu Ile Gly Thr Ser Leu Leu Ser Gin Thr Ala Glu Gin Thr Arg LyB
130 135 140
Leu Thr Asp Val Glu Thr Gin Val Leu Asn Gin Thr Ser Arg Leu Glu
14 5 150 155 160
Ile Gin Leu Leu Glu Asn Ser Leu Ser Thr Tyr Lys Leu Glu Lys Gin
165 170 175
Leu Leu Gin Gin Thr Asn Glu Ile Leu Lya Ile His Glu Lys Asn Ser
180 185 190
Leu Leu Glu His Lys Ile Leu Glu Met Glu Gly Lys Hle Lys Glu Glu
195 200 205
Leu Asp Thr Leu Lys Glu Glu Lys Glu Asn Leu Gin Gly Leu Val Thr
210 215 220
Arg Gin Thr Tyr Ile Ile Gin Glu Leu Glu Lys Gin Leu Asn Arg Ala
225 230 235 240
Thr Thr Asn Asn Ser val Leu Gin Lys Gin Gin Leu GlU Leu Met Asp
245 250 255
Thr Val His Asn Leu Val Asn Leu CyB Thr Lys Glu Gly Val Leu Leu
260 265 270
Lys Gly Gly Lye Arg Glu Glu Glu Lys Pro Phe Arg Asp Cys Ala Asp
275 280 285
Val Tyr Gin Ala Gly Phe Asn Lys Ser Gly ile Tyr Thr ile Tyr ile
290 295 300
Asn Asn Het Pro Glu Pro Lys Lys Val Phe Cys Asn Met Asp Val Asn
305 310 315 320
Gly Gly Gly Trp Thr Val Ile Gin His Arg Glu Aep Gly Ser Leu Asp
325 330 335
Phe Gin Arg Gly Trp Lye Glu Tyr Lys Met Gly Phe Gly Asn Pro ser
340 345 350
Gly Glu Tyr Trp Leu Gly Asn Glu Phe Ile Phe Ala ile Thr Ser Gin
355 360 365
Arg Gin Tyr Het Leu Arg Ile Glu Leu Met Asp Trp Glu Gly Asn Arg
370 375 380
Ala Tyr ser Gin Tyr Αθρ Arg Phe His Ile Gly Asn Glu Lys Gin Asn
385 390 395 400
Tyr Arg Leu Tyr Leu Lys Gly His Thr Gly Thr Ala Gly Lys Gin Ser
405 410 415
Ser Leu Ile Leu His Gly Ala Asp Phe Ser Thr Lys Asp Ala Asp Asn
420 425 430
Asp Asn Cys Het Cys Lys Cys Ala Leu Met Leu Thr Gly Gly Trp Trp
435 440 445
Phe Asp Ala Cys Gly Pro Ser Asn Leu Asn Gly Het Phe Tyr Thr Ala
450 455 460
Gly Gin Asn His Gly Lys Leu Asn Gly Ile Lys Trp His Tyr Phe Lys
465 470 475 480
Gly Pro Ser Tyr Ser Leu Arg Ser Thr Thr Met Met Ile Arg Pro Leu
485 490 495
Asp Phe
-49CZ 295371 B6
2. Informace o sekv. ID. NO. 3:
i) Charakteristiky sekvence
A. Délka: 2146 párů bází
B. Typ: nukleová kyselina
C. Rozvětvení: jeden
D. Topologie: lineární ii) Typ molekuly: DNA ix) Charakteristika
A. jméno/klíč: kódující sekvence
B. lokace: 310..1800
D. Jiné informace:
A. jméno/klíč: lidský TIE-2 ligand 1
B. lokace: 1....2146
D. Jiné informace: od T98G klonu xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 3:
CAGCTGACTC AGGCAGGCTC CATGCTGAAC GGTCACACAG AGAGGAAACA ATAAATCTCA60
GCTACTATGC AATAAATATC TCAAGTTTTA ACGAAGAAAA ACATCATTGC AGTGAAATAA120
AAAATTTTAA AATTTTAGAA CAAAGCTAAC AAATGGCTAG TTTTCTATGA TTCTTCTTCA180
AACGCTTTCT TTGAGGGGGA AAGAGTCAAA CAAACAAGCA GTTTTACCTG AAATAAAGAA240
CTAGTTTTAG AGGTCAGAAG AAAGGAGCAA GTTTTGCGAG AGGCACGGAA GGAGTGTGCT300
GGCAGTACA ATG ACA GTT TTC CTT TCC TTT GCT TTC CTC GCT GCC ATT CTG351
Met Ťhr Val Phe Leu Ser Phe Ala Phe Leu Ala Ala Ile Leu 1510
ACT CAC ATA GGG TGC AGC AAT CAG CGC CGA AGT CCA GAA AAC AGT GGG399
Thr His Ile Gly Cys Ser Asn Gin Arg Arg Ser Pro Glu Asn SerGly
1S 20 2530
-50CZ 295371 B6
AGA Arg AGA TAT AAC CGG ATT CAA CAT GGG CAA TGT GCC TAC ACT TTC ATT Ile 447
Arg Tyr Αβη Arg 35 Xle Gin His Gly Gin 40 Cys Ala Tyr Thr Phe 45
CTT CCA GAA CAC GAT GGC AAC TGT CGT GAG AGT ACG ACA GAC CAG TAC 495
Leu Pro Glu Hle Asp 50 Gly Asn Cys Arg 55 Glu Ser Thr Thr Asp 60 Gin Tyr
AAC ACA AAC GCT CTG CAG AGA GAT GCT CCA CAC GTG GAA ecG GAT TTC 543
Asn Thr Asn 65 Ala Leu Gin Arg Asp 70 Ala Pro His Val Glu 75 Pro Asp Phe
TCT TCC CAG AAA CTT CAA CAT CTG GAA CAT GTG ATG GAA AAT TAT ACT 591
Ser Ser 80 Gin Lys Leu Gin Hle 85 Leu Glu HLb Val Met 90 Glu Asn Tyr Thr
CAG TGG CTG CAA AAA CTT GAG AAT TAC ATT GTG GAA AAC ATG AAG TCG 639
Gin 95 Trp Leu Gin Lys Leu 100 Glu Asn Tyr Ile Val 105 Glu Asn Het Lys Ser 110
GAG ATG GCC CAG ATA CAG CAG AAT GCA GTT CAG AAC CAC ACG GCT ACC 687
Glu Het Ala Gin Ile 115 Gin Gin Asn Ala Val 120 Gin Asn Hiě Thr Ala 125 Thr
ATG CTG GAG ATA GGA ACC AGC CTC CTC TCT CAG ACT GCA GAG CAG ACC 735
Met Leu Glu Ile Gly 130 Thr Ser Leu Leu 135 Seť Gin Thr Ala Glu 140 Gin Thr
AGA AAG CTG ACA GAT GTT GAG ACC CAG GTA CTA AAT CAA ACT TCT CGA 783
Arg Lys Leu 145 Thr Asp Val Glu Thr 150 Gin Val Leu Asn Gin 155 Thr Ser Arg
CTT GAG ATA CAG CTG CTG GAG AAT TCA TTA TCC ACC TAC AAG CTA GAG 831
Leu Glu 160 Ile Gin Leu Leu Glu 165 Asn Ser Leu Ser Thr 170 Tyr Lys Leu Glu
AAG CAA CTT CTT CAA CAG ACA AAT GAA ATC TTG AAG ATC CAT GAA AAA 879
Lys 175 Gin Leu Leu Gin Gin 180 Thr Asn Glu Ile Leu 185 Lys Ile His Glu Lys 190
AAC AGT TTA TTA GAA CAT AAA ATC TTA GAA ATG GAA GGA AAA CAC AAG 927
Asn Ser Leu Leu Glu 195 His Lys Ile Leu Glu 200 Het Glu Gly Lys His 205 Lys
GAA GAG TTG GAC ACC TTA AAG GAA GAG AAA GAG AAC CTT CAA GGC TTG 975
Glu Glu Leu Aep Thr 210 Leu Lys G1U Glu 215 Ly6 Glu Asn Leu Gin 220 Gly Leu
GTT ACT CGT CAA ACA TAT ATA ATC CAG GAG CTG GAA AAG CAA TTA AAC 1023
Val Thr Arg 225 Gin Thr Tyr Ile Ile 230 Gin Glu Leu Glu Lys 235 Gin Leu Asn
AGA GCT ACC ACC AAC AAC AGT GTC CTT CAG AAG CAG CAA CTG GAG CTG 1071
Arg Ala 240 Thr Thr Asn Asn Ser 245 Val Leu Gin Lys Gin 250 Gin Leu Glu Leu
ATG GAC ACA GTC CAC AAC CTT GTC AAT CTT TGC ACT AAA GAA GTT TTA 1119
Het 255 Asp Thr Val His Asn 260 Leu Val Asn Leu Cys 265 Thr Lys Glu Val Leu 270
CTA AAG GGA GGA AAA AGA GAG GAA GAG AAA CCA TTT AGA GAC TGT GCA 1167
Leu Lys Gly Gly Lys 275 Arg Glu Glu Glu Lys 280 Pro Phe Arg Asp Cys 285 Ala
GAT GTA TAT CAA GCT GGT TTT AAT AAA AGT GGA ATC TAC ACT ATT TAT 1215
Asp Val Tyr Gin Ala 290 Gly Phe Asn Lys 295 Ser Gly Ile Tyr Thr 300 Ile Tyr
ATT AAT AAT ATG Met CCA Pro CAA Glu CCC AAA AAG GIG TTT TGC AAT ATG GAT GTC Val 1263
Ile Asn Asn 305 Pro Lys 310 Lys Val Phe Cys Aen 315 Met Asp
AAT GGG GGA GGT TGG ACT GTA ATA CAA CAT CGT GAA GAT GGA AGT CTA 1311
Asn Gly 320 Gly Gly Trp Thr Val 325 Ile Gin His Arg Glu Asp 330 Gly Ser Leu
GAT TTC CAA AGA GGC TGG AAG GAA TAT AAA ATG GGT TTT GGA AAT CCC 1359
Aap 335 Phe Gin Arg Gly Trp 340 Lye GlU Tyr Lys Met 345 Gly Phe Gly Asn Pro 350
TCC GGT GAA TAT TGG CTG GGG AAT GAG TTT ATT TTT GCC ATT ACC AGT 1407
Ser Gly Glu Tyr Trp 355 Leu Gly Asn Glu Phe 360 ile Phe Ala Ile Thr 355 Ser
CAG AGG CAG TAC ATG CTA AGA ATT GAG TTA ATG GAC TGG GAA GGG AAC 145S
Gin Arg Gin Tyr 370 Met Leu Arg Ile Glu 375 Leu Met Asp Trp Glu 380 Gly Asn
CGA GCC TAT TCA CAG TAT GAC AGA TTC CAC ATA GGA AAT GAA AAG CAA 1503
Arg Ala Tyr 385 Ser Gin Tyr Asp Arg 390 Phe His Ile Gly Aen 395 Glu Lya Gin
AAC TAT AGG TTG TAT TTA AAA GGT CAC ACT GGG ACA GCA GGA AAA CAG 1551
Asn Tyr 400 Arg Leu Tyr Leu Lya 405 Gly His Thr Gly Thr Ala 410 Gly Lys Gin
AGC AGC CTG ATC TTA CAC GGT GCT GAT TTC AGC ACT AAA GAT GCT GAT 1599
Ser 415 Ser Leu Ile Leu His 420 Gly Ala Asp Phe Ser 425 Thr Lya Asp Ala Aap 430
AAT GAC AAC TGT ATG TGC AAA TGT GCC CTC ATG TTA ACA GGA CGA TGG 1647
Aen Aep Asn Cys Met 435 Cys Lys cys Ala Leu 440 Het Leu Thr Gly Gly 445 Trp
TGG TTT GAT GCT TGT GGC CCC TCC AAT CTA AAT GGA ATG TTC TAT ACT 1695
Trp Phe Aep Ala 450 Cys Gly Pro Ser Asn 455 Leu Asn Gly Met Phe 460 Tyr Thr
GCG GGA CAA AAC CAT CGA AAA CTG AAT GGG ATA AAG TGG CAC TAC TTC 1743
Ala Gly Gin 465 Asn His Arg Lya Leu 470 Asn Gly Ile Lys Trp 47S His Tyr Phe
AAA GGG CCC AGT TAC TCC TTA CGT TCC ACA ACT ATG ATG ATT CGA CCT 1791
Lya Gly 480 Pro Ser Tyr Ser Leu 485 Arg Ser Thr Thr Met Met 490 Ile Arg Pro
TTA GAT TTT TGA AAGCGCA ATGTCAGAAG CGATTATGAA AGCAACAAAG AAATCCGGA 1849 Leu Aep Phe
495
GAAGCTGCCA CACCAATAAG TTGAGTTCAC CTCCACTGAC TACTACTGGA
GGTGAGAAAC TGGTAGTTAT AAGAGTCTCT TGTCGGGCTT CCTTATTTTG
TGTTTGAAAA GTGAAGTCAC ACTTGGGGTG TAAAAAGGGA GAACTATGGT
CTTCAGAAGC CAAGGTTCTT ACAGTGCTCA AGAAACTGCT AGCCAGATGA
AAACAATATT GACCGTGAAT CGTGGCTCGA GAGCTTGCTG TAAATATGGT
GTCTCCCTTC CTGGAGCCGT CTATAGAAAA TGCTTCAAAC TAATTTC
1909
1969
2029
2089
2146
2. Informace o sekv. ID. NO. 4:
i) Charakteristiky sekvence
A. Délka: 497 aminokyselin
B. Typ: aminokyselina
C. Rozvětvení: jeden
D. Topologie: lineární ii) Typ molekuly: protein
-52CZ 295371 B6
v) Typ fragmentu: interní ix) Charakteristika
A. jméno/klíč: lidský TIE-2 ligand 1
B. lokace: 1....2146
D. Jiné informace: od T98G klonu jíí) Pepla sskvenes: f EO ID NO: d:
Met Thr Val Phe Leu ser Phe Ala Phe Leu Ala Ala Ile Leu Thr His
1 5 10 15
Ile Gly Cys Ser Asn Gin Arg Arg Ser Pro Glu Asn Ser Gly Arg Arg
20 25 30
Tyr Asn Arg Ile Gin His Gly Gin Cys Ala Tyr Thr Phe Ile Leu Pro
35 40 45
Glu His Asp Gly Asn Cys Arg Glu Ser Thr Thr Asp Gin Tyt Asn Thr
SO 55 60
Asn Ala Leu Gin Arg ABp Ala Pro His val Glu Pro Asp Phe Ser Ser
65 70 75 80
Gin Lys Leu Gin His Leu Glu His Val Met Glu Asn Tyr Thr Gin Trp
85 90 95
Leu Gin Lys Leu Glu Asn Tyr Ile Val Glu Asn Met Lys Ser Glu Met
100 105 110
Ala Gin Ile Gin Gin Asn Ala Val Gin Asn His Thr Ala Thr Met Leu
115 120 125
Glu Ile Gly Thr Ser Leu Leu Ser Gin Thr Ala Glu Gin Thr Arg Lys
130 135 140
Leu Thr Asp Val Glu Thr Gin Val Leu Asn Gin Thr Ser Arg Leu Glu
145 150 155 160
Ile Gin Leu Leu Glu Asn Ser Leu Ser Thr Tyr Lys Leu Glu Lys Gin
165 17 G 175
Leu Leu Gin Gin Thr Asn Glu Ile Leu Lys Ile His Glu Lys Asn Ser
180 185 190
Leu Leu Glu His Lys Ile Leu Glu Met Glu Gly Lys His Lys Glu Glu
195 200 205
Leu Asp Thr Leu Lys Glu Glu Lys Glu ASn Leu Gin Gly Leu Val Thr
210 215 220
Arg Gin Thr Tyr Ile Ile Gin Glu Leu Glu Lys Gin Leu Asn Arg Ala
225 230 235 240
Thr Thr Asn Asn Ser Val Leu Gin Lys Gin Gin Leu Glu Leu Met Asp
245 250 255
Thr val His Asn Leu Val Asn Leu Cys Thr Lys Glu Val Leu Leu Lys
260 265 270
Gly Gly Lys Arg Glu Glu Glu Lys Pro Phe Arg Asp Cys Ala Asp Val
275 280 285
Tyt Gin Ala Gly Phe Asn Lys Ser Gly Ile Tyr Thr Ile Tyr Ile Asn
290 295 300
Asn Met Pro Glu Pro Lys Lys Val Phe Cys Asn Met Asp Val Asn Gly
305 310 315 320
Gly Gly Trp Thr Val Ile Gin His Arg Glu Asp Gly Ser Leu Asp Phe
325 330 335
Gin Arg Gly Trp Lys Glu Tyr Lys Met Gly Phe Gly Asn Pro Ser Gly
340 345 350
Glu Tyr Trp Leu Gly Asn Glu Phe Ile Phe Ala Ile Thr Ser Gin Arg
355 360 365
Gin Tyr Met Leu Arg Ile Glu Leu Met Asp Trp Glu Gly Asn Arg Ala
370 375 380
Tyr Ser Gin Tyr Asp Arg Phe His Ile Gly Asn Glu Lys Gin Asn Tyr
3Θ5 390 395 400
Arg Leu Tyr Leu Lys Gly His Thr Gly Thr Ala Gly Lys Gin Ser Ser
405 410 415
Leu Ile Leu Híb Gly Ala Asp Phe Ser Thr Lys Asp Ala Asp Asn Asp
420 425 430
Aen Cys Met Cys Lys Cys Ala Leu Met Leu Thr Gly Gly Trp Trp Phe
435 440 445
Asp Ala Cye Gly Pro ser Asn Leu Asn Gly Met Phe Tyr Thr Ala Gly
-53CZ 295371 B6
450 455 460
Gin Asn Hle Arg Lys Leu Asn Gly Ile Lyfl Trp Hle Tyr Phe Lye Gly
465 470 475 480
Pro Ser Tyr Ser Leu Arg Ser Thr Thr Met Met Ile Arg Pro Leu Αβρ
485 490 495
2. Informace o sekv. ID. NO. 5:
i) Charakteristiky sekvence
A. Délka: 2282 párů bází
B. Typ: nukleová kyselina
C. Rozvětvení: jeden
D. Topologie: lineární ii) Typ molekuly: DNA ix) Charakteristika
A. jméno/klíč: kódující sekvence
B. lokace: 357..1844
D. Jiné informace:
A. jméno/klíč: lidský TIE-2 ligand 2
B. lokace: 1....2282
D. Jiné informace: od klonu pBluescripst KS zakódující lidský TIE-2 ligand 2 xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 5:
GAATTCCTGG TCTGGGGAGA CCAAGTGAGC AACACAGCAG ACGGACCCAG TGGACGTGTG
GTTGGTGTTT GAGGAACAAA AGGACTGTTC TAAAAACCAG CCATGGCAGC TTTGCCCTCA
ATCTCCTCCC GGACCGŤGAA TTCCCACTGC GTTTGCTACT GTAGCAGCCC AGTTTGCTAA
AGCCTTGAGG AGCTGCTCTG AATCTGACAG GGAAAAAGAG TGCGTTTCAG GCTGCTGGTT
GAGGGAACAA TAAAAGCTGA TTTACTGCAT GAAAGAGAAG ACGGCAGCAG TATTACTGAA
GACTGTAGGA CACAGCCCTC GCCTGGAGAG ACTTTCATTG CTCGGGACTC GAAAGA ATG Met 1
120
180
240
300
3S9
TGG Trp CAG ATT GTT TTC TTT ACT CTG AGC TGT GAT CTT Leu GTC TTG GCC Ala GCA Ala 407
Gin Ile Val 5 Phe Phe Thr Leu Ser 10 Cys Asp Val Leu 15
GCC TAT AAC AAC TTT CGG AAG AGC ATG GAC AGC ATA GGA AAG AAG CAA 455
Ala Tyr Asn Asn Phe Arg Lye Ser Met Asp Ser Ile Gly Lys Lys Gin
20 25 30
TAT CAG GTC CAG CAT GGG TCC TGC AGC TAC ACT TTC CTC CTG CCA GAG 503
Tyr Gin val Gin His Gly Ser Cys Ser Tyr Thr Phe Leu Leu Pro Glu
35 40 45
ATG GAC AAC TGC CGC TCT TCC TCC AGC CCC TAC GTG TCC AAT GCT GTG 551
Met Asp ΑΒΠ Cys Arg Ser Ser Ser Ser Pro Tyr Val Ser Asn Ala Val
50 55 60 65
CAG AGG GAC GCG CCG CTC GAA TAC GAT GAC TCG GTG CAG AGG CTG CAA 599
Gin Arg Asp Ala Pro Leu Glu Tyr Asp Asp Ser Val Gin Arg Leu Gin
70 75 80
GTG CTG GAG AAC ATC ATG GAA AAC AAC ACT CAG TGG CTA ATG AAG CTT 647
Val Leu Glu Asn Ile Met Glu Asn Asn Thr Gin Trp Leu Met Lys Leu
85 90 95
GAG AAT TAT ATC CAG GAC AAC ATG AAG AAA GAA ATG GTA GAG ATA CAG 695
Glu Asn Tyr Ile Gin Asp Asn Met Lys Lye Glu Met Val Glu Ile Gin
100 105 110
CAG AAT CCA GTA CAG AAC Asn CAG ACG GCT GTG ATG ATA Ile 125 GAA Glu ATA GGG ACA Thr 743
Gin Asn Ala Val Gin Gin Thr Ala 120 Val Met Ile Gly
115
AAC CTG TTG AAC CAA ACA GCT GAG CAA ACG CGG AAG TTA ACT GAT GTG 791
Asn 130 Leu Leu Asn Gin Thr 135 Ala Glu Gin Thr Arg 140 Lys Leu Thr Asp Val 145
GAA GCC CAA GTA TTA AAT CAG ACC ACG AGA CTT GAA CTT CAG CTC TTG 839
Glu Ala Gin Val Leu 150 Asn Gin Thr Thr Arg 155 Leu Glu Leu Gin Leu 160 Leu
GAA CAC TCC CTC TCG ACA AAC AAA TTG GAA AAA CAG ATT TTG GAC CAG 887
Glu Hle Ser Leu 165 Ser Thr Asn Lys Leu 170 Glu LyB Gin Ile Leu 175 Asp Gin
ACC AGT GAA ATA AAC AAA TTG CAA GAT AAG AAC AGT TTC CTA GAA AAG 935
Thr ser G1U 180 Ile Asn Lys Leu Gin 185 Asp Lys Asn Ser Phe 190 Leu Glu Lys
AAG GTG CTA GCT ATG GAA GAC AAG CAC ATC ATC CAA CTA CAG TCA ATA 983
Lys Val 195 Leu Ala Met Glu Asp 200 Lys His Ile Ile Gin 205 Leu Gin Ser Ile
AAA GAA GAG AAA GAT CAG CTA CAG GTG TTA GTA TCC AAG CAA AAT TCC 1031
Lys 210 Glu Glu Lys Asp Gin 215 Leu Gin val Leu val 220 Ser Lys Gin Asn Ser 225
ATC ATT GAA GAA CTA GAA AAA AAA ATA GTG ACT GCC ACG GTG AAT AAT 1079
Ile Ile Glu Glu Leu 230 Glu Lys Lys Ile Val 235 Thr Ala Thr Val Asn 240 Asn
TCA GTT CTT CAA AAG CAG CAA CAT GAT CTC ATG GAG ACA GTT AAT AAC 1127
Ser Val Leu Gin 245 Lys Gin Gin His Asp 250 Leu Met Glu Thr Val 255 Asn Asn
TTA CTG ACT ATG ATG TCC ACA TCA AAC TCA GCT AAG GAC CCC ACT GTT 1175
Leu Leu Thr 260 Met Met Ser Thr Ser 265 Asn Ser Ala Lys Asp 270 Pro Thr Val
GCT AAA GAA GAA CAA ATC AGC TTC AGA GAC TGT GCT GAA GTA TTC AAA 1223
Ala Lys 275 Glu Glu Gin Ile Ser 280 Phe Arg Asp Cys Ala 285 Glu Val Phe Lys
TCA GGA CAC ACC ACA AAT GGC ATC TAC ACG TTA ACA TTC CCT AAT TCT 1271
Ser 290 Gly His Thr Thr Asn 295 Gly Ile Tyr Thr Leu 300 Thr Phe Pro Asn Ser 305
ACA GAA GAG ATC AAG GCC TAC TGT GAC ATG GAA GCT GGA GGA GGC GGG 1319
Thr Glu Glu Ile Lys 310 Ala Tyr Cys Asp Ket 315 Glu Ala Gly Gly Gly 320 Gly
TGG ACA ATT ATT CAG CGA CGT GAG GAT GGC AGC GTT GAT TTT CAG AGG 1367
Trp Thr Ile Ilě 325 Gin Arg Arg Glu Asp Gly 330 Ser Val Asp Phe 335 Gin Arg
ACT TGG AAA GAA TAT AAA GTG GGA TTT GCT AAC CCT TCA GGA GAA TAT 1415
Thr Trp Lys 340 Glu Tyr Lys Val Gly 345 Phe Gly Asn Pro Ser 350 Gly Glu Tyr
TGG CTG GGA AAT GAG TTT GTT TCG CAA CTG ACT AAT CAG CAA CGC TAT 1463
Trp Leu 35S Gly Asn Glu Phe Val 360 ser Gin Leu Thr Asn 365 Gin Gin Arg Tyr
GTG CTT AAA ATA CAC CTT AAA GAC TGG GAA GGC AAT GAG GCT TAC TCA 1511
Val 370 Leu Lys Ile His Leu 375 Lys Asp Trp Glu Gly 380 Asn Glu Ala Tyr Ser 385
-55CZ 295371 B6
TTG TAT GAA Leu Tyr Glu CAT His TTC TAT CTC TCA AGT GAA GAA CTC AAT TAT AGG ATT 1559
Phe 390 Tyr Leu Ser Sér Glu 395 Glu Leu Asn Tyr Arg 400 Ile
CAC CTT AAA GGA CTT ACA GGG ACA GCC GGC AAA ATA AGC AGC ATC AGC 1607
His Leu Lys Gly Leu Thr Gly Thr Ala Gly Lys Ile Ser Ser Zle Ser
405 410 415
CAA CCA GGA AAT GAT TTT AGC ACA AAG GAT GGA GAC AAC GAC AAA TGT 1655
Gin Pro Gly Asn Asp Phe Ser Thr Lys Asp Gly Asp Asn Asp Lys Cys
420 425 430
ATT TGC AAA TGT TCA CAA ATG CTA ACA GGA GGC TGG TGG TTT GAT GCA 1703
Ile Cys Lys Cys Ser Gin Met Leu Thr Gly Gly Trp Trp Phe Asp Ala
435 440 445
TGT GGT CCT TCC AAC TTG AAG GGA ATG TAC TAT CCA CAG AGG CAG AAC 1751
Cys Gly Pro Ser Asn Leu Asn Gly Met Tyr Tyr Pro Gin Arg Gin Asn
450 455 460 465
ACA AAT AAG TTC AAC GGC ATT AAA TGG TAC TAC TGG AAA GGC TCA GGC 1799
Thr Asn Lys Phe Asn Gly Ile Lys Trp Tyr Tyr Trp Lys Gly Ser Gly
470 475 480
TAT TCG CTC AAG GCC ACA ACC ATG ATG ATC CGA CCA GCA GAT TTC TAAAC 1849
Tyr Ser Leu Lys Ala Thr Thr Met Met Ile Arg Pro Ala Asp Phe
485 490 495
ATCCCAGTCC GAAAGTCACG CGGGACCCAC AACGGACCAA AGATGAACCC AATGTTATGT ACAGATCATC ATGTCCTGAA
ACCTGAGGAA CTGTCTCGAA
GCTGCGCACT ATGCTCCAGA AGCAAGACCC GAGGCTGAGA GCAAGTTTAT TTGGAACTGC TTC
GTGTCCTCTT TTAGAGCCTG TAAACATCCA ATCAGACTGA CAGTAAATAA ATTCTTCTGA
CTATTTTCAA CCACCACAGA TAAACTTTAT TAATTGTGAT CAGTTTACAG CTGGAAAACA GCACTGTTTA
AGACTTAAGC GGGCGTGTGC CACTTAAACT TAGACAGAAC ACGCTGCTGT GAACACTTAT TACACTGTGT
CCAGTGCACT TCGGTGCTGA TGCATCACTT ACCTATGCAA CACAACCAAG GTTATACAAT AAATACCCAT
1909
1969
2029
2089
2149
2209
2269
2282
2. Informace o sekv. ID. NO. 6:
i) Charakteristiky sekvence
A. Délka: 496 aminokyselin
B. Typ: aminokyselina
C. Rozvětvení: jeden
D. Topologie: lineární ii) Typ molekuly: protein
v) Typ fragmentu: interní ix) Charakteristika
A. jméno/klíč: lidský TIE-2 ligand 2
B. lokace: 1....2146
D. Jiné informace: od klonu pBLuescript KS zakódující lidský TIE-2 ligand 2
-56CZ 295371 B6 xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 6:
Met Trp Gin Ile Val Phe Phe Thr Leu Ser Cys Asp Leu Val Leu Ala
1 5 10 15
Ala Ala Tyr Asn 20 Asn Phe Arg Lys Ser 25 Met Asp Ser Ile Gly 30 Lys Lys
Gin Tyr Gin 35 Val Gin His Gly Ser 40 Cys Ser Tyr Thr Phe 45 Leu Leu Pro
GLu Met 50 Aep Asn Cys Arg Ser 55 Ser Ser Ser Pro Tyr 60 Val Ser Asn Ala
Val Gin 65 Arg Asp Ala Pro 70 Leu Glu Tyr Asp ASp 75 Ser Val Gin Arg Leu 80
Gin Val Leu Glu Aen 85 Ile Met Glu Asn Asn 90 Thr Gin Trp Leu Met 95 Lys
Leu Glu Aen Tyr 100 Ile Gin Aep Asn Met 105 Lys Lys Glu Met Val 110 Glu Ile
Gin Gin Aen 11S Ala Val Gin Asn Gin 120 Thr Ala Val Met Ile 125 Glu Ile Gly
Thr Asn 130 Leu Leu Asn Gin Thr 135 Ala Glu Gin Thr Arg 140 Lys Leu Thr Asp
val Glu 145 Ala Gin Val Leu 150 Aen Gin Thr Thr Arg 155 Leu Glu Leu Gin Leu 160
Leu Glu Hle Ser Leu 165 Ser Thr Asn Lys Leu 170 Glu Lys Gin Ile Leu 175 Aep
Gin Thr Ser Glu 180 Ile Asn Lys Leu Gin 185 Asp Lyfl Asn Ser Phe 190 Leu Glu
Lys Lys Val 195 Leu Ala Met Glu Asp 200 Lys His Ile Ile Gin 205 Leu Gin Ser
Ile Lys 210 Glu Glu Lye Asp Gin 215 Leu Gin Val Leu Val 220 Ser Lys Gin Asn
Ser Ile 225 Ile Glu Glu Leu 230 G1U Lys Lys Ile Val 235 Thr Ala Thr Val Asn 240
Asn Ser Val Leu Cín 245 Lye Gin Gin His Asp 250 Leu Met Glu Thr Val 255 Asn
Asn Leu Leu Thr 260 Met Met Ser Thr Ser 265 Asn Ser Ala Lys Asp 270 Pro Thr
Val Ala Lys 275 Glu Glu Gin Ile Ser 280 Phe Arg Asp Cys Ala 285 Glu Val Phe
Lys Ser 290 Gly His Thr Thr Asn 295 Gly Ile Tyr Thr Leu 300 Thr Phe Pro Asn
Ser Thr 305 Glu Glu Ile Lye 310 Ala Tyr Cys Asp Met 315 Glu Ala Gly Gly Gly 320
Gly Trp Thr Ile Ile 325 Gin Arg Arg Glu Asp 330 Gly Ser Val Asp Phe 335 Gin
Arg Thr Trp Lys 340 Glu Tyr Lys Val Gly 345 Phe Gly Asn Pro Ser 350 Gly Glu
Tyr Trp Leu 355 Gly Asn Glu Phe Val 360 Ser Gin Leu Thr Asn 365 Gin Gin Arg
Tyr Val 370 Leu Lys Ile His Leu 375 Lys Asp Trp Glu Gly 380 Asn Glu Ala Tyr
Ser Leu 385 Tyr Glu His Phe 390 Tyr Leu Ser Ser Glu 395 Glu Leu Asn Tyr Arg 400
Ile His Leu Lys Gly 405 Leu Thr Gly Thr Ala 410 Gly Lys Ile Ser Ser 415 Ile
Ser Gin Pro Gly 420 Asn Asp Phe Ser Thr 425 Lys Asp Gly Asp Aen 430 Asp Lys
Cys Ile Cys 435 Lys cys Ser Gin Met 440 Leu Thr Gly Gly Trp 445 Trp Phe Asp
Ala Cya 450 Gly Pro ser Asn Leu 455 Asn Gly Met Tyr Tyr 460 Pro Gin Arg Gin
Aen Thr 465 Asn Lys Phe Asn 470 Gly Ile Lye Trp Tyr 475 Tyr Trp Lys Gly Ser 480
Gly Tyr Ser Leu Lys 485 Ala Thr Thr Met Met 490 Ile Arg Pro Ala Asp 495 Phe
2. Informace o sekv. ID. NO. 7:
i) Charakteristiky sekvence
A. Délka: 478 aminokyselin
B. Typ: aminokyselina
C. Rozvětvení: jeden
D. Topologie: lineární ii) Typ molekuly: protein ix) Charakteristika
A. jméno/klíč: zralý TLI protein
B. lokace: 1....478
D. Jiné informace:
-58CZ 295371 B6 xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 7:
Asn 1 Gin Arg Arg Ser 5 Pro Glu Asn Ser Gly 10 Arg Arg Tyr Asn Arg 15 Ile
Gin His Gly Gin Cys Ala Tyr Thr Phe Ile Leu Pro Glu His Asp Gly
20 25 30
Asn Cys Arg Glu Ser Thr Thr Asp Gin Tyr Asn Thr Asn Ala Leu Gin
35 40 45
Arg Aap Ala Pro His Val Glu Pro Asp Phe Ser Ser Gin Lys Leu Gin
50 55 60
His Leu Glu His Val Met Glu Asn Tyr Thr Gin Trp Leu Gin Lys Leu
65 70 75 80
Glu Aen Tyr Ile Val Glu Asn Met Lys Ser Glu Met Ala Gin Ile Gin
85 90 95
Gin Asn Ala Val Gin Asn His Thr Ala Thr Met Leu Glu Ile Gly Thr
100 105 110
Ser Leu Leu Ser Gin Thr Ala Glu Gin Thr Arg Lys Leu Thr Asp Val
115 120 125
Glu Thr Gin Val Leu Asn Gin Thr ser Arg Leu Glu Ile Gin Leu Leu
130 135 140
Glu Asn Ser Leu Ser Thr Tyr Lys Leu Glu Lys Gin Leu Leu Gin Gin
145 150 155 160
Thr Asn Glu Ile Leu Lys Ile His Glu Lys Asn Ser Leu Leu Glu His
165 170 175
Lys Ile Leu Glu Met Glu Gly Lye Hifl Lys G1U Glu Leu Asp Thr Leu
180 185 190
Lys Glu Glu Lys Glu Asn Leu Gin Gly Leu Val Thr Arg Gin Thr Tyr
195 200 205
Ile Ile Gin Glu Leu Glu Lys Gin Leu Asn Arg Ala Thr Thr Asn Asn
210 215 220
Ser Val Leu Gin Lys Gin Gin Leu Glu Leu Met Asp Thr Val His Asn
225 230 235 240
Leu Val Asn Leu Cys Thr Lys Glu Gly val Leu Leu Lys Gly Gly Lys
245 250 255
Arg Glu Glu Glu Lys Pro Phe Arg Asp Cys Ala A.sp Val Tyr Gin Ala
260 265 270
Gly Phe Asn Lys Ser Gly Ile Tyr Thr Ile Tyr Ile Asn Asn Met Pro
275 280 285
Glu Pro Lys Lys Val Phe CyB Asn Met Asp Val Aan Gly Gly Gly Trp
290 295 300
Thr Val Ile Gin His Arg Glu Asp Gly Ser Leu Asp Phe Gin Arg Gly
305 310 31S 320
Trp Lye Glu Tyr Lys Met Gly Phe Gly Αεη Pro Ser Gly Glu Tyr Trp
325 330 333
Leu Gly Asn Glu Phe Ile Phe Ala Ile Thr Ser Gin Arg Gin Tyr Met
340 345 350
Leu Arg Ile Glu Leu Het Asp Trp Glu Gly Asn Arg Ala Tyr Ser Gin
355 360 365
Tyr Asp Arg Phe His Ile Gly Asn Glu Lys Gin Asn Tyr Arg Leu Tyr
370 375 380
Leu Lys Gly His Thr Gly Thr Ala Gly Lys Gin Ser Ser Leu Ile Leu
385 390 395 400
His Gly Ala Asp Phe Ser Thr Lya Asp Ala Asp Asn Asp Asn Cys Met
405 410 415
Cys Lys Cys Ala Leu Met Leu Thr Gly Gly Trp Trp Phe Aap Ala Cys
420 425 430
Gly Pro Ser Asn Leu Asn Gly Met Phě Tyr Thr Ala Gly GLn Asn His
435 440 445
Gly Lys Leu Asn Gly Ile Lys Trp His Tyr Phe LyB Gly Pro Ser Tyr
450 455 460
Ser Leu Arg Ser Thr Thr Met Met Ile Arg Pro Leu Asp Phe
465 470 475
-59CZ 295371 B6
2. Informace o sekv. ID. NO. 8:
i) Charakteristiky sekvence
A. Délka: 480 aminokyselin
B. Typ: aminokyselina
C. Rozvětvení: jeden
D. Topologie: lineární ii) Typ molekuly: protein ix) Charakteristika
A. jméno/klíč: zralý TL2 protein
B. lokace: 1....480
D. Jiné informace:
-60CZ 295371 B6 xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 8:
Ala Ala Tyr Asn Asn Phe Arg Lys Ser Met Asp Ser Ile Gly Lys Lye
1 5 10 15
Gin Tyr Gin Val Gin His Gly Ser Cys Ser Tyr Thr Phe Leu Leu Pro
20 25 30
Glu Met Asp Asn Cys Arg Ser ser Ser Ser Pro Tyr Val Sér Asn Ala
35 40 45
Val Gin Arg Asp Ala Pro Leu Glu Tyr Asp Asp Ser Val Gin Arg Leu
50 55 60
Gin Val Leu Glu Asn Ile Met Glu Asn Asn Thr Gin Trp Leu Met Lya
65 70 75 80
Leu Glu ΑΒΠ Tyr Ile Gin Asp Asn Met Lys Lys Glu Met Val Glu Ile
85 90 95
Gin Gin Asn Ala Val Gin Asn Gin Thr Ala Val Met Ile Glu Ile Gly
100 105 110
Thr Asn Leu Leu Asn Gin Thr Ala Glu Gin Thr Arg Lys Leu Thr Asp
115 120 125
Val Glu Ala Gin Val Leu Asn Gin Thr Thr Arg Leu G1U Leu Gin Leu
130 135 140
Leu Glu His Ser Leu Ser Thr Asn Lys Leu Glu Lys Gin Ile Leu Asp
145 150 155 160
Gin Thr Ser Glu Ile Asn Lys Leu Gin Asp Lys Asn Ser Phe Leu Glu
165 170 175
Lys Lye Val Leu Ala Met Glu Asp Lys His Ile Ile Gin Léu Gin Ser
180 185 190
Ile Lys Glu Glu Lye Asp Gin Leu Gin Val Leu Val Ser Lys Gin Asn
195 200 205
Ser Ile Ile Glu G1U Leu Glu Lys Lys Ile val Thr Ala Thr Val Asn
210 215 220
Asn Ser Val Leu Gin Lys Gin Gin His Asp Leu Met Glu Thr Val Asn
225 230 235 240
Asn Leu Leu Thr Met Met Ser Thr Ser Asn Ser Ala Lys Asp Pro Thr
245 250 255
Val Ala Lye Glu Glu Gin Ile Ser Phe Arg Asp Cys Ala Glu Val Phe
260 265 270
Lye Ser Gly His Thr Thr Asn Gly Ile Tyr Thr Leu Thr Phe Pro Asn
275 280 285
Ser Thr Glu Glu Ile Lys Ala Tyr Cys Asp Met Glu Ala Gly Gly Gly
290 295 300
Gly Trp Thr Ile Ile Gin Arg Arg Glu Asp Gly Ser Val Asp Phe Gin
305 310 315 320
Arg Thr Trp Lya Glu Tyr Lys Val Gly Phe Gly Aen Pro ser Gly Glu
325 330 335
Tyr Trp Leu Gly Asn Glu Phe Val Ser Gin Leu Thr Asn Gin Gin Arg
340 345 350
Tyr Val Leu Lys Ile His Leu Lys Asp Trp Glu Gly Asn Glu Ala Tyr
355 360 365
Ser Leu Tyr Glu His Phe Tyr Leu Ser Ser Glu Glu Leu Asn Tyr Arg
370 375 380
Ile His Leu Lys Gly Leu Thr Gly Thr Ala Gly LyB Ile Ser Ser Ile
385 390 395 400
Ser Gin Pro Gly Asn Asp Phe Ser Thr Lys Asp Gly Asp Asn Asp Lys
405 410 415
Cya ile Cys Lys Cys Ser Gin Met Leu Thr Gly Gly Trp Trp Phe Asp
420 425 430
Ala Cye Gly Pro Ser Asn Leu Asn Gly Met Tyr Tyr Pro Gin Arg Gin
435 440 445
Asn Thr Asn Lys Phe Asn Gly Ile Lys Trp Tyr Tyr Trp Lys Gly Ser
450 45S 460
Gly Tyr Ser Leu Lys Ala Thr Thr Met Met Ile Arg Pro Ala Asp Phe
465 470 475 480
-61 CZ 295371 B6
2. Informace o sekv. ID. NO. 9:
i) Charakteristiky sekvence
A. Délka: 1849 párů bází
B. Typ: nukleová kyselina
C. Rozvětvení: j eden
D. Topologie: lineární ii) Typ molekuly: DNA ix) Charakteristika
A. jméno/klíč: kódující sekvence
B. lokace: 47..1573
D. Jiné informace:
A. jméno/klíč: TIE ligand 3
B. lokace: 1....1849
D. Jiné informace: fíbrinogenová doména začíná v poloze 929 xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 9:
CTGTCCTGGT ACCTGACAAG ACCACCTCAC CACCACTTGG TCTCAG ATG CTC TGC S5
Met Leu Cye
CAG CCA GCT ATG CTA Leu CTA Leu GAT Asp 10 GGC CTC Gly Leu CTC CTG CTG GCC ACC ATG Met GCT Ala 103
Gin Pro Ala S Het Leu Leu Leu 15 Ala Thr
GCA GCC CAG CAC AGA GGG CCA GAA GCC GGT GGG CAC CGC CAG ATT CAC 151
Ala 20 Ala Gin His Arg Gly 25 Pro Glu Ala Gly Cly 30 His Arg Gin Ile His 35
CAG GTC CGG CGT GGC CAG TGC AGC TAC ACC TTT GTG GTG CCG GAG CCT 199
Gin Val Arg Arg Gly 40 Gin Cye Ser Tyr Thr 45 Phe Val Val Pro Glu 50 Pro
GAT ATC TGC CAG CTG GCG CCG ACA GCG GCG CCT GAG GCT TTG GGG GGC 247
Asp Ile Cya Gin 55 Leu Ala Pro Thr Ala 60 Ala Pro Clu Ala Leu 65 Cly Gly
TCC AAT AGC CTC CAG AGG GAC TTG CCT GCC TCG AGG CTG CAC CTA ACA 295
Šer Asn Ser 70 Leu Gin Arg Asp Leu 75 Prů Ala Ser Arg Leu 80 His Leu Thr
GAC TGG CGA GCC CAG AGG GCC CAG CGG GCC CAG CGT GTG AGC CAG CTG 343
Asp Trp 85 Arg Ala Gin Arg Ala 90 Gin Arg Ala Gin Arg 95 Val Ser Gin Leu
GAG AAG ATA CTA GAG AAT AAC ACT CAG TGG CTG CTG AAG CTG GAG CAG 391
Glu 100 Lys Ile Leu Glu Αβη 105 Asn Thr Gin Trp Leu 110 Leu Lys Leu Glu Gin 115
TCC ATC AAG GTG AAC TTG AGG TCA CAC CTG GTG CAG GCC CAG CAG GAC 439
Ser Ile Lys Val Asn 120 Leu Arg Ser His Leu 125 Val Gin Ala Gin Gin 130 Asp
-62CZ 295371 B6
ACA ATC CAG Gin AAC CAG ACA ACT ACC ATG Met 140 CTG Leu GCA CTG GGT GCC AAC Asn CTC Leu 487
Thr Ile ΑΒΠ 135 Gin Thr Thr Thr Ala Leu Gly Ala 145
ATG AAC CAG ACC AAA GCT CAG ACC CAC AAG CTG ACT GCT GTG GAG GCA 535
Met Asn Gin 150 Thr Lys Ala Gin Thr 155 His Lys Leu Thr Ala 160 Val Glu Ala
CAG GTC CTA AAC CAG ACA TTG CAC ATG AAG ACC CAA ATG CTG GAG AAC 583
Gin Val 165 Leu Asn Gin Thr Leu 170 His Met Lys Thr Gin 175 Met Leu Glu Asn
TCA CTG TCC ACC AAC AAG CTG GAG CGG CAG ATG CTG ATG CAG AGC CGA 631
Ser 180 Leu Ser Thr Asn Lys 165 Leu Glu Arg Gin Met 190 Leu Met Gin Ser Arg 195
GAG CTG CAG CGG CTG CAG GGT CGC AAC AGG GCC CTG GAG ACC AGG CTG 679
Glu Leu Gin Arg Leu 200 Gin Gly Arg Asn Arg 205 Ala Leu Glu Thr Arg 210 Leu
CAG GCA CTG GAA GCA CAA CAT CAG GCC CAG CTT AAC AGC CTC CAA GAG 727
Gin Ala Leu Glu 215 Ala Gin Hle Gin Ala 220 Gin Leu Asn Ser Leu 225 Gin Glu
AAG AGG GAA CAA CTG CAC AGT CTC CTG GGC CAT CAG ACC GGG ACC CTG 775
Lys Arg Glu 230 Gin Leu His Ser Leu 235 Leu Gly His Gin Thr 240 Gly Thr Leu
GCT AAC CTG AAG CAC AAT CTG CAC GCT CTC AGC AGC AAT TCC AGC TCC 823
Ala Asn 245 Leu LyB His Asn Leu 250 His Ala Leu Ser Ser 255 Asn Ser Ser Ser
CTG CAG CAG CAG CAG CAG CAA CTG ACG GAG TTT GTA CAG CGC CTG GTA 871
Leu 260 Gin Gin Gin Gin Gin 265 Gin Leu Thr Glu Phe 270 Val Gin Arg Leu Val 275
CGG ATT GTA GCC CAG GAC CAG CAT CCG GŤT TCC TTA AAG ACA CCT AAG 919
Arg Ile Val Ala Gin 280 Asp Gin His Pro val 285 Ser Leu Lys Thr Pro 290 Lys
CCA GTG TTC CAG GAC TGT GCA GAG ATC AAG CGC TCC GGG GTT AAT ACC 967
Pro Val Phe Gin 295 Asp Cys Ala Glu Ile 300 Lys Arg Ser Gly Val 305 Asn Thr
AGC GGT GTC TAT ACC ATC TAT GAG ACC AAC ATG ACA AAG CCT CTC AAG 1015'
Ser Gly Val 310 Tyr Thr Ile Tyr Glu 315 Thr Asn Met Thr Lys 320 Pro Leu Lys
GTG TTC TGT GAC ATG GAG ACT GAT GGA GGT GGC TGG ACC CTC ATC CAG 1063
val Phe 325 Cys Aap Met Glu Thr 330 Asp Gly Gly Gly Trp 335 Thr Leu Ile Gin
CAC CGG GAG GAT GGA AGC GTA AAT TTC CAG AGG ACG TGG GAA GAA TAC 1111
His 340 Arg Glu Asp Gly Ser 345 Val Asn Phe Gin Arg 350 Thr Trp Glu Glu Tyr 355
AAA GAG GGT TTT GGT AAT GTG GCC AGA GAG CAC TGG CTG GGC AAT GAG 1159
Lys Glu Gly Phe Gly 360 Asn Val Ala Arg Glu 365 HiB Trp Leu Gly Asn 370 Glu
GCT GTG CAC CGC CTC ACC AGC AGA ACG GCC TAC TTG CTA CGC GTG GAA 1207
Ala Val His Arg 375 Leu Thr Ser Arg Thr 380 Ala Tyr Leu Leu Arg 385 Val Glu
CTG CAT CAC TGG GAA GCC CGC CAG ACC TCC ATC CAG TAT GAG AAC TTC 1255
Leu His Asp 390 Trp Clu Gly Arg Gin 395 Thr ser Ile Gin Tyr 400 Glu Asn Phe
CAG CTG GGC Gly AGC GAG AGG Arg CAG CGG TAC AGC CTC TCT GTG AAT GAC AGC 1303
Gin Leu 405 Ser Glu Gin Arg 410 Tyr Ser Leu Ser Val 415 Asn Asp Ser
AGC AGT TCA GCA GGG CGC AAG AAC AGC CTG GCT CCT CAG GGC ACC AAG 1351
Ser Ser Ser Ala Gly Arg Lys Aen ser Leu Ala Pro Gin Gly Thr Lys
420 425 430 435
TTC AGC ACC AAA GAC ATG GAC AAT GAT AAC TGC ATG TGT AAA TGT GCT 1399
Phe Ser Thr Lys Asp Met Asp Asn Asp Asn Cys Met Cys Lys Cys Ala
440 445 450
CAG ATG CTG TCT CGA GGG TGG TGG TTT GAT GCC TGT GGC CTC TCC AAC 1447
Gin Met Leu Ser Gly Gly Trp Trp Phe Asp Ala Cys Gly Leu ser Asn
455 460 465
CTC AAT GGC ATC TAC TAT TCA GTT CAT CAG CAG TTG CAG AAG ATC AAT 1495
Leu Asn Gly Ile Tyr Tyr Ser Val His Gin Hle Leu His Lys Ile Asn
470 47S 480
GGC ATC CGC TGG CAC TAC TTC CGA GGC CCC AGC TAC TCA CTG CAC GGC 1543
Gly Ile Arg Trp His Tyr Phe Arg Gly Pro Ser Tyr Ser Leu Hle Gly
485 490 495
ACA CGC ATG ATG CTG AGG CCA ATG GGT GCC TGA CACACAG CCCTGCAGAG ACT 1596
Thr Arg Met Met Leu Arg Pro Met Gly Ala
500 505
GATQCCGTAG TCAGTGCCCA AATTACAAGA AAGGCACCTG
GAGGATTCTC GGGCTCATCT ATTCACCTGC CCTCTGTTGG
AACCCAGGTG TGACATTCTG CTCCCTGTTG AACCATACTC
ACTCTGTGCA GAACATCGGA CCCTCTAATT TTTCCCCCTC
CGCTGGGCCC ACCAGCTTAC GTGAAATTGC CTGCTGCATG
TGCCCAGAAA CTTGCCCCTG TGGGTGCTTG CCCGGGAATC
1656 1716 1776
1836
CCTGCCATGA ACT
1849
2. Informace o sekv. ID. NO. 10:
i) Charakteristiky sekvence
A. Délka: 509 aminokyselin
B. Typ: aminokyselina
C. Rozvětvení: jeden
D. Topologie: lineární ii) Typ molekuly: protein
v) Typ fragmentu: interní ix) Charakteristika
A. jméno/klíč: TIE ligand 3
B. lokace: 1....509
D. Jiné informace:
-64CZ 295371 B6 xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 10:
Met Leu Cys Gin Pro Ala Met Leu Leu Aep cly Leu Leu Leu Leu Ala
1 5 10 15
Thr Met Ala Ala Ala Gin His Arg Gly Pro G1U Ala Gly Gly His Arg
20 25 30
Gin Ile His Gin Val Arg Arg Gly Gin Cys Ser Tyr Thr Phe val Val
35 40 45
Pro Glu Pro Aep Ile Cys Gin Leu Ala Pro Thr Ala Ala Pro Glu Ala
50 55 60
Leu Gly Gly Ser Asn Ser Leu Gin Arg Asp Leu Pro Ala Ser Arg Leu
65 70 75 80
His Leu Thr Asp Trp Arg Ala Gin Arg Ala Gin Arg Ala Gin Arg Val
85 90 95
Ser Gin Leu Glu Lys Ile Leu Glu Asn Asn Thr Gin Trp Leu Leu Lys
100 105 110
Leu Glu Gin Ser Ile Lys Val Asn Leu Arg Ser His Leu Val Gin Ala
115 120 125
Gin Gin Aep Thr ile Gin Asn Gin Thr Thr Thr Met Leu Ala Leu Gly
130 135 140
Ala Asn Leu Met Asn Gin Thr Lys Ala Gin Thr His Lys Leu Thr Ala
145 150 155 160
Val Glu Ala Gin Val Leu Asn Gin Thr Leu His Met Lys Thr Gin Met
165 170 175
Leu GLU Asn Ser Leu Ser Thr Asn Lys Leu Glu Arg Gin Met Leu Met
180 185 190
Gin Ser Arg Glu Leu Gin Atg Leu Gin Gly Arg Asn Arg Ala Leu Glu
195 200 205
Thr Arg Leu Gin Ala Leu Glu Ala Gin His Gin Ala Gin Leu Asn Ser
210 215 220
Leu Gin Glu Lys Arg Glu Gin Leu His Ser Leu Leu Gly His Gin Thr
225 230 235 240
Gly Thr Leu Ala Asn Leu Lys His Asn Leu His Ala Leu Ser Ser Asn
245 250 255
Ser Ser Ser Leu Gin Gin Gin Gin Gin Gin Leu Thr Glu Phe Val Gin
260 265 270
Arg Leu Val Arg Ile val Ala Gin ASp Gin His Pro Val Ser Leu Lys
275 280 285
Thr Pro Lys Pro Val Phe Gin Asp Cys Ala Glu Ile Lys Arg Ser Gly
290 295 300
Val Asn Thr Ser Gly Val Tyr Thr Ile Tyr Glu Thr Asn Met Thr Lys
305 310 315 320
Pro Leu Lys Val Phe Cys Asp Met Glu Thr Asp Gly Gly Gly Trp Thr
325 330 335
Leu Ile Gin His Arg Glu Asp Gly ser val Asn Phe Gin Arg Thr Trp
340 345 350
Glu Glu Tyr Lys Glu Gly Phe Gly Asn Val Ala Arg Glu His Trp Leu
355 360 365
Gly Asn Glu Ala Val His Arg Leu Thr Ser Arg Thr Ala Tyr Leu Leu
370 375 380
Arg Val Glu Leu His Asp Trp Glu Gly Arg Gin Thr Ser Ile Gin Tyr
385 390 395 400
Glu Asn Phe Gin Leu Gly Ser Glu Arg Gin Arg Tyr ser Leu Sér Val
405 410 415
Asn Asp Ser Ser Ser Ser Ala Gly Arg Lys Asn Ser Leu Ala Pro Gin
420 425 430
Gly Thr Lys Phe Ser Thr Lys Asp Met Asp Asn Asp Asn Cys Met Cys
435 440 445
Lye Cys Ala Gin Met Leu Ser Gly Gly Trp Trp Phe Asp Ala Cys Gly
450 455 460
Leu Ser Asn Leu Asn Gly Ile Tyr Tyr Ser Val His Glň His Leu His
465 470 475 480
Lye Ile Asn Gly Ile Arg Trp His Tyr Phe Arg Gly Pro Ser Tyr Ser
485 490 495
Leu His Gly Thr Arg Met Met Leu Arg Pro Met Gly Ala
500 505
2. Informace o sekv. ID. NO. 11:
i) Charakteristiky sekvence
A. Délka: 503 aminokyselin
B. Typ: aminokyselina
C. Rozvětvení: jeden
D. Topologie: lineární ii) Typ molekuly: protein ix) Charakteristika
A. jméno/klíč: mTL3
B. lokace: 1....503
D. Jiné informace: myší TIE ligand-3
-66CZ 295371 B6 xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 11:
Met Leu Leu 1 Asp Gly 5 Leu Leu Leu Leu Ala 10 Thr Met Ala Ala Ala 15 Gin
His Arg Gly Pro Glu Ala Gly Gly Híb Arg Gin Ile His Gin Val Arg
20 25 30
Arg Gly Gin Cys Ser Tyr Thr Phe Val Val Pro Glu Pro Asp Ile Cys
35 40 45
Gin Leu Ala Pro Thr Ala Ala Pro Glu Ala Leu Gly Gly Ser Aan Ser
50 55 60
Leu Gin Arg Asp Leu Pro Ala Ser Arg Leu His Leu Thr Asp Trp Arg'
65 70 75 80
Ala Gin Arg Ala Gin Arg Ala Gin Arg Val Ser Gin Leu Glu Lys Ile
85 90 95
Leu Glu Asn Asn Thr Gin Trp Leu Leu Lys Leu Glu Gin Ser Ile Lys
100 105 110
Val ASn Leu Arg Ser His Leu Val Gin Ala Gin Gin Asp Thr Ile Gin
115 120 125
Asn Gin Thr Thr Thr Het Leu Ala Leu Gly Ala Asn Leu Met Asn Gin
130 135 140
Thr Lys Ala Gin Thr His Lys Leu Thr Ala Val Glu Ala Gin Val Leu
145 150 155 160
Asn Gin Thr Leu His Met Lys Thr Gin Met Leu Glu Asn Ser Leu Ser
165 170 175
Thr Asn Lys Leu Clu Arg Gin Met Leu Met Gin Ser Arg Glu Leu Gin
180 185 190
Arg Leu Gin Gly Arg Asn Arg Ala Leu Glu Thr Arg Leu Gin Ala Leu
19 S 200 205
Glu Ala Gin His Gin Ala Gin Leu Asn Ser Leu Gin Glu Lys Arg Glu
210 215 220
Gin Leu His ser Leu Leu Gly His Gin Thr Gly Thr Leu Ala Asn Leu
225 230 235 240
Lys His Asn Leu Hie Ala Leu Ser Ser Asn Ser Ser Ser Leu Gin Gin
245 250 255
Gin Gin Gin Gin Leu Thr Glu Phe Val Gin Arg Leu Val Arg Ile Val
260 265 270
Ala Gin Asp Gin His Pro Val Ser Leu Lys Thr Pro Lys Pro Val Phe
275 280 285
Gin Asp Cys Ala Glu Ile Lys Arg Ser Gly Val Asn Thr Ser Gly Val
290 295 300
Tyr Thr Ile Tyr Glu Thr Asn Met Thr Lys Pro Leu Lys Val Phe Cys
305 310 315 320
Asp Met Glu Thr Asp Gly Gly Gly Trp Thr Leu Ile Gin Hie Arg Glu
325 330 335
Asp Gly Ser Val Asn Phe Gin Arg Thr Trp Glu Glu Tyr Lys Glu Gly
340 345 350
Phe Gly Asn Val Ala Arg Glu His Trp Leu Gly Asn Glu Ala Val His
355 360 365
Arg Leu Thr Ser Arg Thr Ala Tyr Leu Leu Arg Val Glu Leu His Asp
370 375 380
Trp Glu Gly Arg Gin Thr Ser Ile Gin Tyr Glu Asn Phe Gin Leu Gly
385 390 395 400
Ser Glu Arg Gin Arg Tyr Ser Leu Ser Val Asn Asp Ser Ser Ser Ser
405 410 415
Ala Gly Arg Lys Asn Ser Leu Ala Pro Gin Gly Thr Lys Phe Ser Thr
420 425 430
Lys Asp Met Aep Asn Asp Asn Cys Met Cys LyS Cys Ala Gin Met Leu
435 440 445
Ser Gly Gly Trp Trp Phe Asp Ala Cys Gly Leu Ser Asn Leu Αβη Gly
450 455 460
Ile Tyr Tyr ser Val His Gin His Leu His Lys Ile Asn Gly Ile Arg
465 470 475 480
Trp His Tyr Phe Arg Gly Pro Ser Tyr Ser Ile His Gly Thr Arg Het
485 490 495
Met Leu Arg Pro Met Gly Ala
500
-67CZ 295371 B6
2. Informace o sekv. ID. NO. 12:
i) Charakteristiky sekvence
A. Délka: 480 aminokyselin
B. Typ: aminokyselina
C. Rozvětvení: jeden
D. Topologie: lineární ii) Typ molekuly: protein ix) Charakteristika
A. jméno/klíě: hTLl
B. lokace: 1....490
D. Jiné informace: lidský TIE-2 ligand 1
-68CZ 295371 B6 xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 12:
Ala Phe 1 Leu Ala Ala 5 Ile Leu Thr His Ile Gly Cys 10 Ser Asn Gin 15 Arg
Arg ser Pro Glu Asn Ser Gly Arg Arg Tyr Asn Arg Ile Gin His Gly
20 28 30
Gin Cys Ala Tyr Thr Phe Ile Leu Pro Glu His Asp Gly Asn Cys Arg
35 40 45
Glu Ser Thr Thr Asp Gin Tyr Asn Thr Asn Ala Leu Gin Arg Asp Ala
50 55 60
Pro His Val Glu Pro Asp Phe Ser Ser Gin Lys Leu Gin His Leu Glu
65 70 75 80
His Val Met Glu Asn Tyr Thr Gin Trp Leu Gin Lys Leu Glu Asn Tyr
85 90 95
Ile Val Glu Asn Met Lys Ser Glu Met Ala Gin Ile Gin Gin Asn Ala
100 105 110
Val Gin Asn His Thr Ala Thr Met Leu Glu Ile Gly Thr Ser Leu Leu
115 120 125
Ser Gin Thr Ala Glu Gin Thr Arg Lys Leu Thr Asp Val Glu Thr Gin
130 135 140
Val Leu Asn Gin Thr Ser Arg Leu Glu Ile Gin Leu Leu Glu Asn Ser
145 150 155 160
Leu Ser Thr Tyr Lys Leu Glu Lys Gin Leu Leu Gin Gin Thr Asn Glu
165 170 175
Ile Leu Lys Ilé His Glu Lys Asn Ser Leu Leu Glu His Lys Ile Leu
180 185 190
Glu Met Glu Gly Lys His Lys Glu Glu Leu Asp Thr Leu Lys Glu Glu
195 200 205
Lys Glu Asn Leu Gin Gly Leu Val Thr Arg Gin Thr Tyr Ile ile Gin
210 215 220
Glu Leu Glu Lys Gin Leu Asn Arg Ala Thr Thr Asn Asn Ser Val Leu
225 230 235 240
Gin Lys Gin Gin Leu Glu Leu Met Asp Thr Val His Asn Leu Val Asn
245 250 255
Leu Cys Thr Lys Glu Val Leu Leu Lys Gly Gly Lys Arg Glu Glu Glu
260 265 270
Lys Pro Phe Arg Asp Cys Ala Asp Val Tyr Gin Ala Gly Phe Asn Lys
275 280 285
Ser Gly Ile Tyr Thr Ile Tyr Ile Asn Asn Met Pro Glu Pro Lys Lys
290 295 300
Val Phe Cys Asn Met Asp Val Asn Gly Gly Gly Trp Thr Val Ile Gin
305 310 315 320
His Arg Glu Αβρ Gly Ser Leu Asp Phe Gin Arg Gly Trp Lys Glu Tyr
325 330 335
Lys Met cly Phe Gly Asn Pro ser Gly Glu Tyr Trp Leu Gly Asn Glu
340 345 350
Phe Ile Phe Ala Ile Thr Ser Gin Arg Gin Tyr Met Leu Arg Ile Glu
355 360 365
Leu Met Asp Trp Glu Gly Asn Arg Ala Tyr Ser Gin Tyr Asp Arg Phe
370 375 380
His Ile Gly Asn Glu Lys Gin Asn Tyr Arg Leu Tyr Leu Lys Gly His
385 390 395 400
Thr Gly Thr Ala Gly Lys Gin Ser Ser Leu Ile Leu His Gly Ala Asp
405 410 41S
Phe Ser Thr Lys Αβρ Ala Asp Asn Asp Asn Cys Met Cys Lys Cys Ala
420 425 430
Leu Met Leu Thr Gly Gly Trp Trp Phe Asp Ala Cys Gly Pro Ser Asn
435 440 445
Leu Asn Gly Met Phe Tyr Thr Ala Gly Gin Asn His Gly Lys Leu Asn
450 455 460
Gly Ile Lys Trp HiS Tyr Phe Lys Gly Pro Ser Tyr Ser Ile Arg Ser
465 470 475 480
Thr Thr Met Met Ile Arg Pro Leu Asp Phe
485 490
-69CZ 295371 B6
2. Informace o sekv. ID. NO. 13:
i) Charakteristiky sekvence
A. Délka: 491 aminokyselin
B. Typ: aminokyselina
C. Rozvětvení: jeden
D. Topologie: lineární ii) Typ molekuly: protein ix) Charakteristika
A. jméno/klíč: hTLl
B. lokace: 1....491
D. Jiné informace: kuřecí TIE-2 ligand 1 xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 13:
Ala Phe Leu Ala Ala Ile Leu Ala His Ile Gly Cys Thr Thr Gin Arg
1 5 10 15
Arg Ser Pro Glu Asn Ser Gly Arg Arg Phe Asn Arg Ile Gin His Gly
20 25 30
Gin Cys Thr Tyr Thr Phe Ile Leu Pro Glu Gin Asp Gly Asn cys Arg
35 40 45
Glu Ser Thr Thr Asp Gin Tyr Asn Thr Asn Ala Leu Gin Arg Asp Ala
50 55 60
Pro His Val Glu Gin Asp Phe Ser Phe Gin Lys Leu Gin His Leu Glu
65 70 75 80
Hle Val Met Glu Asn Tyr Thr Gin Trp Leu Gin Lys Leu Glu Ser Tyr
85 90 95
Ile Val Glu Asn Met Lys Ser Glu Met Ala Gin Leu Gin Gin Asn Ala
100 105 110
Val Gin Asn His Thr Ala Thr Met Leu Glu Ile Gly Thr Ser Leu Leu
115 120 125
Ser Gin Thr Ala Glu Gin Thr Arg Lys Leu Thr Asp Val Glu Thr Gin
130 135 140
Val Leu Asn Gin Thr Ser Arg Leu Glu Ile Gin Leu Leu Glu Asn Ser
145 150 155 160
Leu Ser Thr Tyr Lys Leu Glu Lys Gin Leu Leu Gin Gin Thr Asn Glu
165 170 175
Ile Leu Lys Ile His Glu Lys Asn Ser Leu Leu Glu His Lys Ile Leu
180 185 190
Glu Met Glu Glu Arg His Lys Glu Glu Met Asp Thr Leu Lys Glu Glu
195 200 205
Lys Glu Asn Leu Gin Gly Leu Val Thr Arg Gin Ser Tyr Ile Ile Gin
210 215 220
Glu Leu Glu Lys Gin Leu Asn Lys Ala Thr Thr Asn Asn Ser Val Leu
225 230 235 240
Gin Lys Gin Gin Leu Glu Leu Met Asp Thr Val His Thr Leu Ile Thr
245 250 255
Leu Cys Ser Lys Glu Gly Val Leu Leu Lys Asn Ala Lys Arg Glu Glu
260 265 270
GlU Lys Pro Phe Arg Asp Cys Ala Asp Val Tyr Gin Ala Gly Phe Asn
275 280 285
Lys Ser Gly Ile Tyr Thr Ile Tyr Ile Asn Asn Val Ser Asp Pro Lys
290 295 300
Lys Val Phe Cys Asn Met Asp Val Asn Gly Gly Gly Trp Thr Val Ile
305 310 315 320
Gin His Arg Glu Asp Gly Ser Leu Asp Phe Gin Lys Gly Trp Lys Glu
325 330 335
Tyr Lys Met Gly Phe Gly Ser Pro Ser Gly Glu Tyr Trp Leu Gly Asn
340 345 350
Glu Phe Ile Phe Ala Ile Thr ser Gin Arg Gin Tyr Ser Leu Arg Ile
355 360 365
Glu Leu Met Asp Trp Glu Gly Asn Arg Ala Tyr Ser Gin Tyr Asp Arg
370 375 380
Phe Hle Ile Gly Asn Glu Lys Gin Asn Tyr Arg Leu Tyr Leu Lys Gly
385 390 395 400
Hle Ser Gly Thr Ala Gly Lys Gin Ser Ser Leu Ile Leu His Gly Ala
405 410 415
Glu Phe Ser Thr Lys Asp Ala Asp Asn ASp Asn Cys Met Cys Lys Cys
420 425 430
Ala Leu Met Leu Thr Gly Gly Trp Trp Phe Asp Ala Cys Gly Pro Ser
435 440 445
Asn Leu Asn Gly Met Phe Tyr Thr Ala Gly Gin Asn His Gly Lys Leu
450 455 460
Asn Gly Ile Lys Trp His Tyr Phe Lys Gly pro Arg Tyr Ser Ile Arg
465 470 475 480
Ser Thr Thr Met Met Ile Arg Pro Leu Asp Phe
485 490
2. Informace o sekv. ID. NO. 14:
i) Charakteristiky sekvence
A. Délka: 497 aminokyselin
B. Typ: aminokyselina
C. Rozvětvení: jeden
D. Topologie: lineární ii) Typ molekuly: protein ix) Charakteristika
A. jméno/klíč: mTLl
B. lokace: 1....497
D. Jiné informace: myší TIE-2 ligand 1
-71 CZ 295371 B6 xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 14:
Met Thr val Phe Leu Ser Phe Ala Phe Phe Ala Ala Ile Leu Thr His
1 5 10 15
Ile Gly Cys Ser Asn Gin Arg Arg Asn Pro Glu Asn Ser Gly Arg Arg
20 25 30
Tyr Asn Arg Ile Gin His Gly Gin Cys Ala Tyr Thr Phe Ile Leu Pro
35 40 45
Glu His Asp Gly Asn Cys Arg Glu Ser Thr Thr Asp Gin Tyr Asn Thr
50 55 60
Asn Ala Leu Gin Arg Asp Ala Pro His Val Glu Pro Asp Phe Ser Ser
65 70 75 80
Gin Lys Leu Gin His Leu Glu His Val Met Glu Asn Tyr Thr Gin Trp
85 90 95
Leu Gin Lys Leu Glu Asn Tyr Ile Val Glu Asn Met Lys Ser Glu Met
100 105 110
Ala Gin Ile Gin Gin Asn Ala Val Gin Asn His Thr Ala Thr Met Leu
115 120 125
Glu Ile Gly Thr Ser Leu Leu Ser Gin Thr Ala Glu Gin Thr Arg Lys
130 135 140
Leu Thr Asp val Glu Thr Gin val Leu Asn Gin Thr ser Arg Leu Glu
145 150 155 160
Ile Gin Leu Leu Glu Asn Ser Leu Ser Thr Tyr Lys Leu Glu Lys Gin
165 170 175
Leu Leu Gin Thr Asn Glu Ile Leu Lys Ile His Glu Lys Asn Ser Leu
180 185 190
Leu Glu His Lys Ile Leu Glu Met Glu Gly Lys His Lys Glu Glu Met
195 200 205
Asp Thr Leu Lys Glu Glu Lys Glu Asn Leu Gin Gly Leu Val Ser Arg
210 215 220
Gin Ser Phe Ile Ile Gin Glu Leu GlU Lys Gin Leu Ser Arg Ala Thr
225 230 235 240
Asn Asn Asn Ser Ile Leu Gin Lys Gin Gin Leu Glu Leu Met Asp Thr
245 250 255
Val His Asn Leu Ile Ser Leu Cys Thr Lys Glu Gly Val Leu Leu Lys
260 265 270
Gly Gly Lys Arg Glu Glu Glu Lys Pro Phe Arg Asp Cys Ala Asp Val
275 280 285
Tyr Gin Ala Gly Phe Asn Lys Ser Gly Ile Tyr Thr Ile Tyr Phe Asn
290 295 300
Asn Val Pro Glu Pro Lys Lys Val Phe Cys Asn Met Asp Val Asn Gly
30S 310 315 320
Gly Gly Trp Thr Val Ile Gin His Arg Glu Asp Gly Ser Leu Asp Phe
325 330 335
Gin Lys Gly Trp Lys Glu Tyr Lys Met Gly Phe Gly Ser Pro Ser Gly
340 345 350
Glu Tyr Trp Leu Gly Asn Glu Phe Ile Phe Ala Ile Thr Ser Gin Arg
355 360 365
Gin Tyr Met Leu Arg Ile Glu Leu Met Asp Trp Glu Gly Asn Arg Ala
370 375 380
Tyr Ser Gin Tyr Asp Arg Phe His Ile Gly Asn Glu Lys Gin Asn Tyr
385 390 395 400
Arg Leu Tyr Leu Lys Gly His Thr Gly Thr Ala Gly Lye Gin Ser Ser
405 410 415
Leu Ile Leu His Gly Ala Asp Phe ser Thr Lys Asp Ala Asp Asn Asp
420 425 430
Asn Cys Met Cys Lys Cys Ala Leu Met Leu Thr Gly Gly Trp Trp Phe
435 440 445
Asp Ala Cys Gly Pro Ser Asn Leu Asn Gly Met Phe Tyr Thr Ala Gly
450 455 460
Gin Asn His Gly Lys Leu Asn Gly Ile Lys Trp His Tyr Phe Lys Gly
465 470 475 480
Pro Arg Tyr Ser Ile Arg Ser Thr Thr Met Met Ile Arg Pro Leu Asp
485 490 495
Phe
-72CZ 295371 B6
2. Informace o sekv. ID. NO. 15:
i) Charakteristiky sekvence
A. Délka: 496 aminokyselin
B. Typ: aminokyselina
C. Rozvětvení: jeden
D. Topologie: lineární ii) Typ molekuly: protein ix) Charakteristika
A. jméno/klíč: mTL2
B. lokace: 1....496
D. Jiné informace: myší TIE-2 ligand 2
-73 CZ 295371 B6 xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 15:
Met Trp ' Gin Ile Ile Phe Leu Thr Phe Gly Trp Asp Ala Val Leu Thr
1 5 10 15
Ser Ala Tyr Ser Asn Phe Arg Lys Ser Val Asp Ser Thr Gly Arg Arg
20 25 30
Arg Tyr Arg Ile Gin Asn Gly Pro Cys Ala Tyr Thr Phe Leu Leu Pro
35 40 45
Glu Thr Asp Ser Gly Arg Ser Ser Ser Ser Thr Tyr Met Thr Asn Ala
50 S5 60
Val Gin Arg Asp Ala Pro Pro Asp Tyr Glu Asp Ser Val Gin Ser Leu
65 70 75 80
Gin Leu Leu Glu Asn Val Met Glu Asn Tyr Thr Gin Trp Leu Met Lys
85 90 95
Leu Glu Asn Tyr Ile Gin Asp Asn Met Lys Lys Glu Met Ala Glu Ile
100 105 110
Gin Gin Asn Val Val Gin Asn H1B Thr Ala Val Met Ile Glu Ile Gly
115 120 125
Thr Ser Leu Leu Ser Gin Thr Ala Glu Gin Thr Arg Lys Leu Thr Asp
130 135 140
Val Glu Thr Gin Val Leu Asn Gin Thr Thr Arg Leu Glu Leu Gin Leu
145 150 155 160
Leu Gin His Ser Ile Ser Thr Tyr Lys Leu Glu Lye Gin Ile Leu Asp
165 170 175
Gin Thr Ser Glu Ile Asn Lys Ile His Asn Lys Asn Ser Phe Leu Glu
180 185 190
Gin Lys Val Leu Asp Met Glu Gly Lys His Ser Glu Glu Met Gin Thr
195 200 205
Met Lys Glu Gin Lys Asp Glu Leu Gin Val Leu Val Ser Lys Gin Ser
210 215 220
Ser Val Ile Asp Glu Leu Glu Lys Lys Leu Val Thr Ala Thr Val Asn
225 230 235 240
Asn Ser Leu Leu Gin Lys Gin Gin His Asp Leu Met Asp Thr Val Asn
245 250 255
Ser Leu Leu Thr Met Met Ser Ser Pro ASn Ser Lys Ser Ser Leu Ala
260 265 270
Ile Arg Arg Glu Glu Gin Thr Thr Phe Arg Asp Cys Ala Asp val Phe
275 280 285
Lys Ala Gly Leu Thr Lys Ser Gly Ile Tyr Thr Leu Thr Phe Pro Asn
290 295 300
Ser Pro Glu Glu Ile Lys Ala Tyr Cys Asn Met Asp Val Gly Gly Gly
305 310 315 320
Gly Trp Thr Val Ile Gin His Arg Glu Asp Gly Ser Leu Asp Phe Gin
325 330 335
Lys Gly Trp Lys Glu Tyr Lys Met Gly Phe Gly Asn Pro Leu Gly Glu
340 345 350
Tyr Trp Leu Gly Asn Glu Phe Ile Ser Gin Ile Thr Gly Gin His Arg
355 360 365
Tyr Val Leu Lys Ile Gin Leu Lys Asp Trp Glu Gly Asn Glu Ala His
370 375 380
Ser Leu Tyr Asp His Phe Tyr Ile Ala Gly Glu Glu Ser Asn Tyr Arg
385 390 395 400
Ile His Leu Thr Gly Leu Thr Gly Thr Ala Ala Lys Ile Ser Ser Ile
405 410 415
Ser Gin Pro Gly Ser Asp Phe Ser Thr Lys Asp Ser Asp Asn Asp Lys
420 425 430
Cys Ile Cys Lys Cys Ser Leu Met Leu Thr Gly Gly Trp Trp Phe Asp
435 440 445
Ala Cys Gly Pro Šer Asn Leu Asn Gly Gin Phe Tyr Pro Gin Lys Gin
4S0 4S5 460
Asn Thr Asn Lys Phe Asn Gly Ile Lys Trp Tyr Tyr Trp Lys Gly Ser
465 470 475 480
Gly Tyr Ser Ile Lys Ala Thr Thr Met Met Ile Arg Pro Ala Asp Phe
485 490 495
2. Informace o sekv. ID. NO. 16:
i) Charakteristiky sekvence
A. Délka: 496 aminokyselin
B. Typ: aminokyselina
C. Rozvětvení: jeden
D. Topologie: lineární ii) Typ molekuly: protein ix) Charakteristika
A. jméno/klíč: mTL2
B. lokace: 1....496
D. Jiné informace: myší TIE-2 ligand 2
-75CZ 295371 B6 xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 16:
Met Trp Gin ile val Phe Phe Thr Leu ser Cys Asp Ala Val Leu Thr
1 5 10 15
Ala Ala Tyr Aen 20 Asn phe Arg Lye ser 25 Met Aep Ser ile Oly Lys 30 Lye
Arg Tyr Arg Ile Gin His Oly Ser Cys Ala Tyr Thr Phe Leu Leu Pro
35 40 4$
Glu Met Asp A«n Gly Arg Ber Ser Ser Ser Thr Tyr Val ZNhti» Asn Ala
50 55. «0
Val Gin Arg AS» Ala Pro Pro Glu Tyr Glu Asp ser'val Gin Ser Leu
es 70 75 eo
Gin Lau Leu Glu Asn Val Met Glu Tyr Thr Gin Trp Leu Met Lye
85 90 95
Leu Glu Aen Tyr Zle Gin Aep Asn Met Lys Lys GlU Mat Ala Glu Zle
100 10$ 110
Gin Gin Asn Val Gin Asn His Thr Ala val Mat Ile GlU Ile Giy
lis 120 12S
Thr Ser Leu Leu Ser cm Thr Ala Glu Gin Thr Arg Lys Leu Thr
130 135 140
Val Glu Thr Gin val Leu Aen Gin Thr Thr Arg Leu Glu Leu Gin Leu
145 150 1S5 160
Lau Gin His ser Ile Ser Thr Tyr Lys Leu Glu Lys Gin Zla Leu ASP
165 170 175
Gin Thr Ser Glu Ile Asn Lye Ile Mls As» Lys Asn Ser Phe Leu Glu
180 185 190
Lye Lys Val Leu Asp Met Glu Asp Lys Kle Zle Ile Glu Met Gin Thr
195 200 205
Ile Lys Glu Glu Lys Asp Glu Leu Gin val Leu Val Ser Lye Gin Aan
210 215 220 Val
Ser Iltt Ile Glu Olu Leu Glu Lys Lye Ile Val Thr Ala Thr Asn
225 230 235 240
Asn Ser Val Leu Gin Lys Gin Gin His Aap Leu Met Asp Thr Val Asn
2 45 250 25S
Aín Leu Leu Thr Met Met ser Thr Ser Asn Ber Ala Lye Asp Ser Thr
260 265 270
val Ala Arg Glu Glu Gin Ile Ser Phe Arg Asp cys Ala Asp Val Phe
275 280 28S
Lye ΐλΧ> Λ Gly His Thr Lys Asn Gly Zits Tyr Thr Leu Thr Phe Pro
290 295 300
Ser Prc Glu GXxi Ile Lys íí Tyr Cys Aen MSt Aep Ala Gly Gly Gly
305 310 31S 320
Gly Trp Thr Ile Ile Gin Arg Arg Glu Αβρ Gly Ser Leu Asp Phe Gin
32S 330 335
Lye Gly Trp Lys G1U Tyr Lys Val CíLy Phe Gly Ser Pro Ser Gly GLu
340 345 350
Tyr Trp Leu Gly Asn Olu Phe Zle Ser Gin Ile Thr Asn Gin Cln Arg
365 360 36S
Tyr val Leu Lya Ile Hle Leu Lys λβρ Trp G1U Gly Asn Glu Ala Tyr
370 376 380
Ser Leu Tyr Asp His Phe Tyr Ile Ser Gly Glu Glu Leu Asn Tyr Arg
385 390 395 400
Ile His Leu Lye Gly Leu Thr Gly Thr Ala Lys Ile ser ser XXcs
405 410 415
ser Gin Pro oiy Asn ASp Phe ser Thr Lys Asp Gly Asp Asn Asp Lys
420 425 430
Cye Ile cys Lys cys Ser Χ*θνι Mat Leu Thr Gly Qiy Trp Trp Phe Asp
435 440 445
Ala Cys Gly pro ser Aoft Leu Asn Cly Het Phe Tyr Pro Gin Arg Gin
450 455 460
Asn Thr Asn Lys Phe Asn GLy Ile Lys Trp Tyr Tyr Trp Lys Gly Ser
465 470 475 480
Gly Tyr Ser Ile Lys Ala Thr Thr Met Met Ile Arg Pro Ala Asp Phe
485 490 495
-76CZ 295371 B6
2. Informace o sekv. ID. NO. 17:
i) Charakteristiky sekvence
A. Délka: 1512 párů bází
B. Typ: nukleová kyselina
C. Rozvětvení: jeden
D. Topologie: lineární ii) Typ molekuly: DNA ix) Charakteristika
A. jméno/klíč: kódující sekvence
B. lokace: 1....1509
D. Jiné informace:
A. jméno/klíč: TIE ligand-4
B. lokace: 1....1512
D. Jiné informace:
xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 17:
ATG CTC TCC CAG CTA GCC ATG Met CTG Leu CAG GGC AGC CTC CTC Leu CTT GTG GTT Val 48
Met 1 Leu Ser Gin Leu 5 Ala Gin Gly 10 Ser Leu Leu Val 15
GCC ACC ATG TCT GTG GCT CAA CAG ACA AGG CAG GAG GGG GAT AGG GGC 96
Ala Thr Met Ser Val Ala Gin Gin Thr Arg Gin Glu Ala Asp Arg Gly
20 25 30
TGC GAG ACA CTT GTA GTC CAG CAC GGC CAC TGT AGC TAC ACC TTC TTG 144
Cys Glu Thr Leu Val Val Gin His Gly HlS Cys Ser Tyr Thr Phe Leu
35 40 45
CTG ccc AAG TCT GAG ccc TGC CCT CCG GGG CCT GAG GTC TCC AGG GAC 192
Leu Pro Lys Ser Glu Pro Cys Pro Pro Gly Pro Glu Val ser Arg Asp
50 55 60
TCC AAC ACC CTC CAG AGA GAA TCA CTG GCC AAC CCA CTG CAC CTG GGG 240
Ser Asn Thr Leu Gin Arg Glu Ser Leu Ala Asn Pro Leu His Leu Gly
es 70 75 80
AAG TTG ccc ACC CAG CAG GTG AAA CAG CTG GAG CAG GCA CTG CAG AAC 288
Lys Leu Pro Thr Gin Gin Val Lys Gin Leu Glu Gin Ala Leu Gin ASn
85 90 95
AAC ACG CAG TGG CTG AAG AAG CTA GAG AGG GCC ATC AAG ACG ATC TTG 336
Asn Thr Gin Trp Leu Lys Lys Leu Glu Arg Ala Ile Lys Thr Ile Leu
100 105 110
AGG TCG AAG CTG GAG CAG GTC CAG CAG CAA ATG GCC CAG AAT CAG ACG 384
Arg Ser Lys Leu Glu Gin val Gin Gin Gin Met Ala Gin Asn Gin Thr
115 120 125
GCC ccc ATG CTA GAG CTG GGC ACC AGC CTC CTG AAC CAG ACC ACT GCC 432
Ala Pro Met Leu Glu Leu Gly Thr Ser Leu Leu Asn Gin Thr Thr Ala
130 135 140
CAG ATC CGC AAG CTG ACC GAC ATG GAG GCT CAG CTC CTG AAC CAG ACA 480
Gin Ile Arg Lys Leu Thr Asp Met Glu Ala Gin Leu Leu Asn Gin Thr
-ΊΊCZ 295371 B6
145 1S0 15 5 160
TCA AGA Ser Arg ATG Met GAT Asp GCC Ala 165 CAG ATG CCA GAG ACC TTT CTG TCC ACC AAC Asn 175 AAG Lys 528
Gin Met Pro Glu Thr 170 Phe Leu Ser Thr
CTG GAG AAC CAG CTG CTG CTA CAG AGG CAG AAG CTC CAG CAG CTT CAG 576
Leu Glu Asn Gin 180 Leu Leu Leu Gin Arg 185 Gin Lys Leu Gin Gin 190 Leu Gin
GGC CAA AAC AGC GCG CTC GAG AAG CGG TTG CAG GCC CTG GAG ACC AAG 624
Gly Gin Aen 195 Ser Ala Leu Glu Lys 200 Arg Leu Gin Ala Leu 205 Glu Thr Lye
CAG CAG GAG GAG CTG GCC AGC ATC CTC AGC AAG AAG GCG AAG CTG CTG 672
Gin Gin 210 Glu Glu Leu Ala Ser 215 Ile Leu Ser Lys Lys 220 Ala Lye Leu Leu
AAC ACG CTG AGC CGC CAG AGC GCC GCC CTC ACC AAC ATC GAG CGC GGC 720
Asn 225 Thr Leu Ser Arg Gin 230 Ser Ala Ala Leu Thr 235 Asn Ile Glu Arg Gly 240
CTG CGC GGT GTC AGG CAC AAC TCC AGC CTC CTG CAG GAC CAG CAG CAC 768
Leu Arg Gly Val Arg 245 Hle Asn Ser Ser Leu 250 Leu Gin Asp Gin Gin 255 His
AGC CTG CGC CAG CTG CTG GTG TTG TTG CGG CAC CTG GTG CAA GAA AGG 816
Ser Leu Arg Gin 260 Leu Leu Val Leu Leu 265 Arg His Leu Val Gin 270 Glu Arg
GCT AAC GCC TCG GCC CCG GCC TTC ATA ATG GCA GGT GAG CAG GTG TTC 864
Ala Asn Ala 275 Ser Ala Pro Ala Phe 280 Ile Met Ala Gly Glu 285 Gin Val Phe
CAG GAC TGT GCA GAG ATC CAG CGC TCT GGG GCC AGT GCC AGT GGT GTC 912
Gin Asp 290 Cys Ala Glu Ile Gin 295 Arg Ser Cly Ala Ser 300 Ala Ser Gly Val
TAC ACC ATC CAG GTG TCC AAT GCA ACG AAG CCC AGG AAG GTG TTC TGT 960
Tyr 305 Thr Ile Gin Val Ser 310 Asn Ala Thr Lye Pro 315 Arg Lys Val Phe Cys 320
GAC CTG CAG AGC AGT GGA GGC AGG TGG ACC CTC ATC CAG CGC CGT GAG 1008
Asp Leu Gin Ser Sér 325 Gly Gly Arg Trp Thr 330 Leu Ile Gin Arg Arg 335 Glu
AAT GGC ACC GTG AAT TTT CAG CGG AAC TGG AAG GAT TAC AAA CAG GGC 1056
Asn Gly Thr Val 340 Asn Phe Gin Arg Asn 345 Trp Lys Asp Tyr Lys 350 Gin Gly
TTC GGA GAC CCA GCT GGG GAG CAC TGG CTG GGC AAT GAA GTG GTG CAC 1104
Phe Gly Aep 355 Pro Ala Gly Glu His 360 Trp Leu Gly Asn Glu 365 Val Val His
CAG CTC ACC AGA AGG GCA GCC TAC TCT CTG CGT GTG GAG CTG CAA GAC 1152
Gin Leu 370 Thr Arg Arg Ala Ala 375 Tyr Ser Leu Arg Val 380 Glu Leu Gin Asp
TGG GAA GGC CAC GAG GCC TAT GCC CAG TAC GAA CAT TTC CAC CTG GGC 1200
Trp 385 Glu Gly His Glu Ala 390 Tyr Ala Gin Tyr Glu 395 His Phe H1B Leu Gly 400
AGT GAG AAC CAG CTA TAC AGG CTT TCT GTG GTC GGG TAC AGC GGC TCA 1248
Ser Glu Asn Gin Leu 405 Tyr Arg Leu Ser Val 410 Val Gly Tyr Ser Gly 415 Ser
GCA GGG CGC CAG AGC AGC CTG GTC CTG CAG AAC ACC AGC TTT AGC ACC 1296
Ala Gly Arg Gin 420 Ser Ser Leu Val Leu Gin 425 Asn Thr Ser Phe 430 Ser Thr
CTT GAC TCA GAC AAC GAC CAC TGT CTC TGC AAG TGT GCC CAG GTG ATG 1344
Leu Asp Ser Asp Asn Aep His Cys Leu Cys Lys Cys Ala Gin Val Met
435 440 445
TCT GGA GGG TGG TGG TTT GAC GCC TGT GGC CTG TCA AAC CTC AAC GGC 1392
Ser Gly Gly Trp Trp Phe Asp Ala Cys Gly Leu Ser Asn Leu Asn Gly
450 455 460
GTC TAC TAC CAC GCT ccc GAC AAC AAG TAC AAG ATG GAC GGC ATC CGC 1440
Val Tyr Tyr His Ala Pro Asp Asn Lys Tyr Lys Met Asp Gly Ile Arg
465 470 475 4J30
TGG CAC TAC TTC AAG GGC CCC AGC TAC TCA CTG CGT GCC TCT CGC ATG 1488
Trp His Tyr Phe Lye Gly Pro Ser Tyr Ser Leu Arg Ala ser Arg Met
465 490 495
ATG ATA CGG CCT TTG GAC ATC TAA 1512
Met Ile Arg Pro Leu Aep Ile
500
2. Informace o sekv. ID. NO. 18:
i) Charakteristiky sekvence
A. Délka: 503 aminokyselin
B. Typ: aminokyselina
C. Rozvětvení: jeden
D. Topologie: lineární ii) Typ molekuly: protein
v) Typ fragmentu: interní ix) Charakteristika
A. jméno/klíč: TIE ligand-4
B. lokace: 1....503
D. Jiné informace:
xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 18:
Met Leu Ser Gin Leu Ala Met Leu Gin Gly Ser Leu Leu Leu Val Val
1 5 10 15
Ala Thr Met Ser Val Ala Gin Gin Thr Arg Gin Glu Ala Asp Arg Gly
20 25 30
Cys Glu Thr Leu Val Val Gin His Gly His Cys Ser Tyr Thr Phe Leu
35 40 45
Leu Pro Lys Ser Glu Pro Cys Pro Pro Gly Pro Glu val Ser Arg Asp
50 55 60
Ser Asn Thr Leu Gin Arg Glu Ser Leu Ala Asn Pro Leu His Leu Gly
65 70 75 80
Lys Leu Pro Thr Gin Gin Val’ Lys Gin Leu Glu Gin Ala Leu Gin Asn
85 90 95
Asn Thr Gin Trp Leu Lys Lys Leu Glu Arg Ala Ile Lys Thr Ile Leu
100 105 110
Arg Ser Lys Leu Glu Gin val Gin Gin Gin Met Ala Gin Asn Gin Thr
115 120 125
Ala Pro Met Leu Glu Leu Gly Thr ser Leu Leu Asn Gin Thr Thr Ala
130 135 140
Gin Ile Arg Lye Leu Thr Asp Met Glu Ala Gin Leu Leu Asn Gin Thr
145 150 155 160
Ser Arg Met Asp Ala Gin Met Pro Glu Thr Phe Leu Ser Thr Asn Lys
165 170 175
Leu Glu Asn Gin Leu Leu Leu Gin Arg Gin Lys Leu Gin Gin Leu Gin
180 185 190
Gly Gin Asn Ser Ala Leu Glu Lys Arg Leu Gin Ala Leu Glu Thr Lys
195 200 205
Gin Gin Glu Glu Leu Ala Ser Ile Leu Ser Lye Lye Ala Lye Leu Leu
210 215 220
Asn Thr Leu Ser Arg Gin Ser Ala Ala Leu Thr Asn Ile Glu Arg Gly
225 230 235 240
Leu Arg Gly Val Arg His Asn Ser Ser Leu Leu Gin Asp Gin Gin His
245 250 255
Ser Leu Arg Gin Leu Leu Val Leu Leu Arg His Leu Val Gin Glu Arg
260 265 270
Ala Asn Ala Ser Ala Pro Ala Phe Ile Met Ala Gly Glu Gin Val Phe
275 280 285
Gin Asp Cys Ala Glu Ile Gin Arg Ser Gly Ala Ser Ala Ser Gly Val
290 295 300
Tyr Thr Ile Gin Val Ser Asn Ala Thr Lys Pro Arg Lys Val Phe Cys
305 310 315 320
Asp Leu Gin Ser Ser Gly Gly Arg Trp Thr Leu Ile Gin Arg Arg Glu
325 330 335
Asn Gly Thr Val Asn Phe Gin Arg Asn Trp Lys Asp Tyr Lys Gin Gly
340 345 350
Phe Gly Asp Pro Ala Gly GlU His Trp Leu Gly Asn Glu Val Val His
355 360 365
Gin Leu Thr Arg Arg Ala Ala Tyr ser Leu Arg Val Glu Leu Gin Asp
370 375 380
Trp Glu Gly His Glu Ala Tyr Ala Gin Tyr Glu His Phe His Leu Gly
385 390 395 400
Ser Glu Asn Gin Leu Tyr Arg Leu ser Val Val Gly Tyr Ser Gly Ser
405 410 415
Ala Gly Arg Gin Ser Ser Leu Val Leu Gin Asn Thr Ser Phe Ser Thr
420 425 430
Leu Asp Ser Asp Asn Asp His Cys Leu Cys Lys Cys Ala Gin Val Met
435 440 445
Ser Gly Gly Trp Trp Phe Asp Ala Cys Gly Leu Ser Asn Leu Asn Gly
450 455 460
Val Tyr Tyr His Ala Pro Asp Asn Lys Tyr Lys Mét Asp Gly Ile Arg
465 470 475 480
Trp His Tyr Phe Lys Gly Pro Ser Tyr Ser Leu Arg Ala Ser Arg Met
485 490 495
Met Ile Arg Pro Leu Asp Ile
500
-80CZ 295371 B6
2. Informace o sekv. ID. NO. 19:
i) Charakteristiky sekvence
A. Délka: 1497 párů bází
B. Typ: nukleová kyselina
C. Rozvětvení: jeden
D. Topologie: lineární ii) Typ molekuly: DNA ix) Charakteristika
A. jméno/klíč: kódující sekvence
B. lokace: 1....1494
D. Jiné informace:
A. jméno/klíč: 1N1C2F (chiméra 1)
B. lokace: 1....1497
D. Jiné informace:
A. jméno/klíč: jiný
B. lokace: 1....60
D. Jiné informace: domnělá vedoucí sekvence je zakódována nukleotidy 1-60
-81 CZ 295371 B6 xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 19:
ATG ACA Het Thr 1 GTT Val TTC CTT TCC TTT GCT TTC CTC GCT GCC ATT CTG ACT CAC 48
Phe Leu s Ser Phe Ala Phe Leu 10 Ala Ala Ile Leu Thr Hie 1S
ATA GGG TGC AGC AAT CAG CGC CGA AGT CCA GAA AAC AGT GGG AGA AGA 96
Ile Gly Cye Ser 20 Asn Gin Arg Arg Ser 25 Pro Glu Aen Ser Gly 30 Arg Arg
TAT AAC CGG ATT CAA CAT GGG CAA TGT GCC TAC ACT TTC ATT CTT CCA 144
Tyr Asn Arg 35 Ile Gin His Gly Gin 40 Cys Ala Tyr Thr Phe 45 Ile Leu Pro
GAA CAC GAT GGC AAC TGT CGT GAG AGT ACG ACA GAC CAG TAC AAC ACA 192
Glu His 50 Asp Gly Asn Cys Arg 55 Glu Ser Thr Thr Aep 60 Gin Tyr Aen Thr
AAC GCT CTG CAG AGA GAT GCT CCA CAC GTG GAA CCG GAT TTC TCT TCC 240
Aen 65 Ala Leu Gin Arg Asp 70 Ala Pro His Val Glu 75 Pro Asp Phe Ser Ser 80
CAG AAA CTT CAA CAT CTG GAA CAT GTG ATG GAA AAT TAT ACT CAG TGG 288
Gin Lys Leu Gin His 85 Leu Glu His Val Met 90 Glu Aěn Tyr Thr Gin 95 Trp
CTG CAA AAA CTT GAG AAT TAC ATT GTG GAA AAC ATG AAG TGG GAG ATG 336
Leu Gin Lys Leu 100 G1U Asn Tyr Ile Val 105 Glu Asn Met Lys Ser lio Glu Met
GCC CAG ATA CAG CAG AAT GCA GTT CAG AAC CAC ACG GCT ACC ATG CTG 384
Ala Gin Ile 115 Gin Gin Asn Ala Val 120 Gin Aen His Thr Ala 125 Thr Met Leu
GAG ATA GGA ACC AGC CTC CTC TCT CAG ACT GCA GAG CAG ACC AGA AAG 432
Glu Ile 130 Gly Thr Ser Leu Leu 135 Ser Gin Thr Ala Glu 140 Gin Thr Arg Ly6
CTG ACA GAT GTT GAG ACC CAG GTA CTA AAT CAA ACT TCT CGA CTT GAG 480
Leu 145 Thr Asp Val Glu Thr 150 Gin Val Leu Aen Gin 15 S Thr Ser Arg Leu Glu 160
ATA CAG CTG CTG GAG AAT TCA TTA TCC ACC TAC AAG CTA GAG AAG CAA 528
Ile Gin Leu Leu G1U 165 Asn Ser Leu Ser Thr 170 Tyr Lys Leu GlU Lys 175 Gin
CTT CTT CAA CAG ACA AAT GAA ATC TTG AAG ATC CAT GAA AAA AAC AGT 576
Leu Leu Gin Gin 180 Thr Asn Glu Ile Leu 185 Lye Ile His Glu Lys 190 Aen Ser
TTA TTA GAA CAT AAA ATC TTA GAA ATG GAA GGA AAA CAC AAG GAA GAG 624
Leu Leu Glu 195 His Lys Ile Leu Glu 200 Het Glu Gly Lys His 205 Lys Glu Glu
TTG GAC ACC TTA AAG GAA GAG AAA GAG AAC CTT CAA GGC TTG GTT ACT 672
Leu Aep 210 Thr Leu Lys Glu Glu 215 Lys Glu Asn Leu Gin 220 Gly Leu Val Thr
CGT CAA ACA TAT ATA ATC CAG GAG CTG GAA AAG CAA TTA AAC AGA GCT 720
Arg 225 Gin Thr Tyr Ile Ile 230 Gin Glu Leu Glu Lys 235 Gin Leu Asn Arg Ala 240
ACC ACC AAC AAC AGT GTC CTT CAG AAG CAG CAA CTG GAG CTG ATG GAC 768
Thr Thr Asn Asn Ser 245 Val Leu Gin Lys Gin 250 Gin Leu Glu Leu Met 255 Asp
ACA GTC CAC AAC CTT GTC AAT CTT TGC ACT AAA GAA GGT GTT TTA CTA 816
-82CZ 295371 B6
Thr Val Hle Aen 260 Leu Val Aen Leu Cye Thr 265 Lye Glu Gly Val 270 Leu Leu
AAG GGA GGA AAA AGA GAG GAA GAG AAA CCA TTT AGA GAC TGT GCT GAA 864
Lye Gly Gly 275 Lys Arg Glu Glu Glu 280 Lys Pro Phe Arg Asp 285 Cys Ala Glu
GTA TTC AAA TCA GGA CAC ACC ACA AAT GGC ATC TAC ACG TTA ACA TTC 912
Val Phe 290 Lys Ser Gly His Thr 295 Thr Asn Gly Ile Tyr 300 Thr Leu Thr Phe
CCT AAT TCT ACA GAA GAG ATC AAG GCC TAC TGT GAC ATG GAA GCT GGA 960
Pro 305 Aen Ser Thr Glu Glu 310 Ile Lys Ala Tyr Cys 315 Asp Met Glu Ala Gly 320
GGA GGC GGG TGG ACA ATT ATT CAG CGA CGT GAG GAT GGC AGC GTT GAT 1008
Gly Gly Gly Trp Thr 325 Ile Ile Gin Arg Arg 330 Glu Asp Gly Ser Val 335 Aep
TTT CAG AGG ACT TGG AAA GAA TAT AAA GTG GGA TTT GGT AAC cct TCA 1056
Phe Gin Arg Thr 340 Trp Lys Glu Tyr Lys 345 Val Gly Phe Gly Asn 350 Pro ser
GGA GAA TAT TGG CTG GGA AAT GAG TTT GTT TCG CAA CTG ACT AAT CAG 1104
Gly Glu Tyr 355 Trp Leu Gly Asn Glu 360 Phe Val Ser Gin Leu 365 Thr Asn Gin
CAA GGC TAT GTG CTT AAA ATA CAC CTT AAA GAC TGG GAA GGG AAT GAG 1152
Gin Arg 370 Tyr Val Leu Lys Ile 375 His Leu Lys Asp Trp 380 Glu Gly Asn Glu
GCT TAC TCA TTG TAT GAA CAT TTC TAT CTC TCA AGT GAA GAA CTC AAT 1200
Ala 385 Tyr Ser Leu Tyr Glu 390 His Phe Tyr Leu Ser 395 Ser Glu Glu Leu Asn 400
TAT AGG ATT CAC CTT AAA GGA CTT ACA GGG ACA GCC GGČ AAA ATA AGC 1248
Tyr Arg Ile His Leu 405 Lys Gly Leu Thr Gly 410 Thr Ala Gly Lys Ile 415 Ser
AGC ATC AGC CAA CCA GGA AAT GAT TTT AGC ACA AAG GAT GGA GAC AAC 1296
Ser Ile Ser Gin 420 Pro Gly Asn Asp Phe 425 Ser Thr Lys Asp Gly 430· ASp: Asn
GAC AAA TGT ATT TGC AAA TGT TCA CAA ATG CTA ACA GGA GGC TGG TGG 1344
Asp Lys Cys 435 Ile Cye Lys Cys Ser 440 Gin Het Leu Thr Gly 445 Gly Trp Trp
TTT GAT GCA TGT GGT CCT TCC AAC TTG AAC GGA ATG TAC TAT CCA CAG 1392
Phe Asp 450 Ala Cys Gly Pro Ser 455 Asn Leu Asn Gly Het 460 Tyr Tyr Pro Gin
AGG CAG AAC ACA AAT AAG TTC AAC GGC ATT AAA TGG TAC TAC TGG AAA 1440
Arg 465 Gin Asn Thr Asn Lys 470 Phe Asn Gly Ile Lys 475 Trp Tyr Tyr Trp Lys 480
GGC TCA GGC TAT TCG CTC AAG GCC ACA ACC ATG ATG ATC CGA CCA GCA 1488
Gly Ser Gly Tyr Ser 485 Leu Lys Ala Thr Thr 490 Het Het Ile Arg Pro 495 Ala
GAT TTC TAA 1497
Asp Phe
-83 CZ 295371 B6
2. Informace o sekv. ID. NO. 20:
i) Charakteristiky sekvence
A. Délka: 498 aminokyselin
B. Typ: aminokyselina
C. Rozvětvení: jeden
D. Topologie: lineární ii) Typ molekuly: protein
v) Typ fragmentu: interní ix) Charakteristika
A. jméno/klíč: 1N1C2F (chiméra 1)
B. lokace: 1....498
D. Jiné informace:
-84CZ 295371 B6 xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 20:
Met Thr Val Phe Leu Ser Phe Ala Phe Leu Ala Ala Ile Leu Thr His
1 5 10 15
Ile Gly Cys ser Asn Gin Arg Arg Ser Pro Glu Asn Ser Gly Arg Arg
20 25 30
Tyr Asn Arg Ile Gin His Gly Gin Cys Ala Tyr Thr Phe Zle Leu Pro
35 40 45
Glu His Asp Gly Asn Cys Arg Glu Ser Thr Thr Asp Gin Tyr Asn Thr
50 55 60
Asn Ala Leu Gin Arg Asp Ala Pro His val Glu Pro Asp Phe Ser Ser
65 70 75 80
Gin Lys Leu Gin His Leu Glu His Val Met Glu Asn Tyr Thr Gin Trp
85 90 95
Leu Gin Lys Leu Glu Asn Tyr Ile Vál Glu Aen Met Lys Ser Glu Met
100 105 110
Ala Gin Ile Gin Gin Asn Ala Val Gin Asn His Thr Ala Thr Met Leu
115 120 125
Glu Ile Gly Thr Ser Leu Leu Ser Gin Thr Ala G1U Gin Thr Arg Lys
130 135 140
Leu Thr Asp Val Glu Thr Gin Val Leu Asn Gin Thr Ser Arg Leu Glu
145 150 155 160
Ile Gin Leu Leu Glu Asn Ser Leu ser Thr Tyr Lys Leu Glu Lys Gin
165 170 175
Leu Leu Gin Gin Thr Asn Glu Ile Leu Lys Zle His Glu Lys Αεη ser
180 185 190
Leu Leu Glu His Lys Ile Leu Glu Met Glu Gly Lys His Lys Glu Glu
195 200 205
Leu Aep Thr Leu Lys Glu Glu Lys Glu Asn Leu Gin Gly Leu Val Thr
210 215 220
Arg Gin Thr Tyr Ile Ile Gin Glu Leu Glu Lys Gin Leu Asn Arg Ala
225 230 235 240
Thr Thr Asn Asn Ser Val Leu Gin Lys Gin Gin Leu Glu Leu Met Asp
245 250 255
Thr Val His Asn Leu Val Asn Leu Cys Thr Lys Glu Gly Val Leu Leu
260 265 270 Ala
Lys Gly Gly Lys Arg Glu Glu Glu Lys Pro Phe Arg Asp Cys Glu
275 280 28S
Val Phe Lys ser Gly His Thr Thr Asn Cly Ile Tyr Thr Leu Thr Phe
290 295 300
Pro Asn Ser Thr Glu Glu Ile Lys Ala Tyr Cys ASp Met Glu Ala Gly
305 310 315 320
Gly Gly Gly Trp Thr Ile Ile cm Arg Arg Glu Asp Gly Ser Val Asp
325 330 335
Phe Gin Arg Thr Trp Lys Glu Tyr Lys Val Gly Phe Gly Aen Pro Ser
340 345 350
Gly Glu Tyr Trp Leu Gly Asn Glu Phe Val Ser Gin Leu Thr Asn Gin
355 360 365
Gin Arg Tyr Val Leu LyB Ile His Leu Lys Asp Trp Glu Gly Asn Glu
370 375 380
Ala Tyr Ser Leu Tyr Glu His Phe Tyr Leu Ser Ser Glu Glu Leu Aen
385 390 395 400
Tyr Arg Ile His Leu Lys Gly Leu Thr Gly Thr Ala Gly Lys Ile Ser
405 410 415
Ser Ile Ser Gin Pro Gly Asn Asp Phe Ser Thr Lys Asp Gly Asp Asn
420 425 430
Asp Lye Cys Ile Cys Lys Cys Ser Gin Met Leu Thr Gly Gly Trp Trp
435 440 445
Phe Asp Ala Cys Gly Pro Ser Asn Leu Aen Gly Met Tyr Tyr Pro Gin
450 455 460
Arg Gin Asn Thr Asn Lys Phe Asn Gly Ile Lys Trp Tyr Tyr Trp Lys
465 470 475 480
Gly Ser Gly Tyr Ser Leu Lys Ala Thr Thr Met Het Ile Arg Pro Ala
485 490 495
Asp Phe
-85CZ 295371 B6
2. Informace o sekv. ID. NO. 21:
i) Charakteristiky sekvence
A. Délka: 1491 párů bází
B. Typ: nukleová kyselina
C. Rozvětvení: jeden
D. Topologie: lineární ii) Typ molekuly: DNA ix) Charakteristika
A. jméno/klíě: kódující sekvence
B. lokace: 1....1488
D. Jiné informace:
A. jméno/klíě: 2N2C2F (chiméra 2)
B. lokace: 1....1491
D. Jiné informace:
A. jméno/klíě: jiný
B. lokace: 1....48
D. Jiné informace: domnělá vedoucí sekvence je zakódována nukleotidy 1-48 xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 21:
ATG TGG Met Trp 1 CAG Gin ATT Ile GTT TTC TTT ACT CTG Leu AGC TGT GAT CTT Leu GTC Val TTG Leu 15 GCC Ala 48
Val 5 Phe Phe Thr Ser 10 Cys Asp
GCA GCC TAT AAC AAC TTT CGG AAG AGC ATG GAC AGC ATA GGA AAG AAG 96
Ala Ala Tyr Asn Asn Phe Arg Lys Ser Met ASp ser Ile Gly Lys Lys
20 25 30
CAA TAT CAG GTC CAG CAT GGG TCC TGC AGC TAC ACT TTC CTC CTG CCA 144
Gin Tyr Gin Val Gin His Gly Ser Cys Ser Tyr Thr Phe Leu Leu Pro
35 40 45
GAG ATG GAC AAC TGC CGC TCT TCC TCC AGC CCC TAC GTG TCC AAT GCT 192
Glu Met Asp Asn cys Arg Ser Ser Ser Ser Pro Tyr Val Ser Asn Ala
50 55 60
GTG CAG AGG GAC GCG CCG CTC GAA TAC GAT GAC TCG GTG CAG AGG CTG 240
Val Gin Arg Asp Ala Pro Leu Glu Tyr Asp Asp Ser Val Gin Arg Leu
65 70 75 80
CAA GTG CTG GAG AAC ATC ATG GAA AAC AAC ACT CAG TGG CTA ATG AAG 288
Gin Val Leu Glu Asn Ile Met Glu Asn Asn Thr Gin Trp Leu Met Lye
85 90 95
CTT GAG AAT TAT ATC CAG GAC AAC ATG AAG AAA GAA ATG GTA GAG ATA 336
-86CZ 295371 B6
Leu Glu Asn Tyr Ile Gin Asp Asn Met Lys Lys Glu Met Val Glu 110 Ile
100 105
CAG CAG AAT GCA GTA CAG AAC CAG ACG GCT GTG ATG ATA GAA ATA GGG 384
Gin Gin Asn 115 Ala Val Gin Asn Gin 120 Thr Ala Val Met Ile 125 Glu Ile Gly
ACA AAC CTG TTG AAC CAA ACA GCT GAG CAA ACG CGG AAG TTA ACT GAT 432
Thr Asn 130 Leu Leu Asn Gin Thr 135 Ala Glu Gin Thr Arg 140 Lys Leu Thr Asp
GTG GAA GCC CAA GTA TTA AAT CAG ACC ACG AGA CTT GAA CTT CAG CTC 480
Val 145 Glu Ala Gin Val Leu 150 Ašn Gin Thr Thr Arg 155 Leu Glu Leu Gin Leu Í60
TTG GAA CAC TCC CTC TCG ACA AAC AAA TTG GAA AAA CAG ATT TTG GAC 528
Leu Glu His Ser Leu 165 Ser Thr Asn Lys Leu 170 Glu Lys Gin Ile Leu 175 Asp
CAG ACC AGT GAA ATA AAC AAA TTG CAA GAT AAG AAC AGT TTC CTA GAA 576
Gin Thr Ser Glu ιβο Ile Asn Lys Leu Gin 185 Asp Lys Asn Ser Phe 190 Leu Glu
AAG AAG GTG CTA GCT ATG GAA GAC AAG CAC ATC ATC CAA CTA CAG TCA 624
Lys Lys Val 195 Leu Ala Met Glu Asp Lys 200 His Ile Ile Gin 205 Leu Gin ser
ATA AAA GAA GAG AAA GAT CAG CTA CAG GTG TTA GTA TCC AAG CAA AAT 672
Ile Lys 210 Glu Glu Lys ABp Gin Leu 215 Gin Val Leu Val 220 Ser Lys Gin Asn
TCC ATC ATT GAA GAA CTA GAA AAA AAA ATA GTG ACT GCC ACG GTG AAT 720
šer 225 Ile Ile Glu Glu Leu 230 Glu Lys Lys Ile Val 235 Thr Ala Thr Val Asn 240
AAT TCA GTT CTT CAA AAG CAG CAA CAT GAT CTC ATG GAG ACA GTT AAT 768
Asn Ser Val Leu Gin 245 Lys Gin Gin His Asp 250 Leu Met Glu Thr Val 255 Asn
AAC TTA CTG ACT ATG ATG TCC ACA TCA AAC TCA GCT AAG GAC CCC ACT 816
Asn Leu Leu Thr 260 Met Met Ser Thr Ser 265 Asn Ser Ala Lys Asp 270 Pro Thr
GTT GCT AAA GAA GAA CAA ATC AGC TTC AGA GAC TGT GCA GAT GTA TAT 864
Val Ala Lys 275 Glu Glu Gin Ile Ser 280 Phe Arg Asp Cys Ala 285 Asp Val Tyr
CAA GCT GGT TTT AAT AAA AGT GGA ATC TAC ACT ATT TAT ATT AAT AAT 912
Gin Ala 290 Gly Phe Asn Lys Ser 295 Gly Ile Tyr Thr Ile 300 Tyr Ile Asn Asn
ATG CCA GAA CCC AAA AAG GTG TTT TCC AAT ATG GAT GTC AAT GGG GGA 960
Met 305 Pro Glu Pro Lys Lys 310 Val Phe Cye Asn Met 315 Asp Val Asn Gly Gly 320
GGT TGG ACT GTA ATA CAA CAT CGT GAA GAT GGA AGT CTA GAT TTC CAA 1008
Gly Trp Thr Val Ile 325 Gin His Arg Glu Asp 330 Gly Ser Leu Asp Phe 335 Gin
AGA GGC TGG AAG GAA TAT AAA ATG GGT TTT GGA AAT CCC TCC GGT GAA 1056
Arg Gly Trp Lys 340 Glu Tyr Lys Met Gly 345 Phe Gly Asn Pro Ser 350 Gly Glu
TAT TGG CTG GGG AAT GAG TTT ATT TTT GCC ATT ACC AGT CAG AGG CAG 1104
Tyr Trp Leu 355 Gly Asn Glu Phe Ile 360 Phe Ala Ile Thr ser 365 Gin Arg Gin
TAC ATG Tyr Met CTA AGA ATT GAG TTA ATG GAC Asp TCG Trp GAA GGG AAC CGA GCC TAT 1152
Leu Arg Ile Glu Leu 375 Met Glu Gly 380 Asn Arg Ala Tyr
370
TCA CAG TAT GAC AGA TTC CAC ATA GGA AAT GAA AAG CAA AAC TAT AGG 1200
Ser Gin Tyr Asp Arg Phe His Ile Gly Asn Glu Lys Gin Asn Tyr Arg
385 390 39S 400
TTG TAT TTA AAA GGT CAC ACT GGG ACA GCA GGA AAA CAG AGC AGC CTG 1248
Leu Tyr Leu Lys Gly His Thr Gly Thr Ala Gly Lys Gin Ser Ser Leu
405 410 415
ATC TTA CAC GGT GCT GAT TTC AGC ACT AAA GAT GCT GAT AAT GAC AAC 1296
Ile Leu His Gly Ala Asp Phe Ser Thr Lys Asp Ala Asp Asn Asp Asn
420 425 430
TGT ATG TGC AAA TGT GCC CTC ATG TTA ACA GGA GGA TGG TGG TTT GAT 1344
Cys Met Cys Lys Cys Ala Leu Met Leu Thr Gly Gly Trp Trp Phe Asp
435 440 445
GCT TGT GGC CCC TCC AAT CTA AAT GGA ATG TTC TAT ACT GCG GGA CAA 1392
Ala Cys Gly Pro Ser Asn Leu Asn Gly Het Phe Tyr Thr Ala Gly Gin
4S0 455 460
AAC CAT GGA AAA CTG AAT GGG ATA AAG TGG CAC TAC TTC AAA GGG CCC 1440
Asn His Gly Lys Leu Asn Gly Ile Lys Trp His Tyr Phe Lys Gly Pro
465 470 475 480
AGT TAC TCC TTA CGT TCC ACA ACT ATG ATG ATT CGA GCT TTA GAT TTT T 1489
Ser Tyr Ser Leu Arg Ser Thr Thr Met Met Ile Arg Pro Leu Asp Phe
485 490 495
CA
1491
2. Informace o sekv. ID. NO. 22:
i) Charakteristiky sekvence
A. Délka: 496 aminokyselin
B. Typ: aminokyselina
C. Rozvětvení: jeden
D. Topologie: lineární ii) Typ molekuly: protein
v) Typ fragmentu: interní ix) Charakteristika
A. jméno/klíč: 2N2C2F (chiméra 2)
B. lokace: 1....496
D. Jiné informace:
-88CZ 295371 B6 xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 22:
Het Trp Gin Ile Val Phe Phe Thr Leu Ser Cys Asp Leu Val Leu Ala
1 5 10 15
Ala Ala Tyr Asn Asn Phe Arg Lys Ser Met Αβρ Ser Ile Gly Lys Lys
20 25 30
Gin Tyr Gin Val Gin His Gly Ser cys Ser Tyr Thr Phe Leu Leu Pro
35 40 45
Glu Met Asp Asn Cys Arg Ser Ser Ser Ser Pro Tyr Val ser Asn Ala
50 55 60
Val Gin Arg Aep Ala Pro Leu Glu Tyr Asp Asp Ser Val Gin Arg Leu
65 70 75 80
Gin Val Leu Glu Asn Ile Met Glu Asn Asn Thr Gin Trp Leu Met Lys
85 90 95
Leu Glu Asn Tyr Ile Gin Aep Asn Met Lys Lye Glu Met Val Glu Ile
100 105 110
Gin Glr. Aen Ala Val Gin Asn Gin Thr Ala Val Met Ile Glu Ile Gly
115 120 125
Thr Asn Leu Leu Asn Gin Thr Ala Glu Gin Thr Arg Lys Leu Thr Asp
130 135 140
Val Glu Ala Gin Val Leu Asn Gin Thr Thr Arg Leu Glu Leu Gin Leu
145 150 155 160
Leu Glu His Ser Leu Ser Thr Asn Lys Leu Glu Lys Gin Ile Leu Asp
165 170 175
Gin Thr Ser Glu Ile Asn Lys Leu Gin Aep Lye Asn Ser Phe Leu Glu
180 185 190
Lys Lye Val Leu Ala Het Glu Asp Lys HiS Ile Ile Gin Leu Gin Ser
195 200 205
Ile Lye Glu Glu Lys Asp Gin Leu Gin Val Leu Val ser Lye Gin Asn
210 215 220
Ser Ile Ile Glu Glu Leu Glu Lys Lye Ile Val Thr Ala Thr Val Asn
225 230 235 240
Asn Ser Val Leu Gin Lys Gin Gin His Asp Leu Met Glu Thr Val Asn
245 250 2S5
Asn Leu Leu Thr Met Met Ser Thr Ser Asn Ser Ala Lys Asp Pro Thr
260 265 270
Val Ala Lys Glu Glu Gin Ile Ser Phe Arg Asp Cys Ala Asp Val Tyr
275 280 285
Gin Ala Gly Phe Asn Lys Ser Gly Ile Tyr Thr Ile Tyr Ile Asn Asn
290 295 300
Het Pro Glu Pro Lys Lys Val Phe Cys Aen Met Asp Val Asn Gly Gly
305 310 315 320
Gly Trp Thr Val Ile Gin His Arg Glu Asp Gly Ser Leu Asp Phe Gin
325 330 335
Arg Gly Trp Lys Glu Tyr Lys Met Gly Phe Gly Asn Pro Ser Gly Glu
340 345 350
Tyr Trp Leu Gly Asn Glu Phe Ile Phe Ala Ile Thr Ser Gin Arg Gin
355 360 365
Tyr Het Leu Arg Ile Glu Leu Met Asp Trp Glu Gly Asn Arg Ala Tyr
370 375 380
Ser Gin Tyr Aep Arg Phe His Ile Gly Asn Glu Lys Gin Asn Tyr Arg
385 390 395 400
Leu Tyr Leu Lys Gly His Thr Gly Thr Ala Gly Lys Gin Ser Ser Leu
405 410 415
Ile Leu His Gly Ala Asp Phe ser Thr Lys Asp Ala Αερ Asn Asp Asn
420 425 430
Cys Het Cys Lys Cys Ala Leu Met Leu Thr Gly Gly Trp Trp Phe Asp
435 440 445
Ala Cye Gly Pro Ser Asn Leu Asn Gly Met Phe Tyr Thr Ala Gly Gin
450 4SS 460
Asn His Gly Lys Leu Asn Gly Ile Lys Trp His Tyr Phe Lys Gly Pro
465 470 475 480
Ser Tyr ser Leu Arg Ser Thr Thr Met Met Ile Arg Pro Leu Asp Phe
485 490 495
-89CZ 295371 B6
2. Informace o sekv. ID. NO. 23:
i) Charakteristiky sekvence
A. Délka: 1500 párů bází
B. Typ: nukleová kyselina
C. Rozvětvení: jeden
D. Topologie: lineární ii) Typ molekuly: DNA ix) Charakteristika
A. jméno/klíč: kódující sekvence
B. lokace: 1....1497
D. Jiné informace:
A. jméno/klíč: 1N2C2F (chiméra 3)
B. lokace: 1....1500
D. Jiné informace:
A. jméno/klíč: jiný
B. lokace: 1....60
D. Jiné informace: domnělá vedoucí sekvence je zakódována nukleotidy 1-60
-90CZ 295371 B6 xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 23:
ATG Met 1 ACA GTT TTC CTT TCC TTT GCT TTC CTC GCT GCC ATT CTG ACT CAC His 48
Thr Val Phe Leu 5 Ser Phe Ala Phe Leu 10 Ala Ala Ile Leu Thr 15
ATA GGG TGC AGC AAT CAG CGC CGA AGT CCA GAA AAC AGT GGG AGA AGA 96
Ile Gly Cys Ser 20 Asn Gin Arg Arg Ser 25 Pro Glu Asn Ser Gly 30 Arg Arg
TAT AAC CGG ATT CAA CAT GGG CAA TGT GCC TAC ACT TTC ATT CTT CCA 144
Tyr Asn Arg 35 Ile Gin Hle Gly Gin 40 Cys Ala Tyr Thr Phe 45 Ile Leu Pro
GAA CAC GAT GGC AAC TGT CGT GAG AGT ACG ACA GAC CAG TAC AAC ACA 192
Glu His 50 Asp Gly Aen Cys Arg Glu 55 ser Thr Thr Asp 60 Gin Tyr Asn Thr
AAC GCT CTG CAG AGA GAT GCT CCA CAC GTG GAA CCG GAT GAC TCG GTG 240
Asn 65 Ala Leu Gin Arg Asp 70 Ala Pro His Val Glu 75 Pro Asp Asp. Ser Val 80
CAG AGG CTG CAA GTG CTG GAG AAC ATC ATG GAA AAC AAC ACT CAG TGG 288
Gin Arg Leu Gin Val 85 Leu Glu Aen Ile Met 90 Glu Asn Asn Thr Gin 95 Trp
CTA ATG AAG CTT GAG AAT TAT ATC CAG GAC AAC ATG AAG AAA GAA ATG 336
Leu Met Lys Leu 100 Glu Asn Tyr Ile Gin 105 Asp Asn Met Lys Lys 110 Glu Met
GTA GAG ATA CAG CAG AAT GCA GTA CAG AAC CAG ACG GCT GTG ATG ATA 384
Vál Glu Ile 115 Gin Gin Asn Ala Val 120 Gin Asn Gin Thr Ala 125 Val Met Ile
GAA ATA GGG ACA AAC CTG TTG AAC CAA ACA GCT GAG CAA ACG CGG AAG 432
Glu Ile 130 Gly Thr Asn Leu Leu Asn 135 Gin Thr Ala Glu 140 Gin Thr Aťg Lys
TTA ACT GAT GTG GAA GCC CAA GTA TTA AAT CAG ACC ACG AGA CTT GAA 480
Leu 145 Thr Asp Val Glu Ala 150 Gin Val Leu Asn Gin 155 Thr Thr Arg Leu GlU 160
CTT CAG CTC TTG GAA CAC TCC CTC TCG ACA AAC AAA TTG GAA AAA CAG 528
Leu Gin Leu Leu G1U 165 His Ser Leu ser Thr 170 Asn Lys Leu Glu Lys 175 Gin
ATT TTG GAC CAG ACC AGT GAA ATA AAC AAA TTG CAA GAT AAG AAC AGT 576
Ile Leu Asp Gin 180 Thr Ser Glu Ile Asn 185 Lys Leu Gin Asp Lys 190 Asn Ser
TTC CTA GAA AAG AAG GTG CTA GCT ATG GAA GAC AAG CAC ATC ATC CAA 624
Phe Leu Glu 195 Lys Lys Val Leu Ala 200 Met Glu Asp Lye His 205 Ile Ile Gin
CTA CAG TCA ATA AAA GAA GAG AAA GAT CAG CTA CAG GTG TTA GTA TCC 672
Leu Gin 210 Ser Ile Lys Glu Glu Lys 215 Asp Gin Leu Gin 220 Val Leu Val Ser
AAG CAA AAT TCC ATC ATT GAA GAA CTA GAA AAA AAA ATA GTG ACT GCC 720
Lye 225 Gin Asn Ser Ile Ile Glu 230 Glu Leu Glu Lye Lys 235 Ile Val Thr Ala 240
ACG GTG AAT AAT TCA GTT CTT CAA AAG CAG CAA CAT GAT CTC ATG GAG 768
Thr Val Asn Asn Ser Val Leu Gin Lye Gin Gin His Asp Leu Met Glu
245 250 25S
ACA CTT AAT AAC TTA CTG ACT ATG ATG TCC ACA TCA AAC TCA GCT AAG 816
Thr Val Asn Asn Leu Leu Thr Met Met Ser Thr Ser Asn Ser Ala Lys
260 265 270
GAC CCC ACT GTT GCT AAA GAA GAA CAA ATC AGC TTC AGA GAC TGT GCT 864
Asp Pro Thr Val Ala Lye Glu Glu Gin Ile ser Phe Arg Asp Cys Ala
275 280 285
GAA GTA TTC AAA TCA GGA CAC ACC ACA AAT GGC ATC TAC ACG TTA ACA 912
Glu val Phe Lys Ser Gly His Thr Thr Aen Gly Ile Tyr Thr Leu Thr
290 295 300
TTC CCT AAT TCT ACA GAA GAG ATC AAG GCC TAC TGT GAC ATG GAA GCT 960
Phe pro Asn Ser Thr Glu Glu Ile Lys Ala Tyr cys Asp Met Glu Ala
305 310 315 320
GGA GGA GGC GGG TGG ACA ATT ATT CAG CGA CGT GAG GAT GGC AGC GTT 1008
Gly Gly Gly Gly Trp Thr Ile Ile Gin Arg Arg Glu Asp Gly Ser Val
325 330 335
CAT TTT CAG AGG ACT TGG AAA GAA TAT AAA GTG GGA TTT GGT AAC CCT 1056
Aep Phe Gin Arg Thr Trp Lys Glu Tyr Lys Val Gly Phe Gly Asn Pro
340 345 350
TCA GGA GAA TAT TGG CTG GGA AAT GAG TTT GTT TCG CAA CTG ACT AAT 1104
Ser Gly Glu Tyr Trp Leu Gly Asn Glu Phe Val Ser Gin Leu Thr Asn
355 360 365
CAG CAA CGC TAT GTG CTT AAA ATA CAC CTT AAA GAC TGG GAA GGG AAT 1152
Gin Gin Arg Tyr Val Leu Lys Ile His Leu Lys Asp Trp Glu Gly Asn
370 375 380
GAG GCT TAC TCA TTG TAT GAA CAT TTC TAT CTC TCA AGT GAA GAA CTC 1200
Glu Ala Tyr Ser Leu Tyr Glu His Phe Tyr Leu Ser Ser Glu Glu Leu
385 390 395 400
AAT TAT AGG ATT CAC CTT AAA GGA CTT ACA GGG ACA GCC GGC AAA ATA 1248
Asn Tyr Arg Ile His Leu Lys Gly Leu Thr Gly Thr Ala Gly Lys Ile
405 410 415
AGC AGC ATC AGC CAA CCA GGA AAT GAT TTT AGC ACA AAG GAT GGA GAC 1296
Ser Ser Ile Ser Gin Pro Gly Asn Asp Phe Ser Thr Lys Asp Gly Asp
420 425 430
AAC GAC AAA TGT ATT TGC AAA TGT TCA CAA ATG CTA ACA GGA GGC TGG 1344
Asn Aep Lys Cys Ile Cys Lys Cys Ser Gin Met Leu Thr Gly Gly Trp
435 440 445
TGG TTT GAT GCA TGT GGT CCT TCC AAC TTG AAC GGA ATG TAC TAT CCA 1392
Trp Phe Aep Ala Cys Gly Pro Ser Asn Leu Asn Gly Met Tyr Tyr Pro
450 455 460
CAG AGG CAG AAC ACA AAT AAG TTC AAC GGC ATT AAA TGG TAC TAC TGG 1440
Gin Arg Gin Asn Thr Aen Lye Phe Asn Gly Ile Lys Trp Tyr Tyr Trp
465 470 475 480
AAA GGC TCA GGC TAT TCG CTC AAG GCC ACA ACC ATG ATG ATC CGA CCA 1488
Lye Gly Ser Gly Tyr Ser Leu Lys Ala Thr Thr Met Met Ile Arg Pro
485 490 495
1500
GCA GAT TTC TAA Ala Aep Phe
2. Informace o sekv. ID. NO. 24:
i) Charakteristiky sekvence
A. Délka: 499 aminokyselin
B. Typ: aminokyselina
C. Rozvětvení: jeden
D. Topologie: lineární ii) Typ molekuly: protein
v) Typ fragmentu: interní ix) Charakteristika
A. jméno/klíč: 1N2C2F (chiméra 3) xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 24:
Het Thr Val Phe Leu Ser Phe Ala Phe Leu Ala Ala Ile Leu Thr His
1 5 10 15
Ile Gly Cys Ser Asn Gin Arg Arg Ser Pro Glu Asn Ser Gly Arg Arg
20 25 30
Tyr Asn Arg Ile Gin His Gly Gin Cye Ala Tyr Thr Phe Ile Leu Pro
35 40 45
Glu His Asp Gly Aen Cys Arg Glu Ser Thr Thr Asp Gin Tyr Asn Thr
50 55 60
Asn Ala Leu Gin Arg Aep Ala Pro Hle Val Glu Pro Aep Asp Ser Val
65 70 75 80
Gin Arg Leu Gin Val Leu Glu Aen Ile Met Glu Asn Asn Thr Gin Trp
85 90 95
Leu Met Lys Leu Glu Asn Tyr Ile Gin Asp Aen Met Lye Lys Glu Met
100 105 110
Val Glu Ile Gin Gin Aen Ala Val Gin Aen Gin Thr Ala Val Met Ile
115 120 125
Clu Ile Gly Thr Asn Leu Leu Asn Gin Thr Ala Glu Gin Thr Arg Lys
130 135 140
Leu Thr Aep val Glu Ala Gin Val Leu Asn Gin Thr Thr Arg Leu Glu
145 150 155 160
Leu Gin Leu Leu G1U His Ser Leu Ser Thr Asn Lye Leu Glu Lys Gin
165 170 175
Ile Leu Aep Gin Thr Ser Glu ile Αεη Lys Leu Gin Asp Lys Asn Ser
180 185 190
Phe Leu Glu Lys Lys Val Leu Ala Met Glu Asp Lys His Ile ile Gin
195 200 205
Leu Gin Ser Ile Lys Glu Glu Lys Asp Gin Leu Gin Val Leu Val Ser
210 21S 220
Lys Gin Asn Ser Ile Ile Glu Glu Leu Glu Lys Lys Ile Val Thr Ala
22S 230 235 240
Thr Val Asn Asn Ser Val Leu Gin Lys Gin Gin His Asp Leu Met Glu
245 250 255
Thr Val Asn Αβπ Leu Leu Thr Met Met Ser Thr Ser Asn ser Ala Lye
260 265 270
Asp Pro Thr Val Ala Lys Glu Glu Gin Ile Ser Phe Arg Asp Cys Ala
275 280 285
Glu Val Phe Lys Ser Gly Hle Thr Thr Aen Gly Ile Tyr Thr Leu Thr
290 295 300
Phe Pro Asn Ser Thr Glu Glu Ile Lys Ala Tyr Cye Aep Met Glu Ala
305 310 315 320
Gly Gly Gly Gly Trp Thr Ile Ile Gin Arg Arg Glu Aep Gly Ser Val
325 330 335
Aep Phe Gin Arg Thr Trp Lys Glu Tyr Lys Val Gly Phe Gly Asn Pro
340 345 350
Ser Gly Glu Tyr Trp Leu Gly Asn Glu Phe Val Ser Gin Leu Thr Asn
355 360 365
Gin Gin Arg 370 Tyr Val Leu Lys 375 Ile His Leu Lys Asp 380 Trp Glu Gly Asn
G1U Ala Tyr Ser Leu Tyr Glu His Phe Tyr Leu Ser Ser Glu Glu Leu
385 390 395 400
Asn Tyr Arg ile His Leu Lys Gly Leu Thr Gly Thr Ala Gly Lys Ile
405 410 415
Ser Ser Ile Ser Gin Pro Gly Asn Asp Phe Ser Thr Lys Asp Gly Asp
420 425 430
Asn Aep Lys Cys Ile Cys Lys Cys Ser Gin Met Leu Thr Gly Gly Trp
435 440 445
Trp Phe Asp Ala Cys Gly Pro Ser Asn Leu Asn Gly Met Tyr Tyr Pro
450 455 460
Gin Arg Gin Asn Thr Asn Lys Phe Asn Gly Ile Lys Trp Tyr Tyr Trp
465 470 475 480
Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Leu Lys Ala Thr Thr Met Met Ile Arg Pro
485 490 495
Ala Asp Phe
2. Informace o sekv. ID. NO. 25:
i) Charakteristiky sekvence
A. Délka: 1488 párů bází
B. Typ: nukleová kyselina
C. Rozvětvení: jeden
D. Topologie: lineární ii) Typ molekuly: DNA ix) Charakteristika
A. jméno/klíč: kódující sekvence
B. lokace: 1....1485
D. Jiné informace:
A. jméno/klíč: 2N1C1F (chiméra 4)
B. lokace: 1....1488
D. Jiné informace:
A. jméno/klíč: jiný
B. lokace: 1....48
D. Jiné informace: domnělá vedoucí sekvence je zakódována nukleotidy 1-48 xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 25:
ATG Met 1 TGG Trp CAG ATT GTT TTC Phe TTT ACT CTG AGC Leu Ser 10 TGT Cys GAT Aep CTT Leu GTC Val TTG Leu 15 GCC Ala 48
Gin Ile Val 5 Phe Thr
GCA GCC TAT AAC AAC TTT CGG AAG AGC ATG GAC AGC ATA GGA AAG AAG 96
Ala Ala Tyr Asn Asn Phe Arg Lys Ser Met Asp Ser Ile Gly Lys Lys
20 25 30
CAA TAT CAG GTC CAG CAT GGG TCC TGC AGC TAC ACT TTC CTC CTG CCA 144
Gin Tyr Gin Val Gin His Gly Ser Cys Ser Tyr Thr Phe Leu Leu Pro
35 40 45
GAG ATG GAC AAC TGC CGC TCT TCC TCC AGC CCC TAC GTG TCC AAT GCT 192
Glu Met Asp Asn Cys Arg Ser Ser Ser Ser Pro Tyr val Ser Asn Ala
50 55 60
GTG CAG AGG GAC GCG CCG CTC GAA TAC GAT TTC TCT TCC CAG AAA CTT 240
Val Gin Arg Aep Ala Pro Leu Glu Tyr Aep Phe Ser Ser Gin Lys Leu
65 70 75 80
-94CZ 295371 B6
CAA CAT Gin His CTG GAA CAT GTG ATG Met GAA AAT TAT ACT CAG TGG CTG Trp Leu CAA Gin 95 AAA Lys 288
Leu Glu His 85 Val Glu Asn Tyr 90 Thr Gin
CTT GAG AAT TAC ATT GTG GAA AAC ATG AAG TCG GAG ATG GCC CAG ATA 336
Leu Glu Asn Tyr 100 Ile Val Glu Asn Met 105 Lys Ser G1U Met Ala 110 Gin Ile
CAG CAG AAT GCA GTT CAG AAC CAC ACG GCT ACC ATG CTG GAG ATA GGA 384
Gin Gin Asn 115 Ala Val Gin Asn His 120 Thr Ala Thr Met Leu 125 Glu Ile Gly
ACC AGC CTC CTC TCT CAG ACT GCA GAG CAG ACC AGA AAG CTG ACA GAT 432
Thr Ser 130 Leu Leu Ser Gin Thr 135 Ala Glu Gin Thr Arg 140 Lys Leu Thr Asp
GTT GAG ACC CAG GTA CTA AAT CAA ACT TCT CGA CTT GAG ATA CAG CTG 480
Val 145 Glu Thr Gin Val Leu 150 Asn Gin Thr ser Arg 155 Leu Glu Ile Gin Leu 160
CTG GAG AAT TCA TTA TCC ACC TAC AAG CTA GAG AAG CAA CTT CTT CAA 528
Leu Glu Asn Ser Leu 165 Ser Thr Tyr Lys Leu 170 Glu Lys Gin Leu Leu 175 Gin
CAG ACA AAT GAA ATC TTG AAG ATC CAT GAA AAA AAC AGT TTA TTA GAA 576
Gin Thr Asn Glu 180 Ile Leu Lys Ile His 185 Glu Lys Asn Ser Leu 190 Leu Glu
CAT AAA ATC TTA GAA ATG GAA GGA AAA CAC AAG GAA GAG TTG GAC ACC 624
His Lys Ile 195 Leu Glu Met Glu Gly 200 Lys His Lys Glu Glu 205 Leu Asp Thr
TTA AAG GAA GAG AAA GAG AAC CTT CAA GGC TTG GTT ACT CGT CAA ACA 672
Leu Lys 210 Glu Glu Lys Glu Asn 215 Leu Gin Gly Leu Val 220 Thr Arg Gin Thr
TAT ATA ATC CAG GAG CTG GAA AAG CAA TTA AAC AGA GCT ACC ACC AAC 720
Tyr 225 Ile Ile Gin Glu Leu 230 Glu Lys Gin Leu Asn 235 Arg Ala Thr Thr Asn 240
AAC AGT GTC CTT CAG AAG CAG CAA CTG GAG CTG ATG GAC ACA GTC CAC 768
Asn Ser Val Leu Gin 245 Lys Gin Gin Leu Glu 250 Leu Met Asp Thr Val 255 His
AAC CTT GTC AAT CTT TGC ACT AAA GAA GGT GTT TTA CTA AAG GGA GGA 816
Asn Leu Val Asn 260 Leu Cys Thr Lys Glu 265 Gly Val Leu Leu Lys 270 Gly Gly
AAA AGA GAG GAA GAG AAA CCA TTT AGA GAC TGT GCA GAT GTA TAT CAA 864
Lys Arg Glu 275 Glu Glu Lys Pro Phe 280 Arg Asp Cys Ala Asp 285 Val Tyr Gin
GCT GGT TTT AAT AAA AGT GGA ATC TAC ACT ATT TAT ATT AAT AAT ATG 912
Ala Gly 290 Phe Asn Lys Ser Gly 29 5 Ile Tyr Thr Ile Tyr 300 Ile Asn Asn Met
CCA GAA CCC AAA AAG GTG TTT TGC AAT ATG GAT GTC AAT GGG GGA GGT 960
Pro 305 Glu Pro Lys Lys Val 310 Phe Cys Asn Met Asp 315 Val Asn Gly Gly Gly 320
TGG ACT GTA ATA CAA CAT CGT GAA GAT GGA AGT CTA GAT TTC CAA AGA 1008
Trp Thr Val Ile Gin 325 His Arg Glu Asp Gly 330 Ser Leu Asp Phe Gin 335 Arg
GGC TGG AAG GAA TAT AAA ATG GGT TTT GGA AAT CCC TCC GGT GAA TAT 1056
Gly Trp Lys Glu 340 Tyr Lys Met Gly Phe 345 Gly Asn Pro Ser Gly 350 Glu Tyr
-95CZ 295371 B6
TGG CTG GGG AAT GAG Glu TTT ATT TTT GCC ATT ACC AGT CAG AGG CAG TAC 1104
Trp Leu Gly Asn 355 Phe Ile Phe 360 Ala Ile Thr Ser Gin 365 Arg Gin Tyr
ATG CTA AGA ATT GAG TTA ATG GAC TGG GAA GGG AAC CGA GCC TAT TCA 1152
Met Leu Arg Ile Glu Leu Met Asp Trp Glu Gly Asn Arg Ala Tyr Ser
370 375 380
CAG TAT GAC AGA TTC CAC ATA GGA AAT GAA AAG CAA AAC TAT AGG TTG 1200
Gin Tyr Asp Arg Phe His Ile Gly Asn Glu Lys Gin Asn Tyr Arg Leu
385 390 395 400
TAT TTA AAA GGT CAC ACT GGG ACA GCA GGA AAA CAG AGC AGC CTG ATC 1248
Tyr Leu Lys Gly Hle Thr Gly Thr Ala Gly Lys Gin Ser Ser Leu Tle
405 410 415
TTA CAC GGT GCT GAT TTC AGC ACT AAA GAT GCT GAT AAT GAC AAC TGT 1296
Leu His Gly Ala Asp Phe Ser Thr Lys Asp Ala Asp Asn Asp Asn Cys
420 425 430
ATG TGC AAA TGT GCC CTC ATG TTA ACA GGA GGA TGG TGG TTT GAT GCT 1344
Met Cys Lys Cys Ala Leu Met Leu Thr Gly Gly Trp Trp Phe Asp Ala
435 440 445
TGT GGC CCC TCC AAT CTA AAT GGA ATG TTC TAT ACT GGG GGA CAA AAC 1392
Cys Gly Pro Ser Aen Leu Asn Gly Met Phe Tyr Thr Ala Gly Gin Asn
450 45S 460
CAT GGA AAA CTG AAT GGG ATA AAG TGG CAC TAC TTC AAA GGG CCC AGT 1440
His Gly Lys Leu Aen Gly Ile Lys Trp His Tyr Phe Lys Gly Pro Ser
465 470 475 480
TAC TCC TTA CGT TCC ACA ACT ATG ATG ATT CGA CCT TTA GAT TTT TGA 1488
Tyr ser Leu Arg Ser Thr Thr Met Met Ile Arg Pro Leu Asp Phe
485 490 495
2. Informace o sekv. ID. NO. 26:
i) Charakteristiky sekvence
A. Délka: 495 aminokyselin
B. Typ: aminokyselina
C. Rozvětvení: jeden
D. Topologie: lineární ii) Typ molekuly: protein
v) Typ fragmentu: interní ix) Charakteristika
A. jméno/klíč: 2N1C1F (chiméra 4)
B. lokace: 1....495
-96CZ 295371 B6
xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 26:
Het Trp Gin Ile val Phe Phe Thr Leu Ser Cys Asp Leu Val Leu Ala
1 5 10 15
Ala Ala Tyr Asn Ašn Phe Arg Lys Ser Met Asp Ser Ile Gly Lys Lys
20 25 30
Gin Tyr Gin Val Gin His Gly Ser Cys Ser Tyr Thr Phe Leu Leu Pro
35 40 45
Glu Met Asp Asn Cys Arg Ser Ser Ser Ser Pro Tyr Val Ser Asn Ala
50 55 60
Val Gin Arg Asp Ala Pro Leu Glu Tyr Asp Phe Ser Ser Gin Lys Leu
65 70 75 80
Gin His Leu Glu His Val Met Glu Asn Tyr Thr Gin Trp Leu Gin Lys
85 90 95
Leu Glu Asn Tyr Ile Val Glu Asn Met Lys Ser Glu Met Ala Gin Ile
100 105 110
Gin Gin Asn Ala Val Gin Asn His Thr Ala Thr Met Leu Glu Ile Gly
115 120 125
Thr Ser Leu Leu Ser Gin Thr Ala Glu Gin Thr Arg Lys Leu Thr Asp
130 135 140
Val Glu Thr Gin Val Leu Asn Gin Thr Ser Arg Leu Glu Ile Gin Leu
145 150 155 160
Leu Glu Asn Ser Leu Ser Thr Tyr Lys Leu Glu Lys Gin Leu Leu. Gin
165 170 175
Gin Thr Asn Glu Ile Leu Lys Ile His Glu Lys Asn Ser Leu Leu Glu
180 185 190
His Lys Ile Leu Glu Het Glu Gly Lys His Lys Glu Glu Leu Asp Thr
195 200 205
Leu Lys Glu Glu Lys Glu Asn Leu Gin Gly Leu Val Thr Arg Gin Thr
210 215 220
Tyr Ile Ile Gin Glu Leu Glu Lys Gin Leu Asn Arg Ala Thr Thr Asn
225 230 235 240
Asn Ser Val Leu Gin Lys Gin Gin Leu Glu Leu Met Asp Thr Val His
245 250 255
Asn Leu Val Asn Leu Cys Thr Lys Glu Gly Val Leu Leu Lys Gly Gly
260 265 270
Lys Arg Glu Glu Glu Lys Pro Phe Arg Asp Cys Ala Asp Val Tyr Gin
275 280 285
Ala Gly Phe Asn Lys Ser Gly Ile Tyr Thr Ile Tyr Ile Asn Asn Met
290 295 300
Pro Glu Pro Lys Lys Val Phe Cys Asn Met Asp Val Asn Gly Gly Gly
305 310 315 320
Trp Thr val Ile Gin His Arg Glu Asp Gly Ser Leu Asp Phe Gin Arg
325 330 335
Gly Trp Lys Glu Tyr Lys Met Gly Phe Gly Asn Pro ser Gly Glu Tyr
340 345 350
Trp Leu Gly Asn Glu Phe Ile Phe Ala Ile Thr Ser Gin Arg Gin Tyr
355 360 365
Met Leu Arg Ile Glu Leu Met Asp Trp Glu Gly Asn Arg Ala Tyr Ser
370 375 380
Gin Tyr Asp Arg Phe His Ile Gly Asn Glu Lys Gin Asn Tyr Arg Leu
385 390 395 400
Tyr Leu Lys Gly His Thr Gly Thr Ala Gly Lys Gin Ser Ser Leu Ile
405 410 415
Leu His Gly Ala Asp Phe Ser Thr Lys Asp Ala Asp Asn Asp Asn Cys
420 425 430
Met Cys Lye Cys Ala Leu Met Leu Thr Gly Gly Trp Trp Phe Asp Ala
435 440 445
Cys Gly Pro Ser Asn Leu Asn Gly Met Phe Tyr Thr Ala Gly Gin Asn
450 455 460
His Gly Lys Leu Asn Gly Ile Lye Trp His Tyr Phe Lys Gly Pro Ser
465 470 475 480
Tyr Ser Leu Arg Ser Thr Thr Het Met Ile Arg Pro Leu Asp Phe
485 490 495
-97CZ 295371 B6
2. Informace o sekv. ID. NO. 27:
i) Charakteristiky sekvence
A. Délka: 47 párů bází
B. Typ: nukleová kyselina
C. Rozvětvení: jeden
D. Topologie: lineární ii) Typ molekuly: DNA ix) Charakteristika
A. jméno/klíč: hTL4atg
B. lokace: 1....47
D. Jiné informace: PCR primer
A. jméno/klíč: jiný
B. lokace: 1....20
D. Jiné informace: „koncová“ sekvence přidaná k PCR primeru k usnadnění klonování zesílený PCR fragmentů xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 27:
GCATGCTATC TCGAOCCACC ATGCTCTCCC AGCTAGCCAT GCTGCAG 47
2. Informace o sekv. ID. NO. 28:
i) Charakteristiky sekvence
A. Délka: 55 párů bází
B. Typ: nukleová kyselina
C. Rozvětvení: jeden
D. Topologie: lineární ii) Typ molekuly: cDNA ix) Charakteristika
A. jméno/klíč: hTL4not
B. lokace: 1....55
D. Jiné informace: PCR primer
A. jméno/klíč: jiný
B. lokace: 1....28
D. Jiné informace: „koncová“ sekvence přidaná k PCR primeru k usnadnění klonování zesílený PCR fragmentů xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 28:
GTGTCGACGC GGCCGCTCTA GATCAGACTT AGATGTCCAA AGGCCGTATC ATCAT 55

Claims (5)

1. Izolovaná molekula nukleové kyseliny kódující chimemí TIE-2 ligand obsahující jednu N-koncovou doménu, jednu smyčkově stočenou doménu a jednu fíbrinogenu podobnou doménu, přičemž alespoň dvě domény jsou odvozeny od odlišných TIE-2 ligandů ze souboru zahrnujícího TIE-2 ligand 1, TIE-2 ligand 2, TIE-2 ligand 3 a TIE-2 ligand 4.
2. Izolovaná molekula nukleové kyseliny podle nároku 1 kódující chimemí TIE-2 ligand, přičemž jsou N-koncová doména, smyčkově stočená doména a fíbrinogenu podobná doména odvozeny od TIE-2 ligandu 1 nebo TIE-2 ligandu 2.
3. Izolovaná molekula nukleové kyseliny podle nároku 2 kódující chimemí TIE-2 ligand, který váže a aktivuje TIE-2 receptor zahrnující nukleotidové sekvenci kódující TIE-2 ligand 1, přičemž část nukleotidové sekvence, která kóduje N-koncovou doménu TIE-2 ligandu 1 je nahrazena nukleotidovou sekvencí, která kóduje N-koncovou doménu TIE-2 ligandu 2.
4. Izolovaná molekula nukleové kyseliny podle nároku 3, přičemž část nukleotidové sekvence, která kóduje smyčkově stočenou doménu TIE-2 ligandu 1 je nahrazena nukleotidovou sekvencí, která kóduje smyčkově stočenou doménu TIE-2 ligandu 2.
5. Izolovaná molekula nukleové kyseliny podle nároku 3 nebo 4, která je modifikována ke kódování jiné aminokyseliny než cysteinového zbytku, který se kóduje nukleotidy 784 až 786 podle obr. 27.
6. Izolovaná molekula nukleové kyseliny podle nároku 5, která je modifikována ke kódování serinového zbytku místo cysteinového zbytku.
7. Izolovaná molekula nukleové kyseliny podle nároku 5 nebo 6, která je dále modifikována ke kódování jiné aminokyseliny než argininové zbytky, který se kóduje nukleotidy 199 až 201 podle obr. 27.
8. Izolovaná molekula nukleové kyseliny podle nároku 7, která je modifikována ke kódování serinového zbytku místo argininového zbytku.
9. Izolovaná molekula nukleové kyseliny podle nároku 3, která kóduje TIE-2 ligand, který má aminokyselinovou sekvenci podle obr. 27.
10. Izolovaná molekula nukleové kyseliny podle nároku 4, která kóduje chimemí TIE-2 ligand, který má aminokyselinovou sekvenci podle obr. 25.
11. Izolovaná molekula nukleové kyseliny podle nároku 2, která kóduje modifikovaný TIE-2 ligand, který váže avšak neaktivuje TIE-2 receptor zahrnující nukleotidovou sekvenci kódující TIE-2 ligand 1, přičemž část nukleotidové sekvence, která kóduje fíbrinogenu podobnou doménu TIE-2 ligandu, je nahrazena nukleotidovou sekvencí, která kóduje fíbrinogenu podobnou doménu TIE-2 ligandu.
12. Izolovaná molekula nukleové kyseliny podle nároku 11, ve které je část nukleotidové sekvence, která kóduje smyčkově stočenou doménu TIE-2 ligandu 1, nahrazen nukleotidovou sekvencí, která kóduje smyčkově stočenou doménu TIE-2 ligandu 2.
13. Izolovaná molekula nukleové kyseliny podle nároku 11, která kóduje chimemí TIE-2 ligand, který má aminokyselinovou sekvenci podle obr. 24.
-99CZ 295371 B6
14. Izolovaná molekula nukleové kyseliny podle nároku 12, která kóduje chimemí TIE-2 ligand, který má aminokyselinovou sekvenci podle obr. 26.
15. Chimerní TIE-2 ligand kódující molekulu nukleové kyseliny podle nároků 1 až 14.
16. Chimemí TIE-2 ligand, který má aminokyselinovou sekvenci podle obr. 24, 25, 26 nebo 27.
17. Chimemí TIE-2 ligand podle nároku 15, který má aminokyselinovou sekvenci podle obr. 27, je však modifikován, takže kóduje jinou aminokyselinu místo cysteinového zbytku, který se kóduje nukleotidy 784 až 786.
18. Vektor zahrnující molekulu nukleové kyseliny podle nároků 1 až 14.
19. Vektor podle nároku 18, přičemž molekula nukleové kyseliny je operativně vázána na expresní řídicí sekvenci schopnou řídit expresi v hostitelské buňce.
20. Vektor podle nároku 18 nebo 19, kterým je plazmid.
21. Hostitelský vektorový systém pro produkci chimemího ligandu podle nároků 15, 16 nebo 17, který zahrnuje hostitelskou buňku a vektor podle nároků 18, 19 nebo 20.
22. Hostitelský vektorový systém podle nároku 21, přičemž hostitelskou buňkou je bakteriální, kvasnicová nebo savčí buňka.
23. Způsob produkce ligandu podle nároků 15, 16 nebo 17, vyznačující se tím, že se nechají růst buňky hostitelského vektorového systému podle nároku 21 nebo 22 za podmínek umožňujících produkci ligandu a izolaci takto produkovaného ligandu.
24. Protilátka, která specificky váže ligand podle nároků 15, 16 nebo 17 a která neváže nativní TIE-2 ligand.
25. Protilátka podle nároku 24, kterou je monoklonální protilátka.
26. Konjugát obsahující ligand podle nároků 15, 16 nebo 17 a konjugovaný s cytotoxicky účinnou látkou.
27. Konjugát podle nároku 26, přičemž cytotoxicky účinnou látkou je radioizotop nebo toxin.
28. Farmaceutický prostředek, vyznačující se t í m , že obsahuje chimemí ligand podle nároků 15, 16 nebo 17 a farmaceuticky vhodný nosič.
29. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje protilátku podle nároku 24 nebo 25 a farmaceuticky vhodný nosič.
30. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje konjugát podle nároku 26 nebo 27 a farmaceuticky vhodný nosič.
31. Ligand podle nároků 15, 16 nebo 17 pro použití při ošetřování lidí nebo zvířat nebo pro diagnostické účely.
-100CZ 295371 B6
32. Protilátka podle nároku 24 pro použití při ošetřování lidí nebo zvířat nebo pro diagnostické účely.
5 33. Konjugát podle nároku 26 pro použití při ošetřování lidí nebo zvířat nebo pro diagnostické účely.
CZ1999310A 1996-08-02 1997-08-01 Izolovaná molekula nukleové kyseliny kódující chimerní TIE-2 ligand, chimerní TIE-2 ligand kódující molekulu nukleové kyseliny, vektor zahrnující molekulu nukleové kyseliny, způsob produkce ligandu, konjugát obsahující ligand a farmaceutický prostředek, obsahující ligand CZ295371B6 (cs)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US2299996P 1996-08-02 1996-08-02
US08/740,223 US6265564B1 (en) 1996-08-02 1996-10-25 Expressed ligand-vascular intercellular signalling molecule

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ31099A3 CZ31099A3 (cs) 2000-03-15
CZ295371B6 true CZ295371B6 (cs) 2005-07-13

Family

ID=26696604

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ1999310A CZ295371B6 (cs) 1996-08-02 1997-08-01 Izolovaná molekula nukleové kyseliny kódující chimerní TIE-2 ligand, chimerní TIE-2 ligand kódující molekulu nukleové kyseliny, vektor zahrnující molekulu nukleové kyseliny, způsob produkce ligandu, konjugát obsahující ligand a farmaceutický prostředek, obsahující ligand

Country Status (20)

Country Link
US (5) US6265564B1 (cs)
EP (1) EP0915974B1 (cs)
JP (1) JP3977434B2 (cs)
KR (1) KR100481560B1 (cs)
CN (1) CN1171997C (cs)
AT (1) ATE262037T1 (cs)
AU (1) AU724032C (cs)
CA (1) CA2262409C (cs)
CZ (1) CZ295371B6 (cs)
DE (1) DE69728149T2 (cs)
DK (1) DK0915974T3 (cs)
ES (1) ES2216163T3 (cs)
HU (1) HU227995B1 (cs)
IL (1) IL128311A (cs)
NO (1) NO990470L (cs)
NZ (2) NZ333994A (cs)
PL (1) PL189639B1 (cs)
PT (1) PT915974E (cs)
RU (1) RU2233880C2 (cs)
WO (1) WO1998005779A1 (cs)

Families Citing this family (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6265564B1 (en) 1996-08-02 2001-07-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Expressed ligand-vascular intercellular signalling molecule
US6030831A (en) * 1997-09-19 2000-02-29 Genetech, Inc. Tie ligand homologues
US6348350B1 (en) 1997-09-19 2002-02-19 Genentech, Inc. Ligand homologues
AU4643699A (en) * 1998-06-24 2000-01-10 Compugen Ltd. Angiopoietin-like growth factor sequences
AU776393B2 (en) * 1998-12-23 2004-09-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Method of enhancing the biological activity of ligands
US6455035B1 (en) 1999-03-26 2002-09-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Angiopoietins and methods of use thereof
JP2003529345A (ja) * 2000-01-20 2003-10-07 ハダシット メディカル リサーチ サービシーズ アンド ディベロップメント リミテッド 新規走触性ペプチド
AU8022901A (en) 2000-08-21 2002-03-04 Pacific Corp Novel thiourea derivatives and the pharmaceutical compositions containing the same
US6753321B2 (en) 2000-09-15 2004-06-22 Genvec, Inc. Method of modulating neovascularization
US7138370B2 (en) 2001-10-11 2006-11-21 Amgen Inc. Specific binding agents of human angiopoietin-2
US7205275B2 (en) 2001-10-11 2007-04-17 Amgen Inc. Methods of treatment using specific binding agents of human angiopoietin-2
US7658924B2 (en) 2001-10-11 2010-02-09 Amgen Inc. Angiopoietin-2 specific binding agents
US7521053B2 (en) 2001-10-11 2009-04-21 Amgen Inc. Angiopoietin-2 specific binding agents
US7052695B2 (en) 2001-10-25 2006-05-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Angiopoietins and methods of treating hypertension
AU2002359464A1 (en) * 2001-11-30 2003-06-17 Genvec, Inc. Angiopioetin related factors
US7081443B2 (en) 2002-05-21 2006-07-25 Korea Advanced Institutes Of Science And Technology (Kaist) Chimeric comp-ang1 molecule
WO2004076650A2 (en) * 2003-02-27 2004-09-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Angiopoietin and fragments, mutants, and analogs thereof and uses of the same
US8232247B2 (en) * 2003-05-29 2012-07-31 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods of treating cancer, arthritis and/or diabetes with angiopoietins
US7871610B2 (en) * 2003-08-12 2011-01-18 Dyax Corp. Antibodies to Tie1 ectodomain
US7348001B2 (en) * 2003-08-12 2008-03-25 Dyax Corp. Tie1-binding ligands
US7485297B2 (en) * 2003-08-12 2009-02-03 Dyax Corp. Method of inhibition of vascular development using an antibody
CN1323723C (zh) * 2003-12-26 2007-07-04 上海新世界基因技术开发有限公司 Tie2受体介导的靶向性肿瘤基因治疗的基因转移系统
US8298532B2 (en) 2004-01-16 2012-10-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Fusion polypeptides capable of activating receptors
KR101017301B1 (ko) 2004-12-21 2011-02-28 메드임뮨 리미티드 앤지오포이에틴-2에 대한 항체 및 그의 용도
US20080213253A1 (en) * 2007-01-12 2008-09-04 Dyax Corp. Combination therapy for the treatment of cancer
JO2913B1 (en) 2008-02-20 2015-09-15 امجين إنك, Antibodies directed towards angiopoietin-1 and angiopoietin-2 proteins and their uses
EP2671891A3 (en) 2008-06-27 2014-03-05 Amgen Inc. Ang-2 inhibition to treat multiple sclerosis
US9434925B2 (en) * 2009-04-13 2016-09-06 Apceth Gmbh & Co. Kg Genetically modified mesenchymal stem cell that express an exogenous cytotoxic protein
ES2704038T3 (es) 2011-05-24 2019-03-13 Zyngenia Inc Complejos multiespecíficos multivalentes y monovalentes y sus usos
KR101967345B1 (ko) * 2012-10-18 2019-04-09 삼성전자주식회사 안지오포이에틴-2와 인테그린 간의 결합을 저해하는 펩타이드 및 그 용도
CN105451767B (zh) 2013-03-15 2019-10-18 泽恩格尼亚股份有限公司 多价和单价多特异性复合物及其用途
RU2538701C1 (ru) * 2013-07-11 2015-01-10 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки "Тюменский научный центр Сибирского отделения РАН" (ТюмНЦ СО РАН) Способ извлечения куриного эмбриона из яйца для дальнейшего получения клеточных трансплантатов из фетальных тканей
US10670611B2 (en) 2014-09-26 2020-06-02 Somalogic, Inc. Cardiovascular risk event prediction and uses thereof
WO2017079556A1 (en) 2015-11-06 2017-05-11 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Use of angiopoietins in promoting blood coagulation and in the treatment of blood coagulation disorders

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5070192A (en) * 1988-03-23 1991-12-03 The Johns Hopkins University Cloned human topoisomerase i: cdna expression, and use for autoantibody detection
US5814464A (en) * 1994-10-07 1998-09-29 Regeneron Pharma Nucleic acids encoding TIE-2 ligand-2
DE69633121T2 (de) * 1995-04-06 2005-07-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Tie-2 liganden, herstellungsverfahren und verwendung
US6265564B1 (en) * 1996-08-02 2001-07-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Expressed ligand-vascular intercellular signalling molecule

Also Published As

Publication number Publication date
EP0915974B1 (en) 2004-03-17
EP0915974A1 (en) 1999-05-19
US6441137B1 (en) 2002-08-27
DK0915974T3 (da) 2004-07-12
JP3977434B2 (ja) 2007-09-19
ATE262037T1 (de) 2004-04-15
PL189639B1 (pl) 2005-09-30
CA2262409C (en) 2007-11-20
CN1171997C (zh) 2004-10-20
HUP0400256A3 (en) 2006-01-30
NO990470D0 (no) 1999-02-01
IL128311A0 (en) 2000-01-31
HUP0400256A2 (hu) 2004-04-28
NO990470L (no) 1999-04-06
ES2216163T3 (es) 2004-10-16
CN1232501A (zh) 1999-10-20
US20050106099A1 (en) 2005-05-19
KR100481560B1 (ko) 2005-04-08
HU227995B1 (en) 2012-08-28
DE69728149T2 (de) 2004-10-28
CA2262409A1 (en) 1998-02-12
US6825008B2 (en) 2004-11-30
NZ505684A (en) 2001-12-21
RU2233880C2 (ru) 2004-08-10
AU3968797A (en) 1998-02-25
NZ333994A (en) 2000-09-29
DE69728149D1 (de) 2004-04-22
HK1017379A1 (en) 1999-11-19
WO1998005779A1 (en) 1998-02-12
AU724032B2 (en) 2000-09-07
US6265564B1 (en) 2001-07-24
CZ31099A3 (cs) 2000-03-15
PT915974E (pt) 2004-05-31
US20030092891A1 (en) 2003-05-15
KR20000029778A (ko) 2000-05-25
IL128311A (en) 2007-08-19
JP2000516807A (ja) 2000-12-19
US7045302B2 (en) 2006-05-16
AU724032C (en) 2001-08-16
US20050186665A1 (en) 2005-08-25
PL331405A1 (en) 1999-07-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6627415B1 (en) TIE-2 ligands, methods of making and uses thereof
AU724032C (en) Modified tie-2-receptor ligands
US6645484B1 (en) Method of blocking blood vessel growth using tie-2 ligand 2
US5650490A (en) Tie-2 ligand 2
US5879672A (en) Tie-2 ligand 1
US5851797A (en) Tie ligand-3, methods of making and uses thereof
JP2000513932A (ja) Ｔｉｅ―２レセプターリガンド（ｔｉｅリガンド―３；ｔｉｅリガンド―４）およびそれらの使用
US7063840B2 (en) TIE-2 ligands, methods of making and uses thereof
US20030166858A1 (en) TIE-2 ligands, methods of making and uses thereof
US7063965B2 (en) Nucleic acid encoding TIE-2 ligand
CA2595038C (en) Modified tie-2 receptor ligands
HK1008230B (en) Tie-2 ligands, methods of making and uses thereof
HK1017379B (en) Modified tie-2-receptor ligands
AU2241300A (en) New uses of tie-2 ligands
AU6134100A (en) Novel modified tie-2 receptor ligands

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic
MK4A Patent expired

Effective date: 20170801